KR102334114B1

KR102334114B1 - 진균을 이용한 스캐폴드 제조 및 이를 이용한 조직 재생방법

Info

Publication number: KR102334114B1
Application number: KR1020190152260A
Authority: KR
Inventors: 한성수; 베드리칸난; 조선미; 최순모
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2021-12-02
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: KR20210063760A

Abstract

본 발명은 진균을 이용한 스캐폴드 제조 및 이를 이용한 조직 재생방법에 관한 것으로, 사상균(Filamentous fungus)으로 진균 스캐폴드를 제조하고, 이를 β-메르캅토에탄올(BME)로 처리함으로써 스캐폴드의 기계적 강도를 향상시킬 수 있으며, 혈액적합성, 세포 부착 및 증식능을 증진시켜 생체적합성이 우수하여 조직 공학용, 재생의학, 상처 치유 등의 응용에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

진균을 이용한 스캐폴드 제조 및 이를 이용한 조직 재생방법{Fabrication of scaffolds using fungi and tissue regeneration method using same}

본 발명은 진균을 이용한 스캐폴드 제조 및 이를 이용한 조직 재생방법에 관한 것이다.

세포 외 기질(extracellular matrix; ECM)은 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸/글리코사미노글리칸(proteoglycans/glycosaminoglycans), 엘라스틴(elastin), 피브로넥틴(fibronectin), 라민(lamin) 및 다른 당단백질(glycoprotein)로 이루어진 3차원(3D) 비세포 네트워크로, 이는 세포와 이들의 복잡한 행동을 지지해주는 역할을 한다.

최근 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산(hyaluronic acid) 및 합성 고분자(폴리비닐알코올(poly(vinyl) alcohol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리락틱-글리콜산 (poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA))와 같은 ECM 단백질의 천연 고분자는 인공 ECM 제조를 위한 생체재료로 이용되어 재생의학용 세포의 부착 및 증식을 위해 사용되고 있다. 그러나 합성 고분자는 독성 화학 가교제 및 생물학적 반응성 작용기의 사용으로 인해 생체 적합성에 위협이 제기되고 있다.

이에 따라 재생의학용 세포의 부착 및 증식을 위한 스캐폴드(scaffold) 생체재료로서 ECM 단백질인 천연 고분자 사용의 필요성이 대두 되고 있다.

그러나 상기 ECM 단백질은 대규모 생산을 위해 재조합 DNA 기술을 사용하여 발현될 수 있다. 이에 따라 스캐폴드(scaffold) 생체재료로서 재조합 기술로 제조된 ECM 단백질을 사용하는 것은 조직공학 응용을 위한 대규모 생산 측면에서 고가라는 한계점이 있어왔다.

따라서, 경제적이며, 세포 부착 및 증식능을 향상시키기 위한 생체적합 스캐폴드 재료 및 이를 이용한 스캐폴드 제조의 개발이 필요한 실정이다.

1. 대한민국등록 특허 10-1363574(2014.02.24. 공고)

본 발명의 목적은 경제적이며, 생체적합성이 우수한 진균 스캐폴드 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 진균 스캐폴드를 이용한 조직 재생방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사상균(Filamentous fungus)으로 이루어진 진균 스캐폴드를 제공한다.

또한, 본 발명은 사상균을 배양하여 균사 매트(mat)를 제조하는 단계; 상기 균사 매트를 멸균 및 동결건조하여 진균 스캐폴드를 제조하는 단계; 및 상기 스캐폴드를 β-메르캅토에탄올로 처리하는 단계; 를 포함하는 진균 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 진균 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법을 제공한다.

본 발명의 진균 스캐폴드는 기계적 강도가 우수한 세포벽을 지닌 사상균(Filamentous fungus) 포자의 배양만으로 제조될 수 있어, 간단하고, 경제적이며, 기계적 강도가 우수한 3차원 다공성의 스캐폴드를 제조할 수 있다.

