SK13762000A3 - Dna sekvencia, ktorá kóduje rap-2 proteín, replikovateľné expresné vehikulum, transformované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky, rap-2 proteín, spôsob jeho výroby, protilátky, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka oblasti receptorov patriacich do TNF/NGF superrodiny receptorov a kontroly ich biologických funkcií. TNF/NGF superrodina receptorov zahŕňa receptory ako napríklad receptory p55 a p75 tumorových nekrotických faktorov (TNF-Rs, tu označované ako p55-R a p75-R) a receptor FAS ligandu (tiež označovaný ako FAS/APO1 alebo FAS-R a tu bude označovaný ako FAS-R) a iné. Konkrétne sa predložený vynález týka nových proteínov, ktoré sa viažu na iné proteíny, ktoré sa priamo alebo nepriamo viažu na členov TNF/NGF receptorovej rodiny a iné vnútrobunkové modulačné proteíny.

Konkrétnejšie sa vynález týka proteínu, tu označeného ako RAP-2 (od RIPasociovaný proteín-2) a jeho izoforiem, fragmentov, derivátov, ako aj proteínov, ktoré sa viažu na RAP-2.

RAP-2 sa viaže na RIP (proteín interagujúci s receptorom) a je schopný modulovať alebo sprostredkovať funkciu RIP, a tým je schopný aj modulovať alebo prostredkovať, priamo alebo nepriamo, funkciu RIP a iných proteínov, ktoré sa priamo alebo nepriamo viažu na RIP. RAP-2 viažuce proteíny sú modulátormi/mediátormi RAP-2 funkcie.

Doterajší stav techniky

Tumorový nekrotický faktor (TNF-α) a lymfotoxín (TNF-β) (tu používaná skratka TNF sa týka tak TNF-α, ako aj TNF-β) sú multifunkčné pro-zápalové cytokíny vytvárané najmä mononukleárnymi fagocytmi, ktoré majú mnoho účinkov na bunky (Wallach, D. (1986) v Interferón 7 (lon Gresser vyd.) str. 83 až 122,

-2Academic Press, London; a Beutler a Cerami (1987)). Tak TNF-α, ako aj TNF-β iniciujú svoje účinky väzbou na špecifické bunkové receptory. Niektoré účinky sú pravdepodobne pre organizmus výhodné: môžu napríklad zničiť nádorové bunky alebo bunky infikované vírusom a môžu zvýšiť antibakteriálne účinky granulocytov. Týmto spôsobom sa TNF podieľa na obrane organizmu proti nádorom a infekčným činidlám a na zotavení sa z poranenia. Takže TNF je možné použiť ako protinádorové činidlo, pri ktorého aplikácii sa viaže na svoje receptory na povrchu nádorových buniek, a tým spúšťa deje vedúce ku smrti nádorovej bunky. TNF môže byť použitý aj ako antiinfekčné činidlo.

Avšak tak TNF-α, ako aj TNF-β majú aj škodlivé účinky. Je dokázané, že nadprodukcia TNF-α môže hrať hlavnú patogenickú úlohu pri niekoľkých ochoreniach. Je napríklad známe, že hlavnými príčinami septického šoku sú účinky TNF-α, primárne na vaskulatúru (Tracey a ďalší, 1986). Pri niektorých ochoreniach môže TNF zapríčiniť nadmernú stratu hmotnosti (kachexia) potlačením účinkov adipocytov a spôsobením anorexie, a preto sa TNF-α nazýva kachektín. Je tiež opísaný ako mediátor poškodenia tkanív pri reumatických ochoreniach (Beutler a Cerami, 1987) a ako hlavný mediátor poškodenia pozorovaného pri reakciách odmietnutia štepu hostiteľom (Piquet a ďalší, 1987). Navyše je známe, že TNF sa podieľa na zápalových procesoch a na mnohých ďalších ochoreniach.

Dva odlišné, nezávisle exprimované receptory, p55 a p75, TNF-Rs, ktoré špecificky viažu TNF-α a TNF-β, iniciujú a/alebo sprostredkúvajú vyššie uvedené biologické účinky TNF. Tieto dva receptory majú štruktúrne nepodobné vnútrobunkové domény, čo naznačuje, že prenášajú signál odlišne (pozri Hohmann a ďalší, 1989; Engelmann a ďalší, 1990; Brockhaus a ďalší, 1990; Loetscher a ďalší, 1990; Schall a ďalší, 1990; Nophar a ďalší, 1990; Smith a ďalší, 1990; a Holler a ďalší, 1990). Avšak ešte vždy je potrebné odhaliť bunkové mechanizmy, napríklad rôzne proteíny a možné iné faktory, ktoré sú zahrnuté vo vnútrobunkovej signalizácii prostredníctvom p55 a p75 TNF-Rs. Je to vnútrobunková signalizácia, ktorá zvyčajne nastáva po naviazaní sa ligandu, tzn. TNF (a alebo β) na receptor,

-3čím sa začína kaskáda reakcií, ktorej konečným výsledkom je pozorovaná odpoveď bunky na TNF.

Čo sa týka vyššie uvedeného cytocidneho účinku TNF, vo väčšine buniek študovaných z tohto hľadiska bol tento účinok spustený najmä prostredníctvom p55 TNF-R. Protilátky proti extracelulárnej doméne (ligand viažuca doména) p55 TNF-R môžu sami spustiť cytocídny účinok (pozri EP 412486), ktorý koreluje s účinnosťou receptora krížovo prepojeného protilátkami, čo je považované za prvý krok generovania vnútrobunkového signálneho procesu. Navyše, mutačné štúdie (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993) ukázali, že biologická funkcia p55 TNF-R závisí od integrity vnútrobunkovej domény. V súlade s tým bolo navrhnuté, že iniciácia vnútrobunkovej signalizácie vedúca k cytocídnemu účinku TNF nastáva ako dôsledok asociácie dvoch alebo viacerých vnútrobunkových domén p55 TNF-R. Navyše TNF (a a β) sa vyskytuje ako homotrimér, a ako taký je navrhnutý ako faktor, ktorý indukuje vnútrobunkovú signalizáciu prostredníctvom p55 TNF-R tak, že je schopný viazať sa na a prepájať sa s molekulami receptora, tzn. spôsobovať agragáciu receptora.

Ďalším členom TNF/NGF superrodiny receptorov je FAS receptor (FAS-R), ktorý bol označený ako FAS antigén, pričom ide o bunkový povrchový protein exprimovaný v rôznych tkanivách, ktorý je homologický s množstvom bunkových povrchových receptorov vrátane TNF-R a NGF-R. FAS-R sprostredkúva bunkovú smrť vo forme apoptózy (Itoh a ďalší, 1991) a zdá sa, že slúži ako negatívny selektor autoreaktívnych T buniek, tzn. počas dozrievnania T buniek, FAS-R spôsobuje apoptickú smrť T buniek, ktoré rozoznávajú vlastné antigény. Zistilo sa tiež, že mutácie vo FAS-R géne (Ιρή spôsobujú poruchu lymfoproliferácie u myší, ktorá sa podobá ľudskému autoimunitnému ochoreniu - systémovému lupus erytematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga a ďalší, 1992). Zdá sa, že ligandom pre FAS-R je molekula spojená s bunkovým povrchom, ktorú, okrem iných nesú zabíjačské T bunky (alebo cytotoxické T lymfocyty- CTLs). Takže, keď sa takéto CTLs dostanú do kontaktu s bunkami nesúcimi FAS-R, sú schopné indukovať apoptickú bunkovú smrť buniek nesúcich FAS-R. Navyše bola pripravená monoklonálna protilátka, ktorá je špecifická pre FAS-R, a táto protilátka je schopná

-4indukovať apoptickú bunkovú smrť v bunkách nesúcich FAS-R, vrátane myšacích buniek transformovaných cDNA, ktorá kóduje ľudský FAS-R (Itoh a ďalší, 1991).

Prihlasovatelia použili množstvo prístupov (pozri napríklad európske prihlášky č. EP 186833, EP 308378, EP 398327 a EP 412486) na regulovanie ničivých účinkov TNF prostredníctvom inhibovania viazania sa TNF na jeho receptori použitím anti-TNF protilátok alebo použitím rozpustných TNF receptorov, ktoré konkurovali viazaniu sa TNF na TNF-Rs naviazané na povrch. Navyše, vychádzajúc zo skutočnosti, že TNF viazanie sa na jeho receptory je potrebné pre TNF-indukované bunkové účinky, prihlasovatelia použili prístupy (pozri napríklad EP 568925) na modulovanie TNF účinku modulovaním aktivity TNF-Rs.

V stručnosti, EP 568925 sa týka spôsobu modulovania prenosu signálu a/alebo štiepenia v TNF-Rs, ktorým môžu peptidy alebo iné molekuly interagovať buď so samotným receptorom, alebo s efektorovými proteínmi interagujúcimi s receptorom, a tak modulovať normálnu funkciu TNF-Rs. V EP 568925 je opísaná konštrukcia a charakterizácia rôznych mutantných foriem p55 TNF-Rs, ktoré majú mutácie v extracelulárnej, transmembránovej a vnútrobunkovej doméne. Týmto spôsobom sa identifikovali oblasti vo vyššie uvedených doménach p55 TNF-R, ktoré sú nevyhnutné pre fungovanie receptora, tzn. pre väzbu ligandu (TNF) a následný prenos signálu a pre vnútrobunkovú signalizáciu, ktorej konečným výsledkom je TNF účinok pozorovaný na bunkách. Ďalej, uvedený dokument opisuje množstvo postupov na izoláciu a identifikáciu proteínov, peptidov alebo iných faktorov, ktoré sú schopné viazať sa na rôzne oblasti vyššie uvedených domén TNF-R, pričom tieto proteíny, peptidy a iné faktory sa môžu podieľať na regulácii alebo modulovaní aktivity TNF-R. V EP 568925 je uvedené aj množstvo postupov na izolovanie a klonovanie DNA sekvencií kódujúcich takéto proteíny a peptidy; na konštrukciu expresných vektorov na produkciu týchto proteínov a peptidov; a na prípravu protilátok alebo ich fragmentov, ktoré interagujú s TNF-R alebo s vyššie uvedenými proteínmi a peptidmi, ktoré sa viažu na rôzne oblasti TNF-R. Avšak EP 568925 nešpecifikuje konkrétne proteíny a peptidy, ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs (napr. p55 TNF-R), ani neopisuje kvasinkový dvojhybridný postup na izoláciu a identifikáciu takých proteínov alebo peptidov,

-5ktoré sa viažu na vnútrobunkové domény TNF-Rs. Podobne, EP 568925 neopisuje proteíny alebo peptidy, ktoré sú schopné viazať sa na vnútrobunkovú doménu FASR.

Hoci je známe, že receptory pre tumorový nekrotický faktor (TNF) a štruktúrne príbuzný receptor FAS-R spúšťajú po stimulácii ligandami produkovanými leukocytmi deštrukčné aktivity v bunkách, ktoré vedú k ich usmrteniu, je mechanizmus tohto spustenia ešte stále málo pochopený. Z mutačných štúdií vyplýva, že FAS-R a p55 TNF receptorový (p55-R) prenos cytotoxického signálu zahŕňa rôzne oblasti vo vnútri ich vnútrobunkových domén (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993; Itoh a Nagata, 1993). Tieto oblasti (smrtiace domény) majú podobné sekvencie. Smrtiace domény tak FAS-R, ako aj p55-R majú tendenciu spájať sa sami so sebou. Je zrejmé, že toto vzájomné spájanie podporuje agregovanie receptorov, ktoré je potrebné na iniciovanie prenosu signálu (pozri Song a ďalší, 1994; Wallach a ďalší, 1994; Boldin a ďalší, 1995), a výsledkom vysokých úrovní receptorovej expresie môže byť spustenie ligandzávislého prenosu signálu (Boldin a ďalší, 1995).

Podobne ako iné účinky indukované receptorom, indukcia bunkovej smrti TNF receptormi a FAS-R nastáva prostredníctvom série proteín-proteín interakcií, ktoré vedú od väzby ligandu na receptor, k eventuálnej aktivácii enzymatických efektorových funkcií, pričom v prípade štúdií boli odhalené neenzymatické proteínproteín interakcie, ktoré iniciujú prenos signálu pre bunkovú smrť: naviazanie trimérnych TNF alebo FAS-R ligandových molekúl na receptory, čo sú výsledné interakcie ich vnútrobunkových domén (Brakebusch a ďalší, 1992; Tartaglia a ďalší, 1993; Itoh a Nagata, 1993), ktoré sú zosilnené náchylnosťou motívov smrtiacich domén navzájom asociovať (Boldin a ďalší, 1995a) a indukované väzbou dvoch cytoplazmatických proteínov (ktoré sa môžu viazať aj navzájom) na receptorové vnútrobunkové domény - MORT-1 (alebo FADD) na FAS-R (Boldin a ďalší, 1995b; Chinnaiyan a ďalší, 1995; Kischkel a ďlaší, 1995) a TRADD na p55-R (Hsu a ďalší, 1995; Hsu a ďalší, 1996). Kvasinkovým dvojhybridným skríningovým postupom sa identifikovali tri proteíny, ktoré sa viažu na vnútrobunkovú doménu FAS-R a p55-R v oblasti smrtiacej domény podieľajúcej sa na indukcii bunkovej smrti

-6prostredníctvom receptorov cez hetero-asociovanie homologických oblastí, a ktoré sú tiež schopné nezávisle spustiť bunkovú smrť. Jedným z nich je proteín MORT-1 (Boldin a ďalší, 1995b), tiež známy ako FADD (Chinnaiyan a ďalší, 1995), ktorý sa špecificky viaže na FAS-R. Druhý, TRADD (pozri aj Hsu a ďalší, 1995, 1996) sa viaže na p55-R, a tretí, RIP (pozri aj Stanger a ďalší, 1995) sa viaže tak na FAS-R, ako aj na p55-R. Okrem toho, že sa viažu na FAS-R a p55-R, sú tieto proteíny schopné aj viazať sa navzájom, čo poskytuje funkčnú krížovú komunikáciu medzi FAS-R a p55-R. Tieto väzby sa uskutočňujú prostredníctvom konzervatívneho sekvenčného motívu, smrtiaceho doménového modulu, ktorý je spoločný pre receptory a ich asociované proteíny. Navyše, hoci kvasinkový dvojhybridný test ukázal, že MORT-1 sa spontánne viaže na FAS-R, v cicavčích bunkách sa táto väzba uskutočňuje len po stimulácii receptora, čo naznačuje, že MORT-1 sa podieľa na úvodných dejoch FAS-R signalizácie. MORT-1 neobsahuje žiadny sekvenčný motív, pre ktorý by bola typická enzymatická aktivita, takže sa zdá, že jeho schopnosť spustiť bunkovú smrť nezahŕňa vnútorný účinok samotného MORT1, ale skôr aktiváciu nejakého iného proteínu (proteínov), ktorý sa viaže na MORT1, a účinkuje v signalizačnej kaskáde následne. Ukázalo sa, že bunková expresia MORT-1 mutantov, ktorým chýba N-koncová časť molekuly, blokuje cytotoxickú indukciu sprostredkovanú FAS/APO1 (FAS-R) alebo p55-R (Hsu a ďalší, 1996; Chinnaiyan a ďalší, 1996), z čoho vyplýva, že N-koncová časť prenáša signál pre cytocídny účinok oboch receptorov prostredníctvom proteín-proteín interakcií.

Takže je zrejmé, že motívy smrtiacej domény receptorov p55-R a FAS-R, ako aj ich troch asociovaných proteínov MORT-1, RIP a TRADD sú miestami proteín-proteín interakcií. Tri proteíny MORT-1, RIP a TRADD interagujú s p55-R a FAS-R vnútrobunkovými doménami väzbou ich smrtiacich domén na smrtiace domény receptorov, a tak pri RIP, ako aj pri TRADD asociujú ich smrtiace domény sami so sebou, (hoci MORT-1 sa v tomto ohľade líši v tom, že jeho smrtiaca doména neasociuje sama so sebou). Navyše, MORT-1 a TRADD sa odlišne viažu na FAS-R a p55-R a viažu sa tiež navzájom. Tak MORT-1, ako aj TRADD sa účinne viažu na RIP. V súlade s tým by sa mohlo zdať, že interakcia medzi troma proteínmi MORT-1, RIP a TRADD je dôležitou časťou celkovej modulácie vnútrobunkovej

-7signalizácie sprostredkovanej týmito proteínmi. Výsledkom interferencie interakcie medzi týmito troma vnútrobunkovými proteínmi bude modulácia účinkov spôsobených touto interaciou. Napríklad, inhibícia TRADD viazania sa na MORT-1 môže modulovať FAS-R-p55 TNF-R interakciu. Podobne, inhibícia RIP okrem vyššie uvedenej inhibície TRADD väzby na MORT-1 môže navyše modulovať FASR-p55 TNF-R interakciu.

Monoklonálne protilátky vyvolané proti smrtiacej doméne p55-R, konkrétne proti väzobným miestam TRADD a RIP môžu byť tiež použité na inhibíciu alebo prevenciu väzby týchto proteínov, a tak spôsobovať moduláciu interakcie medzi FAS-R a p55-R.

V súčasnosti sa zistilo, že okrem vyššie uvedených bunkových cytotoxických účinkov a ich modulácie prostredníctvom rôznych receptorov a ich väzobných proteínov vrátane FAS-R, p55-R, MORT-1, TRADD, RIP, MACH, Mch4 a G1, môže sa množstvo týchto receptorov a ich väzobných proteínov podieľať aj na modulovaní aktivity jadrového transkripčného faktora NF-κΒ, ktorý je kľúčovým mediátorom bunkového prežívania alebo životaschopnosti, keďže je zodpovedný za kontrolu expresie mnohých imunitné a zápalovo responzívnych génov. Napríklad sa zistilo, že TNF-α v skutočnosti stimuluje aktiváciu NF-κΒ, a tak je TNF-α schopný indukovať dva typy signálu v bunkách, jedným je vyvolanie bunkovej smrti a druhým je ochrana bunky pred indukciou smrti indukovaním génovej expresie prostredníctvom NF-κΒ (pozri Beg a Baltimore, 1996; Wang a ďalší, 1996; Van Antwerp a ďalší, 1996). Podobný duálny účinok bol publikovaný aj pre FAS-R (pozri citácie týkajúce sa tohto účinku uvedené vyššie vo Van Antwerp a ďalší, 1996). Malo by byť preto zrejmé, že existuje jemná rovnováha medzi bunkovou smrťou a prežívaním bunky pri stimulácii rôznych typov buniek s TNF-α a/alebo FAS-R ligandom, pričom finálny výstup stimulácie je závislý na tom, ktorá vnútrobunková dráha sa stimuluje vo väčšom rozsahu, či dráha vedúca k bunkovej smrti (zvyčajne apoptóza) alebo dráha vedúca k bunkovému prežívaniu prostredníctvom aktivácie NF-kB.

-8Navyše, pôvodcovia predloženého vynálezu v súčasnosti podrobnejšie objasnili možnú dráhu, ktorou členovia TNF/NGF receptorovej rodiny aktivujú NF-kB (pozri Malinin a ďalší, 1997 a rôzne tam uvedené relevantné citácie; a spoločne vlastnené izraelské prihlášky č. IL117800 s IL119133, ktoré sú paralelne v konaní). V stručnosti, zistilo sa, že niekoľko členov TNF/NGF receptorovej rodiny je schopných aktivovať NF-κΒ prostredníctvom spoločného adaptorového proteínu, TRAF2. Novoobjavená protein kináza nazvaná NIK (pozri vyššie Malinin a ďalší, 1997 a IL 117800 a IL119133) je schopná viazať sa na TRAF2 a stimulovať NF-kB aktivitu. V skutočnosti sa ukázalo (pozri vyššie uvedenú publikáciu Malinin a ďalší a IL prihlášky), že výsledkom expresie kináz-deficientných NIK mutantov sú bunky, v ktorých nie je možné stimulovať NF-κΒ normálnym endogénnym spôsobom a tiež bunky, ktoré sú blokované v indukcii NF-κΒ aktivity prostredníctvom TNF aj FAS-R, a ktoré sú blokované v induckcii NF-κΒ prostredníctvom TRADD, RIP a MORT-1 (čo sú adaptorové proteíny, ktoré sa viažu na p55-R a/alebo FAS-R receptory). Všetky receptory p55-R, p75-R, FAS-R a ich adaptorové proteíny MORT-1, TRADD a RIP sa priamo alebo nepriamo viažu na TRAF2, ktorý svojou schopnosťou viazať sa na NIK zjavne moduluje indukciu NF-kB.

Je zrejmé, že z vyššie uvedených modulačných proteínov, ktoré sa podieľajú na jemnej rovnováhe medzi bunkovou smrťou a prežívaním po stimulácii FAS-R a/alebo p55-R, hrá dôležitú úlohu RIP. RIP (pozri Stanger a ďalší, 1995 a aj Malinin a ďalší, 1997) má smrtiacu doménu v svojej C-terminálnej oblasti, ktorá umožňuje indukciu bunkovej cytotoxicity nezávislým spôsobom a aj asociáciou so smrtiacimi doménami MORT-1, p55-R, FAS-R a TRADD. RIP má aj protein kinázovú doménu vo svojej N-terminálnej oblasti a prostrednú doménu, ktorá sa považuje za schopnú intersekcie (viazania sa) s TRAF2 a teda za doménu, ktorá sa podieľa na indukcii NF-κΒ. V súlade s tým sú podrobnosti týkajúce sa vlastností a sekvencií (DNA a aminokyselinových) RIP uvedené vo vyššie uvedených publikáciách (najmä v Stanger a ďalší, 1995) zahrnuté do tohto opisu ich citáciou.

TNF je aj jedným z cytokínov, ktoré sa podieľajú na iniciovaní a modulovaní protivírusovej obrany hostiteľa. Podobne, vyvinuli sa vírusy, ktoré exprimujú gény,

-9ktorých proteíny regulujú aktivitu cytokínov a tieto cytokín-regulačné vírusové proteíny sú považované za proteíny napomáhajúce perzistencii vírusu vo vnútri živočíšneho hostiteľa. Jedným z najlepšie preštudovaných príkladov takéhoto proteínu je E3-14.7K zo skupiny C ľudských adenovírusov (Ad) typov 2 a 5, ktorý účinkuje ako silný antagonista TNF-sprostredkovanej cytolýzy.

S cieľom izolovať molekulové komponenty TNF signalizačnej kaskády, ktoré sú cieľmi pre E3-14.7K pri vírusovej infekcii, izoloval sa v súčasnosti ľudský protein viažuci E3-14.7K dvojhybridným skríningom (FIP-2 od Fourteen-K jnteracting Protein, Li Y. a ďalší, 1998). Zistilo sa, že FIP-2 je ako taký netoxický a neguje ochranný účinok E3-14.7K na cytotoxicitu indukovanú nadexpresiou TNFR-I alebo RIP, bez toho, aby sa viazal na nejaký z vyššie uvedených proteínov. Zistilo sa, že FIP-2 je homologický s RAP-2, proteínom podľa predloženého vynálezu. Avšak stupeň celkovej podobnosti medzi RAP-2 a FIP-2 je dosť nízky, ako je zrejmé z celkového porovnania dvoch aminokyselinových sekvencii (obrázok 3). Homológia sa však stáva významnejšou v konkrétnych oblastiach smerom k C-koncu proteínov, a kulminuje skutočnou zhodou 30 C-koncových aminokyselín. Je pozoruhodné, že okrem vyššie uvedenej C-koncovej domény, je v RAP-2 značne konzervovaný motív leucínového zipsu z FIP-2 (okrem lle na Ala substitúcie).

Podobne sa v súčasnosti dodala do GenBank sekvencia označená ako HYPL, ktorá kóduje protein týkajúci sa Huntingtonovej choroby, a zdá sa, že je vzdialeným homológom RAP-2, s názvom protein interagujúci s huntingtínom, HYPL (prístupové číslo AF049614). Avšak publikácia opisujúca funkciu proteínu ešte nebola zverejnená.

Súčasná publikácia od Yamaoka S. a ďalší (1998) zverejňuje identifikáciu hlodavčieho RAP-2 homológu. Hlodavčí homológ NEMO (od NF-κΒ esenciálny modulátor) sa identifikoval pri prehľadávaní kľúčových molekúl, ktoré regulujú aktiváciu NF-κΒ signalizácie. Charakterizoval sa plochý bunkový variant HTLV-I Tax transformovaných potkaních fibroblastov, označený 5R, ktorý neodpovedal na žiadne NF-κΒ aktivačné stimuly (LPS, PMA, IL-I, TNF) a uskutočnila sa jeho genetická komplementácia. Výsledkom tohto postupu bola izoláci cDNA, ktorá

-10kóduje NEMO 48kD protein. Na základe týchto údajov je možné tvrdiť, že tento protein nie je prítomný v 5R bunkách, je časťou Ik B-kinázového komplexu s vysokou molekulovou hmotnosťou a je potrebný pre jeho vytvorenie. In vitro môže NEMO homodimerizovať a priamo interagovať s ΙΚΚβ.

V opise izraelského patentu č. 120485 je uvedený RIP-asociovaný protein, označený ako RAP, ktorý sa špecificky viaže na RIP a inhibuje indukciu NF-kB.

Opis izraelského patentu č. 123758 sa týka iného RIP-asociovaného proteínu, označeného ako RAP-2, ktorý má rovnaké alebo podobné účinky.

RAP-2 podľa vynálezu sa nazýva aj 303 alebo RAP-303 alebo RAT-303. Kvôli prehľadnosti sa tu ďalej bude označovať ako RAP-2.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je protein RAP-2, vrátane všetkých jeho izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov, ktorý je schopný viazať sa na RIP protein (tu ďalej označovaný ako RIP). Keďže RIP je schopný priamo alebo nepriamo interagovať s vnútrobunkovými mediátormi zápalu, bunkovej cytotoxicity/bunkovej smrti, ako p55-R a FAS-R a ich asociovanými adaptorovými alebo modulátorovými proteínmi, ako napríklad MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1 a inými, sú nové proteíny podľa vynálezu prostredníctvom viazania sa na RIP schopné ovplyvniť vnútrobunkový signalizačný proces iniciovaný viazaním sa FAS ligandu na svoj receptor a viazaním sa TNF na svoj receptor (p55-R), a ako také sú nové proteíny podľa predloženého vynálezu modulátormi p55-R a FAS-R- sprostredkovaných účinkov na bunky. RIP je schopný aj interagovať s TRAF2, a tým je schopný priamo alebo nepriamo interagovať s NIK, a tak RIP slúži ako modulátor zápalových a bunkových prežívacích dráh, ktoré zahŕňajú indukciu NF-κΒ, takže nové proteíny podľa predloženého vynálezu sú modulátormi zápalového a bunkového prežívacieho účinku závislého na RIP. Podobne môžu byť proteíny podľa predloženého vynálezu prostredníctvom FAS-R, p55-R a ich modulačných proteínov MORT-1 a TRADD, ktoré sú schopné indukovať NF-κΒ a bunkové

-11 prežívanie priamym alebo nepriamym viazaním sa na RIP alebo viazaním sa na TRAF2, na ktorý sa viaže RIP, aj mediátormi procesov bunkového prežívania, prostredníctvom operovania cez spoločné alebo príbuzné vnútrobunkové signalizačné dráhy, v ktorých operujú rôzne vyššie uvedené proteíny, aby sa indukovalo prežívanie bunky. Podobne, keďže p75-R sa viaže na TRAF2, na ktorý sa viaže RIP, môžu byť nové proteíny podľa vynálezu aj modulátormi RIPsprostredkovaného účinku prostredníctvom p75-R.

