SK285804B6

SK285804B6 - DNA sekvencia, ktorá kóduje RAP-2 proteín, replikovateľné expresné vehikulum, transformované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky, RAP-2 proteín, spôsob jeho výroby, protilátky, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Info

Publication number: SK285804B6
Application number: SK1376-2000A
Authority: SK
Inventors: David Wallach; Andrei Kovalenko; Marshall S. Horwitz; Yongan Li
Original assignee: Yeda Research And Development Company Limited; Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University
Priority date: 1998-03-19
Filing date: 1999-03-18
Publication date: 2007-08-02
Also published as: WO1999047672A1; EA200000961A1; PT1062336E; HUP0101612A2; IL126024A0; DE69929958T2; BG109537A; JP2002506644A; BG104769A; JP4351389B2; CA2323637A1; AU760900B2; ES2258838T3; EP1062336A1; PL200763B1; CN1232641C; HK1034995A1; PL343262A1; HUP0101612A3; NZ506776A

Abstract

Poskytnutý je proteín, ktorý je schopný modulovaťalebo sprostredkovať vnútrobunkový účinok RIP v dráhach zápalu, bunkového prežívania a bunkovej smrti. Vynález poskytuje aj DNA, ktorá kóduje tento proteín, spôsob jeho výroby a jeho použitie.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka oblasti receptorov patriacich do TNF/NGF superrodiny receptorov a kontroly ich biologických funkcií. TNF/NGF superrodina receptorov zahŕňa receptory ako napríklad receptory p55 a p75 tumorových nekrotických faktorov (TNF-Rs, tu označované ako p55-R a p75-R) a receptor FAS ligandu (tiež označovaný ako FAS/APO1 alebo FAS-R a tu bude označovaný ako FAS-R) a iné. Konkrétne sa predložený vynález týka RAP-2 proteínu (od RIP-asociovaný proteín-2) a jeho izoforiem, fragmentov a derivátov.

RAP-2 sa viaže na RIP („proteín interagujúci s receptorom“) a je schopný modulovať alebo sprostredkovať funkciu RIP, a tým je schopný aj modulovať alebo prostredkovať, priamo alebo nepriamo, funkciu RIP a iných proteinov, ktoré sa priamo alebo nepriamo viažu na RIP. RAP-2 viažuce proteíny sú modulátormi/mediátormí RAP-2 funkcie.

Doterajší stav techniky

Tumorový nekrotický faktor (TNF-α) a lymfotoxín (TNF-β) (tu používaná skratka TNF sa týka tak TNF-α, ako aj TNF-β) sú multifunkčné pro-zápalové cytokíny vytvárané najmä mononukleámymi fagocytmi, ktoré majú mnoho účinkov na bunky (Wallach, D. (1986) v Interferon 7 (Ion Gresser vyd.) str. 83 až 122, Academic Press, London; a Beutler a Cerami (1987)). Tak TNF-α, ako aj TNF-β iniciujú svoje účinky väzbou na špecifické bunkové receptory. Niektoré účinky sú pravdepodobne pre organizmus výhodné: môžu napríklad zničiť nádorové bunky alebo bunky infikované vírusom a môžu zvýšiť antibakteriálne účinky granulocytov. Týmto spôsobom sa TNF podieľa na obrane organizmu proti nádorom a infekčným činidlám a na zotavení sa z poranenia. Takže TNF je možné použiť ako protinádorové činidlo, pri ktorého aplikácii sa viaže na svoje receptory na povrchu nádorových buniek, a tým spúšťa deje vedúce ku smrtí nádorovej bunky. TNF môže byť použitý aj ako antiinfekčné činidlo.

Ale tak TNF-α, ako aj TNF-β majú aj škodlivé účinky. Je dokázané, že nadprodukcia TNF-α môže mať hlavnú patogenickú úlohu pri niekoľkých ochoreniach. Je napríklad známe, že hlavnými príčinami septického šoku sú účinky TNF-α, primáme na vaskulatúru (Tracey a ďalší, 1986). Pri niektorých ochoreniach môže TNF zapríčiniť nadmernú stratu hmotnosti (kachexia) potlačením účinkov adipocytov a spôsobením anorexie, a preto sa TNF-α nazýva kachektín. Je tiež opísaný ako mediátor poškodenia tkanív pri reumatických ochoreniach (Beutler a Cerami, 1987) a ako hlavný mediátor poškodenia pozorovaného pri reakciách odmietnutia štepu hostiteľom (Piquet a ďalší, 1987). Navyše je známe, že TNF sa podieľa na zápalových procesoch a na mnohých ďalších ochoreniach.

Dva odlišné, nezávisle exprimované receptory, p55 a p75, TNF-Rs, ktoré špecificky viažu TNF-α a TNF-β, iniciujú a/alebo sprostredkúvajú uvedené biologické účinky TNF. Tieto dva receptory majú štruktúrne nepodobné vnútrobunkové domény, čo naznačuje, že prenášajú signál odlišne (pozri Hohmann a ďalší, 1989; Engelmann a ďalší, 1990; Brockhaus a ďalší, 1990; Loetscher a ďalší, 1990; Schall a ďalší, 1990; Nophar a ďalší, 1990; Smith a ďalší, 1990; a Holler a ďalší, 1990). Ale ešte vždy je potrebné odhaliť bunkové mechanizmy, napríklad rôzne proteíny a možné iné faktory, ktoré sú zahrnuté vo vnútrobunkovej signalizácii prostredníctvom p5 5 a p75 TNF-Rs. Je to vnútrobunková signalizácia, ktorá zvyčajne nastáva po naviaza ní sa ligandu, t. j. TNF (a alebo β) na receptor, čím sa začína kaskáda reakcií, ktorej konečným výsledkom je pozorovaná odpoveď bunky na TNF.

Čo sa týka uvedeného cytocídneho účinku TNF, vo väčšine buniek študovaných z tohto hľadiska bol tento účinok spustený najmä prostredníctvom p55 TNF-R. Protilátky proti extracelulámej doméne (ligand viažuca doména) p55 TNF-R môžu samé spustiť cytocídny účinok (pozri EP 412486), ktorý koreluje s účinnosťou receptora krížovo prepojeného protilátkami, čo je považované za prvý krok generovania vnútrobunkového signálneho procesu. Navyše, mutačné štúdie (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993) ukázali, že biologická funkcia p55 TNF-R závisí od integrity vnútrobunkovej domény. V súlade s tým bolo navrhnuté, že iniciácia vnútrobunkovej signalizácie vedúca k cytocídnemu účinku TNF nastáva ako dôsledok asociácie dvoch alebo viacerých vnútrobunkových domén p55 TNF-R. Navyše TNF (a a β) sa vyskytuje ako homotrimér, a sám osebe je navrhnutý ako faktor, ktorý indukuje vnútrobunkovú signalizáciu prostredníctvom p55 TNF-R tak, že je schopný viazať sa na a prepájať sa s molekulami receptora, t.J. spôsobovať agragáciu receptora.

Ďalším členom TNF/NGF superrodiny receptorov je FAS receptor (FAS-R), ktorý bol označený ako FAS antigén, pričom ide o bunkový povrchový proteín exprimovaný v rôznych tkanivách, ktorý je homologický s množstvom bunkových povrchových receptorov vrátane TNF-R a NGF-R. FAS-R sprostredkúva bunkovú smrť vo forme apoptózy (Itoh a ďalší, 1991) a zdá sa, že slúži ako negatívny selektor autoreaktívnych T buniek, t. j. počas dozrievnania T buniek, FAS-R spôsobuje apoptickú smrť T buniek, ktoré rozoznávajú vlastné antigény. Zistilo sa tiež, že mutácie vo FAS-R géne (Ipr) spôsobujú poruchu lymfoproliferácie pri myšiach, ktorá sa podobá ľudskému autoímunitnému ochoreniu - systémovému lupus erytematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga a ďalší, 1992). Zdá sa, že ligandom pre FAS-R je molekula spojená s bunkovým povrchom, ktorú, okrem iných nesú zabíjačské T bunky (alebo cytotoxické T lymfocyty- CTLs). Takže, keď sa takéto CTLs dostanú do kontaktu s bunkami nesúcimi FAS-R, sú schopné indukovať apoptickú bunkovú smrť buniek nesúcich FAS-R. Navyše bola pripravená monoklonálna protilátka, ktorá je špecifická pre FAS-R, a táto protilátka je schopná indukovať apoptickú bunkovú smrť v bunkách nesúcich FAS-R, vrátane myšacích buniek transformovaných cDNA, ktorá kóduje ľudský FAS-R (Stoh a ďalší, 1991).

Prihlasovatelia použili množstvo prístupov (pozri napríklad európske prihlášky č. EP 186833, EP 308378, EP 398327 a EP 412486) na regulovanie ničivých účinkov TNF prostredníctvom inhibovania viazania sa TNF na jeho receptory použitím anti-TNF protilátok alebo použitím rozpustných TNF receptorov, ktoré konkurovali viazaniu sa TNF na TNF-Rs naviazané na povrch. Navyše, vychádzajúc zo skutočnosti, že TNF viazanie sa na jeho receptory je potrebné pre TNF-indukované bunkové účinky, prihlasovatelia použili prístupy (pozri napríklad EP 568925) na modulovanie TNF účinku modulovaním aktivity TNF-Rs.

V stručnosti, EP 568925 sa týka spôsobu modulovania prenosu signálu a/alebo štiepenia v TNF-Rs, ktorým môžu peptidy alebo iné molekuly interagovať buď so samotným receptorom, alebo s efektorovými proteínmi interagujúcimi s receptorom, a tak modulovať normálnu funkciu TNF-Rs. V EP 568925 je opísaná konštrukcia a charakterizácia rôznych mutantných foriem p55 TNF-Rs, ktoré majú mutácie v extracelulámej, transmembránovej a vnútrobunkovej doméne. Týmto spôsobom sa identifikovali oblasti v uvedených doménach p55 TNF-R, ktoré sú nevyhnutné na fun govanie receptora, t. j. pre väzbu ligandu (TNF) a následný prenos signálu a na vnútrobunkovú signalizáciu, ktorej konečným výsledkom je TNF účinok pozorovaný na bunkách. Ďalej, uvedený dokument opisuje množstvo postupov na izoláciu a identifikáciu proteínov, peptidov alebo iných faktorov, ktoré sú schopné viazať sa na rôzne oblasti uvedených domén TNF-R, pričom tieto proteíny, peptidy a iné faktory sa môžu podieľať na regulácii alebo modulovaní aktivity TNF-R. V EP 568925 je uvedené aj množstvo postupov na izolovanie a klonovanie DNA sekvencií kódujúcich takéto proteíny a peptidy; na konštrukciu expresných vektorov na produkciu týchto proteínov a peptidov; a na prípravu protilátok alebo ich fragmentov, ktoré interagujú s TNF-R alebo uvedenými proteinmi a peptidmi, ktoré sa viažu na rôzne oblasti TNF-R. Ale EP 568925 nešpecifikuje konkrétne proteíny a peptidy, ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs (napr. p55 TNF-R), ani neopisuje kvasinkový dvojhybridný postup na izoláciu a identifikáciu takých proteínov alebo peptidov, ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs. Podobne, EP 568925 neopisuje proteíny alebo peptidy, ktoré sú schopné viazať sa na vnútrobunkovú doménu FAS-R.

Hoci je známe, že receptory pre tumorový nekrotický faktor (TNF) a štruktúrne príbuzný receptor FAS-R spúšťajú po stimulácii ligandmi produkovanými leukocytmi deštrukčné aktivity v bunkách, ktoré vedú k ich usmrteniu, je mechanizmus tohto spustenia ešte stále málo pochopený. Z mutačných štúdií vyplýva, že FAS-R a p55 TNF receptorový (p55-R) prenos cytotoxického signálu zahŕňa rôzne oblasti vnútri ich vnútrobunkových domén (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993; Itoh a Nagata, 1993). Tieto oblasti („smrtiace domény“) majú podobné sekvencie. „Smrtiace domény“ tak FAS-R, ako aj p55-R majú tendenciu spájať sa samc so sebou. Je zrejmé, že toto vzájomné spájanie podporuje agregovanie receptorov, ktoré je potrebné na iniciovanie prenosu signálu (pozri Song a ďalší, 1994; Wallach a ďalší, 1994; Boldin a ďalší, 1995), a výsledkom vysokých úrovní receptorovej expresie môže byť spustenie ligand-závislého prenosu signálu (Boldin a ďalší, 1995).

Podobne ako iné účinky indukované receptorom, indukcia bunkovej smrti TNF receptormi a FAS-R nastáva prostredníctvom série proteín-proteín interakcií, ktoré vedú od väzby ligandu na receptor k eventuálnej aktivácii enzymatických efektorových funkcií, pričom v prípade štúdií boli odhalené neenzymatické protein-protein interakcie, ktoré iniciujú prenos signálu pre bunkovú smrť: naviazanie trimémych TNF alebo FAS-R ligandových molekúl na receptory, čo sú výsledné interakcie ich vnútrobunkových domén (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993; Itoh a Nagata, 1993), ktoré sú zosilnené náchylnosťou motívov smrtiacich domén navzájom asociovať (Boldin a ďalší, 1995a) a indukované väzbou dvoch cytoplazmatických proteínov (ktoré sa môžu viazať aj navzájom) na receptorové vnútrobunkové domény - MORT-1 (alebo FADD) na FAS-R (Boldin a ďalší, 1995b; Chinnaiyan a ďalší, 1995; Kischkel a d’laší, 1995) a TRADD na p55-R (Hsu a ďalší, 1995; Hsu a ďalší, 1996). Kvasinkovým dvojhybridným skríningovým postupom sa identifikovali tri proteíny, ktoré sa viažu na vnútrobunkovú doménu FAS-R a p55-R v oblasti „smrtiacej domény“ podieľajúcej sa na indukcii bunkovej smrti prostredníctvom receptorov cez heteroasociovanie homologických oblastí, a ktoré sú tiež schopné nezávisle spustiť bunkovú smrť. Jedným z nich je proteín MORT-1 (Boldin a ďalší, 1995b), tiež známy ako FADD (Chinnaiyan a ďalší, 1995), ktorý sa špecificky viaže na FAS-R. Druhý, TRADD (pozri aj Hsu a ďalší, 1995, 1996) sa viaže na p55-R, a tretí, RIP (pozri aj Stanger a ďalší, 1995) sa viaže tak na FAS-R, ako aj na p55-R. Okrem toho, že sa viažu na FAS-R a p55-R, sú tieto proteíny schopné aj viazať sa navzájom, čo poskytuje funkčnú krížovú komunikáciu medzi FAS-R a p55-R. Tieto väzby sa uskutočňujú prostredníctvom konzervatívneho sekvenčného motívu, „smrtiaceho doménového modulu“, ktorý je spoločný pre receptory a ich asociované proteíny. Navyše, hoci kvasinkový dvojhybridný test ukázal, že MORT-1 sa spontánne viaže na FAS-R, v cicavčích bunkách sa táto väzba uskutočňuje len po stimulácii receptora, čo naznačuje, že MORT-1 sa podieľa na úvodných dejoch FAS-R signalizácie. MORT-1 neobsahuje žiadny sekvenčný motív, pre ktorý by bola typická enzymatická aktivita, takže sa zdá, že jeho schopnosť spustiť bunkovú smrť nezahŕňa vnútorný účinok samotného MORT-1, ale skôr aktiváciu nejakého iného proteínu (proteínov), ktorý sa viaže na MORT-1, a účinkuje v signalizačnej kaskáde následne. Ukázalo sa, že bunková expresia MORT-1 mutantov, ktorým chýba N-koncová časť molekuly, blokuje cytotoxickú indukciu sprostredkovanú FAS/APO1 (FAS-R) alebo p55-R (Hsu a ďalší, 1996; Chinnaiyan a ďalší, 1996), z čoho vyplýva, že N-koncová časť prenáša signál pre cytocídny účinok oboch receptorov prostredníctvom proteín-proteín interakcií.

Takže je zrejmé, že motívy „smrtiacej domény“ receptorov p55-R a FAS-R, ako aj ich troch asociovaných proteínov MORT-1, RIP a TRADD sú miestami proteín-proteín interakcií. Tri proteíny MORT-1, RIP a TRADD interagujú s p55-R a FAS-R vnútrobunkovými doménami väzbou ich smrtiacich domén na smrtiace domény receptorov, a tak pri RIP, ako aj pri TRADD asociujú ich smrtiace domény sami so sebou, (hoci MORT-1 sa v tomto ohľade líši v tom, že jeho smrtiaca doména neasociuje sama so sebou). Navyše, MORT-1 a TRADD sa odlišne viažu na FAS-R a p55-R a viažu sa tiež navzájom. Tak MORT-1, ako aj TRADD sa účinne viažu na RIP. V súlade s tým by sa mohlo zdať, že interakcia medzi troma proteinmi MORT-1, RIP a TRADD jc dôležitou časťou celkovej modulácie vnútrobunkovej signalizácie sprostredkovanej týmito proteinmi. Výsledkom interferencie interakcie medzi týmito troma vnútrobunkovými proteinmi bude modulácia účinkov spôsobených touto interaciou. Napríklad, inhibicia TRADD viazania sa na MORT-1 môže modulovať FAS-R-p55 TNF-R interakciu. Podobne, inhibicia RIP okrem uvedenej inhibície TRADD väzby na MORT-1 môže navyše modulovať FAS-R-p55 TNF-R interakciu.

Monoklonálne protilátky vyvolané proti „smrtiacej doméne“ p55-R, konkrétne proti väzobným miestam TRADD a RIP môžu byť tiež použité na inhibíciu alebo prevenciu väzby týchto proteínov, a tak spôsobovať moduláciu interakcie medzi FAS-R a p55-R.

V súčasnosti sa zistilo, že okrem uvedených bunkových cytotoxických účinkov a ich modulácie prostredníctvom rôznych receptorov a ich väzobných proteínov vrátane FAS-R, p55-R, MORT-1, TRADD, RIP, MACH, Mch4 a Gl, môže sa množstvo týchto receptorov a ich väzobných proteínov podieľať aj na modulovaní aktivity jadrového transkripčného faktora NF-κΒ, ktorý je kľúčovým mediátorom bunkového prežívania alebo životaschopnosti, keďže je zodpovedný za kontrolu expresie mnohých imunitné a zápalovo responzívnych génov. Napríklad sa zistilo, že TNF-α v skutočnosti stimuluje aktiváciu NF-κΒ, a tak je TNF-α schopný indukovať dva typy signálu v bunkách, jedným je vyvolanie bunkovej smrti a druhým je ochrana bunky pred indukciou smrti indukovaním génovej expresie prostredníctvom NF-κΒ (pozri Beg a Baltimore, 1996; Wang a ďalší, 1996; Van Antwerp a ďalší, 1996). Podobný duálny účinok bol publikovaný aj pre FAS-R (pozri citácie týkajúce sa tohto účinku uvedené vo Van Antwerp a ďalší, 1996). Malo by byť preto zrejmé, že existuje jemná rovnováha medzi bunkovou smrťou a prežívaním bunky pri stimulácii rôznych typov buniek s TNF-α a/alebo FAS-R ligandom, pričom finálny výstup stimulácie je závislý od toho, ktorá vnútrobunková dráha sa stimuluje vo väčšom rozsahu, či dráha vedúca k bunkovej smrti (zvyčajne apoptóza) alebo dráha vedúca k bunkovému prežívaniu prostredníctvom aktivácie NF-kB.

Navyše, pôvodcovia predloženého vynálezu v súčasnosti podrobnejšie objasnili možnú dráhu, ktorou členovia TNF/NGF receptorovej rodiny aktivujú NF-κΒ (pozri Malinin a ďalší, 1997 a rôzne tam uvedené relevantné citácie; a spoločne vlastnené izraelské prihlášky č. IL117800 s IL119133, ktoré sú paralelne v konaní). V stručnosti, zistilo sa, že niekoľko členov TNF/NGF receptorovej rodiny je schopných aktivovať NF-κΒ prostredníctvom spoločného adaptorového proteínu, TRAF2. Novoobjavená proteín kináza nazvaná NIK (pozri Malinin a ďalší, 1997 a IL 117800 a IL119133) je schopná viazať sa na TRAF2 a stimulovať NF-κΒ aktivitu. V skutočnosti sa ukázalo (pozri uvedenú publikáciu Malinin a ďalší a IL prihlášky), že výsledkom expresie kináz-deficientných NIK mutantov sú bunky, v ktorých nie je možné stimulovať NF-κΒ normálnym endogénnym spôsobom a tiež bunky, ktoré sú blokované v indukcii NF-κΒ aktivity prostredníctvom TNF aj FAS-R, a ktoré sú blokované v induckcii NF-κΒ prostredníctvom TRADD, RIP a MORT-1 (čo sú adaptorové proteíny, ktoré sa viažu na p55-R a/alebo FAS-R receptory). Všetky receptory p55-R, p75-R, FAS-R a ich adaptorové proteíny MORT-1, TRADD a RIP sa priamo alebo nepriamo viažu na TRAF2, ktorý svojou schopnosťou viazať sa na NIK zjavne moduluje indukciu NF-kB,

Je zrejmé, že z uvedených modulačných proteínov, ktoré sa podieľajú na jemnej rovnováhe medzi bunkovou smrťou a prežívaním po stimulácií FAS-R a/alebo p55-R, má dôležitú úlohu RIP. RIP (pozri Stanger a ďalší, 1995 a aj Malinin a ďalší, 1997) má „smrtiacu doménu“ v svojej C-terminálnej oblasti, ktorá umožňuje indukciu bunkovej cytotoxicity nezávislým spôsobom a aj asociáciou so smrtiacimi doménami MORT-1, p55-R, FAS-R a TRADD. RIP má aj proteín kinázovú doménu vo svojej N-terminálnej oblasti a prostrednú doménu, ktorá sa považuje za schopnú intersekcie (viazania sa) s TRAF2 a teda za doménu, ktorá sa podieľa na indukcii NF-κΒ. V súlade s tým sú podrobnosti týkajúce sa vlastností a sekvencií (DNA a aminokyselinových) RIP uvedené v uvedených publikáciách (najmä v Stanger a ďalší, 1995) zahrnuté do tohto opisu ich citáciou.

TNF je aj jedným z cytokinov, ktoré sa podieľajú na iniciovaní a modulovaní proti vírusovej obrany hostiteľa. Podobne, vyvinuli sa vírusy, ktoré exprimujú gény, ktorých proteíny regulujú aktivitu cytokinov a tieto cytokínregulačné vírusové proteíny sú považované za proteíny napomáhajúce perzistencii vírusu vnútri živočíšneho hostiteľa. Jedným z najlepšie preštudovaných príkladov takéhoto proteínu je E3-14.7K zo skupiny C ľudských adcnovírusov (Ad) typov 2 a 5, ktorý účinkuje ako silný antagonista TNF-sprostredkovanej cytolýzy.

S cieľom izolovať molekulové komponenty TNF signalizačnej kaskády, ktoré sú cieľmi pre E3-I4.7K pri vírusovej infekcii, izoloval sa v súčasnosti ľudský proteín viažuci E3-14.7K dvojhybridným skríningom (FIP-2 od Fourteen-K Interacting Proteín, Li Y. a ďalší, 1998). Zistilo sa, že FIP-2 je sám osebe netoxický a neguje ochranný účinok E3-14.7K na cytotoxicitu indukovanú nadexpresiou TNFR-J alebo RIP, bez toho, aby sa viazal na nejaký z uvedených proteínov. Zistilo sa, že FIP-2 je homologický s RAP-2, proteínom podľa predloženého vynálezu. Ale stupeň celkovej podobnosti medzi RAP-2 a FIP-2 je dosť nízky, ako je zrejmé z celkového porovnania dvoch aminokyselinových sekvencií (obrázok 3). Homológia sa však stáva významnejšou v konkrétnych oblastiach smerom k C-koncu proteínov, a kulminuje skutočnou zhodou 30 C-koncových aminokyselín. Je pozoruhodné, že okrem uvedenej Ckoncovej domény, jc v RAP-2 značne konzervovaný motív leucínového zipsu z FIP-2 (okrem íle na Ala substitúcie).

Podobne sa v súčasnosti dodala do GenBank sekvencia označená ako HYPL, ktorá kóduje proteín týkajúci sa Huntingtonovej choroby, a zdá sa, že je vzdialeným homológom RAP-2, s názvom „proteín interagujúci s huntingtínom, HYPL“ (prístupové číslo AF049614). Ale publikácia opisujúca funkciu proteínu ešte nebola zverejnená.

