SK288005B6

SK288005B6 - In vitro method for specifically removing or isolating plasminogen or plasmin and support used in this method

Info

Publication number: SK288005B6
Application number: SK1420-2003A
Authority: SK
Inventors: Israel Nur; Liliana Bar; Malkit Azachi
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals S. A.
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2012-10-02
Also published as: KR100871454B1; HU228899B1; DE60215338D1; US8563288B2; CA2447789C; PL205685B1; US20090176293A1; RU2008130356A; KR20040011503A; US20030124703A1; HUP0600110A2; SK14202003A3; US20070092959A1; US20040197891A1; IL158754A; EP1390485A1; ZA200309030B; IL158754A0; CZ20033097A3; CA2447789A1

Abstract

An in vitro method for specifically removing or isolating plasminogen or plasmin in presence of fibrinogen from a mixture containing plasminogen or plasmin by contacting the mixture in with a rigid amino acid wherein the amino group of the amino acid and the carboxylic group of the amino acid are 0.6 to 0.8 nm, preferably 0.7 nm apart and the rigid amino acid is covalently bound to a support via the amino group of the amino acid. Tranexamic acid and 4-aminomethylbicyclo[2.2.2]octane-1- carboxylic acid are the preferred rigid amino acid. Disclosed is also a support having covalently bound a rigid amino acid wherein the amino group of the amino acid and the carboxylic group of the amino acid are apart 0.6 to 0.8 nm, preferably 0.7 nm.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka živice a spôsobu na špecifické odstránenie plazmin(ogénu) a jeho derivátov z proteínových roztokov, pričom výsledný proteínový roztok je možné použiť na intravenózne podanie a na lokálne aplikácie, to je ako nosnú matricu na dlhodobé uvoľňovanie a hojenie rán, buď ako jedinú účinnú zložku, alebo v kombinácii s ďalšími farmaceutický prijateľnými účinnými látkami. Odstránenie plazmin(ogénu) by zaistilo integritu a funkciu proteínového roztoku pri dlhších inkubačných periódach. Vynález sa tiež týka výroby vysoko purifikovaného plazmin(ogénu) na terapeutické použitie.

Doterajší stav techniky

Plazmin(ogén) alebo jeho aktívna molekula plazmín (ďalej len plazmin(ogén)) veľmi často kontaminuje proteínové roztoky, a najmä tie proteínové roztoky, ktoré sú extrahované z tekutín alebo z orgánov živočíchov. Prítomnosť plazmin(ogénu) v proteínovom roztoku predstavuje niekoľko hrozieb pre prijateľnosť proteínového roztoku ako stabilného farmaceutického produktu, v dôsledku známej proteolytickej aktivity tejto molekuly na rôzne proteíny a peptidy na arginylpeptidových a lyzylpeptidových väzbách (Weinstein M. J., Doolittle R. F. Differential specificities of the thrombin, plasmin and trypsín with regard to synthetic and natural substrates and inhibitors RF Biochim. Biopliys. Acta 1972; 258: str. 577 až 590 a Ling C. M., Summaria L., Robbins K. C.; Mechanism of formation of bovine plasmin(ogen) activator from human plasmin; J. Biol. chem. 1965; 240: str. 4212-B); a na bázických aminokyselinách, pre jeho stimulačnú aktivitu na rôznom tkanive, najmä na centrálne nervovú tkanivo a pre jeho úlohu pri naviazaní (Chen Z. L., Strickland S., Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmincatalyzed degradation; Liminin. Celí. 1997; 91: str. 917 až 925) a pravdepodobne pri prenášaní priónov v krvi cicavcov (Fischer M. B., Roeckl C., Parizek P., Schwarz H. P., Aguzzi A. Binding of disease associated prion proteín to plazmin(ogén); Náture 2000; 408: str. 479 až 483).

Na purifikáciu plazmin(ogénu) z proteínových roztokov, a teda na odstránenie plazmin(ogénu) z proteínového roztoku, bolo vyvinutých niekoľko chromatografických spôsobov.

Tieto spôsoby sú v podstate založené na dvoch princípoch. Podstatou prvej skupiny spôsobov je niekoľko po sebe idúcich purifikačných krokov, ktoré využívajú rôzne rozpustnosti, izoelektrického bodu alebo distribúcie molekulových hmotností (Alkjaerisig N.; The purification and properties of human plazmin(ogén); Biochem. J. 1963; 93: str. 171 až 182). Pretože základným cieľom týchto spôsobov je purifikácia plazmin(ogénu), dochádza k tomu, že sa pri ich uskutočňovaní celkom zrúti pôvodné zloženie proteínového roztoku. Druhá skupina spôsobov je založená na jednostupňovej afinitnej purifikácii. Základom purifikácie je naviazanie plazmin(ogénu) na rôzne syntetické ligandy na báze ω-aminokarboxylovej kyseliny, ktoré sa môžu viazať na lyzínové väzbové miesta na ťažkom reťazci plazmin(ogénu). Tieto miesta, ktoré pozostávajú z piatich štruktúr vzájomne prepojených tromi disulfidickými mostíkmi s vnútornou sekvenčnou homológiou, známych ako tzv. plazmin(ogénové) „kringles (sľučky), ktoré sú umiestnené na NH₂ plazmin(ogénovom) ťažkom reťazci a ďaleko od katalytického miesta umiestneného na COOH ľahkom reťazci, viažu fibrin(ogén). Ďalšou možnosťou pre afinitnú chromatografiu je naviazanie plazmin(ogénu) cez katalytické miesto, ktoré je miestom potenciálne menej špecifického naviazania, pretože môže viazať mnoho proteínov, akými sú napríklad serínproteázy majúce podobnú alebo nižšiu afinitu k arginylpeptidovej a lyzylpeptidovej väzbe a bázickým aminokyselinám. Súhrnom je možné vyvodiť záver, že všeobecne je plazmin(ogénová) afinitná chromatografia uskutočňovaná s použitím ligandu, ktorý je chemicky a iónovo podobný ω-aminokarboxylovej kyseline alebo tiež substrátu plazmínového katalytického miesta. Ligand sa naviaže na živicu cez zodpovedajúci dištančný člen alebo tiež linker. Ideálna afinitná živica na odstránenie plazmin(ogénu) ale nie je v podstate rovnakou živicou, o ktorej sa zistilo, že je ideálnou živicou na purifikáciu plazmin(ogénu). Takéto živice by mali obsahovať ligand, ktorý viaže plazmin(ogén) pri vysokej afinite a má veľmi nízku afinitu k ostatným proteínom, akými sú ďalšie serínproteázy, a najmä má veľmi nízku afinitu pre fibrinogén, ktorý je hlavným proteínom v Cohnovej frakcii plazmy I alebo v kryoprecipitáte. Tiež je dôležité, že odstránenie plazmin(ogénu) použitím danej afinitnej chromatografie môže byť uskutočňované v širokom rozsahu pufrov a nie je obmedzené len na určitý pufor, ktorý môže znamenať nebezpečie pre stabilitu a integritu proteínov v roztoku, pričom cieľom záujmu nie je plazmin(ogén), ale práve tieto proteíny.

Antifibrinolytická schopnosť (schopnosť inhibovať naviazanie plazmin(ogénu) na fibrinogén s vysokou afinitou) týchto ω-aminokarboxylových kyselín závisí od prítomnosti voľnej aminoskupiny a karboxylovej skupiny a od vzdialenosti medzi COOH-skupinou a atómami uhlíka, na ktoré sa viaže NH₂-skupina (Markwardt 1978). Napríklad, pokiaľ ide o kyselinu ε-aminokaprónovú (EACA) ap-aminobenzamidín (PAMBA), ukázalo porovnanie antifibrinolytických aktivít EACA a PAMBA, že druhá menovaná je približne trikrát aktívnejšia. Shimura a kol. (1984) navrhol živicu, v ktorej bol p-aminobenzamidín naviazaný na mikročastice hydrofilného vinylpolyméru cez časť dištančného člena (linkera). Pri použití tejto živice bol Shimura a kol.

schopný separovať plazmín a plazmin(ogén) pomocou vysokovýkonnej afmitnej chromatografie. Skutočnosť, že sa plazmin(ogén) nemohol eluovať kyselinou 6-aminohexánovou a že do elučného pufra musela byť zahrnutá 3M močovina, naznačila dvojmiestnu interakciu plazmínu s týmto imobilizovaným ligandom, to je s miestami viažucimi lyzín na ťažkom reťazci a s katalytickým miestom na ľahkom reťazci. To môže vysvetliť zistenie ďalších vedcov, podľa ktorých p-aminobenzamidín odstraňuje tiež niektoré ďalšie proteíny.

Pre afinitnú purifikáciu plazmin(ogénu) sa vyrába a používa ďalšia živica, ktorou je lyzínová živica. Antifibrinolytická schopnosť lyzínu je ale veľmi nízka, a nízka je teda aj jeho väzbová afinita. Viaže sa tiež na ďalšie proteíny a jeho špecifickosť je závislá od pufra.

