CZ135798A3

CZ135798A3 - Cílené cytotoxické anthracyklinové analogy

Info

Publication number: CZ135798A3
Application number: CZ981357A
Authority: CZ
Inventors: Andrew V. Schally; Attila Nagy; Ren-Zhi Cai
Original assignee: Asta Medica Aktiengesellschaft
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1996-11-14
Publication date: 1998-10-14
Also published as: JP2007045845A; DK0863917T3; EP0863917A1; CZ297297B6; ES2205067T3; AU709539B2; EP1384710A1; KR19990071672A; BR9611647A; HK1017363A1; JP2000502055A; CA2471775C; EP1384710B1; CA2238574A1; IS4734A; KR20040037176A; PL187230B1; DE69630233T2; ATE251179T1; HK1052920B

Description

Cílené cýtotoxické anthracyklinové analogy

Tento vynález byl částečně vytvořen s podporou vlády. Vláda má.určitá práva k této přihlášce vynálezu.

' /

Oblast techniky ---------------—--- · ·--„ ..__

Tento vynález spočívá v oblasti chemie cílení protirakovinových anthracyklinóvých derivátů. Zejména se týká doxorubicinu (DÓX) nebo jeho daunosaminových modifikovaných derivátů (DM-DOX) vázaných kovalentně k analogům peptidových hormonů jako je LH-RH, bombesin a somatostatin. Tyto kovalentní konjugáty jsou cíleny k různým nádorům nesoucím receptory pro peptidové hormonové analogy.

Dosavadní stav techniky _v LH-RH analogy, které mají cýtotoxické skupiny v šesté poloze, jsou uvedeny v Schally, Janaky a Bajusz, EP 0 450 461 Bl, publikovaná 6. září 1995.

GnRH (LH-RH) analogy pro ničení gonadotropů jsou popsány v Nett a Glode, WO 90/09799, publikované 7. září 1990.

Tato přihláška popisuje toxiny jako je ricin, vázané k analogům LH-RH pro ničení gonadotropů a tak léčení rakovin závislých na pohlavních hormonech. LH-RH doxorubicinový derivát je také zmíněn bez specifikace chemie vazby.

Cýtotoxické somatostatinové analogy jsou popsány Schallym a kol. v US patentové přihlášce přihlášené 6. dubna 1990 a znovu přihlášené 15. července 1993 pod pořadovým číslem

08/076846.

Přehled od A.V.Schallyho v Anti-Cancer Drugs 5, 115 až 130 (1994) uvádí detaily o přítomnosti receptorů na buněčných membránách široké škály nádorů pro analogy LH-RH, bombesin nebo somatostatin.

G.Weckbecker shrnuje několik referencí, které ukazují “přitomnost^rečeptOrů“a receptorových subt-ipů—pro-somatostati-——--Inové analogy na několika normálních a nádorových tkáních v jeho přehledu v Farmác. Ther. 60, 245-264 (1993).

Bombesinovité peptidy a přítomnost bembesin/GRP receptorů na různých normálních a nádorových tkáních jsou diskutovány v přehledu od N. Bunnetta v Gut Peptides: Biochemistry a Physiology, 423-445 (1994) Ed.: J. Walsh a G. J. Dockray, Raven Press, New York a od E. Spindella v Recent Progress in Hormone Research, 48 (1993) (Academie Press).

Doxorubicin (DOX) je v současné době nejšířejí používaným a velmi potentním protirakovínovým prostředkem. Avšak určité nádory na něj nereagují vůbec a jeho použití je také ome- ·?

zeno multidrogovou rezistencí (MDR) a kardiotoxicitou stejně t:

jako neutropenií, které jsou výsledky chronického léčení. Aby se tyto nevýhody překonaly a pro další využití enormního tumoricidního potenciálu obsaženého ve struktuře anthracyklinových antibiotik, byly dosud popsány tisíce syntetiackých derivátů zahrnujících jejich cílené analogy vázané k různým nosí ným makromolekulám.

I £

Většina historie DOX a jeho analogů je popsána v Adriamycin” David W. Henry ACS Symposium Series, číslo 30, Cancer

Chemotherapy, Američan Chemical Society, str. 15 až 57, (1976) a v knize Doxorubicin, Federico Arcamone, Academie Press, (1981).

4*4 « . . ..- 3 Vysoce aktivní alkylační, nesííové rezistentní 3'-deamino3'-(3''-kyan-4-morfolinylJ-DOX a jeho deriváty, které mají protinádorový účinek, jsou popsány v Mosher a j., US patent číslo 4 464 529, 7. srpen 1984. Syntéza a biologické vyhodnocení těchto intenzivně potentních morfolinylových anthracyklinů jsou popsány také v J. Med. Chem. 1984, 27, 638-645.

V Proč. Nati. Acad. Sci. USA sv. 88, str. 4845-4849, červen 1991, Gao a J. popisují formaldehydem zprostředkovanou alkylaci DNA sekvence daunorubicinovým derivátem.

Anthracyklinové analogy nesoucí latentní alkylační substituenty jsou popsány v J. Mech. Chem. 35, 3208-3214 (1992).

Použití alfa, omega-diodové sloučeniny pro alkylaci dáunosaminového dusíku DOX a tak tvorbu nového morfolinylového DOX derivátu je popsáno v evropském patentu EP 434 960 přihlášeného firmou Pharmacia Carlo Erba 12. prosince 1989.

N-Trifluoracetyladriamycin -O-hemiglutarat a -hemiadipat jsou uvedeny jako analogy N-trifluoracetýladriamycin -O-valeratu (AD-32) se zvýšenou vodorozpustností v Israel a j._f US patent 4 299 822, 10. listopad 1981.

Horton a Priebe (J. Antibiotics, XXXVI, 1211-1215) popisují několik 14-O-esterů různých anthracyklinových analogů s žádnými dramatickými změnami v protirakovinové účinnosti ve srovnání s 14-OH mateřskými analogy.

V dosavadním stavu techniky navrhování cílených chemoterapeutických prostředků jsou požadovány následující cíle:

1. stabilní vazba mezi nosnou molekulou a chemoterapeutickým prostředkem dokud se nedosáhne cíle.

2. Zachované biologické vlastnosti nosné molekuly v konjugátu tak jako zachované vazební vlastnosti.

3. Zachovaná farmaceutická účinnost chemoterapeutického prostředku v konjugátu tak jako zachovaná cytotoxická účinnost.

4. Jako výsledek konjugace, produkce analogůintenzívnějšího účinku a/nebo niž&í periferní toxicity ve vztahu k nekonjugovaným skupinám.

Konjugace DOX pomocí NaIO₄ oxidace daunosaminové skupiny DOX následované redukční alkylací zahrnující primární amin nosné molekuly je popsána v Sela a j. US patent č. 4 263 279, 21. duben 1981. Cis-akonitová vložka byla použita k vazbě daunosaminového dusíku k makromolekulárním nosičům s pH senzitivní vazbou, jak je popsáno v Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981 102, 1048-1054.

Tvorba esterových vazeb a C-N vazeb mezi 14-bromdaunorubicinem a proteiny nebo poly-N-aminokyselinami je popsána, od Zunino a j. (1981) Tumori 67, 521-524 a (1984) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 20, 421-425.

Morfolino-DOX (vysoce aktivní daunosaminem modifikovaný analog DOX) byl konjugován k protilátce pomocí hydrolyzovatelné {lysosomotropní, pH senzitivní) hydrazonové vazby zahrnující C-13 oxofunkci cytotoxického prostředku, jak je popsáno v Bioconjugate Chemistry 1990 1(5), 325-330.

Citlivost karboxamidové vazby leucinového zbytku k enzymatické degradaci byla úspěšně využita v konjugátech DOX obsahujících vymezovací rameno peptidu, výhodně Ala-Leu-Ala-Leu, kde karboxy terminál Leu acyluje daunosaminový dusík v DOX a amino terminál Ala je vázán k nosiči přes vložku dikarboxylové

kyseliny, jak je popsáno v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1982 79, 626 - 629.

i··,

Daunosaminový dusík DOX byl acylován vložkou glutarové kyseliny a vázán k LH-RH analogům se závažnou ztrátou cytotoxického účinku jak je popsáno v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1982 89? 972-976Ú “-----------------------------------—--Další reference vztažené k použití sloučenin podle předloženého vynálezu pro léčení různých lidských nádorů jsou uvedeny níže:

1. Schally et.al. (1996) in Treaunent with GnRH Analogs: Controversies and

Perspectives, eds. Filicort, M. & Flamignt, C. (Parthenon.Carnforth, U.K.), pp. 33-44. _

2. Nagy etal.(1996) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7269-7273.

3. Yanoetal. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7090-7094.

4. Rekasi et.al. (1993) Endocrinology 132(5) 1991-2000.

5. Srkalovic et.al. (1990) Cancer Res. 50,1841-1846.

6. Emons et.al (1993) Cancer Res. 53, 5439-5446.

7. Emons et.al. (1993) Joumal of Clin. Endocrin. and Metabol. 77(6) 1458-)

8. Schally, A. V. (1988) OncologicaJ applications of somatostatin analogs.

Cancer Res. 48, 6977-6985.

9. Schally etal. (1994) International Joumal of Pancreatology 16,277-280.

10. Srkalovic etal. (1990) Joumal of Clinical Endocrinology and Metabolism

70(3), 661 -669. 4 Pinski etal. (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.

11. Radulovic etal. (1992) Cancer Letters 62, 263-271.

12. Qin etal. (1995) Int J. Cancer 60, 694-700. ' ' ^:

13. Radulovic etal. (1992) P.S.E.B.M. 200, 394-401.

14. Radulovic etal. (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701.

15. Pinski etal. (1993) Cancer Letters 71,189-196.

16. 0’Byrne etal. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(11) 1682-1687.

17. Pinski etal. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

18. Pinski et. al. (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.

φ φφ

19. Pinski et.al. (1996) Int. J. Cancer 65, 870-874.

20. Banks et.al. (1992) Anticancer Drugs. 3, 519-523.

21. Reubi and Kvols (1992) Cancer Res. 52, 6074-6078.)

22.Schally et.al. (1994) Intemational Journal of Pancreatology 16,277-280.

23. Halmos et.af. (1995) Cancer Res. 55,280-287.

24. Halmos et.al. (1994) Cancer Letters 85, 111-118.______________________

25. Qin et.al. (1994) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 120, 519-528

26. Qin et.al. (19940 Cancer Res. 54,1035-1041.

27. Qin etál. (1995) Int. J. Cancer 63, 257-262.

28. Reile et.al. (1994) The Prostatě 25, 29-38.

29. Pinski et.al. (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.

30. Radulovic etal. (1992) P.S.E.B.M. 200, 394-401.

31. Radulovic et.al. (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701.

32. Pinski et.al. (1993) Cancer Letters 71,189-196.

33. Pinski et.al. (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

34. Pinski et. al. (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.)

Všechny uvedené citace jsou zde začleněny odkazem.

Podstata vynálezu

Sloučeniny tohoto vynálezu jsou nové cílené cytotoxické peptidové hormony obsahující anthracyklinový cytotoxický prostředek jako je DOX nebo DM-DOX konjugovaný s peptidovým hormonem, jako jsou analogy LH-RH, bombesin a somatostatin... Tyto cytotoxické peptidové hormonové konjugáty jsou určeny pro léčení nádorů nesoucích specifické receptory pro konjugát jako je rakovina prsu, rakovina vaječníků, endometriální rakovina, rakovina prostaty, rakovina pankreatu, rakovina tlustého střeva, rakovina zažívacího ústrojí a rakovina plic.

- 7 Určité z těchto (nekonjugovaných) anthracyklinových cytotoxických prostředků, které jsou zde využity, jsou samy o sobě nové a vysoce potentní, ale jejich úroveň toxicity je však příliš vysoká pro to, aby byly využity v nekonjugované formě.

Daunosaminem modifikované DOX analogy uvedené v tomto vynálezu byly vyvinuty během výzkumu nových vysoce aktivních--nesířove rezistentních analogů DOX vhodných pro tvorbu kovalentních konjugátů s peptidovými nosiči.

g

Tvorba stabilních kovalentne vázaných konjugátů plně zachovanými biologickými účinky jejich složek bylo dosaženo pomocí vložky dikarboxylové kyseliny, jako je kyselina glutarová. Jednak karboxylová skupina této vložky tvoří esterovou vazbu s 14-OH skupinou DOX nebo DM-DOX a druhá karboxylová skupina vložky tvoří karboxamidovou vazbu s dobře zvolenou volnou aminoskupinou peptidového nosiče.

