TWI229608B - A method for preparing biodegradable microspheres which release an anticancer agent for the treatment of glioblastoma, pharmaceutical composition containing these microspheres and suspension containing them - Google Patents

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1229608 A7 ____B7五、發明說明（/ ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

本專利申請案係關於利用會釋出抗癌劑之生物可降解 微球體治療神經膠母細胞瘤之用法。 神經膠母細胞瘤是National Organization for Rare Disorders列出的一種罕見疾病。 · 惡性神經膠質細胞腫瘤是中樞神經系統之原始腫瘤， 根據分類，代表13至22%之顱内腫瘤，組織學上，事實上 可分類成多形性膠質母細胞瘤及神經膠母細胞瘤之兩型惡 性神經膠質細胞腫瘤，後者代表最少分化形式之這些腫 瘤。 … 目前對於惡性神經膠質細胞腫瘤無有效的治療，^有 神經膠母細胞瘤之病人存活不超過一年，即使是•手術並結 合化學治療及放射性治療。 惡性神經膠質細胞腫瘤之治療主要是受限於三種現 象。 首先是存在血腦障壁(BBB)，其將中樞神經系統與身 體其他部份隔離，此腦只容許少量的脂溶性分子通過， 其他分子必須用藥非常高的的劑量以便到達中樞神經系 統，此用藥將造成嚴重的全身性副作用。 限制神經膠質細胞腫瘤的治療功效之第二個因素是這 二腫瘤之⑻潤性本質，因為腦是高功能性的器g，無法在 癌學，義内進行廣泛的手術，可行的最完全切除將只^大 體上，全切除，在切除腔的壁上留下大量的浸潤腫瘤細 月=，卉夕作者還指出9〇%經手術及放射·練的惡性神經 膠質細胞_在原始_雜的兩公分内復發。 〜3〜 1—NIIJIIII — — — — — · I I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) * -·線·

本紙張尺度_巾@國豕標丰（CNS)A4規格⑽ X 297公釐） 1229608 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（> ) 限制神經膠質細胞腫瘤的治療功效之最後一個因素是 低治療指標，腫瘤細胞在某種方式下將其躲藏在對例如放 射性治療或某些抗癌劑引起的攻擊非常脆弱且敏感之正常 組織後，因此，很難破壞腫瘤細胞而不會破壞正常神經細 胞。 在神經膠質細胞腫瘤的治療進展不足(Komblith P.L.， Walker M., Chemotherapy for malignant gliomas. J. Neurosurg., 68: M7? 1988; Shapiro W.R., Green S.B., Burger P.C., Selker R.G., VanGilder J.C.? Robertson J.T., Mahaley S.M., A randomized comparison of intra-arterial versus intravenous BCNU with or without intravenous 5-fluorouracil? for newly diagnosed patients with malignant glioma, J. Neurosurg., 76: 772-781, 1992) 〇 目前，神經膠母細胞瘤在手術切除後的標準治療是以 外部放射性治療為基準，其無法達到存活時間超過一年， 結合放射性治療與使m_(2·氣乙基>3_環己基小亞硝基月尿 (BCNU)之化學治療只對多形性膠質母細胞瘤有效，其只 有中等的作用，因為其只增加在十八個月之存活者比例， 沒有改善存活時間。 ’ 而且，免疫治療從未在此領域建立，且基因治療需要 證明。 〃 經研究針對增加抗鋪局部濃度的數馳術，例如渗 '丨遽極破裂命腦障壁、域至腦脊液、使用皮下貯器之頸動 脈内灌輸及腫瘤内用藥(Tamargo R.J. and Brem H_，Dmg 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4現格（210 x 297公ί! )----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -,¾ •線· 1229608

五、發明說明（ 經濟部智慧產局員工消費合作社印製 delivery to the central nervous system, Neurosurgery Quarterly，2: 259-279, 1992)，這些技術都無法增加病人之 存活時間且其中部份經證明有高毒性。 在最近數年，藥學研究促使發展出可植入的聚合物系 統用於保護活性物質避免降解，及使其可在給定時間内控 制局部釋放，同時降低全身性副作用，這些可植入的聚合 物系統之優點激勵數個團隊研究其在中樞神經系統病理之 應用（Langer R” P〇lymer impiants for drug delivery in the brain，J. Controlled Release，16: 53-60, 1991)，具'體地今兒 此系統植入惡性神經膠瘤的腫瘤切除壁後，可延遲腫:瘤復 發並延長病人之存活時間，隔離的惡性細胞存留*在手術腔 附近，這些細胞與90%的復發相關，其在手術部位的兩公 分内產生，在此區域内，神經組織具有功能且血腦障壁仍 完整，其限制慣用的化學治療及放射性治療之作用。 多種釋出活性分子之可植入的聚合物系統經研發並在 動物上測試。 經發展一種含PCPP-SA (聚[1,3-雙(魏基苯氧基)丙烷-co-癸二酸])並釋出BCNU之生物可降解盤系統(Gliadd®)，… 不管臨床研究只有中等的結果(Brem H·，Polymers to treat brain tumors，Biomaterials 11: 699-701，1990; Brem Η.， Mahaley M.S·，Vick Ν·Α·，Black K丄·，Schold S.C·，Eller Ϊ-W” Cozzens J.W., Kenealy J.N. Interstitial chemotherapy with drug polymer implants for the treatment of recurrent J· Neurosurg. 74: 441-446, 1991; Brem. H.，Walter K.A·， 〜5〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -®τ· 線- 1229608 A7 B7 五、發明說明（β)