Moroz L. A., Gilmore N. J. Fibrinolysis in normál plasma and blood: evidence for significant mechanisms independent of the plasminogen-plasmin systém, Blood 1976, 48, str. 531 až 545, opisuje prípravu plazmin(ogénu) bez plazmy afinitnou chromatografiou. Pokiaľ ide o použité spôsoby, boli zverejnené výsledky pozorovaní naznačujúce, že spôsoby, ktoré kulminujú v generácii fibrinolytického enzýmu plazmín, majú nanajvýš minimálnu úlohu pri spontánnej alebo bazálnej fibrinolytickej aktivite merateľnej v normálnej ľudskej plazme. Na meranie fibrinolytickej aktivity sa použila kyselina tranexámová.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje gradientovú gélovú SDS-PAGE (5 % až 12 % polyakrylamid) 7 pg proteínov eluovaných dvoma spôsobmi (opísanými v odseku „Materiál a metóda“) s tromi rôznymi živicami: TEA-sefaróza, Lyz-Ceramic Hyper DF a Lyz-sefaróza 4B. Pásy: 1 - Glu plazminogén; 2 - fibrinogén; 3 - albumín; 4 - imunoglobulín G; 5 - molekulový hmotn. marker; elučné piky: 6 - TEA s použitím metódy 1; 7 - TAE s použitím metódy 2; 8 - lyzín-Ceramic Hyper D s použitím metódy 1; 9 - lyzín-sefaróza s použitím metódy 1; 10 - lyzín-Ceramic Hyper D s použitím metódy 1,11- lyzín-sefaróza s použitím metódy 1.

Podstata vynálezu

Vynález je založený na zistení, že je rigidná aminokyselina schopná špecificky viazať plazmin(ogén). Výrazom „špecifické naviazanie“ sa v kontexte opisu prihlášky vynálezu rozumie, že sa zo zmesi obsahujúcej proteíny, akými sú napríklad plazmin(ogén) a fibrinogén, odstráni v podstate len plazmin(ogén), zatiaľ čo fibrinogén zostane v zmesi takmer nedotknutý.

Predmetom vynálezu je spôsob in vitro špecifického odstraňovania alebo izolácie plazminogénu alebo plazmínu za prítomnosti fíbrinogénu zo zmesi obsahujúcej plazminogén alebo plazmín, ktorého podstata spočíva v tom, že sa zmes uvedie do kontaktu s rigidnou aminokyselinou, kde sú aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny od seba odsadené o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodne o 0,7 nm, a rigidná aminokyselina je konvalentne naviazaná na nosič cez aminoskupinu aminokyseliny. Výhodne sa zmes zvolí z množiny pozostávajúcej z telových tekutín, akými sú výhodne krv, krvné frakcie, kryoprecipitát, bunkové kultúry, extrakty živočíšnych tkanív, akými sú výhodne bovinné plúca, bovinné črevá alebo želatína extrahovaná zo zvieracích kostí, albumín bovinného séra, a rovnako tak živočíšne s vodou miešateľné tuky, akým je výhodne lanolín. Výhodne je nosičom chromatografický materiál. Výhodne chromatografickým materiálom je hydrofilný materiál, akým sú výhodne agaróza, celulóza, sklo s kontrolovanými pórmi, silikagély, dextrány alebo organický umelo pripravený polymér, výhodne na báze polyakrylamidov polystyrénov. Výhodne chromatografickým materiálom je agaróza alebo sefaróza.

Výhodne chromatografickým materiálom je časticový materiál alebo materiál vo forme monolitického bloku. Výhodne rigidná aminokyselina je naviazaná na nosič cez linker medzi nosičom a kyselinou tranexámovou. Výhodne linkerom je bifunkčný linker.

Výhodne sa bifunkčný linker zvolí z množiny pozostávajúcej z nosiča aktivovaného N-hydroxysukcinimidom, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylamínom, 1,6-diaminohexánom, kyselinou sukcínovou, 1,3-diamino-2-propanolom, etyléndiamínom, TNB, pyridyldisulfidom, jódacetamidom, maelimidom alebo ich kombinácií.

Výhodne nosič je modifikovaný zvyškom, ktorý reaguje s primárnou alebo sekundárnou aminoskupinou. Výhodne po uvedení zmesi do kontaktu s nosičom, na ktorom je naviazaná kyselina tranexámová, sa zmes inkubuje s nosičom po časovú periódu dostatočnú na naviazanie plazminogénu alebo plazmínu a eluuje neutrálnym vodným roztokom obsahujúcim sodné soli, vápenaté soli a pufrové soli. Výhodne po kontaktovaní zmesi sa plazmín alebo plazminogén eluuje vodným roztokom obsahujúcim dostatočné množstvo ligandu konkurujúceho plazminogénovým väzbovým miestam na rigidnej aminokyseline naviazanej na nosiči. Výhodne ligandom je lyzín. Predmetom vynálezu je tiež nosič, ktorého podstata spočíva v tom, že má na seba konvalentne naviazanú rigidnú aminokyselinu, kde sú aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny od seba vzdialené 0,6 až 0,8 nm, výhodne 0,7 nm. Výhodne sa aminokyselina zvolí z množiny pozostávajúcej z kyseliny tranexámovej a kyseliny 4-aminometylbicyklo [2.2.2.] oktán-1-karboxylovej. Výhodne je nosič tvorený chromatografickým materiálom. Výhodne chromatografickým materiálom je hydrofilný materiál, akým je výhodne agaróza, celulóza, sklo s riadenými pórmi, silikagély, dextrány alebo organický umelo pripravený polymér, výhodne na báze polyakrylamidov polystyrénov. Výhodne chromatografickým materiálom je agaróza alebo sefaróza. Výhodne chromatografickým materiálom je časticový materiál alebo materiál vo forme monolitického bloku. Výhodne kyselina tranexámová je naviazaná na nosič cez linker medzi nosičom a kyselinou tranexámovou. Výhodne linkerom je bifunkčný linker. Výhodne sa bifunkčný linker zvolí z množiny pozostávajúcej z nosiča aktivovaného N-hydroxysukcinimidom, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylamínom, 1,6-diaminohexánom, kyselinou sukcínovou, l,3-diamino-2-propanolom, etyléndiamínom, TNB, pyridyldisulfidom, jódacetamidom, maleimidom alebo ich kombinácií. Výhodne je nosič modifikovaný zvyškom, ktorý reaguje s primárnou alebo sekundárnou aminoskupinou.

Prekvapivo sa zistilo, že kyselina ε-aminokaprónová nefunguje tak dobre ako kyselina tranexámová a že potom, čo sa kyselina tranexámová naviaže na pevný povrch, stráca všetku svoju mimoplazmin(ogénovú) väzbovú kapacitu (takzvaná kooperácia) a živica odstráni z plazmy alebo produktov plazmy len plazmin(ogén). Aj po naviazaní na kolónu si kyselina ε-aminokaprónová zachová svoju mimoplazmin(ogénovú) aktivitu a stále na seba viaže fibrinogén a ďalšie proteíny prítomné v plazme, zatiaľ čo mimoplazmin(ogénová) aktivita kyseliny tranexámovej podľa vynálezu je celkom eliminovaná. Afinita živice na báze kyseliny tranexámovej k plazmin(ogénu) ale nie je nijako ovplyvnená.

Rigidná aminokyselina je prichytená k vhodnému dištančnému členu, v podstate dlhšiemu ako 3 atómy uhlíka, a nosič a afinitný materiál teda môžu odstrániť plazmin(ogén) zo zmesi obsahujúcej proteíny bez ďalšej zmeny zloženia proteínového roztoku. Odstránenie je možné realizovať za prítomnosti rôznych pufrov. Spôsob podľa vynálezu je tiež vhodný na výrobu čistých frakcií plazmin(ogénu) po elúcii z afinitného nosiča.

Vynález sa týka spôsobu špecifického odstránenia alebo izolácie plazmin(ogénu) za prítomnosti fibrinogénu zo zmesi obsahujúcej plazmin(ogén), pričom tento spôsob spočíva v uvedení zmesi do kontaktu s rigidnou aminokyselinou, pričom aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny sú od seba vzdialené o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodne približne o 7 nm, a rigidná aminokyselina je kovalentne naviazaná na nosič cez aminoskupinu aminokyseliny.

Výhodne sa zmes v spôsobe podľa vynálezu zvolí z množiny pozostávajúcej z telesných tekutín, akými sú napríklad krv, krvné frakcie, kryoprecipitát, bunkové kultúry, extrakty zvieracích tkanív, napríklad bovinné pľúca, bovinné črevá alebo želatína z extraktov zvieracích kostí, albumín bovinného séra, a rovnako tak živočíšne s vodou nemiešateľné tuky, ako napríklad lanolín (PC-fosfatidyl-cholín).

Spôsob podľa vynálezu je možné použiť na získanie vysoko purifikovaného plazmin(ogénu) z príslušných zmesí. Po uvedení zmesi do kontaktu, napríklad s chromatografickým materiálom, na ktorý je naviazaná rigidná aminokyselina, je možné plazmin(ogén) eluovať z pevného afinitného materiálu. Tiež tuje možné použiť takzvané princípy extrakcie pevnej fázy. Plazmin(ogén) je možné eluovať roztokom obsahujúcim ligand, ktorý konkuruje väzbovým miestam rigidnej aminokyseliny, napríklad kyseliny tranexámovej v proteíne plazmin(ogénu). Týmito ligandmi sú spravidla ε-aminokyseliny, výhodne lyzín. Lyzín je možné napríklad použiť v koncentráciách 0,85 % hmotn. až 0,99 % hmotn. Možné sú aj ďalšie koncentrácie, najmä pokiaľ je iónová sila elučného média vyvážená ďalšími prísadami, napríklad elektrolytmi.

