SE526038C2 - Polymeraffinitetsmatris, förfarande för framställning därav och anvädning därav - Google Patents

Description

25 30 35 användning av starkt biokompatibla material för undvikan- de av oönskad aktivering av komponenter i vätskan, t ex blod.

Bakterietoxiner Bakteriella endo- och exotoxiner befrämjar en kraf- tig inflammatorisk immunreaktion hos en värd på grund av en aktivering orsakad av multipla interaktioner mellan å ena sidan blodkroppar och lösliga proteiner hos värden och å andra sidan endotoxinet. Denna immunrespons be- skrivs som ett väsentligt särdrag vid de kliniska symto- men av SIRS (systemiskt inflammatoriskt responssyndrom), sepsis eller septisk chock. Patogenesen är svårartad, och tillståndet leder till vävnadsskada, multipel organsvikt och död inducerad av sepsis. Sökandet efter nya terapeu- tiska läkemedel och förfaranden för behandling av sepsis- patienter är viktigt, eftersom studier av färska terapeu- tiska interventioner (Dinarello et al, kine Network 1997; 8:294) vad gäller skydd av patienter med svårartad sepsis eller i European Cyto- har visat att man misslyckats. septisk chock. Vid framställning av terapeutiska ämnen eller vätskor måste hänsyn också tas till att produkten är icke-pyrogen, dvs att endotoxinkoncentrationen är noll eller ligger under accepterade gränser, för utövande av dess effekter.

Endotoxiner Endotoxiner eller "pyrogener" från ytterskikten av cellmembranet hos gramnegativa bakterier, t ex Esherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa eller Proteus vulgaris, spelar en viktig roll vid patogenesen av sepsis, septisk chock och systemiskt inflammatoriskt responssyndrom (SIRS).

(LPS) från E. är sammansatt av lipid A och en poly- sackaridkedja (Zähringer et al, Adv. Carb. Chem. Bio- chem., 1994). Molekylstrukturen för LPS visas i fig l.

Lipid A-komponenten är den biologiskt sett mest aktiva delen och medierar den toxiska effekten av endotoxiner på celler. Lipid A är starkt konserverad i de olika stam- Endotoxiner, t ex lipopolysackarid coli, ZÛO3-ll-06 15:35 V:\EAMBRC LUNDIA AB\GAMBEO LUNDEÅ àBäE-“ATErš-T“-._N@Farnily'\5E\lü'LI468\20l24¿ê Applicatiorlteztfïcïnstrustar CH 2003-11-03 l.dc: 10 15 20 25 30 35 ( s 1 x C/x f.) (w. i 3 marna av gramnegativa bakterier, medan polysackariddelen är mycket mer variabel.

Lipid A från E. coli består av två glukosaminenhe- ter, som innehåller två negativt laddade fosfatgrupper i motsatta ändar av de två glukosaminerna och sex lång- kedjiga, starkt hydrofoba fettsyrarester som är bundna till de två glukosaminringarna. Den variabla polysacka- ridkedjan hos endotoxinet är också bunden till en av glu- kosaminerna.

Avlägsnande av endotoxiner Avlägsnandet av endotoxiner är besvärligt och inklu- derar ofta problem med återhämtning eller skada av värde- fulla proteiner, dvs proteiner som inte är avsedda att avlägsnas, eller biokompatibilitetsproblem mellan blodet eller kroppsvätskan och anordningarna som används för av- lägsnande av endotoxinet. Ett sådant biokompatibilitets- problem orsakas av en ren aktivering av värdens försvars- mekanismer och involverar multipel cellulär aktivering och frisättning av lösliga proteiner, såsom cytokiner och proteiner i komplementkaskaden. Den cellulära aktive- ringen och proteinfrisättningen kan leda till svårartad inflammation, dvs systemisk sepsis eller septisk chock, med vävnadsskada och organsvikt som resultat. Blodkoagel- bildning orsakad av koagulation är ett annat problem or- sakat av bioinkompatibilitet. Dessutom skulle pyrogenen kanske inte avlägsnas fullständigt.

Kända metoder för avlägsnande av endotoxiner inklu- derar inaktivering under användning av värme, syra eller alkali (USA-patentskrifterna nr 3 644 175, 3 659 027 och 4 070 289). Sådana metoder påverkar ofta kvaliteten av slutprodukten, dvs den inaktiverade detoxifierade väts- kan, eftersom vätskan och dess värdefulla proteiner också skulle kunna denatureras eller inaktiveras genom använd- ning av denna typ av förfaranden. Andra metoder som an- vänds inkluderar adsorption på träkol eller oxidativ ned- brytning genom användning av ett oxidationsmedel, t ex 2003-11-06 15:35 Vfïiššêfßíiíl LUNDIA âEl-.Gšå-íßšïü LUHDKA AB\E'~ATE!-.TTE_1»I-.-Faxr1j. ly\SE'x'2'I1 i: 4 68 XZO 12 4 i-B äppl :LcatiGnteztTcInstructor den: ZÛÜS-ll-ÜI; 1 . 10 15 20 25 30 35 kaliumpermanganat, vattenbaserad väteperoxid och natrium- hypoklorit.

' Konventionella medel för avlägsnande av endotoxiner Extrakorporealt avlägsnande av endotoxiner från plasma eller helblod hos sepsispatienter diskuteras som en potentiell terapeutisk strategi vid behandling av sep- sis, septisk chock och SIRS. I humanplasma finns åtskil- liga bindande proteiner som spelar en roll vid mediering och inhibering av endotoxineffekter på celler, t ex lipo- polysackaridbindande protein (LBP), baktericidprotein som sCD14, CAP18 och laktoferrin.

Peptidantibiotikat polymyxin B (producerat av Bacillus ökar permeabiliteten (BPI), polymyxa) inhiberar verkan av endotoxiner pá celler.

Hästskokrabban (Limulus polyphemus) innehåller också endotoxinbindande proteiner, och ett cellysat från denna art används vid detektion av endotoxiner (Limulus-amebo- cytlysat-, LAL- eller Limulus-test). Bindningsmotiven hos sådana endotoxinbindande proteiner kan användas för extrakorporeal behandling av plasma eller helblod hos sepsispatienter.

En gemensam egenskap hos många endotoxinbindande sekvenser är närvaron av alternerande positivt laddade och hydrofoba aminosyror i den bindande delen därav. Det har visat sig att för ett endotoxinbindande protein här- rörande från hästskokrabba bildar den endotoxinbindande sekvensen en amfifatisk sekundärstruktur, där positivt laddade rester och hydrofoba rester är belägna på mot- (Hoess et al, EMBO J, Ett liknande mönster har föreslagits för andra satta ytor av en öglestruktur 1993). kända endotoxinbindande säten. _ Positivt laddade polymerer, såsom polyetenimin (Mizner et al, Artif. Organs, 1993; Weber et al, ASAIO J, 1995; Petsch et al, J. Chromatogr. Biomed. Sci. Appl., 1998) eller dietylaminoetyl (DEAE)-modifierad cellulosa (Weber et al, A.S.A.I.O. J, 1995) har en viss förmåga att adsorbera endotoxiner, förmodligen baserat på interaktio- nen mellan de positiva laddningarna och de negativt lad- IGfJS-ll-ízê 15:35 V-.YGïüéBI-:O LUNEJIA ABRGAIvêKBRO LUZIIÉIA AE\E'ATEr~IT\__NoFarrriIyRSERSO124íšßfifilêflzlß ApplicatiorltextToïnsizructox; 'JH 2928-11-93 luclcflc 10 15 20 25 30 35 _--_, » -4- I :n 000.0' n .nø. Icon .: c: .: . *-»_ , l ~ . 2: a I f a a n n 0 0 v-J fl-'J -°:°°.°.:::.:-: z-z: I I I I OI IQ CIO IDC ÛÛÛ dade fosfatresterna hos lipid A. En nackdel med polyeten- imin är den starka absorptionen av heparin och dess väl beskrivna interaktion med blodplättar, vilket ger upphov till bioinkompatibilitetsproblem, såsom koagulation, vid tillämpning in vivo eller ex vivo.

Pâ liknande sätt används positivt laddade membran- filter för rening av infusionsvätskor. Absorptionen är sålunda beroende pà attraherande laddningar och är mindre specifik och kan därför avlägsna även önskade värdefulla proteiner.

Arginin immobiliserat pà Sepharose har föreslagits för avlägsnande av endotoxiner från plasma, blod och far- maceutiska lösningar (EP O 494 848 och EP O 333 474).

I WO 92/11847 beskrivs användning av en förening för beredning av ett läkemedel som kan användas oralt, intra- venöst, intramuskulärt, intrakutant eller intraperito- nealt för behandling av endotoxininducerade effekter, samt ett förfarande för behandling av endotoxininducerade effekter. Den i WO 92/11847 beskrivna föreningen är inte immobiliserad på en fast bärare.

Hydrofoba polymerer (t ex polystyren, polyamid, polysulfon och polyetersulfon) kan också adsorbera endo- toxiner i vattenbaserade lösningar. Denna egenskap an- vänds i ultrafiltreringsmembraner för rening av vatten och dialys-/infusionsvätska, dvs lösningar med en låg eller ingen proteinhalt (Weber et al, Int. J. Artific. 1997). plasma introducerar emellertid ett problem med konkurrens med cirkulerande plasmaproteiner (LBP, BPI, sCD14) cellulära receptorer Org., Avlägsnandet av endotoxiner från blod eller och (t ex CDI4) om bindning till en ad- sorptionsmatris pà grund av den enbart hydrofoba adsorp- tionen, som har en låg specificitet.

Användningen av positivt laddade eller hydrofoba polymerer för avlägsnande av endotoxiner visar att speci- ficiteten för bindningen och sålunda även selektiviteten för avlägsnandet av endotoxinet i plasma är låg. I prak- tiken har det varit en utmaning att utveckla en effektiv 1383-11-05 'i5-:3EV XY:'=.:S'Z>.I'<1ERO ILIJI-líllà ABÉGI/äI-IBRO LLHJDIA åEXPATEB-'T“-.__l~ioïamiljASERSÛLS4Eêïíülêêaéâ ï-.pplicaticritextifoïnstructor -IIH ZGLïS-ll-GZ Ifcic-c 10 15 20 25 30 35 endotoxinadsorbent med både hög specificitet och hög se- lektivitet, samtidigt i kombination med hög biokompatibi- litet.

Användningen av peptidsekvenser från endotoxinbin- dande proteiner har föreslagits för terapeutiska tillämp- ningar (US-patentskrifterna nr 5 639 727 och 5 643 875) genom användning av t ex baktericida/permeabilitetsökande (BPI) proteinprodukter. En nackdel med immobiliserade peptider är kostnaderna för syntes och nödvändigheten för peptiderna att immobiliseras utan att interferera med bindningsstrukturen.

Affinitetsligander, såsom histamin, histidin och polymyxin B, är effektiva för avlägsnande av endotoxiner, trots att deras effektivitet är beroende på andra protei- ner i vätskan och minskar drastiskt i närvaro av serum- proteiner, såsom serumalbumin, eller andra negativt lad- dade proteiner (Anspach och Hilbeck, J. Cromatogr., 1995, Petsch et al, 1997, EP O 129 786). myxin B är emellertid toxiskt för det centrala nervsyste- J. Chromatogr., Poly- met och kan orsaka njurskada, vilket är en nackdel vid marknadsgodkännande på grund av risk för läckage till pa- tientens blod. I USA-patentskriften 4 771 104 beskrivs ett endotoxindetoxifierande material inbegripande en fiberartad bärare, till vilken polymyxin B är fixerat.

Avlägsnande av endotoxiner, särskilt LPS, från läke- medel och vätskor genom användning av vattenolösliga poly(s-lysin)(PL)-partiklar har beskrivits av Hirayama et al i Journal of Chromatography B, 271 (1999), l87-195.

Begränsningar och framtidsperspektiv Effektivt endotoxinavlägsnande från en proteinvätska beror på nettoladdningen för det önskade värdefulla pro- teinet, Interak- från vilket endotoxinet bör avlägsnas. tionen mellan endotoxinet och dess hydrofob och jonisk karaktär, ligand är av både även om bidraget av vart och ett av dessa beror pá vätskans de. en utpräglad perfusionsförmåga och jonstyrka och pH-vär- Effektivt endotoxinavlägsnande är också beroende på biokompatibilitet hos Ifiílš-'ll-“ÜG 15:35 *¿:\-t'_~'.~'>.MBR,O LUND-IA ABKGAMBEO LUNDI!! AB\E'ATEr\'T*-._!*1:\Fa:nilyRSEÅEaB12468\20124é8 Appl:cationteztTolnstructor CH ZO-'CßE-lí-GS lucia-c 10 15 20 25 30 35 anordningen för avlägsnande av endotoxinet i syfte att förebygga t ex cellaktivering eller blodkoagelbildning. Även om många anordningar har utvecklats eller före- slagits för avlägsnande av ämnen, såsom endotoxiner, från vätskor, t ex blod, andra kroppsvätskor eller terapeu- tiska vätskor, är emellertid ingen av de beskrivna anord- ningarna starkt biokompatibel eller har någon hög grad av specificitet och selektivitet för ämnen som skall avlägs- nas, t ex endotoxiner, och kan samtidigt lätt perfunde- ras, t ex med helblod eller plasma. Det är sålunda önsk- värt att utveckla starkt effektiva, biokompatibla och effektiva metodiker och anordningar för avlägsnande av ämnen, t ex endotoxiner, från en vätska och sålunda möj- liggöra undvikande av de problem som är förknippade med anordningar från känd teknik. I detta avseende fokuserar föreliggande uppfinning på detta behov och intresse.

Behovet av ett nytt och effektivt förfarande och en anordning för reduktion av koncentrationerna eller av- lägsnande av ett eller flera ämnen från en vätska, t ex endotoxiner från blod, vilken annan kroppsvätska eller terapeutisk vätska som helst i syfte att förebygga, eli- minera eller reducera oönskad aktivering av komponenter eller processer i en vätska, är uppenbart av de ovan be- skrivna skälen, särskilt inom det biomedicinska området.

Ett sådant förfarande och en sådan anordning skulle också vara specifikt värdefull vid behandling av sepsis, sep- tisk chock och SIRS genom extrakorporealt avlägsnande av pyrogener eller andra aktiverande ämnen från plasma hos sepsispatienter.

Sammanfattning av uppfinningen Det huvudsakliga ändamålet med föreliggande uppfin-- ning är därför att eliminera problemen som är förknippade med känd teknik genom tillhandahållande av en starkt bio- kompatibel, specifik, selektiv och lättperfunderad poly- meraffinitetsmatris för avlägsnande och/eller reduktion av mängderna eller koncentrationerna av de ovannämnda oönskade ämnena, t ex endotoxiner, i vätskor, dvs en ÉÛÜ3-ll-Ü6 15235 Vt\GAMBRO LUNDIR ÄBKGÄMBRO LUNDIA AEAPATENT\___ï¶cvE'azaily'xSE'\20124G8\20l24é8 Applicati-t-rltextTolnstructor CE! 2003-11-92; Ldb-c 10 15 20 25 30 35 polymeraffinitetsmatris med samtliga av fördelarna inom känd teknik och inga av nackdelarna.

