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WO2021150029A1 - Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 - Google Patents

Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법 Download PDF

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Publication number
WO2021150029A1
WO2021150029A1 PCT/KR2021/000823 KR2021000823W WO2021150029A1 WO 2021150029 A1 WO2021150029 A1 WO 2021150029A1 KR 2021000823 W KR2021000823 W KR 2021000823W WO 2021150029 A1 WO2021150029 A1 WO 2021150029A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gapn
strain
amino acid
microorganism
corynebacterium
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/000823
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
배지연
윤병훈
권수연
김경림
김주은
변효정
조승현
권나라
김형준
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
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Priority to US17/423,262 priority patent/US12173341B2/en
Priority to CN202180001841.2A priority patent/CN113785070B/zh
Priority to BR112021007124-5A priority patent/BR112021007124B1/pt
Priority to EP21724998.6A priority patent/EP3878965A4/en
Publication of WO2021150029A1 publication Critical patent/WO2021150029A1/ko

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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
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    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01009—Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP+) (1.2.1.9)
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    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01012—Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (phosphorylating) (1.2.1.12)
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    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application relates to a microorganism of the genus Corynebacterium having an increased ability to produce L-amino acids including NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and production of L-amino acids using the same it's about how
  • Corynebacterium genus microorganism ( Corynebacterium sp. ) is a gram-positive microorganism frequently used to industrially produce materials having various uses, such as feed, pharmaceuticals and food, including L- amino acids and various nucleic acids. Recently, diamine, keto-acid, and the like are also produced from microorganisms of the genus Corynebacterium.
  • NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • the oxidized form of NADP+ and the reduced form of NADPH are mutually in vivo electron transport materials and are involved in various synthesis processes.
  • NADPH production pathways include 1) the oxidative pentose phosphate pathway and 2) the NADP-dependent isocitrate dehydrogenase (Icd gene) of the TCA pathway.
  • Icd gene NADP-dependent isocitrate dehydrogenase
  • enzymes that produce NADPH regardless of the central metabolic pathway include transhydrogenase, ferredoxin: NADP+ oxidoredutase ( Spaans et al , 2015, NADPH-generating systems in bacteria and archaea, Front. Microbiol. 6:742).
  • the present inventors introduced NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase into the microorganism of the genus Corynebacterium through various studies of Corynebacterium.
  • the present application was completed by confirming that the production of amino acids and their precursors is increased in microorganisms of the genus Leum.
  • One object of the present application is a microorganism of the genus Corynebacterium comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) culturing in a medium; And recovering the L- amino acid from the cultured microorganism or culture of the present application; comprising, to provide a method for producing L- amino acid.
  • Another object of the present application including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, including NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), L- amino acid production capacity is increased It is to provide microorganisms of the genus Corynebacterium.
  • Another object of the present application is of a microorganism of the genus Corynebacterium comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) To provide a use for the production of L-amino acids.
  • the reducing power is increased through gapN activity, and L- of the microorganisms of the genus Corynebacterium sp. Amino acid production capacity can be increased.
  • One aspect of the present application for achieving the above object is a coli comprising NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Culturing the microorganisms of the genus Nebacterium in a medium; and recovering L-amino acids from the cultured microorganism or culture; it provides a method for producing L-amino acids, including.
  • NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase refers to glyceraldehyde-3-phosphate as a substrate and 3-phosphoglyceride using NADP as a coenzyme. It refers to a polypeptide having an activity of converting into a rate (3-phasphateglycerate).
  • the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase may include NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase derived from animals, plants, and bacteria.
  • the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase may be derived from bacteria, and more specifically, may be derived from the genus Lactobacillus sp ., Lactobacillus delburuki subspecies bulgaricus. ( Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ) It may be derived from.
  • the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase may be, for example, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be used interchangeably with the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 refers to an amino acid sequence having NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity.
  • SEQ ID NO: 1 may be a polypeptide sequence having NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity encoded by the gapN gene.
  • the polypeptide may be derived from Lactobacillus sp ., specifically Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus ) It may be derived from, but not limited to, the amino acid Sequences having the same activity as may be included without limitation.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained from a known database, National Institutes of Health (NIH GenBank).
  • NIH GenBank National Institutes of Health
  • polypeptide having NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity in the present application is defined as a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, meaningless sequences before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are added or naturally occurring mutations, or silent mutations thereof.
  • the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has the same or corresponding activity to each other, it corresponds to the polypeptide having the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity of the present application.
  • the polypeptide having NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity of the present application is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97 thereof. It may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least %, 98%, or 99% homology or identity.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence in which some sequence is deleted, modified, substituted or added is also included within the scope of the polypeptide subject to mutation of the present application. is self-evident
  • polypeptides consisting of modified, substituted or added amino acid sequences may also be used in the present application.
  • a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1' may belong to a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1' if it has the same or corresponding activity.
  • the gene encoding the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is a gapN gene, and the gene may be derived from bacteria, and more specifically, from Lactobacillus sp. It may be derived from, but is not particularly limited as long as it is a microorganism of the genus Lactobacillus that can express the gapN gene. Specifically, the Lactobacillus genus microorganism may be Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus.
  • the gene may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and more specifically, may be a sequence including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 may be used in combination with the polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are linked in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the polypeptide. polynucleotide fragments.
  • the polynucleotide of the present application may contain a variety of coding regions within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or considering codons preferred in an organism to express the polypeptide. Deformation can be made. Specifically, any polynucleotide sequence encoding NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be included without limitation.
  • NADP-dependent glyceraldehyde comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by hydridation under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence complementary to all or part of the nucleotide sequence. Any sequence encoding a polypeptide having -3-phosphate dehydrogenase activity may be included without limitation.
  • stringent condition refers to a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J.
  • 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more homology between genes with high homology or identity, or Genes with the same identity are hybridized and genes with homology or identity lower than that are not hybridized, or washing conditions of normal southern hybridization at 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically At a salt concentration and temperature equivalent to 60° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, the conditions of washing once, specifically 2 to 3 times can be listed. there is.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
  • adenosine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include isolated nucleic acid fragments that are complementary to substantially similar nucleic acid sequences as well as the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55°C and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 °C, 63 °C or 65 °C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • the appropriate stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, and the parameters are well known in the art (eg, J. Sambrook et al., supra).
  • the term 'homology' or 'identity' refers to a degree related to two given amino acid sequences or base sequences and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used.
  • Substantially, homologous or identical sequences generally have moderate or high stringency conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length sequence. It can hybridize under stringent conditions. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotides.
  • GAP program is defined as the total number of symbols in the shorter of two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • the gene encoding the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is introduced into a microorganism of the genus Corynebacterium by a conventional method known in the art, and NADP-dependent glycerin in the microorganism of the genus Corynebacterium Aldehyde-3-phosphate dehydrogenase may be expressed.
  • a polypeptide refers to a state in which a target polypeptide is introduced into a microorganism or modified to be expressed in a microorganism.
  • a “polypeptide of interest” may be the aforementioned NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
  • introduction of a polypeptide means that the microorganism exhibits the activity of the target polypeptide that it did not originally have.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be introduced into a chromosome in a microorganism, or a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide may be introduced into a microorganism to exhibit its activity. Even if the target polypeptide is already present in the microorganism, by introducing the target polypeptide into the microorganism, the expression or activity of the polypeptide in the microorganism can be increased or enhanced compared to the unmodified microorganism.
  • enhancement of activity means that the activity of a specific polypeptide in the microorganism is improved compared to the intrinsic activity, or it means that the activity of the polypeptide in the non-mutated microorganism is improved.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain before the transformation when the trait of a microorganism is changed due to genetic variation caused by natural or artificial factors.
  • activity enhancement is a method for introducing a polypeptide into the microorganism, a method for increasing the intracellular copy number of a gene encoding the polypeptide, a method for introducing a mutation into an expression control sequence of a gene encoding the polypeptide, a method for encoding the polypeptide It may consist of any one or more methods selected from the group consisting of a method of replacing a gene expression control sequence with a sequence with strong activity and a method of additionally introducing a mutation into a gene encoding a polypeptide to enhance the activity of the polypeptide, but is not limited thereto. does not
  • the method for introducing the polypeptide into the microorganism or the method for increasing the intracellular copy number of the gene encoding the polypeptide is not particularly limited thereto, but is performed by inserting the polynucleotide encoding the polypeptide into a chromosome or plasmid in the microorganism using a vector can be Specifically, a vector capable of replicating and functioning independently of a host to which a polynucleotide encoding a polypeptide of the present application is operably linked may be introduced into a host cell.
  • a vector capable of inserting the polynucleotide into a chromosome in the host cell, to which the polynucleotide is operably linked may be introduced into the chromosome of the host cell. Insertion of the polynucleotide into a chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, by homologous recombination.
  • modifying the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide is not particularly limited thereto, to further enhance the activity of the expression control sequence, deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence, or their It can be carried out by inducing a mutation in the sequence in combination, or by replacing it with a nucleic acid sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence for regulating the termination of transcription and translation, and the like.
  • a strong promoter may be linked to the upper portion of the polynucleotide expression unit instead of the original promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include cj1 to cj7 promoter (Korean Patent No. 10-0620092), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter , SPL13 (sm3) promoter (Korean Patent No. 10-1783170), O2 promoter (Korean Patent No. 10-1632642), tkt promoter and yccA promoter, but are not limited thereto.
  • the modification of the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited thereto, but a mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of a nucleic acid sequence or a combination thereof to further enhance the activity of the polynucleotide sequence. It can be carried out by inducing and replacing with a polynucleotide sequence improved to have stronger activity.
  • Such introduction and enhancement of the polypeptide activity may be, but is not limited to, the activity or concentration of the corresponding polypeptide being increased compared to the activity or concentration of the polypeptide in a wild-type or unmodified microbial strain.
  • the introduction or enhancement of the activity of the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is to prepare a recombinant vector for expression containing the gene encoding it, and introduce the vector into a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • This can be achieved by producing a transformed microorganism of the genus Corynebacterium. That is, the microorganism containing the gene encoding the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase may be a recombinant microorganism produced by transformation with a vector containing the gene, but is not limited thereto.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a suitable regulatory sequence and a nucleotide sequence of the target polypeptide so that the target polypeptide can be expressed in a suitable host.
  • regulatory sequences may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited as long as it is capable of replication in a host cell, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • phage vectors or cosmid vectors pWE15, M13, ⁇ EMBL3, ⁇ EMBL4, ⁇ FIXII, ⁇ DASHII, ⁇ ZAPII, ⁇ gt10, ⁇ gt11, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A, etc. will be used.
  • plasmid vector pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ-based, pET-based, pMal-based, pQE-based, pCL-based and the like can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • the recombinant vector for the expression of the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is a conventional method, that is, the gene sequence of the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is obtained by using a restriction enzyme in an appropriate vector. It may be prepared by ligation.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be inserted into the chromosome through the recombinant vector for expression of the polypeptide.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. It may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule is inserted, and to confer a selectable phenotype such as drug resistance, auxotrophicity, resistance to cytotoxic agents, or expression of a surface polypeptide. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as they can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding the target polypeptide. The polynucleotide may be introduced into a host cell and expressed in any form, as long as it can be expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target polypeptide of the present application and the gene sequence are functionally linked.
  • the method for transforming the vector of the present application includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • a microorganism producing L-amino acids or "a microorganism of the genus Corynebacterium that produces L-amino acids” includes all microorganisms of the genus Corynebacterium or microorganisms in which genetic modification has occurred naturally or artificially It is a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened due to causes such as insertion of an external gene or intensification or inactivation of the activity of an intrinsic gene, in which genetic mutation or activity is enhanced for the production of the desired L-amino acid. It may be a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the activity of a portion of the polypeptide in the biosynthetic pathway of the desired L-amino acid is enhanced, or the activity of a portion of the polypeptide in the desired L-amino acid degradation pathway is weakened, so the desired L-amino acid It may be a microorganism with enhanced production ability.
  • the microorganism is, aspartate kinase (lysC), homoserine dehydrogenase (homoserine dehydrogenase, hom), L- threonine dehydratase (L-threonine dehydratase, ilvA), 2- Enhanced activity of 2-isopropylmalate synthase (leuA), acetolactate synthase (ilvN), or/and homoserine O-acetyltransferase (metX) It may be a microorganism. Also, for example, the microorganism may include a gene or polypeptide whose activity is enhanced by being modified to have feedback inhibition resistance.
  • the microorganism may have weakened or inactivated activities of various genes or polypeptides that degrade desired L-amino acids.
  • the microorganism may be a microorganism having an increased ability to produce L-amino acids by random mutation, but is not limited thereto. That is, the microorganism may be a microorganism in which the production of the desired L-amino acid is increased by enhancing the polypeptide activity of the desired L-amino acid biosynthetic pathway or inactivating / weakening the polypeptide activity of the degradation pathway.
  • Enhancing the activity of a polypeptide as described above may include increasing the intracellular copy number of a gene encoding the polypeptide; introducing a mutation into a chromosomal gene encoding a polypeptide and/or an expression control sequence thereof; replacing a gene expression control sequence on a chromosome encoding a polypeptide with a highly active sequence; introducing a mutation into a portion of a gene on a chromosome encoding a polypeptide to increase expression of the polypeptide or to resist feedback inhibition; Or it may be made by a method combining them, but is not limited thereto.