Langer R., Polymers as controlled drug delivery devices for the treatment of malidnant brain tumors, Eur. J. Pharm. Biopharm” 39 (1): 2-7, 1993, Brem H” Piantadosi S·，Burger P.C.? Walker M. et al.5 Placebo-controlled trial of safety and efficacy of intraoperative controlled delivery by biodegradable polymers of chemotherapy for recurrent glioma，Lancet，345: 1008-1012, 1995)。 經發展釋出BCNU之微球體，·但是動物研究結果沒有 特別令人鼓舞(Torres A.I·，Boisdron-Celle M·，Benoit J.P.， Formulation of BCNU-loaded microspheres: influence of drug stability and solubility on the design of the microencapsulation procedure，J· Microencapsulation，13: 41-51，1996; Painbeni T·，Venier-Julienne M.C” Benoit J.P·， Internal morphology of poly(D，L-lactide-co-glycolide) BCNU-loaded microspheres. Influence on drug stability, Eur. J· Pharm. Biopharm· 1998, 45, 31-39)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之主題是利用會釋出抗癌劑之可植入的生物降 解微球體治療神經膠母細胞瘤，使用這些微球體是結合放 射性治療及手術，切除腫瘤後，將會釋出抗癌劑之可生物 降解微球體經由組織内注射而植入手術部位，然後在介入 後不超過七天内進行放射性治療。 根據使用這些微球體，申請者成功地完全有利於加倍 患有神經膠母細胞瘤的病人之存活時間，其理由是使用根 據本發明之微球體可以達到存活時間至少是9〇週。 〜6〜

