PL205685B1

PL205685B1 - Sposób in vitro usuwania lub wyodrębniania plazminogenu lub plazminy w obecności fibrynogenu, stałe podłoże powinowactwa do oczyszczania mieszaniny zawierającej fibrynogen i plazminę i/lub plazminogen oraz krioprecypitat

Info

Publication number: PL205685B1
Application number: PL365808A
Authority: PL
Inventors: Israel Nur; Liliana Bar; Malkit Azachi
Original assignee: Omrix Biopharm Sa
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2010-05-31
Also published as: KR100871454B1; HU228899B1; DE60215338D1; US8563288B2; CA2447789C; US20090176293A1; RU2008130356A; KR20040011503A; US20030124703A1; HUP0600110A2; SK14202003A3; US20070092959A1; US20040197891A1; IL158754A; EP1390485A1; ZA200309030B; IL158754A0; CZ20033097A3; CA2447789A1; JP4385097B2

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro usuwania lub wyodrębniania plazminogenu lub plazminy w obecności fibrynogenu, z mieszaniny zawierającej plazminogen lub plazminę, stałe podłoże powinowactwa do oczyszczania mieszaniny zawierającej fibrynogen i plazminę i/lub plazminogen z plazminy i/lub plazminogen oraz krioprecypitat z osocza ludzkiego, otrzymany sposobem według wynalazku. Mieszaniny otrzymane sposobem według wynalazku mogą być stosowane do podawania dożylnego i miejscowego, na przykład w postaci plastra o spowolnionym uwalnianiu, do leczenia ran. Mieszanina może być podawana zarówno osobno, jako pojedynczy składnik aktywny lub w połączeniu z innymi ś rodkami farmaceutycznymi lub lekami. Usunię cie plazminogenu prowadzi do zachowania integralności i funkcji mieszaniny według wynalazku przez dłuższy czas.

Plazminogen lub jego aktywna cząsteczka plazmina (poniżej określany jako plazmin(ogen)), bardzo często zanieczyszcza roztwory białkowe, zwłaszcza te ekstrahowane z płynów lub organów zwierzęcych. Obecność w roztworze białkowym plazmin(ogenu) stanowi pod wieloma względami zagrożenie dla akceptacji tego roztworu jako stabilnego produktu farmaceutycznego. Znana jest bowiem proteolityczna aktywność plazmin(ogenu) względem różnych białek i peptydów mających wiązania arginylowe i lizylowe (Weinstein M. J., Doolittle RF. Differential specificities of the thrombin, plasmin and trypsin with regard to synthetic and natural substrates and inhibitors RF. Biochim Biophys Acta. 1972 258: 577-90 i Ling CM, Summaria L, Robbins KC. Mechanism of formation of bovine plasminogen activator from human plasmin. J Biol chem. 1965,240: 4212-B) i zasadowych aminokwasów, jego aktywność stymulująca różne tkanki, zwłaszcza tkance nerwowej w obwodowym układzie nerwowym i jego rola w wią zaniu (Chen ZL, Strickland S Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmincatalyzed degradation of liminin. Cell. 1997,91: 917-25), a także prawdopodobnie przenoszeniu prionów we krwi ssaków Fischer (MB, Roeckl C, Parizek P, Schwarz HP. Aguzzi A Binding of disease associated prion protein to plasmin(ogen). Nature. 2000. 408: 479-83).

Znanych jest kilka chromatograficznych sposobów oczyszczania roztworów białek z plazmin(ogenu), prowadzących do usuwania plazmin(ogenu) z roztworu białek.

Sposoby te są zasadniczo oparte na dwóch założeniach. Pierwsza grupa sposobów obejmuje kilka kolejnych etapach oczyszczania, które wykorzystują różnice w rozpuszczalności, różne punkty izoelektryczne, lub rozdział cząsteczek w zależności od ich wielkości Alkjaerisig N. (The purification and properties of human plasmin(ogen). Biochem. J. 1963, 93: 171-182). Ponieważ głównym celem w tych sposobach było oczyszczenie plazmin(ogenu), sposoby te całkowicie niszczyły składowe białka pozostałego roztworu. Druga grupa sposobów jest oparta na jednoetapowym oczyszczaniu metodą powinowactwa. Oczyszczanie takie jest oparte na wiązaniu plazmin(ogenu) z różnymi syntetycznymi ligandami ω-amino karboksylowego kwasu, tak aby mogły one wiązać się do miejsc wiążących lizyny w ciężkim łańcuchu plazmin(ogenu). Miejsca te, składające się z 5 potrójnych pętli utworzonych przez mostki disiarczkowe o wewnętrznej homologii sekwencji znanej jako kringle plazmin(ogenu), zlokalizowane na NH2 ciężkiego łańcucha plazmin(ogenu) i z dala od miejsca katalitycznego zlokalizowanego na lekkim łańcuchu COOH, wiążą fibryn(ogen). Inna możliwość zastosowania chromatografii powinowactwa polega na związaniu plazmin(ogenu) poprzez miejsce katalityczne, prawdopodobnie wiążące mniej specyficznie, gdyż może wiązać się z wieloma białkami takimi proteazy seryny, mające podobne lub niższe powinowactwo z peptydowymi wiązaniami arginylowymi i lizylowymi, i zasadowymi aminokwasami. Podsumowując, można stwierdzić ogólnie że, chromatografia powinowactwa plazmin(ogenu) jest przeprowadzana danym ligandem, który chemicznie i jonowo przypomina kwas ω-amino-karboksylowy lub substrat miejsca katalitycznego plazminy. Ligand jest związany z żywicą poprzez odpowiednią część odległościową lub linker. Jednakże odpowiednie podłoże w chromatografii powinowactwa stosowane w celu usunięcia plazmin(ogenu) jest inne niż najlepsze dostępne podłoże wykorzystywane do oczyszczania plazmin(ogenu). Odpowiednie żywice powinny zawierać ligand, który wiąże plazmin(ogen) z wysokim powinowactwem i ma bardzo niskie powinowactwo z innymi białkami takimi jak inne proteazy serynowe, a zwłaszcza bardzo niskie powinowactwo wiązania z fibrinogenem, który jest głównym białkiem we frakcji osocza Cohna I lub w krioprecypitacie. Ważne jest również, aby usuwanie plazmin(ogenu) z wykorzystaniem danej chromatografii powinowactwa mogło być przeprowadzane w szerokim zakresie buforów i nie było ograniczone do wąskiej grupy buforów, które mogą niekorzystnie wpływać na stabilność i integralność białka w roztworze, co stanowi główny problem tego sposobu.

PL 205 685 B1

Antyfibrynolityczna skuteczność (zdolność do hamowania wiązania plazmin(ogenu) z fibrynogen z wysokim powinowactwem) kwasami ω-amino-karboksylowymi zależy od obecności wolnej grupy aminowej i grupy karboksylowej, a także od odległości pomiędzy grupą COOH a atomami węgla z którymi grupa NH₂ jest połączona (Markwardt 1978) tak jak w kwasie ε-amino kapronowym (EACA) i p-amino benzamidynowym (PAMBA). Porównanie między antyfibrynolitycznymi aktywnościami EACA i PAMBA wykazało, że ten ostatni jest około trzy razy bardziej aktywny. Shimura i wsp. (1984) zaprojektowali żywicę, w której p-amino benzamidyna była związana z mikrocząsteczkami hydrofilowego winylowego polimeru poprzez część odległościową (linker). Stosując tę żywicę, Shimura i wsp. mogli oddzielić plazminę i plazmin(ogen) poprzez wysokowydajną chromatografię powinowactwa. Fakt, że plazmin(ogen) nie mógł być wymywany samym kwasem 6-aminoheksanowym i że 3 M mocznik musiał być wprowadzony do buforu do wymywania wskazał na dwumiejscowe oddziaływanie plazminy z tym unieruchomionym ligandem to jest, lizynowymi miejscami wiązania w ciężkim łańcuchu i miejsce katalityczne w lekkim łańcuchu. To może wyjaśniać odkrycie innych badaczy, że p-amino benzamidyna usuwa również pewne inne białka.

Inna żywica, lizynowa-żywica jest wytwarzana i stosowana do oczyszczania przez powinowactwo plazmin(ogenu). Jednakże, antyfibrynolityczna skuteczność lizyny jest bardzo niska a zatem, również jej powinowactwo wiązania. Wiąże się ona również z innymi białkami i jej specyficzność jest zależna od buforu.

Moroz LA. Gilmore NJ Fibrinolysis in normal plasma and blood: evidence for significant mechanisms independent of the plazminogen-plazmin system, Blood, 1976,48,531-45, ujawnił wytwarzanie osocza pozbawionego plazmin(ogenu) poprzez chromatografię powinowactwa. W oparciu o zastosowane sposoby autorzy przedstawiają obserwacje wskazujące, że procesy, które przeważają w wytwarzaniu fibrynolitycznego enzymu plazminy odgrywa przynajmniej mniejszą rolę w spontanicznym lub podstawnej fibrynolitycznej aktywności mierzalnej w normalnym ludzkim osoczu. Kwas traneksamowy stosowano razem z innymi inhibitorami proteaz jako inhibitory plazminy do pomiaru fibrynolitycznej aktywności. Do wytwarzania osocza pozbawionego plazmin(ogenu) zastosowano sposób według Deutsch i Meltz, Science 170; 1095-1096,1997.