Elúciu plazmin(ogénu) z pevnej fázy je možné uskutočňovať za absencie elučného pufra spôsobom, ktorý extrahuje pufrové zložky, napríklad dialýzou. Plazmin(ogén), ktorý je možné získať spôsobom podľa vynálezu, je charakteristický veľmi vysokou čistotou. Táto jedinečná vlastnosť je zrejmá z nasledujúcich údajov.

Súhrnná tabuľka 1: Porovnanie špecifickej aktivity, purifikačného faktora a izolácie plazmin(ogénu) z kryo-deficitnej FFP plazmy s použitím výhodného zaťaženia a elučných podmienok pre každú živicu

Použitá živica	Metóda	Špecifická aktivita (mg plazmin(ogénu)/mg proteínu)	Purifikačný faktor	Izolácia
TEA-sefaróza 4B	2	0,794	567	91,6
Lyzín-Ceramic Hyper DF	2	0,444	444	10,9
Lyzín-sefaróza 4 B	1	0,121	101	11,6

Súhrnná tabuľka 2: Porovnanie odstránenia plazmin(ogénu) z kryo-deficitnej FFP plazmy s použitím výhodných podmienok zaťaženia pre každú živicu

Použitá živica	Metóda	Odstránenie (%)
TEA-sefaróza 4B	1 a 2*	99,5
Lyzín-Ceramic Hyper DF	1	54,6
Lyzín-sefaróza 4B	1	58,0

*Obidva spôsoby sú identické a zahŕňajú zbierku nenaviazaného piku.

Ako je zrejmé zo súhrnnej tabuľky, pokiaľ sa použili komerčne dostupné živice s imobilizovanými lyzínovými ligandmi a TEA živice za optimalizovaných chromatografických podmienok, potom bola izolácia a špecifická aktivita plazmin(ogénu) vyššia v prípade TEA živice (súhrnná tabuľka 1). Za zmienku tiež stojí zistenie, že TEA živica je oveľa účinnejšia pri odstraňovaní plazmin(ogénu) (ako naznačil test v prípade Gluplazmin(ogénu)) z kryo-deficitnej plazmy ako lyzínová živica (súhrnná tabuľka 2).

Čistota eluátov bola testovaná pomocou SDS-gélovej elektroforézy. Eluáty troch rôznych živíc (TEA-sefaróza, Lyz- Ceramic Hyper DF a Lyz-sefaróza 4B) sa podrobili SDS-PAG pri zaťažení a 5 % až 12 % gradientom akrylamidu a pri zaťažení 7 pg proteínu na pás. Výsledný gél zafarbený Coomassie modravou je znázornený na obr. 1.

Obr. 1 znázorňuje gradientovú gélovú SDS-PAGE (5 % až 12 % polyakrylamid) 7 pg proteínov eluovaných dvoma spôsobmi (opísanými v odseku „Materiál a metóda) s tromi rôznymi živicami: TEA-sefaróza, Lyz-Ceramic Hyper DF a Lyz-sefaróza 4B. Pásy: 1 - Glu-playminogén, 2 - fibrinogén, 3 - albumín, 4 - imunoglobulín G; 5 - molekulový hmotn. marker, elučné piky: 6 - TEA s použitím metódy 1,7- TAE s použitím metódy 2, 8 - lyzín-Ceramic Hyper D s použitím metódy 1,9- lyzín-sefaróza s použitím metódy 1, 10 - lyzín-Ceramic Hyper D s použitím metódy 1,11- lyzín-sefaróza s použitím metódy 1.

Výsledné proteínové pásy a čistota produktu dobre korelujú so špecifickou aktivitou plazmin(ogénu), ako naznačuje súhrnná tabuľka 1. Z toho vyplýva, že použitie TEA-sefarózovej živice vedie k získaniu vysoko purifikovaného plazmin(ogénu) len s minimálnou kontamináciou albumínom. Zdá sa, že na použitie tohto produktu pre klinické indikácie nie je potrebná žiadna ďalšia purifikácia.

Predmetom vynálezu je tiež prípravok obsahujúci plazmin(ogén).

Predmetom vynálezu je ďalej nosič majúci na sebe kovalentne naviazanú rigidnú aminokyselinu, pričom aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny sú od seba vzdialené o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodne o 0,7 nm.

Nosičom na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu je výhodne chromatografický materiál, ktorý je schopný viazať rigidnú aminokyselinu, kde sú aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny od seba vzdialené o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodne o 0,7 nm. Vzdialenosť medzi aminoskupinou a karboxylovou skupinou je udržiavaná v podstate konštantná rigidnou konštitúciou aminokyseliny. Rigiditu aminokyseliny je možné generovať alicyklickými kruhmi, výhodne cyklohexánovým kruhom, kde sú aminoskupina a karboxylová skupina umiestnené v 1,4-polohe alicyklického kruhu. Do rozsahu vynálezu tiež spadajú aromatické systémy, napríklad substituované benzoové kyseliny alebo anilínom substituovaná kyselina octová.

Podľa vynálezu má na sebe nosič výhodne naviazané aminokyseliny zvolené z množiny pozostávajúcej z kyseliny tranexámovej a EMBOCA.

Chromatografickým materiálom, ktorý je možné použiť v rámci spôsobu podľa vynálezu, je napríklad hydrofilný materiál, akým je napríklad agaróza, celulóza, sklo s riadenou veľkosťou pórov, silikagély, dextrány alebo organický umelo pripravený polymér, napríklad na báze polyakrylamidov polystyrénov. Typické materiály sú komerčne dostupné pod obchodnými označeniami Sephacryl (Pharmacia, Švédsko), Ultragel (Biosepara, Francie), TSK-Gel Toyopearls (Toso Corp., Japonsko), HEMA (Alltech Ass. (Deerfield, II, USA), Eupergit (Rohm Pharma, Darmstadt, Nemecko). Tiež je možné použiť materiály na báze azlaktónov (3M, St. Paul, Minn, USA). Zvlášť výhodným materiálom je agaróza alebo sefaróza. Tieto materiály sú komerčne dostupné, napríklad od spoločnosti Sigma, St. Louis.

Vo výhodnom uskutočnení sa spôsob podľa vynálezu uskutočňuje s použitím časticového chromatografického materiálu alebo materiálu, ktorý má formu monolitického bloku. Časticový materiál je možné suspendovať vo vhodnom médiu a výslednú suspenziu je možné použiť napríklad v chromatografickej kolóne. Spôsob podľa vynálezu je ale možné tiež uskutočňovať vo vsádzke. Ďalej je možné použiť polyméry vo forme časticového materiálu alebo tiež vo forme membrán.

Kyselina tranexámová je viazaná na nosič výhodne cez linker, najmä bifunkčný linker, medzi nosičom a kyselinou tranexámovou. Pokiaľ sa použije bifunkčný linker, potom môže byť zvolený z množiny pozostávajúcej z nosiča aktivovaného N-hydroxysukcinimidom, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylamínom(DADPA), 1,6-di-aminohexánom, kyselinou sukcínovou, l,3-diamino-2-propanolom, etyléndiamínom (EDA), TNB, pyridyldisulfidom, jódacetamidom, maleimidom alebo ich kombinácií.

Nosič na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu je výhodne modifikovaný zvyškom, ktorý reaguje s primárnou alebo sekundárnou aminoskupinou.

Podľa spôsobu podľa vynálezu sa zmes inkubuje s nosičom počas dostatočnú periódu a po uvedení zmesi do kontaktu s nosičom, na ktorom je naviazaná kyselina tranexámová, eluuje neutrálnym vodným roztokom obsahujúcim sodné soli, vápenaté soli a pufrové soli. Nasledovne je možné plazmín alebo plazmin(ogén) eluovať vodným roztokom obsahujúcim dostatočné množstvo lyzínu alebo jeho ekvivalentu, ktorý konkuruje kovalentne naviazanej kyseline tranexámovej.

Predmetom vynálezu je zmes odvodená z prírodných zdrojov, ktorá je v podstate bez plazmin(ogénu) a plazmínu.

Zmesou podľa vynálezu je najmä krv, krvný derivát alebo krvné frakcie a kryoprecipitát.

Krvným derivátom podľa vynálezu je najmä z plazmy odvodený faktor zrážavosti krvi alebo zmes faktorov zrážavosti krvi, akými sú napríklad FVIII, FIX, fibrinogén, fíbronektín, arantitrypsín, antitrombín III, von Willebrandov faktor, albumín, imunoglobulín.

Predmetom vynálezu je ďalej nosič majúci na sebe kovalentne naviazanú kyselinu tranexámovú. Nosičom podľa vynálezu je výhodne chromatografický materiál, výhodnejšie hydrofilný chromatografický materiál, akým sú napríklad dextrány alebo zmienený organický umelo pripravený polymér. Zvlášť výhodným nosičom sú agaróza alebo sefaróza, na ktorých je naviazaná kyselina tranexámová.

Chromatografícký materiál, ktorý tvorí nosič, môže mať formu časticového materiálu alebo monolitického bloku. Druhý menovaný je opísaný v Hermanson G. T., Mallia A. K. a Smith P. K. 1992 „Immobilization Affínity Ligand Techniques“ str. 454, Academic Press, Inc. San Diego, USA, ktorého obsah je tu uvedený formou odkazu.

