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TW202229538A - 絲狀真菌生物墊，其製造方法及其使用方法 - Google Patents

絲狀真菌生物墊，其製造方法及其使用方法 Download PDF

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TW202229538A
TW202229538A TW111109755A TW111109755A TW202229538A TW 202229538 A TW202229538 A TW 202229538A TW 111109755 A TW111109755 A TW 111109755A TW 111109755 A TW111109755 A TW 111109755A TW 202229538 A TW202229538 A TW 202229538A
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fungal
biomass
medium
filamentous
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TW111109755A
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馬克 科左貝爾
理查德 馬可爾
雨維爾 艾維尼爾
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美商芬德集團公司
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Abstract

揭示一種生長真菌之新穎方法，其使用經工程設計之人工培養基且製造高密度絲狀真菌生物墊，該生物墊可以最少處理收穫且諸如抗生素、蛋白質、與脂質的真菌產物可自其分離，該方法於能源使用、加氧、水使用與廢料流出產造成較低的真菌培養花費。

Description

絲狀真菌生物墊，其製造方法及其使用方法
本申請案係關於經分離之子囊菌門（ Ascomycota）、接合菌門（ Zygomycota）、擔子菌門（ Basidiomycota）、球囊菌門（ Glomermycota）、與壺菌門（ Chytridiomycota）內之絲狀真菌品系，諸如鐮孢菌屬（ Fusarium）物種、麴菌屬（ Aspergillus）物種、木黴菌屬（ Tricoderma）物種、青黴菌屬（ Penicillium）物種、毛黴目（ Mucorales）內之物種，包括根黴菌屬（ Rhizopus）物種、被命名為MK7的嗜酸性絲狀真菌品系與其等之子代，以及實施表面發酵以自如此真菌品系製造絲狀真菌生物墊之方法，其製造各種各樣的有用產物。
大多數真菌之細胞生長成稱為菌絲之管狀、細長與線狀的結構，其可含有多個細胞核且其藉由於其等之尖端生長來延伸。此與諸如絲狀綠藻之外觀類似的生物體（其等藉由重複細胞分裂而有一連串之細胞來生長）成對比。
構成真菌之營養期的菌絲之集合體被稱為菌絲體（mycelium，複數為mycelia）。菌絲體可被視為真菌之主體或主要形式且往往被描述成呈絲狀。生長藉由菌絲之無性生殖發生，其生長成分支鏈。菌絲體對真菌而言係重要的，因為其可導引通過土壤或木頭並使用該基質作為食物，而若真菌要製造子實體（例如擔子果）（諸如洋菇、簷狀菌、塊菌、杯狀菌、或羊肚菌）會需要其。
菌絲體分泌細胞外酵素，其可殺死活組織（腐植營養性）並接著吸收該死亡物質（腐生性）、簡單地吸收已死亡之物質（再次，腐生性）或藉由取食活組織為生（活體營養性）。
雖然咸相信真菌界之諸門之每一者皆含有絲狀物種，子囊菌門與接合菌門尤其有大量的絲狀物種。此等門之成員製造各種各樣的產物，諸如蛋白質、胺基酸、油、醫藥（例如青黴素）、食物（例如丹貝（tempeh））、食物添加物、食物防腐劑（例如檸檬酸）、與工業酵素以及被用於烘焙、與乳酪、啤酒、與葡萄酒之製造。
目前最佳技術之固態基質發酵（SSF）為一些不同的缺點所苦。例如，終產物（即所製造的生質）與固態基質充分地混合，而於根本上難以將其等彼此分開。典型地，SSF以低濃度製造真菌生質，具有極低的轉換速率且最終造成低的產率。SSF需要特殊的水活性以有效發酵。遞送與維持正確量的水活性實施起來係困難且昂貴的。通氣SSF系統亦難以實現，進一步惡化轉換效率並限制系統產率。不適當的水活性以及差的通風引起對質量傳遞與熱傳導之限制，其造成過熱與於氧供給之缺乏。所得之生質特徵在於具有方向隨機的絲狀構造，其大大地限制於某些應用（即食物及/或動物飼料）中之實用性。
Quorn TM（一種主要包含毒鐮孢菌（Fusarium venenatum）絲狀真菌之生質之產品）提供相對營養的黴菌蛋白質。Quorn TM係藉由目前最佳技術之浸沉發酵系統製造，該系統能夠以基於批次之連續程序製造大體積。雖然商業上可行，該製造方法學為一些不同的缺點所苦。為了符合商業需求，Quorn TM使用每個花費$3.5-4千萬間的生物反應器。Quorn TM系統係於單一反應器中連續運行，直到真菌系統成熟超過關鍵衡量指標或被另一個物種污染。於此點，製造停頓，反應器及所有相連配管被清空並滅菌，而該程序可能需花費數週來完成且對商業產品之供應商而言可能引進一些嚴重問題。如此問題係（例如）(1)難以預期製造循環、(2)清理與停止製造所招致之花費、(3)於控制存貨之困難、等等。進一步，於大型生物反應器中浸沉發酵需要極大量之能源以通氣與混合。生質自其於其中發酵之液體之分離需要離心，其亦已知係資本密集性且能源需求性程序。該程序進一步係水密集性的，使大量廢水之處理成為必須。所製造之生質之特徵為具有短的絲狀構造長度，而此限制其直接轉換成食物/飼料產物而無須導入結合劑與隨後的處理步驟之能力，其招致於有效管理之進一步的花費、困難及勞力。
目前的絲狀菌絲體生長方法學為一些缺點所苦。例如，具有適當通氣之設施與生長真菌及隨後自生長培養基分離真菌菌絲體所需之設備（例如離心機）需要顯著的資本花費（特別是對於實施工業規模之真菌生長）。目前的程序不僅需要投入大量的能源與水，且亦造成大量廢料流之產生。
因此，於產業中對於絲狀菌絲體絲狀真菌生物墊形成之流線方法有需求。
本文之揭示內容克服目前使用之程序之限制。此處，絲狀真菌生物墊係於將所欲的真菌品系接種至新穎的生長培養基中後透過表面發酵產生，而不需通氣。此表面發酵之方法可在一系列不同工業中應用於能夠製造各種各樣之產物之各種各樣的真菌物種。所開發之培養基產生快速的細胞生長、創造具有長絲狀構造的高密度絲狀真菌生物墊、產生小的廢料流、與允許將所製造之絲狀真菌生物墊工程設計成隨著碳源、碳對氮比率（C:N）、與處理參數變化。總體功效係伴隨以及最小的如水使用、能源使用、設備需要、與碳足跡測量之環境衝擊發生之高製造速率。
因此，本文之揭示內容提供一種適合用於培養絲狀真菌並使其等製造絲狀真菌生物墊之人工培養基。該人工培養基包含至少以下主要營養物質：氮（N）、磷（P）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、碳（C）、鉀（K）、硫（S）、氧（O）、氫（H）與以下微量營養物質：鐵（Fe）、硼（B）、銅（Cu）、錳（Mn）、鉬（Mo）、與鋅（Zn）。於一些實例中，該微量營養物質係以以下另外的微量營養物質加強：鉻（Cr）、硒（Se）、與釩（V）。該人工培養基具有多變的C:N比率，其有利於具有高蛋白質:脂質比率或高脂質:蛋白質比率之絲狀真菌生物墊之製造。
亦提供者係培養種種絲狀真菌以用於絲狀真菌生物墊製造之條件，該等真菌中一些係嗜酸性的，諸如以下物種及/或品系：鐮孢菌屬、 Fusisporium、假鐮孢菌屬（ Pseudofusarium）、赤黴菌屬（ Gibberella）、 Sporotrichella、麴菌屬.青黴菌屬、木黴菌屬、毛黴目物種內之物種（例如根黴菌屬物種）與被命名為MK7之絲狀真菌品系。取決於物種及/或品系，培養基之pH範圍在約0.68至約8.5且於一些例子中至高達10.5。該方法之一個實施方式包括將該等真菌物種及/或品系之一或多者接種至人工培養基中並使該真菌物種及/或品系生長以製造含有一或多種有用的產物之絲狀生質。
所製造之絲狀真菌生物墊通過表面發酵自其等之組合之無氧性、微需氧性、需氧性條件產生。該等絲狀真菌生物墊包含該真菌物種及/或品系及/或其呈分生胞子、小分生胞子、大分生胞子、分生孢子器、厚壁孢子、菌絲、菌絲之片段或其等之任何與所有組合之形式之子代。
亦提供者係用於收穫該等絲狀真菌生物墊、分離及/或純化由該絲狀真菌製造之有用蛋白質、胺基酸、及/或脂質之方法。此等蛋白質、胺基酸、及/或脂質可被用於食物、魚飼料、動物飼料、油、脂肪酸、醫藥、類藥劑營養品、殺真菌劑、殺草劑、殺酵母菌劑、殺昆蟲劑、生物潤滑劑、與作為用於轉換成其他加值產品之原料。
定義
用於本文中，動詞「包含」及其之詞性變化係於本描述與申請專利範圍中以其之非限制性意義使用以意謂於該語詞後之項目被包括，但未具體提及之項目不被排除。此外，以不定慣詞「一（a）」或「一（an）」提及一個元件並不排除存在多於一個該元件之可能性，除非前後文清楚地要求有一個且僅僅一個該元件。不定慣詞「一（a）」或「一（an）」因此通常意謂「至少一個」。
用於本文中，術語「衍生自」係論及來源之起源，且可包括天然存在的、重組的、未經純化的、或經純化的分子。衍生自特定經分離的真菌品系及/或其之子代之真菌可包含某些突變但仍保留其所衍生自之經分離的真菌或其子代之一個、二個或更多個、或所有的區分性形態與生理特徵。
用於本文中，術語「嗜酸性」係論及其最理想的生長條件係於酸性條件下之生物體。
用於本文中，術語「原料」係論及任何可被直接用作為燃料或被轉換成另一個形式之燃料或能源產物之可再生的生物材料。生質原料係用於衍生例如乙醇、丁醇、生物柴油、與其他碳氫化合物燃料之燃料之植物與藻類材料。
用於本文中，語詞「木質纖維素原料」係論及含有木質織維素之原料。木質纖維素原料之非限制性實例包括農作物殘渣（例如小麥桿、大麥桿、稻桿、細粒禾榖桿、玉米桿、玉米纖維（例如玉米纖維膠（CFG）、乾酒粕（DDG）、玉米蛋白粗粉（CGM））、有目的的生長之禾草作物、能源作物、柳枝稷、苜蓿草乾草、甘蔗渣）、玉米浸液、甜菜渣非農業生質（例如藻墊、城市樹木殘渣）、玉米浸液、甜菜渣、林產品與工業渣（例如軟木初級/次級製材廠廢料、硬軟木初級/次級製材廠廢料、回收紙漿污泥）、含有木質纖維素之廢棄物（例如新聞紙、廢紙、釀造穀粒、都市有機廢棄物、庭園廢棄物、臨床有機廢棄物、於生質燃料之製造期間產生之廢棄物（例如經處理藻類生質、甘油、來自纖維素乙醇之製造之殘渣、來自生物柴油製造之固體殘渣）、與其等之組合。
用於本文中，除非另外具體指明，術語「碳水化合物」係論及含有與至少二個羥基基團組合之醛或酮基團之碳、氫、與氧之化合物。本發明之碳水化合物亦可視需要地於一或多個位置經取代或脫氧。碳水化合物因此包括經取代的與未經取代的單醣、二醣、寡醣、與多醣。該醣可係醛醣或酮醣，且可包含3、4、5、6、或7個碳。於一個實施方式中，其等係單醣。於另一個實施方式中，其等可係哌喃醣與呋喃醣糖。其等可視需要地於任何相對應C位置經脫氧、及/或以一或多個諸如以下者之部分取代：氫、鹵基、鹵烷基、羧基、醯基、醯氧基、胺基、醯胺基、羧基衍生物、烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亞胺、磺醯基、氫硫基、亞磺醯基、胺磺醯基、酯、羧酸、醯胺、膦醯基、膦基、磷氧基、硫酯、硫醚、肟、肼、胺甲酸酯。此等醣單元可以任何順序排列且二個醣單元間之鍵聯可以大約十種不同方式之任一者發生。因此，不同的可能立體異構性寡醣鏈之數目係巨大的。於一個實施方式中，該碳水化合物係選自由單醣、二醣、寡醣、多醣、與其等之組合所組成之群組。
用於本文中，術語「單醣」係論及選自由以下者所組成之群組之糖單體：三個碳的糖（三碳醣）、四個碳的糖（四碳醣）、五個碳的糖（五碳醣）、六個碳的糖（六碳醣）、等等、與其等之組合。於一個實施方式中，該五個碳的糖係選自由以下者所組成之群組：酮五碳醣（例如核酮糖、木酮糖）、醛五碳醣（核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖）、去氧糖（去氧核糖）、與其等之組合。於一個實施方式中，該六個碳的糖係選自由以下者所組成之群組：醛六碳醣（例如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、艾杜糖、半乳糖、太洛糖）、環狀半縮醛、酮六碳醣（例如假果糖、果糖、山梨糖、塔格糖）。於一個實施方式中，該單醣係選自由三碳醣、四碳醣、五碳醣、六碳醣、七碳醣、等等、與其等之組合所組成之群組。
於一個實施方式中，該單醣係呈線性形式；於另一個實施方式中，該單醣係呈環狀形式。
用於本文中，語詞「可發酵的糖」係論及可被轉換成非限制性實例包括以下者之有用的加值發酵產物之糖化合物：胺基酸、蛋白質、糖、碳水化合物、脂質、核酸、聚乙醯類、維生素、藥品、動物飼料補充物、特用化學品、化學原料、塑膠、溶劑、燃料、或其他有機聚合物、乳酸、與乙醇。可由所揭示之方法製造的特殊加值產物（但不限於）β葡聚醣、乳酸；特用化學品；有機酸，包括檸檬酸、琥珀酸與順丁烯二酸；溶劑；魚飼料與動物飼料補充物；藥品；維生素；胺基酸，諸如離胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、蘇胺酸、類胡蘿蔔素、人類食物、類藥劑營養品、與天門冬胺酸；工業酵素，諸如蛋白酶、纖維素酶、澱粉酶、葡聚醣酶、乳醣酶、脂酶、解離酶、氧化還原酶、轉移酶與木糖聚糖酶；與化學原料。
用於本文中，術語「真菌（fungus）」或「真菌（fungi）」係論及具有吸收性營養且缺乏葉綠素之不同群組之真核生物體。
用於本文中，術語「酸化材料」係論及任何在加至溶劑（例如水）中時給出具有大於在純溶劑（例如水）中者之氫離子活性之溶液的材料、化學化合物、劑、及/或組成物。該材料可呈氣體、液體、或固體形式。該材料可係有機及/或無機。酸化材料之非限制性實例包括包含以下者之任何材料：鹵化氫與其等之溶液（例如氫氯酸（HCl）、氫溴酸（HBr）、與氫碘酸（HI））、鹵素含氧酸（例如次氯酸、氯酸、過氯酸、過碘酸與溴與碘之相對應化合物）、硫酸（H2SO 4）、氟硫酸、硝酸（HNO 3）、磷酸（H 3PO 4）、氟銻酸酸、氟硼酸、六氟磷酸、鉻酸（H 2CrO 4）、磺酸、甲磺酸（又稱為甲基磺酸，MeSO 3H）、乙磺酸（又稱為乙基磺酸，EtSO 3H）、苯磺酸（又稱為苯基磺酸，C 6H 5SO 3H）、對甲苯磺酸（又稱為對甲苯基磺酸CH 3C 6H 4SO 3H）、三氟甲磺酸（又稱為三氟甲基磺酸酸，CF 3SO 3H）、羧酸（例如醋酸、檸檬酸、蟻酸、葡萄糖酸、乳酸、草酸、酒石酸、插烯羧酸（例如抗壞血酸酸、meldrum氏酸）、酸鹽（例如碳酸氫鈉（NaHCO 3）、硫氫化鈉（NaHS）、硫酸氫鈉（NaHSO 4）、磷酸二氫鈉（NaH 2PO 4）、與磷酸氫二鈉（Na 2HPO 4））。
用於本文中，術語「中和（neutralize）」、「中和（neutralizing）」、與「中和（neutralization）」係論及於水溶液中之化學反應，其中酸與鹼反應以形成水與鹽，且其中該溶液之pH被帶回最初的pH。
用於本文中，術語「錳予體」係論及可於水溶液中提供錳離子（例如錳(I)、錳(II)、與錳(III)）之組成物或化合物。錳予體之非限制性實例包括Mn 2(CO) 10、K 5Mn(CN) 6NO、MnCl、MnF 2、MnBr 2、MnO、MnO 2、MnCh、MnF 3、MnBr 3、MnCO 3、Mn(CH 3COO) 2、C 6H 9MnO 6、MnTiO 3、[CH 3COCH=C(O)CH 3] 2Mn、[C 6H 11(CH 2) 3CO 2] 2Mn、(HCO 2) 2Mn、Mn(C 5HF 6O 2) 2、Mn(PH 2O 2) 2、MnI、(C 3H 5O 3) 2Mn、MnMoO 4、Mn(NO 3) 2、Mn(ClO 4) 2、C 32H 16MnN 8、MnSO 4、(CH 3COO) 3Mn、C 32H 16ClMnN 8、C 48H 28ClMnN 4O 8、C 5H 4CH 3Mn(CO 3)、Mn(C 5H 4C 2H 5) 2、與C 16H 22Mn。
用於本文中，術語「pH緩衝物質」係論及當加至液體混合物中時可將該液體混合物之pH維持在大約以下者之組成物：約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4.0、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0。例如，液體混合物之pH範圍係在約0.5至約3.0之間。對於絲狀嗜酸性MK7品系之較佳pH係約2.2至約3.0。如此組成物可包含諸如（例如）以下者之酸、酸鹽、鹼與鹼鹽之化合物：HCl、H 2NO 3、H 2SO 4、NaHCO 3、NaHS、NaHSO 4、NaH 2PO 4、Na 2HPO 4、NaHSO 3、KHCO 3、KHS、KHSO 4、KH 2PO 4、K 2HPO 4、KHSO 3. NaOH、KOH、Mg(OH) 2、Na 2CO 3、K 2CO 3、KHCO 3、CaCO 3、MgCO 3、Na 2S、K 2S、等等。
用於本文中，術語「需氧性條件」係論及於其中充足的氧，被提供的條件，且於如此條件下生長之微生物中之無氧呼吸被妨礙且無氧代謝途徑被抑制而預防無氧呼吸。
用於本文中，術語「微需氧性」與「微好氧性」係可互換地使用以指其中氧之供給被限制，但生物體中之細胞呼吸主要係需氧性呼吸的條件。
用於本文中，術語「脂肪酸」係論及於一端具有甲基基團且於另一端具有羧酸基團的長鏈分子。
用於本文中，術語「經分離的真菌」係論及任何包含從天然來源獲得的真菌族群之組成物。
用於本文中，術語「碳源」一般係論及適合用作為用於原核或真核細胞生長之碳的來源之物質。碳源包括（但不限於）生質水解產物、酸乳清、甜乳清、碳水化合物（例如澱粉、蔗糖、多醣、與單醣）、纖維素、半纖維素、木糖、與木質素、以及此等基質之單體組份及/或其等之組合。碳源可包含呈種種形式之種種有機化合物，包括但不限於聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、胺基酸、胜肽、等等。此等包括（例如）種種單醣，諸如葡萄糖、右旋糖（D-葡萄糖）、麥芽糖、寡醣、多醣、飽和或不飽和脂肪酸、琥珀酸鹽、乳酸鹽、醋酸鹽、乙醇、等等、或其等之混合物。碳源亦可係原料或木質纖維素原料，諸如糖甜菜渣。光合作用生物體可另外製造呈光合作用產物的碳源。
用於本文中，術語「生物觸媒」係論及任何類型的藉由降低反應之活化能來加速化學反應且於過程中既不被消耗又不被改變之活體系統或細胞。生物觸媒可包括（但不限於）微生物，諸如酵母菌、真菌、細菌、與古菌。例如，本發明之經分離的真菌物種及/或品系可於蛋白質與脂質之製造中或於碳基質或有機分子之降解中被用作為生物觸媒以用於製造蛋白質與脂質。
用於本文中，術語「發酵」或「發酵程序」係論及其中生物體或生物觸媒係於含有原料（諸如碳源或養分）的培養基中培養之程序，於該培養基中該生物體或生物觸媒將該等原料轉換成產物。
用於本文中，術語「生質」係論及衍生自例如莖、葉、與綠色植物之含澱粉部分之活生物體或最近為活的生物體、或木頭、廢棄物、森林殘渣（死亡之樹木、樹枝與樹木殘幹）、庭院修剪廢物、木屑之生物材料、或衍生自藻類或動物及/或工業副產物與廢料流、食物廢棄物/殘羹、與其他單醣之材料。於一些例子中，生質含有顯著量的蛋白質及/或脂質。於其他例子中，其主要由澱粉、木質素、果膠、纖維素、半纖維素、及/或果膠構成。
用於本文中，術語「纖維素生質」係論及主要由對人類而言不可食用或幾乎不可食用之植物纖維構成且具有纖維素作為重要組份之生質。該等纖維可被水解以產生各種各樣可被微生物發酵之糖。纖維素生質之實例包括自農業或林產品工業產生之禾草、木頭、與富纖維素殘渣。
用於本文中，術語「絲狀生物墊」與「絲狀真菌生物墊」係可互換地使用且係論及由絲狀真菌製造且含有其之生物墊。
用於本文中，術語「澱粉」係論及由消化酵素（例如澱粉酶）輕易水解的葡萄糖之聚合物。澱粉通常集中於諸如馬鈴薯、玉米仁、稻米穀粒、小麥穀粒、與甘蔗莖的植物之特化部分。
用於本文中，術語「木質素」係論及主要由連接的酚單體化合物（諸如對羥基肉桂醇、松柏醇、與芥子醇）構成之聚合物材料，其形成植物中之結構剛性的基礎且頻繁地被稱為植物之木質部分。木質素亦被視為植物之細胞壁之非碳水化合物部分。
用於本文中，術語「纖維素」係論及式(C 6H 10O 5) n之β-葡萄糖之長鏈聚合物多醣碳水化合物，其通常於植物細胞壁中與木質素及任何半纖維素組合在一起被找到。
用於本文中，術語「半纖維素」係論及一類植物細胞壁多醣，其可係許多異元聚合物之任一者。此等包括木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、葡萄甘露聚糖與半乳甘露聚糖。半纖維素之單體組份包括（但不限於）：D-半乳糖、L-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、L-海藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、與D-葡萄糖醛酸。此類多醣係與纖維素一起於幾乎所有細胞壁中被找到。半纖維素之重量比纖維素小且無法藉由熱水或螫合劑萃取，但可藉由鹼水溶液萃取。半纖維素之聚合性鏈於形成大多數植物細胞之細胞壁的交聯纖維之網狀結構中與果膠及纖維素結合。
術語「果膠」用於本文中係論及一類可藉由以酸與螫合劑處理來萃取的植物細胞壁非均質多醣。典型地，70-80%的果膠係呈α-(1-4)連接性D-半乳糖醛酸單體之線性鏈。果膠之較小的RG-I部分係由交替的(1-4)連接性半乳糖醛酸與(1-2)連接性L-鼠李糖構成，且大量阿拉伯半乳聚糖分支自鼠李糖殘基伸出。其他單醣（諸如D-海藻糖、D-木糖、洋芹糖、醋酸、Kdo、Dha、2-O-甲基-D-海藻糖、與2-O-甲基-D-木糖）係於RG-II果膠部分中找到（＜2%），或呈RG-I部分中之次要構成物。單醣之各者相對於D-半乳糖醛酸之比例基於以下者變化：個別的植物與其微環境、物種、與於生長周期期間之時間。基於相同理由，高半乳糖醛酸聚糖與RG-I部分於GalA殘基上之甲酯的含量、與GalA與中性糖之C-2和C-3位置上之乙醯基殘基酯的含量可能差異很大。
用於本文中，術語「兼嫌氧性生物體」或兼嫌氧性微生物」或「兼嫌氧性生物觸媒」被定義成於存在或不存在氧下皆可生長之生物體，諸如於本發明中分離之真菌品系。
用於本文中，術語「乾酒粕」（縮寫成DDG）係論及發酵後剩下之固體，其通常由未消耗的原料固體、剩下的養分、蛋白質、纖維、與油、以及生物觸媒細胞碎片所組成。該術語亦包括來自發酵的可溶性殘餘材料且因此被稱為「乾酒粕與可溶物」（DDGS）。
用於本文中，術語「養分」被定義成被生物體或生物觸媒使用以生長與存活的化學化合物。作為實例，養分可係有機化合物（諸如碳水化合物與胺基酸）或無機化合物（諸如金屬鹽）。
