SK284672B6 - Spôsob konverzie dusíka - Google Patents

Abstract

Spôsob konverzie dusíka primárnej aminoskupiny alfa, beta- alebo alfa, gama-hydroxyprimárneho amínu na dusík mononenasýtenej dusík obsahujúcej heterocyklickej zlúčeniny majúcej 5 až 6 atómov v kruhu, pri ktorom sa postupne a) spracuje uvedený hydroxyamín s prebytkom halogénaldehydu majúceho aldehydový uhlík, halogén nesúci uhlík a majúceho 2 až 3 skupiny medzi aldehydovým uhlíkom a halogén nesúcim uhlíkom vybrané zo skupín CH2, CH2CH2 a OCH2, b) pridá sa prebytok, vo vzťahu k hydroxyamínu, organickej bázy, c) táto báza sa neutralizuje slabou kyselinou, a d) nasleduje spracovanie zriedenou vodnou kyselinou.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu konverzie dusíka primárnej aminoskupiny alfa, beta- alebo alfa, gama-hydroxyprimárneho amínu na dusík mononcnasýtencj dusík obsahujúcej heterocyklickej zlúčeniny majúcej 5 až 6 atómov v kruhu. Táto konverzia sa môže používať na prípravu cielených protirakovinových derivátov. Zvlášť sa týka doxorubicínu (DOX) alebo jeho daunosamínových modifikovaných derivátov (DM-DOX) viazaných kovalentne na analógie peptidových hormónov, ako je LH-RH, bombezín a samostatín. Tieto kovalentné konjugáty sú cielené na rôzne nádory nesúce receptory pre peptidové hormónové analógie.

Doterajší stav techniky

LH-RH analógie, ktoré majú cytotoxické skupiny v šiestej polohe, sú uvedené v Schally, Janaky a Bajusz, EP 0 450 461 BI, publikovaná6. septembra 1995.

GnRH (LH-RH) analógie na ničenie gonadotropov sú opísané v Nett a Glode, WO 90/09799, publikovanej 7. septembra 1990. Táto prihláška opisuje toxíny, ako je ricín, viazané na analógie LH-RH na ničenie gonadotropov, a tak liečenie rakovín závislých od pohlavných hormónov. LH-RH doxorubicínový derivát je taktiež spomenutý bez špecifikácie chemickej väzby.

Cytotoxické somatostatínové analógie sú opísané Schallym a kol. v US patentovej prihláške prihlásenej 6. apríla 1990 a znova prihlásenej 15. júla 1993 pod poradovým číslom 08/076846.

Prehľad od A. V. Schallyho v Anti-Cancer Drugs 5, 115 až 130 (1994) uvádza detaily o prítomnosti receptorov na bunkových membránach širokej škály nádorov pre analógie LH-RH, bombezín alebo somatostatín.

G. Weckbecker zhŕňa niekoľko referencií, ktoré ukazujú prítomnosť receptorov a receptoravých subtípov pre somatostatínové analógie na niekoľkých normálnych a nádorových tkanivách v jeho prehľade vo Farmac. Ther. 60, 245 - 264(1993).

Bombezínovité peptidy a prítomnosť bombezin/GRP receptorov na rôznych normálnych a nádorových tkanivách sú uvedené v prehľade od N. Bunnetta v Gut Peptides: Biochemistry a Physiology, 423 - 445 (1994) Ed.: J. Walsh a

G. J. Dockray, Raven Press, New York a od E. Spindella v Recent Progress in Hormone Research, 48 (1993) (Academic Press).

Doxorubicín (DOX) je v súčasnosti najrozšírenejšie používaným a veľmi potentným protirakovinovým prostriedkom. Ale určité nádory naň nereagujú vôbec a jeho použitie je taktiež obmedzené multidrogovou rezistenciou (MDR) a kardiotoxicitou rovnako ako neutropéniou, ktoré sú výsledkami chronického liečenia. Aby sa tieto nevýhody prekonali a na ďalšie využitie enormného tumoricidného potenciálu obsiahnutého v štruktúre antracyklínových antibiotík, boli dosiaľ opísané tisíce syntetických derivátov zahŕňajúcich ich cielené analógie viazané na rôzne nosné makromolekuly.

Väčšina histórie DOX a jeho analógií je opísaná v „Adriamycin“ Dávid W. Henry ACS Symposium Šerieš, číslo 30, Cancer Chemotherapy, Američan Chemical Society, str. 15 - 57 (1976) a v knihe Doxorubicín, Federico Arcamone, Academic Press (1981).

Vysoko aktívny alkylačný, nesieťovo rezistentný 3'-deamino-3’-(3-kyán-4’’-morfolinyl)-DOX a jeho deriváty, ktoré majú protinádorový účinok, sú opísané v Moshcr a koľ, US patent číslo 4 464 529, 7. august 1984. Syntéza a biologické vyhodnotenie týchto „intenzívne potentných morfolinylových antracyklínov“ sú opísané taktiež v J. Med. Chem. 1984,27, 638 -645.

V Proc. Natl. Acad. Sci. USA ZV. 88, str. 4845 - 4849, jún 1991, Gao a kol. opisujú formaldehydom sprostredkovanú alkyláciu DNA sekvencie daunorubicínovým derivátom.

Antracyklínové analógie nesúce latentné alkylačné substituenty sú opísané v J. Mech. Chem. 35, 3208 - 3214 (1992).

Použitie alfa, omega-diódovej zlúčeniny na alkyláciu daunosamínového dusíka DOX, a tak na tvorbu nového morfolinylového DOX derivátu, je opísané v európskom patente EP 434 960 prihláseného firmou Pharmacia Carlo Erba 12. decembra 1989.

N-trif luóracetyladriamycín^l4-O-hemiglutarát a -hemiadipát sú uvedené ako analógie N-trifluóracetyladriamycín¹⁴-O-valérátu (AD-32) so zvýšenou vodorozpustnosťou v Israel a kol., US patent 4 299 822, 10. november 1981.

Horton a Priebe (J. Antibiotics, XXXVI, 1211 - 1215) opisujú niekoľko 14-O-esterov rôznych antracyklínových analógií bez žiadnych dramatických zmien v protirakovinovej účinnosti v porovnaní s 14-OH materskými analógiami.

V doterajšom stave techniky navrhovania cielených chemoterapeutických prostriedkov sú požadované nasledujúce ciele:

1. Stabilná väzba medzi nosnou molekulou a chemoterapeutickým prostriedkom, až kým sa nedosiahne cieľ.

2. Zachované biologické vlastnosti nosnej molekuly v konjugáte tak, ako zachované väzbové vlastnosti.

3. Zachovaná farmaceutická účinnosť chemoterapeutického prostriedku v konjugáte tak, ako zachovaná cytotoxická účinnosť.

4. Ako výsledok konjugácie, produkcia analógií intenzívnejšieho účinku a/alebo nižšej periférnej toxicity vo vzťahu k nekonjugovaným skupinám.

Konjugácia DOX pomocou NaIO₄ oxidácie daunosamínovej skupiny DOX nasledovanej redukčnou alkyláciou zahŕňajúca primárny amín nosnej molekuly je opísaná v Sela a kol. US patent č. 4 263 279, 21. apríl 1981. Cisakonitová vložka bola použitá pri väzbe daunosamínového dusíka na makromolekuláme nosiče s pH senzitívnou väzbou, ako je opísané v Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981 102, 1048 -1054.

Tvorba csterových väzieb a C-N väzieb medzi 14-brómdaunorubicínom a proteínmi alebo poly-N-aminokyselinami je opísaná od Zunino a kol. (1981) Tumori 67, 521 - 524 a (1984) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 20, 421 -425.

Morfolino-DOX (vysoko aktívna daunosamínom modifikovaná analógia DOX) bol konjugovaný k protilátke pomocou hydrolyzovateľnej (lyzozómotrópnej, pH senzitívnej) hydrazónovej väzby zahŕňajúcej C-13 oxofunkciu cytotoxického prostriedku, ako je opísané v Bioconjugate Chemistry 1990 1(5),325-330.

Citlivosť karboxamidovej väzby leucínového zvyšku na enzymatickú degradáciu bola úspešne využitá v konjugátoch DOX obsahujúcich „vymedzovacie rameno“ peptidu, výhodne Ala-Leu-Ala-Leu, kde karboxy terminál Leu acyluje daunosamínový dusík v DOX a amino terminál Ala je viazaný na nosič cez vložku dikarboxylovej kyseliny, ako je opísané v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982 79, 626 -629.

Daunosamínový dusík DOX bol acylovaný vložkou glutarovej kyseliny a viazaný na LH-RH analógie so zá2 vážnou stratou cytotoxického účinku, ako je opísané v Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982 89, 972 - 976.

Ďalšie referencie vzťahujúce sa na použitie zlúčenín podľa predloženého vynálezu na liečenie rôznych ľudských nádorov sú uvedené neskôr:

1. Schally et. al. (1996) in Treatment with GnRH Analogs: Controversies and Perspectives, eds. Filicori, M. & Flamigni, C. (Parthenon, Camforth, U.K.), pp. 33-44.

2. Nagy et. al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7269-7273.

3. Yano et. al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7090-7094.

4. Rekasi et. al. (1993) Endocrinology 132(5) 1991-2000.

5. Srkalovic et. al. (1990) Cancer Res. 50,1841-1846.

6. Emons et. al. (1993) Cancer Res. 53, 5439-5446.

7. Emons et. al. (1993) Joumal of Clin. Endocrin. And Metabol. 77(6) 1458-)

8. Schally, A. V. (1988) Oncological applications of somatostatin analogs. Cancer Res. 48, 6977-6985.

9. Schally et. al. (1994) Intemational Joumal ofPancreatology 16, 277-280.

10. Srkalovic et. al. (1990) Joumal of Clinical Endocrinology and Metabolism 70(3), 661-669. 4 Pinski et. al. (199.4) Int. J. Cancer 57, 574-580.

11. Radulovic et. al. (1992) Cancer Letters 62, 263-271.

12. Qin et. al. (1995) Int. J. Cancer 60, 694-700.

13. Radulovic et. al. (1992) P.S.E.B.M. 200,394- 401.

14. Radulovic et. al. (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701.

15. Pinski et. al. (1993) Cancer Letters 71, 189-196.

16. O'Byme et. al. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(l 1) 1682-1687.

17. Pinski et. al. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

18. Pinski et. al. (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.

19. Pinski et. al. (1996) Int. J. Cancer 65, 870-874.

20. Banks et. al. (1992) Anticancer Drugs. 3, 519-523.

21. Reubi and Kvols (1992) Cancer Res. 52, 6074-6078.

22. Schally et. al. (1994) Intemational Joumal ofPancreatology 16, 277-280.

23. Halmos et. al. (1995) Cancer Res. 55, 280-287.

24. Halmos et. al. (1994) Cancer Letters 85, 111-118.

25. Qin et. al. (1994) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 120, 519-528.

26. Qin et. al. (1994) Cancer Res. 54, 1035-1041,.

27. Qin et. al. (1995) Int. J. Cancer 63, 257-262.

28. Reile et. al. (1994) The Prostate 25, 29-38.

29. Pinski et. al. (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.

30. Radulovic et. al. (1992) P.S.E.B.M. 200, 394-401.

31. Radulovic et. al. (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701.

32. Pinski et. al. (1993) Cancer Letters 71,189-196.

33. Pinski et. al. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

34. Pinski et. al. (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.

Všetky uvedené citácie sú tu začlenené odkazom.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob konverzie dusíka primárnej aminoskupiny alfa, beta- alebo alfa, gama-hydroxyprimámeho amínu na dusík mononenasýtenej dusík obsahujúcej heterocyklickej zlúčeniny majúcej 5 až 6 atómov v kruhu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa postupne

a) spracuje uvedený hydroxyamín s prebytkom halogénaldehydu majúceho aldehydový uhlík, halogén nesúci uhlík a majúceho 2 až 3 skupiny, medzi aldehydovým uhlíkom a halogén nesúcim uhlíkom vybrané zo skupín CH₂, CH₂CH₂ a OCH₂,

b) pridá sa prebytok, vo vzťahu k hydroxyamínu, organickej bázy,

c) táto báza sa neutralizuje slabou kyselinou, a

d) nasleduje spracovanie zriedenou vodnou kyselinou.