Detta ändamål uppnås enligt en första aspekt av föreliggande uppfinning, dvs med en polymeraffinitets- matris för bindning av ett eller flera ämnen i en vätska för avlägsnande av ämnet eller ämnena från vätskan och/- eller reduktion av mängden eller koncentrationen därav i vätskan i syfte att förebygga, eliminera eller reducera oönskad aktivering av komponenter eller processer i väts- kan, varvid matrisen inbegriper a) en fast bärare, b) minst en spacermolekyl bunden till den fasta bäraren, och, kopplad till varje spacermolekyl, c) en ligand innehållande minst en bindningsenhet med minst en funktionell grupp, varvid liganden har en definierad tredimensionell struktur som är komplementär vad beträffar laddning och/eller hydrofobicitet/hydro- filicitet med den tredimensionella strukturen för ett bindningsmotiv hos ämnet eller ämnena, varvid polymer- affinitetsmatrisen har förmåga att selektivt binda ämnet eller ämnena.

Vid en föredragen utföringsform hänför sig förelig- gande uppfinning till en polymeraffinitetsmatris för av- lägsnande av endotoxiner för reduktion av oönskad aktive- ring av komponenter eller processer i en vätska, varvid matrisen tillhandahåller en ligand med en tredimensionell struktur som är komplementär med den tredimensionella strukturen för ett bindningsmotiv hos endotoxinet, vilket möjliggör bindning av endotoxinet.

Vid den föredragna utföringsformen av polymeraffini- tetsmatrisen enligt föreliggande uppfinning är den fasta bäraren tvärbunden polystyren, spacermolekylen är poly- etenglykol, nämnda minst en bindningsenhet hos liganden är en aminosyra och varje funktionell grupp är en amino- grupp eller guanidinogrupp.

Vid den föredragna utföringsformen för avlägsnande av endotoxiner för reduktion av aktivering av vätskan, :IQÜB--ll-Oé 15:35 Xhäaššuáäßèö Lübïilïà .XBVSAMBRO LUNIV-Išx àE'*-_E'ATEI=*T“-»._I~JoFa1nilyäSEKÉÛïiêišêwOlíäéß ApplirjzaticnteztTolxastru-:tor CH ZOÜB-íl-'LIS 1410:: 0 o 000000 10 15 20 25 30 35 g- r. v- 1,4 --- _ y : o' :on.ø. .a .nu nu: .z .: .E :U ~, f , v _» u n u c-.J L-oo :..'§..:'.__::§_,., pg, O I I O Il OI III III ICC I inbegriper varje bindningsenhet i polymeraffinitetsmatri- sen en aminosyra som är positivt laddad vid eller kring det fysiologiska pH-värdet för blod, helst arginin, ly- sin, cystein eller histidin, eller en annan bi- eller trifunktionell molekyl med minst en funktionell grupp som är positivt laddad vid eller kring det fysiologiska pH- värdet för blod. En sådan polymeraffinitetsmatris bildar ett definierat tröskelvärde ("cut-off") av lx102-1xl06 Daltons och kan användas för bindning av både hydrofoba och/eller hydrofila ämnen.

I en annan aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till ett förfarande för avlägsnande av ett eller flera ämnen från en vätska och/eller reduktion av mängden eller koncentrationen därav i vätskan i syfte att förebygga, eliminera eller reducera oönskad aktivering av komponen- ter eller processer i vätskan, varvid förfarandet inbe- griper kontakt mellan vätskan och polymeraffinitetsmatri- sen enligt uppfinningen under en tidsperiod som är till- räcklig för att reducera mängden eller koncentrationen av och/eller avlägsna ämnet eller ämnena av intresse, före- trädesvis upp till 24 h, helst från 1 s till 2 h. Tids- perioden beror emellertid på flödeshastigheten, kolonn- storleken och appliceringssättet, dvs om behandlingen sker in vivo, ex vivo eller in vitro. Företrädesvis lig- ger mängden eller koncentrationen av ämnet eller ämnena efter avlägsnande eller reduktion under förmàgan för aktivering av komponenter eller processer i blod eller förebygger aktivering av komponenter eller processer i blod.

I en ytterligare aspekt hänför sig uppfinningen till ett förfarande för framställning av polymeraffinitets- matrisen enligt föreliggande uppfinning, varvid det in- begriper stegen att a) binda spacermolekylen till den fasta bäraren för erhållande av ett första komplex, och IC-Üš-ll--ÜG 13:35 ïlflxí-ilåMBfiü LUNDlA AEÅGAMBR-'J LÜlšP-Éïšs ABXE'ï=.TEHT*-.__NoFarfi¿lyfiëšfixiiïï3468\20l2468 Apr/iicatiantezfífølnstructos; :IH ZGülI-lii-Lllß 1.39: I I Oona 09010: 10 15 20 25 30 35 r-r ' (-*'») ç._u 0 OOI oonø 0 0 1 oo Ia 0 0 I n 0 0 n 0 n 0 0 0 0 0 0 oo oo 000 000 0 000 0 10 b) till det första komplexet binda liganden innehål- lande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funk- tionell grupp, eller c) binda spacermolekylen till liganden innehållande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funktionell grupp för erhållande av ett andra komplex, och d) eller binda den fasta bäraren till det andra komplexet, e) binda spacermolekylen till den fasta bäraren för erhållande av ett första komplex, och f) utföra fast fas-syntes av liganden på den till den fasta bäraren bundna spacermolekylen, eller g) bygga upp eller syntetisera spacermolekylen med utgångspunkt från monomerer direkt på den fasta bäraren genom ympning, och h) till det första komplexet binda liganden innehål- lande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funk- tionell grupp, eller i) bygga upp eller syntetisera spacermolekylen med utgångspunkt från monomerer direkt på den fasta bäraren genom ympning, och k) utföra fast fas-syntes av liganden på spacermole- kylen som bundits till den fasta bäraren, varvid information om den tredimensionella strukturen, 'närvaron av laddningar och hydrofoba/hydrofila regioner i bindningsmotivet pá ämnet eller ämnena som skall bindas förvärvas med hjälp av röntgenkristallografi, protein- sekvensering, proteinmodellering eller hydrofobicitets- och hydrofilicitetsberäkningar, och bindningsenheten görs komplementär med ämnets eller ämnenas bindningsmotiv vad beträffar laddning och/eller hydrofilicitet/hydrofobici- tet.

I ytterligare en aspekt hänför sig föreliggande upp- finning till användning av polymeraffinitetsmatrisen för 2003-11-516 15:35 ï/ÜfiGfÄMBPàO LUNEJIÄ ÅBXGAMBEC LUNDIA Aíå\PATENTXJ-JcïamilyKSEKJÛ1246*3\2G124á8 ApplicationteztToInstructor »II-H 2003-11-03 Laïc-c n 0 0 noga 10 15 20 25 30 35 f” » ~ “ß fv- -q '-5 g .0 :..0 .I 0. 0..0 .-.: 0: 0: I: 0--0 v'~,_ 000000000 00 000 v-0 UV- :"wJ::n:'::':m 0 0 0 0 00 00 000 000 000 00 11 avlägsnande av ett eller flera ämnen, företrädesvis endo- toxiner, från en vätska, eller reduktion av mängden eller koncentrationen därav i vätskan, företrädesvis en kropps- vätska eller en terapeutisk vätska, helst blod.

I en ytterligare aspekt hänför sig uppfinningen till en kit för avlägsnande av ett eller flera ämnen från en vätska och/eller reduktion av mängden eller koncentra- tionen därav i vätskan i syfte att förebygga, eliminera eller reducera oönskad aktivering av komponenter eller processer i vätskan, varvid denna kit inbegriper polymer- affinitetsmatrisen, provrör och en anordning för extra- och/eller intrakorporeal behandling av vätskan, företrä- desvis blod eller serum.

Användning av en polymeraffinitetsmatris enligt föreliggande uppfinning optimerar behandlingen av väts- kor, såsom blod, vilken annan kroppsvätska som helst eller terapeutiska vätskor, för avlägsnande av ett eller flera ämnen, såsom endotoxiner, och/eller reducerar mängden eller koncentrationen därav i syfte att före- bygga, komponenter eller processer i vätskan. eliminera eller reducera oönskad aktivering av Närmare bestämt är användning av ett i hög grad bio- kompatibelt och perfunderbart material enligt uppfin- ningen viktig för förebyggande av aktiveringen i vätskan under användning av polymeraffinitetsmatrisen. Detta är av särskild vikt vid extrakorporealt avlägsnande av endo- toxiner från plasma eller blod hos sepsispatienter och beskrivs som en potentiell terapeutisk strategi vid be- handling av sepsis, septisk chock och SIRS. Som en ytter- ligare fördel reducerar användningen av polymeraffini- tetsmatrisen enligt föreliggande uppfinning behandlings- tiden för patienten. A Ytterligare fördelar med och särdrag hos förelig- gande uppfinning framgår tydligare av efterföljande de- taljerade beskrivning tillsammans med ritningarna och de efterföljande patentkraven. 2003-11-06 15:35 VÅGÅMBRÉÜ LUNDIP; ABVSAMBRO LÜÉJDIA AZ-l\_E'ATEbïT\_NOFamily\SE\iÛl24ë8¥20l2458 Apyfl.icationteztToInstrustar CH 2003-11-03 1. 10 15 20 25 30 35 12 Kort beskrivning av ritningarna I fig I visas schematiskt en lipid A-enhet med sina strukturelement i LPS-molekylen.

I fig 2A och 2B visas schematiskt exempel på ligan- der tillhörande den trädliknande strukturen (2A) kamliknande strukturen (ZB) av polymeraffinitetsmatrisen och den enligt föreliggande uppfinning.

I fig 2C visas exempel på polymeraffinitetsmatriser med en cyklisk ligandstruktur.

I fig 3A-3B visas hur den komplementära strukturen för endotoxinet bildas genom användning av strukturella krav och positiva laddningar, hydrofoba regioner och optimala avstånd i bindningstemat.

I fig 4 beskrivs olika sätt att framställa en poly- meraffinitetsmatris enligt föreliggande uppfinning.

I fig 5 visas halterna av endotoxin i humanplasma efter inkubation med PS-PEG-pärlor vid olika tidpunkter (1, 10 och 120 min).

I fig 6A-6G visas inhiberingen av endotoxininducerad produktion av intracellulär IL6 i monocyter efter behand- ling av LPS-bemängt (“spiked") blod med PS-PEG-Arg8-pär- lor som jämförelse med pärlor utan matrisen, dvs ett referensmaterial (PS-PEG-referensmaterial).

I fig 7A-7D visas biokompatibilitetsprofilen för PS- PEG-Argg-pärlor under mätning av antalet vita blodkroppar (WBC) och röda blodkroppar (RBC), antalet trombocyter (THR) (MCT).

I fig 8 visas avsaknaden av TCC(terminalt komple- mentkomplex)-bildning efter användning av PS-PEG-Arg8- pärlor i helblod. och hematokrit I fig 9 visas frånvaron av elastasfrisättning efter användning av PS-PEG-Arga-pärlor i helblod.

I fig 10 visas frånvaron av TAT(trombin-antitrombin III-komplex)-bildning efter användning av PS-PEG-Arg8- pärlor i helblod. ÉÜÜ3~ll~Ü6 15235 ï-'ÜRGÄMBRO LUNDIÄ .ÉB\GÅMBRÜ LÜNDIÃ F-.Fxl-'ÅTENÜJIOFMMly\SE\2012468\20l2468 App-li-:atioriteztToInstrun-tor fïä 2003-11-02; Ldb-c 10 15 20 25 30 35 Ü U š-f¿, y=M,ï :z Q.;J b\Ju ifl 13 I fig 11A-llB visas en tredimensionell struktur av liganden innehållande bindningsenheten för -Arga och -Arg4 optimerad för LPS-bindning.

I fig 12A visas kurvanpassade Langmuir-isotermer för PS-PEG-Arga och PS-PEG-Arg4 i relation till massan för pärlor uttryckt i gram.

I fig l2B visas kurvanpassade Langmuir-isotermer för PS-PEG-Arga och PS-PEG-Arg4 i relation till antalet mol arginin.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Såsom angetts ovan hänför sig föreliggande uppfin- ning till en polymeraffinitetsmatris för avlägsnande av ämnen från en vätska, såsom blod, vilken annan kropps- vätska som helst eller terapeutiska vätskor, för reduk- tion av aktivering av komponenter eller processer i väts- kan, medan den samtidigt har tillräcklig specificitet för undvíkande av adsorption av andra värdefulla ämnen i vätskan, t ex fysiologiska komponenter i blodet. Matrisen tillhandahåller en ligand mentär med strukturen för med en struktur som är komple- ett bindningsmotiv hos ämnet som skall avlägsnas eller vars mängd eller koncentration skall reduceras, t ex ett endotoxin.

Definitioner I detta sammanhang är uttrycket "avlägsna ett ämne" avsett att innebära förebyggande, reduktion, minsk- ning, neutralisation, inaktivering, nedbrytning, modifie- ring, borttvättning, bindning eller döljande av ett ämne, dock inte alltid till en nollmängd eller -koncentration av ämnet. Dessutom-är uttrycket "reducera mängden eller koncentrationen av ett ämne" avsett att innebära en re- duktion eller minskning av mängden eller koncentrationen av ett ämne i en vätska som är tillräcklig för att före- bygga eller inhibera efterföljande aktivering av kompo- nenter i vätskan och/eller cellulära och/eller icke-cel- lulära biologiska mekanismer i vätskan.

Uttrycket "förebyggande, eliminering eller reduktion av oönskad aktivering av komponenter eller processer" av- :Ûflš-PL-'ÜG lÉ-:LE '~,-'I\(SAI\IBRO LÜNDIA AE\G_ÄMBEO LZÉEIDIA AEXPATEIITXJ~JOFamilyXSE'xïlü124GBRZZOIZI!58 ApplicationteztToïnstructor CH 2803-11-03 Ldb-c l0 15 20 25 30 35 14 ser inaktivering, inhibering, sänkning, minskning, reduk- tion, dämpning eller förebyggande av en viss kemisk, bio- logisk eller biokemisk process i vätskan, t ex i blod eller vävnadsceller, t ex plasmaproteinkaskader, såsom signaltransduktionsvägar, komplement- eller koagulations- processer och/eller aktivering av komponenter involverade i sådana processer, på ett direkt eller indirekt sätt.