1229608 A7 A7 ------ B7 五、發明說明（r) 因此，本發明係關於利用會釋出放射敏感化的抗癌劑 之生物可降解微球體製造醫用產品，供同時或不同時間或 持縯與放射性治療使用，供治療神經膠母細胞瘤之用法， 該微球體是在切除神經膠質細胞瘤後植入手術部位，其·中 含抗癌劑之微球體被聚合物包覆，其可延遲釋出抗癌劑且 長期保持實質腔内的有效醫療濃度，以便使治療後的病人 之存活時間達到至少90週，較宜約130週，更宜是160週。 在本發明中使用的微球體含抗癌劑其較宜是親水性及 /或不會越過血腦障壁，此抗癌劑適宜沒有中樞神經毒 性1此抗癌劑較宜作用在個別的細胞。 t 此抗癌劑包括放射敏感化的抗癌化合物或含呈少一種 放射敏感化的抗癌化合物之抗癌化合物混合物，該抗癌化 合物是選自例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、鉑劑例如碳鉑及順 翻；特克素(taxanes)例如多司特克(docetaxel)及巴立特克 (paclitaxel)、吉司大賓(gemcitabine)、VP16、絲裂黴素、 蛾苷；脫普異構轉化酶1 (t〇p〇isomerase 1)抑制劑例如愛立 諾地克(irinotecan)、脫普特克(topotecan)及喜樹驗；亞硝 基脲例如BCNU、ACNU或MCNU、胺基甲基葉酸、博萊 徽素、阿黴素、赛多克(cytoxan)及長春新驗；免疫控制性 細胞活素例如IL2、IL6、IL12及IL13及干擾素。 气， 此抗癌劑較宜是5-FU。' 〜 5-FU是一種古老且熟知的抗有絲分裂劑，其係親水 v 4 、性分子其穿越血腦障壁非常微弱，且其活性因此可經由局 部用藥而增加(Bourke R.S·，West C.R·，Chheda G. et al” 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） ij — — — — — — — — — — — — 0 I I /請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂：· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229608 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（A ) Kinetics of entry and distribution of 5-fluorouracil in CSF and brain following intravenous injection in primate，Cancer Res·， 33: 1735-1746, 1973; Gerosa M.A·，Dougherty D.V·，Wison C. B., Rosenblum M.L., Improved treatment of a brain tumor model, Part 2: Sequential therpy with BCNU and 5-fluorouracil，J· Neurosurg·，58: 368, 1983; Kotsilimbas D.G·， KarpfR.，Meredith S·，Scheinberg L-C·，Evaluation of parenteral 5-FU on experimental brain tumors, Neurology, 16: 916-918, 1966; Levin V.A·，Edwards M.S·，Wara W.M·，Allen J·，Ortega J·，Vestnys P·，5-fluorouracil and l-(2-chloroethyl)- 3-cyclohexyl-1-nitrosourea (CCNU) followed by hydroxyurea, misonidazole and irradiation for brain stem gliomas: a pilot study of the brain tumor research center and the children cancer group, Neurosurgery, 14: 679-681, 1984; Oda Y.5 Tokuridi Y·，Tsuda E·，Handa H·，Kieler J·，Trial of anticancer pellet in malignant brain tumours，5-FU and urokinase embedded in silastic. Proceeding of the 6th European Congress of Neurosurgery, Acta neurochirurgica, Suppl. 28: 489-490, 1979; Penn R.D.? Kroin J.S., Harris J.E., Chiu K.M.? Braun D. P., Chronic intratumoral chemotherapy of a rat tumor with cisplatin and fluorouracil，Appl. Neurophysio·，46: 240-244， 1983; Shapiro W.R., Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: EYafeaMm of l -(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosourea, vincristine and 5-fluorouracil, J. Nat. 〜8〜 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ;% --線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229608 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（7 ) Cancer Institute，46(2)，359-368, 1971; Shapiro W.R·，Green S.B·，Burger P.C·，Selker R.G·，VanGilder J.C·，Robertson J.T” Mahaley S.M., A randomized comparison of intra-arterial versus intravenous BCNU with or without intravenous 5- ’ fluorouracil, for newly diagnosed patients with malignant glioma，J. Neurosurg·，76: 772-781，1992; Soloway A.H” Mark V.H·，Dukat E.G·，et al.，Chemotherapy of brain tumors. I-Transplanted murine ependymoblastomas, Cancer Chemother. Rep·，36: M，1964) 〇 一 - 5-FU之活性也經由持續用藥而增加，5-FU是一種經 由干擾核酸的合成而作用之藥劑，研究顯示在任》可特定時 刻只有30至50%的老鼠惡性神經膠瘤細胞(L9)及14至44%的 人類惡性神經膠瘤細胞是在分裂，而且，神經膠母細胞瘤 之細胞週期很長(L9神經膠瘤是20小時，人類神經膠母細 胞瘤是從3至7天)，但是，從血漿清除5_FU很快(半衰期是 30分鐘）（Neuwelt E.A·，Barnett P.A., Frenkel E.P.， Chemotherapeutic agent permeability to normal brain and delivery to avian sarcoma virus-induced brain tumors in the rodent, observation on problems of drug delivery, Neurosurgery，14: i54_i6〇, 1984)，5-fu因此無法經由拿身 性用藥或局部注射而破壞大量惡性細胞。 v 5-FU實質上是作用在組織上，其進行快速更新且有 異常的林經毒性，5-FU干預合成核酸，進行快速成長的 組織對其特別需要以便確保其複製及再生，不用說，此不

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂； -I線- A7 1229608 — ___B7_ 五、發明說明（# ) 適用於大腦組織之情形，其中有絲分裂在正常狀態下很稀 少且只發生在神經膠質細胞群，限制5-FU全身性用藥之 毒性效應主要是在血液及胃腸，雖然5-FU的神經副作用 很少報導，其發病機理相當不清楚，可能是多重因子(經 由5-FU分解代謝產物阻止Krebs循環或惡化預先存在的硫 胺素缺乏）（Aoki N·，Reversible leukoencephalopathy caused by 5-fluorouracil derivatives, presenting as ajinetic mutism, Surg. Neurol., 25: 279-282, 1986; Moore D,H.5 Fowler W.C.5 Crumpler L.S., 5-fluorouracil neurotoxicity, case report,