Iwamoto w Thrombos. Diathes. Heamorrh. (Stuttg.), 1975,33,573 ujawnia specyficzne wiązanie kwasu traneksamowego z plazminą. Pomimo, że kwas traneksamowy zidentyfikowano jako o dużej mocy ligand plazminy, wskazano, że antyfibrynolityczne działanie kwasu traneksamowego jest wynikiem nie tylko wiązania się z plazmin(ogenem), lecz również podwyższenie kooperacji naturalnych antyplazmin. Dlatego można stwierdzić, że wiązanie kwasu traneksamowego ze stałym podłożem usunie nie tylko plazmin(ogen) z osocza lecz również naturalne antyplazminy. Można również sugerować, że kwasy traneksamowe mogą powodować tworzenie agregatów (konglomeratów) z inhibitorami plazminy. Takie rozumienie jest oparte na rozbieżności, która może być stwierdzona gdy porównuje się anty-fibrynolityczną aktywność kwasu ε-amino-kapronowego i kwasu traneksamowego prowadzące do 98 i 91% hamowania w stymulowaniu urokinazą osoczu względem osocza, które było heparynizowaną krwią ustną (odpowiednio 65 i 39% w przypadku kwasu ε-amino-kapronowego i kwasu traneksamowego porównaj tabele 2 i 7 w pracy Moroza i wsp.). Można się spodziewać, że ze względu na fakt, że ich wysoki stosunek wiązania z kwasem traneksamowym i ε-amino-kapronowym są one dobrymi kandydatami na ligandy o wysokim powinowactwie. Jednakże, można również spodziewać się, że te ligandy mogłyby blokować kolumnę powinowactwa w wyniku wiązania plazminy z kompleksami inhibitorów plazminy.

Przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro usuwania lub wyodrębniania plazminogenu lub plazminy, w obecności fibrynogenu, z mieszaniny zawierającej te substancje, zawierający etapy w których kontaktuje się mieszaninę zawierającą plazminogen lub plazminę z aminokwasem o sztywnej strukturze, przy czym odległość między grupą aminową tego aminokwasu a jego grupą karboksylową wynosi 6 do 8 x10^-10, korzystnie 7 x10^-10 m i faminokwas ten jest kowalencyjnie związany z podłożem poprzez swoją grupę aminową.

Korzystnie stosuję się mieszaninę wybraną z grupy obejmującej płyny ustrojowe takie jak krew; frakcje krwi, krioprecypitat, hodowle komórkowe, ekstrakty z tkanek zwierzęcych, takich jak płuca bydlęce, jelita bydlęce lub ekstrakty żelatynowe z kości zwierząt, albuminę z surowicy bydlęcej jak również zwierzęce, nie mieszające się z wodą tłuszcze, takie jak lanolina, PC - fosfatydylocholina.

Jako korzystne podłoże, stosuje się które jest podłożem chromatograficznym.

Korzystniej stosuje się podłoże chromatograficzne, które jest materiałem hydrofilowym takim jak agaroza, celuloza, szkło o kontrolowanych porach, żele krzemionkowe, dekstrany lub organiczny

PL 205 685 B1 sztuczny polimer taki jak oparty na poliakryloamidowych polistyrenach. W korzystnym rozwiązaniu jako materiał chromatograficzny stosuje się agarozę lub sefarozę. W innym korzystnym rozwiązaniu jako materiał chromatograficzny stosuje się materiał rozdrobniony lub lity-blokowy.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się aminokwas o sztywnej strukturze związany z podłożem za pośrednictwem linkera. Korzystniej stosuje się linker dwufunkcyjny, korzystnie wybrany z grupy obejmującej N-hydroksy sukcynoimid, DAPA, CNBr, epoksy, diaminodipropyloaminę (DADPA), 1,6 diaminoheksan, kwas bursztynowy, 1,3 diamino-2-propanol, etylenodiaminę (EDA), TNB, pirydylodisiarczek jodoacetamidu, podłoże aktywowane maleimidem lub kombinacje tych substancji.

W korzystnym sposobie stosuje się podłoże modyfikowane częścią cząsteczki, która oddziałuje z pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi grupami aminowymi.

Korzystnie stosuje się aminokwas o sztywnej strukturze będący kwasem traneksamowym. Korzystniej po etapie kontaktowania mieszaniny z podłożem ze związanym kwasem traneksamowym mieszaninę tę inkubuje się z podłożem przez dostatecznie długi czas aby związać plazminogen lub plazminę, po czym plazminogen lub plazminę wymywa się obojętnym roztworem wodnym zawierającym sole sodu, sole wapnia, sole buforujące.

W korzystnym rozwiązaniu, następnie po skontaktowaniu mieszaniny, plazminę lub plazminogen wymywa się roztworem wodnym zawierającym dostateczną ilość ligandu kompetycyjnego względem miejsc wiązania plazminogenu aminokwasu mającego sztywną strukturę związanego z podłożem. Korzystniej ligandem jest lizyna.

Korzystnie stosuje się mieszaninę stanowiącą pochodną krwi, krew, frakcję krwi lub krioprecypitat. Korzystniej pochodna krwi jest czynnikiem krzepliwości krwi z osocza lub mieszaniną czynników krzepliwości krwi, albuminy, immunoglobuliny, fibrynogenu, fibronektyny, a₁-antytrypsyny, anty-trombiny III, czynnika von Willebranda.

Innym przedmiotem wynalazku jest stałe podłoże powinowactwa do oczyszczania mieszaniny zawierającej fibrynogen i plazminę i/lub plazminogen z plazminy i/lub plazminogenu, znamienne tym, że zawiera kowalencyjnie związany aminokwas o sztywnej strukturze, w którym grupy aminowa i grupa karboksylowa aminokwasu są oddalone od siebie o 6 do 8 x10^-10, korzystnie 7 x10^-10 m. Korzystnie aminokwas wybrano z grupy obejmującej kwas traneksamowy i kwas 4-aminometylobicyklo-[2,2,2,]-oktano-1 karboksylowy. Korzystnie podłoże jest podłożem chromatograficznym. W korzystnym rozwiązaniu podłoże chromatograficzne jest materiałem hydrofilowym takim jak agaroza, celuloza, szkło o kontrolowanych porach, żele krzemionkowe, dekstrany lub organiczny sztuczny polimer, taki jak oparty na poliakryloamidowych polistyrenach, korzystnie materiał chromatograficzny jest agarozą lub sefarozą. W korzystnym rozwiązaniu, że materiał chromatograficzny jest materiałem rozdrobnionym lub materiałem litym-blokowym. Korzystnie kwas traneksamowy jest związany z podłożem poprzez linker, gdzie korzystnie linker jest linkerem dwufunkcyjnym, wybranym z grupy obejmującej N-hydroksy sukcynoimid, DAPA, CNBr, epoksy, diaminodipropyloaminę (DADPA), 1,6 diaminoheksan, kwas bursztynowy, 1,3 diamino-2-propanol, etylenodiaminę (EDA), TNB, pirydylodisiarczek jodoacetamidu, podłoże aktywowane maleimidem lub kombinacje tych substancji.

Korzystnie podłoże jest modyfikowane częścią cząsteczki, która oddziałuje z pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi grupami aminowymi.

Przedmiotem wynalazku jest również krioprecypitat z osocza ludzkiego, który jest w 85-99% wolny od plazminogenu, a poziom fibrynogenu i fibrynektyny jest niezmieniony, który jest otrzymany sposobem według wynalazku. Korzystnie krioprecypitat z osocza ludzkiego jest wolny od plazminy.

Korzystnie naturalnym źródłem jest krew, frakcje krwi, krioprecypitat, hodowle komórkowe, ekstrakty z tkanek zwierzęcych, takie jak płuca bydlęce, jelita bydlęce lub ekstrakty żelatynowe z kości zwierząt, albumina z surowicy bydlęcej jak również zwierzęce, nie mieszające się z wodą tłuszcze, takie jak lanolina (PC-fosfatydylo cholina). W korzystniejszym rozwiązaniu pochodną krwi jest w szczególności czynnik krzepliwości krwi z osocza lub mieszanina czynników krzepliwości krwi, takich jak FVIII, FIX, fibrynogen, fibronektyna, a₁-anty-trypsyna, anty-trombina III, czynnik von Willebranda, albumina, immunoglobulina.

Krótki opis rysunku

Fig. 1 przedstawia gradient w żelu SDS-PAGE (5-12% poli-akrylamid) 7 μg białka wymywano dwoma sposobami (opisanego w części materiały i metody), w trzech różnymi żywicami -TEA-Sefaroza, Lys-Ceramiczny Hyper DF i Lys Sefaroza 4B. Ścieżki 1-Glu plazminogen; 2-fibrynogen; 3-albumina; 4 Immunoglobulina G; 5-znaczniki masy cząst.; Piki wymywania: 6-TEA stosując metodę;

PL 205 685 B1

7-TAE stosując metodę 2; 8-Lizyno Ceramiczny Hyper D metodą 1; 9 Lizyno Sefarozę metodę 1; 10-Lizyno Ceramiczny Hyper D metodę 1; 11 Lizyno Sefarozę metodę 1.

Podsumowanie wynalazku

Niniejszy wynalazek jest oparty na wyniku, że aminokwas o sztywnej strukturze, jak niespodziewanie stwierdzono, mógł wiązać specyficznie plazmin(ogen).

Specyficznie wiązanie w kontekście opisu wynalazku oznacza, że z mieszaniny zawierającej białka, takie jak plazmin(ogen) i fibrynogen zasadniczo plazmin(ogen) jest usuwany z mieszaniny, podczas gdy fibrynogen pozostaje niemal nietknięty w mieszaninie. Korzystnie przynajmniej 85 do 99% plazmin(ogenu) jest usuwane i przynajmniej 85% fibrynogenu pozostaje w mieszaninie. Korzystniej plazmin(ogen) jest usuwany w przynajmniej 98,0% do 99,9% lub fibrynogen pozostaje 95% do 99%.