  • weakened/inactivated polypeptide activity means that the expression of an enzyme or polypeptide is not expressed at all compared to a native wild-type strain, a parent strain, or a strain in which the polypeptide is unmodified, or has no activity even if it is expressed. means reduced.
  • the decrease is when the activity of the polypeptide is decreased compared to the activity of the polypeptide possessed by the original microorganism due to mutation of the gene encoding the polypeptide, modification of the expression control sequence, deletion of part or all of the gene, and the gene encoding it
  • the overall degree of activity of the polypeptide in the cell is lower than that of the native strain or the strain before transformation due to inhibition of expression or translation inhibition, it is a concept including a combination thereof as well.
  • the inactivation may be achieved by applying various methods well known in the art.
  • Examples of the method include a method of deleting all or part of the gene encoding the polypeptide; modification of expression control sequences to reduce expression of said gene encoding said polypeptide; modification of the gene sequence encoding the polypeptide such that the activity of the polypeptide is eliminated or attenuated; introduction of an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to the transcript of the gene encoding the polypeptide; a method of making the attachment of ribosomes impossible by adding a sequence complementary to the Shine-Dalgarno sequence to the front end of the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the polypeptide to form a secondary structure; There is a method of adding a promoter transcribed in the opposite direction to the 3' end of the open reading frame (ORF) of the polynucleotide sequence of the gene encoding the polypeptide (Reverse transcription engineering, RTE), and a combination thereof is also achieved.
  • the above-described method is an example, and methods for enhancing or inactivating polypeptide activity and genetic manipulation methods are known in the art, and the L-amino acid producing microorganism can be prepared by applying various known methods.
  • a microorganism of the genus Corynebacterium that produces the L-amino acid including the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase converts the desired L-amino acid from a carbon source in the medium into an unmodified wild-type It can be produced in excess compared to the strain or unmodified mutant, as described above.
  • the "microorganism of the genus Corynebacterium that produces L-amino acids” is "Corynebacterium sp. strain having L-amino acid producing ability" or "L-amino acid producing Corynebacterium sp. strain”. can be used
  • the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity is modified to express a polypeptide, and a microorganism of the genus Corynebacterium that produces L-amino acids is a genus of Corynebacterium capable of producing L-amino acids. If it is a microorganism, it is not specifically limited.
  • Corynebacterium genus ( Corynebacterium sp .) microorganisms are Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium ammoniagenes ( Corynebacterium ammoniagenes ), Corynebacterium crudilactis ( Corynebacterium crudilactis ) ), Corynebacterium deserti ( Corynebacterium deserti ), Corynebacterium efficiens ), Corynebacterium callunae ( Corynebacterium callunae ), Corynebacterium stationis ( Corynebacterium stationis ), Cory Nebacterium singulare ( Corynebacterium singulare ), Corynebacterium halotolerans ( Corynebacterium halotolerans ), Corynebacterium striatum ( Corynebacterium striatum ), Corynebacterium pollutisoli
  • the microorganism of the genus Corynebacterium that produces the L-amino acid may be a recombinant microorganism.
  • the recombinant microorganism is as described above.
  • the term "cultivation” means growing the microorganism in an appropriately controlled environmental condition.
  • the culturing process of the present application may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be batch, continuous, and fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material in which nutrients required for culturing the microorganism are mixed as a main component, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and growth.
  • any medium and other culture conditions used for culturing the microorganism of the present application may be used without any particular limitation as long as it is a medium used for culturing conventional microorganisms, but a suitable carbon source, nitrogen source, personnel, inorganic It can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing compounds, amino acids and/or vitamins.
  • the culture medium for the Corynebacterium sp. strain can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
  • carbon source in the present application, carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugar cane offal and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e., converted to reducing sugar). molasses) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be variously used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract
  • the phosphorus may include potassium first potassium phosphate, second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • potassium first potassium phosphate potassium phosphate
  • second potassium phosphate or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and in addition, amino acids, vitamins and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, the present invention is not limited thereto.
  • a compound such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like may be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium during culturing of the microorganism.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injection of gas or without injection of gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions, which are limited thereto. it is not
  • the temperature of the medium may be 20 °C to 45 °C, specifically 25 °C to 40 °C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may be continued until a desired production amount of the useful substance is obtained, and specifically, it may be 10 hours to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the L-amino acid produced by the culture may be discharged into the medium or may remain in the cell without being discharged.
  • the method for recovering the L-amino acid produced in the culturing step of the present application may be to collect the desired L-amino acid from the culture medium using a suitable method known in the art according to the culture method. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC may be used, and the desired L-amino acid may be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the recovery step may include a purification process, and may be performed using a suitable method known in the art. Therefore, the recovered L-amino acid may be in a purified form or a microbial fermentation broth containing L-amino acid (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
  • the L-amino acid produced by the L-amino acid production method according to the present application is not limited in its type. That is, all L-amino acids that can be produced from microorganisms of the genus Corynebacterium may be included without limitation, and intermediates of L-amino acids may also be included.
  • the L-amino acids include, for example, L-arginine, L-histidine, L-lysine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-serine, L-threonine, L-asparagine, L-glutamine, L- Tyrosine, L-alanine, L-isoleucine, L-leucine, L-valine, L-phenylalanine, L-methionine, L-tryptophan, L-glycine, L-proline, L-cysteine, etc., specifically L- It may be lysine, L-threonine, L-isoleucine, L-leucine, L-valine, L-arginine, or L-glutamic acid, but is not limited thereto, and the L-amino acid intermediate is, for example, O - May be acetyl homoserine, but is not limited thereto.
  • L- amino acid production ability including NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It is to provide an increased microorganisms of the genus Corynebacterium.
  • NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase a gene encoding it, its expression, and a microorganism of the genus Corynebacterium are as described above.
  • a microorganism of the genus Corynebacterium containing a gene encoding a NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is expressed in an unmodified microorganism by NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
  • L-amino acid production capacity may be increased or improved.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium of the present application is a microorganism capable of producing L-amino acids, and may include not only wild-type microorganisms, but also microorganisms genetically modified to improve L-amino acid production ability.
  • the microorganisms that produce L-amino acids are the same as described above.
  • the microorganism of the present application is a recombinant microorganism containing NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase derived from the genus Lactobacillus, and does not include the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
  • the desired L-amino acid can be produced in excess from the carbon source in the medium.
  • the increased ability to produce L-amino acids of the recombinant microorganism may be obtained with increased reducing power by activation of the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
  • the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase into a microorganism of the genus Corynebacterium that produces L-amino acids, the NADP-dependent glyceraldehyde- By activating 3-phosphate dehydrogenase, it can be used as a reducing power, an energy source, in the biosynthesis of L-amino acids by increasing the amount of NADPH.
  • the term "unmodified microorganism” refers to a native strain itself, a microorganism that does not contain the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, or the NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. It may refer to a microorganism that has not been transformed with a vector containing a polynucleotide encoding an agent, but is not limited thereto.
  • the L-amino acid is the same as described above.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium in which the L-amino acid production ability is increased by introducing a gene encoding NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase according to the present application is accession number KCCM 12580P, accession number KCCM 12581P, accession number KCCM 12582P, accession number KCCM 12583P, accession number KCCM 12584P, accession number KCCM 12585P, accession number KCCM 12586P or accession number KCCM 12587P It may be any one selected from the group consisting of microorganisms of the genus Corynebacterium deposited.
  • Corynebacterium genus comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
  • NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase a gene encoding the same, its expression, a microorganism.
  • Microorganisms of the genus Corynebacterium including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, microorganisms of the genus Corynebacterium, and L-amino acids as described above.
  • Example 1-1 Vector construction for introducing NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapN(L)) derived from Lactobacillus delburuki subspecies bulgaricus ATCC 11842 into a transposon in the chromosome of a microorganism of the genus Corynebacterium
  • gapN(L) NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Bulgaricus NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase derived from Bulgaricus was selected. Thereafter, the following experiment was performed to improve the activity.
  • amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the Ldb1179 gene encoding gapN derived from Lactobacillus delburuki subspecies bulgaricus ATCC 11842 were obtained from the National Institutes of Health (NIH GenBank).
  • Ldb1179 gene For the Ldb1179 gene, a gene fragment of about 1.43 kb was amplified in a form in which the initiation codon TTG was changed to ATG using the SEQ ID NO: 3 and 4 primers using the chromosome of the Lactobacillus delburuki subspecies bulgaricus ATCC 11842 strain as a template (Table 1) . At this time, the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 1 minute and 30 seconds. The PCR product was purified by electrophoresis on a 0.8% agarose gel by eluting an approximately 1.4 kb band.
  • the cj7 promoter region was subjected to PCR under the same conditions using the primer pair of SEQ ID NOs: 5 and 6 to obtain a PCR product.
  • the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 30 seconds.
  • the PCR product obtained above was fusion cloned.
  • An In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used for fusion cloning.
  • the resulting plasmid was named pDZ2457::P(cj7)-gapN(L).
  • the vector was used to introduce gapN into a lysine, leucine or acetyl homoserine-producing strain.
  • the Ldb1179 gene was amplified with a gene fragment of about 1.43 kb in a form in which the initiation codon TTG was changed to ATG using SEQ ID NOs: 3 and 7 primers using the chromosome of Lactobacillus delburuki subspecies bulgaricus ATCC 11842 strain as a template (Table 1) .
  • the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 1 minute and 30 seconds.
  • the PCR product was purified by electrophoresis on a 0.8% agarose gel by eluting an approximately 1.4 kb band.
  • the cj7 promoter region was subjected to PCR under the same conditions using the primer pair of SEQ ID NOs: 8 and 6 to obtain a PCR product.
  • the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 30 seconds.
  • the PCR product obtained above was fusion cloned.
  • An In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used for fusion cloning.
  • the resulting plasmid was named pDZ1108::P(cj7)-gapN(L).
  • the vector was used to introduce gapN into isoleucine or threonine-producing strains.
  • the Ldb1179 gene was amplified with a gene fragment of about 1.43 kb in a form in which the start codon TTG was changed to ATG using SEQ ID NOs: 3 and 10 primers using the chromosome of Lactobacillus delburuki subspecies bulgaricus ATCC 11842 strain as a template (Table 1) .
  • the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 1 minute and 30 seconds.
  • the PCR product was purified by electrophoresis on a 0.8% agarose gel by eluting an approximately 1.4 kb band.
  • the cj7 promoter region was subjected to PCR under the same conditions using the primer pair of SEQ ID NOs: 9 and 6 to obtain a PCR product.
  • the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 30 seconds.
  • the PCR product obtained above was fusion cloned.
  • An In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used for fusion cloning.
  • the resulting plasmid was named pDZTn5::P(cj7)-gapN(L).
  • the vector was used to introduce gapN into a valine or arginine-producing strain.
  • Ldb1179 gene For the Ldb1179 gene, a gene fragment of about 1.43 kb was amplified in a form in which the start codon TTG was changed to ATG using SEQ ID NO: 3 and 12 primers using the chromosome of the Lactobacillus delburuki subspecies bulgaricus ATCC 11842 strain as a template (Table 1) . At this time, the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 1 minute and 30 seconds. The PCR product was purified by electrophoresis on a 0.8% agarose gel by eluting an approximately 1.4 kb band.
  • the cj7 promoter region was subjected to PCR under the same conditions using the primer pair of SEQ ID NOs: 11 and 6 to obtain a PCR product.
  • the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 30 seconds.
  • the PCR product obtained above was fusion cloned.
  • An In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used for fusion cloning.
  • the resulting plasmid was named pDZ0286::P(cj7)-gapN(L).
  • the vector was used to introduce gapN into a glutamic acid-producing strain.
  • Example 1-2 Streptococcus mutant ( Streptococcus mutans ) Vector construction for introducing NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapN(S)) derived from ATCC 25175 into a transposon in the chromosome of a microorganism of the genus Corynebacterium
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) and base sequence (SEQ ID NO: 14) of the SMUFR_0590 gene encoding gapN derived from the Streptococcus mutant ATCC 25175 was obtained from the National Institutes of Health (NIH GenBank), and by the CJ7 promoter in the transposon gene. A vector was prepared for introducing the expressed SMUFR_0590.
  • Example 1-1 the vector pDZ for transformation was used, and cj7 was used as the promoter.
  • the SMUFR_0590 gene derived from the Streptococcus mutant ATCC 25175 was amplified with a gene fragment of about 1.7 kb using SEQ ID NOs: 15 and 16 primers using pECCG122-Pcj7-gapN (Korean Patent No. 10-1182033) as a template (Table 2) .
  • the PCR reaction was repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and elongation at 72° C. for 2 minutes.
  • the PCR product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel and purified by eluting a band of a desired size.
  • the PCR product obtained above was fusion cloned.
  • An In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used for fusion cloning.
  • the resulting plasmid was named pDZTn::P(cj7)-gapN(S).