Gynecol. Oncology，36: 152-154, 1990)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 最後，5-FU是放射性敏感化(Koutcher J.A.，Alfieri Α·Α_，Thaler Η· et al.，Radiation enhancement by biochemical modulation and 5-FU, Int. J. Radit. Biol. Phys.? 39: 1145-1152, 1997)，5-FU/放射性治療組合在各這些分離治療中的優越 性自從1960年起經在動物模式及試管内的腫瘤細胞證實 (Bagshaw M.5 A possible role of potentiation in radiation therpy，Amer· J· Roentgenol，85: 822-833, 1961; Vietti T·， Eggerding F·，Valeriote F.，Combined effect of X-radiation and 5-fluorouracil on survival of transplanted leukemic cells, J. Natl· Inst·，47: 865-870, 1971)，此增效性咸信是因為腫瘤 細胞群之同步作用及減少5-FU的細胞修護機制，放射性 治療與抗嘧啶(5-FU或BrudR)之組合已經在人類中嘗試 (Goffman T.E., Dachowski L.J., Boho H, et al.? Long term follow-up on national cancer institute phase I/II study of 〜10〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229608 A7 B7 五、發明說明（f) glioblastoma multiforme treated with iododeoxyuridine and hyperfractionated irradiation, J. Clinical Oncology, 10: 264- 268, 1992)，缺乏清楚的功效在此也可經由全身途徑用藥 解釋。 當抗癌劑是5_FU時，反應實質腔濃度之腦脊液内抗 癌劑的濃度是介於3及20毫微克/毫升之間。 為了限制在本發明中使用的微球體所含的抗癌劑之神 經毒性，可以在該抗癌劑内加入神經保護性化合物，此神 經保護性化合物是選自例如從肽生長因子例如NGF或 BDNF 〇 在本發明中使用的生物可降解微球體係被聚合物包 覆，其可延遲釋出抗癌劑及保持實質腔内的有效醫療濃度 至少三週，較宜至少四週。 此聚合物是選自乙基纖維素、聚苯乙烯、聚（ε_己内 酉曰)、Kd，l-乳酸)及聚(d，l-乳酸-co-乙醇酸）。' 此聚合物較宜是聚(d，l-乳酸-C0-乙醇酸)或PLAGA，其 係一種認可的調製持續釋出鲁藥製劑之生物可降解聚合物 (不同於PCPP-SA其係只認可供大規模臨床使用）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 聚(d，l-乳酸-co-乙醇酸)較宜是5〇:5〇 pLAGA (也就是說 含等量的乳酸及乙醇酸)，例如BI Chimie，France販賣之 Resomer^RGSOG，分子量等於72，_，聚分散性指數等 於1_8且固有黏性等於〇·8分升/克(在机在氣仿中的〇1% 聚合物溶液）。 , ”；_ 〜11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱_了 1229608 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（/c) PLAGA是一種疏水性共聚物，其經由水解反應產生 的降解得到兩個正常生物受質乳酸及乙醇酸，其在需氧糖 原酵解結束後代謝成C〇AH2〇，長久已經建立的研究顯 示呼吸途徑是去除這兩種受質的主要途徑，PLAGA之圣 物降解速率決定於乳酸及乙醇酸之各比例，PLAGA是完 全生物相容且產生中等反應至外體(VisscherG.E.，