Grupa aminowa aminokwasu i grupa karboksylowa aminokwasu są około 6-8 Angstremów, korzystnie około 7 Angstremów oddalone od siebie i aminokwas o sztywnej strukturze jest kowalencyjnie związany z podłożem poprzez grupę aminową aminokwasu. W szczególności korzystne kwas traneksamowy w swojej konfiguracji trans i kwas 4-aminometylobicyklo-[2,2,2,]-oktano-1-karboksylowy (EMBOCA).

Niespodziewanie stwierdzono, że na pierwszym miejscu kwas ε-amino-kapronowy nie działał jak również kwas traneksamowy i że gdy kwas traneksamowy jest związany ze stałą powierzchnią traci on swoją wyjątkową zdolność wiązania plazmin(ogenu) (tak zwana kooperacja) i żywica usuwa tylko plazmin(ogen) z osocza lub produktów osocza. Jeśli kwas ε-amino-kapronowy jest przyłączony do kolumny jego wyjątkowa aktywność względem plazmin(ogenu) pozostaje nadal i nadal wiąże fibrynogen i inne białka z osocza, podczas gdy dodatkowa aktywność względem plazmin(ogenu) kwasu traneksamowego według wynalazku jest całkowicie zniesiona. Jednakże, powinowactwo żywicy kwasu traneksamowego wobec plazmin(ogenu) nie jest dotknięte.

Aminokwas o sztywnej strukturze jest przyłączony z odpowiednią częścią odległościową, w szczególności dłuższą niż 3 atomów węgla i podłoże i materiał powinowactwa może usunąć plazmin(ogen) z mieszaniny zawierającej białka bez dalszej zmiany kompozycji roztworu białkowego. Usuwanie może być przeprowadzono w obecności różnych buforów. Sposób według wynalazku jest również odpowiedni do wytwarzania czystych frakcji plazmin(ogenu) po wymyciu z podłoża o powinowactwie.

Sposoby według wynalazku mogą być stosowane otrzymując wysoce oczyszczony plazmin(ogen) z odpowiednich mieszanin. Po kontaktowaniu mieszaniny z np. materiałem chromatograficznym mającym związany aminokwas o sztywnej strukturze, plazmin(ogen) może być wymywany ze stałego podłoża powinowactwa.

Plazmin(ogen) może być wymywany przez roztwór zawierający ligand, który współzawodniczy z miejscami wiązania aminokwasu o sztywnej strukturze, np. kwasu traneksamowego, w białku plazmin(ogenu). Takie ligandy obejmują typowo ε-aminokwasy, korzystnie lizynę. Na przykład, lizyna może być zastosowana w stężeniach 0,85% wagowych do 0,99% wagowych. Możliwe są również inne stężenia, zwłaszcza gdy siła jonowa ośrodka wymywającego jest zrównoważona innymi składnikami np. elektrolitami.

Wymywanie plazmin(ogenu) ze stałej fazy może być wykonane bez buforu do wymywania, sposobem, w którym ekstrahuje się składniki buforu przez na przykład dializy. Plazmin(ogen) możliwy do uzyskania według wynalazku charakteryzuje się bardzo wysoką czystością. Wyjątkowa właściwość staje się oczywista na podstawie poniższych danych:

T a b e l a p o d s u m o w u j ą c a 1:

Porównanie specyficznej aktywności, współczynnika oczyszczenia i odzyskania plazmin(ogenu) z kriopozbawionego FFP osocza stosując korzystne warunki nakładania i wymywania dla każdej z żywic.

Żywica stosowana	Sposób	Specyficzna aktywność (mg plazmin(ogenu)/mg białka)	Współczynnik oczyszczenia	Odzyskanie (%)
TEA-Sefaroza 4B	2	0,794	567	91,6
Lizyna-Ceramiczny Hyper DF	2	0,444	444	10,9
Lizyna-Sefaroza 4B	1	0,121	101	11,6

PL 205 685 B1

T a b e l a p o d s u m o w u j ą c a 2:

Porównanie usuwania plazmin(ogenu) z kriopozbawionego FFP osocza stosując korzystne warunki nakładania każdej z żywic.

Stosowana żywica	Sposób	Usuwanie (%)
TEA-Sefaroza 4B	1 i 2*	99,5
Lizyna-Ceramiczny Hyper DF	1	54,6
Lizyna-Sefaroza 4B	1	58,0

*Oba sposoby są identyczne do momentu zebrania niezwiązanego piku.

Widoczne jest w tabeli podsumowującej, że gdy zastosowano dostępne na rynku żywice z unieruchomionymi ligandem-Lizyną i żywica TEA w zoptymalizowanych warunkach chromatograficznych, odzyskanie i specyficzna aktywność plazmin(ogenu) były wyższe w przypadku żywicy TEA (Tabela podsumowująca 1). Warte również zauważenia, że żywica TEA jest znacznie bardziej skuteczna przy usuwaniu plazmin(ogenu) (jako wykazano testem dla Glu-plazmin(ogenu)) z osocza kriopozbawionego, niż przy lizynowej żywicy (Tabela podsumowująca 2).

Czystość eluatów określono elektroforezą w żelu SDS. Eluaty trzech różnych żywic (TEA-Sefaroza, Lys-Ceramiczny Hyper DF i Lys-Sefaroza 4B) poddano SDS-PAG przez wprowadzenie 5-12% gradient akrylamidu i wprowadzenie 7 μg białka na ścieżkę. Otrzymywany żel wybarwiony błękitem Coomassie przedstawiono na fig. 1.

Fig. 1 przedstawia gradient w żelu SDS-PAGE (5-12% poli-akrylamid) 7 μg białka wymywano dwoma sposobami (jak opisano w materiałach i sposobach), trzema różnymi żywicami-TEA-Sefaroza, Lys-Ceramiczny Hyper DF i Lys Sefaroza 4B. Ścieżki 1-Glu plazminogen; 2-fibrynogen; 3-Albumina; 4-lmmunoglobulina G; 5-znaczniki masy cząst.; Piki wymywania: 6-TEA stosując metodę; 7-TAE stosując metodę 2; 8-Lizyno Ceramiczny Hyper D metodę 1; 9 Lizyno Sefarozę metodę 1; 10-Lizyna Ceramiczny Hyper D metodę 1; 11 Lizyno Sefarozę metodę 1.

Wydaje się, że nie potrzebne jest zastosowanie dalszego oczyszczania tego produktu do wskazań klinicznych.

Podłoże do przeprowadzania sposobu według wynalazku korzystnie stanowi materiał chromatograficzny, który może związać aminokwas o sztywnej strukturze, w którym grupa aminowa aminokwasu i grupa karboksylowa aminokwasu są oddalone od siebie około 6-8x10^-10, korzystnie około 7x10^-10 m. Odległość pomiędzy grupą aminową i grupą karboksylowa jest utrzymywana zasadniczo stała dzięki sztywnej konstrukcji aminokwasu. Sztywność aminokwasu może być uzyskiwana przez zastosowanie pierścieni alicyklicznych, korzystnie pierścienia cykloheksanowego, w którym aminowa i karboksylowa grupa są podstawione w 1,4 pozycji pierścienia alicyklicznego. Wynalazek obejmuje również aromatyczne układy np. podstawionych benzoesowych kwasów lub kwasu octowego podstawionego aniliną.

Według wynalazku podłoże korzystnie ma związane aminokwasy wybrane z grupy obejmującej kwas traneksamowy i EMBOCA.

Podłoże chromatograficzne według wynalazku może być wybrane z grupy np. dostępnych na rynku podłóż znanych pod nazwami handlowymi Sephacryl® (Pharmacia, Szwecja), Ultragele (Biosepara, Francja) TSK-Gel Toyopearls® (Toso Corp., Japan), HEMA (Alltech Ass. (Deerfield, II, USA), Eupergit® (Rohm Pharma, Darmstadt, Germany). Również podłoża oparte na azlaktonach (3 M, St. Paul, Minn, USA). Szczególnie korzystny jest Agaroza® lub Sefaroza®. Te materiały są dostępne na rynku na przykład z przedsiębiorstwa Sigma, USA.

W korzystnym rozwiązaniu, sposób według wynalazku jest przeprowadzany przez zastosowanie rozdrobnionego materiału chromatograficznego lub materiału litego-blokowego. Materiał rozdrobniony może być zawieszony w odpowiednim ośrodku i otrzymana zawiesina może być stosowana np. w kolumnie chromatograficznej. Jednakże, sposób według wynalazku może również być wykonywany w części. Ponadto, polimery mogą być stosowane jako materiał pylisty lub również w postaci błon.

Kwas traneksamowy jest związany z podłożem korzystnie poprzez linker, w szczególności linker dwufunkcyjny, pomiędzy podłożem a kwasem traneksamowym. Jeśli linker dwufunkcyjny jest stosowany może być wybrany z grupy obejmującej N-hydroksysukcynoimid, DAPA, CNBr, epoksy, diaminodipropyloaminę (DADPA), 1,6 diaminoheksan, kwas bursztynowy, 1,3 diamino-2-propanol, etylenoPL 205 685 B1 diaminę (EDA), TNB, pirydylodisiarczek jodoacetamidu, maleimidem aktywowane podłoże lub połączenia tych substancji.

Podłoże do przeprowadzania sposobu wynalazku jest korzystnie zmodyfikowane z wykorzystaniem cząsteczek, które oddziałują z pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi grupami aminowymi.