Iným predmetom vynálezu je poskytnúť antagonistov (napr. protilátky, peptidy, organické zlúčeniny alebo aj niektoré izoformy) voči vyššie uvedeným novým RAP-2 proteínom, ich izoformám, analógom, fragmentom a derivátom, ktoré môžu byť použité na inhibíciu signalizačného procesu, alebo konkrétnejšie na inhibíciu zápalovej bunkovej cytotoxicity alebo procesov bunkového prežívania, ak je to želateľné.

Ďalším predmetom vynálezu je použitie vyššie uvedených RAP-2 proteínov, ich izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov na izoláciu a charakterizáciu ďalších proteínov alebo faktorov, ktoré sa môžu podieľať na regulácii receptorovej aktivity, napr. iných proteínov, ktoré sa môžu viazať na RAP-2 proteíny a ovplyvňovať ich účinok a/alebo na izoláciu a identifikáciu iných receptorov, ktoré pôsobia v signalizačných procesoch predtým alebo následne, a na ktoré sa tieto proteíny, analógy, fragmenty a deriváty viažu, a tým sa podieľajú aj na ich funkcii.

Vynález poskytuje aj proteíny viažuce RAP-2, ktoré sú schopné modulovať/sprostredkovať RAP-2 funkciu.

Ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť inhibítory, ktoré môžu byť zavedené do buniek, aby sa viazali alebo interagovali s RAP-2 a možnými RAP-2 izoformami, pričom môžu pôsobiť ako inhibítory účinku asociovaného s RIP v bunkových cytotoxických procesoch a tým, ak je to želateľné, posilniť bunkové prežívanie, alebo môžu pôsobiť ako inhibítory účinku asociovaného s RIP v bunkových prežívacích procesoch a tým, ak je to želateľné, posilniť bunkovú cytotoxicitu.

Navyše, predmetom predloženého vynálezu je použitie vyššie uvedených RAP-2 proteínov, ich izoforiem a analógov, fragmentov a derivátov ako antigénov

-12na prípravu polyklonálnych a/alebo monoklonálnych protilátok voči nim. Naopak, protilátky môžu byť použité napríklad na purifikáciu nových proteínov z odlišných zdrojov, ako bunkových extraktov alebo transformovaných bunkových línií.

Navyše, tieto protilátky môžu byť použité na diagnostické účely, napr. na identifikáciu porúch týkajúcich sa abnormálnej funkcie bunkových účinkov sprostredkovaných p55-R, FAS-R alebo inými príbuznými receptormi.

Ďalším predmetom vynálezu je poskytnúť farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú vyššie uvedené RAP-2 proteíny, ich izoformy alebo analógy, fragmenty alebo deriváty, ako aj farmaceutické prostriedky obsahujúce vyššie uvedené protilátky alebo iné antagonisty.

Podľa predloženého vynálezu bol izolovaný nový protein RAP-2. RAP-2 je schopný viazať sa na alebo interagovať s RIP, takže je modulátorom alebo mediátorom RIP vnútrobunkového účinku. RIP sa podieľa na modulácii alebo sprostredkovaní vnútrobunkových signalizačných dráh, napr. bunkovej cytotoxicity alebo dráhy spojenej s bunkovou smrťou, pričom RIP má v nich cytotoxický účinok samotný ale aj v spojení, priamom alebo nepriamom s množstvom iných proteínov spojených s bunkovou smrťou, ako napríklad MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1, p55-R a FAS-R, s ktorými sa RIP môže asociovať alebo viazať priamym alebo nepriamym spôsobom prostredníctvom motívu/modulu smrtiacej domény, ktorá sa nachádza v RIP a vo všetkých vyššie uvedených proteínoch. Ďalšou dráhou, v ktorej môže mať RIP aktívnu úlohu, priamo alebo nepriamo prostredníctvom prítomnosti kinázového motívu alebo domény nachádzajúcej sa v RIP a schopnosti RIP viazať sa na TRAF2, ktorý sa môže viazať na NIK, ktorá sa priamo podieľa na aktivácii NF-κΒ, ktorý hrá hlavnú úlohu pri zápale a bunkovom prežívaní, je zápalová dráha, dráha bunkového prežívania alebo dráha životaschopnosti. Navyše p55-R je schopný aj interagovať s TRADD a TRAF2 (prostredníctvom TRADD) a podieľa sa aj na aktivácii NF-κΒ a tým na dráhe bunkového prežívania, a teda RIP, ktorý je schopný viazať sa na alebo interagovať s FAS-R, TRADD a p55-R (cez TRADD), ako aj s TRAF2, sa môže podieľať, prostredníctvom týchto proteínov, aj na modulovaní zápalu a aktivovaní bunkového prežívania. Z toho vyplýva, že RIP je

-13modulátorom alebo mediátorom týchto dráh a podobne, nový RAP-2 podľa vynálezu je prostredníctvom väzby na RIP modulátorom alebo mediátorom týchto vn útrobu nkových dráh.

RAP-2 sa izoloval a klonoval použitím kvasinkového dvojhybridného systému, sekvenoval a charakterizoval sa ako je podrobne opísané nižšie. Je zrejmé, že RAP-2 je vysokošpecifickým proteínom viažucim RIP, a teda špecifickým RIP modulátorom/mediátorom. RAP-2 sa neviaže na TRADD, MORT-1, p55-R, p75R a MACH. Ďalej je zrejmé, že RAP-2 nemá charakteristický modul alebo motív smrtiacej domény, čo je v súlade so zistením, že RAP-2 ako taký neindukuje bunkovú cytotoxicitu.

Tu používaný výraz RIP účinok je mienený tak, že zahŕňa jeho účinok pri modulovaní/sprostredkovaní v zápalovej dráhe a v dráhach bunkovej smrti alebo prežívania. Tieto účinky vyplývajú z tu uvedeného opisu, ako aj zo všetkých vyššie uvedených publikácií a patentových prihlášok, ktorých kompletný obsah je tu zahrnutý ich citáciou. Podobne, tu používaný výraz RAP-2 účinok je mienený tak, že zahŕňa jeho modulovanie/sprostredkovanie RIP účinku prostredníctvom jeho špecifickej väzby na RIP, pričom táto modulácia/sprostredkovanie RIP prostredníctvom RAP-2 zahŕňa moduláciu/sprostredkovanie zápalu, bunkovej smrti a dráhy bunkového prežívania, na ktorých sa RIP priamo alebo nepriamo podieľa, a ako taký môže byť RAP-2 považovaný za nepriamy modulátor/mediátor všetkých vyššie uvedených proteínov a je možné, že aj množstva iných, ktoré sa podieľajú na zápale, bunkovej smrti alebo bunkového prežívania, a na ktorý sa RIP viaže, alebo s ktorým RIP interaguje priamym alebo nepriamym spôsobom.

Tento vynález opisuje aj dva nové RAP-2 viažuce proteíny, ktoré sa identifikovali dvojhybridným skríningom použitím úplnej RAP-2 proteínovej sekvencie ako návnady.

Použitím kompletného RAP-2 proteínu ako návnady v dvojhybridnom skríningu sa získal nový protein interagujúci s RAP-2, tu označený ako kloň č. 10 (alebo protein kódovaný klonom č. 10 alebo RAT-viažuci protein č. 10 alebo RBT10). Sekvencia získanej cDNA sa ďalej študovala použitím sekvenčných metód

-14dobre známych v oblasti smerom k 5' koncu, aby sa rekonštituoval čiastočný otvorený čítací rámec proteínu, ktorému však chýba štartovací kodón.

Dvojhybridným testom väzobného repertoáru klonu č. 10 sa odhalilo, že tento proteín sa nie len že viaže na RAP-2, ale vykazuje aj pomerne silnú afinitu k TRAF2. Kloň č. 10 sa však neviaže na RIP, TRADD, MORT1, MACH, TNFR-I, TIP60 a NIK, ako ani na niekoľko kontrolných proteínov (napríklad na cyklín D). Nemožno však vylúčiť, že kloň č. 10 sa môže viazať na NIK v cicavčích bunkách, berúc do úvahy zvláštnosti správania sa NIK v kvasinkách. Ukázalo sa, že kloň č. 10 sa viaže na RAP-2 vo vnútri C-koncových 200 aminokyselín alebo ďalej, tzn. v oblasti, ktorá nie je nevyhnutná na asociáciu s RIP, TIP60, NIK a ΙΚΚβ. Táto sekvencia nám, hoci nedostatočne, umožnila uskutočniť niekoľko kôl prieskumu GenBank za účelom identifikácie homológov klonu č. 10. Jediným, proteínom, ktorý vykazoval podstatný stupeň podobnosti s proteínom kódovaným klonom č. 10 bol F40F12.5, hypotetická molekula z C. Elegans, ktorej nie je priradená žiadna fýziologická úloha.

Je zaujímavé, že F40F12.5 vykazuje určitú podobnosť s niekoľkými členmi značne konzervovanej rodiny ubiquitínom-riadených proteáz. Tieto enzýmy tvoria protiváhu deštrukčného účinku ubiquitínovej mašinérie, o ktorej je známe, že je zodpovedná za väčšinu proteínových degradačných dejov v bunke. Zatiaľ čo ubiquitínové Iigázy sú zodpovedné za pripojenie poly-ubiquitínového stromu na proteín, ktorý je určený na degradáciu, ubiquitínové proteázy zabraňujú rozvetvovaniu sa rastúceho stromu. Takýto predpoklad týkajúci sa funkcie F40F12.5 založený na podobnosti s vyššie uvedenými ubiquitínom-riadenými proteázami je však otázny, keďže sa ešte neskúmalo, či tento konkrétny proteín má nejakú enzymatickú aktivitu vo vzťahu k ubiquitínovým polymérom. Navyše, niekoľko bodov robí takúto zhodu dosť nepravdepodobnou;

a) Zvyšky, ktoré sú považované za také, ktoré predstavujú jadrovú katalytickú oblasť každej podtriedy ubiquitínových proteáz, nie sú konzervované ani vo F40F12.5, ani v klone č. 10;

b) Okrem ich katalytických miest, enzýmy rodiny ubiquitínom-riadených proteáz odvodené z rôznych druhov (od baktérií po ľudí) v skutočnosti nevykazujú žiadnu

- 15sekvenčnú zhodu, zatiaľ čo F40F12.5 a kloň č. 10 vykazujú určitý stupeň homológie.

Takže je zrejmé, že RAP-2 je špecifický RIP-viažuci proteín, a teda modulátor/mediátor RIP vnútrobunkového účinku. RAP-2 viažuce proteíny majú prostredníctvom ich schopnosti viazať RAP-2 nepriamy vplyv na RIP, a sú aj modulátormi/mediátormi RIP vnútrobunkového účinku.

Takže ako je zrejmé RAP-2 má úlohu pri modulovaní/sprostredkovaní zápalu, bunkového prežívania a/alebo bunkovej smrti, na ktorých sa podieľa RIP, priamo alebo nepriamo, najmä pri procesoch, ktoré sa týkajú cytotoxicity a zápalu spôsobených alebo indukovaných rôznymi stimulmi vrátane stimulov prenášaných cez receptory TNF/NGF receptorovej rodiny, ako aj možnými inými stimulmi (pozri schému RIP podielu na týchto vnútrobunkových dejoch, a tým aj schému RAP-2 podielu, na obrázku 1 v Malinin a ďalší, 1997).

RAP-2 môže slúžiť aj ako inhibítor bunkovej cytotoxicity a zápalu prostredníctvom jeho prítomnosti ako časti komplexu s inými proteínmi, napr. RIP a proteínmi viazanými na RIP, a tak môže ovplyvniť cytotoxické alebo zápalové účinky týchto iných proteínov (napr. p55-R, FAS-R, MACH, Mch4, G1 a MORT-1), ktorých konečným výsledkom je inhibícia ich cytotoxického účinku alebo ich účinku pri zápale.

RAP-2 môže slúžiť aj ako zosilňovať bunkovej cytotoxicity a zápalu, a to zosilnením účinku iných proteínov, napr. RIP a iných proteínov viažucich sa na RIP, ako je uvedené vyššie, prostredníctvom napomáhania zhromaňďovaniu týchto proteínov cez RIP. Zhromažďovanie slúži na zosilnenie cytotoxického účinku rôznych proteínov alebo na zosilnenie ich zápalových účinkov.

Podobne môže RAP-2 analogickým spôsobom slúžiť ako inhibítor alebo zosilňovať bunkovej prežívacej dráhy, ako bolo uvedené vyššie, prostredníctvom podielania sa RIP na tejto dráhe.

V súlade s tým, predložený vynález poskytuje DNA sekvenciu, ktorá kóduje RIP-asociovaný proteín (RAP-2), jeho izoformy, analógy alebo fragmenty, ktoré sú schopné viazať sa na RIP a modulovať alebo sprostredkovať vnútrobunkový účinok

-16RIP, pričom uvedeným vnútrobunkovým účinkom je modulácia/sprostredkovanie zápalu a/alebo bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania.

Predložený vynález poskytuje najmä DNA sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá zahŕňa:

a) cDNA sekvenciu odvodenú od kódujúcej oblasti prirodzeného RAP-2 proteínu;

b) DNA sekvencie schopné hybridizovať so sekvenciou podľa a) v stredne prísnych podmienkach, ktoré kódujú biologicky účinný RAP-2 proteín; a

c) DNA sekvencie, ktoré sú degenerované ako následok genetického kódu, vo vzťahu k DNA sekvenciám definovaným podľa a) a b), a ktoré kódujú biologicky účinný RAP-2 proteín.

Iným konkrétnym uskutočnením vyššie uvedenej DNA sekvencie podľa vynálezu je DNA sekvencia, ktorá zahŕňa najmenej časť sekvencie kódujúcej aspoň jednu izoformu RAP-2 proteínu. Iným uskutočnením vyššie uvedenej DNA sekvencie je sekvencia kódujúca RAP-2 proteín ako je znázornená na obrázku 1. Ešte iným uskutočnením je DNA sekvencia znázornená na obrázku 2.

Predložený vynález poskytuje RAP-2 proteíny, ich analógy, fragmenty alebo deriváty kódované, ktoroukoľvek z vyššie uvedených sekvencii podľa vynálezu, ktoré sú schopné viazať sa na RIP a modulovať/sprostredkovať jeho biologický účinok vo vnútrobunkových dráhach bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania.

Konkrétnym uskutočnením vynálezu je RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty. RAP-2 proteínová sekvencia, ako bola odvodená od DNA sekvencii znázornených na obrázkoch 1 a 2, je uvedená na obrázku 3. Iným uskutočnením je akákoľvek izoforma RAP-2 proteínu, jej analógy, fragmenty a deriváty.

Predložený vynález poskytuje aj replikovateľné expresné nástroje, ktoré zahŕňajú vyššie uvedenú DNA. Tieto replikovateľné expresné nástroje sú schopné byť exprimované vo vhodných eukaryotických alebo prokaryotických hostiteľských bunkách. Vynález ďalej poskytuje transformované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky obsahujúce takéto replikovateľné expresné nástroje; a spôsob produkcie RAP-2 proteínu alebo analógov, fragmentov alebo derivátov podľa vynálezu pestovaním takýchto transformovaných hostiteľských buniek v

- 17podmienkach, ktoré sú vhodné na expresiu uvedeného proteínu, analógov, fragmentov alebo derivátov, uskutočňovaním post-translačných modifikácií uvedeného proteínu, ak je to nevyhnutné na získanie proteínu a extrahovaním exprimovaného proteínu, analógov, fragmentov alebo derivátov z kultivačného média transformovaných buniek alebo z bunkových extraktov transformovaných buniek. Vyššie uvedené definície zahŕňajú všetky izoformy RAP-2 proteínu.

Iným predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť aj protilátky alebo ich aktívne deriváty alebo fragmenty špecifické voči RAP-2 proteínu, jeho analógom a derivátom podľa vynálezu.

Ešte iným predmetom vynálezu je poskytnúť rôzne použitia vyššie uvedených DNA sekvencii alebo proteínov, ktoré sú nimi kódované, podľa vynálezu. Tieto použitia okrem iného zahŕňajú:

(i) Spôsob modulácie vnútrobunkových dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú modulované alebo sprostredkované proteínom RIP, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými RAP-2 proteínmi, jeho izoformami, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi, ktoré sú schopné viazať sa na RIP, pričom toto ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo viacerých proteínov, jeho izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná na ich vnútrobunkové zavedenie, alebo zavedenie DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero proteínov, izoforiem, analógov alebo derivátov do bunky vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť začlenenie sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa táto sekvencia v bunkách exprimuje.

(ii) Spôsob modulácie vnútrobunkových dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú modulované ligandami TNF rodiny prostredníctvom účinku na bunky cez pôsobenie RIP proteínu podľa pôdu (i) vyššie, pričom ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie proteínu, jeho izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme, ktorá je vhodná na ich vnútrobunkové zavedenie, alebo zavedenie DNA sekvencie kódujúcej G1 proteín alebo jeho izoformy, analógy alebo deriváty do bunky vo forme vhodného vektora nesúceho

-18uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť začlenenie sekvencie do buniek spôsobom, pri ktorom sa táto sekvencia v bunkách exprimuje.

(iii) Spôsob podľa vyššie uvedeného bodu (ii), v ktorom sa ošetrenie buniek uskutočňuje transfekciou buniek rekombinantným živočíšnym vírusovým vektorom a zahŕňa nasledujúce kroky:

a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora, ktorý nesie sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín (ligand) schopný viazať sa na šppecifický bunkový povrchový receptor na povrchu bunky nesúcej FAS-R alebo p55-R, a druhú sekvenciu, ktorá kóduje proteín vybraný zo skupiny zahŕňajúcej RAP-2 proteín a jeho izoformy, analógy, fragmenty a deriváty, pričom tento vektor, keď je exprimovaný v bunkách, je schopný modulovať/sprostredkovať vnútrobunkové dráhy zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania; a

b) infikovanie buniek vektorom podľa bodu a).

(iv) Spôsob modulovania dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom ligandov TNF rodiny na bunky prostredníctvom účinku RIP proteínu, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek protilátkami alebo ich aktívnymi fragmentárni alebo derivátmi podľa vynálezu, pričom ošetrenie sa uskutočňuje aplikáciou vhodného prostriedku, ktorý obsahuje protilátky, ich aktívne fragmenty alebo deriváty, na bunky, pričom ak aspoň časť RAP-2 proteínu je vystavená na extracelulárnom povrchu, prostriedok je formulovaný na extracelulárnu aplikáciu, a keď sú RAP-2 proteíny úplne vnútrobunkové, prostriedok je formulovaný na vnútrobunkové aplikáciu.

(v) Spôsob modulovania dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom ligandov TNF rodiny na bunky prostredníctvom účinku RIP proteínu, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek oligonukleotidovou sekvenciou kódujúcou antisense sekvenciu aspoň časti RAP-2 proteínovej sekvencie podľa vynálezu, pričom oligonukleotidová sekvencia je schopná blokovať expresiu RAP-2 proteínu.

(vi) Spôsob podľa vyššie uvedeného bodu (ii) na ošetrenie nádorových buniek alebo buniek infikovaných HIV alebo iných chorých buniek, ktorý zahŕňa:

-19a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora, ktorý nesie sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový proteín schopný viazať sa na špecifický povrchový receptor nádorovej bunky alebo na povrchový receptor HIVinfikovanej bunky alebo na receptor nesený inými chorými bunkami a sekvenciu kódujúcu proteín vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa RAP-2 proteín, analógy, fragmenty a deriváty podľa vynálezu, ktorý, keď sa exprimuje v nádorovej, HIVinfikovanej alebo inej chorej bunke, je schopný usmrtiť uvedenú bunku pôsobením RIP proteínu; a

b) infikovanie nádorových alebo HlV-infikovaných alebo iných chorých buniek vektorom podľa bodu a).

(vii) Spôsob modulácie dráh bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom ligandov TNF rodiny na bunky prostredníctvom pôsobenia RIP proteínu, ktorý zahŕňa aplikovanie ribozýmového postupu, v ktorom sa vektor kódujúci ribozýmovú sekvenciu schopnú interagovať s bunkovou mRNA sekvenciou kódujúcou RAP-2 proteín podľa vynálezu, zavádza do buniek vo forme, ktorá umožňuje expresiu ribozýmovej sekvencie v bunkách, pričom keď sa ribozýmová sekvencia exprimuje v bunkách, interaguje s bunkovou mRNA sekvenciou a štiepi mRNA sekvenciu, čoho výsledkom je inhibícia expresie RAP-2 proteínu v bunkách.

(viii) Spôsob vybraný z vyššie uvedených spôsobov podľa vynálezu, v ktorom RAP-2 proteín kódujúca sekvencia zahŕňa najmenej jednu z RAP-2 izoforiem, ich analógov, fragmentov a derivátov podľa vynálezu, ktoré sú schopné viazať sa na RIP.

(ix) Spôsob izolácie a identifikácie proteínov podľa vynálezu, ktoré sú schopné viazať sa na RIP proteín, ktorý zahŕňa aplikovanie kvasinkového dvojhybridného postupu, v ktorom je sekvencia kódujúca RIP proteín nesená jedným hybridným vektorom a sekvencia z cDNA alebo genomickej DNA knižnice je nesená druhým hybridným vektorom, pričom vektory sú potom použité na transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek a pozitívne transformované bunky sa izolujú, nasleduje extrakcia druhého hybridného vektora, aby sa získala sekvencia kódujúca proteín, ktorý sa viaže na RIP proteín.

-20(x) Spôsob podľa ktoréhokoľvek z vyššie uvedených bodov (i) až (x), v ktorom je RAP-2 proteínom ktorákoľvek z izoforiem RAP-2, ich analógy, fragmenty a deriváty.

(xi) Spôsob podľa ktoréhokoľvek z vyššie uvedených bodov (i) až (x), v ktorom sa RAP-2 proteín alebo ktorákoľvek z jeho izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov podieľa na modulácii bunkového účinku sprostredkovaného alebo modulovaného akýmkoľvek iným mediátorom alebo induktorom, na ktorý je schopný RAP-2 proteín, izoforma, analóg, fragment alebo derivát sa priamo alebo nepriamo viazať.

Predložený vynález poskytuje aj farmaceutický prostriedok na moduláciu dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú sprostredkované účinkom TNF rodiny na bunky prostredníctvom pôsobenia RIP proteínu alebo pôsobenia akéhokoľvek iného mediátora alebo induktora na bunky, ako bolo uvedené vyššie, ktorý obsahuje ako účinnú zložku čokoľvek z nasledujúceho;

(i) RAP-2 proteín podľa vynálezu a jeho biologicky účinné fragmenty, analógy, deriváty zmesí;

(ii) rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci proteín schopný viazať bunkový povrchový receptor a kódujúci RAP-2 proteín alebo biologicky účinné fragmenty alebo analógy podľa vynálezu;

(iii) oligonukleotidová sekvencia kódujúca anti-sense sekvenciu RAP-2 proteínovej sekvencie podľa vynálezu, pričom oligonukleotid môže byť druhou sekvenciou rekombinantného živočíšneho vírusového vektora podľa vyššie uvedeného bodu (ii).

Predložený vynález poskytuje aj:

I. Spôsob modulovania dráh zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ktoré sú modulované/sprostredkované RIP proteínom alebo účinkom akéhokoľvek iného mediátora alebo induktora, alebo akéhokoľvek NK-kB induktora alebo inhibítora na bunky, ktorý zahŕňa ošetrenie buniek v súlade s ktorýmkoľvek spôsobom podľa (i) až (x) uvedenými vyššie, s RAP-2 proteínmi, ich izoformami, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi alebo sekvenciami kódujúcimi RAP-2

-21 proteíny, ich izoformy, analógy, fragmenty alebo deriváty, pričom výsledkom ošetrenia je zosilnenie inhibície RIP-sprostredkovaného účinku, a tým aj FAS-R alebo p55-R sprostredkovaného účinku alebo zosilnenie alebo inhibícia iného mediátora alebo induktora alebo iného NF-κΒ induktora alebo inhibítora.

II. Spôsob ako je uvedené vyššie, v ktorom je RAP-2 proteín, jeho analóg, fragment alebo derivát tou časťou RAP-2 proteínu, ktorá sa špecificky podieľa na väzbe na RIP alebo iný mediátor alebo induktor, alebo na iný NF-κΒ induktor alebo inhibítor, alebo RAP-2 proteínová sekvencia kóduje tú časť RAP-2 proteínu, ktorá sa špecificky podieľa na väzbe na RIP alebo iný mediátor alebo induktor, alebo na iný NF-κΒ induktor alebo inhibítor.

III. Spôsob ako je uvedené vyššie, v ktorom je RAP-2 proteínom ktorákoľvek z RAP-2 izoforiem, ktoré sú schopné zosilniť RIP-asociovaný účinok.

IV. Spôsob ako je uvedené vyššie, v ktorom je RAP-2 proteínom ktorákoľvek z RAP-2 izoforiem, ktoré sú schopné inhibovať RIP-asociovaný účinok alebo účinok asociovaný s iným mediátorom alebo induktorom na bunky, a tým aj inhibovať FASR alebo p55-R asociovaný účinok na bunky alebo inhibovať účinok iného cytotoxického mediátora alebo induktora na bunky.

V. Spôsob ako je uvedené vyššie, v ktorom je RAP-2 proteín, izoforma, analóg, fragment alebo derivát schopný zosilniť alebo inhibovať RIP-asociovaný účinok na zápal alebo dráhu bunkového prežívania prostredníctvom priamej alebo nepriamej inhibície NF-κΒ alebo priamou alebo nepriamou aktiváciou JNK alebo p38 kinázy.

Izolácia RAP-2 proteínov, ich identifikácia a charakterizácia sa môže uskutočňovať ktoroukoľvek zo štandardných skríningových techník používaných na izoláciu a identifikáciu proteínu, napríklad kvasinkovým dvojhybridným spôsobom, metódami afinitnej chromatografie a ktoroukoľvek inou dobre známou štandardnou technikou používanou na tento účel.

Podľa ešte iného uskutočnenia vynálezu sa samotný RAP-2 proteín alebo jeho izoforma, fragment alebo derivát používa ako návnada v kvasinkovom dvojhybridnom skríningu pre proteíny, ktoré sa na neho viažu.

-22Proteíny, ktoré sa viažu na RAP-2, jeho izoformy, fragmenty alebo derivátu, sú tiež časťou predloženého vynálezu.

Ako vyplynie z podrobného opisu vynálezu sú poskytnuté aj iné predmety a uskutočnenia vynálezu.

Treba poznamenať, že tu používané nasledujúce výrazy modulácia/sprostredkovanie RIP účinku alebo účinku FAS-ligandu alebo TNF účinku na bunky”; a akékoľvek iné výrazy zahŕňajúce moduláciu/sprostredkovanie, ktoré sú uvedené v opise, zahŕňajú tak in vitro, ako aj in vivo pôsobenie, a navyše zahŕňajú inhibíciu alebo zosilnenie/posilnenie.

Podrobný opis vynálezu

Predložený vynález sa v jednom uskutočnení týka RAP-2 proteínov, ktoré sú schopné viazať sa na RIP proteín, a tým sprostredkovať alebo modulovať vnútrobunkovú aktivitu RIP, najmä ak sa RIP podieľa na modulovaní alebo sprostredkovaní zápalu, dráh bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, ako je podrobne uvedené vyššie. Takže RAP-2 môže inhibovať RIP účinok v dráhach bunkovej smrti, prežívania a/alebo zápalu, RAP-2 môže zvýšiť RIP účinok v dráhach zápalu, bunkovej smrti a/alebo bunkového prežívania, alebo môže posilniť RIP účinok v jednej z týchto dráh a zároveň inhibovať RIP účinok v inej.

