PL191781B1 - Nowe związki antracyklinowe, zawierające je kompozycje farmaceutyczne oraz ich zastosowanie do wytwarzania leku - Google Patents

Abstract

1. Zwiazek antracyklinowy o wzorze: Q 14 -O-R-P (I) gdzie Q 14 oznacza podstawione w pozycji 14 ugrupowanie Q o ogólnym wzorze gdzie - R- oznacza -C(O)-(CH 2) n -C (O)-, a n=O-7, R' jest wybrane z grupy zawierajacej NH 2, aromatyczny lub uwodorniony 5 lub 6 czlonowy zwiazek he- terocykliczny posiadajacy co najmniej jeden azot w pierscieniu i taki zwiazek heterocykliczny, który posiada ugrupowanie butadienowe zwiazane z sasiednimi atomami wegla wymienionego pierscienia z utworzeniem ukladu dwucyklicznego, a P oznacza ugrupowanie peptydowe, korzystnie analogu LHRH, somatostatyny lub bombezyny. 24. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca skladnik aktywny oraz jego farmaceutycznie dopuszczal- ny nosnik, znamienna tym, ze jako skladnik aktywny zawiera zwiazek okreslony w zastrz. 1. 25. Zastosowanie zwiazków okreslonych w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia raka u ssaka. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe związki antracyklinowe, zawierające je kompozycje farmaceutyczne oraz ich zastosowanie do wytwarzania leku.

Wynalazek należy do dziedziny chemii nakierowanych antyrakowych pochodnych antracykliny. Dokładniej dotyczy on doksorubicyny (DOX) lub jej pochodnych zmodyfikowanych daunosaminą (DMDOX), związanych kowalentnie z analogami hormonów peptydowych, takich jak LH-RH, bombezyna i somatostatyna. Te kowalentne produkty sprzężenia chemicznego są nakierowane w różne tworzące nowotwory receptory analogów hormonów peptydowych.

Analogi LH-RH, które mają cytotoksyczne części cząsteczek w szóstej pozycji, przedstawione są w EP 0.450.461 Bl (Schally, Janaky i Bajusz) udzielonym 6 września 1995.

Analogi GnRH (LH-RH) do niszczenia gonadotropów opisane są w WO 90/09799 (Nett i Glode), opublikowanym 7 września 1990. Zgłoszenie to opisuje toksyny, takie jak rycynę, złączone z analogami LH-RH w celu niszczenia gonadotropów i przez to leczenia nowotworów zależnych od hormonów płciowych. Wspomniano również o pochodnej LH-RH doksorubicyny bez opisywania chemii wiązania.

Cytotoksyczne analogi somatostatyny opisane są w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/076.846 (Schally i inni) złożonym 6 kwietnia 1990 i ponownie zgłoszonym 15 lipca 1993.

Dokonany przez A.V. Schally przegląd w Anti-Cancer Drugs 5, 115-130 (1994) podaje szczegóły na temat obecności receptorów na błonach komórkowych wielu różnych nowotworów dla analogów LH-RH, bombezyny lub somatostatyny.

G. Weckbecker wylicza kilka pozycji, które przestawiają receptory i podtypy receptorów dla analogów somatostatyny na kilku normalnych i nowotworowych tkankach w swym przeglądzie w Farmac. Ther. 60, 245-264 (1993).

Peptydy bombezynopodobne i występowanie receptorów bombezyny/GRP na różnych tkankach normalnych i nowotworowych omówione zostały przez N. Bunnett w przeglądzie w Gut Peptides: Biochemistry i Physiology 423-445 (1994) Wyd.: J. Walsz i G. J. Dockray, Raven Press, Nowy Jork oraz E. Spindell w Recent Progress in Hormone Research 48, (1993) (Academic Press).

Doksorubicyna (DOX) jest obecnie najszerzej stosowanym i bardzo silnym środkiem antyrakowym. Jednakże niektóre nowotwory nie reagują na nią wcale, a ponadto jej zastosowanie jest ograniczone przez odporność wielolekową (MDR) i kardiotoksyczność jak również neuropenię, które są wywoływane przez stałe leczenie. W celu przezwyciężenia tych wad i w celu dalszego wykorzystywania olbrzymich możliwości antyrakowych właściwych strukturze antybiotyków antracyklinowych opisano tysiące syntetycznych pochodnych, łącznie z ich nakierowanymi analogami związanymi z różnymi makrocząsteczkami nośnymi.

Większość historii DOK oraz jej analogów opisano w Adriamycin, David W. Henry, ACS Symposium Series, nr 30, Cancer Chemotherapy, American Chemical Society, s. 15-57 (1976) oraz w książce Doxorubicin, Federico Arcamone, Academic Press, (1981).

Silnie aktywna, alkilująca, pozbawiona odporności skrośnej 3'-deamino-3'-(3-cyjano-4-morfolinylo)-DOX i jej pochodne, które mają działanie przeciwnowotworowe, opisane są w patencie USA nr 4.464.529 (Mosher i inni) z 7 sierpnia 1984. Synteza i ocena biologiczna tych Intensywnie Silnych Antracyklin Morfolinowych opisane są również w J. Med. Chem. 1984, 27, 638-645.

W Proc. Nati Acad. Sd. USA wol. 88, s. 4845-4849, czerwiec 1991, Gao i inni. opisują alkilowanie za pośrednictwem formaldehydu sekwencji DNA pochodną daunorubicyny.

Antracyklinowe analogi niosące utajone podstawniki alkilacji opisano w J. Med. Chem. 35, 3208-3214 (1992).

Użycie związku α,ω-dwujodowego do alkilowania azotu daunosaminy w DOX i przez to tworzenia nowej morfolinylowej pochodnej DOX opisano w patencie europejskim EP 434 960, zgłoszonym przez Pharmacia Carlo Erba 12 grudnia 1989.

N-trójfIuoroacetyloadriamycyno¹⁴-O-hemiglutarynian i -hemiadypinian opisano jako analogi N-trójfluoroacetyloadriamycyno¹⁴-O-walerianianu (AD-32) o lepszej rozpuszczalności w wodzie w patencie

USA nr 4.299.822 (Israel i inni), 10 listopada 1981.

Horton i Priebe (J. Antibiotics, XXXVI, 1211-1215.) opisują kilka 14-O-estrów różnych analogów antracykliny bez żadnych drastycznych zmian działania antyrakowego w porównaniu z macierzystymi analogami 14-OH.

W dziedzinie opracowywania nakierowanych czynników chemoterapeutycznych myśli się o następujących zadaniach:

PL 191 781 B1

1. Stabilne połączenie pomiędzy cząsteczką nośną a czynnikiem chemoterapeutycznym aż do osiągnięcia celu.

2. Utrzymywane właściwości biologiczne cząsteczki nośnika w produkcie sprzężenia, na przykład utrzymywane właściwości wiązania.

3. Utrzymywana aktywność farmakologiczna czynnika chemoterapeutycznego w produkcie sprzężenia, np. utrzymywana aktywność cytotoksyczna.

4. W wyniku sprzężenia produkcja analogów o intensywniejszej aktywności i/lub mniejszej toksyczności obwodowej względem części cząsteczek nie uczestniczących w sprzężeniu.

Sprzężenie DOX przez utlenienie NaIO4 daunosaminowej części cząsteczki DOK, po którym następuje alkilowanie redukcyjne wykorzystujące aminę pierwszorzędową cząsteczki nośnika, opisano w patencie USA nr 4.263.279 (Sela i inni), 21 kwietnia 1981.

Element dystansujący z kwasu cis-akonitynowego został użyty do połączenia azotu z daunosaminy z makromolekularnymi nośnikami z wiązaniem wrażliwym na pH, jak opisano w Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981 102, 1048-1054.

Tworzenie wiązań estrowych i połączeń C-N pomiędzy 14-bromodaunorubicyną a proteinami lub kwasami poli-L-aminowymi opisane zostało przez Zunino i innych (1981) Tumori 67, 521-524 oraz (1984) Eur. J. Cancer Glin. Oncol. 20, 421-425.

Morfolino-DOX (silnie aktywny modyfikowany daunosaminą analog DOX) była sprzęgana z przeciwciałem przez podlegające hydrolizie (lizosomotrop, wrażliwy na pH) wiązanie hydrazonowe z wykorzystaniem funkcji C-13 okso czynnika cytotoksycznego, jak opisano w Bioconjugate Chemistry 1990 1(5), 325-330.

Czułość wiązania karboksamidowego pozostałości leucynowej na rozkład enzymatyczny była z powodzeniem wykorzystywana w produktach sprzężenia DOK zawierają cych peptyd ramienia dystansującego, korzystnie Ala-Leu-Ala-Leu, gdzie zakończenie karboksy Leu acyluje azot daunosaminy w DOK, a aminowe zakoń czenie Ala jest dołą czone do noś nika poprzez element dystansują cy z kwasu dwukarboksylowego, jak opisano w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982 79, 626-629.

Azot daunosaminy w DOK był acylowany przez element dystansujący z kwasu glutarowego i łączony z analogami LH-Rh z poważną stratą aktywności cytotoksycznej, jak opisano w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 89, 972-976.

Dalsze publikacje związane ze stosowaniem związków według przedmiotowego wynalazku do leczenia różnych nowotworów u ludzi:

1. Schally i inni (1996), Treatment with GnRH Analogs: Controversies and Perspectives, wyd. Filicori, M. & Flamigni, C. (Parthenon,Carnfonh, U.K.), s. 33-44.

2. Nagy i inni (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7269-7273.

3. Yano i inni (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7090-7094.

4. Rekasi i inni (1993) Endocrinology 132(5) 1991-2000.

5. Srkalovic i inni (1990) Cancer Res. 50, 1841-1846.

6. Emons i inni (1993) Cancer Res. 53, 5439-5446.

7. Emons i inni (1993) Journal of Glin. Endocrin. and Metabol. 77(6) 1458.

8. Schally, A. V. (1988) Oncological applications of somatostatin analogs. Cancer Res. 48, 6977-6985.

9. Schally i inni (1994) International Journal of Pancreatology 16, 277-280.

10. Srkalovic i inni (1990) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 70(3), 661-669. 4 Pinski i inni (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.

11. Radulovic i inni (1992)~Cancer Letters 62, 263-271.

12. Qin i inni (1995) Int. J. Cancer 60, 694-700.

13. Radulovic i inni (1992) P.S.E.B.M. 200, 394-401.

14. Radulovic i inni (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701.

15. Pinski i inni (1993) Cancer Letters 71, 189-196.

16. O'Byrne i inni (1994) Eur. J. of Cancer 30A(11) 1682- 1687.

17. Pinski i inni (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

18. Pinski i inni (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.

19. Pinski i inni (1996) Int. J. Cancer 65, 870-874.

20. Banks i inni (1992) Anticancer Drugs. 3, 519-523.

21. Reubi and Kvols (1992) Cancer Res. 52, 6074-6078.)

22. Schally i inni (1994) International Journal of Pancreatology 16, 277-280.

PL 191 781 B1

23. Halmos i inni (1995) Cancer Res. 55, 280-287.

24. Halmos i inni (1994) Cancer Letters 85, 111-118.

25. Qin i inni (1994) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 120, 519-528

26. Qin i inni (1994) Cancer Res. 54, 1035-1041.

27. Qin i inni (1995) Int. J. Cancer 63, 257-262.

28. Reile i inni (1994) The Prostate 25, 29-38.

29. Pinski i inni (1994) Int. J. Cancer 57, 574-580.

30. Radulovic i inni (1992) P.S.E.S.M. 200, 394-401.

31. Radulovic i inni (1994) Acta Oncologica 33(6) 693-701.

32. Pinski i inni (1993) Cancer Letters 71, 189-196.

33. Pinski i inni (1994) Br. J. of Cancer 70, 886-892.

34. Pinski i inni (1994) Cancer Res. 54, 5895-5901.

Niniejsze zgłoszenie nawiązuje do wszystkich tych publikacji.

Związkami według wynalazku są nowe nakierowane cytotoksyczne hormony peptydowe zawierające antracyklinowy czynnik cytotoksyczny, taki jak DOX lub DM-DOX, sprzężony z hormonem peptydowym, takim jak analogi LH-RH, bombezyny i somatostatyny. Te produkty sprzężenia cytotoksycznych hormonów peptydowych są przeznaczone do leczenia nowotworów mających receptory specyficzne dla produktu sprzężenia, takich jak rak piersi, rak jajnika, rak śluzówki macicy, rak prostaty, rak trzustki, rak okrężnicy, rak żołądka oraz rak płuc. Niektóre z tych (niesprzężone) cytotoksycznych czynników antracyklinowych, wykorzystywanych tu, są nowe jako takie i mają duże możliwości, jednakże ich poziom toksyczności jest zbyt wysoki, aby były one używane w postaci niesprzężonej.

Modyfikowane daunosaminą analogi DOK przedstawione w tym wynalazku zostały opracowane w trakcie poszukiwania nowych, silnie aktywnych, nie mają cych odpornoś ci skroś nej analogów DOK nadających się do tworzenia kowalentnych produktów sprzężenia z nośnikami peptydowymi.

Tworzenie stabilnych, kowalentnie związanych produktów sprzężenia z utrzymanymi w pełni aktywnościami biologicznymi swych składników uzyskano przez zastosowanie elementu dystansującego z kwasu dwukarboksylowego, takiego jak kwas glutarowy. Jedna grupa karboksylowa takiego elementu dystansującego tworzy wiązanie estrowe z grupą 14-OH w DOX lub DM-DOX, a inna grupa karboksylowa elementu dystansującego tworzy wiązanie karboksyamidowe z dobrze wybraną swobodną grupą aminową nośnika peptydowego.