5- a 6-členné čiastočne nasýtené heterocyklické skupiny môžu byť vytvorené, keď vicinálny alebo disjuktívny amín sa nechajú zreagovať s halogénom substituovaným aldehydom majúcim 2 alebo 3 skupiny medzi aldehydovým uhlíkom a uhlíkovým atómom majúcim halogénovú skupinu. Tieto skupiny môžu byť všetky metylénové alebo môže byť zahrnutý hetcroatóm, ako je kyslík.

Reakcia sa uskutočňuje v troch stupňoch. Veľký prebytok halogénaldehydu sa nechá reagovať s kyselinou solí hydroxyamínu výhodne v polárnom inertnom bezvodom organickom rozpúšťadle. Takto sa vytvorí 5-členný oxazolidínový kruh (alebo 6-členný 1,3-tetrahydrooxazínový kruh) kondenzáciou aldehydovej skupiny s hydroxylovými a amínovými skupinami.

Tento produkt sa spracuje s organickou bázou, vhodne terciámym amínom, čím sa eliminujú prvky hydrohalogénovej kyseliny medzi halogénovou skupinou predchádzajúceho halogénaldehydu a sekundárnou aminoskupinou oxazolidínového alebo 1,3-tetrahydrooxazínového kruhu, čím sa vytvorí kondenzovaná kruhová štruktúra prídavkom 5alebo 6-členného kruhu. Báza sa potom neutralizuje slabou kyselinou, ako je ľadová kyselina octová.

Spracovanie s vodnou kyselinou, výhodne organickou kyselinou, otvára oxazolidínovú alebo 1,3-tetrahydrooxazínovú časť kondenzovaného kruhu. To je jasné odborníkom z odboru, že v závislosti od východiskového aldehydu, finálny dusík obsahujúci kruh, môže obsahovať aspoň jeden ďalší heteroatóm, ako bolo uvedené.

Všeobecná reakcia môže byť znázornená nasledovne:

-c-z-cI I

OH NHj*X'

H OCH;

t ///

C-(CH;-Y) (III) (veíký prebytok) v rozpúšťadle, bezvodom ——... ——ä aprotickom rozpúšťadle

-c-z-cI I

O NH CHz-X' \ / i

CH-ÍCH^Y) (IV) báza (terciárny bezvodý amín)

-c-z-c-		(V)
1 1	H2° + kyselina
0 N------CH;
V 1 !	,—.-->
CH-(CH2-Y)

-C-Z-CI l

HO N / \

CH CH₂ W / (CH-Y) kde

X'je halogén, vhodne bróm alebo jód, výhodne jód,

Y je CH₂, OCH₂, CH₂-CH₂,

Zje O alebo CH₂.

(VI)

Keď Z jc O, aldchydový zvyšok tvorí 5-člcnný kruh ako prvý stupeň reakcie. Keď Z je CH₂, aldehydový zvyšok tvorí 6-členný 1,3-tetrahydrooxazínový kruh.

Zatiaľ čo takéto kruhové formácie sú dobre známe, v kombinácii s uzatvorením kruhu prevádzaným halogénalkánovým postranným reťazcom v bázickom prostredí, ako je terciámy amín v bezvodom prostredí, je táto reakcia nová a prekvapujúca.

Spôsobom podľa vynálezu je možné pripraviť cielené cytotoxické peptidové hormóny obsahujúce antracyklínový cytotoxický prostriedok, ako je DOX alebo DM-DOX konjugovaný s peptidovým hormónom, ako sú analógie LH-RH, bombezín a somatostatín. Tieto cytotoxické peptidové hormónové konjugáty sú určené na liečenie nádorov nesúcich špecifické receptory pre konjugát, ako je rakovina prsníka, rakovina vaječníkov, endometriálna rakovina, rakovina prostaty, rakovina pankreasu, rakovina hrubého čreva, rakovina tráviaceho ústrojenstva a rakovina pľúc.

Určité z týchto (nekonjugovaných) antracyklínových cytotoxických prostriedkov, ktoré sú tu využité, sú samy osebe nové a vysoko potentné, ale ich úroveň toxicity je však príliš vysoká na to, aby mohli byť využité v nekonjugovanej forme.

Daunosamínom modifikované DOX analógie, uvedené v tomto vynáleze, boli vyvinuté počas výskumu nových vysoko aktívnych nesieťovo rezistentných analógii DOX vhodných na tvorbu kovalentných konjugátov s peptidovými nosičmi.

Tvorba stabilných kovalentné viazaných konjugátov s úplne zachovanými biologickými účinkami ich zložiek bola dosiahnutá pomocou vložky dikarboxylovej kyseliny, ako je kyselina glutarová. Jedna karboxylová skupina tejto vložky tvorí esterovú väzbu s 14-OH skupinou DOX alebo DM-DOX a druhá karboxylová skupina vložky tvorí karboxamidovú väzbu s dobre zvolenou voľnou aminoskupinou peptidového nosiča.

Zlúčeniny, ktoré je možné pripraviť podľa tohto vynálezu, sú predstavené všeobecným vzorcom (I):

Q^M-O-R-P (I), kde Q má všeobecný vzorec (II):

Q¹⁴ značí skupinu Q s postranným reťazcom v polohe 14, -R- je jednoduchá väzba alebo -C(O)-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 0 - 7,

R' je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z NH₂, aromatického alebo hydrogenovaného čisto dusíkatého päť alebo šesťčlenného heterocyklu majúceho aspoň jeden kruhový dusík, ku ktorému je prípadne prostredníctvom dvoch susedných kruhových atómov prikondenzovaný ďalší šesťčlenný karbocyklický kruh za vzniku bicyklického systému a

P je vodík alebo pepetidový zostatok odvodený z analógu LHRH, somastatínu alebo bombesínu za predpokladu, že keď R' je NH₂, potom R-P je odlišný od vodíka, a keď R-P znamená vodík, potom R'je odlišný od NH₂.

P výhodne predstavuje zostatok LHRH analógu, ktorý má afinitu k neoplastickým bunkovým receptorom, najmä analógu, ktorý obsahuje v polohe 6 skupinu D-Lys alebo zostatok skráteného somastatinového alebo bombesínového analógu.

Aj tak ale platí, že keď R' je NH₂, potom R-P je odlišný od vodíka, a keď R-P je vodík, potom R'je iný ako NH₂.

Prehľad obrázkov na vý kresoch

Obr. 1 je graf objemových zmien estrogénovo nezávislých MXT myších prsných rakovin pre rôzne dávkové úrovne zlúčenín tohto vynálezu a DOX.

Obr. 2 je graf objemových zmien estrogénovo nezávislých MXT myších prsných rakovin pre rôzne dávkové úrovne určitých zlúčenín tohto vynálezu, zlúčeniny doterajšieho stavu techniky, DOX a kontroly.

Obr. 3 je graf účinku určitých cytotoxických LH-RH analógií na prežitie myší s estragónovo nezávislými MXT myšími prsnými rakovinami.

Obr. 4 je graf nádorového objemu u samčích kodanských krýs nesúcich krysie Dunning R-3327-H prostatorakovinové transplantáty, počas liečenia známym agonistom a určitou zlúčeninou tohto vynálezu.

Obr. 5 je graf ukazujúci účinok liečenia, určitou zlúčeninou tohto vynálezu a zodpovedajúcou cytotoxickou. LH-RH analógiou na nádorový objem u krýs s Dunning R-3327-H rakovinou prostaty.

Obr. 6 je graf ukazujúci účinok liečenia určitou zlúčeninou tohto vynálezu a zodpovedajúcou cytotoxickou LH-RH analógiou na telesnú hmotnosť kodaňských krýs nesúcich Dunning R-3327-H rakovinu prostaty.

Obr. 7 je graf ukazujúci inhibíciu rastu nádoru dosiahnutou liečením určitou zlúčeninou tohto vynálezu a DOX.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Opis výhodných vyhotovení

Skupina Q, keď je substituovaná v R' určitými výhodnými skupinami, má podskupinové označenia Q, až Q₈, z ktorých Q₂ až Q_s sú nové cytotoxické skupiny.

R' má výhodné hodnoty vedúce k požadovaným Q_x skupinám uvedeným v zátvorkách nasledovne: NH₂ (Q,), pyrrolidin-1-yl (Q₂), izoindolin-2-yl (Q₃), 3-pyrrolin-l-yl (Q₄), 3-pyrrolidon-l-yl (Q5), 2-pyrrolin-l-yl (Q₆), 3-piperidon-l-yl (Q₇) alebo 1,3-tetrahydropyridin-l-yl (Q_g).

Ak R-P je H a -R’je -NH₂, Q, je DOX, ak R-P je H a R' je pyrrolidin-1-yl, Q₂ je 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-l-yľ) doxorubicín Q₂, ak R-P je H a R' je izoindolin-2-yl, Q₃ je 3'-deamino-3'-(izoindolin-2''-yl)doxorubicín (Q₃), ak R-P je H a -R'je 3-pyrrolin-l-yl, Q₄ je 3'-deamino-3'-(3-pynolin-1 -yl) doxorubicín (Q₄), ak R-P je H a -R'je 3-pyrrolidon-1-yl, Q₅ je 3'-deamino-3'-(3-pyrrolidon-l-yl)doxorubicín (Q₅), ak R-P je H a -R' je 2-pyrrolin-l-yl, Q<, je 3'-deamino3'-(2-pyrrolin-l-yl)doxorubicín (Q₆), ak R-P je H a R' je

3-piperidon-l-yl, Q₇ je 3'-deamino-3'-(3-piperidon-l-yl)doxorubicin (Q₇), ak R-P je H a -R' je 1,3-tetrahydropyridin-l-yl, Q_s je 3'-deamino-3'-(l”,3-tetrahydropyridin-l-yl)doxorubicín (Q₈).

Zlúčeniny začleňujúce daunosamínový dusík v 5-člennom kruhu s alkylačnou funkciou 10 až 50 x aktívnejšie in vitro ako ich homologové proťajšky začleňujúce daunosa mínový dusík v 6-člennom kruhu- (Takéto páry sú Q₅ a Q₇ rovnako ako Q₆ a Q₈).

Vo výhodných vyhotoveniach tohto vynálezu v látke so vzorcom Q¹⁴-O-R-P R a P sú iné ako vodík. P je iný ako vodík tam, kde je P,, P₂ a P₃, vhodne P] je LH-RH antagonistový nosič alebo skrátený LH-RH analogický nosič, P₂ je skrátená somatostatínová analógia a P₃ je bombezínový antagonista.

Vhodne P, je Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-LeuArg-Pro-Ddd, kde Xxx je vodík alebo diaminosubstituent, ako je A₂Bu alebo A₂Pr, pričom ak:

Aaa je Glp, potom Bbb je His, Ccc je Trp a Ddd je GlyNH₂, Aaa je Ac-D-Nal(2), Ac-D-Phe alebo Ac-D-Phe(4Cl), potom Bbb je D-Phe(4CI) alebo D-Phc, Ccc je D-Pal(3) a D-Trp a Ddd je D-Ala-NH₂, a ak Aaa-Bbb-Ccc je Ac, potom Ddd je -NH-CH₂CH₃, P₂ je (—----------------------₁

Aaa-Cys-Bbb-D-Trp-Lys-Ccc-Cys-Ddd-NH₂, pričom ak Aaa je D-Phe, potom Bbb je Tyr, Ccc je Val a Ddd je Thr alebo Trp a ak Aaa je D-Trp, potom Bbb je Phe a Ccc a Ddd sú Thr, a P₃je Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Bbb-NH₂ pričom Aaa je nula, D-Tpi alebo D-Phe a Bbb je (CH₂-NHjLeu, (CH₂-NH)Phe, (CH₂-NH)Trp, (CH₂-N)Tac alebo (CH₂-N)DmTac.

V nových zlúčeninách tohto vynálezu začleňujúcich analógie LH-RH je cytotoxická skupina Q pripojená k D-Lys postrannému reťazcu na LH-RH analógiách alebo (Xxx) pripojená skupina cez vložku dikarboxylovej kyseliny, ako je to vo vzorci (VII):

Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys (Xxx),» (Q^I4O-R)n-Leu-Arg-Pro-Ddd (VII), kde m je 1 alebo 0 a n je 1 alebo 2 za predpokladu, keď m je 1, tak (Xxx) je A₂Bu alebo A₂Pr, n je 1 alebo 2, keď m je 0, tak (Xxx) je H, n je L

V nových zlúčeninách tohto vynálezu začleňujúcich analógie somatostatínu, je cytotoxická skupina Q pripojená k amínovému terminálu somatostatínových analógií cez vložku dikarboxylovej kyseliny, ako je to vo vzorci (VIII):

Q^l4-O-R-Aaa-Cis-Bbb-D-Trp-Lys-Ccc-Cys-Ddd-NH₂ (VIII).