Sloučeniny tohoto vynálezu jsou představeny obecným vzorcem I

Q¹⁴-O-R-P (I), kde Q má obecný vzorec Ji

HO

»· ·

....... - 8 _Značí Q skupinu s postranním řetězcem v poloze 14,

R je H nebo -C(O)-(CH_) -C(0)- a n = 0 až 7, z n

R' je NH2 nebo aromatická, nasycená nebo částečně nasycená 5ti nebo 6ti členná heterocyklická sloučenina mající alaespoň jeden kruhový dusík a případně mající butadienovou skupinu vázanou—k—piíh-leh-lému-a-tomu-uhliku—k_tomuto_kruhu.,_čímž_s.e_____ vytvoří bicylický systém, p je H nebo peptidová skupina vhodně LHRH, somastatinový nebo bombesinový analog, ale nevyl/učující jiné fyziologicky aktivní peptidy. Zvlášř žádoucí jsou ty LHRH analogy, které mají afinitu k neoplastickým buněčným receptorům, zejména ty analogy, které mají D-Lys skupinu v poloze 6 stejně jako zkrácené somastatinové a bombesinové analogy.

Nicméně kde N' je NHj, pak R a P jsou jiné než H. Když R a P jsou H, pak R' je jiný než NHj.

Nová syntézní reakce byla objevena během této práce. Bylo nejen zjištěno, že doxorubicin a jeho deriváty mohou být sloučeny pomocí dikarboxylové skupiny v poloze 14, čímž se získají nové farmakologicky účinné konjugáty, ale byl vytvořen nový způsob pro formaci částečně nasycených heterocyklických skupin z vicinálních a disjunktivních, to je alfa,betanebo alfa,gama-hydroxyprimárních aminů.

Zvláštní aplikace v tomto vynálezu je tvorba 2^l,'-pyrrolinyl a 1 ,3''-tetrahydropyridinylových skupin na daunosaminovém cukru. Avšak tato reakce má širší použitelnost. 5ti a 6ti členné částečně nasycené heterocyklické skupiny mohou být vytvořeny, když vicinální nebo disjunktivní amin se nechají reagovat s halogen substituovaným aldehydem majícím 2 nebo 3 skupiny mezi aldehydovým uhlíkem a uhlíkovým atomem majícím halogen skupinu.

- 9 Tyto skupiny mohou být všechny methylenové nebo může být zahrnuty heteroatom jako je kyslík.

Reakce se uskutečňuje ve třech stupních. Velký přebytek halogenaldehydu se nechá reagovat s kyselinou solí hydroxyaminu, výhodně v polárním inertním bezvodém organickém rozpouštědle. Takto se vytvoří 5Ώ~členný oxazolidinový-kruh--(nebo 6ti členný 1,3-tetrahydrooxazinový kruh) kondenzací aldehydové skupiny s hydroxylovými a aminovými skupinami.

Tento produkt se zpracuje s organickou bází, vhodně terciárním aminem» čímž se eliminují prvky hydro^halogenové kyseliny mezi halogenovou skupinou dřívějšího halogenaldehydu a sekundární aminoskupinou oxazolidinového nebo 1,3-tetrahydrooxazinového kruhu, čímž se vytvoří kondenzovaná kruhová struk-, tura přídavkem 5ti nebo 6ti cleného kruhu. Báze se pak neutralizuje slabou kyselinou, výhodně organickou kyselinou jako je ledová kyselina octová.

Zpracování s vodnou kyselinou,výhodně organickou kyselinou, otevírá oxazolidinovou nebo 1,3-tetrahydrooxažinovou část kondenzovaného kruhu. To je zřejmé odborníkům v oboru, že v závislosti na výchozím aldehydu, finální dusík obsahující kruh může obsahovat alespoň 1 další heteroatom jak bylo výše uvedeno.

Obecná reakce může být znázorněna následovně:

-c-z-c-	. (III)
1 1 OH NH,· X'	(velký přebytek) v rozpouštědle, bezvodém
1	aprotickém rozpouštědle
^H o CH₂ \ η / C-(CH₂-Y)

• *

- 10 -c-z-cI I

O NH CH₂-X' \ / / CH-(CH_?-Y)______ (IV) báze (terciární bezvodý amin)

------------------>

-c-z-cI I o N--CH₂ \ / / CH-(CH₂-Y) (V)

HjO + kyselina

---------------φ

HO N / \

CH CH₂\\ / (CH-Y) kde

X* je halogen» vhodně brom nebo jod» výhodně jod, γ je ch₂, och₂, ch₂-ch₂,

Z je 0 nebo CH₂·

Když Z je 0, aldehydový zbytek tvoří 5ti členný kruh jako první stupeň reakce. Když Z je CH₂» aldehydovy zbytek tvoří 6ti členný 1,3-tetrahydrooxazinový kruh.

- 11 Zatímco takovéto kruhové formace jsou dobře známy, v kombinaci s uzavřením kruhu prováděném halogenalkanovým postranním tětězcem v basickém prostředí, jako je terciární amin v bezvodém prostředí, je tato reakce nová a překvapující.

Stručný popis výkresů_________________________________________

Obr. 1 je graf objemových změn estrogenově' nezávislých

MXT myších prsních rakovin pro různé dávkové úrovně sloučenin tohoto vynálezu a DOX.

Obr. 2 je graf objemových změn estrogenově nezávislých

MXT myších prsních rakovin pro různé dávkové úrovně určitých sloučenin tohoto vynálezu, sloučeniny dosavadního stavu techniky, DOX a kontroly.

Obr. 3 je graf účinku určitých cytotoxických LHRH analogů na přežití myší s estrogenově nezávislými MXT myšími prsními rakovinami.

Obr. 4 je graf nádorového objemu u samčích kodaňských krys nesoucích krysí Duhning R-3327-H prostatorakovinové transplantáty, během léčení známým agonistou a určitou sloučeninou tohoto vynálezu.

Obr. 5 je graf ukazující účinek léčení určitou sloučeninou tohoto vynálezu a odpovídajícím cytotoxickým LH-RH analogem na nádorový objem u krys s Dunning R-3327-H rakovinou prostaty.

Obr. 6 je graf ukazující účinek léčení určitou sloučeninou tohoto vynálezu a odpovídajícím cytotoxickým LH-RH analogem na tělesnou hmotnost kodaňských krys nesoucích

Dunning R-3327-H rakovinu prostaty.

* ·

- 12 Obr. 7 je graf ukazující inhibici růstu nádoru dosaženou léčením určitou sloučeninou tohoto vynálezu a DOX.

Příklady provedení vynálezu

Popis výhodných provedení

Skupina Q když je substituována v R* určitými výhodnými skupinami, má podskupinová označení až Q_g z nichž Q₂ až Qg jsou nové cytotoxické skupiny.

R' má výhodné hodnoty vedoucí k požadovaným Q skupinám <» uvedeným v závorkách následovně: NH₂ (Q^), pyrrolidin-l-yl (Q₂)» isoindolin-2-yl (Qg), 3-pyrrolin-l-yl (Q^), 3-pyrrolidon-l-yl (Qg); 2-pyrrolin-l-yl (Qg); 3-piperidon-l-yl (Q?), nebo 1,3tetrahydropyridin-l-yl (Qg).

Tak jestliže R-P je H a -R' je -NH₂, ®i ^D0X' ještěže R-P je H a R' je pyrrolidin-l-yl, Q2 je 3'-deamino-3*-(pyrrolidin-1''-yl(doxorubicin) Q2, jestliže R-P je H a R' je isoindolin-2-yl, Qg je 3'-deamino-3'-(isoindolin-2''-yljdoxorubicin (Qg), jestliže R-P je H a -R' je 3-pyrrolin-l-yl, Q4 je 3'-deamino-3'-(3-pyrrolin-l'’-yl)doxorubicin (Q^), jestliže R-P je H a -R' je 3-pyrrolidon-l-yl, Q5 je 3'-deamino-3'(3''-pyrrolidon-1''-yl)doxorubicin (Qg); jestliže R-P je H a -R^f je 2-pyrrolin-l-yl, Qg je 3'-deamino-3'-(2-pyrrolin-l„yljdoxorubicin? (Qg).; jestliže R-P je H a R' je 3-piperidon-1-yl, Q? je 3'-deamino-3'-(3''-piperidon-1''-yl)doxorubicin (Q_?), jestliže R-P je H a -R' je 1,3-tetrahydropyridin-l-yl, Q_g je 3'-deamino-3'-(l'',3''-tetrahydropyridin-1''-yl)doxorubicin (Qg).

*4 · · ·*· «

- 13 Sloučeniny začleňující daunosaminový dusík v 5ti členném kruhu s alkylační funkcí jsou 10 až 50 x aktivnější in vitro než jejich homologové protějšky začleňující daunosaminový dusík v 6ti členném kruhu. (Takovéto páry jsou Qg a Q? stejně jako Qg a Q_q).

Ve výhodných provedeních tohoto vynálezu v látce vzorce q!4_o-r-p, r a P jsou jiné než vodík. Kde P je jiný než vodík, to je kde je P_lf Pj a Pg, vhodně kde P^ je LH-RH antagonistový nosič, LH-RH antagonistový nosič nebo zkrácený LH-RH analogový nosič, P₂ je zkrácený somastatinový analog a Pg je bombesinový antagonista.

Vhodně Pj je Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-ProDdd, kde (Xxx) je vodík nebo diaminosubstituent jako je A₂Bu nebo A₂Pr, přičemž kde:

Áaa je Glp, pak Bbb je His, Ccc je Trp a Ddd je Gly-NH₂, Aaa je Ac-D-Nal(2), Ac-D-Phe nebo Ac-D-Phe(4Cl), pak Bbb je D-Phe(4C1) nebo D-Phe, Ccc je D-Pal(3) a D-Trp a Ddd je D-Ala-NH₂, a kde Aaa-Bbb-Ccc je Ac, pak Ddd je -NH-CH^Hg, i--------------------------------------------------------------------------------1

Aaa-Cys-Bbb-D-Trp-Lys-Ccc-Cýs-Ddd-NH₂, přičemž kde Aaa je D-Phe, pak Bbb je Tyr, Ccc je Val a Ddd je Thr nebo Trp a kde Aaa je D-Trp, pak Bbb je Phe a Ccc a Ddd jsou Thr , aP.j je Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Bbb-NH₂ přičemž Aaa je nula, D-Tpi nebo D-Phe a Bbb je (CH₂-NH)Leu, (CH₂-NH)Phe, (CH₂-NH)Trp, (CH₂-N)Tac nebo (CH₂-N)DmTac.

- 14 • fl · ·

V nových sloučeninách tohoto vynálezu začleňujících analogy LH-RH je cytotoxická skupina Q připojena k D-Lys postrannímu řetězci na LH-RH analozích nebo (Xxx) připojená skupina přes vložku dikarboxylové kyseliny, jak je formulováno ve vzorci VII:

Aaa-Bbb-Ccc-Sěr-Tyr-D-Lys(Xxx) (Q^^-O-R)_n~Leu-Arg-Pro-Ddd (VII) kde m je 1 nebo 0 a m je 1 nebo 2, za předpokladu, když m je 1, to je (Xxx) je A2^{Bu nelx> A}2^Pr' ⁿ í^e nebo 2, když m je 0, to je (Xxx) je Η, n je 1.

V nových sloučeninách tohoto vynálezu začleňujících analogy somatostatinu, je cytotoxická skupina Q připojena k aminovému terminálu somastatinových analogů přes vložku dikarboxylové kyseliny jak je formulováno ve vzorci VIII:

Q^^-O-R-Aaa-Cis-Bbb-D-Trp-Lys-Ccc-Cys-Ddd-NH^ (VIII).

V nových sloučeninách tohoto vynálezu začleňujících analogy bombesinových antagonistů, je cytotoxická skupina Q vázána k aminovému terminálu bombesinových antagonistů jak je formulováno ve vzorci IX: Q^^-0-R-Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Bbb-NH2 (IX).

Zvlášň výhodnými provedeními tohoto vynálezu jsou ty peptidové konjugáty, které obsahují a Qg jako cytotoxické skupiny a glutarovou kyselinu (n=3) jako vložku dikarboxylové kyseliny tvořící 14-O-esterovou vazbu s Qj (doxorubicin) nebo Qg (2-pyrrolinodoxorubicin) akarboxamidovou vazbu s peptidovým nosičem. Nejvýhodnější provedení tohoto vynálezu jsou cytotoxické LH-RH analogy následujících vzorců:

• · • « φφφ · · · • ΦΦ φ ·· · ·* ··

1. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Qi ’⁴-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂;

2. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q_s’⁴-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂;

cytotoxické somastatinové analogy následujících vzorců:

II

3. Q₁ ¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Tip-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

I I

4. Qe¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

I1

5. Q/⁴-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

6. Q₆ ¹⁴-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

7. Q_l ¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D’Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂; and

8. Q₆ ¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-T rp-Lys-Val-Cys-T rp-NH₂;

a’cytotoxické bombesinové antagonistové analogy následujících vzorců:

9. Qi¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂;

10. Q₆ ^,4-O-glt-Gín-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂

11. Qi¹⁴-O-glt-D-Tpi“Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂; and

12. Q₆ ¹⁴-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp’Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂.

· * * · • φ · φ « • φ · · φφφ φ

•	9 Φ	Φ·
•	« ···	Φ ·
Φ	•	« Φ
Φ	ΦΦ	·♦

V novém postupu tvorby částečně nasyceného heterocyklického kruhu s dusíkem vicinálního nebo disjunktivního, to je alfa, beta- nebo alfa, gama-hydroxyaminu, se první stupeň reakce provádí v bezvodém inertním organickém polárním nehydroxylovém (aprotickém) rozpouštědle, vhodně dimethylformamidu za použití podstatného přebytku, výhodně 30ti násobného přebytku halogenaldehydu, přičemž 4-jodbutyraldehyd a 5-joďváleraldehyd jsou zvlášč výhodné. Vynález není omezen pouze na tyto aldehydy, může být použit brom místo jodu. Tato reakce stejně jako následující stupně může být prováděna při okolní teplotě.

