ES2212650T3

ES2212650T3 - Uso de una composicion liberador de la hormona de crecimiento y sus antagonistas para el tratamiento de los tumores.

Info

Publication number: ES2212650T3
Application number: ES99955974T
Authority: ES
Inventors: Giampiero Muccioli; Mauro Papotti; Ezio Ghigo; Romano Deghenghi
Original assignee: Ardana Bioscience Ltd
Current assignee: Ardana Bioscience Ltd
Priority date: 1998-11-16
Filing date: 1999-11-11
Publication date: 2004-07-16
Anticipated expiration: 2019-11-11
Also published as: PT1131083E; UA73100C2; TWI263642B; CN1895660A; NO20012367D0; CN1200726C; WO2000029011A1; TWI237565B; CZ20011577A3; TW200530270A; DE69914365D1; KR100704138B1; CN1326353A; BR9915390A; NO20012367L; CA2350914A1; HUP0104374A2; HUP0104374A3; AR021286A1; IL142858A0

Abstract

El uso de un péptido liberador de una hormona de crecimiento o su antagonista, el cual desplaza el marcador radiactivo 125l-Tyr-Ala-Hexarelina para la producción de un medicamento para tratar un mamífero que tenga un tumor provisto de un receptor para secretagogos de hormona de crecimiento, en el cual dicho péptido o antagonista se debe administrar a un mamífero en necesidad de dicho tratamiento en una cantidad eficaz para reducir o inhibir la proliferación de células oncogénicas.

Description

Uso de una composición liberadora de la hormona de crecimiento y sus antagonistas para el tratamiento de los tumores.

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de un péptido liberador de la hormona de crecimiento, un antagonista suyo, el cual desplaza el marcador radiactivo ^{125}I-Tyr-Ala-Hexarelina, para la producción de un medicamento para la reducción de la proliferación de las células cancerígenas al administrar péptidos, y sus antagonistas, liberadores de la hormona de crecimiento.

Antecedentes de la invención

La secreción de la hormona del crecimiento (GH, por las siglas de su expresión inglesa, Growth Hormone, Hormona del Crecimiento) es regulada por dos péptidos del hipotálamo: la hormona de liberación de la GH (GHRH, por las siglas de su expresión inglesa, GH-Releasing Hormone), que ejerce un efecto estimulante sobre la liberación de la GH y la Somatostatina que exhibe una influencia inhibitoria. En los últimos años, varios investigadores han demostrado que la secreción de GH también puede estimularse por oligopéptidos sintéticos denominados péptidos liberadores de GH (GHRP, por las siglas de su expresión inglesa, GH-Releasing Peptides), como la hexarelina y varios análogos de la hexarelina (Ghigo et al.,European Journal of Endocrinology, 136, 445-460, 1997). Estos compuestos actúan a través de un mecanismo que es distinto al de la GHRH (C.Y. Bowers, en "Xenobiotic Growth Hormone Secretagogues", Eds. B.Bercu and R.F. Walker, Pág. 9-28, Springer-Verlag, New York 1996) y por la interacción con receptores específicos localizados en el hipotálamo y la glándula pituitaria ((a) G. Muccioli et al., Journal of Endocrinology, 157, 99-106, 1998; (b) G. Muccioli, "Tissue Distribution of GHRP Receptors in Humans", Abstracts IV European Congress of Endocrinology, Sevilla, España, 1998). Recientemente fue demostrado que los receptores de GHRP no sólo están presentes en el sistema hipotálamo - pituitario, sino que incluso en varios tejidos humanos generalmente no asociados con la liberación de GH.

Los GHRP y sus antagonistas se describen, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: C.Y. Bowers, supra, R. Deghenghi, "Growth Hormone Releasing Peptides", ibidem, 1996, pg. 85-102; R. Deghenghi et al., "Small Peptides as Potent Releasers of Growth Hormone", J. Ped. End. Metab., 8, pg. 311-313, 1996; R. Deghenghi, "The Development of Impervious Peptides as Growth Hormone Secretagogues", Acta Paediatr. Suppl., 423, pg. 85-87, 1997; K. Veeraraganavan et al., "Growth Hormone Releasing Peptides, (GHRP) Binding to Porcine Anterior Pituitary and Hypothalamic Membranes", Life Sci., 50, Pg. 1149- 1155, 1992; y en T.C. Somers et al., "Low Molecular Weight Peptidomimetic Growth Hormone Secretagogues", WO 96/15148 (May 23, 1996).