Według sposobu wynalazku mieszaninę inkubowano z podłożem przez dostatecznie długi czas i wymywano obojętnym roztworem wodnym zawierającą sole sodu, sole wapnia, sole buforujące po kontaktowaniu mieszaninę z podłożem mającym związany kwasem traneksamowym. Następnie, plazmina lub plazmin(ogen) może być wymywany roztworem wodnym zawierającym dostateczną ilość lizyny lub równoważnika który współzawodniczy z kowalencyjnie związanym kwasem traneksamowym.

Przedmiotem wynalazku jest mieszanina pochodząca z naturalnego źródła zasadniczo wolna od plazmin(ogenu) i plazminy. W szczególności, mieszanina według wynalazku stanowi krew, pochodną krwi lub frakcję krwi, krioprecypitat.

Pochodną krwi według wynalazku jest w szczególności czynnik krzepliwości krwi z osocza lub mieszanina czynników krzepliwości krwi, takich jak FVIII, FIX, fibrynogen, fibronektyna, a₁-antytrypsyna, anty-trombina III, czynnik von Willebranda, albumina, immunoglobulina.

Ponadto, przedmiotem obecnego wynalazku jest również podłoże zawierające kowalencyjnie związany kwas traneksamowy.

W innym korzystnym rozwiązaniu według wynalazku kwas traneksamowy jest związany z podłożem poprzez linker pomiędzy podłożem a kwasem traneksamowym. Jest to korzystne gdy podłoże nie ma funkcyjnych grup zdolnych do związania kwasu traneksamowego kowalencyjnie. Następnie podłoże jest po raz pierwszy sfunkcjonalizowane a następnie poddane reakcji z linkerem, który może związać się z kwasem traneksamowym. Ramiona części odległościowej lub linkery są cząsteczkami o małej masie cząsteczkowej, które są stosowane jako pośredniczące linkery pomiędzy podłożem lub matrycą a ligandem powinowactwa którym jest według wynalazku aminokwas mający sztywną strukturę i grupa aminowa około 6-7 Angstremów oddalona od grupy karboksylowej. Korzystnie, części odległościowe zawierają dwie funkcyjne grupy po obu stronach w celu łatwego sprzęgania z ligandem i podłożem. Częścią odległościową jest typowo węglowodorowy związek mający dwie funkcyjne grupy na swoich końcach. Jeden z dwóch końców jest przyłączony kowalencyjnie z macierzą stosując tradycyjne lub znane per se reakcje. Drugi koniec jest kowalencyjnie związany z ligandem stosując inną procedurę sprzęgania.

Sposób według wynalazku jest również opisany bardziej szczegółowo na przykładzie wytwarzania krioprecypitatu wolnego zasadniczo od plazmin(ogenu), który może być materiałem wyjściowym dla wielu produktów krwiopochodnych.

Krioprecypitat jest poddany chromatografii powinowactwa z unieruchomionym ligandem otrzymując zaadsorbowaną frakcję i niezaadsorbowaną frakcję. Substancja, która może być wymywana z zaadsorbowanej frakcji stanowi plazmin(ogen).

Unieruchomionym ligandem może być dowolny analog, który może oddziaływać z miejscami plazmin(ogenu) wiążącymi lizynę. Sposób wytwarzania unieruchomionych ligandów, które są stosowane według wynalazku został przedstawiony poniżej. Poniższe przykłady stanowią jedynie ilustrację i nie ograniczaj ą zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1: Unieruchomienie różnych ligandów kwasu ε-amino-karboksylowego

Aby określić poziom usuwania plazmin(ogenu) z roztworów pochodzących z osocza wytworzono lub zakupiono serię ligandów kwasu ε-amino-karboksylowego połączonego różnymi linkerami z kilkoma żywicami (jeśli są dostępne na rynku). Poniższa tabela podsumowuje wszystkie badane połączenia (podane poniżej numery żywic odnoszą się do części poniżej, w której przedstawiono syntezę każdego połączenia):

T a b e l a 1

Linker ligandu	p-benzamidyna	Arginina	Kwas Traneksamowy	Kwas ε-aminoheksanowy	Lizyna
1	2	3	4	5	6
N-hydroksy- sukcynowy				Sefaroza 4B(1)
sukcynowy				4B (1)

PL 205 685 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6
DADPA	Agaroza 4% (2)	Agaroza 4% (3)	Agaroza 4% (4)
CNBr		Sefaroza 4B (5)	Sefaroza 4B (6)
Epoksy	Sefaroza 6B (10)	Sefaroza 6B (7)	Sefaroza 6B (8)		Ceramiczny HyperDF (9)

1) N-hydroksysukcynoimidowy ester kwasu ε-aminoheksanowego Sefarozę 4B zakupiono z firmy Sigma

2) Wytwarzanie p-aminobenzamidyno-Agarozy 4%

Poniższą procedurę stosowano do unieruchomienia diaminodipropyloaminy (DADPA) na Agarozie 4% (Pierce), reakcja miała miejsce w żel odległościowym zakończonym aminą, który następnie zmodyfikowano bezwodnikiem.

ml żelu DADPA-Agaroza przemyto oczyszczoną wodą a następnie żel zwieszono w równej objętości oczyszczonej wody. Zawiesinową mieszaninę mieszano powoli przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, podczas dodawanie do niej 2,5 g bezwodnika bursztynowego. Na koniec mieszania, sukcynylowany żel przemyto kolejno oczyszczoną wodą. 1 M NaCI i ponownie oczyszczoną wodą aby usunąć nadmiarem nieprzereagowanego kwasu bursztynowego.

Negatywny wynik testu z TNBS (Sigma) wskazał, że wszystkie aminy DADPA były skutecznie zablokowane kwasem bursztynowym.

Unieruchomiony sukcynylowany DADPA przemyto 250 ml oczyszczonej wody, następnie nadmiar wody odessano do suchości wilgotnego ciasta i przenoszono do 500 ml zlewki. Żel ponownie zawieszono w 25 ml 0,1 M buforu MES, pH 4,7 i mieszano powoli podczas gdy 0,25 g p-aminobenzamidyny (Sigma) i 0,75 g EDC (Pierce) dodawano. pH mieszaniny reakcyjnej utrzymywano na poziomie 4,7 przez 1 godzinę przez ciągłe dodawanie 0,5 M NaOH. Mieszaninę reakcyjną następnie pozostawiono przez noc w temperaturze pokojowej przy stałym powolnym mieszaniu.

Żel przemyto następnie 0,5 I każdego z: oczyszczoną wodą 0,1 M octanem sodu, pH 4,7, 0,5 M wodorowęglanem sodu i oczyszczoną wodą.

Unieruchomioną p-aminobenzamidynę przechowywano do momentu użycia w 0,02% azydku sodu w temp. 4°C.

3) Arginina-Agaroza 4%

Synteza Arginino-Agarozy 4% była korzystnie przeprowadzona według powyższej procedury, p-aminobenzamidyno-Agaroza 4% (patrz 2).

4) Kwas traneksamowy (TEA)-Agaroza 4%

Synteza kwasu traneksamowy (TEA)-Agarozy 4% była korzystnie przeprowadzona według powyższej procedury, p-aminobenzamidyno-Agaroza 4% (patrz 2).

5) Arginina-Sefaroza 4B

Poniższą procedurę stosowano do unieruchomienia Argininy lub kwasu traneksamowego na CNBr-Sefarozie 4B (Pharmacia) jako żelu odległościowym. Synteza dwóch ligandów w dwóch różnych stężeniach (10 mmoli lub 0,01 mmola/ml suchego żelu) była podobna, jak wymienione w obecnej i nastę pnej sekcji (5-6).

2,5 g aktywowanej CNBr Sefarozy 4B zwieszono w 50 ml 1 mM HCI. Żel poddano pęcznieniu przez 10 min w temperaturze pokojowej a następnie 15 min przemywano 500 ml 1 mM HCI w spiekanym filtrze szklanym.

Argininę rozpuszczono w 12,5 ml sprzęgającego buforu, 0,1 M NaHCO3, pH 8,3 zawierającego 0,5 M NaCI. Sprzęgający roztwór zawierający ligand zmieszano z żelem w plastykowej probówce a nastę pnie poddano koł ysaniu poprzecznemu przez noc w temp. 4°C.

Na koniec inkubacji, mieszaninę tę przemyto z nadmiaru ligandu 10 objętościami żelu sprzęgającego buforu przez spiekany filtr szklany. Roztwór białkowy przemyto 3 cyklami 50 ml buforu przy zmieniającym się pH (0,1 M buforu octanowego pH 4 zawierającego 0,5 M NaCI, a następnie przemyto 0,1 M buforem Tris-HCI pH 8 zawierającym 0,5 M NaCI). Unieruchomioną Arginino Sefarozę 4B przechowywano do momentu użycia w 0,02% azydku sodu w temp. 4°C.

6) Kwas traneksamowy (TEA)-Sefaroza 4B

Syntezę tę przeprowadzono według powyższej procedury dla Arginino-Sefarozy 4B (patrz sekcja 5).

PL 205 685 B1

7) Arginina-Sefaroza 6B

Argininę w dwóch różnych stężeniach (2 mmole lub 0,2 mmola/ml suchego żelu) sprzęgano z dostępną na rynku unieruchomioną Epoksy Sefarozą 6B (Pharmacia) w następujący sposób : 2,5 g aktywowanej Epoksy Sefarozy 6B zwieszono w 200 ml oczyszczonej wody. Żel poddano pęcznieniu przez w przybliżeniu 5 min w temperaturze pokojowej a następnie przemyto przez 1 godzinę 500 ml oczyszczonej wody, dodawano wielokrotne ilości próbki, poprzez spiekany filtr szklany.

ml sprzęgającego buforu (0,1 M NaHCO3 pH 9,3 i 0,5 M NaCI) i spęczniały żel przelano do dwóch probówek zawierających Argininę. Mieszaniny zmieszano w plastykowej probówce przez noc w temperaturze pokojowej.

