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WO2013081296A1 - Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 - Google Patents

Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 Download PDF

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Publication number
WO2013081296A1
WO2013081296A1 PCT/KR2012/008456 KR2012008456W WO2013081296A1 WO 2013081296 A1 WO2013081296 A1 WO 2013081296A1 KR 2012008456 W KR2012008456 W KR 2012008456W WO 2013081296 A1 WO2013081296 A1 WO 2013081296A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
riboflavin
lysine
threonine
microorganism
production
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/008456
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박상희
문준옥
임상조
권도현
이경한
성진석
김형준
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to EP12852576.3A priority Critical patent/EP2787082A4/en
Priority to BR112014013239-9A priority patent/BR112014013239B1/pt
Priority to JP2014544651A priority patent/JP5966016B2/ja
Priority to RU2014123540/10A priority patent/RU2588657C2/ru
Priority to MX2014006502A priority patent/MX355904B/es
Priority to US14/362,036 priority patent/US10590446B2/en
Publication of WO2013081296A1 publication Critical patent/WO2013081296A1/ko

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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present invention relates to a method for simultaneously producing high concentrations of L-amino acid and riboflavin and to a microorganism that simultaneously produces L-amino acid and riboflavin.
  • Grain feeds such as corn, sorghum, barley and wheat, which are the most commonly used feedstocks, generally provide 30-60% of the amino acid requirement. Therefore, an additional supply of amino acids is required to meet the remaining requirements and to balance the essential amino acids. In addition, all feeds contain certain levels of vitamins, which can lead to deficiency if not supplied in sufficient quantities. Therefore, vitamins, like amino acids, need to be supplemented to maintain proper amounts. Amino acids are the most expensive raw materials of feed ingredients, and the efficient supply of amino acids can be said to be one of the factors that affect overall productivity. In particular, L-lysine and L-threonine among these amino acids frequently become the first limiting essential amino acids for livestock growth.
  • the L-lysine and L-threonine are produced by a fermentation method using microorganisms, L-lysine and L-threonine produced by the fermentation method is purified and concentrated, and then added to the feed.
  • Microorganisms used in the fermentation of L- lysine was coryneform microorganisms (Corynebacterium sp.) Or Escherichia sp inde (Escherichia. Coli) are typically, for example, the microorganism may produce an L- lysine it has been reported a lot of manipulation by genetic (Korean Patent Nos. 10-0930203, 10-0924065, US Pat. No. 7,871,801).
  • Vitamins although required in very small amounts, are essential organic compounds that must be supplied for the normal metabolism, growth, reproduction and health maintenance of livestock.
  • riboflavin (B2) is a water-soluble vitamin that is biosynthesized by various species of microorganisms and all plants, and has a property that is not biosynthesized in the body of vertebrates, including humans, it is necessary to supply from the outside. Deficiency of the riboflavin leads to sterility and reproductive disturbance of sows in pigs ( Biol. Reprod . (1981) 25: 659-665, J. Anim. Sci. (1984) 59: 1567-1572).
  • the nerves especially the sciatic and brachial nerves, may cause problems and may have an adverse effect on the development of the embryo, resulting in death of the embryo (Korean Standard, Poultry, 2002, Ministry of Agriculture). Therefore, the riboflavin has been used as a feed additive for livestock growth, especially the concentrated riboflavin itself has been used as feed.
  • riboflavin is 6000 tonnes annually, about 75% of which is used as feed additive, and the rest is used for food and medicine.
  • a chemical synthesis method and a fermentation method using microorganisms are used in combination.
  • Chemical synthesis is a method of producing high purity riboflavin through a multi-step process, usually using a precursor such as D-ribose.
  • the chemical synthesis method has a disadvantage that the production cost is expensive because the starting material is expensive, a fermentation method using a microorganism has been developed.
  • Fermentation using microorganisms is a method of separating riboflavin-producing microorganisms from nature or culturing microorganisms induced by mutations by genetic engineering or chemical-physical methods under appropriate conditions so that riboflavin is overproduced, and then separating riboflavin from fermentation broth. .
  • fermentation methods are mainly cost-competitive and environmentally friendly, and the riboflavin produced by the fermentation method is purified and concentrated and then added to the feed.
  • Candida Farma (representative yeast) Candida famata Has been disclosed (US Pat. No. 5,231,007), and in industrial production of riboflavin, Eremoteum ASHBI, Eremothecium ashbyii ) And Eshbian Gospy ( Ashbya gossypii ; International Patent Publication No. 9526406) is the most used strain.
  • the bacterium is Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Many examples of riboflavin production by genetically engineering the bacteria have been reported (European Patent No. 0821063, U.S. Patent No. 5,837,528, U.S. Patent No. 5,334,510). It was produced (Korea Patent Registration No. 10-0542573).
  • each component In animal feed, the required amount of each component is about 1-5 g / kg for L-lysine, about 0.6-3.3 g / kg for L-threonine, and about 2-4 mg / kg for riboflavin. 0.1% (NRC. 1998. National Academy of Sciences- National Research Council, Washington, DC).
  • L-lysine and riboflavin are produced separately by fermentation, they are purified and concentrated before being added to the feed, and are fed to the feed blending plant. If the concentration of riboflavin of the microorganisms producing L-lysine and riboflavin simultaneously reaches about 0.1% of the L-lysine concentration, the culture medium of the microorganism may be added to satisfy the standard requirement of the feed additive. There have been no reports of these attempts.
  • riboflavin is a product of ribulose 5-phosphate (Ru5P) and purime metabolism, one of the products of the pentose-phosphate path way (PPP). It is biosynthesized from one of its products, guanosine triphosphate (GTP), via two pathways, the GTP cyclohydrolase II (RibA) gene, pyrimidine deaminase (pyrimidine deaminase).
  • RibG Riboflavin synthase subunit alpha (RibC) gene
  • RibH riboflavin synthase subunit beta
  • the riboflavin biosynthetic gene group forms an operon (rib operon) together with ribulose-5-phosphate-3-epimerase (Rpe, NCgl1536) that is involved in the pentose phosphorylation pathway.
  • Rpe and RibA are both in competition with Ru5P as a substrate (Fig. 1).
  • Rpe mediates the intermediate reaction of incorporating D-Xylose-5-phosphate from Ru5P into the glycolytic metabolite produced by pentose phosphorylation
  • RibA is a riboflavin biosynthesis.
  • the pentose phosphorylation pathway in Corynebacterium is a major source of reducing power (NADPH) involved in lysine biosynthesis, and a direct link between the regeneration of NADPH and L-lysine biosynthesis has been reported in the literature.
  • NADPH reducing power
  • the pentose phosphorylation pathway is glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), 6-phosphogluconolactonase (6-phosphogluconolactonase), 6-phosphogluconate dehydrogenase ( 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD), Rpe, ribose-5-phosphate isomerase (RpiA), transketolase and transaldolase catalyze sequential reactions.
  • G6PDH glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • 6-phosphogluconolactonase 6-phosphogluconate dehydrogenase
  • 6-PGD 6-phosphogluconate dehydrogenase
  • Rpe ribose-5-phosphate isomerase
  • transketolase transaldolase catalyze sequential reactions.
  • the final metabolite produced by this process is fed back into the process.
  • European patent EP 01941065 (2001.06) and EP 02781875 (2002.12) disclose a mutation having negative feedback inhibition resistance of the enzymes that directly produce NADPH of the enzymes
  • the present invention relates to corynebacterium lysine producing strains that overexpress transketolase and transaldolase (European Patents EP 1109915, EP 1179076, EP 1179084).
  • Patent Publication DE10037611, DE10037612 discloses the effect of increasing L-lysine production in Corynebacterium overexpressing Rpe or RpiA, respectively.
  • microorganisms that simultaneously produce L-lysine and riboflavin may exist in nature, but production yields of L-lysine and riboflavin are competing. Therefore, the production of riboflavin can be industrialized in industrial microorganisms that produce L-lysine in large quantities. Attempts to increase have not been reported.
  • One object of the present invention is L-lysine or L- threonine production in Corynebacterium genus microorganisms, the L- lysine or L- threonine production is maintained at a high concentration, the production of riboflavin is increased Providing a method for the simultaneous production of L-lysine or L-threonine, and riboflavin, comprising culturing the microorganism so modified to simultaneously produce L-lysine or L-threonine, and riboflavin. will be.
  • Another object of the present invention is to induce a random mutation in Corynebacterium glutamicum having high concentration of L-lysine production capacity, the L- lysine production is maintained at a high concentration, modified to increase the production of riboflavin It is to provide a variant Corynebacterium glutamicum microorganism of the number KCCM11223P.
  • Another object of the present invention is to enhance the activity of the enzyme group expressed by rib operon including riboflavin biosynthetic gene group in the microorganism of the genus Corynebacterium having the ability to produce L-amino acid, It is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium that maintains a high concentration and at the same time modified to increase the production of riboflavin, simultaneously producing L-amino acid and riboflavin.
  • Another object of the present invention is to provide a feed additive comprising the formulation containing L-amino acid and riboflavin or the granules prepared by culturing the microorganism.
  • microorganisms capable of simultaneously producing a high concentration of L-amino acid and riboflavin, such as L-lysine and L-threonine, which have been used as essential animal feeds and are being produced in large quantities industrially It can be expected to reduce the production cost and the production cost of the effect in the industrial development, and can be used as an efficient L-amino acid and vitamin feed additive production strain.
  • Figure 1 shows the competitive use of ribulose-5-phosphate in glycolysis and riboflavin biosynthetic pathways.
  • Figure 2 is a diagram showing the insertion of a strong promoter on the top or inside of rib operon to enhance the activity of the rib operon encoding enzyme group or riboflavin biosynthetic enzyme group.
  • Figure 3 is a diagram showing a pDZ-Pmrb vector prepared to insert the promoter of SEQ ID NO: 5.
  • Figure 4 is a diagram showing the pDZ-lysCP1-ribG vector prepared to insert the promoter of SEQ ID NO: 6.
  • rib operon refers to a ribG gene encoding riboflavin biosynthesis gene group pyrimidine deaminase-reductase (RibG, NCgl1535), and riboflavin synthase subunit alpha.
  • ribC alpha, ribC, NCgl1534) coding ribC gene, TP cyclo hydrolase kinase II (GTP cyclohydrolase II, ribA gene encoding the RibA), and riboflavin new protease subunit beta (riboflavin synthase subunit beta, RibH, NCgl1532 to) the Gene group consisting of ribH gene encoding (hereinafter referred to as 'riboflavin biosynthesis gene group') and ribulose-5-phosphate-3-epimerase (Rpe) involved in the pentose phosphorylation pathway. It means an operon comprising a gene encoding a NCgl1536 rpe) (Fig. 2). Information on each gene of the operon can be obtained from published databases (NCBI GenBank, etc.).
  • L-amino acid may be selected from the group consisting of L-lysine, L-threonine, L-valine, L-isoleucine, L-tryptophan and L-methionine, preferably L- Lysine or L-threonine.
  • the present invention is a microorganism of the genus Corynebacterium having L- lysine or L- threonine production capacity, the L- lysine or L- threonine production is maintained at a high concentration And culturing the microorganism modified to increase the production of riboflavin, thereby simultaneously producing L-lysine or L-threonine, and riboflavin by fermentation, L-lysine or L-threonine, and riboflavin To provide a simultaneous production method.
  • the modified microorganisms while maintaining the production of L-lysine or L-threonine the same as the parent strain, the production of riboflavin increased by about 70 to 80 times, in particular the production of lysine and riboflavin It was confirmed that the ratio of approximately 1: 0.005 or the ratio of L-threonine and riboflavin was approximately 1: 0.03 (Tables 1 to 6). Therefore, L-amino acid and riboflavin produced simultaneously using the microorganism of the present invention was found to be suitable for addition to the feed.
  • the modified microorganism enhances the activity of the enzyme group expressed by rib operon including riboflavin biosynthetic gene group in the microorganism of the genus Corynebacterium having L-amino acid producing ability, thereby maintaining the L-amino acid production in high concentration.
  • the L-lysine or L-threonine production is maintained at a high concentration, while at the same time increasing the production of riboflavin Modified Corey to Simultaneously Produce Modified, L-Lysine or L-Threonine, and Riboflavin Bacterium can be Solarium spp.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium in the present invention may include all strains of the genus Corynebacterium having L-amino acid production capacity, for example Corynebacterium glutamicum ( Coynebacterium glutamicum ) (ATCC 13032), Cory Nebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539), Brevibacterium flavum (ATCC 14067), or Brevibacterium Lactobacillus ( Brevibacterium fermentum ) (ATCC 13869) and the like can be used, but is not limited thereto.
  • Corynebacterium glutamicum Coynebacterium glutamicum
  • Cory Nebacterium ammoniagenes Corynebacterium thermoaminogenes
  • FERM BP-1539 Corynebacterium thermoaminogenes
  • Brevibacterium flavum ATCC 14067
  • Brevibacterium Lactobacillus Brevibacterium fermentum
  • Corynebacterium glutamicum may be used, and specific examples of the Corynebacterium glutamicum include KFCC10881 (Korean Patent No. 0159812) and KFCC11074 (Korean Patent No. 0292299). ), KFCC11001 (South Korea Patent No. 0253424) and KCCM11222P can be used, but is not limited to these examples.
  • a modified microorganism was modified using KFCC10881 as a parent strain, so that the production of L-lysine or L-threonine was maintained at a high concentration while the production of riboflavin was increased.
  • the modified microorganisms modified to increase the production of riboflavin while maintaining the high production of L- threonine was prepared using KCCM11222P as a parent strain.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having the production capacity of L- lysine may be a microorganism to increase the production efficiency of L- lysine.