Sumario de la invención

La presente invención se refiera al uso de un péptido liberador de la hormona de crecimiento, un antagonista suyo, el cual desplaza el marcador radiactivo ^{125}I-Tyr-Ala-Hexarelina, para la producción de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un mamífero, en el cual una cantidad eficaz de un péptido liberador de la hormona de crecimiento (GHRP) o un antagonista suyo se debe administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento. Alternativamente, los compuestos usados según la presente invención se pueden definir como secretadores de una hormona de crecimiento o su antagonista. Las cantidades de estos compuestos son eficaces para reducir o inhibir la proliferación de células oncogénicas en el mamífero. Estos compuestos se especifican por la característica que ellos desplazan al marcador radiactivo ^{125}I-Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2} (^{125}I-Tyr-Ala-Hexarelina) de un tejido que contenga un tumor en un mamífero.

Los compuestos aquí descritos exhiben una ligadura al tejido oncogénico y se ha encontrado que después de su administración actúan sobre un receptor específico, para así impartir una disminución en el número de células oncogénicas. Preferentemente, los tumores tratados son tumores de pulmón, mamas, tiroides o páncreas.

Los compuestos antedichos incluyen ciertos compuestos conocidos (véase lo anterior), pero otros compuestos útiles en la invención no se han publicado con anterioridad e incluyen un espirolactamo, unidad peptidomimética bicíclica o tricíclica. Una característica común para todos los compuestos útiles en la invención es que en ellos está presente por lo menos una unidad de lisina.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes

En esta descripción, se usan las siguientes abreviaciones: D es el dextro enantiómero, GH es la hormona de crecimiento, Mrp es 2-metil-Trp, IMA es imidazolilacetilo, GAB es \gamma-butirilamino, INIP es isopecotinilo, AIB es amino- isobutirilo, Nal es (3-naftilalanina, TXM es el tranexamilo, es decir, 4-(amino-metil)-hexametilen-carbonilo, D-HNH es D-1,2,3,4,5,6-hexahidro-norharman-3-carboxilato, HAIC es (2S, 5S) -5-amino-1, 2, 4, 5, 6, 7-hexahidro-azepino(3, 2, 1-hi]indole-4-ona-2-carboxilato, ATAB es 2-R-(2\beta, 5\beta, 8\beta)-8-amino-7-oxo-4-tia-1-aza-biciclo[3.4.0] nonan-2-carboxilato, y Ala, Lys, Phe, Trp, His, Thr, Cys, Tyr, Leu e Ile son los aminoácidos alanina, lisina, fenilalanina, triptofano, histidina, treonina, cisteína, tirosina, leucina e iso-leucina, respectivamente.

En una realización de la invención, los compuestos útiles para ser administrados son de la fórmula general I:

(I)AA^{1}-AA^{2}-AA^{3}-AA^{4}-Lys-R

En la que:

AA^{1} es IMA, GAB, INIP, TXM, AIB, His-D-Trp -, His-D-Mrp, Thr-D-Trp,

Thr-D-Mrp, D-Thr-D-Trp, D-Thr-D-Mrp, D-Ala-D-Nal, IMA-D -Trp, IMA-D-Mrp,

D-Thr-His-D-Trp, D-Thr-His-D-Mrp, Cys-Tyr-GAB, Ala-His -Trp,

Ala-His-D-Mrp, Tyr-Ala-His-D-Trp, Tyr-Ala-His-D-Mrp, D-Ala-D-Trp,

o D-Ala-D-Mrp;

AA^{2} es Ala, D-Nal, D-Lys, D-Mrp o Trp;

AA^{3} es D-Trp, D-Nal, D-Trp, Mrp, D-Mrp, Phe, o D-Phe;

AA^{4} es D-Trp, Mrp, D-Mrp, Phe, o D-Phe; y

R es -NH_{2}, Thr-NH_{2}, o D-Thr-NH_{2}.

Se prefieren los compuestos que contengan una unidad D-Mrp.