Basifikační stupeň se provádí s přebytkem, vhodně 2 až 4 násobným přebytkem organická báze. Pro tento účel jsou vhodné terciární aminy jako jsou trialkylaminy.

Takto vytvořený bicyklický kruh je otevřen k uvolnění vicinální nebo disjunktivní hydroxylové skupiny zpracováním s organickou kyselinou v přítomnosti vody. Zředěná vodná fluoroctová kyselina, vhodně v inertním organickém rozpouštědle jako je acetonitril, může být použita. Produkt je vyčištěn odstraněním těkavých látek za sníženého tlaku, přebytečné halogenové sloučeniny jsou extrahovány hexanem a zbytek vyčištěn na HPLC.

Zkratky

Pro popis peptidů a jejich derivátů tohoto vynálezu jsou použity konvenční zkratky pro aminokyseliny jak je obecně akceptováno v chemii peptidů a jak je doporučeno IUPAC-IUB komisí pro biochemickou nomenklaturu (European J.Biochem., 138, 9-37, (1984).

- 17 Zkratky pro jednotlivé aminokyselinové zbytky jsou založeny na triviálním názvu aminokyselin, například Glp je pyroglutamová kyselina, His je histidiň, Trp je triptofan atd. Zkratky označují L isomerní formu aminokyselin pokud není vyjádřeno jinak, například Ser je L-serin a D-Lys je D~lysin.

Zkratky neběžných aminokyselin v tomto vynálezu jsou následující:

D-Nal(2) je D-3-(2-naftyl)alanin a D-Pal(3) je D-3-(3-pyridyl)alanin, D-Phe(4Cl) je D-4-chlorfenylalanin.

Peptidové sekvence jsou psány podle konvence, čímž N-terminální aminokyselina je nalevo a C-terminální aminokyselina je napravo, například Glp-His-Trp.

Vzorec Leu(CH₂~NH)Leu-NH₂ popisuje redukovanou peptidovou vazbu mezi leucinem a leucinovým amidovým zbytkem v C-terminálu peptidové sekvence.

Jiné použité zkratky jsou:

A₂Bu: je diaminobutyrová kyselina,

A₂Pr: diaminopropionová kyselina,

BN: bomběsin,

BOP reagent: benzotriazol-l-yloxitris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfat,

DIPEA: N,N-diisopropylethylamin,

DM-DOX: daunosaminem modifikovaný doxorubicin,

DMF: Ν,Ν-dimethylformamid,

DMTac: 5,5-dimethylthiazolidin-4-karboxylová kyselina,

DOX: doxorubicin,

Fmoc: 9-fluorenylmethyloxykarbonyl, fr · · • ·♦ • · ·

♦ ·«· · · • · * glt: -C( O)-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-,glutaryl,

Glt₂O: je glutaranhydrid,

HOBtí 1-hydroxybenztriazol,

HO-glt-OH: glutarová kyselina,

HOSuí N-hydroxysukcinimid,

HPLC; vysokovýkonná kapalinová chromátografie,

TFA: trifluoroctová kyselina,

Tac: thiazolidin-4-karboxylová kyselina,

Tpi: 2,3,4,9-tetrahydro-lH-pyrido/3,4-b/indol-3-karboxylová kyselina.

Beckmanův analytický HPLC systém vybavený modelem 168 diodového mřížkového detektoru a Systém Gold chromátografického softveru (Beckman) byl použit k monitorování chemických reakcí a ke kontrole čistoty sloučenin tohoto vynálezu. Použitá kolona byla Dynamax C-18 (250 x 4,6 mm), velikost pórů 30 nm, velikost částic: 12 mikrometrům Rozpouštědlový systém sestával ze dvou komponent: (i) 0,l%ní TFA ve vodě a (ii) 0,l%ní TFA v 70%ním vodném acetonitrilu a byl použit lineární gradient rostoucí 1 % .(ii) za 1 minutu pro monitorování chemických reakcí. Systém byl použit v isokratickém způsobu pro kontrolu čistoty.

Beckmanův model 342 semipreparativního HPLC systému bylí použit pro izolaci a vyčištění sloučenin tohoto vynálezu. Kolona byla Aquapore Octyl (250 x 10 mm, velikost pórů 30 nm, velikost částic 15 mikrometrů). Rozpouštědlový systém byl stejný jak byl popsán pro analytickou HPLC výše.

* ·

- 19 Analýza

Brukerův ARX300 NMR spektrometr (300 MHz 1H frekvence, 75 MHz 13C frekvence) a elektrorozprašovací hmotový spektrometr Finnigan-MAT TSQ 7000 byly použity pro identifikaci struktury doxorubicinových derivátů.

Syntéza peptidových nosičů

Peptidy tohoto vynálezu jsou často podávány ve formě farmaceuticky akceptovatelných netoxických solí jako jsou adiční soli s kyselinou. Ilustrací těchto adičních solí s kyselinou jsou hydrochlorid, hydrobromid, sulfát, fosfát, fumarat, glykonat, tannat, maleat, aeetat, trifluoraceta, citrát, benzoat, sukcinat, alginat, palmoat, malat, askorbat, tartrat a podobně.

Když aktivní složka má být podávána v tabletové formě, tableta může obsahovat farmaceuticky akceptovatelné ředidlo, které zahrnuje pojivo jako je tragakant, kukuřičný škrob nebo želatina a desintegrační prostředek jako je alginová kyselina a lubrikant jako je stearan hořečnatý.

Jestliže se požaduje podávání v kapalné formě, oslazení a/nebo ochucení může být použito jako část farmaceuticky akceptovatelného ředidla, intravenózní podávání může být provedeno v izotonickém solném roztoku, fosfátových pufrových roztocích) nebo podobně.

Farmaceutické kompozice budou obvykle obsahovat peptid v konjunkci s konvenčním farmaceuticky akceptovatelným nosičem.

Obvykle dávkování bude od asi 1 do asi 100 mikrogramů peptidu na kg tělesné hmotnosti příjemce, když se podává intravenózně, orální dávky budou mnohem vyšší.

* 9 • 9

• 9 ·· · ·· •· · ·

99·9

- 20 Celkově léčení subjektů těmito peptidy se obecně provádí stejným způsobem jako klinické léčení používající jiné analogy LHRH, somatostatin a analogy doxorubicinu.

Tyto peptidy mohou být podávány savcům intravenózně, subkutánně, intramuskulárně, orálně, intranasálně nebo intrávaginálně, čímž se dosáhne biologických hormonálních účinků přes vazbu ke specifickým receptorům. V případě LHRH analogů tyto účinky mohou zahrnovat reverzibilní potlačení gonadální aktivity a v případě somastatinových analogů inhibici gastro-) intestinální funkce.

Účinné dávky se budou měnit s formou podávání a s příslušným druhem ošetřovaného savce. Příklad jedné typické dávkovači formy je fyziologický solný roztok obsahující peptid, kterýžto roztok je podáván k zajištění dávky v rozmezí asi 0,1 až 2,5 mg/kg tělesné hmotnosti. Orální podávání peptidu může být provedeno bud v tuhé nebo kapalné formě.

Syntéza peptidových nosičů tohoto vynálezu může být provedena jakoukoli technikou.^ která je známa odborníkům v oboru chemie peptidů. Souhrn těchto technologií může být nalezen v N.Bodanszky, Principles of Peptide Synthesisů Springer-Verlag, Haidelberg, 1984. Technologie pro syntézu peptidů v pevné fázi může být nalezena v učebnici J.M.Stewart a J.D.Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. CO., Rockford, IL, 1984 (2. vydání) a v přehledu G.Barany a j., Int. J. Peptide and Protein Res. 30, 705-739 (1987).

Syntéza LH-RH analogových nosičů použitých v tomto vynálezu je detailně uvedena v příkladech US patentu 5 258 492,

Sandor Bajusz a Anmdrew V.Schally, 2.listopad 1993 a v článcích Bajusz a j. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 1637-1641 (1988) a 86, 6318-6322 (1989) a Janaky a j., Proc.Natl.Acad.Sci. USA,

89, 1023-1027 a 972-976 (1992).

• φ

- 21 Syntéza nosičů somastatinových analogů použitých v tomto vynálezu je detailně uvedena v příkladech US patentu 4 650 787, 17. březen 1987, Andrew W.Schally a Ren Z. Cai. Popis syntézy může být také nalezen v článcích od Cai a j., Proč. Nati.Acad. Sci. USA 83, 1896-1900 (1986) a Proč.Nati.Acad.Sci. USA 84, 2502-2506 (1987). Syntéza nosičů bombeslnových antagonistů použitých v tomto vynálezu je detailně popsána v článcích od Coy a j., J.Biol.Chem. 263, 5056-5060 (1988) a 264, 1469114697 (1989) a od Cai a j. Peptides 13, 267-271 (1992) a Proč. Nati.Acad.Sci. USA 91, 12664-12668 (1994).

• · • 4«

- 22 Příklady provedení vynálezu

Syntéza doxorubicinových derivátů použitých v tomto vynálezu a tvorba jejich konjugátů s různými peptidovými^nosiči je detailně uvedena v následujících příkladech, které jsou určeny k ilustraci a ne k omezení vynálezu.

Příklad 1

Příprava a izolace N-Fmoc-DOX -O-hemiglutaratu

DOXHC1 sůl, 50 mg (86 mikromol), byla rozpuštěna v 1 ml DMF a bylo přidáno 30 mg (90 mikromol) Fmoc-OSu, načež následoval přídavek 31 mikrol. (180 mikromol) DIPEA. Po míchání po dobu 3 hodin byla reakce dokončena jak bylo potvrzeno analytickou HPLC. Rozpouštědlo bylo odpařeno do sucha ve Speed Wac vysokovakuové odparce a zbytek byl vykrystalizován vytřením s 0,líním TFA v H₂O. Krystaly byly odfiltrovány a promyty jednou studeným etherem k odstranění přebytku Fmoc-OSu. Po. vysušení v exsikátoru bylo získáno 62 mg 98%ního čistého N-Fmoc-DOX. Výtěžek 94 í.

Tento meziprodukt reagoval přes noc s 11,4 mg (100 mikromol) Glt₂O v 1 ml bezvodého DMF v přítomnosti 26,1 mikrol (150 mikromol DIPEA). Rozpouštědlo bylo odpařeno ve Speed Wac a zbytkový olej byl vytužen třením s 0,líním vodným TFA (obj/obj). Surový materiál takto získaný obsahuje 70 % N-Fmoc-D0X14-0-hemiglutaratu, 20 % nezreagovaného N-Fmoc-DOX a 10 % jiných nečistot, jak bylo potvrzeno analytickou HPLC. Tento surový produkt může být použit pro přípravu peptidových DOX konjugátů bez dalšího čištění. Když byl tento surový materiál rozpuštěn ve 20 ml 60%ního vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1 % TFA a aplikován na semipreparativní HPLC, bylo získáno 45,7 mg 98%ního N-Fmoc-D0X14-0-hemiglutaratu jako konečný produkt (výtěžek 64 %).

- 23 Příklad 2

Příprava a izolace 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-1''-yl)doxorubicin-TFA soli () ^a 14-0-hemigutarat (AN-193) - TFA soli

DOX HC1 sůl, 50 mg (86 mikromol), byla rozpuštěna v 1 ml DMF a 171 mikrol (1,3 mmol}, 15ti násobný přebytek, 1,4-dijodbutanu byl přidán, načež následoval přídavek 45 mikrol (260 mikromol) trojnásobného přebytku DIPEA. Reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Po 16 hodinách byla reakce dokončena jak potvrdila analytická HPLC. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve Speéd Wac a zbytový olej byl rozpuštěn ve 3 ml 0,l%ního TFA a H₂O a extrahován etherem k odstranění přebytku 1,4-dijodbutanu. Bezvodý extrakt byl pak aplikován na HPLC a bylo získáno 41,6 mg, 98%ního čistého DOX derivátu. (Výtěžek 68 %.)