Na koniec inkubacji, mieszaninę tę przemyto z nadmiaru ligandu pięcioma objętościami żelu sprzęgającego buforu przez poprzez spiekany filtr szklany. Produkt przemyto w 3 cyklach zmieniającego się pH (0,1 M bufor octanowy pH 4,0 i 0,5 M bufor NaCI a następnie przemyto 0,1 M Buforu TrisHCI pH 8 i 0,5 M NaCI). Unieruchomioną Arginino-Sefarozę 6B przechowywano do momentu użycia w 0,02% azydku sodu w temp. 4°C.

8) Kwas traneksamowy (TEA)-Sefaroza 6B

Syntezę tę przeprowadzono korzystnie według powyższej procedury dla Arginino-Sefarozy 6B (patrz sekcja 7).

9) aktywowana L-lizyną epoksy-ceramiczny HyperDF Hydrogel zakupiono od Sigma.

10) P-aminobenzamidynowy kowalencyjnie przyłączony do Sefarozy 6B zakupiono z Pharmacia.

P r z y k ł a d 2: Przeszukiwanie żywic do różnych chromatografii powinowactwa do usuwania plazmin(ogenu)

Krioprecypitat z zebranego ludzkiego osocza zawierający 1 lU/ml plazmin(ogenu) i 50 mg/ml fibrynogenu stosowano w poniższym badaniu.

Podwielokrotności zmrożonego krioprecypitatu roztopiono w 37°C i dializowano w buforze BN1 (0,12 M NaCI, 10 mM Tri Na-cytrynian, 1 mM CaCl2 w pH 7,0). Ten roztwór białkowy przesączono przez 5 μm filtr o głębokości otrzymując przejrzysty roztwór. Cylinder strzykawki 5 ml o przekroju 8,36 mm wypełniono 1,5 ml (objętość na mokro) poniższych żywic powinowactwa opisanych w przykładzie 1: unieruchomiony kwas ε-aminoheksanowy (Sefaroza 4B, stosując CNBr jako część odległościową), unieruchomiona p-aminobenzamidyna/Arginina/TEA (Agaroza 4% stosując DADPA jako część odległościową), unieruchomiona Arginina/TEA (Sefaroza 4B stosując CNBr jako część odległościową) unieruchomiona Arginina/TEA (Sefaroza 6B, stosując epoksy jako część odległościową) i unieruchomiona L-Lizyna (Ceramiczny HyperDF Hydrożel, stosując epoksy jako część odległościową). Optymalizowana procedura wprowadzania żelu była następująca: wprowadzony żel przemyto 4 objętościami i) oczyszczonej wody ii) 1 M NaCI iii) oczyszczonej wody iv) buforu TLN 0,1 (Tris 0,05 M Lizyna 0,02 M, 0,1 M NaCI, pH 9,0), v) buforu TLN 1 (Tris 0,05 M, Lizyna 0,02 M i 1 M NaCI, pH 9,0) i vi) oczyszczonej wody. Wszystkie bufory do próbek, wprowadzania i przemycia nanoszono na cylinder strzykawki po wirowaniu 1000 rpm przez 1 min w temp. 25°C.

Równoważenie przeprowadzono 4 objętościami BN1 i wstępnie przesączony, zatężony krioprecypitat na noszono na żywicę (2: 1 obj./obj., odpowiednio) mieszaninę tę następnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podwielokrotności niezwiązanych żwirowanych przemyć zebrano do plastykowych probówek po każdym wirowaniu. Żywicę przemyto przynajmniej trzynastoma objętościami kolumny zarówno buforem BN1 aż wartość O.D.280 osiągnie 0,02. Wymywanie plazmin(ogenu) przeprowadzono buforem TLN 1 a następnie przemyto czterema objętościami złoża 3 M NaCI. Minikolumny szczelnie zamknięto i przechowywano w temp. 4°C.

Żywice, które uległy degradacji w czasie przeprowadzania sposobu lub usuwały mniej niż 50% plazmin(ogenu) wyłączono we wczesnej fazie badań. Wyniki podsumowano w tabeli 2.

T a b e l a 2

Usuwanie plazmin(ogenu) P w niezwiązanym materiale stosując różne unieruchomione ligandy z buforem BN1.

Unieruchomione ligandy	Usuwanie plazmin(ogenu) (%)
1	2
Kwas ε-aminoheksanowy, stosując CNBr jako część odległościową	13,36
p-Aminobenzamidyna, stosując DADPA jako część odległościową	Nic (kolumna była wypełniona)

PL 205 685 B1 cd. tabeli

1	2
P-Aminobenzamidyna, stosując Epoksy jako część odległościową	19,78
Arginina, stosując DADPA jako część odległościową	6,04*
TEA (wysokie stęż.), stosując CNBr jako część odległościową	0
TEA (niskie stęż.), stosując CNBr jako część odległościową	0
Arginina (niskie stęż.), stosując CNBr jako część odległościową	23,25
Arginina (niskie stęż.), stosując Epoksy jako część odległościową	0
Arginina (wysokie stęż.), stosując Epoksy jako część odległościową	5,61

*Ten punkt danych stanowi średnią z trzech przebiegów.

Powyższa tabela przedstawia, że najlepsze ligandy, aby usunąć plazmin(ogen) z krioprecypitatu obejmowały żele powinowactwa, które były dostatecznie mocne aby utrzymać sekwencję w czasie wprowadzenia, przemywania i wymywania bez zapadania lub żele, które zachowały ponad 50% wprowadzonego fibrynogenu.

Tabela 3 przedstawia zarówno skuteczność różnych typów żeli do usuwania plazmin(ogenu) i ich zdolności do zachowania fibrynogenu w zatężonym krioprecypitacie.

Resztkowy plazmin(ogen) obecny w krioprecypitacie został zaadsorbowany przez żywice, podczas gdy fibrynogen nie, zatem uzyskany supernatant był zasadniczo wolny od plazmin(ogenu).

Zawartość fibrynogenu mierzono testem czasu powstawania skrzepu podczas, gdy zawartość plazmin(ogenu) mierzono testem chromogennym.

Obliczone odzyskanie plazmin(ogenu) i fibrynogenu z żeli lizynowych służyły jako złoty standard dla wszystkich innych zastosowanych ligandów żelowych. Wyniki, zaprezentowane w tabeli 2 wskazują że tylko ligandy TEA z częścią odległościową epoksy zapewniały doskonałe usuwanie plazmin(ogenu) i wysokie odzyskanie fibrynogenu (patrz tabela 3).

Wysokie stężenie unieruchomionego TEA zapewniło wyjątkowo wysokie usuwanie plazmin(ogenu) i podobne odzyskanie fibrynogenu w porównaniu do ligandu związanego z lizyną: odzyskanie 89% w porównaniu do 92% dla fibrynogenu i 89% w porównaniu do 56% dla usuwania plazmin(ogenu), odpowiednio. Wszystkie inne żywice były znacznie mniej wydajne zarówno przy usuwaniu plazmin(ogenu) lub odzyskaniu fibrynogenu.

T a b e l a 3

Podsumowanie danych otrzymanych przy odzyskaniu fibrynogenu i usuwania plazmin(ogenu) w niezwiązanym materiale, stosując różne unieruchomione ligandy w buforze BN1.

Unieruchomione ligandy	Usuwanie plazmin(ogenu)	Odzyskanie fibrynogenu (%)
Lizyna, stosując Epoksy jako część odległościową	56*	92*
TEA, stosując DADP jako część odległościową	49	84
TEA (niskie stęż.), stosując Epoksy jako część odległościową	44,35	88,62
TEA (wysokie stęż.), stosując Epoksy jako część odległościową	89	89
Arginina (wysokie stęż.), stosując CNB jako część odległościową	91,26	49

* Ten punkt danych stanowi średnią z trzech przebiegów.

P r z y k ł a d 3: Wpływ buforu fosforanowego i BNI w profilu chromatografii powinowactwa unieruchomionej żywicy Lizyny i TEA.

Krioprecypitat poddano działaniu wodorotlenkiem glinu aby zaadsorbować witaminę K zależna od czynników krzepliwości krwi a następnie inkubowano z rozpuszczalnikową detergentową mieszaniną (SD-1% Tri (n-butylo) fosforanu, 1% Triton X-100) przez 4 godziny w temp. 30°C do dezaktywacji

PL 205 685 B1 wirusów o otoczkach lipidowych. Odczynniki SD usunięto stosując ekstrakcję olejem rzepakowym (castor oil) i chromatografii hydrofobowych oddziaływań i preparat następnie pasteryzowano (10 godzin w temp. 60°C) w obecności sacharozy i glicyny jako stabilizatorów.

Po pasteryzacji, sacharozę i glicynę usunięto przez diafiltrację. Kwas traneksamowy (TEA) i chlorowodorek argininy dodawano jako stabilizatory przed sterylizacją przez filtrację. Podwielokrotności stabilizowanego produktu utrzymywano w temp. -30°C do momentu użycia.