En otra realización, los compuestos útiles incluyen aquellos descritos en la solicitud de patente americana Nº 09/089,954, presentada el 3 de junio de 1998. Estos compuestos son péptidos de la fórmula general II:

(II)A - B - D-Mrp - C - E

En la que:

A es H o Tyr;

B es un espirolactamo de la fórmula general III

1

en la que R^{1} es H o Tyr, R^{2} representa la cadena lateral de cualquier aminoácido que exista en la naturaleza y la configuración en * es (R), (S) o una mezcla de éstas; un compuesto tricíclico de la fórmula IV

2

en la que R^{3} es H o Tyr y la configuración en * es (R), (S) o una mezcla de éstas; un compuesto bicíclico de la fórmula V

3

en la que R^{4} es H o Tyr y la configuración en * es (R), (S) o una mezcla de éstas;

D-Mrp es Dextro-2-metil-Trp;

C es Trp-Phe-Lys, D-Trp-Phe-Lys, Mrp-Phe-Lys, D-Mrp-Phe Lys, Trp-Lys,

D-Trp-Lys, Mrp-Lys, D-Mrp-Lys, Ala-Trp-D-Phe-Lys, Ala -Mrp-D-Phe-Lys,

Ala-D-Mrp-D-Phe-Lys, D-Lys-Trp-D-Phe-Lys, D-Lys-Mrp-D Phe-Lys,

D-Lys-D-Mrp-D-Phe -Lys, o un compuesto tricíclico de la fórmula VI

4

en la que R^{5} es H o SO_{2}Me y las configuraciones en * son cualesquiera de (R), (S) o una mezcla de éstas; y

E es Lys-NH_{2} o -NH_{2}, con tal de que E sea Lys-NH_{2} cuando C es el compuesto tricíclico VI, previamente definido. v

De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que tanto los compuestos que liberan GH y compuestos que no liberan GH son útiles para el tratamiento de tumores. Preferentemente el tumor a ser tratado según la invención es un tumor de pulmones, mamas, tiroides o páncreas.

Específicamente los compuestos preferentes liberadores de GH de la fórmula general I incluyen los siguientes:

His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, His-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2}, D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-
Lys-NH_{2}, Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2}, IMA-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-
NH_{2}, GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH_{2}, D-Ala-D-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, INIP-D-Nal-D-Nal-Phe-Lys-NH_{2}, INIP-D-Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2}, IMA-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},
INIP-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH_{2}, GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2}, TXM-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2}, GAB-D-Mrp-Mrp-Phe-Lys-NH_{2} Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Thr-NH_{2}, His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH_{2}, GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH_{2}, Cys-Tyr-GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH_{2}, Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, y D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}.

mientras que los compuestos preferentes de la fórmula general I que no liberan GH incluyen a:

His-D-Trp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

His-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

His-Ala-D-Trp-Lys-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2}

His-D-Mrp-D-Lys-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2},

His-Ala-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2}, y

His-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2}.

Los compuestos preferentes de la fórmula general II incluyen los siguientes:

[S,S-Spiro(Pro-Leu)] - D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},

[S, S-Spiro (Pro-Leu)] - D-Mrp-Mrp - Lys -NH_{2}

[S, S-Spiro (Pro-Leu)]-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

[S,S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

Tyr-[S,S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

[S,S-Spiro(Pro-Ile)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

[S, S-Spiro (Pro-Leu)]-D-Mrp-D-HNH-(SO_{2}CH_{3})-Phe-Lys-NH_{2},

HAIC-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, y

ATAB-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

en los que S,S-Spiro(Pro-Leu) y S,S-Spiro(Pro-Ile) son pentanoato de 4-Metil-2S[6'-oxo-(5'-S)1',7'-diazaspiro[4,4]nonan-7'-il -] y pentanoato de 3-Metil-2S[6'-oxo-(5'-S)1',7'-diazaspiro[4,4]nonan-7'-il-], respectivamente.