또한, 진균 스캐폴드를 β-메르캅토에탄올(BME)로 처리함으로써 기계적 강도를 향상시킬 수 있으며, 혈액적합성, 세포 부착 및 증식능을 증진시켜 생체적합성이 우수하여 조직 공학용, 재생의학, 상처 치유 등의 응용에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 FE-SEM은 다분지(highly branched) 되어 네트워크를 형성하는 F-스캐폴드의 표면 형태 이미지를 나타낸 도면으로, 다른 배율에서 BME 처리(0.45M) 전(a, b)과 후(c, d)의 이미지를 나타낸다.
도 2는 F-스캐폴드의 인장강도 및 파단 신장률을 나타낸 도면이다.
도 3은 F-스캐폴드의 TG/DTG 열중량분석을 나타낸 도면이다.
도 4는 F-스캐폴드의 생체 내 분해 가능성 분석을 나타낸 도면이다.
도 5는 용혈작용 분석법을 이용한 BME 처리 여부에 따른 F-스캐폴드의 혈액적합성(Hemocompatibility) 분석 값을 나타낸 도면이다. 값은 세 번의 독립적인 실험으로부터 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 별표(*)는 unpaired t-test (**P≤ 0.01; ***P≤0.001; ****P≤0.0001)에 의해 측정된 양성 대조군과 BME 처리되지 않은 샘플, 및 BME 처리되지 않은 샘플과 BME 처리된 샘플의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 6은 배양 기간에 따른 BME 처리된(0.45 M) F-스캐폴드에 인간 각질세포(keratinocyte)의 대사 활동을 나타낸 그래프이다. 결과 값은 3회 실시한 실험의 평균 ± SD로 나타내었다. 서로 다른 날에 2D (대조군)와 F-스캐폴드에서 배양된 각질세포 대사 활성 사이의 통계적 차이를 unpaired t-test(**P≤0.01; ***P≤0.001)에 의해 측정되었다.
도 7은 BME 처리된(0.45M) F-스캐폴드에서 1, 7, 14 및 21일째 증식된 인간 각질세포의 (A) ×300의 배율에서의 FE-SEM 이미지(스케일 바: 100㎛),(B) DAPI 염색 형광 이미지 및 (C) 살아 있는-죽은 세포 염색 형광 이미지를 나타낸 도면이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 사상균(Filamentous fungus)인 Aspergillus sp.을 이용하여 진균 포자를 배양함으로써 간단하고, 경제적이며, 기계적 강도가 우수한 3차원 다공성의 진균 스캐폴드를 제조할 수 있었으며, 상기 진균 스캐폴드를 β-메르캅토에탄올(BME)로 처리함으로써 혈액적합성, 세포 부착 및 증식능을 증진시켜 생체적합성이 우수하여 조직 공학용, 재생의학, 상처 치유 등의 응용에 유용하게 사용될 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 사상균(Filamentous fungus)으로 이루어진 진균 스캐폴드를 제공한다.

이때, 상기 사상균은 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.), 후사리움 속(Fusarium sp.), 킬린드로클라디움 속(Cylindrocladium sp.), 글로에오필룸 속(Gloeophyllum sp.), 파네로차에테 속(Phanerochaete sp.) 및 카에토미움 속(Chaetomium sp.)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)일 수 있으나, 이에 제한 없이 사상균이면 모두 가능하다.

또한, 상기 사상균을 0.1 내지 0.5M 농도의 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 0.45M의 농도로 처리될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 처리된 사상균의 평균 직경은 1.5 내지 4.5㎛일 수 있다.

또한, 균사 매트는 분생포자를 25 내지 35℃에서 8 내지 12일 동안 정치배양 하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 30℃에서 10일 동안 정치배양하여 제조될 수 있다.

이때, 상기 조건을 벗어나게 되면 분생포자가 제대로 배양되지 않아 본 발명에 따른 3차원의 다공성 스캐폴드를 제조할 수 없어, 스캐폴드 상의 세포 부착 및 증식능이 떨어져 조직 재생의 효과가 발생 되지 않는 문제가 야기 될 수 있다.