Konkrétnejšie, podľa predloženého vynálezu je poskytnutý proteín RAP-2. RAP-2 sa sekvenoval a charakterizoval a zistilo sa, že RAP-2 je RIP-viažuci proteín s vysokou špecificitou voči RIP, avšak neviaže sa na množstvo proteínov, o ktorých je známe, že sa podieľajú na vnútrobukových signalizačných dráhach, ktoré vedú k zápalu, bunkovej smrti alebo bunkovému prežívaniu. Je tiež zrejmé, že RAP-2 nemá žiadne domény spoločné s proteínmi, ktoré sú aktívne v niektorej z týchto dráh, tzn. RAP-2 nemá motív alebo modul smrtiacej domény, nemá kinázový motív alebo doménu a nemá proteázovú doménu alebo motív. Aj stanovená RAP-2 sekvencia je unikátna, ako vyplýva z jej porovnania so sekvenciami v množstve databáz vrátane GeneBank, Human Génom level A a sbest databáz. Ako je podrobne uvedené vyššie (aj s odvolaním sa na všetky citované publikácie a prihlášky vynálezov), RIP sa podieľa vnútrobunkovo na dráhe zápalu, bunkovej

-23smrti a bunkového prežívania. Takže regulácia alebo kontrola účinku RIP môže regulovať určitú alebo všetky tieto dráhy, keď sú tieto dráhy iniciované napríklad väzbou TNF alebo Fas-ligandu na ich receptori (pri TNF na p55-R). RIP môže hrať kľúčovú úlohu pri determinácii toho, ktorá dráha je aktivovaná vo väčšom rozsahu a to prostredníctvom toho, že je schopný viazať sa na množstvo cytotoxických proteínov, ktoré majú smrtiace domény a aj na množstvo proteínov, ktoré majú kinázovú aktivitu. Z toho vyplýva, že proteíny, ako RAP-2 proteín podľa predloženého vynálezu, ktoré sa môžu špecificky viazať na RIP, môžu hrať významnú úlohu pri modulovaní RIP účinku, a tým modulovať rozsah indukcie jednej dráhy v porovnaní s inými. Takže RAP-2 proteín podľa predloženého vynálezu predstavuje dôležitý vnútrobunkový signalizačný modulátor alebo mediátor.

Okrem RAP-2 proteínu s úplnom dĺžkou podľa predloženého vynálezu, klonovala sa aj kratšia cDNA, o ktorej sa zistilo, že je zložená zo sekvenčných blokov odvodených od niekoľkých vzdialených oblastí úplnej cDNA, ktoré sú zjavne výsledkom alternatívneho zostrihu rovnakého génu. Pri podobnom prieskume myšej zbierky ESTs sa identifikoval hlodavčí náprotivok ľudského RAP2. Zistilo sa, že časť hlodavčej cDNA je v skutočnosti identická s jej ľudským náprotivkom v kódujúcej oblasti.

Fyziologická relevancia RIP-RAP-2 interakcie sa ďalej potvrdila v transfekovaných HEK-293T a HeLa bunkách. Avšak výsledkom vytvorenia takéhoto komplexu nebola RIP enzymatická aktivita, čoho dôkazom je skutočnosť, že výsledkom nadexpresie RIP nie je fosforylácia RAP-2.

Výsledkom transfekčných experimentov v cicavčích HEK-293T bunkách bolo tiež vytvorenie RAP-2-NIK komplexu.

Je zrejmé, že RAP-2 je kritickým elementom NF-κΒ a c-Jun signalizačných transdukčných dráh, keďže sa viaže na NIK, ΙΚΚβ a TIP60 (histón acetyltransferáza) a moduluje NF-κΒ a c-Jun závislú transkripciu. V skutočnosti vedie zosilnená ektopická expresia RAP-2 k inhibícii NF-κΒ odpovede, zatiaľ čo

-24výsledkom jeho odstránenia z bunky prostredníctvom antisense konštruktu je zosilnenie NF-κΒ a c-Jun transaktivácie.

Zistilo sa tiež, že RAP-2 aj zvyšuje potenciál c-Jun hyperfosforylácie, ktorá nie je sprostredkovaná účinkom JNK. RAP-2 neinhiboval c-Jun a RelA väzbu na DNA. Väzobné a funkčné domény RAP-2 sa identifikovali sekvenčnými delečnými analýzami. Z týchto štúdií vyplynulo, že väzobná oblasť RIP, NIK a TIP60 sa prekrýva s RAP-2 v rámci aminokyselín 95 až 264. Avšak zistilo sa, že následné funkčné účinky sprostredkované RAP-2 sú lokalizované v N-koncovej doméne proteínu, ktorá zahŕňa aminokyseliny 1 až 264.

Vzhľadom na vyššie uvedené je zrejmé, že RAP-2 je kritickým elementom signálneho-atenuačného kruhu stresovej responzívnej siete: ektopická expresia sense-kódujúceho konštruktu inhibuje odpoveď, zatiaľ čo expresia antisensekódujúceho konštruktu posilňuje odpoveď. V skutočnosti je RAP-2 v laboratóriu pôvodcov známy ako RAT (RIP atenuátor) a môže tu byť preto označovaný aj ako RAT a/alebo RAT-303 a/alebo kloň 303.

Z existencie viacnásobných zostrihových variantov vyplýva, že pravdepodobne aspoň čiastočne závisí sieťový účinok RAP-2 v daných podmienkach na prítomnosti určitých sekvenčných blokov, ktoré sú nevyhnutné pre proteínovú väzbu/ smerovanie/ translokáciu/ modifikáciu v prevládajúcej izoforme. Napríklad ak v skutočnosti väzba RAP-2 na TIP60 umožňuje jadrovú lokalizáciu TIP60, je možné hypoteticky uvažovať, že varianty RAP-2, ktoré majú vystrihnuté jadrové lokalizačné signály (NLS), sa môžu stať defektnými alebo naopak nadmerne aktívnymi pri NFkB/AP-1 represii. Sekvenčná analýza dokazuje, že RAP-2 obsahuje niekoľko klastrov pozitívne nabitých aminokyselín (E, K a R), čo je charakteristické pre väčšinu známych NLS.

RAP-2 väzba na RIP bola mapovaná v oblasti RAP-2 proteínu, ktorá začína aminokyselinami 177 až 218 a končí aminokyselinou 264. RIP väzobná doména vo vnútri RAP-2 sa neprekrýva ani s ΙΚΚβ, ani s NIK väzobným miestom.

Väzba na TIP60, člena rodiny jadových proteínov nazývaných histón acetyltransferázy, zjavne spadá do oblasti aminokyselín 95 až 264. Zistilo sa, že oblasť,

-25ktorá sa podieľa na homodimerizácii sa nachádza medzi aminokyselinami 217 až 264.

Z nazhromaždených údajov vyplýva, že všetky funkčné účinky RAP-2 (konkrétne NF-κΒ inhibícia a indukcia c-Jun hyperfosforylácie) sú lokalizované v rovnakej oblasti.

Je zrejmé, že protein kódovaný klonom č. 10 sa viaže vo vnútri oblasti začínajúcej medzi aminokyselinami 218 až 309 a končiacej na aminokyseline 416, takže jeho väzobné miesto môže obsahovať oblasti prekrývajúce sa s väzobnými miestami pre RIP, NIK, ΙΚΚβ a TIP60.

Navyše je možné, že oblasť postačujúca na účinnú moduláciu signalizácie prostredníctvom všetkých induktorov je lokalizovaná na N-terminálnom segmente proteínu.

Oblasť v rámci aminokyselín 95 až 416 je účinná, hoci signifikantne slabšia v porovnaní s účinkom spôsobeným kompletným proteínom. Takže tento účinok môže byť výsledkom posilnenej agregácie endogénneho RAP-2.

Navyše, s výnimkou RelA, všetky účinky indukované v našich experimentoch môžu byť sprostredkované len približne 100 N-koncovými aminokyselinami RAP-2. V skutočnosti aj fragment obsahujúci aminokyseliny 1 až 102 sprostredkúva zreteľný účinok, hoci značne miernejší.

Na druhej strane supresia RelA-sprostredkovaného účinku vyžaduje oveľa väčšiu časť RAP-2. Z tohto hľadiska by bolo možné definovať hranice tejto oblasti vo vnútri aminokyselín 1 až 264, ktorá zjavne obsahuje oblasť medzi aminokyselinami 157 a 264 s určitými, RelA-asociovanými, väzobnými vlastnosťami.

Z vyššie uvedených pozorovaní vyplýva, že:

a) S výnimkou RelA, väzba RAP-2 na RIP, kloň č. 10 a najpravdepodobnejšie na NIK a TIP60, nie je potrebná pre funkciu proteínu ako inhibítora nadexpresie indukovanej NF-κΒ.

b) Účinok RAP-2 na RelA nadexpresiou indukovanú aktiváciu je zvyčajne sprostredkovaný aspoň čiastočne rôznymi väzobnými udalosťami. V podstate

-26všetky uvedené proteíny sa môžu podieľať na danej aktivite, vychádzajúc z doteraz uskutočnených experimentov.

Vďaka unikátnej schopnosti FAS-R a TNF receptorov spôsobiť bunkovú smrť, ako aj schopnosti TNF receptorov spustiť rôzne aktivity poškodzujúce tkanivá, pre organizmus môže byť zmena funkcie týchto receptorov značne škodlivá. V skutočnosti sa ukázalo, že tak nadmerná, ako aj deficientná funkcia týchto receptorov sa podieľa na patologických manifestáciách rôznych ochorení. Identifikácia molekúl, ktoré sa zúčastňujú na signalizačnej aktivite týchto receptorov, a nájdenie spôsobov na moduláciu funkcie týchto molekúl, predstavuje potenciálny kľúč pre nové terapeutické prístupy k týmto ochoreniam. Vzhľadom na predpokladanú dôležitú úlohu RIP vo FAS-R a p55-R toxicite, a tým predpokladanú dôležitú regulačnú úlohu RAP-2 voči FAS-R a TNF prostredníctvom modulácie RIP, zdá sa dôležité najmä navrhnúť liečivá, ktoré môžu blokovať cytotoxickú funkciu RIP, možno prostredníctvom blokovania väzby RAP-2 na RIP alebo inhibovaním interakcie medzi RAP-2 a RIP v takých podmienkach, v ktorých RAP-2 slúži na zosilnenie RIP-sprostredkovanej cytotoxicíty (ako je uvedené vyššie, RIP je cytotoxický ako taký a v spojení s inými proteínmi, ktoré majú oblasti smrtiacej domény).

Podobne, je známe (pozri vyššie), že FAS-R a p55-R sa podieľajú na aktivácii N F-k B, a tým na bunkovom prežívaní. Z toho vyplýva, že ak je želateľné usmrtiť bunky, napríklad nádorové bunky, HlV-infikované bunky a podobné bunky, bolo by želateľné zosilniť cytotoxické účinky FAS-R a p55-R (a ich asociovaných proteínov ako napríklad MORT-1, MACH, Mch4, G1, TRADD), a zároveň inhibovať ich schopnosť indukovať NF-κΒ. Takže ak je výsledkom interakcie alebo väzby RAP-2 na RIP zosilnenie možnej úlohy v zosilnení NF-κΒ indukcie (možno prostredníctvom TRAF2 a možno prostredníctvom kinázovej domény a/alebo strednej domény RIP), potom by bolo želateľné blokovať túto interakciu medzi RAP2 a RIP, aby sa inhibovala, alebo aspoň aby sa zabránilo zosilneniu NF-kB aktívácie, a aby sa tým posunula rovnováha TNF- alebo FAS-ligandom indukova-27ných účinkov smerom k bunkovej cytotoxicite, čo v konečnom dôsledku poskytuje zvýšenie bunkovej smrti.

Podobne, v opačnej situácii (ako je tá uvedená vyššie), v ktorej RAP-2 väzba na RIP v skutočnosti spôsobuje inhibíciu FAS-R a p55-R zápalových alebo cytptoxických účinkov, a je želateľné blokovať tieto cytotoxické účinky, napr. pri zápale, rôznych autoimunitných ochoreniach a podobne, keď je cieľom zvýšenie bunkového prežívania, potom je dôležité navrhnúť liečivá, ktoré by zosilnili interakciu medzi RAP-2 a RIP, aby sa zosilnila celková inhibícia bunkovej smrti, a aby sa rovnováha posunula smerom k bunkovému prežívaniu. Z vyššie uvedeného tiež vyplýva, že v prípade, keď RAP-2 interakcia s RIP spôsobuje inhibíciu RIP funkcie pri zosilňovaní NF-κΒ aktivácie, potom, ak je želateľné bunkové prežívanie, je nevyhnutné blokovať túto interakciu medzi RAP-2 a RIP, a tým blokovať zosilnenie RIP účinku pri posilňovaní aktivácie NF-kB.

Z vyššie uvedeného vyplýva, že RIP má kľúčovú úlohu v rovnováhe medzi indukciou alebo sprostredkovaním dráh zápalu, bunkovej smrti alebo bunkového prežívania, a teda aj RAP-2 má ekvivalentne dôležitú úlohu, keďže je modulátorom RIP. Ovplyvnením RAP-2-RIP interakcie/väzby použitím rôznych liečiv alebo postupov, ako je uvedené vyššie alebo nižšie, bude možné umožniť posun vnútrobunkových signalizačných dráh od bunkovej smrti k bunkovému prežívaniu a vice verša, podľa potreby.

Predložený vynález sa týka aj DNA sekvencie kódujúcej RAP-2 protein a RAP-2 proteínov kódovaných DNA sekvenciami.

Navyše sa predložený vynález ďalej týka DNA sekvencií, ktoré kódujú biologicky aktívne analógy, fragmenty a deriváty RAP-2 proteínu a nimi kódovaných analógov, fragmentov a derivátov. Príprava takýchto analógov, fragmentov a derivátov je štandardným postupom (pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989), v ktorom môže byť v DNA sekvenciách kódujúcich RAP-2 protein, jeden alebo viacero kodónov deletovaných, pridaných alebo substituovaných, aby sa získali analógy, ktoré obsahujú najmenej jednu zmenu aminokyselinového zvyšku v porovnaní s prirodzeným proteínom.

-28Okrem vyššie uvedených DNA sekvencií podľa vynálezu, ktoré kódujú RAP2 proteín, jeho izoformu, analóg alebo derivát, do rozsahu vynálezu ako jeho uskutočnenie spadajú aj DNA sekvencie, ktoré sú schopné hybridizovať s cDNA sekvenciou odvodenou od kódujúcej oblasti prirodzeného RAP-2 proteínu, pričom takáto hybridizácia sa uskutočňuje v stredne prísnych podmienkach, a hybridizovateľné DNA sekvencie kódujú biologicky aktívny RAP-2 proteín. Takže tieto hybridizovateľné DNA sekvencie zahŕňajú DNA sekvencie, ktoré majú relatívne vysokú homológiu s cDNA sekvenciou pre prirodzený RAP-2 proteín, a predstavujú teda sekvencie podobné RAP-2 proteínu, ktoré môžu byť napríklad prirodzené derivovanými sekvenciami kódujúcimi rôzne izoformy RAP-2 proteínu alebo prirodzene sa vyskytujúce sekvencie kódujúce proteíny, ktoré patria do skupiny sekvencií podobných s RAP-2 sekvenciami, ktoré kódujú proteín s RAP-2 účinkom. Navyše, tieto sekvencie môžu zahŕňať napríklad aj synteticky vyrábané sekvencie, ktoré sa prirodzene nevyskytujú, a ktoré sú podobné s cDNA sekvenciou prirodzeného RAP-2 proteínu, ale obsahujú množstvo želateľných modifikácií. Takže takéto syntetické sekvencie zahŕňajú všetky možné sekvencie kódujúce analógy, fragmenty a deriváty RAP-2, ktoré všetky majú aktivitu RAP-2.

Na získanie rôznych vyššie uvedených prirodzene sa vyskytujúcich sekvencií podobných RAP-2 proteínu je možné použiť štandardné postupy vyhľadávania a izolácie prirodzene odvodených DNA alebo RNA vzoriek z rôznych tkanív použitím cDNA prirodzeného RAP-2 proteínu alebo jej časti ako sondy (pozri napríklad štandardné postupy uvedené v Sambrook a ďalší, 1989).

Podobne, na prípravu vyššie uvedených rôznych RAP-2-podobných sekvencií, ktoré kódujú analógy, fragmenty alebo deriváty RAP-2, je možné použiť množstvo štandardných postupov, ako je podrobne uvedené nižšie pre prípravu takých analógov, fragmentov a a derivátov.

Polypeptid alebo proteín v podstate zodpovedajúci RAP-2 proteínu zahŕňa nie len RAP-2 proteín, ale aj polypeptidy alebo proteíny, ktoré sú analógmi RAP-2.

Analógmi, ktoré v podstate zodpovedajú RAP-2 proteínu, sú také polypeptidy, v ktorých je jedna alebo viacero aminokyselín v aminokyselinovej sekvencií RAP-2 proteínu nahradená inou aminokyselinou, deletovaná a/alebo vložená, s tou

-29podmienkou, že výsledný protein vykazuje v podstate rovnaký alebo vyšší biologický účinok ako RAP-2 protein, ktorému zodpovedá.

Ak majú takéto izoformy v podstate zodpovedať RAP-2 proteínu, sú vo všeobecnosti zmeny v sekvencii RAP-2 proteínov malé. Hoci počet zmien môže byť vyšší ako desať, výhodne počet zmien nie je vyšší ako desať, výhodnejšie nie je vyšší ako päť a najvýhodnejšie nie je vyšší ako tri. Hoci môže byť použitá akákoľvek technika na nájdenie potenciálnych biologicky účinných proteínov, ktoré v podstate zodpovedajú RAP-2 proteínom, jednou takouto technikou je použitie bežných mutagenizačných techník na DNA kódujúcu protein, ktorých výsledkom je niekoľko modifikácií. Proteíny exprimované v takýchto klonoch sa potom môžu skrínovať z hľadiska ich schopnosti viazať RIP a modulovať účinok RIP vo vyššie uvedených modulačných/sprostredkovacích vnútrobunkových dráhach, ako boli uvedené vyššie.

Konzervatívne zmeny sú také zmeny, od ktorých by sa nedalo očakávať, že zmenia účinok proteínu a zvyčajne sa skrínujú prvé, keďže sa od nich nedá očakávať, že by podstatne menili veľkosť, náboj alebo konfiguráciu proteínu, a teda sa nedá očakávať, že by menili jeho biologické vlastnosti.

Konzervatívne substitúcie v RAP-2 proteínoch zahŕňajú analóg, v ktorom je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v polypeptide konzervatívne nahradený odlišnou aminokyselinou. Takéto substitúcie sa výhodne uskutočňujú v súlade s nasledujúcim zoznamom uvedeným v tabuľke IA, pričom tieto substitúcie je možné stanoviť rutinným experimentovaním tak, aby sa získali modifikované štruktúrne a funkčné vlastnosti syntetizovanej polypeptidovej molekuly, a aby sa zároveň zachoval biologický účinok charakteristický pre RAP-2 protein.

Tabuľka IA

Pôvodný zvyšok

Ala

Arg

Asn

Asp

Príkladná substitúcia

Gly; Ser

Lys

Gin; His Glu

Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala; Pro
His	Asn; Gin
lle	Leu; Val
Leu	lle; Val
Lys	Arg; Gin; Glu
Met	Leu; Tyr; lle
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	lle; Leu

Alternatívne, inou skupinou substitúcií v RAP-2 proteíne sú substitúcie, pri ktorých je najmenej jeden aminokyselinový zvyšok v poiypeptide nahradený odlišným zvyškom podľa nasledujúcej tabuľky IB. Typy substitúcií, ktoré je možné uskutočniť v poiypeptide, sa môžu zakladať na analýze frekvencií aminokyselinových zmien medzi homologickými proteínmi odlišných druhov, ako napríklad na analýze prezentovanej v Tabuľke 1-2 v publikácii Schulz a ďalší, G.E., Principles of Proteín Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1998, a na obrázkoch 3 až 9 v publikácii Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Na základe takýchto analýz sú tu definované alternatívne konzervatívne substitúcie ako výmeny v rámci jednej z nasledujúcich piatich skupín:

Tabuľka IB

1. Malé, alifatické, nepoláme alebo slabo polárne zvyšky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Polárne, záporne nabité zvyšky a ich amidy: Asp, Asn, Glu, Gin;

-31 3. Polárne, kladne nabité zvyšky: His, Arg, Lys;

4. Veľké, alifatické, nepoláme zvyšky: Met, Leu, lle, Val(Cys); a

5. Veľké, aromatické zvyšky: Phe, Tyr, Trp.

Tri aminokyselinové zvyšky, ktoré sú vyššie uvedené v zátvorkách, majú v proteínovej architektúre špeciálnu úlohu. Gly je jediným zvyškom, ktorý nemá žiadny bočný reťazec, a teda zavádza do reťazca flexibilitu. To však má tendenciu posilňovať vytvorenie inej ako α-závitnicovej sekundárnej štruktúry. Pro, kvôli svojej nezvyčajnej geometrii, tesne stláča reťazec, a vo všeobecnosti má tendenciu napomáhať vytvoreniu štruktúr podobných β-skladanému listu, zatiaľ čo v niektorých prípadoch môže byť Cys schopný podieľať sa na vytvorení disulfidovej väzby, ktorá je dôležitá pre poskladanie proteínu. Treba poznamenať, že podľa vyššie uvedenej publikácie Schulz a ďalší by sa skupiny 1 a 2 zlúčili. Treba tiež poznamenať, že vďaka svojmu potenciálu vytvárať vodíkové väzby je Tyr významne príbuzný so Ser a Thr, atď.

Konzervatívne aminokyselinové substitúcie podľa predloženého vynálezu, napríklad vyššie uvedené substitúcie, sú v oblasti známe, a očakáva sa od nich, že zachovávajú biologické a štruktúrne vlastnosti polypeptidu po aminokyselinovej substitúcií. Väčšina delécií a substitúcií podľa predloženého vynálezu je takých, že nespôsobujú radikálne zmeny vlastností proteínovej alebo polypeptidovej molekuly. Vlastnosti sú definované tak ako zmeny v sekundárnej štruktúre, napr. a-helix alebo β-skladaný list, ako aj zmeny biologického účinku, napr. väzba na RIP a/alebo sprostredkovanie RIP účinku na bunkovú smrť.

Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité na získanie analógov RAP-2 proteínov na použitie podľa vynálezu, zahŕňajú akékoľvek známe spôsobové kroky, ako je uvedené napríklad v US patente RE 33653, 4959314, 4588585 a 4737462, Mark a ďalší; 5116943 Koths a ďalší, 4965195 Namen a ďalší, 4879111 Chong a ďalší, a 5017691 Lee a ďalší; a lyzín substituované proteíny uvedené v US patente č. 4904584 (Shaw a ďalší).

-32Do rozsahu vynálezu spadajú okrem vyššie uvedených konzervatívnych substitúcií, ktoré by nemali významne meniť účinok RAP-2 proteínu, aj konzervatívne substitúcie alebo menej konzervatívne a náhodnejšie zmeny, ktoré vedú ku zvýšeniu biologického účinku analógov RAP-2 proteínov.

Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že keď sa má stanoviť presný účinok substitúcie alebo delécie, bude sa ich účinok stanovovať rutinným väzobným testom a testom bunkovej smrti. Skríning využívajúci takýto štandardný test nezahŕňa nadmerné experimentovanie.

Prijateľnými RAP-2 analógmi sú analógy, ktoré si zachovávajú aspoň schopnosť viazať sa na RIP, a tým sprostredkovať účinok RIP vo vnútrobunkových dráhach, ako je uvedené vyššie. Takýmto spôsobom je možné vytvoriť analógy, ktoré majú takzvaný dominantný negatívny účinok, konkrétne analógy, ktoré sú chybné buď pri viazaní RIP, alebo v následnej signalizačnej alebo inej aktivite, ktorá nasleduje po takomto naviazaní sa. Takéto analógy môžu byť použité napríklad na inhibíciu účinku RIP alebo na inhibíciu NF-κΒ indukujúceho (priameho alebo nepriameho) účinku RIP, v závislosti na tom, ktorá z týchto aktivít je z väčšej časti modulovaná interakciou RAP-2 a RIP (pozri vyššie), a to tak, že tieto analógy súťažia s prirodzeným RAP-2 proteínom pri väzbe na RIP.

Na genetickej úrovni sa tieto analógy vo všeobecnosti pripravujú miestneriadenou mutagenézou nukleotidov v DNA kódujúcej RAP-2 proteín, čím sa vytvorí DNA kódujúca analóg, a potom syntézou DNA a expresiou polypeptidu v rekombinantnej bunkovej kultúre. Tieto analógy typicky vykazujú rovnaký alebo zvýšený kvalitatívny biologický účinok v porovnaní s prirodzene sa vyskytujúcim proteínom, Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook a ďalší, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Príprava RAP-2 proteínu podľa vynálezu alebo alternatívnej nukleotidovej sekvencie kódujúcej rovnaký polypeptid, ktorá sa však líši od prirodzenej sekvencie kvôli známej degenerácii genetického kódu, sa môže dosiahnuť miestne-špecifickou mutagenézou DNA, ktorá kóduje skôr pripravený analóg alebo prirodzenú verziu

-33RAP-2 proteínu. Miestne špecifická mutagenéza umožňuje produkciu analógov prostredníctvom použitia špecifických oligonukleotidových sekvencií, ktoré kódujú DNA sekvenciu s požadovanou mutáciou, ako aj dostatočné množstvo priľahlých nukleotidov, čím je poskytnutá primerová sekvencia s dostatočnou veľkosťou a sekvenčnou komplexitou na vytvorenie stabilného duplexu na oboch stranách delečnej spojky, ktorá sa má preklenúť. Typickým výhodným primerom je primér s dĺžkou približne 20 až 25 nukleotidov, pričom má približne 5 až 10 komplementujúcich nukleotidov na oboch stranách sekvencie, ktorá sa má meniť. Vo všeobecnosti je technika miestne-špecifickej mutagenézy v oblasti dobre známa, čo je ilustrované napríklad v publikácii Adelman a ďalší, DNA 2: 183 (1983), ktorej opis je tu zahrnutý touto citáciou.

Ako bude zrejmé, miestne špecifická mutagenizačná technika typicky využíva fágový vektor, ktorý existuje tak v jednovláknovej, ako aj v dvojvláknovej forme. Typické vektory užitočné na miestne-riadenú mutagenézu zahŕňajú vektory ako M13 fág, napríklad ako je opísané v Messing a ďalší, Third Cleveland Symposium on Macromoleculs and Recombinant DNA, vyd. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), pričom opis tejto publikácie je tu zahrnutý jej citáciou. Tieto fágy sú jednoducho komerčne dostupné a pre priemerného odborníka v oblasti je ich použitie dobre známe. Na získanie jednovláknovej DNA môžu byť alternatívne použité plazmidové vektory, ktoré obsahujú počiatok replikácie jednovláknového fága (Veira a ďalší, Meth. Enzymol. 153:3,1987).