Związki według niniejszego wynalazku są reprezentowane przez ogólny wzór Q¹⁴-O-R-P (I) gdzie Q¹⁴ oznacza podstawione w pozycji 14 ugrupowanie Q o ogólnym wzorze

I R

R- oznacza -C(O)-(CH2)n -C(O)-, a n=O-7,

R' oznacza NH₂ albo aromatyczne, nasycone lub częściowo nasycone 5 lub 6 członowe związki heterocykliczne posiadające co najmniej jeden azot w pierścieniu i ewentualnie posiadające ugrupowanie butadienowe związane z sąsiednimi atomami węgla wymienionego pierścienia z utworzeniem układu dwucyklicznego,

P oznacza ugrupowanie peptydowe, korzystnie analogu LHRH, somatostatyny lub bombezyny, ale bez wykluczania innych peptydów aktywnych fizjologicznie. Szczególnie pożądane są analogi

PL 191 781 B1

LHRH mające powinowactwo wobec receptorów komórek neoplastycznych, zwłaszcza analogi posiadające ugrupowanie D-Lys w pozycji 6, jak również analogi skróconej somatostatyny i bombezyny.

W trakcie tych prac wykorzystano reakcję syntezy, w której doksorubicyna i jej pochodne są sprzęgane poprzez cząstkę dwukarboksylową w pozycji 14 dając nowe farmakologicznie skuteczne produkty sprzężenia. Ponadto wytwarza się częściowo nasycone cząstki heterocykliczne z sąsiadujących i dysjunktywnych cząstek, to znaczy α, β- lub α,γ-hydroksyamin pierwszorzędowych. Szczególne zastosowanie w niniejszym wynalazku miało tworzenie cząstek 2^-pirolinylu i 13-czterohydropirydynylu na cukrze daunosaminowym. Jednakże reakcja ta ma szersze zastosowanie. 5 i 6-członowe częściowo nasycone cząstki heterocykliczne mogą powstawać wtedy, gdy sąsiadująca lub dysjunktywna hydroksyamina reaguje z halopodstawionym aldehydem posiadającym 2 lub 3 ugrupowania pomiędzy węglem aldehydowym a atomem węgla posiadającym grupę halo. Ugrupowania te wszystkie mogą być metylenem, albo też mogą obejmować heteroatom, taki jak tlen. Reakcja przebiega w trzech etapach. Bardzo duży nadmiar haloaldehydu reaguje z kwasową solą hydroksyaminy korzystnie w polarnie obojętnym bezwodnym rozpuszczalniku organicznym. Powstaje w ten sposób

5-członowy pierścień oksazolidynowy (albo 6-członowy pierścień 1,3-czterohydrooksazynowy) przez kondensację grupy aldehydowej z grupami hydroksylową i aminową. Produkt ten jest traktowany organiczną zasadą, korzystnie trzeciorzędową aminą, przy czym elementy kwasu chlorowcowodorowego są eliminowane pomiędzy ugrupowaniem halo poprzedniego haloaldehydu a grupą aminy drugorzędowej oksazolidyny lub pierścieniem 1,3-czterohydrooksazynowego, by utworzyć skondensowaną strukturę pierścieniową przez dodanie pierścienia 5 lub 6-członowego. Zasada ta jest następnie zobojętniania słabym kwasem, korzystnie kwasem organicznym, takim jak lodowaty kwas octowy. Potraktowanie wodnym roztworem kwasu, korzystnie organicznego, otwiera oskazolidynową lub 1,3-czterohydrooksazynową część skondensowanego pierścienia. Dla fachowców będzie zrozumiałe, że zależnie od wyjściowego aldehydu końcowy pierścień zawierający azot może zawierać co najmniej jeden dodatkowy heteroatom, jak wspomniano powyżej. Ogólną reakcję można przedstawić jak następuje:

(III)

-C-Z-CI I

OH NH₃ ⁺ X'

I

H O CH₂ \ // / C-(CH₂-Y) (duży nadmiar) w rozpuszczalniku, bezwodny rozpuszczalnik aprotonowy

-c-z-ci i

O NH CH₂ \ / / CH-(CH₂-Y)

-c-z-cI I o N------CH₂ (IV)

X zasada (trzeciorzędowa bezwodna amina (V)

H2O + kwas

CH-(CH₂-Y)

-C-Z-C- (VI)

HO N / \

CH CH₂

W / (CH-Y)

PL 191 781 B1

Gdzie X' oznacza halo, odpowiednio bromo lub jodo, korzystnie jodo,

Y oznacza CH2, OCH2, CH2-CH2,

Z oznacza nic lub CH2.

Kiedy Z jest nic, cząstka aldehydowa tworzy 5-członowy pierścień oksazolidynowy jako pierwszy etap reakcji. Kiedy Z oznacza CH2, cząstka aldehydowa tworzy 6-członowy pierścień 1,3-czterohydrooksazynowy.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia wykres zmian estrogenowo niezależnych raków sutka myszy MXT dla różnych poziomów dawkowania nowych związków oraz DOK.

Figura 2 przedstawia wykres zmian estrogenowo niezależnych raków sutka myszy MXT dla różnych poziomów dawkowania pewnego związku według przedmiotowego wynalazku, związku według stanu techniki, DOX i substancji kontrolnej.

Figura 3 przedstawia wykres wpływu cytotoksycznych analogów LHRH na przeżycie myszy z estrogenowo niezależnymi rakami sutka myszy MXT.

Figura 4 przedstawia wykres objętości nowotworu u samców szczurów Copenhagen z przeszczepami raka prostaty Dunning R-3327-H w trakcie leczenia substancją agonistyczną według stanu techniki i pewnym związkiem według przedmiotowego wynalazku.

Figura 5 przedstawia wykres pokazujący wpływ leczenia związkiem według przedmiotowego wynalazku na objętość nowotworu u szczurów z rakiem prostaty Dunning R-3327-H.

Figura 6 przedstawia wykres pokazując wpływ leczenia związkiem według wynalazku na ciężar ciała szczurów Copenhagen mających raka prostaty Dunning R-3327-H.

Figura 7 przedstawia wykres pokazujący wstrzymanie wzrostu nowotworu uzyskane przez leczenie związkiem według wynalazku i DOX.

Ugrupowanie Q, gdy jest podstawione w pozycji R' pewnymi korzystnymi grupami, ma oznaczenia podugrupowania Q1-Q8, z czego Q2-Q8 są nowymi cząstkami cytotoksycznymi.

R' ma korzystne znaczenia prowadzące do pożądanych ugrupowań Qx podanych w nawiasach, jak następuje: NH2 (Q1), pirolidyno-1-il (Q2), izoindolino-2-il (Q3), 3-pirolino-1-il (Q4), 3-pirolidono-1-il (Q5), 2-pirolino-1-il (Q6), 3-piperidono-1-il (Q7) lub 1,3-czterohydropirydyno-1-il (Q8).

Związki zawierające azot daunosaminy w pięcioczłonowym pierścieniu o funkcji alkilującej są

10-50 razy bardziej aktywne in vitro niż ich homologowe odpowiedniki zawierające azot daunosaminy w sześcioczłonowym pierścieniu. (Takie pary stanowią Q5 i Q7 oraz Q6 i Q8.)

W związkach według wynalazku o wzorze Q¹⁴-O-R-P, R-P jest inne niż wodór. Tam gdzie P jest inne niż wodór, to znaczy gdzie jest to P1, P2, P3, odpowiednio gdzie P1 jest agonistycznym nośnikiem LH-RH, antagonistycznym nośnikiem LH-RH lub skróconym nośnikiem analogowym LH-RH, P2 jest skróconym analogiem somatostatyny, a P3 jest antagonistą bombezyny.

Odpowiednio P1 jest Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd, gdzie (Xxx) jest wodorem lub podstawnikiem dwuaminowym, takim jak A2Bu lub A2Pr, przy czym gdzie Aaa jest Glp, wtedy Bbb jest His, Ccc jest Trp, a Ddd jest Gly-NH2, gdzie Aaa jest Ac-D-Nal(2), Ac-D-Phe lub AcD-Phe(4Cl), wtedy Bbb jest D-Phe(4Cl) lub D-Phe, Ccc jest D-Pal(3), a D-Trp i Ddd jest D-Ala-NH2; a gdzie Aaa-Bbb-Ccc jest Ac, wtedy Ddd jest -NH-CH2-CH3;

P₂ jest Aaa-Cys-Bbb-D-Trp-Lys-Ccc-Cys-Ddd-NH₂ przy czym:

kiedy Aaa jest D-Phe, wtedy Bbb jest Tyr, Ccc jest Val, a Ddd jest Thr lub Trp; a kiedy Aaa jest D-Trp, wtedy Bbb jest Phe, a Ccc i Ddd są Thr; a P3 jest Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH2 przy czym: Aaa oznacza nic, D-Tpi lub D-Phe a Bbb jest (CH2-NH)Leu, (CH2-NH)Phe, (CH2-NH)Trp, (CH2-N)Tac lub (CH2-N)DMTac.

W nowych związkach według wynalazku, zawierających analogi LH-RH, cytotoksyczny rodnik Q jest dołączony do bocznego łańcucha D-Lys na analogach LH-RH lub do dołączonej do niego grupy (Xxx) poprzez element dystansujący z kwasu dwukarboksylowego według wzoru VII:

Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)m(Q¹⁴-O-R)n-Leu-Arg-Pro-Ddd (VII) gdzie m oznacza 1 albo 0, a n oznacza 1 albo 2, pod warunkiem że kiedy m jest 1, to znaczy (Xxx) jest A2Bu lub A2Pr, n jest 1 albo 2, a kiedy m jest 0, to znaczy (Xxx) jest H, wówczas n jest 1.

PL 191 781 B1

W nowych zwią zkach według przedmiotowego wynalazku zawierają cych analogi somatostatyny cytotoksyczny rodnik Q jest dołączony do aminowego zakończenia analogów somatostatyny poprzez element dystansujący z kwasu dwukarboksylowego według wzoru VIII.

W nowych zwią zkach według przedmiotowego wynalazku zawierają cych analogi antagonistów bombezyny cytotoksyczny rodnik Q jest dołączony do zakończenia aminowego antagonistów bombezyny według wzoru IX:

Q¹⁴-O-R-Aaa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu Bbb-NH2 (IX)

Szczególnie korzystnymi przykładami realizacji niniejszego wynalazku są te peptydowe produkty sprzężenia, które zawierają Q1 i Q6 jako cytotoksyczne rodniki i kwas glutarowy (n=3) jako element dystansujący kwasu dwukarboksylowego tworzący wiązanie estrowe 14-O z Q1 (doksyrubicyna) lub Q6 (2-pirolino-doksorubicyna) i wiązanie karboksyamidowe z nośnikiem peptydowym.

Najkorzystniejszymi przykładami realizacji niniejszego wynalazku są cytotoksyczne analogi LH-RH o nastę pują cych wzorach:

1. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q1¹⁴-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2;

2. Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys (Q6¹⁴-O-glt)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; cytotoksyczne analogi somatostatyny o następujących wzorach :

3. Q₁ ¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

I l

4. Q_e ¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

I 1

5. Q,¹⁴-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

I Ί

6. Q₀ ¹⁴-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

I I

7. QAO-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂;

oraz

I I

8. Q_e ¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D’Trp-Lys-Val-Cys-T rp-NH₂;

i cytotoksyczne antagonistyczne analogi bombezyny o nastę pują cych wzorach:

9. Qi¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂;

10. Q₆ ¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-l_eu (CH₂-NH)Leu-NH₂

11. Qi’⁴-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂; i

Q₆ ¹⁴-O-glt-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂.

PL 191 781 B1

W procesie tworzenia częściowo nasyconego heterocyklicznego pierścienia z azotem sąsiadującej lub dysjunktywnej, to znaczy α, β- lub α,γ-hydroksyaminy pierwszy etap reakcji jest przeprowadzany w bezwodnym obojętnym organicznym polarnym (aprotonowym) rozpuszczalniku niehydroksylowym, odpowiednio w dwumetyloformamidzie z zastosowaniem znacznego nadmiaru, odpowiednio 30-krotnego nadmiaru haloaldehydu, przy czym szczególnie skuteczny jest 4-jodobutyraldehyd i 5-jodowaleraldehyd. Proces nie ogranicza się jednak do nich, a zamiast jodo mogą być stosowane bromo. Reakcja ta, jak również następne etapy, mogą być przeprowadzane przy temperaturze otoczenia.

Etap zasadowania jest przeprowadzany z nadmiarem, odpowiednio 2-4-krotnym nadmiarem zasady organicznej. Odpowiednie do tego celu są aminy trzeciorzędowe, takie jak trójalkiloaminy.

Utworzony w ten sposób pierścień dwucykliczny jest otwierany w celu uwolnienia sąsiadującej lub dysjunktywnej grupy hydroksylowej przez traktowanie kwasem organicznym w obecności wody. Można zastosować rozcieńczony wodny roztwór kwasu trójfluorooctowego, odpowiednio w obojętnym rozpuszczalniku organicznym, takim jak acetonitryl. Produkt ten jest oczyszczany przez usuwanie składników lotnych pod zmniejszonym ciśnieniem, ekstrahowanie heksanem nadmiaru halozwiązku i oczyszczanie pozostałości na HPLC.