V nových zlúčeninách tohto vynálezu začleňujúcich analógie bombezínových antagonistov, je cytotoxická skupina Q viazaná k amínovému terminálu bombezínových antagonistov tak, ako je to vo vzorci (IX):

Q¹⁴-O-R-Aaa-Gln-Trp-AIa-Val-Gly-His-Leu-Bbb-NH₂ (IX).

Obzvlášť výhodnými vyhotoveniami tohto vynálezu sú tie peptidové konjugáty, ktoré obsahujú Qj a Q₆ ako cytotoxické skupiny a glutarovú kyselinu (n=3) ako vložku dikarboxylovej kyseliny tvoriacej 14-O-esterovú väzbu s Qi (doxorubicin) alebo Q₆ (2-pyrrolinodoxorubicin) a karboxamidovú väzbu s peptidovým nosičom. Najvýhodnejším vyhotovením tohto vynálezu sú cytotoxické LH-RH analógie s nasledujúcimi vzorcami:

1. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Qi¹⁴-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

2. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q<s¹⁴-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ cytotoxické somastatínové analógie s nasledujúcimi vzorcami:

3- Q₁ ¹⁴-o-glt-D-Phe-cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Tbr-NH₂ · Q₆ ¹⁴-0-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂

5· Qi¹⁴-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-cys-Thr-NH₂

5. 0₆ ¹⁴-o-glt-D-Trp-^cys-phe-0-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-HH₂ ’ · Q₁ ¹⁴-O-glt-D-Phe-CyB-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂

8· Q₆ ¹⁴-o-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂ cytotoxické bombezínové antagonistové analógie s nasledujúcimi vzorcami:

9. Qi^l4-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂

10. Q₆'⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂

11. Qi^l4O-g1t-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂

12. Q₆ ^l4-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-11 is-I .eu(CIL-NH)Lcu-

-nh₂

V novom postupe tvorby čiastočne nasýteného heterocyklického kruhu s dusíkom vicinálneho alebo disjunktívneho, to je alfa, beta- alebo alfa, gama-hydroxyaminu, sa prvý stupeň reakcie vykonáva v bezvodom inertnom organickom polárnom nehydroxylovom (aprotickom) rozpúšťadle, vhodne v dimetylformamide s použitím podstatného prebytku, vhodne 30-násobného prebytku halogénaldehydu, pričom 4-jódbutyraldehyd a 5-jódvaléraldchyd sú zvlášť výhodné. Vynález nie je obmedzený iba na tieto aldehydy, môže byť použitý bróm namiesto jódu. Táto reakcia, rovnako ako nasledujúce stupne, môže byť vykonaná pri teplote okolia.

Bazifikačný stupeň sa vykonáva s prebytkom, vhodne s 2-až 4-násobným prebytkom organickej bázy. Na tento účel sú vhodné terciáme aminy, ako sú trialkylamíny.

Takto vytvorený bicyklický kruh je otvorený na uvoľnenie vicinálnej alebo disjuktivnej hydroxylovej skupiny spracovaním s organickou kyselinou v prítomnosti vody. Zriedená vodná fluóroctová kyselina, vhodne v inertnom organickom rozpúšťadle, ako je acetonitril, môže byť použitá. Produkt je vyčistený odstránením prchavých látok pri zníženom tlaku, prebytočné halogénové zlúčeniny sú extrahované hexánom a zvyšok je vyčistený na HPLC.

Skratky

Na opis peptidov a ich derivátov tohto vynálezu sú použité konvenčné skratky pre aminokyseliny tak, ako sú všeobecne akceptované v chémii peptidov, a ako je odporučené IUPAC-IUB komisiou pre biochemickú nomenklatúru (European J. Biochem., 138,9-37, (1984)).

Skratky jednotlivých aminokyselinových zvyškov sú založené na triviálnom názve aminokyselín, napríklad Glp je pyroglutámová kyselina, His je histidín, Trp je triptofán atď. Skratky označujú L izomému formu aminokyselín, pokiaľ nie je povedané inak, napríklad Ser je L-serín a D-Lys je D-lyzín.

Skratky aminokyselín v tomto vynáleze, ktoré nie sú bežné, sú nasledujúce:

D-Nal(2) je D-3-(2-naftyl)alanín a D-Pal(3) je D-3-(3-pyridyljalanín, D-Phe(4Cl) je D-4-chlórfenylalanin.

Peptidové sekvencie sú opísané podľa konvemcie, čím N-terminálna aminokyselina je vľavo a C-terminálna aminokyselina je vpravo, napríklad Glp-His-Trp.

Vzorec Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂ opisuje redukovanú peptidovú väzbu medzi leucinom a leucínovým amidovým zvyškom v C-terminále peptidovej sekvencie.

Iné použité skratky sú: A₂Bu: je diaminobutyrová kyselina, A₂Pr: je diaminopropiónová kyselina, BN: bombezín,

BOP reagent: benzotriazol-l-ylooxitris(dimetylamino)fosfónium-hexyfluórfosfát,

DIPEA: N,N-diizopropyletylamin,

DM-DOX. daunosamínom modifikovaný doxorubicín, DMF: N,N-dimetylformamid,

DMTac: 5,5-dimetyltiazolidin-4-kyrboxylová kyselina, DOX: doxorubicín,

Fmoc: 9-fluórenylmetyloxykarbonyl, git: -C(O)-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-, glutaryl, Glt₂O: glutaranhydrid, HOBt: 1-hydroxybenztriazol, HO-glt-OH: glutarová kyselina,

HOSu: N-hydroxysukcinimid, HPLC: vysokovýkonná kvapalinová chromatografia, TFA: trifluóroctová kyselina,

Tac: tiazolidín-4-karboxylová kyselina,

Tpi: 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido/3,4-b/indol-3-karboxylová kyselina.

Beckmanov analytický HPLC systém vybavený modelom 168 diódového mriežkového detektora a Systém Gold chromatografického softvéru (Beckman) bol použitý na monitorovanie chemických reakcii a pri kontrole čistoty zlúčenín tohto vynálezu. Použitá kolóna bola Dynamax C-l 8 (250 x 4,6 mm), veľkosť pórov 30 nm, veľkosť častíc: 12 mikrometrov. Rozpúšťadlový systém pozostával z dvoch komponentov: (i) 0,1 %-nej TFA vo vode a (ii) 0,1 %-nej TFA v 70 %-nom vodnom acetonitrile a bol použitý lineárny gradient rastúci 1 % (ii) za minútu na monitorovanie chemických reakcii. Systém bol použitý izokratickým spôsobom na kontrolu čistoty.

Beckmanov model 342 semipreparatívneho HPCL systému bol použitý na izoláciu a vyčistenie zlúčenín tohto vynálezu. Kolóna bola Aguapore Octyl (250 x 10 mm, veľkosť pórov 30 nm, veľkosť častíc 15 mikrometrov). Rozpúšťadlový systém bol rovnaký, ako bol opísaný pre analytickú HPCL skôr.

Analýza

Brukerov ARX300 NMR spektrometer (300 MHz 1H frekvencia, 75 MHz 13C frekvencia) a elektrorozprašovaci hmotový spektrometer Finnigan-MAT TSQ 7000 boli použité na identifikáciu štruktúry doxorubicínových derivátov.

Syntéza peptidových nosičov

Peptidy tohto vynálezu sú často podávané vo forme farmaceutický akceptovateľných netoxických solí, ako sú adičné soli s kyselinou. Ilustráciou týchto adičných solí s kyselinou sú hydrochlorid, hydrobromid, sulfát, fosfát, fumarát, glykonát, tanát, maleát, acetát, trifluóracetát, citrát, benzoát, sukcinát, alginát, palmoát, malát, askorbát, tartrát a podobne.

Ak aktívna zložka má byť podávaná v tabletkovej forme, tableta môže obsahovať farmaceutický akceptovateľné riedidlo, ktoré zahŕňa spojivo, ako je tragakant, kukuričný škrob alebo želatína a desintegračný prostriedok, ako je algínová kyselina a lubrikant, ako je stearan horečnatý.

Ak sa požaduje podávanie v kvapalnej forme, osladenie a/alebo ochutenie môže byť použité ako časť farmaceutický akceptovateľného riedidla, intravenózne podávanie môže byť vykonané v izotonickom soľnom roztoku, fosfátových pufŕových roztokoch alebo podobne.

Farmaceutické kompozície budú zvyčajne obsahovať peptid v konjukcii s konvenčným farmaceutický akceptovateľným nosičom. Dávkovanie bude zvyčajne asi od 1 do 100 mikrogramov peptidu na kg telesnej hmotnosti príjemcu pokiaľ sa podáva intravenózne, orálne dávky budú oveľa vyššie.

Celkové liečenie subjektov týmito peptidmi sa vo všeobecnosti vykonáva rovnakým spôsobom ako klinické liečenie používajúce iné analógie LHRH, somatostatín a analógie doxorubicínu.

Tieto peptidy môžu byť podávané cicavcom intravenózne, subkutánne, intramuskuláme, orálne, ihtranazálne alebo intravaginálne, čím sa dosiahnu biologické hormonálne účinky cez väzbu na špecifické receptory. V prípade LHRH analógií môžu tieto účinky zahŕňať reverzibilné potlačenie gonadálnej aktivity a v prípade somatostatínových analógií inhibíciu gastrointestinálnej funkcie.

Účinné dávky sa budú menili formou podávania a s príslušným druhom ošetrovaného cicavca. Príklad jednej typickej dávkovacej formy je fyziologický soľný roztok obsahujúci peptid, a tento roztok je podávaný na zaistenie dávky v rozmedzí asi 0,1 až 2,5 mg/kg telesnej hmotnosti. Orálne podávanie peptidu môže byť vykonané buď v tuhej alebo v kvapalnej forme.

Syntéza peptidových nosičov tohto vynálezu môže byť zrealizovaná akoukoľvek technikou, ktorá je známa odborníkom z odboru chémie peptidov. Súhm týchto technológií možno nájsť v N. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Haidelberg, 1984. Technológiu syntézy peptidov v pevnej fáze možno nájsť v učebnici J. M. Stewart a J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. vydanie) a v prehľade

G. Barany a kol., Int. J. Peptide and Proteín Res. 30, 705-739(1987).

Syntéza LH-RH analógových nosičov použitých v tomto vynáleze je detailne uvedená v príkladoch US patentu 5 258 492, Sandor Bajusz a Andrew v. Schally, 2. november 1993 a v článkoch Bajusz a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1637-1641 (1988) a 86, 6318 - 6322 (1989) a Janaky a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1023 - 1027 a 972-976(1992).

Syntéza nosičov somatostatínových analógií použitých v tomto vynáleze je detailne uvedená v príkladoch US patentu 4 650 787, 17. marce 1987, Andrew V. Schally a Rcn Z. Cai. Opis syntézy možno taktiež nájst aj v článkoch od Cai a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2502 - 2506 (1987). Syntéza nosičov bombezínových antagonistov je detailne opísaná v článkoch od Coy a kol., J. Biol. Chem. 263, 5056 -5060 (1988) a 264, 14691 - 14697 (1989) a od Cai a kol., Peptides 13, 267 - 271 (1992) a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12664 - 12668 (1994).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Syntéza doxorubicínových derivátov použitých v tomto vynáleze a tvorby ich konjugátov s rôznymi peptidovými nosičmi je detailne opísaná v nasledujúcich príkladoch, ktoré sú určené na ilustráciu a nie na obmedzenie vynálezu.

Príklad 1

Príprava a izolácia N-Fmoc-DOX¹⁴-O-hemiglutarátu

DOX HC1 soľ, 50 mg (86 mikromólov), bola rozpustená v 1 ml DMF a bolo pridaných 30 mg (90 mikromólov) Fmoc-OSu, a nasledoval prídavok 31 mikrol (180 mikromólov) DIPEA. Po miešaní počas 3 hodín bola reakcia dokončená, ako bolo potvrdené analytickou HPLC. Rozpúšťadlo bolo odparené do sucha v Speed Wác vysokovákuovej odparke a zvyšok bol vykryštalizovaný vytrenim s 0,1 % TFA v H₂O. Kryštály boli odfiltrované a premyté jedenkrát studeným éterom na odstránenie prebytku Fmoc-OSu. Po vysušení v exsikátore bolo získaných 62 mg 98 % čistého N-Fmoc-DOX. Výťažok 94 %.