  • Examples 1-3 Clostridium acetobutylicum Vector construction for introducing NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapN(C)) derived from Corynebacterium into a transposon in the chromosome of a microorganism of the genus Corynebacterium
  • gapN(C) NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • amino acid sequence (SEQ ID NO: 35) and base sequence (SEQ ID NO: 36) of the gapN gene of NCBI GenBank WP_010966919.1 and NCBI GenBank NC_015687.1 derived from Clostridium acetobutylicum were obtained from NCBI GenBank, and CJ7 in the transposon gene
  • a vector for introducing gapN of NCBI GenBank WP_010966919.1 expressed by a promoter was constructed.
  • Example 1-1 the vector pDZ for transformation was used, and cj7 was used as the promoter.
  • the gapN gene of NCBI GenBank WP_010966919.1 derived from Clostridium acetobutylicum was amplified by using the Clostridium acetobutylicum gDNA as a template and primers SEQ ID NOs: 37 and 38 to amplify a gene fragment of about 1.5 kb.
  • pECCG122-Pcj7-gapN Korean Patent Registration No.
  • Example 2-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L), gapN(S) or gapN(C) in L-lysine-producing strain KCCM11016P
  • the selected strains were named KCCM11016P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S), and KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C), respectively.
  • the prepared strains were cultured in the following way to compare the lysine production capacity. Each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the seed medium, and incubated at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm. Then, a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and cultured with shaking at 30° C. for 72 hours at 200 rpm.
  • the composition of the species medium and the production medium is as follows, respectively.
  • L-lysine concentration and concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 4 below.
  • the concentration of L-lysine increased by about 16% in KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S) introduced with the gapN gene compared to the L-lysine-producing strain KCCM11016P, KCCM11016P:::P ( It was confirmed that the concentration of L-lysine increased by about 20% in cj7)-gapN(L), and the concentration of L-lysine increased by about 9% in KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C).
  • KCCM11016P::P(cj7)-gapN(L) was named CA01-7528 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty on September 2, 2019, and was given an accession number KCCM12585P.
  • Example 2-2 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L), gapN(S), or gapN(C) in L-lysine-producing strain KCCM11347P
  • the prepared strain was cultured in the same manner as in Example 2-1, and after completion of the culture, the production ability of L-lysine was measured by HPLC.
  • the L-lysine concentration and the concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 5 below.
  • Example 1-1-1 the plasmid prepared in Example 1-1-1, the plasmid prepared in Example 1-2, and the plasmid prepared in Examples 1-3
  • the strain introduced into the L-lysine-producing strain, Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) in the same manner as in Example 2-1 was prepared and , CJ3P::P(cj7)-gapN(L), CJ3P::P(cj7)-gapN(S), and CJ3P::P(cj7)-gapN(C), respectively.
  • the CJ3P strain introduced three types of mutations (pyc(Pro458Ser), hom(Val59Ala), lysC(Thr311Ile)) into wild strains based on previously known technology to have L-lysine-producing ability Corynebacterium glutami. cum strain.
  • the prepared strain was cultured in the same manner as in Example 2-1, and after completion of the culture, the production ability of L-lysine was measured by HPLC.
  • the L-lysine concentration and the concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 6 below.
  • the concentration of L-lysine increased by about 8% in CJ3P::P(cj7)-gapN(S) into which the gapN gene was introduced compared to the L-lysine-producing strain CJ3P, CJ3P::P(cj7) It was confirmed that the concentration of L-lysine increased by about 13% in )-gapN(L), and the concentration of L-lysine increased by about 4% in CJ3P::P(cj7)-gapN(C).
  • Example 2-4 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L), gapN(S) or gapN(C) in L-lysine-producing strain KCCM10770P
  • Example 1-1-1 In order to confirm the effect in another lysine-producing strain belonging to Corynebacterium glutamicum, the plasmid prepared in Example 1-1-1, the plasmid prepared in Example 1-2, and the plasmid prepared in Examples 1-3 Using a plasmid, the strain introduced into Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Korea Patent No. 10-0924065), which is an L-lysine-producing strain with enhanced lysine biosynthesis pathway, in the same manner as in Example 2-1.
  • KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C) were produced, and named as KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L), KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S), KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C), respectively.
  • the KCCM10770P strain is a lysine biosynthetic pathway constituting genes aspB (gene encoding aspartate aminotransferase), lysC (gene encoding aspartate kinase), asd (gene encoding aspartate semialdehyde dehydrogenase) ), dapA (gene encoding dihydrodipicolinate synthase), dapB (gene encoding dihydrodipicolinate reductase) and lysA (gene encoding diaminodipimelate decarboxylase), i.e. , an L-lysine-producing strain having two copies of each of the six genes on the chromosome.
  • the prepared strain was cultured in the same manner as in Example 2-1, and after completion of the culture, the production ability of L-lysine was measured by HPLC.
  • the L-lysine concentration and the concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 7 below.
  • the concentration of L-lysine increased by about 17% in KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S) introduced with the gapN gene compared to the L-lysine-producing strain KCCM10770P, KCCM10770P::P(cj7) It was confirmed that the concentration of L-lysine increased by about 25% in )-gapN(L), and the concentration of L-lysine increased by about 10% in KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C).
  • Example 3-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-threonine-producing strains
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 17 and 18 or SEQ ID NOs: 19 and 20 using the WT chromosome as a template. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 30 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes. As a result, a 509 bp DNA fragment in the 5' upper region and a 520 bp DNA fragment in the 3' lower region were obtained based on the mutation of the lysC gene, respectively.
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NOs: 17 and 20. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 60 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes.
  • a 1011 bp DNA fragment containing a mutation in the lysC gene encoding an aspartokinase variant in which the leucine at position 377 was substituted with a lysine was amplified.
  • the transformed strain was obtained in a selective medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • a strain WT::lysC (L377K) in which a nucleotide mutation was introduced into the lysC gene was obtained by a DNA fragment inserted into the chromosome through a secondary recombination process (cross-over).
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 21 and 22 and primers of SEQ ID NOs: 23 and 24 using WT genomic DNA as a template. PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 30 seconds, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes. As a result, a 290 bp DNA fragment at the 5' upper end and a 170 bp DNA fragment at the 3' lower end were obtained centering on the hom gene mutation.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 21 and 24 using the two PCR products as templates. After denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes. As a result, a 440 bp DNA fragment containing the hom gene mutation was amplified.
  • the obtained pDZ-hom(R398Q) vector was introduced into the WT::lysC(L377K) strain by electroporation, and then the transformed strain was obtained in a selective medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • Example 1-1-2 The plasmid prepared in Example 1-1-2 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced into the WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) strain, and in the same manner as in Example 2-1.
  • the strains were constructed and WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L), WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN( S) was named.
  • the prepared strain was cultured in the same manner as in Example 2-1, and the L-threonine production ability was compared after the culture was terminated.
  • the L-threonine concentration and the concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 10 below.
  • WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L) was named CA09-0906 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, an institution under the Budapest Treaty, as of September 2, 2019. It was given accession number KCCM12586P.
  • Example 3-2 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-threonine producing strain KCCM11222P
  • Example 1-1-2 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced into Corynebacterium glutamicum KCCM11222P (WO2013/081296), which is an L-threonine-producing strain, and the above Example Strains were prepared in the same manner as in 2-1, and were named KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L) and KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S), respectively.
  • the prepared strain was cultured in the same manner as in Example 2-1, and the L-threonine production ability was compared after the culture was terminated.
  • the L-threonine concentration and the concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 11 below.
  • Example 4-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-isoleucine-producing strains
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (hereinafter WT) strain based on L. delbrueckii subsp.
  • WT Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • ilvA mutation [ilvA (V323A); S. Morbach et al., Appl. Enviro. Microbiol., 62(12): 4345-4351, 1996] was introduced to prepare a strain with enhanced L-isoleucine production ability.
  • a pair of primers (SEQ ID NOs: 25 and 26) for amplifying the 5' upper region around the mutation site and a pair of primers for amplifying the 3' lower region (SEQ ID NOs: 27 and 28) was devised.
  • a BamHI restriction enzyme site (indicated by an underline) was inserted at each end, and the primers of SEQ ID NOs: 26 and 27 were designed to cross each other so that a nucleotide substitution mutation (indicated by an underline) was located. did.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 using the WT chromosome as a template. PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 30 seconds, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes. As a result, a 627 bp DNA fragment at the 5' upper end and a 608 bp DNA fragment at the 3' lower end were obtained centering on the mutation of the ilvA gene.
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 28. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 60 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes.
  • a 1217 bp DNA fragment containing a mutation in the ilvA gene encoding the IlvA variant in which valine at position 323 was substituted with alanine was amplified.
  • the pECCG117 vector (Korean Patent No. 10-0057684) and a DNA fragment of 1011 bp were treated with a restriction enzyme BamHI, ligated using a DNA conjugation enzyme, and then cloned to obtain a plasmid, which was called pECCG117-ilvA (V323A). named.
  • R398Q By introducing into the R398Q)::P(cj7)-gapN(S) strain, a strain in which the ilvA(V323A) mutation was introduced was prepared.
  • a strain in which only ilvA(V323A) mutation was introduced into WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) was also prepared.
  • the prepared strain was cultured in the same manner as in Example 2-1, and the L-isoleucine-producing ability was compared after the end of the culture.
  • the L-isoleucine concentration and the concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 13 below.
  • WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A) was named CA10-3108, It was deposited on September 2 and was given accession number KCCM12582P.
  • Example 4- Production and evaluation of the strain introduced with gapN(L) or gapN(S) in the L-isoleucine producing strain KCCM11248P
  • Example 1-1-2 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced into L-isoleucine-producing strain, Corynebacterium glutamicum KCCM11248P (Korean Patent No. 10-1335789), Strains were prepared in the same manner as in Example 2-1, and were named KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L) and KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S), respectively.
  • the produced strain was cultured in the same manner as in Example 2-1 to compare L-isoleucine production ability. After completion of the culture, the production ability of L-isoleucine was measured by HPLC, and the L-isoleucine concentration and concentration increase rate in the culture solution for each strain tested are shown in Table 14 below.
  • the concentration of L-isoleucine increased by about 38% in KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S) into which the gapN gene was introduced compared to the L-isoleucine-producing strain KCCM11248P, KCCM11248P::P(cj7) )-gapN(L), it was confirmed that the concentration of L-isoleucine increased by about 61.5%.
  • Example 5-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-leucine-producing strains
  • the recombinant plasmid pDZ-leuA (R558H, G561D) prepared in the above patent was introduced into the WT strain by an electric pulse method, and then selected in a medium containing 25 mg/l of kanamycin.
  • a strain in which nucleotide mutations were introduced into the leuA gene, WT::leuA (R558H, G561D) was obtained by a DNA fragment inserted on the chromosome through a secondary recombination process (cross-over), and it was named CJL8001.
  • Example 2- Strains were prepared in the same manner as in 1, and named as CJL8001::P(cj7)-gapN(S) and CJL8001::P(cj7)-gapN(L), respectively.
  • the produced strain was cultured in the following manner to compare the leucine-producing ability. After subculture of each strain in a nutrient medium, each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium, and cultured with shaking at 30° C. for 72 hours at 200 rpm. Then, the concentration of L- leucine was analyzed using HPLC, and the concentration and the concentration increase rate of the analyzed L- leucine are shown in Table 15 below.
  • Glucose 10g broth 5g, polypeptone 10g, sodium chloride 2.5g, yeast extract 5g, agar 20g, urea 2g (based on 1 liter of distilled water)
  • Glucose 50 g Ammonium Sulfate 20 g, Corn Steep Solids 20 g, Potassium Dibasic 1 g, Magnesium Sulfate 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine-HCl 1 mg, Calcium Carbonate 15 g (distilled water) 1 liter)
  • CJL8001::P(cj7)-gapN(L) was named CA13-8102 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty, on September 2, 2019, and was given accession number KCCM12583P.
  • Example 5-2 Production and evaluation of L-leucine producing strains KCCM11661P, KCCM11662P with gapN (L) or gapN (S) introduced strain
  • Example 1-1-1 L-leucine-producing strains Corynebacterium glutamicum KCCM11661P (Korean Patent No. 10-1851898), KCCM11662P (Korean Patent No. 10-1796830) was produced in Example 1-1-1
  • KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L) were named.
  • the prepared strain was cultured in the same manner as in Example 5-1, and L-leucine production ability was compared after the culture was terminated.
  • the concentration and concentration increase rate of L-leucine produced in each strain are shown in Table 16 below.
  • the gapN gene introduced KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S) compared to L-leucine-producing strains KCCM11661P and KCCM11662P, L- It was confirmed that the concentration of leucine increased by about 4%, and the concentration of L-leucine increased by about 11% in KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L).
  • Example 6-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-valine producing strains
  • PCR was performed using the genomic DNA of the ATCC13869 strain, which is a wild-type Corynebacterium glutamicum, as a template.
  • gene fragments (A, B) were obtained using the primer pair of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30, and the primer pair of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32, respectively.
  • PCR conditions include denaturation at 94°C for 5 minutes, then denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds, repeated 25 times, and polymerization was performed at 72°C for 7 minutes. .
  • the obtained 1044bp DNA fragment and the previously used pDZ vector were treated with restriction enzyme XbaI, ligated using a conjugation enzyme, and then cloned to obtain a plasmid, which was named pDZ-ilvN (A42V).