Vo všeobecnosti sa tu opísaná miestne-riadená mutagenéza uskutočňuje tak, že sa najprv získa jednovláknový vektor, ktorý v rámci svojej sekvencie obsahuje DNA sekvenciu, ktorá kóduje relevantný polypeptid. Oligonukleotidový primér nesúci požadovanú mutovanú sekvenciu sa pripravuje synteticky, automatizovanou DNA/oligonukleotidovou syntézou. Tento primér sa potom aneluje s jednovlákovým vektorom obsahujúcim proteín kódujúcu sekveniu a reakčná zmes sa ošetrí s DNA-polymerizačnými enzýmami, ako E.coli polymerázovým I Klenowovým fragmentom, aby sa skompletizovala syntéza vlákna, ktoré nesie mutáciu. Takže mutovaná sekvencia a druhé vlákno nesie požadovanú mutáciu. Tento heteroduplexový vektor sa potom použije na transfomáciu príslušných

-34buniek, ako napríklad E. coli JM101 buniek, a vyberú sa klony, ktoré obsahujú rekombinantné vektory nesúce mutovanú sekvenciu.

Po výbere takéhoto klonu je možné vybrať mutovanú sekvenciu RAP-2 proteínu a umiestniť ju do vhodného vektora, vo všeobecnosti do transferového alebo expresného vektora takého typu, ktorý môže byť použitý na transfekciu príslušného hostiteľa.

Z toho vyplýva, že gén alebo nukleovú kyselinu kódujúcu RAP-2 proteín je možné tiež detekovať, získať a/alebo modifikovať in vitro, in situ a/alebo in vivo, použitím známych DNA alebo RNA amplifikačných techník, ako napríklad PCR a chemickej oligonukleotidovej syntézy. PCR umožňuje amplifikáciu (zvýšenie počtu) špecifických DNA sekvencií opakovanými DNA polymerizačnými reakciami. Táto reakcia sa môže použiť ako náhrada klonovania; všetko čo je potrebné, je znalosť sekvencie nukleovej kyseliny. Aby sa uskutočnila PCR, sú navrhnuté primery, ktoré sú komplementárne so študovanou sekvenciou. Tieto primery sa potom generujú automatizovanou DNA syntézou. Pretože primery je možné navrhnúť tak, aby hybridizovali s ktoroukoľvek časťou génu, je možné vytvoriť také podmienky, aby boli tolerované nepresnosti pri komplementárnom párovaní báz. Amplifikácia týchto nespárovaných oblastí môže viesť ku syntéze mutovaného produktu, čoho výsledkom je generovanie peptidu s novými vlastnosťami (tzn. miestne riadená mutagenéza). Pozri aj napr. Ausubel, vyššie, kapitola 16. Ako východiskový materiál na syntézu extracelulárnej domény prolaktínového receptora bez klonovania môže byť použitá RNA, ktorá vznikne spojením DNA (cDNA) syntézy použitím reverznej transkriptázy, a PCR.

Navyše, PCR primery môžu byť navrhnuté tak, aby obsahovali nové reštrikčné miesta alebo iné znaky, ako napríklad terminačné kodóny na koncoch génového segmentu, ktorý sa má amplifikovať. Toto umiestnenie reštrikčných miest na 5' a 3' konci amplifikovanej génovej sekvencie umožňuje, aby boli génové segmenty kódujúce RAP-2 proteín alebo jeho fragment navrhnuté na ligáciu s inými sekvenciami a/alebo do klonovacích miest vektorov.

PCR a iné spôsoby amplifikácie RNA a/alebo DNA sú v oblasti dobre známe a môžu byť použité podľa predloženého vynálezu bez nadmerného experimen-35tovania, na základe tu uvedeného opisu a návodu. Známe spôsoby DNA alebo RNA amplifikácie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, polymerázovú reťazovú rekaciu (PCR) a príbuzné amplifikačné spôsoby (pozri napr. US patenty č. 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 Mullis a ďalší; 4795699 a 4921794 Tábor a ďalší; 5142033 Innis; 5122464 Wilson a ďalší; 5091310 Innis; 5066584 Gyllensten a ďalší; 4889818 Gelfand a ďalší; 4994310 Silver a ďalší; 4766067 Biswas; 4656134 Ringold; a Innis a ďalší, vyd. PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a RNA sprostredkované amplifikácie, ktoré využívajú anti-sense RNA voči ciefovej sekvencii ako templát pre syntézu dvojvláknovej DNA (US patent č. 5130238 Malek a ďalší, s komerčným názvom NASBA); imuno-PCR, ktorá kombinuje použitie DNA amplifikácie s protilátkovým značením (Ružička a ďalší, Science 260: 487 (1993); Sano a ďalší, Science 258:120 (1992); Sano a ďalší, Biotechniques 9:1378 (1991), pričom obsah všetkých uvedených publikácií a patentov je zahrnutý do tohto opisu ich citáciou.

Analogickým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie vo vzťahu ku analógom RAP-2 proteínu, je možné pripraviť biologicky účinné fragmenty RAP-2 proteínov (napr. fragmenty ktoréhokoľvek z RAP-2 proteínov alebo jeho izoforiem). Vhodnými fragmentárni RAP-2 proteínu sú tie, ktoré si zachovávajú schopnosti RAP-2 proteínu, a ktoré môžu modulovať alebo sprostredkovať biologický účinok RIP alebo iných proteínov priamo alebo nepriamo asociovaných s RIP. Z toho vyplýva, že je možné pripraviť fragmenty RAP-2 proteínu, ktoré majú dominantný negatívny alebo dominantný pozitívny účinok, ako bolo poznamenané vyššie, vo vzťahu ku analógom. Je potrebné uviesť, že tieto fragmenty predstavujú špeciálnu triedu analógov podľa vynálezu, konkrétne sú to definované časti RAP-2 proteínov, ktoré sú odvodené od úplnej sekvencie RAP-2 proteínu (napr. od RAP-2 alebo od jeho izoformy), pričom každá takáto časť alebo fragment má ktorýkoľvek z vyššie uvedených požadovaných účinkov. Takýmto fragmentom môže byť napr. peptid.

Podobne, je možné pripraviť deriváty štandardnými modifikáciami bočných skupín jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov RAP-2 proteínu, jeho analógov alebo fragmentov, alebo konjugáciou RAP-2 proteínu, jeho analógov alebo fragmentov, s inou molekulou, napríklad s protilátkou, enzýmom, receptorom,

-36atď, ako je v oblasti dobre známe. Z toho vyplýva, že tu použitý výraz derivát pokrýva deriváty, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín vyskytujúcich sa ako bočné reťazce zvyškov alebo N- alebo C-koncových skupín, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté v tomto vynáleze. Deriváty môžu mať chemické časti, ako uhľovodíkové alebo fosfátové zvyšky, s tou podmienkou, že frakcia má rovnaký alebo vyšší biologický účinok ako RAP-2 proteíny.

Deriváty môžu zahŕňať napríklad alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín vzniknuté reakciou s amoniakom alebo s primárnym alebo sekundárnym amínom, N-acyl deriváty voľnej amino skupiny aminokyselinových zvyškov tvorené s acylovými časťami (napr. alkanoylové alebo karbocyklické aroylové skupiny) alebo O-acyl deriváty voľnej hydroxylovej skupiny (napríklad O-acylové deriváty serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorené s acylovými časťami.

Výraz deriváty zahŕňa len tie deriváty, ktoré nezamieňajú jednu aminokyselinu za inú, z dvadsiatich prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín.

RAP-2 je proteín alebo polypeptid, tzn. sekvencia aminokyselinových zvyškov. Polypeptid pozostávajúci z väčšej sekvencie, ktorá obsahuje celú sekvenciu RAP-2 proteínu podľa tu uvedených definícií, je považovaný za taký, ktorý spadá do rozsahu výrazu polypeptid, pokiaľ pridané aminokyseliny neovplyvňujú základné a nové vlastnosti podľa vynálezu, tzn. pokiaľ si zachováva alebo zvyšuje biologický účinok RAP-2 proteínu alebo pokiaľ môže byť rozštiepený tak, že výsledkom je proteín alebo polypeptid s biologickým účinkom RAP-2 proteínu. Takže predložený vynález zahŕňa napríklad aj fúzované proteíny RAP-2 proteínu s inými aminokyselinami alebo peptidmi.

RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty majú množstvo možných použití, napríklad:

(i) RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty a deriváty môžu byť použité na moduláciu funkcie RIP v dráhach zápalu, bunkovej smrti alebo bunkového prežívania ako je uvedené vyššie. Napríklad, RAP-2 môže modulovať účinok RIP na aktiváciu NF-κΒ, JNK (Jun kináza) alebo p38 kinázy. Tieto RAP-2 účinky vedú k zosilneniu RAP-2-RIP účinku, keď je to potrebné, v protinádorových, anti- alebo pro-37 zápalových, anti-HIV aplikáciách, atď. V takomto prípade RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty, ktoré modulujú zápal, zosilňujú cytotoxický účinok alebo blokujú účinok bunkového prežívania, môžu byť zavedené do buniek štandardnými postupmi, ktoré sú známe sami o sebe. Napríklad, ak je RAP-2 proteín celý vnútrobunkový (ako sa predpokladá) mal by byť zavedený len do buniek, kde je potrebný účinok FAS-R ligandu alebo TNF alebo iného cytotoxického proteínu sprostredkovaný RIP, a je preto nevyhnutný systém na špecifické zavedenie tohto proteínu. Jedným spôsobom ako to urobiť je vytvorenie rekombinantného živočíšneho vírusu, napr. odvodeného od Vaccinia, do ktorého sa zavádza DNA nasledujúcich dvoch génov: gén kódujúci ligand, ktorý sa viaže na bunkové povrchové proteíny špecificky exprimované bunkami, napríklad ako AIDS (HIV) vírusový gp120 proteín, ktorý sa špecificky viaže na niektoré bunky (CD4 lymfocyty a príbuzné leukémie) alebo akýkoľvek iný ligand, ktorý sa špecificky viaže na bunky nesúce FAS-R alebo p55-R, takže rekombinantný vírusový vektor bude schopný viazať takéto FAS-R- alebo p55-R-nesúce bunky; a gén kódujúci RAP-2 proteín. Takže expresia proteínu viažuceho sa na povrch buniek na povrchu vírusu nasmeruje vírus špecificky do nádorovej bunky alebo do inej bunky, ktorá nesie FAS-R alebo p55-R, a následne sa sekvencia kódujúca RAP-2 proteín zavedie do buniek prostredníctvom tohto vírusu, a výsledkom jej expresie v bunkách bude zosilnenie účinku FAS-R ligandu alebo TNF, ktorý je sprostredkovaný RIP, alebo je nezávislý od RIP. Konštrukcia takéhoto rekombinantného živočíšneho vírusu je štandardným postupom (pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989). Inou možnosťou je zaviesť sekvencie RAP-2 proteínu (napríklad ktorýkoľvek z RAP-2 alebo jeho izoforiem) vo forme oligonukleotidov, ktoré môže bunka absorbovať, a môžu sa v nej exprimovať.

(ii) Môžu byť použité na inhibíciu účinku FAS-R ligandu alebo TNF alebo príbuzných proteínov, ktorý je sprostredkovaný RIP alebo je nezávislý od RIP účinku, napr. v prípadoch poškodení tkanív pri septickom šoku, odmietnutí štepu hostiteľom alebo akútnej hepatitíde, kedy je potrebné blokovať FAS-R ligandom alebo TNF indukovanú FAS-R alebo p55-R vnútrobunkovú signalizáciu alebo nezávislý RIP účinok alebo signalizáciu sprostredkovanú iným proteínom a zároveň

-38podporiť dráhu bunkového prežívania. V tejto situácie je napríklad možné zaviesť do týchto buniek štandardnými postupmi oligonukleotidy, ktoré majú anti-sense kódujúcu sekvenciu pre RAP-2 proteín, ktorá by účinne blokovala transláciu mRNAs kódujúcich RAP-2 proteín, a tým môžu blokovať jeho expresiu, čo vedie k inhibícii účinku FAS-R ligandu alebo TNF alebo RIP alebo iného proteínu. Takéto oligonukleotidy môžu byť zavedené do buniek použitím vyššie uvedeného rekombinantného vírusového postupu, pričom druhou sekvenciou, ktorú nesie vírus je oligonukleotidová sekvencia.

Podobne, ako je uvedené vyššie, v závislosti na povahe RAP-2-RIP interakcie, môže byť možné, ak je to potrebné, spôsobmi (i) a (ii) opísanými vyššie zosilniť alebo inhibovať dráhy bunkového zápalu a prežívania.

Inou možnosťou je použiť protilátky špecifické pre RAP-2 proteín na inhibíciu jeho vnútrobunkového signalizačného účinku.

Ešte iným spôsobom na inhibíciu RIP-sprostredkovaných účinkov alebo účinku nezávislého od RIP je v súčasnosti vyvinutý ribozýmový prístup. Ribozýmy sú katalytické RNA molekuly, ktoré špecificky štiepia RNAs. Ribozýmy môžu byť navrhnuté tak, že štiepia vybrané cieľové RNA, napr. mRNA kódujúce RAP-2 proteín podľa vynálezu. Takéto ribozýmy majú sekvencie špecifické pre RAP-2 proteínovú mRNA a sú schopné s ňou interagovať (komplementárna väzba) s následným štiepením mRNA, čoho výsledkom je pokles (alebo úplné vymiznutie) expresie RAP-2 proteínu, pričom úroveň poklesu expresie je závislá na úrovni ribozýmovej expresie v cieľovej bunke. Na zavedenie ribozýmu do vybraných buniek (napríklad buniek nesúcich FAS-R alebo p55-R), môže byť použitý akýkoľvek vhodný vektor, napr. plazmid, živočíšny vírusový (retrovírusový) vektor, ktoré sú zvyčajne používané na tento účel (pozri aj bod (i) vyššie, kde vírus má ako druhú sekvenciu cDNA kódujúcu zvolenú ribozýmovú sekvenciu). (Zhrnutie spôsobov, atď. týkajúcich sa ribozýmov pozri v Chen a ďalší, 1992; Zhao a Pick, 1993; Shore a ďalší, 1993; Joseph a Búrke, 1993; Shimayama a ďalší, 1993; Cantor a ďalší, 1993; Barinaga, 1993; Crisell a ďalší, 1993 a Koizumi a ďalší, 1993). Tento prístup je vhodný, keď RAP-2-RIP interakcia zosilňuje bunkovú cytotoxicitu, v situáciách, kedy je potrebné blokovať túto cytotoxicitu alebo ak RAP-2-RIP

-39interakcia inhibuje NF-κΒ aktiváciu, v situácii, keď je potrebné blokovať túto inhibíciu, aby sa zvýšila NF-κΒ aktivácia, tzn. v oboch prípadoch je potrebné zvýšiť bunkové prežívanie ako vo vyššie uvedenom bode (ii).

(iii) RAP-2, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty môžu byť použité aj na izoláciu, identifikáciu a klonovanie iných proteínov rovnakej triedy, to znamená proteínov, ktoré sa viažu na RIP alebo na funkčne príbuzné receptory alebo proteíny, ktoré sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Na túto aplikáciu je možné použiť vyššie uvedený kvasinkový dvojhybridný systém alebo môže byť použitý v súčasnosti vyvinutý systém využívajúci neprísnu Southern hybridizáciu a následne PCR klonovanie (Wilks a ďalší, 1989). V publikácii Wilks a ďalší je opísaná identifikácia a klonovanie dvoch pravdepodobných proteín-tyrozín kináz aplikáciou neprísnej Southernovej hybridizácie a následným klonovaním prostredníctvom PCR na základe známej sekvencie kinázového motívu, ktorý je zahrnutý v kinázovej sekvenii. Tento prístup môže byť použitý, podľa predloženého vynálezu, použitím sekvencie RAP-2 proteínu na identifikáciu a klonovanie proteínov viažucich RIP.

(iv) Iným prístupom využívajúcim RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu je ich použitie v spôsoboch afinitnej chromatografie na izoláciu a identifikáciu iných proteínov alebo faktorov, na ktoré sú schopné sa viazať, napr. iných proteínov alebo faktorov, ktoré sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Pri tejto aplikácii môžu byť RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa predloženého vynálezu jednotlivo pripojené na matrice pre afinitnú chromatografiu a potom sa môžu uviesť do kontaktu s bunkovými extraktmi alebo izolovanými proteínmi alebo faktormi, o ktorých sa predpokladá, že sa podieľajú na procese vnútrobunkovej signalizácie. Po afinitnej chromatografii je možné ďalšie proteíny alebo faktory, ktoré sa viažu na RAP-2 proteín alebo na jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu, eluovať, izolovať a charakterizovať.

(v) Ako bolo uvedené vyššie, RAP-2 proteín, jeho analógy, fragmenty alebo deriváty podľa vynálezu môžu byť použité aj ako imunogény (antigény) na

-40produkciu špecifických protilátok voči nim. Tieto protilátky môžu byť tiež použité na účely purifikácie RAP-2 proteínu (napr. RAP-2 proteínu alebo ktorejkoľvek z jej izoforiem) buď z bunkových extraktov alebo z transformovaných bunkových línií produkujúcich RAP-2 proteín alebo jeho analógy alebo fragmenty. Navyše, tieto protilátky môžu byť použité na diagnostické účely, na identifikáciu porúch týkajúcich sa abnormálneho fungovania RIP-sprostredkovaného FAS-R ligandového alebo TNF systému alebo aktivít nezávislých od RIP, napr. bunkových účinkov indukovaných nadmernou alebo podpriemernou aktivitou FAS-R ligandu alebo TNF, ktoré sú sprostredkované cez RIP alebo bunkových účinkov špecifických pre samotné RIP. Takže ak by sa tieto poruchy týkali nesprávnej funkcie vnútrobunkového signalizačného systému, v ktorom je zahrnutý RIP proteín alebo rôzne iné vyššie uvedené RIP-viažuce proteíny alebo samotný RAP-2 proteín, taktéto protilátky by slúžili ako dôležitý diagnostický nástroj.

Treba tiež poznamenať, že izolácia, identifikácia a charakterizácia RAP-2 proteínu podľa vynálezu sa môže uskutočňovať použitím ktoréhokoľvek z dobre známych štandardných skríningových postupov. Napríklad jeden z takýchto skríningových postupov je nižšie opísaný kvasinkový dvojhybridný postup, ktorý bol použitý na identifikáciu RIP proteínu (pozri Stanger a ďalší, 1995) a následne rôznych RAP-2 proteínov podľa vynálezu (okrem rôznych iných nových proteínov podľa vyššie a nižšie uvedených prihlášok vynálezov, ktoré sú spoločne vlastnené a paralelne v konaní). Podobne, ako je uvedené vyššie a nižšie, je možné využiť iné postupy, ako afinitnú chromatografiu, DNA hybridizačné postupy, atď., ako je v oblasti dobre známe, na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu RAP-2 proteínu podľa vynálezu alebo na izoláciu, identifikáciu a charakterizáciu ďalších proteínov, faktorov, receptorov atď, ktoré sú schopné viazať sa na RAP-2 proteíny podľa vynálezu

Ako je uvedené vyššie, RAP-2 proteín môže byť použitý na vytvorenie protilátok špecifických pre RAP-2 proteíny, napr. RAP-2 a jeho izoformy. Tieto protilátky alebo ich fragmenty môžu byť použité ako je podrobne uvedené nižšie, pričom treba brať do úvahy, že v týchto aplikáciách sú protilátkami alebo ich fragmentárni protilátky a fragmenty špecifické pre RAP-2 proteíny.

-41 Na základe zistení podľa predloženého vynálezu, a to, že RAP-2 sa špecificky viaže na RIP, a ako taký je mediátorom/modulátorom RIP a môže teda sprostredkovať/modulovať RIP účinok v dráhach zápalu, bunkovej smrti a bunkového prežívania spôsobmi, v ktorých RIP funguje nezávisle alebo spolu s inými proteínmi (napr. FAS-R, p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, G1 a TRADD v dráhach bunkovej smrti, alebo s TRAF2 v dráhach bunkového prežívania), existuje potreba navrhnúť liečivá, ktoré môžu zosilniť alebo inhibovať RAP-2-RIP interakciu, ak je to potrebné, a to v závislosti na tom, ktorá z týchto dráh sa má zosilniť/inhibovať RAP-2-RIP interakciou. Existuje mnoho chorôb, v ktorých môžu byť takéto liečivá veľmi nápomocné. Okrem iných ide o akútnu hepatitídu, pri ktorej sa zdá, že akútne poškodenie pečene odráža FAS-R ligandom sprostredkovanú smrť pečeňových buniek; autoimunitne indukovanú bunkovú smrť, ako smrť β Langerhansových buniek pankreasu, čoho výsledkom je diabetes; smrť buniek pri odmietnutí štepu hostiteľom (napr. obličiek, srdca a pečene); smrť oligodendrocytov v mozgu pri skleróze multiplex; AIDS-inhibovaná samovražda T buniek, ktorá spôsobuje proliferáciu AIDS vírusu, a tým AIDS ochorenie.

Je možné, že RAP-2 alebo jedna alebo viacero z jeho izoforiem môže slúžiť ako prirodzený inhibítor RIP v jednej alebo vo viacerých z vyššie uvedených dráh a môžu byť teda využité ako vyššie uvedené špecifické inhibítory RIP. Podobne, je možné skrínovať iné látky ako napríklad peptidy, organické zlúčeniny, protilátky, atď., aby sa získali špecifické liečivá, ktoré sú schopné inhibovať interakciu RAP-2RIP.

Neobmedzujúci príklad toho, ako by peptidové inhibítory RAP-2-RIP interakcie mohli byť navrhnuté a skrínované, je založený na predchádzajúcich štúdiách o peptidových inhibítoroch ICE alebo ICE-podobných proteáz, substrátovej špecificite ICE a stratégiách epitopovej analýzy použitím peptidovej syntézy. Zistilo sa, že minimálnou požiadavkou na účinné štiepenie peptidu prostredníctvom ICE je obsah štyroch aminokyselín naľavo od miesta štiepenia, so silnou preferenciou kyseliny asparágovej v P1 polohe, pričom stačí, aby napravo od P1 polohy bol metylamín (Sleath a ďalší, 1990; Howard a ďalší, 1991; Thornberry a ďalší, 1992).

-42Ďalej fluorogénny substrátový peptid (tetrapeptid), acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4metyl-kumaryl-7-annid) so skratkou Ac-DEVD-AMC, zodpovedá sekvencií v poly(ADP-ribóza)polymeráze (PARP), o ktorej sa zistilo, že je štiepená v bunkách krátko po FAS-R stimulácii, ako aj v iných apoptických procesoch (Kaufmann, 1989; Kaufmann a ďalší, 1993; Lazebnik a ďalší, 1994), a je štiepená účinne CPP32 (člen CED3/ICE proteázovej rodiny) a MACH proteázami (a podobne možno aj G1 proteázami, pozri napríklad spoločne vlastnenú IL120367, ktorá je paralelne v konaní).

Keďže je zrejmé, že Asp v P1 polohe substrátu je dôležitá, je možné rýchlo skrínovať tetrapeptidy, ktoré majú Asp ako štvrtý aminokyselinový zvyšok a rôzne kombinácie aminokyselín v prvých troch polohách, z hľadiska väzby na aktívne miesto použitím napríklad spôsobu, ktorý vyvinul Geysen (Geysen, 1985; Geysen a ďalší, 1987), ktorý skrínoval veľké množstvo peptidov na tuhých podkladoch z hľadiska špecifických interakcií s protilátkami. Viazanie sa MACH proteáz na špecifické peptidy je možné detekovať rôznymi dobre známymi detekčnými spôsobmi, ktoré spadajú do rozsahu vedomostí priemerného odborníka v oblasti, ako napríklad rádioaktívne značenie G1 proteáz, atď. Ukázalo sa, že táto metóda podľa Geysena je schopná testovať najmenej 4000 peptidov každý pracovný deň.

Podobným spôsobom je možné objasniť presnú väzobnú oblasť alebo homologickú oblasť, ktorá determinuje interakciu medzi RAP-2 a RIP, a potom je možné skrínovať peptidy, ktoré môžu slúžiť na blokovanie tejto interakcie, napr. peptidy syntetizované tak, aby obsahovali sekvenciu, ktorá je podobná so sekvenciou väzobnej oblasti alebo ktorá je s ňou komplementárna, a tak môže konkurovať prirodzenému RAP-2 pri väzbe na RIP.

Liečivá alebo peptidové inhibítory, ktoré sú schopné inhibovať zápalový alebo bunkovú smrtiaci účinok RAP-2 inhibovaním RAP-2-RIP interakcie, môžu byť konjugované alebo v komplexe s molekulami, ktoré uľahčujú vstup do bunky.

US patent č. 5149782 opisuje konjugovanie molekuly, ktorá sa má preniesť cez bunkovú membránu, s membránovým zmesovým činidlom, akým je napríklad fusogénny polypeptid, polypeptidy tvoriace iónový kanál, iné membránové polypeptidy a aminokyseliny s dlhým reťazcom, napr. kyselina myristová, kyselina

-43palmitová. Tieto membránové zmesové činidlá začleňujú molekulové konjugáty do lipidovej dvojvrstvy bunkových membrán a uľahčujú ich vstup do cytoplazmy.

Low a ďalší, US patent č. 5108921 zhŕňa dostupné metódy na transmembránové doručenie molekúl, ako napríklad, ale bez obmedzenia, proteínov a nukleových kyselín, mechanizmom receptorom sprostredkovanej endocytovej aktivity. Tieto receptorové systémy zahŕňajú receptory rozoznávajúce galaktózu, manózu, manóza-6-fosfát, transferín, azialoglykoproteín, transkobalamín (vitamín B12), a-2 makroglobulíny, inzulín a iné peptidové rastové faktory, ako napríklad epidermálny rastový faktor (EGF). Low a ďalší uvádza, že nutričné receptory, ako napríklad receptory pre biotín a folát, sa môžu výhodne využiť na zosilnenie transportu cez membránu, pretože biotínové a folátové receptory sa nachádzajú vo veľkom množstve na membránových povrchoch väčšiny buniek a ich asociované receptory sprostredkúvajú transmembránové transportné procesy. Takže komplex vytvorený medzi zlúčeninou, ktorá sa má dostať do cytoplazmy, a ligandom, ako napríklad biotínom alebo folátom, sa uvádza do kontaktu s bunkovou membránou, ktorá nesie biotínový alebo folátový receptor, aby sa inicioval receptorom sprostredkovaný transmembránový transportný mechanizmus, a tým sa umožňuje vstup požadovanej zlúčeniny do bunky.

Okrem toho je v oblasti známe, že fúzovanie potrebnej peptidovej sekvencie s vedúcou/signálnou peptidovou sekvenciou, ktorým sa vytvorí chimérny peptid, umožní, aby sa takýto chimérny peptid prepravil cez bunkovú membránu do cytoplazmy.

Ako bude zrejmé pre priemerného odborníka v oblasti peptidov, peptidovými inhibítormi RAP-2-RIP interakcie podľa predloženého vynálezu sa myslia peptidy, ktoré zahŕňajú peptidomimetické liečivá alebo inhibítory, ktoré je možné aj rýchlo skrínovať z hľadiska väzby na RAP-2/RIP proteázu, aby sa navrhli možno stabilnejšie inhibítory.

Bude tiež zrejmé, že aj pre samotný RAP-2 alebo jeho izoformy, ako aj iné peptidy a proteíny, ktoré vykazujú svoje účinky vnútrobunkovo, je možné aplikovať to isté, čo bolo uvedené na uľahčenie alebo zosilnenie transportu peptidových inhibítorov cez bunkové membrány.

-44Čo sa týka tu uvedených protilátok, výraz protilátka znamená polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky (mAbs), chimérne protilátky, anti-idiotypové (antiId) protilátky voči protilátkam, ktoré je možné značiť v roztoku alebo v naviazanej forme, ako aj ich fragmenty získané akoukoľvek známou technikou, ako napríklad, ale bez obmedzenia, technikou enzymatického štiepenia, technikou peptidovej syntézy alebo rekombinantnantnou technikou.