Tento medziprodukt reagoval cez noc s 11,4 mg (100 mikromólov) Glt₂O v I ml bezvodého DMF v prítomnosti 26,1 mikrol (150 mikromólov) DIPEA. Rozpúšťadlo bolo odparené v Speed Wac a zvyškový olej bol stužený trením s 0,1 % vodným TFA (obj./obj.) Surový materiál, takto získaný, obsahuje 70 % N-Fmoc-DOX 14-O-hemiglutarátu, 20 % nezreagovaného N-Fmoc-DOX a 10 % iných nečistôt, ako bolo potvrdené analytickou HPLC. Tento surový produkt môže byť použitý na prípravu peptidových DOX konjugátov bez ďalšieho čistenia. Keď bol tento surový materiál rozpustený v 20 ml 60 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA a aplikovaný na semipreparativnu HPLC, bolo získaných 45,7 mg 98 % N-Fmoc-DOX14-O-hemiglutarátu ako konečný produkt (výťažok 64 %).

Príklad 2

Príprava a izolácia 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-l-yl)doxorubicín-TFA soli (Q₂) a jeho 14-O-hemiglutarát (AN-193)-TFA soli

DOX HC1 soľ, 50 mg (86 mikromólov), bola rozpustená v 1 ml DMF a 171 mikrol (1,3 mmólov), bol pridaný 15násobný prebytok 1,4-dijódbutánu, potom nasledovalo pridanie 45 mikrol (260 mikromólov) trojnásobného prebytku DIPEA. Reakčná zmes bola miešaná cez noc pri teplote miestnosti. Po 16 hodinách bola reakcia dokončená ako potvrdila analytická HPLC. Rozpúšťadlo bolo odparené v Speed Wac a zvyšný olej bol rozpustený v 3 ml 0,1 % TFA a H₂O a extrahovaný éterom na odstránenie prebytku 1,4dijódbutánu. Bezvodý extrakt bol potom aplikovaný na HPLC a bolo získaných 41,6 mg 98 % čistého DOX derivátu. (Výťažok 68 %.)

41,6 mg (58 mikromólov) 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-l-yl)-doxorubicín TFA soli (Q₂) takto získanej zreagovalo s 1,2 ekvivalentu Glt₂O v suchom DMF presne tak, ako je to opísané v príklade 1. Výťažok bol 35 % (16,9 mg) a čistota bola 98 %.

Príklad 3

Príprava a izolácia 3'-deamino-3'-(isoindolin-2-yl)doxorubicín TFA soli (Q?)

DOX HC1 soľ, 50 mg (86 mikromólov), bola rozpustená v 1 ml DMF a bolo pridaných 226 mg (1,3 mmólov) 15násobného prebytku alfa, alfa'dichlór-orto-xylénu, potom nasledovalo pridanie 45 mikrolitrov (260 mikromólov) trojnásobného prebytku DIPEA a katalytického množstva Nal. Po 16 hodinách bolo rozpúšťadlo odstránené pomocou Speed Wacu a zvyšok bol rozpustený v 3 ml 0,1 % vodného TFA a extrahovaný 3 ml éteru na odstránenie prebytku halogénovej zlúčeniny.

Takto získaný surový materiál bol aplikovaný na HPLC. Po vyčistení bolo získaných 36 mg 98 % konečného produktu. (Výťažok 55 %.)

Príklad 4

Príprava a izolácia 3'-deamino-3'-(3-pyrrolin-l-yl)doxorubicí TFA soli (Q₄)

DOX HC1 soľ, 50 mg (86 mikromólov) bola rozpustená v 1 ml DMF a bolo pridaných 136,8 mikrolitrov (1,3 mmólov) 15-násobného prebytku cis-l,4-dichlór-2-buténu (Aldrich), potom nasledovalo pridanie 45 mikrol (260 mikromólov) trojnásobného prebytku DIPEA. Po 15 hodinách boli rozpúšťadlá odstránené v Speed Wac a zvyšok bol rozpustený v 3 ml 0,1 % vodného TFA a extrahovaný 3 ml hexánu na odstránenie prebytku halogénovej zlúčeniny. Takto získaný surový materiál bol aplikovaný na HPLC. Po vyčistení bolo získaných 22,6 mg 98 % konečného produktu. (Výťažok 37 %.)

Príklad 5

Príprava a izolácia 1 -chlór-4-bróm-2-butanónu (C₄H₆ClBrO) a 1 -chlór-5-bróm-2-pentanónu (C<H_sCIBrO)

3-Brómpropionylchlorid, 100,8 mikrol (lmmól) (Aldrich), zreagoval s prebytkom diazometánu v éteri. Po 1 hodine bol éterický roztok eluovaný a kvapkovo otestovaný na TLC. Tenkovrstvové chromatografické hliníkové listy potiahnuté silikagélom 60 F254, Merck Art No. 5554 boli použité ako stacionárna fáza a CHCIy.MeOH 95 : 5 (obj./obj.) ako mobilná fáza.

Pre kvapkový test bol 2,4-dinitrofenylhydrazínový reagent (Vogél: A textbook of Practical Organic Chemistry, str. 1061, 3. vydanie, Longmans, New York) nastriekaný na TLC list po elúcii. Diazometylketónový derivát, takto vytvorený, ukázal žltú škvrnu s Rf 0,3. Éterický roztok sa potom nechal zreagovať s bezvodou HC1 v éteri vyhotovením diazometylketónu na požadovaný konečný produkt 1-chlór-4-bróm-2-butanón. Tento produkt mal žltú škvrnu charakteristickú pre oxozlúčeniny s Rf 0,8 v rovnakom rozpúšťadlovom systéme a s reagentom kvapkového testu opísaného skôr.

Po odparení rozpúšťadla bol surový produkt aplikovaný na kolóniu (15 cm dlhú, 2,5 cm v priemere) naplnenú 5 g silikagélom, Merck, druh 9385, 230 - 400 mesh, veľkosť pórov 6 nm. Kvapalná mobilná fáza bol čistý CHCI₃. Frakcie obsahujúca požadovaný konečný produkt (charakterizovaný kvapkovým testom detailne uvedeným skôr) boli zmiešané a odparené do sucha. Bolo získaných 1,5 g čistého oleja. (Výťažok 80 %.) l-Chlór-5-bróm-2-pentanón bol pripravený z 4-brómbutyrylchloridu rovnakým spôsobom, ako je opísaný pre 1-bróm-4-bróm-2-pentanón s výnimkou toho, že 4-brómbutyrylchlorid bol použitý namiesto 3-brómpropionylchloridu. Bolo získaných 1,6 g číreho oleja. (Výťažok 80 %.)

Príklad 6

Príprava a izolácia 3’-deamino-3'-(3-pyrrolidon-l-yl)doxorubicín TFA soli (Q5)

DOX HC1 soľ, 50 mg (86 mikromólov), bola rozpustená v 1 ml DMF a bolo pridaných 241 mg (1,3 mmólov) 15-násobného prebytku l-chlór-4-bróm-2-butanónu, potom nasledovalo pridanie 45 mikrol (260 mikromólov) trojnásobného prebytku DIPEA.

Po 16 hodinách boli rozpúšťadlá odstránené v Speed Wac a zvyšok bol rozpustený v 3 ml 0,1 % vodného TFA a extrahovaný 3 ml hexánu na odstránenie prebytku halogénovej zlúčeniny. Takto získaný surový materiál bol aplikovaný na HPLC. Po vyčistení bolo získaných 20,6 mg 98 % čistého konečného produktu. (Výťažok 33 %.)

Príklad 7

Príprava a izolácia 3'-deamino-3'-(3-piperidon-l-yl)doxorubicín TFA soli (Q?)

DOX HC1 soľ, 50 mg (86 mikromólov), bola rozpustená v 1 ml DMF a bolo pridaných 260 mg (1,3 mmólov) 15-násobného prebytku l-chlór-5-bróm-2-pentanónu, potom nasledovalo pridanie 45 mikrol (260 mikromólov) trojnásobného prebytku DIPEA. Po 16 hodinách boli rozpúšťadlá odstránené v Speed Wac a zvyšok bol rozpustený v 3 ml 0,1 % vodného TFA a extrahovaný 3 ml hexanónu, čím sa odstránil prebytok halogénovej zlúčeniny. Takto získaný materiál bol aplikovaný na HPCL. Po vyčistení bolo získaných 18 mg 95 % čistého konečného produktu. (Výťažok 28 %.)

Príklad 8

Príprava a izolácia 4-jódbutyraldehydu a 5-jódvaléraldehydu

2-(3-Chlórpropyl)-l,3-dioxolan-(4-chlór-n-butyraldehydetylénacetal), 1,3 ml (10 mmólov), (Fluka), bol rozpustený v 200 ml acetónu obsahujúceho 30 g (200 mmólov) 20-násobného prebytku Nal. Roztok bol refluxovaný počas 24 hodín, potom nasledovalo odparenie do sucha. 100 ml éteru bolo pužitých na extrakciu organického materiálu z anorganického tuhého zvyšku. Éterický roztok bol potom premytý 10 ml H₂O, 50 ml 5 % vodného roztoku Na₂S₂O₃ a 3 x 50 ml vody.

Éter bol odstránený vo vákuu a zvyšný olej bol rozpustený v 3 ml 50 % vodnej kyseliny octovej. Po 1 hodine bolo pridaných 100 ml éteru do tohto roztoku a kyselina octová, rovnako ako etylénglykol, bola odstránená premytím 50 ml H₂O 3x. Hlavný produkt bol eluovaný pri Rf 0,8 na TLC v čistom CHC1₃. Kvapkový test použitý na aldehydovú funkčnú skupinu bol rovnaký, ako bol opísaný pre ketóny v príklade 5. Éter bol potom odstránený a čierny olej bol nanesený na stĺpec (15 cm dlhý, 2,5 cm priemer), naplnený 15 g silikagélu, Merck, trieda 9385, 230 - 400 mesh, veľkosť pórov 6 nm. Kvapalnou mobilnou fázou bol CHCI₃. Frakcie obsahujúce požadovaný konečný produkt (charakterizovaný uvedeným kvapkovým testom) boli zmiešané a odparené do sucha. Bolo získaných 1,6 g žltého oleja. Výťažok: 80 %.

5-Jódvaléraldehyd bol získaný rovnakým spôsobom, pričom sa vychádzalo z 2-(4-chlórbutyl)-l,3-dioxalan-(5-chlór-n-valéraldehydetylénacetálu) (Fluka). Bolo získaných 1,65 g žltého oleja. Výťažok 80 %.

Príklad 9

Príprava a izolácia 3'-deamino-3'-(2-pirrolin-l-yl)doxorubicín TFA soli (Q_Ď)

DOX HC1 soľ, 50 mg (86 mikromólov), bola rozpustená v 1 ml DMF a bolo pridaných 515 mg (2,6 mmólov) 30násobného prebytku 4-jódbutyraldehydu, potom nasledovalo pridanie 45 mikrol (260 mikromólov) trojnásobného prebytku DIPEA. Po 1 hodine bolo pridaných 100 mikrolitrov ľadovej kyseliny octovej do reakčnej zmesi, ktorá bola potom pridaná po kvapkách do 5 ml 0,1 % TFA v 70 % vodnom acetonitrile (rozpúšťadlo ii HPLC systému).

Tento roztok bol zriedený 2 ml 0,1 % vodného TFA roztoku, potom nasledovalo odstránenie acetonitrilu v Speed Wac. Výsledný roztok bol extrahovaný hexánom na odstránenie prebytku halogénovej zlúčeniny. Takto získaný materiál bol aplikovaný na HPCL. Po vyčistení bolo získaných 52 mg 98 % čistého konečného produktu. (Výťažok 85 %.)

Príklad 10

Príprava a izolácia 3'-deamino-3'-(l,3-tetrahydropyridin1 -yljdoxorubicin TFA soli (Q₈)

DOX HCI soľ, 50 mg (86 mikromólov), bola rozpustená v 1 ml DMF a bolo pridaných 552 mg (2,6 mmólov) 30-násobného prebytku 5-jódvaléraldehydu, po čom nasledovalo pridanie 45 mikrolitrov (260 mikromólov) trojnásobného prebytku DIPEA. Po 1 hodine bolo pridaných 100 mikrolitrov ľadovej kyseliny octovej do reakčnej zmesi, ktorá bola potom pridaná po kvapkách do 5 ml 0,1 % TFA v 70 % vodnom acetonitrile (rozpúšťadlo ii HPLC systému). Tento roztok bol zriedený 2 ml 0,1 % vodného TFA roztoku, potom nasledovalo odstránenie acetonitrilu v Speed Wac.