Do opisania peptydów i związków według niniejszego wynalazku stosuje się konwencjonalne skróty dla aminokwasów ogólnie przyjęte w dziedzinie chemii peptydów i zalecane przez IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (European J. Biochem., 138, 9-37 (1984).

Skróty dla reszt poszczególnych aminokwasów oparte są na zwykłej nazwie aminokwasu, np. Glp oznacza kwas piroglutaminowy, His oznacza histydynę, Trp oznacza tryptofan itd. Skróty te oznaczają postać izomerową L aminokwasów, chyba że podano inaczej, np. Ser oznacza L-serynę, a D-Lys oznacza D-lizynę.

Skróty niepospolitych aminokwasów użyte w tym wynalazku są następujące: D-Nal(2) oznacza D-3-(2-naftylo)alaninę, a D-Pal(3) oznacza D-3-(3-pirydylo)alaninę, D-Phe(4Cl) oznacza D-4-chlorofenyloalaninę.

Sekwencje peptydów są zapisywane zgodnie z konwencją z umieszczeniem aminokwasu z zakończeniem N z lewej strony i aminokwasu z zakończeniem C z prawej strony, np. Glp-His-Trp.

Wzór Leu (CH2-NH)Leu-NH2 opisuje osłabione wiązanie peptydowe pomiędzy leucyną a resztą leucynoamidową przy C-końcu sekwencji peptydowej.

Inne użyte skróty są następujące:

A2Bu: kwas dwuaminomasłowy

A2Pr: kwas dwuaminopropionowy

BN: bombęzyna

Reagent BOP: sześciofluorofosforan benzotrójazolo-1-iloksytris(dwumetyloamino)fosfoniowy

DIPEA: N,N-dwuizopropyloetyloamina

DM-DOX: doksorubicyna modyfikowana daunosaminą

DMF: N,N-dwumetyloformamid

DMTac: kwas 5,5-dwumetylo-tiazolidyno-4-karboksylowy

DOK: doksorubicyna

Fmoc: 9-fluoroenylometylooksykarbonyl glt: -C(O)-CH2-CH2-CH2-C(O)-, glutaryl

Glt2O: bezwodnik glutarowy

HOBt: 1-hydroksybenzotriazol

HO-glt-OH: kwas glutarowy

HOSu: N-hydroksybursztynoimid

HPLC: chromatografia cieczowa o dużej skuteczności

TFA: kwas trójfluorooctowy

Tac: kwas tiazolidyno-4-karboksylowy

Tpi: kwas 2,3,4,9-czterohydro-1H-pirydo[3,4-b]indolo-3-karboksylowy

Do monitorowania reakcji chemicznych i kontrolowania czystości związków według niniejszego wynalazku stosowano system analityczny HPLC Beckmana wyposażony w detektor z polem złożonym ze 168 diod i oprogramowanie chromatograficzne System Gold (Beckman). Użyta kolumna była Dynamax C-18 (250x4,6 mm; wielkość porów 300 A; wielkość cząstek: 12 μm). System rozpuszczalnika złożony był z dwóch składników: (i) 0,1% TFA w wodzie oraz (ii) 0,1% TFA w 70% wodnym roztworze acetonitrylu i użyty w trybie liniowego gradientu ze wzrostem 1% (ii) na 1 minutę w celu monitorowania reakcji chemicznych. Do kontroli czystości zastosowano system w trybie izokratycznym.

PL 191 781 B1

Do izolowania i oczyszczania związków według niniejszego wynalazku zastosowano semipreparatywny system HPLC Beckman model 342. Kolumna była Aquapore Octyl (250x10 mm, wielkość porów: 300 A; wielkość cząstek: 15 μm. System rozpuszczalnika był taki sam jak opisano dla analitycznego systemu HPLC powyżej.

Do oznaczania struktury pochodnych doksorubicyny zastosowano spektrometr Bruker ARX300 NMR (częstotliwość 1H 300 MHz, częstotliwość 13C 75MHz) i spektrometr masowy Finnigan-MAT TSQ 7000 pracujący w trybie rozpylania.

Następnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek według wynalazku jako składnik aktywny oraz jego farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Związki według wynalazku są często podawane w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych, nietoksycznych soli, takich jak sole addycyjne z kwasami. Przykładami takich soli addycyjnych z kwasami są chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, fumarynian, glikonian, taninian, maleinian, octan, trójfluorooctan, cytrynian, benzoesan, bursztynian, alginian, embonian, jabłczan, askorbinian, winian itp. Jeżeli składnik aktywny ma być podawany w postaci tabletki, wówczas tabletka ta może zawierać farmaceutycznie możliwy do przyjęcia rozcieńczalnik, który zawiera spoiwo, takie jak tragakant, skrobię zbożową lub żelatynę, czynnik dezintegrujący, taki jak kwas alginowy oraz czynnik smarujący, taki jak stearynian magnezu.

Jeżeli pożądane jest podawanie w postaci cieczy, wówczas jako część rozpuszczalnika możliwego farmaceutycznie do zaakceptowania może być używany środek słodzący i/lub zapachowy, przy czym możliwe jest podawanie dożylne w izotonicznym roztworze soli, fosforanowych roztworach buforowych itp.

Kompozycje farmaceutyczne będą zwykle zawierać związek według wynalazku w połączeniu z konwencjonalnym nośnikiem możliwym farmaceutycznie do zaakceptowania. Zwykle dawka będzie od około 1 do około 100 μg związku według wynalazku na kilogram ciężaru ciała żywiciela przy podawaniu dożylnym; dawki doustne będą znacznie większe. Ogólnie leczenie pacjentów związkami według wynalazku tymi peptydami jest zasadniczo przeprowadzane w taki sam sposób jak leczenie kliniczne przy użyciu innych analogów LHRH, somatostatyny i analogów doksorubicyny.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie związków według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia raka u ssaka.

W kolejnym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla LH-RH, łącznie z rakami sutka, jajników, śluzówki macicy, prostaty, trzustki i okrężnicy.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania związków według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, posiadających receptory dla takich analogów somatostatyny, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i niemałokomórkowymi, rakami komórek nerkowych, kostniakomięsakami i nowotworami mózgu.

W jeszcze innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związków według wynalazku 20 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla GRP i peptydy bombezynopodobne, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, odbytnicy i okrężnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i niemałokomórkowymi oraz nowotworami mózgu.

Związki według wynalazku mogą być podawane ssakom dożylnie, podskórnie, domięśniowo, doustnie, poprzez nos lub dopochwowo, aby osiągnąć biologiczne efekty hormonalne przez wiązanie ze specyficznymi receptorami. W przypadku analogów LHRH efekty te mogą obejmować odwracalne stłumienie aktywności gonad, a w przypadku analogów somatostatyny zahamowanie funkcji żołądkowo-jelitowych. Skuteczne dawki będą zmieniać się w zależności od formy podawania i leczenia określonych gatunków ssaków. Przykładem typowej postaci dawkowania jest fizjologiczny roztwór soli zawierający związek według wynalazku, którego roztwór jest podawany w celu osiągnięcia dawki w zakresie 0,1-2,5 mg/kg ciężaru ciała. Podawanie doustne związek według wynalazku może być podawany albo w postaci stałej, albo w postaci cieczy.

Synteza nośników peptydowych według wynalazku może być przeprowadzana dowolnymi spośród technik znanych fachowcom w dziedzinie chemii peptydów. Zestawienia odpowiednich technik można znaleźć w pracy M. Bodanszky, Principles ot Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984. Techniki syntezy peptydów w fazie stałej można znaleźć w książce J. M. Stewart i J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. wydanie) oraz w przeglądzie G. Barany i in., Int. J. Peptide and Protein Res. 30, 705-739 (1987).

PL 191 781 B1

Synteza nośników będących analogami LH-RH, użytych według niniejszego wynalazku, jest szczegółowo opisana w przykładach do patentu USA nr 5.258.492 (Sandor Bajusz i Andrew V. Schally) 2 listopada 1993 oraz w artykułach Bajusz i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1637-1641 (1988) oraz 86, 6318-6322 (1989), jak również Janaky i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1023-1027 i 972-976 (1992).

Synteza nośników będących analogami somatostatyny, użytych według niniejszego wynalazku, jest szczegółowo opisana w przykładach do patentu USA nr 4.650.787, 17 marca 1987 (Andrew V. Schally i Ren Z. Cai). Opis syntezy można również znaleźć w artykułach Cai i in., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83, 1896-1900 (1986) i Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2502-2506 (1987).

Synteza nośników będących antagonistami bombezyny, użytych według przedmiotowego wynalazku, jest szczegółowe opisana w artykułach Coy i in., J. Biol. Chem. 263, 5056-5060 (1988) i 264, 14691-14697 (1989) oraz Cai i in., Peptides 13, 267-271 (1992) i Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12664-12668 (1994).

Synteza pochodnych doksorubicyny, użytych w niniejszym wynalazku oraz tworzenie jej produktów sprzężenia z różnymi nośnikami peptydowymi jest opisana szczegółowo w poniższych przykładach, które mają być ilustracyjne, a nie ograniczające.

P r z y k ł a d I

Przygotowanie i wyizolowanie N-Fmoc-DOX¹⁴-O-hemiglutarynianu

Sól DOX HCl 50 mg (86 μmol) rozpuszczona została w 1ml DMF i dodano 30 mg (90 μmol) Fmoc-OSu, po czym dodano 31 μ! (180 μmol) DIPEA. Po mieszaniu przez 3 godziny reakcja została zakończona i przeprowadzono ocenę przez analityczny system HPLC. Rozpuszczalnik odparowano do stanu suchego w wyparce próżniowej Speed Vac, a pozostałość skrystalizowano przez ucieranie z 0,1% TFA w H2O. Kryształy odfiltrowano i przemyto raz zimnym eterem w celu usunięcia śladu nadmiaru Fmoc-OSu. Po wysuszeniu w eksykatorze, m=62 mg otrzymano N-Fmoc-DOX o czystości 98%. (Wydajność: 94%).

Ten produkt pośredni poddawano przez noc reakcji z 11,4 mg (100 μmol) Glt₂O w 1 ml bezwodnego DMF w obecności 26,1 μl (150 μmol) DIPEA. Rozpuszczalnik odparowano w Speed Vac, a resztkowy olej przeprowadzono w stan stały przez ucieranie z 0,1% roztworem wodnym TFA (obj./obj.). Tak otrzymany surowy materiał zawiera 70% N-Fmoc-DOX 14-O-hemiglutarynianu, 20% nieprzereagowanej N-Fmoc-DOX i 10% innych zanieczyszczeń, jak to zostało ocenione za pomocą analitycznego systemu HPLC. Ten surowy produkt można użyć do wytworzenia peptydowych produktów sprzężenia z DOX bez dalszego oczyszczania. Kiedy ten surowy materiał był rozpuszczony w 20 ml 60% wodnego roztworu acetonitrylu, zawierającego 0,1% TFA i doprowadzony do semipreparatywnego systemu HPLC, otrzymano 45,7 mg końcowego produktu w postaci N-Fmoc-DOX14-O-hemiglutarynianu o czystości 98%. (Wydajność: 64%).

P r z y k ł a d II

Przygotowanie i wyizolowanie soli (Q₂) TFA 3'-deamino-3'-(pirolidyno-1-il)-doksorubicyny i jej soli TFA 14-O-hemiglutarynianu (AN-193).

Sól DOX-HCl, 50 mg (86 μmol) rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 171 μl (1,3 mmol) 15-krotnego nadmiaru 1,4-dwujodobutanu, po czym dodano 45 μl (260 μmol) 3-krotnego nadmiaru DIPEA. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Po 16 godzinach reakcja była zakończona zgodnie z oceną analitycznego systemu HPLC. Rozpuszczalnik odparowano w Speed Vac, a resztkowy olej rozpuszczono w 3 ml 0,1% TFA w H2O i ekstrahowano eterem w celu usunięcia nadmiaru 1,4-dwujodobutanu. Następnie ten wodny ekstrakt doprowadzono do systemu HPLC i otrzymano m:41,6 mg pochodnej DOK o czystości 98% (wydajność 68%).

41,6 mg (58 μmol) soli (Q₂) TFA 3'-deamino-3'-(pirolidyno-1-il)-doksyrubicyny otrzymanej w ten sposób przereagowano z 1,2 równoważnika Glt2O w suchym DMF dokładnie jak opisano w przykładzie I. Wydajność wynosiła 35% (16,9 mg), a czystość wynosiła 98%.

P r z y k ł a d III

Przygotowanie i wyizolowanie soli (Q₃) TFA 3'-deamino-3'-(izoindolino-2-il)doksyrubicyny

Sól DOK HCl, 50 mg (86 μmol) rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 226 mg (1,3 mmol) 15-krotnego nadmiaru α,α'-dwuchloroortoksylenu, po czym dodano 45 μl (260 μmol) 3-krotnego nadmiaru DIPEA i katalityczną ilość Nal. Po 16 godzinach rozpuszczalniki usunięto za pomocą Speed Vac, a resztę rozpuszczono w 3 ml 0,1% wodnego roztworu TFA i ekstrahowano za pomocą 3 ml eteru w celu usunięcia nadmiaru związku chlorowca. Tak otrzymany surowy materiał doprowadzono do systemu HPLC. Po oczyszczeniu otrzymano 36 mg produktu końcowego o czystości 98%. (Wydajność: 55%).