Pri ďalšom výhodnom uskutočnení podľa vynálezu je kyselina tranexámová viazaná na nosič cez linker medzi nosičom a kyselinou tranexámovou. Je výhodné, pokiaľ nosič nemá funkčné skupiny, ktoré sú schopné kovalentne viazať kyselinu tranexámovú. Potom sa nosič najprv fúnkcionalizuje a nasledovne uvedie do reakcie s linkerom, ktorý je schopný viazať kyselinu tranexámovú. Ramená alebo tiež reťazce dištančného člena sú molekulami s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré sa použijú ako medzerné linkery medzi nosičom alebo matricou a afmitným ligandom, ktorým je podľa vynálezu aminokyselina majúca rigidnú štruktúru, pričom aminoskupina je o 0,6 nm až 0,7 nm odsadená od karboxylovej skupiny. Pre jednoduché naviazanie na ligand a nosič obsahujú dištančné členy výhodne dve funkčné skupiny na obidvoch koncoch. Dištančným členom je spravidla uhľovodíková zlúčenina majúca na svojich koncoch dve funkčné skupiny. Jeden z dvoch koncov sa kovalentne naviaže s použitím konvenčných alebo osebe známych reakcií na matricu. Druhý koniec sa kovalentne naviaže na ligand s použitím ďalšieho väzbového postupu.

Výhodne je linkerom bifunkčný linker, akým je napríklad nosič aktivovaný N-hydroxysukcinimidom, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylamínom (DADPA), 1,6-diaminohexánom, kyselinou sukcínovou, 1,3-diamino-2-propanolom, etyléndiamínom (EDA), TNB, pyridyldisulfidom, jódacetamidom, maleimidom alebo ich kombinácií.

Vzhľadom na komerčnú dostupnosť celého radu funkcionalizovaných nosičov môže byť výhodne použitý ako východiskový produkt nosič, ktorý je modifikovaný zvyškom, ktorý reaguje s primárnymi alebo sekundárnymi aminoskupinami.

Spôsob podľa vynálezu je ďalej podrobnejšie opísaný na príkladoch prípravy v podstate plazmin(ogénu) bez kryoprecipitátu, ktorý môže byť východiskovým materiálom pre celý rad produktov odvodených z krvi.

Kryoprecipitát sa podrobí afinitnej chromatografii s imobilizovaným ligandom, čím sa získa adsorbovaná frakcia a neadsorbovaná frakcia. Látka, ktorú je možné eluovať z adsorbovanej frakcie, je plazmin(ogén).

Imobilizovaným ligandom môže byť ľubovoľný analóg, ktorý môže reagovať s lyzínovými väzbovými miestami plazmin(ogénu). Spôsob prípravy imobilizovaných ligandov, ktoré je možné použiť podľa vynálezu, bude opísaný. Nasledujúce príklady majú len ilustratívny charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený priloženými nárokmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Imobilizácia rôznych ligandov na báze ε-aminokarboxylovej kyseliny

Na účely hodnotenia odstraňovania plazmin(ogénu) z roztokov odvodených z plazmy bol buď pripravený, alebo kúpený rad ligandov (pokiaľ sú komerčne dostupné) na báze ε-aminokarboxylovej kyseliny v kombinácii s rôznymi dištančnými členmi v niekoľkých živiciach. Nasledujúca tabuľka sumarizuje všetky študované kombinácie (čísla pod živicami sa týkajú odseku, v ktorom je syntéza konkrétnej kombinácie opísaná).

Tabuľka 1

^\Ligand Linker	p-Benzamidín	Arginín	Kyselina tranexámová	Kyselina ε-amino- hexanová	Lyzín
Kyselina N-hydroxy- sukcínová				Sefaróza 4B (1)
DADPA	Agaróza 4 % (2)	Agaróza 4 % (3)	Agaróza 4 % (4)
CNBr		Sefaróza 4B (5)	Sefaróza 4B (6)
Epoxy	Sefaróza 6B (10)	Sefaróza 6B (7)	Sefaróza 6B (8)		Ceramic Hyper DF (9)

(1) N-Hydroxysukcinimidester kyseliny ε-aminohexánovej sefaróza 4B sa kúpila od spoločnosti Sigma.

(2) Výroba p-aminobenzamidínu agarózy 4 %

Nasledujúci postup sa použil na imobilizáciu diaminodipropylamínu (DADPA) na agaróze 4 % (Pierce), reakcia sa uskutočňovala na géli amínom zakončeného dištančného člena, ktorý sa nasledovne modifikoval anhydridom.

ml DADPA-agarózového gélu sa prepláchlo purifikovanou vodou a nasledovne sa gél suspendoval v rovnakom objeme purifikovanej vody. Suspenzná zmes sa pozvoľna miešala 1 h pri teplote miestnosti a počas tejto doby sa pridalo 2,5 g anhydridu kyseliny sukcínovej. Na konci miešania sa sukcinylovaný gél postupne prepláchol purifikovanou vodou, IM NaCl a opäť purifikovanou vodou, s cieľom odstrániť prebytok nezreagovanej kyseliny sukcínovej.

Negatívny test s TNBS (Sigma) naznačil, že všetky amíny DADPA boli úspešne blokované kyselinou sukcínovou.

Imobilizovaný sukcinilovaný DADPA sa prepláchol 250 ml purifikovanej vody, potom sa prebytok vody odsal a mokrý koláč sa premiestnil do 500 ml kadičky. Gél sa resuspendoval v 25 ml 0,1 M MES pufra s pH hodnotou 4,7 a zatiaľ čo sa pozvoľna miešal, pridalo sa 0,25 g p-aminobenzamidínu (Sigma) a 0,75 g EDC (Pierce). Počas 1 h sa pH hodnota reakčnej zmesi udržiavala na 4,7 kontinuálnym pridávaním 0,5M NaOH. Reakčná zmes sa nasledovne nechala stáť cez noc pri teplote miestnosti a za kontinuálneho pomalého miešania.

Gél sa postupne prepláchol 0,5 1 každej z nasledujúcich látok: purifikovanou vodou, 0,1 M octanom sodným s hodnotou pH 4,7, 0,5 M hydrogenuhličitanom sodným a purifikovanou vodou.

Imobilizovaný p-aminobenzamidín sa skladoval až do následného použitia v 0,02 % azide sodnom pri 4 °C.

(3) Arginín-agaróza 4 %

Syntéza arginín-agarózy 4 % sa výhodne uskutočňovala opísaným postupom na prípravu p-aminobenzamidín-agarózy 4 % (pozri 2).

(4) Kyselina tranexámová (TEA)-agaróza 4 %

Syntéza kyseliny tranexámovej (TEA)-agarózy 4 % sa výhodne uskutočňovala opísaným postupom na prípravu /?-aminobenzamidín-agarózy 4 % (pozri 2).

(5) Arginín-sefaróza 4B

Na imobilizáciu arginínu alebo kyseliny tranexámovej na CNBr-sefaróze 4B (Pharmacia) ako dištančnom géli sa použil nasledujúci postup. Syntézy dvoch ligandov pri dvoch rôznych koncentráciách (10 mmol/ml alebo 0,01 mmol/ml suchého gélu) boli podobné, ako je zmienené v tomto a nasledujúcom odseku (5 a 6).

2,5 g CNBr-aktivovanej sefarózy 4B sa suspendovalo v 50 ml lmM HCI. Gél sa nechal 10 min. napučať pri teplote miestnosti a potom sa 15 min. preplachoval 500 ml lmM HCI na sklenenej frite.

Arginín sa rozpustil v 12,5 ml väzbového pufra, 0,lM NaHCO₃ s pH hodnotou 8,3, ktorý obsahoval 0,5M NaCl. Väzbový roztok obsahujúci Iigand sa v plastovej skúmavke zmiešal s gélom a táto skúmavka sa nasledovne udržiavala cez noc pri 4 °C za súčasného pretrepávania nakláňaním.

Na konci inkubácie sa z tejto zmesi vypláchol zvyšok ligandu desaťnásobným objemom väzbového pufra, vztiahnuté na objem gélu, cez sklenenú fritu. Proteínový roztok sa v troch cykloch prepláchol 50 ml pufra pri striedajúcich sa pH hodnotách (0,lM acetátový pufer s pH hodnotou 4 obsahujúci 0,5M NaCl a nasledovne 0,1 M Tris-HCl pufer s pH hodnotou 8 obsahujúci 0,5M NaCl). Imobilizovaná arginin-sefaróza 4B sa skladovala až do následného použitia v 0,02 % azide sodnom pri 4 °C.

(6) Kyselina tranexámová (TEA)-sefaróza 4B

Táto syntéza sa uskutočňovala opísaným postupom pre arginín-sefarózu 4B (pozri odsek 5).