  • a method for improving the production efficiency of L-lysine a method of amplifying a gene on the L-lysine biosynthetic pathway or modifying a promoter of the gene to increase enzyme activity.
  • Korean Patent No. 0924065 discloses a method of improving the production capacity of L-lysine by introducing one or more copies of the above-mentioned biosynthesis genes, and introducing foreign promoters into the promoters of the genes. It is described.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having the production capacity of L-threonine may be a microorganism which increases the production efficiency of L-threonine.
  • methods commonly applied such as the acquisition of nutritionally demanding mutations, analogue resistant strains or metabolic regulatory mutants, as well as the production of recombinant strains with enhanced activity of L-threonine biosynthetic enzymes can be used by those skilled in the art.
  • the L-threonine biosynthetic enzyme may not be subjected to feedback inhibition, or the recombinant strain may be modified to enhance expression of the L-threonine biosynthetic enzyme gene.
  • properties such as nutritional requirement, analog resistance and metabolic regulatory mutations can be imparted alone or in combination. If the activity of L-threonine biosynthetic enzymes is enhanced, the activity of one or more of these enzymes may be enhanced.
  • genes encoding L-threonine biosynthetic enzymes include the aspartokinase III gene (lysC), the aspartate semialdehyde dehydrogenase gene (asd), and the aspartokinase I gene included in the thr operon. (thrA), homoserine kinase gene (thrB) and threonine synthase gene (thrC), which are enhanced by introducing mutations into or amplifying the gene encoding the enzyme, thereby increasing the intracellular activity of the enzyme. Can be. These can be accomplished using genetic recombination techniques.
  • L-threonine dehydrogenase activity related to threonine degradation may increase L-threonine production.
  • enzymes involved in the corresponding pathways that have a detrimental effect on L-threonine production enzymes involved in the TCA cycle or respiratory chain processes, enzymes regulating gene expression, or enzymes in the biosynthetic system of by-products L-threonine production can be increased by reducing or lacking
  • a method for improving the production efficiency of L-threonine for example, a method of modifying such that the expression of a gene encoding an enzyme on the biosynthetic pathway of L-threonine is enhanced.
  • Enzymes involved in L-threonine biosynthesis include homoserine dehydrogenase, homoserine kinase and threonine synthase, threonine releasing enzyme and the like.
  • An example of another method of conferring or enhancing L-threonine production is known to introduce a variant of homoserine dehydrogenase to release feedback regulation for threonine (US Pat. No. 6,649,379). ).
  • Microorganism of the present invention is a Corynebacterium spp.
  • Microorganism having a high concentration of L-amino acid production by enhancing the activity of the enzyme expressed by rib operon by producing a high concentration of L-amino acid
  • Activity of enzymes expressed by the riboflavin biosynthetic gene family in rib operon which may be a microorganism of the genus Corynebacterium that is modified to increase the production of riboflavin and at the same time produces a high concentration of L-amino acids and riboflavin, or It may be a microorganism fortified.
  • the method of enhancing the activity may include, for example, an increase in the intracellular copy number of a gene group encoding the 'operon or enzyme group' (hereinafter, referred to as an enzyme group), a regulatory sequence of a gene group on a chromosome encoding the enzyme group.
  • a method of introducing a mutation a method of replacing a regulatory sequence of a gene group on a chromosome encoding the enzyme group with a highly active sequence, a gene encoding the enzyme on a chromosome with a gene mutated to increase the activity of the enzyme group
  • It may be any one or more methods selected from the group consisting of a method of replacing and introducing a mutation in a group of chromosomes on the chromosome encoding the group of enzymes so as to enhance the activity of the enzyme group, but is not limited thereto. This can be done by various methods known in the art.
  • the regulatory sequence of the gene on the chromosome encoding the group of enzymes expressed by the rib operon is replaced by a promoter with a strong activity, and the chromosome of the gene encoding RiriG (pyrimidine deaminase-reductase) located at the forefront of the riboflavin biosynthesis gene group.
  • RiriG pyrimidine deaminase-reductase
  • the increase in the intracellular copy number is when the gene encoding the enzyme is operably linked into the chromosome of the cell to stably express the enzyme or the vector containing the gene encoding the enzyme is operatively transformed into the cell. And stably expressing the enzyme.
  • the vector refers to a DNA construct containing a nucleotide sequence of a gene operably linked to a suitable regulatory sequence so that the gene of interest can be expressed in a suitable host cell.
  • a person skilled in the art can increase the number of copies of an enzyme expressed by a rib operon through a vector outside the chromosome or through rib operon inside or outside a chromosome through the effect of increasing the number of gene copies encoding an enzyme expressed by the rib operon inside the chromosomal DNA. It can be predicted that the same effect will be obtained even when the expression level is increased through modification of the expression regulatory region of the gene encoding the enzyme to be expressed or mutation of the gene itself.
  • a microorganism having enhanced activity of an enzyme expressed by rib operon can be prepared by transforming a microorganism of Corynebacterium having L-amino acid production ability with a recombinant vector having a nucleotide sequence.
  • the vector usable in the present invention is not particularly limited and known expression vectors may be used.
  • pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 vectors and the like can be used.
  • pECCG117 was used.
  • the regulatory sequence includes a promoter capable of initiating transcription, any operator for regulating such transcription, a ribosomal binding site (RBS) encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, And sequences that control the termination of transcription and translation.
  • an improved or heterologous promoter having a base substitution mutation originating from its own promoter may be linked.
  • the heterologous promoter may include a pcj7 promoter, a lysCP1 promoter, and an EF-Tu promoter. , groEL promoter, aceA promoter, aceB promoter and the like, it is preferable to use a pcj7 promoter or lysCP1 promoter, which is a promoter derived from Corynebacterium, and most preferably, the lysCP1 promoter can be used.
  • the "lysCP1 promoter" of the present invention is an improved promoter through nucleotide sequence substitution of a gene encoding aspartate kinase and aspartate semialdehyde dehydrogenase, and the activity of glycoenzyme through increased expression of aspartate kinase gene. It represents a powerful promoter which can improve about 5 times of wild type (WO 2009/096689).
  • the lysCP1 promoter may consist of the lysCP1 promoter sequence and the 1 to 353 nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 including a portion of the lysC-asd gene (SEQ ID NO: 6).
  • the vector of the present invention was designed to introduce the improved promoter lysCP1 containing the nucleotide substitution mutation of SEQ ID NO: 5 or the improved promoter lysCP1 of the lysC gene having strong expression inducing activity of SEQ ID NO: 6 into the chromosome of the host cell.
  • a method for overexpressing a gene of interest there are a method of improving a promoter to increase the expression level by substituting some bases of a unique promoter sequence with another base, and a method of replacing a promoter of another gene having a large expression level (WO 2009 / 096689).
  • the term "transformation” refers to an overall action of introducing a gene into a strain of genus Corynebacterium that is a host cell so that the gene can be expressed in the host cell.
  • the promoter and the gene include DNA and RNA as polynucleotides.
  • the gene may be introduced in any form as long as it can be expressed by being introduced into a host cell.
  • the gene may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct that contains all the elements necessary for the expression of the gene.
  • the expression cassette typically comprises a promoter, transcription termination signal, RBS and translation termination signal operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell in itself or in the form of a polynucleotide structure, and may be operably linked to a sequence required for expression of the host cell.
  • Methods for transforming a vector of the present invention include any method for introducing nucleic acids into cells, and can be carried out by selecting appropriate standard techniques as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method;
  • a host having high DNA introduction efficiency and a high expression efficiency of the introduced DNA it is preferable to use a host having high DNA introduction efficiency and a high expression efficiency of the introduced DNA.
  • a microorganism of Corynebacterium may be used.
  • Corynebacterium glutamicum, specifically Corynebacterium glutamicum KFCC10881, can be used.
  • Microorganisms having L-threonine production capacity can be used without limitation microorganisms that can produce L-threonine, preferably KFCC10881-THR can be used, which may be deposited with the accession number KCCM11222P.
  • the upstream promoter on the chromosome encoding the group of enzymes expressed by the rib operon may be replaced by the promoter of SEQ ID NO: 5 or the upstream promoter of the ribG gene.
  • the average concentration of L-lysine was not changed, but it was confirmed that the average concentration of riboflavin increased by about 61 times (Table 2), ribG
  • riboflavin increased 73-fold (Table 3)
  • riboflavin increased 66-fold by increasing the rib operon copy number (Table 4).
  • upstream of the gene encoding Rpe ribulose-5-phosphate-3-epimerase located at the foremost rib operon Insert a strong promoter into the riboflavin biosynthetic gene family or insert a strong promoter upstream of the gene encoding the riboflavin pyrimidine deaminase-reductase (RibG) gene to encode the ribooperon-encoding or riboflavin biosynthetic enzyme family.
  • Rpe ribulose-5-phosphate-3-epimerase
  • riboflavin can be modified to produce high concentrations with L-lysine or L-threonine.
  • the variation of the -10 to -16 th second nucleotide sequence of rpe located in the upstream of the rib operon of strain Accession No. KCCM11223P was confirmed that the variation of the -10 to -16 th second nucleotide sequence of rpe located in the upstream of the rib operon of strain Accession No. KCCM11223P.
  • SEQ ID NO: 5 expected region of the rib operon promoter of the deposited strain
  • the production of riboflavin was maintained while the production of the L-lysine was maintained. It was confirmed that the increase was similar to the KCCM11223P strain (Table 2).
  • riboflavin productivity was predicted to be increased through the strengthening of the rib operon, and riboflavin production was approximately 73 times higher than that of the parent strain as a result of introducing a strong promoter upstream of ribG , the most upstream of the riboflavin biosynthesis gene group in the rib operon. It confirmed that it increased (Table 3). In addition, even when the copy number of rib operon was increased, the effect of increasing riboflavin production similar to the case of using the strong promoter was confirmed (Table 4).
  • L- threonine producing ability of the promoter upstream rpe the parent strain the production of L- threonine, even if the introduction of a strong promoter in the upstream result and ribG replacing a promoter of SEQ ID NO: 5 of the present invention is similar to While maintaining the production of riboflavin was confirmed to increase approximately 60 to 70 times (Table 6). From this, it was confirmed that the modified Corynebacterium microorganism of the present invention can be modified to maintain the production of L-amino acid at a high concentration and to increase the production of riboflavin, and at the same time to produce a high concentration of L-amino acid and riboflavin. .
  • the mutant Corynebacterium microorganisms that produce L-lysine and riboflavin at the same time induce random mutations in Corynebacterium glutamicum having a high concentration of L-lysine production, thereby producing L-lysine Accession numbers maintained at high concentrations and modified to increase the production of riboflavin Corynebacterium glutamicum of KCCM11223P.
  • the L-lysine production is maintained at a high concentration and simultaneously Corynebacterium glutamicum of Accession No. KCCM11220P, KCCM11221P or KCCM11223P, modified to increase the production of riboflavin.
  • the inventors found a colony with a dark yellow cell color during random mutagenesis in order to increase the carbon flow on the octasaccharide phosphorylation pathway of the L-lysine producing strain, and the yield of the L-lysine of the mutant was similar. It was confirmed that the productivity of riboflavin increased approximately 60 times while maintaining (Table 1). The inventors have determined that this feature of the mutant strains would be useful in the production of feed additives in which amino acids and riboflavin should be supplied at a constant rate.
  • mutant strain Corynebacterium glutamicum CA01-2183, KFCC10881-YC, and on November 11, 2011 to the Korea Microorganism Conservation Center (Hongje 1-dong Yurim Building, Seodaemun-gu, Seoul, Korea) Deposited with accession number KCCM11223P.
  • mutant strains can also be collectively referred to as KFCC10881-YC.
  • the present inventors named the mutant strains that introduced the Pmrb promoter into the rib operon promoter of the parent strain KFCC10881, Corynebacterium glutamicum CA01-2162, KFCC10881 :: Pmrb, and on November 11, 2011, It was deposited with the accession number KCCM11221P at the Microbial Preservation Center (Yurim Building, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea).
  • the mutant strain can also be collectively referred to as KFCC10881 :: Pmrb.
  • strains in which lysCP1 was introduced at the top of the start codon of the ribG gene of the parent strain KFCC10881 were named Corynebacterium glutamicum CA01-2161 and KFCC10881 :: lysCP1_ribG.
  • the mutant strain is also collectively referred to as KFCC10881 :: lysCP1_ribG, and was deposited on November 11, 2011 with the accession number KCCM11220P at the Korea Microorganism Conservation Center (Hongje 1-dong Yurim Building, Seodaemun-gu, Seoul, Korea).
  • the ratio of L-amino acid and riboflavin in the culture solution produced at the same time by the method of the present invention is 1: 0.0001 to 0.1, more preferably when the L-amino acid is L-lysine, most preferably 1: 0.001 to 0.05, most preferably 1: 0.003 to 0.01.
  • the L-amino acid in the case of L-threonine the ratio of L-threonine and riboflavin is more preferably 1: 0.001 to 0.1, and most preferably 1: 0.005 to 0.05.
  • Cultivation of the microorganism of the genus Corynebacterium can be carried out by various culture methods known in the art in a suitable medium (Chmiel, BipRIStechnik 1. Einbowung in die Biovonstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991; Storhas, Bioreaktoren und periphere bamboo , Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994).
  • Examples of the culturing method include batch, continuous and fed-batch cultivation.
  • the fed-batch culture includes, but is not limited to, injection batch and repeated injection batch culture.
  • a medium that can be used for culture may be selected according to the culture method and strain, a suitable medium known in the art ("Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington DC, USA, 1981).
  • the medium used in the present invention includes various carbon sources, nitrogen sources and trace element components. Sucrose, glucose, fructose, fats, fatty acids, alcohols, organic acids, and the like may be used as the carbon source in the medium for culturing Corynebacterium microorganisms.