Súčasná publikácia od Yamaoka S. a ďalší (1998) zverejňuje identifikáciu hlodavčieho RAP-2 homológu. Hlodavčí homológ NEMO (od NF-κΒ esenciálny modulátor) sa identifikoval pri prehľadávaní kľúčových molekúl, ktoré regulujú aktiváciu NF-κΒ signalizácie. Charakterizoval sa plochý bunkový variant HTLV-I Tax transformovaných potkaních fibroblastov, označený 5R, ktorý neodpovedal na žiadne NF-κΒ aktivačné stimuly (LPS, PMA, IL-I, TNF) a uskutočnila sa jeho genetická komplementácia. Výsledkom tohto postupu bola izolácia cDNA, ktorá kóduje NEMO 48kD proteín. Na základe týchto údajov je možné tvrdiť, že tento proteín nie je prítomný v 5R bunkách, je časťou Ικ B-kinázového komplexu s vysokou molekulovou hmotnosťou a je potrebný na jeho vytvorenie. In vitro môže NEMO homodimerizovať a priamo interagovať s ΙΚΚβ.

V opise izraelského patentu č. 120485 je uvedený RIP-asociovaný proteín, označený ako RAP, ktorý sa špecificky viaže na RIP a inhibuje indukciu NF-kB.

Opis izraelského patentu č. 123758 sa týka iného RIP-asociovaného proteínu, označeného ako RAP-2, ktorý má rovnaké alebo podobné účinky.

RAP-2 podľa vynálezu sa nazýva aj 303 alebo RAP-303 alebo RAT-303. Kvôli prehľadnosti sa tu ďalej bude označovať ako RAP-2.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je proteín RAP-2, vrátane všetkých jeho izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov, ktorý je schopný viazať sa na RIP proteín (tu ďalej označovaný ako „RIP“), ktorý je kódovaný definovanou DNA sekvenciou. Keďže RIP je schopný priamo alebo nepriamo interagovať s vnútrobunkovými mediátormi zápalu, bunkovej cytotoxicity/bunkovej smrti, ako p55-R a FAS-R a ich asociovanými adaptorovými alebo modulátorovými proteínmi, ako napríklad MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, Gl a inými, sú nové proteíny podľa vynálezu prostredníctvom viazania sa na RIP schopné ovplyvniť vnútrobunkový signalizačný proces iniciovaný viazaním sa FAS ligandu na svoj receptor a viazaním sa TNF na svoj receptor (p55-R), a sme osebe sú nové proteíny podľa predloženého vynálezu modulátormi p55-R a FAS-R- sprostredkovaných účinkov na bunky. RIP je schopný aj interagovať s TRAF2, a tým je schopný priamo alebo nepriamo interagovať s NIK, a tak RIP slúži ako modulátor zápalových a bunkových prežívacích dráh, ktoré zahŕňajú indukciu NF-κΒ, takže nové proteíny podľa predloženého vynálezu sú modulátormi zápalového a bunkového prežívacieho účinku závislého od RIP. Podobne môžu byť proteíny podľa predloženého vynálezu prostredníctvom FAS-R, p55-R a ich modulačných proteínov MORT-1 a TRADD, ktoré sú schopné indukovať NF-kB a bunkové prežívanie priamym alebo nepriamym viazaním sa na RIP alebo viazaním sa na TRAF2, na ktorý sa viaže RIP, aj mediátormi procesov bunkového prežívania, prostredníctvom operovania cez spoločné alebo príbuzné vnútrobunkové signalizačné dráhy, v ktorých operujú rôzne uvedené proteíny, aby sa indukovalo prežívanie bunky. Podobne, keďže p75-R sa viaže na TRAF2, na ktorý sa viaže RIP, môžu byť nové proteíny podľa vynálezu aj modulátormi RIP-sprostredkovaného účinku prostredníctvom p75R.

Iným predmetom vynálezu je poskytnúť protilátky proti uvedenému RAP-2 proteínu, jeho izoformám, analógom, fragmentom a derivátom, ktoré môžu byť použité na inhibíciu signalizačného procesu, alebo konkrétnejšie na inhibíciu zápalovej bunkovej cytotoxicity alebo procesov bunkového prežívania, ak je to želateľné.

Ďalším predmetom vynálezu je použitie uvedeného RAP-2 proteínu, jeho izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov na izoláciu a charakterizáciu ďalších proteínov alebo faktorov, ktoré sa môžu podieľať na regulácii receptorovej aktivity, napr. iných proteínov, ktoré sa môžu viazať na RAP-2 proteín a ovplyvňovať ich účinok a/alebo na izoláciu a identifikáciu iných receptorov, ktoré pôsobia v signalizačných procesoch predtým alebo následne, a na ktoré sa tieto proteíny, analógy, fragmenty a deriváty viažu, a tým sa podieľajú aj na ich funkcii.

Ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť protilátky, ktoré môžu byť zavedené do buniek, aby sa viazali alebo interagovali s RAP-2 a možnými RAP-2 izoformami, pričom môžu pôsobiť ako inhibítory účinku asociovaného s RIP v bunkových cytotoxických procesoch a tým, ak je to želateľné, posilniť bunkové prežívanie, alebo môžu pôsobiť ako inhibítory účinku asociovaného s RIP v bunkových prežívacích procesoch a tým, ak je to želateľné, posilniť bunkovú cytotoxicitu.

Navyše, predmetom predloženého vynálezu je použitie uvedeného RAP-2 proteínu, jeho izoforiem a analógov, fragmentov a derivátov ako antigénov na prípravu polyklonálnych a/alebo monoklonálnych protilátok proti nim. Naopak, protilátky môžu byť použité napríklad na purifikáciu nových proteínov z odlišných zdrojov, ako bunkových extraktov alebo transformovaných bunkových línií.

Navyše, tieto protilátky môžu byť použité na diagnostické účely, napr. na identifikáciu porúch týkajúcich sa abnormálnej funkcie bunkových účinkov sprostredkovaných p55-R, FAS-R alebo inými príbuznými receptormi.

Ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú uvedený RAP-2 proteín, jeho izoformy alebo analógy, fragmenty alebo deriváty, ako aj farmaceutické prostriedky obsahujúce uvedené protilátky alebo iné antagonisty.

Podľa predloženého vynálezu bol izolovaný nový protein RAP-2. RAP-2 je schopný viazať sa na alebo interagovať s RIP, takže je modulátorom alebo mediátorom RIP vnútrobunkového účinku. RIP sa podieľa na modulácii alebo sprostredkovaní vnútrobunkových signalizačných dráh, napr. bunkovej cytotoxicity alebo dráhy spojenej s bunkovou smrťou, pričom RIP má v nich cytotoxický účinok samotný, ale aj v spojení, priamom alebo nepriamom s množstvom iných proteínov spojených s bunkovou smrťou, ako napríklad MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, Gl, p55-R a FAS-R, s ktorými sa RIP môže asociovať alebo viazať priamym alebo nepriamym spôsobom prostredníctvom motívu/modulu „smrtiacej domény“, ktorá sa nachádza v RIP a vo všetkých uvedených proteinoch. Ďalšou dráhou, v kto rej môže mať RIP aktívnu úlohu, priamo alebo nepriamo prostredníctvom prítomnosti kinázového motívu alebo domény nachádzajúcej sa v RIP a schopnosti RIP viazať sa na TRAF2, ktorý sa môže viazať na NIK, ktorá sa priamo podieľa na aktivácii NF-κΒ, ktorý má hlavnú úlohu pri zápale a bunkovom prežívaní, je zápalová dráha, dráha bunkového prežívania alebo dráha životaschopnosti. Navyše p55-R je schopný aj interagovať s TRADD a TRAF2 (prostredníctvom TRADD) a podieľa sa aj na aktivácii NF-κΒ a tým na dráhe bunkového prežívania, a teda RIP, ktorý je schopný viazať sa na alebo interagovať s FAS-R, TRADD a p55-R (cez TRADD), ako aj s TRAF2, sa môže podieľať, prostredníctvom týchto proteínov, aj na modulovaní zápalu a aktivovaní bunkového prežívania. Z toho vyplýva, že RIP je modulátorom alebo mediátorom týchto dráh a podobne, nový RAP-2 podľa vynálezu je prostredníctvom väzby na RIP modulátorom alebo mediátorom týchto vnútrobunkových dráh.

RAP-2 sa izoloval a klonoval použitím kvasinkového dvojhybridného systému, sekvenoval a charakterizoval sa, ako je podrobne opísané. Je zrejmé, že RAP-2 je vysoko špecifickým proteínom viažucim RIP, a teda špecifickým RIP modulátorom/mediátorom. RAP-2 sa neviaže na TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R a MACH. Ďalej je zrejmé, že RAP-2 nemá charakteristický modul alebo motív smrtiacej domény, čo je v súlade so zistením, že RAP-2 sám osebe neindukuje bunkovú cytotoxicitu.

Tu používaný výraz RIP účinok je mienený tak, že zahŕňa jeho účinok pri modulovaní/sprostredkovaní v zápalovej dráhe a v dráhach bunkovej smrti alebo prežívania. Tieto účinky vyplývajú z tu uvedeného opisu, ako aj zo všetkých uvedených publikácií a patentových prihlášok, ktorých kompletný obsah je tu zahrnutý ich citáciou. Podobne, tu používaný výraz RAP-2 účinok je mienený tak, že zahŕňa jeho modulovanie/sprostredkovanie RIP účinku prostredníctvom jeho špecifickej väzby na RIP, pričom táto modulácia/sprostredkovanie RIP prostredníctvom RAP-2 zahŕňa moduláciu/sprostredkovanie zápalu, bunkovej smrti a dráhy bunkového prežívania, na ktorých sa RIP priamo alebo nepriamo podieľa, a sám osebe môže byť RAP-2 považovaný za nepriamy modulátor/mediátor všetkých uvedených proteínov a je možné, že aj množstva iných, ktoré sa podieľajú na zápale, bunkovej smrti alebo bunkového prežívania, a na ktorý sa RIP viaže, alebo s ktorým RIP interaguje priamym alebo nepriamym spôsobom.

Takže je zrejmé, že RAP-2 je špecifický RIP-viažuci proteín, a teda modulátor/mediátor RIP vnútrobunkového účinku. RAP-2 viažuci proteín má prostredníctvom svojej schopnosti viazať RAP-2 nepriamy vplyv na RIP, a je aj modulátorom/mediátorom RIP vnútrobunkového účinku.

Takže ako je zrejmé, RAP-2 má úlohu pri modulovani/sprostredkovaní zápalu, bunkového prežívania a/alebo bunkovej smrti, na ktorých sa podieľa RIP, priamo alebo nepriamo, najmä pri procesoch, ktoré sa týkajú cytotoxicity a zápalu spôsobených alebo indukovaných rôznymi stimulmi vrátane stimulov prenášaných cez receptory TNF/NGF receptorovej rodiny, ako aj možnými inými stimulmi (pozri schému RIP podielu na týchto vnútrobunkových dejoch, a tým aj schcmu RAP-2 podielu, na obrázku 1 v Malinin a ďalší, 1997).

RAP-2 môže slúžiť aj ako inhibítor bunkovej cytotoxicity a zápalu prostredníctvom jeho prítomnosti ako časti komplexu s inými proteínmi, napr. RIP a proteínmi viazanými na RIP, a tak môže ovplyvniť cytotoxické alebo zápalové účinky týchto iných proteínov (napr. p55-R, FAS-R,

MACH, Mch4, Gl a MORT-1), ktorých konečným výsled5 kom je inhibícia ich cytotoxického účinku alebo ich účinku pri zápale.

RAP-2 môže slúžiť aj ako zosilňovať bunkovej cytotoxicity a zápalu, a to zosilnením účinku iných proteínov, napr. RIP a iných proteínov viažucich sa na RIP, ako je uvedené, prostredníctvom napomáhania zhromažďovaniu týchto proteínov cez RIP. Zhromažďovanie slúži na zosilnenie cytotoxického účinku rôznych proteínov alebo na zosilnenie ich zápalových účinkov.

Podobne môže RAP-2 analogickým spôsobom slúžiť ako inhibítor alebo zosilňovač bunkovej prežívacej dráhy, ako bolo uvedené, prostredníctvom podielania sa RIP na tejto dráhe.

V súlade s tým poskytuje predložený vynález DNA sekvenciu, ktorá kóduje RIP-asociovaný proteín - RAP-2, jeho izoformy, analógy alebo fragmenty, ktoré sú schopné viazať sa na RIP amodulovať alebo sprostredkovať vnútrobunkovú aktivitu RIP, pričom je vybraná zo skupiny, ktorá pozostáva z:

(a) DNA sekvencie kódujúcej RAP-2 proteín, ako je znázornený na obrázku 3, (b) DNA sekvencie uvedenej ako SEQ ID NO: 1 alebo 2, (c) DNA sekvencie schopnej hybridizovať so sekvenciou podľa (a) alebo (b) za prísnych podmienok, a ktorá kóduje biologicky aktívny RAP-2 proteín, (d) DNA sekvencie, ktorá je degenerovaná v dôsledku genetického kódu na DNA sekvenciu definovanú v (a) alebo (b) a ktorá kóduje biologicky aktívny RAP-2 proteín, a (e) DNA sekvencie podľa (b) kódujúcej RAP-2 proteín, izoformu, analóg alebo fragment, ktoré majú aspoň časť sekvencie, ako je znázornená na obrázku 3.

Predložený vynález poskytuje RAP-2 proteíny, ich analógy, fragmenty alebo deriváty kódované ktoroukoľvek z uvedených sekvencií podľa vynálezu, ktoré sú schopné viazať sa na RIP a modulovať/sprostredkovať jeho biologický účinok vo vnútrobunkových dráhach bunkovej smrti a'alebo bunkového prežívania.

Predložený vynález poskytuje aj replikovateľné expresné nástroje, ktoré zahŕňajú uvedenú DNA. Tieto replikovateľné expresné nástroje sú schopné byť exprimované vo vhodných eukaryotických alebo prokaryotických hostiteľských bunkách. Vynález ďalej poskytuje transformované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky obsahujúce takéto replikovateľné expresné nástroje; a spôsob produkcie RAP-2 proteínu alebo analógov, fragmentov alebo derivátov podľa vynálezu pestovaním takýchto transformovaných hostiteľských buniek v podmienkach, ktoré sú vhodné na expresiu uvedeného proteínu, analógov, fragmentov alebo derivátov, uskutočňovaním posttranslačných modifikácií uvedeného proteínu, ak je to nevyhnutné na získanie proteínu a extrahovaním expnmovaného proteínu, analógov, fragmentov alebo derivátov z kultivačného média transformovaných buniek alebo z bunkových extraktov transformovaných buniek. Uvedené definície zahŕňajú všetky izoformy RAP-2 proteínu.

Iným predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť aj protilátky alebo ich aktívne deriváty, alebo fragmenty, ktoré špecificky reagujú s biologicky aktívnou RAP-2 proteínovou časťou RAP-2 proteínu, jeho analógmi, fragmentmi a derivátmi podľa vynálezu.

Ešte iným predmetom vynálezu je poskytnúť rôzne použitia uvedených DNA sekvencií alebo proteínov, ktoré sú nimi kódované, podľa vynálezu. Tieto použitia okrem iného zahŕňajú:

(i) Použitie na moduláciu vnútrobunkových dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú modulované alebo sprostredkované proteínom RIP, ktorý za hŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými RAP-2 proteínmi, jeho izoformami, analógmi, fragmentmi alebo derivátmi, ktoré sú schopné viazať sa na RIP, pričom toto ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo viacerých proteínov, jeho izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná na ich vnútrobunkové zavedenie, alebo zavedenie DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero proteínov, izoforiem, analógov alebo derivátov do bunky vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť začlenenie sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa táto sekvencia v bunkách exprimuje.

(ii) Použitie na moduláciu vnútrobunkových dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú modulované ligandmi TNF rodiny prostredníctvom účinku na bunky cez pôsobenie RIP proteínu podľa bodu (i), pričom ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie proteínu, jeho izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná na ich vnútrobunkové zavedenie alebo zavedenie DNA sekvencie kódujúcej G1 proteín alebo jeho izoformy, analógy alebo deriváty do bunky vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť začlenenie sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa táto sekvencia v bunkách exprimuje.

(iii) Použitie podľa uvedeného bodu (ii), v ktorom sa ošetrenie buniek uskutočňuje transfekciou buniek rekombinantným živočíšnym vírusovým vektorom a zahŕňa nasledujúce kroky:

a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora, ktorý nesie sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín (ligand) schopný viazať sa na špecifický bunkový povrchový receptor na povrchu bunky nesúcej FAS-R alebo p55-R, a druhú sekvenciu, ktorá kóduje proteín vybraný zo skupiny zahŕňajúcej RAP-2 proteín a jeho izoformy, analógy, fragmenty a deriváty, pričom tento vektor, keď je exprimovaný v bunkách, je schopný modulovať/sprostredkovať vnútrobunkové dráhy zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania; a

b) infikovanie buniek vektorom podľa bodu a).

(iv) Použitie na moduláciu dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom ligandov TNF rodiny na bunky prostredníctvom účinku RIP proteínu, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek protilátkami alebo ich aktívnymi fragmentmi alebo derivátmi podľa vynálezu, pričom ošetrenie sa uskutočňuje aplikáciou vhodného prostriedku, ktorý obsahuje protilátky, ich aktívne fragmenty alebo deriváty, na bunky, pričom ak aspoň časť RAP-2 proteínu je vystavená na extracelulámom povrchu, prostriedok je formulovaný na extracelulárnu aplikáciu, a keď sú RAP-2 proteíny úplne vnútrobunkové, prostriedok je formulovaný na vnútrobunkovú aplikáciu.

(v) Použitie na moduláciu dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom ligandov TNF rodiny na bunky prostredníctvom účinku RIP proteínu, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek oligonukleotidovou sekvenciou kódujúcou antisensc sekvenciu aspoň časti RAP-2 proteínovej sekvencie podľa vynálezu, pričom oligonukleotidová sekvencia je schopná blokovať expresiu RAP-2 proteínu.

(vi) Použitie podľa uvedeného bodu (ii) na ošetrenie nádorových buniek alebo buniek infikovaných HIV, alebo iných chorých buniek, ktorý zahŕňa:

a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora, ktorý nesie sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín schopný viazať sa na špecifický povrchový receptor nádorovej bunky alebo na povrchový re6 cepíor HlV-infikovanej bunky, alebo na receptor nesený inými chorými bunkami a sekvenciu kódujúcu proteín vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa RAP-2 proteín, analógy, fragmenty a deriváty podľa vynálezu, ktorý, keď sa exprimuje v nádorovej, HlV-infikovanej alebo inej chorej bunke, je schopný usmrtiť uvedenú bunku pôsobením RIP proteínu; a

b) infikovanie nádorových alebo HIVinfikovaných, alebo iných chorých buniek vektorom podľa bodu a).

(vii) Použitie na moduláciu dráh bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom ligandov TNF rodiny na bunky prostredníctvom pôsobenia RIP proteínu, ktorý zahŕňa aplikovanie ribozýmového postupu, v ktorom sa vektor kódujúci ribozýmovú sekvenciu schopnú interagovať s bunkovou mRNA sekvenciou kódujúcou RAP-2 proteín podľa vynálezu, zavádza do buniek vo forme, ktorá umožňuje expresiu ribozýmovej sekvencie v bunkách, pričom keď sa ribozýmová sekvencia exprimuje v bunkách, interaguje s bunkovou mRNA sekvenciou a štiepi mRNA sekvenciu, čoho výsledkom je inhibícia expresie RAP-2 proteínu v bunkách.

(viii) Použitie vybrané z uvedených použití podľa vynálezu, v ktorom RAP-2 proteín kódujúca sekvencia zahŕňa najmenej jednu z RAP-2 izoforiem, ich analógov, fragmentov a derivátov podľa vynálezu, ktoré sú schopné viazať sa na RIP.

(ix) Spôsob izolácie a identifikácie proteínov podľa vynálezu, ktoré sú schopné viazať sa na RIP proteín, ktorý zahŕňa aplikovanie kvasinkového dvojhybridného postupu, v ktorom je sekvencia kódujúca RIP proteín nesená jedným hybridným vektorom a sekvencia z cDNA alebo genomickej DNA knižnice je nesená druhým hybridným vektorom, pričom vektory sú potom použité na transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek a pozitívne transformované bunky sa izolujú, nasleduje extrakcia druhého hybridného vektora, aby sa získala sekvencia kódujúca proteín, ktorý sa viaže na RIP proteín.

(x) Použitie alebo spôsob podľa ktoréhokoľvek z uvedených bodov (i) až (ix), v ktorom je RAP-2 proteínom ktorákoľvek z izoforiem RAP-2, ich analógy, fragmenty a deriváty.

(xi) Použitie alebo spôsob podľa ktoréhokoľvek z uvedených bodov (i) až (ix), v ktorom sa RAP-2 proteín alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov podieľa na modulácii bunkového účinku sprostredkovaného alebo modulovaného akýmkoľvek iným mediátorom alebo induktorom, na ktorý je schopný RAP-2 proteín, izoforma, analóg, fragment alebo derivát sa priamo alebo nepriamo viazať.

Predložený vynález poskytuje aj farmaceutický prostriedok na moduláciu dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom TNF rodiny na bunky prostredníctvom pôsobenia RIP proteínu alebo pôsobenia akéhokoľvek iného mediátora alebo induktora na bunky, ako bolo uvedené, ktorý obsahuje ako účinnú zložku čokoľvek z nasledujúceho:

(i) RAP-2 proteín podľa vynálezu a jeho biologicky účinné fragmenty, analógy, deriváty zmesí;

(ii) rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci proteín schopný viazať bunkový povrchový receptor a kódujúci RAP-2 proteín alebo biologicky účinné fragmenty alebo analógy podľa vynálezu;

(iii) oligonukleotidová sekvencia kódujúca anti-sense sekvenciu RAP-2 proteínovej sekvencie podľa vynálezu, pričom oligonukleotid môže byť druhou sekvenciou re kombinantného živočíšneho vírusového vektora podľa uvedeného bodu (ii).

Predložený vynález poskytuje aj nasledujúce použitia:

I. Použitie na moduláciu dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú modulované/sprostredkované RIP proteínom alebo účinkom akéhokoľvek iného mediátora alebo induktora, alebo akéhokoľvek NK-kB induktora alebo inhibítora na bunky, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek v súlade s ktorýmkoľvek spôsobom podľa (i) až (x) uvedenými, s RAP-2 proteínmi, ich izoformami, analógmi, fragmentmi alebo derivátmi, alebo sekvenciami kódujúcimi RAP-2 proteíny, ich izoformy, analógy, fragmenty alebo deriváty, pričom výsledkom ošetrenia je zosilnenie inhibície RIP-sprostredkovaného účinku, a tým aj FAS-R alebo p55-R sprostredkovaného účinku alebo zosilnenie, alebo inhibícia iného mediátora alebo induktora, alebo iného NF-κΒ induktora, alebo inhibítora.

II. Použitie ako je uvedené, v ktorom je RAP-2 proteín, jeho analóg, fragment alebo derivát tou časťou RAP-2 proteínu, ktorá sa špecificky podieľa na väzbe na RIP alebo iný mediátor alebo induktor, alebo na iný NF-κΒ induktor alebo inhibítor, alebo RAP-2 proteínová sekvencia kóduje tú časť RAP-2 proteínu, ktorá sa špecificky podieľa na väzbe na RIP alebo iný mediátor alebo induktor, alebo na iný NF-κΒ induktor alebo inhibítor.

III. Použitie ako je uvedené, v ktorom je RAP-2 proteínom ktorákoľvek z RAP-2 izoforiem, ktoré sú schopné zosilniť RIP-asociovaný účinok.

IV. Použitie ako je uvedené, v ktorom je RAP-2 proteínom ktorákoľvek z RAP-2 izoforiem, ktoré sú schopné inhibovať RIP-asociovaný účinok alebo účinok asociovaný s iným mediátorom alebo induktorom na bunky, a tým aj inhibovať FAS-R alebo p55-R asociovaný účinok na bunky alebo inhibovať účinok iného cytotoxického mediátora alebo induktora na bunky.

V. Použitie ako je uvedené, v ktorom je RAP-2 proteín, izoforma, analóg, fragment alebo derivát schopný zosilniť alebo inhibovať RIP-asociovaný účinok na zápal alebo dráhu bunkového prežívania prostredníctvom priamej alebo nepriamej inhibície NF-κΒ alebo priamou alebo nepriamou aktiváciou JNK alebo p38 kinázy.