Polyklonálne protilátky sú heterogénnou populáciou protilátkových molekúl odvodených zo séra živočíchov imunizovaných antigénom. Monoklonálna protilátka obsahuje v podstate homogénnu populáciu protilátok špecifických voči antigénom, ktoré obsahujú v podstate podobné epitopové väzobné miesta. MAbs sa dajú získať spôsobmi známymi pre priemerného odborníka v oblasti. Pozri, napríklad Kohler a Milstein, Náture, 256:495-497 (1975); US patent č. 4376110; Ausubel a ďalší, vyd. Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan a ďalší, vyd. Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience N.Y., (1992-1996), pričom obsah týchto publikácii je tu komplet začlenený ich citáciou. Takýmito protilátkami môžu byť akékoľvek protilátky triedy imunoglobulínov vrátane IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a ktorejkoľvek ich podtriedy. Hybridómy produkujúce mAb podľa predloženého vynálezu môžu byť kultivované in vitro, in situ alebo in vivo. Produkcia vysokých titrov mAbs in vivo alebo in situ robí túto metódu v súčasnosti najvýhodnejšou.

Chimérne protilátky sú molekuly, ktorých rozličné časti sú odvodené od rôznych živočíšnych druhov, ako napríklad variabilná oblasť je odvodená od hlodavčej mAb a konštantnú oblasť tvorí ľudský imunoglobulín. Chimérne protilátky sa primárne používajú na zníženie imunogénnosti pri aplikácii a na zvýšenie výťažku pri produkcii, napríklad, tam, kde hlodavčie mAbs majú vyššie výťažky z hybridómov, ale vyššiu imunogénnosť u ľudí, sú používané ľudské/hlodavčie chimérne mAbs. Chimérne protilátky a spôsoby ich produkcie sú v oblasti známe (Cabilly a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne a ďalší, Náture 312:643-646 (1984); Cabilly a ďalší, európska prihláška vynálezu č. 125023 (publikovaná 14 novembra 1984); Neuberger a ďalší, Náture 314:268-270 (1985);

-45Taniguchi a ďalší, európska prihláška vynálezu č. 171496 (zverejnená 19. februára

1985) ; Morrison a ďalší, európska prihláška vynálezu 173494 (zverejnená 5 marca

1986) ; Neuberger a ďalší, PCT prihláška WO8601533 (zverejnená 13 marca 1986); Kudo a ďalší, európska prihláška vynálezu č. 184187 (zverejnená 11 júna 1986); Sahagan a ďalší, J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson a ďalší, medzinárodná prihláška vynálezu č. WO8702671 (zverejnená 7. mája 1987); Liu a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Sun a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Better a ďalší, Science 240:1041-1043 (1988); a Harlow a Lane, Antibodies: A laboratory manual, vyššie. Tieto publikácie sú tu komplet zahrnuté ich citáciou.

Anti-idiotypová (anti-ld) protilátka je protilátka, ktorá rozoznáva unikátne determinanty, ktoré sú vo všeobecnosti asociované s antigén-viažucim miestom protilátky. Id protilátka sa môže pripraviť imunizáciou živočícha rovnakého druhu a genetického typu (napr. myšacieho kmeňa) ako zdroj mAb, voči ktorej sa má pripraviť anti-ld. Imunizovaný živočích bude rozoznávať a odpovedať voči idiotypovým determinantám imunizačnej protilátky produkciou protilátky proti týmto idiotypovým determinantám (anti-ld protilátky). Pozri napríklad US patent č. 4699880, ktorý je tu celý zahrnutý jeho citáciou.

Anti-ld protilátka môže byť použitá aj ako imunogén na indukciu imunitnej odpovede v ešte inom živočíchovi, na produkciu takzvanej ani-anti-ld protilátky. Anti-anti-ld protilátka môže byť epitopicky identická s pôvodnou mAb, ktorá indukovala anti-ld. Takže použitím protilátok voči idiotypovým determinantám mAb je možné identifikovať iné klony, ktoré exprimujú protilátky s identickou špecifitou.

Z toho vyplýva, že mAbs generované proti RAP-2 proteínu, jeho analógom, fragmentom alebo derivátom podľa vynálezu môžu byť použité na indukciu anti-ld protilátok vo vhodných živočíchoch, ako napríklad BALB/c myšiach. Slezinové bunky z takto imunizovaných myší sa použijú na tvorbu anti-ld hybridómov, ktoré budú vylučovať anti-ld mAbs. Ďalej je možné anti-ld mAbs spojiť s nosičom, ako napríklad pijavicovým hemocyanínom (KLH) a použiť ich na imunizáciu ďalších BALB/c myší. Séra z týchto myší budú obsahovať anti-anti-ld protilátky, ktoré budú

-46schopné viazať sa na pôvodnú mAb špecifickú pre epitop vyššie uvedeného RAP-2 proteínu, jeho analógov, fragmentov a derivátov.

Anti-ld mAbs tak majú svoje vlastné idiotypové epitopy alebo idiotopy, ktoré sú štruktúrne podobné s hodnoteným epitopom, ako napríklad GRB proteín-a.

Výraz protilátka zahŕňa aj intaktné molekuly, ako aj ich fragmetny, ako napríklad Fab a F(ab')₂, ktoré sú schopné viazať antigén. Fab a F(ab')₂ fragmentom chýba Fc fragment intaktnej protilátky, rýchlejšie sa strácajú z obehu a môžu sa menej nešpecifický tkanivovo viazať ako intaktná protilátka (Wahl a ďalší, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Je zrejmé, že Fab a F(ab')₂ a iné fragmenty protilátok užitočných podľa predloženého vynálezu môžu byť použité na detekciu a kvantifikáciu RAP-2 proteínu v súlade s tu opísanými spôsobmi pre intaktné protilátkové molekuly. Takéto fragmenty sa typicky produkujú proteolytickým štiepením, použitím enzýmov, ako papaínu (na vytvorenie Fab fragmentov) alebo pepsínu (na vytvorenie F(ab')₂ fragmentov).

Protilátka je označená ako schopná viazať molekulu, ak je schopná špecificky reagovať s molekulou, a tým dochádza k väzbe molekuly a protilátky. Výraz epitop znamená tú časť ktorejkoľvek molekuly, ktorá môže byť viazaná protilátkou, ktorá je schopná byť aj rozoznávaná touto protilátkou. Epitopy alebo antigénové determinanty zvyčajne pozostávajú z chemicky aktívnych povrchových zoskupení molekúl, ako napríklad aminokyselinových alebo sacharidových bočných reťazcov, a majú špecifické trojrozmerné štruktúrne vlastnosti, ako aj špecifické nábojové charakteristiky.

Antigén je molekula alebo časť molekuly, ktorá je schopná byť viazaná protilátkou, a ktorá je schopná aj indukovať živočícha, aby produkoval protilátku schopnú viazať sa na epitop tohto antigénu. Antigén môže mať jeden alebo viac ako jeden epitop. Vyššie uvedená špecifická reakcia znamená to, že antigén bude reagovať vysoko selektívnym spôsobom so zodpovedajúcou protilátkou a nebude reagovať s mnohými inými protilátkami, ktoré môžu byť vyvolané inými antigénmi.

Protilátky, vrátane fragmentov protilátok, užitočné podľa vynálezu, môžu byť použité na kvantitatívnu alebo kvalitatívnu detekciu RAP-2 proteínu vo vzorke alebo

-47na detekciu prítomnosti buniek, ktoré exprimujú RAP-2 protein podľa vynálezu. To sa môže uskutočniť imunofluorescenčnými technikami využitím fluorescenčné značenej protilátky (pozri nižšie) spolu so svetelným mikroskopom, prietokovou cytometriou alebo fluorometrickou detekciou.

Protilátky (alebo ich fragmenty) užitočné podľa vynálezu, môžu byť využité histologický, ako napríklad v imunofluorescenčnej alebo imunoelektrónovej mikroskopii, na in situ detekciu RAP-2 proteínu podľa predloženého vynálezu. In situ detekcia sa môže uskutočňovať odohraním histologickej vzorky od pacienta a použitím značenej protilátky podľa vynálezu pre takúto vzorku. Protilátka (alebo fragment) sa výhodne poskytuje náterom alebo naliatím značenej protilátky (alebo fragmentu) na biologickú vzorku. Použitím takéhoto postupu je možné stanoviť nie len prítomnosť RAP-2 proteínu, ale aj jeho distribúciu v skúmanom tkanive. Pre priemerného odborníka v oblasti je zrejmé, že použitím predloženého vynálezu bude možné modifikovať široký rozsah histologických metód (ako napríklad farbiace postupy) na dosiahnutie in situ detekcie.

Takéto testy pre RAP-2 protein podľa vynálezu typicky zahŕňajú inkubovanie biologickej vzorky, ako napríklad biologickej tekutiny, tkanivového extraktu, čerstvo izolovaných buniek ako lymfocytov alebo leukocytov, alebo buniek, ktoré boli inkubované v tkanivovej kultúre, v prítomnosti detekovateľne značenej protilátky, ktorá je schopná identifikovať RAP-2 protein, a detekovanie protilátky ktoroukoľvek z množstva techník, ktoré sú v oblasti dobre známe.

Biologická vzorka sa môže ošetriť podkladom na tuhej fáze alebo nosičom, ako je nitrocelulóza, alebo iným tuhým podkladom alebo nosičom, ktorý je schopný imobilizovať bunky, bunkové častice alebo rozpustné proteíny. Podklad alebo nosič sa potom môže premyť vhodnými tlmivými roztokmi, a následne ošetriť detekovateľne značenou protilátkou podľa vynálezu, ako bolo uvedené vyššie. Tuhý fázový podklad alebo nosič sa potom môže premyť s tlmivým roztokom druhý raz, aby sa odstránila nenaviazaná protilátka. Bežnými prostriedkami je potom možné detekovať množstvo naviazanej značky na tuhom podklade alebo nosiči.

Výrazy podklad na tuhej fáze, nosič na tuhej fáze, tuhý nosič, podklad alebo nosič znamenajú akýkoľvek podklad alebo nosič, ktorý je schopný viazať

-48antigén alebo protilátky. Dobre známe podklady alebo nosiče zahŕňajú sklo, polystyrén, polypropylén, polyetylén, dextrán, nylonové amylázy, prirodzené alebo modifikované celulózy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Pre účely vynálezu môže byť nosič buď do určitej miery rozpustný, alebo nerozpustný. Podkladový materiál môže mať v skutočnosti akúkoľvek možnú štruktúrnu konfiguráciu, pokiaľ je pripojená molekula schopná viazať antigén alebo protilátku. Takže konfigurácia podkladu alebo nosiča môže byť sférická, ako napríklad guľovitá, valcovitá, ako napríklad vo vnútri skúmavky alebo na vonkajšom povrchu tyčinky. Alternatívne môže byť povrch rovný, ako napríklad platňa, testovací pásik, a pod. Výhodné podklady alebo nosiče zahŕňajú polystyrénové guličky. Priemerný odborník v oblasti bude vedieť vybrať iné vhodné nosiče na viazanie protilátky alebo antigénu, alebo bude schopný nájsť ich použitím rutinného experimentovania.

Väzobný účinok daného množstva protilátky podľa vynálezu ako je uvedená vyššie, môže byť stanovený dobre známymi spôsobmi. Priemerný odborník v oblasti bude schopný stanoviť funkčné a optimálne testovacie podmienky pre každé stanovenie využitím rutinného experimentovania.

Do testovacej reakcie je možné pridať aj iné kroky, ako napríklad premývanie, miešanie, trepanie, filtrovanie a podobne, ak je to zvykom alebo nevyhnutné v konkrétnej situácii.

Jedným zo spôsobov, v ktorých môže byť protilátka podľa vynálezu detekovateľne značená, je pripojenie protilátky ku enzýmu a jej použitie v enzýmovom imunologickom teste (EIA). Tento enzým, keď sa neskôr vystaví vhodnému substrátu, bude reagovať so substrátom takým spôsobom, že sa vytvorí chemická zlúčenina, ktorú je možné detekovať napríklad spektrofotometricky, fluorometricky alebo vizuálnymi prostriedkami. Enzýmy, ktoré môžu byť použité na detekovateľné značenie protilátky zahŕňajú, ale nie sú limitované na, malát dehydrogenázu, stafylokokovú nukleázu, δ-5-steroid izomerázu, kvasinkovú alkohol dehydrogenázu, α-glycerofosfát dehydrogenázu, triózofosfát izomerázu, chrenovú peroxidáczu, alkalickú fosfatázu, asparaginázu, glukóza oxidázu, β-galaktozidázu, ribonukleázu, ureázu, katalázu, glukózo-6-fosfát dehydrogenázu, glukoamylázu a

-49acetylcholín esterázu. Detekcia sa môže uskutočňovať kolorimetrickými metódami, ktoré využívajú chromogénny substrát pre enzým. Detekcia sa môže uskutočňovať aj vizuálnym porovnaním enzymatickej reakcie substrátu v porovnaní s podobne pripravenými štandardami.

Detekcia sa môže uskutočňovať použitím ktoréhokoľvek z rôznych iných imunologických testov. Napríklad rádioaktívnym značením protilátok alebo fragmentov protilátok je možné detekovať R-PTPázu prostredníctvom použitia rádioimunologického testu (RIA). Dobrý opis RIA je možné nájsť v Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, od Work, T.S. a ďalší, North Holland Publishing Company, NY (1978), najmä v časti s názvom An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques od Chard, T., pričom publikácia je do tohto opisu zahrnutá jej citáciou. Rádioaktívny izotop je možné detekovať prostredníctvom použitia g snímača alebo scintilačného snímača alebo autorádiografie.

Je možné značiť protilátku podľa predloženého vynálezu aj fluorescenčnou zlúčeninou. Keď sa fluorescenčné značená protilátka vystaví svetlu so správnou vlnovou dĺžkou, je možné detekovať jej prítomnosť na základe fluorescencie. Medzi najbežnejšie používané flurescenčne značené zlúčeniny patria fluoresceín izotiokyanát, rodamín, fýkoerytrín, pykocyanín, alofykocyanín, o-ftaldehyd a fluorescamín.

Protilátku je možné detekovateľne značiť aj použitím fluorescenciu emitujúcich kovov ako ^1S2E alebo iných kovov lantanoidovej série. Tieto kovy je možné pripojiť na protilátku použitím takých kovových chelatačných skupín, ako je kyselina dietyléntriamínpentaoctová (ETPA).

Protilátku je možné detekovateľne značiť aj pripojením protilátky na chemiluminiscenčnú zlúčeninu. Prítomnosť protilátky s chemiluminiscenčným príveskom sa potom determinuje detekovaním prítomnosti luminiscencie, ktorá vzniká počas chemickej reakcie. Príkladmi výnimočne užitočných chemiluminiscenčne značených zlúčenín sú luminol, izoluminol, teromatický akridínium ester, imidazol, akridíniová soľ a oxalát ester.

-50Podobne je možné na značenie protilátky podľa predloženého vynálezu použiť bioluminiscenčnú zlúčeninu. Bioluminiscencia je typom chemiluminiscencie, ktorá sa nachádza v biologických systémoch, v ktorých katalytický proteín zvyšuje účinnosť chemiluminiscenčnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscenčného proteínu sa determinuje detekciou prítomnosti luminiscencie. Dôležitými bioluminiscenčnými zlúčeninami na účely značenia sú luciferín, luciferáza a aequorín.

Molekula protilátky podľa predloženého vynálezu sa môže upraviť na použitie v imunometrickom teste, tiež známom ako dvojstranný alebo sendvičový test. V typickom imunometrickom teste sa určité množstvo neznačenej protilátky (alebo fragmentu protilátky) naviaže na tuhý podklad alebo nosič a pridá sa určité množstvo detekovateľne značenej rozpustnej protilátky na umožnenie detekcie a/alebo kvantifikácie ternárneho komplexu, ktorý sa vytvorí medzi protilátkou na tuhej fáze, antigénom a značenou protilátkou.

Typické a výhodné imunometrické testy zahŕňajú priame testy, v ktorých sa protilátka naviazaná na tuhú fázu najprv skontaktuje so vzorkou, ktorá má byť testovaná, na extrahovanie antigénu zo vzorky vytvorením binárneho tuhého komplexu protilátka-antigén. Po vhodnej inkubačnej dobe sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránil zvyšok kvapalnej vzorky, vrátane nezreagovaného antigénu, ak sa tam nejaký nachádza, a potom sa uvedie do kontaktu s roztokom obsahujúcim neznáme množstvo značenej protilátky (ktorá funguje ako reporterová molekula). Po druhej inkubačnej dobe na umožnenie toho, aby značená protilátka vytvorila komplex s antigénom naviazaným na tuhý podklad alebo nosič prostredníctvom neznačenej protilátky, sa tuhý podklad alebo nosič premyje druhý raz, aby sa odstránila nezreagovaná značená protilátka.

V inom type sendvičového testu, ktorý tiež môže byť užitočný s antigénmi podľa predloženého vynálezu, sú použité takzvané simultánne a reverzné testy. Simultánny test zahŕňa jediný inkubačný krok, v ktorom sa zároveň ku testovanej vzorke pridáva tak protilátka naviazaná na tuhý podklad alebo nosič, ako aj značená protilátka. Po ukončení inkubovania sa tuhý podklad alebo nosič premyje, aby sa odstránili zvyšky kvapalnej vzorky a značenej protilátky mimo komplexu.

-51 Prítomnosť značenej protilátky asociovanej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom stanovuje ako by išlo o bežný priamy sendvičový test.

V reverznom teste sa využíva postupné pridávanie najprv roztoku značenej protilátky do kvapalnej vzorky, a potom, po vhodnej inkubačnej dobe, nasleduje pridanie neznačenej protilátky naviazanej na tuhý podklad alebo nosič. Po druhej inkubácii sa tuhá fáza premyje bežným spôsobom, aby sa zbavila zvyšku testovanej vzorky a roztoku nezreagovanej značenej protilátky. Determinácia značenej protilátky asociovanej s tuhým podkladom alebo nosičom sa potom uskutočňuje ako v simultánnom a priamom teste.

RAP-2 proteíny podľa vynálezu sa môžu produkovať akoukoľvek štandardnou rekombinantnou DNA technikou (pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989 a Ansabel a ďalší, 1987-1995, vyššie), v ktorej sa vhodné eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky dobre známe v oblasti transformujú príslušnými eukaryotickými alebo prokaryotickými vektormi, ktoré obsahujú sekvencie kódujúce proteíny. Z toho vyplýva, že predložený vynález sa týka tak expresných vektorov, ako aj transfomovaných hostiteľov, na produkciu proteínov podľa vynálezu. Ako bolo uvedené vyššie, tieto proteíny zahŕňajú aj ich biologicky účinné analógy, fragmenty a deriváty, takže vektory, ktoré ich kódujú, tiež zahŕňajú vektory kódujúce analógy a fragmenty týchto proteínov a transformovaný hostitelia zahŕňajú aj hostiteľské bunky, ktoré produkujú takéto analógy a fragmenty. Derivátmi týchto proteínov, ktoré sú produkované transformovanými hostiteľmi, sú deriváty produkované štandardnými modifikáciami proteínov alebo ich analógov alebo fragmentov.

Predložený vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci RAP-2 proteíny, ktorý kóduje aj vírusový povrchový proteín schopný viazať sa na špecifické cieľové bunkové (napr. nádorové bunky) povrchové proteíny, aby sa priamo zaviedli RAP-2 proteínové sekvencie do buniek. Ďalej farmaceutické prostriedky podľa vynálezu obsahujú ako účinnú zložku (a) oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu anti-sense sekvenciu RAP2 proteínovej sekencie, alebo (b) liečivá, ktoré blokujú RAP-2-RIP interakciu.

-52Farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu obsahujú dostatočné množstvo účinnej zložky, aby sa dosiahol zamýšľaný účel. Navyše, farmaceutické prostriedky môžu obsahovať vhodné farmaceutický prijateľné nosiče obsahujúce vehikulá a prídavné látky, ktoré uľahčujú spracovanie účinných zložiek do prípravkov, ktoré je možné použiť farmaceutický, a ktorými je možné stabilizovať takéto prípravky na podanie subjektu, ktorý ich potrebuje, ako je dobre známe pre priemerného odborníka v oblasti.

Predpokladá sa, že RAP-2 proteín a jeho izoformy alebo izotypy sa exprimujú v rôznych tkanivách v značne odlišných hladinách a zjavne aj s odlišným spektrom izotypov, analogickým spôsobom ako sú exprimované rôzne iné proteíny podieľajúce sa na vnútrobunkových signalizačných dráhach, ako je uvedené vo vyššie citovaných spoločne vlastnených prihláškach vynálezov, ktoré sú paralelne v konaní. Tieto odlišnosti sa môžu pravdepodobne podieľať na tkanivovo-špecifických znakoch odpovede na Fas/APO1-ligand a TNF. V prípade iných CED3/ICE homológov (Wang a ďalší, 1994; Alnemri a ďalší, 1995) pôvodcovia predloženého vynálezu ukázali (vo vyššie uvedených prihláškach vynálezov), že MACH izoformy, ktoré obsahujú nekompletné CED3/ICE oblasti (napr. MACHa3), majú inhibičný účinok na aktivitu koexprimovaných MAC Ha 1 alebo MACHa2 molekúl; zistilo sa tiež, že blokujú mechanizmus indukcie smrti bunkovej obrany proti Fas/APO1- a TNF-sprostredkovanej cytotoxicite. Predpokladá sa podobný inhibičný účinok aspoň niektorých G1 izoforiem (G1 je v súčasnosti izolovaný nový Mch4- a možno MACHviažuci proteín, a aj MORT-1-viažuci proteín, ktorý má MORT moduly a proteázovú doménu, pozri spoločne vlastnenú IL120367, ktorá je paralelne v konaní). Značná heterogenita MACH izoforiem a podobne predpokladaná analogická heterogenita G1 izoforiem, ktorá značne prevyšuje heterogenitu pozorovanú pre ktorúkoľvek inú proteázu z CED3/ICE rodiny, by mala umožniť veľmi jemné ladenie funkcie aktívnych MACH izoforiem, a analogicky aj aktívnych G1 izoforiem. Takže, ako bolo uvedené vyššie, RAP-2 proteíny alebo ich možné izoformy môžu mať rôzne účinky v odlišných tkanivách vo vzťahu k ich interakcii s RIP, a tým k ich vplyvu na

-53rovnováhu medzi aktiváciou dráh bunkovej smrti a bunkového prežívania, ako je opísané vyššie.

Je tiež možné, že niektoré možné RAP-2 izoformy majú iné funkcie. Napríklad RAP-2 alebo niektoré RAP-2 izoformy môžu slúžiť ako ukotvovacie miesta molekúl, ktoré sa podieľajú na iných, necytotoxických účinkoch Fas/APO1 a TNF receptorov, prostredníctvom interakcie s RIP alebo aj nezávisle od RIP.

Kvôli unikátnej schopnosti Fas/APO1 a TNF receptorov spôsobovať zápal, bunkovú smrť, ako aj schopnosti TNF receptorov spustiť iné aktivity ničiace tkanivá, mohli by byť aberácie vo funkcii týchto receptorov značne ničivé voči organizmu. V skutočnosti sa ukázalo, že tak nadmerná, ako aj deficientná funkcia týchto receptorov sa podieľa na patologickej manifestácii rôznych chorôb (Vassalli, 1992; Nagata a Golstein, 1995). Identifikácia molekúl, ktoré sa podieľajú na signalizačnej aktivite receptorov, a nájdenie spôsobov ako modulovať aktivitu týchto molekúl, by mohlo určiť nové terapeutické prístupy. Z nasledujúcich príkladov budú zrejmé iné predmety vynálezu.

Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný v nasledujúcich neobmedzujúcich príkladoch a na priložených obrázkoch.

Treba poznamenať, že (i) dvojhybridný skríning a dvojhybridný β-galaktozidázový expresný test; (ii) indukovaná expresia, metabolické značenie a imunoprecipitácia proteínov; (iii) in vitro väzba; (iv) stanovenie cytotoxicity; a (v) Northern a sekvenčná analýza (pozri aj Boldin a ďalší, 1995b) 2, 3 (pozri aj Boldin a ďalší, 1996) a 4, opísané s ohľadom na MORT-1 a MORT-1 viažuci proteín (napr. MACH), ako aj novo izolovaný proteín G1 (pozri IL120367), sú rovnako aplikovateľné (s nejakými modifikáciami) pre zodpovedajúcu izoláciu, klonovanie a charakterizáciu RAP-2 a jeho možných ízoforiem podľa predloženého vynálezu. Tieto postupy tak predstavujú postupy na použite na izoláciu, klonovanie a charakterizáciu RAP-2 podľa predloženého vynálezu, ako sú podrobne uvedené, napr. v rovnakej alebo v ekvivalentnej forme, v spoločne vlastnených izraelských prihláškach č. 114615, 114986, 115319, 116588, 117932 a 120367, ako aj v zodpovedajúcej PCT prihláške č.

-54PCT/US96/10521. Ďalej, čo sa týka NIK proteínu a jeho úlohy v aktivácii NF-κΒ, a tým v bunkovom prežívaní, a úlohy TRAF2 v tejto dráhe bunkového prežívania, napríklad interakcie medzi TRAF2 a RIP a inými proteínmi, tieto skutočnosti sú podrobne uvedené pôvodcami tohto vynálezu v spoločne vlastnených IL117800, IL119133, ktoré sú paralelne v konaní a v Malinin a ďalší, 1997.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 (A,B) (sekv. č. 1) znázorňuje nukleotidovú sekenciu RAP-2, v ktorej sú štartovací a stop kodón podčiarknuté. Šípky označujú začiatok 1,5 kb klonu získaného dvojhybridným skríningom.

Obrázok 2 (A,B) (sekv. č. 2) znázorňuje nukleotidovú sekvenciu klonu č. 41072 (pozri príklad 1), v ktorej sú štartovací a stop kodón podčiarknuté.

Obrázok 3 A (/1, /2) znázorňuje odvodené aminokyselinové sekvencie ľudských (20.4 komplet a Human shrí) a hlodavčích (NEMO komplet a Mouse parí) zostrihových variantov RAP-2 a B (/1,/2) znázorňuje publikovanú sekvenciu FIP-2, ktoré sú porovnané použitím softwarového balíčka dostupného od BCM Search Launcher (Baylor College of Medicíne, Houston, TX). Homologické aminokyseliny sú zarámované, zhodné aminokyseliny sú sivo-tieňované. Hviezdičky v (B) označujú pravdepodobný motív podobný leucínovému zipsu (LZ) vo FIP-2.

Obrázok 4 opisuje molekulovú charakterizáciu RAP-2. Na A je znázornená Northern blotová hybridizácia ľudského MTN Blot I (Clontech) s DNA fragmenom RAP-2. Na B je analyzované RAP-2 viazanie sa na RIP, ako je podrobne opísané v príklade 3. Na C sa detekovala NIK-RAP-2 interakcia ako v (B) s tou výnimkou, že pre Western bloting boli použité anti-FLAG protilátky a nasledovala imunoprecipitácia s anti-His6. Šípky označujú polohu imunoprecipitovaných proteínov.