본 발명에 따른 사상 균류(filamentous fungi)는 키틴으로 구성된 기계적으로 강한 세포벽을 지닌 진핵 세포이며, 나노 및 마이크로 크기로 딱딱한 실 모양의 구조처럼 자라서 다분지(highly branched) 되어 네트워크를 형성하는 균사체를 형성할 수 있다.

따라서 본 발명의 진균 스캐폴드는 기계적 강도가 우수한 세포벽을 지닌 사상균(Filamentous fungus) 포자의 배양만으로 제조될 수 있어, 간단하고, 경제적이며, 기계적 강도가 우수한 3차원 다공성의 스캐폴드를 제조할 수 있는 특징이 있다.

또한, 상기 β-메르캅토에탄올은 0.1 내지 0.5M의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 0.45M의 농도로 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 진균 스캐폴드의 β-메르캅토에탄올 처리는 스캐폴드에 보다 높은 기계적 강도를 부여하는 다당류 골격을 제공할 수 있으며, 용혈소(hemolysin) 및 기타 진균 스캐폴드 세포 표면 단백질을 제거하여 용혈작용의 감소, 세포의 부착 및 증식능을 향상시켜 우수한 생체적합성 환경을 제공할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 진균 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법을 제공한다.

상기 세포는 피부세포, 연골세포, 뼈세포, 및 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

이때, 상기 줄기세포는 자가 동종 또는 이종 줄기세포일 수 있으며, 구체적으로 중간엽 줄기세포, 배아 줄기세포 및 역분화 줄기세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

조직 공학에서 본 발명에 따른 3D 스캐폴드는 생체 외에서 세포를 배양하여 손상된 부위에 이식하거나 생체 내에서 손상된 부위에 직접 이식할 때 조직 재생을 위한 주형(template)으로 작용하여 새로운 조직의 성장을 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 β-메르캅토에탄올 처리된 진균 스캐폴드를 이용하여 각질세포를 배양한 결과, 도 7과 같이 1일 및 7일에는 세포 부착 및 증식을 나타내었으며, 14일 후에는 각질형성 세포에 의해 다량의 ECM 성분이 형성되고, 스캐폴드 내의 세포의 이동 및 증식이 이루어짐을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 진균 스캐폴드는 조직공학, 의학, 약학 및 재료과학 분야에서 약물, 세포, 단백질 및 성장인자 전달용 재료 또는 인공피부 등으로 폭넓게 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<참고예> 실험재료

감자 덱스트로스 (Potato dextrose; PD) 한천 및 PD 배지는 BD Difco (USA)로부터 구입하였다. 진균 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger)는 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection; KACC 40280)에서 획득하였다. 인간 각질 세포주 (Human keratinocyte cell line; CRL-2310)는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 획득하였다. β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol; BME)은 한국 덕산 순수화학공업(주)에서 구입하였다. Dulbecco 's modified Eagle 배지 (DMEM), Dulbecco's 인산염 완충액(DPBS), 1x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민 용액, 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 0.025% 트립신-EDTA (1X)를 Gibco, Life Technologies(Carlsbad, CA,USA)로부터 구매하였다. 모든 수용액은 Milli-Q 탈이온수 (18 MΩㆍcm, Millipore)로 제조하였다.

< 실시예 1> 진균 균사 매트(mat)의 제조

아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger)를 PD 한천 플레이트(agar plate)에서 배양하고, 멸균된 초순수 증류수에 진균 포자를 모았다. 이러한 분생포자를 200ml의 PD 배지(broth)에 접종하고, 삼각 플라스크에서 30℃의 온도조건으로 10일간 정치배양 하였다. 완전하게 자란 진균 포자 매트를 모으고, 추가 사용을 위해 멸균 증류수로 세척하였다.

< 실시예 2> F- 스캐폴드 제작

진균 균사 매트를 0.5 × 0.5 × 0.3 cm³치수의 원형으로 절단하고, 20%, 40%, 60%, 80%, 90% 및 2 x 100% (v / v) 에탄올로 단계적으로 각각 10분 동안 탈수 및 멸균한 후, 121℃에서 15분간 고압멸균(autoclave)하고 동결건조 시켰다. 동결건조된 진균-스캐폴드(이하 'F-스캐폴드')를 37℃에서 16시간 동안 환원제인 β-메르캅토에탄올(BME) (0.15, 0.3, 0.45M)로 처리하여 균사의 세포 표면에 결합된 단백질을 용해 시켰다.