Izolácia RAP-2 proteínov, ich identifikácia a charakterizácia sa môže uskutočňovať ktoroukoľvek zo štandardných skríningových technik používaných na izoláciu a identifikáciu proteínu, napríklad kvasinkovým dvojhybridným spôsobom, metódami afinitnej chromatografie a ktoroukoľvek inou dobre známou štandardnou technikou používanou na tento účel.

Podľa ešte iného uskutočnenia vynálezu sa samotný RAP-2 proteín alebo jeho izoforma, fragment alebo derivát používa ako návnada v kvasinkovom dvojhybridnom skríningu pre proteíny, ktoré sa naň viažu.

Ako vyplynie z podrobného opisu vynálezu sú poskytnuté aj iné predmety a uskutočnenia vynálezu.

Treba poznamenať, že tu používané nasledujúce výrazy „modulácia/sprostredkovanie RIP účinku alebo účinku FAS-ligandu, alebo TNF účinku na bunky“; a akékoľvek iné výrazy zahŕňajúce „moduláciu/sprostredkovanie“, ktoré sú uvedené v opise, zahŕňajú tak in vitro, ako aj in vivo pôsobenie, a navyše zahŕňajú inhibíciu alebo zosilnenie/posilnenie.

Podrobný opis vynálezu

Predložený vynález sa v jednom uskutočnení týka

RAP-2 proteínu, ktorý je kódovaný definovanou DNA sekvenciou, a ktorý je schopný viazať sa na RIP proteín, a tým sprostredkovať alebo modulovať vnútrobunkovú aktivitu

RIP, najmä ak sa RIP podieľa na modulovaní alebo sprostredkovaní zápalu, dráh bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ako je podrobne uvedené. Takže RAP-2 môže inhibovať RIP účinok v dráhach bunkovej smrti, prežívania a/alebo zápalu, RAP-2 môže zvýšiť RIP účinok v dráhach zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, alebo môže posilniť RIP účinok v jednej z týchto dráh a zároveň inhibovať RIP účinok v inej.

RAP-2 sa sekvenoval a charakterizoval a zistilo sa, že RAP-2 je RIP-viažuci proteín s vysokou špecifickou proti RIP, ale neviaže sa na množstvo proteínov, o ktorých je známe, že sa podieľajú na vnútrobukových signalizačných dráhach, ktoré vedú k zápalu, bunkovej smrti alebo bunkovému prežívaniu. Je tiež zrejmé, že RAP-2 nemá žiadne domény spoločné s proteínmi, ktoré sú aktívne v niektorej z týchto dráh, t. j. RAP-2 nemá motív alebo modul „smrtiacej domény“, nemá kinázový motív alebo doménu a nemá proteázovú doménu alebo motív. Aj stanovená RAP-2 sekvencia je unikátna, ako vyplýva z jej porovnania so sekvenciami v množstve databáz vrátane GeneBank, Human Génom level A a „sbest“ databáz. Ako je podrobne uvedené (aj s odvolaním sa na všetky citované publikácie a prihlášky vynálezov), RIP sa podieľa vnútrobunkovo na dráhe zápalu, bunkovej smrti a bunkového prežívania. Takže regulácia alebo kontrola účinku RIP môže regulovať určitú alebo všetky tieto dráhy, keď sú tieto dráhy iniciované napríklad väzbou TNF alebo Fas-ligandu na ich receptory (pri TNF na p55-R). RIP môže mať kľúčovú úlohu pri determinácii toho, ktorá dráha je aktivovaná vo väčšom rozsahu a to prostredníctvom toho, že je schopný viazať sa na množstvo cytotoxických proteínov, ktoré majú smrtiace domény a aj na množstvo proteínov, ktoré majú kinázovú aktivitu. Z toho vyplýva, že proteíny, ako RAP-2 proteín podľa predloženého vynálezu, ktoré sa môžu špecificky viazať na RIP, môžu mať významnú úlohu pri modulovaní RIP účinku, a tým modulovať rozsah indukcie jednej dráhy v porovnaní s inými. Takže RAP-2 proteín podľa predloženého vynálezu predstavuje dôležitý vnútrobunkový signalizačný modulátor alebo mediátor.

Okrem RAP-2 proteínu s úplnom dĺžkou podľa predloženého vynálezu, klonovala sa aj kratšia cDNA, o ktorej sa zistilo, že je zložená zo sekvenčných „blokov“ odvodených od niekoľkých vzdialených oblastí „úplnej“ cDNA, ktoré sú zjavne výsledkom alternatívneho zostrihu rovnakého génu. Pri podobnom prieskume myšej zbierky ESTs sa identifikoval hlodavči náprotivok ľudského RAP-2. Zistilo sa, že časť hlodavčej cDNA je v skutočnosti identická s j ej ľudským náprotivkom v kódujúcej oblasti.

Fyziologická relevancia RIP-RAP-2 interakcie sa ďalej potvrdila v transfekovaných HEK-293T a HeLa bunkách. Ale výsledkom vytvorenia takéhoto komplexu nebola RIP enzymatická aktivita, čoho dôkazom je skutočnosť, že výsledkom nadexpresie RIP nie je fosforylácia RAP-2.

Výsledkom transfekčných experimentov v cicavčích HEK-293T bunkách bolo tiež vytvorenie RAP-2-NIK komplexu.

Je zrejmé, že RAP-2 je kritickým elementom NF-κΒ a c-Jun signalizačných transdukčných dráh, keďže sa viaže na NIK, ΙΚΚβ a TIP60 (histón acetyl-transferáza) a moduluje NF-κΒ a c-Jun závislú transkripciu. V skutočnosti vedie zosilnená ektopická expresia RAP-2 k inhibícii NF-κΒ odpovede, zatiaľ čo výsledkom jeho odstránenia z bunky prostredníctvom antisense konštruktu je zosilnenie NF-κΒ a c-Jun transaktivácie.

Zistilo sa tiež, že RAP-2 aj zvyšuje potenciál c-Jun hyperfosforylácic, ktorá nie je sprostredkovaná účinkom JNK. RAP-2 neinhiboval c-Jun a RelA väzbu na DNA. Väzobné a funkčné domény RAP-2 sa identifikovali sekvenčnými delečnými analýzami. Z týchto štúdií vyplynulo, že väzobná oblasť RIP, NIK a TIP60 sa prekrýva s RAP-2 v rámci aminokyselín 95 až 264. Ale sa zistilo, že následné funkčné účinky sprostredkované RAP-2 sú lokalizované v N-koncovej doméne proteínu, ktorá zahŕňa aminokyseliny 1 až 264.

Vzhľadom na uvedené je zrejmé, že RAP-2 je kritickým elementom signálneho-atenuačného kruhu stresovej responzívnej siete: ektopická expresia sensc-kódujúccho konštruktu inhibuje odpoveď, zatiaľ čo expresia antisensekódujúceho konštruktu posilňuje odpoveď. V skutočnosti je RAP-2 v laboratóriu pôvodcov známy ako RAT (RIP atenuátor) a môže tu byť preto označovaný aj ako RAT a/alebo RAT-303, a/alebo kloň 303.

Z existencie viacnásobných zostrihových variantov vyplýva, žc pravdepodobne aspoň čiastočne závisí sieťový účinok RAP-2 v daných podmienkach od prítomnosti určitých sekvenčných blokov, ktoré sú nevyhnutné pre proteínovú väzbu/ smerovanie/ translokáciu/ modifikáciu v prevládajúcej izoforme. Napríklad ak v skutočnosti väzba RAP-2 na T1P60 umožňuje jadrovú lokalizáciu TIP60, je možné hypoteticky uvažovať, že varianty RAP-2, ktoré majú vystrihnuté jadrové lokalizačné signály (NLS), sa môžu stať defektnými alebo naopak nadmerne aktívnymi pri NF-κΒ/ΑΡ-1 represii. Sekvenčná analýza dokazuje, že RAP-2 obsahuje niekoľko klastrov pozitívne nabitých aminokyselín (E, K a R), čo je charakteristické pre väčšinu známych NLS.

RAP-2 väzba na RIP bola mapovaná v oblasti RAP-2 proteínu, ktorá začína aminokyselinami 177 až 218 a končí aminokyselinou 264. RIP väzobná doména vnútri RAP-2 sa neprekrýva ani s ΙΚΚβ, ani s NIK väzobným miestom.

Väzba na TIP60, člena rodiny jadových proteínov nazývaných histón acetyl-transferázy, zjavne spadá do oblasti aminokyselín 95 až 264. Zistilo sa, že oblasť, ktorá sa podieľa na homodimerizácii sa nachádza medzi aminokyselinami 217 až 264.

Z nazhromaždených údajov vyplýva, že všetky funkčné účinky RAP-2 (konkrétne NF-κΒ inhibícia a indukcia c-Jun hyperfosforylácie) sú lokalizované v rovnakej oblasti.

Navyše je možné, že oblasť postačujúca na účinnú moduláciu signalizácie prostredníctvom všetkých induktorov je lokalizovaná na N-terminálnom segmente proteínu.

Oblasť v rámci aminokyselín 95 až 416 jc účinná, hoci signifikantne slabšia v porovnaní s účinkom spôsobeným kompletným proteínom. Takže tento účinok môže byť výsledkom posilnenej agregácie endogénneho RAP-2.

Navyše, s výnimkou RelA, všetky účinky indukované v našich experimentoch môžu byť sprostredkované len približne 100 N-koncovými aminokyselinami RAP-2. V skutočnosti aj fragment obsahujúci aminokyseliny 1 až 102 sprostredkúva zreteľný účinok, hoci značne miernejší.

Na druhej strane supresia RelA-sprostredkovaného účinku vyžaduje oveľa väčšiu časť RAP-2. Z tohto hľadiska by bolo možné definovať hranice tejto oblasti vnútri aminokyselín 1 až 264, ktorá zjavne obsahuje oblasť medzi aminokyselinami 157 a 264 s určitými, RelA-asociovanými, väzobnými vlastnosťami.

Z uvedených pozorovaní vyplýva, že:

a) S výnimkou RelA, väzba RAP-2 na RIP, a najpravdepodobnejšie na NIK a TIP60, nie je potrebná na funkciu proteínu ako inhibítora nadexpresie indukovanej NF-kB.

b) Účinok RAP-2 na RelA nadexpresiou indukovanú aktiváciu je zvyčajne sprostredkovaný aspoň čiastočne rôznymi väzobnými udalosťami. V podstate všetky uvedené proteíny sa môžu podieľať na danej aktivite, vychádzajúc z doteraz uskutočnených experimentov.

Vďaka unikátnej schopnosti FAS-R a TNF receptorov spôsobiť bunkovú smrť, ako aj schopnosti TNF receptorov spustiť rôzne aktivity poškodzujúce tkanivá, pre organizmus môže byť zmena funkcie týchto receptorov značne škodlivá. V skutočnosti sa ukázalo, že tak nadmerná, ako aj deficientná funkcia týchto receptorov sa podieľa na patologických manifestáciách rôznych ochorení. Identifikácia molekúl, ktoré sa zúčastňujú na signalizačnej aktivite týchto receptorov, a nájdenie spôsobov na moduláciu funkcie týchto molekúl, predstavuje potenciálny kľúč pre nové terapeutické prístupy k týmto ochoreniam. Vzhľadom na predpokladanú dôležitú úlohu RIP vo FAS-R a p55-R toxicite, a tým predpokladanú dôležitú regulačnú úlohu RAP-2 proti FAS-R a TNF prostredníctvom modulácie RIP, zdá sa dôležité najmä navrhnúť liečivá, ktoré môžu blokovať cytotoxickú funkciu RIP, možno prostredníctvom blokovania väzby RAP-2 na RIP alebo inhibovaním interakcie medzi RAP-2 a RIP v takých podmienkach, v ktorých RAP-2 slúži na zosilnenie RIP-sprostredkovanej cytotoxicity (ako je uvedené, RIP je cytotoxický sám osebe a v spojení s inými proteínmi, ktoré majú oblasti smrtiacej domény).

Podobne, je známe (pozri skôr), že FAS-R a p55-R sa podieľajú na aktivácii NF-κΒ, a tým na bunkovom prežívaní. Z toho vyplýva, že ak je želateľné usmrtiť bunky, napríklad nádorové bunky, HlV-infíkované bunky a podobne bunky, bolo by želateľné zosilniť cytotoxické účinky FAS-R a p55-R (a ich asociovaných proteínov ako napríklad MORT-1, MACH, Mch4, Gl, TRADD), a zároveň inhibovať ich schopnosť indukovať NF-κΒ. Takže ak je výsledkom interakcie alebo väzby RAP-2 na RIP zosilnenie možnej úlohy v zosilnení NF-κΒ indukcie (možno prostredníctvom TRAF2 a možno prostredníctvom kinázovej domény a/alebo strednej domény RIP), potom by bolo želateľné blokovať túto interakciu medzi RAP-2 a RIP, aby sa inhibovala, alebo aspoň aby sa zabránilo zosilneniu NF-κΒ aktivácie, a aby sa tým posunula rovnováha TNF- alebo FAS-ligandom indukovaných účinkov smerom k bunkovej cytotoxicite, čo v konečnom dôsledku poskytuje zvýšenie bunkovej smrti.

Podobne, v opačnej situácii (ako je tá uvedená), v ktorej RAP-2 väzba na RIP v skutočnosti spôsobuje inhibíciu FAS-R a p55-R zápalových alebo cytotoxických účinkov, a je želateľné blokovať tieto cytotoxické účinky, napr. pri zápale, rôznych autoimunitných ochoreniach a podobne, keď je cieľom zvýšenie bunkového prežívania, potom je dôležité navrhnúť liečivá, ktoré by zosilnili interakciu medzi RAP-2 a RIP, aby sa zosilnila celková inhibícia bunkovej smrti, a aby sa rovnováha posunula smerom k bunkovému prežívaniu. Z uvedeného tiež vyplýva, že v prípade, keď RAP-2 interakcia s RIP spôsobuje inhibíciu RIP funkcie pri zosilňovaní NF-κΒ aktivácie, potom, ak je želateľné bunkové prežívanie, je nevyhnutné blokovať túto interakciu medzi RAP-2 a RIP, a tým blokovať zosilnenie RIP účinku pri posilňovaní aktivácie NF-kB.

Z uvedeného vyplýva, že RIP má kľúčovú úlohu v rovnováhe medzi indukciou alebo sprostredkovaním dráh zápalu, bunkovej smrti alebo bunkového prežívania, a teda aj RAP-2 má ekvivalentne dôležitú úlohu, keďže je modulátorom RIP. Ovplyvnením RAP-2-RIP interakcie/väzby použitím rôznych liečiv alebo postupov, ako je uvedené, bude možné umožniť posun vnútrobunkových signalizačných dráh od bunkovej smrti k bunkovému prežívaniu a vice verša, podľa potreby.

Predložený vynález sa týka aj DNA sekvencie, ako je definovaná, kódujúcej RAP-2 proteín a RAP-2 proteínov kódovaných DNA sekvenciami.

Navyše sa predložený vynález ďalej týka DNA sekvencií, ktoré kódujú biologicky aktívne analógy, fragmenty a deriváty RAP-2 proteínu a nimi kódovaných analógov, fragmentov a derivátov. Príprava takýchto analógov, fragmentov a derivátov je štandardným postupom (pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989), v ktorom môže byť v DNA sekvenciách kódujúcich RAP-2 proteín, jeden alebo viacero kodónov deletovaných, pridaných alebo substituovaných, aby sa získali analógy, ktoré obsahujú najmenej jednu zmenu aminokyselinového zvyšku v porovnaní s prirodzeným proteínom.

Okrem uvedených DNA sekvencií podľa vynálezu, ktoré kódujú RAP-2 proteín, jeho izoformu, analóg alebo derivát, do rozsahu vynálezu ako jeho uskutočnenie spadajú aj DNA sekvencie, ktoré sú schopné v prísnych podmienkach hybridizovať s cDNA sekvenciou odvodenou od kódujúcej oblasti prirodzeného RAP-2 proteínu, a hybridizovateľne DNA sekvencie kódujú biologicky aktívny RAP-2 proteín. Takže tieto hybridizovateľné DNA sekvencie zahŕňajú DNA sekvencie, ktoré majú relatívne vysokú homológiu s cDNA sekvenciou pre prirodzený RAP-2 proteín, a predstavujú teda sekvencie podobné RAP-2 proteínu, ktoré môžu byť napríklad prirodzené derivovanými sekvenciami kódujúcimi rôzne izoformy RAP-2 proteínu alebo prirodzene sa vyskytujúce sekvencie kódujúce proteíny, ktoré patria do skupiny sekvencií podobných s RAP-2 sekvenciami, ktoré kódujú proteín s RAP-2 účinkom. Navyše, tieto sekvencie môžu zahŕňať napríklad aj synteticky vyrábané sekvencie, ktoré sa prirodzene nevyskytujú, a ktoré sú podobné s cDNA sekvenciou prirodzeného RAP-2 proteínu, ale obsahujú množstvo želateľných modifikácií. Takže takéto syntetické sekvencie zahŕňajú všetky možné sekvencie kódujúce analógy, fragmenty a deriváty RAP-2, ktoré všetky majú aktivitu RAP-2.

Na získanie rôznych uvedených prirodzene sa vyskytujúcich sekvencií podobných RAP-2 proteínu je možné použiť štandardné postupy vyhľadávania a izolácie prirodzene odvodených DNA alebo RNA vzoriek z rôznych tkanív použitím cDNA prirodzeného RAP-2 proteínu alebo jej časti ako sondy (pozri napríklad štandardné postupy uvedené v Sambrook a ďalší, 1989).

Podobne, na prípravu uvedených rôznych RAP-2 podobných sekvencií, ktoré kódujú analógy, fragmenty alebo deriváty RAP-2, je možné použiť množstvo štandardných postupov, ako je podrobne uvedené na prípravu takých analógov, fragmentov a derivátov.

Polypeptid alebo proteín „v podstate zodpovedajúci“ RAP-2 proteínu zahŕňa nielen RAP-2 proteín, ale aj polypeptidy alebo proteíny, ktoré sú analógmi RAP-2.

Analógmi, ktoré v podstate zodpovedajú RAP-2 proteínu, sú také poly-peptidy, v ktorých je jedna alebo viacero aminokyselín v aminokyselinovej sekvencií RAP-2 proteínu nahradená inou aminokyselinou, deletovaná a/alebo vložená, s tou podmienkou, že výsledný proteín má v podstate rovnaký alebo vyšší biologický účinok ako RAP-2 proteín, ktorému zodpovedá.

Ak majú takéto izoformy v podstate zodpovedať RAP-2 proteínu, sú vo všeobecnosti zmeny v sekvencií RAP-2 proteínov malé. Hoci počet zmien môže byť vyšší ako desať, výhodne počet zmien nie je vyšší ako desať, výhodnejšie nie je vyšší ako päť a najvýhodnejšie nie je vyšší ako tri. Hoci môže byť použitá akákoľvek technika na nájdenie potenciálnych biologicky účinných proteínov, ktoré v podstate zodpovedajú RAP-2 proteínom, jednou takouto techni kou je použitie bežných mutagenizačných techník na DNA kódujúcu proteín, ktorých výsledkom je niekoľko modifikácií. Proteíny exprimované v takýchto klonoch sa potom môžu skrínovať z hľadiska ich schopností viazať RÍP a modul ovať účinok RIP v uvedených modul ačných/sprostredkovacich vnútrobunkových dráhach, ako boli uvedené.

„Konzervatívne“ zmeny sú také zmeny, od ktorých by sa nedalo očakávať, že zmenia účinok proteínu a zvyčajne sa skrínujú prvé, keďže sa od nich nedá očakávať, že by podstatne menili veľkosť, náboj alebo konfiguráciu proteínu, a teda sa nedá očakávať, že by menili jeho biologické vlastnosti.

Konzervatívne substitúcie v RAP-2 proteinoch zahŕňajú analóg, v ktorom je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v polypeptide konzervatívne nahradený odlišnou aminokyselinou. Takéto substitúcie sa výhodne uskutočňujú v súlade s nasledujúcim zoznamom uvedeným v tabuľke IA, pričom tieto substitúcie je možné stanoviť rutinným experimentovaním tak, aby sa získali modifikované štruktúrne a funkčné vlastnosti syntetizovanej polypeptidovej molekuly, a aby sa zároveň zachoval biologický účinok charakteristický pre RAP-2 proteín.

Tabuľka 1A

Pôvodný zvyšok

Ala

Arg

Asn

Asp

Cys

Gin

Glu

Gly

His íle

Leu

Lys

Met

Phe

Ser

Thr

Trp

Tyr

Val

Príkladná substitúcia

Gly; Ser

Lys

Gin;His

Glu

Ser

Asn

Asp

Ala; Pro

Asn; Gin

Leu; Val íle; Val

Arg; Gin; Glu

Leu; Tyr; íle

Met; Leu; Tyr Thr

Ser

Tyr

Trp; Phe íle; Leu

Alternatívne, inou skupinou substitúcií v RAP-2 proteíne sú substitúcie, pri ktorých je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v polypeptide nahradený odlišným zvyškom podľa nasledujúcej tabuľky IB. Typy substitúcií, ktoré je možné uskutočniť v polypeptide, sa môžu zakladať na analýze frekvencií amino-kyselinových zmien medzi homologickými proteínmi odlišných druhov, ako napríklad na analýze prezentovanej v tabuľke 1-2 v publikácii Schulz a ďalší, G.E., Principles of Proteín Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1998, a na obrázkoch 3 až 9 v publikácii Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Na základe takýchto analýz sú tu definované alternatívne konzervatívne substitúcie ako výmeny v rámci jednej z nasledujúcich piatich skupín:

TabuľkaIB

1. Malé, alifatické, nepoláme alebo slabo poláme zvyšky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly).

2. Poláme, záporne nabité zvyšky a ich amidy: Asp, Asn, Glu, Gin.

3. Poláme, kladne nabité zvyšky: His, Arg, Lys.

4. Veľké, alifatické, nepoláme zvyšky: Met, Leu, íle, Val (Cys).

5. Veľké, aromatické zvyšky: Phe, Tyr, Trp.

Tri aminokyselinové zvyšky, ktoré sú uvedené v zátvorkách, majú v proteínovej architektúre špeciálnu úlohu. Gly je jediným zvyškom, ktorý nemá žiadny bočný reťazec, a teda zavádza do reťazca flexibilitu. To však má tendenciu posilňovať vytvorenie inej ako α-závitnicovej sekundárnej štruktúry. Pro, kvôli svojej nezvyčajnej geometrii, tesne stláča reťazec, a vo všeobecnosti má tendenciu napomáhať vytvoreniu štruktúr podobných β-skladanému listu, zatiaľ čo v niektorých prípadoch môže byť Cys schopný podieľať sa na vytvorení disulfidovej väzby, ktorá je dôležitá na poskladanie proteínu. Treba poznamenať, že podľa uvedenej publikácie Schulz a ďalší by sa skupiny 1 a 2 zlúčili. Treba tiež poznamenať, že vďaka svojmu potenciálu vytvárať vodíkové väzby je Tyr významne príbuzný so Ser a Thr, atď.

Konzervatívne aminokyselinové substitúcie podľa predloženého vynálezu, napríklad uvedené substitúcie, sú v oblasti známe, a očakáva sa od nich, že zachovávajú biologické a štruktúrne vlastnosti polypeptidu po aminokyselinovej substitúcii. Väčšina delécií a substitúcií podľa predloženého vynálezu je takých, že nespôsobujú radikálne zmeny vlastností proteínovej alebo polypeptidovej molekuly. Vlastnosti sú definované tak ako zmeny v sekundárnej štruktúre, napr. α-helix alebo β-skladaný list, ako aj zmeny biologického účinku, napr. väzba na RIP a/alebo sprostredkovanie RIP účinku na bunkovú smrť.

Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v proteinoch, ktoré môžu byť použité na získanie analógov RAP-2 proteínov na použitie podľa vynálezu, zahŕňajú akékoľvek známe spôsobové kroky, ako je uvedené napríklad v US patente RE 33653, 4959314, 4588585 a 4737462, Mark a ďalší; 5116943 Koths a ďalší, 4965195 Namen a ďalší, 4879111 Chong a ďalší, a 5017691 Lee a ďalší; a lyzín substituované proteíny uvedené v US patente č. 4904584 (Shaw a ďalší).

Do rozsahu vynálezu spadajú okrem uvedených konzervatívnych substitúcii, ktoré by nemali významne meniť účinok RAP-2 proteínu, aj konzervatívne substitúcie alebo menej konzervatívne a náhodnejšie zmeny, ktoré vedú ku zvýšeniu biologického účinku analógov RAP-2 proteínov.

Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že keď sa má stanoviť presný účinok substitúcie alebo delécie, bude sa ich účinok stanovovať rutinným väzobným testom a testom bunkovej smrti. Skríning využívajúci takýto štandardný test nezahŕňa nadmerné experimentovanie.

Prijateľnými RAP-2 analógmi sú analógy, ktoré si zachovávajú aspoň schopnosť viazať sa na RIP, a tým sprostredkovať účinok RIP vo vnútrobunkových dráhach, ako je uvedené. Takýmto spôsobom je možné vytvoriť analógy, ktoré majú takzvaný dominantný negatívny účinok, konkrétne analógy, ktoré sú chybné buď pri viazaní RIP, alebo v následnej signalizačnej alebo inej aktivite, ktorá nasleduje po takomto naviazaní sa. Takéto analógy môžu byť použité napríklad na inhibíciu účinku RIP alebo na inhibíciu NFkB indukujúceho (priameho alebo nepriameho) účinku RIP, v závislosti od toho, ktorá z týchto aktivít je z väčšej časti modulovaná interakciou RAP-2 a RIP (pozri skôr), a to tak, že tieto analógy súťažia s prirodzeným RAP-2 proteínom pri väzbe na RIP.

Na genetickej úrovni sa tieto analógy vo všeobecnosti pripravujú miestne riadenou mutagenézou nukleotidov v DNA kódujúcej RAP-2 proteín, čím sa vytvorí DNA kódujúca analóg, a potom syntézou DNA a expresiou polypeptidu v rekombinantnej bunkovej kultúre. Tieto analógy majú typicky rovnaký alebo zvýšený kvalitatívny biologický účinok v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim proteínom, Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook a ďalší, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Príprava RAP-2 proteínu podľa vynálezu alebo alternatívnej nukleotidovej sekvencie kódujúcej rovnaký polypeptid, ktorá sa však líši od prirodzenej sekvencie kvôli známej degenerácii genetického kódu, sa môže dosiahnuť miestne špecifickou mutagenézou DNA, ktorá kóduje skôr pripravený analóg alebo prirodzenú verziu RAP-2 proteínu. Miestne špecifická mutagenéza umožňuje produkciu analógov prostredníctvom použitia špecifických oligonukleotidových sekvencii, ktoré kódujú DNA sekvenciu s požadovanou mutáciou, ako aj dostatočné množstvo priľahlých nukleotidov, čím je poskytnutá primerová sekvencia s dostatočnou veľkosťou a sekvenčnou komplexitou na vytvorenie stabilného duplexu na oboch stranách delečnej spojky, ktorá sa má preklenúť. Typickým výhodným primerom je primer s dĺžkou približne 20 až 25 nukleotidov, pričom má približne 5 až 10 komplementujúcich nukleotidov na oboch stranách sekvencie, ktorá sa má meniť. Vo všeobecnosti je technika miestne špecifickej mutagenézy v oblasti dobre známa, čo je ilustrované napríklad v publikácii Adelman a ďalší, DNA 2: 183 (1983), ktorej opis je tu zahrnutý touto citáciou.

Ako bude zrejmé, miestne špecifická mutagenizačná technika typicky využíva fágový vektor, ktorý existuje tak v jednovláknovej, ako aj v d voj vláknovej forme. Typické vektory užitočné na miestne riadenú mutagenézu zahŕňajú vektory ako Ml 3 fág, napríklad ako je opísané v Messing a ďalší, Third Cleveland Symposium on Macromoleculs and Recombinant DNA, vyd. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), pričom opis tejto publikácie je tu zahrnutý jej citáciou. Tieto fágy sú jednoducho komerčne dostupné a pre priemerného odborníka v oblasti je ich použitie dobre známe, Na získanie jednovláknovej DNA môžu byť alternatívne použité plazmidové vektory, ktoré obsahujú počiatok replikácie jednovláknového fága (Veira a ďalší, Meth. Enzymol. 153:3, 1987).

Vo všeobecnosti sa tu opísaná miestne riadená mutagenéza uskutočňuje tak, že sa najprv získa jednovláknový vektor, ktorý v rámci svojej sekvencie obsahuje DNA sekvenciu, ktorá kóduje relevantný polypeptid. Oligonukleotidový primer nesúci požadovanú mutovanú sekvenciu sa pripravuje synteticky, automatizovanou DNA/oligonukleotidovou syntézou. Tento primer sa potom aneluje s jednovlákovým vektorom obsahujúcim proteín kódujúcu sekveniu a reakčná zmes s:a ošetrí s DNA-polymerizačnými enzýmami, ako E.coli polymerázovým I Klenowovým fragmentom, aby sa skompletizovala syntéza vlákna, ktoré nesie mutáciu. Takže mutovaná sekvencia a druhé vlákno nesie požadovanú mutáciu. Tento heteroduplexový vektor sa potom použije na transfomáciu príslušných buniek, ako napríklad E. coli JM10I buniek, a vyberú sa klony, ktoré obsahujú rekombinantné vektory nesúce mutovanú sekvenciu.

Po výbere takéhoto klonu je možné vybrať mutovanú sekvenciu RAP-2 proteínu a umiestniť ju do vhodného vek tora, vo všeobecnosti do transferového alebo expresného vektora takého typu, ktorý môže byť použitý na transfekciu príslušného hostiteľa.

Z toho vyplýva, že gén alebo nukleovú kyselinu kódujúcu RAP-2 proteín je možné tiež detekovať, získať a/alebo modifikovať in vitro, in situ a/alebo in vivo, použitím známych DNA alebo RNA amplifikačných techník, ako napríklad PCR a chemickej oligonukleotidovej syntézy. PCR umožňuje amplifikáciu (zvýšenie počtu) špecifických DNA sekvencii opakovanými DNA polymerizačnými reakciami. Táto reakcia sa môže použiť ako náhrada klonovania; všetko čo je potrebné, je znalosť sekvencie nukleovej kyseliny. Aby sa uskutočnila PCR, sú navrhnuté primery, ktoré sú komplementárne so študovanou sekvenciou. Tieto primery sa potom generujú automatizovanou DNA syntézou. Pretože primery je možné navrhnúť tak, aby hybridizovali s ktoroukoľvek časťou génu, je možné vytvoriť také podmienky, aby boli tolerované nepresnosti pri komplementárnom párovaní báz. Amplifikácia týchto nespárovaných oblastí môže viesť ku syntéze mutovaného produktu, čoho výsledkom je generovanie peptidu s novými vlastnosťami (t. j. miestne riadená mutagenéza). Pozri aj napr. Ausubel, kapitola 16. Ako východiskový materiál na syntézu extracelulámej domény prolaktínového receptora bez klonovania môže byť použitá RNA, ktorá vznikne spojením DNA (cDNA) syntézy použitím reverznej transkriptázy, a PCR.

Navyše, PCR primery môžu byť navrhnuté tak, aby obsahovali nové reštrikčné miesta alebo iné znaky, ako napríklad terminačné kodóny na koncoch génového segmentu, ktorý sa má amplifikovať. Toto umiestnenie reštrikčných miest na 5' a 3' konci amplifikovanej génovej sekvencie umožňuje, aby boli génové segmenty kódujúce RAP-2 proteín alebo jeho fragment navrhnuté na ligáciu s inými sekvenciami a/alebo do klonovacích miest vektorov.

PCR a iné spôsoby amplifikácie RNA a/alebo DNA sú v oblasti dobre známe a môžu byť použité podľa predloženého vynálezu bez nadmerného experimentovania, na základe tu uvedeného opisu a návodu. Známe spôsoby DNA alebo RNA amplifikácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na polymerázovú reťazovú rekaciu (PCR) a príbuzné amplifikačné spôsoby (pozri napr. US patenty č. 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 Mullis a ďalší; 4795699 a 4921794 Tábor a ďalší; 5142033 Innis; 5122464 Wilson a ďalší; 5091310 Innis; 5066584 Gyllensten a ďalší; 4889818 Gclfand a ďalší; 4994310 Silver a ďalší; 4766067 Biswas; 4656134 Ringold; a Innis a ďalší, vyd. PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a RNA sprostredkované amplifikácie, ktoré využívajú anti-sense RNA proti cieľovej sekvencii ako templát na syntézu dvojvláknovej DNA (US patent č. 5130238 Malek a ďalší, s komerčným názvom NASBA); imuno-PCR, ktorá kombinuje použitie DNA amplifikácie s protilátkovým značením (Ružička a ďalší, Science 260: 487 (1993); Sano a ďalší, Science 258:120 (1992); Sano a ďalší, Biotechniques 9:1378 (1991), pričom obsah všetkých uvedených publikácií a patentov je zahrnutý do tohto opisu ich citáciou.

Analogickým spôsobom, ako bolo uvedené vo vzťahu ku analógom RAP-2 proteínu, je možné pripraviť biologicky účinné fragmenty RAP-2 proteínov (napr. fragmenty ktoréhokoľvek z RAP-2 proteínov alebo jeho izoforiem). Vhodnými fragmentmi RAP-2 proteínu sú tie, ktoré si zachovávajú schopnosti RAP-2 proteínu, a ktoré môžu modulovať alebo sprostredkovať biologický účinok RIP alebo iných proteínov priamo alebo nepriamo asociovaných s RIP. Z toho vyplýva, že je možné pripraviť fragmenty RAP-2 proteínu, ktoré majú dominantný negatívny alebo dominantný pozitívny účinok, ako bolo poznamenané, vo vzťahu ku analógom. Je potrebné uviesť, že tieto fragmenty predstavujú špeciálnu triedu analógov podľa vynálezu, konkrétne sú to definované časti RAP-2 proteínov, ktoré sú odvodené od úplnej sekvencie RAP-2 proteínu (napr. od RAP-2 alebo od jeho izoformy), pričom každá takáto časť alebo fragment má ktorýkoľvek z uvedených požadovaných účinkov. Takýmto fragmentom môže byť napr. peptid.

Podobne je možné pripraviť deriváty štandardnými modifikáciami bočných skupín jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov RAP-2 proteínu, jeho analógov alebo fragmentov, alebo konjugáciou RAP-2 proteínu, jeho analógov alebo fragmentov, s inou molekulou, napríklad s protilátkou, enzýmom, receptorom atď, ako je v oblasti dobre známe. Z toho vyplýva, že tu použitý výraz derivát pokrýva deriváty, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín vyskytujúcich sa ako bočné reťazce zvyškov alebo N-, alebo C-koncových skupín, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté v tomto vynáleze. Deriváty môžu mať chemické časti, ako uhľovodíkové alebo fosfátové zvyšky, s tou podmienkou, že frakcia má rovnaký alebo vyšší biologický účinok ako RAP-2 proteíny.

Deriváty môžu zahŕňať napríklad alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín vzniknuté reakciou s amoniakom alebo s primárnym, alebo sekundárnym aminom, N-acyl deriváty voľnej amino skupiny amino-kyselinových zvyškov tvorené s acylovými časťami (napr. alkanoylové alebo karbocyklické aroylové skupiny) alebo O-acyl deriváty voľnej hydroxylovej skupiny (napríklad O-acylové deriváty serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorené s acylovými časťami.

Výraz „deriváty“ zahŕňa len tie deriváty, ktoré nezamieňajú jednu aminokyselinu za inú, z dvadsiatich prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín.

RAP-2 je proteín alebo polypeptid, t. j. sekvencia aminokyselinových zvyškov. Polypeptid pozostávajúci z väčšej sekvencie, ktorá obsahuje celú sekvenciu RAP-2 proteínu podľa tu uvedených definícií, je považovaný za taký, ktorý spadá do rozsahu výrazu polypeptid, pokiaľ pridané aminokyseliny neovplyvňujú základné a nové vlastnosti podľa vynálezu, t. j. pokiaľ si zachováva alebo zvyšuje biologický účinok RAP-2 proteínu alebo pokiaľ môže byť rozštiepený tak, že výsledkom jc proteín alebo polypeptid s biologickým účinkom RAP-2 proteínu. Takže predložený vynález zahŕňa napríklad aj fúzované proteíny RAP-2 proteínu s inými aminokyselinami alebo peptidmi.

RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty majú množstvo možných použití, napríklad:

(i) RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty môžu byť použité na moduláciu funkcie RIP v dráhach zápalu, bunkovej smrti alebo bunkového prežívania, ako je uvedené. Napríklad, RAP-2 môže modulovať účinok RIP na aktiváciu NF-κΒ, JNK (Jun kináza) alebo p38 kinázy. Tieto RAP-2 účinky vedú k zosilneniu RAP-2-RIP účinku, keď je to potrebné, v protinádorových, anti- alebo prozápalových, anti-HÍV aplikáciách atď. V takomto prípade RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty, ktoré modulujú zápal, zosilňujú cytotoxický účinok alebo blokujú účinok bunkového prežívania, môžu byť zavedené do buniek štandardnými postupmi, ktoré sú známe samé osebe. Napríklad, ak je RAP-2 proteín celý vnútrobunkový (ako sa predpokladá), mal by byť zavedený len do buniek, kde je potrebný účinok FAS-R ligandu alebo TNF, alebo iného cytotoxického proteínu sprostredkovaný RIP, a je preto nevyhnutný systém na špecifické zavedenie tohto proteínu. Jedným spôsobom ako to urobiť, je vytvorenie rekombinantného živočíšneho vírusu, napr. odvodeného od Vaccinia, do ktorého sa zavádza DNA nasledujúcich dvoch génov: gén kódujúci ligand, ktorý sa viaže na bunkové povrchové proteíny špecificky exprimované bunkami, napríklad ako AIDS (HIV) vírusový gp 120 proteín, ktorý sa špecificky viaže na niektoré bunky (CD4 lymfocyty a príbuzné leukémie) alebo akýkoľvek iný ligand, ktorý sa špecificky viaže na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R, takže rekombinantný vírusový vektor bude schopný viazať takéto FAS-Ralebo p55-R-nesúce bunky; a gén kódujúci RAP-2 proteín. Takže expresia proteínu viažuceho sa na povrch buniek na povrchu vírusu nasmeruje vírus špecificky do nádorovej bunky alebo do inej bunky, ktorá nesie FAS-R alebo p55-R, a následne sa sekvencia kódujúca RAP-2 proteín zavedie do buniek prostredníctvom tohto vírusu, a výsledkom jej expresie v bunkách bude zosilnenie účinku FAS-R ligandu alebo TNF, ktorý je sprostredkovaný RIP, alebo je nezávislý od RIP. Konštrukcia takéhoto rekombinantného živočíšneho vírusu je štandardným postupom (pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989). Inou možnosťou je zaviesť sekvencie RAP-2 proteínu (napríklad ktorýkoľvek z RAP-2 alebo jeho izoforiem) vo forme oligonukleotidov, ktoré môže bunka absorbovať, a môžu sa v nej exprimovať.

(ii) Môžu byť použité na inhibíciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF, alebo príbuzných proteínov, ktorý je sprostredkovaný RIP alebo je nezávislý od RIP účinku, napr. v prípadoch poškodení tkanív pri septickom šoku, odmietnutí štepu hostiteľom alebo akútnej hepatitíde, kedy je potrebné blokovať FAS-R ligandom alebo TNF indukovanú FAS-R alebo p55-R vnútrobunkovú signalizáciu alebo nezávislý RIP účinok, alebo signalizáciu sprostredkovanú iným proteínom a zároveň podporiť dráhu bunkového prežívania. V tejto situácie je napríklad možné zaviesť do týchto buniek štandardnými postupmi oligonukleotidy, ktoré majú anti-sense kódujúcu sekvenciu pre RAP-2 proteín, ktorá by účinne blokovala transláciu mRNAs kódujúcich RAP-2 proteín, a tým môžu blokovať jeho expresiu, čo vedie k inhibícii účinku FAS-R ligandu alebo TNF, alebo RIP, alebo iného proteínu. Takéto oligonukleotidy môžu byť zavedené do buniek použitím uvedeného rekombinantného vírusového postupu, pričom druhou sekvenciou, ktorú nesie vírus je oligonukleotidová sekvencia.

Podobne, ako je uvedené, v závislosti od povahy RAP-2-RIP interakcie, môže byť možné, ak je to potrebné, opísanými spôsobmi (i) a (ii) zosilniť alebo inhibovať dráhy bunkového zápalu a prežívania.

Inou možnosťou je použiť protilátky špecifické pre RAP-2 proteín na inhibíciu jeho vnútrobunkového signalizačného účinku.

Ešte iným spôsobom na inhibíciu RlP-sprostredkovaných účinkov alebo účinku nezávislého od RIP je v súčasnosti vyvinutý ribozýmový prístup. Ribozýmy sú katalytické RNA molekuly, ktoré špecificky štiepia RNAs. Ribozýmy môžu byť navrhnuté tak, že štiepia vybrané cieľové RNA, napr. mRNA kódujúce RAP-2 proteín podľa vynálezu. Takéto ribozýmy majú sekvencie špecifické pre RAP-2 proteínovú mRNA a sú schopné s ňou interagovať (komplementárna väzba) s následným štiepením mRNA, čoho výsledkom jc pokles (alebo úplné vymiznutie) expresie RAP-2 proteínu, pričom úroveň poklesu expresie je závislá od úrovne ribozýmovej expresie v cieľovej bunke. Na zavedenie ribozýmu do vybraných buniek (napríklad buniek nesúcich FAS-R alebo p55-R), môže byť použitý akýkoľvek vhodný vektor, napr. plazmid, živočíšny vírusový (retrovírusový) vektor, ktoré sú zvyčajne používané na tento účel (pozri aj bod (i), kde vírus má ako druhú sekvenciu cDNA kódujúcu zvolenú ribozýmovú sekvenciu). (Zhrnutie spôsobov atď. týkajúcich sa ribozýmov pozri v Chen a ďalší, 1992; Zhao a Pick, 1993; Shore a ďalší, 1993; Joseph a

Búrke, 1993; Shimayama a ďalší, 1993; Cantor a ďalší, 1993; Barinaga, 1993; Crisell a ďalší, 1993 a Koizumi a ďalší, 1993). Tento prístup je vhodný, keď RAP-2-RIP interakcia zosilňuje bunkovú cytotoxicitu, v situáciách, kedy je potrebné blokovať túto cytotoxicitu alebo ak RAP-2-RIP interakcia inhibuje NF-κΒ aktiváciu, v situácii, keď je potrebné blokovať túto inhibíciu, aby sa zvýšila NF-κΒ aktivácia, t. j. v oboch prípadoch je potrebné zvýšiť bunkové prežívanie ako v uvedenom bode (ii).

(iii) RAP-2, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty môžu byť použité aj na izoláciu, identifikáciu a klonovanie iných proteínov rovnakej triedy, to znamená proteínov, ktoré sa viažu na RIP alebo na funkčne príbuzné receptory alebo proteíny, ktoré sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Na túto aplikáciu je možné použiť uvedený kvasinkový dvojhybridný systém alebo môže byť použitý v súčasnosti vyvinutý systém využívajúci neprísnu Southem hybridizáciu a následne PCR klonovanie (Wilks a ďalší, 1989). V publikácii Wilks a ďalší je opísaná identifikácia a klonovanie dvoch pravdepodobných proteín-tyrozín kináz aplikáciou neprísnej Southemovej hybridizácie a následným klonovaním prostredníctvom PCR na základe známej sekvencie kinázového motívu, ktorý je zahrnutý v kinázovej sekvenii. Tento prístup môže byť použitý, podľa predloženého vynálezu, použitím sekvencie RAP-2 proteínu na identifikáciu a klonovanie proteínov viažucich RIP.

(iv) Iným prístupom využívajúcim RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu je ich použitie v spôsoboch afinitnej chromatografie na izoláciu a identifikáciu iných proteínov alebo faktorov, na ktoré sú schopné sa viazať, napr. iných proteínov alebo faktorov, ktoré sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Pri tejto aplikácii môžu byť RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa predloženého vynálezu jednotlivo pripojené na matrice pre afinitnú chromatografiu a potom sa môžu uviesť do kontaktu s bunkovými extraktmi alebo izolovanými proteínmi alebo faktormi, o ktorých sa predpokladá, že sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Po afinitnej chromatografii je možné ďalšie proteíny alebo faktory, ktoré sa viažu na RAP-2 proteín alebo na jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu, eluovať, izolovať a charakterizovať.

(v) Ako bolo uvedené, RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu môžu byť použité aj ako imunogény (antigény) na produkciu špecifických protilátok proti nim. Tieto protilátky môžu byť tiež použité na účely purifikácie RAP-2 proteínu (napr. RAP-2 proteínu alebo ktorejkoľvek z jej izoforiem) buď z bunkových extraktov, alebo z transformovaných bunkových línií produkujúcich RAP-2 proteín alebo jeho analógy, alebo fragmenty. Navyše, tieto protilátky môžu byť použité na diagnostické účely, na identifikáciu porúch týkajúcich sa abnormálneho fungovania RIP-sprostredkovaného FAS-R ligandového alebo TNF systému, alebo aktivít nezávislých od RIP, napr. bunkových účinkov indukovaných nadmernou alebo podpriemernou aktivitou FAS-R ligandu alebo TNF, ktoré sú sprostredkované cez RIP alebo bunkových účinkov špecifických pre samotné RIP. Takže ak by sa tieto poruchy týkali nesprávnej funkcie vnútro-bunkového signalizačného systému, v ktorom je zahrnutý RIP proteín alebo rôzne iné uvedené RIP-viažuce proteíny alebo samotný RAP-2 proteín, taktéto protilátky by slúžili ako dôležitý diagnostický nástroj.

Treba tiež poznamenať, že izolácia, identifikácia a charakterizácia RAP-2 proteínu podľa vynálezu sa môže uskutočňovať použitím ktoréhokoľvek z dobre známych štandardných skríningových postupov. Napríklad jeden z ta kýchto skríningových postupov je opísaný kvasinkový dvojhybridný postup, ktorý bol použitý na identifikáciu RIP proteínu (pozri Stanger a ďalší, 1995) a následne RAP-2 proteínu podľa vynálezu (okrem rôznych iných nových proteínov podľa uvedených prihlášok vynálezov, ktoré sú spoločne vlastnené a paralelne v konaní). Podobne, ako je uvedené, je možné využiť iné postupy, ako afinitnú chromatografiu, DNA hybridizačné postupy atď., ako je v oblasti dobre známe, na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu RAP-2 proteínu podľa vynálezu alebo na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu ďalších proteínov, faktorov, receptorov atď., ktoré sú schopné viazať sa na RAP-2 proteín podľa vynálezu

Ako je uvedené, RAP-2 proteín môže byť použitý na vytvorenie protilátok špecifických reagujúcich s biologicky aktívnou RAP-2 proteínovou časťou RAP-2 proteínu a jeho izoforiem. Tieto protilátky alebo ich fragmenty môžu byť použité, ako je podrobne uvedené, pričom treba brať do úvahy, že v týchto aplikáciách sú protilátkami alebo ich fragmentárni protilátky alebo fragmenty s uvedenou špecificitou.

Na základe zistení podľa predloženého vynálezu, a to, že RAP-2 sa špecificky viaže na RIP, a sám osebe je mediátorom/modulátorom RIP a môže teda sprostredkovať/modulovať RIP účinok v dráhach zápalu, bunkovej smrti a bunkového prežívania spôsobmi, v ktorých RIP funguje nezávisle alebo spolu s inými proteínmi (napr. FAS-R, p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, Gl a TRADD v dráhach bunkovej smrti, alebo s TRAF2 v dráhach bunkového prežívania), existuje potreba navrhnúť liečivá, ktoré môžu zosilniť alebo inhibovať RAP-2-RIP interakciu, ak je to potrebné, a to v závislosti od toho, ktorá z týchto dráh sa má zosilniť/inhibovať RAP-2-RIP interakciou. Existuje mnoho chorôb, v ktorých môžu byť takéto liečivá veľmi nápomocné. Okrem iných ide o akútnu hepatitídu, pri ktorej sa zdá, že akútne poškodenie pečene odráža FAS-R ligandom sprostredkovanú smrť pečeňových buniek; autoimunitne indukovanú bunkovú smrť, ako smrť β Langerhansových buniek pankreasu, čoho výsledkom je diabetes: smrť buniek pri odmietnutí štepu hostiteľom (napr. obličiek, srdca a pečene); smrť oligodendrocytov v mozgu pri skleróze multiplex; AIDS-inhibovaná samovražda T buniek, ktorá spôsobuje proliferáciu AIDS vírusu, a tým AIDS ochorenie.

le možné, že RAP-2 alebo jedna alebo viacero z jeho izoforiem môže slúžiť ako „prirodzený“ inhibítor RIP v jednej alebo vo viacerých z uvedených dráh a môžu byť teda využité ako uvedené špecifické inhibítory RIP. Podobne, je možné skrínovať protilátky, aby sa získali špecifické liečivá, ktoré sú schopné inhibovať interakciu RAP-2-RIP.