Ett "direkt" avlägsnande av ett ämne påverkar förfarandet utan några mellanliggande steg, medan ett "indirekt" av- lägsnande innefattar avlägsnande av ett ämne som är en del av en lång kedja eller kaskad av reaktioner, där av- lägsnande av ett ämne tidigt förebygger, dämpar eller in- hiberar en händelse av intresse nedströms. Detta innebär att avlägsnande av ett ämne från t ex blod kan ge ett in- aktiverat eller mindre aktiverat blod. Här är dessutom förebyggande av aktivering av vätskan, inne- fattat.

Uttrycket "vätska" avses inkludera vilket fluidum såsom blod, som helst, såsom vilken gas eller vätska som helst, såsom en suspension eller en lösning, inkluderande konventio- nella lösningar, t ex vattenbaserade eller organiska lös- ningar, eller blod, vilken kroppsvätska eller terapeutisk vätska som helst, vätskor för "life science"-tillämp- ningar, såsom vätskor vid biologiska, diagnostiska eller biotekniska tillämpningar, t ex buffertlösningar, infu- sionsvätskor eller dialysvätskor, vätskor avsedda för näringstillförsel och vätskor avsedda för industriell tillämpning.

Uttrycket "kroppsvätska" är avsett att inkludera blod, plasma, cerebrospinalvätska, ascites och reinfu- sionsvätskor (t ex efter hemokoncentration), blodproduk- ter erhållna från friska donatorer, såsom plasma, blod- plättskoncentrat och erytrocytkoncentrat, som används för transfusioner.

Uttrycket "terapeutisk vätska" är avsett att inklu- dera peritoneala dialysvätskor, hemodialyskoncentrat och dialysvatten, substitutionsvätskor/on-line-beredda väts- ÉÜÜB--ll-ÜS 15:35 VIXGAMBRI) LUI-IDIA .ÅE\GAMBR='J LÜNDIÅ AB\E*ATEI~ïTkwjwloFarnily"\SE\3Ül24EBRQOlZIIáB Applicetir-ntextToInstructor CH 2003-11-03 Ldoc 10 15 20 25 30 35 ¿.¿ë . , _. E _ , ,, fi .

~J 4. x) is \1 \J '..' 15 kor, infusionsvätskor, parenterala näringsvätskor, tvätt- vätskor i kirurgisk miljö och vätskor för blodkomponent- beredning, blodsubstitut hemoglobinlösningar och artificiella hemoglobinlös- (t ex syrebärare, modifierade ningar).

Uttrycket "vätskor för "life science"-tillämpning" är avsett att inkludera vätskor och/eller medier för cell/Vävnadsodlingsteknik, molekylärbiologi (t ex lös- ningar av proteiner och enzymer som används för PCR-tek- niker), bakteriologi, analytika och läkemedelsberedning.

Uttrycket "vätskor avsedda för näringstillförsel“ är avsett att inkludera dricksvatten, vätskor för utomhus- bruk och rekonstitutionsvätskor för livsmedels- och dryckeskoncentrat eller -pulver.

Uttrycket “fast bärare" är avsett att innebära en fast fas eller bärare eller en olöslig matris, på vilken en molekyl, t ex en ligand i form av en polypeptid, kan syntetiseras eller kopplas med eller utan en länk- eller spacermolekyl däremellan.

Uttrycket "funktionell grupp" är avsett att innebära en specifik atom eller grupp av atomer som ger en mole- kyl, dvs bindningsenheten i matrisen enligt föreliggande uppfinning, t ex en aminosyra, en fettsyra, ett kolhyd- rat, en lektin och en nukleotid, och derivat därav, eller kombinationer därav, en specifik kemisk egenskap eller struktur, t ex en positiv eller en negativ laddning, hydrofobicitet eller hydrofilicitet och/eller vilken annan fysikalisk-kemisk kraft som helst, t ex van der Waals-krafter och n-n-interaktioner bland aromatiska grupper, eller förmåga att bilda ytterligare bindningar, såsom vätebindningar eller kovalenta bindningar. Exempel på funktionella grupper på guanidin och -NH2, men kan aminosyror är -COOH, -OH, -SH, också vara en substituerad aminogrupp eller vilken positivt laddad grupp som helst eller blandningar därav.

Uttrycket "bindningsenhet" är avsett att innebära den ovannämnda molekylen under definitionen av uttrycket IífF-'JS-l .l-OE 15: 35 V: \_SZ=.I*1BR(1 LUNDIA AB* GAHLBRL) LUEDIÅ \ ëE\PATENT\_N0Family\SERBÜIÉ46G\2012458 ApplicationïeztToInstructo: CH 25ü3-ll-G3 l.doc onøoøn 0 o annans 10 15 20 25 30 35 16 "funktionell grupp", varvid molekylen är ansvarig för bindningen av ämnet eller ämnena som skall avlägsnas och/eller reduceras, innehåller minst en funktionell grupp och är inkluderad i den till en spacermolekyl bundna liganden i polymeraffinitetsmatrisen enligt före- liggande uppfinning.

Uttrycket "bindningsmotiv" är avsett att innebära en tredimensionell struktur och ett kemiskt motiv, enkelt eller upprepat, på ämnet eller ämnena som skall avlägs- nas.

Uttrycket "ligand" avser hela den tredimensionella molekylen bunden till matrisen via spacermolekylen, dvs inbegripande minst en bindningsenhet med minst en funk- tionell grupp. Liganden bildar en tredimensionell komple- mentär struktur med och binds till bindningsmotivet på ämnet som skall avlägsnas. Här är uttrycket "komplemen- tär" avsett att innebära en tredimensionellt och geomet- riskt definierad struktur som kännetecknas av en förmåga för exakt hopparning med den tredimensionella komplemen- tära strukturen för ett bindningsmotiv hos ämnet som skall avlägsnas.

I Uttrycket "derivat därav" som används tillsammans med en viss förening innebär en eller flera föreningar som derivatiserats på ett sådant sätt att de har samma eller väsentligen samma funktion som föreningen som sådan.

Dessutom är isomerer av föreningarna som utgör li- ganden också avsedda att vara inkluderade inom ramen för föreliggande uppfinning, förutsatt att de uppvisar samma eller väsentligen samma funktion som föreningarna som så- dana. I strukturformlerna definierar a och s enligt den för aminosyror vanligtvis använda nomenklaturen amino- grupperna som används för kovalent koppling av ytterli- gare molekyler.

Uttrycket "ämne(n)" är avsett att innebära minst en löslig eller olöslig komponent eller molekyl av intresse som är avsedd att bindas till bindningsenheten. Exempel 2ÛÜ3~1l~Ü6 15:35 V:\G2 'RÖ LUNDIA ABRGAMBRO -JNDIA àëïFlëTEHTkj-loFarraLyXSh “Gl34i~'8\2f.)l24¿3 Applicatiofitextfroïristructo: CH 2003-11-53 íudc-c 10 15 20 25 30 35 17 på ämnen är toxiska ämnen som kan aktivera blodkroppar, såsom ämnen härledda från virus och bakterier, t ex ett endotoxin, en blodcellpopulation, såsom en lymfocyt, trombocyt, granulocyt, dendritisk cell, monocyt, endotel- cell, stamcell, tumörcell; eller en blodkomponent eller en produkt från en metabolisk aktivitet, såsom glukos- härledda molekyler eller nedbrytningsprodukter därav, blodkoagulationsproteiner, prokoagulationsproteiner, in- flammatoriska eller proinflammatoriska proteiner, cyto- kiner, tillväxtfaktorer, hormoner, kemokiner, uremiska toxiner och makrofagmigrationsinhiberande faktor. Exempel på blodkomponenter är infektiösa ämnen som t ex orsakar en smittsam sjukdom inkluderande viruspartiklar, prioner eller parasiter, svampar, patogenförsedda blodkroppar, liksom läkemedel efter överdosering, patogena livsmedels- tillsatser eller andra komponenter som inte härrör från kroppen. Pyrogener, särskilt bakteriella pyrogener, bak- teriella exotoxiner, produkter från grampositiva bakte- rier, såsom lipoteikonsyra, produkter från kroniska eller akuta metaboliska störningar, som ett resultat av t ex diabetes mellitus, leversjukdom, uremi eller njursjuk- domar eller -inflammation, liksom adhesionskaskader, t ex lösliga adhesionsmolekyler, är också avsedda att vara in- kluderade. Föredragna ämnen som skall avlägsnas är t ex endotoxiner från gramnegativa bakterier, såsom LPS, lik- som bakterie-DNA eller fragment eller nedbrytningsproduk- ter därav, samt oligonukleotider, heparin, fosfat, blod- kroppar och lösliga eller cellytbundna proteiner.

Uttrycket "spacermolekyl" är avsett att innebära en kedjeformad molekyl, t ex en polymer, som modifierar den fasta bäraren i betydelsen av att utgöra en del av den fasta bäraren och positionerar liganden med nämnda minst en bindande enhet innehållande minst en funktionell grupp på distans från den fasta bäraren och gör den mindre be- gränsad genom steriskt hinder från den fasta bäraren och är tillgänglig för ämnet eller ämnena som skall bindas, t ex ett endotoxin, en cellpopulation eller en blodkompo- IÛÜB-ll-Üê 15:35 '-.=':\_!É1'Aï~1B-R,í1 LUNDEÅ ïàF-áïï-XMBRG LUNDIÅ AE\PATEbšTLbJoFamilyflSERIO12468\_2Gl24é8 ApplicatieritextTuhis-t:ut-tor iffi WïLïS-íï-ülï l.c;f:-c 10 15 20 25 30 35 18 nent. Spacermolekylen kan förekomma i ett linjärt och/el- ler grenat och/eller cykliskt format. Spacermolekyl- längden definieras här i förväg med utgångspunkt från de strukturella kraven för ämnet eller ämnena som skall avl- ägsnas.

Uttrycket "distansmolekyl" är avsett att innebära bifunktionella molekyler i liganden med funktionen att skapa ett strukturellt avstånd, om så är önskvärt, mellan bindningsenheten och den trifunktionella förgreningsmole- kylen som definieras under de allmänna formlerna I och II nedan och/eller mellan spacermolekylen och den trifunk- tionella förgreningsmolekylen. Distansmolekylen kan också förekomma i ett cykliskt format.

Uttrycket "pyrogen" och särskilt "bakteriell pyro- gen" definierar ett feberinducerande ämne, oftast av bak- teriellt ursprung, t ex ett endotoxin.

Uttrycket "biokompatibilitet" är här avsett att innebära avsaknad eller frånvaro av aktiverande förmåga för t ex aktivering av celler, koagulation, komplement- kaskader eller liknande processer, i betydelsen att an- vändning av matrisen inte leder till någon aktivering av patientens immunsystem, eller endast i mindre omfattning om sådan aktivering sker. Detta innebär att användningen av en biokompatibel förening eller ett biokompatibelt ämne inte leder till någon oönskad eller oemotsedd akti- vering av komponenter eller processer i t ex blod eller andra kroppsvätskor, ej heller mekanisk eller stress- inducerad celldöd eller cellysis.

Polymeraffinitetsmatrisen För àstadkommande av en diversitet i polymeraffini- tetsmatrisen enligt föreliggande uppfinning som är till- räcklig för att binda och adsorbera en stor mångfald ämnen, kan liganden inbegripa l-100 funktionella grupper, företrädesvis 1-32 funktionella grupper.

Polymeraffinitetsmatrisen enligt föreliggande upp- finning kan föreligga i form av en pärla, en gelliknande 2003-11-06- lßzfåf- 'v't\!3Z=.š~å}'-IR.O LUNDII-'a ABXGAÉJBRO Lüšlílïà A81PATEIETXï-Joïrarnily\E;E'\2G1246617012468 ApplicationteztToIzxstructor CH 2093-11-03 lar-c :Ina .nagon s nunnan 10 '15 20 25 30 35 19 struktur, ett membran eller del av ett membran, en film eller ett nät, eller en kombination därav.

När matrisen är sammansatt enligt föreliggande upp- finning, ger den specifikt ett definierat tröskelvärde av från ca 1xl02 till lxl06 Daltons och kan binda både hydro- foba och hydrofila ämnen utan begränsning.

Vid en föredragen utföringsform föreligger polymer- affinitetsmatrisen i form av en PS-PEG-pärla (t ex TentaGel®, som kan erhållas från Rapp Polymere Tübingen), genom användning av PEG som spacermolekyl. PEG använd som en spacermolekyl har fördelen av tillfredsställande svällning av pärlorna i både organiska och vattenbaserade lösningsmedel och möjliggör på grund av sina kvasivätske- egenskaper likande diffusionsprocesser som i en vätska, och har företrädesvis en diffusionskoefficient som ligger nära den för vatten, dvs 40%.

Biokompatibilitet Enligt uppfinningen bör polymeraffinitetsmatrisen i en föredragen form uppvisa en hög biokompatibilitet vid användning vid en specifik tillämpning, såsom extrakorpo- real behandling av helblod. En hög biokompatibilitet in- nebär att vissa egenskaper är avsedda att vara viktigare än andra. Icke-komplementaktivering, uppmätt genom bild- ning av tidiga komplex och kvantifiering av terminalt komplementkomplex (TCC-protein) enligt Deppisch et al (Kidney Int. 37:696-706), är viktig. En låg trombogeni- citet är också önskvärd för patienten. Graden av trom- bogenicitet mäts genom kvantifiering av trombin-anti- trombin III-komplex (TAT) enligt Deppisch et al (Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3:17-23, 1994) och denna bör inte öka under blod- eller plasmabehandling.

Ett stabilt antal av röda och vita blodkroppar före och efter behandling är också innefattat, liksom frånvaro av cellaktivering pà grund av kontaktfasaktivering. Ett sta- bilt antal blodkroppar är avsett att innebära en lâg grad av eller praktiskt taget ingen skada av blodkropparna på grund av enbart stress, aktivering eller mekanisk skada. 2003-11-06 15:35 V:\GåMBRO LUNDIA ÄBEGAMBRO LUNDIA AB\_PATE!-IT\__Nc=FarrLilyfiSEE01:2468\20l2468 ApplicatiorrtextToInstructor CH 2003-11-03 l.df.r-c 10 l5 20 25 30 35 Sko 20 Proteaser, såsom elastas producerat av t ex granulo- cyter eller neutrofiler efter aktivering, ökar hos pa- tienter med bakteriell sepsis och septisk chock (Heiden et al, Sem. Thromb. Hemost., 1996). antyds också vara en tidig och effektiv markör för infek- Scand. J. Clin. Lab. 1996; 1995). Mätningar av elastas kan ge ytterligare information om biokompatibilitet, och halterna bör följaktligen inte förändras under blodbe- handling.

Liganden För att kunna skapa en ligand som är komplementär Neutrofilt elastas tion (Jensen et al, Invest, Groenenveld et al, Cytokine, med bindningsmotivet för ämnet som skall avlägsnas, såsom ett endotoxin, måste en tredimensionell struktur bildas.

