CN106947702B - 一种侧耳属一级菌种复合培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种侧耳属一级菌种复合培养基，该复合培养基包括马铃薯、补充碳源、补充氮源、维生素及无机盐，所述补充碳源为鼠尾草多糖，所述补充氮源为酵母粉、牛肉膏或蛋白胨中的一种，所述维生素为VB6，所述无极盐包括磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙。本发明利用鼠尾藻多糖提取物作为一种迟效碳源，使侧耳属食用菌的一级菌种生长旺盛，菌丝体浓密粗壮、生长均匀、菌丝萌发点多，生长周期短，有效保证了菌种的活力，有利于在二次高盐的培养基上生长，为产业化人工栽培育种节约了大量的人力物力；本发明技术方案有利于鼠尾藻资源的再利用、成本低、有利于规模化产业生产。
Description
技术领域
本发明涉及菌种的培养基，具体涉及一种侧耳属一级菌种复合培养基及其制备方法。
背景技术
侧耳属真菌具有丰富的营养物质，包括多糖、蛋白质、氨基酸、脂肪酸等，这些生物活性成分具有提高机体免疫力、延缓衰老、抗疲劳、抗肿瘤、调节血糖、调节血脂、化学预防等重要作用。侧耳属真菌具有药理活性，对人体具有养身保健作用，是一类良好的具有极大药用潜质和食用价值的食用菌。侧耳属主要有平菇、榆黄菇、姬菇、鲍鱼菇等，其中榆黄菇和平菇为重要药用真菌，目前人工大面积栽培较少，资源有限，需深入研究和开发。目前各大高校实验室用的侧耳属的一级培养基均为PDA培养基(即土豆培养基)，其中常常通过添加葡萄糖作为补充碳源，这种培养基培养得到的菌丝长势不好，且葡萄糖的价格较贵，不利于生产中使用。
凡能为食用菌提供碳素营养的物质，称为碳源，碳源是构成细胞物质的主要元素，也是能量的来源，碳素约占菌体成分的50％～65％，因菌体的多数物质皆以碳素为骨架。微生物选择碳源与自身代谢系统有关，微生物往往能利用多种碳源。侧耳属食用菌属于异养型的真菌，只能以有机碳为碳源，侧耳属食用菌吸收的碳素约20％用于合成细胞，80％用于维持生命活动所需的能量。鼠尾藻产于海礁、浪岗、嵊山、中街山、普陀山、象山港、韭山、大陈、洞头、南虎、大渔等地，广分布于我国沿海，鼠尾藻富含鼠尾藻多糖。鼠尾藻多糖是从鼠尾藻中提取得到的一种白色海绵状水溶性多糖，现有技术研究表明，鼠尾藻多糖是一类多组分的混合物，由不同的单糖基通过糖苷键相连形成，其主要组成单糖为吡楠糖，目前，关于将鼠尾藻多糖用于菌种培养基的组成成分未见报道。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种侧耳属一级菌种复合培养基及其制备方法，该培养基利用鼠尾藻多糖作为补充碳源，有效解决了我国沿海鼠尾藻资源严重浪费的问题，同时促进了侧耳属一级菌种的生长，使用该培养基培育的菌丝体浓密粗壮、气生菌丝多、生长周期短，有效保证了菌种的活力，为产业化人工栽培育种节约了大量的人力物力。
一种侧耳属一级菌种复合培养基包括马铃薯、补充碳源、补充氮源、维生素及无机盐，所述补充碳源为鼠尾草多糖，所述补充氮源为酵母粉、牛肉膏或蛋白胨中的一种，所述维生素为VB6，所述无机盐包括磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙。
作为优选的技术方案，一种侧耳属一级菌种复合培养基包括马铃薯、补充碳源、补充氮源、维生素及无机盐，所述补充碳源为鼠尾藻多糖，所述补充氮源为蛋白胨，所述维生素为VB6，所述无机盐包括磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙。
作为优选，所述鼠尾藻多糖为鼠尾藻多糖粗提物，其鼠尾藻多糖含量在20-40％。
作为优选，所述鼠尾藻多糖粗提物的制备可以采用微波法提取、超声波法提取或超声波酶法提取制备得到，优选为微波法提取制备得到。
作为优选的技术方案，一种侧耳属一级菌种复合培养基，包括以下组分(1L):
马铃薯 140-160g，
蛋白胨 1.4-1.6g，
VB6 0.015mg，
磷酸二氢钾 2.0g，
硫酸镁 1.0g，
氯化钙 0.05g，
20-40％鼠尾草多糖粗提物 40-60g，
琼脂 20g。
作为优选的技术方案，一种侧耳属一级菌种复合培养基，包括以下组分(1L):
马铃薯 150g，
蛋白胨 1.5g，
VB6 0.015mg，
磷酸二氢钾 2.0g，
硫酸镁 1.0g，
氯化钙 0.05g，
20-40％鼠尾草多糖粗提物 40-60g，
琼脂 20g。
一种侧耳属一级菌种复合培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)新鲜马铃薯洗净去皮，切成小块，装入烧杯(量杯)中，放入自来水，加热煮沸维持20～30min，至马铃薯酥而不烂为度，加热过程中稍加搅拌，然后用四层纱布过滤，取其滤液，得马铃薯汁液；
