TWI237565B - Pharmaceutical composition for treating tumors comprising growth hormone releasing compounds or their antagonists - Google Patents

Description

1237565 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明的範圍 本發明關於一種用來減少癌細胞增生的方法，此方法 是藉著給予所要治療封象生長激素釋出狀類及其捨抗劑來 進行的。 本發明的背景 生長激素（G Η )的分泌是由二種視丘下的肽類來調 節：（a ) G Η -釋出激素（G H R Η )，它可刺激G Η 的釋出，（b )生長抑素，它對G H R Η的釋出有抑制效 果。在最近幾年中，有幾位硏究者已證實GH的分泌它可 經由稱爲G Η -釋出肽類（G H R Ρ )的合成之寡肽類來 刺激，如： '、六崎啉"（H e X a r e 11 η )及不同的、'六ρ窗啉" 類似物（吉可等人所著，歐洲內分泌期刊，1 3 6， 445 — 460，1997)。這些化合物是通過一種不 同於G H R Η之機制的機制來作用（C . Υ .鮑爾斯，於 λ'異生物質的生長激素促泌劑〃 ’ E d s . Β ·伯辜和 R · F ·瓦克，P · 9 — 2 8，史賓格一維賴，紐約 1 9 9 6 )並藉著與位於下視丘和腦下垂腺的特殊受體間 的相互作用（（a ) G ·慕奇利等人著’內分泌期刊’ 157^99-106^1998； (b)G.慕奇利等 ，、、人類G H R P受體的組織分佈〃歐洲內分泌等的進展 摘要IV，賽威拉，西班牙，1998)來進行作用。最近 證明：G H R Ρ受體不只存於下視丘和腦下腺的系統也分 佈在一般來說與G Η釋出無關的許多人類組織中（G ·慕 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（〒）Μ驗（210X297錢）_ 4 1237565 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 奇利等人著，見上述（a))。 G H R P s和其拮抗劑說明於如下列之文獻中：C . Υ ·鮑爾斯，supra，R ·狄格非， ''生長激素釋出肽〃 ’ ibidem，1 996，p.85 - 1 02 ; R ·狄格非等人著，、'做爲生長 激素強力釋出劑的小型肽類〃 J. Ped. End. Metab.，8，p. 311-313，1 996 ; R ·狄格非， ''用來做爲生長激素促泌劑 之不透水肽的發展〃，八(^?86(^1：]：.311??1.，423，？.85-87，1 9 97 ; K .維利利嘉納凡等人著， ''連結至豬前腦下 腺和下視丘膜的生長激素釋出肽（G H R P ) 〃 ，生命科 學，50，ρ. 1 1 49- 1 1 5 5，1 992 ;和 Τ · C .索摩斯等人著， ''低分子量之擬肽的生長激素促泌劑〃， W 0 96/15148(5 月 23 日，1996 年）。 本發明的摘要 本發明關於一種用來治療哺乳動物體內之腫瘤的方法 ，它包含了給予需要此種治療之哺乳動物一有效量的生長 激_素釋出肽（G H R Ρ )或其拮抗劑，或者，根據本發明 所使用的化合物可以被定義爲生長激素促泌劑或其拮抗劑 。這些化合物的量可有效降低或抑制哺乳動物體內生瘤細 胞的增生。在另一種體系中，這些化合物的特性是它們可 取代哺乳動物之含瘤組織中的放射活性標記 12bI— Tyr— A1 a - Hi s— D— Mr p— A 1 a —丁 rp — D - Phe— Lys-NH2 ( 1 2 5 I - τ y r —Ala —六崎啉）。 本紙張尺度適用中國國家標準（CpS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237565 A7 B7 五、發明説明（3 ) 此處所揭示的化合物顯示出它們可連接在生瘤組織上 並在給予病人後會作用在特定的受體上，因此，可使生瘤 細胞的數目減少。較佳的情況是，所治療的腫瘤是肺、乳 房、甲狀腺或胰臟腫瘤。 上述化合物包括了某些已知的化合物（參考上述）’ 但其它有些用於本發明的化合物以前並未發表過，這些化 合物包括了 一種螺內醯胺，雙環或三環的擬肽單位。本發 明中所有這些有用的化合物的共同特徵是至少有一種賴胺 酸單位存在。 圖形的簡單說明 第一圖是一種說明1 2 5 I — T y r — A 1 a —六崎啉 對細胞膜之特定連接的圖形，這些細胞膜是來自不同起源 之非內分泌和內分泌的人類腫瘤。 第二圖是一種說明1 2 5 I - T y r — A 1 a —六pf啉 連接至來自非內分泌之肺腫瘤細胞膜的圖形。 第三圖是一種說明由不同化合物取代1 2 5 I — T y r —A 1 a -六啉以連接至來自非-內分泌肺腫瘤細胞膜 上的圖形。縱座標代表結合率’這是以對照組的百分比來 表示（即：在無標記的競爭物中的特定連接）。 第四圖說明了 /、ο舊琳’ A 1 a —六d奮啉，T y r — A1 a —六,啉 ’ EP 8 0 317 (HAIC — D —