Estas unidades tienen la fórmula

5

en la que R^{1} es H y R^{2} es la cadena lateral de Leu o Ile (véase P. Ward et al.,J. Med. Chem., 33, 1848 (1990)). También, el compuesto tricíclico HNH se obtiene por hidrogenación convencional de los correspondientes ácidos tetrahidro-norharman-3-carboxílicos de la fórmula

10

Las unidades según las fórmulas III, IV, V y VI constituyen unidades peptidomiméticas que son ventajosas ya que ellas se cierran en una configuración de un \beta-giro que imita así a los aminoácidos naturales.

También, si se desea, pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables de estos compuestos. Tales sales incluyen sales orgánicas o inorgánicas de adición, como hidrocloruro, hidrobromuro, fosfato, sulfato, acetato, succinato, ascorbato, tartrato, gluconato, benzoato, malato, fumarato, estearato o sales de pamoato.

Todos los compuestos pueden sintetizarse convenientemente según métodos usuales de la química de péptidos tales, como la síntesis de péptidos en fase sólida de la manera descrita por E. Atherton and R.C. Sheppard in "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL Press de Oxford University Press, 1989, o como la síntesis en solución en calidad de fase como se ha descrito por J. Jones in "The Chemical Synthesis of Peptides", Clarendon Press, Oxford 1994, o por una combinación de ambos métodos en fases sólida y de solución, como es conocido en la técnica.

La síntesis en fase sólida parte del terminal C de los compuestos. Puede prepararse un material conveniente de partida, por ejemplo, pegando el ácido \alpha-amino protegido requerido a una resina clorometilada, una resina hidroximetilada, una resina de bencidrilamina (BHA) o a una resina para-metil-bencidrilamina (p-Me-BHA). Como por ejemplo, una resina clorometilada disponible es BIOBEADS SX1 de los Laboratorios BioRad, Richmond, California. La preparación de la resina hidroximetilada se describe por Bodansky et al.,Chem. Ind. (London), 38, 15997 (1966). La resina BDH se describe por Pietta & Marshall, Chem. Comm., 650 (1970), y está comercialmente disponible en Peninsula Laboratories Inc., Belmont, California.

Después de la pegadura de partida, se puede retirar el grupo de protección del \alpha-aminoácido por medio de diferentes reactivos ácidos, como el ácido trifluoracético (TFA) o ácido clorhídrico (HCl), disueltos en solventes orgánicos a temperatura ambiente. Después de la retirada del grupo de protección del \alpha-aminoácido, los aminoácidos naturales o ácidos carboxílicos protegidos que aún permanezcan y que correspondan a las unidades según las fórmulas generales III, IV, V, y VI, las que también constituyen aminoácidos, se pueden acoplar paso a paso en el orden deseado. Generalmente, se puede hacer reaccionar cada aminoácido protegido en un exceso de más de aproximadamente tres veces usando un grupo carboxilo conveniente, como la diciclohexilcarbodiimida (DCC) o diisopropilcarbodiimida (DIC) disueltas, por ejemplo, en dicloroetano (CH_{2}Cl_{2}), dimetilformamida (DMF) o sus mezclas. Después de que se haya completado la sucesión deseada de aminoácidos, el compuesto deseado puede ser escindido de la resina de soporte por tratamiento con un reactivo como fluoruro de hidrógeno (HF), que no sólo escinde al compuesto de la resina, sino que también los grupos de protección de las cadenas laterales. Cuando se usa una resina clorometilada, el tratamiento con HF lleva a la formación de un compuesto que tiene un grupo ácido terminal y está presente en su forma libre. Cuando se usa una resina BDH o p-Me-BDH, el tratamiento con HF lleva directamente a la formación de un compuesto que tiene un grupo amida terminal y está presente en su forma libre.

Los medicamentos útiles para tratar tumores en un mamífero, incluyendo un humano, pueden comprender un compuesto según la presente invención o una sal suya, farmacéuticamente aceptable, o combinaciones de compuestos según la presente invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables, opcionalmente en mezcla con un portador, excipiente, vehículo, diluyente, matriz, o recubrimiento de liberación. Ejemplos de tales portadores, excipientes, vehículos y diluyentes pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990.

Cualquiera de los compuestos según la presente invención puede formularse por el experto en la técnica para proporcionar medicamentos que sean convenientes para la administración parenteral, bucal, rectal, vaginal, transdérmica, vías pulmonares u orales.