Denna kan åstadkommas genom användning av t ex en flexi- bel eller rigid polypeptidstruktur, som är lätt att syn- tetisera på ett optimalt sätt för den erforderliga tre- dimensionella strukturen. En sådan polymer kan vara lin- jär eller grenad, t ex i en träd- eller kamliknande struktur, eller vara cyklisk. Vid bildningen av sådana tredimensionella strukturer är det fördelaktigt att an- vända aminosyror, eftersom de ger flexibilitet av natu- ren. Kemin för koppling av en sådan polymer, t ex en polypeptid, är välkänd inom teknikområdet. Vid en före- dragen utföringsform av föreliggande uppfinning avser en sådan polymer en polymer innehållande mer än en amino- syra, i allmänhet upp till ca 100 aminosyror, dvs en oligomer, bundna tillsammans via peptidbindningar. Exem- pel på linjära polymerer är poly- eller oligopeptider bildade av amidbindningar mellan alfa-karboxyl- och alfa- aminogrupperna hos intilliggande rester, och exempel på grenade polymerer är poly- eller oligopeptider bildade av amidbindningar involverande en eller flera icke-alfa- aminogrupper.

Såsom angetts ovan kan ligandmolekylen föreligga i ett cykliskt format. Den cykliska strukturen kan bildas genom kovalent koppling mellan två lämpliga funktionella ïIÜfJ3~-ll~-4'J6 \f:\-.3N4BR.O IJJNÜEA Al-“fxíëäl-íâïz-í) LUNDEA AB\E*~ATENT\__I~iC-Farnily\SE\2Ül24G8\2.:l2458 Applicaticnt'eztToïnstaructoi^ 'TI-I ZÛÜZ-ll--Oš 'hd-ac :Inuit 10 15 20 25 30 35 21 grupper i ligandstrukturen, t ex en disulfidbindning (-S-S-) mellan två SH-grupper hos cystein genom oxidation (en vanlig cykliseringsreaktion som också förekommer i naturliga proteinstrukturer).

I fig 2A och 2B visas exempel på olika grenade, trädliknande respektive kamliknande strukturer av ligan- den kopplad till en spacermolekyl, som är bunden till en fast bärare. I dessa strukturer är liganderna i grund och botten uppbyggda av lysinrester, och bindningsenheterna i varje ligand är argininrester. Liganden som är inkluderad i polymeraffinitetsmatrisen enligt föreliggande uppfin- ning kan representeras av de tvà följande formlerna: Allmän formel I: -XIn-YmIXZi-zl; xä-zzlßufun I den allmänna formeln I, som representerar en träd- liknande struktur, har de olika symbolerna följande inne- börd: 0 eller 1; = 2k-1; O till 10, 0 eller 1; 0 eller 1, varvid om k = 0 är X2 = X3 och Z1 = Z2; och LJ. F» ;f 3 5 H H Allmän formel II: -r-x“p-z3 I den allmänna formeln II, som representerar en kam- liknande struktur, har de olika symbolerna följande inne- börd: n = 0 eller 1; m = 2k-l; :ses-11-ae 1s=ss v \sAMsa@ Luunïr Aßxsnnßaø ruun:A AE\?ATENT\_NcFemilyXSE\331246B\20l24¿8 ApplicationteztToInstructoz CH 2003-ll-03 l.doP 10 15 20 25 30 35 22 k = 0-10, varvid om k = 0 är X2 = X3 och Z1 = Z2; r = 1-100; i = 0 eller 1; j = O eller 1; och p = O eller 1.

Zl, Zz and Z3 representerar var och en bindningsenheten och är var och en en organisk molekyl vald från den grupp som består av en aminosyra, en peptid, en fettsyra, ett kolhydrat, eller kombinationer därav, varvid Y, Y1 and Y2 var och en en lektin och en nukleotid, och derivat därav, är en trifunktionell förgreningsmolekyl som innehåller funktionella grupper som är valda från den grupp som be- står av amino, hydroxi, aldehyd, isocyanat, isotiocyanat, eller kombina- tioner därav, och varvid X1, X2 och X3 var och en är en eventuell bifunktionell distansmolekyl innehållande två funktionella grupper som är valda från den grupp som be- aldehyd, tiocyanat, tiol, maleimido, epoxi och derivat därav, tiol, maleimido, epoxi och derivat därav, står av amino, karboxi, hydroxi, isocyanat, iso- eller kombinationer därav.

I fig 2C visas exempel på polymeraffinitetsmatriser med en cyklisk ligandstruktur. I strukturformlerna inne- bär R 'LYSm[Ar9], där m=2k-1, och exempel där k=O,l och 2 visas.

Nämnda minst en bindningsenhet av liganden i poly- 'meraffinitetsmatrisen enligt uppfinningen innehåller så- lunda minst en funktionell grupp, företrädesvis en amino- grupp eller en guanidingrupp eller en substituerad amino- grupp eller minst en av dessa funktionella grupper.

Företrädesvis är aminosyrorna valda med avseende på sin förmåga att vara positivt laddade på eller kring ett fysiologiskt pH-värde, som är specifikt för blod, näm- ligen 2 7,2, dvs vid ett pK-värde av ca 2 6,0. Exempel på sådana föredragna aminosyror är arginin (Arg), lysin (Lys) och histidin (His). Blandningar av sådana amino- 'ÉÜFJÉ-il--ÛG 15:25 VÜ-.KSAMB-Ríš LUISDIA .ÄBKGM/IBI-TO LÉERIIIA FlB\E“I=TEíJ'I'\__NOFarailyïSßßülfâüâïïülß!-58 App-licatioriteztToïlistrucztør 2003-11-52; ludcvc .onto . 0 u nunnan 10 15 20 25 30 35 : ß 2 ',' ',.' Ü. un nu v" 23 syror kan också användas i matrisens ligand för åstad- kommande av en ytterligare variabilitet.

Hellre utgör liganden arginin såsom bindningsenhet eller bindningsenheter och utgör 5 3 mmol/g matris. I allmänhet kan mängden aminosyror vara minst ca 0,01-5 mmol/g matris.

Vid utföringsformen där bindningsenheten hos en gre- nad ligand inbegriper aminosyran arginin, är antalet argininmolekyler per ligand 2-100 argininmolekyler, före- trädesvis 4-8 molekyler, kända som Argmß. Genom använd- ning av en trifunktionell syra, dvs innehållande tre funktionella grupper, här tvâ aminogrupper och en kar- boxigrupp, såsom lysin, kan ändå en grenad struktur bil- das. Detta tillvägagångssätt för användning av s k mul- tipla antigena peptider, MAP, har introducerats av Tam et al och beskrivs i USA-patentskriften nr 5 229 490. Genom variation av antalet grenar, kan anhopningen och avstån- den för ändgrupper, t ex positivt laddat arginin inbe- gripande terminala positiva funktionella grupper, varie- ras, såsom diskuterats ovan i samband med fig 2.

Vid en specifik utföringsform av uppfinningen, där endotoxiner är ämnena som skall avlägsnas med hjälp av polymeraffinitetsmatrisen, hålls de positiva laddningarna för de funktionella grupperna hos aminosyrorna på ett av- stånd som definieras av avståndet mellan individuella negativt laddade fosfatgrupper i ett endotoxin, såsom visas i fig 3.

Såsom diskuterats ovan ger mängden och konfigura- tionen av aminosyrorna variabiliteten för den komplemen- tära liganden i polymeraffinitetsmatrisen och kan därför variera för àstadkommande av tillräcklig variabilitet för absorption av ett stort antal ämnen. Vid en ytterligare utföringsform av uppfinningen är mängden av aminosyror minst ca 0,01, 0,1, 1, 2, 3, 4 eller 5 mmol/g matris. 2503-114/'6 flffzfåfi XÜMÉPMBRO LUNDIA šBfi-.GAMBEO LUFIDIA AEXE“ATEIIT\___I~J:~Farn.ilg-'xslüfiaël246822012468 Appliczationteztïoïnstructcr CH 2003-11-03 1.130: IIII - : I C000 ICC' OO .

ICIIIO 10 15 20 25 30 35 24 Utformning av liganden innehållande bindningsenheten eller -enheterna För åstadkommande av en komplementär struktur för ett ämne förvärvas information med hjälp av förfaranden som är kända inom teknikområdet för studier av förhållan- det mellan struktur, närvaro av positiva laddningar håll- na på ett visst avstånd, liksom närvaro av en hydrofob region i närheten av de laddade grupperna, t ex röntgen- kristallografi, proteinsekvensering, proteinmodellering eller hydrofobicitets- och hydrofilicitetsberäkningar, såsom beskrivs i exempel 1 och visas i fig 3 och ll.

Vid den föredragna utföringsformen är ämnet som skall avlägsnas ett endotoxin, såsom LPS innehållande lipid A, och för fackmannen på området känd information om molekylen beträffande struktur och avstånd mellan laddade fosfatgrupper i molekylen används för bildning av en ligand med minst en bindningsenhet i polymeraffini- tetsmatrisen. Polymeren som utgör liganden syntetiseras vid denna utföringsform av aminosyror, t ex arginin och/eller lysin. Andra aminosyror skulle emellertid också kunna användas, såsom histidin eller cystein.

Vid Argnfi-utföringsformen av uppfinningen såsom komplementär del till bindningsmotivet för ämnet som skall avlägsnas, t ex ett endotoxin, har argininet såsom bindningsenheter följande egenskaper för avlägsnande av endotoxinerna, såsom visas i fig 3: a) närvaro av positiva laddningar hållna på ett av- stånd som optimalt överensstämmer med avståndet till den negativt laddade fosfatgruppen i lipid A, b) laddade grupperna, vilket möjliggör hydrofoba interaktio- ner med fettsyraenheterna hos lipid A, och c) en kombination av egenskaperna i a) och b) för närvaro av en hydrofob region i närheten av de erhållande av en komplementär struktur för lipid A som möjliggör optimal bindning. 'lilífš-lbüê 15:35 X-'ü-GAMBRO LUNDIA AEWAMBRIJ Lüribïša AE\PATENT\__NoFarnily'\S3E\2u)13468\.2Gl24¿8 App-lica:icntextToInstruc-tor CH QOÜE-'Iï-ašš: l.df:-c IDOIOI o o ouøoøn 10 15 20 25 30 35 anses. o 0 u nu ooonuø 0 n 0 o nu en o"'.

I 91... na.. o 0 u o one: o Q 1 0 0 en no 0 0 0 oooaøo n u o gonna- o 9 o ocoooø scan o 25 Spacermolekylen Polymeraffinitetsmatrisen enligt uppfinningen in- begriper en spacermolekyl som är väsentligen hydrofob eller hydrofil, som modifierar den fasta bäraren i bety- delsen av att utgöra en del av den fasta bäraren och har funktionen av en förankringsdel för liganden inbegripande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funktionell grupp- Företrädesvis används polyetenglykol (PEG) som spacermolekyl i en linjär eller grenad konfiguration med en föredragen genomsnittlig molekylvikt av 400-10 000 Daltons och representeras av formeln H-(OCH2CHfln-OH, där n är ca 2-250. Flexibiliteten för PEG-kedjor möjliggör en tillfredsställande tillgång till toxinmolekyler i ligand- polymerens tredimensionella struktur.

Vid en annan utföringsform av föreliggande uppfin- ning kan dessutom den fasta bäraren tillhandahållas med två eller flera spacermolekyler av samma eller olika slag, t ex polyetenglykoler, polypropenoxider, polyvinyl- alkoholer, polyvinylaminer, polyglycidoler eller poly- eteniminer, och derivat därav.

Alternativt krävs inte närvaro av en spacermolekyl i polymeraffinitetsmatrisen, t ex när den tredimensionella strukturen för det komplementära bindningsmotivet för ämnet eller ämnena som skall bindas möjliggör frånvaro av spacermolekylen för att bindning skall äga rum. Enligt denna utföringsform av föreliggande uppfinning är sålunda bindningsenheten direkt bunden till den fasta bäraren.

Den fasta bäraren Den fasta bäraren bör tillhandahålla variabilitet vad beträffar porositet och storleksuteslutningsegenska- per. Den bör dessutom tillhandahålla en bärare för fast fas-syntes för polypeptidsyntes vid den föredragna ut- föringsformen. Olika fasta bärare, dvs polymerer, som kan användas vid föreliggande uppfinning beskrivs i EP 0 187 391, WO 99/17120 och i USA-patentskriften nr 4 908 405. Här är den fasta bäraren en linjär och/eller 2003-11-06 15:35 *JfxGAMEšR-.O LUNDIA lxßïïiu/.IBRO LUNDIA AEWEATENT\__NoFarnily\SE\2012468\20l24:S8 àpplicatifsriteztToInstructor CE-í 2003-11-03 1 dec Q ecco .piano 0 u 00000. 10 15 20 25 30 35 _ , , . .. ..._ u oc O 9 V '°'. ~'ff fi/ 'ïïïïš f: 9 '='= 'E:: Ü å: o L' *J ïJ šnu šsu: ä: :..: ..': ' OE. .§. .:. o.'o grenad biokompatibel ympsampolymer med en tvärbindnings- grad av 0,05-10% och är vald från den grupp som bestàr av polyvinylalkoholer, polyhydroxistyrener, polymerer produ- cerade av klormetylerade polystyrener och etylenglykoler; poly- eller oligoetenglykoler med formeln H-(OCH2CHfln-OH, där n representerar 2-250, polyakrylater eller polymet- akrylater som funktionaliserats med hydroxigrupper; och derivat därav. Vid föreliggande uppfinning kan ovannämnda tvärbindningsgrad vara upp till 50%.

Det fasta bärarmaterialet är valt från den grupp som utöver de ovannämnda består av polystyren, hydroxialkyl- polystyrener, hydroxiarylpolystyrener, hydroxialkylaryl- polystyrener, polyhydroxilerade polystyrener, poly- hydroxiarylerade polystyrener, isocyanatalkylpolystyre- ner, isocyanatarylpolystyrener, karboxialkylpolystyrener, karboxiarylpolystyrener, aminoalkylpolystyrener, amino- arylpolystyrener, tvärbundna polyetenglykoler, poly- akrylater, polymetakrylater, cellulosa, kiseldioxid, kol- hydrater, latex, cykloolefinsampolymerer, glas, andra lämpliga polymerer eller kombinationer därav. Formen av den fasta bäraren kan vara en pärla, ett membran, en partikel, t ex en nanopartikel, ett nät, fibertyger och vävar, en fibermatta, ett rör, en film, en folie eller kombinationer därav, eller tvärbundna interpenetrerande nätverk. Vid en föredragen utföringsform består den ovan beskrivna affinitetsmatrisen av tvärbundet polystyren på vilket PEG är ympat som en spacermolekyl.