Podwielokrotności zamrożonego, dezaktywowanego pod kątem wirusów krioprecypitatu roztopiono w temp. 37°C i dializowano względem buforu BN1 (złożonego z 0,12 M NaCl, 0,01 M Tri Nacytrynianu, 1 mM CaCl2, w pH 7,0) lub w innym rozwiązaniu względem 25 mM buforu fosforanowego. Ten ostatni roztwór przesączono przez filtr o głębokości 5 μm otrzymując przejrzysty roztwór. Kolumna o średnicy 10 mm (Biorad, USA) wypełniono bądź 6 ml (objętości na mokro) unieruchomionej TEA (TEA Sefaroza 6B) lub unieruchomionej Lizyną (Ceramiczny HyperDF/Sefaroza 4B) i przemyto 4 objętościami każdego z poniższych roztworów kolejno: i) oczyszczoną wodą ii) 1 M NaCl iii) oczyszczoną wodą iv) buforem TLN 0,1 (0,1 M NaCI, Lizyna 0,02 M, Tris 0,05 M pH 9,0), v) buforem TLN 1 (1 M NaCI, Lizyna 0,02 M, Tris 0,05 M pH 9) i vi) oczyszczoną wodą. Równoważenie przeprowadzono 4 objętościami BN1 lub w innym rozwiązaniu buforem fosforanowym. Przesączony krioprecypitat wprowadzono do kolumny przy szybkości przepływu 100 gl/min.

Próbki niezwiązanego materiału zebrano w plastikowych probówkach i żywicę przemyto 16 objętościami kolumny bądź buforem BN1 bądź buforem fosforanowym. Wymywanie plazmin(ogenu) przeprowadzono buforem TLN 1, a następnie przemyto czterema objętościami 3 M roztworu NaCI, czterema objętościami oczyszczonej wody i czterema objętościami 25% etanolu uzupełnionego 1 M NaCI.

Tabela 4 przedstawia skuteczność usuwania plazmin(ogenu) i odzyskania fibrynogenu różnymi rodzajami żywic. Zawartość fibrynogenu mierzono testem czasu tworzenia skrzepu (test Claussa) podczas gdy zawartość plazmin(ogenu) mierzono testem chromogeniczne.

Porównanie pomiędzy różnymi żywicami wskazują że 95,4% do 96,4% zawartości fibrynogenu jest utrzymanych w niezwiązanym piku, gdy stosowany jest bufor BN1. Przeciwnie, odzyskanie fibrynogenu było niskie gdy bufor fosforanowy był stosowany. Niespodziewanie, tylko unieruchomiona TEA żywica zapewniała zarówno wysokie usuwanie plazmin(ogenu) i duże odzyskanie fibrynogenu.

Wyniki przy lizynowej żywicy również wykazały ulepszoną skuteczność z buforem BN1 w porównaniu do buforu fosforanowego.

T a b e l a 4

Podsumowanie danych otrzymanych w wyniku badania odzyskiwania fibrynogenu i plazmin(ogenu) stosując unieruchomione żywice z buforem BN1 lub buforem fosforanowym.

Unieruchomione ligandy	Usuwanie plazmin(ogenu) (%)	Odzyskanie fibrynogenu (%)
TEA (wysokie stęż.) Epoksy + Bufor	77,1	96,4
BN1
Lizyna-Epoksy + Bufor BN1	68,87	95,4
Lizyna-Epoksy + Bufor fosforanowy	100	66,9
Lizyna CNBr + Bufor BN1	62,5	121,8
Lizyna CNBr + Bufor fosforanowy	100	62,2

P r z y k ł a d 4

Podwielokrotności zamrożonego, dezaktywowanego pod kątem wirusów krioprecypitatu roztopiono w temp. 37°C i dializowano względem buforu BN1 (0,12 M NaCI, 0,01 M Tri Na-cytrynian, 1 mM CaCl2 przy pH 7,0) lub w innym rozwiązaniu względem 25 mM buforu fosforanowego. Ten ostatni roztwór przesączono przez filtr o głębokości 5 gm aby usunąć substancje nierozpuszczalne.

Kolumnę o średnicy 26 mm (Pharmacia, Szwecja) wypełniono 50 ml (objętość na mokro) unieruchomionego TEA (TEA Sefaroza 6B) i przemyto 4 objętościami oczyszczonej wody i taką samą objętością buforu TLN 0,1 (0,1 M NaCI, Lizyna 0,02 M, Tris 0,05 M pH 9,0), buforu TLN 1 (1 M NaCI, Lizyna 0,02 M, Tris 0,05 M pH 9) i oczyszczonej wody. Równoważenie przeprowadzono 4 objętościa12

PL 205 685 B1 mi buforu BN1 (NaCI, Tri Na-cytrynian, CaCl2, pH 7,0) i przesączony BAC przeszedł przez kolumnę przy szybkości przepływu 700 nl/ml.

Próbki niezwiązanego materiału zebrano w plastykowej szalce i żywicę przemyto przynajmniej 3 objętościami żelu buforem BN1. Wymywanie plazmin(ogenu) przeprowadzono buforem TLN 1 a następnie przemyto 3 M NaCI.

Niezwiązane frakcje z dwóch przebiegów zebrano i przechowywano w temp. 4°C do momentu zatężenia. Na koniec, BAC zatężono do około wyjściowej objętości przez diafiltrację stosując błonę odcinającą 100 i wobec buforu B1 (Glycine, NaCI, Tri Na-cytrynian, Cal2, pH 7) a następnie filtrowano przez 0,45 nm filtr. 2% argininę dodawano do przesączu.

Do przeprowadzenia testów stabilności, otrzymany produkt przesączono w celu sterylizacji przez 0,2 nm filtr.

Jak wskazano w tabeli 5 stosowanie większej i dłuższej kolumny poprawiało skuteczność ligandu TEA, odzyskanie fibrynogenu wynosiło 100% i usuwanie plazmin(ogenu) prowadziło do poziomu poniżej wykrywalnego w teście chromogenowym plazmin(ogenu).

Porównanie pomiędzy produktem przed i po diafiltracji ujawniło utratę 33% zawartości fibrynogenu. Zjawisko to może być wyjaśnione technicznymi problemami, które są odkryte jedynie w niewielkiej skali. Unieruchomiona TEA żywica dostarcza, niewątpliwie zarówno doskonałe usuwanie plazmin(ogenu) i doskonałe odzyskanie fibrynogenu.

T a b e l a 5

Podsumowanie danych otrzymanych w wyniku badania odzyskiwania fibrynogenu i plazmin(ogenu) z niezwiązanego piku. Każdy punkt danych stanowi średnią z dwóch przebiegów.

Próbka	Odzyskanie fibrynogenu (%)	Odzyskanie Plazmin(ogenu) (%)
Po wprowadzeniu	100	0
Po wprowadzeniu i diafiltracji	66,2	0*

*odzyskanie plazmin(ogenu) po zatężeniu zebranej próbki 3,7 krotnie.

Nie stwierdzono resztkowego TEA ani w wymywanym roztworze białkowym ani w zatężonym produkcie ultrafiltracji. Analiza resztkowego poziomu kwasu traneksamowego przeprowadzono metodą HPLC.

Cztery dodatkowe przebiegi zostały przeprowadzone, w celu usunięcia plazmin(ogenu), stosując taką samą żywicę i warunki przebiegu jak już opisane powyżej (przykład 4). Ogólnie, wyniki wszystkich próbek przetestowanych były podobne do pierwszych wyników przedstawionych powyżej.

Nie stwierdzono resztkowego TEA ani w wymywanym roztworze białkowym zatężonego ultrafiltrowanego produktu. Analiza resztkowego poziomu kwasu traneksamowego przeprowadzono metodą HPLC.

Nie stwierdzono adhezji z żądnym paskiem przed usunięciem plazmin(ogenu) lub po zbadaniu na modelu szczurzym.

Krioprecypitat przed i po usunięciu plazmin(ogenu) badano pod kątem degradacji podczas, gdy był inkubowany w temperaturze pokojowej. Dane w procentach białek zdolnych do skrzepów (poprzez absorbancję UV) w różnych próbkach przedstawiono w tabeli 6.

T a b e l a 6

Procent białek zdolnych do skrzepów po inkubacji w temperaturze pokojowej podwójnie dezaktywowanego wirusowo, zatężonego krioprecypitatu przed i po usuwaniu plazminogenu Epoksy Sefarozą 6B zligowaną z kwasem traneksamowym

Czas inkubacji (tygodnie)
	0	1	2	3	4	5	6
Przed potraktowaniem	62,91	0	0	0	0	0	0
Po potraktowaniu	73,44	70,80	68,24	65,6	63,69	63,84	62,46

PL 205 685 B1

Testy stabilności przeprowadzano paskami, które otrzymano z krioprecypitatu przed i po usuwaniu plazmin(ogenu) a następnie inkubacji w temp. 37°C w obecności buforu. Te paski poddano działaniu dodatkowej glicyny i lub argininy. Wyniki podsumowano w tabeli 7 poniżej.

T a b e l a 7

Czas degradacji w paskach przed i po usuwaniu plazmin(ogenu).