2)在马铃薯汁液中加入琼脂，继续加热搅拌至琼脂完全溶化，最后加入鼠尾藻海藻多糖，蛋白胨，VB6，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙，用自来水定容，用1mol.L-1的NaOH调节PH值，至7.0。
3)放在高压灭菌锅中121℃，灭菌30min，自然降温到60℃左右出锅。
侧耳属食用菌能分泌降解高分子物质的胞外酶，如水解酶，氧化酶等，将多糖等复杂的物质分解成可溶于水、能被细胞吸收利用的小分子物质。平菇、榆黄菇和桃红平菇、姬菇、鲍鱼菇等侧耳属食用菌是一些分泌胞外酶能力很强的菌种，这些胞外酶(水解酶或氧化酶)把复杂的物质变成简单、可利用的物质，通过细胞壁的渗透作用把可溶性物质吸收到体内，再通过胞内酶在有氧的条件下以呼吸作用取得能量。
本发明复合培养基对原有培养基进行了改良，利用鼠尾藻多糖粗提物代替了昂贵的葡萄糖，这种复合培养基培养出来的侧耳属食用菌的菌丝生长速度快，菌丝强壮；鼠尾藻多糖提取物中除了含有鼠尾藻多糖外，还含有多种溶于水的各种微量元素，在刺激菌丝迅速生长的同时又可被菌丝体充分吸收贮存，提高菌丝抗性，解决中国沿海鼠尾藻资源严重浪费的问题；本发明利用鼠尾藻多糖提取物作为一种迟效碳源，使侧耳属食用菌的一级菌种生长旺盛，菌丝体浓密粗壮、生长均匀、菌丝萌发点多，生长周期短，有效保证了菌种的活力，有利于在二次高盐的培养基上生长，为产业化人工栽培育种节约了大量的人力物力；本发明的技术方案有利于鼠尾藻资源的再利用、成本低、有利于规模化产业生产。
具体实施方式
本发明鼠尾藻多糖粗提物的制备方法可以参考现有技术的制备方法，如微波法提取、超声波法提取或超声波酶法提取，本实施例1-4中鼠尾草多糖粗提物的制备方法参考黎庆涛等微波法提取鼠尾藻多糖的工艺研究中的最优技术方案制备得到，具体工艺为：微波时间8min，微波功率540W，料液比1:30，超声时间3min，得到的粗多糖含量为26.7％。
1L平板培养基A的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取150g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止，用四层纱布过滤，得到滤液。称取蛋白胨1.5g，VB6 0.015mg，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，氯化钙0.05g，鼠尾草多糖60g，琼脂20g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，于121℃下灭菌30min，分装于大培养皿中，每个大培养皿18ml。
1L平板培养基B的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取140g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止，用四层纱布过滤，得到滤液。称取蛋白胨1.5g，VB6 0.015mg，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，氯化钙0.05g，鼠尾草多糖50g，琼脂18g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，于121℃下灭菌30min，分装于大培养皿中，每个大培养皿18ml。
1L平板培养基C的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取160g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止，用四层纱布过滤，得到滤液。称取蛋白胨1.5g，VB6 0.015mg，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，氯化钙0.05g，鼠尾草多糖40g，琼脂22g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，于121℃下灭菌30min，分装于大培养皿中，每个大培养皿18ml。
1L平板培养基D的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取150g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止，用四层纱布过滤，得到滤液。称取蛋白胨1.5g，VB6 0.015mg，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，氯化钙0.05g，葡萄糖20g，琼脂20g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，于121℃下灭菌30min，分装于大培养皿中，每个大培养皿18ml。