Obrázok 5 je grafickým znázornením značnej redukcie NF-κΒ a aktivácie cJun rôznymi stimulmi, ektopickou expresiou RAP-2 ako je opísané v príklade 4. HEK-293T bunky sa prechodne transfekovali reportérovým plazmidom (HIVLTRLuc alebo CMV-Luc pre NF-κΒ (A) a GAL-4Luc pre cJun (B) aktivačné testy) a expresným vektorom pre uvedený induktor a buď prázdnym vehikulom (pcDNA3 -55na obrázku označený samostatne), alebo plazmidom kódujúcim kompletný RAP-2 (pcRAP-2 - na obrázku označené ako plus). Aktivácia luciferázovej aktivity reporterového génu je vyjadrená v relatívnych luciferázových jednotkách (R.L.U.).

Obrázok 6 znázorňuje, že RAP-2 vykazuje podobné represívne správanie voči NF-κΒ a c-Jun v širokom koncentračnom rozsahu. TRAF2 sa prechodne exprimoval v HEK-293T bunkách spolu s rôznymi uvedenými množstvami buď pcRAP-2 (sense) alebo pcRAP-2-a/s (antisense) konštruktov. Na stanovenie NF-κΒ aktivácie sa zaviedol pHIVLTR-Luc reporterový plazmid (A) a na stanovenie c-Jun (B) aktivácie sa zaviedol pGAL4-Luc reporterový plazmid. Luciferázový test sa uskutočňoval ako je opísané pre obrázok 5 v príklade 4.

Obrázok 7 znázorňuje, že RAP-2 značne zvyšuje potenciál signálom indukovanej fosforylácie c-Jun, bez toho, aby interferoval s JNK1/2 aktivačnou hladinou.

(A) Celkové bunkové lyzáty HEK-293T buniek transfekované uvedenými expresnými konštruktmi spolu s buď pcDNA3-nosičom, označené na obrázku znamienkom (-), alebo s pcRAP označené na obrázku ako (+), sa identifikovali prostredníctvom Western blot analýzy s anti-fosfo-Jun protilátkami ako je opísané v príklade 5. Kontrolná membrána znázornená na spodnom paneli sa znovu sondovala s anti-total-c-Jun Abs (NEB);

(B) Aktivované JNK1/2 z HEK-293T buniek transfekovaných buď pcDNA3 alebo pcRAP-2, ošetrené s hrTNFa s predlžujúcimi sa časovými periódami, sa detekovali prostredníctvom Western blotingu celkových lyzátov s Abs voči fosfoJNK ako je podrobne opísané v príklade 5.

(C) HEK-293T bunky kotransfekované prázdnym vektorom, pcRAP-2 a pcRIP v rôznych kombináciách, spolu s HA-JNK1-expresným plazmidom. JNK1 sa potom imunoprecipitoval prostredníctvom jeho N-koncového HA-prívesku a jeho schopnosť fosforylovať bakteriálne produkovaný purifikovaný GST-Jun sa stanovila v in vitro kinázovom teste. Reakčné produkty sa analyzovali na SDS-PAGE. GSTJun je označené šípkou.

-56Obrázok 8 ukazuje, že RAP-2 nekonkuruje NF-κΒ a AP-1 pri väzbe DNA. HEK-293T sa transformovali uvedenými proteínmi buď samostatne (-) alebo spolu s pcRAP-2 (+). Jadrové extrakty pripravené z buniek sa koinkubovali s ³²P-značenými oligonukleotidmi obsahujúcimi klasické rozoznávacie sekvencie pre AP-1 (A) alebo NF-κΒ (B). Reakčné produkty sa analyzovali nedenaturačnou PAGE.

Obrázok 9 ukazuje, že RAP-2 ovplyvňuje bazálnu hladinu NF-κΒ v HEK293T a HeLa bunkách, ktoré boli prechodne transfekované rôznymi množstvami buď RAP-2 (sense), alebo RAP-2-antisense (a/s). Všetky manipulácie sa uskutočňovali ako je opísané pre obrázok 6, v príklade 4.

Obrázok 10 (A, B) (sekv. č. 3) znázorňuje čiastočnú nukleotidovú sekvenciu klonu č. 10.

Obrázok 11 znázorňuje funkčné vlastnosti seriálnych delécií RAP-2. A je schematickým znázornením postupných C-koncových delécií RAP-2. Spoločné pre všetky skrátenia je intaktný RAP-2 N-koniec, zatiaľ čo C-terminálne konce sú označené šípkami. RIP, NIK, ΙΚΚβ a TIP60 viažuca oblasť sú podčiarknuté. Tri vyšrafované rámiky zodpovedajú pravdepodobným motívom podobným leucínovému zipsu. B znázorňuje účinok nadexpresie delečných konštruktov opísaných v A na NF-κΒ aktiváciu v HEK-293T bunkách prostredníctvom RelA, TRAF2, TNF a NIK, použitím HIV-LTR luciferázového reporterového plazmidu pre NF-κΒ. Aktivácia luciferázovej aktivity reporterového génu je vyjadrená v relatívnych luciferázových jednotkách (R.L.U.).

Obrázok 12 znázorňuje mapovanie RAP-2 funkčných a väzobných oblastí.

(A) Rôzne delécie RAP-2 sa testovali z hľadiska ich schopnosti viazať sa na uvedené proteíny vo vnútri fransfekovanej kvasinky (párne stĺpce) a cicavčích HEK293T buniek (nepárne stĺpce). Dva sĺpce najviac vpravo znázorňujú schopnosť rovnakých delečných mutantov transfekovať v množstvách podrobne uvedených v príklade 9 HEK-293T bunky, inhibovať NF-κΒ aktiváciu a zosilniť c-Jun hyperfosforyláciu (c-Jun), ako odpoveď na pôsobenie TNF-α. Hrubosť krížikov zodpovedá intenzite daného účinku. Hviezdičky indikujú, že pozorované účinky označených konštruktov na Rel-A stimuláciu sú zreteľné.

-57(B) Zhrnutie schémy znázorňujúcej lokalizáciu väzobných (horná časť) a funkčných (spodná časť) oblastí RAP-2, ako sa identifikovalo z delečnej analýzy znázornenej na (A), pričom sú usporiadané pozdĺž proteínovej chrbtice. Vyšrafované časti označujú možné umiestnenie hraníc zodpovedajúcich minimálnych oblastí.

Obrázok 13 ukazuje, že ser-146 v RAP-2 je esenciálny pre jeho schopnosť indukovať c-Jun hyperforsforyláciu v polohe ser-63. Je znázornený Western blot, v ktorom wt znamená divý typ, S148A znamená, že ser v polohe 148 sa nahradil ala a vektor je prázdny kontrolný vektor.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie a izolácia RAP-2 proteínu, ktorý sa viaže na RIP proteín

Dvojhybridný skríning, sekvenovanie a predbežná analýza

Použitím dvojhybridného skríningu knižnice B-buniek s RIP ako návnadou (pozri napr. Fields a Song, 1989, WO/96/18641), sa izoloval kloň s veľkosťou približne 1,5 Kb. Tento 1,5 Kb kloň (pozri sekvenciu na obrázkoch 1 a 2) bol použitý na skríning fágovej cDNA knižnice, čoho výsledkom bol približne 2,0 Kb kloň, ktorého sekvencia je znázornená na obrázku 1.

Využitím EST porovnávania so sekvenciou 1,5 Kb klonu sa získal EST fragment, ktorý tvorí 3' koniec J.M.A.G.E. konsorcia klonu č. 41072 (Research Genetics Inštitúte). Z tohto klonu, ktorý pochádza z knižnice fetálneho mozgu, boli publikované len dva malé sekvenčné fragmenty na jeho 3' a 5' koncoch. Po získaní klonu sa tento sekvenoval a zistilo sa, že aj tieto publikované sekvenčné fragmenty obsahujú chyby. Zistilo sa, že druhý kloň (obr. 2) je zhodný s klonom na obrázku 1 v jeho kódujúcej oblasti, ale sú odlišné v 5'-nekódujúcej oblasti. Preto sa predpokladá, že obe cDNA sú alternatívne zostrihnuté formy rovnakého génu.

Analýza sekvencie ukázala, že podobne ako RAP, RAP-2 proteín zjavne nemá smrtiacu doménu, nemá MORT modul, nemá proteázovú doménu podobnú

-58doménam ICE rodiny, nemá kinázovú doménu, ani TRAF domény (pozri vyššie uvedené spoločne vlastnené prihlášky vynálezu, ktoré sú paralelne v konaní, a rôzne iné publikácie, najmä Malinin a ďalší, 1997, ktoré sa týkajú všetkých rôznych domén prítomných vo vnútrobunkových signalizačných dráhach). Nenašli sa ani žiadne závažné motívy v danej sekvencii, s výnimkou troch blokov podobných leucínovému zipsu (LZ), nepravidelne distribuovaných pozdĺž protein kódujúcej oblasti. Tieto oblasti sú označené ako podobné, pretože dve z nich obsahujú Leu na Val, Met alebo Ile substitúcie. Hoci sú zvyčajne považované za konzervatívne, nie je jasné, či takéto zmeny vo vnútri domény leucínového zipsu umožňujú, aby si protein zachoval svoju funkčnú aktivitu, tzn. schopnosť viazať sa na iné LZs. Väzobné štúdie odhalili, že RAP-2 sa v podstate viaže na RIP, RAP-2 nie je schopný viazať sa na TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R a MACH (v doteraz uskutočnených štúdiách). Tieto výsledky podporujú skutočnosť, že RAP-2 zjavne nemá smrtiace domény a MORT moduly.

Preto je zrejmé, že RAP-2 je špecifický RIP-viažuci protein, ktorý interaguje/viaže sa na RIP veľmi špecifickým spôsobom. Takže RAP-2 je zjavne špecifickým modulátorom/mediátorom RIP vnútrobunkového účinku, ktorý má dôležitú úlohu v RIP modulácii/sprostredkovaní dráh zápalu a bunkovej smrti/bunkového prežívania.

V stručnosti, kloň RAP-2 sa získal dvojhybridným skríningom humánnej cDNA knižnice z B-buniek, použitím celého RIP proteínu ako návnady. RIP sekvencia bola prístupná v predchádzajúcich publikáciách (napr. Stanger a ďalší, 1995) a nachádza sa v GenBank databáze pod prístupovým č. U25994, ako ľudská RIP sekvencia (v tejto databáze je prítomná aj myšia RIP sekvencia pod prístupovým č. U25995). Použitím tejto sekvenčnej informácie sa navrhli PCR primery prostredníctvom OLIGO4™ softwaru a prostredníctvom PCR sa získal DNA fragment zodpovedajúci kódujúcej časti RIP, pričom sa použila ako templát cDNA z celkovej RNA ľudskej fibroblastovej bunkovej knižnice (použitím štandardných postupov). Táto kódujúca časť RIP sa potom klonovala do pGBT-9 vektora (Clontech) a použila sa ako návnada, ako bolo uvedené vyššie, v dvojhybridnom

-59skríningovom postupe. Týmto dvojhybridným skríningom sa získal kloň, ktorý kóduje RIP-viažuci proteín, ktorý interaguje s RIP.

Tento kloň, ako bolo uvedené vyššie, bol použitý na skríning fágovej cDNA knižnice a EST databázy. Na obrázkoch 1 a 2 je možné vidieť, že kódujúce sekvencie dvoch klonov sú zhodné, zatial¹ čo 5-nekódujúce oblasti sa líšia. Takže pravdepodobne ide o alternatívne zostrihnuté formy. Klony majú dĺžku približne 2,0 Kb a ORF (otvorený čítací rámes) má dĺžku približne 1,5 Kb, čo zodpovedá molekulovej hmotnosti samotného proteínu približne 50 Kd. Odvodená aminokyselinová sekvencia RAP-2 je znázornená na obrázku 3.

Analýza vyššie uvedených sekvencií RAP-2 klonu a sekvencií v dbest databáze, Human Genome Databáze level 1 a GenBank databáze odhalila, že RAP-2 sekvencia je unikátna (nová) sekvencia, keďže nie je významne homologická so žiadnou zo známych sekvencií. Po podaní IL123758, z ktorej si táto prihláška nárokuje prioritu, Yamaoka S a ďalší (1998) publikoval charakterizáciu hlodavčej cDNA, ktorá kóduje 48kD proteín, ktorý bol označený ako NEMO (od NFkB esenciálny modulátor), (pozri Doterajší stav techniky).

Ďalšie prieskumy databáz (in sillico) identifikovali FIP-2, proteín s neznámymi funkciami, ktorý pôvodne klonoval Li Y. a ďalší (1998, pozri Doterajší stav techniky).

Ako je možné vidieť z globálneho porovnania RAP-2 a FIP-2 sekvencií (obrázok 3B), stupeň celkovej podobnosti je značne nízky (preto nie je prekvapujúce, že sekvencia sa neidentifikovala použitím skenu založenom na globálnych algoritmoch). Homológia medzi RAP-2 a FIP-2 sa zvyšuje smerom k Ckoncu proteínov, a kulminuje ako skutočná zhoda v C-koncových 30 aminokyselinách. Stojí za zmienku, že okrem spomenutej oblasti, ostáva LZ-motív z FIP-2 značne zachovaný v RAP-2 (okrem Ile/Ala substitúcie).

Identifikovala sa aj ďalšia kratšia RAP-2 cDNA, s približnou dĺžkou 0,5 kb (ID: 1469996), ktorá tu ďalej bude označovaná ako Human shrt. Tento variant obsahuje kódujúce sekvenčné bloky odvodené od niekoľkých oddelených oblastí 1,5 kb celkovej cDNA, pravdepodobne vzniknuté alternatívnym zostrihom rovnakého génu.

-60Northern hybridizačná analýza použitím Multiple Tissue Northern blotu (Clontech) s 0,9 kb fíg///-fragmentom RAP-2 cDNA vykazovala komplexný vzor RAP-2 mRNA. Detegovalo sa najmenej 5 rôznych mRNA v rozsahu veľkosti od menej ako 1 kb do viac ako 7 kb, pričom viac alebo menej prevládali varianty s veľkosťou 2,5 kb a 6 kb (obrázok 4A).

Príklad 2

Identifikácia hlodavčieho RAP-2

Podobný prieskum myšej EST zbierky založenej na TIGR odhalil čiastočnú cDNA s dĺžkou 1,6 kb (Mouse part. ID:761011, obrázok 3), ktorá pravdepodobne zodpovedá myšaciemu RAP-2, keďže je v skutočnosti zhodná (95%) so svojim ľudským náprotivkom v kódujúcej oblasti (pozri obrázok 3).

Napriek tomu, rozdiel medzi ľudskou a hlodavčou RAP-2 a NEMO sekvenciou presahuje to, čo by sa mohlo jednoznačne prisúdiť normálnemu medzidruhovému rozdielu. V skutočnosti chýbajúci blok 7 aminokyselín (poloha 249 v 20.4) z hlodavčieho RAP-2 a z NEMO sekvencie a inzercia 3 aminokyselín (KLE v polohe 111) v NEMO otvorenom čítacom rámci v porovnaní s celým ľudským variantom a s čiastočnou hlodavčou sekvenciou, sú len najzreteľnejšími príkladmi (obrázok 3). Výsledkom týchto rozdielov však nemusia byť funkčné reakcie na účinok proteínu. V skutočnosti je však zrejmé, že vlastnosti publikované pre NEMO sú opačné ako vlastnosti zistené pre ľudský RAP-2, hoci frakcionačná analýza publikovaná pre NEMO potvrdila, že lokalizuje do signálnej zóny.

Príklad 3

RIP väzba na RAP-2 v cicavčích bunkách

Ďalší dôkaz fyziologického významu RAP-2-RIP interakcie sa získal v transfekovaných HEK-293T a HeLa bunkách. V skutočnosti bolo možné tieto dva proteíny jednoducho koprecipitovať z bunkových lyzátov HEK-293 (ATCC č. CRL 1573) buniek transfekovaných, ako je vyznačené pod každou líniou na obrázku 4B,

-61 a imunoprecipitovať s anti-FLAG mAbs (Kodak). Imunokomplexy sa potom analyzovali z hľadiska prítomnosti HIS-RAP-2 bežným Western blotom s anti-His6 mAbs (Sigma) (obrázok 4B a neuvedené údaje). Avšak výsledkom vytvorenia takéhoto komplexu nie je RIP enzymatická aktivita: v rozsahu, ktorý bolo možné posúdiť in vitro imunokomplexovým kinázovým testom, nadexpresia RIP nefosforylovala RAP-2 (nie je ukázané).

Uskutočňovali sa väzobné testy, aby sa stanovilo, či sa RAP-2 viaže na nejaký iný známy vnútrobunkový signalizačný protein. V týchto testoch sa testovali proteíny TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH z hľadiska ich schopnosti viazať sa na RAP-2. Zistilo sa však, že RAP-2 nebol schopný viazať sa na žiadny z týchto proteínov. RAP-2 sa neviazal ani na žiadny z kontrolných proteínov, napr. lamín, cyklín D.

Zo všetkých vyššie uvedených výsledkov preto vyplýva, že nový RAP-2 protein možno interaguje s RIP veľmi špecifickým spôsobom, a ako taký predstavuje špecifický modulátor/mediátor RIP.

Príklad 4

RAP-2 interaguje s NIK a moduluje NF-κΒ a c-Jun závislú transkripciu

Hoci sa RAP-2-NIK interakcia nedetegovala v dvojhybridných kvasinkových testoch (pozri vyššie), transfekčné experimenty s HEK-293T cicavčími bunkami indikovali stabilné vytvorenie tohto komplexu. NIK-RAP-2 interakcia sa detekovala ako je opísané v príklade 3, s tou výnimkou, že na Western blot sa použili antiFLAG protilátky a nasledovala imunoprecipitácia s anti-His6 (obrázok 4C). Takýto nesúlad medzi väzbou v kvasinkách a väzbou v cicavčích bunkách nebol prekvapujúci, pretože úplná NIK má tendenciu stratiť väzobné vlastnosti, keď sa exprimuje v kvasinkách.

Vzhľadom na skutočnosť, že sa verí, že RIP a NIK sú in vivo nepostrádateľné mediátory TNF-indukovanej NF-κΒ aktívácie, skúmalo sa, či nadexpresia RAP-2 v bunkovej kultúre je schopná interferovať s touto konkrétnou signalizačnou

-62dráhou. Začiatočná sada experimentov sa uskutočňovala v HEK-293T bunkách prechodne transfekovaných reportérovými plazmidmi, ktoré obsahujú luciferázový gén pod kontrolou HIV-LTR minimálneho promótora. Pri podobnom nastavení sa najprv zistilo, že RAP-2 tlmí, takmer na základnú úroveň, reporterovú aktiváciu spôsobenú tak nadexpresiou rôznych známych NF-KB-induktorov podieľajúcich sa na TNF signalizácii (NIK, TRAF2, RIP, atď), ako aj ošetrením buniek vonkajšími stimulmi (TNF a PMA, obrázok 5A). HEK-293T bunky sa prechodne transfekovali reportérovým plazmidom (HIVLTR-Luc alebo CMV-Luc pre NF-κΒ (5A) a GAL4-Luc pre c-Jun (5Β) aktivačné testy) a expresným vektorom pre uvedený induktor a buď čistým vehikulom (pcDNA3) alebo plazmidom kódujúcim úplný RAP-2 (pcRAP-2). Zo skutočnosti, že RAP-2 je schopný vykonávať svoje účinky do tej mieri, že tlmí signalizačnú transdukčnú dráhu ako RelA, vyplýva, že časť účinku tohto proteínu by mohla byť spoločná pre rôzne a inak divergentné signalizačné dráhy (pozri nižšie). Zároveň nebola ohrozená kB nezávislá (riadená CMV skorým promótorom) transkripcia luciferázy (obrázok 5A), takže veríme, že možný všeobecný neporiadok základnej transkripčnej/translačnej mašinérie prostredníctvom RAP-2 je možné vylúčiť. Tieto výsledky sa následne úplne potvrdili v HeLa bunkách (neuvedené).

Avšak, ako odhalili ďalšie titračné testy, skutočný fenomén bol oveľa komplexnejší. V skutočnosti, keď sa TRAF2 prechodne exprimoval v HEK-293T bunkách spolu s rôznymi množstvami pcRAP-2, ktoré sú uvedené na obrázku 6, RAP-2 drasticky zmenil svoje správanie pri nízkych koncentráciách (približne 20 ng/10⁶ buniek), zosilňujúc TRAF2 NF-κΒ indukovanú transkripciu (pozri obrázok 6A). Navyše sa skonštruovalo účinné RAP-2 antisense expresné vehikulum zamenením pôvodného inzertu inzertom s opačnou orientáciou a TRAF2 sa prechodne exprimoval v HEK-293T bunkách spolu s rôznymi uvedenými množstvami pcRAP-2-a/s (antisense) konštruktov, a analyzoval sa účinok progresívnej straty RAP-2, čo viedlo k znázorneniu diagramu závislého na koncentrácii. Z celkového trendu krivky vyplýva, že bunková odpoveď zhruba inverzne koreluje s množstvom transfekovanej RAP-2 DNA, s výnimkou charakteristickej oblasti, ktorá zahŕňa okolie nulového bodu, zodpovedajúceho

-63nominálnej, endogénnej hladine proteínu (obrázok 6). Treba poznamenať, že tlmenie expresie daného génu zavedením antisense je pravdepodobne jemnejšie ako pri sense nadexpresii. Antisense v skutočnosti nezahŕňa umelú produkciu žiadneho proteínu vo vnútri bunky, a preto jasne zvýrazňuje hodnotu RAP-2 inhibičnej schopnosti. Napriek tomu treba poznamenať, že vyššie uvedený skok pri nízkych koncentráciách je zrkadlený, nie obrátený do antisense polovice grafu (obrázok 6).

Na zhodnotenie diverzity transkripčných systémov, v ktorých môže byť zahrnutý RAP-2, posunuli sme sa k štúdii c-Jun, jadrového faktora, ktorého úloha v zavedení a udržiavaní adekvátnej stresovej odpovede bola potvrdená ako takmer rovnako kritická ako úloha NF-κΒ. Použitím komponentov komerčného Path Detec systému (Stratagene), sme potvrdili podobné dvojfázové správanie RAP-2 vo vzťahu k niekoľkým rozoznávaným aktivátorom AP-1 v HEK-293T a HeLa bunkách (pozri obrázky 5B a 6B).

Príklad 5

RAP-2 zvyšuje potenciál c-Jun hyperfosforylácie bez toho, aby menil aktivitu JNK

Na štúdium mechanizmu, ktorý je základom takého vážneho účinku na transkripciu, bolo esenciálne stanoviť presnú úroveň, pri ktorej sa rozpadá normálna signalizácia. Je potvrdené, že trans-aktivačný potenciál c-Jun je regulovaný extracelulárnym signálom indukovanou fosforyláciou dvoch serínových zvyškov (⁶³Ser a ⁷³Ser) jeho amino-terminálnej aktivačnej domény. JNK/SAPK proteín kinázy zodpovedné za vyššie uvedenú fosforyláciu predstavujú značne rôznorodú podtriedu MAP kinázovej rodiny a sami sú aktivované fosforyláciou na ¹⁸³Thr a ¹⁸⁵Tyr, ktorá je sprostredkovaná ďalšími duálne špecifickými kinázami pôsobiacimi upstream. Takže stav fosforylácie na príslušných miestach vo vnútri tak c-Jun, ako aj JNKs, je možné použiť ako marker odrážajúci stav aktivácie proteínu. Wéstern blot analýza s lyzátmi prechodne transfekovaných HEK-293T buniek odhalila, že bez ohľadu na poškodenie c-Jun-sprostredkovanej transkripcie, RAP-2 významne zvyšuje potenciál fosforylácie endogénneho c-Jun na ⁶³Ser, ktorá je indukovaná

-64množstvom stimulov (pozri obrázok 7A). Celkové bunkové lyzáty HEK-293T buniek, ktoré boli transfekované s uvedenými expresnými konštruktami spolu s buď pcDNA3-nosičom, označeným na obrázku 7 znamienkom (-), alebo s pcRAP-2, označeným na tom istom obrázku znamienkom (+), sa rozdelili na SDS-PAGE, preniesli sa na ECL-membránu a testovali sa použitím sondy anti-fosfo-⁶³Ser-c-Jun Abs (NEB). Membrána znázornená na spodnom paneli obrázku 7A bola znova podrobená testu so sondou anti-total-c-Jun Abs kvôli kontrole (NEB).

Celkové množstvo c-Jun však ostalo nezmenené, čo vylučuje zvýšenie c-Jun hladín ako možný zdroj modifikácie. Protilátky špecifické voči fosforylovanej forme JNK1/2 nedetegovali žiadne podstatné zvýšenie množstva týchto aktivovaných kináz ako odpovede na nadexpresiu RAP-2, z čoho vyplýva, že ďalšia fosforylácia c-Jun nebola výsledkom RAP-2-závislej podpory JNKs aktivity (obrázok 7B). Aktivované JNK1/2 z HEK-293T buniek transfekovaných buď pcDNA3, alebo pcRAP-2, ktoré boli ošetrené s hrTNFa počas predlžujúcich sa časových periód, boli detekované Western blotom celkových lyzátov s fosfo-(¹⁸³Thr/¹⁸⁵Tyr)-JNK Abs (NEB) ako je znázornené na obrázku 7.

Na ďalšiu podporu posledného tvrdenia, in vitro kinázový test s imunoprecipitovaným JNK1 a purifikovaným GST-c-Jun ako substrátom, vykázal v podstate rovnaký výsledok (obrázok 7C). HEK-293T bunky sa kotransfekovali prázdnym vektorom, pcRAP-2 a pcRIP v rôznych kombináciách spolu s HA-JNK1expresným vektorom. JNK1 sa potom imunoprecipitoval prostredníctvom svojho Nkoncového HA-prívesku a jeho schopnosť fosforylovať baktériami produkovaný purifikovaný GST-Jun sa stanovila prostredníctvom inkorporovania ³²P v in vitro kinázovom teste. Reakčné produkty sa analyzovali na SDS-PAGE ako je znázornené na obrázku 7.

RAP-2 sa stáva fosforylovaným, keď sa RAP-2-IKK1 komplex, imunoprecipitovaný z transfekovaných HEK293 buniek, inkubuje v in vitro fosforylačných podmienkach. Prieskum funkčnej úlohy fosforylácie RAP-2 odhalil, že mutácia jedného konkrétneho serínu v tomto proteíne (v polohe 148) úplne zničí aktiváciu Jun fosforylácie sprostredkovanú týmto proteínom. Ako je ilustrované na obrázku 13, zatiaľ čo nadexpresia divého typu RAP-2 vedie k masívnemu nárastu Jun

-65fosforylácie, nadexpresia RAP-2 (S148A) neovplyvňuje fosforyláciu Jun. Táto mutácia však vôbec neovplyvnila účinok RAP-2 na NF-κΒ. Z týchto zistení vyplýva, že fosforylácia serínu 148 v RAP-2 sa špecificky podieľa na jeho účinku na Jun fosforylácii.

Príklad 6

RAP-2 neinhibuje c-Jun a RelA väzbu na DNA

Vzhľadom na skutočnosť, že experimenty uvedené v príklade 5 neodhalili cytoplazmadickú moduláciu cieľa RAP-2 nadexpresie, teda NF-κΒ- a AP-1-signalizačných kaskád, skúmala sa integrita jadrových procesov potrebných na transkripciu. Uskutočňoval sa test posunu elektromobility (EMSA) s jadrovým extraktom transfekovaných HEK-293T buniek, ktorý jednoznačne demonštroval, že RAP-2 neinterferuje s väzbou c-Jun a RelA na oligonukleotidy zodpovedajúce ich klasickým rozoznávacím sekvenciám (obrázok 8). V skutočnosti sa pozorovalo sedemnásobné zosilnenie účinnosti formovania DNA/AP-1 komplexu v RAP-2transfekovaných bunkách. Navyše, nebola pozorovaná žiadna interakcia medzi RAP-2 a c-Jun/RelA, ktorá by mohla viesť k sférickej obštrukcii aktivačných domén c-Jun/RelA. Predpokladá sa, účinok vstupu RAP-2 do jadra, ak nejaký existuje, sa uskutočňuje v určitom časovom bode za naviazaním zosilňovača.