PL 191 781 B1

P r z y k ł a d IV

Przygotowanie i wyizolowanie soli (Q₄) TFA 3'-deamino-3'-(3-pirolino-1-il)-doksorubicyny

Sól DOX HCl, 50 mg (86 μmol), rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 136,8 μl (1,3 mmol) 15-krotnego nadmiaru cis-1,4-dwuchloro-2-butenu (Aldrich), po czym dodano 45 μl (260 μmol) 3-krotnego nadmiaru DIPEA. Po 16 godzinach rozpuszczalniki usunięto w Speed Vac, a pozostałość rozpuszczono w 3 ml 0,1% wodnego roztworu TFA i ekstrahowano za pomocą 3 ml heksanu w celu usunięcia nadmiaru związku chlorowca. Tak otrzymany surowy materiał doprowadzono do systemu HPLC. Po oczyszczeniu otrzymano 22,6 mg końcowego produktu o czystości 98%. (Wydajność: 37%).

P r z y k ł a d V

Przygotowanie i wyizolowanie 1-chloro-4-bromo-2-butanonu (C4H6ClBrO) oraz 1-chloro-5-bromo-2-pentanonu (C5H8ClBrO)

Chlorek 3-bromopropionylowy, 100,8 μl (1 mmol), (Aldrich) przereagowano z nadmiarem dwuazometanu w eterze. Po 1 h eterowy roztwór eluowano i badano punktowo na TLC. Arkusze aluminium do chromatografii cienkowarstwowej powleczono żelem krzemionkowym 60 F254, Merck Art. Nr 5554, zastosowano jako fazę stacjonarną, a CHCl3:MeOH 95:5 (obj./obj.) jako fazę ruchomą. Do badania punktowego odczynnik 2,4-dwunitrofenylohydrazynowy (Vogel: A textbook of Practical Organic Chemistry, strona 1061, trzecie wydanie, Longmans, Nowy Jork) natryśnięto na arkusz TLC po eluowaniu. Tak wytworzona pochodna dwuazometyloketonu wykazywała żółty punkt przy Rf:0,3. Następnie przeprowadzono reakcję tego eterowego roztworu z bezwodnym HCl w eterze, przetwarzając dwuazometyloketon w żądany produkt końcowy, 1-chloro-4-bromo-2-butanon. Produkt ten miał żółty punkt, charakterystyczny dla związków okso, z Rf: 0,8 w tym samym systemie rozpuszczalnika i z opisanym powyżej odczynnikiem do badań punktowych. Po odparowaniu rozpuszczalnika surowy produkt podano na kolumnę (długość 15 cm, średnica 2,5 cm) załadowaną 15 g żelu krzemionkowego, Merck, gatunek 9385, numer sita 230-400, wielkość porów 60 A. Ruchomą fazą ciekłą był czysty CHCl3. Frakcje zawierające żądany produkt końcowy (scharakteryzowane przez badania punktowe opisane szczegółowo powyżej) wymieszano i odparowano do stanu suchego. Otrzymano M = 1,5 g czystego oleju. (Wydajność: 80%).

1- chloro-5-bromo-2-pentanon przygotowano z chlorku 4-bromobutyrylowego dokładnie w taki sam sposób jak opisano dla 1-chloro-4-bromo-2-pentanonu z tym wyjątkiem, że chlorek 4-bromobutyrylu zastosowano zamiast chlorku 3-bromo-propionylu. Otrzymano 1,6 g przezroczystego oleju. Wydajność: 80%.

P r z y k ł a d VI

Przygotowanie i wyizolowanie soli (Q₅) TFA 3'-deamino-3'-(3-pirylidono-1-il)-doksorubicyny.

Sól DOX HCl, 50 mg (86 μmol), rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 241 mg (1,3 mmol) 15-krotnego nadmiaru 1-chloro-4-bromo-2-butanonu, po czym dodano 45 μl (260 μmol) 3-krotnego nadmiaru DIPEA. Po 16 godzinach rozpuszczalniki usunięto w Speed Vac, a pozostałość rozpuszczono w 3 ml 0,1% wodnego roztworu TFA i ekstrahowano za pomocą 3 ml heksanu w celu usunięcia nadmiaru związku chlorowca. Tak otrzymany surowy materiał doprowadzono do systemu HPLC. Po oczyszczeniu otrzymano 20,6 mg produktu końcowego o czystości 98%. (Wydajność: 33%).

P r z y k ł a d VII

Przygotowanie i wyizolowanie soli (Q₇) TFA 3'-deamino-3'-(3-piperydono-1-il)-doksyrubicyny

Sól DOK HCl, 50 mg (86 μmol), rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 260 mg (1,3 mmol) 15-krotnego nadmiaru 1-chloro-5-bromo-2-pentanonu, po czym dodano 45 μl (260 μmol) 3-krotnego nadmiaru DIPEA. Po 16 godzinach rozpuszczalniki usunięto za pomocą Speed Vac, a pozostałość rozpuszczono w 3 ml 0,1% wodnego roztworu TFA i ekstrahowano za pomocą 3 ml heksanu w celu usunięcia nadmiaru związku chlorowca. Tak otrzymany surowy materiał doprowadzono do HPLC. Po oczyszczeniu otrzymano 18 mg końcowego produktu o czystości 95%. (Wydajność: 28%).

P r z y k ł a d VIII

Przygotowanie i wyizolowanie 4-jodobutyraldehydu i 5-jodowaleraldehydu

2- (3-chloropropylo)-1,3-dwuoksolanu (etylenowy acetal 4-chloro-n-butyraldehydu), 1,3 ml (10 mmol), (Fluka) rozpuszczono w 200 ml acetonu zawierającego 30 g (200 mmol, 20-krotny nadmiar) Nal. Roztwór ten wykraplano przez 24 godziny, a następnie odparowano do stanu suchego. Użyto 100 ml eteru do ekstrahowania materiału organicznego z nieorganicznych stałych resztek. Ten eterowy roztwór następnie przemywano za pomocą 50 ml P2O, 50 ml 5% wodnego roztworu Na2S2O3 i 3 razy za pomocą 50 ml H2O. Eter usunięto in vacuo, a pozostały olej rozpuszczono w 3 ml 50% wodnego roztworu kwasu octowego. Po 1 h dodano 100 ml eteru do tego roztworu, a kwas octowy jak również glikol

PL 191 781 B1 etylenowy usunięto przez 3-krotne przepłukanie za pomocą 50 ml H2O. Główny produkt był eluowany przy Rf: 0,8 na TLC w czystym CHCl3. Badanie punktowe użyte dla funkcji aldehydu było takie samo jak opisane dla ketonów w przykładzie V. Następnie eter usunięto, a czarny olej podano na kolumnę (długość 15 cm, średnica 2,5 cm) załadowaną przez 15 g żelu krzemionkowego, Merck, gatunek 9385, numer sita 230-400, wielkość porów 60 A. Cieką fazą ruchomą był CHCl3. Frakcje zawierające żądany produkt końcowy (scharakteryzowany przez badania punktowe omówione szczegółowo powyżej) wymieszano i odparowano do stanu suchego. Otrzymano 1,6 g żółtego oleju. Wydajność: 80%.

Dokładnie w taki sam sposób otrzymano 5-jodowaleraldehyd, zaczynając od 2-(4-chlorobutylo)-1,3-dwuoksolanu (acetal etylenowy 5-chloro-n-waleraldehydu) (Fluka). Otrzymano 1,65 g żółtego oleju. (Wydajność 80%).

P r z y k ł a d IX

Przygotowanie i wyizolowanie soli (Q₆) TFA 3'-deamino-3'-(2-pirolino-1-il)-doksorubicyny

Sól DOK HCl, 50 mg (86 μmol), rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 515 mg (2,6 mmol) 30-krotnego nadmiaru 4-jodobutyraldehydu, a następnie dodano 45 μl (260 μmol, 3-krotny nadmiar) DIPEA. Po 1 godzinie dodano 100 μl lodowatego kwasu octowego do mieszaniny reakcyjnej, którą następnie kroplami dodano do 5 ml 0,1% TFA w 70% wodnym roztworze acetonitrylu (rozpuszczalnik ii systemu HPLC). Roztwór ten rozcieńczono za pomocą 2 ml 0,1% wodnego roztworu TFA, a następnie acetonitryl usunięto w Speed Vac. Otrzymany roztwór ekstrahowano heksanem w celu usunięcia nadmiaru związku chlorowca. Tak otrzymany materiał podano następnie na system HPLC. Po oczyszczeniu otrzymano 52 mg produktu końcowego o czystości 98%. (Wydajność: 85%).

P r z y k ł a d X

Przygotowanie i wyizolowanie soli (Q₈) TFA 3'-deamino-3'-(1,3-czterohydropirydyno-1-il)-doksorubicyny.

Sól DOX HCl, 50 mg (86 μmol), rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 552 mg (2,6 mmol) 30-krotnego nadmiaru 5-jodowaleraldehydu, po czym dodano 45 μl (260 μmol) 3-krotnego nadmiaru DIPEA. Po 1 godzinie 100 μl lodowatego kwasu octowego dodano do tej mieszaniny reakcyjnej, którą następnie dodawano kroplami do 5 ml 0,1% TFA w 70% wodnym roztworze acetonitrylu (rozpuszczalnik ii systemu HPLC). Roztwór ten rozcieńczono za pomocą 2 ml 0,1% wodnego roztworu TFA, po czym usunięto acetonitryl w Speed Vac. Uzyskany w wyniku roztwór ekstrahowano heksanem w celu usunięcia nadmiaru związku chlorowca. Tak otrzymany materiał doprowadzono następnie do systemu HPLC. Po oczyszczeniu otrzymano 46 mg końcowego produktu o czystości 98%. (Wydajność: 75%).

P r z y k ł a d XI

Przygotowanie i wyizolowanie cytotoksycznego agonistycznego analogu LH-RH zawierającego DOX.

([D-Lys⁶ (DOX¹⁴-O-glt] LH-RH, Q1¹⁴gL)

[D-Lys⁶]LH-RH, 60 mg (37,5 μmol), i 52 mg (czystość 64%, 37,5 μmol)N-Fmoc-DOX14-O-hemiglutarynianu, (patrz przykład I) rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano 22 mg (50 μmol) odczynnika BOP (Aldrich), 13,5 mg (100 μmol) HOBt jak również 52 μl (300 μmol) DIPEA. Po mieszaniu przez 1 h w temperaturze pokojowej reakcja jest zakończona. Rozpuszczalniki odparowano, a pozostały olej skrystalizowano za pomocą 3 ml octanu etylu, a następnie dwukrotnie przemyto 3 ml octanu etylu. 90 mg surowego materiału stałego rozpuszczono następnie w 3 ml DMF i dodano 300 μl piperydyny. Po 5 minutach reakcję wprowadzono do kąpieli lodowej i zakwaszono przez dodanie mieszaniny 300 μl TFA, 700 μl pirydyny i 2 ml DMF. Po odparowaniu rozpuszczalników pozostały olej doprowadzono do stanu stałego przez octan etylu. Tak otrzymane surowe ciało stałe rozpuszczono w 1 ml 70% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (i) i rozcieńczono za pomocą 3 ml 0,1% wodnego roztworu TFA (ii) oraz doprowadzono do semipreparatywnego systemu HPLC. Otrzymano 40 mg (14,8 μmol) produktu końcowego o czystości 98%. (Wydajność: 48%).

P r z y k ł a d XII

Przygotowanie cytotoksycznego agonistycznego analogu LH-RH zawierającego 2-pirolino-DOX ([D-Lys⁶(2-pirolino-DOX¹⁴-O-glt]LH-RH, Q6¹⁴gL)

Q₁ ¹⁴gL, 11,2 mg (5 μmol), (patrz przykład XI) rozpuszczono w 200 μl DMF i dodano 30 mg (150 μmol, nadmiar 30-krotny) 4-jodobutyraldehydu (przykład VIII), a następnie dodano 3 μl (17 μmol) DIPEA. Po 1 godzinie reakcja była zakończona (patrz przykład IX) i 10 μl lodowatego kwasu octowego dodano do mieszaniny reakcyjnej, którą następnie dodawano kroplami do 1 ml (0,1% TFA w 70% wodnym roztworze acetonitrylu. Roztwór ten następnie rozcieńczono przez 1 ml 0,1% wodnego roztworu TFA i usunięto in vacuo acetonitryl. Pozostały roztwór wodny ekstrahowano następnie przez 1 ml heksanu

PL 191 781 B1 i doprowadzono do systemu HPLC. Otrzymano m: 7,6 mg końcowego produktu o czystości 99%. (Wydajność: 66%).

P r z y k ł a d XIII

Przygotowanie i wyizolowanie cytotoksycznego analogu somatostatyny zawierającego DOX (DOX^u-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, Qi¹⁴gS)

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(Fmoc)-Val-Cys-Thr-NH₂, 20 mg (14,5 Limol) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, s. 1986-1990) i 20 mg (czystość 64%, 14,5 μmol) N-Fmoc-DOX14-O-hemiglutarynianu (przykład I) rozpuszczono w 200 μl DMF i dodano 8,8 mg (20 μmol) odczynnika BOP (Aldrich), 5,4 mg (40 μ-lol) HOBt jak również 17 μl (100 μmol) DIPEA. Po mieszaniu przez 1 h przy temperaturze pokojowej reakcja była zakończona. Po usunięciu rozpuszczalników in vacuo pozostałość skrystalizowano za pomocą octanu etylu. Ten materiał stały rozpuszczono następnie w 1 ml DMF i dodano 100 μl piperydyny. Po 7 minutach reakcję umieszczono w kąpieli lodowej i zakwaszono przez dodanie mieszaniny 100 μl TFA, 300 μl pirydyny i 2 ml DMF. Po odparowaniu rozpuszczalników pozostały olej przeprowadzono w stan stały przez octan etylowy. Tak otrzymane surowe ciało stałe rozpuszczono w 1 ml 70% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (i) i rozcieńczono za pomocą 3 ml 0,1% wodnego roztworu TFA (ii) i doprowadzono do semipreparatywnego systemu HPLC. Otrzymano 9,7 mg (5,1 μmol) produktu końcowego o czystości 95%. (Wydajność: 35%).