用於本文中，術語「綜合養分」被定義成主要含有被生物體或生物觸媒使用以製造蛋白質、DNA、脂質、與碳水化合物之單體有機化合物的養分來源。術語「豐富養分」於各處係與術語綜合養分可互換地使用。典型地，綜合養分或豐富養分係衍生自生物材料，諸如屠宰場廢棄物、乳業廢棄物、或農業殘渣。綜合養分或豐富養分包括（但不限於）:酵母菌萃取物、胰腖、蛋白腖、大豆萃取物、玉米浸液、大豆蛋白質、與酪蛋白。
用於本文中，術語「需氧性代謝」係論及其中氧被使用以自碳水化合物製造能量（典型係呈ATP之形式）的生物化學程序。典型的需氧性代謝係透過其中單一葡萄糖分子於存在氧下被完全地代謝成二氧化碳之醣解與TCA循環發生。
用於本文中，語詞「無氧性代謝」係論及其中氧並非係NADH所含之電子的最終接受體之生物化學程序。無氧性代謝可被分成無氧呼吸（其中氧以外的化合物充當終端電子接受體）與發酵（其中來自NADH的電子被利用以通過「發酵性途徑」產生經還原的產物）。
用於本文中，術語「微生物發酵」係論及其中有機物質係藉由微生物分解並被重新集合成產物的程序。該等物質可包括（但不限於）葡萄糖、蔗糖、甘油、澱粉、麥芽糊精、乳糖、脂肪、碳氫化合物、蛋白質、氨、硝酸鹽、與磷來源。該等產物可包括（但不限於）、特殊產品（包括（但不限於）黴菌蛋白質產品、大豆產品、丹貝、等等）、傳統產品（包括（但不限於）麵包、啤酒、葡萄酒、烈酒、乳酪、乳業產品、經發酵肉與蔬菜、洋菇、醬油與醋）、農業產品（包括（但不限於）赤霉素、殺真菌劑、殺昆蟲劑、青貯料、胺基酸，諸如L-麩醯胺酸、L-離胺酸、L-色胺酸、L-蘇胺酸、L-天門冬胺(+)、L-芳基甘胺酸）、酵素（包括（但不限於）碳水化合物、纖維素、脂酶、果膠酶、蛋白酶）、燃料與化學原料（包括（但不限於）丙酮、丁醇、丁二醇、異丙醇、乙醇、甘油、甲烷、甘油、丁酸、甲烷、檸檬酸、延胡索酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、與L-戊二酸或此等酸之任一者之鹽）、核苷酸、有機酸、藥品與相關化合物（包括（但不限於）生物鹼、抗生素、激素、免疫抑制劑、干擾素、類固醇、抗體、維生素）與聚合物（包括（但不限於）藻酸鹽、右旋糖酐、結蘭、聚羥基丁酸酯、硬葡聚醣與黃原）。用於發酵的微生物可包括原核微生物（包括細菌、藍綠菌）與真核微生物（包括酵母菌、真菌與藻類）兩者。
用於本文中，語詞「能源作物」係論及用於製造生質燃料或被直接利用其能源內含物之以低花費及低維持收穫物之形式生長的植物。商業能源作物典型係緻密地種植、高產率作物物種，其中該等能源作物會被燃燒以產生能源。諸如柳樹或白楊木之木質作物以及諸如芒草屬（ Miscanthus）與狼尾草（ Pennisetum purpureum）（亦以象草為人所知）之熱帶禾草被廣泛地利用。
用於本文中，術語「表面發酵」係論及其中所利用的微生物生長在發酵培養基之表面上而無任何進一步支持的發酵。培養基典型係自由流動的水性培養基。無意受限於任何理論，咸認為絲狀生物墊係由需氧性、微需氧性及/或無氧性代謝之一些組合產生。例如，咸認為該生物墊之表面依賴需氧性呼吸而該生物墊之底部可能係微需氧性至高度無氧性。
用於本文中，術語「固態基質表面發酵」係論及該等其中所利用的微生物生長在發酵培養基之表面上使用由浸沉於該發酵培養基中之固體提供的碳與養分之發酵。於一些實施方式中，該生物墊之一些部分可係部分浸沉的。
用於本文中，術語「浸沉發酵」係論及該等其中所利用的微生物以浸沉狀態於發酵培養基內生長之發酵。許多發酵落入此範疇內，諸如青黴素浸沉發酵技術。
用於本文中，術語「固態發酵」係論及生長在基於其目的挑選的固體支持物上之微生物的培養。例如，固態培養基質（諸如稻米或小麥麩）於以微生物接種後被放置在平台上；該基質接著被放在溫度受控的房間內共多日。固態發酵使用具有低水含量（減低的水活性）的培養基質。該培養基（例如稻米或小麥麩）係以水飽和，但僅有極小部分的水可自由流動。該固體培養基包含基質與固體支持物兩者，於其上發酵發生。
用於本文中，術語「類藥劑營養品」係論及具有健康或醫藥利益的物質。於一些實例中，類藥劑營養品不僅補充飲食且亦協助預防及/或治療疾病及/或失調。術語「類藥劑營養品（nutraceutical）」係由Stepen DeFelice, MD（醫學創新基金會（Foundation for Innovation in Medicine，FIM）之創立者與主席）於1989自「營養（nutrition）」與「藥的（pharmaceutical）」創造。
用於本文中，「子代」係論及在世系上起源自一個品系之任何及所有後裔，無論係如何或係於何處製造的。用於本文中，包括在「子代」之定義中者係所分離/寄存的品系及其子代之任何及所有突變體，其中如此突變體具有所分離/寄存的品系與其子代之生理及/或形態特徵之至少一者。 用於絲狀真菌生物墊之生長的人工培養基
使用人工培養基以製造絲狀真菌生物墊。該人工培養基提供相較於該等於天然找到者增加細胞週期時間（即增加的生長速率）且造成細胞密度增加所需之養分。該人工培養基包含至少以下主要營養物質：氮（N）、磷（P）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、碳（C）、鉀（K）、硫（S）。亦可將諸如鐵（Fe）、硼（B）、鉻（Cr）、銅（Cu）、硒（Se）、錳（Mn）、鉬（Mo）、釩（V）、與鋅（Zn）之微量營養物質添加至該培養基以補充碳源。諸如木質纖維素原料、甜乳清、及/或酸乳清之碳源典型地提供充足的微量營養物質以使得不需額外的微量營養物質。
可將額外的養分添加物加至該人工培養基。如此者之實例係碳水化合物（例如單醣、多醣）、胺基酸予體（例如胺基酸、多肽）、與其等之組合。此外，亦可將可促進木質纖維素碳源之預處理之化合物添加至該人工培養基中。如此化合物包括（但不限於）酸化材料、錳予體、養分、與pH緩衝物質。
該人工培養基可呈充滿液體之固體、液體、或凝膠之形式。該人工培養基亦可呈覆蓋固體碳基質（諸如木質織維素原料或其他固體碳基質）之液體之形式。此處，該固態基質係浸沉在液體之表面下，使得該生物墊生長在該液體之表面上使用衍生自該浸沉固體的碳，一種以固態基質表面發酵（SSSF）為人所知的程序。自真菌分泌之細胞外酵素降解該固體碳基質，釋放可於或靠近該生物墊/水介面被該生物墊攝取之可溶性碳。所得之生物墊在該浸沉固態基質上面之液體層上形成一個墊子。一般而言，在該浸沉碳源上之液體層應係約0.01-1.0 cm深。液體太少會造成無墊子形成且固態發酵及/或浸沉發酵接著發生。液體太多會造成無效率的轉換與削弱之生物墊生長周期。
有各種各樣可被用作為用於該人工培養基之碳源的物質。此等包括糖（例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、果糖、等等）、甘油、澱粉、碳水化合物、甘油、乳清、木質纖維素原料、廢料流（例如酸乳清）與其等之組合。適合的木質纖維素原料包括（例如）柳枝稷、能源作物、森林硬木與其他產物、用過的啤酒粕、小麥桿、禾草、葉、AFEX作物殘渣、無氧消化產物、農作物殘渣（例如大麥桿、稻桿、細粒禾榖桿、玉米桿、玉米纖維（例如玉米纖維膠（CFG）、乾酒粕（DDG）、玉米蛋白粗粉（CGM））、苜蓿草乾草、甘蔗渣、非農業生質（例如藻墊、城市樹木殘渣）、工業殘渣（例如軟木初級/次級製材廠廢料、硬軟木、初級/次級製材廠廢料、回收紙、紙漿污泥）、含木質纖維素廢棄物（例如新聞紙、廢紙、釀造穀粒、都市有機廢棄物、庭園廢棄物）、臨床有機廢棄物、於生質燃料之製造期間產生之廢棄物（例如經處理藻類生質、來自纖維素乙醇之製造之殘渣、來自生物柴油製造之固體殘渣）、與其等之組合。適合的廢料流包括農業廢棄物、都市有機廢棄物、來自生質燃料製造之廢棄物（例如纖維素乙醇製造殘渣）、藻類生質、用過的啤酒粕及/或廢料流（例如糖蜜、玉米糖漿、等等）、工業廢棄物（例如有機分子，諸如酚與其他芳香族物）與纖維，諸如β-葡聚醣、纖維素、幾丁質、半纖維素與聚右旋糖、單醣、二醣、寡醣、多醣、與任何其等之組合。該等單醣包含三碳醣、四碳醣、五碳醣、六碳醣、七碳醣、等等、與任何及所有其等之組合，該五碳醣包含核酮糖、木酮糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、去氧核糖、與任何及所有其等之組合，而該六碳醣係選自由阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖、艾杜糖、半乳糖、太洛糖、假果糖、果糖、山梨糖、塔格糖、與任何及所有其等之組合所組成之群組。該等二醣包含蔗糖、乳糖、麥芽糖、與任何及所有其等之組合，而該等多醣包含澱粉、肝醣、纖維素、幾丁質、與任何及所有其等之組合。
用於生長該經分離的真菌品系之碳源可包含量為以下者之纖維素：約5%至約100%、約10%至約95%、約20%至約90%、約30%至約85%、約40%至約80%、約50%至約75%、或約60%至約70%，以該碳源之乾重計。供選擇地，該纖維素碳源包含量為以下者之纖維素：該碳源之乾重之至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、或至少約70%。於其他例子中，用於生長該經分離的真菌品系的纖維素碳源包含約1%至約50%、約5%至約40%、或約10%至約30%以重量計之選自木質素、半纖維素、或其等之組合之組份。於一些本發明之實施方式中，用於生長微生物之纖維素碳源包含至少約1%、至少約5%、至少約10%、至少約20%、或至少約30%以重量計之選自木質素、半纖維素、或其等之組合之組份。
適合的氮源包括尿素、硝酸銨（NH 4NO 3）、硫酸銨（NH 4SO 4）、硝酸鹽（例如KNO 3）、氨鹽（即NH 4SO 4）與有機N（例如蛋白質、胜肽）、氮含量高的工業廢料流、玉米浸液、與其等之組合。以純尿素氮源製備之人工培養基提供比以尿素與硝酸銨之組合製備之人工培養基所提供者快大約25%的絲狀真菌之生長（即分別為70 g/m 2/日對52 g/m 2/日）。亦可使用尿素與硝酸銨之組合。儘管遠較使用單單尿素或尿素之組合製造者緩慢，生長亦於使用硫酸銨作為唯一的氮源時發生。雖然亦可單獨使用硝酸銨，此氮源再次不會產生在使用尿素之組合時看到的強有力之生長。
人工培養基內碳對氮比例（C：N）之操作對由該真菌物種及/或品系製造之生物墊之組成具有顯著的影響。典型地，低C：N比率（諸如7.5:1或更低的C：N比率）相較於脂質偏好蛋白質及胺基酸之製造。另一方面，高於7.5:1之C：N比率相較於蛋白質偏好脂質之製造。當人工培養基具有至少10:1、15:1、20:1、26:1、30:1、40:1、或50:1之C：N比率時往往脂質形成特別被偏好。
人工培養基之pH係基於所欲的產物與所利用之真菌物種及/或品系決定。 Fusisporium、假鐮孢菌屬、赤黴菌屬、 Sporotrichella、麴菌屬、青黴菌屬、木黴菌屬、毛黴目物種內之物種（例如根黴菌屬物種）、被命名為MK7之經分離之絲狀嗜酸性真菌品系、與其等之組合，高脂質製造在pH範圍2.0 – 7.0且最理想地於小於3.5之pH發生。高蛋白質製造，雖然主要受影響而隨著呈C：N比率變化，需要至少2.7之pH且較佳為介於4.5與5.5之pH。 包含經分離的真菌物種及 / 或品系之培養物與組成物
本發明使用經分離的真菌物種及/或品系之純的培養物、或二種真菌物種及/或品系之純的共培養物、或由三種或更多種真菌物種及/或品系之實質上純的培養物構成。可使用大量的經分離之絲狀真菌物種及/或品系，諸如 Fusisporium、假鐮孢菌屬、赤黴菌屬、 Sporotrichella、麴菌屬. 青黴菌屬、木黴菌屬、畢赤酵母菌屬（ Pichia）物種、毛黴目物種內之物種（例如根黴菌屬物種）、與其等之組合之物種及/或品系。生物上純的培養物/共培養物/實質上純的培養物亦可包含經分離之被命名為MK7的絲狀嗜酸性真菌品系，其已以ATCC登錄寄存編號PTA-10698寄存，或其活性突變體。亦可使用基因上經修飾的絲狀真菌之生物上純的培養物。該等純的真菌物種及/或品系及/或其子代典型係呈分生胞子、小分生胞子、大分生胞子、分生孢子器、厚壁孢子、菌絲、菌絲之片段與菌絲體或其等之組合之形式。
絲狀嗜酸性MK7真菌品系係一個嗜酸性真菌之新品系，其可將諸如木質纖維素碳源、碳水化合物（例如酸乳清）與藻類生質的碳源直接轉換成包含蛋白質與脂質的絲狀真菌生物墊。
使用人工培養基及經分離的真菌染色及/或其子代製造有用的產物之方法包含： a)將一或多種真菌物種或品系及/或其子代接種至於容器中之具有選自由以下者所組成之群組之碳源的人工培養基中：糖、甘油、木質纖維素原料、含碳農業、工業、與都市廢棄產物、碳水化合物、酵母菌萃取物、酪蛋白胺基酸、酸乳清、甜乳清及/或其等之組合，其中該人工培養基可透過表面發酵支持該經分離的真菌品系生長； b)於該人工培養基中生長該經分離的真菌品系以製造絲狀真菌生物墊； c)收穫該等絲狀真菌生物墊；與 d)視需要地自該等絲狀真菌生物墊分離、純化及/或製造產物。
生長係在需氧性條件下產生。於另一個實施方式中，該生長係在微需氧性條件下產生。供選擇地，生長係由於需氧性條件、微需氧性條件與無氧性條件之任何組合（諸如透過表面發酵）而產生。
該等有用的產物係富含蛋白質的生質、生物墊及/或絲狀真菌生物墊。例如，使用所揭示的真菌與方法製造的有用的產物包括（但不限於）供用於食物產品、魚飼料產品、動物飼料產品、生物塑膠、及/或其等之先驅物的蛋白質生物墊。此處，該生長係藉由需氧性條件、微需氧性條件、與無氧性條件或任何其等之組合產生。
大量的嗜酸性真菌物種及/或品系（諸如 Fusisporium、假鐮孢菌屬、赤黴菌屬、 Sporotrichella、麴菌屬. 青黴菌屬、木黴菌屬、毛黴目物種內之物種（例如根黴菌屬物種）、被命名為MK7之經分離之絲狀嗜酸性真菌品系與其等之組合、及/或其等之子代）可於不存在抗生素下伴隨很少或無污染培養。典型地，於人工培養基中之污染係由諸如以下者之其他生物體造成：細菌、其他非所欲的真菌（例如酵母菌、黴菌）、藻類、植物、昆蟲、與其等之混合物。
亦揭示至少一個包含以下經分離的真菌物種及/或品系的組成物： Fusisporium、假鐮孢菌屬、赤黴菌屬、 Sporotrichella、麴菌屬. 青黴菌屬、木黴菌屬、毛黴目物種內之物種（例如根黴菌屬物種）、能夠製造絲狀構造的酵母菌（即耶氏酵母菌屬（Yarrowia））被命名為MK7之經分離之絲狀嗜酸性真菌品系、與其等之組合。該組成物可進一步包含支持該真菌物種及/或品系之生長的人工培養基、與視需要的酸化材料、錳予體、養分添加物、及/或其等之混合物之一或多者。 表面發酵
本文之揭示內容藉由以所欲的絲狀真菌物種及/或品系之浮游性細胞之懸浮液接種人工培養基來起始表面發酵。將來自接種體反應器的接種體培養物以會於所欲的時段製造成熟生物墊的濃度加至人工培養基。理論上，該培養基可以單個細胞接種；然而，如此接種為了使成熟生物墊成長會需要格外嚴苛的滅菌條件與顯著延長的時段。典型地，以0.5 – 1.0 g的細胞每公升生長培養基接種會於3至6日產生生物墊。例如，以7.5%（體積對體積）所使用之培養基添加含有約10 g/L之細胞的接種體會於3至6日產生生物墊。無外部氧藉由起泡或其他方法被引進至該人工培養基，充足的氧可自周圍或近周圍條件收集。
無意受限於任何理論，咸認為因為細胞生長於存在氧下係遠較快速，存在於該人工培養基之表面（於該處存在更多氧）上的分生胞子會快速地生長並開始菌絲體生物墊之形成。咸相信氧濃度於該人工培養基之表面下僅幾個微米就遠較低且因此會使位於該等區域中的真菌細胞處於壓力環境。已知壓力會增加細胞外多醣（其具有「黏著性」表型）之分泌，且因此會藉由黏附至於該表面增殖的細胞來協助該絲狀真菌生物墊之快速形成。然而，基質濃度亦具有顯著的功效。例如，當該碳基質之濃度係低於4%時，絲狀真菌生物墊不會形成。應注意形成墊子的最初環境壓力不必然暗示形成受壓力的墊子（即含有受壓力的生物體所分泌的毒素的墊子）。
典型地，將含有人工培養基的淺盤用於在適合用於所利用之真菌物種及/或品系的溫度、濕度、與空氣流動之受控條件下的表面發酵。滅菌條件被維持以用於最理想的絲狀真菌生物墊生長。充足的空氣流動被維持以移除從微生物呼吸產生的熱與二氧化碳並供給氧而不攪動該人工培養基之表面與中斷真菌菌絲生長。
一般而言，於接種後第2日在該人工培養基之表面上開始形成「薄層」。此「薄層」係最初的絲狀真菌生物墊，其通常包括氣生菌絲以及與該人工培養基接觸的菌絲且其繼續生長與增加細胞密度。典型地，於接種後三至六日，所得的絲狀真菌生物墊係1至30 mm厚且具有充足的抗張力與結構完整性而可搬動而不撕裂。
所製造之絲狀真菌生物墊具有於天然中未見到的所描述之結構。使先，天然形成的絲狀真菌生物墊並非由純的培養物/共培養物/實質上純的培養物構成。典型地，天然形成的生物墊除了至少一個絲狀真菌物種外含有種種類型的藻類及/或細菌且形成人工微生態系。天然形成的真菌生物墊之實例係菌根真菌墊，其於土壤中以主要為散生之形式存在且係與植物根、地衣（例如馴鹿苔與殼狀地衣）、與洋菇（例如Armillaria ostoyae）相關連。
第二，使用本文中描述的方法與技術形成之生物墊具有明顯比該等於自然中找到者大的細胞密度，即使將在天然形成的生物墊中找到的多種物種納入考量。所製造的絲狀真菌生物墊傾向為非常緻密的，典型為50 - 200克每公升。用於絲狀真菌之生長的天然與浸沉程序一般造成約15 克每公升的生質密度。固態發酵程序產生具有小百分比的真菌（即小於5%真菌組成物）的基質之混合物。於固體百分率觀點，本文中揭示之方法產生範圍一般在5 – 20%固體的絲狀真菌生物墊。對照下，用於生長絲狀真菌的天然與浸沉程序一般造成小於1.5%的百分比固體範圍。所達成的密度、絲狀性質、與於此等緻密生物墊中找到的細胞外基質之一個結果係於乾燥後維持黏著性墊子的能力。此與於其他經乾燥絲狀真菌生物墊中通常找到的粉狀及/或非黏著性形式形成明顯的對比。
第三，使用本文中描述的方法與技術形成之生物墊相較於天然存在的生物墊具有高抗張力，允許其等被提起並移動而不毀壞。
第四，本案之生物墊具有包含（於一些實例中）單一緻密層之清晰的結構，該緻密層由一般排列成與空氣:生物墊介面平行的長絲狀構造構成。於一些絲狀真菌生物墊中，存在至少二層：(a)緻密底層與(b)氣生菌絲層。於一些絲狀真菌生物墊中，可看見至少三個結構上不同的層：(a)緻密底層、(b)氣生菌絲層與(c)過渡帶層（參見圖10A與B）。對於具有氣生菌絲的系統與具有三個層的系統，該氣生菌絲層典型係看得見地最佔優勢的，接著為該緻密底層，而該過渡帶層（若存在的話）係最小的。該等層之各者一般具有相較於其他層與其關連的獨特細胞密度。例如，該氣生菌絲層相較於該生物墊之底層緻密度明顯較低（參見圖10A）。若製造氣生菌絲，其等之方向主要與該生物墊:空氣及/或生物墊:培養基介面垂直。對於所有生物墊，該緻密層係由傾向排列成與該生物墊:空氣及/或生物墊:培養基介面平行的長絲狀構造構成。進一步，所得之生物墊係至少主要由真菌生質構成且於較佳之實施方式中，實質上無殘留原料且由實質上純的真菌生質構成。
於該等其中形成氣生菌絲之實例（諸如當使用甘油作為基質時）中，在該氣生菌絲層與該緻密底層之間亦存在一些關鍵區分性因子。就長度而論，氣生菌絲傾向比該等於該緻密底層中找到者長。個別氣生菌絲之密度與分佈係小於該等與緻密層菌絲體關連者。該氣生菌絲之方向於與大氣並列之末端傾向為垂直方向。即，氣生菌絲傾向相對垂直於表面培養基地生長。另一方面，該緻密層之菌絲傾向以主要與空氣:生物墊及/或生物墊:培養基介面平行的方向生長。該氣生菌絲之低相對密度加上其等較長的長度與垂直方向暗示氧收穫之最大化。進一步，極少至沒有細胞外基質係於該氣生菌絲層中找到。對照下，許多細胞外基質可於該緻密底層中找到。
該生物墊之氣生層（若形成的話）似乎會加速該生物墊之生長。該氣生層中斷區域之中斷負面地衝擊該生物墊之經加速的生長。中斷包括與固體物體之接觸、與小水滴之接觸、及導因於該生物墊於其上生長之液體培養基之攪動之裂縫或裂隙。典型地，當中斷之原因被移除時，中斷的生物墊區域不經歷進一步生長。一般地，該生物墊生長係由需氧性條件、微需氧性條件、與無氧性條件或任何其等之組合產生。
該生物墊正常係於接種後第3日與第12日之間收穫，取決於所使用之物種/品系與所欲的產物，雖然較晚的收穫時間亦係可能的。該等絲狀真菌生物墊可藉由一些可包括以下者之不同的方法學收穫；漂洗、物理處理（粉碎、壓力處理、脫水、等等）、生存程序之去活化、溫度循環、生質構成物之萃取及/或分離、與轉換及/或納入至不同的系統中。於一些實施方式中，該等絲狀真菌生物墊被收穫、以水漂洗、並接著於溫度受控制的烘箱中乾燥以鈍化該生物墊內之酵素之許多者及限制該生物墊內之生物化學轉換、或被冷凍。
絲狀真菌被認為係重組蛋白質製造與表現平台之非常有用的宿主細胞，產生於生質、及/或絲狀真菌生物墊中表現之有用的產物。目前被使用或被建議用於如此方法中的絲狀真菌之實例包括粗厚神經胞子菌（ Neurospora crassa）、產黃頂孢黴菌（ Acremonium chrysogenum）、 Tolypocladium geodes、捲柄毛黴（ Mucor circinelloides）、李氏木黴菌（ Trichoderma reesei）、小巢狀麴菌（ Aspergillus nidulans）、黑麴菌（ Aspergillus niger）與米麴菌（ Aspergillus oryzae）。進一步，用於製造如所揭示的生物墊之微生物物種可經基因修飾以藉由基因表現（包括轉錄）之操作表現/削弱系統，使得其等過度表現或不表現於其等之天然或未經改變之形式中找到的化合物或化學品。使用與操作真菌系統以過度表現存在的化學品，天然不存在之表現系統或於天然形式中一般存在的削弱系統於所屬技術領域中係已知的，即麴菌屬物種、青黴菌屬物種、根黴菌屬物種、木黴菌屬物種、與酵母菌，諸如畢赤酵母菌屬物種。使用所揭示的生物墊與方法製造的有用產物包括（但不限於）用於表現藥品、類藥劑營養品、供工業應用之建構組元之用的化學品、醫藥、酵素及/或其等之先驅物的生質及/或生質生物墊。 嗜酸性真菌物種及 / 或品系
於本發明中使用之嗜酸性真菌物種及/或品系係具有至少以下識別性特性的木質織維素降解性絲狀真菌品系及/或其等之子代： a)該經分離之品系係嗜酸性的且可於範圍在約8.5之約0.68的pH下生長；與 b)在需氧性條件、微需氧性條件、無氧性條件或任何其等之組合下透過表面發酵自人工培養基製造含有蛋白質與脂質之絲狀、生物墊。此處，該人工培養基之碳源包括碳水化合物、木質纖維素原料、含碳廢棄產物（例如酸乳清）、或其等之組合。
該經分離之物種及/或品系典型進一步包含以下額外識別性特性之一或多者： c)製造蛋白質、脂質胺基酸、酵素、核酸（核苷酸）、碳水化合物、纖維，諸如β葡聚醣、聚乙醯類、生物鹼、色素、與抗生素之能力。之實例包括（但不限於）酯、麩胺酸、天門冬胺酸、澱粉酶、蛋白酶、纖維素酶、木糖聚糖酶、脂酶、過氧化酶、錳過氧化酶、核酸/核苷酸：DNA/RNA、嘌呤、嘧啶、油酸、棕櫚油酸、β-葡聚醣、幾丁質、β-胡蘿蔔素、醣苷、酚、萜類，其等來自如於第22頁段落[0080]描述的碳源與藻類原料、與來自於在各種各樣的無氧性、需氧性微需氧性條件及/或任何其等之組合下的生質燃料製造（例如經處理藻類生質、甘油）之期間產生的廢棄物； d)包含與SEQ ID NO.:1共有至少98%一致性的18S rRNA與ITS區域DNA序列。