Príklad 7

RAP-2 interaguje in vivo s histón acetyltransferázou TIP60

TIP60 (GeneBank U 74667) patrí do v súčasnosti opísanej rodiny jadrových proteínov nazývaných histón acetyltransferázy (HATs). Enzymatická aktivita týchto proteínov je spojená so stavom chromatínovej štruktúry v nukleozomálnych komplexoch. HATs sú často spojené s určitými elementárni transkripčného aparátu a sú schopné modulovať rýchlosť transkripcie. HATs účinkujú prostredníctvom uvoľnenia chromatínového balíka v blízkosti iniciačných miest prostredníctvom

-66prenosu acetylových skupín na špecifické lyzínové zvyšky histónov, a tým podporou prístupu rôznych relevantných faktorov ku DNA. Je zrejmé, že jeden z týchto pomocných jadrových proteínov uľahčuje komunikáciu medzi zosiľovač-viažucimi faktormi a RNA polymerázou II. Preto sa skúmalo, či by mohol TIP60 vytvoriť komplex s RAP-2. Imunoprecipitácia z HeLa buniek a následne dvojhybridné testy jednoznačne ukázali, že RAP-2 silno interaguje s TIP60 v oboch systémoch. Napriek tomu sme neboli schopní vidieť žiadnu významnú zmenu RAP-2sprostredkovaného účinku na NF-κΒ a c-Jun pri koexpresii TIP60 v HEK-293T bunkách (neuvedené). Žiadne zmeny neboli pozorované ani v kontrolnom experimente, tzn. stimulácii ± TIP60 (w/o RAP-2), čo vedie k záveru, že krátky čas odčítavania (20 až 30 hodín po transfekcii), pravdepodobne znemožňuje, aby sa reporterová DNA stala chromatinizovanou, a neostáva dostatok času na účinok HAT-podobných enzýmov.

Príklad 8

Kloň č. 10 - nové proteíny interagujúce s RAP-2

Použitím úplného RAP-2 proteínu ako návnady v dvojhybridnom skríningu cDNA knižnice B buniek sa izoloval nový proteín interagujúci s RAP-2, ktorý je tu označený ako kloň č. 10 alebo proteín kódovaný klonom č. 10 alebo proteín č. 10 viažuci RAP alebo RBP-10 (obrázok 10). Zistilo sa, že pôvodný kloň (približne 2,2 kb) kóduje pravdepodobný polypeptid so zdanlivou molekulovou hmotnosťou 60 kDa. Avšak pravdepodobný ATG prvý kódón v tejto sekvencii zjavne chýba. Preto sa napriek svojej značnej dĺžke získaná cDNA predĺžila ďalej smerom k 5' koncu a rekonštituoval sa celý otvorený čítací rámec.

Dvojhybridný test väzobného repertoáru klonu č. 10 odhalil, že tento proteín má okrem afinity k RAP-2, dosť silnú afinitu k TRAF2. Kloň č. 10 sa však neviaže na RIP, TRADD, MORT1, MACH, TNFR-I, TIP60 a NIK, ako ani na niekoľko kontrolných proteínov (napríklad Iamín a cyklín). Nemožno však vylúčiť, že kloň č. 10 sa môže v cicavčích bunkách viazať na NIK, berúc do úvahy zvláštnosti správania sa

-67NIK v kvasinkách. Ukázalo sa, že kloň č. 10 sa viaže na RAP-2 v rámci Ckoncových 200 aminokyselín, tzn. v oblasti, ktorá nie je nevyhnutne spojená s väzbou RIP, TIP60, NIK a ΙΚΚβ.

Koexpresia klonu č. 10 s TRAF-2 v cicavčích 293T bunkách zabraňovala TRAF2-sprostredkovanej aktivácii NF-κΒ, zatiaľ čo koexpresia klonu č. 10 s NIK silno zvyšovala NF-κΒ aktiváciu. Z týchto zistení by mohla vyplývať dôležitá regulačná funkcia klonu č. 10. Z rôznych pozorovaných modulačných účinkov by mohla pravdepodobne vyplývať existencia rôznych, neprekrývajúcich sa miest účinku proteínu vo vnútri bunky.

Niekoľko kôl prieskumov GenBank s cieľom identifikovať blízke RBP-10 homológy, viedlo k identifikácii F40F12.5 (prístupové číslo S42834), ktorý je hypotetickým proteínom z C. elegans, ktorému nebola priradená žiadna fyziologická úloha. Je zaujímavé, že sa zistilo, že F40F12.5 vykazuje určitú podobnosť s niekoľkými členmi široko konzervovanej rodiny proteáz riadených ubiquitínom. Tieto enzýmy vyvažujú deštrukčný účinok ubiquitinačného mehanizmu, o ktorom je známe, že je zodpovedný za väčšinu proteínovej degradácie v bunke. Zatiaľ čo ubiquitín ligázy sú zodpovedné za pripojenie poly-ubiquitínového stromu na protein, ktorý je určený na degradáciu, ubiquitín proteázy zabraňujú účinnému rozvetvovaniu rastúceho stromu. Takýto predpoklad vo vzťahu k funkcii F40F12.5, založený na podobnosti s vyššie uvedenými proteázami riadenými ubiquitínom, sa však zdá byť otáznym, keďže sa ešte nepreskúmalo, či tento konkrétny protein má nejakú enzymatickú aktivitu voči ubiquitínovým polymérom. Navyše pár bodov robí túto zhodu dosť nepravdepodobnou:

a) Zvyšky, o ktorých sa verí, že tvoria jadro katalytickej oblasti v oboch podtriedach ubiquitínových proteáz, nie sú konzervované ani v F40F12.5, ani v RBP-10;

b) S výnimkou ich katalytických miest nevykazujú enzýmy rodiny proteáz riadených ubiquitínom odvodené z rôznych druhov (od baktérií po ľudí) v skutočnosti žiadnu sekvenčnú podobnosť, zatiaľ čo F40F12.5 a kloň č. 10 vykazujú určitý stupeň homológie.

-68Príklad 9

Kloň č. 84: RAP-2 interagujúci proteín

Ďalší Rap-2 viažuci proteín sa identifikoval použitím úplného RAP-2 proteínu ako návnady v dvojhybridnom skríningu cDNA knižnice B-buniek a označil sa ako kloň č. 84.

Zistilo sa, že kloň č. 84 sa špecificky viaže na úplný RAP-2, zatiaľ čo nevykazuje žiadnu interakciu so žiadnym iným analyzovaným proteínom vrátane TRAF2, M0RT1, TRADD, RIP, NIK, TIP60 a lamínom. Zistilo sa, že čiastočná 5'sekvencia klonu č. 84 je zhodná so sekvenciou predtým klonovanej cDNA, ktorá kóduje bunkový rastový regulačný proteín CGR19, ktorý bol identifikovaný ako transkript špecificky nadregulovaný v bunkách nesúcich funkčný p53 proteín (Madden S. a ďalší 1996, prístupové č. U66469). Sekvenčná analýza CGR19 viedla k identifikácii motívu C₃HC₄-zinkového prsta (tiež označovaný ako RING prst) v jeho C-koncovej doméne. Zistilo sa, že expresia CGR19 potláča rast niekoľkých bunkových línií. Podieľanie sa GCR19 proteínu na NF-κΒ regulácii prostredníctvom väzby na RAP-2 mohlo indikovať možnú moduláciu regulačnej siete bunkového cyklu členmi TNF-R rodiny.

Príklad 10

Vzťah štruktúry a funkcie RAP-2

A. Väzobné oblasti

Použitím postupnej delečnej analýzy sa zmapovali väzobné oblasti vo vnútri RAP-2 a identifikovala sa väzba na RIP, NIK, TIP60, ako aj vzájomná asociáciá domény (domén) (obrázok 11).

Väzba na RIP bola zmapovaná do oblasti RAP-2 proteínu, ktorá začína medzi aminokyselinami 177 až 218 a končí na aminokyseline 264.

-69Zistilo sa, že ani ΙΚΚβ (aminokyseliny 95 až 264), ani NIK (aminokyseliny 1 až 264) väzobné miesta sa neprekrývajú s RIP väzobným miestom vo vnútri RAP-2 (obrázok 11).

Väzba na TIP60 bola jasne zmapovaná vo vnútri oblasti zahŕňajúcej aminokyseliny 95 až 264. Strata interakcie pri delécii fragmentu zahŕňajúceho aminokyseliny 95 až 309 by mohla byť najpravdepodobnejšie dôsledkom špecifickej obštrukčnej konformácie prislúchajúcej tejto konkrétnej delécii.

Podobnú nezrovnalosť vo väzbe na delečné fragmenty je možné pozorovať pre väzbu klonu č. 10 a pre spájanie RAP-2 samého so sebou. Avšak na rozdiel od TIP60, zo skutočnosti, že úplný RAP-2 sa viaže na delečný fragment zahŕňajúci aminokyseliny 218 až 416, ako aj na delečný fragment obsahujúci aminokyseliny 1 až 264, vyplýva, že oblasť podieľajúca sa na homodimerizácii je lokalizovaná medzi aminokyselinami 217 až 264.

Proteín kódovaný klonom č. 10, s vyššie uvedenou výnimkou, sa zjavne viaže vo vnútri oblasti začínajúcej medzi aminokyselinami 218 až 309 a končiacej aminokyselinou 416, takže toto väzobné miesto môže obsahovať prekrývajúce sa oblasti s väzobnými miestami pre RIP, NIK, ΙΚΚβ a TIP60 (obrázok 11).

B. Funkčné oblasti

Pokiaľ je nám v súčasnosti známe, všetky funkčné účinky RAP-2 (konkrétne NF-κΒ inhibícia a indukcia c-Jun hyperfosforylácie) sú zmapované do rovnakej oblasti (obrázok 11).

Navyše je možné, že oblasť postačujúca na účinnú moduláciu signalizácie všetkými induktormi použitým v týchto experimentoch je lokalizovaná na Nkoncovom segmente proteínu.

Oblasť zahŕňajúca aminokyseliny 95 až 416 mala účinok, hoci bol významne slabší v porovnaní s účinkom spôsobeným kompletným proteínom, takže môže byť výsledkom zosilnenej agragácie endogénneho RAP-2.

Navyše, s výnimkou RelA, účinok všetkých induktorov použitých v našich experimentoch, môže byť sprostredkovaný len približne 100 N-koncovými

-70aminokyselinami RAP-2. V skutočnosti aj fragment zahŕňajúci aminokyseliny 1 až 102 sprostredkúva odlišitefný účinok, hoci značne slabý (obrázok 12B).

Na druhej strane, úspešná indukcia RelA vyžaduje oveľa dlhšiu časť RAP-2 proteínu. Takže je možné definovať hranice tejto oblasti medzi aminokyseliny 1 a 264, pričom zjavne zahŕňa oblasť medzi aminokyselinami 157 a 264 s určitými špecifickými, RelA-asociovanými, väzobnými vlastnosťami.

C. Vzťah väzby a funkcie

Z výsledkov na obrázkoch 11 a 12 je zrejmé, že;

a) S výnimkou RelA, väzba RAP-2 na RIP, kloň č. 10 a najpravdepodobnejšie na NÍK a TIP60 nie je potrebná na funkciu proteínu ako inhibítora nadexpresiou indukovaného NF-kB.

b) Účinok RAP-2 na aktiváciu indukovanú nadexpresiou RelA je zvyčajne sprostredkovaný, aspoň čiastočne, rôznymi väzobnými udalosťami. V podstate sa môže zistiť, že všetky vyššie uvedené proteíny sa môžu podieľať na danej aktivite, ako sa dá dedukovať z doteraz uskutočnených experimentov.

Presné miesto interakcie medzi RAP-2 a RIP sa ešte musí determinovať, ale zdá sa, že toto miesto je špecifické pre RIP a RAP-2 a nie je obsiahnuté v iných proteínoch, o ktorých je známe, že interagujú s RIP, napr. MORT-1, TRADD, FAS-R a možno aj s TRAF2 (pozri Malinin a ďalší, 1997). Zistilo sa tiež (zo sekvenčnej analýzy a porovnania so sekvenciami v rôznych databázach, ako bolo uvedené vyššie), že RAP-2 nemá smrtiacu doménu, MORT modul, proteázovú doménu (napr. ICE/CED3 motív), kinázovú doménu/motív, ani TRAF domény. V súlade s tým, analýza biologickej aktivity odhalila aj to, že RAP-2 má zjavne nasledujúce charakteristiky;

(i) keď sa nadexprimuje, RAP-2 silno inhibuje NF-κΒ aktiváciu prostredníctvom TNF alebo nadexpresiou TRADD, RIP, TRAF-2, NIK alebo p65 NF-kB podjednotkou;

(ii) RAP-2 zvyšuje potenciál c-Jun hyperfosforylácie, bez toho, aby menil aktivitu JNK;

-71 (iii) RAP-2, ako bolo ukázané delečnou analýzou, nevyžaduje smrtiacu doménu RIP, ani kinázovú aktivitu RIP, na väzbu na RIP;

(iv) na základe vyššie uvedenej delečnej analýzy sa väzobná oblasť RAP-2 na RIP zúžila na N-koncovú oblasť približne 200 aminokyselín;

(v) RAP-2 sa viaže na NIK v transfekovaných cicavčích bunkách, ale nie v kvasinkách.

Vzhľadom na vyššie uvedené je preto zrejmé, že RAP-2 je vysoko špecifický RIP-viažuci proteín, a teda RIP modulátor/mediátor, ktorý sa pravdepodobne podieľa na RIP-sprostredkovaných vnútrobunkových signalizačných dráhach.

Vzhľadom na vyššie uvedené je zrejmé, že RAP-2 sa podieľa na modulácii/sprostredkovaní RIP aktivít. Vnútrobunkovo sú týmito RIP aktivitami RIP podiel v dráhe bunkového prežívania (NF-κΒ aktivácia, možno prostredníctvom interakcie s TRAF2) a jeho podiel v dráhach zápalu a bunkovej smrti (nezávisle prostredníctvom smrtiacej domény alebo interakcie s inými proteínmi ako MORT1, TRADD, p55-R, FAS-R a asociovanými proteázami ako MACH, Mch4, G1 a podobne). Možné spôsoby, ktorými môže RAP-2 modulovať/sprostredkovať RIP účinok sú podrobne uvedené vyššie. Napríklad RAP-2-RIP interakcia môže viesť k zosilneniu buď dráhy bunkovej smrti, alebo dráhy bunkového prežívania, pričom toto zosilnenie alebo inhibícia je možno závislá na relatívnych aktivitách iných členov týchto dvoch opačných vnútrobunkových dráh. RAP-2 môže účinkovať aj ako ukotvovací proteín, ktorý zabezpečuje agregáciu určitého počtu RIP molekúl alebo iných RIP- alebo RAP-2-viažucich proteínov, pričom tento agregát môže potom fungovať buď v smere bunkovej smrti, alebo bunkového prežívania (alebo aj v oboch smeroch) v závislosti na relatívnych aktivitách/množstvách iných členov týchto dráh v bunke.

Príklad 11

Príprava polyklonálnych protilátok voči RAP-2

-72Králikom sa najprv subkutánnou injekciou podalo 5 gg čistého prípravku RAP-2 emulzifikovaného v kompletnom Freudovom adjuvans. O tri týždne neskôr sa znova subkutánnou injekciou podalo 5 pg RAP-2 prípravku v nekompletnom Freundovom adjuvans. Dve ďalšie injekcie RAP-2 vo forme roztoku v PBS sa podali v 10 dňových intervaloch. 10 dní po poslednej imunizácii sa králikom odobrala krv. Vývoj hladiny protilátky sa sledoval rádioimunotestom. ¹²⁵l-značený RAP-2 sa zmiešal s rôznymi riedeniami (1:50, 1:500, 1:5000 a 1:50000) králičieho séra. V celkovom objeme 200 μΙ sa pridala suspenzia proteín-G agarózových guličiek (20 μΙ Pharmacia). Zmes sa nechala 1 hodinu pri laboratórnej teplote, a guličky sa potom premyli tri krát a snímala sa naviazaná rádioaktivita. Králičie antisérum voči ľudskému leptínu sa použilo ako negatívna kontrola. Titer RAP-2 antiséra sa meral v porovnaní s titrom negatívnej kontroly.

Príklad 12

Príprava monoklonálnych protilátok voči RAP-2

Samičkám Balb/C myší (3 mesačné) sa najprv injekčné podali 2 pg purifikovaného RAP-2 v emulzii kompletného Freundovho adjuvans a o tri týždne sa subkutánne podalo to isté množstvo v nekompletnom Freundovom adjuvans. Tri ďalšie injekcie sa podávali v 10 dňových intervaloch subkutánne v PBS. Konečné dávky sa podávali intraperitoneálne 4 a 3 dni pred fúziou myšiam, ktoré vykazovali najvyšší väzobný titer, ktorý bol stanovovaný prostredníctvom IRIA (pozri nižšie). Fúzia sa uskutočňovala použitím NSO/1 myelómovej bunkovej línie a lymfocytov pripravených tak zo sleziny, ako aj z lymfatických uzlín živočícha. Fúzované bunky sa distribuovali na mikrokultivačné platne a hybridómy sa selektovali v DMEM doplnenom s HAT a 15% koňským sérom. Hybridómy, o ktorých sa zistilo, že produkujú protilátky voči RAP-2, sa subklonovali limitujúcou riediacou metódou a injekciou sa zaviedli do Balb/C myší, ktorým bol vopred podaný pristán na produkciu ascitov. Izotypy protilátok boli definované použitím komerčne dostupného ELISA kitu (Amersham, UK).

-73Skríning hybridómov produkujúcich anti-RAP-2 monoklonálne protilátky sa uskutočňoval nasledovne: Supernatanty hybridómov sa testovali z hľadiska prítomnosti anti-RAP-2 protilátok obráteným rádioimunotestom na tuhej fáze (IRIA). Na ELISA platne (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) sa naniesol Talonpurifikovaný IL-18BPA-His₆ (10 pg/ml, 100 μΙ/jamku). Nasledovalo inkubovanie cez noc pri 4 °C, platne sa dva krát premyli s PBS s obsahom BSA (0,5%) a Tweenu 20 (0,05%) a blokovali sa v premývacom roztoku najmenej 2 hodiny pri 37 °C. Pridali sa supernatanty hybridómovej kultúry (100 μΙ/jamku) a platne sa inkubovali 4 hodiny pri 37 °C. Platne sa premyli 3 krát a pridal sa konjugát kozej anti-myšej chrenovej peroxidázy (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 μΙ/jamku) na 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Platne sa 4 krát premyli a prostredníctvom ABTS (kyseliny 2,2'-azinobis(3-etylbenztiazolín-6-sulfónovej, Sigma) sa vyvinula farba s H₂O₂ ako substrátom. Platne sa snímali automatickým ELISA snímačom. Vzorky, ktoré mali OD najmenej 5 krát vyššie ako hodnota negatívnej kontroly, boli považované za pozitívne.

RAP-2 protilátky môžu byť použité na purifikáciu RAP-2 afinitnou chromatografiou.

Príklad 13

ELISA test

Na mikrotitračné platne (Dynatech alebo Mxisorb od Nunc) sa naniesla antiRAP-2 monoklonálna protilátka (hybridómový supernatant bez séra alebo imunoglobulíny ascitickej kvapaliny) cez noc pri 4 °C. Platne sa premyli s PBS s obsahom BSA (0,5%) a Tweenu 20 (0,05%) a blokovali sa rovnakým roztokom najmenej 2 hodiny pri 37 °C. Testované vzorky sa riedili v blokovacom roztoku a pridali sa do jamiek (100 μΙ/jamku) na 4 hodiny pri 37 °C. Platne sa potom 3 krát premyli s PBS s obsahom Tweenu 20 (0,05%) a nasledovalo pridanie králičieho anti-RAP-2 séra (1:1000, 100 μΙ/jamku) a ďalšia inkubácia cez noc pri 4 °C. Platne sa 3 krát premyli a pridal sa konjugát kozej anti-králičej chrenovej peroxidázy (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 μΙ/jamku) na 2 hodiny pri laboratórnej teplote. Platne

-74sa 4 krát premyli a prostredníctvom ABTS (kyseliny 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolín-6-sulfónovej, Sigma) sa vyvinula farba s H₂O₂ ako substrátom. Platne sa snímali automatickým ELISA snímačom.

Po úplnom opise tohto vynálezu je pre priemerného odborníka v oblasti zrejmé, že to isté je možné uskutočniť v rámci širokého rozsahu ekvivalentných parametrov, koncentrácií a podmienok bez toho, aby sa prekročil rámec vynálezu a bez nadmerného experimentovania.

Hoci tento vynález bol opísaný v spojitosti s jeho konkrétnymi uskutočneniami, bude zrejmé, že sú možné ďalšie modifikácie. Úmyslom tejto prihlášky je pokryť akékoľvek varianty, použitia alebo adaptácie vo všeobecnosti sledujúce princípy vynálezu a to vrátane odbočení od predloženého opisu, ktoré spadajú do známej alebo zvyčajnej praxe oblasti, do ktorej patrí vynález, a ktoré môžu byť aplikované na základe znakov vyplývajúcich s pripojených nárokov.

Všetky tu citované publikácie, vrátane časopisových článkov alebo abstraktov, publikovaných alebo korešpondujúcich US alebo zahraničných prihlášok vynálezu, vydaných US alebo zahraničných patentov alebo akékoľvek iné citácie sú tu zahrnuté ako celok prostredníctvom ich spomenutia, vrátane všetkých údajov, tabuliek, obrázkov a textov, ktoré sú v nich prezentované. Navyše sú tu komplet zahrnuté obsahy citácií v uvedených publikáciách.

Odvolanie sa na známe spôsobové kroky, bežné spôsobové kroky, známe metódy alebo bežné metódy, nemá byť v žiadnom prípade brané ako skutočnosť, že nejaký aspekt, opis alebo uskutočnenie predloženého vynálezu bolo nárokované, opísané alebo navrhnuté v relevantnej oblasti.

Vyššie uvedený opis špecifických uskutočnení kompletne odhalí všeobecnú povahu vynálezu a pre priemerného odborníka v oblasti je možné aplikovaním znalostí z oblasti (zahŕňajúc obsah uvedených citácií) jednoducho modifikovať a/alebo adaptovať ho pre rôzne aplikácie konkrétnych uskutočnení, bez nadmerného experimentovania a bez vybočenia zo všeobecného konceptu podľa predloženého vynálezu. Preto sú takéto adaptácie a modifikácie považované za spadajúce do rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení na základe tu uvedeného opisu a návodu. Treba poznamenať, že tu uvedená frazeológia a

-75terminológia plní funkciu opisu a nie limitácie, takže terminológia a frazeológia predloženého opisu má byť interpretovaná priemerným odborníkom v oblasti vo vzťahu k tu uvedenému opisu a návodu, v kombinovaní so znalosťami priemerného odborníka v oblasti.

-76Literatúra

Alnemri, E.S. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:4312-4317

Barinaga, M. (1993) Science 262:1512-1514

Beg, A.A. a Baltimore, D. Science 274:782-784

Beidler, J. a ďalší, (1995) J. Biol. Chem. 270:16526-16528

Berger, J. a ďalší, (1988) Gene 66:1-10

Beutler, B. a Cerami, C. (1987) NEJM: 316:379-385

Bigda, J. a ďalší (1994) J. Exp. Med. 180:445-460

Boldin, M.P. a ďalší (1995a) J. Biol. Chem. 270:337-341

Boldin, M.P. a ďalší (1995b) J. Biol. Chem. 270:7795-7798

Boldin, M.P. a ďalší (1996) Celí 85:803-815

Brakebusch, C. a ďalší (1992) EMBO J., 11:943-950

Brockhaus, M a ďalší (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3127-3131 Cantor, G.H. a ďalší (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10932-6 Cerreti, D.P. a ďalší (1992) Science 256:97-100

Chen, C.J. a ďalší (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:271-3

Chinnaiyan a ďalší (1995) Celí 81:505-512

Chinnaiyan a ďalší (1996) J. Biol. Chem. 271:4961-4965

Cifone, M.G. a ďalší (1995) EMBO J. 14:5859-5868

Clement, M.V. a ďalší (1994) J. Exp. Med. 180:557-567

Crisell, P. a ďalší (1993) Nucleic Acids Res. (Anglicko) 21 (22):5251-5

Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M. & Warki, A., vyd.) (1994) str. 8.1.1-8.1.6 a 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc a Wiley & Sons, Inc., New York

Dirks, W., a ďalší, (1993) Gene 128:247-249

Durfee T a ďalší, Genes Dev 1993; 7:555-569

Eischen, C.M. a ďalší (1994) J. Immunol. 153:1947-1954

Ellis, H.M. a ďalší (1986) Celí 44:817-829

Enari, M. a ďalší (1995) Náture 375:78-81

-77 Engelmann, H. a ďalší (1990) J. Biol. Chem., 265:1531-1536

Faucheu, C. a ďalší (1995) EMBO J. 14:1914-1922

Femandes-Alnemri T a ďalší, (1994) J. Biol. Chem. 269:30761-30764 Femandes-Alnemri T a ďalší, (1995) Cancer Res. 55:2737-2742 Femandes-Alnemri T a ďalší, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7464-7469 Field, J. a ďalší (1988) Mol. Celí Biol. 8:2159-2165 Fields, S. a Song, O. (1989) Náture, 340:245-246

Frangioni, J.V. a Neel, B.G. (1993) Anál. Biochem. 210:179-187

Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6:364-369

Geysen, H.M. a ďalší (1987) J. Immunol. Meth. 102:259-274

Gossen, M. a Boujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551

Grell, M. a ďalší (1994) Eur. J. Immunol. 24:2563-2566

Heller, R.A. a ďalší (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6151-6155

Henkart, P.A. (1996) Immunity 4:195-201

Hohmann, H.P. a ďalší (1989) J. Biol. Chem., 264:14927-14934

Howard, A.D. a ďalší (1991) J. Immunol. 147:2964-2969

Hsu, H. a ďalší (1995) Celí 81:495-504

Hsu, H. a ďalší (1996) Celí 84:299-308

Itoh, N. a ďalší (1991) Celí 66:233

Itoh, N. a Nagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268:10932-7

Joseph, S. a Búrke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 268:24515-8

Kamens, J. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:15250-15256

Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49:5870-5878

Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 53:3976-3985

Kischkel F.C. a ďalší (1995) EMBO J. 14:5579-5588

Koizumi, M. a ďalší (1993) Biol. Pharm. Bull (Japonsko) 16(9):879-83

Kumar, S. a ďalší (1994) Genes Dev. 8:1613-1626

Kumar, S. (1995) Trends Biochem Sci. 20:198-202

Lazebnik, Y.A. a ďalší (1994) Náture 371:346-347

Leithauser, F. a ďalší (1993) Lab Invest. 69:415-429

Li, Y. a ďalší (1998) Mol Celí Biol 18:1601-1610

-78Loetscher, H. a ďalší (1990) Celí, 61:351-359

Los, M. a ďalší (1995) Náture 375:81-83

Madden, S.L. a ďalší (1996) Cancer Res 56:5384-5390

Malinin, N.L. a ďalší (1997) Náture 385:540-544

Martin, S.J. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:6425-6428

Mashima, T. a ďalší (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:907-915

Miller, B.E. a ďalší (1995) J. Immunol. 154:1331-1338

Milligan, C.E. a ďalší (1995) Neurón 15:385-393

Miura, M. a ďalší (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8318-8322

Munday, N.A. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:15870-15876

Muranishi, S. a ďalší (1991) Pharm. Research 8:649

Musti AM, a ďalší (1997) Science 1997 275:400-402

Nagata S. a Golstein, P. (1995) Science 267, 1449-1456

Natoli, G. a ďalší (1997) J. Biol. Chem. 272, 26079-26082

Nicholson, D.W. a ďalší (1995) Náture 376:37-43

Nophar, Y. a ďalší (1990) EMBO J., 9:3269-3278

Piquet, P.F. a ďalší (1987) J. Exp. Med., 166:1280-89

Ray a ďalší (1992) Celí 69:597-604

Ruggiero, V. a ďalší (1987) Celí Immunol. 107:317-325

Sambrook a ďalší (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

Schall, T.J. a ďalší (1990) Celí, 61:361-370

Schlegel a ďalší (1996) J. Biol. Chem. 271:1841-1844

Schulze-Osthoff, K. a ďalší (1994) EMBO J. 13:4587-4596

Shimayama, T. a ďalší (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29:177-8

Shore, S.K. a ďalší (1993) Oncogene 8:3183-8

Sleath, P.R. a ďalší (1990) J. Biol. Chem. 265:14526-14528

Smith, C.A. a ďalší (1990) Science, 248:1019-1023

Song, H.Y. a ďalší (1994) J. Biol. Chem. 269:22492-22495

Srinivasula, S.M. a ďalší (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14486-14491

Stanger, B.Z. a ďalší (1995) Celí 81:513-523

-79Tartaglia, L.A. a ďalší (1993) Celí, 74:845-853

Tewari, M. a ďalší (1995) J. Biol. Chem. 270:3255-3260

Tewari, M. a ďalší (1995a) J. Biol. Chem. 270:18738-18741

Tewari, M. a ďalší (1995b) Celí 81:1-20

Thornberry N.A. a ďalší (1992) Náture 356:768-774

Thornberry N.A. a ďalší (1994) Biochemistry 33:3934-3940

Tracey, J.T. a ďalší (1987) Náture, 330:662-664

Van Antwerp, D.J. a ďalší (1996) Science 274:787-789

Vandenabeele, P. a ďalší (1995) Trends Celí Biol. 5:392-400

Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10:411-452

Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132:2464-9

Wallach, D. (1986) v: Interferon 7 (Ion Gresser, vyd.) str. 83-122, Academic Press, London

Wallach, D. a ďalší (1994) Cytokine 6:556

Wäng, L. a ďalší (1994) Celí 78:739-750

Wang, C.-Y. a ďalší (1996) Science 274:784-787

Watanabe-Fukunaga, R. a ďalší (1992) Náture, 356:314-317

Watanabe, F.R. a ďalší (1992) J. Immunol. 148:1274-1279

Weitzen, M. a ďalší (1980) J. Immunol. 125:719-724

Wilks, A.F. a ďalší (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1603-1607

Wong a ďalší (1994) J. Immunol. 152:1751-1755

Xue, D. a ďalší (1995) Náture 377:248-251

Yamaoka S. a ďalší (1998) Celí 93:1231-1240

Yonehara, S. a ďalší (1989) J. Exp. Med. 169:1747-1756

Yuan, J. a ďalší (1993) Celí 75:641-652

Zaccharia, S. a ďalší (1991) Eur. J. Pharmacol. 203:353-357

Zhao, J.J. a Pick, L. (1993) Náture (Anglicko) 365:448-51

-80Zoznam sekvencii <100> WALLACH, Dávid KOVALENKO, Andrei Yeda Research and Development Co. Ltd.