< 실시예 3> F- 스캐폴드의 특성 분석

BME 처리 전후의 나노/마이크로섬유 F-스캐폴드의 형태, 및 F-스캐폴드에서 각질세포의 증식은 전계-방출주사전자 현미경(Field-emission scanning electron microscopy; FE-SEM) (Model S-4800, Hitachi)을 사용하여 스퍼터링에 의해 스캐폴드를 백금 박막으로 코팅하고, 알루미늄 스터브(stub)에 장착하여 10 및 15 kV의 조건에서 관찰하였다.

BME 처리 후 F-스캐폴드로부터 추출된 단백질을 산-아세톤 침전을 사용하여 침전시키고, Bradford 분석법을 사용하여 정량화하였다.

F-스캐폴드의 기계적 특성은 Instron universal 3345 모델을 활용하여 로드셀은 1kN, 5mm/min의 인장속도로 측정하였다. 크기는 폭 10mm ⅹ길이 20mm ⅹ두께 0.25±0.008 인 샘플로 분석을 진행하였으며, 3회 반복 측정하고, 인장 강도 및 파단 신장률을 기록하였다.

F-스캐폴드의 열중량분석(TG)은 TA instrument unit (Model: SDT Q600)을 활용하여 실온에서 700℃까지(질소를 분당 200cm³주입하고 분당 10℃씩 온도 증가) 측정하였다.

생체 내 분해 가능성을 확인하기 위해 동결건조 된 F-스캐폴드를 정량하고(W1), DPBS(0.1M,pH7.4) 10ml 원심분리 튜브에 함침하여 37℃에서 28일간 분해 정도를 관찰하였다. 1,7,14,21,28일 각각 DPBS를 제거하고 멸균 증류수로 세척 후 실온에서 밤새 건조 시킨 후 무게(W2)를 측정하였으며, : [(W1 - W2)/W1] x 100 방정식을 사용하여 분해로 인한 중량 손실(백분율%)을 계산하였다. 결과는 3번의 독립적인 반복실험의 평균으로 계산하였다.

< 실시예 4> 혈액적합성( Hemocompatibility ) 평가

F-스캐폴드의 체외 혈액적합성 평가는 용혈작용 분석을 사용하여 수행되었다. 간단하게, 돼지 혈액을 채취하여 500×g 에서 10분 동안 원심 분리하여 혈장을 제거하고, 150mM NaCl로 여러번 세척한 후, pH 7.4의 멸균 PBS로 교체하였다. BME- 처리된, 미처리된 F-스캐폴드는 밤새 37℃의 조건으로 PBS에 담가 안정화시켰다. PBS로 희석된 혈액 샘플을 BME-처리된, 미처리된 F-스캐폴드에 첨가하고, 37℃의 수조에서 60분 동안 반응시켰다. 양성 및 음성 대조군은 Triton X-100 및 멸균된 PBS를 각각 혼합하여 반응시켰다. 반응 후, UV-Vis 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 540 nm에서 상등액의 흡광도를 측정하였다.

용혈률은 다음과 같이 계산되었다 : % Hemolysis(용혈률) = [(시료의 흡광도 - (음성 대조군의 흡광도)] / [(양성 대조군의 흡광도) - (음성 대조군의 흡광도)] × 100

< 실시예 5> 세포 증식 분석

인간 각질세포를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 75cm² 의 세포 배양 플라스크에서 배양하고, 5% CO₂ 대기 및 37℃의 조건하에서 80%로 빽빽하게 배양될 때까지 배양하였다. 배양 48시간 후, 각질세포를 0.25% 트립신-EDTA로 트립신 처리하고, 10,000개의 세포를 함유하는 세포 현탁액을 24-웰 플레이트에 놓인 F-스캐폴드 상에 시딩(seed)하여 배양하였다. F-스캐폴드에서 각질세포의 대사 활성은 세포 생존율 및 증식을 평가하기 위한 PrestoBlue 분석에 의해 결정되었다. F-스캐폴드에서 각질세포의 대사 활성을 1, 7, 14일 및 21일 후에 분석하였다.