適合的絲狀嗜酸性真菌物種及/或品系包括 Fusisporium、假鐮孢菌屬、赤黴菌屬、 Sporotrichella、麴菌屬、青黴菌屬、木黴菌屬、毛黴目物種內之物種（例如根黴菌屬物種）、被命名為MK7之經分離之絲狀嗜酸性真菌品系、與其等之組合、及/或其等之子代。被命名為MK7之品系，已以ATCC登錄寄存編號PTA-10698寄存。
該嗜酸性真菌物種及/或品系及/或其子代可於以下者之低pH下生長：至多約7.0、約6.5、約6.0、約5.5、約5.0、約4.5、約4.0、約3.5、約2.0、約1.8、約1.6、約1.4、約1.2、約1.0、約0.9、約0.8、或約0.7或約0.6、或約0.5。例如，該真菌品系可於範圍在約0.68至約2.0之低pH下生長。
所利用之嗜酸性物種及/或品系可於在如以上描述之低pH範圍下生長的絲狀真菌生物墊內以高量製造脂質與蛋白質。例如，該經分離之品系可在如以上描述的低pH內以較先前已於所屬技術領域中報導者高的速率將該碳源轉換成脂質，諸如先前分離之Fusarium品系已被描述（參見Nairn等人，1985、Bhatia等人，2006、與Naqvi等人，1997）。在於pH 2.5下培養10日後，所利用的嗜酸性物種及/或品系可以以下速率將碳源轉換成脂質：至少0.04 g脂質/g碳源、0.05 g脂質/g碳源、0.06 g脂質/g碳源 0.07 g脂質/g碳源、0.08 g脂質/g碳源、0.1 g脂質/g碳源、0.12 g脂質/g碳源、0.14 g脂質/g碳源、0.16 g脂質/g碳源、0.18 g脂質/g碳源、0.2 g脂質/g碳源、0.25 g脂質/g碳源、0.3 g脂質/g碳源、0.35 g脂質/g碳源、或0.4 g脂質/g碳源。
本發明之培養條件亦製造相較於先前自所培養的真菌或微型藻類製造之生質具有更有利的脂質輪廓的絲狀生質。例如，所使用之嗜酸性物種及/或品系製造更飽和的脂肪酸（例如棕櫚酸(16:0)與硬酯酸(18:0)）與單不飽和脂肪酸（例如油酸 (18:1)），但較少之多不飽和脂肪酸，其較易受氧化傷害。
此外，該嗜酸性真菌物種及/或品系及/或其子代可於高金屬濃度下生長，其中該金屬係選自由以下者所組成之群組：Mn、Ag、Zn、Fe、Al、Be、Pb、Cu、Cr、Ni、Cd、Co、Ni、Pd、Pt、U、Th、Mo、Sn、Ti、As、Au、Se、Sb與Hg。
該嗜酸性真菌物種及/或品系及/或其等之子代於該培養條件下能夠快速高密度細胞生長。此處，該微生物能夠達成以下細胞密度（以人工培養基之乾重/L測量）：至少約10 g/L、至少約15 g/L、至少約20 g/L、至少約25 g/L、至少約30 g/L、至少約50 g/L、至少約75 g/L、至少約100 g/L、至少約125 g/L、至少約135 g/L、至少約140 g/L、至少約145 g/L、至少約150 g/L、至少約160 g/L、至少約170 g/L、至少約180 g/L、至少約190 g/L、至少約200 g/L、至少約210 g/L、至少約220 g/L、至少約230 g/L、至少約240 g/L、至少約250 g/l。
例如，該嗜酸性真菌物種及/或品系能夠達成以下細胞密度：約10 g/L至約300 g/L、約15 g/L至約300 g/L、約20 g/L至約300 g/L、約25 g/L至約300 g/L、約30 g/L至約300 g/L、約50 g/L至約300 g/L、約75 g/L至約300 g/L、約100 g/L至約300 g/L、約125 g/L至約300 g/L、約150 g/L至約300 g/L、約170 g/L至約300 g/L、約130 g/L至約290 g/L、約135 g/L至約280 g/L、約140 g/L至約270 g/L、約145 g/L至約260 g/L、約150 g/L至約250 g/L、約170 g/L至約250 g/L、約100 g/L至約280 g/L。之嗜酸性真菌物種及/或品系之高密度生長可藉由調整發酵條件（諸如溫度、pH、離子之濃度、培養之時間及/或氣體濃度）而進一步增加。 鐮孢菌屬物種
關於嗜酸性鐮孢菌屬物種、識別之方法、分離培養之資訊係於以下者中描述：Nelson等人，（Taxonomy, Biology, and Clinical Aspects of Fusarium Species, 1994, Clinical Microbiology Reviews, 7(4): 479-504）、Toussoun與Nelson（1976, Fusarium）、Booth（Fusarium: laboratory guide to the identification of the major species, 1977, Commonwealth Mycological Institute, ISBN 0851983839, 9780851983837）與Leslie等人（The Fusarium laboratory manual, 2006, Wiley-Blackwell, ISBN 0813819199, 9780813819198），其等之每一者皆以其整體藉由引用方式併入本文中。
由該等絲狀真菌物種及/或品系製造的蛋白質（包括（例如）某些酵素）可自由該等生物體製造的絲狀生質純化。蛋白質純化之方法對所屬技術領域中具有通常知識者而言係已知的。詳細的蛋白質純化方法已於以下者中描述：Janson與Ryden （Protein purification: principles, high-resolution methods, and applications；Wiley-VCH, 1998, ISBN 0471186260, 9780471186267）、Detscher（Guide to protein purification, Volume 182 of Methods in enzymology, Gulf Professional Publishing, 1990, ISBN 0121820831, 9780121820831）、與Cutler（Protein purification protocols, Volume 244 of Methods in molecular biology, Humana Press, 2004 ISBN 1588290670, 9781588290670），其等係為了所有目的以其等之整體藉由引用方式併入。
蛋白質不需自該墊子純化以得到作為產品之實用性與有用性。即，該墊子可被加工而不經純化且係有用的；即作為蛋白質來源、作為糧食、及/或作為動物飼料。該墊子本身可形成產品；生物墊原位製造的產物之混合物係重要且有價值的。 真菌物種及 / 或品系之脂質
如於以上提及的，當於具有高C：N比率的人工培養基培養時，絲狀真菌生物墊被製造，其具有高脂質含量及相較於藻類與其他脂質製造性生物體更有利的脂質輪廓。該等脂質可自該經分離之絲狀生質萃取。於一些例子中，該等脂質主要係具有脂肪酸醯基基團的三醯基甘油酯。於一些實例中，該等脂肪酸係實質上不飽和的脂肪酸及/或飽和的脂肪酸。該等不飽和脂肪酸包括油酸(18:1)、α-次亞麻油酸(18:3)、二十烯酸(20:1)、與其等之組合。飽和脂肪酸包括棕櫚酸(16:0)、硬酯酸(18:0)、花生酸(20:0)、二十二酸(22:0)、與其等之組合。可被製造的脂質之其他類型包括（但不限於）固醇（例如麥角固醇、於D2先驅物中的維生素）、二醯基甘油酯、類胡蘿蔔素、飽和脂肪（例如丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸、十六酸、十七酸、十八酸、十九酸、二十酸、二十二酸、二十四酸）、單不飽和脂肪（例如十四烯酸、十五烯酸、十六烯酸、十七烯酸、十八烯酸、二十烯酸、二十二烯酸、順-二十四烯酸）、與多不飽和脂肪（例如十六碳二烯酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、α-次亞麻油酸、γ-次亞麻油酸、十八碳四烯酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳二烯酸、鰶油酸與二十二碳六烯酸）。
該等絲狀真菌物種及/或品系及/或其等之子代能夠高效率地製造脂質。於一些實例中，所製造的脂質之量係至少約1g/L/日、5 g/L/日、至少約10 g/L/日、至少約20 g/L/日、至少約30 g/L/日、至少約40 g/L/日、至少約50 g/L/日、至少約60 g/L/日、至少約70 g/L/日、或更多。例如，所製造的生物油之量係約1g/L/日至約5 g/L/日、約5 g/L/日至約70 g/L/日、約10 g/L/日至約70 g/L/日、約20 g/L/日至約70 g/L/日、或約30 g/L/日至約70 g/L/日。此等值係遠大於文獻中所報導的約12 g/L/日之最高值（參見Dey, P.等人(2011) Comparative lipid profiling of two endophytic fungal isolates – Colletotrichum sp. and Alternaria sp. having potential utilities as biodiesel feedstock. Bioresource Technology 102:5815-5823；Gong, Z.等人(2013) Efficient conversion of biomass into lipids by using the simultaneous saccharification and enhanced lipid production process. Biotechnology for Biofuels 6:36；Gong, Z.等人(2014) Lipid production from corn stover by the oleaginous yeast Cryptococcus curvatus. Biotechnology for Biofuels 7:158；Hui, L.等人(2010) Direct microbial conversion of wheat straw into lipid by a cellulolytic fungus of Aspergillus oryzae A-4 in solid-state fermentation. Bioresource Technology 101:7556-7562；Liang, Y.等人(2014) Microbial lipid production from pretreated and hydrolyzed corn fiber. Biotechnol Progress 30:945-951；Liu, C.-Z.等人(2012) Ionic liquids for biofuel production: Opportunities and challenges. Applied Energy 92:406-414；Ruan, Z.等人(2013) Co-hydrolysis of lignocellulosic biomass for microbial lipid accumulation. Biotechnol. Bioeng. 110:1039-1049；Sung, M.等人(2014) Biodiesel production from yeast Cryptococcus sp. using Jerusalem artichoke. Bioresource Technology 155:77-83；Xie, H.等人(2012) Enzymatic hydrolysates of corn stover pretreated by a N-methylpyrrolidone–ionic liquid solution for microbial lipid production. Green Chem. 14:1202-1210）。
脂質可自該等絲狀真菌生物墊使用種種程序萃取。脂質萃取之非限制性實例係於以下者中描述：King等人（Supercritical Fluid Extraction: Present Status and Prospects, 2002, Grasa Asceites, 53,8-21）、Folch等人（A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, 1957, J Biol. Chem., 226, 497-509）、Bligh與Dyer（A rapid method of total lipid extraction and purification. 1959, Can. J Biochem. Physiol., 37, 911-917）、Cabrini等人（Extraction of lipids and lipophilic antioxidants from fish tissues - a comparison among different methods. 1992, Comp. Biochem. Physiol., 101(3), 383-386）、Hara等人（Lipid extraction of tissues with a low toxicity solvent. 1978, Anal. Biochem. 90, 420-426）、Lin等人（Ethyl acetate/ethyl alcohol mixtures as an alternative to Folch reagent for extracting animal lipids. 2004, J. Agric. Food Chem., 52, 4984-4986）、Whiteley等人（Lipid peroxidation in liver tissue specimens stored at subzero temperatures. 1992, Cryo-Letters, 13, 83-86）、Kramer等人（A comparison of procedures to determine free fatty acids in rat heart. 1978, J. Lipid Res., 19, 103-106）與Somashekar等人（Efficacy of extraction methods for lipid and fatty acid composition from fungal cultures, 2001, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17(3):317-320）。
於另一個實例中，脂質可藉由與FRIOLEX®（Westfalia Separator Industry GmbH，德國）類似的方法萃取  程序係用於萃取藉由該等微生物製造之生物油。FRIOLEX®係基於水的物理油萃取程序，藉其含有油的原料可被直接用於萃取油而不使用任何習用溶劑萃取方法。於此程序中，水可溶性有機溶劑可被用作為程序助劑且油係藉由密度分離使用重力或離心力自原料液態培養基分離。
在已萃取脂質後，該脂質可藉由於所屬技術領域中已知的任何適合的手段回收或自非脂質組份分開。例如，使用低花費物理及/或機械技術以自非脂質組成物分離含脂質組成物。若用於萃取該等脂質的萃取方法創造出多個相或部分，在一或多個相或部分含有脂質的情況下，用於回收含脂質相或部分的方法可包括自非脂質相或部分物理地移出含脂質相或部分、或反之亦然。於一些例子中，使用FRIOLEX®型方法以萃取由該等微生物製造的脂質且富含脂質的輕相接著係自富含蛋白質的重相物理分離（諸如藉由於密度分離後脫脂掉在富含蛋白質的重相之頂面上之富含脂質的相）。
藉由該等絲狀真菌物種及/或品系的脂質之製造中有至少二個階段：(a)絲狀真菌生物墊累積階段與(b)脂質製造階段。絲狀真菌生物墊累積階段製造該真菌物種及/或品系之，絲狀生質，使得於絲狀真菌生物墊累積階段期間達成該真菌品系之總絲狀真菌生物墊製造之約10%至約95%、約20%至約95%、約30%至約95%、約40%至約95%、或約50%至約95%。於其他例子中，於絲狀真菌生物墊累積階段期間達成該微生物之總絲狀真菌生物墊製造之約60%至約95%、約70%至約95%、或約80%至約95%。於其他情況中，絲狀真菌生物墊累積階段製造該微生物之絲狀生質使得於絲狀真菌生物墊累積階段期間達成該微生物之總絲狀生質製造之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、或100%。例如，於絲狀真菌生物墊累積階段期間達成該微生物之總絲狀真菌生物墊製造之約50%至約95%。
關於脂質製造階段，脂質係貫穿所有生長階段製造，因為其等對於細胞生長及增殖係所需的；即，脂質係於絲狀真菌生物墊累積階段期間製造。雖然不受限於理論，咸相信一些儲藏脂質係於生物墊生長之較晚階段中製造而其他儲藏脂質係於生物墊形成期間之較早製造。此外，於低氮條件下，該生物體會以較快的速率累積儲藏脂質。
脂質累積階段製造脂質，使得於脂質累積階段期間達成該微生物之總脂質製造之約10%至約95%、約20%至約95%、約30%至約95%、約40%至約95%、或約50%至約95%。於一些例子中，於脂質累積階段期間達成該微生物之總脂質製造之約60%至約95%、約70%至約95%、或約80%至約95%。於其他情況中，脂質累積階段製造脂質，使得於脂質累積階段期間達成該微生物之總脂質製造之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約95%。較佳地，於脂質累積階段期間達成該微生物之總脂質製造之約50%至約95%。
一旦該等脂質係根據本發明製造，可使用種種於所屬技術領域中已知的方法以將該等生物油轉換成脂肪酸之酯以用作為食物或醫藥產品之成分。脂肪酸之酯之製造可包含轉酯化該微生物製造之生物油。脂質自該等微生物之萃取與該等脂質之轉酯化可同時以一步驟方法執行。例如，含有該經分離的真菌品系之培養物可被暴露至促進該等脂質之萃取及該等脂質之轉酯化的條件或處理（或條件或處理之組合）。如此條件或處理包括（但不限於）pH、溫度、壓力、溶劑之存在、水之存在、催化劑或酵素之存在、清潔劑之存在、與物理/機械力。可組合二組條件或處理以產生萃取及轉酯化該等脂質的一步驟方法，其中一組條件或處理有利地促進該等脂質之萃取且另一組條件或處理有利地促進該等脂質之轉酯化，只要可組合該二組條件或處理而不會造成該等脂質之萃取或轉酯化之效率之顯著減低。可對全細胞絲狀生質直接執行水解與轉酯化。
供選擇地，該等脂質之萃取係作為與該等脂質之轉酯化之步驟分開的步驟而執行。如此轉酯化反應係使用酸或鹼催化劑執行。用於將該等生物脂質轉酯化成脂肪酸之酯以用作為食物或醫藥產品之成分的方法包含於存在醇及鹼下反應該等含有三甘油酯的生物油以自該等三甘油酯製造該脂肪酸殘基之酯。
適合用於轉酯化的醇包括任何含有1至6個碳原子的低碳數烷基醇（即C 1-6烷基醇，諸如甲基、乙基、異丙基、丁基、戊基、己基醇與其等之異構物）。無意受限於任何理論，咸相信低碳數烷基醇之使用會製造該脂肪酸殘基之低碳數烷基酯。例如，乙醇之使用會製造乙基酯。若該醇係甲醇或乙醇，所製造之脂肪酸酯分別係該脂肪酸殘基之甲基酯及乙基酯。典型地，該醇包含約5 wt. %至約70 wt. %、約5 wt. %至約60 wt. %、約5%至約50 wt. %、約7 wt. %至約40 wt. %、約9 wt. %至約30 wt. %、或約10 wt. %至約25 wt. %的該脂質組成物、該醇與該鹼之混合物。可將該組成物與該鹼加至純的乙醇或純的甲醇。一般而言，所使用的醇之量可隨著該含有的三甘油酯之脂質或組成物於該醇中的溶解度而改變。
該包含三甘油酯的組成物、該醇與該鹼係於允許從該等脂肪酸殘基及該醇製造酯的溫度下一起反應允許從該等脂肪酸殘基及該醇製造酯的時間。用於製造酯的適合之反應時間與溫度可由所屬技術領域中具有通常知識者決定。無意受限於理論，咸相信該脂肪酸殘基係自該三甘油酯之甘油主鏈切離且各脂肪酸殘基之酯係於反應之步驟期間形成。於存在醇與鹼下反應該組成物之步驟係於以下溫度執行： 約20°C至約140°C、約20°C至約120°C、約20°C至約110°C、約20°C至約100°C、或約20°C至約90°C。供選擇地，於存在醇與鹼下反應該組成物之步驟係於以下溫度下或於大於以下溫度下執行：約20°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°C、105°C、或120°C。取決於所欲的產物，於存在醇與鹼下反應該組成物之步驟係執行共以下時間：約2個小時至約36個小時、約3個小時至約36個小時、約4個小時至約36個小時、約5個小時至約36個小時、或約6個小時至約36個小時。作為替代，於存在醇與鹼下反應該組成物之步驟可被執行以下時間：約0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、10、12、16、20、24、28、32、或36個小時。
反應該脂質組成物、醇與鹼之步驟可藉由回流該組份以製造該等脂肪酸酯（諸如PUFA酯）來實施。反應該脂質組成物之步驟亦可於不會造成該等反應組份之回流之溫度下實現。例如，在大於大氣壓力之壓力下實現反應該脂質組成物之步驟可增加該反應混合物中存在之溶劑之沸點。於如此條件下，該反應可於溶劑會於大氣壓力下沸騰但不會造成該等反應組份之回流的溫度下發生。一般地，該反應係於以下壓力下實施：約5至約20磅每平方英吋（psi）；約7至約15 psi；或約9至約12 psi。一些反應係於以下壓力下實施：7、8、9、10、11、或12 psi。在壓力下實施之反應可於以上所列反應溫度下實現。於壓力下實施之反應可於以下溫度下或於大於以下溫度下實現：約70°C、75°C、80°C、85°C、或90°C。
脂肪酸酯係藉由蒸餾組成物以回收包含脂肪酸之酯的部分來自反應混合物分離。包括所關注的脂肪酸酯的反應混合物之所瞄準的部分可自該反應混合物分離與回收。蒸餾可在真空下執行。無意受限於任何理論，在真空下的蒸餾允許相較於於不存在真空下於較低的溫度下實現蒸餾且因此可預防該等酯之降解。典型的蒸餾溫度範圍在約120°C至約170°C，諸如於以下溫度執行蒸餾：低於約180°C、低於約175°C、低於約70°C、低於約165°C、低於約160°C、低於約155°C、低於約150°C、低於約145°C、低於約140°C、低於約135°C、或低於約130°C。用於真空蒸餾的典型壓力範圍在約0.1 mm Hg至約10 mm Hg，諸如於以下者或大於以下者之真空蒸餾壓力：約0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、或4 mm Hg。