<120> Modulátory funkcie receptorov TNF/NGF receptorovej rodiny a iné proteíny <130> TNF/NGF receptory <140>

<141>

<150> 123758 <151 > 1998-09-01 <160>3 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211 >2009 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaagattcca ttgtgggcct gsgaggccta gcaagggcgg accgcgaaac tgggaetttt 60 ttcggagcgc cggggcccta ccagcgttca cagtccgccg ctcccaccct tctcacgtct 120 gacggactct gctgacagcc cttgccctgt tggatgaata ggcacctctg gaagagccaa 180 ctgtgtgaga tggtgcagcc cagtggtggc ccggcagcag atcaggacgt actgggcgaa 240 gagtctcctc tggggaagcc agccatgctg cacctgcctt cagaacaggg cgctcctgag 300 accctccagc gctgcctgga ggagaatcaa gagctccgag atgccatccg gcagagcaac 360

-81 cagattctgc gggagcgctg cgaggagctt ctgcatttcc aagccagcca gagggaggag 420 aaggagttcc tcatgtgcaa gttccaggag gccaggaaac tggtggagag actcggcctg 480 gagaagctcg atctgaagag gcagaaggag caggctctgc gggaggtgga gcacctgaag 540 agatgccagc agcagatggc tgaggacaag gcctctgtga aagcccaggt gacgtccttg 600 ctcggggagc tgcaggagag ccagagtcgc ttggaggctg ccactaagga atgccaggct 660 ctggagggtc gggcccgggc ggccagcgag caggcgcggc agctggagag tgagcgcgag 720 gcgctgcagc agcagcacag cgtgcaggtg gaccagctgc gcatgcaggg ccagagcgtg 780 gaggccgcgc tccgcatgga gcgccaggcc gcctcggagg agaagaggaa gctggcccag 840 ttgcaggtgg cctatcacca gctcttccaa gaatacgaca accacatcaa gagcagcgtg 900 gtgggcagtg agcggaagcg aggaatgcag ctggaagatc tcaaacagca gctccagcag 960 gccgaggagg ccctggtggc caaacaggag gtgatcgata agctgaagga ggaggccgag 1020 cagcacaaga ttgtgatgga gaccgttccg gtgctgaagg cccaggcgga tatctacaag 1080 gcggacttce aggctgagag gcaggcccgg gagaagctgg ccgagaagaa ggagctcctg 1140 caggagcagc tggagcagct gcagagggag tacagcaaac tgaaggccag ctgtcaggag 1200 tcggccagga tcgaggacat gaggaagcgg catgtcgagg tctcccaggc ccccttgccc 1260 cccgcccctg cctacctctc ctctcccctg gccctgccca gccagaggag gagccccccc 1320 gaggagccac ctgacttctg ctgtcccaag tgccagtatc aggcccctga tatggacacc 1380 ctgcagatac atgtcatgga gtgcattgag tagggccggc cagtgcaagg ccactgcctg 1440 ccgaggacgt gcccgggacc gtgcagtctg cgctttcctc tcccgcctgc ctagcccagg 1500 atgaagggct gggtggccac aactgggatg ccacctggag ccccacccag gagctggccg 1560 cggcacctta cgcttcagct gttgattccg ctggtcccct cttttggggt agatgcggcc 1620 ccgatcaggc ctgactcgct gctctttttg ttcccttctg tctgctcgaa ccacttgcct 1680 cgggctaatc cctccctctt cctccacccg gcactgggga agtcaagaat ggggcctggg 1740 gctctcaggg agaactgctt cccctggcag agctgggtgg cagctcttcc tcccaccgga 1800 caccgacccg cccgctgctg tgccctggga gtgctgccct cttaccatgc acacgggtgc 1860 tetccttttg ggctgcatgc tattccattt tgcagccaga ccgatgtgta tttaaccagt 1920 cactattgat ggacatttgg gttgtttccc atctttttgt taccatmaat artggcmtag 1980 akaaaaatcc ttgtgcatta aaaaaaaaa 2009 <210>2 <211 >2034 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttctactcct eectcctcct cactgcgggg tctgacccta ctccttgtgt gaggactcct 60 ctagttcaga gacatattct gttcaccaaa cttgactgcg ctctatcgag gtcgttaaat 120 tcttcggaaa tgcctcacat atagtttggc agctagccct tgccctgttg gatgaatagg 180 cacctctgga agagccaact gtgtgagatg gtgcagccca gtggtggcce ggcagcagat 240 caggacgtac tgggcgaaga gtctcctctg gggaagccag ecatgctgca cctgccttca 300 gaacagggcg ctcctgagac cctccagcgc tgcctgggag gagaatcaag agctccgaga 360 tgccatccgg cagtagcaac cagattcttg cgggagctgc cgaagggagc tttctgcatt 420 ttccaagcca gccagaggga ggagaaggag ttcctcatgt gcaagttcca ggaggccagg 480 aaactggtgg agagactcgg cctggagaag ctcgatctga agaggcagaa ggagcaggct 540 ctgcgggagg tggagcacct gaagagatgc cagcagcaga tggctgagga caaggcctct 600 gtgaaagccc aggtgacgtc cttgctcggg gagctgcagg agagccagag tcgcttggag 660 gctgccacta aggaatgcca ggctctggag ggtcgggccc gggcggccag cgagcaggcg 720 cggcagctgg agagtgagcg cgaggcgctg cagcagcagc acagcgtgca ggtggaccag 780 ctgcgcatgc agggccagag cgtggaggcc gcgctccgca tggagcgcca ggccgcctcg 840 gaggagaaga ggaagctggc ccagttgcag gtggcctatc accagctctt ccaagaatac 900 gacaaccaca tcaagagcag cgtggtgggc agtgagcgga agcgaggaat gcagctggaa 960

-82gatctcaaac agcagctcca gcaggccgag gaggccctgg tggccaaaca ggaggtgatc 1020 gataagctga aggaggaggc cgagcagcac aagattgtga tggagaccgt tccggtgctg 1080 aaggcccagg cggatatcta caaggcggac ttccaggctg agaggcaggc ccgggagaag 1140 ctggccgaga agaaggagct cctgcaggag cagctggagc agctgcagag ggagtacagc 1200 aaactgaagg ccagctgtca ggagtcggcc aggatcgagg acatgaggaa gcggcatgtc 1260 gaggtctccc aggcccectt gccccccgcc cctgcctacc tctcctctcc cctggccctg 1320 cccagccaga ggaggagccc ccccgaggag ccacctgact tctgctgtcc caagtgccag 1380 tatcaggccc ctgatatgga caccctgcag atacatgtca tggagtgcat tgagtagggc 1440 cggccagtgc aaggccactg cctgccgagg acgtgcccgg gaccgtgcag tctgcgcttt 1500 cctctcccgc ctgcctagcc caggatgaag ggctgggtgg ccacaactgg gatgccacct 1560 ggagccccac ccaggagctg gccgcggcac cttacgcttc agctgttgat tccgctggtc 1620 ccctcttttg gggtagatge ggccccgatc aggcctgact cgctgctctt tttgttccct 1680 tctgtctgct cgaaccactt gcctcgggct aatcectcee tcttcctcca cccggcactg 1740 gggaagtcaa gaatggggcc tggggctctc agggagaact gcttcccctg gcagagctgg 1800 gtggcagctc ttcctcccac cggacaccga cccgcccgct gctgtgccct gggagtgctg 1860 ccctcttacc atgcacacgg gtgctctcct tttgggetgc atgetattcc attttgcagc 1920 cagaccgatg tgtatttaac cagtcactat tgatggacat ttgggttgtt tcccatcttt 1980 ttgttaccat maatartggc mtagakaaaa atccttgtgc attaaaaaaa aaaa 2034 <210>3 <211> 2116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>3 gccacgaagg cccagacttt gaccgttctt caccaccact ccagcctcct cctgtgaact 60 cactgaccac cgagaacaga ttccactctt taccattcag tctcaccaag atgcccaata 120 ccaatggaag tattggccac agtccacttt ctctgtcagc ccagtctgta atggaagagc 180 taaacactgc acccgtccaa gagagtccac ccttggccat gcctcctggg aactcacatg 240 gtctagaagt gggctcattg gctgaagtta aggagaaccc tcctttctat ggggtaatcc 300 gttggatcgg tcagccacca ggactgaatg aagtgctcgc tggactggaa ctggaagatg 360 agtgtgcagg ctgtacggat ggaaccttca gaggcactcg gtatttcacc tgtgccctga 420 agaaggcgct gtttgtgaaa ctgaagagct gcaggcctga ctctaggttt gcatcattgc 480 agccggtttc caatcaagat tgagcgctgt aactctttag catttggagg ctacttaagt 540 gaagtagtga agaaaatact ccaccaaaaa tggaaaaaga argcttggag ataatgattg 600 gggaaagaag aaaggcatcc aagggtcatt acaattcttg ktacttagac tcaaccttat 660 tctkgcttat ttkgctttta gttctgttct nggacactgg tgttacttta gaccccaaag 720 aaaaagaaac gatgttagaa tattwtwkwg mmacccaaga gctactgagg acagaaattg 780 ttaatcctct gagaatatat ggatatgtgt gtgccacaaa aattatgaaa ctgaggaaaa 840 tacttgaaaa ggtggaggct gcatcaggat ttacctctga agaaaaagat cctgaggaat 900 tcttgaatat tctgtttcat catattttaa gggtagaacc tttgctaaaa ataagatcag 960 caggtcaaaa ggtacaagat tgttacttct atcaaatttt tatggaaaaa aatgagaaag 1020 ttggcgttcc cacaattcag cagttgttag aatggtcttt tatcaacagt aacctgaaat 1080 ttgcagaggc accatcatgt ctgattattc agatgcctcg atttggaaaa gactttaaac 1140 tatttaaaaa atttttcctt ctctggaatt agatataaca gatttacttg aagacacccc 1200 agacagtgcc ggatatgtgg agggcttgca atgtatgagt gtaagaatgc tacgacgatc 1260 cggacaccag ctggaaaaac aagcagtttt gtaaaacctg caacactcaa gtccaccttc 1320 atccgaagag gctgaatcat aaatataacc cagtgtcact tcccaaagac ttaccccgac 1380 tgggagattg gagacacggc tgcatccctt gccagaatat ggagttattt gctgttctct 1440 gcatagaaac aagccactat gttgcttttg tgaagtatgg gaaggacgat tctgcctggc 1500

-83tcttctttgg acagcatggc cgatccggga tggtggtcag aatggctcaa cattccccca 1560 agtcmcccmt gscccagaag taggagagta cttggaagat gtctcctgga agaccctgsa 1620 wtyccttgga ctcccaggag aatcccaagg ctgtgcacga agactgcttt gtgatgccat 1680 atatgtgcca tgtacccaga gtccaacaat gagtttgtac aaataactgg gggtcatcgg 1740 gaaaggcaaa gaaactggaa ggcagagtcc ctaacgttgc atcttattcg gagctggcag 1800 ttctgttcac ggtccattgc cggcaatgga tgtctttgtg gtgatgatcc ttcagaaaag 1860 gatgcctctg tttaaaaaca aattgctttt gtgtccctga agtatttaat aagaagcatt 1920 ttgcactcta gaaagtatgt ttgtgttggt tttttaagaa gtctaaatga agttattaat 1980 acctgaagct ttaagttaag tgcattgatc atatgatatt tttggaagca tacaatttta 2040 attgtggaag tttaaagcct cttttagtcc attgagaatg taaataaatg tgtcttcttt 2100 atggaaaaaa aaaaaa 2116

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. DNA sekvencia, ktorá kóduje RIP-asociovaný protein - RAP-2, jeho izoformy, fragmenty alebo analógy, pričom RAP-2, jeho izoformy, fragmenty alebo analógy sú schopné viazať sa na RIP.
2. 2. DNA sekvencia podľa nároku 1, ktorá kóduje RAP-2, jeho izoformy, fragmenty alebo analógy, schopné modulovať alebo sprostredkovať vnútrobunkový účinok RIP.
3. 3. DNA sekvencia podľa nároku 1 alebo 2, ktorá je vybraná zo skupiny zahŕňajúcej:

   (a) cDNA sekvenciu odvodenú z kódujúcej oblasti prirodzeného RAP-2 proteínu;

   (b) DNA sekvencie schopné hybridizovať so sekvenciou podľa bodu (a) za stredne prísnych podmienok, a ktoré kódujú biologicky aktívny RAP-2 protein; a (c) DNA sekvencie, ktoré sú degenerované voči DNA sekvenciám definovaným v bode (a) a (b) ako dôsledok štruktúry genetického kódu, a ktoré kódujú biologicky účinný RAP-2 protein.
4. 4. DNA sekvencia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorá zahŕňa sekvenciu znázornenú na obrázku 1.
5. 5. DNA sekvencia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorá zahŕňa sekvenciu znázornenú na obrázku 2.
6. 6. DNA sekvencia podľa nároku 4 alebo 5, kódujúca RAP-2 protein, jeho izoformu, analóg alebo fragment, ktorá obsahuje aspoň časť sekvencie znázornenej na obrázku 3.

   -857. Replikovateľné expresné vehikulum, ktoré obsahuje DNA sekvenciu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, ktorá je voliteľne operačne spojená s riadiacimi sekvenciami, promótormi alebo inými DNA sekvenciami umožňujúcimi expresiu v správnej orientácii.
7. 8. Replikovateľné expresné vehikulum podľa nároku 7, ktoré je schopné byť exprimované v eukaryotickej hostiteľskej bunke.
8. 9. Replikovateľné expresné vehikulum podľa nároku 7, ktoré je schopné byť exprimované v prokaryotickej hostiteľskej bunke.
9. 10. Transformované eukaryotické alebo prokaryotické hostiteľské bunky, ktoré obsahujú replikovateľné expresné vehikulum podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 9.
10. 11. RAP-2 proteín, jeho izoforma, fragment, funkčné analógy alebo deriváty, ktoré sú kódované DNA sekvenciou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, pričom proteín, jeho izoforma, fragment, analógy a deriváty sú schopné viazať sa na RIP.
11. 12. RAP-2 proteín podľa nároku 11, ktorý je schopný modulovať alebo sprostredkovať vnútrobunkový účinok RIP v dráhach zápalu, bunkového prežívania alebo bunkovej smrti, na ktorých sa RIP zúčastňuje priamo alebo nepriamo prostredníctvom spojenia s inými vnútrobunkovými modulátormi alebo mediátormi týchto dráh.
12. 13. RAP-2 proteín, jeho izoforma, fragment, analógy a deriváty podľa nároku 11, pričom tento proteín, jeho izoforma, analógy, fragmenty a deriváty obsahujú aspoň časť aminokyselinovej sekvencie znázornenej na obrázku 3.
13. 14. Spôsob výroby RAP-2 proteínu, jeho izoformy, fragmentu, analógov alebo derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúci sa

    -86t ý m, že zahŕňa rast transformovanej hostiteľskej bunky podľa nároku 9 v podmienkach vhodných na expresiu uvedeného proteínu, izoformy, analógu, fragmentu alebo derivátu, uskutočnenie post-translačných modifikácii nevyhnutných na získanie uvedeného proteínu, fragmentov, analógov alebo derivátov a izoláciu exprimovaného proteínu, fragmentov, analógov alebo derivátov.
14. 15. Protilátky alebo ich aktívne fragmenty alebo deriváty špecifické voči RAP2 proteínu, izoforme, fragmentu, analógu alebo derivátu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13.
15. 16. Spôsob modulácie alebo sprostredkovania RIP modulovaných/sprostredkovaných vnútrobunkových účinkov v dráhach zápalu, bunkovej smrti alebo bunkového prežívania, na ktorých sa RIP podieľa priamo, alebo nepriamo prostredníctvom iných modulátorov/mediátorov týchto dráh, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými RAP-2 proteínmi, izoformami, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktoré sú schopné viazať sa na RIP, a modulovať alebo sprostredkovať vnútrobunkový účinok RIP, pričom uvedené ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo viacerých uvedených proteínov, izoforiem, analógov, fragementov alebo derivátov do buniek vo forme vhodnej na ich vnútrobunkové zavedenie, alebo zavedenie DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero uvedených proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu sekvencie do buniek spôsobom, ktorým sa sekvencia exprimuje v bunkách.
16. 17. Spôsob modulácie RIP modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že ošetrovanie buniek zahŕňa zavedenie DNA sekvencie kódujúcej RAP-2 protein, izoformy, analógy, fragmenty alebo deriváty do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu sekvencie do buniek spôsobom, ktorým sa sekvencia exprimuje v bunkách.

    -8718. Spôsob podľa nároku 16 alebo 17, vyznačujúci sa tým, že ošetrením buniek je transfekcia buniek rekombinantným živočíšnym vírusovým vektorom, a zahŕňa nasledujúce kroky:

    (a) konštrukciu rekombinantného živočíšneho vírusového vektora, ktorý nesie sekvenciu kódujúcu vírusový povrchový protein - ligand, schopný viazať sa na špecifický bunkový povrchový receptor na povrchu buniek, ktoré sa majú ošetriť, a druhú sekvenciu kódujúcu protein vybraný z RAP-2 proteínu, izoforiem, analógov, fragmentov a derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktorý keď sa exprimuje v bunkách, je schopný modulovať/sprostredkovať účinok RIP; a (b) infikovanie buniek vektorom podľa bodu (a).
17. 19. Spôsob modulácie RIP modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek protilátkami alebo ich účinnými fragmentárni alebo derivátmi podľa nároku 15, pričom ošetrenie sa uskutočňuje aplikáciou vhodného prostriedku obsahujúceho protilátky, ich účinné fragmenty alebo deriváty, pričom keď sa RAP-2 protein alebo jeho časť nachádza na vonkajšom bunkovom povrchu, prostriedok je formulovaný na extracelulárne podanie, a keď sú RAP-2 proteíny vnútrobunkové, prostriedok je formulovaný na vnútrobunkové podanie.
18. 20. Spôsob modulácie RIP modulovaného/sprostredkovaného účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek oligonukleotidovou sekvenciou, ktorá kóduje antisense sekvenciu voči aspoň časti DNA sekvencie kódujúcej RAP-2 protein podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, pričom oligonukleotidová sekvencia je schopná blokovať expresiu RAP-2 proteínu.
19. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotidová sekvencia sa zavádza do buniek prostredníctvom vírusu podľa nároku 18, pričom druhá sekvencia vírusu kóduje uvedenú oligonukleotidovú sekvenciu.

    -8822. Spôsob ošetrovania nádorových buniek alebo HlV-infikovaných buniek alebo iných chorých buniek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    (a) konštrukciu rekombinatného živočíšneho vírusového vektora nesúceho sekvenciu, ktorá kóduje vírusový povrchový proteín schopný viazať sa na špecifický nádorový bunkový povrchový receptor alebo povrchový receptor HlV-infikovanej bunky alebo receptor nesený inými chorými bunkami, a sekvenciu kódujúcu proteín vybraný z RAP-2 proteínu, izoformy, analógov, fragmentov a derivátov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktorý keď sa exprimuje v nádorovej, HlVinfikovanej alebo inej chorej bunke, je schopný zosilniť RIP modulované/sprostredkované priame alebo nepriame usmrtenie bunky; a (b) infikovanie nádorovej alebo HlV-infikovanej bunky alebo iných chorých buniek vektorom podľa bodu (a).
20. 23. Spôsob modulovania RIP účinku na bunky, v y z n a č u j ú c i sa tým, že zahŕňa použitie ribozýmovej procedúry, v ktorej je vektor kódujúci ribozýmovú sekvenciu, ktorá je schopná interagovať s bunkovou mRNA sekvenciou kódujúcou RAP-2 proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, zavedený do buniek vo forme umožňujúcej expresiu ribozýmovej sekvencie v bunkách, pričom, keď sa ribozýmová sekvencia exprimuje v bunkách, interaguje s bunkovou mRNA sekvenciou a štiepi tuto mRNA sekvenciu, čoho výsledkom je inhibícia expresie RAP-2 proteínu v bunkách.
21. 24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 23, vyznačujúci sa tým, že proteín je najmenej jedným proteínom z RAP-2 izoforiem, ich analógov, fragmentov a derivátov.
22. 25. Farmaceutický prostriedok na moduláciu RIP účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú zložku obsahuje najmenej jeden RAP2 proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, jeho biologicky účinné fragmenty, analógy, deriváty alebo ich zmesi.

    -8926. Farmaceutický prostriedok na moduláciu RIP účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú zložku obsahuje rekombinantný živočíšny vírusový vektor kódujúci proteín, ktorý je schopný viazať sa na bunkový povrchový receptor, a kódujúci najmenej jeden RAP-2 proteín, izoformu, účinný fragment alebo analóg podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13.
23. 27. Farmaceutický prostriedok na moduláciu RIP účinku na bunky, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú zložku obsahuje oligonukleotidovú sekvenciu kódujúcu anti-sense sekvenciu voči RAP-2 proteínovej DNA sekvencií podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.
24. 28. Spôsob modulovania spôsobov priamo alebo nepriamo modulovaných/sprostredkovaných RIP, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými RAP-2 proteínmi, izoformami, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktoré sú schopné viazať sa na RIP, pričom ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo viacerých proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodnej na ich vnútrobunkové zavedenie alebo, zavedenie DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero uvedených proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu sekvencie do buniek spôsobom, ktorým sa sekvencia exprimuje v bunkách.
25. 29. Spôsob modulovania spôsobov priamo alebo nepriamo modulovaných/sprostredkovaných RIP, a ktoré zahŕňajú inhibíciu NF-κΒ a aktiváciu JNK a p38 kinázy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými RAP-2 proteínmi, izoformami, analógmi, fragmentárni alebo derivátmi podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, pričom ošetrenie buniek zahŕňa zavedenie jedného alebo viacerých proteínov, izoforiem, analógov, fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodnej na ich vnútrobunkové zavedenie alebo, zavedenie DNA sekvencie kódujúcej jeden alebo viacero uvedených proteínov, izoforiem, analógov,

    -90fragmentov alebo derivátov do buniek vo forme vhodného vektora nesúceho uvedenú sekvenciu, pričom tento vektor je schopný uskutočniť inzerciu sekvencie do buniek spôsobom, ktorým sa sekvencia exprimuje v bunkách.
26. 30. Fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, ktorým je peptid.
27. 31. DNA sekvencia kódujúca RAP-2 viažuci proteín, jeho izoformy, fragmenty alebo analógy, pričom RAP-2 viažuci proteín, izoformy, fragmenty alebo analógy sú schopné viazať sa na RAP-2.
28. 32. DNA sekvencia podľa nároku 32, ktorá kóduje proteín schopný modulovať/sprostredkovať RAP-2 funkciu.
29. 33. DNA sekvencia podľa nároku 32 alebo 33, ktorá zahŕňa sekvenciu znázornenú na obrázku 10.
30. 34. RAP-2 viažuci proteín, ktorý je schopný viazať sa na RAP-2 a/alebo modulovať/sprostredkovať funkciu RAP-2.
31. 35. Spôsob izolácie a identifikácie proteínov, ktoré sú schopné viazať RAP-2, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa použitie kvasinkového dvojhybridného postupu, v ktorom je sekvencia kódujúca RAP-2 nesená jedným hybridným vektorom a sekvencia z cDNA alebo genomickej DNA knižnice je nesená druhým hybridným vektorom, pričom vektory sa potom použijú na transformáciu kvasinkových hostiteľských buniek a pozitívne transformované bunky sa izolujú, nasleduje extrakcia druhého hybridného vektora na získanie sekvencie kódujúcej proteín, ktorý sa viaže na RAP-2.
32. 36. RAP-2 viažuci proteín, ktorý je kódovaný klonom č. 10.

    -91
33. 37. Spôsob modulovania/sprostredkovania funkcie RAP-2, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa ošetrenie buniek jedným alebo viacerými RAP-2 viažucimi proteínmi.
34. 38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že RAP-2 viažuce proteíny sú vybrané z proteínov kódovaných klonom č. 10 a CGR19.