  • SEQ ID NO: sequence (5'-3') 29 AATTTCTAGAGGCAGACCCTATTCTATGAAGG 30 AGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGAC 31 GTCCCTCGTGTCTGTAAAGACCGAAACACT 32 AATTTCTAGACGTGGGAGTGTCACTCGCTTGG
  • the recombinant plasmid pDZ-ilvN (A42V) prepared above was introduced into the wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13869 by an electric pulse method by homologous recombination on the chromosome, and then containing 25 mg/L of kanamycin.
  • Transformed strains were obtained from one selective medium. After amplifying the gene fragment through PCR using the primers of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 32 for the Corynebacterium glutamicum transformant on which the secondary recombination has been completed, the mutation introduced strain is identified through gene sequence analysis did.
  • the recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum CJ8V.
  • Example 1-1-3 the plasmid prepared in Example 1-1-3 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced to Corynebacterium glutamicum CJ8V having L-valine-producing ability
  • Strains were prepared in the same manner as in 2-1 and named CJ8V::P(cj7)-gapN(L) and CJ8V::Pcj7-gapN(S), respectively.
  • the produced strain was cultured in the following manner to compare L-valine production ability.
  • each strain was subcultured in a nutrient medium, each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium, and cultured with shaking at 30° C. for 72 hours at 200 rpm. Thereafter, the concentration of L-valine was analyzed using HPLC, and the analyzed concentration and the increase rate of the concentration of L-valine are shown in Table 18 below.
  • Glucose 10g broth 5g, polypeptone 10g, sodium chloride 2.5g, yeast extract 5g, agar 20g, urea 2g (based on 1 liter of distilled water)
  • CJ8V-Pcj7/gapN(L) was named CA08-2038 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty, on September 2, 2019, and was given accession number KCCM12581P.
  • Example 6-2 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-valine producing strain KCCM11201P
  • Example 1-1-3 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced into L-valine-producing strain, Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (Korean Patent No. 10-1117022), Strains were prepared in the same manner as in Example 2-1, and were named KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L) and KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S), respectively.
  • the L-valine concentration was analyzed by culturing in the same manner as in Example 6-1, and the analyzed L-valine concentration and the concentration increase rate are shown in Table 19 below. .
  • Example 7-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-arginine-producing strains
  • Example 1-1-3 the plasmid prepared in Example 1-1-3 and Example 1- targeting the wild strain Corynebacterium glutamicum ATCC21831
  • strains were prepared in the same manner as in Example 2-1, and named ATCC21831::P(cj7)gapN(L), ATCC21831::P(cj7)-gapN(S), respectively. did.
  • the produced strain was cultured in the following way to compare L-arginine production ability. After subculture of each strain in a nutrient medium, each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the seed medium, and cultured with shaking at 30° C. for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium and cultured with shaking at 30° C. for 72 hours at 200 rpm.
  • the composition of the nutrient medium, the species medium, and the production medium is as follows, respectively. After the end of the culture, the production of L-arginine was measured by HPLC, and the analyzed concentration and concentration increase rate of L-arginine are shown in Table 20 below.
  • Glucose 10 g broth 5 g, polypeptone 10 g, sodium chloride 2.5 g, yeast extract 5 g, agar 20 g, urea 2 g (based on 1 liter of distilled water)
  • ATCC21831::P(cj7)gapN(L) was named CA06-2951 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty on September 2, 2019, and was given accession number KCCM12580P.
  • Example 7-2 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-arginine-producing strain KCCM10741P
  • Example 1-1-3 The plasmid prepared in Example 1-1-3 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced into the L-arginine-producing strain, Corynebacterium glutamicum KCCM10741P (Korean Patent No. 10-0791659).
  • strains were prepared in the same manner as in Example 2-1 and named KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L), KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S), respectively.
  • the concentration of L-arginine was analyzed by culturing in the same manner as in Example 7-1, and the concentration and concentration increase rate of the analyzed L-arginine are shown in Table 21 below. .
  • Example 8-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in O-acetyl homoserine-producing strains
  • Example 1-1-1 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced into the wild-type strain, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, to prepare a strain in the same manner as in Example 2-1. and ATCC13032::P(cj7)-gapN(L), ATCC13032::P(cj7)-gapN(S), respectively.
  • the produced strain was cultured in the following manner to compare the production ability of O-acetyl homoserine.
  • Each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the seed medium, and incubated at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm. Then, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium and cultured with shaking at 30° C. for 48 hours at 200 rpm.
  • the composition of the species medium and the production medium is as follows, respectively.
  • Glucose 50 g (NH 4 ) 2 SO 4 12.5 g, Soy Protein 2.5 g, Corn Steep Solids 5 g, Urea 3 g, KH 2 PO 4 1 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, thiamine hydrochloride 1000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2,000 ⁇ g, nicotinamide 3000 ⁇ g, CaCO 3 30 g (based on 1 liter of distilled water)
  • O-acetyl homoserine concentration and concentration increase rate in the culture medium for each strain tested are shown in Table 22 below.
  • strain name O-acetyl homoserine concentration (g/L) O-acetyl homoserine concentration increase (%) ATCC13032 0.3 g/L - ATCC13032::P(cj7)-gapN(S) 0.4 g/L 33% ATCC13032::P(cj7)-gapN(L) 0.5 g/L 67%
  • the concentration of O-acetyl homoserine increased by about 33% in ATCC13032::P(cj7)-gapN(S) into which the gapN gene was introduced compared to ATCC13032, which is a wild-type strain, ATCC13032:::P ( It was confirmed that the concentration of O-acetyl homoserine increased by about 67% in cj7)-gapN(L).
  • ATCC13032:::P(cj7)-gapN(L) was named CM04-0531 and was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty on September 2, 2019, and was given an accession number KCCM12584P.
  • Example 8-2 In the O-acetyl homoserine producing strain Corynebacterium glutamicum strain L. delbrueckii subsp. Bulgaricus gapN(L) or S. mutans Production and evaluation of strains into which the derived gapN(S) is introduced
  • SEQ ID NOs: 33 and 34 Based on the reported sequence derived from WT (Wild type) to amplify the gene encoding MetX, SEQ ID NOs: 33 and 34 for amplification from the promoter site (about 300 bp above the start codon) to the terminator site (about 100 bp at the bottom of the stop codon) devised. BamHI restriction enzyme sites were inserted at both ends of the primers of SEQ ID NOs: 33 and 34. PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 90 seconds, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • pECCG117-metX WT a DNA fragment of 1546 bp of the coding region of the metX gene was obtained.
  • the pECCG117 vector (Korean Patent No. 10-0057684) and the metX DNA fragment were treated with BamHI, ligated using a DNA conjugation enzyme, and then cloned to obtain a plasmid, which was named pECCG117-metX WT.
  • the prepared strains were cultured in the same manner as in the flask culture method of Example 8-1, and the concentration and concentration increase rate of O-acetyl homoserine in the culture medium were analyzed, and the results are shown in Table 24.
  • strain name O-acetyl homoserine concentration (g/L) O-acetyl homoserine concentration increase (%) WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-metX WT 2.0 g/L - WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-metX WT 2.7 g/L 35% WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-metX WT 3.1 g/L 55%
  • the concentration of O-acetyl homoserine increased by about 35%
  • Example 9-1 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in glutamic acid-producing strains
  • Each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the seed medium, and incubated at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm. Then, a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and cultured with shaking at 30° C. for 40 hours at 200 rpm. Cultivation was carried out in biotin-restricted conditions. After completion of the culture, the L-glutamic acid concentration and the concentration increase rate were measured through the method using HPLC, and the measurement results are shown in Table 25 below.
  • ATCC13869:::P(cj7)-gapN(L) was named CA02-1360 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee under the Budapest Treaty, on September 2, 2019, and was given accession number KCCM12587P.
  • Example 9-2 Production and evaluation of strains introduced with gapN(L) or gapN(S) in L-glutamic acid producing strain KFCC11074
  • Example 1-1-4 The plasmid prepared in Example 1-1-4 and the plasmid prepared in Example 1-2 were introduced into the L-glutamic acid producing strain, Corynebacterium glutamicum KFCC11074 strain (Korean Patent No. 10-0292299).
  • the strains prepared in the same manner as in Example 2-1 were named KFCC11074::P(cj7)-gapN(L) and KFCC11074::P(cj7)-gapN(S), respectively.
  • the concentration of L-glutamic acid was analyzed by culturing in the same manner as in Example 10-1, and the analyzed concentration and concentration increase rate of L-glutamic acid are shown in Table 26 below. .
  • L. delbrueckii subsp. Bulgaricus or S. mutans- derived gapN gene introduction improves L-amino acid production, and in particular, L. delbrueckii subsp.
  • the gapN gene derived from Bulgaricus was introduced, it was confirmed that it exhibited better L-amino acid production ability.

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Abstract

본 출원은 락토바실러스 속 유래의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 L-아미노산 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물에 관한 것으로, 본 출원에 따라 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) 유래의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 도입함으로써 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 통해 환원력을 증가시켜 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 균주의 L-아미노산 생산능을 증대시킬 수 있다.

Description

NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 Ｌ-아미노산을 생산하는 방법
본 출원은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 L-아미노산 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 속 미생물(Corynebacterium sp.)은 L- 아미노산 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 다양한 용도를 갖는 물질을 산업적으로 생산하는데에 자주 이용되는 그람양성 미생물이다. 근래에는 디아민(diamine), 케토산(keto-acid) 등을 코리네박테리움 속 미생물로부터 생산하기도 한다.
미생물 발효를 통하여 유용 산물을 생산하기 위하여, 미생물내 목적산물의 생합성 경로 강화와 함께 에너지원 또는 환원력에 대한 요구가 증가한다. 이 중, 환원력을 공급하는데 있어 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)는 필수요소이다. 산화형인 NADP+와 환원형인 NADPH는 서로 생체내 전자 전달 물질로, 여러 합성과정에 관여한다. 중앙대사 경로중 NADPH를 생산하는 경로에는 1) 산화적 오탄당 인산경로(oxidative pentose phosphate pathway)와 2) TCA경로의 NADP 의존성 이소시트르산 탈수소효소(NADP-dependent isocitrate dehydrogenase; Icd 유전자)에 의해 주로 생산되는 것으로 알려져 있다. 이외 여러 미생물에서 NADPH를 공급하기 위한 다양한 대안경로로써 말레익 효소(malate enzyme), 글루코즈 디하이드로지나제(glucose dehydrogenase). 비인산화 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(nonphosphorylation glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 가지고 있다.
또한 중앙대사경로와 무관하게 NADPH를 생산하는 효소로는 트렌스수소화효소(transhydrogenase), 페레독신 NADP+ 산화환원효소(Ferredoxin: NADP+ oxidoredutase) 등이 있다(Spaans et al, 2015, NADPH-generating systems in bacteria and archaea, Front. Microbiol. 6:742).
본 발명자들은 아미노산 생산 미생물에서 각각의 아미노산 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코리네박테리움 속 미생물에 도입하는 다방면의 연구를 통하여 코리네박테리움 속 미생물에서 아미노산 및 그의 전구체 생산이 증가됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 본 출원의 배양된 미생물 또는 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계;를 포함하는, L-아미노산 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는, L-아미노산 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물의 L-아미노산 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원에 따른 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) 유래의 gapN을 암호화하는 유전자를 도입함으로써 gapN 활성을 통해 환원력을 증가시켜 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물의 L-아미노산 생산능을 증대시킬 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계;를 포함하는, L-아미노산 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원에서, 용어 "NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제"는 글리세르알데하이드-3-포스페이트(glyceraldehyde-3-phosphate)를 기질로 하고 조효소인 NADP를 이용하여 3-포스포글리세레이트(3-phasphateglycerate)로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제에는 동물, 식물, 및 박테리아로부터 유래한 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제가 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제는 박테리아로부터 유래하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)으로부터 유래하는 것일 수 있으며, 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)로부터 유래하는 것일 수 있다. 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제는 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 출원에서 상기 서열번호 1은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 구체적으로, 상기 서열번호 1는 gapN 유전자에 의해 코딩되는 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 갖는 폴리펩티드 서열일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 폴리펩티드는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 유래일 수 있고, 구체적으로 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)로부터 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)에서 얻을 수 있다. 또한, 본 출원에서의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 비록 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드라고 정의하였으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 갖는 폴리펩티드에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 폴리펩티드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 본 출원의 변이 대상이 되는 폴리펩티드의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자는 gapN 유전자이며, 상기 유전자는 박테리아로부터 유래하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 미생물으로부터 유래하는 것일 수 있으나, gapN 유전자를 발현할 수 있는 락토바실러스 속 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 락토바실러스 속 미생물은 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60 ℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68 ℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원에서, 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 코리네박테리움 속 미생물 내에 도입되어, 코리네박테리움 속 미생물 내에서 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제가 발현될 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드가 "발현되도록/되는"은 목적 폴리펩티드가 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 본 출원의 목적상 "목적 폴리펩티드"는 전술한 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제일 수 있다.