El tipo de formulación del medicamento que contenga el compuesto puede seleccionarse según la tasa deseada de entrega. Por ejemplo, si los compuestos deben ser entregados rápidamente, se prefiere la vía nasal o intravenosa.

Los medicamentos pueden administrarse a los mamíferos, incluyendo a los humanos, en una dosis terapéuticamente eficaz que puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica y que puede variar según la especie, edad, sexo y peso del paciente o sujeto tratado, así como también variar según la vía de administración. Por ejemplo, en los humanos, cuando se administra intravenosamente, la dosis preferente se encuentra en el intervalo desde aproximadamente 1 \mug hasta aproximadamente 25 \mug del compuesto total por kg de peso corporal. Cuando se administra oralmente, generalmente son necesarias cantidades superiores. Por ejemplo, en los humanos para la administración oral, el nivel de dosificación es típicamente desde aproximadamente 30 \mug hasta aproximadamente 1000 \mug del compuesto total por kg de peso corporal. El nivel exacto se puede fácilmente determinar empíricamente en base a la revelación anterior.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran la eficacia de los compuestos más preferentes, usados en el tratamiento de esta invención para tumores.

1. Materiales y métodos a) Compuestos químicos

Hexarelina (His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}), Ala-Hexarelina (Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}), Tyr-Ala Hexarelina (Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys- NH_{2}), MK0677 (sulfonato de N-[1 (R) ([1,2-dihidro-l-metan-sulfonil-espiro-(3H-indol, 3,4'-piperidina)-1'il)-2-(fenil-metoxi)etil]-2-amino-metil-propan-amida-metano), EP80317 (HAIC-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}) y D -(Lys)_{3}-GHRP6 (His-D Trp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}) se proporcionaron por Europeptides (Argenteuil, Francia). El GHRH humano (GHRH 1-44) y la somatostatina (somatostatina 1-14) se adquirieron de Bachem (Bubendorf,, Suiza). El factor recombinante humano de crecimiento epidérmico (EGF, por las siglas de su expresión inglesa, Epidermal Growth Factor) y todos los reactivos de cultivo de tejidos se compraron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.). La ^{3}H-Timidina se compró de Pharmacia-Amersham Italia (Milán, Italia).

b) Tejidos humanos

Los especímenes quirúrgicos de tumores fueron reunidos en el Departamento de Ciencias Biomédicas y Oncología Humana (División de Patología) de la Universidad de Turín. Un fragmento de tumor, adyacente al usado para el diagnóstico histopatológico fue inmediatamente helado a -80ºC y guardado durante 2 hasta 60 meses para su procesamiento ulterior en estudios de ligadura. Se usaron muestras de 13 carcinomas invasivos de pecho (10 ductales y 3 lobulares), 14 carcinomas pulmonares no endocrinos (5 de células escamosas y 9 de adenocarcinomas), 11 tumores endocrinos de pulmón, 9 tumores endocrinos de páncreas y 12 carcinomas tiroideos (7 de origen folicular y 5 de origen medular). También se analizaron tejidos normales no neoplásicos de los órganos correspondientes, en paralelo con los tumores individuales.

c) Líneas celulares de tumores

Las líneas celulares de carcinoma pulmonar humano (CaLu1), T47D y MDA-MB231, respectivamente, cáncer humano de pecho oestrogen dependiente y oestrogen independiente se adquirieron de ATCC (Rockville, MD, EE.UU.). Las células fueron cultivadas de modo rutinario en frascos de 25 cm^{3} a 37ºC, en una atmósfera de 5% CO2 y 95% humedad en RPMI con suplemento de 10% de FCS, penicilina-estreptomicina y fungizone. Cuando se alcanzaba un estado subconfluente, se retiraban las células de los frascos con ayuda de tripsina / EDTA.

d) Ensayo de receptores de GHRP

Los receptores de GHRP fueron medidos en membranas tumorales como está descrito en G. Muccioli et al., Journal of Endocrinology, 157, 99-106, 1998, usando ^{125I}-Tyr-Ala-Hexarelina como ligando. La ligadura específica fue calculada como la diferencia entre la ligadura en ausencia y en presencia de exceso de Tyr-Ala- Hexarelina sin marcar y expresada como un porcentaje de la radioactividad añadida. Los estudios de ligadura de saturación y competición se analizaron con el programa GraphPAD Prism 2 program (GraphPAD Software, San Diego, CA, EE.UU.).