1L平板培养基E的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取140g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止，用四层纱布过滤，得到滤液。称取蛋白胨1.5g，VB6 0.015mg，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，氯化钙0.05g，葡萄糖20g，琼脂18g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，于121℃下灭菌30min，分装于大培养皿中，每个大培养皿18ml。
1L平板培养基F的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取160g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止，用四层纱布过滤，得到滤液。称取蛋白胨1.5g，VB6 0.015mg，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，氯化钙0.05g，葡萄糖20g，琼脂22g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，于121℃下灭菌30min，分装于大培养皿中，每个大培养皿18ml。
1L斜面活化母种培养基的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取150g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止。用四层纱布过滤，得到滤液。称取葡萄糖20g，琼脂20g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，分装试管中，于121℃下灭菌30min。
1L平板活化培养基的制备：将马铃薯去皮，挖去牙眼，清洗干净后称取150g后，切片后加水煮沸，至马铃薯片煮至熟而不烂为止。用四层纱布过滤，得到滤液。称取葡萄糖20g，琼脂20g，并用水定容至1000ml，加热搅拌至琼脂全部溶化为止，于121℃下灭菌30min，分装在小培养皿中，每个小培养皿10ml。
本发明中的侧耳属(Pleurotus)的菌种，平菇(Pleurotus ostreatus)、榆黄菇(Pleurotus citrinopileatus)、佛罗里达平菇(Pleurotus florida)、鲍鱼菇(Pleurotusabalonus)的母种可以通过商业途径购买得到，本发明实施例中的侧耳属菌种从山东济宁第一食用菌研究所购买得到，采用传统的土豆培养基冰箱中冷藏进行菌种保藏，以备实验所用。
高压灭菌锅：Hirayama，HVE-50，50L。
大培养皿型号：100mm直径。
小培养皿型号：50mm直径。
观测方法：每天定时测量菌丝生长速度、生长密度、菌丝色泽、菌丝萌发时间及满皿时间；菌落生长量指标：++++菌落整齐，菌丝多，浓白；+++整齐，较多，浓白；++较整齐，较多，白色；+不整齐，菌丝生长势弱。菌丝生长速度＝培养皿的直径(mm)/满皿时间(d)。
实施例1
将保藏在冰箱中的平菇(Pleurotus ostreatus)菌种无菌条件下接种在斜面活化母种培养基上，接种5管，恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养5d。5d后选取生长状况最好的活化菌株，无菌条件下接种到PDA平板正中央，以保证菌落边缘连续，菌丝生长均匀，保证下一步打孔接种所使用的菌丝生长情况相同或相近。每个菌株接种5个小平板(小培养皿)。恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养8d。
选取培养8天后生长状况最好的平板，无菌条件下，在与平板中央距离相同的生长有菌丝的培养基上，用打孔器打成均一的小块，直接为5mm，分别接种到平板培养基A、B、C、D、E、F中央(大培养皿)，每种培养基设置5个重复。每天定时测量菌丝生长速度、生长密度、菌丝色泽、菌丝萌发时间及满皿时间，实验结果见表1。
表1
实施例2
将保藏在冰箱中的榆黄菇(Pleurotus citrinopileatus)菌种无菌调节下接种在斜面活化母种培养基上，接种5管，恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养5d。5d后选取生长状况最好的活化菌株，无菌条件下接种到PDA平板正中央，以保证菌落边缘连续，菌丝生长均匀，保证下一步打孔接种所使用的菌丝生长情况相同或相近。每个菌株接种5个小平板(小培养皿)。恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养8d。