Mr p — D — Lys— T r P-D-Phe — Ly s~ N H 2 ) ，D- (Lys)3- GHRP6(His-D- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） " ~

-6- 1237565 A7 B7 五 '發明説明（4 丁 r

D D — Ly s — Trp — D — Phe— Lys — NH2)及 MK0677 (N -〔l(R) (〔1，2 -二 氫一 1〜甲磺醯螺一（3 H —吲哚，3 ，4 / 一六氫吡啶 1 基） 2 — （苯甲氧基）乙基〕一 2 —胺基一甲基 丙醯胺〜甲磺酸酯）等在人類肺癌細胞中對基底和經 E G F剌激之3 Η -胸腺啶鑲嵌作用的效果。 第五圖說明了如下群體在人類肺癌細胞中對經E G F 刺激之3 Η -胸腺啶鑲嵌作用的效果··六uf啉，A 1 a —六 口畜啉，T y r - A 1 a —六t?·啉 EP80317，D-( Lys)3 - GHRP6和MK0677，此圖形是以劑量 反應曲線表示。 第六圖是一種說明六啉在人類肺癌細胞之增生作用 上的效果的圖形。 第七圖是一種說明六邊啉（a )和A 1 a —六p|啉（ b )在人類乳癌（T 4 7 D )之細胞增生作用上的效果的 圖形。 第八圖是六啉（a )和A 1 a —六。看啉（b )在人 類乳癌（M D A - Μ B 2 3 1 )之細胞增生作用上的效果 請 先 閲 讀 背 Sj 之 注 意 事 項 再 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 較佳體系的詳細說明 在本說明中，使用了下列：D是右旋的鏡像體，G是 生長激素，Mr ρ是2 -甲基—T r ρ ’ ΙΜΑ是咪σ坐基 乙醯，〇八8是了 —胺丁炔基，1 ΝΙΡ是1sopecotmy1 ， 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1237565 A7 B7 五、發明説明（5 ) A I B是胺基異丁炔基，Na 1是Θ -萘基氨基丙酸， T X Μ是抗血纖溶環基，也就是4 一（胺甲基）一環己院 羰基，D — ΗΝΗ 是 D — 1 ，2 ，3 ，4 ，5 ，6 —六氫 —norharmaii — 3 —羧酸酯，HAIC 是（2S，5S) — 5 —胺基—1 ，2 ，4，5 ，6 ’ 7 —六氫一氮雜罩〕3 ，2 ，1 — h 1〕吲哚—4 —酮一噻—1 一氮雜—雙環〔 3 · 4 . 0〕壬—2 —羧酸酯，而 A1 a ，Lys ，

Phe，Trp，His，Thr，Cys，Tyr ’ L e u和I 1 e各是胺基酸丙胺酸、賴胺酸、苯基丙胺酸 、色胺酸、組胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、白胺酸 和異白胺酸。 在本發明的一種體系中，可用來給予欲治療之哺乳動 物的有用化合物爲通式I所示的化合物： AA1 — AA2 — AA3-AA4— Lys — R (I) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 中 A i h 其 A Η τ S Γ Γ h τ A Μ ι—^ι 是