e) Estudios de proliferación celular

La síntesis de ADN se evaluó por incorporación de ^{3}H-timidina como está descrito en G. Muccioli et al., Journal of Endocrinology, 153, 365-371, 1997. Se incubaron las células de cultivo con el medio solo (basal) o EGF (1 ng/ml) en ausencia o en presencia de concentraciones diferentes (de 10^{-8} a 10^{-6} mol/l) de Hexarelina, Ala-Hexarelina, Tyr-Ala-Hexarelina, MK0677, (D-Lys)_{3}-GHRP6 o EP80317. Después de incubación durante 20 horas, se agregaron _{3}H-timidina y la incubación se continuó durante unas 4 horas adicionales. La reacción fue detenida y las células fueron colectadas sobre tiras de filtro de fibra de vidrio. La incorporación de _{3}H-timidina fue medida en un contador de centelleo.

Los estudios de crecimiento celulares se realizaron como está descrito en P.Cassoni et al., Virchows Archiv, 425, 467-472, 1994. Se sembraron las células por triplicado en placas de 24 viales a una densidad de 5,000-10,000 células/ml. Se cambiaron a las veinticuatro horas después de colocar el medio. Se agregaron Hexarelina o Ala-Hexarelina en donde se requería a concentraciones del orden de 10^{-8} a 10^{-6} mol/l. El medio se cambió cada 48 horas. Se contaron las células a 48 y 72 o 96 horas de tratamiento en un análisis doble a ciegas por dos investigadores independientes que usaban un hemocitómetro.

f) Análisis estadístico

Los datos se expresaron como promedios (Fig. 1 y 2)) o promedios \pm S.E.M., a menos que por otra parte se especifique lo contrario. El valor estadístico significativo se determinó por Mann Whitney o por ANOVA. Todos los experimentos se llevaron a cabo por lo menos por triplicado.

2. Resultados a) Identificación de receptores de GHRP y sus antagonistas en diferentes tumores humanos.

Se midió la distribución de la ligadura radiomarcada de Tyr-Ala-Hexarelina a las membranas de diferente tumores humanos, endocrinos y no endocrinos, de varios orígenes (*P < 0,01 vs. el tejido no tumoral correspondiente). Los tumores no endocrinos de pulmón y pecho, así como los tumores endocrinos de páncreas y tiroides (de tipo folicular) mostraron un valor mediano de ligadura específica, el cual fue estadísticamente superior al encontrado en los correspondientes tejidos normales no tumorales. Por el contrario, no se observó ninguna diferencia de los valores de ligadura específica entre el tejido normal y de los tumores endocrinos de pulmón y tiroides (tipo medular).

b) Características bioquímicas de los receptores de GHRP y sus antagonistas

Para determinar si la ligadura de ^{125}I-Tyr-Ala-Hexarelina a las membranas tumorales muestra las propiedades típicas de la interacción ligando-receptor, se investigó con mayor detalle la ligadura del radiomarcador en un carcinoma no endocrino de pulmón, el cual mostró el mayor valor de ligadura específica. Se midió la ligadura de ^{125}I-Tyr-Ala-Hexarelina a las membranas tumorales como una función de las concentraciones en aumento del radioligando. Este estudio reveló la evidencia de ligadura específica saturable y el análisis de Scatchard indicó (cuadro superior) la presencia de una sola clase de sitios de alta afinidad.

La especificidad de la ligadura de ^{125}I-Tyr-Ala-Hexarelina se estableció determinando la habilidad de diferentes compuestos para competir con los radioligandos para los sitios tumorales de ligadura. La ligadura del radiotrazador se desplazó de un modo dependiente de la dosis por antagonistas de Hexarelina, Ala-Hexarelina, Tyr-Ala-Hexarelina y GHRP, tales como (D-Lys)_{3}-GHRP6 y EP80317, un derivado (Amino-azepino-indol)- (D-Lys)_{3}- de la Hexarelina, el cual no libera GH en ratas neonatas. Se observó un desplazamiento despreciable en presencia de MK0677, un GHRP mimético no peptidilo que liga a los receptores de GHRP pituitarios. Por el contrario, no se observó ninguna competición en la presencia de GHRH o somatostatina.