使用自本發明之絲狀真菌物種或品系及/或其子代萃取的脂質以製造生物潤滑劑。用於本文中，術語「生物潤滑劑」係論及藉由使用源自活的或最近為活的生物體之材料製造的潤滑劑。用於本文中，術語「潤滑劑」係論及被引入二個移動的表面之間以減少其等間之摩擦與磨損的物質（在操作條件下通常係流體）。用作為機油的基油一般被美國石油協會分類為礦油（第I、II、與III族）或合成油（第IV及V族）。參見美國石油協會（API）出版物編號09。潤滑劑（呈機油之形式）之單一最大應用之一係保護機動車輛與能源驅動設備中的內燃機。典型地，潤滑劑含有90%基油（最常係石油分餾物，稱為礦油）與少於10%的添加物。蔬菜油或合成液體（諸如氫化聚烯、酯、聚矽氧、氟碳化合物與許多其他者）有時被用作為基油。此等主要係衍生自植物與動物的三甘油酯酯。對於潤滑劑基油用途，衍生自蔬菜的材料係較佳者。常見者包括來自蔬菜的高油性芥花籽油（canola oil）、蓖麻油、棕櫚油、葵花籽油與菜籽油、與來自動物來源的松油。許多蔬菜油往往被水解而產生酸，其隨後被選擇性地組合以形成專家合成酯。
因此，從由本發明之絲狀真菌物種及/或品系及/或其等之子代形成之絲狀真菌生物墊萃取的脂質可用於藉由添加適合的添加物來製造基於酯的生物潤滑劑組成物。製造基於酯的潤滑劑組成物之方法對所屬技術領域中具有通常知識者係已知的。對於非限制性實例，提供一個量的包含三甘油酯之衍生自生物的油並加工其以水解至少三甘油酯之一些並形成自由脂肪酸，其中該脂肪酸係屬於選自由飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、與多不飽和脂肪酸、與其等之組合所組成之群組的類型。該等脂肪酸係按類型分開，使得至少該單不飽和脂肪酸係實質上自該等飽和脂肪酸與該等多不飽和脂肪酸分離。其次，該等單不飽和脂肪酸之至少一些係經修飾以形成酯產物（例如包含三酯），且該等飽和脂肪酸及/或多不飽和脂肪酸之至少一些被加氫以產生烷烴（石臘）。亦應注意於一些實施方式中，如此酯產物可包括以下者之一或多者：單-、二-、與三酯物種、與其等之羥化類似物。 來自絲狀真菌物種及 / 或品系的耐酸性 pH 酵素
蕃茄分化型尖鐮孢菌（ Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）品系4287之基因組最近已被定序且已被顯示帶有各種各樣涉及木質素、半纖維素與纖維素之降解的基因。此外，涉及此等材料之降解的酵素（例如纖維素酶、木糖聚糖酶、木質素酶、葡萄醣醛酸酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯半乳聚糖酶、阿魏酸酯酶、脂酶、果膠酶、葡萄醣聚甘露糖酶、澱粉酶、昆布醣酶、木葡聚糖酶、半乳糖聚糖酶、葡萄醣澱粉酶、果膠酸解離酶、幾丁質酶、外-[3D-葡萄胺糖苷酶、纖維雙糖脫氫酶、與乙醯基木聚糖酯酶、木糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、內葡聚醣酶、[3-葡萄糖苷酶、Mn-過氧化酶、與蟲漆酶）已於尖鐮孢菌品系F3中被廣泛地研究（Xiros等人（2009) Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by a Fusarium oxysporum consolidated system. Biotechnol Biofuels 10:4）。因此，諸如鐮孢菌屬物種與被命名為MK7的嗜酸性絲狀真菌品系的嗜酸性絲狀真菌物種及/或品系，被預期會充分有能力水解諸如木質纖維素材料及廢料流（例如酸乳清）的複雜碳源。咸亦預期因為此等嗜酸性絲狀真菌物種及/或品系能夠於遠較低的pH（0.7-7.5）生長（相較於其他絲狀品系（pH＞2；Starkey, 1973）），用於木質素、半纖維素與纖維素降解之酵素於低pH會具有較高的活性。在酸性條件下具有高活性的酵素會特別有用於在低pH下實施的程序。 由鐮孢菌屬物種製造的毒素。
往往，基於微生物的製造需要使用昂貴且花時間的方法以預防污染。如於以上討論的，絲狀嗜酸性真菌物種及/或品系對導因於其他生物體之污染係高度有抗性的。咸已知（例如）鐮孢菌屬之成員製造毒素（例如伏馬鐮孢菌毒素（fumonisin）），其具有潛在的抗生素、殺昆蟲與植物毒性特性。同樣地，絲狀嗜酸性MK7真菌品系在用於絲狀真菌生物墊之製造時需要添加極少外部抗生素或不需要添加外部抗生素。一些鐮孢菌屬物種可製造九種不同的毒素，而製造取決於其等與不同宿主植物的關係（Marasas等人，1984, Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, ISBN 0271003480）。毒素之製造亦隨著用於發酵的培養基而改變。由鐮孢菌屬物種製造與分泌的毒素包括（但不限於）比卡菌素（bikaverin）、恩鐮孢菌素（enniatin）、鐮孢菌酸、番茄菌肽（lycomarasmin）、串珠鐮孢菌素（moniliformin）、oxysporone、單端孢菌烯（trichothecene）、玉米赤黴烯酮、種種萘醌與蔥醌（例如壬烯酮（nonaketide）萘茜（naphthazarin）醌、比卡菌素與正比卡菌素（norbikaverin）、庚烯酮（heptaketide）、nectriafurone、5-0-甲基爪哇梭黴素、與無水鐮孢菌红素（anhydrofusarubin）内半縮醛）。
此外，來自鐮孢菌屬物種的毒素可包括，4-乙醯氧基藨草鐮孢菌烯二醇（4-Acetoxyscirpenediol）（4-3-乙醯氧基-3,15-二羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯。類似的化合物，單去乙醯基蛇形菌素（monodeacetylanguidin）4-或15-乙醯基藨草鐮孢菌烯三醇）、3-乙醯基去氧雪腐鐮孢菌烯醇（去氧雪腐鐮孢菌烯醇單醋酸酯，3"-乙醯氧基-7",l5-二羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯-8-酮）、8-乙醯基新茄病鐮孢菌烯醇（8-acetylneosolaniol）（新茄病鐮孢菌烯醇單醋酸酯，4",8",15-三乙醯氧基-3"-羥基-l2,13-環氧單端孢菌-9-烯）、4-或15-乙醯基藨草鐮孢菌烯三醇（4-乙醯氧基藨草鐮孢菌烯二醇）、乙醯基T-2毒素（3",4",15-三乙醯氧基-8"-(3-甲基丁醯基(氧)-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、蛇形菌素（二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇）、燕麥鐮孢菌素（Avenacein）、白僵菌素（Beauvericin）、丁烯酸內酯（Butenolide）（4-乙醯胺基-4-羥基-2-丁烯-酸-內酯）、麗赤殼黴素（Calonectrin）（3",15-二乙醯氧基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、15-去乙醯基麗赤殼黴素（15-去-O-乙醯基麗赤殼黴素，3"-乙醯氧基-15-羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、去氧雪腐鐮孢菌烯醇（Rd毒素，嘔吐毒素，3",T',15-三羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯-8-酮）、去氧雪腐鐮孢菌烯醇二醋酸酯（二乙醯基去氧雪腐鐮孢菌烯醇）、去氧雪腐鐮孢菌烯醇單醋酸酯（3-乙醯基去氧雪腐鐮孢菌烯醇）、二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯二醇（7"-羥基二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇）、二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇（蛇形菌素，4,15-二乙醯氧基-3'-羥基12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯三醇（7",8"-二羥基二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇）、二乙醯基去氧雪腐鐮孢菌烯醇（去氧雪腐鐮孢菌烯醇二醋酸酯，3",15-二乙醯氧基-7-羥基12,13-環氧單端孢菌-9-烯-8-酮）、二乙醯基雪腐鐮孢菌烯醇（雪腐鐮孢菌烯醇二醋酸酯，4,15-二乙醯氧基-3',7'二羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯-8-酮）、7”,8"-二羥基二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇（二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯三醇，4,15-二乙醯氧基-3”,7”,8"-三羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、恩鐮孢菌素、產果鐮孢菌素（Fructigenin）、伏馬鐮孢菌毒素B1（1,2,3-丙三甲酸l,-l-[l-(12-胺基-4,9,11-三羥基-2-甲基十三基)-2-(1-甲基戊基)-1,2-乙二基]酯；macrofusine）、鐮孢菌烯酮（Fusarenon）（鐮孢菌烯酮X，鐮孢菌烯酮，單乙醯基雪腐鐮孢菌烯醇，雪腐鐮孢菌烯醇單醋酸酯，4-乙醯氧基-3",7",15-三羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯-8-酮）鐮孢菌酸（萎蔫酸（Fusarinic acid），5-丁醇吡啶甲酸）、萎蔫酸（鐮孢菌酸）、F-2（玉米赤黴烯酮）、HT-2毒素= 15-乙醯氧基-3",4-二羥基-8"-(3-甲基丁醯基氧)-12-環氧單端孢菌-9-烯、7"-羥基-二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇（二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯二醇，4,15-二乙醯氧基-3",7"-二羥基-12,13環氧單端孢菌-9烯）、8"-羥基二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇（新茄病鐮孢菌烯醇）、1,4-甘薯黑疤黴二醇（1,4-Ipomeadiol）（1-(3-呋喃基)-1,4-戊二醇）、甘薯黑疤黴二酮（1-(3-呋喃基)-l,4-戊二酮）、1-甘薯黑疤黴醇（Ipomeanol）（1-(3-呋喃基)-1-羥基-4-戊酮）、4-甘薯黑疤黴醇（l-(3-呋喃基)-4-羥基4戊酮）、Lateritin、番茄菌肽、串珠鐮孢菌素（1-羥基環丁-1-烯-3,4-二酮之鉀或鈉鹽）、單乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇（15-乙醯氧基-3",4"-二羥基-12,13-環氧單端孢菌-9烯）、單乙醯基雪腐鐮孢菌烯醇（鐮孢菌烯酮X）、單去乙醯基蛇形菌素（4-乙醯氧基藨草鐮孢菌烯二醇）、新茄病鐮孢菌烯醇（8"-羥基二乙醯氧基藨草鐮孢菌烯醇，4,15-二乙醯氧基-3"8"-二羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、新茄病鐮孢菌烯醇醋酸酯（8-乙醯基新茄病鐮孢菌烯醇）、新茄病鐮孢菌烯醇單醋酸酯（8-乙醯基新茄病鐮孢菌烯醇）、雪腐鐮孢菌烯醇（3",4",7",15"-四羥基-12,13-環氧-單端孢菌-9-烯-8-酮）、雪腐鐮孢菌烯醇二醋酸酯（二乙醯基雪腐鐮孢菌烯醇）、雪腐鐮孢菌烯醇單醋酸酯（鐮孢菌烯酮X）、NT-1毒素（T-1毒素，4",8"-二乙醯氧基-3",15-二羥基-12,13-環氧-單端孢菌-9-烯）、NT-2毒素（4"-乙醯氧基-3",8",15-三羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、Rd毒素（去氧雪腐鐮孢菌烯醇）、接骨木鐮菌素（Sambucynin）、藨草鐮孢菌烯三醇（3",4",l5"-三羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、Solaniol（新茄病鐮孢菌烯醇）、T-1毒素（NT-1毒素）、T-2毒素（4",15"-二乙醯氧基-3"-羥基-8"-(3-甲基丁醯基氧)-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、三乙醯氧基-藨草鐮孢菌烯二醇（4",8",15"-三乙醯氧基-3",7"-二羥基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、三乙醯氧基-藨草鐮孢菌烯醇（3",4",l5"-三乙醯氧基-12,13-環氧單端孢菌-9-烯）、嘔吐毒素（去氧雪腐鐮孢菌烯醇）、爪哇鐮菌素（Yavanicin）、玉米赤黴烯醇（Zearalenol）（2,4-二羥基-6-(6,10-二羥基-反式-l-十一烯基)-苯甲酸-內酯）、玉米赤黴烯酮（6-(10-羥基-6-側氧基-反式-l-十一烯基)-雷鎖酸內酯）。更多由尖鐮孢菌製造的毒素之細節係於以下者中描述：Tatum等人（Naphthoquinones produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1985, Phytochemistry 24:457-459）、Tatum等人（Naphthofurans produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1987, Phytochemistry, 26:2499-2500）、Baker等人（Novel anthraquinones from stationary cultures of Fusarium oxysporum. 1998, J Ferment Bioeng 85:359-361）。Thrane（Fusarium species on their specific profiles of secondary metabolites, in Fusarium. Mycotoxins, taxonomy and pathogenicity, 1989，由Chelkowski J編輯，Elsevier, NY, USA, pp 199-225）；Baker等人，Antimicrobial activity of naphthoquinones from Fusaria, Mycopathologia 111: 9-15, 1990；Marasas等人（Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, 1984，賓州州立大學出版社，University Park, PA, USA），其等中之每一者係為了所有目的以其整體以引用方式納入。
本發明進一步藉由以下實施例闡明，該等實施例不應理解成限制性。本申請案各處引用之所有參考文獻、專利案、與公開專利申請案之內容（以及圖式與序列表）係為了所有目的以其等之整體以引用方式併入本文中。 實施例 實施例 1 ：天然環境中的品系 MK7
天然存在的品系MK7於自然中總是與藻類、古菌及細菌連結且特徵在於小於0.5 g乾燥生質/L泉水的平均密度（圖1）。此外，MK7於自然中以「流線（streamer）」形式存在。Purcell等人定義「流線」如下：「流線係絲狀及其他細胞形態之浸沉聚集物，其自一個接附點伸入流動的水中」（Purcell等人(2007) FEMS Microbiology Ecology7 60:456-466）。以總流線生質之百分比計，品系MK7係小於10%。此外，於自然中品系MK7生質特徵在於大於30%呈巨分生胞子細胞的生質，其從未在由本文之揭示內容中概述的方法製造的表面發酵生物墊中找到。 實施例 2 ：人工培養基之製備
用於以下程序中的MK7-1液體培養基係藉由以下者製備：將於表1A中所列的成分加至去離子水（18.2 Mohm），溫度介於22-30°C，接著將pH調整至2.8，以13 N HCl將pH調低。使用Oakton儀器型號150 pH計量器與探針（奧倫吉堡，NY）測量pH。接著使培養基沸騰共20分鐘並在使用前允許其冷卻至室溫（~23°C）。緊接著添加液體培養基前，再次使用Oakton儀器150 pH計量器與探針檢查pH並調整回pH 2.8，若需要。
MK7-3液體培養基係以相同的方式使用於表1B中所列的成分製備。
於一些實施方式中，所使用的碳源並非甘油，但可選自種種其他碳源，諸如糖、甘油、木質纖維素材料、木質纖維素材料之水解產物、都市或農業廢棄物、食物加工廢棄物（例如酸乳清）、工業廢料流產物、馬鈴薯廢棄物（馬鈴薯皮、由降解產生的馬鈴薯拋棄物、馬鈴薯切下物、受傷的馬鈴薯）、澱粉廢棄物、甜菜廢棄物、甜菜渣、來自玉米加工的廢棄物（即玉米浸液）、來自生質燃料之製造的廢棄物（來自纖維素乙醇製造之殘渣、無氧性消化產物、等等）。於該等例子中，調整培養基以適應來自所使用的碳源之養分之貢獻。例如，若該碳源係糖蜜、酸乳清、或木質織維素，所需要的微量元素可能會部分或完全由該碳源提供且可能僅僅需要將主要營養物質加至培養基。於其他實施方式中，該碳源可被分類為「食品級」。於此等實施例中，不會預期有與該碳源相連的微量元素及主要營養物質且因此必須添加所有微量元素及主要營養物質。 表 1A. 用於接種體產生的 MK7-1 培養基之成分。 MK7-1 培養基
   液體 培養盤            
   (g/L) (g/L) 等級 批次 # 賣方 位置
NH4NO3 12.9 3 ACS 144801A Fisher 沃爾珊，MA
尿素 4.3 0.3 ACS A0355726 ACROS 薩莫維，NJ
KH2PO4 10 2 試劑    Eiser- Golden   
CaCl2•2H20 2.6 0.4 ACS 53H0276 Sigma 聖路易，MO
MgSO4•7H2O 2 0.3 實驗室 5GJ15040920A Fisher 沃爾珊，MA
酵母菌萃取物 2 0            
瓊脂 0 15 工業 5287994 Fisher 沃爾珊，MA
甘油 75 60 食品 4O19410427A Duda Energy 第開特，AL
                    
微量營養素 * mg/L mg/L         
FeSO4•7H2O 9.98 4.99 ACS 3562C398 Amresco 索倫，OH
ZnSO4•7H2O 4.4 2.2 USP/FCC 61641 Fisher 沃爾珊，MA
MnCl2•4H2O 1.01 0.51    13446-34-9 Fisher 沃爾珊，MA
CoCl2•6H2O 0.32 0.16    7791-13-1 Fisher 沃爾珊，MA
CuSO4•5H2O (NH4)6Mo7O24•4 0.31 0.16 工業 114675 Fisher 沃爾珊，MA
H2O 0.22 0.11 ACS 68H0004 Sigma 聖路易，MO
H3BO3 0.23 0.11 ACS 103289 Fisher 沃爾珊，MA
EDTA，自由酸 78.52 39.3 電泳 46187 Fisher 沃爾珊，MA
                    
   pH pH            
HCl 2.8 4.8 ACS 5GK251022 Fisher 沃爾珊，MA
表 1B. MK7-3 培養基中之成分。 MK7-3 培養基
液體
（ g/L ） 等級 批次 # 賣方 位置
                    
尿素 8.4    ACS A0355726 ACROS 薩莫維，NJ
KH2PO4 10    試劑    Eiser- Golden   
CaCl2•2H20 2.6    ACS 53H0276 Sigma 聖路易，MO
MgSO4•7H2O 2    實驗室 5GJ15040920A Fisher 沃爾珊，MA
酵母菌萃取物 2               
瓊脂 0    工業 5287994 Fisher 沃爾珊，MA
甘油 75    食品 4O19410427A Duda Energy 第開特，AL
                    
微量營養素 * mg/L               
FeSO4•7H2O 9.98    ACS 3562C398 Amresco 索倫，OH
ZnSO4•7H2O 4.4    USP/FCC 61641 Fisher 沃爾珊，MA
MnCl2•4H2O 1.01       13446-34-9 Fisher 沃爾珊，MA
CoCl2•6H2O 0.32       7791-13-1 Fisher 沃爾珊，MA
CuSO4•5H2O (NH4)6Mo7O24•4 0.31    工業 114675 Fisher 沃爾珊，MA
H2O 0.22    ACS 68H0004 Sigma 聖路易，MO
H3BO3 0.23    ACS 103289 Fisher 沃爾珊，MA
EDTA，自由酸 78.52    電泳 46187 Fisher 沃爾珊，MA
                    
   pH               
HCl 2.8    ACS 5GK251022 Fisher 沃爾珊，MA
實施例 3 ：接種程序
於10 L生物反應器中在浸沉發酵條件下於MK7-1液態培養基中生長欲用於盤之接種的培養物。應注意可使用其他生物反應器大小且選擇10 L反應器大小不應被理解成限制性。該10 L反應器係以直徑10.16 cm之透明PVC管之1.3 m長的節段建構，其於底部具有PVC末端蓋子。具有3 mm孔口的塑膠通風口/接頭被接附至底部末端蓋子且供給空氣的桶材被接附至該通風口。塑膠取樣口/閥被接附至透明PVC壁之由該底部末端蓋子之底部往上15 cm的側面。該透明PVC反應器之頂部係以無菌紗布覆蓋，而該無菌紗布係藉由鬆弛地安裝的PVC末端蓋子固定，而該蓋子具有3 mm孔洞以允許氣體自該反應器離開。組裝好的生物反應器係於圖2中顯示。
用於該10 L生物反應器的接種體係自絲狀嗜酸性MK7真菌品系之經歸檔培養儲備物（批次# 003）製備。該經歸檔儲備培養物係由在含有由以下者構成的固體培養基之無菌Petri皿上生長的絲狀嗜酸性MK 7真菌品系菌絲體墊組成：1.5%瓊脂（BD Difco粒化瓊脂、批次# 5287994，ThermoFisher，沃爾珊，MA）、甘油與如於表1針對MK7-1培養盤培養基描述的無機養分。該瓊脂培養基係藉由以下者製備：沸騰共20分鐘，允許該培養基冷卻至50˚C，並接著將25 mL的該溶液倒入無菌Petri盤中。在冷卻與固化後，該培養盤係使用第二代經歸檔冷藏儲備物接種，而此係藉由使用無菌環（於火焰中加熱至赤熱並冷卻）以自經歸檔儲備物收集樣本並在該Petri培養盤上以樣本塗痕（圖3A）。