Preparat	Czas degradacji pasków (dni)
	0	1	2	3	4	5	6
Przed traktowaniem	+++	-	-	-	-	-	-
Przed traktowaniem + 2% arginina	+++	-	-	-	-	-	-
Przed traktowaniem + 2% arginina + 1% glicyna	+++	-	-	-	-	-	-
Po traktowaniu	+++	+++	+++	+++	+++	+++	-
Po traktowaniu + 2% arginina + 1% glicyna	+++	+++	+++	+++	+++	+++	-

+++ Ten punkt danych oznacza istnienie paska - Ten punkt danych oznacza degradację paska

1. Badania opisane w poniższych przykładach przeprowadzono na kriopozbawionym, zebranych świeżo zamrożonym osoczu od normalnych, zdrowych dawców. Ze względu na fakt, że wysokie stężenie antyplazminy i małe ilości plazminy u normalnych, zdrowych dawców (1), plazmina nie może być wykrywa testem funkcjonalnym (chromogennym) (Schreiber AD, Kaplan AP, Austen KF. Plasma inhibitors of the components of the fibrinolytic pathway in man. J. Clin. Invest 52: 1394-1401,1973). W konsekwencji jest niemożliwe wykazanie usuwania, oczyszczania i odzyskania z TEA żywicy plazminy od zdrowego dawcy w próbce osocza. Jednakże, dostępny w handlu zestaw ELISA do wykrywania bardzo małych ilości glu-plazmin(ogenu) i, jak stwierdzono w poprzednich badaniach, TEA żywica ma równe powinowactwo względem obu form plazmin(ogenu) jak również plazminy (Fredenburgh JP, Nesheim ME. Lys-plasmin(ogen) is a significant intermediate in the activation of Glu plazmin(ogenu) during fibrinolysis in vitro. J Biol Chem 267, 26150-6,1992 i Miyashita C, Wenzel E., Heiden M. Plasmin(ogen): a brief introduction into its biochemistry i function. Haemostasis 1: 7-13,1988.)

2. Zatem pomiar glu-plazmin(ogenu) może być stosowany jako wskaźnik całkowitego plazmin(ogenu) w osoczu.

P r z y k ł a d 5

Etap chromatograficzny:

Badania przeprowadzono w celu wyznaczenia skuteczności unieruchomionego TEA na Sefarozie 4FF w usuwaniu plazmin(ogenu) z kriopozbawionego świeżo zamrożonego osocza (FFP) zawierającego 1 lU/ml plazmin(ogenu). Podwielokrotności kriopozbawionego świeżo zamrożonego osocza roztopiono w temp. 37°C i przesączono przez filtr o głębokości 3 μm aby usunąć nierozpuszczalne białka.

Kolumnę o średnicy 10 mm (Pharmacia, Szwecja) wypełniono 2 ml (objętość na mokro) unieruchomionego TEA i przemyto 4 objętościami oczyszczonej wody i taką samą objętością buforu TLN-0,1 (0,1 M NaCI, Lizyna 0,02 M, Tris 0,05 M pH 9,0), buforu TLN-1 (1 M NaCI, Lizyna 0,02 M, Tris 0,05 M pH 9,0) i oczyszczonej wody. Równoważenie przeprowadzono 4 objętościami buforu BN1 (0,12 M NaCI, 0,01 M Tri Na-cytrynian, 1 mM CaCl₂, pH 7,0) i przesączone osocze (s20IU plazmin(ogenu)) przepuszczono przez kolumnę przy szybkości przepływu 1 ml/min.

Materiał przepływający zebrano i zamrożono w plastikowej butelce, i żywicę przemyto przynajmniej 3 objętościami kolumny buforu BN1. Wymywanie plazmin(ogenu) przeprowadzono buforem TLN-1, a następnie przemyto w przybliżeniu trzema objętościami 3 M roztworu NaCI, dwoma objętościami oczyszczonej wody i dwoma objętościami 20% etanolu + 1 M NaCI (Sposób 1). W drugiej metodzie (Sposób 2), ta sama procedura jak stosowano w metodzie 1 została przeprowadzona, lecz z dodatkowym przemyciem 3 M NaCI przed wymywaniem plazmin(ogenu).

PL 205 685 B1

Testy analityczne:

Test wykrywania Glu-Plazmin(ogenu): Zestaw ELISA Imunclone® Glu-plazmin(ogen) (American Diagnostica, Greenwich, CT, USA) stosowany w tych doświadczeniach jest immunologicznym oznaczaniem biologicznie aktywnych substancji z zastosowaniem enzymów unieruchamianych na sorbentach specyficznym do wyznaczania poziomów natywnego ludzkiego glu-plazmin(ogenu). Ograniczenie ilościowe testu (według najniższych standardów krzywej kalibracyjnej) w osoczu lub w pochodnych osocza wynosi 0,063 μg/ml.

Aktywność plazminy: test fibrynolityczny przeprowadzano, aby półilościowo określić aktywność plazminy w eluatach. Pokrótce, fibrynogen pozbawiony plazmin(ogenu) (Enzyme Research) inkubowano z różnymi stężeniami normalnego zebranego osocza (Unicalibrator, Stago) lub oczyszczony plazmin(ogen) wymywano z kolumn powinowactwa w obecności nadmiaru streptokinazy. Czas, w którym degradacja skrzepu była całkowita został zapisany i porównany z całkowitą degradacją skrzepu próbki.

Wyznaczenie ilości białka: Całkowitą ilość białka wyznaczano stosując metodę Bradforda (Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-54,1976). Tabele 8a i b przestawiają wyniki chromatograficznego usuwania i oczyszczania ludzkiego osocza z Glu-plazmin(ogenu) ligandem TEA. Tabela 8a podsumowuje dane otrzymane w wyniku oczyszczania plazmin(ogenu). Tabela przedstawia, że sposób 2 prowadzi do nieco lepszego oczyszczania plazmin(ogenu) niż sposób 1, przy oczyszczaniu 567-krotnym i doprowadziła do uzyskania 91,6%. Tabela 8b przedstawia, że średnią 99,5% plazmin(ogenu) usunięto z niezwiązanej frakcji, w większości wyjaśniane przez ilości odzyskane z eluatu (tabela 8a).

T a b e l a 8a:

Wpływ dodatkowego przemycia żywicy TEA 3 M roztworem chlorku sodu (Sposób 1 względem sposobu 2) na specyficzną aktywność, oczyszczanie i odzyskanie plazmin(ogenu) z osocza.

	Sposób 1	Sposób 1	Sposób 2	Sposób 2
Frakcja	Materiał wyjściowy	Eluat	Materiał wyjściowy	Eluat
Objętość (ml)	40	13,2	40	20
Białko (mg/ml)	46,96	0,291	55,41	0,180
Glu-plazmin(ogen) (pg/ml)	65,4	18,2	78,0	142,9
Plazmin(ogen) (lU/ml)	Nie wykonane	-0,5	-1
Specyficzna aktywność (mg plazmin(ogenu)/mg białka	0,0014	0,625	0,0014	0,794
Współczynnik oczyszczenia	446	567
Odzyskanie plazmin(ogenu) %	91,8	91,6

T a b e l a 8b:

Usuwanie plazmin(ogenu) z osocza (średnia z wyników dla dwóch sposobów) *

Sposób	Frakcja chromatograficzna	Glu-Plazmin(ogen) (średnia, pg/ml)	Objętość (średnia, ml)	Plazmin(ogenu) Usuwanie (%)
1 & 2*	Osocze	71,7	40,0	99,5
	Niezwiązana frakcja	0,18	83,5

* Sposoby 1 i 2 są identyczne włącznie do, zebrania niezwią zanej (przepł ywają cej) frakcji.

P r z y k ł a d 6: Wpływ warunków chromatograficznych na skuteczność unieruchomionego ligandu-lizyny w oczyszczaniu metodą powinowactwa plazmin(ogenu).

PL 205 685 B1

Etap chromatograficzny:

Badano oczyszczanie metodą powinowactwa stosując żywicę z unieruchomionym ligandem z lizyną stosując dwie dostępne na rynku lizynowe żywice. Stosowano chromatograficzny sposób udokomentowany w literaturze (patrz Robbins KC, Summaria L. Plasmin(ogen) and Plasmin. Methods Enzymol. 45: 257-73,1976, dla sposobu 2 opisanego poniżej) i również sposób opracowany w labolatorium twórcy (Sposób 1 poniżej).

Dwie żywice z unieruchomioną lizyną (ceramiczny HyperDF wytworzona przez Biosepra i Sefaroza 4B wytworzona przez Pharmacia) każda została wprowadzona do kolumn o średnicy 10 mm (Pharmacia, Szwecja). Każda kolumna zawierała 2 ml (objętość na mokro) żywicy.

Podwielokrotności kriopozbawionego świeżo zamrożonego osocza roztopiono w temp. 37°C i przesączono przez filtr o głębokości 3 nm otrzymując przeźroczysty roztwór.

Chromatograficzny etap przeprowadzano stosując jeden z poniższych sposobów:

Sposób 1

Kolumnę przemyto 4 objętościami każdego z poniższych roztworów: 1) oczyszczoną wodą 2) TLN-0,1,3) TLN-1 i 4) oczyszczoną wodą. Równoważenie przeprowadzono 4 objętościami BN1. Przesączone osocze (40 ml) wprowadzono do kolumny przy szybkości przepływu 1 ml/min. Próbki materiału przepływającego zebrano w plastikowych butelkach i żywicę przemyto buforem BN1. Wymywanie plazmin(ogenu) przeprowadzono buforem TLN-1, a następnie przemyto 3 M roztworem NaCI, 2 objętościami oczyszczonej wody i 2 objętościami 20% etanolu + 1 M NaCI.

Sposób 2: (ref. 5)

Podwielokrotności kriopozbawionego świeżo zamrożonego osocza (40 ml) przez filtr o głębokości 3 nm. 4 ml buforu 0,5 M Tris, 0,2 M lizyna, 1 M NaCI, pH 9 dodawano do 40 ml przesączonego osocza.

Kolumnę przemyto 4 objętościami kolumny oczyszczonej wody i zrównoważono 0,1 M buforem fosforanowym, pH 7,4. Rozcieńczone osocze przepuszczono przez żywicę przy szybkości przepływu 1 ml/min. Próbki niezwiązanego materiału zebrano do butelek plastikowych i żywicę przemyto 0,1 M buforem fosforanowym, pH 7,4 do momentu aż absorbancja wycieku przy 280 nm osiągnie linię podstawową. Plazmin(ogen) następnie wymywano 0,2 M kwasem ε-amino-kapronowym rozpuszczonym w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4 i zebrano na plastikową szalkę. Po wymywaniu następnie przemyto w przybliżeniu 2 objętościami 3 M roztworu NaCI i oczyszczonej wody.