选取培养8天后生长状况最好的平板，无菌条件下，在与平板中央距离相同的生长有菌丝的培养基上，用打孔器打成均一的小块，直接为5mm，分别接种到平板培养基A、B、C、D、E、F中央(大培养皿)，每种培养基设置5个重复。每天定时测量菌丝生长速度、生长密度、菌丝色泽、菌丝萌发时间及满皿时间，实验结果见表2。
表2
实施例3
将保藏在冰箱中的佛罗里达平菇(Pleurotus florida)菌种无菌调节下接种在斜面活化母种培养基上，接种5管，恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养5d。5d后选取生长状况最好的活化菌株，无菌条件下接种到PDA平板正中央，以保证菌落边缘连续，菌丝生长均匀，保证下一步打孔接种所使用的菌丝生长情况相同或相近。每个菌株接种5个小平板(小培养皿)。恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养8d。
选取培养8天后生长状况最好的平板，无菌条件下，在与平板中央距离相同的生长有菌丝的培养基上，用打孔器打成均一的小块，直接为5mm，分别接种到平板培养基A、B、C、D、E、F中央(大培养皿)，每种培养基设置5个重复。每天定时测量菌丝生长速度、生长密度、菌丝色泽、菌丝萌发时间及满皿时间，实验结果见表3。
表3
实施例4
将保藏在冰箱中的鲍鱼菇(Pleurotus abalonus)菌种无菌调节下接种在斜面活化母种培养基上，接种5管，恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养5d。5d后选取生长状况最好的活化菌株，无菌条件下接种到PDA平板正中央，以保证菌落边缘连续，菌丝生长均匀，保证下一步打孔接种所使用的菌丝生长情况相同或相近。每个菌株接种5个小平板(小培养皿)。恒湿培养箱25℃，相对湿度为50％，遮光培养8d。
选取培养8天后生长状况最好的平板，无菌条件下，在与平板中央距离相同的生长有菌丝的培养基上，用打孔器打成均一的小块，直接为5mm，分别接种到平板培养基A、B、C、D、E、F中央(大培养皿)，每种培养基设置5个重复。每天定时测量菌丝生长速度、生长密度、菌丝色泽、菌丝萌发时间及满皿时间，实验结果见表4。
表4
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种侧耳属一级菌种复合培养基，其特征在于所述复合培养基由以下组分组成：
马铃薯 140-160g，
蛋白胨 1.4-1.6g，
VB6 0.015mg，
磷酸二氢钾 2.0g，
硫酸镁 1.0g，
氯化钙 0.05g，
20-40%鼠尾藻多糖粗提物 40-60g，
琼脂 20g 。
2.根据权利要求1所述的一种侧耳属一级菌种复合培养基，其特征在于所述鼠尾藻多糖粗提物采用微波法提取、超声波法提取或超声波酶法提取制备得到。
3.根据权利要求2所述的一种侧耳属一级菌种复合培养基，其特征在于所述鼠尾藻多糖粗提物采用微波法提取制备得到。
4.根据权利要求1所述的一种侧耳属一级菌种复合培养基，其特征在于1L培养基由以下组分组成:
马铃薯 150g，
蛋白胨 1.5g，
VB6 0.015mg，
磷酸二氢钾 2.0g，
硫酸镁1.0g，
氯化钙 0.05g，
20-40%鼠尾藻多糖粗提物40-60g，
琼脂20g。
5.一种如权利要求1所述的侧耳属一级菌种复合培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）新鲜马铃薯洗净去皮，切成小块，装入烧杯或量杯中，放入自来水，加热煮沸维持20～30min，至马铃薯酥而不烂为度，加热过程中稍加搅拌，然后用四层纱布过滤，取其滤液，得马铃薯汁液；
2）在马铃薯汁液中加入琼脂，继续加热搅拌至琼脂完全溶化，最后加入鼠尾藻海藻多糖，蛋白胨，VB6 ，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙，用自来水定容，用1mol.L-1的NaOH调节PH值，至7.0；
3） 放入高压灭菌锅中121℃，灭菌30min，自然降温到60℃出锅。
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|---|---|---|---|---|
| KR20070004154A (ko) * | 2005-07-04 | 2007-01-09 | 박칠동 | 홍삼·인삼 엑기스를 이용 재배한 기능성 느타리버섯 배지조성물. |
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| CN106947702A (zh) | 2017-07-14 |
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