41,6 mg (58 mikromol) 3'-deamino-3'-(pyrrolidin-1-yl)doxorubicin TFA soli (Q₂) takto získané bylo zragováno s 1,2 ekvivalentu GltjO v suchém DMF přesně tak, jak je popsáno v pllíkladu 1. Výtěžek byl 35%ní (16,9 mg) a Čistota byla 98%ní. Příklad 3

Příprava a izolace 3'-deamino-3'-(isoindolin-2''-yl)doxorubicin TFA soli (Q3)

DOX HC1 sůl, 50 mg (86 mikromol), byla rozpuštěna v 1 ml DMF a bylo přidáno 226 mg (1,3 mmol) 15ti násobného přebytku alfa, alfa'dichlor-ortho-xylenu, načež následoval přídavek 45 mikrolitrů (260 mikromol) trojnásobného přebytku DIPEA a katalytického množství Nal. Po 16 hodinách bylo rozpouštědlo odstraněno pomocí Speed Wacu a zbytek byl rozpuštěn ve 3 ml 0,l%ního vodného TFA a extrahován 3 ml etheru k odstranění přebytku halogenové sloučeniny.

/ * J l f • V v f materiál byl aplikován na •í.PLC. Po .o 36 mg 98%ního konečného produktu.

íklad 4

Příprava a izolace rub i cín TFA soli'

3^f-deamino-3'-(3''-p/rrolin-1''-yl)doxo(<>.-) li.

DOX tICl sůl, 50 mg. (36 mikromol) byla rozpuštěna v-1 ml DMF a 136,8 mikrolitrů (1,3 mmol) paťnáctinásobného přebytku cis-1,4-diohlor češ následoval přídave přebytku DIPEA. Po 16 ve Speed ??ac a zbytek

TFA a extrahován 3 ml no

2-butenu . 45 mikrol hodinách (Aldrich) bylo přidáno, namikromol) trojnásobnérozpouštědla .odstraněve 3 ml 0,l%ního vodnék odstranění přebytku halogesurový materiál byl (260 byla byl rozpuštěn hexanu ho . nové., sloučeniny. Takto získaný surový materiál byl aplikován na HPLC. Po vyčistění bylo získáno 22,6 mg. 98$ního čistého produktu. (Výtěžek 37 £.)

j.

Příklad 5

Příprava l-chlora izolace l-chlor-4-brom-2-butanonu (C,H,.ClBrO) a 4 v 5-brom-2-pentanonu (0_ΓΗ,.01Βχ0) .

o o

3-Brompropionylchlorid, 100,3 mikrol (1 mmol), (Aldrich) zťeagoval s přebytkem diazomethanu v etheru. Po 1 hodině byl etherický roztok eluován a kapkově testován na TLC. Tenkovrstvé chromatografické hliníkové listy povlečené silikageleia 60 5’254, Morek Art No.5554 byly použitý jako stacionární fáze a CHCI,:MeOH 05:5 (obj./obj.) jako mobilní fáze.

- 25 Pro kapkový test 2,4-dinitrofenylhydrazinový reagent (Vogel: A textbook of Practical Organic Chemistry, str. 1061, 3. vydání, Longmans, New York) byl nastříkán na TLC list po eluci. Diazomethylketonový derivát takto vytvořený ukázal žlutou skvrnu s Rf 0,3. Etherický roztok byl pak zreagován s bezvodým HC1 v etheru převedením diazomethylketonu na požadovaný konečný produkt l-chlor-4-brom-2-butanon. Tento produkt vykazoval žlutou skvrnu charakteristickou pro oxosloučeniny, s Rf 0,8 ve stejném rozpouštědlovém systému a s reagentem kapkového testu popsaným výše.

Po odpaření rozpouštědla byl surový produkt aplikován na kolonu (15 cm dlouhou, 2,5 cm v průměru) naplněnou 5 g silikagelu, Měrek, druh 9385, 230-400 mesh, velikost pórů 6 nm. Kapalná mobilní fáze byl čistý CHCl^· Frakce Obsahující požadovaný konečný produkt (charakterizovaný kapkovým testem detailně uvedeným výše) byly smíchány a odpařeny do sucha. Bylo získáno 1,5 g čistého oleje. (Výtěžek 80%ní).

l-Chlor-5-brom-2-pentanon byl připraven z 4-brombutyrylchloridu přesně stejným způsobem jak je popsán pro l-chlor-4brom-2-pentanon, s výjimkou toho, že 4-brombutyrylchlorid byl použit místo 3-brompropionylchloridu. Bylo získáno 1,6 g čirého oleje. (Výtěžek 80%ní.)

Příklad 6

Příprava a izolace 3'-deamino-3'-(3'*-pyrrolidon-1''-yljdoxorubicin TFA soli (Q^) *

DOX HC1 sůl, 50 mg (86 mikromol) byla rozpuštěna v 1 ml

DMF a bylo přidáno 241 mg (1,3 mmol) 15ti násobného přebytku l-chlor-4-brom-2-butanonu, načež následoval přídavek 45 mikrol (260 mikromol) trojnsobného přebytku DIPEA.

Po 16 hodinách byla rozpouštědla odstraněna ve Speed Wac a zbytek byl rozpuštěn ve 3 ml 0,l%ního vodného TFA a extrahován 3 ml hexanu k odstranění přebytku halogenové sloučeniny. Takto získaný surový materiál byl aplikován na HPLC. Po vyčištění bylo získáno 20,6 mg 98%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 33 %.)

Příklad 7

Příprava a izolace 3'-deamino-3'-(3''-piperidon-1''-yl)do xorubicin TFA soli (Q_?)

DOX HC1 sůl, 50 mg (86 mikromol) byla rozpuštěna v 1 ml DMF a bylo přidáno 260 mg (1,3 mmol) 15ti násobného přebytku l-chlor-5-brom-2-pentanonu, načež následoval přídavek 45 mikrol (260 mikromol) trojnásobného přebytku DIPEA. Po 16 hodinách byla rozpouštědla odstraněna ve Speed Wac a zbytek byl rozpuštěn ve 3 ml 0,l%ního vodného TFA a extrahován 3 ml hexanonu, čímž se odstranil přebytek halogenové sloučeniny. Takto získaný materiál byl aplikován na HPLC. Po vyčištění bylo získáno 18 mg 95%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 28 %.)

Příklad 8

Příprava a izolace 4-jodbutyraldehydu a 5-jodvaleraldehydu

2-(3-Chlorpropyl)-1,3-dioxolan-(4-čhlor-n-butyraldehydethylenacetal^ ) , 1,3 ml (10 mmol), (Fluka), byl rozpuštěn ve 200 ml acetonu obsahujícího 30 g (200 mmol), 20ti násobný přebytek) Nal. Roztok byl refluxován po dobu 24 hodin, načež následovalo odpaření do sucha. 100 ml etheru bylo použito k extrakci organického materiálu z anorganického tuhého zbytku. Etherický roztok byl pak promyt 10 ml H₂O, 50 ml 5%ního vodného roztoku Na₂S₂O₃ a 3 x 50 ml vody.

Ether byl odstraněn za vakua a obývající olej byl roz27

puštěn

va 3 ml 50%ní vodné kyseliny octové. Po 1 hodině

bylo přidáno 100 ml etheru, do tohoto roztoku a kyselina

octová	stejně jako ethylenglykol byly odstraněny promy-
tím 50	ml ΓΙ₂Ο 3::· Hlavní produkt byl eluován při Rf:0,8
na TLC	v čistém CHCI3. Kapkový test použitý pro aldehy-

dovou funkční skupinu bvl stejný jaký byl popsán pro tony v příkladu 5. Ether pak byl odstraněn a černý olej byl nanesen na sloupek (15 cm dlouhý, 2,5 cm v průměru), naplněný 15' g silikagelu, Měrek, třída 3385, 230-400 mesh, velikost pórů 6 nm. Kapalnou mobilní fází byl CHCI-,. Frakce .obsahující, požadovaný konečný produkt (charakterizovaný výše uvedeným kapkovým testera) byly smíchány a od- pařeny do sucha. Bylo získáno 1,6 g žlutého'oleje.

Výtěžek: 30 %.

5-Jodvale.raldehyd byl získán přesně stejným způsobem, přičemž se vycházelo z 2-(4-chlorbutyl )-l,3,-dioxalan-(5-chlor-n-valeraldehydethylenacetalu) (Fluka).

.Bylo získáno 1.,65 g žlutého oleje. Výtěžek 80·%.,;

Příklad 9

Příprava a izolace 3'-deamino-3'-(2''-pyrrolin-1''-yl)doxorubicin TFA soli «V

DOX HC1 sůl, 50 přidáno mg

515 (86’ mikromol) byla rozpuštěna mg (2,b mmol) 30násobného načež následoval přídavek 45 bytek) DIPEA.

v 1 ml DMF a bylo přebytku 4-jodbutyraldehydru, mikrolitrů (260 mikrcmol, trojnásobný pž

Po 1 hodině bylo přidáno 100 mikrolitrů ledové kyseliny octové do reakční směsi, která pak byla přidána po kapkách do 5 ml 0,l%ního TFA.v 70%ním vodném acetonitrilu (rozpouš tědlo ii íiPLC systému.

* « • φ♦ • ·» ♦ φ· φ φ φφ • φ φ φ · • · · ·♦ • φ φ φ φ · φ • ΦΦΦ φ φφ φφ

Tento roztok byl zředěn 2 ml 0,l%ního vodného TFA roztoku, načež následovalo odstranění acetonitrilu ve Speed Wac. Výsledný roztok byl extrahován hexanem k odstranění přebytku halogenové sloučeniny. Takto získaný materiál byl aplikován na HPLC. Po vyčištění bylo získáno 52 mg 98%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 85%ní.)

Příklad 10

Příprava a izolace 3'-deamino-3'-ď',3*'-tetrahydropyridin1''-yD-doxorubicin TFA soli (Q_q)

O

DOX HC1 sůl, 50 mg (86 mikromol) byla rozpuštěna v 1 ml DMF a 552 mg (2,6 mmol) 30ti násobný přebytek 5-jodvaleraldehydu byl pllidán, načež následoval přídavek 45 mikrolitrů (260 mikromol) trojnásobného přebytku DIPEA. Po 1 hodině bylo přidáno 100 mikrolitrů ledové kyseliny octové do reakční směsi, která pak byla přidána po kapkách do 5 ml 0,l%ního TFA v 70%ním vodném acetonitrilu (rozpouštědlo ii HPLC systému). Tento roztok byl zředěn 2 ml 0,l%ního vodného TFA roztoku, načež následovalo odstranění acetonitrilu v Speed Wac.

Výsledný roztok byl extrahován hexanem k odstranění přebytku halogenové sloučeniny. Takto získaný materiál byl aplikován na HPLC. Po vyčištění bylo získáno 46 mg 98%ního Čistého konečného produktu. (Výtěžek 75%ní.)

Přikladli - ......

Příprava a izolace čitotoxického LH-RH antagonistového analogu obsahujícího DOX (/b-Lys⁶(DOX¹⁴-O-glt)7LH-RH, Q^gL) • ·

Φ

Φ «Φ Φ

- 29 *4 ·

Φ Φ

Φ φΦΦΦ

Φφ44·

Φ 4 Φ Φ · 4*

Φ4 Φ 4

44 φφ /D-Lys^/LH-RH, 60 mg (37,5 mikromol), a 52 mg (64%ní čistota, 37,5 mikromol) N-Fmoc-D0X14-0-hemiglutaratu, (viz příklad 1) bylo rozpuštěno v 1 ml DMF a bylo přidáno 22 mg (50 mikromol) BEOP reagentu (Aldrich), 13,5 mg (100 mikromol) HOBt stejně jako 52 mikrolitrů (300 mikromol) DIPEA. Po míchání po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti byla reakce kompletní. Rozpouštědla byla odpařena a zbytkový olej byl vykrystalizován 3 ml ethylacetátu a pak 2 x promyt 3 ml acetatu. 90 mg surový tuhý materiál byl pak rozpuštěn ve 3 ml DMF a bylo přidáno 300ml piperidinu. Po 5 minutách byla reakční směs umístěna do ledové lázně a okyselena přídavkem směsi 300 mikrolitrů TFA, 700 mikrolitrů pyridinu a 2 ml DMF. Po odpaření rozpouštědel byl zbylý olej ztužen ethylacetatem.

Surová tuhá látka takto získaná byla rozpuštěna v 1 ml 70%ního vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1 % TFA (i) a zředěna 3 ml 0,l%ního vodného TFA (ii) a aplikována na semi-j preparativní HPLC. Bylo získáno 40mg (14,8 mikromol 98%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 48%ní.)

Příklad 12

Příprava cytotoxického LH-RH antagonistového analogu obsahujícího 2-pyrrolino-DOX (/D-Lys⁶(2-pyrrolino-D0X¹⁴-0-glt)7LH-RH, Q_g ¹⁴gL) gL, 11,2 mg (5 mikromol), (viz příklad 11) bylo rozpuštěno ve 200 mikrol DMF a bylo přidáno 30 mg (150 mikromol, 30násobný přebytek) 4-jodbutyraldehydu (příklad 8), načež následoval přídavek 3 mikrolitrů (17 mikromol) DIPEA.

Po 1 hodině byla reakce dokončena (viz příklad 9) a do reakční směsi bylo přidáno 10 mikrolitrů ledové kyseliny octové, a směs pak byla přidána po kapkách do 1 ml 0,l%ního TFA v 70%ním vodném acetonitrilu.