  • carbon sources that can be used include molasses, glucose, lactose, fructose, maltose, starch, carbohydrates such as cellulose, soybean oil, sunflower oil, castor oil, fats such as coconut oil, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid Fatty acids such as, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid, and various amounts of appropriate carbon sources can be used.
  • Nitrogen sources include organic nitrogen sources and urea, such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, and soybean meal hydrolysate, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. These nitrogen sources can be used alone or in combination.
  • the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts as a source of phosphoric acid. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate.
  • amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included. These media or precursors can be added batchwise or continuously to the culture.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C. The incubation period can continue until the desired amount of L-amino acid is obtained, preferably 10 to 160 hours.
  • the method of the present invention may further comprise the step of granulating a culture fermentation broth comprising the L-amino acid and riboflavin.
  • the fermentation broth may include cell sludge, or the cell sludge may be removed.
  • the method may further include removing cell sludge from the culture fermentation broth comprising L-lysine or L-threonine and riboflavin.
  • the fermentation broth contains cell sludge, it does not filter to remove the cell sludge, and it is possible to produce granules having low hygroscopicity, good flowability, high apparent density, and amino acid content control without the addition of a separate hygroscopic agent.
  • the granulation method may be applied to, for example, the method described in Republic of Korea Patent No. 0838200 or the method described in Republic of Korea Patent No. 0338578.
  • a coating agent such as excipients or moisture absorption inhibitor, but is not limited thereto.
  • the cell sludge can be separated from the fermentation broth by removing L-amino acid and riboflavin by centrifugation, filtration, ion exchange chromatography and crystallization. Specifically, the fermentation broth may be centrifuged at low speed to remove cell sludge, and the supernatant may be further separated through ion exchange chromatography, but is not limited thereto.
  • the present invention by inducing a random mutation in Corynebacterium glutamicum having a high concentration of L- lysine production capacity, the L- lysine production is maintained at a high concentration, modified to increase the production of riboflavin
  • a variant Corynebacterium glutamicum microorganism of Accession No. KCCM11223P Provided is a variant Corynebacterium glutamicum microorganism of Accession No. KCCM11223P.
  • the microorganism is as described above.
  • the present invention is to enhance the activity of a group of enzymes expressed by rib operon including riboflavin biosynthesis gene group in microorganisms of the genus Corynebacterium having L-lysine or L-threonine production capacity , L-lysine or L- threonine production is maintained at a high concentration, and at the same time modified to increase the production of riboflavin, L- lysine or L- threonine, and mutant corynebacterium to produce riboflavin at the same time It may be a genus microorganism.
  • microorganisms The activity of microorganisms, enzyme groups, microorganisms of the genus Corynebacterium is as described above.
  • the present invention a) In a microorganism of the genus Corynebacterium having L-lysine or L-threonine production capacity, the L-lysine or L-threonine production is maintained at a high concentration and the microorganisms modified to increase the production of riboflavin Culturing the same to produce L-lysine or L-threonine, and riboflavin simultaneously by fermentation; And b) granulating a fermentation broth comprising L-lysine or L-threonine and riboflavin of step a).
  • the L-amino acid may be L-lysine or L-threonine.
  • the modified microorganism is as described above.
  • the granules may be granules prepared by further comprising the step of removing the bacterial sludge in the fermentation broth comprising L- lysine or L- threonine, and riboflavin produced in step a). That is, the granules of the present invention may or may not include cell sludge as described above.
  • the ratio of L-lysine or L-threonine: riboflavin in the granule preparation may be 1: 0.0001 to 0.01, as described above.
  • Granules of the present invention refers to a granulated form of the formulation to overcome the disadvantages of dust generation and product loss in the conventional powder form.
  • the present invention is a) L- lysine or L- threonine production in Corynebacterium genus microorganisms, L- lysine or L- threonine production is maintained at a high concentration, riboflavin Culturing the microorganisms modified to increase the amount of L-lysine or L-threonine, and simultaneously producing riboflavin by fermentation; And b) removing the cell sludge from the fermentation broth comprising L-lysine or L-threonine, and riboflavin of step a).
  • the ratio of L-lysine or L-threonine: riboflavin in the inclusion formulation may be from 1: 0.0001 to 0.01, as described above.
  • the present invention provides a feed or feed additive comprising the granules, L-lysine or L-threonine, and riboflavin-containing preparations.
  • the high concentrations of L-lysine or L-threonine and riboflavin produced by the method of the present invention in particular, the ratio of lysine and riboflavin is approximately 1: 0.005 or the ratio of L-threonine and riboflavin This consisted approximately 1: 0.03 (see Tables 1-6).
  • the requirement of L-lysine in animal feed is about 1-5 g / kg
  • L-threonine is about 0.6-3.3 g / kg
  • riboflavin is about 2-4 mg / kg, which is about 0.1% of L-lysine.
  • L-amino acid and riboflavin produced simultaneously by the method of the present invention was found to be suitable for addition to the feed.
  • the L-amino acid may be L-lysine or L-threonine.
  • the ratio of L-lysine or L-threonine: riboflavin in the feed or feed additive may be 1: 0.0001 to 0.01, as described above.
  • the feed of the present invention may be prepared by separately preparing the L-amino acid and riboflavin in the form of a feed additive, and mixing the feed, or by directly adding the feed.
  • L-amino acid and riboflavin in the feed of the present invention may be liquid or dried, preferably in the form of a dried powder. Drying methods may be, but not limited to, ventilation drying, natural drying, spray drying and freeze drying.
  • the animal feed may further include conventional additives to increase the shelf life of the feed in addition to the L-amino acid and riboflavin of the present invention.
  • the feed additive of the present invention may further be added to other non-pathogenic microorganisms.
  • Microorganisms that may be added include lactobacillus, which has physiological activity and organic degradability under anaerobic conditions such as Bacillus subtilis , Bacillus subtilis , which can produce proteolytic enzymes, lipolytic enzymes and sugar converting enzymes, and bovine stomach. strain, increasing the weight of livestock, such as increasing the milk yield of milk (Aspergillus oryzae) on Aspergillus duck characters showing the effect of increasing the absorption of digested food fungi (J AnimalSci 43 (Lactobacillus sp. ): 910-926, 1976 ) And yeast (J Anim Sci 56: 735-739, 1983) such as Saccharomyces cerevisiae .
  • the feed containing L-amino acid and riboflavin includes grains, fruit fruits, food processing by-products, algae, fiber oil, pharmaceutical by-products, oils, starches, gourds, grain by-products, and the like.
  • Animals include, but are not limited to, protein, minerals, oils, minerals, oils, unicellular protein, zooplankton, and leftovers.
  • Feed additives including L-amino acid and riboflavin in the present invention include binders, emulsifiers, preservatives and the like added to prevent degradation of quality, amino acids, vitamins, enzymes, probiotics, added to the feed for increased utility Flavoring agents, nonprotein nitrogen compounds, silicates, buffers, colorants, extractants, oligosaccharides, and the like, in addition to these may include a feed mixture, but is not limited thereto.
  • KFCC10881 (Korean Patent No. 0159812) was used as a parent strain to induce artificial mutation by N-methyl-N-nitro-N-nitroguanidine (NTG), and then contained gluconic acid at a concentration of 20 g / l.
  • NTG N-methyl-N-nitro-N-nitroguanidine
  • Strains forming colonies were isolated at a faster rate than the NTG untreated control while incubating in a composite plate medium.
  • the average diameter of colonies formed at 60 hours of culture in the NTG untreated control group was about 0.5 mm, whereas colonies that reached 1 mm in diameter were formed in the NTG treatment group even after about 40 hours of culture. Among them, unlike the control group, a dark yellow colony was found, and a mutation of a new trait was expected.
  • the strain was named Corynebacterium glutamicum CA01-2183 and KFCC10881-YC. I tried to clarify.
  • the mutant strain is also collectively referred to as KFCC10881-YC, which was deposited on November 11, 2011 at the Korea Microorganism Conservation Center (Hongje Building, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea) with accession number KCCM11223P.
  • Gluconic acid 20 g (NH 4 ) 2 SO 4 50 g, peptone 10 g, yeast extract 5 g, urea 1.5 g, KH 2 PO 4 5 g, K 2 HPO 4 10 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g , 100 ⁇ g biotin, 1000 ⁇ g thiamine hydrochloride, 2000 ⁇ g calcium-pantothenic acid, 2000 ⁇ g nicotinamide, 20 g agar (based on 1 liter of distilled water)
  • Example 1 To determine the characteristics of the KFCC10881-YC strain prepared in Example 1 was cultured in the following manner to compare the lysine production capacity and analyzed the culture components.
  • Each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium and shaken at 200 rpm for 20 hours at 30 ° C.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of production medium was then inoculated with 1 ml of the seed culture and shaken at 200 rpm for 72 hours at 30 ° C.
  • the composition of the seed medium and the production medium is as follows.
  • Glucose 20 g Peptone 10 g, Yeast extract 5 g, Urea 1.5 g, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine HCl 1000 ⁇ g, Calcium- 2000 ⁇ g pantothenic acid, 2000 ⁇ g nicotinamide (based on 1 liter of distilled water)
  • the present inventors determined that the causative agent of color development was included in the culture solution and analyzed the concentrations of carotenoids and riboflavin that affect the color development of microorganisms. As a result, the concentration of riboflavin in the culture medium was significantly different from the control, and no significant difference was found in the carotenoids.
  • concentrations of L-lysine and riboflavin analyzed using HPLC are shown in Table 1 below.
  • Example 3 Confirmation of mutation of rib operon upstream promoter of high concentration riboflavin producer and preparation of vector for chromosomal introduction of said variant promoter (Pmrb)
  • Chromosomes related to riboflavin biosynthesis of the genus KFCC10881-YC in order to search for sequence mutations at the fundamental gene level that caused color change and increased riboflavin production capacity of KFCC10881-YC prepared in Example 1 above The base sequence of the site was determined and confirmed based on the NIH GenBank of the National Institutes of Health.
  • primers having an EcoR I restriction enzyme site inserted into the 5 'end and a Sal I restriction enzyme site inserted into the 3' end were synthesized, and a chromosome of KFCC10881-YC was templated.
  • the PCR amplified the Pm-rpe gene fragment of about 650 bp, including 350 bp of rib operon promoter expected interval.
  • PCR conditions were modified for 5 minutes at 94 °C, 94 °C 30 seconds denaturation, 56 °C 30 seconds annealing, 72 °C 40 seconds polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out for 7 minutes at 72 °C.
  • the primer used for this is shown below.
  • the DNA fragments amplified by PCR were treated with restriction enzymes EcoR I and Sal I to obtain respective DNA fragments, which were then linked to a pDZ vector for introducing chromosomes with restriction enzymes EcoR I and Sal I ends (Korean Patent No. 2009-0094433). It was then transformed into E. coli DH5 ⁇ and plated in LB solid medium containing kanamycin (25 mg / L). Colonies transformed with the vector into which the target gene was inserted by PCR were selected, and plasmids were obtained by using a commonly known plasmid extraction method, and the plasmid was named pDZ-Pmrb (FIG. 3).
  • the vector pDZ-Pmrb prepared in Example 3 was transformed into L-lysine producing strain Corynebacterium glutamicum KFCC10881 by homologous chromosome recombination. Thereafter, the strain into which the rib operon promoter mutation on the chromosome was introduced was selectively isolated by colony color change and cultured in the same manner as in Example 2, and the concentrations of L-lysine and riboflavin recovered therefrom were analyzed (Table 2). .
  • the strain into which the rib operon promoter mutation was introduced was named Corynebacterium glutamicum CA01-2162, KFCC10881 :: Pmrb.
  • the mutant strain is also collectively referred to as KFCC10881 :: Pmrb, and was deposited on November 11, 2011 with the accession number KCCM11221P at the Korea Microbial Conservation Center (Hongje 1-dong Yurim Building, Seodaemun-gu, Seoul, Korea).
  • the KFCC10881 As a result, as shown in the results of Table 2, compared to the control KFCC10881 (Experimental Group 3) having a wild-type rpe gene intrinsic promoter, the KFCC10881 :: Pmrb introduced promoter Pmrb having two base substitution mutations (Experimental Group 4). The average concentration of L-lysine was not changed, but the average concentration of riboflavin was increased by about 61 times.
  • Example 5 In rib operon ribG Vector production for introduction of powerful promoter (LysCP1) upstream
  • riboflavin biosynthesis genes except the rpe genes Corynebacterium in a strong promoter of Solarium derived on the front side of the rib biosynthetic genes ribG gene (SEQ ID NO: 4) riboflavin biosynthetic expression of the gene family by connecting the top of the initiation codon of A recombinant vector was constructed to induce an increase in amount.
  • the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum KFCC10881 was used as a template, and the EcoRI restriction enzyme site at the 5 'end and the XbaI restriction enzyme site at the 3' end were used.
  • the primers (SEQ ID NOs: 9 and 10) designed to make were synthesized. The synthesized primers were PCR to obtain DNA fragments containing 300 bp upstream of the start codon of the ribG gene.
  • primers designed to have Xba I and Nde I restriction enzyme sites at the 5 'end and Sal I restriction enzyme sites at the 3' end were synthesized, and 300 containing the initiation codon of the ribG gene was obtained by PCR. bp DNA fragments were obtained. PCR conditions were modified for 5 minutes at 94 °C, 94 °C 30 seconds denaturation, 56 °C 30 seconds annealing, 72 °C 30 seconds polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes.
  • pDZ vectors were linked with DNA fragments obtained by treatment with restriction enzymes Sal I and EcoR I to prepare pDZ-ribG vectors.
  • the primer sequence used for this PCR is shown below.