Ett föredraget fast bärarmaterial enligt förelig- gande uppfinning är en pärla med en storlek som är till- räcklig för att tillhandahålla en starkt perfunderbar och biokompatibel bärare, t ex polystyren, företrädesvis i kombination med PEG såsom spacermolekyl, till vilken lysin och/eller arginin är bundet, vilket inte bör ge några restriktioner vad beträffar hydrofila eller hydro- foba ämnen. En lista över lämpliga kommersiellt tillgäng- liga pärlor visas i tabell l.

LÉtT-Ü3-l}.-ü6 15:35 SIN-.XSJš-.P-EERK) LUEIDIA ÅBRGAMBRO lišššffllïa AEKPATENT*rjløïfïaznilgfäsßiü134G8\.2012468 ApplicatiorrteztTøïnstructor fafiüfæ-lï-ÜB Ldc-c 10 15 20 i” f' _' .i z 0:0 b' :o-...cz .E šo c bro 'ao rr3¥*JmP¿H;.a 27 Tabell 1 Kommersiellt tillgängliga aktiverade pärlora Toyo Pearl HW7OEC® (Tosoflaas) Toyo Pearl HW65EC® (TosoHaas) Toyo Pearl AF65OM® (TosoHaas) TentaGel® (Rapp Polymer) Eupergit c25oL® (Röhm) Eupergit 250® (Röhm) Fractogel EMD Epoxy® (M) Fractogel EMD Azlactone® (Merck) (S) (Merck) Poros EP® (Perkin Elmer-Biosystems) “De kommersiellt tillgängliga aktiverade pärlorna ovan kan konditioneras för immobilisering av en ligand Perfunderbarhet för polymeraffinitetsmatrisen En hydrogelliknande struktur bildas när polymer- affinitetsmatrisen hydreras och på grund av hydreringen sväller. Svällningsförmågan definieras som svällning på grund av hydratisering av polymeren från ett torrt till- stånd för bildning av den hydratiserade och gelliknande matrisen. En sådan svällning kan också definieras som en ökning av vikt per volymsenhet i hydratiserat tillstånd och den kan enligt uppfinningen vara en faktor av ca 1,5-10 gånger, företrädesvis 3-5 gånger, vid jämförelse mellan torra och hydratiserade former av polymeraffini- tetsmatrisen. Denna svällningsförmåga möjliggör att hel- blod kan perfunderas fullständigt genom matrisen, varvid blodkropparna och antalet därav hålls intakta.

Såsom angetts ovan vid den föredragna utförings- formen genererar polymeraffinitetsmatrisen som sådan en matris med ett definierat tröskelvärde av ca lx1O2-1xl06 ÉÜÜ3~Ll-í26 15:35 X-'ÅGÄLMBRIO LUNDIÄ .ÄI-ÄGAMEEÉYJ LÜNIIIÄ AE\_PATENTXJIGFarniJ.yÄSEXIÉßlS468\20l24ó8 ApplicationtextTo-Iiistructcr CH 2003-11-03 Ldoc 10 15 20 25 30 35 28 Daltons, vilket möjliggör att blodkroppar perfunderar, utan någon diffusionsrestriktion för hydrofila och/eller hydrofoba ämnen.

Förfarande för avlägsnande av ett ämne Föreliggande uppfinning hänför sig även till ett förfarande för avlägsnande av ett eller flera ämnen från en vätska och/eller reduktion av mängden eller koncentra- tionen därav i vätskan i syfte att förebygga, eliminera eller reducera oönskad aktivering av komponenter eller processer i vätskan, vilket förfarande inbegriper kontakt mellan vätskan och polymeraffinitetsmatrisen enligt före- liggande uppfinning under en tidsperiod som är tillräck- lig för att reducera mängden eller koncentrationen av och/eller avlägsna ämnet eller ämnena. Vid en föredragen utföringsform under användning av detta förfarande kommer därigenom avlägsnandet av ett ämne, t ex ett endotoxin, från blod eller vilken annan kroppsvätska som helst, att direkt eller indirekt förebygga aktivering av t ex blod- kroppar genom bindning av de oönskade ämnena som är upp- räknade under definitionen av "ämne(n)" ovan. Företrä- desvis kan detta uppnås genom kontakt mellan vätskan och den ovan definierade polymeraffinitetsmatrisen under en period av upp till 24 h, helst från 1 s till 2 h, vilket ger en mindre aktiverad eller förebyggd aktivering av blod och dess komponenter.

Vid en föredragen utföringsform är ämnet som skall avlägsnas med hjälp av förfarandet som beskrivs enligt föreliggande uppfinning ett endotoxin. Föreliggande upp- finning hänför sig även till avlägsnande av en definierad blodkroppstyp eller -population som är vald bland leuko- cyter, t ex T- och B-celler, monocyter, trombocyter, gra- nulocyter och/eller neutrofiler. Det är också avsett att med hjälp av den ovan beskrivna polymermatrisen avlägsna komponenter i den extra- eller intracellulära signal- transduktionsvägen, vilka är valda från den grupp som består av glukos och dess nedbrytningsprodukter, karbo- nylföreningar, inflammatoriska och proinflammatoriska 'Äiïüš-ll-VJÉ 15:35 VfxüATdBRG LUNDIA .ÄBXGALIEJEO LUNDIA AE\FATEríT\___NoFaïr\i.§.y"\SE\_3Ül24éšB*-.20l24:S8 Appíic-ationtextTcïxistrut-to: CH f/:Oüífi-ll-ÛS lfiaïf-c 10 15 20 25 30 35 -~»,» ..» . ~ura:: 5-°¶: ¿ 4 4 f.) Å O U J u '-._:' :__' 29 proteiner och/eller proteiner involverade i trombogenes eller i komplementkaskaden, bakteriehärledda bestånds- delar, endotoxiner, celler, blodkroppar, bakterier och virus, eller patogenbemängda blodkroppar, eller åtmins- tone delar eller nedbrytningsprodukter därav, DNA eller fragment därav, eller fosfat, genom tillhandahållande av en ligand som inbegriper minst en bindningsenhet och som har en struktur som är komplementär med strukturen för ett bindningsmotiv hos ämnet.

Vid denna föredragna utföringsform avlägsnas ett t ex LPS, till < 50% under 2 h under t ex en statisk inkubation eller under perfusion av en kolonn med fast fas. endotoxin, Vid denna föredragna utföringsform avlägsnas endo- toxinet under en definierad tidsperiod av ca l s och upp till och med ca 2 h till en mängd eller koncentration som inaktiverar blodet eller förebygger aktivering av blodet, såsom uppmätts med hjälp av en LAL-analys, som beskrivs nedan. Användning av LAL-analysen är känd inom teknik- området och ger information om endotoxinhalterna. Förfa- randet enligt uppfinningen, som är snabbt och effektivt, ger med hjälp av LAL-analysen inom den ovan angivna tids- perioden av 1 s till 2 h halter av endotoxin som ligger under kapaciteten för aktivering av blod, eller aktiverar blodkroppar och komponenter i endast en mindre omfatt- ning.

Förfarande för framställning av en polymeraffinitets- matris Förfarandet för framställning av en polymeraffini- tetsmatris enligt föreliggande uppfinning inbegriper de följande stegen att: a) binda spacermolekylen till den fasta bäraren för erhållande av ett första komplex, och b) till det första komplexet binda liganden innehål- lande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funk- tionell grupp, eller ÉÛLS-ll-ílê 15:35 Vfxíššlšåïšü LUNDIA AB\GAMBRO IJUI-IDIA AEKFATENT\_NoFaxnily\SE'\30l24-38\2Ûl2468 applicaticritextToínstrucztcr -LIH ccoo quoouo annan 10 15 20 25 30 35 0 U u aøonou n Q 0 oonntv 0 30 c) binda spacermolekylen till liganden innehållande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funktionell grupp för erhållande av ett andra komplex, och d) binda den fasta bäraren till det andra komplexet, eller e) binda spacermolekylen till den fasta bäraren för erhållande av ett första komplex, och f) utföra fast fas-syntes av liganden på den till den fasta bäraren bundna spacermolekylen, eller g) bygga upp eller syntetisera spacermolekylen med utgångspunkt från monomerer direkt pà den fasta bäraren genom ympning, och h) till det första komplexet binda liganden innehål- lande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funk- tionell grupp, eller i) bygga upp eller syntetisera spacermolekylen med utgångspunkt från monomerer direkt på den fasta bäraren genom ympning, och k) utföra fast fas-syntes av liganden pà spacermole- kylen som bundits till den fasta bäraren, varvid information om den tredimensionella strukturen, närvaron av laddningar och hydrofoba/hydrofila regioner bindningsmotivet på ämnet eller ämnena som skall bíndas förvärvas med hjälp av röntgenkristallografi, protein- modellering eller hydrofobicitets- och hydrofilicitets- beräkningar, och bindningsenheten görs komplementär med ämnets eller ämnenas bindningsmotiv vad beträffar ladd- ning och/eller hydrofilicitet/hydrofobicitet.

Det ovan beskrivna förfarandet inkluderar vid en utföringsform även framställning av en matris med en spacermolekyl inbegripande en ligand immobiliserad på en fast bärare enligt något av de följande sätten, som visas mer detaljerat i fig 4; för a) och b) ovan: aktivering av den fasta bäraren, koppling av spacermolekylen till den fasta bäraren, syn- IÜÜS-ll-Ûš 15:35 '~.-':\!EI~'.E~1BR(J LUNDIA ABMEAI/IBRL) LUNDIA AE\_E“ATENTX__Nc»FaxrLilyflSEDG12468\2Ol24di: Applicationteztïïoïnstructor CH ífiüia-li-»üš 1.

GO" stol 10 15 20 25 30 35 (f. ßif (Jr 31 tes av liganden innehållande bindningsenheten och sätes- specifik koppling av liganden till spacermolekylen, eller för c) och d) ovan: syntes av liganden innehållande bindningsenheten, koppling av spacermolekylen till ligan- den, aktivering av den fasta bäraren och sätesspecifik koppling av spacer-ligandkomplexet till den aktiverade fasta bäraren, eller för e) och f) ovan: aktivering av den fasta bäraren, koppling av spacermolekylen till den aktiverade fasta bä- raren och fast fas-syntes av liganden innehållande bind- ningsenheten på denna bärare.

Förfarandet innehållande stegen a)-f) som beskrivits ovan fika inkluderar vid en andra utföringsform även de speci- stegen för a) och b), aktivering av spacermolekylen, kopp- ling av den aktiverade spacermolekylen till den fasta bäraren och koppling av liganden till den aktiverade spacermolekylen, eller för c) och d), syntes av liganden, aktivering av spacermolekylen, sätesspecifik koppling av liganden till den aktiverade spacermolekylen och koppling av spacer- ligandkomplexet till den fasta bäraren, eller för e) och f), aktivering av spacermolekylen, kopp- ling av den aktiverade spacermolekylen till den fasta bäraren och fast syntes av liganden på spacermolekylen som bundits till den fasta bäraren.

Såsom angetts ovan är ett föredraget förfarande enligt föreliggande uppfinning ett där den fasta bäraren, spacermolekylen och liganden immobiliseras genom aktive- ring av en fast bärare, koppling av spacermolekylen och fast fas-syntes av liganden innehållande bindningsenheten direkt på den fasta bäraren.

Användning av polymeraffinitetsmatrisen Föreliggande uppfinning hänför sig även till använd- ning av en polymeraffinitetsmatris enligt föreliggande uppfinning, företrädesvis för användning för avlägsnande av ett eller flera ämnen, företrädesvis endotoxiner, från IÛÜ3~il-06 15:35 V:\GÅMBRO LÜNDEÄ ÅEÄGAMBRÛ LUNDIA AE'\_FATENT\_NoFarrö.l3f'ašE'=,3:)íšá(18\.2O12f!623 Applicätieritextïolrxstrue-tor CH 2-2-'313-11-03 Ivar-c 00:00: 10 15 20 25 30 35 526 Use 32 en vätska, eller reduktion av mängden eller koncentratio- nen därav i vätskan, företrädesvis en kroppsvätska eller en terapeutisk vätska, helst blod, särskilt för beredning av mindre aktiverat blod eller förebyggande av oönskad aktivering av komponenter eller processer i blod. Poly- meraffinitetsmatrisen används företrädesvis som en del vid ett extrakorporealt blodreningsförfarande eller i kontakt med blod eller ett blodflöde, t ex som ett im- plantat i kroppen för kontakt med blod eller vilken kroppsvätska som helst, t ex i det vaskulära systemet, i blodkärl eller i bukhålan.

Kit inbegripande polymeraffinitetsmatrisen Vid en utföringsform hänför sig föreliggande uppfin- ning till en kit för avlägsnande av ett eller flera ämnen fràn en vätska och/eller reduktion av mängden eller kon- centrationen därav i vätskan i syfte att förebygga, eli- minera eller reducera oönskad aktivering av komponenter i vätskan, varvid denna kit inbegriper en polymeraffini- tetsmatris enligt föreliggande uppfinning, provrör och en anordning för extra- och/eller intrakorporeal behandling av vätskan, företrädesvis blod eller serum.

Slutsats Med föreliggande uppfinning tillhandahålls medel för avlägsnande av ämnen från en vätska på ett högeffektivt och tidsbesparande sätt. Detta åstadkoms med hjälp av användning av en polymeraffinitetsmatris enligt förelig- gande uppfinning, som är starkt biokompatibel och möjlig- gör för helblod att flöda därigenom på grund av till- fredsställande svällningsförmåga. Medlets effektivitet beror också på bildandet av en ligand inbegripande en bindningsenhet som är komplementär med det bindande moti- vet för ämnet som skall avlägsnas. Därför kan förelig- gande uppfinning appliceras vid t ex extrakorporeal blod- behandling såsom en dialys- och transfusionsmedicin för terapeutiska tillämpningar, stamcellsterapi och/eller cellterapi, diagnostiska tillämpningar och även inom bio- IOOS-ll--flê VAGïtßflE-.RO LUNDIA .IxBäGAr-IIBEO LKJHDIA AE\.E“3>.'E'Eï-IT\_2-loFarnily\SEl'\:2ül2468\2Ql2=!68 ApplicationteztToïnsfïructcr CH 2953-11-33 lpd-f-c u o bundna 10 15 20 25 30 35 v ß; C. 33 teknik, bioingenjörskonst, genteknik, livsmedelskemi och vattenberedning och/eller -rening.

EXEMPEL Exempel 1 Utformning av en ligand innehållande en bindningsenhet för LPS I detta exempel beskrivs, utan begränsningar av uppfinningen, utformningen av en ligand innehållande en bindningsenhet för avlägsnande av LPS.