P r z y k ł a d XIV

Przygotowanie cytotoksycznego analogu somatostatyny zawierającego 2-pirolino-DOX (2-pirolino-D0X¹⁴-0-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr NH₂,Q₆ ¹⁴gS)

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ (6, 4 rag, 5 pmol) rozpuszczono w 100 μl DMF i doda-no 2-pirolino-DOX¹⁴-O-hemiglutarynian (4,1 mg, 5 μmol), a następnie odczynnik BOP (4,4 mg, 10 μmol) HOBt (100 μmol) i DIPEA (50 μmol). Po mieszaniu przez 2 h przy temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną zakwaszono przez 20 μl AcOH i rozcieńczono przez 500 μl 70% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA, a następnie rozcieńczono przez 700 μl 0,1% wodnego roztworu TFA i doprowadzono do systemu HPLC. Otrzymano 3,9 mg (wydajność: 40%) produktu końcowego o czystości 99%.

2-pirolino-DOX¹⁴-O-hemiglutarynian przygotowano przez reakcję DOX14-O-hemiglutarynianu z 4-jodobutyraldehydu, jak opisano w przykładzie IX.

DOX¹⁴-O-hemiglutarynian przygotowano z N-Fmoc-DOX¹⁴-O-hemiglutarynianu przez rozszczepienie grupy ochronnej Fmoc, jak opisano w przykładzie XI. (Wydajność: 40%).

P r z y k ł a d XV

Przygotowanie i wyizolowanie cytotoksycznego antagonisty bombezyny zawierającego DOX. (DOX¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH2-NH) Leu-NH2, Q1¹⁴gB)

Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂, 20 mg (15,8 μmol) (Int. J. Peptide Protein Res. 38, 1991, s. 593-600) i 22 mg (64% czystości, 15,8 μmol) N-Fmoc-DOX14-O-hemiglutarynianu (przykład I) rozpuszczono w 200 μl DMF i dodano 8,8 mg (20 μmol) odczynnika BOP (Aldrich), 5,4 mg (40 μmol) HOBt jak również 17 μl (100 μmol) DIPEA. Po mieszaniu przez 1 h w temperaturze pokojowej reakcja była zakończona. Po usunięciu rozpuszczalników in vacuo pozostałość wykrystalizowano octanem etylu. Ten materiał stały rozpuszczono następnie w 1 ml DMF i dodano 100 μl piperydyny. Po 5 minutach reakcję umieszczono w kąpieli lodowej i zakwaszono przez dodanie mieszaniny 100 μl TFA, 300 μl pirydyny i 2 ml DMF. Po odparowaniu rozpuszczalników pozostały olej przeprowadzono w stan stały przez octan etylu. Tak otrzymane surowe ciało stałe rozpuszczono w 1 ml 70% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (i) i rozcieńczono za pomocą 3 ml 0,1% wodnego roztworu TFA

PL 191 781 B1 (ii) oraz doprowadzono do semipreparatywnego systemu HPLC. Otrzymano 13,5 mg (7,1 μmol) produktu końcowego o czystości 98%. (Wydajność: 45%).

P r z y k ł a d XVI

Przygotowanie i wyizolowanie cytotoksycznego antagonistycznego analogu bombezyny zawierającego 2-pirolino-DOX

2-pirolino-DOX¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2-NH)Leu-NH2, Q6¹⁴gB

Q₁ ¹⁴gB, 9,5 mg (5 μmol), (przykład XV) rozpuszczono w 200 μmol DMF i dodano 30 mg (150 μmol, 30-krotny nadmiar) 4-jodobutyraldehydu (przykład VIII), a następnie dodano 3 μ! (17 μmol) DIPEA. Po 1 h reakcja była zakończona (przykład IX) i 10 μ! lodowatego kwasu octowego dodano do tej mieszaniny reakcyjnej, którą następnie dodawano kroplami do 1 ml 0,1% TFA w 70% wodnym roztworze acetonitrylu. Roztwór ten następnie rozcieńczono za pomocą 1 ml 0,1% wodnego roztworu TFA i usunięto acetonitryl in vacuo. Pozostały roztwór wodny ekstrahowano następnie za pomocą 1 ml heksanu i doprowadzono do systemu HPLC. Otrzymano 6 mg produktu końcowego o czystości 98%. (Wydajność: 60%).

Oznaczanie aktywności cytotoksycznej in vitro

Linię komórek raka sutka myszy niezależnej od estrogenu MXT dostarczył dr Gunter Berndhardt, Uniwersytet w Regensburg, RFN. Wszystkie inne linie komórek użytych do oznaczania antyproliferacyjnej aktywności związków według niniejszego wynalazku otrzymane były z American Type Culture Collection (ATCC).

W celu oceny aktywności analogów zastosowano kolorymetryczne badanie cytotoksyczności w płytkach mikromiareczkowych oparte na kwantyfikacji biomasy przez barwienie komórek fioletem metylowym, który koreluje każde zagłębienie z oznaczeniem liczb komórek. (Reile i in.: Anal. Biochem. 187, 262-267, 1990; Bernhardt G. i in., J. Cancer Res. Clin. Oncol. (1992), 118, 35-43; Spruss Th. i in. J. Cancer Res. Clin. Oncol 117, 435-443, 1991; Gillies, R. J., Anal. Biochem. 159, 109-113, 1986; Kueng, W. i in.: Anal. Biochem., 182 16-19, 1989).

Protokół badań

1-2 dni po umieszczeniu komórek w płytkach z 96 dołkami medium hodowlane wymienia się na świeże medium zawierające związki, które mają być testowane i świeże medium tylko dla kultur kontrolnych. Po zmianie czasu inkubacji komórki są unieruchamiane dwualdehydem glutarynowym i przechowywane pod bydlęcą surowicą płodową (FBS) przy 4°C aż do końca eksperymentu. Komórki są barwione fioletem metylowym, a związane zabarwienie jest ekstrahowane za pomocą 70% wodnego roztworu EtOH. Gęstość optyczna mierzona jest za pomocą czytnika EIA Reader (Bio-Tek Instruments) lub Biomek 1000 (Beckman) odpowiednio przy 590 nm lub 600 nm. Każdy punkt danych reprezentuje wartość średnią z ośmiu dołków hodowlanych. Wartości T/C są obliczone jako T/C=(T-CO)-/(C-CO), gdzie T = gęstość optyczna potraktowanych kultur, C = gęstość optyczna kultur hodowlanych (bez potraktowania), CO = gęstość optyczna kultur na początku inkubacji (t=0).

P r z y k ł a d XVII

Aktywność cytotoksyczna in vitro pochodnych DOX modyfikowanych daunosaminą.

Tabela 17-1 przedstawia wpływ doksorubicyny i jej pochodnych zmodyfikowanych daunosaminą na linię komórek raka sutka u ludzi MCF-7 in vitro.

Rodniki cytotoksyczne ze swym azotem daunosaminy zawartym w pięcioczłonowym pierścieniu z funkcją reakcyjną są 5-50 razy bardziej aktywne niż ich homologowy odpowiednik z sześcioczłonowym pierścieniem, jak np. 3-pirolidono-DOX(Q5) i 3-piperydono-DOX(Q7) jak również 2-pirolino-DOX(Q6) i 1,3-czterohydropirydyno-DOX(Q8).

T a b e l a 17-1:

Wpływ doksorubicyny i jej pochodnych modyfikowanych daunosaminą na linię komórek raka sutka u ludzi MCF-7 in vitro

Związek	Czas inkubacji (h)	Wartość T/C przy (M)
		3x10-10	10-9	3x10-9	10-8	3x10-8	10-7
1	2	3	4	5	6	7	8
Doksorubicyna (DOX)	70 120				98 95	82 66	54 33
Pirolidyno-DOX (Q2)	70 120				97 94	25 17	-26 -19

PL 191 781 B1

c.d. tabeli 17-1

1	2	3	4	5	6	7	8
Piperydyno-DOX(AN-	70			114	70	4
183)	120			109	67	0
Izolindolidyno-DOX (Q3)	70				118	86	-11
	120				108	77	-29
3-pirolino-DOX (Q4)	70			106	72	-3
	120			97	65	-5
3-pirlidono-DOX (Qs)	70			87	30	-28
	120			67	25	-10
3-piperydono-DOX (Qz)	70			96	80	59
	120			97	70	43
2-pirolino-DOX (Q6)	70	50	-3	-18
	120	26	2	-9
1,3-czterohydropirydyno-	70	96	88	69
-DOX (Qg)	120	99	93	62

Komórki były inkubowane w mediach IMEM zawierających 5% HI-DCC-FBS (uaktywniana ciepłem, powleczoną dekstranem, potraktowaną węglem drzewnym surowicę z płodów bydlęcych) na płytkach z 96 dołkami. Względną liczbę komórek w płytkach potraktowanych i kontrolnych określono metodą barwienia fioletem metylowym i wyrażano jako wartości T/C, gdzie T/C=(T-C0/C-C0)x100[T=absorbancja kultur potraktowanych, C = absorbancja kultur kontrolnych, C0 = absorbancja kultur na początku inkubacji (t=0). Zmierzona absorbancja jest proporcjonalna do liczby komórek].

Mniejsze wartości T/C oznaczają zmniejszenie przeżycia komórek rakowych spowodowane leczeniem. 75 oznacza zatem 75% przeżywania komórek w porównaniu ze 100% dla przypadku kontrolnego lub 25% zahamowania.

P r z y k ł a d XVIII

Pełne utrzymanie aktywności cytotoksycznej in vitro DOX w agonistycznym produkcie sprzęże14 nia peptydu LH-RH Q1¹⁴gL i superaktywnej 2-pirolino-DOX(Q6) w produkcie sprzężenia agonistyczne14 go peptydu LH-RH Q5¹⁴gL.

Tabela 18-1 przedstawia wpływ doksorubicyny i jej pochodnej modyfikowanej daunosaminą, 2-pirolinodoksorubicyny (Q6) w porównaniu z ich produktami sprzężenia z agonistycznym analogiem LH-RH [D-Lys⁶] LH-RH (Q1¹⁴gL i odpowiednio Q6¹⁴gL) na hodowlę linii komórek ludzkiego raka sutka MCF-7 oraz linii komórek raka sutka myszy niezależnych od estrogenu MXT in vitro.

T a b e l a 18-1

Związek	Czas inkubacji (h)	Wartość T/C na	inii komórek MCF-7 przy stężeniu (M)
3x10-11	10'10	3x10-10	10'9	3x10-9	10'8	3x10-8	10'7
Doksorubicyna*	70						98	82	54
	120						95	66	33
Q114gL	70						111	89	63
	120						78	55	28
Q6	70		50		-3	-18
	120		26		-2	-9
Q614gL	70		74		28	-24
	120		60		16	-14

PL 191 781 B1

c.d. tabeli 18-1

Związek	Czas inkubacji (h)	Wartość T/C na linii komórek MXT przy stężeniu (M)
3x10-11	10-10	3x10-10	10-9	3x10-9	10-8	3x10-8	10-7
Doksorubicyna	26						85	90	59
	50						74	60	43
Q114gL	26						87	91	73
	50						71	59	50
Qe	28	90	78	56
Qe14gL	69	52	6	-13
	28	91	78	64
	69	59	15	-11

Komórki MCF-7 były inkubowane w mediach IMEM zawierających 5% HI-DCC-FBS na płytkach 96-dołkowych. Komórki MXT były inkubowane w mediach RPMI 1640 zawierających 0,6 g/l L-glutaminy i 10% FBS.

*Określone jak w tabeli 17-1.

P r z y k ł a d XIX

Tabela 19-1 demonstruje, że aktywność cytotoksyczna in vitro analogów somatostatyny zawierających DOX według wynalazku jest w pełni zachowana.

T a b e l a 19-1:

Wpływ cytotoksycznych analogów somatostatyny zawierających doksorubicynę na hodowlę linii komórek raka trzustki u ludzi MIIA PaCa-2 in vitro

Związek	Czas inkubacji (h)	Wartość T/C przy stężeniu (M)
108	10-7	10-6
DOX14-O-glt-	28	93	95	32
S-98*(Q114gS98)	76	103	11	-3
Analog noś nika	28	-	-	96
S-98*	76	-	-	98
DOX14-O-glt-	28	93	82	35
S-121**(Q114gS121)	76	97	10	-4
Analog noś nika	28	-	-	76
S-121**	76	-	-	96
Doksorubicyna	28	95	64	-28
	76	71	10	-7

Komórki były inkubowane w mediach RPIM 1640 zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej na płytkach 96-dołkowych.