  • a primer designed to amplify the lysCP1 promoter (SEQ ID NO: 6) derived from Corynebacterium glutamicum, having an Xba I restriction enzyme site inserted at the 5 'end, and a Nde I restriction enzyme site at the 3' end (SEQ ID NO: 6) Nos. 13 and 14) were synthesized, and a promoter region of about 400 bp was amplified by PCR using chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum strain as a template.
  • PCR conditions were modified for 5 minutes at 94 °C, 94 °C 30 seconds denaturation, 58 °C 30 seconds annealing, 72 °C 30 seconds polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes.
  • the pDZ-ribG vector was linked with DNA fragments obtained by treatment with restriction enzymes Xba I and Nde I to prepare a pDZ-lysCP1_ribG vector (FIG. 4).
  • the primer sequence used for this PCR is shown below.
  • Example 6 ribG Comparison of Lysine and Riboflavin Production Capacity of Strains with a Strong Promoter (LysCP1) Upstream
  • the vector pDZ-lysCP1_ribG prepared in Example 5 was transformed into L-lysine producing strain Corynebacterium glutamicum KFCC10881 by using an electric pulse method, and a strain in which the ribG gene native promoter on the chromosome was substituted with lysCP1.
  • KFCC10881 By selective separation, KFCC10881 :: lysCP1_ribG, which simultaneously produces L-lysine and riboflavin, was obtained.
  • This strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the concentrations of L-lysine and riboflavin in the culture were analyzed (Table 3).
  • the KFCC10881 :: lysCP1_ribG strain was named Corynebacterium glutamicum CA01-2161, KFCC10881 :: lysCP1_ribG.
  • the mutant strain is also collectively referred to as KFCC10881 :: lysCP1_ribG, and was deposited on November 11, 2011 with the accession number KCCM11220P at the Korea Microorganism Conservation Center (Hongje 1-dong Yurim Building, Seodaemun-gu, Seoul, Korea).
  • riboflavin biosynthetic operon using a heterologous promoter could significantly increase the amount of riboflavin production without affecting lysine production, and the stronger the expression-inducing activity of the promoter, the greater the riboflavin production by overexpression of the riboflavin biosynthetic gene family. It can be seen that the ability increases.
  • the plasmid containing rib operon was introduced into the KFCC10881 strain to increase the number of copies of riboflavin biosynthesis genes.
  • primers in which the Xba I restriction enzyme site was inserted at the 5 'end and primers (SEQ ID NOs. 15 and 16) having the same restriction enzyme site at the 3' end were synthesized, and the chromosome of KFCC10881 was used as a template.
  • PCR approximately 4500 bp rib operon including a promoter site was amplified. PCR conditions were modified for 5 minutes at 94 °C, 94 °C 30 seconds denaturation, 56 °C 30 seconds annealing, 72 °C 4 minutes polymerization was repeated 30 times, and then polymerization was carried out at 72 °C 7 minutes.
  • the primer sequence used for this PCR is shown below.
  • DNA fragments amplified by PCR were treated with restriction enzyme Xba I to obtain DNA fragments, which were then linked to a pECCG117 vector having a restriction enzyme Xba I terminal, transformed into E. coli DH5 ⁇ , and an LB solid medium containing kanamycin (25 mg / l). Smeared. Colonies transformed with the vector into which the desired gene was inserted were selected by PCR, and then plasmids were obtained by using a commonly known plasmid extraction method, and the plasmid was named pECCG117-rib.
  • the prepared vector pECCG117-rib was introduced into the KFCC10881 strain using an electric pulse method, followed by culture in the same manner as in Example 2, and the concentrations of L-lysine and riboflavin in the culture solution were analyzed (Table 4).
  • the riboflavin production could be significantly increased without affecting the production of lysine at all.
  • NTG untreated control showed resistance to AHV of 1 to 3 g / l at 72 hours of culture, but colonies were formed at NTG 6g / l at the same time of culture.
  • NTG untreated control showed resistance to AHV of 1 to 3 g / l at 72 hours of culture, but colonies were formed at NTG 6g / l at the same time of culture.
  • L-threonine production capacity was cultured in the following way to analyze the production of L-threonine in the culture medium.
  • Each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium and shaken at 200 rpm for 20 hours at 30 ° C.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of production medium was then inoculated with 1 ml of seed culture and shaken at 200 rpm for 48 hours at 30 ° C.
  • the composition of the seed medium and the production medium is as follows.
  • Glucose 20 g Peptone 10 g, Yeast extract 5 g, Urea 1.5 g, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine HCl 1000 ⁇ g, Calcium- 2000 ⁇ g pantothenic acid, 2000 ⁇ g nicotinamide (based on 1 liter of distilled water)
  • KFCC10881-THR Corynebacterium glutamicum CA01-2182
  • the mutant strain is also referred to simply as KFCC10881-THR, which was deposited on November 11, 2011 at the Korea Microorganism Conservation Center (Hongje 1-dong Yurim Building, Seodaemun-gu, Seoul, Korea) with accession number KCCM11222P.
  • the L-threonine production capacity of KFCC10881-THR is as follows (Table 5).
  • Table 5 shows the average concentration of L- threonine of KFCC10881, a control group of Experiment 9, and experimental group 10 shows the average concentration of L-threonine of KFCC10881-THR.
  • the vector pDZ-Pmrb prepared in Example 3 and the pDZ-lysCP1_ribG prepared in Example 5 were transformed into KFCC10881-THR, the L-threonine producing strain prepared in Example 8, respectively, by using an electric pulse method. and, the native promoter rpe genes on the chromosome of the strain or ribG gene-specific promoter substituted with Pmrb selectively separating a strain substituted with lysCP1 were cultured in the same manner as in example 7, and used a number of times therefrom L- Leo Nin and The concentration of riboflavin was analyzed (Table 6).
  • wild-type and rpe ribG gene promoter compared to the control group has a unique KFCC10881-THR (group 11)
  • a promoter is introduced Pmrb having two base substitution mutations KFCC10881 :: Pmrb ( Experimental group 12) and KFCC10881-THR :: lysCP1_ribG overexpressing RibG using lysCP1 promoter (Experimental group 13) showed no change in the average concentration of L-threonine, but the average concentration of riboflavin was about 56 times and 66, respectively. The belly was confirmed to increase.

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Abstract

본 발명은 고농도의 L-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 방법 및 L-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물에 관한 것으로, 구체적으로 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써 변형된 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 변이형 미생물, 상기 미생물을 이용한 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈의 동시 생산 방법, 상기 변이형 미생물 배양액으로부터 제조한 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 제제 또는 과립제제, 사료 및 사료첨가제를 제공하는 것에 관한 것이다.

Description

Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
본 발명은 고농도의 L-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 방법 및 L-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물에 관한 것이다.
사료에 가장 많이 이용되는 원료 사료인 옥수수, 수수, 보리, 밀과 같은 곡류 사료는 일반적으로 아미노산 요구량의 30~60%를 공급한다. 그러므로 나머지 요구량을 충족시키고 필수 아미노산 간의 균형유지를 위해서는 아미노산의 추가 공급이 필요하다. 또한, 모든 사료에는 일정 수준의 비타민이 포함되어 있는데, 어떤 비타민이든지 충분한 양을 공급하지 않으면 결핍증상이 일어날 수 있다. 따라서, 비타민도 아미노산과 마찬가지로 추가 공급을 해야 적정한 함량을 유지할 수 있다. 아미노산은 사료성분 중 공급원의 가격이 가장 비싼 원료로, 상기 아미노산의 효율적인 공급이 전체 생산성을 좌우하는 요소 중 하나라고 할 수 있다. 특히, 상기 아미노산 중 L-라이신 및 L-쓰레오닌은 가축의 성장에 대해 제1 제한 필수아미노산이 되는 경우가 빈번하다. 상기 L-라이신 및 L-쓰레오닌은 미생물을 이용한 발효법으로 생산되는데, 상기 발효법으로 생산된 L-라이신 및 L-쓰레오닌은 정제 및 농축된 후, 사료에 첨가된다. L-라이신의 발효에 쓰이는 미생물은 코리네형 미생물(Corynebacterium sp.) 또는 에세리키아 속 균주(Escherichia. coli)가 대표적인데, 상기 미생물을 유전자 조작함으로써 L-라이신을 생산한 예들이 많이 보고되고 있다(대한민국 등록특허 제10-0930203호, 제10-0924065호, 미국 특허 제7,871,801호).
현재, 유전공학적인 방법으로 미생물을 개량함으로써 L-라이신 또는 L-쓰레오닌의 생산량을 늘리기 위한 노력이 지속적으로 이루어지고 있으나, 산업의 발달에 따라 더욱 많은 양의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌의 공급이 요구되고 있기 때문에 보다 효과적이고 경제적으로 L-라이신 또는 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위한 노력이 계속되고 있다.
비타민은 비록 매우 적은 양이 요구되지만 가축의 정상적인 대사기능, 성장, 번식 기능 및 건강유지를 위해 공급되어야 할 필수적인 유기 화합물이다. 상기 비타민 중 리보플라빈(B2)은 다양한 종의 미생물과 모든 식물에서 생합성 되는 수용성 비타민이나, 인간을 포함한 척추동물의 체내에서는 생합성 되지 않는 특성이 있어, 외부로부터의 공급이 필요하다. 상기 리보플라빈이 결핍되면 돼지의 경우, 무발정과 모돈의 번식장애를 유발하고(Biol. Reprod. (1981) 25:659-665, J. Anim. Sci. (1984) 59:1567-1572), 닭의 경우, 신경, 특히 좌골 및 상완 신경에 문제를 일으키며 배아(embryo) 발육에 나쁜 영향을 미쳐 배아가 사망 할 수도 있다(한국사양표준, 가금, 2002, 농림부). 따라서, 상기 리보플라빈은 가축성장을 위한 사료 첨가제로서 사용되어 왔으며, 특히 농축된 상태의 리보플라빈은 그 자체가 사료로 사용되어 왔다.
현재 리보플라빈의 생산량은 전세계적으로 연간 6000톤 규모이며, 그 중 75% 정도가 사료 첨가제로 사용되고, 나머지가 식품 및 의약용으로 사용되고 있다. 리보플라빈을 생산하는 방법으로는 화학적 합성법과 미생물을 이용한 발효법이 병용되고 있다. 화학적 합성법은 대개 D-리보오스와 같은 전구물질을 이용하여 다단계 공정을 거쳐 고순도의 리보플라빈을 생산하는 방법이다. 상기 화학적 합성법은 그 출발물질이 고가이기 때문에, 생산비용이 비싼 단점이 있어 미생물을 이용한 발효법이 개발되었다. 미생물을 이용한 발효법은 자연으로부터 리보플라빈을 생산하는 미생물을 분리하거나 또는 리보플라빈이 과생산되도록 유전공학적 방법 또는 화학적-물리적 방법으로 변이를 유도한 미생물을 적절한 조건으로 배양한 다음 발효액으로부터 리보플라빈을 분리하는 방법이다. 최근에는 발효법이 원가 경쟁력이 있고, 친환경적이어서 주로 연구되며, 상기 발효법으로 생산된 리보플라빈은 정제 및 농축된 후, 사료에 첨가된다.
대표적으로 효모인 캔디다 파마타(Candida famata)를 이용한 리보플라빈의 생산방법이 개시되어 있으며(미국특허 제5,231,007호), 리보플라빈의 산업적 생산에 있어서는, 자낭균류인 에레모테시움 에쉬비(Eremothecium ashbyii)와 에쉬비아 고시피(Ashbya gossypii; 국제특허공개 제9526406호)가 가장 많이 사용되는 균주이다. 세균으로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 보고되었는데, 상기 세균을 유전자 조작함으로써 리보플라빈을 생산한 예들이 많이 보고되었으며(유럽특허 제0821063호, 미국특허 제5,837,528호, 미국특허 제5,334,510호), 본 발명자들 또한 상기 세균을 이용하여 리보플라빈을 생산한 바 있다(대한민국 등록특허 제10-0542573호). 또한, 리보플라빈 생합성 관련 효소 유전자가 과발현되도록 조작하여 4.5 g/L의 리보플라빈을 생산한 예가 보고된 바도 있다(J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (1999), 22:8-8).
동물사료에서 각 성분의 요구량은 L-라이신은 약 1~5 g/kg, L-쓰레오닌은 약 0.6~3.3 g/kg이며, 리보플라빈은 약 2~4 mg/kg으로 L-라이신의 약 0.1% 수준으로 공급된다(NRC. 1998. National Academy of Sciences- National Research Council, Washington, D.C.)). 그러나 상기 L-라이신 및 리보플라빈은 각각 발효법으로 따로 생산되고, 사료에 첨가되기 전에 정제 및 농축과정을 거치며, 사료 배합 공장으로 각각 이송되기 때문에 사료 원가가 높게 책정될 수 있다. 만약, L-라이신 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물의 리보플라빈의 농도가 L-라이신 농도의 약 0.1% 수준에 도달한다면, 상기 미생물의 배양액을 첨가하므로 사료 첨가제의 기준 요구량을 만족시킬 수 있을 것이나, 아직까지 이러한 시도에 대한 보고는 없었다.