(7) Arginín-sefaróza 6B

Arginín sa vo dvoch rôznych koncentráciách (2 mmol alebo 0,2 mmol/ml suchého gélu) naviazal na komerčne dostupnú imobilizovanú epoxy-sefarózu 6B (Pharmacia) nasledujúcim postupom:

2,5 g epoxy-aktivovanej sefarózy 6B sa suspendovalo v 200 ml purifikovanej vody. Gél sa nechal približne 5 min. napučať pri teplote miestnosti a nasledovne sa 1 h preplachoval 500 ml purifikovanej vody pridávanej v alikvotných podieloch cez sklenenú fritu.

ml väzbového pufra (0,1 M NaHCO₃ s pH hodnotou 9,3 a 0,5M NaCl) a napučaný gél sa naliali do dvoch skúmaviek obsahujúcich arginín. Zmesi sa miešali v plastovej skúmavke cez noc pri teplote miestnosti.

Na konci inkubácie sa zo zmesi vypláchol zvyšok ligandu päťnásobným objemom väzbového činidla, vztiahnuté na objem gélu, cez sklenenú fritu. Produkt sa prepláchol v troch cykloch s meniacou sa pH hodnotou (0,1 M acetátový pufer s pH hodnotou 4,0 a 0,5M NaC pufer a následný preplach 0,1 M Tris-HCl pufrom s pH hodnotou 8 a 0,5M NaCl). Imobilizovaná arginín-sefaróza 6B sa skladovala až do následného použitia v 0,02 % azide sodnom pri 4 °C.

(8) Kyselina tranexámová (TEA)-sefaróza 6B

Táto syntéza sa výhodne uskutočňovala opísaným postupom pre arginín-sefarózu 6B (pozri odsek 7).

(9) L-Lyzín epoxy-aktivovaný Ceramic Hyper DF Hydrogel sa kúpil od spoločnosti Sigma.

(10) p-Aminobenzamidín kovalentne naviazaný na sefaróze 6B sa kúpil od spoločnosti Pharmacia.

Príklad 2

Zľadovanie rôznych živíc použitých pri afinitnej chromatografii pri odstraňovaní plazmin(ogénu)

Pre nasledujúcu štúdiu sa použil kryoprecipitát ľudskej plazmy obsahujúci 1 IU/ml plazmin(ogénu) a 50 mg/ml fibrinogénu.

Alikvotné podiely zamrazeného kryoprecipitátu sa nechali rozpustiť pri 37 °C a dialyzovali proti pufru BN1 (0,12 M NaCl, 10 mM Tri Na-citrát, 1 mM CaCl₂ pri pH hodnote 7,0). Tento proteínový roztok sa prefiltroval cez filter majúci hĺbku 5 pm, čím sa získal číry roztok. 5 ml valec injekčnej striekačky s priemerom 8,36 mm sa naplnil 1,5 ml (objem za mokra) nasledujúcich afinitných živíc opísaných v príklade 1: imobilizovaná kyselina ε-aminohexánová (sefaróza 4B využívajúca CNBr ako dištančný člen), imobilizovaný p-aminobenzamidín/arginín/TEA (agaróza 4 % používajúca DADPA ako dištančný člen), imobilizovaný arginín/TEA (sefaróza 4B používajúci CNBr ako dištančný člen), imobilizovaný arginín/TEA (sefaróza 6B používajúci epoxy ako dištančný člen) a imobilizovaný L-lyzín (Ceramic Hyper DF Hydrogel používajúci epoxy ako dištančný člen). Gélová náplň sa optimalizovala nasledujúcim postupom: gélová náplň sa prepláchla štyrmi objemami i) purifikovanej vody, ii) 1 M NaCl, iii) purifikovanej vody, iv) TLN 0,1 pufra (Tris 0,05 M lyzín 0,02 M, 0,1 M NaCl, pH hodnota 9,0), v) TLN 1 pufra (Tris 0,05 M, lyzín 0,02 M a 1 M NaCl, pH 9,0) a vi) purifikovanej vody. Všetky vzorky, koncentrácie a preplachové pufry sa aplikovali na valec striekačky po 1 min. odstreďovania pri frekvencii otáčania 1000 min.'¹ pri 25 °C. Vyváženie sa uskutočnilo štyrmi objemami BN1 a predfiltrovaný zahustený kryoprecipitát sa naniesol na živicu (2 : 1 obj./obj.) a táto zmes sa potom 1 h inkubovala pri teplote miestnosti. Alikvotné podiely nenaviazaných „spin preplachov sa po každom odstreďovaní zhromažďovali v plastových skúmavkách. Živica sa prepláchla aspoň 13 objemami kolóny BN1 pufra až do dosiahnutia O.D₂₈₀ 0,02. Elúcia plazmin(ogénu) sa uskutočňovala s použitím TLN 1 pufra a následným prepláchnutím štyrmi objemami vrstvy 3 M NaCl. Minikolóny sa tesne uzavreli a skladovali pri 4 °C.

Živice, ktoré počas procesu degradovali alebo ktoré odstránili menej ako 50 % plazmin(ogénu), sa zo štúdie skoro vylúčili. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 2.

Tabuľka 2: Odstránenie plazmin(ogénu) v naviazanom materiáli využívajúcom rôzne imobilizované ligandy BN 1 pufrom

Imobilizované ligandy	Odstránenie plazmin(ogénu) (%)
Kyselina ε-aminohexánová využívajúca CNBr ako dištančný člen	13,36
p-Aminobenzamidín využívajúci DADPA ako dištančný člen	Žiadne (kolóna bola zapchatá)
p-Aminobenzamidín využívajúci epoxy ako dištančný člen	19,78
Arginin využívajúci DADPA ako dištančný člen	6,04*
TEA (vysoká kone.) využívajúca CNBr ako dištančný člen	0
TEA (nízka kone.) využívajúca CNBr ako dištančný člen	0
Arginin (nízka kone.) využívajúci CNBr ako dištančný člen	23,25
Arginin (nízka kone.) využívajúci epoxy ako dištančný člen	0
Arginin (vysoká kone.) využívajúci epoxy ako dištančný člen	5,61

* Tento údaj je priemernou hodnotou troch meraní.

Uvedená tabuľka ukazuje, že najlepšie ligandy na odstránenie plazmin(ogénu) z kryoprecipitátu obsahovali afinitne gély, ktoré boli dostatočne objemné preto, aby odolali sledu nanesení, preplachov a elúcie bez zrútenia alebo gély, ktoré zachytili viac ako 50 % použitého fibrinogénu.

Tabuľka 3 ukazuje tak účinnosť rôznych typov gélov pri odstraňovaní plazmin(ogénu), ako ich účinnosť pri zachytení fibrinogénu v zahustenom kryoprecipitáte.

Reziduálny plazmin(ogén) prítomný v kryoprecipitáte sa adsorboval živicami, zatiaľ čo fibrinogén nie, a tak sa získal výsledný supematant v podstate bez plazmin(ogénu).

Obsah fibrinogénu sa meral testom doby zrážavosti, zatiaľ čo obsah plazmin(ogénu) sa meral chromogénnym testom.

Vypočítané množstvá plazmin(ogénu) a fibrinogénu izolované z lyzínových gélov slúžili ako zlatý štan15 dard pre všetky ďalšie použité gélové ligandy. Výsledky obsiahnuté v tabuľke 2 naznačujú, že len TEA ligandy s epoxy dištančným členom poskytli vynikajúce výsledky pri odstraňovaní plazmin(ogénu) a pri izolácii fibrinogénu (pozri tabuľka 3).

Vysoká koncentrácia imobilizovanej TEA poskytla vynikajúce výsledky pri odstránení plazmin(ogénu) a podobne dobré výsledky pri izolácii fibrinogénu ako ligand naviazaný na lyzín: 89 % vs. 92 % pre izoláciu fibrinogénu a 89 % vs. 56 % na odstránenie plazmin(ogénu). Účinnosť všetkých ostatných živíc, tak pri odstraňovaní plazmin(ogénu) ako pri izolácii fibrinogénu bola oveľa nižšia.

Tabuľka 3: Súhrn dát získaných pre izoláciu fibrinogénu a odstránenie plazmin(ogénu) v naviazanom materiáli používajúcom rôzne imobilizované ligandy BN1 pufrom

Imobilizované ligandy	Odstránenie plaz- min(ogénu) (%)	Izolácia fibrinogénu (%)
Lyzín používajúci epoxy ako dištančný člen	56*	92*
TEA používajúca DADP ako dištančný člen	49	84
TEA (nízka kone.) používajúca epoxy ako dištančný člen	44,35	88,62
TEA (vysoká kone.) používajúca epoxy ako dištančný člen	89	89
Arginín (vysoká kone.) používajúci CNBr ako dištančný člen	91,26	49

* Táto hodnota je priemerom troch meraní.

Príklad 3

Vplyv pufrového fosfátu a BNI na profil afinitnej chromatografie lyzínom a TEA-imobilizovanej živice

Kryoprecipitát sa ošetril hydroxidom hlinitým s cieľom adsorbovať faktory zrážavosti závislé od vitamínu K a nasledovne sa 4 h inkuboval so zmesou detergentných rozpúšťadiel (SD-1 % Tri (n-butyl)fosfát, 1 % Tritón X-100) pri 30 °C, čím sa inaktivovali vírusy s lipidovou obálkou. SD reakčné činidlá sa odstránili extrakciou ricínovým olejom a hydrofóbnou interakčnou chromatografiou a prípravok sa nasledovne pasterizoval (10 h pri 60 °C) za prítomnosti sacharózy a glycínu ako stabilizátorov.