Čo sa týka tu uvedených protilátok, výraz „protilátka“ znamená polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky (mAbs), chiméme protilátky, anti-idiotypové (anti-Id) protilátky proti protilátkam, ktoré je možné značiť v roztoku alebo v naviazanej forme, ako aj ich fragmenty získané akoukoľvek známou technikou, ako napríklad, ale bez obmedzenia, technikou enzymatického štiepenia, technikou peptidovej syntézy alebo rekombinantnantnou technikou.

Polyklonálne protilátky sú heterogénnou populáciou protilátkových molekúl odvodených zo séra živočíchov imunizovaných antigénom. Monoklonálna protilátka obsahuje v podstate homogénnu populáciu protilátok špecifických proti antigénom, ktoré obsahujú v podstate podobné epitopové väzobné miesta. MAbs sa dajú získať spôsobmi známymi pre priemerného odborníka v oblasti. Pozri, napríklad Kohler a Milstein, Náture, 256:495-497 (1975); US patent č. 4376110; Ausubel a ďalší, vyd. Harlow and Lane

Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan a ďalší, vyd. Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), pričom obsah týchto publikácií je tu komplet začlenený ich citáciou. Takýmito protilátkami môžu byť akékoľvek protilátky triedy imunoglobulínov vrátane IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a ktorejkoľvek ich podtriedy. Hybridómy produkujúce mAb podľa predloženého vynálezu môžu byť kultivované in vitro, in situ alebo in vivo. Produkcia vysokých titrov mAbs in vivo alebo in situ robí túto metódu v súčasnosti najvýhodnejšou.

Chiméme protilátky sú molekuly, ktorých rozličné časti sú odvodené od rôznych živočíšnych druhov, ako napríklad variabilná oblasť je odvodená od hlodavčej mAb a konštantnú oblasť tvorí ľudský imunoglobulín. Chiméme protilátky sa primáme používajú na zníženie imunogénnosti pri aplikácii a na zvýšenie výťažku pri produkcii, napríklad, tam, kde hlodavčie mAbs majú vyššie výťažky z hybridómov, ale vyššiu imunogénnosť u ľudí, sú používané ľudské/hlodavčic chiméme mAbs. Chiméme protilátky a spôsoby ich produkcie sú v oblasti známe (Cabilly a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984): Morrison a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne a ďalší, Náture 312:643-646 (1984); Cabilly a ďalší, európska prihláška vynálezu č. 125023 (publikovaná 14. novembra 1984); Neuberger a ďalší, Náture 314:268-270 (1985); Taniguchi a ďalší, európska prihláška vynálezu č. 171496 (zverejnená 19. februára 1985); Morrison a ďalší, európska prihláška vynálezu 173494 (zverejnená 5. marca 1986); Neuberger a ďalší, PCT prihláška WO8601533 (zverejnená 13. marca 1986); Kudo a ďalší, európska prihláška vynálezu č. 184187 (zverejnená 11. júna 1986); Sahagan a ďalší, J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson a ďalší, medziná-rodná prihláška vynálezu č. WO8702671 (zverejnená 7. mája 1987); Liu a ďalší, Proc. Natl. Acad. Set USA 84:3439-3443 (1987); Sun a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better a ďalší, Science 240:1041-1043 (1988); a Harlow a Lane, Antibodies: A laboratory manual. Tieto publikácie sú tu komplet zahrnuté ich citáciou.

Anti-idiotypová (anti-Id) protilátka je protilátka, ktorá rozoznáva unikátne determinanty, ktoré sú vo všeobecnosti asociované s antigén-viažucim miestom protilátky. Id protilátka sa môže pripraviť imunizáciou živočícha rovnakého druhu a genetického typu (napr. myšacieho kmeňa) ako zdroj mAb, proti ktorej sa má pripraviť anti-Id. Imunizovaný živočích bude rozoznávať a odpovedať proti idiotypovým determinantám imunizačnej protilátky produkciou protilátky proti týmto idiotypovým determinantám (anti-Id protilátky). Pozri napríklad US patent č. 4699880, ktorý je tu celý zahrnutý jeho citáciou.

Anti-Id protilátka môže byť použitá aj ako „imunogén“ na indukciu imunitnej odpovede v ešte inom živočíchovi, na produkciu takzvanej ani-anti-Id protilátky. Anti-anti-Id protilátka môže byť epitopicky identická s pôvodnou mAb, ktorá indukovala anti-Id. Takže použitím protilátok proti idiotypovým determinantám mAb je možné identifikovať iné klony, ktoré exprimujú protilátky s identickou špecifitou.

Z toho vyplýva, že mAbs generované proti RAP-2 proteinu, jeho analógom, fragmentom alebo derivátom podľa vynálezu môžu byť použité na indukciu anti-Id protilátok vo vhodných živočíchoch, ako napríklad BALB/c myšiach. Slezinové bunky z takto imunizovaných myší sa použijú na tvorbu anti-ld hybridómov, ktoré budú vylučovať anti-Id mAbs. Ďalej je možné anti-ld mAbs spojiť s nosičom, ako napríklad pijavicovým hemocyaninom (KLH) a použiť ich na imunizáciu ďalších BALB/c myší. Séra z týchto myší budú obsahovať anti-anti-Id protilátky, ktoré budú schopné viazať sa na pôvodnú mAb Špecifickú pre epitop uvedeného RAP-2 proteínu, jeho analógov, fragmentov a derivátov.

Anti-Id mAbs tak majú svoje vlastné idiotypové epitopy alebo „idiotopy“, ktoré sú štruktúrne podobné s hodnoteným epitopom, ako napríklad GRB proteín-a.

Výraz protilátka zahŕňa aj intaktné molekuly, ako aj ich fragmetny, ako napríklad Fab a F(ab')₂, ktoré sú schopné viazať antigén. Fab a F(ab')₂ fragmentom chýba Fc fragment intaktnej protilátky, rýchlejšie sa strácajú z obehu a môžu sa menej nešpecifický tkanivovo viazať ako intaktná protilátka (Wahl a ďalší, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Je zrejmé, že Fab a F(ab')₂ a iné fragmenty protilátok užitočných podľa predloženého vynálezu môžu byť použité na detekciu a kvantifikáciu RAP-2 proteínu v súlade s tu opísanými spôsobmi pre intaktné protilátkové molekuly. Takéto fragmenty sa typicky produkujú proteolytickým štiepením, použitím enzýmov, ako papainu (na vytvorenie Fab fragmentov) alebo pepsínu (na vytvorenie F(ab')₂fragmentov).

Protilátka je označená ako „schopná viazať“ molekulu, ak j c schopná špecificky reagovať s molekulou, a tým dochádza k väzbe molekuly a protilátky. Výraz „epitop“ znamená tú časť ktorejkoľvek molekuly, ktorá môže byť viazaná protilátkou, ktorá je schopná byť aj rozoznávaná touto protilátkou. Epitopy alebo „antigénové determinanty“ zvyčajne pozostávajú z chemicky aktívnych povrchových zoskupení molekúl, ako napríklad aminokyselinových alebo sacharidových bočných reťazcov, a majú špecifické trojrozmerné štruktúrne vlastnosti, ako aj špecifické nábojové charakteristiky.

„Antigén“ je molekula alebo časť molekuly, ktorá je schopná byť viazaná protilátkou, a ktorá je schopná aj indukovať živočícha, aby produkoval protilátku schopnú viazať sa na epitop tohto antigénu. Antigén môže mať jeden alebo viac ako jeden epitop. Uvedená špecifická reakcia znamená to, že antigén bude reagovať vysoko selektívnym spôsobom so zodpovedajúcou protilátkou a nebude reagovať s mnohými inými protilátkami, ktoré môžu byť vyvolané inými antigénmi.

Protilátky, vrátane fragmentov protilátok, užitočné podľa vynálezu, môžu byť použité na kvantitatívnu alebo kvalitatívnu detekciu RAP-2 proteínu vo vzorke alebo na detekciu prítomnosti buniek, ktoré exprimujú RAP-2 proteín podľa vynálezu. To sa môže uskutočniť imunofluorescenčnými technikami využitím fluorescenčné značenej protilátky (pozri nižšie) spolu so svetelným mikroskopom, prietokovou cytometriou alebo fluorometrickou detekciou.

Protilátky (alebo ich fragmenty) užitočné podľa vynálezu, môžu byť využité histologický, ako napríklad v imunofluorescenčncj alebo imunoelektrónovej mikroskopu, na in situ detekciu RAP-2 proteínu podľa predloženého vynálezu. In situ detekcia sa môže uskutočňovať odohraním histologickej vzorky od pacienta a použitím značenej protilátky podľa vynálezu pre takúto vzorku. Protilátka (alebo fragment) sa výhodne poskytuje náterom alebo naliatím značenej protilátky (alebo fragmentu) na biologickú vzorku. Použitím takéhoto postupu je možné stanoviť nielen prítomnosť RAP-2 proteínu, ale aj jeho distribúciu v skúmanom tkanive. Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že použitím predloženého vynálezu bude možné modifikovať široký rozsah histologických metód (ako napríklad farbiace postupy) na dosiahnutie in situ detekcie.

Takéto testy pre RAP-2 proteín podľa vynálezu typicky zahŕňajú inkubovanie biologickej vzorky, ako napríklad biologickej tekutiny, tkanivového extraktu, čerstvo izolovaných buniek ako lymfocytov alebo leukocytov, alebo buniek, ktoré boli inkubované v tkanivovej kultúre, v prítomnosti detekovateľne značenej protilátky, ktorá je schopná identifikovať RAP-2 proteín, a detekovanie protilátky ktoroukoľvek z množstva techník, ktoré sú v oblasti dobre známe.

Biologická vzorka sa môže ošetriť podkladom na tuhej fáze alebo nosičom, ako je nitrocelulóza, alebo iným tuhým podkladom alebo nosičom, ktorý je schopný imobilizovať bunky, bunkové častice alebo rozpustné proteíny. Podklad alebo nosič sa potom môže premyť vhodnými tlmivými roztokmi, a následne ošetriť detekovateľne značenou protilátkou podľa vynálezu, ako bolo uvedené. Tuhý fázový podklad alebo nosič sa potom môže premyť s tlmivým roztokom druhý raz, aby sa odstránila nenaviazaná protilátka. Bežnými prostriedkami je potom možné detekovať množstvo naviazanej značky na tuhom podklade alebo nosiči.

Výrazy „podklad na tuhej fáze“, „nosič na tuhej fáze“, „tuhý nosič“, „podklad“ alebo „nosič“ znamenajú akýkoľvek podklad alebo nosič, ktorý je schopný viazať antigén alebo protilátky. Dobre známe podklady alebo nosiče zahŕňajú sklo, polystyrén, polypropylén, polyetylén, dextrán, nylonové amylázy, prirodzené alebo modifikované celulózy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Na účely vynálezu môže byť nosič buď do určitej miery rozpustný, alebo nerozpustný. Podkladový materiál môže mať v skutočnosti akúkoľvek možnú štruktúrnu konfiguráciu, pokiaľ je pripojená molekula schopná viazať antigén alebo protilátku. Takže konfigurácia podkladu alebo nosiča môže byť sférická, ako napríklad guľovitá, valcovitá, ako napríklad vnútri skúmavky alebo na vonkajšom povrchu tyčinky. Alternatívne môže byť povrch rovný, ako napríklad platňa, testovací pásik a pod. Výhodné podklady alebo nosiče zahŕňajú polystyrénové guľôčky. Priemerný odborník v oblasti bude vedieť vybrať iné vhodné nosiče na viazanie protilátky alebo antigénu, alebo bude schopný nájsť ich použitím rutinného experimentovania.

Väzobný účinok daného množstva protilátky podľa vynálezu ako je uvedená, môže byť stanovený dobre známymi spôsobmi. Priemerný odborník v oblasti bude schopný stanoviť funkčné a optimálne testovacie podmienky pre každé stanovenie využitím rutinného experimentovania.

Do testovacej reakcie je možné pridať aj iné kroky, ako napríklad premývanie, miešanie, trepanie, filtrovanie a podobne, ak je to zvykom alebo nevyhnutné v konkrétnej situácii.

Jedným zo spôsobov, v ktorých môže byť protilátka podľa vynálezu detekovateľne značená, je pripojenie protilátky ku enzýmu a jej použitie v enzýmovom imunologickom teste (EIA). Tento enzým, keď sa neskôr vystaví vhodnému substrátu, bude reagovať so substrátom takým spôsobom, že sa vytvorí chemická zlúčenina, ktorú je možné detekovať napríklad spektrofotometricky, fluorometricky alebo vizuálnymi prostriedkami. Enzýmy, ktoré môžu byť použité na detekovateľné značenie protilátky, zahŕňajú, ale nie sú limitované na, malát dehydrogenázu, stafylokokovú nukleázu, δ-5-steroid izomerázu, kvasinkovú alkohol dehydrogenázu, α-glycerofosfát dehydrogenázu, triózofosfát izomerázu, chrenovú peroxidázu, alkalickú fosfatázu, asparaginázu, glukóza oxidázu, β-galaktozidázu, ribonukleázu, urcázu, katalázu, glukózo-6-fosfát dehydrogenázu, glukoamylázu a acetylcholín esterázu. Detekcia sa môže uskutočňovať kolorimetrickými metódami, ktoré využívajú chromogénny substrát pre enzým. Detekcia sa môže uskutočňovať aj vizuálnym porovnaním enzymatickej reakcie substrátu v porovnaní s podobne pripravenými štandardmi.

Detekcia sa môže uskutočňovať použitím ktoréhokoľvek z rôznych iných imunologických testov. Napríklad rádioaktívnym značením protilátok alebo fragmentov protilátok je možné detekovať R-PTPázu prostredníctvom použitia rádioimunologického testu (RIA). Dobrý opis RIA je možné nájsť v Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, od Work, T.S. a ďalší, North Holland Publishing Company, NY (1978), najmä v časti s názvom „An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques“ od Chard, T., pričom publikácia je do tohto opisu zahrnutá jej citáciou. Rádioaktívny izotop je možné detekovať prostredníctvom použitia g snímača alebo scintilačného snímača, alebo autorádiografie.

Je možné značiť protilátku podľa predloženého vynálezu aj fluorescenčnou zlúčeninou. Keď sa fluorescenčné značená protilátka vystaví svetlu so správnou vlnovou dĺžkou, je možné detekovať jej prítomnosť na základe fluorescencie. Medzi najbežnejšie používané flurescenčne značené zlúčeniny patria fluoresceín izotiokyanát, rodamín, fykoerytrín, pykocyanín, alofykocyanín, o-ftaldehyd a fluorescamín.

Protilátku je možné detekovateľne značiť aj použitím fluorescenciu emitujúcich kovov ako ^l52E alebo iných kovov lantanoidovej série. Tieto kovy je možné pripojiť na protilátku použitím takých kovových chelatačných skupín, ako je kyselina dietyléntriamínpentaoctová (ETPA).

Protilátku je možné detekovateľne značiť aj pripojením protilátky na chemiluminiscenčnú zlúčeninu. Prítomnosť protilátky s chemiluminiscenčným príveskom sa potom determinuje detekovaním prítomnosti luminiscencie, ktorá vzniká počas chemickej reakcie. Príkladmi výnimočne užitočných chemiluminiscenčne značených zlúčenín sú luminol, izoluminol, teromatický akridínium ester, imidazol, akridiniová soľ a oxalát ester.

Podobne je možné na značenie protilátky podľa predloženého vynálezu použiť bioluminiscenčnú zlúčeninu. Bioluminiscencia je typom chemiluminiscencie, ktorá sa nachádza v biologických systémoch, v ktorých katalytický proteín zvyšuje účinnosť chemiluminiscenčnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscenčného proteínu sa determinuje detekciou prítomnosti luminiscencie. Dôležitými bioluminiscenčnými zlúčeninami na účely značenia sú luciferín, luciferáza a aequorín.

Molekula protilátky podľa predloženého vynálezu sa môže upraviť na použitie v imunometrickom teste, tiež známom ako „dvojstranný“ alebo „sendvičový“ test. V typickom imunometrickom teste sa určité množstvo neznačenej protilátky (alebo fragmentu protilátky) naviaže na tuhý podklad alebo nosič a pridá sa určité množstvo detekovateľne značenej rozpustnej protilátky na umožnenie detekcie a/alebo kvantifikácie temámeho komplexu, ktorý sa vytvorí medzi protilátkou na tuhej fáze, antigénom a značenou protilátkou.

Typické a výhodné imunometrické testy zahŕňajú „priame“ testy, v ktorých sa protilátka naviazaná na tuhú fázu najprv skontaktuje so vzorkou, ktorá má byť testovaná, na extrahovanie antigénu zo vzorky vytvorením binárneho tuhého komplexu protilátka-antigén. Po vhodnom inkubačnom čase sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránil zvyšok kvapalnej vzorky, vrátane nezreagovaného antigénu, ak sa tam nejaký nachádza, a potom sa uvedie do kontaktu s roztokom obsahujúcim neznáme množstvo značenej protilátky (ktorá funguje ako „reporterová molekula“). Po druhom inkubačnom čase na umožnenie toho, aby značená protilátka vytvorila komplex s antigénom naviazaným na tuhý podklad alebo nosič prostredníctvom nezna čenej protilátky sa tuhý podklad alebo nosič premyje druhý raz, aby sa odstránila nezreagovaná značená protilátka.

V inom type „sendvičového“ testu, ktorý tiež môže byť užitočný s antigénmi podľa predloženého vynálezu, sú použité takzvané „simultánne“ a „reverzné“ testy. Simultánny test zahŕňa jediný inkubačný krok, v ktorom sa zároveň ku testovanej vzorke pridáva tak protilátka naviazaná na tuhý podklad alebo nosič, ako aj značená protilátka. Po ukončení inkubovania sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránili zvyšky kvapalnej vzorky a značenej protilátky mimo komplexu. Prítomnosť značenej protilátky asociovanej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom stanovuje ako by išlo o bežný „priamy“ sendvičový test.

V „reverznom“ teste sa využíva postupné pridávanie najprv roztoku značenej protilátky do kvapalnej vzorky, a potom, po vhodnom inkubačnom čase, nasleduje pridanie neznačenej protilátky naviazanej na tuhý podklad alebo nosič. Po druhej inkubácii sa tuhá fáza premyje bežným spôsobom, aby sa zbavila zvyšku testovanej vzorky a roztoku nezreagovanej značenej protilátky. Determinácia značenej protilátky asociovanej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom uskutočňuje ako v „simultánnom“ a „priamom“ teste.

RAP-2 proteín podľa vynálezu sa môže produkovať akoukoľvek štandardnou rekombinantnou DNA technikou (pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989 a Ansabel a ďalší, 1987-1995), v ktorej sa vhodné eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky dobre známe v oblasti transformujú príslušnými eukaryotickými alebo prokaryotickými vektormi, ktoré obsahujú sekvencie kódujúce proteíny. Z toho vyplýva, že predložený vynález sa týka tak expresných vektorov, ako aj transfomovaných hostiteľov, na produkciu proteínov podľa vynálezu. Ako bolo uvedené, tieto proteíny zahŕňajú aj ich biologicky účinné analógy, fragmenty a deriváty, takže vektory, ktoré ich kódujú, tiež zahŕňajú vektory kódujúce analógy a fragmenty týchto proteinov a transformovaní hostitelia zahŕňajú aj hostiteľské bunky, ktoré produkujú takéto analógy a fragmenty. Derivátmi týchto proteínov, ktoré sú produkované transformovanými hostiteľmi, sú deriváty produkované štandardnými modifikáciami proteínov alebo ich analógov alebo fragmentov.

Predložený vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci RAP-2 proteín, ktorý kóduje aj vírusový povrchový proteín schopný viazať sa na špecifické cieľové bunkové (napr. nádorové bunky) povrchové proteíny, aby sa priamo zaviedli RAP-2 proteínové sekvencie do buniek. Ďalej farmaceutické prostriedky podľa vynálezu obsahujú ako účinnú zložku oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu anti-sense sekvenciu RAP-2 proteínovej sekvencie.

Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu obsahujú dostatočné množstvo účinnej zložky, aby sa dosiahol zamýšľaný účel. Navyše, farmaceutické prostriedky môžu obsahovať vhodné farmaceutický prijateľné nosiče obsahujúce vehikulá a prídavné látky, ktoré uľahčujú spracovanie účinných zložiek do prípravkov, ktoré je možné použiť farmaceutický, a ktorými je možné stabilizovať takéto prípravky na podanie subjektu, ktorý ich potrebuje, ako jc dobre známe pre priemerného odborníka v oblasti.

Predpokladá sa, že RAP-2 proteín a jeho izoformy alebo izotypy sa exprimujú v rôznych tkanivách v značne odlišných hladinách a zjavne aj s odlišným spektrom izotypov, analogickým spôsobom ako sú exprimované rôzne iné proteíny podieľajúce sa na vnútrobunkových signalizačných dráhach, ako je uvedené v citovaných spoločne vlastnených prihláškach vynálezov, ktoré sú paralelne v konaní.

Tieto odlišnosti sa môžu pravdepodobne podieľať na tkanivovo-špecifických znakoch odpovede na Fas/APOl-ligand a TNF. V prípade iných CED3/ICE homológov (Wang a ďalší, 1994; Alnemri a ďalší, 1995) pôvodcovia predloženého vynálezu ukázali (v uvedených prihláškach vynálezov), že MACH izoformy, ktoré obsahujú nekompletné CED3/ICE oblasti (napr. MACHa3), majú inhibičný účinok na aktivitu koexprimovaných MACHal alebo MACHa2 molekúl; zistilo sa tiež, že blokujú mechanizmus indukcie smrti bunkovej obrany proti Fas/APOl- a TNF-sprostredkovanej cytotoxicite. Predpokladá sa podobný inhibičný účinok aspoň niektorých G1 izoforiem (G1 je v súčasnosti izolovaný nový Mch4- a možno MACH-viažuci proteín, a aj MORT-l-viažuci proteín, ktorý má MORT moduly a proteázovú doménu, pozri spoločne vlastnenú IL120367, ktorá je paralelne v konaní). Značná heterogenita MACH izoforiem a podobne predpokladaná analogická heterogenita G1 izoforiem, ktorá značne prevyšuje heterogenitu pozorovanú pre ktorúkoľvek inú proteázu z CED3/ICE rodiny, by mala umožniť veľmi jemné ladenie funkcie aktívnych MACH izoforiem, a analogicky aj aktívnych G1 izoforiem. Takže, ako bolo uvedené, RAP-2 proteíny alebo ich možné izoformy môžu mať rôzne účinky v odlišných tkanivách vo vzťahu k ich interakcii s RIP, a tým k ich vplyvu na rovnováhu medzi aktiváciou dráh bunkovej smrti a bunkového prežívania, ako je opísané.

Je tiež možné, že niektoré možné RAP-2 izoformy majú iné funkcie. Napríklad RAP-2 alebo niektoré RAP-2 izoformy môžu slúžiť ako ukotvovacie miesta molekúl, ktoré sa podieľajú na iných, necytotoxických účinkoch Fas/APOl a TNF receptorov, prostredníctvom interakcie s RJP alebo aj nezávisle od RJP.

Kvôli unikátnej schopnosti Fas/APOl a TNF receptorov spôsobovať zápal, bunkovú smrť, ako aj schopnosti TNF receptorov spustiť iné aktivity ničiace tkanivá, mohli by byť aberácie vo funkcii týchto receptorov značne ničivé proti organizmu. V skutočnosti sa ukázalo, že tak nadmerná, ako aj deficíentná funkcia týchto receptorov sa podieľa na patologickej manifestácii rôznych chorôb (Vassalli, 1992; Nagata a Golstein, 1995). Identifikácia molekúl, ktoré sa podieľajú na signalizačnej aktivite receptorov, a nájdenie spôsobov ako modulovať aktivitu týchto molekúl, by mohlo určiť nové terapeutické prístupy. Z nasledujúcich príkladov budú zrejmé iné predmety vynálezu.

Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný v nasledujúcich neobmedzujúcich príkladoch a na priložených obrázkoch.