於生長5日後，菌絲體墊完全生長到覆蓋該瓊脂培養基之表面（圖3B）。接著於-80˚C下冷凍該培養物。於接種該10 L反應器前五日前，自冷藏器移出Petri培養盤儲備物並允許其平衡至室溫（~23˚C）共2個小時。生長在該瓊脂之表面上的菌絲體墊接著係以無菌鑷子（鑷子係以火焰加熱至赤熱並以異丙醇冷卻）移出並放置入於以無菌紗布織物覆蓋的無菌1 L玻璃擋板搖動燒瓶中之350 mL的無菌MK7-1液態培養基中。於VWR OS-500實驗室搖動器（VWR，拉德諾，PA）上以200 rpm轉動燒瓶共5日，之後將其用作為用於該10 L生物反應器之接種體。
為準備接受該接種體，將該10 L生物反應器藉由以下者滅菌：將330 mL的濃縮次氯酸鈉溶液（Chlorox®漂白水= 8.25%次氯酸鈉）加至於該生物反應器中之11 L的飲用品質自來水並使其平衡共二日。於二日後，將另外330 mL的濃縮次氯酸鈉溶液加至該反應器。於一日後，自該反應器將經稀釋的次氯酸鈉溶液完全排掉並藉由添加2 L的熱水並旋轉以漂洗該生物反應器內的所有表面來以~80˚C經沸騰水漂洗該反應器。接著排掉漂洗水。將3.5 L的無菌MK7-1液態培養基加至該生物反應器並以無菌空氣（經0.2 um過濾）以400 mL每分鐘之速率通過位於該反應器之底部的通風口起泡。此等起泡條件產生大小範圍在直徑為3至30 mm的泡泡且造成於生長期間於液態培養基（浮游性細胞）各處之真菌細胞之混合與均質分佈。實驗已顯示較高的起泡速率或較小的泡泡大小造成形成黏在該生物反應器中之表面上的生質之團塊的生物薄膜生長習性。生物薄膜生長習性因此並非所欲的，因為對於該盤式反應器之接種而言細胞之均質懸浮係所欲的。接著使用無菌技術（在打開該生物反應器之頂部前以70%異丙醇/30%水噴灑所有靠近的外表面且不觸碰該生物反應器之任何內表面）將於該1 L搖動燒瓶中生長的接種體加至該10 L反應器。為了於該10 L反應器中建立另外的培養體積，於培養物達到6 g/L乾燥絲狀生質密度後將無菌新鮮MK7-1液態培養基加至該反應器。若欲將新鮮MK7-1液態培養基加至該反應器，體積應為不大於該反應器中之液態培養物體積之9倍。乾燥絲狀生質係藉由以下者測量：在通風系統運作同時通過在該生物反應器上之側口收集樣本，並使用真空過濾設備（Millipore，Cat# WP6111560、XX1004700、XX1004705, Darmstat，德國）通過0.22 um過濾器（Millipore，Cat# GSWP04700, Darmstat，德國）過濾已知體積。於50˚C下在Benchmark Scientific Incu-Shaker Mini（愛迪生，NJ）中乾燥預秤重的過濾器加上潮濕的絲狀生質共4 h並接著在Mettler Toledo天平型號MS3035（哥倫布，OH）上秤重。
絲狀嗜酸性MK7真菌品系於該10 L反應器中具有約0.024 h -1之比生長速率（圖4）且於指數期期間的生長會按照以下方程式： （方程式1）                    x=x oexp µt其中x係最終生質，x o係最初生質，µ係比生長速率，且t係時間。為用作為該盤式反應器中的接種體，於該10 L反應器中的培養細胞密度應係高於6 g/L乾重且於晚期指數生長期（圖4；指數生長係在細胞數目連續倍增時的培養中之生長的時期；晚期指數生長係緊接著指數生長之停止之前在細胞生長速率開始下跌時的時期）。若將有較低細胞密度的培養基用於接種體，其會造成明顯較低的生物墊形成（比2日長的遲滯期）且因此非係所欲的。
接種體於本文中定義成實質上由浮游性細胞構成，而浮游性細胞被定義成不集結成塊或聚集在一起且係寬度約4微米而長度約5-20 微米的單個細胞。
為接種表面盤式反應器以用於表面發酵或固態基質表面發酵，於藉由起泡連續地混合同時自該10 L反應器通過靠近該反應器之底部的口移出液態培養物。以無菌方式藉由以下者移出欲用於接種體的培養物：以70%異丙醇/30%去離子水混合物噴灑該口之內部，接著打開閥以允許約25 mL的培養物被排出並因此漂洗該閥。此廢棄接種體培養物被丟棄。該接種體培養物被直接加至該盤式反應器培養基，如於實施例3中描述的。 實施例 4 ：品系 MK7 於盤式反應器中透過表面發酵的生長。
絲狀嗜酸性MK 7真菌品系，係生長於淺盤式反應器中。應注意就本發明之教示而言可使用不同的盤大小。於此實施例中，聚乙烯盤之內部尺寸係寬41.27 cm而長61.28 cm且側壁高2.54 cm（可用於墊子生長的總表面積= 0.253 m 2；圖5；Winco，愛達荷弗斯，ID）。以下者係所欲的：於使用前清除盤上之碎片與化學品以及滅菌以最小化潛在的污染。因此，於使用前，將該等盤以肥皂與溫飲用品質自來水（50 – 70 C）徹底洗滌，以溫自來水徹底漂洗共1分鐘，並確認所有肥皂殘渣皆被移除。此之後為以70%異丙醇/30%去離子水（18.2 Mohm）之溶液噴灑該等盤之所有表面直到所有表面皆濕潤並以戴手套的手使用浸泡在該醇混合物中的紙巾擦拭該等盤。接著將盤放置在架子系統內以使得該盤可接受並容納液態培養基（於以下描述）而不散出並允許其乾燥。
此處描述的用於表面發酵程序之盤與架子系統提供所有對形成生物墊而言係必要的組份並使該生物墊之快速生長成為可能。用於支承該等反應盤的架子系統係購自Global Equipment Company（芝加哥，IL）的鍍鉻鋼39盤架（圖5A、B）。使用16英吋寬的透明塑膠類Saran®保鮮膜（好市多，波司曼，MT）包裹並圍住該架子系統、並將該等盤自周圍的空間分離。此使環境條件（濕度、氣流）之控制成為可能並最小化污染（圖5A、B）。使經加濕無菌空氣藉由起泡通過200 mL的去離子水（18.2 Mohm）以800 mL/分鐘之速率吹入被圍住的架子中，水溫度為22 -30°C（以加濕空氣）且通過經高壓蒸氣滅菌的0.2 um過濾器（Millipore，Cat# SLFG85000, Darmstat，德國）以移除微生物。理想地，空氣流動之速率係使得其於該架子系統中產生輕微的正壓（＞0.1 psi），藉此最小化進入被圍住的盤與架子系統之帶有污染物的空氣之量直到該生物墊達到所欲的密度及/或黏稠度。
儘管該微生物墊有活性，細胞在呼吸；即，製造二氧化碳與熱，以及消耗氧。累積二氧化碳可減少氧之可用性且應被限制。因此，空氣流動應使得其沖掉於微生物呼吸期間製造與累積的二氧化碳。此外，空氣流動應使得其移除於微生物呼吸期間產生之過量的熱並對呼吸中之細胞提供適當的氧。應調整空氣流動以滿足此等需求。例如，由於需求隨著使用數目較大的盤而增加，應增加空氣流動以滿足增加的溫度與大氣需求。空氣流動不應強到足以擾亂真菌菌絲並抑制其等之生長與發揮功能。理想地，於盤系統中，空氣流動會造成橫越該等盤的氣流。於一個實施方式中，空氣流動可利用使空氣通過0.2 um過濾器並橫越該等墊子的風扇產生。該風扇之速度以及所產生的氣流可基於置於該架子中的溫度、二氧化碳與氧感應器藉由智慧型感應器/致動系統控制。
於生長期間該盤系統之溫度範圍在25° ± 2°C。溫度係使用ThermoScientific Genesys 10S Series, Biomat 3S, Evolution 60S軟體與感應器系統（Thermo Fisher.沃爾珊，MA）測量。該等熱電偶感應器被放置在該盤架系統中高處內部20mm與該盤架系統之頂部。
MK7-1培養基如於實施例2中描述地製備（養分之添加、pH調整、沸騰與冷卻至室溫（~23°C）]。於培養基製備後，獲得來自接種體反應器的接種體培養物（參見實施例3）並於一個罐子中以該MK7-1培養基之7.5%（體積對體積）之比率添加。例如，將113 mL的接種體加至於該罐子中的1.5 L之培養基。此接種體對培養基之比率提供用於該等細胞之快速生長與墊子形成的適當的條件。於此實施方式中，所欲的新鮮培養基之接種後的乾燥細胞絲狀生質係0.45至0.75 g/L。然而，可能可使用範圍在0.01至100g/L的密度以於本案之盤系統中成功地產生生物墊。減少該接種體對培養基之比率造成較慢的生長，如於實施例3中描述的。
與培養基之體積相比的碳基質之體積衝擊所造成的生質製造之速率。一般而言，當以上提及的比率太小時，該生長速率由於可用的碳之缺乏而減緩；即，其等變得碳受限的。當以上提及的比率太大時，所產生的滲透壓變得過大且生質生長速率減低。此外，當碳受限時，所產生的生質密度與生質黏著性係小的，藉此減小由表面發酵程序提供的處理與操作優勢。例如，被命名為MK7之絲狀真菌品系在以上提及的比率係介於8 – 15%時具有最理想的生長條件。
該培養基/細胞懸浮液係使用無菌大型塑膠湯匙（30 cm長，藉由以該醇混合物漂洗來滅菌）混合並將1.5 L的所產生之混合物使用無菌（以該醇混合物漂洗）量筒加至各盤。在將所有的盤皆裝載至該架子系統中後，以該透明塑膠包裹該架子系統。
於培養6日後，所得的生物墊係3至10 mm厚且有足夠的抗張力與結構上的完整性 以使得其等可被搬動而不被撕裂（圖6）。該生物墊係藉由首先移除包裹該架子系統的透明塑膠並自該架子移出該等盤來收穫。生物墊係用手從該等盤移出，放置在12.7 x 23 cm Pyrex玻璃盤中並以飲用品質自來水溫柔地漂洗共二分鐘。經漂洗的生物墊被留在玻璃盤並乾燥或置於3.7 L塑膠袋中並冷凍。為乾燥，將該等生物墊放置於溫度受控制的烘箱中並於60° ± 1°C下加熱共45分鐘以去活化該墊子內的許多酵素並限制生物化學轉換，接著於50° ± 1°C下加熱直到其乾重不改變（大約48 -72個小時）。在以上的條件下製造的生物墊之平均乾重對於絲狀嗜酸性MK7真菌品系而言係81 g乾燥絲狀生質每盤。此相等於54 g/L、324 g/m 2表面積與0.37 g/L/小時的生產率。未經乾燥的生物墊之平均含水量係0.17乾燥絲狀生質/g或83%液體。
於盤中的細胞生長典型係根據於圖7中顯示的生長曲線發生。細胞以浮游性（於該培養基各處之均質/均勻地分佈的細胞）狀態生長直到生長之約48個小時。於48個小時後，該等細胞於該培養基之表面聚集且開始形成生物薄膜；換言之，於其中細胞糾纏黏並在一起的微生物墊。該墊子一開始係非常薄的薄層，但繼續快速生長直到諸如缺乏碳基質或其他養分的一些限制性因子限制生長。
由於該生物墊對擾動之敏感性與隨之發生的生長之下跌，重要的是於整個生長期間盤維持不受擾動且該生物墊之完整性被維持。衝擊該生物墊的擾動包括該盤之過份搖動、對該墊子施加壓力、將液體施加至該生物墊之表面、橫越該生物墊的快速氣流、菌絲之擾動、斷裂或壓縮、或該墊子本身之物理中斷。此等類型的擾動造成生長生物墊之優勢（其等包括每液體體積與表面積的快速生長速率與高絲狀生質累積）之喪失。
假設氣生菌絲與菌絲體在整個生物墊中於供給氧以用於細胞之呼吸扮演重要的角色。因此，氣生菌絲/菌絲體之形成、生長與發揮功能對於該生物墊之快速生長係重要的。因此，任何衝擊此等菌絲/菌絲體之形成或生長的擾動皆會造成生物墊生長之下跌。
以上描述的表面發酵方法與培養基提供所有對於形成生物墊而言係必要的組份並使快速生長成為可能。使用以上概念測試各種各樣的盤系統且獲得幾乎相等的每單位面積生產率。例如，使用7.5%甘油及10:1 C：N比率，隨著該等生物反應器之表面積從0.02增至1 m 2，生產率於生長期期間維持固定在約44 g/m 2/d。 實施例 5 ：盤大小對絲狀真菌生物墊生長與生產率之功效
為測試盤大小對生物墊生長及生產率的功效，將品系MK7絲狀真菌生物墊在於0.02 m 2Pyrex®玻璃盤、0.25 m 2聚丙烯盤與1.77 m 2塑膠襯裡盤中的MK7-1培養基上利用7.5%甘油生長。對於所有處理，液態培養基體積對表面積比率皆為6 L/m 2。生長速率僅被盤大小最低限度地影響且於6日後觀察到線性生長速率（圖8）。對於0.02、0.25、與1.77 m 2盤，乾燥生質生產率分別係1.32、1.54、與1.57 /m 2/h。 實施例 6 ：於不同的培養基上之品系 MK7 之生長
絲狀嗜酸性MK7真菌品系生長特性之生長特性（即生長速率、細胞密度、基質轉換效率、墊子形成）隨著生長培養基之選擇與該等培養物是否於在SSF/浸沉發酵或SSSF/表面發酵條件下生長而劇烈變化。絲狀嗜酸性MK7真菌品系被培養在歷史性（2009年5月至2012年1月）培養基MK7A上，該培養基最初被設計成模擬該生物體於黃石國家公園中的天然環境中找到的化學性質但有增加的氮、磷、鈣與鎂濃度以符合已發現對其他絲狀真菌有益的養分來源（表2；MK7A）。開發MK7-1培養基以增強並改善絲狀嗜酸性MK7真菌品系生長特性，特別係關於透過表面發酵的墊子形成（表2）。具體言之，增加磷酸鹽、鈣與鎂及氮並添加額外的氮源（尿素）。增加鈣、鎂與添加尿素特別增加生長速率並增加墊子形成。
表 2.歷史性培養基MK7A（浸沉發酵）之化學組份，與針對透過表面發酵的高密度絲狀生質形成而設計之經修飾MK7-1比較。
Figure 02_image001
使用MK7A培養基的最初實驗係專門於搖動燒瓶中在浸沉發酵條件下完成。最大生長速率、轉換效率（轉換成絲狀生質之g碳基質）與於此等條件下製造的最高絲狀生質分別係0.072 g/L/h；22%；與8.6 g/L（表3）。
表 3.絲狀嗜酸性MK7真菌品系於各種各樣的條件下之生長特性。
生物反應器 碳源 平均生長速率（ g/L/hr ） 最大所製造生質 g/L 最大所製造生質 g/m 2 生質製造速率 g/m 2/ 日 最大所製造生質（日） 轉換效率
經浸沉-經通氣 4%葡萄糖基本 0.072 8.6       5 22%
經浸沉-經通氣 4%葡萄糖MK7-1 0.126 15.1       5 38%
經浸沉-經通氣 7.5%甘油MK7-1 0.28 24.1 23       31%
0.02m 2盤- 100 ml 4%葡萄糖MK7-1 0.135 19.5 110 18.3 6 49%
0.02m 2盤- 100 ml 12.5%甘油MK7-1 0.44 64.7 324 52.9 6 52%
0.25m 2盤- 1.25L 12.5%甘油MK7-1 0.46 66.2 331 55.2 6 53%
為增加細胞密度，連結表面發酵條件利用MK7A培養基。生物墊係於介於4-15%之碳濃度下利用葡萄糖或蔗糖形成及於4-30%之碳濃度下利用甘油形成。發現尿素會於表面發酵條件中增加製造之速率且NH 4NO 3、NH 4PO 4、NH 4SO 4係NH 4之替代性來源。尿素之添加相較於其他NH 4來源具有較不昂貴的市價之利益。發現12.5%碳基質對於增加絲狀生質密度至至高達180 g/L（生物墊自盤移出後的密度）與使生長速率理想化而言係理想的。
利用表面發酵及MK7-1培養基製造的高密度生物墊相較浸沉發酵條件（使用任一培養基）具有一些包括以下者的優勢：(1)至高180 g/L之增加的絲狀生質密度（生物墊自盤移出後的密度），相較於利用浸沉發酵之24.1 g/L的最大值（表3）、(2)至高0.46 g/L/h之增加的生長速率，相較於在浸沉條件下0.28 g/L/hr的最大速率、(3)對於最大生長速率而言7.5至12.5%之增加的碳原料之密度、(4)對於絲狀生質而言遠較簡單之收穫條件，特別是於高密度絲狀生質被製造時（例如不需要離心）、(5)不需要通氣該絲狀生質，相較於用於浸沉發酵的大型複雜通氣生物反應器(6)遠更可擴充與擴展以使用表面盤系統，相較於非常大型的商用浸沉發酵器(7)較少液體廢棄物。
減少C：N比率至＜10:1對於絲狀生質製造而言亦係高度有益的且增加蛋白質相對脂質之水平。歷史上地，MK7A培養基被設計來用來藉由絲狀嗜酸性MK7真菌品系製造脂質，特別係於高於30:1的C：N比率。改變C：N比率以及培養條件允許將絲狀嗜酸性MK7真菌品系生質中的脂質濃度修改成生質之重量之5至至高60%之間。絲狀生質之脂肪酸輪廓於使用種種簡單碳基質（例如甘油、葡萄糖、蔗糖）時在MK7A與MK7-1培養基間非常類似，但發現溫度會增加多不飽和脂肪酸之濃度而ω-3次亞麻油酸於較低的相對溫度下隨著時間而增加（圖9）。 實施例 7. 在 MK7A 與 MK7-1 培養基上品系 MK7 之生長。
品系MK7絲狀真菌生物墊係在表面發酵條件下使用MK7A與MK7-1培養基利用蔗糖或甘油作為碳源（原料）來製造。為評估從MK7A與MK7-1培養基製造的絲狀真菌生物墊，準備五個不同的培養基配方：1) 4%蔗糖，於MK7A培養基中、2) 4%蔗糖，於MK7-1培養基中、3) 4%甘油，於MK7A培養基中、4) 10%甘油，於MK7-1培養基中、與5) 12.5%甘油，於MK7-1培養基中。五種培養基配方之pH皆使用濃HCl之適當添加調整至2.7接著沸騰共10分鐘。於冷卻至室溫（~ 23 °C）後，將7.5%體積/體積處於指數生長期的品系MK7接種體加至各個培養基。將pH再調整至2.7並將經接種的培養基之250 mL等分試樣加至經消毒0.023 m 2Pyrex®玻璃盤。接著將該等盤放置於盤架系統中並允許具有接種體的培養基之混合物於23° ± 1°C下培養。
基於來自先前的實驗之結果，預期到生質會在該培養基組合之每一者上形成。亦預期到生質會在MK7A培養基上更快形成（相對於MK7-1培養基）。此係由於MK7A培養基更適於生長的化學條件（例如較低的離子強度/滲透壓、較低的銨濃度）。然而，隨著時間過去，在MK7-1培養基之表面上發展的絲狀真菌生物墊會以較快的生長速率生長（相較於在MK7A培養基上生長的生質）。即，兩個系統皆具有不同的生長速率曲線，而MK7-1培養基於早期階段展現快速生長接著為於較晚階段生長速率減低。相反地，在MK7-1培養基上生長的絲狀真菌生物墊於早期生長階段最初具有相對低的生長速率接著於較晚的生質生長之階段有極快速的生長速率。最終，在MK7-1培養基上生長的絲狀真菌生物墊變得較厚且具有較大的抗張力（相較於在MK7A培養基上生長的生物墊）。預期到於MK7A培養基中養分之明顯較低的濃度（例如N、P、K）會導致早期養分限制，造成生長抑制以及不如在MK7-1培養基上製造的生物墊厚或強壯的生物墊。 實施例 8 ：由品系 MK7 製造的生物墊之結構
該生物墊之結構係藉由透射光顯微鏡測定。此處，生物墊係自在MK7-1培養基上利用7.5%甘油生長共5日的品系MK7製造。收穫生物墊，冷凍（-20°C）、與切成1cm x 1cm正方形塊，之後於冷凍模具（VWR 25608-916，拉德諾，PA）中嵌進10%明膠（Sigma G2500-3000 Bloom明膠，Sigma-Aldrich，聖路易，MO）中。藉由使該冷凍模具暴露至液體氮浴之蒸汽相快速冷凍該明膠/組織樣本，之後置於-20°C下過夜。
使用Leica型號39475214冷凍切片機（Leica，威次拉爾，德國）實現冷凍切片。自該等冷凍模具移出樣本並以OTC組織冷凍培養基（Leica 14020108926）塗覆其等，之後冷凍切片成10-50 μm厚的切片。使用透射光顯微鏡（顯微鏡：Zeiss AxioObserver；相機：Zeiss AxioCam HRc, Carl Zeiss, Oberkochen，德國）顯像與造像樣本切片。
利用甘油墊，觀察到至少二個不同的層：(a)緻密底層與(b)氣生菌絲層。於一些樣本中，可看見至少三個結構上不同的層：(a)緻密底層、(b)氣生菌絲層與(c)過渡帶層（參見圖10A與B）。典型地，氣生菌絲層係看得見地最佔優勢的，接著為緻密底層，而過渡帶層（當存在及/或可看見時）係最小的。於一些實施例中，例如於圖10A中顯示的生物墊，(a)緻密底層對(b)氣生菌絲層對(c)過渡帶層之可看見的比率係約3.86比約9.43比約1。於另一個樣本中，諸如於圖18B中顯示的生物墊，該比率係約1.7比約3.7比約1。圖18C中並無明顯看得見的可區分的過渡帶層。
MK7-3生長生物墊之另外的光學造像指出頂部氣生菌絲層中不存在脂質或色素（相較於緻密底層）（圖11A與11B）。發現氣生菌絲自該墊子延伸且各自暴露至大氣而菌絲間無液體。此將其等自該墊子之其他層中的菌絲/菌絲體區分開來，而其等係由液體及/或細胞外多醣/蛋白質基質分開。氣生菌絲負責氧轉運與CO2轉運。氧可接近性造成頂部氣生菌絲層中的氧吸收菌絲。此等氣生菌絲似乎比下面的墊子層中找到的菌絲/菌絲體長（比較圖11B與圖11C）。頂層之氣生菌絲亦傾向主要具有垂直方向，即其等之方向傾向與絲狀真菌生物墊空氣介面垂直。
垂直方向於緻密底層之菌絲中沒那麼顯著（圖11C）。此處，菌絲傾向糾纏且具有混雜的方向且主要具有水平方向。底層之菌絲亦似乎含有紫色色素，其於頂部氣生層中不明顯。初步實驗指出底層含有大約30%脂質且菌絲被嵌進蛋白質及/或多醣基質中。底層菌絲亦係色素、脂質、碳水化合物、與蛋白質之主要儲藏區域。
自在(1) MK7-1培養基與(2) MK7-3培養基上的品系MK7生長製造的生物墊，係於5日後收穫並於20°C冷凍。兩種生物墊之厚度範圍皆在2至4 mm。自該二個冷凍生物墊切下三重複之一cm 2正方形切片並接著緯向地切成兩半，產生上半與下半截面，各大約1.5 mm厚。\
於MK7-1培養基中生長的生物墊之平均密度對於頂部緯向切片而言係0.131 g/cm 3（標準差= 0.068）且對於底部緯向切片而言係0.311 g/cm 3（標準差= 0.032）。頂部對底部密度之比率係0.42。
對於在MK7-3培養基中生長的生物墊而言，頂部緯向切片之平均密度係0.102 g/cm 3（標準差= 0.048）而底部緯向切片之平均密度係0.256 g/cm 3（標準差= 0.010。頂部對底部密度之比率係0.40。 實施例 9 ：由品系 MK7 製造的生物墊之抗張力
評估在MK7-3培養基上生長共5日的MK7生物墊之抗張力。此處，使用寬25.4 cm、長46 cm、厚3.5 mm的墊子。該墊子之水含量係約85%，等同於大約15%乾重。總乾重係70 g/0.25m 2盤或280 g/m 2。該墊子具有0.08 g/cm 3的密度。
為測量抗張力，將該墊子之一端夾在固定的位置而另一端夾在可自由移動的裝置。該可自由移動的裝置本身係接附至測量所施加的拉力之刻度尺。藉由於許多秒的期間拉該刻度尺直到該墊子斷裂來將穩定且緩慢的拉力施加至該墊子。所測量的斷裂/扯裂/撕裂該墊子所需之拉力範圍在0.28 kg/2.54 cm之墊寬度至0.58 kg/2.54 cm之墊寬度，其等於0.11 kg/cm之墊寬度至0.23 kg/cm之墊寬度。平均值係0.5 kg/2.54 cm墊寬度，或0.2 kg/cm墊寬度。 實施例 10 ：品系 MK7 生物墊在粗甘油上的生長。
緻密品系MK7生物墊係於8日中使用粗甘油作為碳及養分來源（原料）而製造。粗甘油（一種生物柴油製造之副產物）係從W-2 Fuels（產品代碼GL32000，批次4300，CAS編號56-81-5，亞得里安，MI）獲得。該粗甘油係由75-85%甘油、2-10%水、2-5%鹽、1-2%脂肪、油或酯、與＜1%甲醇構成。
以全強度或½強度MK7-1培養基鹽補充於飲用品質自來水中濃度為7.5%（重量:體積）的粗甘油以創造11 L的全強度與½強度MK7-1培養基。將此等溶液之pH調整至4.8，接著沸騰共10分鐘。於冷卻至室溫（~23°C）後，將5%體積:體積之如於實施例3中描述地製備的品系MK7接種體加至該培養基。將pH再調整至4.8並將經接種的粗甘油培養基之1.5 L等分試樣加至經消毒之聚丙烯0.25 m 2盤，之後將該等盤放置於架子系統中。