스캐폴드에 시딩하지 않고, 동일한 세포 수를 갖는 2D로 배양된 세포를 대조군으로 사용하였다.

배양 후, 배지를 버리고, 세포를 DPBS로 세척한 후, PrestoBlue 세포 생존율 시약(Invitrogen, Grand Island, NY) 20㎕를 함유하는 무혈청 DMEM 배지 200㎕를 첨가하였다. 이 플레이트를 5% CO₂ 챔버에서 37℃ 조건에서 30분 동안 배양하고, 레자주린(resazurin) 시약을 분홍색 레조루핀(resorufin) 생성물로 환원시키는 스캐폴드 상에 살아있는 세포의 대사 활성을 광도계로 검출하였다. 색 변화의 흡광도는 Epoch 마이크로플레이트 분광광도계(BioTek Instruments Inc., USA)를 사용하여 600nm를 기준 파장으로 하고, 570nm에서 측정하였다.

F-스캐폴드의 세포 부착 및 증식을 확인하기 위해 DAPI (4 ', 6- 디아미디노-2-페닐인돌; 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) 염색 반응을 수행하였다. 간단하게, 배양된 F-스캐폴드 상의 각질세포를 PBS로 세척하고 4% 포름알데히드로 30분간 고정 시킨 후, 스캐폴드에 300 nM DAPI 용액을 첨가하여 형광 현미경(Nikon Eclipse Ti-U) 하에서 관찰을 위해 10분 동안 반응시켰다.

< 실시예 6> 세포 생존율 분석

녹색-적색 형광 염색법에 의한 F-스캐폴드 상의 각질세포의 생존율을 평가하기 위해 LIVE/DEAD® 생존율/세포 독성 분석 키트(Molecular Probes, Life Technologies, USA)를 사용하였다. F-스캐폴드 상의 각질세포를 PBS로 3회 세척하고, 반응용액(working solution) 100㎕를 첨가하여 30분동안 실온에서 반응시킨 후, Nikon 형광 현미경 (Nikon Eclipse Ti-U) 하에서 관찰하였다. 상기 반응용액은 2mM 에티디움 호모다이머-1(ethidium homodimer-1; EthD-1) 스탁 용액(stock solution) 20㎕ 와 4mM 칼세인(calcein) AM 스탁 용액 5㎕를 10ml의 DPBS에 넣어 제조하였다.

< 실시예 7> 통계분석

unpaired two-tailed student’s t-test를 사용하여 통계분석을 수행하였으며, 결과는 3번의 독립적인 실험으로 평균 ± SD로 나타냈다.

< 실험예 1> F- 스캐폴드의 형태 분석

FE-SEM은 나노/마이크로섬유의 BME-미처리된 진균 균사체 구조는 1.02-11.7㎛ 범위의 균사 직경과 5.62 ± 2.02 ㎛의 평균 직경을 갖으며, 다분지(highly branched) 되어 네트워크를 형성하는 균사체가 연속적으로 존재한다는 것을 보여 주었다(도 1a, b). 반면 BME 처리는 원형질막의 상태에 영향을 미치지 않았으나, 표면 및 세포질 단백질의 제거로 인해 꼬여진 흠 및 융기 부분을 갖는 얇아진 균사체 구조를 보여줬으며, 0.92-5.6 ㎛ 범위의 균사 직경 범위에서 2.94 ± 0.96 ㎛ 의 평균 직경을 갖음을 확인하였다(도 1c, d).