Robinson R.L·，Mauding H.V” Fong J.W·，Pearson J.E·， >' Argentieri G.J., Biodegradation of and tissue reaction to 50:50 p〇ly(D,L-lactide-co-glycolide) microcapsules, J. Biomed. Mat. Res· 19: 349-365, 1985)，PLAGA形成手術縫合線組成物之 φ 一部份(Frazza E.J·，Schmidt E.E·，A new absorbable suture，J. Biomed· Mater· Res·，5: 43-58, 1971)及皮下可植冬的醫藥形 式之一部份(Jalil R·，Nixon J.R·，Biodegradable poly(lactic acid) and poly(lactide-co-glycolide) microcapsules: problems associated with preparative techniques and release properties (Review)，J· Microencapsulation，7: 297-325, 1990)，經證明 50:50 PLAGA微球體可經由射線破壞，且當經由立體 定位植入老鼠的腦内，其在兩個月内完全生物降解，只產 生非專一性星形細胞及組織細胞型之中度反應(MeneiP·， Daniel V.? Montero-Menei C.5 Brouillard M., Pouplard-Barthelaix A.? Benoit J.P.: Biodegradation and brain tissue reaction to poly(D?L-lactide-co-glycolide microcapsules, Biomaterials 14: 470-478^ 1993; Menei P.? Croue A.? Daniel V.? Pouplard-Barthelaix A., Benoit J.P.: Fate and 〜12〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） . %------- 丨訂---：-------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1229608 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i、發明說明（，/ ) biocompatibility of three types of microspheres implanted into the brain，J· Biomed· Mat· Res·，28, 1079-1085, 1994)，此最 後結果經證實在Kou J.H.，Emmett C.，Shen P et aL， Bioerosion and biocompatibility of poly(d,l-lactide-co-glycolide) implants in brain，J. Control Release，43, 123-130， 1997。 本發明之生物可降解微球體之平均直徑較宜是48土20 微米，更宜是46土7微米，其含15至35重量％的抗癌劑、， 較宜從19至27%之5-FU，更宜是20%之5-FU，及65至85 重量％之聚合物。. 在本發明中，特別較宜是傳遞5-FU之50:50 PLAGA微 球體。 在試管内，傳遞5_FU之50:50PLAGA微球體可釋出5-FU歷時21天，在活體内，當皮下植入兔子後，這些微球 體在血漿中產生5-FU之高原濃度歷時23天，同樣在活體 内及老鼠腦内，至少在第19天可在微球體内看到5-FU晶 體，在兔子内，腦内植入PLAGA-5-FU微球體(7毫克/公斤 的5-FU)後，在血清中沒有偵測到5-FU，此建議實質上無 藥劑通過進入全身循環。 腦内植入PLAGA-5-FU微球體至老鼠後，在5-FU之總 劑量微17毫克/公斤下，沒有觀察到全身性毒性徵候或任 何林純或組織神經毒性徵候，在24 Gy之分次劑量下，5-FU微球體/腦放射性治療之組合可完全忍受(Menei P.，丨 Vectorisation dans le SNC par implantation stereotaxique de 〜13〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 言. r 良 1229608 A7 B7 五、發明說明（/> 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 microspheres, These d5Universite en Sciences Pharmaceutiques, Universite d5Angers? 1995 [Vectorization in the CNS by stereotaxic implantation of microsoheres，thesis， University of Pharmaceutical Sciences，University of Angers， 1995])，最後，這些微球體經由立體定位植入在大田鼠發 展的惡性神經膠瘤(C6神經膠瘤)後，明顯地降低致死率 (Menei P.? Boisdron-Celle M., Groue A., Guy G.5 Benoit J.P.5 Effect Of stereotactic implantation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres in normal and C6-gl!〇ma bearing rats，Neurosurgery，39: 117-124, 1996)。 此微球體適宜懸浮在無菌溶液中，在切除腫瘤後將懸 浮液注射至手術部位之壁内。 此無菌溶液較宜含： -介於1及1·5%，較宜是1.25%重量/體積之黏度改良 劑，例如羧基甲基纖維素鈉， -介於0.5及1.5%，較宜是1%之表面活性劑，例如聚山 梨醇酯80®，及 -介於3.5及4.5%，較宜是4%之等滲性劑，例如甘露 醇。 此微球體較宜在使用時在注射前立即懸浮，懸浮濟較 且δ 3¾升上述無菌溶液及7〇〇至8〇〇毫克生物可降解 體。 私紙張尺度^巾⑽規格mo X 297公釐） -ϋ I Ti n n an *ϋ n ϋ n 0 n ϋ (請先閱讀背面之注音3事項再填寫本頁) I · -1線· 1229608 A7 B7 五、發明說明（〇) 經診斷證實是神經膠母細胞瘤且顯微切除神經膠質母 細胞瘤後，將微球體之懸浮液植入手術部位之壁内，深度 至少是2公分，較宜介於2及3公分，至少是每平方公分。 當抗癌劑是5-FU時，注射的懸浮液之總劑量相當於5_ FU之量介於50及200毫克。 放射性/α療疋集中在腫瘤部位，照射的部位包括手術^ 前的腫瘤及各方向至少兩公分之界限，且施加的總劑量是 介於50 Gy及60 Gy。 … 放射性治療較宜在手術後第二天及第七天之間開始， 介於50 Gy及60 Gy之總劑量是持續4及8週的期間，例如在 每週5部份之速率。 切除腫瘤並立即注射微球體後，在腫瘤復發之情形下 可一或多次重複注射微球體。 在本發明中使用的微球體可經由乳化_萃取技術製 備，根據Boisdron-Celle M” Menei P·，Benoit J.P.: Preparation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded • microspheres，J· Pharm· Pharmacol” 47, 108-114, 1995揭示 之方法變化。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明也關於製備用聚合物包覆且在本發明使用的含 抗癌劑之微球體之方法，此方法之主要步驟包括製備一種 有機相其中抗癌劑及聚合物分散在有機溶劑中，將有機相 及水相乳化然後經由加入水將有機溶劑萃取，最後，將含 :微球體之懸浮液過濾。 〜15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1229608 A7

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使用兩個套層反應器且冷卻液依序在兩個反應器令循 裱，有機及水相混合時，兩相之溫度適宜相同，較宜等於 '、々2C，良好控制溫度有利於粒子大小、活性成份溶解速 率及溶劑之萃取速度。 將有機相從第一個反應器轉移至第二個，水相/有機 相之體積比例是介於80/3及120/3，較宜等於100/3。 θ將所得的乳液攪拌至少3分鐘，較宜3至6分鐘，更宜 ^5分鐘，此時間的選擇是直接與釋出動力學相關且尤其 疋24-48小時之”爆發(burst)’’效應。 沒有辅助溶劑並配合足夠的乳化時間使得在表面或包 覆不良之活性成份溶解，所以在最初相之釋出動力學有較 佳的控制。 將水添加至乳化液，乳化液/水之體積比例是介於1/4 及1/2，較宜4於1/3，以便萃取有機溶劑，萃取水之溫度 是介於1及5°C，較宜等於4°C。 乳化及萃取步驟是在相同的反應器内進行以限制批次 之間之變異性，並節省時間，萃取水之溫度很低，以便限 制過度溶解活性成份。 得到的微球體懸浮液混合數分鐘後在惰性氣壓下過 濾，在惰性氣壓下處理使得可限制產品受到污染之風險。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 可經由上述方法得到之微球體適宜冷凍乾燥。 將10,寸無菌水添加至2至5克微球體粉末濾餅，將此 混合物在下冷凍，然後放入冷凍乾燥器内，冷凍乾 〜17〜 本紙張尺度適用中θΐ家標準（CNS>A4規格（2ι。X 297公楚） 1229608