Treba poznamenať, že (i) dvojhybridný skríning a dvojhybridný β-galaktozidázový expresný test; (ii) indukovaná expresia, metabolické značenie a imunoprecipitácia proteínov; (iii) in vitro väzba; (iv) stanovenie cytotoxicity; a (v) Northem a sekvenčná analýza (pozri aj Boldin a ďalší, 1995b) 2, 3 (pozri aj Boldin a ďalší, 1996) a 4, opísané s ohľadom na MORT-1 a MORT-1 viažuci proteín (napr. MACH), ako aj novo izolovaný proteín G1 (pozri IL120367), sú rovnako aplikovateľné (s nejakými modifikáciami) pre zodpovedajúcu izoláciu, klonovanie a charakterizáciu RAP-2 a jeho možných izoforiem podľa predloženého vynálezu. Tieto postupy tak predstavujú postupy na použite na izoláciu, klonovanie a charakterizáciu RAP-2 podľa predloženého vynálezu, ako sú podrobne uvedené, napr. v rovnakej alebo v ekvivalentnej forme, v spoločne vlastnených izraelských prihláškach Č. 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 a 120367, ako aj v zodpovedajúcej PCT prihláške č. PCT/US96/10521. Ďalej, čo sa týka NIK proteínu a jeho úlohy v aktivácii NF-kB, a tým v bunkovom prežívaní, a úlohy TRAF2 v tejto dráhe bunkového prežívania, napríklad interakcie medzi TRAF2 a RIP a inými proteínmi, tieto skutočnosti sú podrobne uvedené pôvodcami tohto vynálezu v spoločne vlastnených IL117800, IL119133, ktoré sú paralelne v konaní a v Malinin a ďalší, 1997.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 (A,B) (sekv. č. 1) znázorňuje nukleotidovú sekenciu RAP-2, v ktorej sú štartovací a stop kodón podčiarknuté. Šípky označujú začiatok 1,5 kb klonu získaného dvoj hybridným skríningom.

Obrázok 2 (A,B) (sekv. č. 2) znázorňuje nukleotidovú sekvenciu klonu č. 41072 (pozri príklad 1), v ktorej sú štartovací a stop kodón podčiarknuté.

Obrázok 3 A (/1, /2) znázorňuje odvodené aminokyselinové sekvencie ľudských (20.4 komplet a Human shrť) a hlodavčích (NEMO komplet a Mouse part) zostrihových variantov RAP-2 a B (/1,/2) znázorňuje publikovanú sekvenciu FJP-2, ktoré sú porovnané použitím softvérového balíčka dostupného od BCM Search Launcher (Baylor College of Medicíne, Houston, TX). Homologické aminokyseliny sú zarámované, zhodné aminokyseliny sú sivotieňované. Hviezdičky v (B) označujú pravdepodobný motív podobný leucínovému zipsu (LZ) vo FIP-2.

Obrázok 4 opisuje molekulovú charakterizáciu RAP-2. Na A je znázornená Northem blotová hybridizácia ľudského MTN Blot I (Clontech) s DNA fragmenom RAP-2. Na B je analyzované RAP-2 viazanie sa na RIP, ako je podrobne opísané v príklade 3. Na C sa detekovala NIK-RAP-2 interakcia ako v (B) s tou výnimkou, že pre Westem bloting boli použité anti-FLAG protilátky a nasledovala imuno-precipitácia s anti-His6. Šípky označujú polohu imunoprecipitovaných proteínov.

Obrázok 5 je grafickým znázornením značnej redukcie NF-κΒ a aktivácie c-Jun rôznymi stimulmi, ektopickou expresiou RAP-2, ako je opísané v príklade 4. HEK-293T bunky sa prechodne transfekovali reportérovým plazmidom (HÍVLTR-Luc alebo CMV-Luc pre NF-κΒ (A) a GAL-4Luc pre cJun (B) aktivačné testy) a expresným vektorom pre uvedený induktor a buď prázdnym vehikulom (pcDNA3 - na obrázku označený samostatne), alebo plazmidom kódujúcim kompletný RAP-2 (pcRAP-2 - na obrázku označené ako plus). Aktivácia luciferázovej aktivity reporterového génu je vyjadrená v relatívnych luciferázových jednotkách (R.L.U.).

Obrázok 6 znázorňuje, že RAP-2 má podobné represívne správanie proti NF-κΒ a c-Jun v širokom koncentračnom rozsahu. TRAF2 sa prechodne exprimoval v HEK293T bunkách spolu s rôznymi uvedenými množstvami buď pcRAP-2 (sense), alebo pcRAP-2-a/s (antisense) konštruktov. Na stanovenie NF-κΒ aktivácie sa zaviedol pHIVLTR-Luc reporterový plazmid (A) a na stanovenie c-Jun (B) aktivácie sa zaviedol pGAL4-Luc reporterový plazmid. Luciferázový test sa uskutočňoval, ako je opísané pre obrázok 5 v príklade 4.

Obrázok 7 znázorňuje, že RAP-2 značne zvyšuje potenciál signálom indukovanej fosforylácie c-Jun bez toho, aby interferoval s JNK1/2 aktivačnou hladinou.

(A) Celkové bunkové lyzáty HEK-293T buniek transfekované uvedenými expresnými konštruktmi spolu s buď pcDNA3-nosičom, označené na obrázku znamienkom (-), alebo s pcRAP označené na obrázku ako (-), sa identifikovali prostredníctvom Westem blot analýzy s anti-fosfo-Jun protilátkami, ako je opísané v príklade 5. Kontrolná mem brána znázornená na spodnom paneli sa znovu sondovala s anti-total-c-Jun Abs (NEB).

(B) Aktivované JNK1/2 z HEK-293T buniek transfekovaných buď pcDNA3, alebo pcRAP-2, ošetrené s hrTNFa s predlžujúcimi sa časovými periódami, sa detekovali prostredníctvom Westem blotingu celkových lyzátov s Abs proti fosfo-JNK, ako je podrobne opísané v príklade 5.

(C) HEK-293T bunky kotransfekované prázdnym vektorom, pcRAP-2 a pcRIP v rôznych kombináciách, spolu s HA-JNK1-expresným plazmidom. JNK1 sa potom imunoprecipitoval prostredníctvom jeho N-koncového HA-prívesku a jeho schopnosť fosforylovať bakteriálne produkovaný purifikovaný GST-Jun sa stanovila v in vitro kinázovom teste. Reakčné produkty sa analyzovali na SDS-PAGE. GST-Jun je označené šípkou.

Obrázok 8 ukazuje, že RAP-2 nekonkuruje NF-κΒ a AP-1 pri väzbe DNA. HEK-293T sa transformovali uvedenými proteínmi buď samostatne (-), alebo spolu s pcRAP-2 (+). Jadrové extrakty pripravené z buniek sa koinkubovali s ³²P-značenými oligonukleotidmi obsahujúcimi klasické rozoznávacie sekvencie pre AP-1 (A) alebo NF-κΒ (B). Reakčné produkty sa analyzovali nedenaturačnou PAGE.

Obrázok 9 ukazuje, že RAP-2 ovplyvňuje bazálnu hladinu NF-κΒ v HEK-293T a HeLa bunkách, ktoré boli prechodne transfekovaná rôznymi množstvami buď RAP-2 (sense), alebo RAP-2-antisense (a/s). Všetky manipulácie sa uskutočňovali ako je opísané pre obrázok 6, v príklade 4.

Obrázok 10 znázorňuje funkčné vlastnosti seriálnych delécií RAP-2. A je schematickým znázornením postupných C-koncových delécií RAP-2. Spoločné pre všetky skrátenia je intaktný RAP-2 N-koniec, zatiaľ čo C-tenminálne konce sú označené šípkami. RIP, NIK, ΙΚΚβ a TIP60 viažuca oblasť sú podčiarknuté. Tri vyšrafované rámiky zodpovedajú pravdepodobným motívom podobným leucínovému zipsu. B znázorňuje účinok nadexpresie delečných konštruktov opísaných v A na NF-κΒ aktiváciu v HEK-293T bunkách prostredníctvom RelA, TRAF2, TNF a NIK, použitím HIV-LTR luciferázového reporterového plazmidu pre NF-κΒ. Aktivácia luciferázovej aktivity reporterového génu je vyjadrená v relatívnych luciferázových jednotkách (R.L.U.).

Obrázok 11 znázorňuje mapovanie RAP-2 funkčných a väzobných oblastí.

(A) Rôzne delécie RAP-2 sa testovali z hľadiska ich schopnosti viazať sa na uvedené proteíny vnútri fransfekovanej kvasinky (párne stĺpce) a cicavčích HEK-293T buniek (nepárne stĺpce). Dva sĺpce najviac vpravo znázorňujú schopnosť rovnakých delečných mutantov transfekovať v množstvách podrobne uvedených v príklade 9 HEK-293T bunky, inhibovať NF-κΒ aktiváciu a zosilniť c-Jun hyperfosforyláciu (c-Jun), ako odpoveď na pôsobenie TNF-ct. Hrubosť krížikov zodpovedá intenzite daného účinku. Hviezdičky indikujú, žc pozorované účinky označených konštruktov na Rel-A stimuláciu sú zreteľné (pozri obrázok 10B).

(B) Zhrnutie schémy znázorňujúcej lokalizáciu väzobných (horná časť) a funkčných (spodná časť) oblastí RAP-2, ako sa identifikovalo z delečnej analýzy znázornenej na (A), pričom sú usporiadané pozdĺž proteínovej chrbtice. Vyšrafované časti označujú možné umiestnenie hraníc zodpovedajúcich minimálnych oblastí.

Obrázok 12 ukazuje, že ser-146 v RAP-2 je esenciálny pre jeho schopnosť indukovať c-Jun hyperforsforyláciu v polohe ser-63. Je znázornený Westem blot, v ktorom wt znamená divý typ, S148A znamená, že ser v polohe 148 sa nahradil ala a vektor je prázdny kontrolný vektor.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad I

Klonovanie a izolácia RAP-2 proteínu, ktorý sa viaže na RIP protein

Dvojhybridný skríning, sekvenovanie a predbežná analýza

Použitím dvojhybridného skríningu knižnice B-buniek s RIP ako návnadou (pozri napr. Fields a Song, 1989, WO/96/18641), sa izoloval kloň s veľkosťou približne 1,5 Kb. Tento 1,5 Kb kloň (pozri sekvenciu na obrázkoch 1 a 2) bol použitý na skríning fágovej cDNA knižnice, čoho výsledkom bol približne 2,0 Kb kloň, ktorého sekvencia je znázornená na obrázku 1.

Využitím EST porovnávania so sekvenciou 1,5 Kb klonu sa získal EST fragment, ktorý tvorí 3' koniec J.M.A.G.E. konsorcia klonu č. 41072 (Research Genetics Inštitúte). Z tohto klonu, ktorý pochádza z knižnice fetálneho mozgu, boli publikované len dva malé sekvenčné fragmenty na jeho 3' a 5' koncoch. Po získaní klonu sa tento sekvenoval a zistilo sa, že aj tieto publikované sekvenčné fragmenty obsahujú chyby. Zistilo sa, že druhý kloň (obr. 2) je zhodný s klonom na obrázku 1 v jeho kódujúcej oblasti, ale sú odlišné v 5'-nekódujúcej oblasti. Preto sa predpokladá, že obe cDNA sú alternatívne zostrihnuté formy rovnakého génu.

Analýza sekvencie ukázala, že podobne ako RAP, RAP-2 protein zjavne nemá „smrtiacu doménu“, nemá MORT modul, nemá proteázovú doménu podobnú doménam ICE rodiny, nemá kinázovú doménu, ani TRAF domény (pozri uvedené spoločne vlastnené prihlášky vynálezu, ktoré sú paralelne v konaní, a rôzne inc publikácie, najmä Malinin a ďalší, 1997, ktoré sa týkajú všetkých rôznych domén prítomných vo vnútrobunkových signalizačných dráhach). Nenašli sa ani žiadne závažné motívy v danej sekvencií, s výnimkou troch blokov podobných leucínovému zipsu (LZ), nepravidelne distribuovaných pozdĺž proteín kódujúcej oblasti. Tieto oblasti sú označené ako „podobné“, pretože dve z nich obsahujú Leu na Val, Met alebo Íle substitúcie. Hoci sú zvyčajne považované za konzervatívne, nie je jasné, či takéto zmeny vnútri domény leucinového zipsu umožňujú, aby si protein zachoval svoju funkčnú aktivitu, t. j. schopnosť viazať sa na iné LZs. Väzobné štúdie odhalili, že RAP-2 sa v podstate viaže na RIP, RAP-2 nie je schopný viazať sa na TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R a MACH (v doteraz uskutočnených štúdiách). Tieto výsledky podporujú skutočnosť, že RAP-2 zjavne nemá „smrtiace domény“ a MORT moduly.

Preto je zrejmé, že RAP-2 je špecifický RIP-viažuci protein, ktorý interaguje/viaže sa na RIP veľmi špecifickým spôsobom. Takže RAP-2 je zjavne špecifickým modulátorom/mediátorom RIP vnútrobunkového účinku, ktorý má dôležitú úlohu v RIP modulácii/sprostredkovaní dráh zápalu a bunkovej smrti/bunkového prežívania.

V stručnosti, kloň RAP-2 sa získal dvojhybridným skríningom humánnej cDNA knižnice z B-buniek, použitím celého RIP proteínu ako návnady. RIP sekvencia bola prístupná v predchádzajúcich publikáciách (napr. Stanger a ďalší, 1995) a nachádza sa v GenBank databáze pod prístupovým č. U25994, ako ľudská RIP sekvencia (v tejto databáze je prítomná aj myšia RIP sekvencia pod prístupovým č. U25995). Použitím tejto sekvenčnej informácie sa navrhli PCR primery prostredníctvom OLIGO4™ softvéru a prostredníctvom PCR sa získal DNA fragment zodpovedajúci kódujúcej časti RIP, pričom sa použila ako templát cDNA z celkovej RNA ľudskej fibroblastovej bunkovej knižnice (použitím štandardných postupov). Táto kódujúca časť RIP sa potom klonovala do pGBT-9 vektora (Clontech) a použi la sa ako návnada, ako bolo uvedené, v dvojhybridnom skríningovom postupe. Týmto dvojhybridným skríningom sa získal kloň, ktorý kóduje RJP-viažuci protein, ktorý interaguje s RIP.

Tento kloň, ako bolo uvedené, bol použitý na skríning fágovej cDNA knižnice a EST databázy. Na obrázkoch 1 a 2 je možné vidieť, že kódujúce sekvencie dvoch klonov sú zhodné, zatiaľ čo 5'-nekódujúce oblasti sa líšia. Takže pravdepodobne ide o alternatívne zostrihnuté formy. Klony majú dĺžku približne 2,0 Kb a ORF (otvorený čítací rámes) má dĺžku približne 1,5 Kb, čo zodpovedá molekulovej hmotnosti samotného proteínu približne 50 Kd. Odvodená amino-kyselinová sekvencia RAP-2 je znázornená na obrázku 3.

Analýza uvedených sekvencií RAP-2 klonu a sekvencií v „dbest“ databáze, Human Genome Databáze level 1 a GenBank databáze odhalila, že RAP-2 sekvencia je unikátna (nová) sekvencia, keďže nie je významne homologická so žiadnou zo známych sekvencií. Po podaní IL123758, z ktorej si táto prihláška nárokuje prioritu, Yamaoka S a ďalší (1998) publikoval charakterizáciu hlodavčej cDNA, ktorá kóduje 48kD protein, ktorý bol označený ako NEMO (od NF-κΒ esenciálny modulátor), (pozri doterajší stav techniky).

Ďalšie prieskumy databáz (in sillico) identifikovali FIP-2, protein s neznámymi funkciami, ktorý pôvodne klonoval Li Y. a ďalší (1998, pozri doterajší stav techniky).

Ako je možné vidieť z globálneho porovnania RAP-2 a F1P-2 sekvencií (obrázok 3B), stupeň celkovej podobnosti je značne nízky (preto nie je prekvapujúce, že sekvencia sa neidentifikovala použitím skenu založenom na globálnych algoritmoch). Homológia medzi RAP-2 a FIP-2 sa zvyšuje smerom k C-koncu proteínov a kulminuje ako skutočná zhoda v C-koncových 30 aminokyselinách. Stojí za zmienku, že okrem spomenutej oblasti ostáva LZ-motív z FIP-2 značne zachovaný v RAP-2 (okrem Ile/Ala substitúcie).

Identifikovala sa aj ďalšia kratšia RAP-2 cDNA, s približnou dĺžkou 0,5 kb (ID: 1469996), ktorá tu ďalej bude označovaná ako Human shrt. Tento variant obsahuje kódujúce sekvenčné „bloky“ odvodené od niekoľkých oddelených oblastí 1,5 kb „celkovej“ cDNA, pravdepodobne vzniknuté alternatívnym zostrihom rovnakého génu.

Northem hybridizačná analýza použitím Multiple Tissue Northem blotu (Clontech) s 0,9 kb žfg7Z/-fragmentom RAP-2 cDNA mala komplexný vzor RAP-2 mRNA. Detegovalo sa najmenej 5 rôznych mRNA v rozsahu veľkosti od menej ako 1 kb do viac ako 7 kb, pričom viac alebo menej prevládali varianty s veľkosťou 2,5 kb a 6 kb (obrázok 4A).

Príklad 2

Identifikácia hlodavčieho RAP-2

Podobný prieskum myšej EST zbierky založenej na T1GR odhalil čiastočnú cDNA s dĺžkou 1,6 kb (Mouse part. ID: 761011, obrázok 3), ktorá pravdepodobne zodpovedá myšaciemu RAP-2, keďže je v skutočnosti zhodná (95 %) so svojím ľudským náprotivkom v kódujúcej oblasti (pozri obrázok 3).

Napriek tomu, rozdiel medzi ľudskou a hlodavčou RAP-2 a NEMO sekvenciou presahuje to, čo by sa mohlo jednoznačne prisúdiť normálnemu medzidruhovému rozdielu. V skutočnosti chýbajúci blok 7 aminokyselín (poloha 249 v 20.4) z hlodavčieho RAP-2 a z NEMO sekvencie a inzercia 3 aminokyselín (KLE v polohe 111) v NEMO otvorenom čítacom rámci v porovnaní s celým ľudským variantom a s čiastočnou hlodavčou sekvenciou, sú len najzreteľnejšími príkladmi (obrázok 3). Výsledkom týchto rozdielov však nemusia byť funkčné reakcie na účinok pro

SK 285804 Β6 teinu. V skutočnosti je však zrejmé, že vlastnosti publikované pre NEMO sú opačné ako vlastnosti zistené pre ľudský RAP-2, hoci frakcionačná analýza publikovaná pre NEMO potvrdila, že lokalizuje do signálnej zóny.

Príklad 3

RIP väzba na RAP-2 v cicavčích bunkách

Ďalší dôkaz fyziologického významu RAP-2-RIP interakcie sa získal v transfekovaných HEK-293T a HeLa bunkách. V skutočnosti bolo možné tieto dva proteíny jednoducho koprecipitovať z bunkových lyzátov HEK-293 (ATCC č. CRL 1573) buniek transfekovaných, ako je vyznačené pod každou líniou na obrázku 4B, a imunoprecipitovať s anti-FLAG mAbs (Kodak). Imunokomplexy sa potom analyzovali z hľadiska prítomnosti HIS-RAP-2 bežným Westem blotom s anti-Hisó mAbs (Sigma) (obrázok 4B a neuvedené údaje). Ale výsledkom vytvorenia takéhoto komplexu nie je RIP enzymatická aktivita: v rozsahu, ktorý bolo možné posúdiť in vitro imunokomplexovým kinázovým testom, nadexpresia RIP nefosforylovala RAP-2 (nie je ukázané).

Uskutočňovali sa väzobné testy, aby sa stanovilo, či sa RAP-2 viaže na nejaký iný známy vnútrobunkový signalizačný proteín. V týchto testoch sa testovali proteíny TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH z hľadiska ich schopnosti viazať sa na RAP-2. Zistilo sa však, že RAP-2 nebol schopný viazať sa na žiadny z týchto proteínov. RAP-2 sa neviazal ani na žiadny z kontrolných proteínov, napr. lamín, cyklín D.

Zo všetkých uvedených výsledkov preto vyplýva, že nový RAP-2 proteín možno interaguje s RIP veľmi špecifickým spôsobom, a sám osebe predstavuje špecifický modulátor/mediátor RIP.

Príklad 4

RAP-2 interaguje s NIK a moduluje NF-κΒ a c-Jun závislú transkripciu

Hoci sa RAP-2-NIK interakcia nedetegovala v dvojhybridných kvasinkových testoch (pozri skôr), transfekčné experimenty s HEK-293T cicavčími bunkami indikovali stabilné vytvorenie tohto komplexu. NIK-RAP-2 interakcia sa detekovala ako je opísané v príklade 3, s tou výnimkou, že na Westem blot sa použili anti-FLAG protilátky a nasledovala imunoprecipitácia s anti-Hisô (obrázok 4C). Takýto nesúlad medzi väzbou v kvasinkách a väzbou v cicavčích bunkách nebol prekvapujúci, pretože úplná NIK má tendenciu stratiť väzobné vlastnosti, keď sa exprimuje v kvasinkách.

Vzhľadom na skutočnosť, že sa verí, že RIP a NIK sú in vivo nepostrádateľné mediátory TNF-indukovanej NF-kB aktivácie, skúmalo sa, či nadexpresia RAP-2 v bunkovej kultúre je schopná interferovať s touto konkrétnou signalizačnou dráhou. Začiatočný súbor experimentov sa uskutočňoval v HEK-293T bunkách prechodne transfekovaných reportérovými plazmidmi, ktoré obsahujú luciferázový gén pod kontrolou HIV-LTR minimálneho promótora. Pri podobnom nastavení sa najprv zistilo, že RAP-2 tlmí, takmer na základnú úroveň, reportérovu aktiváciu spôsobenú tak nadexpresiou rôznych známych NF-KB-induktorov podieľajúcich sa na TNF signalizácii (NIK, TRAF2, RIP, atď), ako aj ošetrením buniek vonkajšími stimulmi (TNF a PMA, obrázok 5A). HEK-293T bunky sa prechodne transfekovali reportérovým plazmidom (HIVLTR-Luc alebo CMV-Luc pre NF-κΒ (5A) a GAL4-Luc pre c-Jun (5B) aktivačné testy) a expresným vektorom pre uvedený induktor a buď čistým vehikulom (pcDNA3), alebo plazmidom kódujúcim úplný RAP-2 (pcRAP-2). Zo skutočnosti, že RAP

-2 je schopný vykonávať svoje účinky do tej miery, že tlmí signalizačnú transdukčnú dráhu ako RelA, vyplýva, že časť účinku tohto proteínu by mohla byť spoločná pre rôzne a inak divergentné signalizačné dráhy (pozri neskôr). Zároveň nebola ohrozená kB nezávislá (riadená CMV skorým promótorom) transkripcia luciferázy (obrázok 5A), takže veríme, že možný všeobecný neporiadok základnej transkripčnej/translačnej mašinérie prostredníctvom RAP-2 je možné vylúčiť. Tieto výsledky sa následne úplne potvrdili v HeLa bunkách (neuvedené).

Ale, ako odhalili ďalšie titračné testy, skutočný fenomén bol oveľa komplexnejší. V skutočnosti, keď sa TRAF2 prechodne exprimoval v HEK-293T bunkách spolu s rôznymi množstvami pcRAP-2, ktoré sú uvedené na obrázku 6, RAP-2 drasticky zmenil svoje správanie pri nízkych koncentráciách (približne 20 ng/10⁶ buniek), zosilňujúc TRAF2 NF-κΒ indukovanú transkripciu (pozri obrázok 6A). Navyše sa skonštruovalo účinné RAP-2 antisense expresné vehikulum zamenením pôvodného inzertu inzertom s opačnou orientáciou a TRAF2 sa prechodne exprimoval v HEK-293T bunkách spolu s rôznymi uvedenými množstvami pcRAP-2-a/s (antisense) konštruktov, a analyzoval sa účinok progresívnej straty RAP-2, čo viedlo k znázorneniu diagramu závislého od koncentrácie. Z celkového trendu krivky vyplýva, že bunková odpoveď zhruba inverzne koreluje s množstvom transfekovanej RAP-2 DNA, s výnimkou charakteristickej oblasti, ktorá zahŕňa okolie „nulového“ bodu, zodpovedajúceho nominálnej, endogénnej hladine proteínu (obrázok 6). Treba poznamenať, že tlmenie expresie daného génu zavedením antisense je pravdepodobne jemnejšie ako pri sense nadexpresii. Antisense v skutočnosti nezahŕňa umelú produkciu žiadneho proteínu vnútri bunky, a preto jasne zvýrazňuje hodnotu RAP-2 inhibičnej schopnosti. Napriek tomu treba poznamenať, že uvedený skok pri nízkych koncentráciách je zrkadlený, nie obrátený do antisense polovice grafu (obrázok 6).