< 실험예 2> F- 스캐폴드의 기계적 특성 분석

F-스캐폴드의 평균 인장강도 및 연신율은 각각 0.192 ± 0.07 MPa 및 10.74 ± 2.53 %인 것을 확인하였다(도 2). 이러한 수치는 피부의 기계적 특성 수치보다 낮지만, 인장강도가 낮은 생체재료는 연질 피부 이식편으로 사용할 수 있으며, 콜라겐과 엘라스틴과 같은 연조직은 인장강도가 낮지만 상처 드레싱 재료와 피부 조직 공학 대체물로 유용하게 사용되어지고 있다.

따라서 본 발명에서 제조된 F-스캐폴드는 생체재료로서 충분한 기계적 특성을 갖음을 확인하였다.

< 실험예 3> F- 스캐폴드의 열중량 및 생체 내 분해 가능성 분석

시간과 온도 변화에 따라 F-스캐폴드 질량 변화를 관찰하기 위하여 TG/DTG 분석을 활용하여 열분석을 진행했다(도 3, 표 1).

그 결과, 15.5-237.3℃, 237.3-330.0℃, 330.0-431.2℃ 및 431.2-689.6℃의 온도 범위에서 주요 중량 손실이 관찰되었다. 15.5-237.3℃의 초기 중량 감소는 스캐폴드에서 약하게 물리, 화학적으로 함유된 물의 중량 손실에 기인한 것으로 중량은 3.7%; 최대 체중 감소는 40.8℃에서 발생했다. 237.3-330.0℃ 사이에서 발생한 두번째 주요 중량 감소는 유기성분(예를 들어, 단백질 및 지질)의 손실에 기인하고, 전체중량의 54.3%에 이르렀으며, 최대 체중 감소는 295.5℃에서 발생했다. 330.0-431.2℃ 사이의 세 번째 주요 중량 손실은 진균 균사체 구조의 나머지 유기 성분 및 중합체 분해의 완전한 손실에 기인하고 중량 24.1%를 차지하였다. F-스캐폴드의 T50 값 및 잔류 중량은 각각 307.91℃ 및 중량 13.8%였다.

DPBS 용액에 F-스캐폴드를 함침시켜 4 주에 걸친 스캐폴드 중량 손실을 측정으로 생분해성을 관찰하였다(도 4).

그 결과, 시간이 지남에 따라 분해율이 증가하였고 28 일 후에 19.2 ± 1.9 %의 중량 감소가 관찰되었다.

sample	TG curves		DTG curves
sample	Δm(%)	ΔT(℃)	Peak(T_p)(℃)
F-스캐폴드	3.7	15.5-237.3	40.8
	54.3	237.3-330.0	295.5
	24.1	330.0-431.2	388.0
	4.1	431.2-689.6	-
	13.8(잔여물)	689.6	-

< 실험예 4> F- 스캐폴드의 혈액적합성( Hemocompatibility ) 분석

사상균(Filamentous fungal) 균사체 구조는 스캐폴드의 기계적 강도와 숙주 구성 요소와의 상호 작용과 관련 있는 3D 구조이다. 진균의 세포벽은 다양한 유형의 선형 및 분지형 다당류, 번역 후 변형(post-translational modification)이 있는 단백질 및 지질로 구성된다. 특히, Aspergillus sp. 세포벽은 α-1,3-글루칸(α-1,3-glucan), β-1,3/1,4-글루칸(β-1,3/1,4-glucan) 및 N-, O-로 연결된 갈락토만난(N- and O-linked galactomannan)으로 변형된 단백질이 풍부하다. 이 세포벽은 주로 키틴의 내부층(N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)의 고분자), 글루칸의 중층(글루코스(glucose)의 고분자), 만난(만노스(mannose)의 고분자)과 단백질의 외층으로 구성되어 있다. 이러한 Aspergillus sp.의 구조적 구성요소는 인간에게 면역학적 영향을 미친다. 이러한 면역 반응에 대한 영향은 주로 균사체의 세포질 항원 및 세포 표면 항원에 기인한 진균의 생존 가능성에 달려 있으며, 진균의 표면에 노출된 단백질은 주로 진균 감염의 병인성에 관여한다.