Výsledný roztok bol extrahovaný hexánom na odstránenie prebytku halogénovej zlúčeniny. Takto získaný materiál bol aplikovaný na HPCL. Po vyčistení bolo získaných 46 mg 98 % čistého konečného produktu. (Výťažok 75 %.) Príklad 11

Príprava a izolácia cytotoxickej LH-RH antagonistovej analógie obsahujúcej DOX (/D-Lys⁶(DOX'⁴-O-glt)/LH-RH, Qi'⁴gL) /D-Lys⁶/LH-RH, 60 mg (37,5 mikromólov) a 52 mg (64 % čistota, 37,5 mikromólov) N-Fmoc-DOX14-0-hemiglutarátu (pozri príklad 1) boli rozpustené v 1 ml DMF a bolo pridaných 22 mg (50 mmólov) BEOP reagentu (Aldrich), 13,5 mg (100 mikromólov) HOBt, rovnako ako 30-násobného prebytku 52 mikrolitrov (300 mikromólov) DIPEA. Po miešaní po 1 hodine pri teplote miestnosti bola reakcia kompletná. Rozpúšťadlá boli odparené a zvyškový olej bol vykryštalizovaný 3 ml etylacetátu a potom 2 x premytý 3 ml acetátu. 90 mg surového tuhého materiálu bolo potom rozpustených v 3 ml DMF a bolo pridaných 300 ml piperidínu. Po 5 minútach bola reakčná zmes umicstnená do ľadového kúpela a okyslená prídavkom zmesi 300 mikrolitrov TFA, 700 mikrolitrov piridínu a 2 ml DMF. Po odparení rozpúšťadiel bol zvyšný olej stužený etylacetátom.

Surová tuhá látka, takto získaná, bola rozpustená v 1 ml 70 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA (i) a zriedená 3 ml 0,1 % vodného TFA (ii) a aplikovaná na semipreparatívnu HPLC. Bolo získaných 40 mg (14,8 mikromólov) 98 % čistého konečného produktu. (Výťažok 48 %.)

Príklad 12

Príprava cytotoxickej LH-RH antagonistovej analógie obsahujúcej 2-pyrrolino-DOX (/D-Lys⁶(2-pyrrolino-DOX^l4-O-glt)/LH-RH, Q₆ ^,4gL)

Q^gL, 11,2 mg (5 mikromólov) (pozri príklad 11) bolo rozpustených v 200 mikrol DMF a bolo pridaných 30 mg (150 mikromólov, 30-násobný prebytok) 4-jódbutyraldehydu (príklad 8), potom nasledovalo pridanie 3 mikrolitrov (17 mikromólov) DIPEA. Po 1 hodine bola reakcia ukončená (pozri príklad 9) a do reakčnej zmesi bolo pridaných 10 mikrolitrov ľadovej kyseliny octovej a zmes bola potom pridaná po kvapkách do 1 ml 0,1 % TFA v 70 % vodnom acetonitrile.

Tento roztok bol potom zriedený 1 ml 0,1 % vodnej TFA a acetonitril bol odstránený vo vákuu. Zvyšný vodný roztok bol potom extrahovaný 1 ml hexánu a aplikovaný na HPLC. Bolo získaných 7,6 mg 99 % čistého konečného produktu. (Výťažok 66 %.)

Príklad 13

Príprava a izolácia cytotoxickej somatostatínovej analógie obsahujúcej DOX (D0X¹⁴-0-glt-D-Pha-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂,Q₁ ¹⁴gs)

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-Val-Cys-Thr-NH₂, 20 mg (14,5 mikromólov) (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986, s. 1986 -1990) a 20 mg (64 % čistota, 14,5 mikromólov) N-Fmoc-DOX14-0-hemiglitarátu (príklad 1) bolo rozpustených v 200 mikrolitroch DMF a bolo pridaných 8,8 mg (20 mikromólov) BOP reagentu (Aldrich), 5,4 mg (40 mikromólov) HOBt, rovnako ako 17 mikrolitrov (100 mikromólov) D1PEA. Po miešaní počas 1 hodiny pri teplote miestnosti bola reakcia ukončená. Po odstránení rozpúšťadiel vo vákuu bol zvyšok vykryštalizovaný etylacetátom.

Tento tuhý materiál bol potom rozpustený v 1 ml DMF a bolo pridaných 100 mikrol piperidínu. Po 7 minútach bola reakčná zmes vložená do ľadového kúpeľa a okyslená prídavkom zmesi 100 mikrol TFA, 300 mikrol pyridinu a 2 ml DMF. Po odparení rozpúšťadiel bol zvyšný olej stužený etylacetátom. Surová tuhá látka, takto získaná, bola rozpustená v 1 ml 70 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA (i) a zriedená 3 ml 0,1 % vodného TFA (ii) a aplikovaná na semipreparatívnu HPLC. Bolo získaných 9,7 mg (5,1 mikromólov) 95 % čistého konečného produktu. (Výťažok 35 %.)

Príklad 14 Príprava cytotoxickej somatostatínovej analógie obsahujúcej 2-pyrrolino-DOX (2-pyrrolino-D0X¹'ⁱ-0-glt~D-Fhe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-c^lys-'Thr-NH₂, Q₆ ¹⁴gS)

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (6,4 mg, 5,00 mikromólov bol rozpustený v 100 mikrol DMF a bol pridaný 2-pyrrolino-DOX¹⁴-O-hemiglutarát (4,1 mg, 5 mikromólov), potom nasledovalo pridanie BOP reagentu (4,4 mg, 10 mikromólov), HOBt (100 mikromólov) a DIPEA (50 mikromólov). Po miešaní počas 2 hodín pri teplote miestnosti bola reakčná zmes okyslená 20 mikrol AcOH a zriedená 500 mikrolitrami 70 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA a ďalej zriedená 700 mikrolitrami 0,1 % vodného TFA a aplikovaná na HPLC. Bolo získaných 3,9 mg 99 % čistého produktu. (Výťažok 40 %.)

2-Pyrrolino-DOX^1<l-O-hemig]utarát bol pripravený reakciou DOX^l4-O-hemiglutarátu a 4-jódbutyraldehydom, ako je opísané v príklade 9. DOX^l4-O-hemiglutarát bol pripravený z N-Fmoc-DOX¹⁴-O-hemiglutarátu odštiepením Fmoc chrániacej skupiny, ako je to opísané v príklade 11. (Výťažok 40 %.)

Príklad 15

Príprava a izolácia, cytotoxického bombezinového antagonistu obsahujúceho DOX (DOX¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂, Q,¹⁴gB)

Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂, 20 mg (15,8 mikromólov) (Int. j.Peptide Proteín Res., 38, 1991, s. 593-600) a 22 mg (64 % čistota, 15,8 mikromólov) N-Fmoc-DOX¹⁴-0-hemiglutarátu (príklad 1) bolo rozpustených v 200 mikrol DMF a bolo pridaných 8,8 mg (20 mikromólov) BOP reagentu (Aldrich), 5,4 mg (40 mikromólov) HOBt, rovnako ako 17 mikrolitrov (100 mikromólov) DIPEA. Po miešaní počas 1 hodiny pri teplote miestnosti bola reakcia ukončená. Po odstránení rozpúšťadiel vo vákuu bol zvyšok vykryštalizovaný v etylacetáte.

Tento tuhý materiál bol potom rozpustený v 1 ml DMF a bolo pridaných 100 mikrolitrov piperidínu. Po 5 minútach bola reakčná zmes vložená do ľadového kúpeľa a okyslená prídavkom zmesi 100 mikrol TFA, 300 mikrol pyridinu a 200 ml DMF. Po odparení rozpúšťadla bo! zvyšný olej stužený etylacetátom. Surová tuhá látka, takto získaná, bola rozpustená v 1 ml 70 % vodného acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % TFA (i) a zriedená 3 ml 0,1 % vodného TFA (ii) a aplikovaná na semipreparatívnu HPLC. Bolo získaných

13,5 mg (7,1 mikromólov) 98 % čistého konečného produktu. (Výťažok 45 %.)

Príklad 16

Príprava a izolácia cytotoxickej bombezínovej antagonistickej analógie obsahujúcej 2-pyrrolino-DOX (2-pyrrolino-DOX’⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH) Leu-NH₂, Q₆ ¹⁴gB)

Qi’⁴gB/ 9,5 mg (5 mikromólov), príklad 15, bol rozpustený v 200 mikrol DMF a bolo pridaných 30 mg (150 mikromólov, 30-násobný prebytok) 4-jódbutyraldehydu (príklad 8), potom nasledovalo pridanie 3 mikrol (17 mikromólov) DIPEA.

Po 1 hodine bola reakcia ukončená (príklad 9) a k reakčnej zmesi bolo pridaných 10 mikrol ľadovej kyseliny octovej a táto zmes bola potom pridaná do 1 ml 0,1 % TFA v 70 % vodnom acetonitrile.

Tento roztok bol potom zriedený v 1 ml 0,1 % vodného TFA a acetonitril bol odstránený vo vákuu. Zvyšný vodný Toztok bol potom extrahovaný 1 ml hexánu a aplikovaný na HPLC. Bolo získaných 6 mg 98 % čistého konečného produktu. (Výťažok 60 %.)

Určenie cytotoxickej aktivity in vitro

MXT estrogénovo nezávislej myšej prsnej rakovinovej bunkové línie bolo získané od Dr. Gunterbcmhardta, University of Regensburg, Nemecko. Všetky ostatné bunkové línie použité pri určovaní antiproliferačnej aktivity zlúčenín tohto vynálezu boli získané z Američan Type Culture Collection (ATCC).

Na vyhodnotenie aktivity analógií bola použitá skúška kolorimetrickej cytotoxicity na mikrotitračných platniach, založená na kvantifikácii biomasy značením buniek kryštálovou fialovou, čo koreluje veľmi dobre s určením počtu buniek. (Reile a kol., Anal.Biochem., 187, 262 - 267, 1990, Bemhardt G. a kol., J.Cancer Res.Clin.Oncol. (1992), 118, 35 - 43, Spruss Th. a kol., J.Cancer Res.Clin.Oncol. 117, 435 - 443, 1991, Gillies, R.J., Anal.Biochem. 159, 109 - 113, 1986, Kucng, W. a kol., Anal.Biochem. 182, 16 - 19, 1989.)

Skúšobný protokol až 2 dni po naočkovani buniek v 96 priehlbinových platniach sa kultivačné médium vymení za čerstvé médium obsahujúce zlúčeniny, ktoré majú byť testované a čerstvé médium len na kontrolu kultúr.

Po rôznej dobe inkubácie sa bunky fixujú glutaraldehydom a uložia sa pod fetálne bovinné sérum (FBS) pri 4 °C až do konca experimentu. Bunky sú označené kryštálovou fialovou a viazané farbivo sa extrahuje 70 % vodným EtOH.

Optická hustota sa meria EIA Reader (Bio-Tek Instruments) alebo Biomek 1000 (Beckman) pri 590 nm alebo 600 nm. Každý údajový bod predstavuje strednú hodnotu z 8 kultivačných priehlbín. T/C hodnoty sú vypočítané ako T/C = (T-CO)/(C-CO), kde T je optická hustota spracová vaných kultúr, C = optická hustota kontrolných (nespracovaných) kultúr, CO = optická hodnota kultúr na začiatku inkubácie (t = 0).

Príklad 17

Cytotoxická aktivita daunosamínom modifikovaných derivátov DOX

Tabuľka 17-1 demonštruje účinky doxorubicínu a jeho daunosamínom modifikovaných derivátov na MCF-7 ľudskú prsnú rakovinovú bunkovú líniu in vitro.

Cytotoxické skupiny majúce ich daunosaminový dusík začlenený do 5-členného kruhu s reaktívnou funkčnou skupinou sú 5 až 50 x aktívnejšie ako ich homológové náprotivky s 6-členným kruhom, ako príklady sú pyrrolidonoDOX (Q₅) a 3-piperidono-DOX (Q₇), rovnako ako 2-pyrrolino-DOX (Q₆) a 1,3-tetrahydropyridino-DOX (Q₈).