Princip Ett effektivt avlägsnande av toxiner, t ex LPS, krä- ver en ligand med en bindningsenhet som är komplementär med bindningsmotivet för ämnet som skall avlägsnas. Detta inkluderar en tredimensionell aspekt av ämnet som skall avlägsnas och ett exakt arrangemang av molekyler för optimering av en biospecifik igenkänning av egenskaper som komplementära laddningar, hydrofobicitet och hydrofi- licitet. Detta tillsammans med lämpliga avstånd mellan de ovannämnda särdragen fullbordar liganden med dess bind- ningsenhet. Den totala tredimensionella presentationen av en sådan ligand i en polymermatris bör också vara optimal i rymden för möjliggörande av höggradig perfusion, li- gandpresentation och flexibilitet för liganden. En hög- gradig biokompatibilitet är också ett krav för blodrening in vivo eller ex vivo hos patienter. I den beskrivna mat- risen är tillgängligheten jämförbar med eller även iden- tisk med den för en vattenbaserad lösning med icke-fast fas. Strukturen för LPS visas i fig 1. Den föreslagna komplementära bindningen till LPS visas i fig 3A-3D, där fosfatgrupperna och den hydrofoba svansen för LPS beaktas för bildning av ett komplementärt bindningsmotiv. Den föreslagna strukturen visas för Arg4 och Arga i fig 2, liksom i ett tredimensionellt format i fig ll. Arga upp- visar hälften av argininpositionerna i vänstra delen av figuren och hälften av argininpositionerna i högra delen, dvs fig llB. Bindningen till spacermolekylen, här till PEG, visas också. 2003-11-06 15:35 vmêšifißäo LUNDIA AEXLÄAMBRO LUND-IA aB\_PATEï~IT\_N-c-FarniLyXSERQOIDI68\2012458 ApplicationtextTøInstructoi' -Jål QOÜS-il-»GS 1.dcf~:: 10 15 20 25 30 34 Molekylär simulering Molekylära simuleringar utfördes för ytterligare identifiering och verifiering av den tredimensionella geometriska och kemiska strukturen för det beskrivna bindningssätet. Simuleringarna utfördes på en Silicon Graphics Octane 2 Workstation, genom användning av Insight II-Package (Molecular Simulations Inc.

(MSI), San Diego, CA) och de däri inkluderade optimeringsalgorit- merna, t ex AMBER forcefields.

Resultatet av de tredimen- sionella arrangemangen för Arg4 och Argß visas i fig 11A respektive llB. Här visas principen för den tredimensio- nella terminala delen av matrisen utan PEG-spacermole- kylen eller fast bärare.

Syntes av liganden Liganden med dess bindningsenhet syntetiseras enligt fig 4, där tre olika vägar visas. Ett föredraget förfa- rande av de tre är fast fas-syntes direkt på PEG-spacer- molekylen, som är bunden till den fasta bäraren. Bind- ningsenheten används här i ytterligare exempel.

Exempel 2 Jämförelse av grenade och linjära ligander I detta exempel beskrivs adsorption av endotoxinet LPS från humanplasma. Exemplet visar också en jämförelse mellan linjära och grenade ligander för adsorption av endotoxinet.

Princip Pärlor inkuberas med hepariniserad humanplasma under en tidsperiod av 2 h. Endotoxinhalterna bestäms efter 2 h inkubation genom användning av en LAL-analys.

Material Följande pärlor användes: ÉÛÛ3-ll-06 15:35 A3\PÄTENT\_NOFamily\SE\ nfi1a -t A- ¥:\GAMBRO LUNDIA AEXGAMBRO LUNDIÅ 46851012468 App-lituatiozitextTcïzxstructor CH QíI-ÜÉJ-'Ll-iïí Lcloc Q Q cotton 10 15 20 PS-PEG-LBP 94-108 endotoxinbindande sekvens från LBP, linjär PS-PEG-BPI 85-99 endotoxinbindande sekvens från BPI, linjär PS-PEG-Arga 8-faldigt grenad, innehàl- lande arginin PS-PEG-NH-Ac acetylerat basmaterial som kontroll Inga pärlor kontroll Förfarande Inkubation av pärlor i hepariniserad plasma utförs vid 37°C. Proverna omrörs långsamt, och pärlorna avlägs- nas genom centrifugering efter en inkubationsperiod av 2 h.

Analxs En LAL-analys utförs för kvantifiering av halterna av endotoxiner efter inkubationen med pärlor. Analysen utförs med hjälp av en LAL-inducerad reaktion med kromo- gent ämne (Chromogenics, Mölndal, Sverige). Halterna be- räknas enligt en standardkurva som erhållits med definie- rade koncentrationer av endotoxin i hepariniserad human- plasma.

Resultat Genom användning av LAL-analysen erhålls följande endotoxinkoncentrationer efter en inkubationsperiod av 2 h.

Endotoxin (IU)/ml PS-PEG-LBP 94-108 10 PS-PEG-BPI 85-99 9 PS-PEG-Argg 2 PS-PEG-NH-AC 10 Inga pärlor 8 Startvärde 10 2003-- ll~-0'>' i; z-'H V: 'ïíäàfiüßí-lü LUNDIÅ âBVš-.låbfïíäíäfà LUNDIÉÅ àBïPhTENTämBoFamilyL H2§1245SX20l246S ApplioatiuntextPoïustruotor Cä 20ül~ll-03 l.doc 10 15 20 25 36 Diskussion Detta försök visar att endotoxinhalterna kunde minskas femfaldigt genom användning av den grenade tre- dimensionella matrisen pá PS-PEG-pärlorna. Pärlor med en linjär ligand var inte lika effektiva, och endotoxin- halterna i dessa prover làg fortfarande på, eller nära, starthalterna av endotoxinet.

Exempel 3 Kinetik för endotoxinbindning I detta exempel visas kinetiken för endotoxinbind- ning när pärlor med en tredimensionell matris, optimerad för LPS-bindning, inkuberas med plasma och analyseras vid olika tidpunkter.

Princip Kinetiken för absorptionen beror på strukturen av och graden av tvärbindning hos polymermatrisen. Pärlor inkuberas med hepariniserad humanplasma. After 1, 10 och 120 minuter tas prover ut. Endotoxinhalterna bestäms genom användning av en LAL-analys.

Material Följande pärlor användes: PS-PEG-Arga 8-faldigt grenad, innehål- lande arginin PS-PEG-Arg4 4-faldigt grenad, innehål~ lande arginin PS-PEG-Arg linjär, innehållande arginin PS-PEG-NH-Ac acetylerat basmaterial (-Ref) Förfarande Inkubation av pärlor i hepariniserad plasma utförs vid 37°C. Proverna omrörs långsamt, och prover tas ut efter en inkubationsperiod av 1, 10 och 120 minuter. Pär: lorna avlägsnas genom centrifugering. 2ÛÜ3~~1 l-ÜG 15:35 \-':\«I3A.MHR.O LUIJDIA AF-.GÅMBRO LUNDIA âE-'XE*ATEI~ïT\___NoFanulyäSERZülS-l68\2G12458 App).icationtextkfifnstructoi* iZi-I 2003-11-03 lpdc-c Analys En LAL-analys utförs för kvantifiering av endotoxin- halterna såsom i exempel 2.

Resultat I fig 5 visas resultaten av endotoxinhalterna upp- mätta vid olika tidpunkter. I figuren visas att en tids- period av 2 h krävs för effektivt avlägsnande, dvs för erhållande av en rest av 20-30% endotoxin jämfört med utgángshalterna i proverna. Den linjära liganden innehål- lande arginin (PS-PEG-Arg) avlägsnar endast halva mängden av endotoxiner, dvs lämnar kvar en halt av 60% efter 120 minuter. När referenspärlorna (PS-PEG-NH-Ac) tillsattes, var pà liknande sätt mängden av endotoxin efter inkuba- tion med pärlorna fortfarande oförändrad, dvs vid start- värdena, efter 120 minuter.

Exempel 4 Inverkan av den terminala aminosyran och polymerens förgrening I detta försök visas inverkan av den terminala ami- nosyran och (arginin kontra lysin) inverkan av förgre- ning, dvs icke-förgrening kontra 4-faldig kontra 8-faldig förgrening av liganden.

Princip Pärlorna inkuberas med hepariniserad humanplasma med och utan endotoxin. Endotoxinhalterna bestäms genom an- vändning av en LAL-analys efter 2 h.

Material Följande pärlor användes: ICÜB-ll-llë 15:35 VflGAIVlBIåO LUNDEA .ÄBXGN-JBRÅ) L-'JIíDIFà àßïxPAïEïíTklflo-Eaxnily-'KSEXLÉÛID468\_20l2458 Applicaticntextfiøïrxstructoi* :IH 2053-11-03 Lcloc IIOCII onncnc 10 38 PS-PEG-Arga 8-faldigt grenad, innehål- lande arginin PS-PEG-Lysg 8-faldigt grenad, innehål- lande lysin PS-PEG-Arg4 4-faldigt grenad, innehål- lande arginin PS-PEG-Lys4 4-faldigt grenad, innehål- lande lysin PS~PEG-NH-AC acetylerat basmaterial PS-PEG-Arg linjär, innehållande arginin Inga pärlor kontroll Analys En LAL-analys utförs såsom i exempel 2.

Resultat PS-PEG-Arga PS-PEG-Lysg PS-PEG-Arg4 PS-PEG-Lys4 PS-PEG-NH-Ac PS-PEG-Arg Inga pärlor Före inkubation, dvs start- värden Diskussion 0,4 1,8 0,01 2,7 7,8 3,5 ll 13 Endotoxin (IU/ml) Resultaten visar att en grenad ligand är mer effek- tiv än linjära former och att arginin är flerfaldigt (4- faldigt och 200-faldigt för Arga respektive Arg4) mera effektivt än lysin vad gäller avlägsnande av endotoxiner.

PS-PEG-Argq är dessutom mest effektivt vad beträffar av- lägsnande av endotoxiner efter 2 h. Éüüšwll-Û6 15:35 V:EGÅMBRO LUNDIA ÅBXGAMBEO LUHDIÅ AEA, PATENT *tjloFami l3f'\SE“\_J0 Éš/l 4 68 \.2-.')1§ï4 ¿8 Appliccatioritextïfoïnst rucqtoif al' 0 0 1:00 annans 10 15 20 25 30 35 .vc 000000 0 0 0 00 000000 0 0 0 0 00 00 0'.... 00... 0000 0 0 0 0 0000 39 Exempel 5 0 0 000000 0 0 0 000000 0 Reduktion av endotoxinberoende IL6-induktion i CD14+- monocyter I detta exempel beskrivs reduktion av endotoxin- 0 0 000000 0 beroende IL6-induktion i humanmonocyter genom användning av PS-PEG-Arga Princip Som respons på LPS startar monocyter att transkri- bera och uttrycka IL6. Graderna av uppreglerad IL6 kan mätas redan efter 4 h med hjälp av en intracellulär flö- descytometrianalys (FACS).

Material Mononukleära humanceller från helblod används.

PS-PEG-Arga används för avlägsnande av endotoxin, och PS-PEG-NH-Ac är inkluderat som en kontroll. Lipopoly- sackarid (E. coli-stammen 055:B5 från Biowittaker Co.) används för stimulering av MNC in vitro. FACS-analys ut- förs genom användning av en FACSCAN Calibur (Beckton Dickinson®).

Förfarande Helblod med 10 eller med och utan typ PS-PEG-NH-Ac. Cellerna fixeras i PermFix (Beckton Dickinson®), och en dubbelfärgning utförs med anti-CDl4- FITC och anti-IL6-PE. 20 000 celler räknas per cellprov för FACS-analys. Monocyter definierade som CDl4+-celler utgör vanligtvis ca 5% av totala cellpopulationen.

Analys inkuberas vid 37°C (5% C02) under 30 minuter 30 IU/ml LPS. Prover inkuberas parallellt PS-PEG-Arga-pärlor, liksom kontrollpärlor av Monocyter definieras som CDl4*-celler i cellsuspen- sionen. Intracellulär IL6 (icIL6) kalibreras mot en inre standard och kvantifieras i CDl4*-cellpopulationen genom användning av FACS-analys efter inkubation med 10 eller 30 IU/ml LPS under 30 minuter. Beräkningar utförs genom användning av CellQuest Software Package (Beckton Dickinson®>. 2003-ll-06 15:35 V:ïSAMBPO LUNDIA ÅB\GAMBEO LUNDIA AßïPATENTLNoFamilyäSERSÜ124G8\20l2468 ApplicatiorlteztTolnstructor CH 2003-1 l 1-U; 1 -díïC 0000 0 0 0 0 0000 10 15 20 25 30 35 Resultat Genom användning av FACS-data och beräkningar er- hållna därav, ger analys av en fackman inom området av CDl4*-monocytpopulationen värdena som visas i fig 6. I figuren visas 70% reduktion av endotoxinhalterna vid an- vändning av PS-PEG-Arga-pärlor jämfört med kontrollpär- lorna (PS-PEG-NH-Ac) och prover utan några pärlor inklu- derade. De intracellulära halterna av IL6 visas i histo- gram. Pâ högra sidan visas en minskning av IL6-halterna efter inkubation med PS-PEG-Arga-pärlor. De nedre raderna till vänster visar frånvaron av intracellulär IL6 i färska celler.

Diskussion Vid detta försök visas en snabb och fullständig in- hibering av LPS-stimulering i en human CDl4+-monocytpopu- lation, uppmätt med hjälp av inhibering av den LPS-be- roende IL6-uppregleringen i monocyter.

Exempel 6 Räknat antal celler efter helblodsperfusion I detta exempel beskrivs, utan begränsning av upp- finningen, permeabiliseringen av blodkroppar efter per- fusion genom polymeraffinitetsmatrisen på pärlor.

Princip Blodrening kräver inte någon skada eller aktivering av celler. Mekanisk skada, särskilt av erytrocyter, kan leda till hemolys och efterföljande livshotande komplika- tioner. En hydrogelliknande polymermatris enligt uppfin- ningen kan överraskande nog perfunderas med hela blod- kroppar.

Material En starkt svällningsbar polymermatris, dvs PS-PEG-Arga-pärlor, används. Kolonnerna, med en inner- diameter av 20 mm, fylls med 1 g av matrisen, som absor- berar 4-5 ml vatten, och sköljs därefter i förväg med fysiologisk saltlösning före användning. Kolonnerna an- vänds därefter för perfusion av helblod.

LÉÜí33~ll~lÜ6 15:35 'LFIVÉšMBRO LUNDIA ÄEÅGAMBRO LUIJDIÅ f«.1'â\.E'ATEN'I'\__N0Faznil3fäSEWGILMGSXZQIZG68 ApplicationtextTolnstructtor CH 2003-11-03 Lai-oc como o 0 I I 0000 nunobv 0 0 onoøuo 10 15 20 25 30 35 41 Förfarande Färskt helblod med citrat och LPS (30 IU/ml) perfun- deras genom kolonner under användning av steril utrust- ning i ett laminärt flöde. LPS-bemängt helblod perfunde- ras vid ett flöde av 5 ml/min vid 37°C. Blodprover tas ut före och efter perfusion och analyseras. Cellerna som analyseras är röda blodkroppar (RBC), hematokrit (HTC) och fritt hemoglobin, vita blodkroppar (WBC), blodplättar och trombocyter (TRC).