- 3.0 Tento roztok byl pak zředěn 1 ml 0,l%ní vodné TFA a acetonitril byl odstraněn za vakua. Zbývající vodný roztok byl pak extrahován 1 ml hexanu a aplikován na HPLC. Bylo získáno 7,6 mg 99%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 66%ní.)

Příklad 13

Příprava a izolace cytotoxického somatostatinového analogu obsahujícího DOX (DOX¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, Q-^gS)

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-LysíFmocJ-Val-Cys-Thr-NH^, 20 mg (14,5 míkromol) (Proč.Nati.Acad.Sci.USA 1986, str.1986-1990) a 20 mg (64%ní čistota, 14,5 mikromol) N-Fmoc-D0X14-0-hemiglutaratu (příklad 1) bylo rozpuštěno ve 200 mikrolitřech DMF a bylo přidáno 8,8 mg (20 mikromol) BOP reragentu (Aldrich), 5,4 mg (40 mikromol) HOBt stejně jako 17 mikrolitrů (100 mikromol) DIPĚA. Po míchání po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti byla reakce dokončena. Po odstranění rozpouštědel za vakua byl zbytek vykrystalizován ethylacetatem.

Tento tuhý materiál byl pak rozpuštěn v 1 ml ĎMF a přidáno 100 mikrol piperidinu. Po 7 minutách byla reakční směs uložena do ledové lázně a okyselena přídavkem směsi 100 mikrol TFA, 300 mikrol pyridinu a 2 ml DMF. Po odpaření rozpouštědel byl zbytkový olej ztužen ethylacetatem. Surová tuhá látka takto získaná byla rozpuštěna v 1 ml 70%ního vodného acetonitrilu obsahujícího 0',l % TFA (i) a zředěna 3 ml 0,l%ního vodného TFA (ii) a aplikována na semipreparativní HPLC. Bylo získáno 9,7 mg (5,1 mikromol) 95%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 35%ní.)

Příklad 14

Příprava cytotoxického somastatinového analogu obsahujícího 2-pyrrolino-DOX ₁ !

(2-pyrrolino-DOX -O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NHj _f

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH^ (6,4 mg, 5,00 mikromol) byl rozpuštěn ve 100 mikrol DMF a byl přidán 2-pyrro. 14 lmo-DOX -O-hemiglutarat (4,1 mg, 5 mikromol), načež následoval přídavek BOP reagentu (4,4 mg, 10 mikromol), HOBt (100 mikromol) a DIPEA (50 mikromol). Po míchání po dobu 2 hodin při teplotě místnosti byla reakční směs okyselena 20 mikrol AcOH a zředěna 500 mikrolitry 70%ního vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1 % TFA a dále zředěna 700 mikrolitry Q,l%ního.vodného TFA a aplikována na HPLC. Bylo získáno 3,9 mg 99%ního Čistého produktu. (Výtěžek 40 %.)

2-Pyrrolino-DOX -O-hemiglutarat byl připraven reakcí

DOX -o-hemiglutaratu s 4-jodbutyraldehydem jak je popsáno v příkladu 9. DOX -O-hemiglutarat byl připraven z N-Fmoc14

DOX -O-hemiglutaratu odštěpením Fmoc chránící skupiny jak je popsáno v příkladu 11. (Výtěžek 40 %.)

Příklad 15

Příprava a izolace cytotoxického bombesínového anťagonisty obsahujícího DOX (D0X¹⁴-0-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH_o-NH)Leu-NH_o,

2 2 gB) * 999 •*·· 9 • 9 »9··

- 32 Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂~NH)Leu-NH₂, 20 mg (15,8 mikromol) (Int.J.Peptide Protein Res., 38, 1991, str. 593-600) a 22 mg (64%ní čistota), 15,8 mikromol) N-Fmoc-DOX¹⁴O-hemiglutaratu (příklad 1) bylo rozpuštěno ve 200 mikrol DMF a bylo přidáno 8,8 mg (20 mikromol) BOP reagéntu (Aldrich), 5,4 mg (40 mikromol} HOBt, stejně jako 17 mikrolitrů (100 mikromol) DIPEA. Po míchání po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti byla reakce dokončena. Po odstranění rozpouštědel za vakua byl zbytek vykrystalizován v ethylacetátu.

Tento tuhý materiál byl pak rozpuštěn v 1 ml DMF a bylo přidáno 100 mikrolitrů piperidinu. Po 5 minutách byla reakční směs uložena do ledové lázně a byla okyselena přídavkem směsi 100 mikrolitrů TFA, 300 mikrolitrů pyridinu a 200 ml DMF. Po odpaření rozpouštědla byl zbytkový olej ztužen ethylacetatem. Surová tuhá látka takto získaná byla rozpuštěna v 1 ml 70%ního vodného acetonitrilu obsahujícího 0,1 % TFA (i) a zředěna 3 ml 0,líního vodného TFA (ii) a aplikována na semipreparativní HPLC. Bylo získáno 13,5 mg (7,1 mikromol} 98%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 45 %.)

Příklad 16

Příprava a izolace cytotoxického bombesinového antagonistického analogu obsahujícího 2-pyrrolino-DOX (2-Pyrrolinó-DOX^^-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₀-NH) Leu-NH₂, Q₆ gB) gB, 9,5 mg (5 mikromol), příklad 15, byl rozpuštěn ve 200 mikrol DMF a 30 mg (150 mikromol, 30 násobný přebytek)

4-jodbutyraldehyd (příklad 8) byl přidán, načež následoval přídavek 3 mikrol (17 mikromol) DIPEA.

Po 1 hodině byla reakce dokončena (příklad 9) a k reakční směsi bylo přidáno 10 mikrol ledové kyseliny octové a tato směs pak byla přidána do 1 ml 0,l%ního TFA v 70%ním vodném acetonitrilu.

Tento roztok byl pak zředěn 1 ml 0,l%niho vodného TFA a acetonitril byl odstraněn ve vakuu. Zbývající vodný roztok pak byl extrahován 1 ml hexanu a aplikován na HPLC. Bylo získáno 6 mg 98%ního čistého konečného produktu. (Výtěžek 60 %.)

Určení cytotoxické aktivity in vitro

MXT estrogenově nezávislé myší prsní rakovinné buněčné linie bylo získáno od Dr. Gunterbernhardta, University of Regensburg, Německo. Všechny ostatní buněčné linie použité při určování antiproliferační aktivity sloučenin tohoto vynálezu byly získány z Američan Type Culture Collection (ATCC).

Pro vyhodnocení aktivity analogů byla použita zkouška kolorimetrické cytotoxicity na mikrotitračních plotnách, založena na kvantifikaci biomasy značením buněk krystalovou violetí, což koreluje velmi dobře s určením počtu buněk. (Reile a j., Anal.Biochem., 187, 262-267, 1990, Bernhardt G. a j., J.Cancer Res.Clin.Oncol. (1992), 118, 35-43, Spruss Th. a j., J.Cancer Res.Clin.Oncol. 117, 435-443, 1991, Gillies, R.J., Anal.Biochem. 159, 109-113, 1986, Kueng, W. a j., Anal. Biochem., 182, 16-19, 1989.)

Zkušební protokol až 2 dny po naočkování buněk v 96 prohlubňových plotnách se kultivační medium vymění za čerstvé medium obsahující sloučeniny, které mají být testovány a čerstvé medium jen pro kontrolu kultur.

• ·

- 34 Po různé době inkubace se buňky fixují glutaraldehydem a uloží se pod fetální bovinní sérum (FBS) při 4 °C až do konce experimentu. Buňky jsou označeny krystalovou violetí a vázané barvivo se extrahuje 70%ním vodným EtOH.

Optická hustota se měří EIA Reader (Bio-Tek Instruments) nebo Biomek 1000 (Beckman) při 590 nm nebo 600 nm. Každý údajový bod představuje střední hodnotu z 8 kultivačních prohlubní. T/C hodnoty jsou vypočteny jako T/C = (T-CO)/£-CO), kde T je optická hustota zpracovávaných kultur, C=optická hustota kontrolních (nezpracovaných kultur), CO = optická hodnota kultur na začátku inkubace (t =0).

Příklad 17

Cytotoxická aktivita daunosaminem modifikovaných derivátů DOX

Tabulka 17-1 demonstruje účinky doxorubicinu a jeho daunosaminem modifikovaných derivátů na MCF-7 lidskou prsní rakovinnou buněčnou linii in vitro.

Cytotoxické skupiny mající jejich daunosaminový dusík začleněný do 5ti členného kruhu s reaktivní funkční skupinou jsou 5 až 50 x aktivnější než jejich homologové protějšky s 6členným kruhem, jako příklady jsou 3-pyrrolidono-DOX (Qg) a 3-piperidono-DOX (Q?) stejně jako 2-pyrrolino-DOX (Qg) a 1,3-tetrahydropyridino-DOX (Οθ).

Tabulka 17-1

Účinky doxorubicinu a jeho daunosaminem modifikovaných derivátů na MCF-7 lidskou prsní rakovinnou buněčnou linii in vitro

SloučeninA	inkubační doba .. . (hod)	3x10’¹⁰	T/C hodnota v (M)
10'⁹	3x10‘⁹	10^-8	3x10^-0	10^-7
Doxorubicin (DOX)	70 120				98 95	82 66	54 33
Pyrrolidino- DOX (Q₂)	70 120				97 94	25 17	-26 -19
PiperidinoDOX (AN-183)	70 120			114 109	70 67	4 0
Isoindolino- DOX (Q₃)	70 120				118 108	86 77	-11 -29
3-Pyrrolino- DOX(Q₄)	70 120			106 97	72 65	-3 -5
3-Pyrrolidono- DOX(Q₅)	70 120			87 67	30 25	-28 -10
3-Piperidono- DOX (Q₇)	70 120			⁹⁶ 97	80 70	59 43
2-PyrrolinoDOX(Q_e)	70 120	50 26	-3 2	-18 -9
1,3-Tetrahydro pyridino-DOX (Qs)	70 120	96 99	68 93	69 - 62

- 36 Buňky byly inkubovány v IMEM mediu obsahujícím 5 % HIDCC-FBS (tepelně inaktivované dextranem pokryté aktivní uhlí upravené fetálním bovinním sérem) na 96 prohlubňových plotnách. Příslušný počet buněk ve zpracovávaných a kontrolních plotnách byl určen značkovací metodou s krystalovou violetí a byl vyjádřen jako hodnoty T/C, kde T/C = (Τ-Οθ/ΟΟθ) x 100 /T= = absorbance zpracovávaných kultur, C - absorbance kontrolních kultur, C_Q = absorbance kultur na začátku inkubace (t=0). Měřená absorbance je proporcionální k počtu buněk./

Nižší hodnoty T/C indikují snížení přežití rakovinných buněk vlivem zpracování. To znamená, že 75 by indikovalo 75%ní přežití buněk ve srovnání fe 100 % pro kontrolu,nebo 25%ní inhibici.

Příklad 18

Plné zachování cytotoxické aktivity DOX v LH-RH agor 14 nistovem péptidovém konjugátu Q- gL a superaktivního 2-pyrro¹ 44 lino-DOX (Qg) v LH-RH agonistovém péptidovém konjugátu Qg gL, in vitro.

Tabulka 18-1 demonstruje účinky doxorubicinu a jeho daunosaminem modifikovaného derivátu, 2-pyrrolinodoxorubicinu (Qg) ve srovnání s jejich konjugáty s LH-RH agonistickými analogy /D-Lys⁶/LH-RH (Q^^^gL a Qg' ⁴gL) na růst MCF-7 lidské prsní rakovinné buněčné linie a MXT estrogenně nezávislé nižší prsní rakovinné buněčné linie in vitro.

• Ή· .-···. · ^{- p}

Tabulka 18-1

Sloučenina	Inkub.	T/C hodnota	na MCF-7 buněčné	linii
	doba		při koncentraci (M)
	(h)
		3x10‘¹¹	10^w	3x10'^w	10‘⁹	3x10'⁹	10'⁸	3x10‘⁶	10‘⁷
Doxorubicin*	70						98	82	54
	120						95	66	33
Q,^,4gL	70						111	89	63
	120						78	55	28
q₆	70		50		-3	-18
	120		26		-2	-9
Q“gL	70		74		28	-24
	120		60		16	-14
Sloučenina	Inkub.	T/C hodnota na MXT	buněčné linii
	doba	při koncentraci (M)
	(h>
		3x10¹¹	₁₀-w	3x10'¹⁰	10'⁹	3x10'⁹	10·®	3x10⁸	10'⁷
Doxorubicin	26						85	90	59
	50						74	60	43
Q,“gL	26						87	91	73
	50						71	59	50
Qe	28	90	78	56
	⁶⁹	52	6	-13
QgV	²⁸ ,	⁹L.	78	84				A. . -	-
	69	59	15	-11

* * • ·

MCF-7 buňky byly inkubovány v IMEM mediu obsahujícím 5%ní HI-DCC-FBS na 96 prohlubňových plotnách. MXT buňky byly inkubovány v RPMI 1640 mediu obsahujícím 0,6 g/1 L-glutaminu a 10 % FBS.

x určeno jako v tabulce 17-1

Příklad 19

Tabulka 19-1 demonstruje, Se cytotoxická aktivita in vitro somatostatinových analogů obsahujících DOX tohoto vynálezu je plně zachována.