Β A G B _—I A Μ X τ ρ τι Ν

D D D ρ ρ Γ Γ τ τ Η

D Μ Γ ρ Γ h τ- D ρ Γ Μ

A- D ρ/ Γ Μ ι D I Γ h τ- D ρ Γ τ- D- A Μ D a ρ Γ τ

a Ν- D ρ Γ Μ- D I A Μ

Η- Γ h τ- D ρ Γ τ- D I S • 1 Η I Γ h τ- D

S 本紙張尺度適用中國國家標準（CpS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 E I 胺 C 醯 - 內. P ' 螺 r 的 Μ 示 I ; 所 D Γ - y 式 BT通 I 或種 A : Η 一 中是是 其 Α Β 1237565 A7 B7 五、發明説明（6 ) — D — Μ r P ， c y s — T y r 一 G A B ， A 1 a — Η 1 s — T r p A 1 a — H 1 s - -D —M r p ，T y r — A 1 a — Η 1 s — D — T r P ， T y r - -A 1 a — H i S -D — M r P ， D — A 1 a -D — T r p 或 D — A 1 a — D — Mr P ; A A 2是 A la D - -N a 1 ， 1 D — L y S ，D — • M r P 5 或 T r Ρ A A 3是 D - -T r P ，D —N a 1 ，D — T r p 7 M r P D — M r P ，P h e ，或 D - P h e ； A A 4是 D - -T r P 1 ，M r p ， D - M r P ，P h e j 或 D — P h e ;且 R 是 — N H 2 , T hr — N H 2 ，或 D - T hr - N H 2 ) 〇 含 有 D — M r p 單 位 者是 較佳1 的化合物。 在 另 個體系中 ，有用的 化合物包 括 那些 在 :美 國 專 利 甲 請 號 〇 9 / 0 8 9 ,c )54 (於1 9 9 8年 6 月 3 曰 提 出）中所說明的化合物。這些化合物是通式Π所示的肽類 本紙張尺度適用中國國家標準（CpS ) A4規格（210X297公釐）

1237565 A7 B7 五、發明説明（7 )

此處R 1是Η或T y r ，R 2代表任何一種天然產生之胺基 酸的側鏈，且在*處的結構是（R ) ’ （ S )或其混合物； 一種式IV所示的三環化合物

(IV) 此處R3是Η或Ty r且在*處的結構是 其混合物；一種式V所示的雙環化合物 Η

R (S )或 R4-NH々N_

CO 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 0 (V) 此處，R4是H或Tyr且在*處的結構是（R) ’ ( S ) 或其混合物；D—Mr ρ是右旋一 2 —甲基一 T r ρ ;C 是丁1口一？116—1^73，〇 — 丁]：0 — ?116- Lys ?Mrp — Phe — Lys ?D— Mrp — Phe —L y s ，Trp — Lys ， D — Trp — Lys ，Mrp — Lys ，D— Mrp — Lys ，Ala — Trp-D — Phe-Lys ，Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 10

1237565 A7 B7 五、發明説明（8 — Μ Γ P — D — P he - -L y s : A 1 a — D — M r P — D - P h e - L y s ，D - L y s — Τ r P — D 一 P h e -L y s ，D - L y s — M r p — D — P h e — L y s ， D — L y s — D — Mr p — D — P h e 一 L y s ，或一種 式 VI 所 示 的 二 環 化 合物

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) R5 (VI)

、1T 此處R5是Η或S〇2Me且在*處的結構是不是（R)，（ S )就是其混合物；且當C是先前定義之二環化合物時’ E 是 Ly s— NH2 或—NH2 (假設 E 是 Ly s— NH2 )° 根據本發明，可發現：G Η釋出化合物及不會釋出 G Η之化合物二者都可用來治療腫瘤。較佳的情況是’根 據本發明所要治療的腫瘤是肺、乳房、甲狀腺或胰臟腫瘤 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 通式I所示之特別好的G Η釋出化合物包括下列 Η i s -D — L y s -N H Η 1 s 一 D — L y s -N H D 一 T h r 一

1 s— D— Mrp—Ai a— Trp— D 本紙張尺度適用中國國家檩準（CNS〉Α4規格（210X297公釐） -11 - 1237565 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

-12- 1237565 A7 B7

五 Λ 發明説明 (10 、 I N Η 2 7 G A B 一 D — M r P — M r P — P h e — L y s — N H A 1 a 一 H 1 s — D — M r P - A 1 a — T r P — D — P h e -L y s — N H 2 Η 1 s -D — M r P — A 1 a — T r P - D — P h e — L τ s -丁 h r — N H 2 1 Η 1 s -D — M r P — A 1 a 一 T r P - D - P h e — L y s -N H 2 7 D — T h r — D — M r P - -A 1 a -T r p - - D - — P (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 — L y s — N H 2 G A B — D — M Γ P — D -N a 1 — P h e — • L y s — N H 2 G A B — D — M Γ P — D -M r P — Mr P — • L y s — N H 2 C y s — T y r — G A B -D — Mr P - D — • M r P — M r P — L y s — N H 2 T y r — A 1 a — H i s -D -M r p -A 1 a - — T r p — D — P h e — L y s — N H 2 ,及 D — A 1 a — D — M Γ P 丨一A 1 a —T r p — D - — P h e — L y s — N H 2 j 訂卜 而不會釋出G Η之通式I所示的較佳化合物包括： Hi s-D-Trp-D-Lys-Trp-D-Phe —L y s — Ν Η 2 ， 本紙張尺度適用中國國家標準（C^S ) A4規格（210 X 297公釐） -13- 1237565 A7 B7 五、發明説明（11 )