코리네박테리움 속 미생물의 경우, 리보플라빈은 오탄당인산화경로(pentose-phosphate path way, PPP) 산물 중 하나인 리불로오스-5-포스페이트(ribulose 5-phosphate, Ru5P)와 퓨린경로(purime metabolism)의 산물 중 하나인 구아노신 트리포스페이트(Guanosine triphosphate, GTP)로부터 2가지 경로를 통해 생합성 되는데, GTP 싸이클로하이드롤라아제 II(GTP cyclohydrolase II, RibA) 유전자, 피리미딘 디아미나아제-리덕타아제(pyrimidine deaminase-reductase, RibG) 유전자, 리보플라빈 신테아제 서브유닛 알파(Riboflavin synthase subunit alpha, RibC) 유전자 및 리보플라빈 신테아제 서브유닛 베타(riboflavin synthase subunit beta, RibH) 유전자로 이루어진 유전자군(이하 '리보플라빈 생합성 유전자군')이 이에 관여한다. 상기 리보플라빈 생합성 유전자군은 오탄당 인산화 경로에 관여하는 리불로오스-5-포스페이트-3-에피머라제(ribulose-5-phosphate-3-epimerase, Rpe, NCgl1536)와 함께 오페론(rib 오페론)을 이루고 있는데, 상기 Rpe 및 상기 RibA는 모두 Ru5P를 기질로 사용하는 경쟁관계에 있다(도 1). 즉, Rpe는 Ru5P로부터 자일로오스-5-포스페이트(D-Xylose-5-phosphate)를 생합성 함으로써 오탄당 인산화 과정에서 생성된 대사산물을 다시 해당과정으로 유입시키는 중간반응을 매개하고, RibA는 리보플라빈 생합성의 중간단계 물질인 3,4-디히드록시-2-부타논-4-포스페이트(3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate)를 생합성 한다(KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, [//www.genome.jp/kegg]).
코리네박테리움에서 오탄당 인산화 경로는 라이신 생합성에 수반되는 주된 환원력(NADPH)의 공급원으로서, 이를 통해 이루어지는 NADPH의 재생과 L-라이신 생합성간의 직접적인 연관관계는 종래의 문헌들에 의해서 다수 보고된 바 있다(Wittmann and Heinzle, Microbiol 68:5843-5849, 2002; Marx et al., J Biotechnol 104:185-197, 2003; Ohnishi et al., Microbiol Lett 242:265-274, 2005).
상기 오탄당 인산화 경로는 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH), 6-포스포글루코노락토나제(6-phosphogluconolactonase), 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD), Rpe, 리보오스-5-포스페이트 이소머라제(ribose-5-phosphate isomerase, RpiA), 트랜스케톨라제(transketolase) 및 트랜스알돌라제(transaldolase)가 순차적인 반응을 촉매함으로서 이루어지며 이 과정을 통해 생성된 최종대사산물은 다시 해당과정으로 유입된다.
이러한 오탄당 인산화 경로를 강화시키기 위한 연구 결과들로서, 유럽특허 EP 01941065호(2001.06)와 EP 02781875호(2002.12)에는 상기 효소들 중 NADPH를 직접적으로 생산하는 효소들의 음성피드백 억제 내성을 갖는 돌연변이가 개시되어 있으며, 이들과 더불어 트랜스케톨라제(transketolase) 및 트랜스알돌라제(transaldolase)를 과발현시키는 코리네박테리움 라이신 생산균주들에 관한 발명이 개시되어 있다(유럽등록특허 EP 1109915, EP 1179076, EP 1179084). 또한 Rpe 또는 RpiA를 각각 과발현시킨 코리네박테리움에서의 L-라이신 생산능 증가 효과를 개시한 발명도 있다(각 독일공개특허 DE10037611, DE10037612).
이로부터 코리네박테리움에서 L-라이신 생산능이 증가할수록 오탄당 인산화 경로에 대한 의존도가 높아지게 됨을 알 수 있으나, 본 발명의 핵심 요소인 리보플라빈 생합성 경로는 오탄당 인산화 경로로부터 파생되므로 리보플라빈 생합성을 위해 당 경로로의 탄소흐름을 강화시킬 경우 오탄당 인산화 경로를 거쳐 해당과정으로 유입되어야 할 탄소원의 유출을 초래하게 되어, 결국 공급된 단위 탄소원 당 L-라이신 생산 수율이 감소하게 된다. 즉 오탄당 인산화 경로 상의 충분한 탄소 흐름이 필요한 L-라이신 생산 균주에서 리보플라빈 생합성 경로는 오탄당 인산화 경로와 경쟁관계에 있다고 할 수 있으며 나아가 당 경로로 유입되는 탄소 흐름이 증가할 경우 L-라이신 생산능 증가에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
따라서 L-라이신 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물은 자연계에 존재할 수 있으나 L-라이신 및 리보플라빈의 생산 수율은 경쟁관계에 있으므로, L-라이신을 대량으로 생산하는 산업용 미생물에서 동시에 리보플라빈 생산량도 산업화가 가능한 수준까지 증가시키기 위한 시도는 아직까지 보고된 바 없다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 L-라이신 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물을 계발하고자 예의 노력한 결과, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움을 대상으로 오탄당 인산화 경로 상의 탄소 흐름을 증가시키기 위해, 인공돌연변이를 통한 고농도 글루콘산 적응성을 부여하여, L-라이신 생산량이 모균주와 유사한 수준으로 유지되면서, 동시에 리보플라빈 생산량이 모균주에 비해 증가한 돌연변이 균주를 개발하였다. 본 발명자들은 L-라이신 생산 코리네박테리움에서 리보플라빈 생합성 유전자군 프로모터가 강력한 발현유도활성을 갖는 이종 프로모터로 교체된 경우에도 L-라이신 및 리보플라빈을 동시에 고농도로 생산할 수 있으며, 또한 L-쓰레오닌 생산능을 갖는 코리네박테리움에서도 동일한 효과가 나타남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 배양하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 발효법으로 동시에 생산하는 단계를 포함하는, L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈의 동시 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 고농도 L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰에 무작위 돌연변이를 유도함으로써, 상기 L-라이신 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 기탁번호 KCCM11223P의 변이형 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 L-아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써, 상기 L-아미노산 생산량은 고농도로 유지되고, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된, L-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 변이형 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 미생물을 배양하고, 과립화하는 단계를 수행하여 제조한 L-아미노산 및 리보플라빈을 포함하는 제제 또는 과립제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 미생물을 배양하는 단계를 수행하여 제조한 L-아미노산 및 리보플라빈 포함 제제 또는 상기 과립제제를 포함하는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 L-아미노산 및 리보플라빈 동시 생산방법에 의하면 현재까지 필수 동물사료로서 사용되고 산업적으로 대량 생산되고 있는 L-라이신, L-쓰레오닌 등의 L-아미노산 및 리보플라빈을 고농도로 동시에 생산할 수 있는 미생물을 개발하여 산업적인 면에서 사료의 생산 편의성 및 제조원가 절감 등의 효과를 기대할 수 있으며, 효율적인 L-아미노산 및 비타민 사료 첨가제 생산 균주로서 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 해당과정 및 리보플라빈 생합성 경로에서 리불로오스-5-포스페이트를 경쟁적으로 사용하는 것을 나타낸 도이다.
도 2는 rib 오페론의 상단 또는 내부에 강력한 프로모터를 삽입하여 rib 오페론이 암호화하는 효소군 또는 리보플라빈 생합성 효소군의 활성을 강화시키는 것을 나타낸 도이다.
도 3은 서열번호 5의 프로모터를 삽입하기 위해 제조한 pDZ-Pmrb 벡터를 나타낸 도이다.
도 4는 서열번호 6의 프로모터를 삽입하기 위해 제조한 pDZ-lysCP1-ribG 벡터는 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명에서 용어, "rib 오페론"이란 리보플라빈 생합성 유전자군인 피리미딘 디아미나아제-리덕타아제(pyrimidine deaminase-reductase, RibG, NCgl1535)를 코딩하는 ribG 유전자, 리보플라빈 신테아제 서브유닛 알파(Riboflavin synthase subunit alpha, RibC, NCgl1534)를 코딩하는 ribC 유전자, TP 싸이클로하이드롤라아제 II(GTP cyclohydrolase II, RibA)를 코딩하는 ribA 유전자, 및 리보플라빈 신테아제 서브유닛 베타(riboflavin synthase subunit beta, RibH, NCgl1532)를 코딩하는 ribH 유전자로 이루어진 유전자군(이하 '리보플라빈 생합성 유전자군') 및 오탄당 인산화 경로에 관여하는 리불로오스-5-포스페이트-3-에피머라제(ribulose-5-phosphate-3-epimerase, Rpe, NCgl1536)를 코딩하는 rpe 유전자를 포함하는 오페론을 의미한다 (도 2). 상기 오페론의 각 유전자에 대한 정보는 공개된 데이터 베이스(NCBI의 GenBank 등)에서 얻을 수 있다.
본 발명에서 용어, "L-아미노산"은 L-라이신, L-쓰레오닌, L-발린, L-이소류신, L-트립토판 및 L-메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 L-라이신 또는 L-쓰레오닌이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 배양하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 발효법으로 동시에 생산하는 단계를 포함하는, L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈의 동시 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 변형된 미생물은 L-라이신 또는 L-쓰레오닌의 생산량은 모균주와 동일하게 유지하면서, 리보플라빈의 생산량이 70~80배 정도 증가하였고, 특히 라이신과 리보플라빈의 생산량의 비율이 대략 1:0.005 또는 L-쓰레오닌과 리보플라빈의 비율이 대략 1:0.03을 이루는 것을 확인하였다 (표 1 내지 6). 이에, 본 발명의 미생물을 이용하여 동시에 생산된 L-아미노산과 리보플라빈은 사료에 첨가되기에 적당한 것으로 확인되었다.
상기 변형된 미생물은 L-아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써, 상기 L-아미노산 생산량은 고농도로 유지되고, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된, L-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 변이형 코리네박테리움 속 미생물로서, 바람직하게는 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된, L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 변이형 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
본 발명에서 상기 코리네박테리움 속 미생물은 L-아미노산 생산능을 갖는 모든 코리네박테리움 속 균주를 포함할 수 있으며, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(ATCC 13032), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)(FERM BP-1539), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(ATCC 14067), 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium fermentum)(ATCC 13869) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 사용할 수 있고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 구체적인 예로는 KFCC10881(대한민국 등록특허 제0159812호), KFCC11074(대한민국 등록특허 제0292299호), KFCC11001(대한민국 등록특허 제0253424호) 및 KCCM11222P를 사용할 수 있지만, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 KFCC10881을 모균주로 하여, L-라이신 또는 L-쓰레오닌의 생산량은 고농도로 유지하면서, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 변이형 미생물을 제조하였다. 특히, L- 쓰레오닌의 생산량은 고농도로 유지하면서, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 변이형 미생물은 KCCM11222P를 모균주로 사용하여 제조하였다.
상기 L-라이신의 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 L-라이신의 생산 효율을 증가시킨 미생물일 수 있다. L-라이신의 생산 효율을 개선시키기 위한 방법으로 L-라이신 생합성 경로 상의 유전자를 증폭시키거나 유전자의 프로모터를 변형시켜, 효소 활성을 증대시키는 방법을 들 수 있다. L-라이신 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면, 아스파테이트 아미노트란스퍼라아제, 아스파토키나아제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제, 피루베이트 카복시라아제, 디히드로디피콜리네이트 리덕타아제, 디히드로디피콜리네이트 신타아제, 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제 등을 들 수 있다. 코리네형 세균 유래의 프로모터와 관련된 선행특허로는 디히드로디피콜리네이트 리덕타아제의 프로모터가 개량된 특허(국제 특허 WO09/096690)가 있으며, 아스파토 키나아제 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제의 프로모터가 개량된 특허(대한민국 등록특허 제0930203호)가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제0924065호에는 상기 언급된 생합성 관여 유전자들을 각각 1 카피(copy) 이상 추가도입하고 상기 유전자들의 프로모터를 각각 외래의 강력한 프로모터를 도입하여 L-라이신의 생산능을 개선시킨 방법이 기재되어 있다.
상기 L-쓰레오닌의 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 L-쓰레오닌의 생산 효율을 증가시킨 미생물일 수 있다. L-쓰레오닌 생산 능력을 개선시키기 위해, 영양 요구 돌여변이주, 유사체 내성주 또는 대사 조절 돌연변이주의 획득뿐만 아니라 L-쓰레오닌 생합성 효소의 활성이 증강된 재조합 균주의 제작과 같이 통상 적용되는 방법을 당업자가 이용할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이주 또는 재조합 균주를 변형시켜, L-쓰레오닌 생합성 효소가 피드백 억제를 받지 않거나, 재조합 균주가 L-쓰레오닌 생합성 효소 유전자의 발현을 증강시키도록 변형될 수 있다. 이들 방법에 의한 L-쓰레오닌 생산 세균의 개량에서, 영양 요구성, 유사체 내성 및 대사 조절 돌연변이와 같은 성질이 단독으로 또는 조합되어 부여될 수 있다. L-쓰레오닌 생합성 효소의 활성이 증강되면, 하나 이상의 이들 효소의 활성이 증강될 수 있다. 예를 들어, L-쓰레오닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 예는 아스파토키나제 III 유전자(lysC), 아스파테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), thr 오페론에 포함되는 아스파토키나제 I 유전자(thrA), 호모세린 키나제 유전자(thrB) 및 쓰레오닌 신타제 유전자(thrC)를 들 수 있으며, 당해 효소를 암호화하는 유전자에 돌연변이를 도입하거나 유전자를 증폭시켜 효소의 세포 내 활성을 증가시킴으로써 증강될 수 있다. 이들은 유전자 재조합 기술을 이용하여 성취될 수 있다. 또한, 쓰레오닌 분해에 관련된 L-쓰레오닌 데하이드로게나제 활성이 결여시킴으로써 L-쓰레오닌 생산을 증가시킬 수 있다. 또한, L-쓰레오닌 분해 시스템 효소 외에, L-쓰레오닌 생산에 해로운 영향을 주는 해당 경로, TCA 주기 또는 호흡 연쇄 과정에 관여하는 효소, 유전자 발현을 조절하는 효소 또는 부산물의 생합성 시스템의 효소를 감소시키거나 결여시킴으로써 L-쓰레오닌 생산을 증가시킬 수 있다. L-쓰레오닌의 생산 효율을 개선시키기 위한 방법으로는 예를 들면 L-쓰레오닌의 생합성 경로상의 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강되도록 변형시키는 방법을 들 수 있다. L-쓰레오닌 생합성에 관여하는 효소로는 호모세린 디히드로게나아제, 호모세린 키나아제 및 쓰레오닌 신타아제, 쓰레오닌 배출 효소 등을 들 수 있다. L-쓰레오닌 생산능을 부여 또는 증강시키는 또 다른 방법의 예는 호모세린 디히드로게나아제를 쓰레오닌에 대한 피드백 조절을 해제하도록 변이를 도입하는 방법등이 알려져 있다(미국 특허 제6,649,379호). 본 발명의 구체적인 실시예에서는 KFCC10881을 L-쓰레오닌 유사물질인 AHV(2-amino-3-hydroxy-valerate)에 내한 내성을 부여한 돌연변이를 구현하여 기탁번호 KCCM11222P인 변이형 미생물 KFCC10881-THR을 이용하였다.