*D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

I I “D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

P r z y k ł a d XX

Wpływ cytotoksycznych analogów antagonistów bombezyny zawierających doksorubicynę na hodowlę komórek ludzkiego raka trzustki CFPAC-1 in vitro

PL 191 781 B1

Tabela 20-1 demonstruje, że aktywność cytotoksyczna in vitro antagonistycznych analogów bombezyny zawierających DOX według wynalazku jest w pełni zachowana

T a b e l a 20-1

Związek	Czas inkubacji (h)	Wartość T/C przy stężeniu (M)
3 x 10'8	10'7	3 x 10'7	10'6
DOX14-O-glt	66	95	81	44	9
B-94	95	95	57	28	4
(Q114gB)	137	94	28	19	0
B-94*	66	99	106	104	100
	95	97	99	99	96
	137	98	98	100	96
DOX14-O-glt-B-50	66	102	78	39	5
	95	97	55	24	-1
	137	92	28	19	-2
B-50**	66	100	93	99	93
	95	98	100	102	98
	137	97	98	99	98
DOX	66	88	52	15	-7
	95	73	32	10	-6
	137	49	20	7	-4

Komórki były inkubowane w mediach IMDM zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej na płytkach 24-dołkowych.

*Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-y(CH2-N)-Leu-NH2 **D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-y(CH2-N)-Tac-NH2

Zachowane właściwości wiązania pochodnych hormonów

P r z y k ł a d XXI

Aktywności hormonalne i możliwości wiązania receptorów cytotoksycznych agonistycznych wobec LH-RH analogów Q1¹⁴gL([D-Lys⁶]LH-RH przenoszących DOX) oraz Q6¹⁴gl([D-Lys⁶]LH-RH przenoszących 2-pirolino-DOX) w porównaniu z peptydem nośnikowym, [D-Lys⁶]LH-RH

T a b e l a 21-1

Związek	Aktywność hormonalna* (reakcja LH w stosunku do LH-RH=1)	Wartość IC50** dla szczurzych receptorów przysadkowych (nM)	Wartość IC50** dla receptorów raka piersi (nM)
qAl	15	2,29	7,24
Q614gL	10	5,59	6,70
[D-Lys6] LH-RH	8	2,26	1,80

W tabeli 21-1 *LH reaguje na analogi, tam gdzie to określono, w przechłodzonym systemie zdyspergowanych szczurzych komórek przysadkowych, jak opisano w pracy S. Vigh i A. V. Schally, Peptides 5, 241-247 (1984). **Powinowactwa wiązania analogów z receptorami LH-RH przysadki szczurzej i receptorami ludzkiego raka piersi określano w konkurencyjnych eksperymentach wiązania przy zastosowaniu znakowanego [1251] [D-Trp6]LH-RH w charakterze radioligandu, jak opisano w pracy B. Szoke i in., Peptides, 15(2), 359-366 (1994). Powinowactwa wiązania wyrażano przez wartości IC50, stężenie nie znakowanego analogu wymagane do wykazania 50% specyficznego wiązania radioligandu.

P r z y k ł a d XXII

Analogi somatostatyny wykazują wydzielanie hormonu wzrostu (GH) z perfundowanej przysadki szczurzej, jak te opisano w pracy Carlson i in.. Thyrotropin-releasing hormone stimulation and somatostatin inhibition of growth hormone secretion from perfused rat adenohypophyses Endocrinology, 94, 1709- (1974). Sposób ten użyty został do porównania cytotoksycznych analogów somatostatyny według przedmiotowego wynalazku z ich macierzystymi cząsteczkami nośnikowymi pod względem swych aktywności hormonalnych.

Hamowanie uwalniania ludzkiego hormonu wzrostu i powodowanego przez uwalnianie hormonu (hGH-RH(1-29)NH2) uwalniania hormonu wzrostu z przechłodzonych komórek szczurzej przysadki przez analogi somatostatyny S-98-I

PL 191 781 B1

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂ i S-121

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

98-1 14 w porównaniu z ich cytotoksyczną pochodną Q₁ ¹⁴gS^98-1(DOX¹⁴-O-glt-S-98-I) i odpowiednio Q₁ ¹⁴gS¹²¹ (DOX¹⁴-O-glt-S-121).

W przechłodzonym systemie szczurzej przysadki analogi somatostatyny były podawane na 3 minuty w dawce 1 nM równocześ nie z 1 nM hGH-RH(1-29)NH2. Infuzję analogów somatostatyny utrzymywano przez następne 6 minut. GH reaguje na 3-minutowe podawanie 1 nM hGH-RH(1-29)NH2, gdzie określono podczas perfuzji analogów somatostatyny (0 min) i 30, 60 oraz 90 min. po wstrzymaniu podawania. Dane przedstawiono w tabeli 22-1.

T a b e l a 22-1

Analogi somatostatyny	Uwalnianie GH** powodowane przez 3-minutowe podawanie 1 nM hGH-RH (1-29) NH2 w różnych czasach po infuzji analogów somatostatyny
0 min	30 min	60 min	90 min
S-98-I	2,9	94,7	117,6	-
14 98 Q1 gS	0	90	89,7	-
S-121	7,8	62,2	57,3	77,9
14 121 Q1 gS	8,8	58,5	54,3	67,7

**Wyrażone jako procent uwalniania GH powodowanego przez 3-minutową infuzję 1nM hGH-RH(1-29)NH2 przed podawaniem analogów somatostatyny.

P r z y k ł a d XXIII

Badania wiązania receptorów z cytotoksycznymi antagonistami bombezyny Radiojodowanie [Tyr⁴]BN (Sigma) przy użyciu zestawu radiojodowania Bio-Rad Enzymobead i wyizolowanie monojodowanego [¹²⁵I-Tyr⁴]BN przeprowadzano jak opisano wcześniej (1). Wią zanie znakowanego [Tyr⁴]BN i wypieranie przez cytotoksyczny antagonistyczny analog bombezyny, Q6¹⁴gB przeprowadzono przy użyciu zlewających się komórek Swiss 3T3 (otrzymanych z American Type Culture Collection) w płytkach 24-dołkowych w modyfikacji (2) metody Krisa i in. (3). Trzy do pięciu dni po zaszczepieniu zrastające się komórki były dwukrotnie przemywane zrównoważonym roztworem solnym Hanksa (HBSS) i inkubowane przez 30 minut przy 37°C z 50 pM [¹²⁵I-Tyr⁴]BN przy braku lub w obecności kilku 14 stężeń nieoznakowanych czynników konkurencyjnych (Q6 gB lub BN) w całkowitej objętości 0,5 ml buforu wiążącego (DMEM z 50 mM HEPES, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5 mM MgCl₂ i 100 μg/ml bacytracyny, pH: 7,4). Niespecyficzne wiązanie stwierdzono w obecności 1 μM nieoznakowanego ligandu. Po trzech płukaniach lodowato zimnym HBSS zawierającym 0,1% BSA (pH: 7,4) komórki rozłączono za pomocą 0,05% trypsyny/roztwór 0,53 mM EDTA i przeniesiono do probówek. Radioaktywność mierzono za pomocą licznika promieniowania gamma (Micromedic Systems Inc. Huntsville, AL). Dane wiązania oceniano stosując opracowane przez McPhersona (4) programy analizy wiązania radioligandu. Wartości Kj przedstawione w tabeli 23-1 obliczono zgodnie z wzorem Chenga i Prusoffa (5).

1. Halmos i in., Cancer Letters, 85, 111-118 (1994)

2. Cai i in., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 12664-12668, (1994)

3. Kris i in., J. Biol. Chem. 262: 11215-11220, (1987)

4. McPherson, G.A., J. Pharmaco Methods, 14: 213-228, (1985)

5. Cheng i Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, (1973)

T a b e l a 23-1

Charakteryzacja specyficznego wiązania cytotoksycznego antagonisty bombezyny

Q6¹⁴gB (2-pirolino-DOX¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-^(CH2-N) Leu-NH₂ z receptorami bombezyny na linii komórek Swiss 3T3 w porównaniu z bombezyną

Związek	Kj (nM)
Bombezyna	1,2
Q114gB	1,0

PL 191 781 B1

Porównawcza skuteczność i toksyczność hormonalnych produktów sprzężenia w porównaniu z samym rodnikiem cytotoksycznym

P r z y k ł a d XXIV

Leczenie za pomocą 2-pirolino-DOX(Q6), cytotoksycznego agonistycznego analogu LH-RH Q6¹⁴gL([D-Lys⁶]LH-RH połączony z Q6¹⁴-O-hemiglutarynianem) i (DOX) estrogenowo niezależnych mysich raków sutka MXT (KS-49)

W celu porównania powstrzymującego rozwój nowotworu działania cytotoksycznej pochodnej doksorubicyny, Q6 i jej nakierowanego cytotoksycznego peptydowego produktu sprzężenia, Q6¹⁴gL jak również znanego czynnika antyneoplastycznego, DOX i aby określić optymalny sposób podawania oraz dawki nietoksyczne wycinki (1 mm³) raka jajnika MXT (3.2) pozytywnego wobec receptorów LH-RH wszczepiono podskórnie samicom myszy B6D2F1. Jeden dzień po przeszczepie myszy losowo podzielono na grupy po pięć zwierząt i rozpoczęto leczenie. Związki rozpuszczano w 0,1% kwasie trójfluorooctowym (pH 2) i podawano śródotrzewnie. Grupy, harmonogramy leczenia i dawki jak również średnie czasy przeżywania przedstawiono w tabeli 24-1. Wyniki zestawiono w tabeli 24-2 i na fig. 1.

Tabela 24-2 przedstawia wynik leczenia za pomocą Q6 i cytotoksycznego analogu LH-RH Q6¹⁴gL na objętościach nowotworu i przeżywanie myszy z estrogenowo niezależnymi rakami piersi. Jak przedstawiono w tabeli 24-2, 1,25 nmola Q6 podawane dnia 1,2,7,8,14 i 15 (grupa 2) powodowało silną toksyczność charakteryzującą się średnim przeżywaniem 17,4 dnia, co jest znacznie krótsze niż przeżywalność nie leczonej grupy kontrolnej. W porównaniu, ta sama dawka Q6¹⁴gL (grupa 6) powodowała średnie przeżywanie 30,8 dnia, które jest znacznie dłuższe niż przeżywalność nie leczonej grupy kontrolnej. Większa skuteczność Q6¹⁴gL w porównaniu z Q6 może być również przedstawiona przez porównanie średnich końcowych objętości nowotworu w grupie 2 (1065 mm³ 16 dnia) i w grupie 6 (863 mm³ 31 dnia).

Podobne wnioski można przedstawić przez porównanie Q6 i Q6¹⁴gL w różnym harmonogramie leczenia, gdzie 0,5 nmola leków podawano przez pięć dni w tygodniu w ciągu trzech kolejnych tygodni.

Doksorubicyna w dawce toksycznej (całkowita ilość: 1560 nmol, przeciętny czas przeżycia: 20 dni) nie może zniszczyć nowotworu, podczas gdy leczenie za pomocą Q6¹⁴gL w nietoksycznej dawce (całkowita ilość: 7 nmoli, przeciętny czas przeżycia: > 31 dni) powodowało przeżycie 2 z 5 zwierząt bez rozwoju nowotworu.

T a b e l a 24-1

Nr grupy	Podawanie	Dawka /ini (nmol)	Dawka /ini (mg)	Ini./tydzień	Dni pomiędzy iniekcjami	Tygodnie podawa- nia	Całkowita ilość zapisana	Przeciętny czas przeżycia* dni
1	kontrola							22
2	Q6	1,25	0,92	2	5			17,5
3		0,5	0,37				7,5	19,6
4		0,25*	0,19	5	2		9,5	14,6
5		0,2	0,15			3	21	13,0
6	Q614gL	1,25	2,9	2	5		30,8
7		0,5	1,16				7,5	26,8
8		0,25*	0,58	5	2		9.5	18,4
9		0,2	0,46				21	13,6
10		3,5	8,12			2	7	>31
11		4	9,28	1	6		8
12		5	11,6		10	13,4
13	DOX	520	340			3	1560	20,0

* Od 9 dnia do 12 dnia dawkę zwię kszono do 2,5 nmola Od 9 dnia do 12 dnia dawka była zwię kszona do 5,0 nmola * Przeż ycie

PL 191 781 B1

T a b e l a 24-2

Nr	Grupa	Sposób podawania	Końcowa objętość nowotwo- ru (mm3)	Dzień pomiaru	Przeciętne oprzeżywanie (dni)	Liczba przeżywających myszy bez nowotworu od 5 myszy w grupie
Dawka/ ini. (nmol)	Liczba iniekcji na tydzień	Przerwa pomię- dzy iniekcjami (dni)	Czas trwania leczenia (tygodnie)	Całkowita ilość wstrzyknięta (nmol)	dnia 18	dnia 31
1	kontrola						7322	21	22,0±1,6	0	0
2	Q6	1,25	2	5	3	7,5	1065	16	17,4±0,2	0	0
6	Q614gL	1,25	2	5	3	7,5	863	31	30,8±0,4**	2	0
3	Q*	0,5	5	2	3	7,5	2531	18	19,6±0,7	0	0
7	Q614gL	0,5	5	2	3	7,5	3978	31	26,8±2.6**	1	0
10	Q614gL	3,5	1	6	2	7	669	31	>31**	4	2
12	Q614gL	5,0	1	6	2	10	0	10	13,4	0	0
13	DOX	520	1	6	3	1560	1560	28	20	1	0

**Przeżywanie jest znacznie dłuższe (p<0,01)

Przeżywanie jest znacznie krótsze (p<0,01) lub (p<0,05) w porównaniu z danymi kontrolnymi przy zastosowaniu testu Duncana.