c) Efecto de GHRP y sus antagonistas en la incorporación de H-timidina

La Hexarelina a 10^{-6} mol/l pudo inhibir la incorporación de _{3}H-timidina, tanto la basal como la estimulada por EGF en las células humanas de carcinoma pulmonar *P < 0,05, **P < 0,.01 vs. el control). Este efecto antiproliferativo también fue observado cuando las células se incubaron en presencia de 10^{-6} mol/l de Ala-Hexarelina, Tyr-Ala-Hexarelina o de antagonistas de GHRP como (D-Lys)_{3}-GHRP6 y EP80317. Por el contrario, se observó una ligera inhibición en presencia de MK0677. Los experimentos usando concentraciones crecientes de Hexarelina, Ala-Hexarelina, Tyr-Ala-Hexarelina, (D-Lys)_{3}-GHRP6 y EP80317 revelaron que estos compuestos inhibieron el efecto proliferativo de EGF en las células humanas de carcinoma de pulmón, inhibidas de un modo dependiente de la dosis. El valor EC_{50} fue 5,6 x 10^{-8}mol/l para EP80317, 6,5 x 10^{-8} mol/l para Tyr-Ala-Hexarelina, 8 x 10^{-8} mol/l para Hexarelina, 9 x 10^{-8} mol/l para (D-Lys)_{3}-GHRP6 y 1 x 10^{-7} mol/l para Ala-Hexarelina.

d) Efecto de GHRP sobre el crecimiento celular

En las células humanas de carcinoma de pulmón, la Hexarelina a 10^{-8} mol/l provocó una disminución (-47%) en el número de células en comparación con el control, lo que constituye un efecto significativo después de sólo 96 horas. Este efecto aumentó aún más a 10^{-7} mol/l y 10^{-6} mol/l y se observó a cualquier valor de tiempo ensayado **P < 0,001, *** P < 0,0002 vs. el control).

En las células T47D de cáncer humano de pecho, la Hexarelina a 10^{-8} mol/l provocó una disminución (-54%) en el número de células en comparación con el control, lo que constituye un efecto significativo, después de solamente 96 horas. Este efecto aumentó más aún a 10^{-8} mol/l y 10^{-6} mol/l y se observó a cualquier valor de tiempo **P < 0,001, *** P < 0,0001 vs. el control). Un efecto similar antiproliferativo también se desarrolló por Ala-Hexarelina en estas células tumorales (**P < 0,001, ***P < 0,0001 vs. el control).

En las células MDA-MB231 de cáncer humano de pecho, la Hexarelina a 10^{-8} mol/l provocó una disminución

\hbox{(-33%)}

en el número de células en comparación con el control, lo que constituye un efecto significativo, después de sólo 72 horas. Este efecto aumentó aún más a las 10^{-7} mol/l y 10^{-6} mol/l y se observó a cualquier valor de tiempo ensayado (*P < 0,01, **P < 0,001; *** P < 0,0001 vs. el control). Un efecto antiproliferativo similar también se desarrolló por Ala-Hexarelina en estas células tumorales (*P < 0,01, ** P < 0,001, ***P < 0,0001 vs. el control).

Estos resultados demuestran que los péptidos sintéticos de liberación de hormona del crecimiento y sus antagonistas inhiben in vitro el crecimiento de células humanas de carcinomas. El efecto antiproliferativo se media por un receptor específico.

Claims

1. El uso de un péptido liberador de una hormona de crecimiento o su antagonista, el cual desplaza el marcador radiactivo ^{125}I-Tyr-Ala-Hexarelina para la producción de un medicamento para tratar un mamífero que tenga un tumor provisto de un receptor para secretagogos de hormona de crecimiento, en el cual dicho péptido o antagonista se debe administrar a un mamífero en necesidad de dicho tratamiento en una cantidad eficaz para reducir o inhibir la proliferación de células oncogénicas.