Hi s-D-Mrp — D-Lys-Trp-D — Phe —L y s — N Η 2，

Hi s-Ala— D — Trp — Lys — Mrp — D —

Phe — Lys— NH2，

Hi s— D— Mrp— D — Lys— Mrp — D — Phe —L y s — N H 2，

Hi s— A1 a— D — Trp - A1 a— Mrp-D —

Phe-Lys— NH2，及

Hi s-D — Trp-Ala-Mrp — D — Phe — L y s — N H 2。 較佳之通式Π所示之化合物包括下列： 〔S，S —螺（Pr 〇 — Leu) ] — D— Mr p— D — T r p-Ph e — Ly s— NH2， 〔S，S —螺（？1：〇 —乙611)〕—〇—]\/[]：0 —

Mr p — Ly s— NHs ? 〔S ， S —螺（Pro — Leu) 〕 一D— Mrp — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A 1 a — T r p — D — Phe — Ly s — N H 2 , 〔S ， S —螺（？1〇一乙611)〕一〇—^1]：0-〇 — Ly s— Tr p — D — Phe — Ly s— NH2 j

Tyr — 〔S ， S —螺（Pr 〇一Leu) 〕 一 D —

Mr p — D — Ly s — Ύ r p — D — Phe — Ly s — N H 2， 〔S ， S —螺（Pro — I 1 e) 〕 一 D— Mrp— D — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -14- 1237565 A7 B7 五、發明説明（12 L y s — T r P — D — Ρ he —L y s ;-N H 2， C s S — 螺 ( Ρ r 〇 — L e u )〕 —D - -Mr p - D - Η N H — ( S 〇 2 C Η 3 ) -P h e — L y s -N H 2， Η A I c — D — Μ r Ρ — D - L y s - -T r p - D — Ρ •h e — L y s — N Η 2 : ，及 A T A B — D — Μ r Ρ — D - L y s - -T r p — D — Ρ h e — L y s — N Η 2 ， 此 處 5 S s — 螺 ( Ρ r 〇 一 Leu) 和S ，S — 螺（ Ρ r 〇 — I 1 e ) 各 是 4 -甲 基一 2 s〔 e 酮基 一（ 5 - — s ) y 1 - 7 〆 —__ 氮雜螺 〔4， 4〕 壬一 7 ^ — 基 — ] 戊 酸 酯 和 3 — 甲 基一 2 S〔 6 ^ - -酮基 -( 5 ^ — S ) 1 〆 5 7 — 二 氮 雜螺 〔4， 4〕壬—7 〆— 基一 1 ] 戊 酸 酯 〇 這 itb 單 位 具 有 式 ( ΠΙ )

請 閲 讀 背 面 i 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (III) 此處R 1是Η且R 2是L e u或I 1 e的側鏈（見P ·華德 等人著，醫學化學期刊，33 ，1848 (1990)。 還有，該三環化合物Η N Η是經由將相對應之四氫-η 〇 r h a r m a η — 3 —竣酸進行傳統氫化作用來取得的， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -15 1237565 A7 B7 五、發明説明（13 ) Η rr co2h Η

I Ή (VII) 據式]Π、IV、V和VI的單位所組成的擬肽單位其 們鎖住一種β -旋動的結構，因此可以模擬天然 〇 化合物之藥學上可接受的鹽如需要時也可拿來使 鹽包括有機或無機的加成鹽，如：氫氯酸鹽、氫 Ρ酸鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽、菸碱酸鹽 鹽、蔔糖酸鹽、苯甲酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽 亞甲基雙（3 —羥基一 2蔡羧酸 化合物都可以根據傳統上肽化學之一般方法來合 ①固相肽合成法，如：由Ε .艾瑟頓及R . C . 固相肽合成法〃（牛津大學出版公司的I R L印 8 9 )中所說明者，②溶液相合成法，如··由 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由根 優點是它 的胺基酸 這些 用。此類 溴酸鹽、 、酒石酸 、硬脂酸 鹽）。 所有 成，如： 雪佰在'' 刷，1 9 J .瓊斯 牛津，1 的組合法 固相 鹽或4，4 在 ''肽類之化學合成法〃（克 如登出版公司， 9 9 4 )中所說明者，③固相和溶液相二種方法 合成法是從化合物之C -終端來開始的。合適的 起始物質可以經由下述方法來製備，如：將所需要之受保 護的α -胺基酸附著至如下群體：氯甲基化樹脂，羥甲基 化樹脂，benzhydrylamine resin ( Β Η A )例如：可取得之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- A7 B7 1237565 五、發明説明（14 ) 氯甲基化樹脂是由加州里奇蒙市，拜爾瑞德實驗室（