P r z y k ł a d XXV

Wyniki pojedynczego potraktowania za pomocą (DOX), cytotoksycznych analogów LH-RH T-107 i Q1¹⁴gL na estrogenowo niezależnych rakach sutka myszy MXT (KS-55)

Związki testowe:

Q1¹⁴gL: doksorubicyno¹⁴-O-hemiglutarynian połączony z [D-Lys⁶]LH-RH

T-107: N-glutarylo-doksorubicyna połączona z [D-Lys⁶]LH-RH Proc Natl. Acad. Sci. wol. 89, s. 972-976 (1992); oraz

DOX

Badania przeprowadzano w następujący sposób:

W celu określenia maksymalnych tolerowanych dawek i porównania wyników wycinki (1 mm³) nowotworu jajnika MXT (3.2) wszczepiano podskórnie samicom myszy B6D2F1. Jeden dzień po przeszczepie myszy losowo podzielono na grupy po pięć zwierząt i potraktowano je pojedynczym zastrzykiem dootrzewnym. Grupy te i dawki podano w tabeli 25-1. Tabela ta podaje również liczby myszy, które miały nowotwory, kiedy zmierzono objętość i przeciętne czasy przeżycia dla tych grup. Zmiany objętości nowotworów przedstawione są na fig. 2. Związki były rozpuszczone w 0,1% TFA (pH: 2,0). Objętość nowotworu była mierzona w dniach 10, 13, 17 i 20.

Jak pokazano w tabeli 25-1 i na fig. 2, T-107, ([D-Lys⁶]LH-RH w połączeniu z N-glutarylo-DOX) jest całkowicie nieskuteczny, jeśli chodzi o hamowanie wzrostu tego nowotworu przy dawce 850 nmol/20 g myszy. Natomiast Q1¹⁴gL,([D-Lys⁶]LH-RH w połączeniu z 14-O-glutarylo-DOX) powodował silne tłumienie wzrostu nowotworu (rysunek) przy nietoksycznej dawce 650 nmol/20 g myszy. Sama DOX była silnie toksyczna (przeciętny czas przeżywania: 13,6 dnia) przy pojedynczej dawce 650 nmol/20 g myszy i znacznie mniej skuteczna niż Q1¹⁴gL (rys. 2).

PL 191 781 B1

T a b e l a 25

Nr	Grupa	Dawka	Liczba myszy z nowotworem/liczba przeżywających myszy	Przeciętne przeżywanie
nmol/ 20 g	mg/20 g	mmol/kg	Dzień 10	Dzień 13	Dzień 17	Dzień 20	Dni
1	Kontrola				5/5	5/5	5/5	5/5	21,2±0,3
2	Q114gL	680	1520	34	1/4	2/4	2/4	3/4	28,6±693 5,3±25**
3	Q114gL	710	1587	35,5	2/4	3/4	3/4	3/4	26,0±663 2,0±34*
4	Q114gL	760	1698	38	3/5	4/5	4/5	(zabite)	(zabite)
5	DOX	650	427	32,5	3/3	2/2	1/1	1/1	13,6±25
6	DOX	700	460	35	2/3	2/3	2/2		15,2±24
7	DOX	750	493	37,5	1/1				7,8±1,3
8	T- 107	750	1676	37,5	5/5	5/5	5/5	4/4	21,8±05
9	T- 107	850	1900	44,4	5/5	5/5	5/5	4/4	21,6±07

* Przeż ywanie jest znacznie krótsze (p<0,01) niż dla grupy kontrolnej ** Przeżywanie jest znacznie dłuższe (p<0,01) lub *(p<0,05) w porównaniu z grupą kontrolną (jedna mysz, która zdechła przypadkowo drugiego dnia, została wykluczona z tych dwóch grup).

P r z y k ł a d XXVI

Wpływ cytotoksycznych analogów LH-RH na niezależne estrogenowo raki sutka myszy MXT (KS-47)

Substancje użyte do leczenia

We wcześniejszym eksperymencie Q2 w dziennej dawce 20 nmol przez 17 dni miał jedynie umiarkowany wpływ hamujący na wzrost nowotworu, a był toksyczny w dawce 40 nmol (średnie przeżywanie wynosiło 14,6 dnia). Dzienna dawka 30 nmol została wybrana dla obecnego eksperymentu, który porównywał skuteczność i toksyczność Q2¹⁴gL (Q2 sprzężony z [D-Lys⁶]LH-RH), Q2 (pirolidynodoksyrubicyna), [D-Lys⁶]LH-RH i [D-Lys⁶] LH-RH + Q2.

Wycinki (1 mm³) nowotworu jajnika MXT (3,2) przeszczepiono samicom myszy B6D2F1. Leczenie rozpoczęto jeden dzień po przeszczepieniu i kontynuowano przez 12 dni przez zastrzyki dootrzewne raz dziennie. Wszystkie grupy otrzymały równomolowe ilości związków, jak podano w tabeli 26-1. Nowotwory zmierzono w dniach 10, 14 i 18 i obliczono objętość nowotworów. Dane przedstawiono w tabeli 26-1 i na fig. 3.

Leczenie z dawką dzienną 30 nmol zmodyfikowanego daunosaminą analogu doksorubicyny Q2 (pirolidyno-DOX) spowodowało silny wpływ zatrzymujący na wzrost nowotworu (objętość nowotworu: 144 mm³ 14-go dnia w porównaniu z 1391 mm³ w grupie kontrolnej), ale spowodowało silną toksyczność zabijającą wszystkie zwierzęta przed końcem eksperymentu (średnie przeżycie 17,9 dnia). Podobnie Q2 połączony (mieszanina) z [D-Lys⁶] LH-RH spowodował silny wpływ hamujący nowotwór (objętość nowotworu: 80 mm³ 14 dnia), ale przeciętne przeżycie (18,5 dnia) było znacznie krótsze niż w nie leczonej grupie kontrolnej (23,1 dnia). W wyniku leczenia za pomocą Q2¹⁴gL (Q2 kowalentnie połączony z [D-Lys⁶] LH-RH) dwa zwierzęta zdechły, jedno 16 dnia, a drugie 26 dnia. Z ośmiu zwierząt, które przeżyły, tylko u jednego rozwinęły się nowotwory przy ostatnim pomiarze 18 dnia, a wszystkie zwierzęta wyglądały zdrowo, ale później u wszystkich z nich zaczęły rozwijać się nowotwory. Średnie przeżywanie w tej grupie było znacznie dłuższe (28,3 dnia niż w grupie kontrolnej). Leczenie tylko [D-Lys⁶] LH-RH nie miało wpływu na rozwój nowotworu.

Eksperyment ten wykazuje, że większa skuteczność i mniejsza toksyczność obwodowa Q2¹⁴gL w stosunku do cytotoksycznego rodnika Q2 mogą być przypisane kowalencyjnemu sprzężeniu cytotoksycznego rodnika z nakierowanym nośnikowym analogiem LH-RH.

PL 191 781 B1

T a b e l a 26-1

Wpływ cytotoksycznych analogów LH-RH na rozwój estrogenowo niezależnych raków sutka myszy MXT i przeż ywanie myszy z nowotworami.

Nr	Leczenie	Dawka	Liczba myszy	Średnia obj w mm	ętość nowotworu po dniach	Średnie przeżywanie po przeszczepie (dni)
		(mg/dzień)
				10		14	18
1	Kontrola		15	253		1391	4794	23,1
2	Q214gL	68,7	10	33		16	23	28,3*
3	Q2	21,3	10	153		144	137	17,9
4	[D-Lys6]LH-RH	48,0	10	165		1348	4003	23,5
5	[D-Lys6]LH-RH+Q2	48,0+21,3	10	121		80	27	18,5

Wszystkie dawki dzienne były równomolowymi ilościami 30 nmol. Znacznie krócej niż w grupie kontrolnej (p<0,05) *Znacznie dłużej niż w grupie kontrolnej (p<0,01) przy teście Duncana

P r z y k ł a d XXVII

Wpływ 2-pirolino-DOX (Q6) i cytotoksycznego agonistycznego analogu LH-RH Q6¹⁴gL([D-Lys⁶]-LH-RH połączony z Q6¹⁴-O-hemiglutarynianem) na rozwój androgenowo zależnych raków prostaty szczurów Dunning R-3327-H

Samce szczurów Copenhagen z hormonalnie zależnymi rakami prostaty Dunning R-3327-H le14 czono za pomocą Q6¹⁴gL, nowego cytotoksycznego analogu hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (LH-RH) zawierającym agonistyczny [D-Lys⁶]LH-RH połączony z 2-pirolino-doksyrubicyną. W pierwszym eksperymencie 2-pirolinodoksyrubicyna była podawana w stężeniu 50 nmol/kg jako jedyny lek (Q6) i jako niesprzężona mieszanina z [D-Lys⁶]LH-RH albo w sprzężeniu z nośnikiem [D-Lys⁶] LH-RH (Q6¹⁴gL). Po drugim podaniu 50 nmol/kg rodnika Q6 samego lub zmieszanego z [D-Lys⁶]LH-RH wszystkie szczury zdechły z oznakami ogólnego zatrucia, podczas gdy wszystkie zwierzęta potrakto14 wane cytotoksycznym produktem sprzężenia LH-RH Q6¹⁴gL przeżyły. Po 5 tygodniach leczenia cał14 3 kowitą dawką 150 nmol/kg Q6¹⁴gL nastąpił regres nowotworów od pierwotnej objętości 8,35±1,7 cm³ na początku eksperymentu do 4,47±0,8 cm³, podczas gdy nowotwory w grupie kontrolnej nadal rozwi3 14 jały się i mierzyły 17,84+2,2 cm³. Terapia za pomocą Q6¹⁴gL również znacznie zmniejszyła ciężar nowotworów i obciążenie nowotworów. W drugim eksperymencie przeznaczonym do porównania sku14 teczności i toksyczności Q6 oraz Q6¹⁴gL reżimy terapeutyczne złożone były z trzech podawań nmol/kg Q6 lub 25 nmol/kg i 50 nmol/kg Q6¹⁴gL. Kiedy leczenie rozpoczęto, objętość nowotworów we wszystkich grupach była w zakresie 3,9-4,5 cm³. Po 5 tygodniach leczenia w przypadku nowotwo14 3 rów u szczurów leczonych 50 nmol/kg Q6¹⁴gL nastąpił regres do 2,3±0,51 cm³, natomiast dawka 25 nmol/kg Q6 była jeszcze toksyczna i mogła jedynie spowodować zmniejszenie końcowej objętości nowotworu do 6,76±1,4 cm³, podobnie jak otrzymano w przypadku dawki 25 nmol/kg Q6¹⁴gL (6,74±1 cm³) ₃ w porównaniu z 15,6+2,2 cm³ w przypadku zwierząt nie leczonych. Histologiczna ocena próbek wyka14 zała znaczny spadek komórek mitotycznych tylko w grupach leczonych Q6¹⁴gL. Receptory LH-RH o dużej zdolności wiązania zostały wykryte w błonach nie leczonych próbek nowotworów Dunninga, ale po leczeniu Q6¹⁴gL nie można było stwierdzić żadnych miejsc wiązania dla LH-RH. Zahamowanie rozwoju nowotworu przez AN-201 i Q6,¹⁴gL było również związane ze znacznym spadkiem zdolności wiązania receptorów EGF. Jak to przedstawiono na fig. 4-6 nakierowany cytotoksyczny analog LH-RH

Q6¹⁴gL jest skutecznym czynnikiem przeciwnowotworowym powodującym regresję raków prostaty u szczurów Dunning R-3327-H. Badania nasze wykazują również, że cytotoksyczny analog LH-RH

Q6¹⁴gL jest znacznie mniej toksyczny niż zawarty antyneoplastyczny rodnik (Q6) i znacznie bardziej aktywny w powstrzymywaniu rozwoju nowotworu.

Legendy do rysunków dotyczących przykładu 27:

Figura 4. Doświadczenie I: objętość nowotworu u samców szczurów Copenhagen z przeszczepami szczurzego raka prostaty Dunning R-3327-H podczas leczenia polegającego na trzech podaniach 50 nmol/kg agonistycznego [D-Lys⁶]LH-RH i 50 nmol/kg cytotoksycznego analogu LH-RH Q6¹⁴gL. Linie pionowe oznaczają SEM.*p<0,05; **p<0,01 w porównaniu z grupą kontrolną przy nowym wielozakresowym teście Duncana. Leczenie zaznaczone strzałkami stosowano w dniach 1, 8 i 29.

t Zwierzęta leczone za pomocą Q₆ jako jedynego leku lub niesprzężoną mieszaniną z [D-Lys⁶] LH-RH zdechły w drugim tygodniu. W tych dwóch grupach przedstawiono objętość nowotworów zarejestrowaną ósmego dnia.

PL 191 781 B1

Figura 5. Eksperyment II: Wpływ leczenia za pomocą 25 nmol/kg 2-pirolinodoksyrubicyną (Q6), 25 nmol/kg i 50 nmol/kg cytotoksycznego analogu LH-RH Q6¹⁴gL na objętość nowotworu u szczurów z rakiem prostaty Dunning R-3327-H. Linie pionowe oznaczają SEM *p<0,05; **p<0,01 w porównaniu z grupą kontrolną . Leczenie zaznaczone strzałkami zastosowano trzy razy, to znaczy w dniach 1, 8 i 29.

Figura 6. Eksperyment II. Wpływ leczenia za pomocą 25 nmol/kg 2-pirolinodoksyrubicyną (Q6) 25 nmol/kg i 50 nmol/kg cytotoksycznego analogu LH-RH Q6¹⁴gL na ciężar ciała szczurów Copenhagen z rakiem prostaty Dunning R-3327-H. Linie pionowe oznaczają SEM. *p<0,05; **p<0,01 w porównaniu z grupą kontrolną. Leczenie zaznaczone strzałkami przeprowadzono 3-krotnie, to znaczy w dniach 1, 8 i 29.