將該等混合物於23° ± 1°C下培養並產生能變形的、相對緻密的生物墊，其於8日後約4 mm厚，於該時刻收穫其等。將生物墊於50°C下乾燥共72 h且平均乾重±標準差對於全強度培養基處理而言係30.3 ± 3.1 g（n=6）而對於½強度培養基處理而言係30.2 ± 2.8 g（n=8）。平均的甘油至乾燥生物墊之轉換係34%且基於乾燥生質重量之潮濕的墊子之密度對於兩個處理而言皆係0.03 g/cm 2。 實施例 11 ：在小麥可溶酒糟上生長的品系 MK7 生物墊之菌絲 / 菌絲體結構。
固結的品系MK7絲狀真菌生物墊係於7日中使用乾燥的小麥可溶酒糟（ds）作為碳及養分來源（原料）而製造。小麥ds係由31.5%蛋白質、8.6%油、2.8%澱粉、13.5%糖、2.7%纖維、8.5%灰分、0.19%鈣、0.29%鎂、1.7%鉀、0.78%磷、與3.5%硫酸鹽構成。準備二種生長培養基處理：處理1使用5% ds乾重於水中且處理2使用5% ds乾重於½強度MK7-1鹽培養基中。將該等混合物之pH調整至3.4。以7.5%（體積:體積）之如於實施例3中描述地製備的品系MK7接種體接種該等混合物並將175 mL的該培養基加至以醇殺菌的12.7 x 12.7 cm塑膠盤。在於室溫（~23°C）下培養7日後收穫絲狀真菌生物墊。在5% ds作為唯一的碳及養分來源（處理1，無MK7-1鹽）上生長的生物墊平均係2.7 mm厚（n=3盤），未顯示明顯的分層，且具有0.83 g的平均乾重與0.019 g/cm 3的平均密度及大約10%的轉換效率。未觀察到氣生菌絲且該等墊子在各處皆被液體飽和；即該等墊子之頂面係位於該液體之表面。
在以MK7-1鹽補充的5% ds（處理2）上生長之生物墊平均係6.4 mm厚且具有3.11 g的平均乾重與0.030 g/cm 3的平均密度及大約40%的轉換效率。此等墊子發展出廣泛的蓬鬆白色氣生菌絲系統，其係約4-7 mm厚且緊鄰在約0.9 mm厚之明顯較緻密的層之上。上面的層之密度係0.011 g/cm 3且下面的層之密度係0.148 g/cm 3。 實施例 12 ：品系 MK7 絲狀真菌生物墊在作為碳與養分來源的玉米浸液及玉米浸液 / 澱粉上之生長
緻密品系MK7絲狀真菌生物墊係於短至4日中使用玉米浸液作為唯一的碳及養分來源（原料）製造。進一步，亦顯示添加5%澱粉的玉米浸液能夠製造緻密絲狀真菌生物墊。玉米浸液係玉米濕磨之黏性副產物且具有使其適用作為微生物發酵的補充物之胺基酸、維生素、與礦物質成分。於此實施例中使用的玉米浸液係自Santa Cruz Biotechnology, Inc.（達拉斯，TX；批次# B0116）購得。此等實驗展示玉米浸液作為MK7-1養分之替代物的用途。處理包括10%及20%玉米浸液作為唯一的碳及養分來源，與10%及20%玉米浸液加上5%澱粉（各自）而該澱粉為絲狀真菌生物墊生長提供額外的碳。
藉由將10%或20%玉米浸液加至含有0或50 g乾燥澱粉的1 L體積來製備四個批次的培養基。藉由添加適合量之HCl來將該培養基調整至pH 3.6並於適合的容器中沸騰15分鐘。於冷卻至室溫後，將該混合物之pH再調整至3.6並以7.5%如於實施例3中製備的品系MK7接種體接種該混合物。將培養基之175 ml之等分試樣加至五個正方形盤（0.016 m 2表面積/盤）且請求在架子系統中於23° ± 1°C下培養。於6日後收穫絲狀真菌生物墊。對於10%、20%、10% +澱粉、與20% +澱粉的玉米浸液處理而言，平均最終pH分別係3.97、3.69、4.23、與4.15。對於此等處理而言，平均生質重量±標準差分別係1.1 ± 0.2、0.1 ± 0.1、2.3 ± 0.1 and 2.1 ± 0.2 g。 實施例 13 ：牲畜飼餵場飲水池之水至絲狀真菌生物墊的轉換
生長實驗係使用牲畜飼餵場飲水池之水作為唯一的碳與養分來源實施。最初的水之溶解有機碳含量係4 g/L且最初的總溶解氮含量係0.8 g/l。
以濃HCl將飼餵場飲水池水調整至pH 2.6並以7%如於實施例3中製備的品系MK7接種體接種之。以1.5 L的經接種廢水充至無菌0.25 m 2聚丙烯盤並將其放置入盤架系統中以於24° ± 1°C培養。於接種後2日後絲狀真菌生物墊開始在液體之表面上形成。於十日後，於單一容器中收集該等絲狀真菌生物墊與剩下的液體並乾燥，之後使用Costech總C及N分析器（ECS 4010, Costech Analytical Technologies，瓦倫西亞，CA）分析總C及N。平均每盤製造之乾燥生質係6.531 g（n=2）。該等墊子與殘留液體之分析展現約77%的碳及99-100%的氮被該等墊子自飼餵場飲水池廢水移除（方法偵測限制 ~1%）。當於10日期間作平均時，對於該系統而言碳及氮移除速率係6.8及1.2 mg/L/h。根據目前的瞭解，藉由使用HCl將飲水池酸化至pH 2.6並以品系MK7接種之來自圈養場水移除大部分的C與幾乎所有的N係可能的。進一步，直接處理飲水池以在圈養場水現場上產生漂浮的絲狀真菌生物墊（其可接著被收穫以供之後使用）係可能的。 實施例 14 ：品系 MK7 生物墊在酸乳清代用物培養基上之生長
緻密品系MK7生物墊係於7日中自酸乳清代用物培養基（AWS）製造。AWS培養基之組成係基於如於Tsakali等人(2010)中描述的酸乳清之典型組成。於此實施例中使用之Tsakali培養基及AWS培養基之組成係於表4中描述。
生物墊係於無菌12.7 x 12.7 cm（0.016 m 2）聚丙烯盤中使用87 mL的pH 4.8 AWS培養基製造。該培養基係藉由以下者製備：於1 L Erlenmeyer燒瓶中混合於表4中所列的成分，將pH調整至4.8，與接著沸騰共10分鐘。在該培養基冷卻至約23 °C後，將處於指數生長期的7.5%體積（體積/體積）之接種體加至該燒瓶。此接種體係如於實施例3中描述地產生。將經接種培養基之87 mL的等分試樣加至經異丙醇擦洗的盤（實施例3）並將該等盤放置於安放在如於實施例3中描述的盤架系統中之更大（0.25 m 2）的盤上。允許培養物於25 ± 1 °C下培養，造成相對緻密的生物墊，其係於於7日後收穫（圖18）。7日後的殘留液體之平均pH值係6.9 ± 0.1。因此，該生長程序將AWS之pH自4.8（對酸乳清為典型者）中和至接近中性（~ 7）。透射光顯微鏡展現在AWS培養基上產生的生物墊之絲狀特性（圖18）。潮濕的生物墊之平均厚度係4 ± 0.5 mm。生物墊係於50°C下乾燥共30 h且所產生的平均乾重係1.88 ± 0.2 g。潮濕的生物墊之平均密度係0.29 g/cm 3。平均的乾燥原料（乳糖與總蛋白質）至乾燥生物墊之轉換係42.2%。
表 4.於此實施例中使用以生長MK7生物墊的如於Tsakali等人，2010中描述的典型酸乳清與酸乳清代用物培養基（AWS）之組成
   Tsakal AWS
   i
   （%） （%）
水 94.5 94.5
乾燥物質 5.5 5.5
乳糖 4 4
乳酸 0.4 0
總蛋白質* 1 1
檸檬酸 0.1 0.1
礦物質** 0.6 1.3
pH 4.8 4.8
*對於AWS而言的總蛋白質來源係呈來自GNC，匹茲堡，PA之100%乳清蛋白質GNC ProPerformance的乳清蛋白質濃縮物。 **AWS之礦物質組成係表1A中描述的½強度MK7-1培養基但無甘油。 實施例 15 ：品系 MK7 生物墊在酸乳清上的生長
品系MK7生物墊係於6日中使用酸乳清作為主要碳與養分來源生長。生物墊係於無菌12.7 x 12.7 cm（0.016 m 2）聚丙烯盤中使用125 mL的已經歷各種各樣的處理之粗酸乳清製造。實施該等處理以評估於調整pH、添加所選養分及/或加熱以最小化競爭性微生物的存在後之生長速率與生質生產率。
將為500 mL的酸乳清體積加至加至先前已滅菌的1 L Erlenmeyer燒瓶（加熱至125°C共10分鐘）並使該液態培養基經歷如於表5中概述的所選處理（1-12）。不調整pH（酸乳清之平均pH係4.8）或將pH以濃HCl調整至pH 2.7。養分添加處理包括：未添加，2.5 g/L之尿素作為氮源、或½強度MK7-1作為養分之整組（在如於實施例1中描述的酸乳清液體中製備），減去甘油。在執行其他處理（pH及或養分添加）後，加熱滅菌係藉由沸騰酸乳清液態培養基共15分鐘來實施。在該培養基已冷卻至約23°C後，將7.5%體積（體積/體積）處於指數生長期的接種體加至該燒瓶。此接種體係如於實施例3中描述地產生。將經接種培養基之125 mL的等分試樣加至經異丙醇擦洗的盤（關於滅菌程序參見實施例3）並將該等盤放置在安放在如於實施例3中描述的盤架系統中之較大的（0.25 m 2）盤上。允許該等培養物於25 ± 1 °C下培養至少6日。
表 5.用於評估酸乳清作為供品系MK7生物墊的生長之用的養分培養基之處理矩陣。
養分 加熱
處理 pH 添加 滅菌
1 未調整 否 否
2 未調整 否 是
3 未調整 尿素 否
4 未調整 尿素 是
5 未調整 1/2MK7-1 否
6 未調整 1/2MK7-1 是
7 2.7 否 否
8 2.7 否 是
9 2.7 尿素 否
10 2.7 尿素 是
11 2.7 1/2MK7-1 否
12 2.7 1/2MK7-1 是
實施例 16 ：品系 MK7 絲狀真菌生物墊在無氧消化產物上之生長
緻密品系MK7生物墊係於7日中使用無氧消化產物作為唯一的碳與養分來源（原料）製造。無氧消化產物係於富木質織維素生質（例如玉米桿、小麥桿、牛糞堆肥）在氧受限條件下的微生物發酵後剩下的富木質素固體殘渣。無氧消化產物被認為對通過微生物之進一步的分解有抗性且基於此理由一般係用作為土壤改良劑或被焚燒以推動蒸汽鍋爐以製造電力。
將潮濕的無氧消化產物（500 g）加至2 L的飲用品質自來水，形成一混合物。此混合物之自然pH係5.5。該混合物係以7.5%（體積:體積）之品系MK7接種體（如於實施例3中描述地製備）接種。將200 mL的所產生之混合物加至正方形12.7 x 12.7 cm盤。固結的生物墊在表面上形成且係於在室溫（~23°C）下培養7日後收穫。該等生物墊具有2.6 mm的平均厚度且具有0.62 g的平均乾重（n=3，標準差= 0.03 g）及0.015 g/cm 3的相對應密度。平均轉換效率係2.3%。
為增加至微生物生質的無氧消化產物轉換之速率，藉由以大麥培養基補充該無氧消化產物（實際上使用經增強生長培養基）來實施另外的實驗。使用大麥培養基以刺激生長並誘發透過品系MK7的原位酵素製造以進一步將無氧消化產物降解與轉換成真菌生質。經增強之大麥培養基係藉由組合1 L的自來水、50 g的大麥花、1 g酵母菌萃取物、0.1 mL葡萄糖澱粉酶（Distillate VHP，杜邦）、0.1 mL α澱粉酶（SPEZYME Α，13,775 AAU/g，杜邦）與0.1 mL β葡聚糖酶（Optimash TBG，杜邦）來製備。將該混合物加熱至65 C並於65 C下攪拌共15分鐘。之後，將混合物沸騰共15分鐘以去活化酵素。接著將混合物冷卻至室溫。
重複以上描述的用於無氧消化產物實驗之方案，除了以經增強的大麥培養基取代自來水以及所使用的各組份之總體積減少一半外。平均的無氧消化產物至生物墊之轉換在減去於對照組處理（其中未添加無氧消化產物）中產生的生質後係6 ± 2%。 實施例 17 ：其他絲狀真菌於盤式反應器中的生長。
使用於實施例1、2、與3中針對品系MK7描述的表面發酵技術評估寡孢根黴菌與毒鐮孢菌之生長。
寡孢根黴菌於世界各地被廣泛地用於丹貝（人類食物）製造。寡孢根黴菌品系ATCC 22595係於2015年10月1日自ATCC獲得。將自ATCC獲得的寡孢根黴菌之純培養樣本放置在如於實施例2中描述的在Petri培養盤中之MK7-1瓊脂培養基上。
於Quorn TM食物製造中使用的毒鐮孢菌係從於2016年1月16日自於波司曼，MT之Albertson氏超市購買的Quorn Chik’n Nuggets包裝（UPC代碼：33735-00006）收集。為分離毒鐮孢菌，將含有毒鐮孢菌的QuornTM Chik’n Nuggets之樣本（~0.25 cm 2）放置於在250 ml擋板搖動燒瓶內之100 mL的無菌pH 5，MK7-1培養基中。該培養基與燒瓶係藉由沸騰於該燒瓶中的該培養基20分鐘來殺菌。允許該培養基冷卻至23 C，之後添加Quorn TM樣本。在於23 ±1 C下伴隨以200 rpm轉動來培養3日後，移出1 mL的培養物並用以接種另一個相同的燒瓶與培養基。於以相同方式再培養3日後，移出該培養物之50 μL等分試樣並將其塗盤在於無菌Petri培養盤內的無菌MK7-1瓊脂培養基（pH 4.8）上。
使用於寡孢根黴菌及毒鐮孢菌培養盤上發展的菌絲體墊來接種如於實施例3中描述的於無菌1 L擋板搖動燒瓶內之350 mL的MK7-1培養基。於在如於實施例3中描述的搖動燒瓶內生長5日後，將該等培養物用作為用於盤式反應器之接種體。所欲的用於該等盤式反應器之接種體係由處於晚期指數期的細胞密度大於6 g/L之微生物上純的培養物組成（參見實施例3）。如於實施例3中描述的，針對該二種生物體之各者準備二個含有1.5 L的經接種MK7-1培養基之盤。該等培養基之pH對於根黴菌屬而言被調整至4.1且對於鐮孢菌屬而言被調整至5.0。所得的培養物與墊子之影像係於圖12及13中顯示。 實施例 18 ：由固態發酵（ SSF ）製造的絲狀真菌生物墊相較於由固態基質表面發酵（ SSSF ）製造的生質之比較SSF程序
於本文中提及之固態發酵（SSF）意謂在固體上於低水含量（典型係低於50%）發生的微生物發酵程序。
MK7 SSF接種體係藉由以下者製備：將20 g葡萄糖加至於2 L玻璃容器內的1 L Mandels與Reese培養基並於121°C下於pH 4.5下高壓蒸氣滅菌共45分鐘。將100 mL的所產生之培養基加至250 ml Erlenmeyer燒瓶並以0.25 g的來自-80°C甘油儲備物之品系MK7接種。將該培養物於30°C，180 rpm下培養共14日，之後用作為用於SSF的接種體。
SSF程序之一個實例係用於在WO 2016/004380與US 2016/0002680中的生物墊之製造者。具體言之，於商用攪拌器中將100克的小麥桿之大小減小並將其放置於2公升玻璃瓶中。添加300 mL的Mandels與Reese培養基及3 mL的濃H 2SO 4。於121°C下高壓蒸氣滅菌所產生的漿液共45分鐘。使用NaOH將該經高壓蒸氣滅菌漿液之pH調整至3.0，允許其冷卻至室溫、與接著相等地轉移至四個250 ml Erlenmeyer燒瓶。添加10 ml的品系MK7接種體並於30°C，180 rpm下搖晃該等燒瓶共4日，接著將所有燒瓶之內含物轉移至單一9x9英吋Pyrex®皿。以Saran®保鮮膜覆蓋所產生的培養物並於30°C下培養7日，之後收穫。 SSSF程序
SSSF接種體係於實施例3中描述且程序係於以下實施例中描述（即漂浮在液體層之頂部上的甜菜渣與其他木質纖維素材料之轉換。具體言之，於本文中提及之SSSF意謂在固態基質係浸沉在液體之表面下時發生的發酵，使得絲狀真菌生物墊在該液體之表面上使用衍生自該浸沉固體的碳與養分生長。所製造的絲狀真菌生物墊係黏著性、緻密、且無原料的（圖14C）。
生質製造與所製造的所得生物墊於SSSF與SSF程序間明顯不同。培養基組份、離子強度、滲透壓、原料濃度、接種體品質、培養時間（表6及7）皆係SSSF與SSF方法學間重要的參數差異。此等程序差異造成巨大不同的生質特性（例如密度、固結墊子之形成、微生物純度、絲狀構造長度、絲狀構造組織、等等）。
藉由SSSF製造的生質造成漂浮在液體層之頂部上且物理上與固體原料層分開的絲狀真菌生物墊之製造。所產生的絲狀真菌生物墊係被組織成黏著性且緻密的墊子之實質上純的真菌生質。該墊子具有高抗張力且係由具有跨越毫米至數厘米的平均長度之長絲狀構造構成（如於圖1C、11及12中顯示的）。該等絲狀構造主要被組織成與該生物墊之表面平行且係由真菌之高度緻密菌塊連接。該生物墊之表面可或可不展現方向與該生物墊之表面垂直的氣生菌絲。該絲狀真菌生物墊可輕易地自其生長環境移出，因為其物理上與液體或固態基質分開，其使快速與容易的收穫成為可能（相對於純的絲狀真菌生物墊）。
對照下，透過SSF生長的生質製造以隨機構型非均質地併入該固態基質內的生質。所製造的生質絲狀構造之長度一般係短於100 μm（圖14B）。進一步，透過SSF製造的生質係非黏著性的且為低抗張力所苦，使得其不能被以單一的單元拾起（參見圖14A）。所產生的生質/固態基質混合物傾向具有低密度，特別是當與透過SSSF製造的絲狀真菌生物墊作比較時。
表 6.以下描述SSF與SSSF方法學中之關鍵差異：
SSF SSSF
密度（g乾重品系MK7生質/培養基:基質混合物之kg ＜5 120-180
抗張力 不可測量 潮濕生質：0.05-0.24 kg/com寬度、平均~0.009 kg/com寬度。乾燥生質（無隨後的處理）：2-6 kg/com寬度，平均~3 kg/com寬度
培養基之滲透壓（atm） 3.4 18.6
培養基之離子強度（莫耳每公升） 0.077 0.368
用於接種體的細胞類型 固定相絲狀細胞（即長度＞ 100 μm的細胞） 晚期指數期浮游性細胞（即長度＜20 μm的細胞）
培養基中的木質織維素（%） ＞25 2.5-25
平均絲狀構造長度 0.001-0.02 cm 0.05-2 cm
絲狀構造方向 隨機 平行
最終組成（%） 小於5%真菌 大於95%真菌
最終生物墊黏稠度 易碎、非黏著性、非均質的 堅固、黏著性、均質的
實施例 19 ：透過品系 MK7 的甜菜渣之 SSF 與 SSSF
品系MK7生質係使用SSF SSSF方法利用甜菜渣作為主要碳源來製造。甜菜渣係在於加工廠將糖自甜菜渣移出後剩下的甜菜之植物部分。甜菜渣係自於比林斯，蒙大納之Western Sugar Cooperative製造工廠獲得，且係由大約24%乾燥物質、9.1%粗蛋白質、0.6%粗脂肪、23.1%粗纖維、4%灰分、與0.56%鈣構成。
對於SSF實驗，使50 g的乾燥甜菜渣與250 ml水混合。將該混合物高壓蒸氣滅菌共20分鐘以確保無菌。於冷卻至室溫（~23°C）後，使用250 mg之以在玉米桿/水混合物之表面上的生物墊之形式生長的潮濕之品系MK7生物墊接種該混合物。該品系MK7生物墊係使用無菌刮勺混合入該甜菜渣混合物中且允許所產生的經接種混合物於室溫下培養共4、5、與7日。
對於SSSF實驗，將甜菜渣以7%的濃度加至½強度MK7-1培養基（甜菜渣重量:液體體積）以製造300 ml的培養基。藉由添加適合量的HCl將該培養基之pH調整至4.8，接著沸騰共20分鐘。於冷卻至室溫後，使用無菌刮勺將大約100 mg的以在如於實施例C中描述的玉米桿/水混合物之表面上的絲狀真菌生物墊之形式生長的MK7生物墊混合入該培養基中。藉由添加適合量的HCl將pH再調整至4.8，並接著將經接種的甜菜渣培養基之100 ml等分試樣加至無菌0.023 m 2Pyrex®玻璃盤，之後將該等盤放置於盤架系統中。於23° ± 1°C下培養經接種的混合物，產生能變形的緻密生物墊，其於4、5、與7日後分別係約2.9、3.4、與4.1 mm厚。收穫該等生物墊並於50°C下乾燥共48 h而其乾重係1.85 g（4日）、2,25 g（5日）、與2.85 g（7日）。對於4、5、與7日墊子而言，甜菜渣至乾燥生物墊之轉換分別係26.4%、32.1%、與40.7%。對於4、5、與7日墊子而言，基於大部分生物墊體積之乾重的生物墊密度分別係0.028、0.029、與0.030 g/cm 3。
使用SSF對SSSF的生長產生明顯不同的生質形式。SSF製造為生質與基質兩者的緊密混合物之生質結構。此等混合物係由於甜菜渣基質之片段附近與內部糾纏的低密度真菌生質構成。此等緊密混合物主要係由散佈著小量的真菌生質之基質構成。並未完成該生質自該基質之分離，因為其會需要明顯額外的程序且會係技術上難以實現的。
對照下，SSSF產生物理上與甜菜渣基質分開且可與其區分的絲狀真菌生物墊，允許該生物墊之直接與簡單的收穫。進一步，所產生的絲狀真菌生物墊係緻密、實質上純的且由長的經排列絲狀構造構成。 實施例 20 ：品系 MK7 絲狀真菌生物墊在胡蘿蔔與青花菜廢棄物上之生長
緻密品系MK7生物墊係於6日中使用經均質化青花菜或經均質化胡蘿蔔作為原料來製造。青花菜與胡蘿蔔係自於波司曼，蒙大納之好市多批發購得。100克的各個原料係於商用食物處理機中或使用金屬葉片以高速個別地均質化共5分鐘並放置於有9000 mL的自來水的2公升燒杯中。如以下添加培養基鹽以形成混合物：
   g/L
NH 4NO 3 5,25
尿素 1.75
KH 2PO 4 5.0
CaCl 2 1.0
MgSO 4•7H 2O 1.0
     
微量營養素 mg/L
FeSO 4•7H 2O 2.50
ZnSO 4•7H 2O 1.10
MnCl 2•4H 2O 0.25
CoCl 2•6H 2O 0.08
CuSO 4•5H 2O 0.08
(NH 4) 6Mo 7O 24•4H 2O 0.06
H 3BO 3 0.06
EDTA，自由酸 19.63
藉由添加1.3 ml濃HCl來將混合物之pH調整至3.5。以鋁箔覆蓋該培養基並接著沸騰共30分鐘。於冷卻至室溫（~23°C）後，對於各原料將50 ml（7.5%體積:體積）的如於實施例3中描述地製備之接種體加至該培養基並攪拌直到形成均質混合物。將250 mL的混合物倒入四個分開的5X7英吋（0.02 m 2）盤中並以Saran®保鮮膜覆蓋。於23° ± 1°C下培養該等盤共7日，之後收穫。所產生的生質係沒有剩下的青花菜或胡蘿蔔原料之能變形的緻密絲狀真菌生物墊。即，製造出不含原料殘渣且由實質上純的MK7生質構成的絲狀真菌生物墊。於收穫後的殘留液體之平均pH值係6.2。潮濕的生物墊之平均厚度係3 ± 1 mm。絲狀真菌生物墊係於50°C下乾燥共72 h且平均乾重±標準差對於青花菜係1.7 ± 0.2 g且對於胡蘿蔔係1.7 ± 0.2 g。平均的青花菜至乾重之轉換係52 ± 5 g品系MK7曳板重量/100 g乾重青花菜。平均的胡蘿蔔至乾重之轉換係55 ± 7 g品系MK7乾重/100 g乾重胡蘿蔔。 實施例 21 ：在都市有機廢棄物代用物（禾草修剪廢物與葉，隨著預處理變化）上的品系 MK7 培養
酸與鹼預處理對都市有機廢棄物的衝擊係以原料至絲狀真菌生物墊之百分比轉換的變化之形式評估。分別於60°C下乾燥肯塔基藍草修剪廢物與光蠟樹葉直到水含量少於8%。各個原料係於商用攪拌器中磨成細粉。 HCl酸預處理
• 3重複之10 g的於100 ml自來水中之pH 2.5（以33% HCl調整）的禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。
• 3重複之10 g的於100 ml自來水中之pH 2.5（以33% HCl調整）的具有10 mM MnSO 4之禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。
• 3重複之10 g的於100 ml MK7-1培養基中之pH 2.5（以33% HCl調整）的禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。