그러나 F-스캐폴드의 BME 처리는 세포 표면 항원 단백질을 제거할 수 있으며, 스캐폴드에 보다 높은 기계적 강도를 부여하는 다당류 골격을 제공한다. 또한, 진균 세포벽 성분은 톨-유사 수용체(Toll-like receptors;TLR), C-타입 렉틴(C-type lectin;CTL) 및 노드-유사 수용체(nod-like receptors;NLR) 계열에서 선천성 면역계를 활성화 시키는 숙주 패턴 인식 수용체(host pattern recognition receptors; PRR)에 의해 인식되나, BME 처리된 죽은 진균 스캐폴드 상에 생체 외 숙주 세포의 배양은 생체 내 면역계의 활성화를 최소화할 수 있다. 또한, 비병원성 섬유 사상균을 사용하는 것이 병원성 진균 균주를 사용하는 것보다 훨씬 유리하다.

F-스캐폴드의 37℃, pH≥8.0, 16시간 동안의 BME 처리(0.45M)는 진균 균사로부터의 단백질 추출을 보여주었다. 브래드포드(Bradford) 분석에 의한 단백질 추정 값은 F-스캐폴드의 건조 중량 g 당 17.4 ± 5.8 mg 임을 보여 주었다. 이는 F-스캐폴드를 BME로 처리함으로써 진균 균사로부터 이황화 가교로 연결된 세포벽 단백질, 비공유 결합된 세포벽 단백질, 세포질 단백질(periplasmic protein) 및 이온 관련 단백질이 방출한 것으로 분석된다.

진균 용혈소(hemolysins)는 aegerolysin 계열의 외독소(exotoxin)에 속하는 β-시트 형태의 단백질이다. 이들은 기공-형성 단백질로서 용균 활성(lytic activity)을 일으키는 뚜렷한 막 성분을 인식하고 세포 표면에 응집되며, 진균 독성에 관여한다.

그러나 BME 처리된 F-스캐폴드의 용혈작용 분석에서 BME 농도가 증가함에 따라 용혈작용의 현저한 감소를 보였다. 구체적으로 도 5와 같이, 0.15M에서 0.45M로 F-스캐폴드에 처리되는 BME 농도가 증가 될수록 용혈소(hemolysin) 및 기타 F-스캐폴드의 세포 표면 단백질이 제거되어 RBC(Red blood cell) 용혈률이 10.44 ± 1.6 %에서 7.4 ± 0.73 %로 감소된 반면, BME 처리하지 않은 F-스캐폴드는 21.0 ± 6.3 %까지 증가되는 용혈작용을 보였다(도 5).

< 실험예 5> F- 스캐폴드에서의 세포 부착 및 증식능 분석

인간 각질세포는 PrestoBlue 분석법을 사용하여 F-스캐폴드의 생체 적합성을 평가하기 위한 체외 모델로서 사용되었다. 세포 호흡에 의한 살아있는 세포의 환원력은 NADPH, FADH, FMNH, NADH 및 시토크롬(cytochrome)으로부터 전자를 받아들여 레자주린(resazurin) 기반 용액을 환원시킴으로써 확인할 수 있다. 이는 세포 생존율 및 증식을 분석하기 위한 대사 활동을 정량적으로 측정하기 위한 것으로, 레자주린(resazurin)이 분홍색 레조루핀(resorufin)으로 환원되는 것은 570nm에서 광도계로 측정할 수 있다.

BME로 처리된(0.45M) F-스캐폴드에서 각질세포의 생존율과 증식은 PrestoBlue 분석법을 사용하여 대사 활성을 측정함으로써 평가되었다.

도 6은 1, 7, 14일 및 21일 동안 배양 후, F-스캐폴드 상에서 각질세포의 총 대사 활성을 나타낸다. 2D 대조군과 비교하여, 3D F-스캐폴드 상에서 증식하는 각질세포의 대사 활성은 21일째에 유의하게 증가하였다. 이것으로 BME 처리된 진균 매트릭스가 각질세포의 부착 및 증식을 위한 생체적합성 환경을 제공함을 확인하였다.