五、發明說明（/〇 經濟部智逄財產局員工消費合作社印製 树，操條錢，第；絲溫度必須維持低 此微球體必賴存在+4t，即使是當乾燥時。 本發明也關於-種懸浮液，其係由含m5%質量衊 =之黏^良劑、0.5至1.5%表面活性劑及35至45%等渗性 w之無囷溶液、及釋出抗㈣且包覆聚合物並視需要得自 根據上述方权上述生物可_财馳成，微球體 例代表200至300毫克/毫升之無菌溶液較宜是23〇至27〇 宅克/毫升。 -- ‘這些微球體較宜由15至35重量％之抗癌劑及65至85重 量％之聚合物組成。 .· 此I合物較宜是聚(d，l-乳酸〇乙醇酸)，較宜含等量 的乳酸及乙醇酸。 此無菌溶液較宜含1.25%重量/體積之羧基曱基纖維素 鈉、1%聚山梨醇酯80及4%甘露醇。 本發明在非限制性的方式下經由下列實例說明。 實例1 根據Boisdron-Celle M·，Menei P·及 Benoit J.P.揭示之 方法變化(Preparation of biodegradable 5-fluorouracil-l〇aded microspheres，J. Pharm. Pharmacol·，47, 108-114, 1995)，y 經 由乳化-萃取技術製備微球體。 ^ 粉碎5-FU 在平盤球磨機例如Pulv6risette 7 (Fritsch)中粉碎5，·:.二: FU，將8.5克5-FU加入各含7個球之燒杯内，在速度7下持 ---------------— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · -線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229608

，粉碎1G分鐘，在層流煙櫃内回收粉末，所的的晶體大小 疋介於15及5G微紅分成兩部份：細部份(粒子大小低於i 微米)及粗部份(大於3〇微米）。 乏二FU分散在有機溶齋丨 、發明說明（ 使用均勻機例如Ultm-Tmrax機在13,500 φΐη下歷時3 分鐘將粉碎的5_FU分散在圓底試管内的#毫升二氯甲烷 中。 製備有機相 — ^將5-FU分散液轉移至150毫升套層冷卻反應器内，在 器中加入PLAGA使得PLAGA/二氣甲烷比例是等於11 %， 用攪拌器在20°C及450 rpm下將有機相攪拌4小時，然後在 2 C15分鐘，藉助低溫控制器將反應器内的溫度保持固定 在〇.l°C内。 備乳化洛 製備1500毫升壓熱器1 〇% PVA水溶液並在套層冷卻的 6升反應器内保持在2°c，然後經由打開第一個反應器之底 閥將有機相轉移至此反應器内，將有機相倒入用在375 rpm旋轉的攪拌器攪拌之水相歷時5至丨〇秒，水相/有機相 之體積比例是等於100/3。 將乳化液攪拌4分鐘45秒。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 當乳化液準備就緒後，將4.5升在4°C之萃取水倒入乳 化液，乳化液/水之體積比例等於1/3，萃取持續2分鐘。 過濾 19' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） 1229608 A7 B7 五、發明說明（ 、經由f部將第二做應器之全勒含娜移至不鏽鋼 才曰並放在氮軋壓下，將懸浮液經由孔洞大小等於3微米之 濾紙過濾。 全部的懸浮液通過濾紙後，將濾_3升無菌水清或 兩次。 一二斤仔微球體内抗癌劑之包圍程度是，檢視後，脫 附-氯甲燒疋在烤爐内進行48小時，然後將微球體包裝並 經由T-射線在19kGy殺菌，進一步監視包圍程度是在殺 菌，進，，然後進行測定殘留的微量溶劑，適查損測到 〇·5%二氣甲燒之殘留量，監視所得微球體之滅菌性及試管 内釋出動力學。 ，· .訂 所得的微球體含23±3·5%之活性成份，根據上述方法 製備數個批次，粒子之平均大小是48±2〇微米(全部批次群） 相§於46+7微米(全部批次平均之平均）。 實例2 經由貫例1揭示之乳化_萃取技術製備微球體。