• 3重複之10 g的於100 ml MK7-1培養基中之pH 2.5（以33% HCl調整）的具有10 mM MnSO 4之禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。 NaOH鹼預處理
• 3重複之10 g的於100 ml 自來水中之pH 10.75（以1%NaOH調整）的禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。最終pH 2.5係以HCl調整。
• 3重複之10 g的於100 ml 自來水中之pH 10.75（以1%NaOH調整）的具有10 mM MnSO 4之禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。最終pH 2.5係以HCl調整。
• 3重複之10 g的於100 ml MK7-1培養基中之pH 10.75（以1%NaOH調整）的禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。最終pH 2.5係以HCl調整。
• 3重複之10 g的於100 ml MK7-1培養基中之pH 10.75（以1%NaOH調整）的具有10 mM MnSO 4之禾草/葉（50:50以乾重計）係藉由沸騰10分鐘預處理。最終pH 2.5係以HCl調整。 對照組預處理
• 3重複之10 g的於100 ml 自來水中之禾草/葉（50:50以乾重計）。最終pH 5.5。
• 3重複之10 g的於100 ml 自來水、10 mM MnSO4中之禾草/葉（50:50以乾重計）。最終pH 5.5。
• 3重複之10 g的於100 ml MK7-1培養基中之禾草/葉（50:50以乾重計）。最終pH 5.5。
• 3重複之10 g的於100 ml MK7-1培養基、10 mM MnSO4中之禾草/葉（50:50以乾重計）。最終pH 5.5。
將該等樣本放置於12.7 x 12.7 cm盤中，覆蓋，與接著培養共7日。結果係於圖15中顯示。於各個例子中，預處理之施加增加所產生的轉換百分比。即，較大量的該原料至所得之絲狀真菌生物墊之轉換係藉由施加酸或鹼預處理與藉由添加錳而達成。 實施例 22 ：品系 MK7 生物墊在澱粉上的生長
緻密品系MK&絲狀真菌生物墊係於短至4日中使用澱粉作為碳與養分來源（原料）製造。於此等特定實驗中使用的澱粉係由Argo Food Companies, Inc（孟斐斯，TN）製造且自於波司曼，MH之Albertson氏超市購買的100% Argo玉米澱粉。
藉由以下者製備三個批次的澱粉培養基：將6%、8%、與10%乾燥澱粉粉末加至於10 L鋼鍋內之6 L體積的飲用品質自來水。以MK7-1鹽補充此混合物並沸騰共10分鐘，接著冷卻至室溫（~23°C）。加熱該混合物，產生凝集澱粉塊，其接著被物理性地破碎成較小的塊。將該混合物之pH調整至2.7並以7.5%（體積:體積）之如於實施例3中描述地製備的MK7接種體接種。
將1.5 L經接種培養基之等分試樣加至四個經消毒聚丙烯0.25 m 2盤，置於盤架系統中，並於23° ± 1°C下培養。於生長僅僅2日後就觀察到緻密絲狀真菌生物墊並於6日後收穫該等生物墊。對於6%、8%、與10%處理而言，於收穫後在該等盤中剩下的殘留液體之平均pH值分別係6.05、6.11、與5.88。對於該三個處理而言，該等生物墊之平均厚度分別係2.9、3.1、與3.3 mm。於50°C下乾燥絲狀真菌生物墊共72 h，而對於含有6%、8%、與10%澱粉的四重複之盤而言平均乾重±標準差分別係29.0 ± 1.3、34.4 ± 1.5、與38.2 ± 1.9 g。此等於32、29、與25%之澱粉至絲狀真菌生物墊乾重的轉換百分比。對於該三個處理而言，潮濕的絲狀真菌生物墊之基於乾重的平均密度分別係0.04、0.04、與0.05 g/cm 2。 實施例 23 ：品系 MK7 絲狀真菌生物墊在馬鈴薯加工廢料流上的生長
緻密品系MK7絲狀真菌生物墊係於7日中使用馬鈴薯加工廢棄物作為碳與養分來源（原料）來製造。馬鈴薯加工廢棄物係於馬鈴薯之加工期間一般地產生且包括來自洗滌、去皮、與切削操作（即薯條、馬鈴薯塊、雪片、與類似者）的廢料流。馬鈴薯加工廢料流亦包括由堆成一堆的多種馬鈴薯加工廢料流構成且暴露至天然環境而無覆蓋物的排放堆。於此實施例中，由各種各樣的馬鈴薯之加工廢棄物構成的馬鈴薯加工廢料流係於2016年9月21日自在懷特荷，蒙大納的Bauch Farms獲得，並於48個小時內使用作為碳與養分來源以生長品系MK7生物墊。
馬鈴薯次料係於自完整馬鈴薯切下薯條後剩下的馬鈴薯部分。馬鈴薯次料大小與尺寸多變，橫跨（作為非限制性實例）薄片至6英吋長0.5英吋厚或更大的片段。於大部分的例子中，新鮮丟棄物描述由於損壞、擦傷、或類似者而自馬鈴薯移除的馬鈴薯部分。於一些例子中，整個馬鈴薯被包括作為丟棄樣本。皮主要係自馬鈴薯移除之皮。
馬鈴薯次料、丟棄物與皮係以大約500 ml體積批次藉由食物處理機處理至均質的黏稠度（Farbarware型號103742食物處理機，設於高速）共1分鐘。經食物處理樣本於此實施例為了描述之目的被稱為混成物（blendate）。
以10%濕重混成物對某體積的MK7-1培養基之比率以500 g混成物對4.5 L液體MK7-1培養基之比率將經混合馬鈴薯次料與新鮮丟棄物加至二個15 L經環氧樹脂塗層之鋼烹飪鍋，產生混合物。使用濃HCl將該混合物之pH調整至2.45。將品系MK7接種體（如於實施例3中描述地製備的）以7.5%體積:體積（即375 ml接種體對4625 ml混合物）之比率添加。將1.5 L經接種懸浮液之等分試樣以三重複加至個別的0.25 m 2無菌聚丙烯盤並放置於盤架系統中。於23° ± 1°C下培養該等培養物，得到n能變形的緻密生物墊，於7日後收穫其等。於收穫後在該等盤中剩下的殘留液體之平均pH值對於該等次料而言係7.1且對於新鮮丟棄處理而言係6.9。於7 L自來水中伴隨溫柔的攪動漂洗所收穫的生物墊共10分鐘並於50°C下乾燥共72 h。
該等潮濕的生物墊之平均厚度對於該等次料而言係3.8 ± 0.9 mm且對於該等丟棄物而言係3.9 ± 1.0 mm。於各盤中的生質之平均乾重±標準差來自該等次料係33.6 ± 0.6 g且對於該等新鮮丟棄物而言係40.2 ± 2.7 g。該等生物墊基於乾重之平均密度對於該等次料而言係0.035 g/cm 3且對於該等丟棄物而言係0.041 g/cm 3。平均的於原本之馬鈴薯副產物中的總固體至乾燥生物墊之轉換對於該等次料而言係36%且對於該等新鮮丟棄物而言係43%。鑑於以下事實，接近50%轉換會被視為100%的碳之轉換效率：約50%被品系MK7使用的碳係以二氧化碳的形式釋放至大氣中。
於生長實驗前預處理混合的馬鈴薯皮以增加馬鈴薯皮養分對於品系MK7之可利用性。將混合的馬鈴薯皮（175 g）加至九個12.7 x 17.8 cm（0.023 cm 2）Pyrex®玻璃盤之各者以產生各自有三重複的三種處理之實驗基質。處理1接受50 ml飲用品質自來水。處理2接受含有一組品系MK7水解酵素的品系MK7水解產物之45 ml等分試樣，該等酵素係由品系MK7在玉米桿上生長時分泌。處理3接受50 ml自來水與一組由以下者構成的商購酵素：0.05g纖維素酶Y-C（MP Biomedicals，Cat# 320951，批次# M4156）、2.5 ml葡萄糖澱粉酶（Distillate VHP，杜邦）、2.5 ml α-澱粉酶（APEZYME Α，13,775 AAU/g，杜邦）與2.5 ml β-葡聚糖酶（Optimash TBG，杜邦）。處理3盤係於50°C下培養共30分鐘以刺激酵素水解，接著沸騰共5分鐘以去活化該等酵素。該等處理之pH係使用濃HCl調整至3.0且所有的盤皆以10 ml的如於實施例2中描述地製備的品系MK7接種。於7日後，自液體之表面移出該等生物墊，於自來水中漂洗共10秒並於60°C下乾燥共48 h。馬鈴薯皮乾重至乾燥生物墊之轉換係：對照組（僅H2O）平均= 5.9%（5.5%、6.5%、與5.8%）；品系MK7酵素= 9.0%（7.2%、10.1%、與9.8%）；與商購酵素= 9.9%（10.2%、8.4%、與11%）。 實施例 24 ：營養分析由 SSF 製造的生質對由 SSSF 製造的生物墊
營養分析係由Eurofins執行來比較從SSF對SSSF方法學獲得的生物墊。SSF樣本係自在以Michigan Biotechnology Institute的氨纖維擴張（AFEX）預處理之玉米桿上培養的品系MK7獲得。於使用濃HCl將pH調整至3.5後，將150 g的AFEX加至500 mL的自來水並於121°C下高壓蒸氣滅菌。以25 ml的根據實施例18之品系MK7接種體接種所得的混合物。將漿液轉移至23 X23 cm Pyrex®玻璃盤並於室溫下培養共11日。收穫經併入的品系MK7生質與玉米桿並於60°C下乾燥共48個小時。由Eurofins USA（Des Moines，IA）針對總蛋白質、總纖維、總碳水化合物、灰分、與總脂肪分析樣本。
SSSF樣本係從在5% AFEX玉米桿上製造的墊子獲得。於使用濃HCl將pH調整至3.5後，將50 g的AFEX玉米桿加至1L之自來水並於121°C下高壓蒸氣滅菌。以50 ml的如於實施例3中描述地製備的品系MK7接種體接種所產生的混合物。將漿液轉移至二個23 X 23 cm Pyrex®玻璃盤並於室溫下培養共11日。收穫墊子並於自來水中漂洗共30秒接著於60°C下乾燥共24個小時。由Eurofins USA（Des Moines IA）針對總蛋白質、總纖維、總碳水化合物、灰分及總脂肪分析樣本。
表 7.
Eurofins 分析 SSF （ % ） SSSF （ % ）
總蛋白質 2.56 51.10
總脂肪 0.60 12.00
總纖維 80.30 23.30
總糖 2.10 ＜0.35
總灰分 15 12.40
實施例 25 ：絲狀嗜酸性 MK7 真菌品系之胺基酸輪廓
絲狀嗜酸性MK7真菌品系生物墊係於盤式反應器中使用於實施例2與3中描述的方法在MK7-1培養基中製造。將來自6個盤的絲狀生質組合在一起，之後於60°C下乾燥共45分鐘與於50°C下乾燥72個小時。將400 g的此絲狀生質送至在Des Moines，IA的Eurofins Scientific Inc.營養分析中心以作營養分析。胺基酸係使用如下美國公認農業化學家協會（AOAC）公認分析方法中公開的國際認可之方法分析：AOAC 988.15用於色胺酸、AOAC 994.12 mod.用於胱胺酸與甲硫胺酸、AOAC 982.30 mod.用於丙胺酸、精胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、總離胺酸、酪胺酸及纈胺酸。由Eurofins報告的絲狀嗜酸性MK7真菌品系樣本之胺基酸組成係於表8中與以下者之胺基酸組成比較：用於魚餌的毒鐮孢菌（Alriksson, B.等人(2014) Fish feed from wood. Cellulose Chemistry and Technology 48:9–10 (2014)、Quorn（Nutritional Profile of Quorn Mycoprotein, 2009）、蛋白蛋白（聯合國糧食與農業組織。The Amino Acid Content of Foods and Biological Data on Proteins, Nutritional Study #24. Rome (1970). UNIPUB, Inc., 4611-F Assembly Drive, Lanham, MD 20706）與寡孢根黴菌（Graham, D. C., Steinkraus, K. H. & Hackler, L. R. (1976) Factors affecting production of mold mycelium and protein in synthetic media. Appl Environ Microbiol 32:381–387）。總蛋白質含量被測量為4.5%含水量生質之41.5%。明顯地，絲狀嗜酸性MK7真菌品系被顯示相較於所有其他四種蛋白質來源具有較高濃度的必須胺基酸，使絲狀嗜酸性MK7真菌品系對食物及飼料而言係高度所欲的蛋白質來源。
表 8.針對絲狀嗜酸性MK7真菌品系與四種高蛋白質食物/飼料來源提供以總胺基酸之百分比計的胺基酸濃度。必須胺基酸係以星號指示。
品系 MK7 用於魚餌的毒鐮孢菌 Quorn 蛋白蛋白 寡孢根黴菌（丹貝）
              
* 色胺酸 1.48% 0.94% 1.24% 1.18% 0.75%
胱胺酸 1.04%       1.88%   
* 甲硫胺酸 1.65% 1.51% 1.59% 3.01% 0.58%
丙胺酸 16.38%       5.49%   
精胺酸 5.39% 4.72%    4.54%   
天門冬胺 9.17%       6.09%   
麩胺 10.72%       10.89%   
甘胺酸 5.06%       2.89%   
* 組胺酸 2.12%    2.69% 1.67%   
* 異白胺酸 4.48% 3.96% 3.93% 5.00%   
* 白胺酸 6.84% 5.85% 6.55% 6.80%   
* 苯丙胺酸 3.57%    3.72% 4.94%   
脯胺酸 4.35%       2.92%   
絲胺酸 4.45%       6.07%   
* 蘇胺酸 5.49% 3.77% 4.21% 3.41% 3.05%
* 離胺酸 7.25% 5.66% 6.28% 4.64% 4.28%   
酪胺酸 2.70%       3.21%   
* 纈胺酸 7.85% 4.72% 4.14% 6.02%   
實施例 26 ：透過絲狀嗜酸性 MK7 真菌品系自食品級甘油的富 C18 脂質之製造
培養基製備：4.5公升的MK7-1培養基係以125 g/L甘油（The Chemistry Store – Kosher食品級甘油＞99.7%，ASIN: B00KN1LRWQ，可於網際網路上購買）（562.5克）製備，而NH 4NO 3及尿素氮濃度被改變成40:1之C：N比率（於C源中之碳mol:於氮化合物中之N mol）。
表 9.經修飾以提供40:1之C：N比率與12.5%甘油濃度的MK7-1培養基之組成。微量營養素係藉由添加2 mL/L的於表1（實施例1）中描述的500x儲備物溶液來提供。
總體積 4.5
NH 4NO 3（g） 10.8
尿素（g） 3.7
CaCl 2（g） 9.0
MgSO 4-7H 2O（g） 9.0
KH 2PO 4（g） 45.0
微量營養素（mL） 9.0
甘油（g） 563
甘油（L） 0.446
C：N比率 40:1
pH 2.7
去離子H2O（L） 4.05
HCl（mL） 5.85
該混合物之pH被調整至2.7且藉由於2公升Erlenmeyer燒瓶（燒瓶之頂部以鋁箔覆蓋）中沸騰30分鐘來加熱滅菌。該混合物被冷卻2個小時至25° C。
接種：將接種體（以乾重計15 g/L的處於指數生長期之浮游性細胞（參見實施例3）以1 g/L之最終乾重濃度加至經冷卻的燒瓶。將該燒瓶徹底混合以均勻分佈接種體。浮游態細胞對於墊子形成而言係關鍵的且最小化細胞群集（即大於1 mm的生物薄膜）係所欲的。理想地，於分配前大於2.5 mm的細胞群集應自該接種劑過濾掉。
培養與收穫：具有接種體的混合物係以1.5公升/盤或6公升每平方公分之體積於三個0.25 m 2盤中均勻地分配並25 C、90-100%濕度下培養共8日。固結的生物墊生質係以超過30 g/L的細胞密度製造且可以一個黏著之墊子的形式收穫生質。於一個實施方式中，該墊子被簡單地捲離該盤（圖6）。該墊子係使用流動的水漂洗共30秒並允許其滴乾共5 – 10分鐘。避免擠壓該墊子，因為蛋白質及其他真菌養分係透過過度水移除流失。滴乾後的絲狀生質具有410克（或1,620克/m 2）的濕重。含水量被測量為82%（即18%之乾重），對應於73.8 g/盤或295 g/m 2的乾重。18%之乾重絲狀生質相較於在浸沉培養中生長具有1.5%之典型乾重的其他真菌生質之加工係有利的。對照下，目前最佳技術之程序利用離心機（一種能源與資本密集程序）以達成所欲的真菌生質密度。相較於此等較昂貴的方法，本文中描述的程序需要遠較少的加工、設備及能源輸入。
脂質分析：總脂質之估計係藉由UV-Vis顯微鏡使用尼羅紅染色完成（Cooksey等人，1987；圖16），其估計總脂質為40-50%。總細胞內脂質之定量係使用直接轉酯化加上GC-MS分析（如於Lohman等人(2013)中描述的）測定且被發現為39%。此對應於115 g脂質/m 2於8日內（14 g/m 2/日）的脂質製造或0.39 g/公升/小時平均製造速率。此等速率遠快於該等於使用絲狀嗜酸性MK7真菌品系利用8%甘油的浸沉培養中找到者（0.245 g/L/hr）且對文獻中找到的其他生物體（包括酵母菌及藻類）非常有競爭性。此外，絲狀嗜酸性MK7真菌品系於大部分生物體所無法容忍之非常高的甘油濃度下以此等競爭性速率製造脂質且係唯一於酸性pH範圍進行此的生物體（就吾人所知），其對於限制污染而言具有顯著的優勢。此外，0.21 g脂質/g甘油的脂質係數（g脂質/g基質）相對於其他品系係高度有競爭力的（參見附表）。增加的脂質製造速率與180 g/L之細胞密度對於轉換透過各種各樣目前正在開發的微生物之微生物油的製造或商業用途有直接意義。
絲狀嗜酸性MK7真菌品系脂質輪廓在不同類型的處理（即pH、溫度、生長基質、培養持續期間、含水量）間明顯係一致的且主要者係C16:0與C18:0、C18:1與C18:2三醯基甘油酯（＞總脂質之95%；以下表10；圖17）。脂肪酸輪廓亦顯示一些高價值產物，包括ω-7反11-十八碳烯酸（11-十八碳烯酸甲酯）、ω-7棕櫚油酸（十六碳-9-烯酸甲酯；商標名Provinal TM）及二十四酸甲酯。此等係在蔬菜油中典型不會找到的稀有脂肪酸且相較於單獨生物柴油每噸原料可產生顯著更多收益。
表 10.使用12.5%甘油30 °C；與40:1之C：N比率培養8日的品系MK7生質中找到的脂肪酸為何及其濃度
   EuroFin SB （ n=3 ）
   FAME輪廓之%    FAME輪廓之% STD
C10:0（癸酸） 0.3%    0.1% 0.01%
C11:0（十一酸） 0.3%    0.0% 0.01%
C12:0（月桂酸） 0.3%    0.0% 0.00%
C14:0（肉豆蔻酸） 0.5%    0.4% 0.00%
C14:1（肉豆蔻油酸） 0.3%    0.0% 0.00%
C15:0（十五酸） 0.3%    0.3% 0.03%
C16:0（棕櫚酸） 15.8%    21.2% 0.45%
C16:1 ω7 1.0%    0.8% 0.05%
C17:0（十七酸） 0.3%    0.1% 0.00%
C18:0（硬酯酸） 4.8%    14.7% 0.39%
C18:1（油酸/異構物） 23.0%    31.9% 0.14%
C18:2 ω6（亞麻油酸） 42.8%    26.8% 0.60%
C18:2（異構物） 1.0%    0.2% 0.00%
C18:3（次亞麻油酸/異構物） 2.3%    0.9% 0.07%
C20:0（花生酸） 0.3%    0.7% 0.02%
C20:1（鱈油酸/異構物） 0.3%    0.1% 0.01%
C21:5 ω3 （二十一碳五烯酸） 0.3%    0.0% 0.01%
C22:0（二十二酸） 0.3%    0.5% 0.03%
C22:1（芥子酸/異構物） 0.3%    0.0% 0.00%
C24:0（二十四酸） 0.7%    0.7% 0.00%
C24:1（二十四碳烯酸/異構物）    0.3%       0.0%    0.00%   
總 % ： 94.7%    99.4%   
實施例 27 ：品系 MK7 之毒性分析
針對黴菌毒素之存在分析五個在不同條件下生長的品系MK7之樣本。樣本1生質係於與在實施例1中描述的用於產生接種體者相同的條件下（除了C：N比率係30:1外）在10 L生物反應器中製造。該生質樣本係藉由透過0.2 um過濾器使用真空過濾設備過濾來收集，如於實施例1中描述的。
樣本2生物墊係於無菌12.7 x 17.8 cm（0.02 m 2）Pyrex®玻璃盤使用50 mL的如於實施例1中描述地製備之pH 2.8 MK7-1培養基（除了該培養基係以12%甘油與0.2%蛋白腖（重量/體積；經粒化蛋白腖，Fisher Scientific，批次# 143241，薩莫維，NJ）補充外）製造。樣本2使用與和實施例3中有關0.25 m 2盤使用者相同之滅菌程序。
樣本3係於與用於樣本2者相同的條件中生長，除了pH被調整至4.5且該培養基並未以蛋白腖補充外。
樣本4係在與用於樣本2者相同的條件中生長，除了該培養基係以4%甘油補充外。
樣本5係在與用於樣本2者相同的條件中生長，除了其pH被調整至pH 2.2且該培養基並未以蛋白腖補充外。樣本2至5培養基係以7.5%（vol/vol）的用於樣本1的液態培養物接種。於生長8日後收集潮濕生質樣本並於-20 C下儲存，之後萃取黴菌毒素。
黴菌毒素係自潮濕生質使用由Vicam（批次# 100000176: Nixa，MO）提供的Myco6in1+黴菌毒素分析套組按照Myco6in1+分析套組手冊中描述的標準方案萃取。十二種不同的黴菌毒素係藉由LC-QTOF使用Myco6in1+ LC/MS/MS使用說明書中描述的方案分析。使用置於蒙大納州立大學之質譜儀核心設施的連接Agilent 1290 HPLC之Agilent 6538 Q-TOF以鑑認與定量毒素。使用伏馬鐮孢菌毒素B1及伏馬鐮孢菌毒素B2作為可靠標準品。
所有所測試毒素的測量值皆低於美國食品及藥物管理局所設定之人類消耗之管制水平（表11）。測量水平比管制水平低至少一個數量級，除了於樣本4中找到的總黃麴毒素外，其係8.76 ng/g，相較於20 ng/g的管制水平。然而，用於黃麴毒素製造之基因並未在品系MK7中出現，因此預期此毒素之來源係來自蛋白腖與其他用於該培養基中的成分之污染而非MK7之產物。
表 11.品系MK7之生質中黴菌毒素的定量。
樣本# 1 2 3 4 5 管制限制
   -----------定量（ng/g）（濕重）---------- ng/g
黃麴毒素B1 0.03 0.04 0.02 0.49 0.02 20*
黃麴毒素B2 0.33 3.13 0.12 0.80 0.10 20*
黃麴毒素G1 0.02 0.02 0.04 1.91 0.04 20*
黃麴毒素G2 0.20 0.03 0.56 5.56 0.49 20*
赭麴毒素A 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 未建立
去氧雪腐鐮孢菌烯醇 0.24 0.10 0.02 0.13 0.02 1,000