BioRad Laboratories )所出品的 BIOBEADS SX1。羥甲基化 樹脂的製備方法說明於、、邦丹史凱等人所著之'、Chem. Ind .(倫敦）38，1 5 997 ( 1 966)"中。Β Η A樹脂在 ''比塔和 馬歇所著，Chem. Comm.，650 ( 1 970Γ中有所說明並由加 州貝爾曼市，潘寧舒拉實驗室（Peninsula Laboratories ) 製成商品。 經過開始時的附著作用後，α -胺基酸的保護基團可 以用不同的酸試劑來移除，如：室溫下，溶於有機溶劑中 的三氟醋酸（TFA)或氫氯酸（HC1)。在移除α-胺基酸的保護基團之後，剩餘之受保護的天然胺基酸或相 對應於根據通式m，IV，V和VI之單位的羧酸（它們也構 成胺基酸）可以依所需要的順序一步一步地進行偶合。各 受保護的胺基酸一般可以利用合適的羧基活化基團在約超 過三倍量的情況下來反應，這類活化基團有，如：溶解的 二環己基碳化二亞胺（D C C )或二異丙基碳化二亞胺， 它們可溶於如：二氯甲烷（C H 2 C 1 2 )，二甲基甲醯胺 (D M F )或其混合物中。在完成所需要之胺基酸性的序 列後便可將所需要之化合物以一種試劑，如：氟化氫（ H F )，來處理使其從支撐樹脂分裂出來，該種試劑不僅 可將化合物從樹脂中分裂出來，也可把側鏈的保護基團分 裂出來。當所使用的爲氯甲基化樹脂時，以H F來處理會 形成具有終端酸基團的化合物並且是以游離的型態存在。 當使用的是一種ΒΗΑ或對一 Me — ΒΗΑ時，以HF來 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ " -17- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237565 A7 B7 五、發明說明（15) 直接處理會形成具有終端醯胺基團的化合物，它們也是以 游離形態存在。 可用來治療哺乳動物（包括人）體中腫瘤的藥品可以 •含一種根據本發明之化合物或其藥學上可接受的鹽，或根 據本發明之化合物或其藥學上可接受之鹽類的組合體，並 隨意地與下列物質一起混合：載體、賦性劑、媒介、稀釋 劑、母質或延遲釋出之包膜，這些物質可見於 明頓藥 物科學’ 1 8版，賓州伊斯登之A . R .詹納如，E d . 馬克出版公司，Easton，PA1990 〃 。 根據本發明的任一化合物可以由內行人士進行製劑以 提供適用於下列給藥途徑的藥品：腸胃道的、肛門的、直 腸的、陰道的、經皮膚的、肺部的或口服的藥品。 藥品製劑的型態包括：根據所需要之遞送速度所選擇 的化合物。例如：若要迅速遞送化合物的話，則鼻部或血 管內的途徑爲較佳者。 這些藥物可以以有效的治療劑量給予哺乳動物（包括 人類在內），這個劑量可以很容易地由內行人士來決定， 並可依病人的人種、年齡、性別、體重而不同，亦可因給 予的途徑而有不同。例如：對人類而言，當以靜脈途徑給 予時，較合適的劑量範圍爲每公斤體重約1微克至2 5微 克的化合物。而經由口服途徑給予時通常需要較高的劑量 ，例如，對人類而言，經由口服給予的劑量，通常是每公 斤體重約3 0微克至1 0 0 0微克的化合物。正確的劑量 可以很容易地根據前述揭示的內容來決定。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂------------線—一 ?· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -18- A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237565 B7 五、發明說明（16) 實施例 下列實施例說明本發明中用來治療腫瘤之最佳化合物 •的效果 1 .物質和方法 a )化學藥品 六 c?费啉（H i s— D— Mr p— A 丄 a— T r p— D — Phe— Lys— NH2) ，Ala —六 琳（A 1 a — Hi s — D— Mrp— A1 a — Trp— D — Phe — Lys— NH2) ，Tyr — Ala — 77 p窗琳（T y r — A1 a— Hi s— D— Mrp — A1 a— Trp — D — Phe — Lys— NH2)， MK〇677 (N-[l(R) (〔1，2 —二氫一1 — 甲磺醯基螺一（3 H —吲哚，3 ，4 > —六氫吡啶）一 1 /基〕一 2 — （苯甲氧基）乙基〕—2 —胺基一甲基丙 醯胺—甲磺酸酯），EP80317(HAIC—D—