구체적으로, "폴리펩티드의 도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 목적 폴리펩티드의 활성을 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 미생물 내 염색체로 도입되거나, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 미생물 내로 도입되어 이의 활성이 나타나는 것일 수 있다. 비록 상기 목적 폴리펩티드가 미생물 내 이미 존재하더라도, 상기 목적 폴리펩티드가 미생물 내 도입됨으로 인하여, 미생물 내 상기 폴리펩티드의 발현 또는 활성이 비변형 미생물에 비하여 증가되거나 강화될 수 있다.
또한, "활성의 강화"는 미생물 내 특정 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 향상된 것을 의미하거나, 또는 비변이 미생물 내 폴리펩티드의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 말한다.
구체적으로, 활성 강화는 상기 미생물에 폴리펩티드를 도입하는 방법, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가 방법, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법 및 상기 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 변이를 추가적으로 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기에서 미생물에 폴리펩티드를 도입하는 방법 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 벡터를 이용하여 미생물 내 염색체 또는 플라스미드에 삽입하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절 서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1783170호), O2 프로모터(대한민국 등록특허 제10-1632642), tkt 프로모터 및 yccA 프로모터 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 도입 및 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도가 야생형이나 비변형 미생물 균주에서의 폴리펩티드의 활성 또는 농도에 비하여 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성 도입 또는 강화는, 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현용 재조합 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 코리네박테리움 속 미생물 내에 도입하여 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물을 생산함으로써 이루어질 수 있다. 즉, 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물은 상기 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어 제조되는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록, 적합한 조절 서열 및 상기 목적 폴리펩티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계, pMal계, pQE계 및 pCL계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 발현용 재조합 벡터는 통상적인 방법 즉, 적절한 벡터에 제한효소를 사용하여 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디히드로게나제의 유전자 염기서열을 라이게이션시킴으로써 제조된 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드 발현용 재조합 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 발현하도록 유전적으로 변형된 코리네박테리움 속 미생물은 비변형 미생물에 비하여, L-아미노산 생산능이 증가된 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-아미노산을 생산하는 미생물" 또는 "L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물"은 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물 또는 코리네박테리움 속 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-아미노산 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
구체적으로, 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로 내 폴리펩티드 일부의 활성이 강화되거나, 목적하는 L-아미노산 분해 경로 내 폴리펩티드 일부의 활성이 약화되어 목적하는 L-아미노산의 생산능이 강화된 미생물일 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물은, 아스파테이트 키나제(aspartate kinase, lysC), 호모세린 디히드로게나제(homoserine dehydrogenase, hom), L-쓰레오닌 디히드라타제(L-threonine dehydratase, ilvA), 2-이소프로필말레이트 신타제(2-isopropylmalate synthase, leuA), 아세토락테이트 신타제(Acetolactate synthase, ilvN), 또는/및 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제(Homoserine O-acetyltransferase, metX)의 활성이 강화된 미생물일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 미생물은 피드백 저해(feedback inhibition) 저항성을 갖도록 변형되어 활성이 강화된 유전자 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 미생물은 목적하는 L-아미노산을 분해하는 다양한 유전자 또는 폴리펩티드의 활성이 약화되거나 불활성화된 것일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 미생물은 랜덤 변이로 L-아미노산 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 미생물은 목적하는 L-아미노산 생합성경로의 폴리펩티드 활성을 강화시키거나 분해경로의 폴리펩티드 활성을 불활성화/약화시켜, 목적하는 L-아미노산의 생산이 증가된 미생물일 수 있다.
전술한 바와 같은 폴리펩티드의 활성 강화는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가; 폴리펩티드를 암호화하는 염색체상 유전자 및/또는 이의 발현 조절 서열에 변이 도입; 폴리펩티드를 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체; 폴리펩티드 발현을 증가시키거나 피드백 저해 저항성을 갖도록, 폴리펩티드를 암호화하는 염색체상의 유전자 일부에 변이 도입; 또는 이를 조합한 방법으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 "폴리펩티드 활성의 약화/불활성화"는 효소 또는 폴리펩티드의 발현이 천연의 야생형 균주, 모균주 또는 해당 폴리펩티드가 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 변이, 발현조절서열의 변형, 유전자 일부 또는 전체의 결손 등으로 폴리펩티드의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드의 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다. 본 출원에 있어서, 상기 불활성화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형; 상기 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 폴리펩티드를 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형; 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 상기 폴리펩티드를 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
다만 전술한 방법은 하나의 예시로, 폴리펩티드의 활성 강화 또는 불활성화 방법 및 유전자 조작 방법은 당업계에 공지되어 있는 바, 상기 L-아미노산 생산 미생물은 공지의 다양한 방법을 적용하여 제조될 수 있다.
본 출원의 목적상 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 상기 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은, 배지 중의 탄소원으로부터 목적하는 L-아미노산을 비변형 야생형 균주 또는 비변형 변이주와 비교하여 과량으로 생산할 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다. 본 출원에서 상기 "L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물"은 "L-아미노산 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 균주" 또는 "L-아미노산 생산 코리네박테리움 속 균주"과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 갖는 폴리펩티드가 발현되도록 변형된, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은, L-아미노산을 생산할 수 있는 코리네박테리움 속 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 및 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 전술한 바와 같다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20 ℃내지 45 ℃, 구체적으로는 25 ℃ 내지 40 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 160 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 배양에 의하여 생산된 L-아미노산은 배지 중으로 배출되거나 미처 배출되지 못하고 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-아미노산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아미노산을 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 L-아미노산은 정제된 형태 또는 L-아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
본 출원에 따른 L-아미노산 생산 방법으로 생산되는 L-아미노산은 그 종류에 제한이 없다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물로부터 생산될 수 있는 L-아미노산은 제한 없이 모두 포함될 수 있고, L-아미노산의 중간체도 포함될 수 있다. 상기 L-아미노산은 예를 들면, L-아르기닌, L-히스티딘, L-라이신, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-세린, L-쓰레오닌, L-아스파라긴, L-글루타민, L-티로신, L-알라닌, L-이소류신, L-루이신, L-발린, L-페닐알라닌, L-메티오닌, L-트립토판, L-글리신, L-프롤린 및 L-시스테인 등일 수 있으며, 구체적으로 L-라이신, L-쓰레오닌, L-이소류신, L-루이신, L-발린, L-아르기닌, L-글루탐산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 L-아미노산의 중간체는 예를 들면, O-아세틸 호모세린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는, L-아미노산 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현 및 코리네박테리움 속 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제가 발현되어 비변형 미생물에 비하여 L-아미노산 생산능이 증대 또는 향상된 것일 수 있다.
본 출원의 코리네박테리움 속 미생물은 L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물로서, 야생형 미생물뿐만 아니라, L-아미노산 생산능이 개선되도록 유전적으로 변형된 미생물을 포함할 수 있다. L-아미노산을 생산하는 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원의 미생물은, 상기 락토바실러스 속 유래의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하지 않는 미생물에 비하여 배지 중의 탄소원으로부터 목적하는 L-아미노산을 과량으로 생산할 수 있다. 상기 재조합 미생물의 증대된 L-아미노산 생산능은 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성화에 의해 증가된 환원력으로 얻어지는 것일 수 있다. 즉, 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물에 도입함으로써 NAD을 조효소로 이용하는 대신에 NADP를 이용하도록 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 활성화시키고, 이를 통해 NADPH의 양을 늘려 L-아미노산 생합성 과정에서 에너지원인 환원력으로 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어 "비변형 미생물"은 천연형 균주 자체이거나, 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L-아미노산에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에 따른 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 L-아미노산 생산능이 증대된 코리네박테리움 속 미생물은 수탁번호 KCCM 12580P, 수탁번호 KCCM 12581P, 수탁번호 KCCM 12582P, 수탁번호 KCCM 12583P, 수탁번호 KCCM 12584P, 수탁번호 KCCM 12585P, 수탁번호 KCCM 12586P 또는 수탁번호 KCCM 12587P로 기탁된 코리네박테리움 속 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물의 L-아미노산 생산 용도를 제공하는 것이다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제, 이를 코딩하는 유전자, 이의 발현, 미생물. 코리네박테리움 속 미생물, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물, 및 L-아미노산에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1-1. 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 유래의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(gapN(L))를 코리네박테리움 속 미생물 염색체 내 트랜스포존에 도입하기 위한 벡터 제작
코리네박테리움에 친화력이 높은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제로 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) 유래의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 선정하였다. 이후 상기 활성을 향상시키기 위해 다음의 실험을 진행하였다.
락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 유래의 gapN을 암호화 하는 Ldb1179 유전자의 아미노산 서열(서열번호 1)과 염기서열(서열번호 2)은 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 확보하였다.
또한, 코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 Ldb1179 유전자를 도입하기 위하여 형질전환용 벡터 4종을 각각 제작하였고, 프로모터는 cj7(대한민국 등록특허 제10-0620092호)를 이용하였다.
1-1-1) pDZ2457::P(cj7)-gapN(L) 벡터 제작
Ldb1179 유전자는 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 3 및 4 프라이머를 이용하여 개시코돈 TTG를 ATG로 변경한 형태로 약 1.43 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 1). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 약 1.4 kb 밴드를 용리하여 정제하였다. 또한, cj7 프로모터 부위는 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝시 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 이로부터 얻은 플라스미드를 pDZ2457::P(cj7)-gapN(L)라 명명하였다.
상기 벡터는 라이신, 루이신 또는 아세틸 호모세린 생산 균주에 gapN을 도입하기 위해 사용하였다.
1-1-2) pDZ1108::P(cj7)-gapN(L) 벡터 제작
Ldb1179 유전자는 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 3 및 7 프라이머를 이용하여 개시코돈 TTG를 ATG로 변경한 형태로 약 1.43 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 1). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 약 1.4 kb 밴드를 용리하여 정제하였다. 또한, cj7 프로모터 부위는 서열번호 8 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝시 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 이로부터 얻은 플라스미드를 pDZ1108::P(cj7)-gapN(L)라 명명하였다.
상기 벡터는 이소류신 또는 쓰레오닌 생산 균주에 gapN을 도입하기 위해 사용하였다.
1-1-3) pDZTn5::P(cj7)-gapN(L) 벡터 제작
Ldb1179 유전자는 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 3 및 10 프라이머를 이용하여 개시코돈 TTG를 ATG로 변경한 형태로 약 1.43 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 1). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 약 1.4 kb 밴드를 용리하여 정제하였다. 또한, cj7 프로모터 부위는 서열번호 9 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝시 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 이로부터 얻은 플라스미드를 pDZTn5::P(cj7)-gapN(L)라 명명하였다.
상기 벡터는 발린 또는 아르기닌 생산 균주에 gapN을 도입하기 위해 사용하였다.
1-1-4) pDZ0286::P(cj7)- gapN(L) 벡터 제작
Ldb1179 유전자는 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 3 및 12 프라이머를 이용하여 개시코돈 TTG를 ATG로 변경한 형태로 약 1.43 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 1). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 약 1.4 kb 밴드를 용리하여 정제하였다. 또한, cj7 프로모터 부위는 서열번호 11 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝시 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 이로부터 얻은 플라스미드를 pDZ0286::P(cj7)- gapN(L)라 명명하였다.
상기 벡터는 글루탐산 생산 균주에 gapN을 도입하기 위해 사용하였다.
서열번호 서열(5'-3')
3 CCCAACGAAAGGAAACACTCATGACAGAACACTATTTAAA
4 GCTTGTGAATAAGCCTGCCCTTAGTCTTCGATGTTGAAGACAACG
5 GATTCCAGGTTCCTTAACCCAGAAACATCCCAGCGCTACT
6 TTTAAATAGTGTTCTGTCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG
7 TTTCGTGCGAGTCTAGAAGTTTAGTCTTCGATGTTGAAGA
8 ACGAGGTCAGCATCTCGAGTAGAAACATCCCAGCGCTACT
9 CGCGGAACTGTACTAGTAGAAACATCCCAGCGCTAC
10 GGAAGGATATCTCTAGAAGATAAAACGAAAGGCC
11 CCCTTCCGGTTTAGTACTAGAAACATCCCAGCGCTA
12 CTCTTCCTGTTTAGTACTTTAGTCTTCGATGTTGAAG
실시예 1-2. 스트렙토코커스 변이주 ( Streptococcus mutans ) ATCC 25175 유래의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(gapN(S))를 코리네박테리움 속 미생물 염색체 내 트랜스포존에 도입하기 위한 벡터 제작
락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 유래의 gapN의 대조군으로써, 스트렙토코커스 변이주(Streptococcus mutans) ATCC 25175 내 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 가진 SMUFR_0590(대한민국 등록특허 제10-1182033호)을 도입하기 위해 다음의 실험을 진행하였다.
스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175 유래의 gapN을 암호화하는 SMUFR_0590 유전자의 아미노산 서열(서열번호 13) 및 염기서열(서열번호 14)은 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 확보하였고, 트랜스포존 유전자 내 CJ7 프로모터에 의해 발현되는 SMUFR_0590을 도입하기 위한 벡터를 제작하였다.