P r z y k ł a d XXVIII

Porównawcze badanie wpływu doksorubicyny (DOK) i nakierowanego cytotoksycznego agonistycznego analogu LH-RH Q6¹⁴gL([D-Lys⁶]LH-RH połączony z DOX¹⁴-O-hemiglutarynianem) na rozwój ludzkiego raka jajnika OV-1063 u nagich myszy.

Linia komórek ludzkiego nabłonkowego raka jajnika OV-1063 pochodziła z przerzutowego brodawkowego gruczolakoraka torbielowatego jajnika 57-letniej kobiety (Horowitz i in. (1985) Oncology 42, 332-337). Dziesięć milionów komórek OV-1063 wstrzyknięto podskórnie trzem gołym myszom w celu spowodowania rozwoju nowotworów. Wycinki 1 mm³ tych nowotworów przeszczepiono sześćdziesięciu zwierzętom do badań powstrzymywania rozwoju in vivo. Celem eksperymentu było wykazanie, że w wyniku obecności receptorów dla LH-RH na OV-1063 cytotoksyczny produkt sprzężenia LH-RH był bardziej skuteczny i mniej toksyczny niż DOK, cytotoksyczny rodnik zawarty w nim. Oddziaływania cytotoksycznego produktu sprzężenia LH-RH porównano z wpływami DOX, mieszaniny DOK z cząsteczkami nośnika, samego nośnika i z nie leczonymi grupami kontrolnymi. Wszystkie iniekcje były dokonywane dootrzewnie. Związki te były rozpuszczone w 0,9% roztworze wodnym chlorku sodowego.

Myszy z przeciętnej wielkości nowotworami około 15 mm³ podzielono na sześć grup po dziewięć zwierząt i leczono je następująco siedem dni po przeszczepieniu nowotworu: grupa 1, roztwór soli; grupa 2, Q1¹⁴gL w dawce 700 nmol/20 g zwierzęcia; grupa 3, Q1¹⁴gL w dawce 413 nmol/20 g zwierzęcia (maksymalna tolerowana dawka, MTD dla DOK); grupa 4, DOK 413 nmol/20 g zwierzęcia (MTD); grupa 5, mieszanina 700 nmol/20 g DOK i 700 nmol/20 g [D-Lys⁶]LH-RH; grupa 6, agonistyczny analog nośnika [D-Lys⁶]LH-RH w dawce 700 nmol/20 g zwierzęcia.

Analiza receptorów OV-1063 wykazała obecność mających wysokie powinowactwo miejsc wiązania dla LH-RH.

Wyniki: jak pokazano na fig. 7, silne zahamowanie rozwoju nowotworu osiągnięto przez leczenie Q1¹⁴gL w dawce 413 nmol/20 g (grupa 3). Zwierzęta nie wykazywały oznak silnej toksyczności. Dla porównania, leczenie za pomocą DOK podawanej w tej samej dawce 413 nmol/20 g (12 mg/kg, MTD, grupa 4) nie spowodowało znacznego wstrzymania rozwoju nowotworu u trzech zwierząt, które przeżyły do końca eksperymentu. Trzy zwierzęta zdechły piątego dnia, a sześć zwierząt zdechło dziewiątego dnia na skutek toksyczności. Przy większej dawce (700 nmol/20 g, grupa 2) Q1¹⁴gL wykazywał bardzo silne hamowanie rozwoju nowotworu (fig. 7). Dwa spośród dziewięciu zwierząt zdechły na skutek toksyczności, a jedno zwierzę zdechło przypadkowo. Sześć zwierząt, które przeżyły, miały przy końcu eksperymentu stratę wagi około 20%. W grupie 6 tę samą dużą dawkę (700 nmol/20 g) DOK zmieszano z 700 nmol [D-Lys⁶] LH-RH. Piątego dnia wszystkie zwierzęta w tej grupie zdechły w wyniku silnej toksyczności.

Wnioski: wyniki wyraźnie wykazują, że na skutek obecności receptorów dla LH-RH na komórkach nabłonkowego raka jajnika OV-1063 nakierowany cytotoksyczny produkt sprzężenia LH-RH Q1¹⁴gL wykazuje mniejszą toksyczność i większą aktywność przeciwnowotworową niż doksorubicyna (Q1), rodnik cytotoksyczny zawarty w tym związku.

Claims (37)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Związek antracyklinowy o wzorze:

   Q¹⁴-O-R-P (I) gdzie Q¹⁴ oznacza podstawione w pozycji 14 ugrupowanie Q o ogólnym wzorze gdzie - R- oznacza -C(O)-(CH2)n -C (O)-, a n=O-7,

   R' jest wybrane z grupy zawierającej NH₂, aromatyczny lub uwodorniony 5 lub 6 członowy związek heterocykliczny posiadający co najmniej jeden azot w pierścieniu i taki związek heterocykliczny, który posiada ugrupowanie butadienowe związane z sąsiednimi atomami węgla wymienionego pierścienia z utworzeniem układu dwucyklicznego, a

   P oznacza ugrupowanie peptydowe, korzystnie analogu LHRH, somatostatyny lub bombezyny.
2. 2. Związek, według zastrz. 1, w którym R' jest wybrany z grupy złożonej z NH2, pirolidyno-1-ilu, izoindolino-2-ilu, 3-pirolino-1-ilu, 3-pirolidono-1-ilu, 2-pirolino-1-ilu, 3-piperydono-1-ilu, 1,3-czterohydropirydyno-1-ilu, a P oznacza P1, P2 i P3, gdzie P1 jest wybrane z grupy złożonej z analogu LH-RH o wzorze

   Aaa-Bbb-Ccc-Ser-Tyr-D-Lys(Xxx)-Leu-Arg-Pro-Ddd gdzie (Xxx) jest wodorem, A2Bu lub A2Pr, przy czym Aaa jest Glp, wtedy Bbb jest His Ccc jest Trp, a Ddd jest Gly-NH2, a jeśli Aaa jest AcD-Nal(2), wtedy Bbb jest D-Phe(4Cl), Ccc jest D-Pal(3), D-Trp i Ddd jest D-Ala-NH2, a kiedy Aaa-Bbb-Ccc jest Ac, wówczas Ddd jest -NH-CH2-CH3, przy czym grupa Q¹⁴-O-R tworzy wiązanie karboksyamidowe z wolną grupą aminową ugrupowania D-Lys lub z co najmniej jedną z wolnych grup aminowych w A2Bu lub A2Pr, kiedy występują w (Xxx) ,

   P2 jest analogiem somatostatyny o wzorze i 1

   Aaa-Cys-Bbb-D-Trp’Lys-Ccc-Cys-Ddd-NH₂ przy czym kiedy Aaa jest D-Phe, wtedy Bbb jest Tyr, Ccc jest Val, a Ddd jest Thr lub Trp, kiedy Aaa jest D-Trp, wówczas Bbb jest Phe, Ccc i Ddd są Thr, przy czym grupa Q¹⁴-O-R- tworzy wiązanie karboksyamidowe z końcową grupą aminową ugrupowania Aaa,

   P3 jest antagonistycznym analogiem bombezyny o wzorze gdzie Aaa oznacza nic, D-Tpi lub D-Phe, Bbb oznacza (CH2-NH)Leu, (CH2-NH)Phe lub (CH2NH)Trp albo ;CH2-N)Tac przy czym grupa Q¹⁴-O-R- tworzy wiązanie karboksyamidowe z końcową grupą aminową ugrupowania Aaa, gdzie ono występuje lub ugrupowania Gln, jeżeli go nie ma.
3. 3. Związek, według zastrz. 2, gdzie n=3.
4. 4. Związek, według zastrz. 3, gdzie R' oznacza NH2.

   PL 191 781 B1
5. 5. Związek, według zastrz. 3, gdzie R' oznacza 2-pirolino-1-il.
6. 6. Związek, według zastrz. 4, gdzie P oznacza P1.
7. 7. Związek, według zastrz. 5, gdzie P oznacza P1.
8. 8. Związek, według zastrz. 4, gdzie P oznacza P2.
9. 9. Związek, według zastrz. 5, gdzie P oznacza P2.
10. 10. Związek, według zastrz. 4, gdzie P oznacza P3.
11. 11. Związek, według zastrz. 5, gdzie P oznacza P3.
12. 12. Związek, według zastrz. 1 o wzorze gdzie Q1¹⁴ jest doksorubicyno-14-ilem.
13. 13. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Q₆’⁴-O-glt)-Arg-Leu-Pro-Gly-NH₂ gdzie Q₆ ¹⁴ jest 3'-deamino-3'-(2-pirolino-1-il)-doksorubicyno-14-ilem.
14. 14. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Q,'⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂ gdzie Q1¹⁴ jest doksorubicyno-14-ilem.
15. 15. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    I “Ί

    Q6¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂;

    gdzie Q₆ ¹⁴ jest 3'-deamino-3'-(2-pirolino-1-il)-doksorubicyno-14-ilem.
16. 16. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Γ |

    Qi¹⁴-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂;

    gdzie Q1⁴ jest doksorubicyno-14-ilem.
17. 17. Związek według zastrz. 1 o wzorze r~ ί

    Q₆ ¹⁴-O-glt-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH₂ gdzie Q₆ ¹⁴ jest 3'-deamino-3'- (2-pirolino-1-il) -doksorubicyno-14-ilem.
18. 18. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Q₁ ¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂ gdzie Q1¹⁴ jest doksorubicyno-14-ilem.
19. 19. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Qs¹⁴-O-glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂ gdzie Q6¹⁴ jest 3 '-deamino-3 '- (2-pirolino-1-il) -doksorubicyno-14-ilem.
20. 20. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Q₁ ¹⁴-O-glt-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH₂-NH)Leu-NH₂ gdzie Q₁ ¹⁴ jest doksorubicyno-14-ilem.

    PL 191 781 B1
21. 21. Związek według zastrz. 1 o wzorze gdzie Q₆ jest 3'-deamino-3'-(2-pirolino-1-il)-doksorubicyno-14-ilem.
22. 22. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Qi¹⁴-O-glt-D-Tpi-Gln Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂ gdzie Q1¹⁴ jest doksorubicyno-14-ilem.
23. 23. Związek według zastrz. 1 o wzorze

    Q₆ ¹⁴_O-q|t-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu (CH₂-NH)Leu-NH₂ gdzie Q₆ ¹⁴ jest 3'-deamino-3-(2-pirolino-1-il)-doksorubi-cyno-14-ilem.
24. 24. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca składnik aktywny oraz jego farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako składnik aktywny zawiera związek określony w zastrz. 1.
25. 25. Zastosowanie związków określonych w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia raka u ssaka.
26. 26. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 12 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla LH-RH, łącznie z rakami sutka, jajników, śluzówki macicy, prostaty, trzustki i okrężnicy.
27. 27. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 13 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla LH-RH, łącznie z rakami sutka, jajników, śluzówki macicy, prostaty, trzustki i okrężnicy.
28. 28. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 14 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, posiadających receptory dla takich analogów somatostatyny, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi, rakami komórek nerkowych, kostniakomięsakami i nowotworami mózgu.
29. 29. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 15 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, posiadających receptory dla takich analogów somatostatyny, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi, rakami komórek nerkowych, kostniakomięsakami i nowotworami mózgu.
30. 30. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 16 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, posiadających receptory dla takich analogów somatostatyny, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi, rakami komórek nerkowych, kostniakomięsakami i nowotworami mózgu.
31. 31. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 17 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, posiadających receptory dla takich analogów somatostatyny, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi, rakami komórek nerkowych, kostniakomięsakami i nowotworami mózgu.
32. 32. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 18 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, posiadających receptory dla takich analogów somatostatyny, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi, rakami komórek nerkowych, kostniakomięsakami i nowotworami mózgu.
33. 33. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 19 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, posiadających receptory dla takich analogów somatostatyny, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, okrężnicy i odbytnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi, rakami komórek nerkowych, kostniakomięsakami i nowotworami mózgu.
34. 34. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 20 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla GRP i peptydy bombezynopodobne, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, odbytnicy i okrężnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi oraz nowotworami mózgu.
35. 35. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 21 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla GRP i peptydy bombezynopodobne, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, odbytnicy i okrężnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi oraz nowotworami mózgu.

    PL 191 781 B1
36. 36. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 22 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla GRP i peptydy bombezynopodobne, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, odbytnicy i okrężnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi oraz nowotworami mózgu.
37. 37. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 23 do wytwarzania leku do leczenia różnych nowotworów ludzkich, które mają receptory dla GRP i peptydy bombezynopodobne, łącznie z rakami sutka, jelita, trzustki, odbytnicy i okrężnicy, prostaty, nowotworami płuc małokomórkowymi i nie małokomórkowymi oraz nowotworami mózgu.

    Rysunki

    Zmiany objętości estrogenowo niezależnych raków sutka myszy ΜΧΤ w KS-29 (Cyfry kursywą podaje przeżywające’ myszy w czasie pomiaru)

    Dni od przeszczepu

    8000

    7000 6000 1000 —·— Kontrola —a— Q₆ 6 x 1.25 nmol/20g —Δ- - Q₆ 15 x 0.5 nmol/20g —V— Q₆ ¹⁴gL 6 x 1.25 nmol/20g ; ··♦·· Q6¹⁴gL 15 x 0.5 nmol/20g !; —e Q6¹⁴gL 2 x3.5 nmol/20g ji —O·· Q₆ ¹⁴gL 2 x 5.0 nmol/20g j' —€3— DOX 520 nmol/20g H