Mr p— D — Ly s— T r p— D — Phe — Ly s — NH2)及 D — (Lys) 3 — GHRP6 (Hi s— ϋ-τ r p— D— Ly s—T r p—D — Phe—Ly s— N H 2 )是由歐洲肽所供應的（法國，阿根提爾）。人體 GHRH (GHRH 1 一 44)和生長抑素（生長抑素 1 一 1 4 )是從、'貝肯〃 （Bachem )公司（瑞士，布邊多 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-19- 1237565 Α7 _ Β7 五、發明說明（17) )購買來的。人類之重組的表皮生長因子（E C F )和所 有的組織培養試劑都是從史格馬化學公司（Sigma， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Chemical Co.，美國密蘇里州聖路易市）所購得的。3 Η —胸 •腺嘧啶是從義大利之法馬西亞-艾默森公司購得（義大利 ，米蘭）。 b )人類組織 從吐林（Tunn )大學 ''生醫科學和人類癌症部門〃( 病理科）收集手術的腫瘤樣本。將相鄰在用於組織病理診 斷之腫瘤旁的腫瘤片段立刻於- 8 0 °C下冷凍並貯存2至 6 0個月直到再經進一步處理以供連接硏究。使用的樣本 包括：1 3個侵入性乳癌（1 0個導管性的，3個小葉性 的），1 4個非內非泌性肺癌（5個鱗狀細胞和9個腺癌 )，1 1個內分泌性肺腫瘤，9個內分泌性胰臟腫瘤及 1 2個甲狀腺癌（7個濾泡源的，5個骨髓源的）。相關 器官之非-腫瘤正常組織也與各腫瘤一起做平行分析。 c )腫瘤細胞株 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 人類肺癌細胞（C a L u 1 ) ，T 4 7 D和M D A — Μ B 2 3 1 ，與人類雌激素有關以及與雌激素無關之乳癌 細胞株從A T C C (美國，馬利蘭州，洛克維爾）購得。 將這些細胞依常例在3 7 °C，5 % C〇2和9 5 %的大氣溫 度下，培養於25cm3的培養盒內以加有i〇%FCS， 青黴素-鏈黴素和兩性黴素的R Ρ Μ I爲其介質。當達到 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -20- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237565 Α7 一 Β7 五、發明說明（1S) 次融合的階段時，以胰蛋白酶/ E D T A將細胞從培養盒 分離出來。 • d ) G H R P受體的分析 依G ·慕奇歐利等人在 ''內分泌期刊，1 5 7，9 9 一 1 0 6 ，1 9 9 8 "中的說明，利用 1 2 5 I — T y r — A 1 a -六啉做爲配體於腫瘤細胞膜上測量G H R P受 體。計算特定連接來做爲沒有過量之未經標識T y r -A 1 a -六啉存在時的連接和有過量之未經標識T y r - A 1 a -六ρ|啉存在時的連接二者間的差異，而其表示 法是以所加入之放射活性的百分比來表示。以GraphPAD Pnsm 2程式（GraphPAD軟體，美國力□州聖地牙哥）來分 析飽和性和競爭性連接的硏究。 e )細胞增生的硏究 D N A的合成是依G ·慕奇利等人所著， ''內分泌學 期刊，1 5 3，3 6 5 — 3 7 1，1 9 9 7 〃中所說明的 3 Η -胸腺嘧啶嵌入法來進行評估的。將飢餓細胞以單獨的 介質（基質）或E GF ( 1毫微克/毫升）在沒有或有不 同濃度（從1 0— 8至1 0— 6莫耳/升）之六ρ會啉，A 1 a 一六 p 孴啉，Tyr-Ala —六 啉，MK0 677’ ( D - Lys) 3 — GHRP6 或 EP803 17 的存在下進 行培養。在培養2 0小時後，加入3 Η -胸腺嘧啶並繼續培 養4小時。終止反應後，將細胞收至玻璃纖維製的濾紙片 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — — — — — — — — — — — ·1111111 « — — — — — — I— I I I - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -21 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237565 A7 B7 五、發明說明（19) 上。以閃爍計數器來計算所嵌入的3 Η -胸腺嘧啶。 依Ρ ·卡所尼（Cassoni)等人所著，於Virchows Archiv，425，467-47 2，1 994 ，中所說明的方法來硏究細胞 •的生長情形。將細胞種在一個帶有2 4個槽的培養盤中， 細胞密度爲5 0 0 〇 — 1 〇 〇 0 0細胞/毫升，共重複三 組。在植入2 4小時後，更換介質。於所需要的槽中加入 濃度從1 0— 8至1 〇— 6莫耳/升的六啉或A 1 a —六 啉。每4 8小時更換一次介質。在處理後的4 8及7 2或 9 6小時計算細胞數，計算方法是由二名各自獨立的檢查 者以血球計數器進行雙盲分析。 f )統計分析 數據是以平均値（第1圖和第2圖）或平均値土 S.E.M.(第3至7圖）來表示（除非另外註明）。統計 上是否具有意義是利用曼一懷特尼測驗（Mann-WhUney test )(第1至3圖）或單向AN0VA (第4至7圖）來決 定的。每一種實驗都至少重複進行三次。 2 .結果 a)鑑定GHRP及其拮抗劑在不同的人類腫瘤中的受體 第1圖顯示經放射標識之T y r — A 1 a —六_啉在 來自不同來源之內分泌及非-內分泌性人類腫瘤細胞膜上 的連接分佈情形（* P < 0 . 0 1對相對應之非腫瘤組織） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ：--I—j----------------1417------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -22- Α7 Β7 1237565 五、發明說明（2〇) 。肺和乳房之非-內分泌性腫瘤以及胰臟和甲狀腺（濾泡 型）的內分泌癌所具有的中間特定連接値在統計學上高於 在相對應之非腫瘤正常組織中所發現的數値。相反的’肺 •部或甲狀腺（骨髓型）的正常組織和內分泌腫瘤的特定連 間値之間並沒有差異。 b)GHRP及其拮抗劑受體的生化特徵 爲了測疋lw5 I - Ty r - A 1 a —六p濟琳對腫瘤細 胞膜的連接是否具有配體-受體交互作用之典型性質，本 發明者在一種起源於肺部的非內分泌性癌（此種組織具有 最高的特定連接値）中更詳盡地檢查放射追蹤劑的連接情 形。第2圖爲放射配體之增加濃度的函數，此函數是描述 125工—Tyr— Ala —六崎啉對腫瘤細胞膜的連接情 形。此硏究顯示出可飽和特定連接的證明，而、、史卡卻分 析〃（較上方的表）表示有一組高親和性部位的存在。 1 2 5 I — T y r — A 1 a —六p會啉連接至腫瘤連接部 位的專一性是以不同化合物與放射配體競爭的能力來決定 的（c f ·第3圖）。放射追蹤劑對腫瘤細胞膜的連接力 是由如下群體以一種依劑量決定的型式來取代：六P|啉、 A 1 a —六崎啉，Tyr— Ala —六p营啉及G H R P括 抗劑，如：D— (Lys)3 — GHRP6 和 ΕΡ80 3 17 ，一種六ρ智啉之（胺基一azepino — D引晚）i — D ( L y s )3衍生物，此衍生物在新生老鼠中不會釋出G Η。在有 Μ Κ 0 6 7 7存在時可觀察到一種可忽略的取代行爲（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 」, f _1 taMMm Βϋ ·11 *1ϋ n I ·ϋ 1 ·*··1 n immm I n I— n n Hi n ·ϋ n·· n I n I— i an n - -23- 1237565 A7