2. El uso de la Reivindicación 1, en el que el tumor es un tumor de pulmón, mamas, tiroides o páncreas.

3. El uso de la Reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona entre un grupo que consiste en

a): en compuestos de la fórmula general I:

(I)AA^{1} - AA^{2}-AA^{3}-AA^{4}-Lys-R

En la que:

AA^{1} es IMA, GAB, INIP, TXM, AIB, His-D-Trp -, His-D-Mrp, Thr-D-Trp,

Thr-D-Mrp, D-Thr-D-Trp, D-Thr-D-Mrp, D-Ala-D-Nal, IMA-D -Trp, IMA-D-Mrp,

D-Thr-His-D-Trp, D-Thr-His-D-Mrp, Cys-Tyr-GAB, Ala-His -Trp,

Ala-His-D-Mrp, Tyr-Ala-His-D-Trp, Tyr-Ala-His-D-Mrp, D-Ala-D-Trp,

o D-Ala-D-Mrp;

AA^{2} es Ala, D-Nal, D-Lys, D-Mrp o Trp;

AA^{3} es D-Trp, D-Nal, D-Trp, Mrp, D-Mrp, Phe, o D-Phe;

AA^{4} es D-Trp, Mrp, D-Mrp, Phe, o D-Phe; y

R es -NH_{2}, Thr-NH_{2}, o D-Thr-NH_{2}.

b): compuestos de la fórmula general II:

(II)A - B - D-Mrp - C - E

En la que:

A es H o Tyr;

B es un espirolactamo de la fórmula general III

6

7

8

D-Mrp es Dextro-2-metil-Trp;

C es Trp-Phe-Lys, D-Trp-Phe-Lys, Mrp-Phe-Lys, D-Mrp-Phe Lys, Trp-Lys,

D-Trp-Lys, Mrp-Lys, D-Mrp-Lys, Ala-Trp-D-Phe-Lys, Ala -Mrp-D-Phe-Lys,

Ala-D-Mrp-D-Phe-Lys, D-Lys-Trp-D-Phe-Lys, D-Lys-Mrp-D-Phe-Lys,

D-Lys-D-Mrp-D-Phe -Lys, o un compuesto tricíclico de la fórmula VI

9

E es Lys-NH_{2} o -NH_{2}, con tal de que E sea Lys-NH_{2}, cuando C es el compuesto tricíclico VI, previamente definido.

4. El uso de la Reivindicación 3, en el que el compuesto es:

: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: His-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},

: IMA-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH_{2},

: GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH_{2},

: D-Ala-D-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: INIP-D-Nal-D-Nal-Phe-Lys-NH_{2},

: INIP-D-Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},

: IMA-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},

: INIP-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH_{2},

: GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},

: TXM-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},

: GAB-D-Mrp-Mrp-Phe-Lys-NH_{2}

: Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Thr-NH_{2},

: His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH_{2},

: GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH_{2},

: Cys-Tyr-GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH_{2},

: Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, o

: D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}.

5. El uso de la Reivindicación 3, en el que el compuesto es:

: His-D-Trp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: His-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: His-Ala-D-Trp-Lys-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2}

: His-D-Mrp-D-Lys-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: His-Ala-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2}, y

: His-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH_{2}.

6. El uso de la Reivindicación 3, en el que el compuesto es

: [S,S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH_{2},

: [S, S-Spiro (Pro-Leu)]-D-Mrp-Mrp-Lys -NH_{2}

: [S, S-Spiro (Pro-Leu)]-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: [S,S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: Tyr-[S,S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: [S,S-Spiro(Pro-Ile)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

: [S, S-Spiro (Pro-Leu)]-D-Mrp-D-HNH-(SO_{2}CH_{3})-Phe-Lys-NH_{2},

: HAIC-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2}, y

: ATAB-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2},

7. El uso de la Reivindicación 3, en el que el tumor es un tumor de pulmón, mamas, tiroides o páncreas.

8. El uso de la Reivindicación 7, en el que el compuesto que se debe administrar al mamífero desplaza al marcador radiactivo ^{125}I-Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2} de un tumor que contiene tejido de dicho mamífero.

9. El uso de la Reivindicación 2, en el que el compuesto que se debe administrar al mamífero desplaza al marcador radiactivo ^{125}I-Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH_{2} de un tumor que contiene tejido de dicho mamífero.