伏馬鐮孢菌毒素B1 0.00 0.91 0.00 4.41 0.00 2,000ƚ
伏馬鐮孢菌毒素B2 0.00 17.40 0.04 89.58 0.02 2,000ƚ
雪腐鐮孢菌烯醇 0.12 0.08 0.04 0.37 0.04 未建立
T-2毒素 0.07 0.00 0.02 0.00 0.03 未建立
HT-2毒素 0.13 0.11 0.04 0.14 0.05 未建立
玉米烯酮 0.00 0.00 0.04 0.37 0.04 未建立
*總黃麴毒素 ƚ總伏馬鐮孢菌毒素
MK7培養基與生質之非毒性特徵係進一步藉由利用大型水蚤（ Daphnia magna，一種一般用於毒性分析之高度敏感的巨無脊椎動物）的生物分析驗證（EPA Publication, 1987；Guilhermino等人，2000）。活的大型水蚤係自Carolina Biological Supply（柏林頓，NC）購買並於該供應商所提供的手冊中描述的條件下生長。於生長及觀察24個小時後，將水蚤用於該毒性實驗。將30 mL的以下者充入三個Petri皿：30%之如於實施例3中描述地在接種體反應器生長共6日之MK7培養物（MK7及MK7-1培養基）、與70%大型水蚤於其中運送的水。對於實驗對照組，以30 mL的運送水充入三個額外的Petri皿。將七隻呈現為活的大型水蚤加至該六個Petri皿之各者並每日觀察共三日。大型水蚤之死亡被定義成於1分鐘後無可看見的移動。於3日期間在以MK7培養基及生質與實驗對照組處理的大型水蚤間並未觀察到存活率之顯著差異（對於各個處理而言於3日後平均1.2隻死亡每Petri皿）。
亦於金魚（鯽魚（ Carassius auratus））上測試品系MK7生質之毒性。二個相同的5.7 L魚缸、泵浦與過濾器係自在波司曼，MT的Petco購買（Aqueon型號# E414W，富蘭克林，WI）。將5.7 L自Albertson氏超市，波司曼蒙大納購買的Poland泉水充入該等魚缸。六隻金魚（長度~ 3 cm）係自Petco（波司曼，MT）購買並於每個魚缸中放入三隻。一個魚缸每日接受約0.05 g的乾燥TetraFin Goldfish Flaskes Plus（Blacksberg，VA）魚飼料（自Petco，波司曼，MT購買）。另一個魚缸每日接受約0.0.05 g的乾燥之品系MK7生質。潮濕MK7生質係自根據於實施例3中描述的方案製造的盤式反應器之一者獲得。MK7生質係藉由自一個盤移出40 g的MK7製備（參見實施例3）並將該生質放置在250 mL燒杯中。該潮濕生質接著係使用GE微波（型號WES1452SS1SS）微波共30秒。該乾燥的生質具有小於0.5%的含水量。接著使用不鏽鋼刮勺將生質壓碎以形成與TetraFin Goldfish Flaskes大小相似的小型薄片。於餵食60日後所有的魚皆存活且顯得為健康的（強有力地游泳）且顯示對於食用MK7製造之生質墊的明顯熱情。該實驗係於60日後終止。 SEQ ID NO:1 命名為品系 MK7 的嗜酸性絲狀真菌物種之 18S rRNA 與 ITS 區域 DNA 序列
CCGCGGGGAATACTACCTGATCCGAGGTCACATTCAGAGTTGGGGGTTTACGGCTTGGCCGCGCCGCGTACCAGTTGCGAGGGTTTTACTACTACGCAATGGAAGCTGCAGCGAGACCGCCACTAGATTTCGGGGCCGGCTTGCCGCAAGGGCTCGCCGATCCCCAACACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAATTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGTTCTCACCTACGGATAGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCCATTGTTGCCTCGGCCGGATCAGCCCGCTCCCGGTTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGTACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACACGCATCTCTTGCTTCTGTCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAGTCATGTGATTGCACATTCAGTGAATCATCGATCTTGACGCACATTGCGCCTGCAGTATTCTGGCGGTCATGCCTGTTCGAGCGTCATTCAGCCCTCAGCCCTCGGTTGTGTTCGGGATCGGCGAGTCCTGCGCCAGCGACCGGATCAGTGGCGTCTGCCTGCGCCTCCATTGCGGTTAGAGTTAAGCCCTCGCCCACTTGTTTTACGCTAAC SEQ ID NO:2 轉譯延長因子 1 α （ Tef1 ）
ATGATCACTGGTACTTCCCAGGCCGATTGCGCCATTCTCATCATTGCCGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCACGCTCTTCTTGCCTACACCCTTGGTGTCAAGAACCTCATCGTCGCCATCAACAAGATGGACACCACCAAGTGGTCTGAGGCCCGTTACCAGGAGATCATCAAGGAGACCTCCTCCTTCATCAAGAAGGTCGGCTACAACCCCAAGGCTGTCGCTTTCGTCCCCATCTCCGGTTTCAACGGTGACAACATGCTTACCCCCTCCACCAACTGCCCCTGGTACAAGGGTTGGGAGCGTGAGATCAAGTCCGGCAAGCTCACCGGCAAGACCCTCCTCGAGGCCATTGACTCCATCGAGCCTCCCAAGCGTCCCGTTGACAAGCCCCTCCGTCTTCCCCTCCAGGATGTCTACAAGATCGGTGGTATTGGAACGGTTCCCGTCGGCCGTATTGAGACTGGTGTCATCAAGCCCGGTATGGTCGTTACCTTCGCTCCCTCCAACGTCACCACTGAAGTCAAGTCCGTCGAGATGCACCACGAGCAGCTCAGTGAGGGCCAGCCCGGTGACAACGTTGGTTTCAACGTGAAGAACGTCTCCGTCAAGGACATCCGACGTGGTAACGTCGCTGGTGACTCCAAGAACGACCCCCCCCAGGGTGCCGCTTCTTTCACCGCCCAGGTCATCGTCCTCAACCACCCCGGCCAGGTCGGTGCTGGTTACGCTCCCGTCCTCGATTGCCACACTGCCCACATTGCCTGCAAGTTCGCCGAGATCCAGGAGAAGATCGACCGCCGAACCGGTAAGGCTACTGAGGCCGCTCCCAAGTTCATCAAGTCTGGTGACTCCGCCATCGTCAAGATGGTTCCCTCCAAGCCCATGTGTGTCGAGGCTTTCACTGACTACCCTCCTCTGGGTCGTTTCGCCGTCCGTGACATGCGACAGACTGTCGCCGTCGGTGTCATCAAGGCCGTCGAGAAGTCCACCGGTGCTGCTGGCAAGGTCACCAAGTCCGCTGCCAAGGCCGCCAAGAAATAA SEQ ID NO:3 微管蛋白 β 鏈（ Tub1 ）：部分序列
GTGGATCTTGAGCCCGGTCCTCAGGATGCCATCCGCGCCGGGCCCCTAGGCCAGCTTTTCCGCCCCGACAACTTCGTCGCCGGAAATGCCAGCGCCGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCATTACACCGAAGGTGCTGAGCTCGTTGAGGAGGCCATCGATGTTGTGCGACACGAGGTTGAGAACTGTGACCATCTTCAGGGTTTCCAGCTCACCCACTCTCTCGGCGGTGGTACCGGTTCTGGTATGGGAACGCTTCTTCTGTCGAAAATCCGTGAGGAGTTTCCCGATCGCATGATGGCTACTTTTTCCGTTATGCCTTCGCCTAAGGTTTCTGATACCGTTGTCGAACCTTACAACGCCACTTTGTCATTGAACCAGCTTGTCGAGAACTCCGATGAGACCTTCTGTATCGATAACGAGGCTTTGTACGACATTTACGAGAAGACCCTGAAGATTGCTGATCCTTCTTACGCCGATCTC 參考文獻
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無
圖 1. A 、 B：在黃石國家公園於熱泉環境中之天然的品系MK7； C 、 D：在不同人工條件下製造之品系MK7生質，其顯示高密度、高抗張力黏著性純生質； E： C 、 D之品系MK7生質之截面。
圖 2.用於產生接種體之例示性10 L生物反應器。
圖 3. A：顯示自第2代保管培養物收集之白色菌絲體墊之環； B：具有品系MK7菌絲體墊之Petri培養盤。
圖 4.於10 L生物反應器中欲用於接種盤式反應器之品系MK7培養物之生長與pH。甘油含量為7.5%且C:N比率為7.5:1之MK7-1液體培養基。用作為接種體之最理想培養物係於72與90個小時間產生，於當時該生質係處於晚期指數生長期（於箭頭之間）。
圖 5. A：用作為用於製造生物墊之盤式反應器的盤。該盤中的尺標係31.75 cm（12.5 英吋）長； B：由用於容納39個塑膠盤之盤架系統所組成之生物反應器。整個反應器被包裹在類Saran®透明塑膠保鮮膜內。
圖 6.為了高脂質製造而培養在有限氮條件下（40:1之C:N比率）於8日之表面發酵後在有1.5公升之MK7-1培養基與125 g/L甘油之0.25 m 2盤中所收穫之品系MK 7生物墊。
圖 7.品系MK7於淺盤中之典型生長模式，其顯示生質累積速率相對低之遲滯期0 – 1.5日）、與於其指數生長開始之生物墊形成之時間（箭頭，1.5日）。利用7.5%甘油與30:1 C:N比率於MK7-1培養基中生長之生物墊。
圖 8.在甘油上於範圍在三個數量級之盤尺寸生長之品系MK7生物墊之乾重。
圖 9.隨著培養持續期間與溫度變化之由品系MK7製造之次亞麻油酸。4%甘油表面發酵；pH 2.8與MK7-1培養基。
圖 10.使用MK7-1培養基+甘油製造之5日齡MK7生物墊之截面之透射光顯微鏡影像。 A、 B：50X放大，顯示三個層：氣生菌絲層、過渡帶層、與緻密底層； C：50X放大，顯示二個不同的層。
圖 11.使用MK7-尿素培養基製造之5日齡MK7生物墊之截面顯微圖。 A：品系MK7生物墊之頂面，其展現自緻密菌絲體層延伸出之氣生菌絲與菌絲體。使用透射光顯微鏡於100X倍率下產生之影像； B：品系MK7生物墊之頂面，其展現自緻密菌絲體層延伸出之氣生菌絲與菌絲體。使用透射光顯微鏡於400X倍率下產生之影像； C：品系MK7生物墊之底面，其展現菌絲與菌絲體。使用透射光顯微鏡於400X倍率下產生之影像； D：品系MK7生物墊之緻密內部，其展現其之糾纏之纖維狀組成物。使用透射光顯微鏡於400X倍率下產生之影像。
圖 12. A、 B：在0.25 m 2盤上使用pH 4.1 MK-7培養基利用5%甘油生長共6日之寡孢根黴菌（ Rhizopus oligosporus）之生物墊。 C：於墊子中之寡孢根黴菌菌絲之400x光顯微鏡影像。
圖 13.於0.25 m 2盤反應器中生長於 A：4日、與 B：6日後之毒鐮孢菌之影像。生物墊係使用pH 5.0之MK7-1培養基與12.5%甘油生長。影像C顯示使用光顯微鏡以400x倍率取得之毒鐮孢菌之菌絲形式。於此等條件下，毒鐮孢菌於二個盤製造每盤平均71 g之乾燥生質。
圖 14. A：收穫藉由固態發酵（SSF）培養之品系MK7生質，其顯示品系MK7以＜5 g品系MK7乾重生質/L（培養基:原料混合物）完全併入木質織維素中。 B：A之所收穫之品系MK7生質之顯微照片影像，其顯示絲狀構造隨機地併入小麥桿中。C：透過固態基質表面發酵（SSSF）之品系MK7生物墊，其顯示緻密（180 g.L）、黏著性實質上純的品系MK7生質。
圖 15.使用種種處理於12.7 X 12.7 cm盤共7日之品系MK7之培養。誤差槓係三個盤之標準差。
圖 16.左：以12.5%甘油於pH 2.7培養8日後之品系MK7之光學顯微鏡影像。右：尼羅紅染色後之螢光影像，指出高百分比之脂質，估計於40-60%之細胞面積間。
圖 17.由品系MK7製造之脂質之輪廓。（ 左圖）於直接轉酯化（總燃料潛能）及可萃取脂質部分中的總脂肪酸甲酯（FAME）之平均，其隨著培養基C：N比率變化（n=3）。可萃取脂質部分條內之各條代表三-、二-與單-醯基甘油酯（TAG、DAG、MAG）及自由脂肪酸（FFA）組份。插入圖顯示GC-FID層析圖，其中TAG分子佔脂質部分之主要部分。（ 右圖）從所有脂肪酸至FAME之直接轉酯化（直接）產生之脂質及從單單可萃取脂質先驅物（可萃取的）衍生之FAME之FAME輪廓。插入圖顯示直接與可萃取部分之GC-MS層析圖。
圖 18.在酸性乳清代用物培養基（AWS）上於4.8之最初pH下生長7日後之品系MK7生物墊（ A、 B、 C）。顯示該材料之絲狀性質的生物墊之透射光顯微鏡影像（400X）（ C）。
國內寄存資訊[請依寄存機構、日期、號碼順序註記] 財團法人食品工業發展研究所、106年6月20日、BCRC930188 國外寄存資訊[請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記] 美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、2010年3月2日、寄存號碼PTA-10698 
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          atgatcactg gtacttccca ggccgattgc gccattctca tcattgccgc cggtactggt       60
          gagttcgagg ctggtatctc caaggatggc cagacccgtg agcacgctct tcttgcctac      120
          acccttggtg tcaagaacct catcgtcgcc atcaacaaga tggacaccac caagtggtct      180
          gaggcccgtt accaggagat catcaaggag acctcctcct tcatcaagaa ggtcggctac      240
          aaccccaagg ctgtcgcttt cgtccccatc tccggtttca acggtgacaa catgcttacc      300
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          cacactgccc acattgcctg caagttcgcc gagatccagg agaagatcga ccgccgaacc      840
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          gtggatcttg agcccggtcc tcaggatgcc atccgcgccg ggcccctagg ccagcttttc       60
          cgccccgaca acttcgtcgc cggaaatgcc agcgccggta acaactgggc caagggtcat      120
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          ccgcggggaa tactacctga tccgaggtca cattcagagt tgggggttta cggcttggcc       60
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Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (44)

  1. 一種菌絲體生物墊，其包含絲狀真菌生質，其中所述生物墊為實質上純的真菌生質且其中該生物墊包含氣生菌絲，及其中所述生物墊已被選自該生質去活化、該生質中酶失活及其組合之程序處理。
  2. 如請求項1的菌絲體生物墊，其中所述生物墊包括底層及氣生菌絲層；其中該底層相較於該氣生菌絲層較緻密；其中該底層係由排列成第一方向的長絲狀構造構成且該氣生菌絲之方向主要與該第一方向垂直。
  3. 如請求項2的菌絲體生物墊，其中所述生物墊包括第三過渡帶層。
  4. 如請求項2或3的菌絲體生物墊，其中所述底層係由排列成與該生物墊:空氣及/或生物墊:培養基介面平行的長絲狀構造構成。
  5. 如請求項2至4中任一項的菌絲體生物墊，其中所述氣生菌絲之方向主要與該生物墊:空氣及/或生物墊:培養基介面垂直。
  6. 如請求項1至5中任一項的菌絲體生物墊，其中所述生物墊的抗張力為至少0.2 kg/cm墊寬。
  7. 如請求項1至6中任一項的菌絲體生物墊，其中所述細胞密度為至少25 g乾重/L培養基、至少50 乾重/L培養基或至少75 乾重/L培養基。
  8. 如請求項1至7中任一項的菌絲體生物墊，其中所述生物墊為1 mm至30 mm厚。
  9. 如請求項1至8中任一項的菌絲體生物墊，其中所述生物墊的蛋白質含量為至少40%。
  10. 如請求項1至9中任一項的菌絲體生物墊，其中所述生物墊的脂肪含量為至少39%。
  11. 一種絲狀真菌生物墊，其包含至少一個細胞層，其中所述生物墊之細胞密度為至少25 g乾重/ L培養基且為1 mm至30 mm厚
  12. 一種產生生物墊的方法，其係透過表面發酵方法產生，其包含： 將有效量的至少一種絲狀真菌接種至人工生長培養基；及 透過表面發酵在不受擾動狀態下培養所述經接種的生長培養基來產生絲狀真菌生物墊。
  13. 如請求項12的方法，其進一步包含收穫該絲狀真菌生物墊。
  14. 如請求項12的方法，其進一步包含向所述生物墊進行選自生物墊去活化、該生物質中酶失活及其組合之處理程序。
  15. 一種生長真菌菌絲體的方法，其包含下列步驟： 提供多個容器，每個容器都有裝有培養基及真菌的空腔； 將該等容器置入密閉培養室； 將該密閉培養室維持在足以產生真菌菌絲體生質的經控制環境條件； 將空氣流動導至該培養室； 於每個容器中培養該培養基及真菌；及 將該空氣流動越過於各容器中之該培養基及真菌； 其中該培養為足以使該真菌消化該培養基並於各容器中產生該真菌菌絲體生質之一段時間。
  16. 如請求項15的方法，其中所述真菌菌絲體生質為實質上純的。
  17. 如請求項15的方法，其中所述空氣流動係被側面地引導到該等容器的該密閉培養室。
  18. 如請求項17的方法，其中所述空氣流動係被水平地引導到該等容器。
  19. 如請求項15的方法，其中該等容器係在該培養室內堆疊成多個垂直間隔的行。
  20. 如請求項15的方法，其中所述經控制環境條件包含相對濕度、二氧化碳含量及溫度。
  21. 如請求項20的方法，其中所述經控制環境條件係選自由維持在90%-100%之相對濕度、維持在30 oC-37 oC之溫度及其組合所組成之群。
  22. 如請求項15的方法，其中所述空氣流動在培養的過程中被調整。
  23. 如請求項15的方法，其中所述真菌菌絲體包含氣生菌絲。
  24. 如請求項15的方法，其中所述將該空氣流動越過於各容器中之該培養基及真菌包含將該空氣流動穿過於各容器中之該培養基及真菌之表面。
  25. 如請求項15的方法，其中所述真菌菌絲體生質係為真菌菌絲體生質之生物墊。
  26. 如請求項25的方法，其中所述真菌菌絲體生質係實質上純的。
  27. 如請求項15的方法，其中所述真菌菌絲體生質進一步包含細胞外多醣。
  28. 如請求項15的方法，其進一步包含將該空氣流動引導到該等容器中之生長菌絲體。
  29. 如請求項15的方法，其中所述容器沒有配備蓋子。
  30. 如請求項15的方法，其中所述培養基係選自由充滿液體之固體、液體及凝膠所組成之群。
  31. 如請求項15的方法，其中所述培養基係選自由覆蓋固體碳基質之液體及液體所組成之群。
  32. 一種真菌菌絲體生質，其中所述真菌菌絲體生質係為墊子的形式，為實質上純的真菌生質，且包含氣生菌絲。
  33. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述真菌菌絲體生質係經選自由生存之去活化、酵素之失活及其組合所組成之處理方式處理。
  34. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述真菌菌絲體生質具有至少40%之蛋白質含量。
  35. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述生物墊包含底層及氣生菌絲層，其中該底層相較於該氣生菌絲層較緻密，其中該底層包含排列成第一方向的絲狀構造，且該氣生菌絲之方向主要與該第一方向垂直。
  36. 如請求項35的真菌菌絲體生質，其中所述生物墊包含第三過渡帶層。
  37. 如請求項35的真菌菌絲體生質，其中所述底層包含傾向排列成與選自由生物墊/空氣介面及生物墊/培養基介面所組成之介面群平行的絲狀構造。
  38. 如請求項35的真菌菌絲體生質，其中所述氣生菌絲之方向主要與該至少一種介面垂直。
  39. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述細胞密度為至少25 g乾重/L培養基、至少50 g乾重/L培養基或至少75 g乾重/L培養基。
  40. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述生物墊係1 mm至30 mm厚。
  41. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述生物墊具有至少39%的脂肪含量。
  42. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述生物墊的抗張力為至少0.05 kg/cm墊寬。
  43. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述生物墊的抗張力為至少0.2 kg/cm墊寬。
  44. 如請求項32的真菌菌絲體生質，其中所述真菌菌絲體生質進一步包含細胞外多醣。
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