Antalet celler räknas före och efter kolonnperfusion med hjälp av en Coulter Counter® (Becton Dickinson).

Mängden fritt hemoglobin mäts som total hemoglobin- halt efter en fullständig lysis av erytrocyter, följt av en fotometrisk kvantifiering vid 405 nm. Integriteten för erytrocyter efter helblodsperfusion visas genom mätningar av fritt hemoglobin i plasma med hjälp av en fotometrisk kvantifiering vid 405 nm.

Resultat och diskussion Cellantalet och HCT mäts, och resultaten visas i fig 7A (trombocyter), 7B (HCT), 7C (RBC) och 7D (WBC). Dess- utom påträffades inte någon ökning av mängden fritt hemo- globin, dvs ingen hemolys inducerades (data ej visade).

Data från detta försök visar att efter den initiala över- gående retentionstiden på grund av en initial utspäd- ningseffekt, stabiliseras Cellantalet till prekolonn- värden. Värdena visar en permeabilisering av matrismate- rialet av ca 100%, eftersom prekolonncellantalet är samma som postkolonncellantalet. Dessutom upprätthålls cellerna intakta, vilket uppmätts med hjälp av en räkning av an- talet viabla celler och lysis av röda blodkroppar.

Exempel 7 ' Biokompatibilitetsegenskaper I detta exempel beskrivs delar av biokompatibilitets- profilen hos PS-PEG-Arga-matrisen.

Princip Biokompatibilitet eller icke-biokompatibilitet mäts här som komplementaktivering, elastasfrisättning och IÜGS-Ill-Ûš 15:35 \«":\Gš.š\ïBRO LUNDIA .ÄPHGAMBRO LUIíF-IA AEEE*ATENTX__bJcfiFamily\SEKÉO124GSXZOIM-šß ApplicatiorltextToïzistructcr CH 2663-11-03 l.c|oc 10 15 20 25 30 35 Iff U2~» Yü¶3í:É"? 4 4 åzï kå J¿v J :"wm::u:°::°:==== I I O O IO OI ll! IDO IOI OO 0 Û 42 trombogenicitet med hjälp av trombin-antitrombin III- komplexbildning.

Material Liksom i exempel 6 används cellulosamaterial som referens.

Förfarande Elastas mäts i plasma från helblodsperfusion genom användning av en specifik enzymbunden immunsorbentanalys (ELIsA,- Diagnostic Product 090.).

Komplementaktivering mäts genom kvantifiering av ter- minalt komplementkomplex (TCC-protein), uppmätt enligt (Kidney Int. 37:696-706).

TAT, graden av trombogenicitet, mäts enligt Deppisch et al (Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3:17-23, 1994).

Resultat I fig 8 visas bildning av TCC med tiden. Referens- pärlor, dvs PS-PEG-NH-Ac (TG-bas eller -ref-material) uppvisar en 4- till S-faldig ökning av TCC-bildning.

Deppisch et al Efter en initial ökning under 10-15 minuter för PS-PEG- Arga, stabiliseras TCC-bildningen vid preperfusions- nivåerna.

I fig 9 är halten av elastas uppmätt med tiden. Hal- terna förändras inte jämfört med prekolonnvärdena. Mät- ningar under 35 minuter visas. För referensmaterialet ökar elastashalterna 8- till 9-faldigt under 35 minuter.

I fig 10 visas bildningen av TAT. Ingen ökning av TAT-bildning detekteras.

Diskussion Biokompatibilitetsegenskaper är viktiga vid behand- ling av blod ex vivo och in vivo, t ex dialys. Den be- skrivna matrisen visar inte någon aktivering av komple- mentsystemet, ingen aktivering av koagulationssystemet och ingen elastasfrisättning jämfört med det inkluderade referensmaterialet, dvs har en hög biokompatibilitet.

Tillsammans med den höga perfusionsförmågan för helblod, såsom visas i exempel 6, visar detta att polymeraffini- tetsmatrisen enligt uppfinningen är i hög grad lämplig 2993-11-36 15:35- VÜGÅaMBRO LUNDIA .ÄIMGAI-ZERO LUIšDIA AIIÅFATEIJIWJisF-azrrily\SE'x20124ë8\2Ol2458 Applica.tiontextToïxistructor CH 2063-11-93 Ldoc 10 15 20 25 30 L? Bl 43 för extrakorporeal behandling av blod, inkluderande hel- blod.

Exempel 8 Ytterligare endotoxinadsorptionsförsök Endotoxinadsorptionsförsök har utförts i syfte att visa betydelsen av upptäckt av ett specifikt geometriskt definierat arrangemang av funktionella grupper (dvs argi- ninrester), som bygger upp en ligand för endotoxinbind- ning. Det visar sig att endotoxinbindningen inte endast beror på mängden arginin (dvs de positiva laddningarna), utan att det definierade geometriska arrangemanget är viktigare.

Förfarande Humanserum (som en representant av humankroppsväts- kor, såsom blod, plasma etc) försågs med definierade mängder av endotoxin (dvs 3 IU/ml och 10 EU/ml) och in- kuberades med 40 mg PS-PEG-pärlor innehållande antingen Arga-arrangemanget eller Arg4-arrangemanget som ligand. De två typerna av pärl-/ligandarrangemang innehåller olika mängder av arginin, varvid Arg4 innehåller 0,72 mmol/g och Arga innehåller 1,89 mmol/g. Den högre argininhalten för Arga-pärlor är en följd av den ytterligare förgre- ningen orsakad av lysinförgreningarna. Efter inkubation under 30 minuter mättes koncentrationen av fritt (dvs ej bundet till ytan av matrisen) endotoxin (med hjälp av LAL-testet) i supernatantserat.

Analys Tabell 2 Resultat av inkubationsförsök med humanserum Endotoxinbemängt serum 0 3 10 EU/ml före inkubation serum efter inga pärlor 0 3 9,1 EU/ml inkubation PS-PEG-Arg4 0 1,5 5,5 EU/ml under 30 min PS-PEG-Arga 0 0,2 1,6 EU/ml ÉÛÜ3-ll-Ü6 15:35 V2\GAMBRO LUNDIA ABXGAMBRO LENDIÅ AEKPäTEHT\_NoFamily\SE\2012468\25l24¿8 ApplicationtextToInstructo: CE 2053-ll-Û3 l.á0c 10 15 20 25 30 35 44 Dessa värden analyserades genom användning av Langmuir-metoden, som beskriver ligand-receptorinter- aktioner och jämvikter på fasta ytor (t ex proteinadsorp- tion). (Ref: JD Andrade: Principles of protein adsorp- tion. i: JD Andrade (utg.) Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, volym 2, Protein Adsorp- tion, Plenum Press New York 1985, sid 1-80). Denna analys sker genom plottning av mängden toxin (dvs endotoxin) som bundits till ligandmatrisen (beräknat med utgångspunkt från skillnaden mellan tillförd mängd och kvarvarande mängd i supernatanten efter inkubation) dividerat med totalantalet närvarande ligander på matrisen i förhål- lande till jämviktskoncentrationen för toxinet (dvs endo- toxinkoncentrationen efter inkubation) i supernatanten.

Dessa plottar anpassas därefter till det matematiska uttrycket för Langmuir-isotermen, som ger affinitets- eller associationskonstanterna för de olika matrisbundna liganderna gentemot toxinet. I fig 12A och l2B visas exempel på Langmuir-metoden.

Två typer av Langmuir-plottar utfördes, vilka skil- jer sig med avseende pà sättet på vilket totalantalet av närvarande ligander på matrisen definieras: (1) Neglegering av de olika argininhalterna på pär- lorna, dvs genom att helt enkelt betrakta massan av pär- lorna uttryckta i gram som ett mått på totalantalet li- gander (fig 12A), varvid detta tillvägagångssätt är be- rättigat, eftersom den praktiska tillämpningen av ligand- polymermatrisen, t ex i en adrorptionsanordning som skall perfunderas med en human kroppsvätska, såsom blod eller plasma, i en extrakorporeal krets, är till en viss om- fattning begränsad av totalmassan eller volymen av pärlor som måste fyllas i anordningen i syfte att ge en terapeu- tiskt effektiv reduktion av koncentrationen av toxin hos patienten. Begränsningen är t ex relaterad till tryckfall över anordningen, icke-specifika effekter på blodkompo- nenter (proteiner och celler) eller till och med förva- ringsutrymme för anordningen. ÉÛÜ3-1l~Ü6 15:35 U2\GÅHBRO LÜNDIÄ ÄEÄGÄMBEG LUNDIÄ AEAPATENT\__NsFam1l.yäSERSL?134ßzhïülbš-šê App-licatioriteztïsl:istructor iZi-i 2003-11-03 Maia-z; I I OOOI nuucøo 0 0 000000 10 15 20 25 45 (2) Beaktande av de olika argininhalterna på pär- lorna, dvs genom att betrakta massan av pärlor uttryckt i gram dividerat med argininbelastningen uttryckt i mmol/gram som ett mått på totalantalet ligander (fig l2B), varvid detta tillvägagångssätt är berättigat, eftersom argininhalten är en huvudsaklig kostnadsfaktor vid framställning av ligand-polymermatrisen, varvid re- sultatet beskriver effektiviteten för liganderna ur eko- nomisk synpunkt.

Jämviktsparametrarna för de olika Langmuir-plottarna visas i tabell 3.

Table 3: Jämviktsparametrar erhållna fràn de anpassade kurvorna PS-PEG- PS-PEG- enhet Arga Arg4 analys affinitetskonstant 1,81 0,15 ml/EU 1 mättnads- 253,9 200,7 EU/g koncentration analys affinitetskonstant 1,81 0,15 ml/EU 2 mättnads- 479,9 168,6 EU/mmol koncentration Resultat och diskussion Affinitetskonstanten beskriver och karakteriserar hur starkt en viss ligand har förmåga att binda ett toxin, oberoende av mängden närvarande ligand. Över- raskande nog var affinitetskonstanten för Arga-liganden mer än 10-faldigt högre (dvs med en faktor av 12,3) än affinitetskonstanten för Arg4-liganden.

Mättnadskoncentrationen beskriver den maximala mängden toxin som kan bindas av respektive ligandmatris, under antagandet att obegränsade mängder av toxiner är tillgängliga. Överraskande nog var mättnadskoncentratio- nen för Arga-ligandmatrisen mer än 2-faldigt högre (dvs med en faktor av 2,8) än mättnadskoncentrationen för Arg4-ligandmatrisen. Eftersom mättnadskoncentrationen QOÜS-ll-üê 15:35 XYÅGAMBRIJ LUFIDIA APAGPJIiEsI-ÅO L-'JIJDIA AEXFIaTEšJT\_PloEaznily'\SE\2012468\20l2468 ApplicationtextToInstrucztor CH 2003-11-03 Lcifr-c 10 15 20 25 30 46 enligt Langmuir-adsorptionsmodellen helt och hållet är oberoende av affinitetskonstanten, kan detta tolkas på så sätt att det specifika geometriska arrangemanget för Arga-liganden påverkar ligandmatrisens tillgänglighet för toxinerna, t ex genom att påverka morfologin (t ex kris- talliknande kontra flytande) för PEG-delen av ligand- matrisen.

Följande exempel visar betydelsen och relevansen av den förbättrade affiniteten för Arg8-ligandmatrisendo- toxinet med avseende på mängden matris som är nödvändig för uppnående av en terapeutiskt relevant reduktion av toxinkoncentrationen.

Endotoxinkoncentrationer i omrâdet 0,l till 1 EU/ml påträffas hos sepsispatienter (t ex Nakamura et al, Renal Failure 2000; 22:225-234). Under antagandet av en plasma- koncentration av 0,3 EU/ml vid starten av behandlingen, en plasmakoncentration av 0,03 EU/ml efter behandling och en plasmavolym av 4000 ml, innebär detta att 1080 EU endotoxin har bundits till ligandmatrisen under behand- lingen. Mängden matris som är nödvändig för att binda denna mängd av endotoxin kan beräknas med utgångspunkt fràn Langmuir-uttrycket genom användning av affinitets- konstanterna och mättnadskoncentrationerna för respektive ligander. Koncentrationen vid slutet av behandlingen är därefter jämviktskoncentrationen. Genom användning av jämviktsdata från tabell 3 visar denna beräkning att för Arga-ligandmatrisen är endast 83 g nödvändigt, medan för Arg4-ligandmatrisen är 1201 g nödvändigt för uppnàende av det terapeutiska målet. Eftersom båda ligandmatriserna har en liknande densitet (massa per volym) innebär detta att volymen och storleken av en adsorptionsanordning är mycket mindre för Arga-liganden, vilket underlättar per- fusion av plasma eller blod.

LÉÛfBS-ll-íßš 15:35 VPVSIaMBIíÛ Lïlï-IDIA ABVf-.AMšRO LUNDIÄ APAPFJPEIJTXjlclïarnily/XSE'v201.34E8\_20124á8 AppliciaticritextTcïnstraxctor CH 2003-11-03 iii-fc

Claims (30)

10 15 20 25 30 35 47 PATENTKRAV

1. Polymeraffinitetsmatris för bindning av ett eller flera ämnen i en vätska för avlägsnande av ämnet eller ämnena fràn vätskan och/eller reduktion av mängden eller koncentrationen därav i vätskan i syfte att förebygga, eliminera eller reducera oönskad aktivering av komponen- ter eller processer i vätskan, varvid matrisen inbegriper en fast bärare, minst en spacermolekyl bunden till den fasta bäraren och, kopplad till varje spacermolekyl, en ligand med en definierad tredimensionell struk- tur, som är komplementär vad beträffar laddning och/eller hydrofobicitet/hydrofilicitet med den tredimensionella strukturen för ett bindningsmotiv hos ämnet eller ämnena, varvid liganden är en grenad polymer inkluderande minst en oligomer med följande struktur: Aag Aßgl Y' I där Arg (arginin) är en bindningsenhet och Y är minst en trifunktionell förgreningsmolekyl som innehåller funk- tionella grupper som är valda fràn den grupp som består av amino, hydroxi, aldehyd, isocyanat, isotiocyanatj tiol, maleimido, epoxi, karboxi och derivat därav, eller kombinationer därav.