바람직하게, 본 발명의 변이형 코리네박테리움 속 미생물은 고농도 L-아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, rib 오페론에 의해 발현하는 효소의 활성을 강화시킴으로써 상기 L-아미노산 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 동시에 L-아미노산 및 리보플라빈을 고농도로 생산하는 변이형 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 또는 rib 오페론 중 리보플라빈 생합성 유전자군에 의해 발현하는 효소의 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다.
상기 활성을 강화하는 방법은 그 예로, 상기 '오페론 또는 효소군' (이하, 효소군으로 통칭)을 암호화하는 유전자군의 세포내 카피수 증가, 상기 효소군를 암호화하는 염색체 상의 유전자군의 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소군을 암호화하는 염색체 상의 유전자군의 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소군의 활성이 증가하도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 효소군의 활성이 강화되도록 상기 효소군을 암호화하는 염색체상의 유전자군에 변이를 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군을 암호화하는 염색체 상의 유전자의 조절 서열을 활성이 강력한 프로모터로 교체, 리보플라빈 생합성 유전자군의 가장 앞쪽에 위치한 RibG(pyrimidine deaminase-reductase)를 코딩하는 유전자의 염색체 상의 상류에 강력한 프로모터를 삽입하는 방법 또는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군 또는 리보플라빈 생합성 유전자군에 의해 발현하는 효소군을 암호화하는 유전자군의 세포내 카피수 증가일 수 있다.
상기 세포내 카피수 증가는 세포의 염색체내로 상기 효소를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 안정적으로 상기 효소를 발현하는 경우 또는 상기 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터가 세포내로 작동 가능하게 형질전환되어 안정적으로 상기 효소를 발현하는 경우를 포함한다. 상기 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 작제물을 의미한다. 당업자라면 염색체 DNA 내부의 rib 오페론에 의해 발현하는 효소를 코딩하는 유전자 카피수 증가에 의한 효과를 통해 rib 오페론에 의해 발현하는 효소가 염색체 외부에서 벡터를 통해 카피수가 증가되거나, 염색체 내외부에서 rib 오페론에 의해 발현하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현조절부위 변형 혹은 유전자자체의 변이를 통한 발현량 증가시에도 동일한 효과를 가져올 것이라고 예측할 수 있다. 벡터를 사용할 경우, 염기서열을 도입한 재조합 벡터로 L-아미노산 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환함으로써 rib 오페론에 의해 발현하는 효소의 활성이 강화된 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 벡터 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pECCG117을 사용하였다.
또한, 원핵생물에서 상기 조절 서열에는 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 작동유전자(operator), 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 RBS(ribosome binding site), 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
상기 효소를 암호화하는 유전자의 상류에 위치한 본래의 프로모터 대신 고유의 프로모터로부터 발생한 염기치환 변이를 갖는 개량형 프로모터 또는 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 이종 프로모터의 예로는 pcj7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 프로모터, aceB 프로모터 등이 있으며, 코리네박테리움 유래의 프로모터인 pcj7 프로모터 또는 lysCP1 프로모터를 사용함이 바람직하고, 가장 바람직하게는 lysCP1 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명의 "lysCP1 프로모터"는 아스파테이트 키나제 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화 하는 유전자의 프로모터 부위 염기서열 치환을 통해 개량한 프로모터로서 아스파테이트 키나제 유전자의 발현량 증대를 통해 당 효소의 활성을 야생형 대비 약 5배 정도로 향상시킬 수 있는 강력한 프로모터를 의미한다(WO 2009/096689). 상기 lysCP1 프로모터는 lysCP1 프로모터 서열 및 lysC-asd 유전자의 일부분을 포함하는 서열번호 17의 1 내지 353번째 뉴클레오티드 서열(서열번호 6)로 이루어져 있을 수 있다. 구체적으로 본 발명의 벡터는 상기 서열번호 5의 염기치환 변이가 포함된 개량형 프로모터 또는 상기 서열번호 6의 발현유도활성이 강력한 lysC 유전자의 개량형 프로모터 lysCP1을 숙주세포의 염색체내로 도입할 수 있도록 제작되었다. 목적한 유전자를 과발현시키기 위한 방법으로 고유한 프로모터 서열의 일부 염기를 다른 염기로 치환함으로써 발현량이 높아지도록 하는 프로모터 개량법 및 발현량이 많은 다른 유전자의 프로모터로 치환하는 방법 등이 있다(제 WO 2009/096689호).
본 발명에서 용어, "형질전환"이란 유전자를 숙주세포인 코리네박테리움 속 균주 내로 도입하여 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 하는 전반적인 행위를 의미한다. 이때, 프로모터와 유전자는 폴리뉴클레오티드로서 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 상기 유전자의 발현에 필요한 모든 요소(element)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사종결 신호, RBS 및 번역 종결 신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터의 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포로 도입되어, 숙주세포의 발현에 필요한 서열과 작동가능하게 연결되는 것일 수도 있다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 바람직하게는 상기에서 설명한 바와 같이, 코리네박테리움 속 미생물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881을 사용할 수 있다. L-쓰레오닌 생산능을 가지는 미생물은 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물은 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 KFCC10881-THR을 사용할 수 있으며, 이는 기탁번호 KCCM11222P일 수 있다.
구체적으로, rib 오페론에 의해 발현하는 효소군을 암호화하는 염색체 상의 상류 프로모터를 서열번호 5의 프로모터 또는 ribG 유전자의 상류 프로모터를 서열번호 6의 프로모터로 교체하는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 KFCC10881 균주를 서열번호 5의 프로모터로 교체한 결과, L-라이신의 평균 농도에는 변화가 없으나, 리보플라빈의 평균 농도가 약 61배 증가하는 것을 확인하였으며 (표 2), ribG 유전자의 상류 프로모터를 서열번호 6의 프로모터로 교체한 결과, 리보플라빈이 73배 증가하고 (표 3), rib 오페론 카피수 증가에 의해 리보플라빈이 66배 증가하는 것을 확인하였다(표 4). 또한 L-쓰레오닌 생산균주인 KFCC10881-THR을 서열번호 5 및 6의 프로모터로 교체한 결과, L-쓰레오닌의 평균 농도에는 변화가 없으나, 각각 리보플라빈의 농도가 56배와 66배가 증가함을 확인하였다(표 6).
또한 구체적으로, L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, rib 오페론의 가장 앞쪽에 위치한 Rpe(ribulose-5-phosphate-3-epimerase)를 코딩하는 유전자의 상류에 강력한 프로모터를 삽입하거나, 리보플라빈 생합성 유전자군의 가장 앞쪽에 위치한 RibG(pyrimidine deaminase-reductase)를 코딩하는 유전자의 상류에 강력한 프로모터를 삽입하여 rib 오페론이 암호화하는 효소군 또는 리보플라빈 생합성 효소군의 활성을 강화시킴으로써(도 2), 리보플라빈을 L-라이신 또는 L-쓰레오닌과 함께 고농도로 생산하도록 변형시킬 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 기탁번호 KCCM11223P 균주의 rib 오페론의 가장 상류에 위치한 rpe의 -10번째 내지 -16번째 염기서열의 변이가 있음을 확인하였다. 이에, 상기 기탁균주의 rib 오페론의 프로모터 예상구간(서열번호 5)을 클로닝한 후, 이를 L-라이신 생산능 모균주의 염색체 내에 도입한 결과, 상기 L-라이신의 생산량은 유지되면서 리보플라빈의 생산량이 KCCM11223P 균주와 유사한 수준으로 증가한 것을 확인하였다(표 2). 이에, 상기 rib 오페론의 강화를 통해 리보플라빈 생산성이 증가한 것으로 예측하고, 상기 rib 오페론 내 리보플라빈 생합성 유전자군의 가장 상류에 위치한 ribG의 상류에 강력한 프로모터로 도입한 결과, 모균주보다 리보플라빈 생산량이 대략 73배 증가한 것을 확인하였다(표 3). 또한, rib 오페론의 카피수를 증가한 경우에도 상기 강력한 프로모터를 사용한 경우와 유사한 리보플라빈 생산량이 증가 효과를 확인하였다(표 4). 아울러, L-쓰레오닌 생산능 모균주에 rpe 상류의 프로모터를 본 발명의 서열번호 5의 프로모터로 교체한 결과 및 ribG 상류에 강력한 프로모터를 도입한 경우에도 L-쓰레오닌의 생산량은 유사하게 유지되면서 리보플라빈의 생산량이 대략 60 내지 70배 증가한 것을 확인하였다(표 6). 이로부터, 본 발명의 변이형 코리네박테리움 속 미생물이 L-아미노산의 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형됨으로써, 동시에 L-아미노산과 리보플라빈을 고농도로 생산할 수 있는 것을 확인하였다.
바람직하게, 상기 L-라이신 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 변이형 코리네박테리움속 미생물은 고농도 L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰에 무작위돌연변이를 유도함으로써, 상기 L-라이신 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 기탁번호 KCCM11223P의 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 또는 상기 L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써, 상기 L-라이신 생산량은 고농도로 유지되고, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된, 기탁번호 KCCM11220P, KCCM11221P 또는 KCCM11223P의 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 발명자들은 L-라이신 생산균주의 오탄당인산화경로상의 탄소흐름을 증가시키기 위해 무작위 인공돌연변이를 수행하는 중에, 짙은 노란색의 균체 색상을 가지는 콜로니를 발견하였고, 상기 돌연변이의 상기 L-라이신의 생산량은 유사하게 유지되면서 리보플라빈의 생산성이 대략 60배 증가한 것을 확인하였다(표 1). 본 발명자들은 상기 돌연변이주의 이러한 특징이 아미노산과 리보플라빈이 일정한 비율로 공급되어야 하는 사료첨가제 생산 시, 유용할 것으로 판단하였다. 이에, 본 발명자들은 상기 돌연변이 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2183, KFCC10881-YC라고 명명하고, 이를 2011년 11월 11일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11223P로 기탁하였다. 상기 돌연변이 균주는 간단하게 KFCC10881-YC로도 통칭될 수 있다. 아울러, 본 발명자들은 모균주인 KFCC10881의 rib 오페론 프로모터에 Pmrb 프로모터를 도입한 돌연변이 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2162, KFCC10881::Pmrb라고 명명하고, 이를 2011년 11월 11일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11221P로 기탁하였다. 상기 돌연변이 균주는 간단하게 KFCC10881::Pmrb로도 통칭될 수 있다. 또한 모균주인 KFCC10881의 ribG 유전자의 개시코돈 상단에 lysCP1을 도입한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2161, KFCC10881::lysCP1_ribG라고 명명하였다. 상기 돌연변이 균주는 간단하게 KFCC10881::lysCP1_ribG로도 통칭되며, 이를 2011년 11월 11일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11220P로 기탁하였다.
본 발명의 방법으로 동시에 생산된 배양액 내 L-아미노산 및 리보플라빈의 비율은 1:0.0001~0.1이며, 상기 L-아미노산이 L-라이신일 경우 더욱 바람직하게는 1:0.001~0.05이며, 가장 바람직하게는 1:0.003~0.01이다. 또한 상기 L-아미노산이 L-쓰레오닌일 경우, L-쓰레오닌 및 리보플라빈의 비율은 더욱 바람직하게는 1:0.001~0.1이며, 가장 바람직하게는 1:0.005~0.05이다.
상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다(Chmiel, Bipprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik ,Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991; Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994). 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 배양에 사용될 수 있는 배지는 배양 방식과 균주에 따라, 당업계에 알려진 적당한 배지가 선택될 수 있다("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981). 본 발명에서 사용되는 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 코리네박테리움 미생물 배양을 위한 배지에서 탄소원으로는 수크로즈, 글루코즈, 프락토즈, 지방, 지방산, 알코올, 유기산 등을 모두 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 탄소원의 구체적인 예에는, 당밀, 글루코즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함하며, 적정량의 탄소원을 다양하게 이용할 수 있다. 질소공급원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두박 가수분해물과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 배지에는 인산 공급원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염을 포함할 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등을 포함할 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가할 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.