Tabulka 19-1

Účinky cytotoxických analogů somastatinu obsahujících doxorubiciní. λ na růst MHA PaCa-2 lidských pankreatických rakovinných buněčných linií in vitro

Sloučenina	Inkubační doba hodin	T/C hodnota při koncentraci (M)
10*	10’⁷	10*
DOX^,4-O-glt-	28	93	95	32
S-98* (Qi¹⁴gS^9B)	76	103	11	-3
Ňosičový analog	28	-	-	96
S-98*	76	-	-	98
DOX¹⁴-O-glt- -	28 .	93 . ..	82 -	35 .......
S-121**(Q,¹⁴gS¹²¹)	76	97	10	-4
Nosičový analog	28	-	-	76
S-121**	76	-	-	96
Doxorubicin	28	95	64	-28
	76	71	10	-7 .

• *

Buňky byly inkubovány v RPMI 1640 mediu obsahujícím

10%ní fetální bovinní sérum na 96 prohlubňových plotnách.

• •0 0

0 p—-----------| x D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂, xx D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂.

Příklad

Účinky cytotoxických analogů bombesinových antagonistů obsahujících doxorubicin na růst CFPAC-1 lidských pankreatických rakovinných buněk in vitro

Tabulka 20-1 demonstruje, že in vitro cytotoxická akti vita bombesinových antagonistických analogů obsahujících DOX tohoto vynálezu je plně zachována.

Tabulka 20-1

Sloučenina	Inkubace doba (h)	T/C hodnota při' koncentraci
(M)	10*
3x10'⁰	10'⁷	3x10’⁷
ĎOX^M-O-glt	66	95	81	44	9
B-94	95	95	57	28	4
(Q”gB)	137	94	28	19	0
B-94*	66	99	106	104	100
	95	97	99	99	96
	137	98	98	100	96
D0X^,4-O-glt-B-50	66	102	78	39	5
	95	97	55	24	-1
	137	92	28.	19	-2
B-50**	66	100	93	99	93
	95	98	100	102	98
	137	97	98	99	98
DOX	66	88	52	15	-7
	95	73	32	10	-6
	137	49	20	7	-4

Buňky byly inkubovány v IMDM mediu obsahujícím 10 % fetálního bovinního séra na 24 prohlubňových plotnách.

*Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-_v(CH₂-N)-Leu-NH₂ **D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-_V(CH₂-N)-Tac-NH₂

Uchované vazební vlastnosti hormonových derivátů.

* »

- 41 Příklad 21

Hormonální aktivity a receptorové vazební potence cytotoxikých LH-RH agonistových analogů Q_x^⁴gL(/D-Lys^/LH-RH nesoucích DOX) a Qg^⁴gL(/D-Lys^/LH-RH nesoucí 2-pyrrolino-DOX) ve srovnání s nosičovým peptidem, /D-Lys^/LH-RH.

Tabulka 21-1

Sloučenina	Hormonální aktivita (LH-odezva ve vztahu k LH-RH = 1)	ICSO^Sodnota pro krysí hypofýzní receptory (nM)	1050** hodnota pro prsní rakovinné receptory (nM)
Q_x ¹⁴gL	15	2,29	7,24
Q₆ ¹⁴9L	10	5,59	6,70
/D-Lys⁶/LH-RH	8	2,26	1,80

V tabulce 21-1 x LH odezvy k analogům byly určeny v rozmělněném krysím hypofýzním buněčném superfúzním systému jak je popsáno v S.Vigh a A. V. Schally, Peptides 5, 241-247 (1984).

xx Vazební afinity analogů k krysím hypovýzním LH-RH receptorům a lidským prsním rakovinným receptorům byly určeny ve srovnávacích vazebních experimentech za použití /1251/ značených /D-Trp6/LH-RH jako radioligandy jak je popsáno v B. Szoke a j., Peptides, 15(2), 359-366 (1994). Vazební afinity byly vyjádřeny hodnotami IC50, koncentrace neznačeného analogu vyžadovaného k inhibici 50 % specifické vazby radioligandu.

♦ ·

- 42 Příklad 22

Somatostatinové analogy inhibují sekreci růstového hormonu (GH) z promýté krysí hypofýzy, jak je to popsáno Carlsoném a j., Thytotropin uvolňující hormonová stimulace a somatostatinová inhibice sekrece růstového hormonu z promytých krysích adenohypofýz, Endocrinology>, 94, 1709 (1974).

Tudíž tato metoda byla použita pro srovnání cytotoxických somatostatinových analogů tohoto vynálezu s jejich mateřskými nosičovými molekulami pokud jde o jejich hormonální aktivity.

Inhibice lidský růstový hormon uvolňovacího hormonu (hGH-RH(l-29)NH₂) vyvolala uvolnění růstového hormonu z promytých krysích hypofýzních buněk somatostatinovými analogy S-98-I

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHj» a S-121

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NHj_t ve srovnání s jejich příslušným cytotoxickým derivátem

98-1 14 gS ⁰ (DOX-o-glt-S-98-I) a

Q₁ ¹⁴gS¹²¹(DOX¹⁴-O-glt-S-121).

* V krysím hypofýzním vymývaném systému byly somastatinové analogy podávány po dobu 3 minut v lnM dávce současně s lnM hGH-RH(l-29)NH₂. Infuze spinatostatinových analogů byla udržována po dobu dalších 6 minut. GH odezvy na 3 minutové podávání 1 nM hGH-RH(l-29)NH₂ byly určeny během vymývání somastatinových analogů (0 minut) a 30, 60 a 90 minut po skončení podávání. Údaje jsou prezentovány v tabulce 22-1.

Tabulka 22-1

Sonáto- statinové analogy	GH uvolnění vyvolané 3 min podáváním 1 nM hGH-RH(l-29)NH2 v různých Časových
bodech po analogů	infuzí soraatostatínových
0 min .	30 min	6 0 min	9C; min
S-98-I	2,9	94,7	117,8	-
	0	90	89,7
Ξ-121	7,8;-	' 62,2	' 57,3	77,9
1ώ 191 . ’gs~	8,3	58,'5	54,3	<r- Ή “J O / f /

xjt Vyjádřeno jako procentáž GH uvolnění vyvolaného. 3 minutovou inf.uzí 1 níí hGIl-RH(l-29)NH2 před podáváním somatostatinových analogů

Receptorové vazební studie s cytotoxickými bombesinovými antagonisty

Radiojodace [Tyr*¹]Βϊϊ (Sigma) užívající Bio-Rad

Enzymobead Rádio lodination soupravu a *]· z¹ něho [ ^i-Tyr δϊ·; byla provoděna jak monojodovapopsá-no (1). Vazba značeného •[TyrJBN a nahrazeni cytotoxickym bombeslnovým antagonistovym analogem pomocí konfluentních Swiss 3T3 buněk zi (V“'gB bvl uroveaen (získaných z .Američan Type Culture Collection) ve 24 prohlubňových plotnách v modifikaci (2) metody Křis a j. (3). 3 ač 5 dnů po naočko-

zeným solným roztokem (HBSS) a inkubovány po dobu 30 minut při '37 °C 50 pM ['^-'i-Tyr^]BN v nepřítomnosti nebo přítomnosti několika koncentrací neznačených kompetitorů nebo BN) v celkovém objemu 0,5 ml vazebního pufru · Q (DMEI-1 s 50 ml-í HEPES, Ο,ΐίηί bovinní séx-ový albumin (BSA) mM IňgCl^ a 100 mikrog/ml bacitracinu, pH 7,4).

Nespecifická, vazba byla určena V přítomnosti 1 mikroM neznačeného ligandu. Po 3 promytích ledově studeným HBSS obsahujícím 0,1 %’ BSA (pH 7,4) byly buňky odděleny 0,05%ním trypsin/0,53 mM EDTA roztokem a převedeny do zkumavek.

Radioaktivita byla měřena gama počítačem (Micrornedics Systems inc.,· Hundsville, AL). Vazební údaje byly vyhodnoceny pomocí radioligandových vazebních analytických programů od McPhersona (4).

Ki hodnoty uvedené v tabulce 23-1. byly vypočteny podle vzorce Chenga a Prusoffa(5).

1. Halmos, a j., Cancer Letters, 85, 111-118 (1994)

2. Cai a j., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 91:12664-12568, (1994)

3. Křis, a j., J.Biol-Chem., 262:11215-11220, (1987)

4. McPherson, G.A., J.Pharmaco Methods, 14:213-228 (1985)

5. Cheng a Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108, (1973)

Tabulka 23-1

Charakterizace specifické vazby cytotoxického bombesinového Í4 14 antagonisty Qg gB(2-pyrrolino-DOX -O-glt-Gln-Trp-AlarValGly-His-Leu-^-tCH^-NjLeu-NHj k bombesinovým receptorům na Swiss 3T3 buněčné linii ve srovnání s bombesinem

Sloučenina	Ki(nm)
bombesin	1,2
Q₁ ¹⁴gB	1,0

Komparativní účinnost a toxicita hormonových konjugátů versus cytotoxická skupina samotná.

Příklad 24

Léčení pomocí 2-pyrrolino-DOX (Q,), cytotoxického LH-RH ago14 6^ 14 nistového analogu Qg gL(/D-Lys ./LH-RH vázaného k Qg -O-hemiglutaratu) a (DOX) estrogenově nezávislých MXT myších prsních rakovin (KS-49).

Aby se porovnala nádorová inhibitorová aktivita cytotoxického doxorubicinového derivátu Q_K a jeho cíleného cyto14 ^b toxického peptidového konjugátu Qg gL stejně jako dobře známého antineoplastického prostředku DOX a k určení optimálního způsobu podávání a netoxických dávek byly LH-RH receptorově pozitivní MXT (3.2) ovex nádorové kousky (1 mm ) implantovány subkutánně samičím B^^Fl myším.

den po transplantaci byly myši náhodně rozděleny do skupin po 5 kusech a bylo zahájeno léčení. Sloučeniny byly rozpuštěny v 0,l%ní trifluoroctové kyselině (pH 2) a podávány intraperitoneálně.

• to··· ·· « to· • toto •· ·*· · ···» to#· « toto • to· to ·· • r * ww ·· • · * * • to·· • toto to· toto« •to ··

Skupiny, léčebné postupy a dávky stejně jako průměrné doby přežití jsou uvedeny v tabulce 24-1. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 24-2 a v obr. 1.

Tabulka 24-2 ukazuje účinek léčení pomocí Q< a LH-RH , o analogu Qg gL na nádorové objemy a přežití myší s estrogenově nezávislými prsními rakovinami.

Jak je uvedeno v tabulce 24-2, 1,25 nmol Qg podávaného v den 1, 2, 7, 8, 14 a 15, skupina (2) vyvolalo silnou toxicitu charakterizovanou průměrným přežitím 17,4 dnů, což je významně kratší než přežití neléčené kontrolní skupiny.

V porovnání stejná dávka Qg gL (skupina 6) vykázala průměrné přežití 30,8 dnů, což je významně déle, než přežití neléčené kontrolní skupiny. Vyšší účinnost Qg ^⁴gL oproti Qg může být také demonstrována srovnáním průměrných objemů finálního nádoru ve skupině 2 (1065 mm^ v den 16) a ve skupině 6 (863 mm^ v den 31).

Podobné závěry mohou být demonstrovány srovnáním Q_ a <Í4 ^b

Qg gL při rozdílném léčebném rozvrhu, kde 0,5 nmol léčiv bylo podáváno 5 dní v týdnu po dobu 3 po sobě jdoucích týdnů.

Doxorubicin v toxické dávce (celkové množství 1560 nmol, průměrné přežití 20 dnů) nemohl vymýtit nádor, zatímco léče?|4 ní pomocí Qg gL v netoxické dávce (celkové množství 7 nmol, průměrné přežití větší než 31 dnů) vedlo k přežití dvou z 5 zvířat bez rozvinutí nádoru.

Tabulka 24-1

číslo skup.	podání	dávka/ inj. (nmol)	dávka/ inj. (^m)	inj. /týden	dny mezi injekcí	týdny podav.	celk. množs. obdrž.	průměrné přežití dny
1	kontrola							22
2	Qe	1,25	0,92	2	5			17,5
3		0,5	0,37.				7.5	19,6
4		0,25 *	0,19	5	2		9.5	14,6
5		0,2	0,15				21	13,0
6	Qe¹⁴gL	1,25	2,9	2	5	3		30,8
7		0,5	1,16				7.5	26,8
8		0,25 *	0,58	5	2		9.5	18,4
9		0,2	0,46				21	13,6
10		3,5	8,12				7	>31
11		4	9,28	1	6	2	8
12		5	11,6				10	13,4
13	DOX	520	340		...	3.	1560	20,0 .