2. Polymeraffinitetsmatris enligt kravet 1, varvid Y är en trifunktionell förgreningsmolekyl som innehåller funktionella grupper som är valda från den grupp som be- står av amino, karboxi och derivat därav, eller kombina- tioner därav. 3 C i) Ii -~ l l G 7 l ä; : V: *Jåk-UVEBRU LUIJD ÅA ;~°1B\_<3;~*.I~1Bï2f7) LUNDIEY: RB 'i Pš-.TEE-'rï 1" 't mbïoïfanxil '~_:\. \_ 2 (11 2 -í 5 2 t: l 2 -à (4 S iappl icat iznlt; om; To I :ist 1; uc-t 42-1; Cí-í 2 ff ü 114 'i l - (f 3- 1 _ rio-L; nnon n n n n. g . ' .I I: II nn n n nu n :u "- . n . . 2 . å 2 2 2 ' ä n o n n o o s g g g . , . I n o n nn nn nno nnn nnn nn n n Lr-x [\._. c» c: t c- 48

3. Polymeraffinitetsmatris enligt kravet 1 eller 2, varvid Y är en aminosyra, företrädesvis Lys (lysin) med trifunktionell förgrenande förmåga.

4. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- 5 gående kraven, varvid liganden är en polymer inkluderande minst en peptid med följande struktur: Aug Aug i \ / 10 i Lys

5. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid liganden är en polymer inkluderande minst en peptid med följande struktur: 15 Aug Aug Ang Aug Lys\\\\ /// Lys 20 Lys I

6. Polymeraffinitetsmatris enligt nàgot av de före- gående kraven, varvid liganden inkluderar minst en peptid med följande struktur: 25 Arg ' Arg Arg Arg Arg\ /Arg Afg\ /Afß Lys Lys Lys \ / Lys Lys LyS A *--\\\\\\\ IQYS I SÛÜS ll 07 11:39 V:ÉGÄMBRÛ LUNDÃA ÄB\GàMBRO LUNDIÄ iïalšï Pifaïíïi-I i* ____ÅI-š<'JIi'an1ilj; SE 2 ü 12-: 6 S 2 0 I. 2 4 6 S Appliea t: ífsxlf; ext; folzlst lust: m; CH 2 0 f: ll fi 3 l . dec 10 15 20 25 _30 35

7. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid liganden har följande struktur: Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg \ / \ / \ / \ / i Lys låm LYS LYS \ / Lys ï Lys

8. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid spacermolekylen är väsentligen hydrofob eller hydrofil och har funktionen av en förank- rande del för liganden.

9. Polymeraffinitetsmatris enligt kravet 8, varvid spacermolekylen är vald från den grupp som består av poly- eller oligoetenglykoler med formeln H-(OCH2CH2)@-OH, varvid n representerar 2-250, eller polyvinylalkoholer, polyvinylaminer, polyglycidoler, polyeteniminer, poly- propenoxider eller derivat därav. _

10. Polymeraffinitetsmatris enligt kravet 9, varvid spacermolekylen är en polyetenglykol (PEG) i en linjär och/eller grenad konfiguration och har en genomsnittlig molekylvikt av 400-10 000 Daltons, eller derivat därav.

11. ll. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid den fasta bäraren är tillverkad av ett material som är valt från den grupp som består av polystyren, polyvinylalkoholer, polyhydroxistyrener, polymerer framställda med utgångspunkt från klormetyle- rade polystyrener eller polyakrylater, polymetakrylater som är funktionaliserade med hydroxigrupper, hydroxi- alkylpolystyrener, hydroxiarylpolystyrener, hydroxialkyl- arylpolystyrener, polyhydroxilerade polystyrener, poly- ifi-:SE 'vïVÉF-'JJIBPIJ LUÉ-ÉDIA ÄBXGAMBY-ïåš Lilïlífïš ,- IMF..milgfxslfilflülflä(ëâkåêlïšd68 Zëpplicaticrgteztïwïnsi:ructol: -iïiš 2üšF;-~ll-í13 Lucic-c 10 15 20 25 30 35 L ß c c: o' c; 50 hydroxiarylerade polystyrener, isocyanatalkylpolystyre- ner, isocyanatarylpolystyrener, karboxialkylpolystyrener, karboxiarylpolystyrener, aminoalkylpolystyrener, amino- arylpolystyrener, polymetakrylater, tvärbundna polyeten- glykoler, cellulosa, kiseldioxid, kolhydrater, latex, cykloolefinsampolymerer, glas eller kombinationer därav, företrädesvis en tvärbunden polystyren.

12. Polymeraffinitetsmatris enligt kravet 11, varvid den fasta bäraren har formen av en pärla, en gel, ett membran, en partikel, ett nät, ett fibertyg eller en väv, en fibermatta, ett rör, en film, en folie eller kombina- tioner därav, eller tvärbundna interpenetrerande nätverk, företrädesvis en polystyren-PEG-pärla.

13. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid matrisen är biokompatibel och har en svällande förmåga som är tillräcklig för möjliggörande av perfusion av helblod.

14. Polymeraffinitetsmatris enligt kravet 13, varvid den svällande förmågan är ca 1,5- till 20-faldig, före- trädesvis 2- till 6-faldig, från ett torrt tillstånd till den hydratiserade formen.

15. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid matrisen tillhandahåller en tre- dimensionell komplementär struktur för bindning av minst ett ämne som är valt från den grupp som består av bakte- rier eller virushärledda beståndsdelar, endotoxiner, exo- toxiner, bakteriell DNA eller fragment därav, oligonuk- leotider; celler, särskilt endotelceller, stamceller och tumörceller; blodkroppar, särskilt lymfocyter, trombo- cyter, granulocyter, dendritceller och monocyter; prio- ner, parasiter, svampar, läkemedel efter överdosering, patogena livsmedelstillsatser, produkter från akuta eller kroniska metaboliska störningar härrörande från diabetes mellitus, leversjukdom, uremi, nfiursjukdomar eller -inflammation, heparin, bakterier och virus, patogen- bemängda blodkroppar, eller åtminstone delar eller ned- brytningsprodukter därav, DNA, fosfat, cytokiner, till- 53-11-06 15:35- WVSZXMBRO LUF-IDIA AÄNGAPÄBRO LUHDEA xë'~_-'“=.TEï~ïT\_äloFan-lilyXSEEG3.3468\20124¿8 ApplicationrextToInstructci> '/f“-=Jß“-'-7"---('?' ' .Aff-c 10 15 20 25 30 35 00" o 00 0 I o : o I o o 0 o 0 wo oo 000 000 o 000000 0 0 0 0 00 00 0.... 0000 o 0000 0 0000 0 0 o 0 0 0 0 C. C Uä C; 51 växtfaktorer, hormoner, kemokiner, uremiska toxiner, blodkoagulationsproteiner, prokoagulationsproteiner, in- flammatoriska eller proinflammatoriska proteiner, makro- fagmigrationsinhiberande faktor, lösliga eller cellyt- bundna proteiner, lösliga vidhäftningsmolekyler och glu- kos eller nedbrytningsprodukter därav, pyrogener, bakte- riella exotoxiner, produkter från grampositiva bakterier; företrädesvis lipoteikonsyra, särskilt bakteriella pyro- gener, företrädesvis endotoxiner, särskilt lipid A-kompo- nenten hos lipopolysackarider (LPS).

16. l6. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid matrisen har ett tröskelvärde av från ca lx1O2 till ca 1xl06 Daltons och binder hydrofoba och/eller hydrofila ämnen.

17. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid vätskan som ämnet eller ämnena skall avlägsnas från eller reduceras i är en vattenbase- rad eller organisk lösning, en kroppsvätska, företrädes- vis blod, terapeutiska vätskor, vätskor för "life * science"-tillämpningar, företrädesvis buffertlösningar, infusionsvätskor eller dialysvätskor vid biologiska, diagnostiska eller biotekniska tillämpningar, blodpro- dukter erhållna från friska donatorer, såsom plasma, blodplättskoncentrat, erytrocytkoncentrat som används för transfusioner, blodsubstitut, företrädesvis syrebärare, modifierade hemoglobinlösningar och artificiella hemo- globinlösningar; vätskor avsedda för näringstillförsel och vätskor för industriell användning.

18. Polymeraffinitetsmatris enligt något av de före- gående kraven, varvid den fasta bäraren är tvärbundet polystyren och spacermolekylen är en polyetenglykol.

19. Förfarande för avlägsnande av ett eller flera ämnen från en vätska och/eller reduktion av mängden eller koncentrationen därav i syfte att förebygga, eliminera eller reducera oönskad aktivering av komponenter eller processer i vätskan, vilket förfarande inbegriper kontakt mellan vätskan och polymeraffinitetsmatrisen såsom defi- LÉCC-S-lïrüê 15:35 VtMÉAMBRIJ LUNDIA AEÅGAMBRO LÜlíDIà A2'\_FATE2»*T\_ëlf:Family'äSE\3Ül2468\2í)l24¿8 App-licationtextïoïzistructcr CH 2003-11-03 L-JÉ-.nc 10 15 20 25 30 35 L... I\~ Cx C? LK. C- 52 nierats i något av kraven 1-18 under en tidsperiod som är tillräcklig för reduktion av mängden eller koncentratio- nen av och/eller avlägsnande av ämnet eller ämnena, före- trädesvis upp till 24 h.

20. Förfarande enligt kravet 19, varvid tidsperioden är från l s till 2 h.

21. Förfarande enligt något av kraven 19 och 20, varvid ämnet är ett endotoxin och vätskan är blod, varvid mängden eller koncentrationen av endotoxin efter att ha avlägsnats eller reducerats ligger under förmågan för aktivering av komponenter i blod eller förebygger aktive- ring av komponenter eller processer i blod.

22. Användning av polymeraffinitetsmatrisen såsom definierats i något av kraven 1-18 för avlägsnande av ett eller flera ämnen, företrädesvis endotoxiner, från en vätska, eller reduktion av mängden eller koncentrationen därav i vätskan, företrädesvis en kroppsvätska eller en terapeutisk vätska, helst blod eller serum.

23. Användning enligt kravet 22 för framställning av mindre aktiverat blod eller förebyggande av oönskad akti- vering av komponenter eller processer i blod.

24. Användning enligt kravet 22 som en del av ett extrakorporealt blodreningsförfarande eller som ett im- plantat i kroppen för kontakt med blod eller vilken kroppsvätska som helst, företrädesvis i det vaskulära i blodkärlen eller i bukhålan.

25. Användning enligt kravet 24 för framställning av mindre aktiverat blod eller förebyggande av oönskad akti- vering av komponenter eller processer i blod. systemet,

26. Kit för avlägsnande av ett eller flera ämnen från en vätska och/eller reduktion av mängden eller kon- centrationen därav i vätskan i syfte att förebygga, eli-H minera eller reducera oönskad aktivering av komponenter eller processer i vätskan, varvid denna kit inbegriper en polymeraffinitetsmatris såsom definierats i något av kra- ven l-18. 2Û03~1l-06 15:35 ¥2\GAMBRO LUNDIA ÄBXGAMBRÛ LUNDIA A2\PATEHT\“Nßïamily\SE\20l24E8\20l24á8 ApplicationtextToInstructor ?H 2093-ll-G3 1.doc 10 15 20 25 30 35 53

27. Kit enligt kravet 26, varvid den dessutom in- begriper provrör och en anordning för extra- och/eller intrakorporeal behandling av vätskan, företrädesvis blod eller serum.

28. Förfarande för framställning av en polymeraffi- nitetsmatris såsom definierats i något av kraven l-18, varvid det inbegriper stegen att a) binda spacermolekylen till den fasta bäraren för erhållande av ett första komplex, och b) till det första komplexet binda liganden innehål- lande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funk- tionell grupp, eller c) binda spacermolekylen till liganden innehållande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funktionell grupp för erhållande av ett andra komplex, och d) binda den fasta bäraren till det andra komplexet, eller e) binda spacermolekylen till den fasta bäraren för erhållande av ett första komplex, och f) utföra fast fas-syntes av liganden på den till den fasta bäraren bundna spacermolekylen, eller g) bygga upp eller syntetisera spacermolekylen med utgångspunkt från monomerer direkt på den fasta bäraren genom ympning, och h) till det första komplexet binda liganden innehål- lande nämnda minst en bindningsenhet med minst en funk- tionell grupp, eller i) bygga upp eller syntetisera spacermolekylen med utgångspunkt från monomerer direkt på den fasta bäraren genom ympning, och k) utföra fast fas-syntes av liganden på spacermole- kylen som bundits till den fasta bäraren, varvid information om den tredimensionella strukturen, närvaron av laddningar och hydrofoba/hydrofila regioner i 2033-li-06 lšzšš V:\GAMBRO LUNUIA ÅB\GAMBRO LUEDIÄ ÄB\E'ATEI~ITä__I~1oFamilyäSEäiü12% 68 \20l24 5-8 ApplicatiorltezfïTcïsxstrat-tor' CH 2GÜ3-ll-GS l.dGC 10 15 20 25 30 35 bindningsmotivet på ämnet eller ämnena som skall bindas .förvärvas med hjälp av röntgenkristallografi, protein- sekvensering, proteinmodellering eller hydrofobicitets- och hydrofilicitetsberäkningar, och bindningsenheten görs komplementär med ämnets eller ämnenas bindningsmotiv vad beträffar laddning och/eller hydrofilicitet/hydrofobici- tet. L

29. Förfarande enligt kravet 28, varvid det inbe- griper stegen av för a) och b) ovan: aktivering av den fasta bäraren, koppling av spacermolekylen till den fasta bäraren, syn- tes av liganden innehållande bindningsenheten och sätes- specifik koppling av liganden till spacermolekylen, eller för c) och d) ovan: syntes av liganden innehållande bindningsenheten, koppling av spacermolekylen till ligan- den, aktivering av den fasta bäraren och sätesspecifik koppling av spacer-ligandkomplexet till den aktiverade fasta bäraren, eller för e) och f) ovan: aktivering av den fasta bäraren, koppling av spacermolekylen till den aktiverade fasta bä- raren och fast fas-syntes av liganden på spacermolekylen som bundits till denna bärare.

30. Förfarande enligt kravet 29, varvid det inbe- griper stegen av för a) och b), aktivering av spacermolekylen, kopp- ling av den aktiverade spacermolekylen till den fasta bäraren och koppling av liganden till den aktiverade spacermolekylen, eller för c) och d), syntes av liganden, aktivering av spacermolekylen, sätesspecifik koppling av liganden till den aktiverade spacermolekylen och koppling av spacer- ligandkomplexet till den fasta bäraren, eller för e) och f), aktivering av spacermolekylen, kopp- ling av den aktiverade spacermolekylen till den fasta bäraren och fast syntes av liganden på spacermolekylen som bundits till den fasta bäraren. IÜÜB-ll-fiê *,=':\*-_GI1.Mí-'%E'I.O LUï-'EDIA .ÄIHGAMBI-ïá) Lülšïuïä AEKIATERÉW. NoFarrdl3=\S;E'\20l¿I4iš8*20124m8 Applicati-r-.uteztToïnstructoz PH 2903-11-03 lxicc