또한, 본 발명의 방법은 추가로 상기 L-아미노산 및 리보플라빈을 포함하는 배양 발효액을 과립화하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 발효액은 균체 슬러지를 포함할 수 있고, 또는 상기 균체 슬러지가 제거된 것일 수 있다. 균체 슬러지를 제거를 위해서는 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 및 리보플라빈을 포함하는 배양 발효액으로부터 균체 슬러지를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 발효액에 균체 슬러지가 포함된 경우, 균체 슬러지를 제거하기 위해 필터작업을 하지 않으며, 별도의 흡습 방지제를 첨가하지 않아도 흡습성이 낮고 흐름성이 좋으며 겉보기 밀도가 높고 아미노산 함량 조절이 가능한 과립제제를 생산할 수 있다. 상기 과립화 방법은 예를 들면 대한민국 등록특허 제0838200호에 기재된 방법 또는 대한민국 등록특허 제0338578호에 기재된 방법 등을 적용할 수 있다. 구체적으로 상기 발효액을 농축하는 단계; 상기 농축액에 부형제를 첨가하여 혼합 농축액을 형성하는 단계; 과립기에 200~500㎛ 크기의 미립자 시드를 투입하는 단계; 및 열풍을 가하면서 과립기 하부로부터 상기 혼합 농축액을 분사하여 상기 미립자 시드를 코팅하면서 과립을 형성하는 단계를 통해 생산될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또는 균체 슬러지가 포함되지 않은 경우, 구체적으로 발효액을 여과하여 균체슬러지를 제거하는 단계; 상기 여과액을 농축하는 단계; 상기 농축액을 건조하여 과립을 형성하는 단계; 및 부형제 또는 흡습 방지제등의 코팅제로 상기 과립을 코팅하는 단계를 통해 생산될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 균체 슬러지는 발효액으로부터 분리하는 방법은 L-아미노산 및 리보플라빈을 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 및 결정화 등의 방법으로 분리함으로써 제거될 수 있다. 구체적으로 발효액을 저속 원심분리하여 균체 슬러지를 제거하고, 추가로 상등액을 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 고농도 L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰에 무작위 돌연변이를 유도함으로써, 상기 L-라이신 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 기탁번호 KCCM11223P의 변이형 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물을 제공한다.
미생물에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된, L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 변이형 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
미생물, 효소군의 활성 강화, 변이형 코리네박테리움 속 미생물은 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 a) L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 배양하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 발효법으로 동시에 생산하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 발효액을 과립화하는 단계를 수행하여 제조된 과립제제를 제공한다. 바람직하게 상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-쓰레오닌일 수 있다. 변형된 미생물은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 과립제제는 a) 단계에서 생산된 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 발효 배양액에서 균체 슬러지를 제거하는 단계를 추가로 포함하여 제조된 과립제제일 수 있다. 즉, 본 발명의 과립제제는 상기에서 설명한 바와 같이, 균체 슬러지를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
바람직하게 상기 과립제제의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌:리보플라빈의 비율은 1:0.0001~0.01일 수 있으며, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 과립제제는 기존의 분말 형태의 먼지 발생 및 제품 손실의 단점을 극복하기 위한 과립화 형태의 제제를 의미한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 a) L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 배양하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 발효법으로 동시에 생산하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 발효액으로부터 균체 슬러지를 제거하는 단계를 수행하여 제조된 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈 포함 제제를 제공한다. 바람직하게, 상기 포함 제제의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌:리보플라빈의 비율은 1:0.0001~0.01일 수 있으며, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 과립제제, L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈 포함 제제를 포함하는 사료 또는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명의 방법으로 생산된 고농도의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 및 리보플라빈은, 특히 라이신과 리보플라빈의 비율이 대략 1:0.005 또는 L-쓰레오닌과 리보플라빈의 비율이 대략 1:0.03으로 구성되었다(표 1 내지 6 참조). 동물사료에서 L-라이신의 요구량은 약 1~5 g/kg, L-쓰레오닌은 약 0.6~3.3 g/kg이며, 리보플라빈은 약 2~4 mg/kg으로 L-라이신의 약 0.1% 수준으로 공급되는데(NRC. 1998. National Academy of Sciences- National Research Council, Washington, D.C.)), 과량 투여에 의한 독성은 보고된바 없다. 이에, 본 발명의 방법으로 동시에 생산된 L-아미노산과 리보플라빈은 사료에 첨가되기에 적당한 것으로 확인되었다.
바람직하게 상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-쓰레오닌일 수 있다.
바람직하게 상기 사료 또는 사료 첨가제의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌:리보플라빈의 비율은 1:0.0001~0.01일 수 있으며, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 사료는 상기 L-아미노산 및 리보플라빈을 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 L-아미노산 및 리보플라빈은 액상 또는 건조상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 가축용 사료는 본 발명의 L-아미노산 및 리보플라빈 외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 첨가될 수 있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(J AnimalSci 43: 910-926, 1976) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(J Anim Sci 56:735-739, 1983)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에서의 L-아미노산 및 리보플라빈을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단밸질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단밸질, 동물성플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서의 L-아미노산 및 리보플라빈을 포함하는 사료 첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인공돌연변이법을 이용한 글루콘산 내성주 스크리닝
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-아미노산 생산시 필요한 NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)의 주된 공급경로인 오탄당인산화경로상의 탄소 흐름을 증가시키기 위하여 고농도 글루콘산(gluconic acid)에 대한 적응성을 부여하는 실험을 실시하였다.
KFCC10881(대한민국 등록특허 제0159812호)을 모균주로 하여 N-메틸-N-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)에 의한 인공돌연변이를 유도한 후 글루콘산을 20 g/ℓ의 농도로 함유한 하기의 복합 평판배지에서 배양하면서 NTG 비처리 대조구 대비 빠른 속도로 콜로니를 형성하는 균주들을 분리하였다. NTG 비처리 대조구의 경우 배양 60시간째 형성된 콜로니들의 평균 직경이 0.5 mm 정도인데 비해 NTG 처리구에서는 배양 약 40시간 만에도 직경 1 mm 크기에 도달하는 콜로니들이 형성되었다. 그 중 특이하게도 대조구와 달리 짙은 노란색을 띠는 콜로니를 발견하였는데 새로운 형질의 돌연변이가 생성되었을 것으로 예상하여, 이 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2183, KFCC10881-YC라고 명명하고 발색 원인을 규명하고자 하였다. 상기 돌연변이 균주는 간단하게 KFCC10881-YC로도 통칭되며, 이를 2011년 11월 11일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11223P로 기탁하였다.
<복합평판배지 (pH 7.0)>
글루콘산 20 g, (NH4)2SO4 50 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 5 g, K2HPO4 10 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍, 한천 20 g (증류수 1리터 기준)
실시예 2: KFCC10881-YC의 라이신 생산능 분석 및 발색 원인 규명
상기 실시예 1에서 제조한 KFCC10881-YC 균주의 특성을 알아보고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 라이신 생산능을 비교하고 배양액 성분을 분석하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양을 종료한 후에도, KFCC10881-YC의 균체 색상은 짙은 노란색을 유지하고 있었으며 배양 상등액 또한 대조구인 KFCC10881의 배양액과는 다르게 짙은 노란색을 띠고 있음을 확인하였다. 이에 본 발명자는 이러한 발색의 원인물질이 배양액 중에 포함되어 있을 것으로 판단하고 이를 규명하기 위해 미생물의 발색에 영향을 미치는 카로티노이드류 및 리보플라빈의 농도를 분석하였다. 그 결과 배양액 중 리보플라빈의 농도가 대조구와 뚜렷한 차이를 보였으며 카로티노이드류에서는 별다른 차이를 발견할 수 없었다. HPLC를 이용하여 분석된 L-라이신 및 리보플라빈의 농도를 하기 표 1에 나타냈다.
표 1 KFCC10881-YC의 L-라이신 및 리보플라빈 생산 농도
실험군 균주 L-라이신(g/ℓ) 리보플라빈(mg/ℓ)
배치 1 배치 2 배치 3 평균 배치 1 배치 2 배치 3 평균
1 KFCC10881 43.1 43.5 44.1 43.5 3.4 3.5 3.0 3.3
2 KFCC10881-YC 43.7 44.3 42.8 43.6 191.2 187.5 189.0 189.2
그 결과, 표 1의 결과에서 나타난 바와 같이 L-라이신 생산 균주 KFCC10881에 비하여, KFCC10881-YC의 경우에는 L-라이신의 평균 농도는 동등하나 리보플라빈의 농도가 무려 57배나 증가함을 확인하였다. 이로부터 콜로니의 색상이 모균주와 구분되는 뚜렷한 특징으로서 짙은 노란 색을 띠게 된 것은 리보플라빈의 농도 증가로 인한 것임을 알 수 있었다.
실시예 3: 고농도 리보플라빈 생산주의 rib 오페론 상류 프로모터의 변이 확인 및 상기 변이형 프로모터(Pmrb)의 염색체 도입용 벡터 제작
상기 실시예 1에서 제조한 KFCC10881-YC의 색상 변화 및 리보플라빈 생산능 증가를 유발한 근본적인 유전자 수준에서의 염기서열 돌연변이를 탐색하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 속 KFCC10881-YC의 리보플라빈 생합성에 관련된 염색체 부위의 염기서열을 결정하고, 미국 국립 보건원의 유전자 은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 확인하였다.
그 결과, rib 오페론 가장 상류에 위치한 rpe 유전자의 개시코돈 앞 10번째와 16번째의 염기서열이 각각 G에서 A로, G에서 T로 치환되었음을 확인하였고, rib 오페론 프로모터 예상구간에 상기 2개의 염기치환 변이를 갖는 프로모터를 Pmrb라 명명하였다(서열번호 5).
염기서열이 치환된 Pmrb 프로모터의 발현유도활성 및 효소활성 증가에 따른 리보플라빈 농도 증가 효과를 확인하기 위하여 이를 염색체상에 도입할 수 있는 벡터를 제작하였다.
보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머와 3' 말단에 SalⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 7 및 8)를 합성하고, KFCC10881-YC의 염색체를 주형으로 한 PCR을 통하여 rib 오페론 프로모터 예상구간 350 bp를 포함하는 약 650 bp의 Pm-rpe 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 56 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 40초 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 이에 사용한 프라이머는 하기에 나타냈다.
서열번호 7: 5'-tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctc-3'
서열번호 8: 5'-tttgtcgacattccgctaaaacacgt-3'
PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 EcoRⅠ 및 SalⅠ말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터(대한민국 특허 제2009-0094433호)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pDZ-Pmrb라 명명하였다(도 3).
실시예 4: 고농도 라이신 생산주의 염색체내 rib 오페론 상류에 Pmrb 도입 균주의 제작 및 라이신 및 리보플라빈 생산능 비교
상기 실시예 3에서 제조한 벡터 pDZ-Pmrb를 상동염색체 재조합에 의해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 형질전환시켰다. 그 후 염색체 상의 rib 오페론 프로모터 변이가 도입된 균주를 콜로니 색상변화에 의해 선택적으로 분리하여 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 이로부터 회수된 L-라이신 및 리보플라빈의 농도를 분석하였다(표 2). 상기 rib 오페론 프로모터 변이가 도입된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2162, KFCC10881::Pmrb라고 명명하였다. 상기 돌연변이 균주는 간단하게 KFCC10881::Pmrb로도 통칭되며, 이를 2011년 11월 11일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11221P로 기탁하였다.
표 2 프로모터의 변이 도입에 따른 L-라이신 및 리보플라빈 생산량 변화
실험군 균주 L-라이신(g/l) 리보플라빈(mg/l)
배치 1 배치 2 배치 3 평균 배치 1 배치 2 배치 3 평균
3 KFCC10881 42.1 42.6 43.1 42.6 3.1 3.3 3.0 3.1
4 KFCC10881::Pmrb 42.7 42.3 42.8 42.6 200.2 186.3 189.9 192.1
그 결과, 표 2의 결과에서 확인된 바와 같이, 야생형 rpe 유전자 고유 프로모터를 갖는 대조구 KFCC10881(실험군 3)에 비하여, 2개의 염기치환 변이를 가지는 프로모터 Pmrb가 도입된 KFCC10881::Pmrb의 경우(실험군 4) L-라이신의 평균농도에는 변화가 없었으나, 리보플라빈의 평균농도는 무려 약 61배가 증가함을 확인하였다.
실시예 5: rib 오페론 내 ribG 상류에 강력한 프로모터(LysCP1) 도입용 벡터 제작
rpe 유전자를 제외한 리보플라빈 생합성 유전자군만을 과발현시키기 위하여 코리네박테리움 유래의 강력한 프로모터를 rib 생합성 유전자군의 가장 앞쪽에 위치한 ribG 유전자(서열번호 4)의 개시코돈 상단에 연결함으로서 리보플라빈 생합성 유전자군의 발현량 증가를 유도하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 ribG 유전자 단편을 확보하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 5' 말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위와 3' 말단에 XbaⅠ 제한효소 부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 9 및 10)를 합성하였다. 합성한 프라이머로 PCR을 통하여 ribG 유전자의 개시코돈 상류 300 bp를 포함하고 있는 DNA 단편을 얻었다. 또한 5' 말단에 XbaⅠ과 NdeⅠ 제한효소 부위와 3' 말단에 SalⅠ 제한효소 부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 11 및 12)를 합성하고, PCR을 통하여 ribG 유전자의 개시코돈을 포함하고 있는 300 bp DNA 단편을 확보하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 56 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 상기 2개의 PCR 증폭 산물을 각각 EcoRⅠ과 XbaⅠ, XbaⅠ과 SalⅠ으로 처리한 후, pDZ 벡터를 제한효소 SalⅠ과 EcoRⅠ으로 처리하여 얻은 DNA절편과 연결하여 pDZ-ribG 벡터를 제작하였다. 본 PCR에 사용한 프라이머 서열을 하기에 나타냈다.
서열번호 9: 5'- tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctcc-3'
서열번호 10: 5'- tttctagattactgcgcgagtgctc-3'
서열번호 11: 5'- ttttctagataacatatggatgttgcgcacgcg-3'
서열번호 12: 5'- tttgtcgacattggcgtaaaacacgt-3'
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 lysCP1 프로모터(서열번호 6)를 증폭할 수 있으며 5' 말단에 XbaⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머와 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 가지도록 고안한 프라이머(서열번호 13 및 14)를 합성하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여 약 400 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 58 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 상기의 PCR 증폭 산물을 XbaⅠ과 NdeⅠ으로 처리한 후, pDZ-ribG 벡터를 제한효소 XbaⅠ과 NdeⅠ으로 처리하여 얻은 DNA절편과 연결하여 pDZ-lysCP1_ribG 벡터를 제작하였다(도 4). 본 PCR에 사용한 프라이머 서열을 하기에 나타냈다.