Tabuľka 17-1

Účinky doxorubicínu a jeho daunosamínom modifikovaných derivátov na MCF-7 ľudskú prsnú rakovinovú bunkovú líniu in vitro

Zlúčenina	Inkubačná doba (hod)	T/c hodnota v (M)
3X10-10	109	3Χ10~9	10-’	3X1O-9	10-7
Doxorubicín	70				98	82	54
(DOX)	120				95	66	33
PyrrolidinG-	70				97	25	-26
DOX [Q2)	120				94	17	-19
Piperídino-	70			114	70	4
DOX (AN-183)	120			109	67	0
Isoindolino-	70				118	86	-11
DOX (Q3)	120				108	77	-29
3-pyrrolino-	70			106	72	-3
DOX (q4)	120			97	65	-5
3-pyrrolidono~	70			87	30	-28
DOX (Q5)	120			67	25	-10
3-plperidono-	70			96	80	59
DOX (Q?)	120			97	70	43
2-pyrrolino-	70	50	-3	-18
DOX (Q6)	120	26	2	-9
1,3-tetrahydro	70	96	83	69
pyridino-DOX	120	99	93	62
<O8)

Bunky boli inkubované v IMEM médiu obsahujúcom 5 % HI-DCC-FBS (tepelne inaktivované dextranom) pokryté aktívnym uhlím upravené fetálnym bovinným sérom na 96 priehlbinových platniach. Príslušný počet buniek v spracovávaných a kontrolných platniach bol určený značkovacou metódou s kryštálovou fialovou a bol vyjadrený ako hodnoty T/C, kde T/C = (T-Co/C-C_o) x 100 (T = absorbancia spracovávaných kultúr, C = absorbancia kontrolných kultúr, C_o = absorbancia kultúr na začiatku inkubácie /t=0/. Meraná absorbancia je proporcionálna k počtu buniek.).

Nižšie hodnoty T/C indikujú zníženie prežitia rakovinových buniek vplyvom spracovania. To znamená, že 75 by indikovalo 75 % prežitie buniek v porovnaní so 100 % na kontrolu alebo 25 % inhibíciou.

Príklad 18

Plné zachovanie cytotoxickej aktivity DOX v LH-RH agonistovom peptidovom konjugáte Q|¹⁴gL a superaktívneho

2-pyrrolino-DOX (Q₆) v LH-RH agonistovom peptidovom konjugáte Q₆ ¹⁴gL, in vitro

Tabuľka 18-1 demonštruje účinky doxorubicínu a jeho daunosamínom modifikovaného derivátu, 2-pyrrolinodoxorubici-nu (Q₆), v porovnaní s ich konjugátmi s LH-RH agonistickými analógiami /D-Lys⁶/LH-RH (Q|^l4gL a Q₆ ¹⁴gL) na rast MCF-7 ľudskej prsnej rakovinovej bunkovej línie a

MXT estrogénovo nezávislej nižšej prsnej rakovinovej bunkovej línie in vitro.

Tabuľka 18-1

Zlúčenina	Inkub. doba (hod)	T/C hodnota na McF-7 bunkovej línie pri koncentrácii (M)
3xl0-11	10'10	3X10“10	10-9	3xl0-9	108	3xl0”6	10“7
Doxorubicín*	70 120						98 95	82 66	54 33
o/’tll.	70 120						111 78	89 55	63 28
«5	70 120		50 26		-3 -2	-18 -9
Os1’	70 120		74 60		28 16	-24 -14
Zlúčenina	Inkub. doba (hod)	T/C hodnota na MXT bunkovej línie pri koncentrácii (M)
3X1011	10'“	3xl0“10	10~9	3xl0-9	10“8	3xl08	10'7
Doxorubicín*	26 50						B5 74	90 60	59 43
Si149t	26 50						87 71	91 59	73 50
«5	28 €9	90 52	78 6	56 -13
Os14	28 69	91 59	78 15	64 -11

MCF-7 bunky boli inkubované v IMEM médiu obsahujúcom 5 % HI-DCC-FBS na 96 priehlbinových platniach. MXT bunky boli inkubované v RPM1 1640 médiu obsahujúcom 0,6 g/1 L-glutaminu a 10 % FBS.

* určené ako v tabuľke 17-1

Príklad 19

Tabuľka 19-1 demonštruje, že cytotoxická aktivita in vitro somatostatínových analógií obsahujúcich DOX tohto vynálezu je úplne zachovaná.

Tabuľka 19-1

Účinky cytotoxických analógií somatostatínu obsahujúcich doxorubicín na rast ΜΠΑ PaCa-2 ľudských pankreatických rakovinových bunkových línií in vitro

Zlúčenina	Inkubačná doba (hod)	T/C hodnota pri koncentrácii (M)
1O'8	10“7	106
DOX14J-O-glt- (Ql?’gs9=)	28 76	93 103	95 11	32 -3
Nosičovi analógia	28			96
S-98	76	-	-	98
DOX14-O-git—	28 76	93 97	82 10	35 -4
Nosičová
analógia	28	-	-	76
S-121	76			96
Doxorubicín	28	95	64	-28
	76	71	10	-7

Bunky boli inkubované v RPMI 1640 médiu obsahujúcom 10 % fetálne bovinné sérum na 96 priehlbinových platniach.

* i t

D-Trp-Cys~Phe-D-Trp-Lys~Thr-Cys-Thr-NH₂ □-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys~Val-Cys-Thr-NH₂

Príklad 20

Účinky cytotoxických analógií bombezínových antagonistov obsahujúcich doxorubicín na rast CFPAC-1 ľudských pankreatických rakovinových buniek in vitro

Tabuľka 20-1 demonštruje, že in vitro cytotoxická aktivita bombezínových antagonistických analógií obsahujúcich DOX tohto vynálezu je úplne zachovaná.

Tabuľka 20-1

Zlúčenina	Inkubačná doba (hod)	Γ/C hodnota pri.koncentráoii (m)
10-8	10 7	3X10“7	ΙΟ'8
OOX14-O-glt-	66	95	81	44	9
	95	95	57	28	4
(01 I4jb)	137	94	28	19	0
B-94*	66	99	106	104	100
	95	97	99	99	96
	137	98	98	100	96
DOX14-o-glt-	66	102	78	39	5
B-50	95	97	55	24	-1
	137	9.2	28	19	-2
B—50**	66	100	93	99	93
	95	98	100	102	98
	137	97	98	99	98
DOX	66	88	52	15	-7
	95	73	32	10	-6
	137	49	20	7	-4

Bunky boli inkubované v IMDM médiu obsahujúcom 10 % fetálneho bovinného séra na 24 priehlbinových platniach.

*Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-v(CH₂-N)-Leu-NH₂ **D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-\|/(CH₂-N)-Tac-NH₂

Uchované väzbové vlastnosti hormónových derivátov.

Príklad 21

Hormonálne aktivity a receptorové väzbové potencie cytotoxických LH-RH agonistových analógií Q!¹⁴gL(/D-Lys'ÝLH-RH nesúce DOX) a Q₆ ¹⁴gL(/D-Lys⁶/LH-RH nesúce 2-pyrrolino-DOX) v porovnaní s nosičovým peptidom /D-Lys⁶/LH-RH.

hormónu z premytých krysých adenohypofýz, Endocrinology 94, 1709 (1974). Taktiež táto metóda bola použitá na porovnanie cytotoxických somatostatínových analógií tohto vynálezu s ich materskými nosičovými molekulami, pokiaľ ide o ich hormonálne aktivity.

Inhibícia ľudského rastového hormónu uvoľňovacieho hormónu (hGH-RH(l-29)NH₂) vyvolala uvoľnenie rastového hormónu z premytých krysích hypofýznych buniek somatostatínovými analógiami S-98-I

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, a S-121

D-Piie-Cys-Tyr-D-Trp-Lye-Val-Cys-Thr-NH₂, v porovnaní s ich príslušným cytotoxickým derivátom Q₁ ¹⁴gS⁹⁸'(DOX^l4-O-glt-S-98-I) a Q]^l4gS^12,(DOX¹⁴-O-glt-S-121).

V krysom hypofýznom vymývateľnom systéme boli somatostatínové analógie podávané počas 3 minút v 1 nM dávke súčasne s 1 nM hGH-RH(l-29)NH₂. Infúzia somatostatínových analógií bola udržiavaná počas ďalších 6 minút. GH reakcie na 3 minútové podávanie 1 nM hGH-RH(1-29)NH₂ boli určené počas vymývania somatostatínových analógií (0 minút) a 30, 60 a 90 minút po skončení podávania. Údaje sú reprezentované v tabuľke 22-1.

Tabuľka 22-1

Somatostatínové analógie	GH uvoínenie vyvolané 3 min podávaním 1 nM hGH-RH(1-29)NH2 v rôznych časových bodoch po infúzii somatostatínových analógií
0 min	3 0 min	60 mín	90 min
S-98-I	2,9	94,7	117,6	-
Q1 14gs98	0	90	89,7	-
S-121	7,8	62,2	57,3	77,9
Q114gs121	8,5	58,5	56,3	67,7

Tabuľka 21-1

Zlúčenina	Hormonálna aktivita (LH-odozva vo vztahu k LH-RH - 1)	1050^ hodnota pre krysie hypofýzne receptory (nM)	IC50xx hodnota pre prsné rakovinové receptory (nM)
0i145L	15	2,29	7,24
o6 14sl	10	5,59	6,70
/D-Lys6/LH-RH	8	2,26	1,80

V tabuľke 21-1 ^x LH reakcie na analógie boli určené v rozdrvenom krysom hypofýznom bunkovom superfúznom systéme, ako je to opisané v S. Vigh a A. V. Schally, Peptides 5, 241 - 247 (1984).

“ Väzbové afinity analógií ku krysím hypofýznym LH-RH receptorom a ľudským prsným rakovinovým receptorom boli určené v porovnávacích väzbových experimentoch s použitím /1251/ značených /D-Trpó/LH-RH ako rádioligandy, ako je to opísané v B. Szoke a koľ, Peptides 15(2), 359 - 366 (1994). Väzbové afinity boli vyjadrené hodnotami IC50 koncentrácie neznačenej analógie vyžadovanej k inhibícii 50 % špecifickej väzby rádioligandu.

Príklad 22

Somatostatínové analógie inhibujú sekréciu rastového hormónu (GH) z premytej krysej hypofýzy, ako je to opísané Carlsonom a kol. Tytotropín uvoľňujúca hormónová stimulácia a somatostatínová inhibícia sekrécie rastového ** Vyjadrené ako percentuálna hodnota GH uvoľnenia vyvolaného 3 minútovou infúziou 1 nM hGH-RH(l-29)NH₂ pred podávaním somatostatínových analógií

Príklad 23

Receptorové väzbové štúdie s cytotoxickými bombezínovými antagonistmi

Rádiojodácia [Tyr⁴]BN (Sigma) využívajúca Bio-Rad Enzymobead Rádio Iodination súpravu a izolácia monojódovaného [^l25I-Tyr⁴]BN bola uskutočnená tak, ako je opísaná skôr (1). Väzba značeného [Tyr⁴]BN a nahradenie cytotoxickou bombezínovou antagonistovou analógiou, Q6^I4gB bolo uskutočnené pomocou konfluentných Swiss 3T3 buniek (získaných z Američan Type Culture Collection) v 24 priehlbinových platniach v modifikácii (2) metódy Kris a kol. (3). 3 až 5 dní po naočkovaní boli konfluentné bunky premyté dvakrát Hanksovým vyváženým soľným roztokom (HDSS) a inkubované počas 30 minút pri 37 °C 50 pM [¹²⁵I-Tyr⁴]BN v neprítomnosti alebo v prítomnosti niekoľkých koncentráciou neznačených kompetitorov Q6¹⁴gB alebo BN) v celkovom objeme 0,5 ml väzbového pufra (DMEN s 50 mM HEPES, 0,1 % bovinný sérový albumín (BSA), 5 mM MgCl₂ a 100 mikrog/ml bacitracínu, pH 7,4). Nešpecifická väzba bola určená v prítomnosti 1 mikroM neznačeného ligandu. Po 3 premytiach ľadovo studeným HBSS obsahujúcim 0,1 % BSA. (pH 7,4) boli bunky oddelené 0,05 % trypsín/0,53 mM EDTA roztokom a premiestnené do skúmaviek.

Rádioaktivita bola meraná gama počítačom (Micromedics Systems Inc., Rundsville, AL). Väzbové údaje boli vyhodnotené pomocou rádioligandových väzbových analytických programov od McPhersona (4).