Od dne 9 do dne 12 byla dávka zvýšena na 2,5 nmol.Od dne 9 do dne 12 byla dávka zvýšena na 5,0 nmol.

24-2

N M · i o ώ a Φ >N £ Ή 8 (3 >q a) ό bd <e m rl n g	fi	o	o	©	©	O	d	©	©
> S eo rQ **	o	o	d	o	1 •í		o
průměrné přežití (dny)	44 O ?r	(N o^s44	cT 44 00 0¼ m ·	& 41 X© ξΓ*	vo * d •H oo MÍ· d ·	«*> . λ :	rf*	o CN
		Ό	cn	co	cn	cn	o	00 CM
'ř ě p φ ·ΓΊ ⁿ\|	Í4 cn . o	V) 8	cn v© 00	cn a	00 r- O\ cn	<y> 8	o	2 *n
Způsob podávání	celkové injékt. imožstv (nmol)		•n	m	V) d	*n	t*	o	s m
trvání léčby (týdny)		cn	ΓΊ	d	m	d	d	d
Mi &hs		VI	wn	d	d	*o	*o	<Ď
počet injekcí za týden		d	d	tn	•n
ra »·* *gg		tn d u*		tfl * o	•Λ θ'	rí“	cs_ «Γ	$
• 1		•L	o	σ	ó	u CO o	u J* o	5?	s o
>ó		—	d		cn	ť·	o	d	m

přežití je významně delší (p je menší než 0,01) přežití je významně kratší (p je menší než 0,01) nebo (pr-je menší než 0,05) ve srovnání s kontrolními údaji za použití Duncanova testu.

• · • 4

- 49 Příklad 25

Účinky jednotlivého léčení pomocí DOX, cytotoxických LH-RH analogů T-107 a Q^^⁴gL na estrogenově nezávislé MXT myší prsní rakoviny (KS-55),

Testované sloučeniny:

_n 14gL: doxorubicin¹⁴-0-hemiglutarat vázaný k /D-Lys^ZLH-RH, ^U1

T-107: N-glutaryldoxorubicin vázaný k /D-Lys^7LH-RH,

Proč.Nati.Acad.Sci., sv. 89, str. 972.976 (1992) a

DOX.

Zkoušky byly provedeny následovně:

aby se určily maximálně tolerované dávky a porovnal účinek, MXT (3.2) ovex rakovinné kousky {1 mm ) byly implantovány subkutánně samicím BgDjFl myším. Jeden den po transplantaci byly myši náhodně rozděleny do skupin po 5 zvířatech a byly léčeny jednotlivou injekcí i.p.

Skupiny a dávky jsou uvedeny v tabulce 25-1. Tabulka také ukazuje počty myší, které měly nádory, kdy/ byl objem měřen a průměrné doby přežití pro skupiny. Změny objemu nádorů jsou uvedeny v obr. 2. Sloučeniny byly rozpuštěny v 0,l%ním TFA (pH 2,0). Objem nádorů byl měřen ve dnech 10, 13, 17 a 20.

Jak je uvedeno v tabulce 25-1 a v obr. 2, T-107 (/b-Lys^/LH-RH vázaný k N-glutarylDOXu), je zcela neefektivní pri inhibici růstu tohoto nádoru v dávce 850 nmol/20 g myši.

Ί Λ £

V kontrastu gL, (/b-Lys ./LH-RH vázaný k 14-O-glutarylDOXu) vykázal silné potlačení růstu nádoru (obr.) při netoxické dávce 650 nmol/20 g myš.

- 50 -- « · · · · « · · » « · · · · · · · • · · · · · φ ··· · • * · · ♦ · * · • · « 9 ·♦ · · · · ·

DOX samotný byl vysoce toxický (průměrná doba přežití 13,6 dnů) v jednotlivé dávce 650 nmol/20g myš a významně méně účinný než Q^^^gL (obr. 2).

č.	skupina	Dávka	pmol/kg	Počet nádorových my$í/ /počet přeživších myší	Práněmé přežití dny
nmol/ 20 g	yg/ 20 g
den 10	den 13	den 17	den 20
1	Kontrola				5/5	5/5	5/5	5/5	21,2±0,3
2	Qi¹⁴gL	680	1520	34	1/4	2/4	2/4	3/4	28,6±693 5.3+25**
3	Qi¹⁴gL	710	1587	35,5	2/4	3/4	3/4	3/4	26,0±663 2,0±34*
4	Qi¹⁴gL	760	1698	38	3/5	4/5	4/5	(Safer.)	(Sak.)
5	DOX	650	427	32,5	3/3	2/2	1/1	1/1	13,6±25
6	DOX	700	460	35	2/3	2/3	2/2		15,2±24
7	DOX	750	493	37,5	1/1				7,811,3'
8	T-107	750 ,	1676	37,5	5/5	5/5	5/5	4/4	21,8±05
9 .	T-107	850	1900	44,4	5/5	5/5	5/5	4/4	21,6107

- 51 * φ · ♦ · φφφφ φ φ φφ · · · φφφ · φ φφ · · φ φ · φ φφφφ · φ φ φφ · ií V W X W

Přežití je významně kratší (p je menší než 0,01) než přežití kontrol

Přežití je významně delší (p je menší než 0,01) nebo

X * (p je menší než 0,05) ve srovnání s kontrolou (1 myš, která zemřela náhodně v den 2, byla ponechána mimo tyto 2 skupiny.

Příklad 26

Účinek cytotoxických LH-RH analogů na estrogenově nezávislé MXT myší prsní rakoviny (KS-47).

Látky použité pro léčení:

V časnějším experimentu Q₂ v 20 nmol denní dávce po dobu 17 dnů měl jen střední inhibiční účinek na růst nádoru a byl toxický v dávce 40 nmol (střední přežití bylo 14,6 dnů). Denní dávka 30 nmol byla zvolena pro současný experiment, ktěřý srovnával účinnost a toxicitu Q₂ ¹⁴gL (Q. vázaný k ZĎ-Lys^LH-RH), Q2 (pyrrolidinodoxorubicin), /D-Lys yLH-RH, a ZD-Lys⁶_7LH-RH+Q2.

MXT (3.2) ovex nádorové kousky (1 mm ) byly transplantovány samicím BgDjFl myším. Léčení začalo 1 den po transplantaci a pokračovalo po 12 i.p. injekcemi 1 x za den. Všechny skupiny obdržely ekvimolární množství sloučenin, jak je uvedeno v tabulce 26-1. Nádory byly měřeny ve dnech 10, 14 a 18 a byl vypočten objem nádorů. Údaje jsou uvedeny v tabulce 26-1 a v obr . 3. '

Léčení denní dávkou 30 nmol daunosaminem modifikovaného doxorubicinového analogu Q„ (pyrrolidino-DOX) vedlo k sil3 nému inhibičnímu účinku na růst nádoru (objem nádoru 144 mm

v den 14 oproti 1391 mm pro kontrolní skupinu) ale vykazoval silnou toxicitu, když zabil všechna zvířete před koncem experimentu (střední přežití 17,9 dne).

Podobně Q„ kombinovaná (směs) š /b-Lys^/LH-RH měla za následek silný nádorově inhibiční účinek (objem nádoru 80 mm v den 14), ale střední přežití (18,5 dnů) bylo významně kratší než přežití neléčené kontrolní skupiny (23,1 dnů).

Jako výsledek léčení pomocí Q„^^gL (Q kovalentně vá6 Z zaný k /D-Lys VLH-RH) 2 zvířata zemřela, 1 v den 16 a další v den 26. Z 8 přeživších zvířat jen u jednoho se vyvinuly nádory při posledním měření v den 18 a všechna vypadala zdravě, ale později se u všech začaly vyvíjet nádory. Střední přežití pro tuto skupinu bylo významně delší (28,3 dní) než přežití kontrolní skupiny. Léčení /D-Lys yLH-RH samotným neovlivnilo nádorový růst.

Tento experiment demonstruje, že vyšší účinnost a nižší periferální toxicita Qj^gL oproti cytotoxické skupině Q₂ í^epřisouditelná kovalentní konjuganci cytotoxické skupiny k cílenému nosiči LH-RH analogu.

Tabulka 26-1

Účinek cytotoxických LH-RH analogů na růst estrogenově nezávislých MXT myších prsních rakovin a přežití myší s nádory • φ

č.	léčení	lávka (jir/den)	počet myfií	střední objem 3 nádoru v mm ve	střední přežití po transplantaci
10	dnech
14	18
1	kontrola		15	253	1391	4794	23,1
2	Q₂’⁴gL	68.7	10	33	16	23	28,3*
3	q₂	21.3	10	153	144	137	17,9
4	[D-Lys⁶}LH-RH	48.0	10	165	1348	4003	23,5
5	[D-Lys⁶]LH-RH + q₂	48.0 + 21.3	10	121	80	27	18,5

Všechny denní dávky jsou 30nmol ekvimolární množství.

Významně kratší než kontrola (p je menší než 0,05) x

významně delší než kontrola (p je menší než 0,01) s Duncanovým testem

Příklad 27

Účinky 2-pyrrolino-DOX (Q,} a cytotoxického LH-RH agonistového i λ ' 6 ** 1 A analogu Qg gL (/D-Lys /LH-RH vázaného k Qg -O-hemiglutaratu) na růst androgenně závislých krysích Dunning R-3327-H prostatových karcinomů

Samci kodaňské krysy nesoucí hormonově závislé Dunning

R-3327-H prostatove karcinomy byly léčeny Qg gL, novým cytotoxickým analogem luteinizační hormon uvolňovacího hormonu £

(LH-RH) sestávajícím z agonisty /D-Lys /LH-RH vázaného k 2-pyrrolinodoxorubicinu.

• · * · • · • ·

V prvním experimentu byl 2-pyrrolinodoxorubicin podáván v koncentraci 50 nmol/kg jako jediné léčivo (Q,) a jako θ

nekonjugovaná směs s /D-Lys /LH-RH nebo konjugován k nosiči /b-Lys^/LH-RH (Q/^)gL. Po druhém podání 50 nmol/kg skupiny θ 6 Qg samotné nebo smíchané s /D-LysyLH-RH všechny krysy uhynuly se známkami obecné toxicity, zatímco všechna zvířata lé'4 čená cytotoxickým LH-RH konjugátem Qg gL přežila.

Po 5 týdnech léčení celkovou dávkou 150 nmol/kg Q_fi gL + 3 · se nádory zmenšily z původního objemu 8,35 - 1,7 cm na za+ 3 čátku experimentu, na 4,47 - 0,8 cm , zatímco nádory v kontrolní skupině pokračovaly v růstu a měřily 17,84 - 2,2 cm .

ή4

Léčení pomocí Qg gL také významně snížilo hmotnost tumoru a tíhu tumoru.

V druhém experimentu určeném pro srovnání účinnosti a *14 toxicity Qg a Qg gL terapeutický režim sestával ze tří aplikací 25 nmol/kg Qg _ne]_3O 25 nmol/kg a 50 nmol/kg Qg^^gL.

Když bylo léčení zahájeno, objem nádorů ve všech skupinách byl mezi 3,9 až 4,5 cm^-5. Po 5 týdnech terapie nádory u krys, +3 léčených 50 nmol/kg Qg gL poklesly na 2,3 - 0,51 cm , zatímco 25 nmol/kg Q_g bylo stále toxické a mohlo pouze produkovat snížení konečného objemu nádorů na 6,76 - 1,4 cm podobně jak 14 +3 bylo získáno s 25 nmol/kg Q_fi gL (6,74 - 1 cm ) ve srovnání + 3 ^b s 15,6 - 2,2 cm pro neléčená zvířata.

Histologické vyhodnocení vzorků ukázalo významné snízení mitotických buněk v Qg gL léčených skupin. LH-RH rečeptory s vysokou vazební kapacitou byly zjištěny v membránách neléčenýčh vzorků Dunningova nádoru, ale po léčení pomocí Qg gL, žádná vazební místa pro LH-RH nemohla být nalezena.

Inhibice růstu nádoru pomocí AN-201 a Q_g^⁴gL byla také spojena s významným poklesem vazební kapacity EGF receptorů.

Jak je demonstrováno v obr. 4 až 6, cílený cytotoxický 14 ‘

LH-RH analog Q_g gL je účinným protinádorovým prostředkem vyvolávajícím régresi krysích Dunning R-3327-H prostatových karcinomů. Studie také ukázaly, že cytotoxický LH-RH analog 14 .

Qg 9^L j® mnohem méně toxický než antineoplastická skupina Q_gkterá je začleněna, a významně aktivnější při inhibici růstu nádorů.

Obrázkové legendy pro příklad 27

Obr. 4, experiment I

Objem nádorů u samců, konaňských krys nesoucích krysí Dunning R-3327-H prostatové karcinomní transplantáty během léčení sestávajícího ze 3 aplikací 50 nmol/kg agonisty /D-Lys /LH14

RH a 50 nmol/kg cytotoxického LH-RH analogu Q_g gL.