Po pasterizácii sa sacharóza a glycín odstránili diafiltráciou. Pred sterilnou filtráciou sa pridala kyselina tranexámová (TEA) a arginín hydrochlorid ako stabilizačné činidlá. Alikvotné podiely stabilizovaného produktu sa udržiavali až do svojho použitia pri -30 °C.

Alikvotné podiely zamrazeného vírusovo inaktivovaného kryoprecipitátu sa nechali rozpustiť pri 37 °C a dialyzovali proti pufru BNI (pufor bol tvorený 0,12 M NaCl, 0,01 M Tri Na- citrát, 1 mM CaCl₂ pri pH hodnote 7,0) alebo alternatívne proti 25 mM fosfátového pufra. Druhý zmieňovaný roztok sa prefiltroval cez filter s hĺbkou 5 pm a poskytol číry roztok.

Kolóna s priemerom 10 mm (Biorad, USA) sa naplnila 6 ml (objem za mokra) imobilizovanej TEA (TEA sefaróza 6B) alebo imobilizovaného lyzínu (Ceramic Hyper DF/sefaróza 4B) a prepláchla štyrmi objemami každého z nasledujúcich roztokov v danom poradí: i) purifikovaná voda, ii) 1 M NaCl, iii) purifikovaná voda, iv) TLN 0,1 pufer (0,1 M NaCl, lyzín 0,02 M, Tris 0,05 M pri pH hodnote 9,0), v) TLN 1 pufer (1 M NaCl, lyzín 0,02 M, Tris 0,05 M pri pH hodnote 9) a vi) purifikovaná voda. Rovnováha sa dosiahla použitím štyroch objemov BN 1 alebo alternatívne fosfátového pufra. Prefiltrovaný kryoprecipitát sa zavádzal do kolóny rýchlosťou 100 pl/min.

Vzorky nenaviazaného materiálu sa zbierali do plastových skúmaviek a živica sa prepláchla 16 objemami kolóny BN 1 pufra alebo fosfátového pufra. Elúcia plazmin(ogénu) sa uskutočňovala s použitím TLN 1 pufra a za následného prepláchnutia štyrmi objemami 3 M roztoku NaCl, štyrmi objemami purifikovanej vody a štyrmi objemami 25 % roztoku etanolu obohateného 1 M NaCl.

Tabuľka 4 ilustruje účinnosť pri odstraňovaní plazmin(ogénu) rôznymi druhmi živíc a účinnosť pri izolácii fibrinogénu. Obsah fibrinogénu sa meral testom doby zrážavosti (Claussov test), zatiaľ čo obsah plazmin(ogénu) sa meral chromogénnym testom.

Porovnanie rôznych živíc naznačilo, že pokiaľ sa použije BNI pufer, potom dochádza k zachyteniu 95,4 % až 96,4 % obsahu fibrinogénu v nenaviazanom piku. Naopak, pokiaľ sa použije fosfátový pufer, potom je množstvo izolovaného fibrinogénu nízke. Prekvapivo sa zistilo, že len imobilizovaná TEA živica umožňuje tak vysoké odstránenie plazmin(ogénu), ako vysokú izoláciu fibrinogénu.

Výsledky získané pri použití lyzínovej živice tiež demonštrujú zvýšenie účinnosti pri použití BN 1 pufra v porovnaní s fosfátovým pufrom.

Tabuľka 4: Súhrn dát získaných pri testovaní izolácie fibrinogénu a plazmin(ogénu) s použitím imobilizovaných živíc a buď BN1 pufra, alebo fosfátového pufra

Imobilizované ligandy	Odstránenie plazmin(ogénu) (%)	Izolácia fibrinogénu (%)
TEA (vysoká kone.) epoxy + BN 1 pufer	77,1	96,4
Lyzín-epoxy + BN 1 pufer	68,87	95,4
Lyzín-epoxy + fosfátový pufer	100	66,9
Lyzin CNBr + BN 1 pufer	62,5	121,8
Lyzin CNBr + fosfátový pufer	100	62,2

Príklad 4

Alikvotné podiely zamrazeného vírusovo inaktivovaného kryoprecipitátu sa nechali rozpustiť pri 37 °C a dialyzovali proti pufru BN1 (0,12 M NaCl, 0,01 M Tri Na-citrát, 1 mM CaCl₂ pri pH hodnote 7,0) alebo alternatívne proti 25 mM fosfátového pufra. Druhý menovaný roztok sa prefiltroval cez filter s hĺbkou 5 pm, s cieľom odstrániť nerozpustné látky.

Kolóna s priemerom 26 mm (Pharmacia, Švédsko) sa naplnila 50 ml (objem za mokra) imobilizovanej TEA (TEA sefaróza 6B) a prepláchla štyrmi objemami purifikovanej vody a rovnakým objemom TLN 0,1 pufra (0,1 M NaCl, lyzin 0,02 M, Tris 0,05 M pri pH hodnote 9,0), TLN 1 pufra (1 M NaCl, lyzin 0,02 M, Tris 0,05 M pri pH hodnote 9) a purifikovanej vody. Rovnováha sa dosiahla štyrmi objemami BN1 pufra (NaCl, Tri Na-citrát, CaCl₂ pri pH hodnote 7,0) a prefiltrovaný BAC sa viedol kolónou rýchlosťou 700 μΙ/ml. Vzorky nenaviazaného materiálu sa zbierali do plastovej nádoby a živica sa prepláchla aspoň tromi objemami BN 1 pufra, vztiahnuté na objem gélu. Elúcia plazmin(ogénu) sa uskutočňovala s použitím TLN 1 pufra a následného prepláchnutia 3 M NaCl.

Nenaviazané frakcie získané vo dvoch behoch sa zlúčili a udržiavali pri 4 °C až do zahustenia. Nakoniec sa BAC zahustil približne na svoj pôvodný objem diafiltráciou s použitím membrány 100 „cut-off' a proti pufru Bl (glycín, NaCl, Tri Na- citrát, CaCl₂ pri pH hodnote 7) a následnou filtráciou cez 0,45 pm filter. Do filtrátu sa pridali 2 % arginínu.

Na účely stabilizačných testov sa výsledný produkt sterilné prefiltroval cez 0,2 pm filter.

Ako naznačuje tabuľka 5, použitie väčšej a dlhšej kolóny zvýšilo účinnosť TEA ligandu tak, že sa izolovalo 100 % fibrinogénu a množstvo odstráneného plazmin(ogénu) bolo nižšie ako množstvo plazmin(ogénu) detegovateľné chromogénnym testom.

Porovnanie produktu pred a po diafiltrácii odhalilo stratu 33 % obsahu fibrinogénu. Tento jav je možné vysvetliť technickými problémami, ktoré sa objavujú len v laboratórnom meradle. Imobilizovaná TEA živica poskytla nepochybne vynikajúce výsledky tak pri odstraňovaní plazmin(ogénu), ako pri izolácii fibrinogénu.

Tabuľka 5: Súhrn dát získaných pri testovaní fibrinogénu a plazmin(ogénu) izolovaných v nenaviazanom piku (každá hodnota je priemerom dvoch meraní)

Vzorka	Izolácia fibrinogénu (%)	Izolácia plazmin(ogénu) (%)
Po naplnení	100	0
Po naplnení a diafiltrácii	66,2	0*

* Izolácia plazmin(ogénu) po 3,7-násobnom zahustení zlúčených vzoriek.

Žiadna reziduálna TEA nebola nájdená ani v eluovanom proteínovom roztoku, ani v zahustenom ultrafiltrovanom produkte. Analýza reziduálnej koncentrácie kyseliny tranexámovej sa uskutočňovala pomocou HPLC.

S použitím rovnakej živice a opísaných podmienok (príklad 4) sa uskutočnili štyri ďalšie behy odstraňovania plazmin(ogénu). Všeobecne je možné povedať, že výsledky dosiahnuté vo všetkých testovaných vzorkách boli podobné prvým získaným a diskutovaným výsledkom.

Pri testovaní na krysom modeli neboli pri pásikoch pred odstránením plazmin(ogénu) ani po jeho odstrá5 není pozorované žiadne adhézie.

Pri kryoprecipitáte sa pred a po odstránení plazmin(ogénu) určovala degradácia za inkubácie pri teplote miestnosti. Údaje uvádzajúce percentá zrážavých proteínov (pomocou UV absorbancie) na rôznych vzorcoch uvádza tabuľka 6.

Tabuľka 6: Percento zrážavého proteínu po inkubácii dvojito vírusovo inaktivovaného zahusteného kryoprecipitátu pred a po odstránení plazmin(ogénu) epoxy sefarózou 6B ligovanou na kyseline tranexámovej pri teplote miestnosti

Inkubačná doba (týždne)
	0	1	2	3	4	5	6
Pred ošetrením	62,91	0	0	0	0	0	0
Po ošetrení	73,44	70,80	68,24	65,69	63,69	63,84	62,46

Testy stability sa uskutočňovali s použitím pásikov pripravených z kryoprecipitátu pred a po odstránení plazmin(ogénu), ktoré sa inkubovali pri 37 °C za prítomnosti pufra. Tieto pásiky sa ošetrili pridaním alebo vypustením glycínu a/alebo arginínu. Výsledky sú zhrnuté v uvedenej tabuľke 7.