Na zhodnotenie diverzity transkripčných systémov, v ktorých môže byť zahrnutý RAP-2, posunuli sme sa k štúdii c-Jun, jadrového faktora, ktorého úloha v zavedení a udržiavaní adekvátnej stresovej odpovede bola potvrdená ako takmer rovnako kritická ako úloha NF-κΒ. Použitím komponentov komerčného „Path Detec“ systému (Stratagene), sme potvrdili podobné dvojfázové správanie RAP-2 vo vzťahu k niekoľkým rozoznávaným aktivátorom AP-1 v HEK-293T a HeLa bunkách (pozri obrázky 5B a 6B).

Príklad 5

RAP-2 zvyšuje potenciál c-Jun hyperfosforylácie bez toho, aby menil aktivitu JNK

Na štúdium mechanizmu, ktorý je základom takého vážneho účinku na transkripciu, bolo esenciálne stanoviť presnú úroveň, pri ktorej sa rozpadá normálna signalizácia. Je potvrdené, že trans-aktivačný potenciál c-Jun je regulovaný extracelulámym signálom indukovanou fosforyláciou dvoch serínových zvyškov (⁶³Ser a ⁷³Scr) jeho aminoterminálnej aktivačnej domény. JNK/SAPK proteín kinázy zodpovedné za uvedenú fosforyláciu predstavujú značne rôznorodú podtriedu MAP kinázovej rodiny a samé sú aktivované fosforyláciou na ^l83Thr a ¹⁸⁵Tyr, ktorá je sprostredkovaná ďalšími duálne špecifickými kinázami pôsobiacimi upstream. Takže stav fosforylácie na príslušných miestach vnútri tak c-Jun, ako aj JNKs, je možné použiť ako marker odrážajúci stav aktivácie proteínu. Westem blot analýza s lyzátmi prechodne transfekovaných HEK-293T buniek odhalila, že bez ohľadu na poškodenie c-Jun-sprostredkovanej transkripcie, RAP-2 významne zvyšuje potenciál fosforylácie endogénneho c-Jun na ⁶³Ser, ktorá je indukovaná množstvom stimulov (pozri obrázok 7A). Celkové bunkové lyzáty HEK-293T buniek, ktoré boli transfckované s uvedenými expresnými konštruktmi spolu s buď pcDNA3-nosičom, označeným na obrázku 7 znamienkom (-), alebo s pcRAP-2, označeným na tom istom obrázku znamienkom (+), sa rozdelili na SDS-PAGE, preniesli sa na ECL-membránu a testovali sa použitím sondy anti-fosfo-⁶³Ser-c-Jun Abs (NEB). Membrána znázornená na spodnom paneli obrázka 7A bola znova podrobená testu so sondou antitotal-c-Jun Abs kvôli kontrole (NEB).

Celkové množstvo c-Jun však ostalo nezmenené, čo vylučuje zvýšenie c-Jun hladín ako možný zdroj modifikácie. Protilátky špecifické proti fosforylovancj forme JNK1/2 nedetegovali žiadne podstatné zvýšenie množstva týchto aktivovaných kináz ako odpovede na nadexpresiu RAP-2, z čoho vyplýva, že ďalšia fosforylácia c-Jun nebola výsledkom RAP-2-závislej podpory JNKs aktivity (obrázok 7B). Aktivované JNK.1/2 z HEK-293T buniek transfekovaných buď pcDNA3, alebo pcRAP-2, ktoré boli ošetrené s hrTNFa počas predlžujúcich sa časových periód, boli detckované Westem blotom celkových lyzátov s fosfo(^l83Thr/¹⁸⁵Tyr)-JNK Abs (NEB) ako je znázornené na obrázku 7.

Na ďalšiu podporu posledného tvrdenia, in vitro kinázový test s imuno-precipitovaným JNK1 a purifikovaným GST-c-Jun ako substrátom, mal v podstate rovnaký výsledok (obrázok 7C). HEK-293T bunky sa kotransfekovali prázdnym vektorom, pcRAP-2 a pcRIP v rôznych kombináciách spolu s HA-JNK1-expresným vektorom. JNK1 sa potom imunoprecipitoval prostredníctvom svojho N-koncového HA-prívesku a jeho schopnosť fosforylovať baktériami produkovaný purifikovaný GST-Jun sa stanovila prostredníctvom inkorporovania ³²P v in vitro kinázovom teste. Reakčné produkty sa analyzovali na SDS-PAGE ako je znázornené na obrázku 7.

RAP-2 sa stáva fosforylovaným, keď sa RAP-2-IKK1 komplex, imunoprecipitovaný z transfekovaných HEK293 buniek, inkubuje v in vitro fosforylačných podmienkach. Prieskum funkčnej úlohy fosforylácie RAP-2 odhalil, že mutácia jedného konkrétneho serínu v tomto proteíne (v polohe 148) úplne zničí aktiváciu Jun fosforylácie sprostredkovanú týmto proteínom. Ako je ilustrované na obrázku 13, zatiaľ čo nadexpresia divého typu RAP-2 vedie k masívnemu nárastu Jun fosforylácie, nadexpresia RAP-2 (S148A) neovplyvňuje fosforyláciu Jun. Táto mutácia však vôbec neovplyvnila účinok RAP-2 na NF-κΒ. Z týchto zistení vyplýva, že fosforylácia serínu 148 v RAP-2 sa špecificky podieľa na jeho účinku na Jun fosforylácii.

Príklad 6

RAP-2 neinhibuje c-Jun a RelA väzbu na DNA

Vzhľadom na skutočnosť, že experimenty uvedené v príklade 5 neodhalili cytoplazmadickú moduláciu cieľa RAP-2 nadexpresie, teda NF-κΒ- a AP-1-signalizačných kaskád, skúmala sa integrita jadrových procesov potrebných na transkripciu. Uskutočňoval sa test posunu elektromobility (EMSA) s jadrovým extraktom transfekovaných HEK-293T buniek, ktorý jednoznačne demonštroval, že RAP-2 neinterferuje s väzbou c-Jun a RelA na oligonukleotidy zodpovedajúce ich klasickým rozoznávacím sekvenciám (obrázok 8). V skutočnosti sa pozorovalo sedemnásobné zosilnenie účinnosti formovania DNA/AP-1 komplexu v RAP-2-transfekovaných bunkách. Navyše, nebola pozorovaná žiadna interakcia medzi RAP-2 a c-Jun/RelA, ktorá by mohla viesť k sférickej obštrukcii aktivačných domén c-Jun/RelA. Predpokladá sa, účinok vstupu RAP-2 do jadra, ak nejaký existuje, sa uskutočňuje v určitom časovom bode za naviazaním zosilňovača.

Príklad 7

RAP-2 interaguje in vivo s histón acetyltransferázou TIP60

TIP60 (GeneBank U 74667) patrí do v súčasnosti opísanej rodiny jadrových proteínov nazývaných histón acetyltransferázy (HATs). Enzymatická aktivita týchto proteínov je spojená so stavom chromatínovej štruktúry v nukleozomálnych komplexoch. HATs sú často spojené s určitými elementmi transkripčného aparátu a sú schopné modulovať rýchlosť transkripcie. HATs účinkujú prostredníctvom uvoľnenia chromatínového balíka v blízkosti iniciačných miest prostredníctvom prenosu acetylových skupín na špecifické lyzínové zvyšky histónov, a tým podporou prístupu rôznych relevantných faktorov ku DNA. Je zrejmé, že jeden z týchto pomocných jadrových proteínov uľahčuje komunikáciu medzi zosilňovač-viažucimi faktormi a RNA polymerázou II. Preto sa skúmalo, či by mohol TIP60 vytvoriť komplex s RAP-2. Imunoprecipitácia z HeLa buniek a následne dvojhybridné testy jednoznačne ukázali, že RAP-2 silno interaguje s TIP60 v oboch systémoch. Napriek tomu sme neboli schopní vidieť žiadnu významnú zmenu RAP-2-sprostrcdkovaného účinku na NF-κΒ a c-Jun pri koexpresii TIP60 v HEK-293T bunkách (neuvedené). Žiadne zmeny neboli pozorované ani v kontrolnom experimente, t. j. stimulácii + TIP60 (w/o RAP-2), čo vedie k záveru, že krátky čas odčítavania (20 až 30 hodín po transfekcii), pravdepodobne znemožňuje, aby sa reporterová DNA stala chromatinizovanou, a neostáva dostatok času na účinok HAT-podobných enzýmov.

Príklad 8

Vzťah štruktúry a funkcie RAP-2

A. Väzobné oblasti

Použitím postupnej delečnej analýzy sa zmapovali väzobné oblasti vnútri RAP-2 a identifikovala sa väzba na RIP, NIK, TIP60, ako aj vzájomná asociácia domény (domén) (obrázok 10).

Väzba na RIP bola zmapovaná do oblasti RAP-2 proteínu, ktorá začína medzi aminokyselinami 177 až 218 a končí na aminokyseline 264.

Zistilo sa, že ani ΙΚΚβ (aminokyseliny 95 až 264), ani NIK (aminokyseliny 1 až 264) väzobné miesta sa neprekrývajú s RIP väzobným miestom vnútri RAP-2 (obrázok 10).

Väzba na TIP60 bola jasne zmapovaná vnútri oblasti zahŕňajúcej aminokyseliny 95 až 264. Strata interakcie pri delécii fragmentu zahŕňajúceho aminokyseliny 95 až 309 by mohla byť najpravdepodobnejšie dôsledkom špecifickej obštrukčnej konformácie prislúchajúcej tejto konkrétnej delécii.

Podobnú nezrovnalosť vo väzbe na delečné fragmenty je možné pozorovať pre väzbu klonu č. 10 a pre spájanie RAP-2 samého so sebou. Ale na rozdiel od TIP60, zo skutočnosti, že úplný RAP-2 sa viaže na delečný fragment zahŕňajúci aminokyseliny 218 až 416, ako aj na delečný fragment obsahujúci aminokyseliny 1 až 264, vyplýva, že oblasť podieľajúca sa na homodimerizácii je lokalizovaná medzi aminokyselinami 217 až 264.

Proteín kódovaný klonom č. 10, s uvedenou výnimkou, sa zjavne viaže vnútri oblasti začínajúcej medzi aminokyselinami 218 až 309 a končiacej aminokyselinou 416, takže toto väzobné miesto môže obsahovať prekrývajúce sa oblasti s väzobnými miestami pre RIP, NIK, ΙΚΚβ a TIP60 (obrázok 10).

B. Funkčné oblasti

Pokiaľ je nám v súčasnosti známe, všetky funkčné účinky RAP-2 (konkrétne NF-κΒ inhibícia a indukcia c-Jun hyperfosforylácie) sú zmapované do rovnakej oblasti (obrázok 10).

Navyše je možné, že oblasť postačujúca na účinnú moduláciu signalizácie všetkými induktormi použitými v týchto experimentoch jc lokalizovaná na N-koncovom segmente proteínu.

Oblasť zahŕňajúca aminokyseliny 95 až 416 mala účinok, hoci bol významne slabší v porovnaní s účinkom spôsobeným kompletným proteínom, takže môže byť výsledkom zosilnenej agragácie endogénneho RAP-2.

Navyše, s výnimkou RelA, účinok všetkých induktorov použitých v našich experimentoch, môže byť sprostredkovaný len približne 100 N-koncovými aminokyselinami RAP-2. V skutočnosti aj fragment zahŕňajúci aminokyseliny 1 až 1 02 sprostredkúva odlišiteľný účinok, hoci značne slabý (obrázok 11B).

Na druhej strane, úspešná indukcia RelA vyžaduje oveľa dlhšiu časť RAP-2 proteínu. Takže je možné definovať hranice tejto oblasti medzi aminokyseliny 1 a 264, pričom zjavne zahŕňa oblasť medzi aminokyselinami 157 a 264 s určitými špecifickými, RelA-asociovanými, väzobnými vlastnosťami.

C. Vzťah väzby a funkcie

Z výsledkov na obrázkoch 10 a 11 je zrejmé, že:

a) S výnimkou RelA, väzba RAP-2 na RIP, a najpravdepodobnejšie na NIK a TIP60 nie je potrebná na funkciu proteínu ako inhibítora nadexpresiou indukovaného NF-kB.

b) Účinok RAP-2 na aktiváciu indukovanú nadexpresiou RelA je zvyčajne sprostredkovaný, aspoň čiastočne, rôznymi väzobnými udalosťami. V podstate sa môže zistiť, že všetky uvedené proteíny sa môžu podieľať na danej aktivite, ako sa dá dedukovať z doteraz uskutočnených experimentov.

Presné miesto interakcie medzi RAP-2 a RIP sa ešte musí determinovať, ale zdá sa, že toto miesto je špecifické pre RIP a RAP-2 a nie je obsiahnuté v iných proteínoch, o ktorých je známe, že interagujú s RIP, napr. MORT-1, TRADD, FAS-R a možno aj s TRAF2 (pozri Malinin a ďalší, 1997). Zistilo sa tiež (zo sekvenčnej analýzy a porovnania so sekvenciami v rôznych databázach, ako bolo uvedené), že RAP-2 nemá „smrtiacu doménu“, MORT modul, proteázovú doménu (napr. ICE/CED3 motív), kinázovú doménu/motív, ani TRAF domény. V súlade s tým analýza biologickej aktivity odhalila aj to, že RAP-2 má zjavne nasledujúce charakteristiky:

(i) keď sa nadexprimuje, RAP-2 silno inhibuje NF-κΒ aktiváciu prostredníctvom TNF alebo nadexpresiou TRADD, RIP, TRAF-2, NIK alebo p65 NF-κΒ podjednotkou;

(ii) RAP-2 zvyšuje potenciál c-Jun hyperfosforylácie bez toho, aby menil íiktivitu JNK;

(iii) RAP-2, ako bolo ukázané delečnou analýzou, nevyžaduje smrtiacu doménu RIP, ani kinázovú aktivitu RIP, na väzbu na RIP;

(iv) na základe uvedenej delečnej analýzy sa väzobná oblasť RAP-2 na RIP zúžila na N-koncovú oblasť približne 200 aminokyselín:

(v) RAP-2 sa viaže na NIK v transfekovaných cicavčích bunkách, ale nie v kvasinkách.

Vzhľadom na uvedené je preto zrejmé, že RAP-2 je vysoko špecifický RIP-viažuci proteín, a teda RIP modulátor/mediátor, ktorý sa pravdepodobne podieľa na RIP

-sprostredkovaných vnútrobunkových signalizačných dráhach.

Vzhľadom na uvedené je zrejmé, že RAP-2 sa podieľa na modulácii/sprostredkovaní RIP aktivít. Vnútrobunkovo sú týmito RIP aktivitami RIP podiel v dráhe bunkového prežívania (NF-κΒ aktivácia, možno prostredníctvom interakcie s TRAF2) a jeho podiel v dráhach zápalu a bunkovej smrti (nezávisle prostredníctvom „smrtiacej domény“ alebo interakcie s inými proteínmi ako MORT-1, TRADD, p55-R, FAS-R a asociovanými proteázami ako MACH, Mch4, G1 a podobne). Možné spôsoby, ktorými môže RAP-2 modulovať/sprostredkovať RIP účinok, sú podrobne uvedené. Napríklad RAP-2-RIP interakcia môže viesť k zosilneniu buď dráhy bunkovej smrti, alebo dráhy bunkového prežívania, pričom toto zosilnenie alebo inhibícia je možno závislá od relatívnych aktivít iných členov týchto dvoch opačných vnútrobunkových dráh. RAP-2 môže účinkovať aj ako ukotvovací protein, ktorý zabezpečuje agregáciu určitého počtu RIP molekúl alebo iných RIP- alebo RAP-2-viažucich proteínov, pričom tento agregát môže potom fungovať buď v smere bunkovej smrti, alebo bunkového prežívania (alebo aj v oboch smeroch) v závislosti od relatívnych aktivít/množstiev iných členov týchto dráh v bunke.

Príklad 9

Príprava polyklonálnych protilátok proti RAP-2

Králikom sa najprv subkutánnou injekciou podalo 5 pg čistého prípravku RAP-2 emulzifikovaného v kompletnom Freudovom adjuvans, O tri týždne neskôr sa znova subkutánnou injekciou podalo 5 pg RAP-2 prípravku v nekompletnom Freundovom adjuvans. Dve ďalšie injekcie RAP-2 vo forme roztoku v PBS sa podali v 10 dňových intervaloch. 10 dní po poslednej imunizácii sa králikom odobrala krv. Vývoj hladiny protilátky sa sledoval rádioimunotestom. ¹²⁵I-značený RAP-2 sa zmiešal s rôznymi riedeniami (1 : 50, 1 : 500, 1 : 5000 a 1 : 50000) králičieho séra. V celkovom objeme 200 pl sa pridala suspenzia proteín-G agarózových guľôčok (20 μΐ Pharmacia). Zmes sa nechala 1 hodinu pri laboratórnej teplote a guľôčky sa potom premyli trikrát a snímala sa naviazaná rádioaktivita. Králičie antisérum proti ľudskému leptínu sa použilo ako negatívna kontrola. Titer RAP-2 antiséra sa meral v porovnaní s titrom negatívnej kontroly.

Príklad 10

Príprava monoklonálnych protilátok proti RAP-2

Samičkám Balb/C myší (3-mcsačné) sa najprv injekčné podali 2 pg purifikovaného RAP-2 v emulzii kompletného Freundovho adjuvans a o tri týždne sa subkutánne podalo to isté množstvo v nekompletnom Freundovom adjuvans. Tri ďalšie injekcie sa podávali v 10 dňových intervaloch subkutánne v PBS. Konečné dávky sa podávali intraperitoneáine 4 a 3 dni pred fúziou myšiam, ktoré mali najvyšší väzobný titer, ktorý bol stanovovaný prostredníctvom IRIA (pozri neskôr). Fúzia sa uskutočňovala použitím NSO/1 myelómovej bunkovej línie a lymfocytov pripravených tak zo sleziny, ako aj z lymfatických uzlín živočícha. Fúzované bunky sa distribuovali na mikrokultivačné platne a hybridómy sa selektovali v DMEM doplnenom s HAT a 15 % konským sérom. Hybridómy, o ktorých sa zistilo, že produkujú protilátky proti RAP-2, sa subklonovali limitujúcou riediacou metódou a injekciou sa zaviedli do Balb/C myší, ktorým bol vopred podaný pristán na produkciu ascitov. Izotypy protilátok boli definované použitím komerčne dostupného ELISA kitu (Amersham, UK).

Skríning hybridómov produkujúcich anti-RAP-2 monoklonálne protilátky sa uskutočňoval nasledovne: Supernatanty hybridómov sa testovali z hľadiska prítomnosti anti-RAP-2 protilátok obráteným rádioimunotestom na tuhej fáze (IRIA). Na ELISA platne (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) sa naniesol Talon-purifikovaný IL-18BPA-His₆ (10 pg/ml, 100 μΐ/jamku). Nasledovalo inkubovanie cez noc pri 4 °C, platne sa dvakrát premyli s PBS s obsahom BSA (0,5 %) a Tweenu 20 (0,05%) a blokovali sa v premývacom roztoku najmenej 2 hodiny pri 37 °C. Pridali sa supematanty hybridómovej kultúry (100 μΐ/jamku) a platne sa inkubovali 4 hodiny pri 37 °C. Platne sa premyli 3-krát a pridal sa konjugát kozej anti-myšej chrenovej peroxidázy (HRP, Jackson Labs, 1 : 10000, 100 μΐ/jamku) na 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Platne sa 4-krát premyli a prostredníctvom ABTS (kyseliny 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolín-6-sulfónovej, Sigma) sa vyvinula farba s H₂O₂ ako substrátom. Platne sa snímali automatickým ELISA snímačom. Vzorky, ktoré mali OD najmenej 5-krát vyššie ako hodnota negatívnej kontroly, boli považované za pozitívne.

RAP-2 protilátky môžu byť použité na purifikáciu RAP-2 afinitnou chromatografiou.

Príklad 11

ELISA test

Na mikrotitračnc platne (Dynatech alebo Mxisorb od Nunc) sa naniesla anti-RAP-2 monoklonálna protilátka (hybridómový supematant bez séra alebo imunoglobulíny ascitickej kvapaliny) cez noc pri 4 °C. Platne sa premyli s PBS s obsahom BSA (0,5 %) a Tweenu 20 (0,05 %) a blokovali sa rovnakým roztokom najmenej 2 hodiny pri 37 °C. Testované vzorky sa riedili v blokovacom roztoku a pridali sa do jamiek (100 μΐ/jamku) na 4 hodiny pri 37 °C. Platne sa potom 3-krát premyli s PBS s obsahom Tweenu 20 (0,05 %) a nasledovalo pridanie králičieho anti-RAP-2 séra (1 : 1000, 100 μΐ/jamku) a ďalšia inkubácia cez noc pri 4 °C. Platne sa 3-krát premyli a pridal sa konjugát kozej antikráličej chrenovej peroxidázy (HRP, Jackson Labs, 1 : 10000, 100 μΐ/jamku) na 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Platne sa 4-krát premyli a prostredníctvom ABTS (kyseliny 2,2'-azino-bis(3-etylbenz-tiazolín-6-sulfónovej, Sigma) sa vyvinula farba s H₂O₂ ako substrátom. Platne sa snímali automatickým ELISA snímačom.

Všetky tu citované publikácie, vrátane časopisových článkov alebo abstraktov, publikovaných alebo korešpondujúcich US alebo zahraničných prihlášok vynálezu, vydaných US alebo zahraničných patentov alebo akékoľvek iné citácie sú tu zahrnuté ako celok prostredníctvom ich spomenutia, vrátane všetkých údajov, tabuliek, obrázkov a textov, ktoré sú v nich prezentované. Navyše sú tu komplet zahrnuté obsahy citácií v uvedených publikáciách.

Odvolanie sa na známe spôsobové kroky, bežné spôsobové kroky, známe metódy alebo bežné metódy, nemá byť v žiadnom prípade brané ako skutočnosť, že nejaký aspekt, opis alebo uskutočnenie predloženého vynálezu bolo nárokované, opísané alebo navrhnuté v relevantnej oblasti.

Uvedený opis špecifických uskutočnení kompletne odhalí všeobecnú povahu vynálezu a pre priemerného odborníka v oblasti je možné aplikovaním znalostí z oblasti (zahŕňajúc obsah uvedených citácií) jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať ho pre rôzne aplikácie konkrétnych uskutočnení, bez nadmerného experimentovania a bez vybočenia zo všeobecného konceptu podľa predloženého vynálezu. Preto sú takéto adaptácie a modifikácie považované za spadajúce do rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení na základe tu uvedeného opisu a návodu. Treba pozname nať, že tu uvedená frazeológia a terminológia plní funkciu opisu a nie limitácie, takže terminológia a frazeológia predloženého opisu má byť interpretovaná priemerným odborníkom v oblasti vo vzťahu k tu uvedenému opisu a návodu, v kombinovaní so znalosťami priemerného odborníka v oblasti.