실시예 1-1에서와 마찬가지로 형질전환용 벡터 pDZ을 사용하였으며, 프로모터는 cj7를 이용하였다. 스트렙토코커스 변이주 ATCC 25175유래의 SMUFR_0590 유전자는 pECCG122-Pcj7-gapN(대한민국 등록특허 제10-1182033호)을 주형으로 서열번호 15 및 16 프라이머를 이용하여 약 1.7 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다(표 2). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝시 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 이로부터 얻은 플라스미드를 pDZTn::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
15 TAGATGTCGGGCCCCATATGAGAAACATCCCAGCGCTACT
16 GCCAAAACAGCCTCGAGTTATTTGATATCAAATACGACGGATTTA
실시예 1-3. Clostridium acetobutylicum 유래의 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(gapN(C))를 코리네박테리움 속 미생물 염색체 내 트랜스포존에 도입하기 위한 벡터 제작
락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스 ATCC 11842 유래의 gapN의 대조군으로써, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 내 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 활성을 가진 NCBI GenBank WP_010966919.1의 gapN을 도입하기 위해 다음의 실험을 진행하였다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰 유래의 NCBI GenBank WP_010966919.1 및 NCBI GenBank NC_015687.1의 gapN 유전자의 아미노산 서열(서열번호 35) 및 염기서열(서열번호 36)은 NCBI GenBank로부터 확보하였고, 트랜스포존 유전자 내 CJ7 프로모터에 의해 발현되는 NCBI GenBank WP_010966919.1의 gapN을 도입하기 위한 벡터를 제작하였다.
실시예 1-1에서와 마찬가지로 형질전환용 벡터 pDZ을 사용하였으며, 프로모터는 cj7를 이용하였다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 유래의 NCBI GenBank WP_010966919.1의 gapN 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 gDNA를 주형으로 서열번호 37및 38 프라이머를 이용하여 약 1.5 kb 의 유전자 단편을 증폭하였다. 또한 CJ7 프로모터를 얻기 위해 pECCG122-Pcj7-gapN(대한민국 등록특허 제10-1182033호)을 주형으로 서열번호 15 및 서열번호 39를 이용하여 약 400bp의 유전자 단편을 증폭하였다(표 3). 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝시 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 이로부터 얻은 플라스미드를 pDZTn::P(cj7)-gapN(C)라 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
37 ACCCAACGAAAGGAAACACTCatgtttgaaaatatatcatcaaa
38 GCCAAAACAGCCTCGAGttataggtttaaaactattgatt
39 tttgatgatatattttcaaacatGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT
실시예 2-1. L-라이신 생산 균주 KCCM11016P에서 gapN(L), gapN(S) 또는 gapN(C)이 도입된 균주의 제작 및 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주 기반으로 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN이 도입에 의한 L-라이신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 실시예 1-1-1에서 제작한 플라스미드, 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드, 및 실시예 1-3에서 제작한 플라스미드를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신(25 ㎍/㎖)과 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌린-β-D-갈락토시드, 5-bromo-4-chloro-3-indoline-β-D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판배지(Braine heart infusion 37 g/l, 소르비톨 91 g/l, 한천 2%)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 푸른색의 콜로니를 선택함으로써 P(CJ7)-gapN(L), P(CJ7)-gapN(S), 또는 P(CJ7)-gapN(C)가 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 각각 KCCM11016P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C)라 명명하였다.
제작된 균주를 다음과 같은 방법으로 배양하여 라이신 생산능을 비교하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종 배지(pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산 배지(pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1 리터 기준).
배양 종료 후 HPLC로 L-라이신의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 4와 같다.
균주명 L-라이신 농도(g/L) L-라이신 농도 증가율(%)
KCCM11016P 43 g/L -
KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S) 50 g/L 16%
KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L) 52 g/L 20%
KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C) 47 g/L 9%
상기 표 4에서 나타난 바와 같이 L-라이신 생산 균주 KCCM11016P에 비하여 gapN 유전자가 도입된 KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S)에서는 L-라이신의 농도가 약 16% 증가, KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L)에서는 L-라이신의 농도가 약 20% 증가, KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C)에서는 L-라이신의 농도가 약 9% 증가함을 확인하였다.
KCCM11016P::P(cj7)-gapN(L)는 CA01-7528이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12585P를 부여받았다.
실시예 2-2. L-라이신 생산 균주 KCCM11347P에서 gapN(L), gapN(S), 또는 gapN(C)이 도입된 균주의 제작 및 평가
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 라이신 생산 균주에서 라이신 생산능을 확인하기 위해 실시예 1-1-1에서 제작한 플라스미드, 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드, 및 실시예 1-3에서 제작한 플라스미드를 이용하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P(대한민국 등록특허 제10-0073610호)에 도입한 균주를 제작하고, 각각 KCCM11347P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C)라 명명하였다.
제작된 균주를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하고 배양 종료 후 HPLC로 L-라이신의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 5와 같다.
균주명 L-라이신 농도(g/L) L-라이신 농도 증가율(%)
KCCM11347P 38 g/L -
KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S) 43 g/L 14%
KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L) 45 g/L 19%
KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C) 40g/L 5%
상기 표 5에서 나타난 바와 같이 L-라이신 생산 균주 KCCM11347P에 비하여 gapN 유전자가 도입된 KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S)에서는 L-라이신의 농도가 약 14% 증가, KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L)에서는 L-라이신의 농도가 약 19% 증가, KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C)에서는 L-라이신의 농도가 약 5% 증가함을 확인하였다.
실시예 2-3. L-라이신 생산 균주 CJ3P에서 gapN(L), gapN(S), 또는 gapN(C)이 도입된 균주의 제작 및 평가
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 또 다른 라이신 생산 균주에서 효과를 확인하기 위해 실시예 1-1-1에서 제작한 플라스미드, 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드, 및 실시예 1-3에서 제작한 플라스미드를 이용하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 도입한 균주를 제작하고, 각각 CJ3P::P(cj7)-gapN(L), CJ3P::P(cj7)-gapN(S), CJ3P::P(cj7)-gapN(C)라 명명하였다. CJ3P 균주는 기 공지된 기술을 바탕으로 야생주에 3종의 변이(pyc(Pro458Ser), hom(Val59Ala), lysC(Thr311Ile))를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게 된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주이다.
제작된 균주를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하고 배양 종료 후 HPLC로 L-라이신의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 6과 같다.
균주명 L-라이신 농도(g/L) L-라이신 농도 증가율(%)
CJ3P 8.3 g/L -
CJ3P::P(cj7)-gapN(S) 9.0 g/L 8%
CJ3P::P(cj7)-gapN(L) 9.4 g/L 13%
CJ3P::P(cj7)-gapN(C) 8.7 g/L 4%
상기 표 6에서 나타난 바와 같이 L-라이신 생산 균주 CJ3P에 비하여 gapN 유전자가 도입된 CJ3P::P(cj7)-gapN(S)에서는 L-라이신의 농도가 약 8% 증가, CJ3P::P(cj7)-gapN(L)에서는 L-라이신의 농도가 약 13% 증가, CJ3P::P(cj7)-gapN(C)에서는 L-라이신의 농도가 약 4% 증가함을 확인하였다.
실시예 2-4. L-라이신 생산 균주 KCCM10770P에서 gapN(L), gapN(S) 또는 gapN(C)이 도입된 균주의 제작 및 평가
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 또 다른 라이신 생산 균주에서 효과를 확인하기 위해 실시예 1-1-1에서 제작한 플라스미드, 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드, 및 실시예 1-3에서 제작한 플라스미드를 이용하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 라이신 생합성 경로가 강화된 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 도입한 균주를 제작하고, 각각 KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L), KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S), KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C)라 명명하였다. 상기 KCCM10770P 균주는 라이신 생합성 경로 구성 유전자들 중 aspB(아스파테이트 아미노트란스퍼라제를 코딩하는 유전자), lysC(아스파테이트 키나제를 코딩하는 유전자), asd(아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 유전자), dapA(디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 유전자), dapB(디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 유전자) 및 lysA(디아미노디피멜레이트 디카르복실라제를 코딩하는 유전자), 즉, 6종의 유전자를 염색체 상에 각각 2 카피씩 보유한 L-라이신 생산 균주이다.
제작된 균주를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하고 배양 종료 후 HPLC로 L-라이신의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 7과 같다.
균주명 L-라이신 농도(g/L) L-라이신 농도 증가율(%)
KCCM10770P 48 g/L -
KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S) 56 g/L 17%
KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L) 60 g/L 25%
KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C) 53 g/L 10%
상기 표 7에서 나타난 바와 같이 L-라이신 생산 균주 KCCM10770P에 비하여 gapN 유전자가 도입된 KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S)에서는 L-라이신의 농도가 약 17% 증가, KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L)에서는 L-라이신의 농도가 약 25% 증가, KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C)에서는 L-라이신의 농도가 약 10% 증가함을 확인하였다.
상기의 실시예 2-1~4의 결과들로부터 서로 다른 계열의 다양한 L-라이신 생산 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN 도입이 L-라이신 생산에 효과적임을 알 수 있었다. 또한 기 공지된 대한민국 등록특허 제10-1182033호의 S.mutans 유래 gapN을 도입한 균주 및 기 공지된 NCBI GenBank WP_010966919.1의 C,acetobutylicum 유래의 gapN을 도입한 균주보다 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래 gapN을 도입한 균주가 L-라이신 생산능이 월등함을 확인하였다.
실시예 3-1. L-쓰레오닌 생산 균주에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(이하 WT) 균주 기반으로 lysC(L377K) 변이체(대한민국 등록특허 제10-2011994호)와 hom(R398Q) 변이체(대한민국 등록특허 제10-1947959호)를 도입하여 L-쓰레오닌 생산 균주를 제작하였다. 이 균주에 실시예 1-1-2에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고 쓰레오닌 생산능을 비교하였다.
lysC(L377K)를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 17 및 18 혹은 서열번호 19 및 20 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 509 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 17 및 20의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 암호화하는 lysC 유전자의 변이를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호)와 1011 bp의 DNA 단편들을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-lysC(L377K)라 명명하였다.
위에서 획득한 pDZ-lysC(L377K) 벡터를 WT 균주에 균주에 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주 WT::lysC(L377K)를 획득하였다.
서열번호 서열(5'-3')
17 TCCTCTAGAGCTGCGCAGTGTTGAATACG
18 TGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGACAT
19 ACATCGAAAAGATTTCCACCTCTGAGATTC
20 GACTCTAGAGTTCACCTCAGAGACGATTA
또한 hom(R398Q)를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 WT 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 21 및 22의 프라이머, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 290 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 170bp의 DNA 단편을 수득하였다. 이 두 개의 PCR 생산물을 주형으로 서열번호 21와 24의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 포함하는 440 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
서열번호 서열(5'-3')
21 TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC
22 CTCTTCCTGTTGGATTGTAC
23 GTACAATCCAACAGGAAGAG
24 GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA
앞서 사용된 pDZ 벡터와 440 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-hom(R398Q)라 명명하였다.
획득한 pDZ-hom(R398Q) 벡터를 WT::lysC(L377K) 균주에 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 hom 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)를 획득하였다.
상기 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) 균주에 실시예 1-1-2에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고 각각 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L), WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하고 배양 종료 후 L-쓰레오닌 생산능을 비교하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-쓰레오닌 농도 및 농도 증가율은 하기 표 10과 같다.
균주명 L-쓰레오닌 농도(g/L) L-쓰레오닌 농도 증가율(%)
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) 1.21 g/L -
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) 1.39 g/L 15%
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L) 1.48 g/L 22%
상기 표 10에서 나타난 바와 같이 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)에 비하여 gapN 유전자가 도입된 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) 에서는 L-쓰레오닌의 농도가 약 15% 증가, WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)에서는 L- 쓰레오닌의 농도가 약 22% 증가함을 확인하였다.
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)는 CA09-0906이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12586P를 부여받았다.
실시예 3-2. L-쓰레오닌 생산 균주 KCCM11222P에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L-쓰레오닌 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11222P(WO2013/081296)에 실시예 1-1-2에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고, 각각 KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하고 배양 종료 후 L-쓰레오닌 생산능을 비교하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-쓰레오닌 농도 및 농도 증가율은 하기 표 11과 같다.
균주명 L-쓰레오닌 농도(g/L) L-쓰레오닌 농도 증가율(%)
KCCM11222P 3.6 g/L -
KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S) 4.1 g/L 14%
KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L) 4.3 g/L 20%
상기 표 11에서 나타난 바와 같이 L-쓰레오닌 생산 균주 KCCM11222P에 비하여 gapN 유전자가 도입된 KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S) 에서는 L-쓰레오닌의 농도가 약 14% 증가, KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L)에서는 L- 쓰레오닌의 농도가 약 20% 증가함을 확인하였다.
상기 실시예의 결과는 코리네박테리움 속 L-쓰레오닌 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN의 도입이 L-쓰레오닌 생산에 효과적임을 나타내었다.
실시예 4-1. L-이소류신 생산 균주에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(이하 WT) 균주 기반으로 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 도입에 의한 L-이소류신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 기 공지된 쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자인 ilvA 변이[ilvA(V323A); S. Morbach et al., Appl. Enviro. Microbiol., 62(12): 4345-4351, 1996]를 도입하여 L-이소류신 생산능이 강화된 균주를 제작하였다.
ilvA 유전자를 대상으로 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 25 및 26)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 27 및 28)을 고안하였다. 서열번호 25 및 28의 프라이머는 각 말단에 BamHI 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 26 및 27의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
서열번호 서열(5'-3')
25 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
26 ACACCACGGCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
27 CTGGTTCTGCCGTGGTGTGCATCATCTCTG
28 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 25 및 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 25 및 서열번호 28의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 323번째 발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 암호화하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pECCG117 벡터(대한민국 등록특허 제10-0057684호)와 1011 bp의 DNA 단편을 제한 효소 BamHI으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-ilvA(V323A)라 명명하였다.