_碾磨5-FU 根據實例1之敘述碾磨4克之5_FU，所得晶體之大小 包^介於15及50微米，且分成n大小紐丨微米及大 小局於30微米。 二在有機溶劑中的5-FU分带浚 “ 在平底試管内，用Ultra_turrax型均勻機在135〇〇 _攪 拌卞將翁磨後的5-FU分散在4〇毫升之二氯甲烧歷時35/分 鐘0 - 20- $紙張尺度適財國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 1229608 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（β) -根據實例1之敘述製備有機相及乳化液。 -根據實例1進行萃取及過濾。 鑑定所得的微球體 5-FU含量：22% 大小：46士7微米 經24小時後之爆發效應(在19 kGy之放射性滅菌）： 40±4°/〇 〇 實例3 — 使用實例1之50··50 PLAGA/5-FU微球體進行相Ι/Π開放 試驗性臨床研究。 使用時將所得的微球體懸浮在下下列物質之溶液中 -1.25%重量/體積之羧基曱基纖維素納(Cooper)， -1%之聚山梨醇酯80， -4%之甘露醇，及 -用於注射製劑之足量的水，得到總體積為3毫升。 經由壓熱器在121°C將溶液預先滅菌20分鐘，然後在5 kGy及25 kGy之間的劑量下經由r -射線放射性滅菌鲂 在19 kGy進行。 慎重地製備此懸浮液，因為必須避免形成氣泡，製備 後立即注射懸浮液，因為微球體容易沈澱在注射針内並將 其堵塞。 ' 顯微切除神經膠質細胞瘤後，將微球體懸浮液植入手 術部位壁内至深度介於2至3公分每平方:公，分，> 每次注射 100微升。 〜21〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} _ ;線· 1229608 A7

五、發明說明（》) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用1¾升注射針及18 ga(Ux45毫米)之導管(Ins〆 ⑽™)進他射，將金屬心軸取出只保留無斜角的泡沫 ^膠導官將懸浮液注射至腦組織内，使用所需數量的i 笔升庄射針:用斜角針注射懸浮液有引發血腫及微球體，逆 抓之風險，‘官必财足鮮的餘⑽免傷害腦組織且 必須足夠大以防止被微球體懸浮液堵塞。 …注射必須非常溫和地進行且導管必須留在原處數分鐘 後拔除，以除止微球體逆流，在注射部位施以丨平方公分 片段之可再吸收的止血壓片（如咏…或邱⑽㈣)： 研究中包括的病人是介於丨8及68歲，沒有長瘤的記 錄，Kamofsky指數大於6〇，臨床記錄及表現引起•支持神 經膠母細胞瘤，曾經進行顯微完全切除，且其手術其内的 組織檢驗(根據WHO的標準進行··壞死、血管複製、核多 型性及有絲分裂活性)證實神經膠母細胞瘤之診斷。 排除病人的標準如下··代謝缺陷、懷孕、其他先前的 癌症病理。 敢初分成二組以研究增加5-氟尿喷ϋ定劑量之效應··依 順序疋70、132及264毫克，下列組之治療是在觀察進行測 試的組之治療耐受度後開始。 基於病人接受132毫克5_FU後發生II級神經毒性，，且 根據停止測試之規定，停止醫療的逐步修正且後續的；人 接受132毫克之相同劑量。 傳蘇的外部放射性治療(集中在手術前在1〇 MV的能 量下用MRI評估之腫瘤區)在手術後的第二及第七天内開 〜22〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _冁 - -•線· 1229608