Ki hodnoty uvedené v tabuľke 23-1 boli vypočítané podľa vzorca Chenga a Prusoffa (5).

1. Halmosakol., Cancer Letters, 85, 1 11 - 118 (1994)

2. Cai a kol., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 12664-15668 (1994)

3. Kris a kol., J. Biol. Chem. 262, 11215 - 11220 (1987)

4. McPerson, G. A., Pharmaco Methods 14, 213 - 228 (1985)

5. Cheng a Prusoff, Biochem.Pharmacol. 22, 3099-3108 (1973)

Tabuľka 23-1

Charakterizácia špecifickej väzby cytotoxického bombezínové-ho antagonistu Q₆ ¹⁴gB(2-pyrrolino-DOX^l4-0-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-ip-(CH₂-N)Leu-NH₂ k bombezínovým receptorom na Swiss 3T3 bunkovej línii v porovnaní s bombezínom

Zlúčenina	Ki (nm)
bombezín	1,2
Q1 14gB	1,0

Komparatívna účinnosť a toxicita hormónových konjugátov versus cytotoxická skupina.

Príklad 24

Liečenie pomocou 2-pyrrolino-DOX (Q₍₁), cytotoxickej LH-RH agonistovej analógie Q₆ ¹⁴gL(,^/D-Lys⁶/LH-RH viazaného na Q₆ ^l4-O-hemiglutarátu) a (DOX) estrogénóvo nezávislých MXT myších prsných rakovín (KS-49).

Aby sa porovnala nádorová inhibítorová aktivita cytotoxického doxorubicínovcho derivátu Q₆ a jeho cieleného cytotoxického peptidového konjugátu Q₆ ¹⁴gL rovnako ako dobre známeho antineoplastického prostriedka DOX a na určenie optimálneho spôsobu podávania a netoxických dávok boli LH-RH receptorovo pozitívne MXT (3.2) ovex nádorové kúsky (1 mm³) implantované subkutánne samiciam B₆D₂F1 myší.

deň po transplantácii boli myši náhodne rozdelené do skupín po 5 kusoch a začalo sa liečenie. Zlúčeniny boli rozpustené v 0,1 % trifluóroctovej kyseline (pH 2) a podávané intraperitoneálne.

Skupiny, liečebné postupy a dávky, rovnako ako priemerné doby prežitia sú uvedené v tabuľke 24-1. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 24-2 a na obrázku 1.

Tabuľka 24-2 ukazuje účinok liečenia pomocou Q₆ a LH-RH analógie Q<, ⁴gL na nádorové objemy a prežitie myší s estrogénóvo nezávislými prsnými rakovinami.

Ako je uvedené v tabuľke 24-2, 1,25 nmólov Q₆ podávaného v deň 1, 2, 7, 8, 14 a 15, skupina (2), vyvolalo silnú toxicitu charakterizovanú priemerným prežitím 17,4 dní, čo je významne kratšie, než prežitie neliečenej kontrolnej skupiny. V porovnaní, rovnaká dávka Q6^l4gL (skupina 6) mala priemerné prežitie 30,8 dní, čo je významne dlhšie, než prežitie neliečenej kontrolnej skupiny. Vyššia účinnosť Q6^l4gL oproti Q6 môže byť taktiež demonštrovaná porovnaním priemerných objemov finálneho nádoru v skupine 2 (1065 mm³ v deň 16) a v skupine 6 (863 mm³ v deň 31).

Podobné závery môžu byť demonštrované porovnaním Q₆ a Q₆ ¹⁴gL pri rozdielnom liečebnom rozvrhu, kde 0,5 nmólov liečiv bolo podávaných 5 dní v týždni počas 3 po sebe nasledujúcich týždňov.

Doxorubicín v toxickej dávke (celkové množstvá 1560 nmólov, priemerné prežitie 20 dňov) nemohol vymyť nádor, zatiaľ čo liečenie pomocou Q₆ ^l4gL v netoxickej dávke (celkové množstvo 7 nmólov, priemerné prežitie väčšie než 31 dní) viedlo k prežitiu dvoch z 5 zvierat bez rozvinutia nádoru.

Tabuľka 24-1

číslo skúp.	podanie	dávka/ inj. (nmól)	dávka/ inj. (pm)	inj./ týždeň	dni medzi injekciou	týždne podiv.	čelk. množs obdrž	priem, prežiti dni
1	kcnťrela							22
2	Q.	1,25	0,92	2	5			17,5
3		0,5	0,37				7.5	19,6
4		0,25 -	0,19	S	2		9.5	14,6
5		0,2	0,15				21	13,0
B	a«”si	1,25	2,9	2	5	3		30,8
7		0,5	1,16				7.5	26,8
8		0,25	0,56	5	2		3.5	19/
9		0,2	0,46				21	13,6
10		3,5	8,12				7	>31
11		4	9,28	1	S	2	6
12		5	11,6				10	13,4
13	DOX	520	340			3	1560	20,0

* Od dňa 9 po deň 12 bola dávka zvýšená na 2,5 nmól. Od dňa 9 po deň 12 bola dávka zvýšená na 5,0 nmól.

Tabuľka 24-2

c.	skúp.	Spôsob podania	konač. objem nádoru Ima3)	deň merania P	srieň, režltie (dni)	počet Í prežitýc myši be2 nádoru z 5 myši na sktip.
		dávka /inj. (mučí	počet injekcii za týždeň	prestávka medzi injek (dni)	trvanie liečby týždne	celk. injekč množstvo (nmól)				den 11	deň í 31
í	Kontrola						7322	21	2£O±l,6	0	0
2		1,25	2	5	3	7/	1055	16	17,4 ±3,2	0	0
6		1,25	2	5	3	7,5	263	31	30z8±D,4	2	0
i	Q<	V	5	2	3	7,5	2531	18	19,	0	c
7		0,5	S	2	3	V	5971	31	25,8 ±2,6	1	0
10	Q.'‘gL	3,S	1	O	2	7	669	31	>31	4	2
12	W	5,0	t	6	2	10	0	10	13,4	0	0
13	DOX	520	t	6	3	1560	15»	28	20	!	0

** prežitie je významne dlhšie (p je menšie ako 0,01), prežitie je významne kratšie (p je menšie ako 0,01) alebo (p je menšie ako 0,01) v porovnaní s kontrolnými údajmi pri použití Duncanovho testu.

Príklad 25

Účinky jednotlivého liečenia pomocou DOX, cytotoxických LH-RH analógií T-107 a Qi^l4gl- na estrogénovo nezávislé MXT myšie prsné rakoviny (KS-55)

Testované zlúčeniny:

Q[¹⁴gL: doxorubicin^l4-0-hemiglutarát viazaný na /D-Lys'VLH-RH,

T-107: N-glutaryldoxorubicín viazaný na /D-Lys⁶/LH-RH, Proc. Natl. Acad. Sci., zv. 89, s. 972 - 976 (1992) a DOX.

Skúšky boli vykonané nasledovne:

Aby sa určili maximálne tolerované dávky a porovnal účinok, MXT (3.2) ovex rakovinové kúsky (1 mm³) boli implantované subkutánne samiciam B₆D₂F1 myší. Jeden deň po transplantácii boli myši náhodne rozdelené do skupín po 5 zvierat a boli liečené jednotlivou injekciou i.p.

Skupiny a dávky sú uvedené v tabuľke 25-1. Tabuľka taktiež ukazuje počty myší, ktoré mali nádory, keď bol objem meraný a priemerné doby prežitia pre skupiny. Zmeny objemu nádoru sú uvedené na obrázku 2. Zlúčeniny boli rozpustené v 0,1 % TFA (pH 2,0). Objem nádorov bol meranývdňoch 10, 13, 17a20.

Ako je uvedené v tabuľke 25-1 a na obrázku 2, T-107 (/D-Lys^s/LH-RH viazaný na N-glutarylDOX), je úplne neefektívny pri inhibícii rastu tohto nádoru v dávke 850 nmól/20 g myši. Oproti tomu Q|^UgL, (/D-Lys⁶/LH-RH viazaný na 14-O-glutarylDOX) mal silné potlačenie rastu nádoru (obr.) pri netoxickej dávke 650 nmól/20 g myš.

DOX sám bol vysoko toxický (priemerná doba prežitia

13,6 dní) v jednotlivej dávke 650 nmól/20 g myš a významne menej účinný ako Q,¹⁴gL (obr. 2).

Č.	skupina	Dávka	pmol/kg	Počet nádorových my£Íí/ •'počet prežitých m.yôí,	Priemerné ?reáitie dni
nmol/ 20 g	M9' 20 g
den 10	den 13	den 17	deÄ 20
1 2	Kontrole Q.V	680	1520	34	5/5 1/4	5/5 2/4	5/5 2/4	5/5 3/4	21,210,3 28,61693 5.3125
3	Q<”sL	710	1587	35,5	2/4	3/4	3/4	3/4	26,01663 2,0134
4	Qi14gl	760	1698	38	3/5	4/5	4/5	(Sakr.I	(Sakr.)
5	DOX	650	427	32,5	3/3	2/2	1/1	1/1	13,6125
6	DOX	700	460	35	2/3	2/3	272		15,2124
7	DOX	750	493	37,5	1/1				7,811,3
6	T-107	750	1676	37,5	5/5	5/5	5/5	4/4	21,6105
9	T-107	850	1900	44,4	5/5	5/5	5/5	4/4	21,6107

* Prežitie je významne kratšie (p je menšie ako 0,01) ako prežitie kontrol ** Prežitie je významne dlhšie (p je menšie ako 0,01) alebo ^x (p je menšie ako 0,05) v porovnaní s kontrolou (1 myš, ktorá zahynula náhodne v deň 2, bola vynechaná z tejto 2 skupiny).

Príklad 26

Účinok cytotoxických LH-RH analógií na estrogénovo nezávislé MXT myšie prsné rakoviny (KS-47)

Látky použité na liečenie:

V skoršom experimente mal Q₂ v 20 nmólovej dennej dávke počas 17 dní len stredný inhibičný účinok na rast nádoru a bol toxický v dávke 40 nmól (stredné prežitie bolo

14,6 dní). Denná dávka 30 nmól bola zvolená pre súčasný experiment, ktorý porovnával účinnosť a toxicitu Q₂ ¹⁴gL (Q2 viazaný na /D-Lys⁶/LH-RH), Q2 (pyrrolidinodoxorubicín), /D-Lys⁶/LH-RH a /D-Lys⁶/LH-RH + Q.

MXT (3.2) ovex nádorové kúsky (1 mm³) boli transplantované samiciam B₆D₂F1 myši. Liečenie začalo 1 deň po transplantácii a pokračovalo po 12 i.p. injekciami 1 x denne. Všetky skupiny obdržali ekvimoláme množstvo zlúčenín, ako je to uvedené v tabuľke 26-1. Nádory boli merané v dňoch 10, 14 a 18 a bol vypočítaný objem nádorov. Údaje sú uvedené v tabuľke 26-1 a na obrázku 3.

Liečenie dennou dávkou 30 nmól daunosamínom modifikovanej doxorubicínovej analógie Q₂ (pyrrolidino-DOX) viedlo k silnému inhibičnému účinku na rast nádorov (objem nádoru 144 mm³ v deň 14 oproti 1391 mm³ pre kontrolnú skupinu), ale mal silnú toxicitu, keď zabil všetky zvieratá pred koncom experimentu (priemerné prežitie 17,9 dňa).

Podobne Q₂ kombinovaná (zmes) /D-Lys⁶/LH-RH mala za následok silný nádorovoinhibičný účinok (objem nádoru 80 mm³ v deň 14), ale priemerné prežitie (18,5 dní) bolo významne kratšie ako prežitie neliečenej kontrolnej skupiny (23,1 dni).

Ako výsledok liečenia pomocou Q₂’⁴gL (Q₂ kovalentne viazaný na /D-Lys⁶/LH-RH) 2 zvieratá zomreli, 1 v deň 16 a druhé v deň 26. Z 8 prežitých zvierat len pri jednom sa vyvinuli nádory pri poslednom meraní v deň 18 a všetky vyzerali zdravo, ale neskôr sa u všetkých začali vyvíjať nádory. Priemerné prežitie pre túto skupinu bolo významne dlhšie (28,3 dni) ako prežitie kontrolnej skupiny. Liečenie /D-Lys⁶/LH-RH samotným neovplyvnilo nádorový rast.