상기 pECCG117-ilvA(V323A) 벡터를 상기 실시예 3-1의 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L), WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) 균주에 도입하여, ilvA(V323A) 변이가 도입된 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)에 ilvA(V323A) 변이만 도입한 균주도 제작하였다.
제작된 균주를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양하고 배양 종료 후 L-이소류신 생산능을 비교하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 13과 같다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) L-이소류신 농도 증가율(%)
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-ilvA(V323A) 4.3 g/L -
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) /pECCG117-ilvA(V323A) 5.1 g/L 18%
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A) 5.6 g/L 30%
상기 표 13에서 나타난 바와 같이 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-ilvA(V323A)에 비하여 gapN 유전자가 도입된 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-ilvA(V323A)에서는 L-이소류신의 농도가 약 18.6% 증가, WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A)에서는 L-이소류신의 농도가 약 30% 증가함을 확인하였다.
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A)는 CA10-3108이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12582P를 부여받았다.
실시예 4-2. L-이소류신 생산 균주 KCCM11248P에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L-이소류신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P(대한민국 등록특허 제10-1335789호)에 실시예 1-1-2에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고, 각각 KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주를 실시예 2-1와 같은 방법으로 배양하여 L-이소류신 생산능을 비교하였다. 배양 종료 후 HPLC로 L-이소류신의 생산능을 측정하였으며, 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 14와 같다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) L-이소류신 농도 증가율(%)
KCCM11248P 1.3 g/L -
KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S) 1.8 g/L 38%
KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L) 2.1 g/L 61.5%
상기 표 14에서 나타난 바와 같이 L-이소류신 생산 균주 KCCM11248P에 비하여 gapN 유전자가 도입된 KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S) 에서는 L-이소류신의 농도가 약 38% 증가, KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L)에서는 L- 이소류신의 농도가 약 61.5% 증가함을 확인하였다.
상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-이소류신 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래 gapN의 도입이 L-이소류신 생산에 효과적임을 나타내었다.
실시예 5-1. L-루이신 생산 균주에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주 기반으로 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 도입에 의한 L-루이신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 기 공지된 2-이소프로필말레이트 신타제(2-isopropylmalate synthase)를 코딩하는 유전자인 leuA의 변이[leuA (R558H, G561D); 대한민국 공개번호 제2018-0077008호]를 도입하여 L-루이신 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 상기 특허에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-leuA(R558H, G561D)를 WT균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25㎎/l를 함유한 배지에서 선별하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA단편에 의하여 leuA 유전자에 뉴클레오타이드 변이가 도입된 균주, WT::leuA(R558H, G561D)를 획득하였고, 이를 CJL8001라 명명하였다.
L-루이신 생산능을 획득한 코리네박테리움 글루타미쿰 CJL8001를 대상으로 실시예 1-1-1에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고, 각각 CJL8001::P(cj7)-gapN(S), CJL8001::P(cj7)-gapN(L)로 명명하였다.
제작된 균주의 L-루이신 생산능을 비교하고자 제작된 균주를 하기와 같은 방법으로 배양하여 루이신 생산능을 비교하였다. 각 균주들을 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-루이신의 농도를 분석하였고, 분석한 L-루이신의 농도 및 농도 증가율을 하기 표 15에 나타내었다.
<영양 배지(pH 7.2)>
포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1 리터 기준)
<생산 배지(pH 7.0)>
포도당 50 g, 황산암모늄 20 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 20 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 탄산칼슘 15 g (증류수 1 리터 기준)
균주명 L-루이신 농도(g/L) L-루이신 농도 증가율(%)
CJL8001 3.4 -
CJL8001::P(cj7)-gapN(S) 3.9 15%
CJL8001::P(cj7)-gapN(L) 4.1 21%
상기 표 15에서 나타난 바와 같이 L-루이신 생산 균주 CJL8001에 비하여 gapN 유전자가 도입된 CJL8001::P(cj7)-gapN(S)에서는 L-루이신의 농도가 약 15% 증가, CJL8001::P(cj7)-gapN(L)에서는 L-루이신의 농도가 약 21% 증가함을 확인하였다.
CJL8001::P(cj7)-gapN(L)는 CA13-8102이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12583P를 부여받았다.
실시예 5-2: L-루이신 생산 균주 KCCM11661P, KCCM11662P에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L-루이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11661P(대한민국 등록특허 제10-1851898호), KCCM11662P(대한민국 등록특허 제10-1796830호)를 대상으로 실시예 1-1-1에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고, 각각 KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주를 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 배양하고 배양 종료 후 L-루이신 생산능을 비교하였다. 각 균주에서 생산한 L-루이신의 농도 및 농도 증가율을 하기 표 16에 나타내었다.
균주명 L-루이신 농도(g/L) L-루이신 농도 증가율(%)
KCCM11661P 2.7 g/L -
KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S) 2.8 g/L 4%
KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L) 3.0 g/L 11%
KCCM11662P 3.0 g/L -
KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S) 3.1 g/L 3%
KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L) 3.3 g/L 11%
상기 표 16에서 나타난 바와 같이 L-루이신 생산 균주 KCCM11661P 및 KCCM11662P 비하여 gapN 유전자가 도입된 KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S)에서는 L-루이신의 농도가 약 4% 증가, KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L)에서는 L-루이신의 농도가 약 11% 증가함을 확인하였다.
상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-루이신 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN 도입이 L-루이신 생산에 효과적임을 나타내었다.
실시예 6-1. L-발린 생산 균주에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN의 도입이 L-발린 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능을 갖게 된 변이주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V라 명명하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC13869 균주의 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였다. ilvN 유전자에 A42V 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해서, 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 단편(A, B)을 각각 얻었다. PCR의 조건은 94℃에서 5분간 변성한 후, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃에서 60초 중합을 25회 반복하고, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 단편 A, B 모두 537bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 상기 두 단편을 주형으로 서열번호 29와 서열번호 32의 프라이머를 이용하여 Overlapping PCR을 실시하여 1044bp의 DNA 단편을 얻었다.
상기 얻어진 1044bp의 DNA 단편과 앞서 사용된 pDZ 벡터를 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고, 이를 pDZ-ilvN(A42V)라 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
29 AATTTCTAGAGGCAGACCCTATTCTATGAAGG
30 AGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGAC
31 GTCCCTCGTGTCTGTAAAGACCGAAACACT
32 AATTTCTAGACGTGGGAGTGTCACTCGCTTGG
이후, 상기에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-ilvN(A42V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25㎎/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 29 및 서열번호 32의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 도입 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V라 명명하였다.
마지막으로, L-발린 생산능을 갖게 된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V를 대상으로 실시예 1-1-3에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고 각각 CJ8V::P(cj7)-gapN(L), CJ8V::Pcj7-gapN(S)라 명명하였다. 제작된 균주를 하기와 같은 방법으로 배양하여 L-발린 생산능을 비교하였다.
각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200rpm에서 진탕 배양하였다. 이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도 및 농도 증가율을 하기 표 18에 나타내었다.
<영양 배지(pH 7.2)>
포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1 리터 기준)
<생산 배지(pH 7.0)>
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1 리터 기준)
균주명 L-발린 농도(g/L) L-발린 농도 증가율(%)
CJ8V 3.4 g/L -
CJ8V-Pcj7/gapN(S) 3.8 g/L 12%
CJ8V-Pcj7/gapN(L) 4.0 g/L 18%
상기 표 18의 결과와 같이, CJ8V-Pcj7/gapN(L), CJ8V-Pcj7/gapN(S) 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 각각 18%, 12% 증가함을 확인하였다.
결과적으로, 코리네박테리움 속 L-발린 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 유전자 도입이 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
CJ8V-Pcj7/gapN(L)는 CA08-2038이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12581P를 부여받았다.
실시예 6-2. L-발린 생산 균주 KCCM11201P에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P(대한민국 등록특허 제10-1117022호)에 실시예 1-1-3에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고 각각 KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도 및 농도 증가율을 하기 표 19에 나타내었다.
균주명 L-발린 농도(g/L) L-발린 농도 증가율(%)
KCCM11201P 2.8 -
KCCM11201P:: P(cj7)-gapN(S) 3.3 17%
KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L) 3.7 32%
상기 결과와 같이, KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S) 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 각각 32.1%, 17.9% 증가함을 확인하였다.
결과적으로, 코리네박테리움 속 L-발린 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 유전자 도입이 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7-1. L-아르기닌 생산 균주에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN의 도입이 L-아르기닌 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21831을 대상으로 실시예 1-1-3에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입 하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고 각각 ATCC21831::P(cj7)gapN(L), ATCC21831::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주를 다음과 같은 방법으로 배양하여 L-아르기닌 생산능을 비교하였다. 각각 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각각 접종하고, 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 영양 배지, 종 배지, 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-아르기닌의 생산량을 측정하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도 및 농도 증가율을 하기 표 20에 나타내었다.
<영양 배지(pH 7.2)>
포도당 10 g, 육즙 5 g, 폴리펩톤 10 g, 염화나트륨 2.5 g, 효모엑기스 5 g, 한천 20 g, 유레아 2 g (증류수 1 리터 기준)
<종 배지(pH 7.0)>
수크로스 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 2 ㎎ (증류수 1 리터 기준)
<생산 배지(pH 7.0)>
수크로스 6%, 황산암모늄 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.2%, CSL(옥수수 침지액) 1.5%, NaCl 1%, 효모 추출물 0.5%, 비오틴 100 mg/L (증류수 1 리터 기준).
균주명 L-아르기닌 농도(g/L) L-아르기닌 농도 증가율(%)
ATCC21831 4.1 g/L -
ATCC21831::P(cj7)gapN(S) 4.6 g/L 12%
ATCC21831::P(cj7)-gapN(L) 4.9 g/L 19%
상기 결과와 같이, ATCC21831::P(cj7)gapN(L), ATCC21831::P(cj7)-gapN(S)균주의 L-아르기닌 생산능은 대조군 대비 각각 19.5%, 12.1% 증가함을 확인하였다.
ATCC21831::P(cj7)gapN(L)는 CA06-2951이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12580P를 부여받았다.
결과적으로, 코리네박테리움 속 L-아르기닌 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 유전자 도입이 L-아르기닌의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7-2. L-아르기닌 생산 균주 KCCM10741P에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L-아르기닌 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(대한민국 등록특허 제10-0791659호)을 대상으로 실시예 1-1-3에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고 각각 KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L), KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주의 L-아르기닌 생산능을 비교하고자 상기 실시예 7-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-아르기닌의 농도를 분석하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도 및 농도 증가율을 하기 표 21에 나타내었다.
균주명 L-아르기닌 농도(g/L) L-아르기닌 농도 증가율(%)
KCCM10741P 3.1 g/L -
KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S) 3.4 g/L 9%
KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L) 3.8 g/L 22%
상기 결과와 같이, KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L), KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S) 균주의 L-아르기닌 생산능은 대조군 대비 각각 22.6%, 9.7% 증가함을 확인하였다.
결과적으로, 코리네박테리움 속 L-아르기닌 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 유전자 도입이 L-아르기닌의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 8-1. O-아세틸 호모세린 생산 균주에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
야생형 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 실시예 1-1-1에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 균주를 제작하고, 각각 ATCC13032::P(cj7)-gapN(L), ATCC13032::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다. 제작된 균주를 하기와 같은 방법으로 배양하여 O-아세틸 호모세린 생산능을 비교하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종 배지(pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4　4 g, K2HPO4　8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산 배지(pH 7.0)>
포도당 50 g, (NH4)2SO4　12.5 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4　1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3　30 g (증류수 1 리터 기준)
배양 종료 후 HPLC로 O-아세틸 호모세린의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 O-아세틸 호모세린 농도 및 농도 증가율은 하기 표 22와 같다.
균주명 O-아세틸 호모세린 농도(g/L) O-아세틸 호모세린 농도 증가율(%)
ATCC13032 0.3 g/L -
ATCC13032::P(cj7)-gapN(S) 0.4 g/L 33%
ATCC13032::P(cj7)-gapN(L) 0.5 g/L 67%
상기 표 22에서 나타난 바와 같이 야생형 균주인 ATCC13032에 비하여 gapN 유전자가 도입된 ATCC13032::P(cj7)-gapN(S)에서는 O-아세틸 호모세린의 농도가 약 33% 증가, ATCC13032:::P(cj7)-gapN(L)에서는 O-아세틸 호모세린의 농도가 약 67% 증가함을 확인하였다.
ATCC13032:::P(cj7)-gapN(L)는 CM04-0531이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12584P를 부여받았다.
실시예 8-2. O-아세틸 호모세린 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN(L) 또는 S.mutans 유래의 gapN(S) 이 도입된 균주의 제작 및 평가
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 도입이 O-아세틸 호모세린 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 코리네박테리움 글루타미쿰의 자가 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제(MetX)를 강화하였다.