Literatúra

Alnemri, E.S. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:4312-4317 Barinaga, M. (1993) Science 262:1512-1514

Beg, A.A. a Baltimore, D. Science 274:782-784

Beidler, J. aďalší, (1995) J. Biol. Chem. 270:16526-16528 Berger, J. a ďalší, (1988) Gene 66:1-10

Beutler, B. a Cerami, C. (1987) NEJM: 316:379-385

Bigda, J. a ďalší (1994) J. Exp. Med. 180:445-460

Boldin, M.P. a ďalší (1995a) J. Biol. Chem. 270:337-341 Boldin, M.P. aďalší (1995b) J. Biol. Chem. 270:7795-7798 Boldin, M.P. aďalší (1996) Celí 85:803-815

Brakebusch, C. a ďalší (1992) EMBO J., 11:943-950 Brockhaus, M a ďalší (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3127-3131

Cantor, G.H. a ďalší (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10932-6

Cerreti, D.P. a ďalší (1992) Science 256:97-100

Chen, C.J. a ďalší (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:271-3 Chinnaiyan a ďalší (1995) Celí 81:505-512

Chinnaiyan aďalší (1996) J. Biol. Chem. 271:4961-4965 Cifone, M.G. a ďalší (1995) EMBO J. 14:5859-5868 Clement, M.V. aďalší (1994) J. Exp. Med. 180:557-567 Crisell, P. a ďalší (1993) Nucleic Acids Res. (Anglicko) 21 (22):5251-5

Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M. & Warki, A., vyd.) (1994) str. 8.1.1-8.1.6 a 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc a Wiley & Sons, Inc., New York

Dirks, W., a ďalší, (1993) Gene 128:247-249

Durfee T a ďalší, Genes Dev 1993; 7:555-569

Eischen, C.M. a ďalší (1994) J. Immunol. 153:1947-1954 Ellis, H.M. a ďalší (1986) Celí 44:817-829

Enari, M. a ďalší (1995) Náture 375:78-81

Engelmann, H. a ďalší (1990) J. Biol. Chem., 265:1531-1536

Faucheu, C. a ďalší (1995) EMBO J. 14:1914-1922 Femandes-Alnemri T a ďalší, (1994) J. Biol. Chem. 269:30761-30764

Femandes-Alnemri T a ďalší, (1995) Cancer Res. 55:2737-2742

Femandes-Alnemri T a ďalší, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7464-7469

Ficld, J. a ďalší (1988) Mol. Celí Biol. 8:2159-2165

Fields, S. a Song, O. (1989) Náture, 340:245-246 Frangioni, J.V. a Neel, B.G. (1993) Anál. Biochem. 210:179-187

Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6:364-369

Geysen, H.M. a ďalší (1987) J. Immunol. Meth. 102:259-274

Gossen, M. a Boujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551

Grell, M. aďalší (1994) Eur. J. Immunol. 24:2563-2566

Heller, R.A. a ďalší (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

87:6151-6155

Henkart, P.A. (1996) Immunity 4:195-201

Hohmann, H.P. a ďalší (1989) J. Biol. Chem., 264:14927-14934

Howard, A.D. a ďalší (1991) J. Immunol. 147:2964-2969

Hsu, H. a ďalší (1995) Celí 81:495-504

Hsu, H. a ďalší (1996) Celí 84:299-308

Itoh, N. a ďalší (1991) Celí 66:233

Itoh, N. aNagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268:10932-7 Joseph, S. a Búrke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 268:24515-8 Kamens, J. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:15250-15256 Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49:5870-5878 Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 53:3976-3985 Kischkel F.C. a ďalší (1995) EMBO J. 14:5579-5588 Koizumi, M. a ďalší (1993) Biol. Pharm. Bull (Japonsko) 16(9):879-83

Kumar, S. a ďalší (1994) Genes Dev. 8:1613-1626 Kumar, S. (1995) Trends Biochem Sci. 20:198-202 Lazebnik, Y.A. a ďalší (1994) Náture 371:346-347 Leithauser, F. a ďalší (1993) Lab Invest. 69:415-429 Li, Y. a ďalší (1998) Mol Celí Biol 18:1601-1610 Loetscher, H. a ďalší (1990) Celí, 61:351-359 Los, M. a ďalší (1995) Náture 375:81-83

Madden, S.L. a ďalší (1996) Cancer Ros 56:5384-5390 Malinin, N.L. a ďalší (1997) Náture 385:540-544

Martin, S. J. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:6425-6428 Mashima, T. a ďalší (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:907-915

Miller, B.E. a ďalší (1995) J. Immunol. 154:1331 -133 8 Milligan, C.E. a ďalší (1995) Neurón 15:385-393

Miura, M. a ďalší (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8318-8322

Munday, N.A. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:15870-15876

Muranishi, S. a ďalší (1991) Pharm. Research 8:649 Musti AM, a ďalší (1997) Science 1997 275:400-402 Nagata S. a Golstein, P. (1995) Science 267,1449-1456 Natoli, G. a ďalší (1997) J. Biol. Chem. 272, 26079-26082 Nicholson, D.W. a ďalší (1995) Náture 376:37-43 Nophar, Y. a ďalší (1990) EMBO J., 9:3269-3278 Piquet, P.F. a ďalší (1987) J. Exp. Med., 166:1280-89 Ray a ďalší (1992) Celí 69:597-604

Ruggiero, V. a ďalší (1987) Celí Immunol. 107:317-325 Sambrook a ďalší (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

Schall, T.J. a ďalší (1990) Celí, 61:361-370

Schlegel a ďalší (1996) J. Biol. Chem. 271:1841-1844 Schulze-Osthoff, K. a ďalší (1994) EMBO J. 13:4587-4596 Shimayama, T. a ďalší (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29:177-8

Shore, S.K. a ďalší (1993) Oncogene 8:3183-8

Sleath, P.R. a ďalší (1990) J. Biol. Chem. 265:14526-14528 Smith, C.A. a ďalší (1990) Science, 248:1019-1023

Song, H.Y. a ďalší (1994) J. Biol. Chem. 269:22492-22495 Srinivasula, S.M. a ďalší (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14486-14491

Stanger, B.Z. a ďalší (1995) Celí 81:513-523 Tartaglia, L.A. a ďalší (1993) Celí, 74:845-853

Tewari, M. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:3255-3260 Tewari, M. a ďalší (1995a) J. Biol. Chem. 270:1873818741

Tewari, M. a ďalší (1995b) Celí 81:1-20

Thomberry N.A. a ďalší (1992) Náture 356:768-774 Thomberry N.A. a ďalší (1994) Biochemistry 33:3934-3940 Tracey, J.T. a ďalší (1987) Náture, 330:662-664

Van Antwerp, D.J. a ďalší (1996) Science 274:787-789 Vandenabeele, P. a ďalší (1995) Trends Celí Biol. 5:392-400 Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10:411-452 Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132:2464-9

Wallach, D. (1986) v: Interferon 7 (lon Gresser, vyd.) str. 83-122, Academic Press, London

Wallach, D. a ďalší (1994) Cytokine 6:556

Wang, L. a ďalší (1994) Celí 78:739-750

Wang, C.-Y. a ďalší (1996) Science 274:784-787 Watanabe-Fukunaga, R. a ďalší (1992) Náture, 356:314-317 Watanabe, F.R. a ďalší (1992) J. Immunol. 148:1274-1279 Weitzen, M. a ďalší (1980) J. Immunol. 125:719-724 Wilks, A.F. a ďalší (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1603-1607

Wong a ďalší (1994) J. Immunol. 152:1751-1755

Xue, D. a ďalší (1995) Náture 377:248-251 Yamaoka S. a ďalší (1998) Celí 93:1231-1240

Yonehara, S. aďalší (1989) J. Exp. Med. 169:1747-1756 Yuan, J. a ďalší (1993) Celí 75:641-652

Zaccharia, S. a ďalší (1991) Eur. J. Pharmacol. 203:353-357 Zhao, J.J. a Pick, L. (1993) Náture (Anglicko) 365:448-51

Zoznam sekvencií <100> WALLACH, Dávid KOVALENKO, Andrei

Ycda Research and Development Co. Ltd.

<120> Modulátory funkcie receptorov TNF/NGF receptorovej rodiny a iné proteíny <130> TNF/NGF receptory <140>

<141>

<150>123758 <151> 1998-09-01 <160> 3 <170>Patentín Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2009 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaagattaea ttgtgggcot gsgaggccta gcaagggegg accgcgaaac tgggactttt 60 ttcggagcgc cggggcccta ccagcgttca cagtccgccg ctcccaccct tctcacgtct 120 gacggactot gctgacagcc cttgccctgt tggatgaata ggcacctctg gaagagacaa 180 ctgtgtgaga tggtgcagcc cagtggtgge ccggcagcag atcaggacgt actgggcgaa 240 gagtatcctc tggggaagcc agccatgctg caectgcctt cagaacaggg cgctcctgag 300 accctccage gctgoctgga ggagaatcaa gagctccgag atgc«atccg gcagagcaac 360 cagattctgc gggagcgctg cgaggagett c aaggaattce tcatgtgaaa gttccaggag gagaagctcg atctgaagag gcagaaagag agatgccagc agcagatggc tgaggacaag ctccgggagc tgaaggagag ccagagtcgc ctggagggtc gggcccgggc ggccagcgag gcgctgcagc agcagcacag cgtgcaggtg gagcccgcge tccgcatgga gcgocaggcc ttgcaggtgg cctatcacca gctcttccaa gtgggcagtg agcggaagcg aggaatgcag gccgaggagg ccctggtggc caaacaggag cagcacaaga ttgtgatgga gaccgttccg gcggacttcc aggctgagag gcaggcccgg eaggagcagc tggagcagct gcagagggag tcggccagga tcgaggacat gaggaagcgg cccgcccctg cctacctctc ctatcccctg gaggagccac ctgacttct.g ctgtcccaag ctgcagatac atgccatgga gtgcattgag ccgaggacgt gcccgggacc gtgcagtctg argaagggct gggtggccac aactgggatg cggcacctta cgcctcagct gttgattccg ccgatcaggc ctgactcgot gctctttttg cgggctaatc cctccctctt cctccacccg gctctcaggg agaaatgctt cccotggcag caccgaaccg cccgctgctg tgccctggga tctccctttg ggctgcatgc tateccattt cactattgat ggacatttgg gttgtttccc akaaaaatcc ttgtgcatta aaaaaaaaa stgcatttcc aagccagcea gagggaggag 42U gacaggaaac tggťggagag actcggcctg 480 caggctatgc gggaggtgga geacstgaag 540 gcctctgtga aagcccaggt gacatccttg 600 ttggaggctg caactaagga acgccaggat 660 caggcgcggc agctggagag tgagegegag 720 gaccagctgc gcatgcaggg ccagagcgtg 780 gcctcggagg agaagaggaa gctggccaag 840 gaatacgaca accacatcaa gagcagcgtg 900 ctggaagatc tcaaacagca gctccagcag 960 gtgategata agctgaagga ggaggccgag 1020 gtgctgaagg cccaggcgga tatctacaag 1080 gagaagctgg ccgagaagaa ggagctcctg 114-0 tacagcaaac tgaaggccag ct-gtcaggag 1200 catgtcgagg tctcccaggc ccccttgccc 1260 gccctgccca gccagaggag gagccccccc 1320 tgccagtatc aggcccctga tatggacacc 1390 tagggccggc cagtgcaagg acactgcctg 1440 cgcttícctc tcccgcctgc ctagcccagg 1500 ccacctggag ccccacccag gagctggccg 1560 ctggtcccct cttttggggt agatgcggcc 1620 ttcccttctg tctgctcgaa ccacttgcct 1680 gcactgggga agtcaagaat ggggcctggg 1740 agatgggtgg cagctettcc tsecacegga 1800 gtgctgccct cttacsatgc acacgggtgc 1850 tgcagccaga ecgatgtgta tttaaccagt 1920 atctttttgt taccataaat artggcatag 1900 2009 <210>2 <211 >2034 <212>DNA <213> Homo sapiens <400>2 ttctactcct ccctcotcct: cactgcgggg ctagttcaga gacatattct gttcaccaaa tcttcggaaa tg-ctcacat atagtttggc cacctctgga agagccaact gtgtgagatg caggacgtac tgggcgaaga gtctcctctg gaacagggcg ctcctgagac cctccagcgc Cgqqatccgg cagtagcaac cagattcttg ttccaagcca gauagaggga ggagaaggaug aaactggtgg agagactcgg qctggagaag ctgagcgagg ťggagoa<?ct jaagagatgc gtgaaagccc aggtgacgtc cítgctcggg gctgacacta aggaatgcca ggctctggag cggeagrrgg agagtgagcg cgaggcgctg ctgcgcatgc agggccagag cgtggaggcc gaggagaaga ggaagctggc ccagttgcag gacaaccaca tcaagagcag cgtggtggga gatcttcaaac agcagctcca gcaggccgag gataagctxga aggaggaggc cgagcagcac aaggcucagg cggataicta caaggcggac ctqqccgaga agaaggagct cctgcaggag aaactgaagg ccagctgtca ggagtcggcc gaggtctccc aggccccctť. geeooccgcc cggagccaga ggaggagccc ccccgaggag tatcaqgccc ctgatatgga caccctccag cggccagtgc aaggcaacUg cctgccgagg cotctcccge c-gcctagoc aaggatgaag ggagacccac ccaggagctg gccgsggcac ccctcttceg ggg-eagacge ggccccgatc tctgtctgct cgaaccactt geetcggget gqqaagucaa gaatggggcc tggggccctc gtggcagccc txecťc.ccac Ľggacaccga c.cctcttacc argcacacgg gtgctctcct cagaccgatg tgt.atttaac nagr.cactat ttgttaccat masEartggc atagakaaaa tctgacccta ofcoct-.t-gRgt gaggactcct 6C ettgactgcg ctctatcgag gtcgttaaat 120 agctagccct tgccctgttg gatgaatagg 160 gtgcagccca gtggtggccc ggcagcagat 240 gggaagccag ccatgctgca cctgacttca 300 tgcctgggag gagaatcaag agctccgaga 360 7953’gctge cgaagggagc tttctgcatt 420 ttcctcatgt gcaagttcca ggaggccagg 48Ô ctcgatctga agaggcagaa ggagcaggct 540 cagcageaga tggctgagga caaggcctct 600 gagctgcagg agagcaagag tcgcttggag 660 ggtcgggcac gggcggccag cgagaaggcg Ί0 cagcagcagc acagcgtgca ggtggaccag 780 gcgctccgca tggagcgcca ggccgcctcg 840 gtggccratc acoagatott ooaígaatsc 500 agtgagcgga agagaggaat gcagctggaa 960 gsggccctgg tggccaaaca ggaggtgatc 1020 aagattgtgA oggagaasgt tcoggtgctg 1080 ttccaggetg agaggeaggc ccgggagaag 1140 cagcbggagc agctgcagag ggagtacagc 1200 agga-ygagg aaatgaggaa gcggcatgcc 1260 ectgcctarr-E tcĽccEctcc cctggccctg 1320 ccacctgact tctgctgtcc caagtgccag 1380 atacatgtca Eggagcgcat tgagtagggc 1440 acgtgcccgg gaecgtgcag tczgcgc;tt 1500 ggctgggtgg ccacaactgg gazgccaccx 1560 cttacgcttc agcEgttgat r.ccgcr.ggte 1620 aggcctgact cgcrgctctt titgttcoc-t 1680 aatcactccc tcttcctcca ccoggcactg 1740 agggagaact gct-tccoctg gcagagctgg 1800 cccgcccgct gctgtgccct gggagtgctg 1860 Cttgggctgc atgctattsc attttgcagc 1920 cgatggacat ttgggttgct toocatctet 1980 atccttgtgr. aťťaaaaaaa aaaa 2034 <210>3 <211> 2116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>3 gacacgaagg cccagacttt gaccgttcct cactgaccac cgagaacaga ttccactcCt ccaatggaag cattggccac agtccacttt taaasactgc aocegtccaa gagagtccac gEctagaagt gggotcattg gctgaagtta grtggatcgg rcagccacca ggactgaabg agtgcgcagg cEgtacggat ggaeeettca agaaggcgct gtttgtgaaa ctgaagagct agccggtttc caatcaagat tgagcgctgr gaagtagtga agaaaatact fľŕAeCaaaaa gggaaagaag aaaggcatcc aagggtcatt í=Ekgcttat ttkgqtttta gttctgttct aaaaagaaac gatgttagaa tattwtvkwg ttaatccECt gagaatatat ggatatgtgt tactxgaaaa ggtggaggct ycatcaggat tcttgaaeat tctgtEtcat catattttaa □aggtcaaaa ggtacaagax tgtcacttot Ctggcgttcc cacaattcag cagctgxtag ttgqagagge accatcatgt ctgattattc tatztaaaaa atttttcctt ctctggaatt agacagrgcfi ggatatgtgg agggcttgea cggacaacag ctggaaaaac aagcagtttt atccgaagag gcr.gaatcat aaatataacc tgggagattg gaga-eacggc tgeatCCCtt gcatagaaac aagccactat gttgcttttg tcttctttgg acagcatggc cqatccggga agE-íucccat gscccngaag taggagagta wtyccttgga ctcccaggag aatcccaagg atatgtgcca tgtacccaga gtccaacaat gaaaggcaaa gaaactggaa ggaagagtcc ttctgttcac ggtccattgc cggcaatgga gatgcctctg txtaaaaaca aattgcEttt ttgcsctota gaaagtatgt tcgtgtEggt acctgaagct ttaagttaag tgeattgatc attgtggaag tttaaagcct octtcagccc atggaaaaaa aaaaaa caecscwct scageetcct ccr.gt:gaact €0 taccattceg tctcaccaag atgcccaata 220 ctctgteagc ccagtetgta atggaagagc 180 acttggccat gcctcetggg aactcacatg 240 aggagaaccc tccttcctat ggggtaatcc .00 aagtgctcgc tggactggaa ctggaagatg 360 gaggcactcg gtatttcacc tgtgccctga 420 gcaggcctga ctctaggttt gcatcattgc 480 aactctttag catttggagg ctacteaagt 540 tggaaaaaqa argcttggag ataatgattg 600 acaattcttg ktacttagac tcaaccttat 660 nggacactgg tgttacttta gaccccaaag 720 ttnacccaaga gctactgagg acagaaattg 780 gtgccacaaa aattatgaaa ctgaggaaaa 840 ttaccfcotga agaaaaagae cctgagg-aat 900 gggtagaacc tttgctaaaa ataagatcag 960 atcaaatttt tatggaaaaa aatgagaaag 1020 aatggtsttt tatcaacagt aacctqaaat 1060 agatgcctcg atttggaaaa gactttaaac 1140 agatataaaa gacttact.tg aagacacccc 1200 algtatgagt gtaagaacgc tacgacgatc 1260 gtaaaacctg caacactcaa gtccaccttc 1320 cagt-Qtcact tcccaaagac tt.acccagao 1380 gccaqaatat ggsgttattt gctgttctct 1440 tgaagtatgg gaaggaagat tctgcctggc 1500 tggtggtcag aatggctoaa cattccccea 1560 ettggaagat gtctcctgga agaccctgsa 1620 ctgtgcacga agaqtgcttt gtgatgcsat 16B0 gagtttgtac aaataactgg gggccaccgg 1740 ctaacgttge atcttattcg gagctggcag 1800 tgtctttgtg gtgatgatcc ttcagaaaag 1860 gtgtccctga agtacttaat aagaagcaLL 192C Ettttaagaa gtctaaatga agtcattaat 1980 atatgatatt tttggaagca tacaatttta 2040 attgagaatq taaaEaaatg Ľgtoitcttt 2100 2116

Claims

1. DNA sekvencia, ktorá kóduje RIP-asociovaný protein - RAP-2, jeho izoformy, analógy alebo fragmenty, ktoré sú schopné viazať sa na RIP a modulovať alebo sprostredkovať vnútrobunkovú aktivitu RIP, pričom je vybraná zo skupiny, ktorá pozostáva z: (a) DNA sekvencie kódujúcej RAP-2 proteín, ako je znázornený na obrázku 3, (b) DNA sekvencie uvedenej ako SEQ ID NO: 1 alebo 2, (c) DNA sekvencie schopnej hybridizovať so sekvenciou podľa (a) alebo (b) za prísnych podmienok, a kódujúcej biologicky aktívny RAP-2 proteín, (d) DNA sekvencie, ktorá je degenerovaná v dôsledku genetického kódu na DNA sekvenciu definovanú v (a) alebo (b) a ktorá kóduje biologicky aktívny RAP-2 proteín, a (e) DNA sekvencie podľa (b) kódujúcej RAP-2 proteín, izoformu, analóg alebo fragment, ktoré majú aspoň časť sekvencie ako je znázornená na obrázku 3.

2. Replikovateľné expresné vehikulum, ktoré obsahuje DNA sekvenciu podľa nároku 1, ktorá je voliteľne operatívne spojená s riadiacimi sekvenciami, promótormi alebo inými DNA sekvenciami umožňujúcimi expresiu v správnej orientácii.

3. Replikovateľné expresné vehikulum podľa nároku 2, ktoré je schopné byť exprimované v eukaryotíckej hostiteľskej bunke alebo v prokaryotickej hostiteľskej bunke.

4. Transformované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky, ktoré obsahujú replikovateľné expresné vehikulum podľa nároku 2 alebo 3.

5. RAP-2 proteín, jeho izoforma, fragment, funkčné analógy alebo deriváty, ktoré sú kódované DNA sekvenciou podľa nároku 1.

6. Spôsob výroby RAP-2 proteínu, jeho izoformy, fragmentu, analógov alebo derivátov podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa rast transformovanej hostiteľskej bunky podľa nároku 4 v podmienkach vhodných na expresiu uvedeného proteínu, analógov, izoforiem, fragmentov alebo derivátov, uskutočnenie posttranslačných modifikácii nevyhnutných na získanie uvedeného proteínu, fragmentov, analógov alebo derivátov a izoláciu exprimovaného proteínu, fragmentov, analógov alebo derivátov.

7. Protilátky alebo ich aktívne fragmenty, alebo deriváty špecificky reagujúce s biologicky aktívnou RAP-2 proteínovou časťou RAP-2 proteínu, izoformou, fragmentom, analógom, derivátom podľa nároku 5 alebo s biologicky aktívnou RAP-2 proteínovou časťou RAP-2 proteínu, izoformou, fragmentom, analógom, derivátom vyrobenými spôsobom podľa nároku 6.

8. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje aspoň jedno z nasledujúcich: RAP-2 proteín podľa nároku 5 alebo RAP-2 proteín získateľný spôsobom podľa nároku 6, jeho biologicky aktívne fragmenty, analógy, deriváty podľa nároku 5, alebo ich zmesi, replikovateľné expresné vehikulum podľa nároku 2 alebo 3, oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu antisense sekvenciu RAP-2 proteínovej DNA sekvencie podľa nároku 1 alebo protilátky podľa nároku 7, a voliteľne farmaceutický prijateľný nosič.

9. Použitie aspoň jedného z nasledujúcich: RAP-2 proteínu podľa nároku 5 alebo RAP-2 proteínu získateľného spôsobom podľa nároku 6, jeho biologicky aktívnych fragmentov, analógov, derivátov podľa nároku 5, alebo ich zmesí, replikovateľného expresného vehikula podľa nároku 2 alebo 3, oligonukleotidovej sekvencie kódujúcej antisense sekvenciu RAP-2 proteínovej DNA sekvencie podľa nároku 1, alebo protilátok podľa nároku 7, na prípravu farmaceutického prostriedku na modulovanie zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania.

10. Použitie protilátok alebo ich aktívnych fragmentov, alebo derivátov podľa nároku 7 na prípravu farmaceutického prostriedku na modulovanie zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, pričom, ak sú RAP-2 proteín alebo jeho časti exponované na extracelulárnom povrchu týchto buniek, je prostriedok formulovaný na extracelulámu aplikáciu, a keď sú RAP-2 proteíny intraceluláme, je prostriedok formulovaný na intracelulámu aplikáciu.

11. Použitie rekombinantného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín, schopný viazať sa na špecifický nádorový bunkový povrchový receptor alebo na povrchový receptor HIV-infikovaných buniek, a sekvenciu kódujúcu proteín vybraný z RAP-2 proteínu, izoformy, analógu, fragmentu a derivátu podľa nároku 5, alebo RAP-2 proteínu, izoformy, analógu, fragmentu alebo derivátu získateľných spôsobom podľa nároku 6, ktorá keď sa exprimuje v nádorových alebo v HlV-infíkovaných bunkách, je schopná zosilniť RIP modulované/sprostredkované priame alebo nepriame usmrcovanie týchto buniek, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie nádorových buniek alebo HIV-infikovaných buniek, pričom tieto nádorové alebo HIV-infikované bunky musia byť infikované uvedeným vektorom.

12. Použitie vektora kódujúceho ribozýmovú sekvenciu schopnú interagovať s bunkovou mRNA sekvenciou kódujúcou RAP-2 proteín podľa nároku 5, alebo RAP-2 proteín získateľný spôsobom podľa nároku 6, na prípravu farmaceutického prostriedku na modulovanie zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, pričom uvedený vektor je vo forme, ktorá umožňuje expresiu ribozýmovej sekvencie v bunkách, a pri expresii ribozýmovej sekvencie v bunkách interaguje s bunkovou mRNA sekvenciou a štiepi mRNA sekvenciu, čo vedie k inhibícii expresie RAP-2 proteínu v týchto bunkách.

13. Použitie jedného alebo viacerých RAP-2 proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov podľa nároku 5, alebo RAP-2 proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov získateľných spôsobom podľa nároku 6, alebo DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero týchto proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov vo forme vhodného vektora nesúceho túto sekvenciu, ktorý je schopný účinne zaviesť túto sekvenciu do buniek spôsobom, pri ktorom sa sekvencia v bunkách exprimuje, na prípravu farmaceutického prostriedku na zavedenie do buniek na liečenie zápalu, autoimunitného ochorenia, septického šoku, odmietnutia štepu hostiteľom alebo hepatitídy.

14. Fragment podľa nároku 5 alebo získateľný spôsobom podľa nároku 6, ktorým je peptid.