Tento experiment demonštruje, že vyššiu účinnosť a nižšiu periferálnu toxicitu Q₂ ¹⁴gL oproti cytotoxickej skupine Q₂ je možné prisúdiť kovalentnej konjugácii cytotoxickej skupiny na cielený nosič LH-RH analógii.

Tabuľka 26-1

Účinok cytotoxických LH-RH analógii na rast estrogénovo nezávislých MXT myších prsných rakovín a prežitie myší s nádormi

č.	liečenie	dávka - Qim/defl	počet	stredný objem nádoru v nnr v dňoch
10	14	16
1	kontrola		15	253	1391	4794
2	Qľ'íL	66.7	10	33	16	23
3	Q:	21.3	10	153	144	137
4	ID-Lys‘}LH-RH	46.0	10	165	1346	4003
5	[D-LyshĽH-RH + Q:	48.0 + 21.3	10	121	80	27

---------------------------------------₍ priemer, prežitie po transplantácii

Všetky denné dávky sú 30 nmól ekvimoláme množstvo. Významne kratšie ako kontrola (p je menšie ako 0,05) * významne dlhšie ako kontrola (p je menšie ako 0,01) s Duncanovým testom

Príklad 27

Účinky 2-pyrrolino-DOX (Q₆) a cytotoxickej LH-RH agonistovej analógie Q₆ ¹⁴gL (/D-Lys⁶/LH-RH viazaného na Q₆ ¹⁴-hemiglutarát) na rast androgénne závislých krysích Dunning R-3327-H prostatových karcinómov.

Samčie kodaňské krysy nesúce hormónovo závislé Dunning R-3327-H prostatové karcinómy boli liečené Q₆ ¹⁴gL, novou cytotoxickou analógiou luteinizačného hormónu uvoľňovacieho hormónu (LH-RH) pozostávajúceho z agonistov /D-Lys⁶/LH-RH viazaného na 2-pyrrolinodoxorubicín.

V prvom experimente bol 2-pyrrolinodoxorubicín podávaný v koncentrácii 50 nmólov/kg ako jediné liečivo (Q₆) a ako nekonjugovaná zmes s /D-Lys⁶/LH-RH alebo konjugovaný s nosičom /D-Lys⁶/LH-RH (Q6¹⁴)gL. Po druhom podaní 50 nmól/kg skupiny Q6 samej alebo zmiešanej s /DLys⁶/LH-RH všetky krysy zahynuli so známkami všeobec nej toxicity, zatiaľ čo všetky zvieratá liečené cytotoxickým LH-RH konjugátom Q₆ ¹⁴gL prežili.

Po piatich týždňoch liečenia celkovou dávkou 150 nmólov/kg Q₆ ¹⁴gL sa nádory zmenili z pôvodného objemu 8,35 ± 1,7 cm³ na začiatku experimentu, na 4,47 ± ± 0,8 cm⁵, zatiaľ čo nádory v kontrolnej skupine pokračovali v raste a merali 17,84 ± 2,2 cm⁵. Liečenie pomocou Q₆ ¹⁴gL taktiež významne znížilo hmotnosť, tumoru a tiaž tumoru.

V druhom experimente určenom na porovnanie účinnosti a toxicity Q₆ a Q₆ ¹⁴gL, pozostával terapeutický režim z troch aplikácií 25 nmólov/kg Q6 alebo 25 nmólov/kg a 50 nmólov/kg Q6^l4gL. Keď bolo liečenie začaté, objem nádorov vo všetkých skupinách bol medzi 3,9 až 4,5 cm³. Po 5 týždňoch terapie nádory pri krysách liečených 50 nmól/kg Q6^l4gL poklesli na 2,3 ± 0,51 cm³, zatiaľ čo 25 nmólov/kg Q6 bolo stále toxických a mohlo iba produkovať zníženie konečného objemu nádorov na 6,76 ± ± 1,4 cm³, podobne ako bolo dosiahnuté s 25 nmól/kg Q6¹⁴gL (6,74 ± 1 cm³) v porovnaní s 15,6 ± 2,2 cm⁵ pre neliečené zvieratá.

Histologické vyhodnotenie vzoriek ukázalo významné zníženie mitotických buniek v Q₆ ^l4gL liečených skupinách. LH-RH receptory s vysokou väzbovou kapacitou boli zistené v membránach neliečených vzoriek Dunningovho nádoru, ale po liečení pomocou Q₆ ¹⁴gL žiadne väzbové miesta pre LH-RH neboli nájdené.

Inhibícia rastu nádoru pomocou AN-201 a Q₆ ¹⁴gL bola taktiež spojená s významným poklesom väzbovej kapacity EGF receptorov.

Ako je demonštrované na obrázkoch 4 až 6 cielená cytotoxická LH-RH analógia Q₆ ^l4gL je účinným protinádorovým prostriedkom vyvolávajúcim regresiu krysích Dunning R-3327-H prostatových karcinómov. Štúdie taktiež ukázali, že cytotoxická LH-RH analógia Q6¹⁴gL je oveľa menej toxická ako antineoplastická skupina Q₆, ktorá je začlenená a významne aktívnejšia pri inhibícii rastu nádorov.

Obrázkové legendy pre príklad 27

Obr. 4, experiment I

Objem nádorov pri samcoch kodanských krýs nesúcich krysie Dunning R-3327-H prostatové karcinómne transplantáty počas liečenia pozostávajúceho z 3 aplikácií 50 nmólov/kg agonistu /D-Lys'7LIÍ-RH a 50 nmólov/kg cytotoxickej LH-RH analógie Q6¹⁴gL. Vertikálne čiary indikujú SEM. *p je menšie ako 0,05, ** p je menšie ako 0,01 oproti kontrole pomocou Duncanovho nového viacnásobného rozsahového testu. Liečenie označené šípkami bolo aplikované počas dní 1, 8 a 29. + zvieratá liečené pomocou Q_e ako jediným liečivom alebo nekonjugovanou zmesou s /D-LysÚLH-RH zahynuli počas druhého týždňa. Pri týchto dvoch skupinách je znázornený objem nádorov zaznamenaný počas 8 dňa.

Obr. 5, experiment II

Účinok liečenia s 25 nmól/kg Ž-pyrrolinodoxorubicínu (Q₆), 25 nmól/kg a 50 nmól/kg cytotoxickej LH-RH analógie Q«^l4gL na objem nádorov pri krysách s Dunning R-3327-H rakovinou prostaty. Vertikálne čiary označujú SEM ^xp je menšie ako 0,05, ^xxp je menšie ako 0,01 oproti kontrole. Liečenia označené šípkami boli aplikované trikrát, a to počas dní 1, 8 a 29.

Obr. 6, experiment II

Účinok liečenia s 25 nmól/kg 2-pyrrolinodoxorubicínu (Q_Ď), 25 nmól/kg a 50 nmól/kg cytotoxickej LH-RH analó gie Q6^l4gL na telesnú hmotnosť kodaňských krýs nesúcich Dunning R-3327-H rakovinu prostaty. Vertikálne čiary označujú SEM *p je menšie ako 0,05, ^xxp je menšie ako 0,01 oproti kontrole. Liečenia označené šípkami boli aplikované trikrát, a to počas dní 1, 8 a 29.

Príklad 28

Porovnávacia štúdia účinku doxorubicínu (DOX) cielenej cytotoxickej LH-RH agonistovej analógie Q,¹⁴gL (/D-Lys⁶/LH-RH viazanej na DOX¹⁴-O-hemiglutarát) na rast OV-1063 ľudského vaječníkového karcinómu pri holých myšiach.

Ľudská epiteliálna vaječníková rakovinová bunková línia OV-1063 pochádzala z metastatického papilámeho cystadenokarcinómu vaječníka 57-ročnej ženy (Horowitz a kol. (1985) Oncology 42, 332 - 337). Desať miliónov buniek OV-1063 bolo injektovaných subkutánne do troch holých myší na pestovanie nádoru. Kúsky týchto nádorov veľkosti 1 mm³ boli transplantované 60 zvieratám na in vivo štúdiu inhibície rastu.

Cieľom tohto experimentu bolo demonštrovať, že ako výsledok prítomnosti receptorov pre LH-RH na OV-1063 bol cytotoxický konjugát LH-RH účinnejší a menej toxický ako DOX, cytotoxická skupina v ňom obsiahnutá. Tak boli účinky cytotoxického LH-RH konjugátu porovnané s účinkami DOX, zmesí DOX s nosnou molekulou, samotným nosičom a neliečenou kontrolnou skupinou.

Všetky injekcie boli podávané intraperitoneálne. Všetky zlúčeniny boli rozpustené v 0,9 % chloride sodnom vo vode (soľný roztok).

Myši s priemernou veľkosťou nádoru asi 15 mm³ boli rozdelené do 6 skupín po 9 zvierat a 7 dní po transplantácii nádoru boli liečené nasledovne: skupina 1 - soľný roztok, skupina 2 - Q|¹⁴gL v dávke 700 nmólov/20 g zvieraťa, skupina 3 - Qi^l4gL v dávke 413 nmólov/20 g zvieraťa, (maximálne tolerovaná dávka MTD pre DOX), skupina 4 - DOX v dávke 413 nmólov/20 g zvieraťa (MTD), skupina 5 - zmes 700 nmól/20 g DOX a 700 nmól/20 g /D-LysÚLH-RH, skupina 6 - nosičová agonistová analógia /D-Lys⁶/LH-RH v dávke 700 nmól/20 g zvieraťa.

Analýza receptorov OV-1063 mala prítomnosť vysokej afinity väzbových miest pre LH-RH.

Výsledky

Ako je znázornené na obrázku 7 silná inhibícia rastu nádorov bola dosiahnutá liečením pomocou Qi¹⁴gL v dávke 413 nmólov/20 g (skupina 3). Zvieratá nemali známky vážnej toxicity. Na porovnanie, liečenie pomocou DOX podávaného v rovnakej dávke 413 nmól/20 g (12 mg/kg, MTD, skupina 4) nemalo významnú inhibíciu rastu nádorov pri troch zvieratách prežitých na konci experimentu. 3 zvieratá zahynuli v deň 5 a 6 zvierat zahynulo v deň 9 vplyvom toxicity.

Pri vyššej dávke (700 nmól/20 g, skupina 2), Qi'⁴gL malo veľmi silnú inhibíciu rastu nádoru (obr. 7). Dva z 9 zvierat zahynuli vplyvom toxicity a 1 zviera zahynulo náhodne. 6 prežitých zvierat sa zotavovalo z hmotnostnej straty asi 20 % na konci experimentu. V skupine 6 rovnako vysoká dávka (700 nmól/20 g) DOX bola zmiešaná so 700 nmól /D-Lys⁶/LH-RH. Počas piateho dňa všetky zvieratá v tejto skupine zahynuli na následky silnej toxicity.

Závery

Výsledky jasne demonštrujú, že vplyvom prítomnosti receptorov pre LH-RH na bunkách epiteliálnej vaječníkovej rakoviny OV-1063 cielený cytotoxický LH-RH konjugát

Qi'⁴gL má nižšiu toxicitu a vyšší protinádorový účinok ako doxorubicín Q_b ktorý obsahuje cytotoxickú skupinu.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob konverzie dusíka primárnej aminoskupiny alfa, beta- alebo alfa, gama-hydroxyprimámeho amínu na dusík mononenasýtenej dusík obsahujúcej heterocyklickej zlúčeniny majúcej 5 až 6 atómov v kruhu, vyznačujúci sa tým, že sa postupne: a) spracuje uvedený hydroxyamín s prebytkom halogénaldehydu majúceho aldehydový uhlík, halogén nesúci uhlík a majúceho 2 až 3 skupiny medzi aldehydovým uhlíkom a halogén nesúcim uhlíkom vybrané zo skupín CH₂, CH₂CH₂ a OCH₂, b) pridá sa prebytok, vo vzťahu k hydroxyamínu, organickej bázy, c) táto báza sa neutralizuje slabou kyselinou, a d) nasleduje spracovanie zriedenou vodnou kyselinou.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , že stupeň a) sa realizuje v aprotickom reakčne inertnom organickom rozpúšťadle.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m , žc stupeň a) sa realizuje v polárnom nehydroxylovom reakčne inertnom organickom rozpúšťadle.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že ako rozpúšťadlo sa použije dimetylformamid.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že aldehyd sa vyberie zo skupiny zahŕňajúcej omega-bróm- a omega-jódbutyraldehyd a valéraldehyd.