五、發明說明（21 ) MK0 6 7 7是一種連接至腦下垂體GHRP受體的非一 Pepndyl G H R P模擬物）。相反的，在有^ η R H或生 長抑素存在時沒有任何競爭行爲可觀察到。 c ) G H R Ρ及其拮抗劑對3 η -胸腺嘧啶嵌入作用的效果 濃度爲1 0_6莫耳/升的六ρ|啉可以抑制在人類肺癌 細胞中之基本及經E G F刺激的二種3 Η -胸腺嚼d定嵌入作 用（c f ·第4圖；*P<〇 .〇5 ，**Ρ<〇·〇]_相對 於對照組）。當將細胞在有1 0 — 6莫耳/升a 1 a -六 啉，丁 yr— Ala —六口曾啉或GHRP拮抗劑，如：（ D — Lys) 3— GHRP6 和 EP80317 的存在下進 行培養時，可觀察到抗增生效果。相反的，當有 Μ K 〇 6 7 7的存在時，可觀察到些微的抑制作用。經由 增加/、ρ會琳，A 1 a —六p畲琳，Tyr— A1 a —六ρ習琳 ，（D — Lys)3— GHRP6 和 EP80317 (cf .第5圖）的濃度可顯示出這些化合物會抑制在人類肺癌 細胞上的E G F增生效果，而且是以根據劑量的型式來作 用的。EP8 0 317的EC5〇數値爲5 . 6x10— 8莫 耳/升，Ty r— A 1 a —六p會啉爲6 · 5x 1 〇— 8莫耳 /升，六，啉爲8x1〇~8莫耳/升。 d ) G H R P在細胞生長上的效果 在人類肺癌細胞中，濃度爲1 〇— 8莫耳/升的六啉 在與對照組進行比較時，待經過9 6小時後會具有明顯的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) * I-------訂---------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -24- 1237565 A7 B7 五、發明説明（22 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 降低肺癌細胞數目的效果（- 4 7 % )。此效果在濃度爲 1 0 —,莫耳/升和1 〇 — 6莫耳/升時，在任何測試時間點 觀察都會有更明顯的增加（c f .第6圖；* * p < 〇·〇〇1 ; ***P <〇·〇〇〇1 v s .對照組）。 在人類乳癌T 4 7 D細胞中，濃度爲丨〇 - 8莫耳/升 的六啉在與對照組進行比較時，待經過9 6小時後會有 很明顯的降低乳癌細胞數目的效果（一 5 4 % )。此效果 在濃度爲1 0 7莫耳/升和1 0 — 6莫耳/升時，於任何測 試時間點觀察時都會時顯地增加（c f .第7 a圖； **Ρ<〇·〇〇1;***Ρ<〇·〇〇〇1 vs·對照組 )。A 1 a -六啉在這些腫瘤細胞上也表現出類似的抗 增生效果（c f ·第7b圖；**P<〇· 〇〇1 0.0 0 0 1 v s ·對照組）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製· 在人類乳癌MDA— MB 2 3 1細胞中，濃度爲 1 0 — 8莫耳/升的六啉在與對照組進行比較時，於7 2 小時後可具有明顯的降低癌細胞的效果（一 3 3 % )。濃 度爲1 0 — 7莫耳/升和10 — 6莫耳/升的六啉於任何測 試時間點觀察時都可觀察到更進一步的效果（c f .第 8a 圖；*P<〇· 〇 1 ;**P<〇.0 0 1 ; *** p < 0-0 0 0 1 73.張照雄）〔（：€.第813圖；*?〈 〇 . 0 1 ； **P < 〇 . 〇 0 1 ； ***P < 0.0 0 0 1 v s .對照組） 這些結果證明合成的生長釋出肽及其拮抗劑可抑制體 外人類癌細胞的生長。而此抗增生效果是由一種特殊受體 本紙浪尺度適用中國國家縣（CNS ) Μ祕（21〇X赠）_ 25 _ 1237565五、發明説明（23 )所促成的。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 «Le 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ297公釐） -26-