五、發明說明（v) 始，在5個部份歷時6.5週之速率下，在Gy之33個部份 施加60 Gy之總劑量，照射的部位包括手術前的腫瘤及各 方向至少兩公分之界限。 臨床及放射性監測病人：在72小時之掃描證實顯微完 全切除並在DIO、D20及D30進行臨床評定，在D10及D30 進行MRI，最後，在72小時、D1〇' D2〇及D3〇進行血液及 CSF中的5-FU測試，根據衍生自而〇之標準等級評定毒 性(神經、血液、黏液及心臟毒性)，經一個丹後^每兩個 月^床監視病人且每三個月進行MRI。 在全部的病人中觀察到溫和的手術後貧血、白血球過 多症及溫和的淋巴球減少。 藥理研究證實在腦脊液(CSF)中持續釋出5-FU歷時超 過30天，且較低量的分子短暫性通過進入全身循環，植入 後一個月在CSF中仍有明顯的5-FU濃度。 對於70及132毫克之劑量，在CSF中釋出5-FU之情形 分別在第十及第十二天顯現高峰，一半的病人從第十天無 法偵測到血漿中的5-FU。 全部受治療的病人之全身财受性極佳，沒有觀察到 CSF之化學或細胞結構變化，一個用132毫克治療的病人 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在放射性治療期間的腦水腫現象，無法容許繼續劑量之逐 步修正。 此研究中包括四個男性及四個女性之八個病人，平均 年齡是48.5且Kamofsky指數大於90，三人的第一組接受7〇 毫克之劑量，且五人的第二組接受132毫克。 〜23‘ 1229608 A7 B7 五、發明說明（>>) 由於病人數量很少，存活之初期結果無法在統計上說 明，但疋其非常令人激勵，在最後的評定中，第一個治療 組(7〇毫克)的三個病人在61、114及125週死亡，必須指出 在114週死亡的病人是死於神經膠母細胞瘤之肺轉移，索 二個治療組(132毫克)的三個病人在31、59及82週死亡， «Μ—個病人在起草這些初期結果時，在159及172週仍然在 緩解期。 病人的存活平均是98週(文獻中滿足相同標準的病人 是50.6週(Devaux B.C·，0，Fallon J.R·，Kelly P.J·，kes^tion， biopsy, and survival in malignant glial neoplasms, J: Neurosurg·，78: 767-775, 1993))，八個病人中的五i也就是 62%在18個月後仍然活著，但是文獻中滿足此研究標準的 病人，在18個月的存活是20°/〇(DevauxB.C.，0，FallonJ.R.， Kelly P.J., Resection, biopsy, and survival in malignant glial neoplasms，J· Neurosurg·，78: 767-775, 1993)) o (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 言· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 '24〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229608 六、申請專利範圍 f-------------------------------- 專利申請案第89111355號 i ROC Patent Appln. No. 89111355 —.............................................. 修正後無劃線之申請專利範圍中文本替換頁-附件(一） Amended Claims in Chinese - Encl.d) 5 (民國93年10月日送呈） (Submitted on October <，2004) 1. 一種經由乳化-萃取製備含抗癌劑並被聚合物包覆之生 物可降解微球體之方法，其係包括將聚合物及抗癌劑 10 分散在有機溶劑中，以得到質量比例介於8及13%之 聚合物，將所得的有機相與水相混合，水相/有機相之 體積比例介於80/3至120/3，以得到乳化液，經由添 加水而萃取有機溶劑，以一比例使得乳化液/水之體積 比例介於1/4及1/2，且隨後過濾所得的微球體懸浮 15 液，其特徵在於該抗癌劑是在添加聚合物前在激烈攪 拌下分散在有機溶劑中。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該有機溶劑是 二氣甲烷。 3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該水相及有機 20 相當混合在一起時有相同的溫度，較宜等於約2°C。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該有機溶劑含 11%聚合物。 5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該聚合物是選 自乙基纖維素、聚苯乙烯、聚(e-己内酯）、聚(d，l-乳酸） 25 及聚(d，l-乳酸-co-乙醇酸）。 6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其合該包覆微球體 之聚合物是聚（d，l-乳酸-co-乙醇酸）。 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該包覆微球體 -25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐）

   89275B-接 1 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229608 六、申請專利範圍 之聚合物是含等量的乳酸及乙醇酸之聚（d，l-乳酸-co-乙 醇酸）。 8.根據申請專利範圍第1項之方法，其中該水相/有機相 比例是等於100/3。 5 9.根據申請專利範圍第1項之方法，其中含水相及有機 相之乳化液是混合至少3分鐘。 10. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中萃取有機溶劑 所需的水是在乳化液/水之體積比例等於1/3加入。 11. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中萃取有機溶劑 10 所需的水之溫度是4°c。 12. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中抗癌劑分散至 有機溶劑前先粉碎，使得抗癌劑晶體大小是介於15及 50微米。 13. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該抗癌劑是5- 15 氟尿嘴。定。 14. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中在抗癌劑中加 入選自肽生長因子包括NGF或BDNF之神經保護性化 合物。 15. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中添加萃取水 20 後，在惰性氣壓下過濾所得的懸浮液。 16. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該微球體是經 冷凍乾燥。 17. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該微球體係用 於治療神經膠母細胞瘤之醫藥組成物，其供同時或不 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

   1229608 3 C8 __D8 六、申請專利範圍 同時間或持續與放射性治療使用，該組成物包含含抗 癌劑並被聚合物包覆之微球體，該聚合物係延遲釋出 抗癌劑且長期在實質腔内保持有效的治療濃度，以便 使經如此治療的病人之存活時間達到至少約90週。 5 18. —種由無菌溶液組成之懸浮液，其中含1至1.5%重量/ 體積之羧基甲基纖維素鈉、0.5至1.5%重量/體積之聚 山梨醇酯80及3.5至4.5%重量/體積之甘露醇，及可 使用根據前述申請專利範圍項中任一項之方法得到之 生物可降解微球體，該微球體係釋出抗癌劑且被聚合 10 物包覆，微球體之比例代表200至300毫克/毫升之無 菌溶液，較佳為230至270毫克/毫升。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）