Tabele 9a i 9b porównują usuwanie i oczyszczanie plazmin(ogenu) dwoma różnymi dostępnymi na rynku o unieruchomionej lizynie, żywicami stosując dwa różne sposoby oczyszczania każdy. Pomimo, że istnieje stosunkowo nieduża różnica w odzyskaniu plazmin(ogenu) w eluatach (9a) można zaobserwować, że stosując sposób 2 i żywicę Ceramiczny HyperDF, osiągnięto znacznie wyższe oczyszczanie plazmin(ogenu).

Wyniki wykazują, że stosując Lys-ceramiczny Hyper DF żywicę i chromatograficzny sposób 2, 444-krotne oczyszczanie osiągnięto. Ponadto, większość plazmin(ogenu) w materiale wyjściowym odzyskano we frakcjach z piku (76,5% w niezwiązanej frakcji + 10,9% w eluacie, przy tylko około 10% nałożonego plazmin(ogenu) niewyjaśnionego). Jednakże, usuwanie plazmin(ogenu) z niezwiązanej frakcji było tylko 23,5%.

T a b e l a 9a:

Specyficzna aktywność, współczynnik oczyszczenia i odzyskanie z osocza plazmin(ogenu) stosując dwa różne dostępne na rynku o unieruchomionej lizynie, żywice i dwa różne chromatograficzne sposoby.

	Sposób 1	Sposób 2
Frakcja	Wkład	Eluat	Wkład	Eluat
		Ceramiczny Hyper DF	Sefaroza 4B		Ceramiczny Hyper DF	Sefaroza 4B
1	2	3	4	5	6	7
Objętość (ml)	40	8,1	7,2	40	8,2	9,8
Białko (mg/ml)	55,94	0,347	0,345	60,05	0,0719	0,672
Glu-plazminogen (ng/ml)	65,4	40,3	41,9	60,8	32,2	19,9

PL 205 685 B1 cd. tabeli 9a

1	2	3	4	5	6	7
Specyficzna aktywność (mg plazminogenu/mg białka)	0,0012	0,116	0,121	0,001	0,444	0,030
Współczynnik oczyszczenia		97	101		444	30
Odzyskanie (%)		12,5	11,6		10,9	8,2

T a b e l a 9b:

Usuwanie plazmin(ogenu) przy pikach niezwiązanych w obu sposobach

Sposób	Zastosowana żywica	Chromatograficzna frakcja	Objętość (ml)	Glu- plazmin(ogen) μg/ml	Całkowity Glu-plazmin(ogen) (μ9)	Usunięcie plasmin (o genu) (%)
1	Ceramiczny Hyper DF	Osocze	40	65,4	2616	54,6 (45,4)
		Niezwiązana	72	16,5	1188
	Sefaroza 4B	Osocze	40	65,4	2616	58,0 (42,0)
		Niezwiązana	82	13,4	1099
2	Ceramiczny Hyper DF	Osocze	40	60,8	2432	23,5 (76,5)
		Niezwiązana	89	20,9	1860
	Sefaroza 4B	Osocze	40	60,8	2432	33,0 (67,0)
		Niezwiązana	91	17,9	1629

*Wartości w nawiasach przedstawiają odzyskanie plazminogenu niezwiązanego piku.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób in vitro usuwania lub wyodrębniania plazminogenu lub plazminy, w obecności fibrynogenu, z mieszaniny zawierającej te substancje, znamienny tym, że zawiera etapy, w których kontaktuje się mieszaninę zawierającą plazminogen lub plazminę z aminokwasem o sztywnej strukturze, przy czym odległość między grupą aminową tego aminokwasu a jego grupą karboksylową wynosi

-10 -10 -10

6x10^-10 do 8x10^-10 m, korzystnie 7x10^-10 i aminokwas ten jest kowalencyjnie związany z podłożem poprzez swoją grupę aminową.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę wybraną z grupy obejmującej płyny ustrojowe takie jak krew; frakcje krwi, krioprecypitat, hodowle komórkowe, ekstrakty z tkanek zwierzęcych, takich jak płuca bydlęce, jelita bydlęce lub ekstrakty żelatynowe z kości zwierząt, albuminę z surowicy bydlęcej jak również zwierzęce, nie mieszające się z wodą tłuszcze, takie jak lanolina, PC - fosfatydylo cholina.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się podłoże, które jest podłożem chromatograficznym.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się podłoże chromatograficzne, które jest materiałem hydrofilowym takim jak agaroza, celuloza, szkło o kontrolowanych porach, żele krzemionkowe, dekstrany lub organiczny sztuczny polimer taki jak oparty na poliakryloamidowych polistyrenach.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako materiał chromatograficzny stosuje się agarozę lub sefarozę.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako materiał chromatograficzny stosuje się materiał rozdrobniony lub lity-blokowy.

PL 205 685 B1
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się aminokwas o sztywnej strukturze związany z podłożem za pośrednictwem linkera.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się linker dwufunkcyjny.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się linker dwufunkcyjny wybrany z grupy obejmującej N-hydroksy sukcynoimid, DAPA, CNBr, epoksy, diaminodipropyloaminę (DADPA), 1,6 diaminoheksan, kwas bursztynowy, 1,3 diamino-2-propanol, etylenodiaminę (EDA), TNB, pirydylodisiarczek jodoacetamidu, podłoże aktywowane maleimidem lub kombinacje tych substancji.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się podłoże modyfikowane częścią cząsteczki, która oddziałuje z pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi grupami aminowymi.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się aminokwas o sztywnej strukturze będący kwasem traneksamowym.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że po etapie kontaktowania mieszaniny z podłożem ze związanym kwasem traneksamowym mieszaninę tę inkubuje się z podłożem przez dostatecznie długi czas aby związać plazminogen lub plazminę, po czym plazminogen lub plazminę wymywa się obojętnym roztworem wodnym zawierającym sole sodu, sole wapnia, sole buforujące.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że następnie po skontaktowaniu mieszaniny, plazminę lub plazminogen wymywa się roztworem wodnym zawierającym dostateczną ilość ligandu kompetycyjnego względem miejsc wiązania plazminogenu aminokwasu mającego sztywną strukturę związanego z podłożem.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że ligandem jest lizyna.
15. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę stanowiącą pochodną krwi, krew, frakcję krwi lub krioprecypitat.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się pochodną krwi wybraną z grupy obejmującej czynnik krzepliwości krwi z osocza, mieszaninę czynników krzepliwości krwi, albuminę, immunoglobulinę, fibrynogen, fibronektynę, a₁-antytrypsynę, anty-trombinę III, czynnik von Willebranda.
17. Stałe podłoże powinowactwa do oczyszczania mieszaniny zawierającej fibrynogen i plazminę i/lub plazminogen z plazminy i/lub plazminogenu, znamienne tym, że zawiera kowalencyjnie związany aminokwas o sztywnej strukturze, w którym grupy aminowa i grupa karboksylowa aminokwasu są oddalone od siebie o 6 do 8 x10^-10, korzystnie 7 x10^-10 m.
18. Stałe podłoże według zastrz. 17, znamienne tym, że aminokwas wybrano z grupy obejmującej kwas traneksamowy i kwas 4-aminometylobicyklo-[2,2,2,]-oktano-1-karboksylowy.
19. Stałe podłoże według zastrz. 17 albo 18, znamienne tym, że podłoże jest podłożem chromatograficznym.
20. Stałe podłoże według zastrz. 19, znamienne tym, że podłoże chromatograficzne jest materiałem hydrofilowym takim jak agaroza, celuloza, szkło o kontrolowanych porach, żele krzemionkowe, dekstrany lub organiczny sztuczny polimer, taki jak oparty na poliakryloamidowych polistyrenach.
21. Stałe podłoże według zastrz. 19, znamienne tym, że materiał chromatograficzny jest agarozą lub sefarozą.
22. Stałe podłoże według zastrz. 19, znamienne tym, że materiał chromatograficzny jest materiałem rozdrobnionym lub materiałem litym-blokowym.
23. Stałe podłoże według zastrz. 18, znamienne tym, że kwas traneksamowy jest związany z podłożem poprzez linker.
24. Stałe podłoże według zastrz. 23, znamienne tym, że linker jest linkerem dwufunkcyjnym.
25. Stałe podłoże według zastrz. 24, znamienne tym, że linker dwufunkcyjny wybrano z grupy obejmującej N-hydroksy sukcynoimid, DAPA, CNBr, epoksy, diaminodipropyloaminę (DADPA), 1,6 diaminoheksan, kwas bursztynowy, 1,3 diamino-2-propanol, etylenodiaminę (EDA), TNB, pirydylodisiarczek jodoacetamidu, podłoże aktywowane maleimidem lub kombinacje tych substancji.
26. Stałe podłoże według zastrz. 17, znamienne tym, że podłoże jest modyfikowane częścią cząsteczki, która oddziałuje z pierwszorzędowymi lub drugorzędowymi grupami aminowymi.
27. Krioprecypitat z osocza ludzkiego, otrzymany sposobem określonym w zastrz. 1 do 16, który jest w 85-99% wolny od plazminogenu, a poziom fibrynogenu i fibrynektyny jest niezmieniony.
28. Krioprecypitat z osocza ludzkiego według zastrz. 27, znamienny tym, że jest wolny od plazminy.