서열번호 13: 5'-ttttctagatagggagccatcttttgggg-3'
서열번호 14: 5'-tttcatatgctttgtgcacctttcg-3'
실시예 6: ribG 상류에 강력한 프로모터(LysCP1) 도입된 균주의 라이신 및 리보플라빈 생산능 비교
상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-lysCP1_ribG를 전기펄스법을 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 형질전환시키고, 염색체 상의 ribG 유전자 고유 프로모터가 lysCP1으로 치환된 균주를 선택적으로 분리함으로써 L-라이신 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 KFCC10881::lysCP1_ribG를 획득하였다. 이 균주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 배양액 중의 L-라이신 및 리보플라빈의 농도를 분석하였다(표 3). 상기 KFCC10881::lysCP1_ribG 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2161, KFCC10881::lysCP1_ribG라고 명명하였다. 상기 돌연변이 균주는 간단하게 KFCC10881::lysCP1_ribG로도 통칭되며, 이를 2011년 11월 11일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11220P로 기탁하였다.
표 3 프로모터의 도입에 따른 L-라이신 및 리보플라빈의 생산량 변화
실험군 균주 L-라이신(g/l) 리보플라빈(mg/l)
배치 1 배치 2 배치 3 평균 배치 1 배치 2 배치 3 평균
5 KFCC10881 43.7 42.5 43.1 43.1 3.4 3.5 3.0 3.3
6 KFCC10881::lysCP1_ribG 43.7 43.4 42.7 43.3 237.2 247.5 241.0 241.9
그 결과, 표 3의 결과에서 나타난 바와 같이, 야생형 프로모터를 갖는 대조구 KFCC10881(실험군 5)에 비하여 lysCP1 프로모터를 이용하여 RibG를 과발현시킬 경우(실험군 6) L-라이신의 평균농도에는 변화가 없었으나, 리보플라빈의 농도가 73배나 증가함을 확인하였다.
따라서, 리보플라빈 생합성 오페론을 이종 프로모터를 이용하여 과발현시킬 경우, 라이신 생산에는 전혀 영향을 주지 않으면서 리보플라빈 생산량을 대폭 증가시킬 수 있었으며 프로모터의 발현 유도활성이 강할수록 리보플라빈 생합성 유전자군의 과발현에 의한 리보플라빈 생산능이 증가함을 알 수 있었다.
실시예 7: rib 오페론의 카피수가 증가한 균주의 라이신 및 리보플라빈 생산능 비교
KFCC10881 균주에 rib 오페론을 포함하고 있는 플라스미드를 도입하여 리보플라빈 생합성 유전자의 카피수를 증가시켜 리보플라빈 생산능을 확인하고자 하였다.
보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 XbaⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머와 3' 말단에 동일한 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 15 및 16)를 합성하고, KFCC10881의 염색체를 주형으로 한 PCR을 통하여 프로모터 부위를 포함한 약 4500 bp의 rib 오페론을 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 56 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 4분 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 본 PCR에 사용한 프라이머 서열을 하기에 나타냈다.
서열번호 15: 5'-TTTGGTACCGATTGAAAAGTCCGTGCGTG-3'
서열번호 16: 5'-TTTGGTACCCGCGATCTTTTTCAGAAACT-3'
PCR로 증폭된 유전자 단편을 제한효소 XbaⅠ으로 처리하여 DNA 절편을 획득한 후 이를 제한효소 XbaⅠ 말단을 가지는 pECCG117 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드를 pECCG117-rib이라 명명하였다.
상기 제조한 벡터 pECCG117-rib을 전기펄스법을 이용하여 KFCC10881 균주에 도입한 후, 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 배양액 중의 L-라이신 및 리보플라빈의 농도를 분석하였다(표 4).
표 4 플라스미드 도입에 따른 L-라이신 및 리보플라빈의 생산량 변화
실험군 균주 L-라이신(g/ℓ) 리보플라빈(mg/ℓ)
배치 1 배치 2 배치 3 평균 배치 1 배치 2 배치 3 평균
7 KFCC10881 /pECCG117 43.1 43.1 42.5 32.9 4.0 3.2 3.6 3.6
8 KFCC10881 /pECCG117-rib 42.7 42.4 43.7 42.9 245.1 231.2 238.3 238.5
그 결과, 표 4의 결과에서 나타난 바와 같이, rib 오페론을 포함하지 않은 대조구 KFCC10881::pECCG117(실험군 7)에 비하여 플라스미드 도입을 통하여 rib 오페론의 카피수를 증가시킬 경우(실험군 8), L-라이신의 평균농도에는 변화가 없었으나, 리보플라빈의 농도가 66배나 증가함을 확인하였다.
따라서, 리보플라빈 생합성 오페론을 플라스미드를 이용하여 카피수를 증가시킴으로서 리보플라빈 생합성 유전자를 과발현시킬 경우, 라이신 생산에는 전혀 영향을 주지 않으면서 리보플라빈 생산량을 대폭 증가시킬 수 있었다.
실시예 8: 인공돌연변이법을 이용한 AHV 내성 L-쓰레오닌 생산 균주의 제작
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰의 L-쓰레오닌 생산능을 증가시키기 위하여 L-쓰레오닌 유사물질인 AHV(2-amino-3-hydroxy-valerate)에 대한 내성을 부여하는 실험을 실시하였다. KFCC10881을 모균주로 하여 N-메틸-N-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)에 의한 인공돌연변이를 유도한 후, AHV를 1~10 g/ℓ의 농도로 함유한 하기의 최소배지에서 배양하면서 배지 내 AHV 농도에 따른 콜로니 형성 여부를 NTG 비처리 대조구와 비교하였다. NTG 비처리 대조구의 경우 배양 72시간째를 기준으로 1~3 g/ℓ의 AHV에 대한 내성을 보였으나, NTG 처리구에서는 동일시간 배양하였을 때 AHV 6 g/ℓ의 농도에서까지 콜로니들이 형성되었다. 이들의 L-쓰레오닌 생산능 증가 여부를 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 L-쓰레오닌의 생산량을 분석하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<최소배지 (pH 7.2)>
포도당 5 g, KH2PO4 1 g, (NH4)2SO4 5 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, NaCl 0.5 g 바이오틴 200 ㎍, 티아민 HCl 100 ㎍, 칼슘-판토텐산 100 ㎍, 니코틴아마이드 0.03 g, L-쓰레오닌 0.01 g, 요소 2 g, Na2B4O710H2O 0.09 mg, (NH4)6Mo7O274H2O 0.04 mg, ZnSO47H2O 0.01 mg, CuSO45H2O, MnCl24H2O 0.01 mg, FeCl36H2O 1 mg, CaCl2 0.01 mg (증류수 1 리터 기준)
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 20 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO47H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 배양액 중 L-쓰레오닌의 농도를 분석하였고, 가장 높은 L-쓰레오닌 생산능을 보인 변이주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2182, KFCC10881-THR이라 명명하였다. 상기 돌연변이 균주는 간단하게 KFCC10881-THR로도 통칭되며, 이를 2011년 11월 11일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11222P로 기탁하였다. KFCC10881-THR의 L-쓰레오닌 생산능은 아래와 같다(표 5).
표 5 KFCC10881-THR의 L-쓰레오닌 생산 농도
실험군 균주 L-쓰레오닌 (g/ℓ)
배치1 배치 2 배치 3
9 KFCC10881 1.2 1.5 1.4
10 KFCC10881-THR 6.7 7.1 7.0
상기 표 5에서 실험군 9인 대조구인 KFCC10881의 L-쓰레오닌 평균농도를 나타내고, 실험군 10은 KFCC10881-THR의 L-쓰레오닌 평균농도를 나타낸다.
그 결과, 표 5의 결과에서 나타난 바와 같이, KFCC10881에 비하여 KFCC10881-THR의 경우 L-쓰레오닌의 생산능이 약 5.6 g/ℓ 가량 증가하였음을 확인하였다.
실시예 9: 염색체 내 rib 오페론 상류 또는 ribG 상류에 강력한 프로모터 도입 균주의 제작 및 쓰레오닌 및 리보플라빈 생산능 비교
상기 실시예 3에서 제조한 벡터 pDZ-Pmrb와 실시예 5에서 제조한 pDZ-lysCP1_ribG를 전기 펄스법을 이용하여 상기 실시예 8에서 제조한 L-쓰레오닌 생산균주인 KFCC10881-THR에 각각 형질전환시키고, 염색체 상의 rpe 유전자 고유 프로모터가 Pmrb로 치환된 균주 또는 ribG 유전자 고유 프로모터가 lysCP1으로 치환된 균주를 선택적으로 분리하여 실시예 7과 동일한 방법으로 배양하고, 이로부터 회수된 L-쓰레오닌 및 리보플라빈의 농도를 분석하였다(표 6).
표 6 프로모터의 변이 도입에 따른 L-쓰레오닌 및 리보플라빈의 생산량 변화
실험군 균주 L-쓰레오닌(g/ℓ) 리보플라빈(mg/ℓ)
배치1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
11 KFCC10881-THR 6.9 6.8 7.0 3.2 3.1 3.3
12 KFCC10881-THR::Pmrb 7.1 6.8 7.1 180.0 177.5 179.2
13 KFCC10881-THR:: lysCP1_ribG 6.7 7.2 6.9 214.2 208.5 213.0
그 결과, 표 6의 결과에서 확인된 바와 같이, 야생형 rpe 및 ribG 유전자 고유 프로모터를 갖는 대조구 KFCC10881-THR(실험군 11)에 비하여, 2개의 염기치환 변이를 가지는 프로모터 Pmrb가 도입된 KFCC10881::Pmrb(실험군 12)와 lysCP1 프로모터를 이용하여 RibG를 과발현시킨 KFCC10881-THR::lysCP1_ribG의 경우(실험군 13) L-쓰레오닌의 평균농도에는 변화가 없었으나, 리보플라빈의 평균농도는 각각 약 56배와 66배가 증가함을 확인하였다.
상기의 결과들은 리보플라빈 생합성 오페론을 과발현시킬 경우, L-쓰레오닌 생산에는 전혀 영향을 주지 않으면서 리보플라빈 생산량을 대폭 증가시켜 L-쓰레오닌 및 리보플라빈을 동시에 생산할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, L-쓰레오닌 생산 균주에서도 리보플라빈 생합성 오페론 프로모터의 발현 유도활성이 강할수록 리보플라빈 생합성 유전자군의 과발현에 의해 리보플라빈의 생산능이 증가함을 알 수 있었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 21.12.2012]　
Figure WO-DOC-FIGURE-187
[규칙 제91조에 의한 정정 21.12.2012]　
Figure WO-DOC-FIGURE-188
[규칙 제91조에 의한 정정 21.12.2012]　
Figure WO-DOC-FIGURE-189
[규칙 제91조에 의한 정정 21.12.2012]　
Figure WO-DOC-FIGURE-190

Claims (21)

  1. L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 배양하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 발효법으로 동시에 생산하는 단계를 포함하는, L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈의 동시 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌:리보플라빈 비율은 1:0.0001~0.1인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 배양 발효액을 과립화하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 배양 발효액으로부터 균체 슬러지를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 고농도 L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰에 무작위 돌연변이를 유도함으로써, 상기 L-라이신 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 기탁번호 KCCM11223P의 변이형 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
  8. L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된, L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 변이형 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 리보플라빈 생합성 유전자군에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시키는 것인 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 효소군의 활성 강화는 상기 효소군을 암호화하는 유전자의 세포내 카피수 증가, 상기 효소군을 암호화하는 염색체 상의 유전자의 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 효소군을 암호화하는 염색체 상의 유전자의 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 효소군의 활성이 증가하도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 효소군을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 효소군의 활성이 강화되도록 상기 효소군을 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법인 것인 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 효소군을 암호화하는 염색체 상의 유전자의 조절 서열을 활성이 강력한 프로모터로 교체하는 방법인 것인 미생물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재된 프로모터인 것인 미생물.
  14. 제8항에 있어서, L-라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 리보플라빈 생합성 유전자군을 포함하는 rib 오페론에 의해 발현하는 효소군의 활성을 강화시킴으로써, 상기 L-라이신 생산량은 고농도로 유지되고, 동시에 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된, L-라이신 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 기탁번호 KCCM11220P, KCCM11221P 또는 KCCM11223P인 것인 미생물.
  15. 제8항에 있어서, 상기 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 기탁번호 KCCM11222P인 것인 미생물.
  16. a) L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 배양하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 발효법으로 동시에 생산하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 발효액을 과립화하는 단계를 수행하여 제조된 과립제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌:리보플라빈의 비율은 1:0.0001~0.01인 것인 과립제제.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 a) 단계에서 생산된 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 발효 배양액에서 균체 슬러지를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 과립제제.
  19. a) L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌 생산량은 고농도로 유지되고, 리보플라빈의 생산량이 증가되도록 변형된 상기 미생물을 배양하여 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 발효법으로 동시에 생산하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈을 포함하는 발효액으로부터 균체 슬러지를 제거하는 단계를 수행하여 제조된 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈 포함 제제.
  20. 제19항에 있어서, 상기 L-라이신 또는 L-쓰레오닌:리보플라빈의 비율은 1:0.0001~0.01인 것인 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈 포함 제제.
  21. 제16항 또는 제18항의 과립제제 또는 제19항의 L-라이신 또는 L-쓰레오닌, 및 리보플라빈 포함 제제를 포함하는 사료 첨가제.
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