Claims (1)

1237565 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 广·*·^ ---------------—.— 附件2A: 第8 8 n 7 9 8 4號專利申請案叫斗0以也修又;1; 中文申請專利範圍替換本 ί................................... ........—---------------------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國94年4月14日修正 1 • 一 種 用 於 哺 乳 動物 治 療腫 瘤 丨之藥 丨學組 成 ，物 5 其 包 含 治 療 上 有 效 量 之 1 或 多個 選 自下 述 之化合物 : Η i s — D — Μ r Ρ — A 1 a -τ r P — D - Ρ h e · 一 L y s — N Η 2 9 A 1 a — H i s - D — Mr P -A 1 a — T r Ρ — D - - P h e — L y s — Ν Η 2 » 丁 y r — A 1 a — Η ί s — D -Μ r P — A 1 a — Τ r P — D — P h e 一 L y S 一 Ν Η 2 ； Η i s — D — 丁 r Ρ — D - L y s — T r Ρ - D — Ρ h e — L y s — N Η 2 ;及 Η A I C — D 一 Μ r Ρ 一 D — L y s -Τ r ρ — D — Ρ h e — L y s — Ν Η 2 ° 2 • 如 串 三主 S円 專 利 範 圍第 1 項之 藥 學組 .成物 ， 其 中 該 腫 瘤 是 肺 乳 房 N 甲 狀 腺 或胰 臟 腫瘤 0 3 • 如 串 三主 日円 專 利 範 圍第 1 項之 藥 學組 .成物 ， 其 中 該 化 合 物 白 含 有 腫 瘤 之 哺 乳 動物 組 織取 代 放射活性i 漂 記 1 2 5 I — Τ y r — A 1 a - Η i s — D - Mr Ρ — A 1 a — τ r P — D — Ρ h e 一 L y s — N Η 2 ο 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）