Vertikální čáry indikují SEM. p je menší než 0,05,-p menší než 0,01 oproti kontrole pomocí Duncanova nového vícenásobného rozsahového testu. Léčení označené šipkami bylo aplikováno ve dnech 1, 8 a 29. + zvířata léčená pomocí Q_g jako jediným léčivem nebo nekonjugovanou směsí s /D-Lys^/LH-RH uhynula v druhém týdnu. U těchto dvou skupin je znázorněn objem nádorů zaznamenaný v den 8.

Obr. 5, ..experiment II

Účinek léčení s 25 nmol/kg 2-pyrrolinodoxorubicinu (Q,), ^Ď nmol/kg a 50 nmol/kg cytotoxického LH-RH analogu Q_g gL na objem nádorů u krys s Dunning R-3327-H rakovinou prostaty.

Vertikální čáry označují SEM ^Xp menší než 0,05, ^xxp menší než 0,01 oproti kontrole. Léčení označená šipkami byla aplikována třikrát, to je v dnech 1, 8 a 29.

Obr. 6, experiment II

Účinek léčení s 25 nmol/kg 2-pyrrolinodoxorubicinu (Q_fi), 25 nmol/kg a 50 nmol/kg cytotoxického LH-RH analogu Qg gL na tělesnou hmotnost kodaňských krys nesoucích Dunning R-3327-H rakovinu prostaty. Vertikální čáry označují SEM ^xp menší než 0,05, p menši než 0,01 oproti kontrole. Léčení označená šipkami byla aplikována třikrát, to je ve dnech 1, 8 a 29.

Příklad 28

Srovnávací studie účinku doxorubicinu (DOX) a cíleného cytotoxického LH-RH agonistového analogu Q.^^gL (/D-Lys^/LH-RH

A vázaného k DOX -O-hemiglutaratu) na růst OV-1063 lidský vaječníkový karcinom u lysých myší.

Lidská epiteliální vaječníková rakovinná buněčná linie OV-1063 pocházená í z metastatického papilárního cystadenokarcinomu vaječníku 571eté ženy (Horowitz a j. (1985) Oncology 42, 332-337. 10 milionů buněk OV-1063 bylo injektováno subkutánně do 3 lysých myší pro pěstování nádorů. Kousky o velikosti 1 mm těchto nádorů byly transplantovány 60 zvířatům pro in vivo studií inhibice růstu.

Cíl tohoto experimentu byl demonstrovat, že jako výsledek přítomnosti receptoru pro LH-RH na OV-1063, cytotoxický konjugát LH-RH byl účinnější a méně toxický než DOX, cytotoxická skupina v něm obsažená. Tak účinky cytotoxického LH-RH konjugátu byly srovnány s účinky DOX, směsi DOX s nosnou molekulou, nosičem samotným a neléčenou kontrolní skupinou.

Φ * · » · ♦ · ·· ··· · · • · ♦ *

a ♦

Všechny injekce byly podávání intraperitoneálně. Všechny sloučeniny byly rozpuštěny v 0,9%ním chloridu sodném ve vodě (solný roztok).

□

Myši s průměrnou velikostí nádoru asi 15 mm byly rozděleny do 6 skupin po 9 zvířatech a obdržely následující léčení 7 dní po transplantaci nádoru: skupina 1 solný roztok, skupina 2 Q_x ¹⁴gL v dávce 700 nmol/20g zvířete, skupina 3 Q_x ¹⁴gL v dávce 413 nmol/20 g zvířete, (maximálně tolerovaná dávka MTD pro DOX), skupina 4 DOX v 413 nmol/20 g zvířete (MTD), skupina 5 směs 700 nmol/20 g DOX a 700 nmol/20 g /D-Lys^/LH-RH, skupig na 6 nosičový agonistový analog /D-Lys /1H-RH v dávce 700 nmol/ /20 g zvířete.

Analýza receptorů OV-1063 vykázala přítomnost vysoké afinity vazebních míst pro LH-RH.

Výsledky

JaK je znázorněno v obr. 7 silná inhibice růstu nádoru byla dosažena léčením pomocí 0_χ gL v 413 nmol/20 g dávce (skupina 3) Zvířata nevykazovala známky vážné toxicity. Ve srovnání, léčení pomocí DOX podávaného ve stejné dávce

413 nmol/20 g (12 mg/kg, MTD, skupina 4) nevykázalo významnou inhibici růstu nádoru u tří zvířat přeživších na konci experimentu. 3 zvířata uhynula v den 5 a 6 zvířat uhynulo v den 9 vlivem toxicity.

Při vyšší dávce (700 nmol/20 g, skupina 2), Q_x ¹⁴gL vykázalo velmi silnou inhibici růstu nádoru (obr. 7).,Dvě z 9 zvířat zahynula vlivem toxicity a 1 zvíře zahynulo náhodně.

přeživších zvířat se zotavovalo z hmotnostní ztráty asi 20 Ϊ na konci experimentu. Ve skupině 6 stejně vysoká dávka (700 nmol/ /20 g) DOX byla smíchána se 700 nmol /D-Lys⁶/LH-RH. V den 5 všechna zvířata zahynula v této skupině následkem silné toxicity .

Závěry

Výsledky jasně demonstrují, že vlivem přítomnosti receptorů pro LH-RH na buňkách epiteliální vaječníkové rakoviny OV-1063 cílený cytotoxický LH-RH konjugát Q^^⁴gL vykazuje nižší toxicitu a vyšší protinádorový účinek než doxorubin Q^,který obsahuje cytotoxickou skupinu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1 2 3

TÝDNY LÉČENÍ i

♦ ·« ·

HMOTNOST ZVÍŘAT (g)

1/7 ·· ·· 'Vyp/''

Obr. 1

Objemové změny estrogenově nezávislých MXT myších prsních rakovin u KS-29 (Čísla psaná kurzívou ukazují počet přeživších myší v době měření)

8000

r.

Objem nádoru

7000 6000 r 5000 4000 3000 2000 - /

Kontrola

Q₆ 6 x 1.25 nmol/20g —Δ- - Q₆ 15 x 0.5 nmol/2Og -^7- Q₆ ¹⁴9L 6 x 1.25 nmol/20g

DOX 520 nmol/20g • » i

Dny po transplantaci ♦ · ♦ σ β · · · · • · · · · * · · · · · • · · · · · · · • · * · · · 9 · · «·

1, kde

-R a

-P jsou oba -H a

R' je jiný než NH₂

13. Sloučenina podle nároku 12, kde -R' je pyrrolidin-l-yl. 14. Sloučenina podle nároku 12, kde -R' je isoindolin-2-yl. 15. Sloučenina podle nároku 12, kde -R' je 3-pyrrolin-l-yl. 16. Sloučenina podle nároku 12, kde -R' je 3-pyrrolidon-l-yl 17. Sloučenina podle nároku 12, kde -R' je . 2-pyrrolin-l-yl., 18. Sloučenina podle nároku 12, kde -R' je 3-piperidon-l-yí. 19. Sloučenina pyridin-l-yl. podle nároku 12, kde -R' je 1,3-tetrahydro-

38.

Způsob podle nároku 30 vyznačený tím, že stupeň a) se provádí v.aprotickém reakčně inertním organickém rozpouštědle.

39. Způsob podle nároku 30 vyznačený tím, že stupeň a) se provádí v polárním nehydroxylovem reakčně inertním organickém rozpouštědle.

40. Způsob podle nároku 30 vyznačený tím, že jako rozpouštědlo se použije dimethylformamid.

41.

Způsob podle nároku 30 vyznačený tím, že aldehyd se vybere ze skupiny zahrnující omega-brom- a omega-jodbutyraldehyd a valeraldehyd.

Zastupuje: JUDr. Ing. Mií/lan Hořejš «

* • * ♦

1. Sloučenina obecného vzorce i

14 Q-O-R-P (I) kde Q má podrobnou chemickou strukturu znázorněnou vzorcem II (II) kde

-R- je H nebo -C(O)-(CH₂) -C(O)- a n je 0-7,

R' je vybrán ze skupiny zahrnující NH₂, aromatický nebo hydrogenovaný 5ti nebo 6členný heterocýkl mající alespoň jeden kruhový dusík a takový heterocýkl mající butadienovou skupinu vázanou k přilehlým atomům uhlíku tohoto kruhu k vytvoření bicyklického systému a

P je H nebo peptid za předpokladu, že kde R' je NH₂, pak R a P jsou jiné než H a kde R a P jsou H, pak R' je jiný než NH₂·

v > 4 4 ♦ • * • 4 • 4 ··· • 4 • • • 4 4 4« 44

2 3 4

TÝDNY LÉČENÍ • fr • fr · ♦

2/7

Obr. 2

Objemové změny estrogenove nezávislých MXT nádorů u KS-55 (Vybrané skupiny)

Objem nádoru

Obr. 3 3/7

Účinek cytotoxických LH-RH analogů na přežití myší s estrogenově nezávislými MXT rakovinami

Počet přeživších myší γ kontrola IDATťftH-RH ♦ AM-192 &

▼ ΠΜ.γϊ*|ΙΗ·ΒΗ + ΑΝΊ81

Obr. 4

2, kde • * · • · · · 0 «4 0 ♦ · 00 n je rovno 3.

2. Sloučenina podle nároku 1, kde R* je vybránize skupiny zahrnující NH₂, pyrrolidin-l-yl, isoindolin-2-yl, 3-pyrrolin1-yl, 3-pyrrolidon-l-yl, 2-pyrrolin-l-yl, 3-piperidon-l-yl, 1,3-tetrahydropyridin-l-yl, a

P je P₂ a P₃, kde

P^ je vybrán ze skupiny zahrnující LH-RH analog vzorce Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd, kde (Xxx) je vodík, A₂Bu ^nebo A₂Pr, přičemž kde

Aaa je Glp, pak Bbb je His, Ccc je Trp a Ddd je gly-NH₂;

kde Aaa je Ac-D-Nal (2), pak Bbb je D-Phe (4C1), Ccc je D-Pal (3), D-Trp, a Ddd je D-Ala-NH₂, a kde Aaa-Bbb-Ccc je Ac, pak Ddd je -NH-CH_CH_q,

14 * přičemž skupina Q -O-R- tvoří karboxamido vazbu s volnou aminoskupinou D-Lys skupiny nebo s alespoň jednou z volných aminoskupin A₂Bu nebo A₂Pr když jsou přítomné v (Xxx), P₂ je analog somatostatinu vzorce

Aas-C^ls-Bbb-D-Trp-Ly s-Ccc-Cy s-Ddd-NH₂, přičemž kde

Aaa je D-Phe, pak Bbb je Tyr, Ccc je Val a Ddd je Thr nebo Trp, kde Aaa je D-Trp, pak Bbb je Phe, Ccc a Ddd jsou Thr, přičemž skupina Q -O-R tvoří karboxamidovou vazbu s terminální aminoskupinou Aaa skupiny,

P₃ je bombesinový antagonistový analog vzorce Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Bbb-NH₂, kde Aaa je 0, D-Tpi nebo D-Phe, Bbb je (CH₂-HN)Leu, CH₂~NH(Phe) nebo (CH--NH)Trp nebo (CH₉-N)Tac,

- · 14 přičemž skupina Q -O-R- tvoří karboxamidovou vazbu, s terminální aminoskupinou Aaa skupiny, kde je přítomna nebo se skupinou Gin, kde chybí.

3, kde

R' je 2-pýrrolin-l-yl.

3, kde

R' je NH₂.

3.

Sloučenina podle nároku

4/7

OBJEM NÁDORU

4, kde je ^P3*

11.

Sloučenina podle nároku

4, kde

P je ^Pl'

7. Sloučenina podle nároku 5, kde

P je P_v

8.

Sloučenina podle nároku kde je

9.

Sloučenina podle nároku

4.

Sloučenina podle nároku

5/7

Obr. 5

OBJEM NÁDORU

18000

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

5, kde ^P3·

12.

Sloučenina podle nároku

5, kde je ^P2*

10.

Sloučenina podle nároku

5.

Sloučenina podle nároku

6/7

Obr. 6

440

420 400 380 360 340

320

300

280

260 • · · · · · 4 · • 9 · 4 4 9 99 9 94 • · · · · 49 • ·· · 4«»·

KONTROLA

25 nmol/kg Q₆—A-- 25 nmol/kg Q₆ ¹⁴gL —v— 50 nmol/kg Q₆ ¹⁴ gL

240 i

TÝDNY LÉČENÍ

• • · • • · ·· * * · • • • * • * • · · • ·· • »· ··

6.

Sloučenina podle nároku

7/7

Obr. 7 i

Inhibice růstu OV 1063 lidských va ječníkových rakovinných xenoimplantátů u holých myší cytotoxickým analogem LH-RH obsahujícím doxorubicin (Q^ gL) a doxorubicinem (Q^)

Objem nádoru