또한, 각질세포가 배양된 3D BME 처리된 F-스캐폴드의 FE-SEM 이미지는 각각 1일 및 7일에 부착 및 증식을 나타내었다(도 7). 14일 후, F-스캐폴드는 각질형성 세포에 의해 합성된 다량의 ECM 성분 형성 및 세포 시트의 형성을 가능하게 하였으며, 스캐폴드 내의 세포의 이동 및 증식도 관찰되었다(도 7A). 포름알데히드 고정 후, BME 처리된 F-스캐폴드에서 증식된 세포 핵의 DAPI 염색은 배양 기간이 증가함에 따라 F-스캐폴드 상에 부착된 많은 수의 각질세포의 형광 이미지를 확인할 수 있었다(도 7B). 도 7C는 F-스캐폴드에서 살아있는(녹색), 죽은(적색) 각질세포를 나타냈다. 배양 1일 후에는 F-스캐폴드에 죽은 세포가 거의 없었으며, 배양 기간이 길어짐에 따라 살아 있으며 증식하는 세포가 우세하게 나타났고, 살아 있는 세포의 비율이 각각 1일, 7일, 14일 및 21일째에 77.3%, 86.5%, 98.6% 및 99.2%로 나타났다. 따라서 F-스캐폴드는 피부 조직재생 및 다른 조직 공학 응용을 위한 우수한 생체적합 재료일 수 있음을 확인하였다.

결론적으로, BME 처리로 세포 표면 단백질이 제거된 진균 골조(framework)는 피부 조직 공학을 위한 생체 모방 나노/마이크로섬유 스캐폴드로 사용될 수 있음을 확인하였다. 결과적으로 인간 각질세포에 우수한 생체적합성과 개선된 혈액적합성을 보여주었다. 또한, 본 발명에 따른 스캐폴드 제조는 비용 효과적이고, 지속 가능하며, 칸디다혈증(candidemia) 및 아스페르길루스증(aspergillosis)과 같은 진균 질환에 대한 방어 면역을 제공할 수 있을 것이다.

Claims

β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 처리된 사상균(Filamentous fungus)으로 이루어진 생체적합성 있는 진균 스캐폴드.
제 1항에 있어서,
사상균은 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.), 후사리움 속(Fusarium sp.), 킬린드로클라디움 속(Cylindrocladium sp.), 글로에오필룸 속(Gloeophyllum sp.), 파네로차에테 속(Phanerochaete sp.) 및 카에토미움 속(Chaetomium sp.)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생체적합성 있는 진균 스캐폴드.
제 1항에 있어서,
상기 β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol)은 0.1 내지 0.5M 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 있는 진균 스캐폴드.
제 1항에 있어서,
β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 처리된 사상균의 평균 직경은 1.5 내지 4.5㎛인 것을 특징으로 하는 생체적합성 있는 진균 스캐폴드.
사상균을 배양하여 균사 매트(mat)를 제조하는 단계;
상기 균사 매트를 멸균 및 동결건조하여 진균 스캐폴드를 제조하는 단계; 및
상기 스캐폴드를 β-메르캅토에탄올로 처리하는 단계;
를 포함하는 생체적합성 있는 진균 스캐폴드의 제조방법.
제 5항에 있어서,
사상균은 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.), 후사리움 속(Fusarium sp.), 킬린드로클라디움 속(Cylindrocladium sp.), 글로에오필룸 속(Gloeophyllum sp.), 파네로차에테 속(Phanerochaete sp.) 및 카에토미움 속(Chaetomium sp.)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생체적합성 있는 진균 스캐폴드의 제조방법.
제 5항에 있어서,
균사 매트는,
분생포자를 25 내지 35℃에서 8 내지 12일 동안 정치배양 하여 제조하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 있는 진균 스캐폴드의 제조방법.
제 5항에 있어서,
상기 β-메르캅토에탄올은 0.1 내지 0.5M의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 생체적합성 있는 진균 스캐폴드의 제조방법.
청구항 1, 청구항 2 및 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 생체적합성 있는 진균 스캐폴드에 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.
제 9항에 있어서,
세포는 피부세포, 연골세포, 뼈세포, 및 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조직 재생방법.