Tabuľka 7: Degradačná doba pásikov pred a po odstránení plazmin(ogénu)

Formulácia	Degradačná doba pásika (dni)
0	1	2	3	4	5	6
Pred ošetrením	+++
Pred ošetrením + 2% arginín	+++		-	-	-	-	-
Pred ošetrením + 2% arginín + 1% glycín	+++	-	-	-	-	-	-
Po ošetrení	+++	+++	+++	+++	+++	+++	-
Po ošetrení + 2° % arginín + 1 % glycín	+++	+++	+++	+++	+++	+++	-

+++ Tieto dáta znamenajú existenciu pásika - Tieto dáta znamenajú degradáciu pásika

1. Štúdie opísané v nasledujúcich príkladoch sa uskutočňovali na kryo-deficitnej zlúčenej čerstvej zamrazenej plazme odobranej normálnym zdravým darcom. V dôsledku vysokej koncentrácie antiplazmínu a malého množstva plazmínu u normálnych zdravých darcov (1) nieje možné plazmín detegovať pomocou funk25 čného (chromogénneho) testu (Schreiber A. D., Kaplan A. P., Austen K. F. Plasma inhibitors of the components of the fibrinolytic pathway, man. J. Clin. Invest 52: str. 1394 až 1401, 1973). Je možné demonštrovať odstránenie, purifikáciu a izoláciu plazmínu vzoriek plazmy zdravého darcu z TEA živice. Komerčný ELISA kit na detekciu veľmi nízkych množstiev Glu-plazmin(ogénu) a, ako sa zistilo v predchádzajúcich štúdiách, aj TEA živica má rovnakú afinitu pre obidve formy plazmín (ogénu), a rovnako tak pre plazmín (Freden30 burgh J. P., Nesheim M. E. Lyz-plazmin(ogén) is a significant itermediate in the activation of Gluplazmin(ogén) during fibrinolysis in vitro, J. Biol. Chem. 267, str. 26150 až 26156, 1992 a Miyashita C., Wenzel E., Heiden M. Plazmin(ogén): a brief introduction into ist biochemistry and function, Haeraostasis 1: str. 7 až 13, 1988.)

2. Meranie Glu-plazmin(ogénu) je možné teda použiť ako indikátor celkového množstva plazmin(ogénu) v plazme.

Príklad 5

Chromatografický krok

Tieto štúdie sa uskutočňovali v snahe stanoviť účinnosť imobilizované TEA na sefaróze 4FF pri odstraňovaní plazmin(ogénu) z kryo-deficitnej čerstvej zamrazenej plazmy (FFP) obsahujúcej 1 IU/ml plazmin(ogénu). Alikvotné podiely kryo-deficitné čerstvo zamrazenej plazmy sa nechali rozpustiť pri 37 °C a filtrovali cez filter majúci hĺbku 3 pm v snahe odstrániť nerozpustné proteíny.

Kolóna s priemerom 10 mm (Pharmacia, Švédsko) sa naplniía 2 ml (objem za mokra) imobilizovanej TEA a prepláchla štyrmi objemami purifikovanej vody a rovnakým objemom TLN-0,1 pufra (0,1 M NaCl, lyzín 0,02M, Tris 0,05M pri pH hodnote 9,0), TLN-1 pufra (IM NaCl, lyzín 0,02M, Tris 0,05M pri pH hodnote 9,0) a purifikovanej vody. Rovnováha sa vytvorila použitím štyroch objemov BN1 pufra (0,12M NaCl, 0,0IM Tri Na-citrát, lmM CaCl? pri pH hodnote 7,0) a prefiltrovaná plazma (približne 20 IU plazmin(ogénu)) sa viedla cez kolónu pri rýchlosti 1 ml/min.

Pretekajúci materiál sa zbieral a zamrazil v plastovej fľaši a živica sa prepláchla aspoň tromi objemami BN1 pufra, vztiahnuté na objem kolóny. Na elúciu plazmin(ogénu) sa použil TLN-1 pufer a následný preplach približne tromi objemami 3M NaCl-roztoku, dvoma objemami purifikovanej vody a dvoma objemami 20 % etanolu + 1 M NaCl (metóda 1). Pri druhej metóde (metóda 2) sa použil rovnaký postup ako v prípade metódy 1, ale doplnil sa ďalším preplachom 3 M NaCl, ktorý predchádzal elúcii plazmin(ogénu).

Analytické testy

Test detekcie Glu-plazmin(ogénu)

Imunclone Glu-plazmin(ogén) ELISA kit (American Diagnostica, Greenwich, CT, USA), použitý v týchto experimentoch, je enzým viažuci sendvičový imunotest špecifický na detekciu prirodzených hladín ľudského Glu-plazmin(ogénu). Kvantitatívna medzná hodnota tohto testu (podľa najnižšej štandardnej kalibračnej krivky) v plazme alebo v derivátoch plazmy je 0,063 pg/ml.

Aktivita plazmínu

Fibrinolytický test sa uskutočňoval s cieľom semi-kvantifikovať aktivitu plazmínu v eluátoch. Jednoducho povedané, plazmin(ogén) zbavený fibrinogén (Enzýme Research) sa inkuboval s rôznymi koncentráciami normálnej odobranej plazmy (Unicalibrator, Stago) alebo purifikovaného plazmin(ogénu) eluovaného z afinitných kolón za prítomnosti zvyšku streptokinázy. Čas, po ktorom bola degradácia zrazeniny kompletná, sa zaznamenal a porovnal s časom kompletnej degradácie zrazeniny vzorky.

Určenie proteínu

Celkový proteín sa testoval s použitím Bradfordovej metódy (Bradford M. M. A rapid and sensitive metód for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding, Anál. Biochem. 72: str. 248 až 254, 1976). Tabuľky 8a a 8b ukazujú výsledky chromatografického odstránenia a purifikácie Glu-plazmin(ogénu) TEA ligandom. Tabuľka 8a zhŕňa získané výsledky týkajúce sa purifikácie plazmin(ogénu). Táto tabuľka ukazuje, že metóda 2 má o trochu lepšie výsledky pri purifikácii plazmin(ogénu) ako metóda 1 pri 567-násobnej purifikácii a výťažku 91,6 %. Tabuľka 8b ukazuje, že sa z nenaviazanej frakcie odstránilo priemerne 99,5 % plazmin(ogénu), čo väčšinou zodpovedá množstvu izolovanému v eluáte (tabuľka 8a).

Tabuľka 8a: Vplyv ďalšieho preplachu TEA živice 3M chloridom sodným (metóda 1 vs. metóda 2) na špecifickú aktivitu, purifikáciu a izoláciu plazmin(ogénu) z plazmy

	Metóda 1	Metóda 1	Metóda 2	Metóda 2
Frakcie	Východiskový materiál	Eluát	Východiskový materiál	Eluát
Objem (ml)	40	13,2	40	20
Proteín (mg/ml)	46,96	0,291	55,41	0,180
Glu-plazmin(ogén)	65,4	18,2	78,0	142,9
Plazmin(ogén) (IU/ml)	neuskutočňované	-0,5	-1
Špecifická aktivita(mg plazmin(ogénu)/mg proteínu)	0,0014	0,625	0,0014	0,794
Purifikačný faktor	446	567
Izolácia plazmin(ogénu)	91,8	91,6

Tabuľka 8b: Odstránenie plazmin(ogénu) z plazmy (priemer výsledkov pre dve metódy)*

Metóda	Chromato- grafická frakcia	Glu-plazmin(ogén) (priemer, pg/ml)	Objem (priemer, ml)	Odstránenie plazmin(ogénu) (%)
1 & 2*	Plazma	71,7	40,0	99,5
	Nenaviazaná Frakcia	0,18	83,5

* metódy 1 a 2 sú identické a zahŕňajú zbieranie nenaviazanej (pretekajúcej) frakcie.

Príklad 6

Vplyv chromatografíckých podmienok na účinnosť imobilizovaného-lyzínového ligandu pri afinitnej purifikácii plazmin(ogénu)

Chromatografický krok

Afínitná purifikácia používajúca živicu s imobilizovaným-lyzínovým ligandom sa testovala s použitím dvoch komerčne dostupných lyzínových živíc. Použila sa chromatografická metóda zdokumentovaná v literatúre (pozri Robbins K. C., Summaria L. Plazmin(ogén) and Plasmin. Metods Enzymol. 45: str. 257 až 273, 1976., pre opísanú metódu 2) a tiež metóda, ktorá bola vyvinutá v laboratóriu vynálezcov (opísaná metóda 1).

Do kolón s priemerom 10 mm (Pharmacia, Švédsko) sa umiestnili dve imobilizované lyzínové živice (Ceramic Hyper DF vyrábaná spoločnosťou Biosepra a sefaróza 4B vyrábaná spoločnosťou Pharmacia). Každá kolóna obsahovala 2 ml (objem za mokra) živice.

Alikvotné podiely kryo-deficitnej čerstvej zamrazenej plazmy sa nechali rozpustiť pri 37 °C a prefiltrovali cez filter majúci hĺbku 3 pm za vzniku číreho roztoku.

Chromatografický krok sa uskutočňoval s použitím jednej z nasledujúcich metód.