MetX를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여 WT(Wild type) 유래의 보고된 서열에 근거하여 프로모터 부위(개시코돈 상단 약 300bp)로부터 터미네이터 부위(종결코돈 하단 약 100bp)까지 증폭하기 위한 서열번호 33 및 34를 고안하였다. 서열번호 33 및 34의 프라이머의 양 말단에 BamHI 제한 효소 부위를 삽입하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metX 유전자의 코딩 부위 1546 bp의 DNA 단편을 수득하였다. pECCG117 벡터(대한민국 등록특허 제10-0057684호)와 metX DNA 단편을 BamHI 으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-metX WT라 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
33 GGATCCCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC
34 GGATCCCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
pECCG117-metX WT 벡터를 상기 실시예 3-1의 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L), WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) 균주에 도입하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 자가 metX가 과발현된 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)에도 동일한 벡터를 도입하였다.
제조된 균주들을 실시예 8-1의 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 O-아세틸 호모세린 농도 및 농도 증가율을 분석하고, 그 결과를 표 24에 나타내었다.
균주명 O-아세틸 호모세린 농도(g/L) O-아세틸 호모세린 농도 증가율(%)
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-metX WT 2.0 g/L -
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-metX WT 2.7 g/L 35%
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-metX WT 3.1 g/L 55%
상기 표 24에서 나타난 바와 같이 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-metX WT에 비하여 gapN 유전자가 도입된 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-metX WT에서는 O-아세틸 호모세린의 농도가 약 35% 증가, WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-metX WT에서는 O-아세틸 호모세린의 농도가 약 55% 증가함을 확인하였다.
상기의 결과는 코리네박테리움 속 야생형 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN의 도입이 O-아세틸 호모세린 생산에 효과적임을 나타낸다.
실시예 9-1. 글루탐산 생산 균주에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래 gapN의 도입이 글루탐산 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 균주를 대상으로 실시예 1-1-4에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 제작된 균주를 각각 ATCC13869::P(cj7)-gapN(L), ATCC13869::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 40시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양은 비오틴 제한 조건에서 진행되었다. 배양 종료 후, HPLC를 이용한 방법을 통해 L-글루탐산 농도 및 농도 증가율을 측정하였으며, 측정 결과는 하기 표 25에 나타내었다.
<종 배지(pH 7.2)>
포도당 1%, 육즙 0.5%, 폴리펩톤 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 0.5%, 한천 2%, 유레아 0.2%
<생산 배지>
원당 6%, 탄산칼슘 5%, 황산암모늄 2.25%, 일인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.04%, 황산철 10 mg/L, 티아민 염산염 0.2 mg/L
균주명 L-글루탐산 농도(g/L) L-글루탐산 농도 증가율(%)
ATCC13869 0.5 -
ATCC13869::P(cj7)-gapN(S) 0.8 60%
ATCC13869::P(cj7)-gapN(L) 0.9 80%
상기 표 25에서 나타난 바와 같이 야생형 균주인 ATCC13869에 비하여 gapN 유전자가 도입된 ATCC13869::P(cj7)-gapN(S)에서는 글루탐산의 농도가 약 60% 증가, ATCC13869:::P(cj7)-gapN(L)에서는 글루탐산의 농도가 약 80% 증가함을 확인하였다.
ATCC13869:::P(cj7)-gapN(L)는 CA02-1360이라고 명명하고, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 9월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12587P를 부여받았다.
실시예 9-2. L-글루탐산 생산 균주 KFCC11074에서 gapN(L) 또는 gapN(S)이 도입된 균주의 제작 및 평가
L-글루탐산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11074 균주(대한민국 등록특허 제10-0292299호)에 실시예 1-1-4에서 제작한 플라스미드와 실시예 1-2에서 제작한 플라스미드를 도입하여, 상기 실시예 2-1와 동일한 방법으로 제작된 균주를 각각 KFCC11074::P(cj7)-gapN(L), KFCC11074::P(cj7)-gapN(S)라 명명하였다.
제작된 균주의 L-글루탐산 생산능을 비교하고자 상기 실시예 10-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-글루탐산의 농도를 분석하였고, 분석한 L-글루탐산의 농도 및 농도 증가율을 하기 표 26에 나타내었다.
균주명 L-글루탐산 농도(g/L) L-글루탐산 농도 증가율(%)
KFCC11074 11.8 -
KFCC11074::P(cj7)-gapN(S) 14.5 22%
KFCC11074::P(cj7)-gapN(L) 16.2 37%
상기 표 26에서 나타난 바와 같이 KFCC11074에 비하여 gapN 유전자가 도입된 KFCC11074::P(cj7)-gapN(S)에서는 글루탐산의 농도가 약 22.9% 증가, KFCC11074::P(cj7)-gapN(L)에서는 글루탐산의 농도가 약 37.3% 증가함을 확인하였다.
결과적으로, 코리네박테리움 속 L-글루탐산 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 유전자 도입이 L-글루탐산의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 실시예 1-9의 결과들을 종합하여 보면, 코리네박테리움 속 L-글루탐산 생산 균주에서 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 또는 S.mutans 유래의 gapN 유전자 도입이 L-아미노산의 생산능을 향상시키며, 특히 S.mutans 유래의 gapN 유전자를 도입했을 때보다 L.delbrueckii subsp. Bulgaricus 유래의 gapN 유전자를 도입했을 때 더 우수한 L-아미노산 생산능을 나타내는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021000823-appb-I000001
Figure PCTKR2021000823-appb-I000002
Figure PCTKR2021000823-appb-I000003
Figure PCTKR2021000823-appb-I000004
Figure PCTKR2021000823-appb-I000005
Figure PCTKR2021000823-appb-I000006
Figure PCTKR2021000823-appb-I000007
Figure PCTKR2021000823-appb-I000008

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계;를 포함하는, L-아미노산 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) 유래인, L-아미노산 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, L-아미노산 생산 방법.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는, L-아미노산 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 락토바실러스 델부루키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) 유래인, 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물의 L-아미노산 생산 용도.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107141A (zh) * 2021-08-19 2022-03-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 高产l-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产l-脯氨酸的方法
CN116218749A (zh) * 2021-12-06 2023-06-06 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法
JP2024529732A (ja) * 2021-08-23 2024-08-08 シージェイ チェイルジェダング コーポレイション 新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体及びそれを用いたｌ－バリン生産方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114765989B (zh) * 2021-04-07 2022-11-22 Cj第一制糖株式会社 新3-磷酸甘油醛脱氢酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN116555132A (zh) * 2022-01-28 2023-08-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其生产苏氨酸的应用和构建方法
CN116622598A (zh) * 2022-02-10 2023-08-22 廊坊梅花生物技术开发有限公司 苏氨酸生产菌株的构建方法
KR102572850B1 (ko) * 2022-07-11 2023-08-31 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법

Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
KR100292299B1 (ko) 1999-03-22 2001-06-01 손경식 글루탐산 생산 미생물 및 이를 이용한 글루탐산 생산방법
KR20060078687A (ko) * 2004-12-30 2006-07-05 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100791659B1 (ko) 2006-07-13 2008-01-03 씨제이 주식회사 알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의제조방법
KR100924065B1 (ko) 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법
US20100009418A1 (en) * 2006-08-29 2010-01-14 Rice University Increasing NADPH-Dependent Products
KR101117022B1 (ko) 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
KR101182033B1 (ko) 2009-07-08 2012-09-11 씨제이제일제당 (주) 외래종 유래의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 획득한 코리네박테리움 속의 ｌ-라이신 생산방법
WO2013081296A1 (ko) 2011-12-01 2013-06-06 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
KR101335789B1 (ko) 2012-01-13 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
KR20170002574A (ko) * 2014-05-12 2017-01-06 메타볼릭 익스플로러 Ｎａｄｐｈ 의존성 아세톨 리덕타제 및 개선된 ｎａｄｐｈ 공급에 기반한 １,２-프로판디올의 생산을 위한 신규한 미생물 및 방법
KR101783170B1 (ko) 2016-08-31 2017-09-29 씨제이제일제당 (주) 신규 프로모터 및 이의 용도
KR101796830B1 (ko) 2015-08-25 2017-11-13 씨제이제일제당 (주) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
KR101851898B1 (ko) 2017-06-15 2018-04-25 씨제이제일제당 (주) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
KR20180077008A (ko) 2016-12-28 2018-07-06 씨제이제일제당 (주) 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
KR20190009872A (ko) * 2017-07-19 2019-01-30 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR101947959B1 (ko) 2018-05-28 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
KR102011994B1 (ko) 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0227435D0 (en) * 2002-11-25 2002-12-31 Univ Denmark Tech Dtu Metabolically engineered micro-organisms having reduced production of undesired metobolic products
CN105209626B (zh) * 2012-11-30 2019-09-03 诺维信股份有限公司 通过重组酵母生产3-羟基丙酸
EP2843043A1 (en) * 2013-08-27 2015-03-04 Evonik Industries AG A method for producing acyl amino acids
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법

Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
KR100292299B1 (ko) 1999-03-22 2001-06-01 손경식 글루탐산 생산 미생물 및 이를 이용한 글루탐산 생산방법
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR20060078687A (ko) * 2004-12-30 2006-07-05 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
KR100791659B1 (ko) 2006-07-13 2008-01-03 씨제이 주식회사 알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의제조방법
US20100009418A1 (en) * 2006-08-29 2010-01-14 Rice University Increasing NADPH-Dependent Products
KR100924065B1 (ko) 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법
KR101182033B1 (ko) 2009-07-08 2012-09-11 씨제이제일제당 (주) 외래종 유래의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 획득한 코리네박테리움 속의 ｌ-라이신 생산방법
KR101117022B1 (ko) 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
WO2013081296A1 (ko) 2011-12-01 2013-06-06 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
KR101335789B1 (ko) 2012-01-13 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법
KR20170002574A (ko) * 2014-05-12 2017-01-06 메타볼릭 익스플로러 Ｎａｄｐｈ 의존성 아세톨 리덕타제 및 개선된 ｎａｄｐｈ 공급에 기반한 １,２-프로판디올의 생산을 위한 신규한 미생물 및 방법
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
KR101796830B1 (ko) 2015-08-25 2017-11-13 씨제이제일제당 (주) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
KR101783170B1 (ko) 2016-08-31 2017-09-29 씨제이제일제당 (주) 신규 프로모터 및 이의 용도
KR20180077008A (ko) 2016-12-28 2018-07-06 씨제이제일제당 (주) 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
KR101851898B1 (ko) 2017-06-15 2018-04-25 씨제이제일제당 (주) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
KR102011994B1 (ko) 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
KR20190009872A (ko) * 2017-07-19 2019-01-30 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR101947959B1 (ko) 2018-05-28 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Atlas of Protein Sequence and Structure", 1979, NATIONAL BIOMEDICAL RESEARCH FOUNDATION, pages: 353 - 358
"GenBank", Database accession no. WP _010966919.1
"Guide to Huge Computers", 1994, ACADEMIC PRESS
A. J. NAIR., INTRODUCTION TO BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING, 2008
ATSCHUL, S. F. ET AL., J MOLEC BIOL, vol. 215, 1990, pages 403
BINDER ET AL., GENOME BIOLOGY, vol. 13, 2012, pages R40
BIOTECHNOLOGY AND BIOPROCESS ENGINEERING, vol. 19, June 2014 (2014-06-01), pages 456 - 467
CARILLO ET AL., SIAM J APPLIED MATH, vol. 48, 1988, pages 1073
DATABASE Protein ANONYMOUS: "NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Lactobacillus delbrueckii]", XP055831628, retrieved from NCBI Database accession no. WP_011543932 *
DEVEREUX, J. ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 12, 1984, pages 387
F. M. AUSUBEL ET AL.: "Manual of Methods for General Bacteriology", 1981, AMERICAN SOCIETY FOR BACTERIOLOGY
GRIBSKOV ET AL., NUCL. ACIDS RES, vol. 14, 1986, pages 6745
J. SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
NEEDLEMAN ET AL., J MOL BIOL., vol. 48, 1970, pages 443
NEEDLEMANWUNSCH, J. MOL. BIOL., vol. 48, 1970, pages 443 - 453
PEARSON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 2444
RICE ET AL.: "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite", TRENDS GENET, vol. 16, 2000, pages 276 - 277, XP004200114, DOI: 10.1016/S0168-9525(00)02024-2
S. MORBACH ET AL., APPL. ENVIRO. MICROBIOL., vol. 62, no. 12, 1996, pages 4345 - 4351
SMITHWATERMAN, ADV. APPL. MATH, vol. 2, 1981, pages 482
SPAANS ET AL.: "NADPH-generating systems in bacteria and archaea", FRONT. MICROBIOL., vol. 6, 2015, pages 742

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107141A (zh) * 2021-08-19 2022-03-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 高产l-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产l-脯氨酸的方法
JP2024529732A (ja) * 2021-08-23 2024-08-08 シージェイ チェイルジェダング コーポレイション 新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼのサブユニット変異体及びそれを用いたｌ－バリン生産方法
CN116218749A (zh) * 2021-12-06 2023-06-06 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法
CN116218749B (zh) * 2021-12-06 2025-06-17 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法

Also Published As

Publication number Publication date
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