Metóda 1

Kolóna sa prepláchla štyrmi objemami každého z nasledujúcich roztokov: (1) purifikovanou vodou, (2) TLN-0,1, (3) TLN-1 a (4) purifikovanou vodou. Rovnováha sa vytvorila pomocou štyroch objemov BN1. Prefíltrovaná plazma (40 ml) sa do kolóny zavádzala rýchlosťou 1 ml/min. Vzorky pretekajúceho materiálu sa zbierali do plastových fliaš a živica sa prepláchla BN1 pufrom. Elúcia plazmin(ogénu) sa uskutočňovala pomocou TLN-1 pufra a pomocou následného preplachu 3 M NaCl roztokom, dvoma objemami purifikovanej vody a dvoma objemami 20 % etanol + 1 M NaCl.

Metóda 2 (ref. 5)

Alikvotné podiely kryo-deficitnej čerstvej zamrazenej plazmy (40 ml) sa prefiltrovali cez filter majúci hĺbku 3 pm. Do 40 ml prefiltrovanej plazmy sa pridali 4 ml 0,5M Tris, 0,2M lyzínu, IM NaCl pufra pri pH hodnote 9.

Kolóna sa prepláchla štyrmi objemami purifikovanej vody a rovnováha sa dosiahla pridaním 0,1 M fosfátového pufra pri pH hodnote 7,4. Nariedená plazma pretekala živicou rýchlosťou 1 ml/min. Vzorky nenaviazaného materiálu sa zbierali v plastových fľašiach a živica sa preplachovala 0,1 M fosfátovým pufrom pri pH hodnote 7,4 až do okamihu, keď absorbancia vytekajúceho prúdu pri 280 nm dosiahla základnú líniu. Plazmin(ogén) sa nasledovne eluoval 0,2M kyselinou ε-aminokaprónovou rozpustenou v 0,1 M fosfátovom pufri pri pH hodnote 7,4 a zbieral do plastovej nádoby. Po elúcii nasledoval preplach približne dvoma objemami 3M NaCl roztoku a purifikovanej vody.

Tabuľky 9a a 9b porovnávajú odstránenie a purifikáciu plazmin(ogénu) pomocou dvoch rôznych komerčne dostupných imobilizovaných-lyzínových živíc a dvoch rôznych purifikačných metód. Aj keď bol zistený relatívne malý rozdiel pri izolácii plazmin(ogénu) z eluátov (tabuľka 9a), je zrejmé, že pri použití metódy 2 a živice Ceramic Hyper DF sa dosiahla oveľa vyššia purifikácia plazmin(ogénu).

Výsledky ukazujú, že použitie živice Lyz-Ceramic Hyper DF a chromatografickej metódy 2 poskytuje 444-násobnú purifikáciu. Navyše väčšina plazmin(ogénu) sa izolovala v pikových frakciách (76,5 % v nenaviazanej frakcii + 10,9 % v eluáte a len približne 10 % zavedeného plazmin(ogénu) nebolo započítané). Z nenaviazanej frakcie sa ale odstránilo len 23,5 % plazmin(ogénu).

Tabuľka 9a: Špecifická aktivita, purifikačný faktor a izolácia plazmin(ogénu) z plazmy s použitím dvoch rôznych komerčne dostupných imobilizovaných-lyzínových živíc a dvoch rôznych chromatografických metód

Frakcia	Metóda 1	Metóda 2
Náplň	Eluát	Náplň	Eluát
	Ceramic Hyper DF	Sefaróza 4B		Ceramic Hyper DF	Sefaróza 4B
Objem (ml)	40	8,1	7,2	40	8,2	9,8
Protein (mg/ml)	55,94	0,347	0,345	60,05	0,0719	0,672
Glu- -plazmin (ogén) (pg/ml)	65,4	40,3	41,9	60,8	32,2	19,9
Špecifická aktivita (mg plazmin(ogénu)/ mg proteínu)	0,0012	0,116	0,121	0,001	0,444	0,030
Purifikačný faktor		97	101		444	30
Izolácia (%)		12,5	11,6		10,9	8,2

Tabuľka 9b: Odstránenie plazmin(ogénu) z nenaviazaných píkov pre obidve metódy

Metóda	Použitá živica	Chromatografická frakcia	Objem (ml)	Glu- -plazmin (ogén) pg/ml	Celkom Glu- -plazmin (ogén) (pg)	Odstránenie plazmin (ogénu) (%)*
1	Ceramic Hyper DF	Plazma	40	65,4	2616	54,6 (45,4)
Nenaviaza- ná	72	16,5	1188
Sefaróza 4B	Plazma	40	65,4	2616	58,0 (42,0)
Nenaviaza- ná	82	13,4	1099
2	Ceramic Hyper DF	Plazma	40	60,8	2432	23,5 (76,5)
Nenaviaza- ná	89	20,9	1860
Sefaróza 4B	Plazma	40	60,8	2432	33,0 (67,0)
Nenaviaza- ná	91	17,9	1629

* Hodnoty v zátvorkách reprezentujú plazmin(ogén) izolovaný z nenaviazaného piku

Claims

10 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob in vitro špecifického odstraňovania alebo izolácie plazminogénu alebo plazmínu za prítomnosti fibrinogénu zo zmesi obsahujúcej plazminogén alebo plazmín, vyznačujúci sa tým, že sa zmes uvedie do kontaktu s rigidnou aminokyselinou, kde sú aminoskupina aminokyseliny a karboxylová

15 skupina aminokyseliny od seba odsadené o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodne o 0,7 nm, a rigidná aminokyselina je že chromatografickým materiálom je časže rigidná aminokyselina je naviazaná na že linkerom je bifunkčný linker. že sa bifunkčný linker zvolí z množiny konvalentne naviazaná na nosič cez aminoskupinu aminokyseliny.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zmes sa zvolí z množiny pozostávajúcej z telových tekutín, akými sú výhodne krv, krvné frakcie, kryoprecipitát, bunkové kultúry, extrakty živočíšnych tkanív, akými sú výhodne bovinné pľúca, bovinné črevá alebo želatína extrahovaná zo zvieracích kostí, albumín bovinného séra, a rovnako tak živočíšne s vodou nemiešateľné tuky, akým je výhodne lanolín.

3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že nosičom je chromatografický materiál.

4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že chromatografickým materiálom je hydrofilný materiál, akým sú výhodne agaróza, celulóza, sklo s kontrolovanými pórmi, silikagély, dextrány alebo organicky umelo pripravený polymér, výhodne na báze polyakrylamidov polystyrénov.

5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že chromatografickým materiálom je agaróza alebo sefaróza.

6. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, ticový materiál alebo materiál vo forme monolitického bloku.

7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, nosič cez linker medzi nosičom a kyselinou tranexámovou.

8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým,

9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým pozostávajúcej z nosiča aktivovaného N-hydroxysukcinimidom, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylamínom, 1,6,-diaminohexánom, kyselinou sukcínovou, l,3-diamino-2-propanolom, etyléndiamínom, TNB, pyridyldisulfidom, jódacetamidom, maleimidom alebo ich kombinácií.

10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že nosič je modifikovaný zvyškom, ktorý reaguje s primárnou alebo sekundárnou aminoskupinou.

11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že po uvedení zmesi do kontaktu s nosičom, na ktorom je naviazaná kyselina tranexámová, sa zmes inkubuje s nosičom po časovú periódu dostatočnú na naviazanie plazminogénu alebo plazmínu a eluuje neutrálnym vodným roztokom obsahujúcim sodné soli, vápenaté soli a pufrové soli.

12. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že po kontaktovaní zmesi sa plazmín alebo plazminogén eluuje vodným roztokom obsahujúcim dostatočné množstvo Ugandu konkurujúceho plazminogénovým väzbovým miestam na rigidnej aminokyseline naviazanej na nosiči.

13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že ligandom je lyzín.

14. Nosič, vyznačujúci sa tým, že má na seba kovalentne naviazanú rigidnú aminokyselinu, kde sú aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny od seba vzdialené 0,6 až 0,8 nm, výhodne 0,7 nm.

15. Nosič podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že sa aminokyselina zvolí z množiny pozostávajúcej z kyseliny tranexámovej a kyseliny 4-aminometylbicyklo[2.2.2.]oktán-l-karboxylovej.

16. Nosič podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tým, že je tvorený chromatografickým materiálom.

17. Nosič podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že chromatografickým materiálom je hydrofilný materiál, akým je výhodne agaróza, celulóza sklo s riadenými pórmi, silikagély, dextrány alebo organicky umelo pripravený polymér, výhodne na báze polyakrylamidov polystyrénov.

18. Nosič podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že chromatografickým materiálom je agaróza alebo sefaróza.

19. Nosič podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým časticový materiál alebo materiál vo forme monolitického bloku.

20. Nosič podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, nosič cez linker medzi nosičom a kyselinou tranexámovou.

21. Nosič podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým,

22. Nosič podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, pozostávajúcej z nosiča aktivovaného N-hydroxysukcinimidom, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylamínom, 1,6,-diaminohexánom, kyselinou sukcínovou, l,3-diamino-2-propanolom, etyléndiamínom, TNB, pyridyldisulfidom, jódacetamidom, maleimidom alebo ich kombinácií.

23. Nosič podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že je modifikovaný zvyškom, ktorý reaguje s primárnou alebo sekundárnou aminoskupinou.

, že chromatografickým materiálom je že kyselina tranexámová je naviazaná na že linkerom je bifunkčný linker. že bifunkčný linker sa zvolí z množiny