[go: up one dir, main page]

RS61620B1 - Konjugovana antitela prema ly75 za lečenje kancera - Google Patents

Konjugovana antitela prema ly75 za lečenje kancera

Info

Publication number
RS61620B1
RS61620B1 RS20210352A RSP20210352A RS61620B1 RS 61620 B1 RS61620 B1 RS 61620B1 RS 20210352 A RS20210352 A RS 20210352A RS P20210352 A RSP20210352 A RS P20210352A RS 61620 B1 RS61620 B1 RS 61620B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
cancer
cell
antigen
Prior art date
Application number
RS20210352A
Other languages
English (en)
Inventor
Jonathan Alexander Terrett
James Edward Ackroyd
Original Assignee
Oxford Bio Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxford Bio Therapeutics Ltd filed Critical Oxford Bio Therapeutics Ltd
Publication of RS61620B1 publication Critical patent/RS61620B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
UVOD
[0001] Predmetna objava se generalno odnosi na oblasti imunologije i molekularne biologije. Specifičnije, ovde su obezbeđena antitela i drugi terapijski proteini usmereni prema LY75, nukleinske kiseline koje kodiraju takva antitela i terapijske proteine, postupci za pripremu monoklonalnih antitela i drugih terapijskih proteina, i postupci za lečenje bolesti, kao što su kanceri posredovani LY75 ekspresijom/aktivnošću i/ili povezani sa abnormalnom ekspresijom/aktivnošću njegovih liganada.
POZADINA
[0002] Limfocitni antigen 75 deluje kao endocitotski receptor za usmeravanje zarobljenih antigena iz vanćelijskog prostora u specijalizovani kompartment za obradu antigena i smatra se da uzrokuje smanjenje proliferacije B-limfocita. Ekspresija limfocitnog antigena 75 uočena je kod kancera pankreasa, jajnika, dojke, kolorektalnog, jednjaka, kože, štitne žlezde i pluća (nesitnoćelijski) kao i kod multipla mijeloma i mnogih različitih podtipova limfoma i leukemija.
[0003] WO2009/061996 objavljuje izolovana monoklonalna antitela koja se vezuju za humani DEC-205 (LY75) i srodne kompozicije i molekule zasnovane na antitelima. Takođe su objavljene farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela, kao i terapijski i dijagnostički postupci za upotrebu antitela.
[0004] WO2008/104806 objavljuje afinitetne reagense koji su sposobni za vezivanje za LY75 za upotrebu u lečenju ili profilaksi kancera.
[0005] WO96/23882 objavljuje identifikaciju i karakterizaciju DEC-205. Dodatno objavljuje postupke za identifikovanje liganada za DEC-205 koji mogu ciljano delovati na ćelije koje eksprimiraju antigen.
[0006] Giridhar, P.V. et al (2011) Clin Exp Metastasis 28:887-897, objavljuje da je blokiranje LY75 antitelom smanjilo adherentnost tumorskih ćelija koje prekomerno eksprimiraju IL6Rα na matrikse in vitro i na omentum. Dodatno sugeriše da bi blokiranje LY75 moglo biti dragocena klinička strategija za smanjenje ranih metastaza kancera jajnika.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0007] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela usmerena prema LY75, nukleinske kiseline koje kodiraju takva antitela, ćelije domaćina koje sadrže takve nukleinske kiseline koje kodiraju antitela iz pronalaska, postupke za pripremu anti-LY75, i postupke za lečenje bolesti, kao što su poremećaji posredovani LY75, npr. humani kanceri, uključujući kancer pankreasa, kancer jajnika, kancer dojke, kolorektalni kancer, kancer jednjaka, kancer kože, kancer štitne žlezde, kancer pluća, kancer glave i vrata, kancer bešike, kancer želuca, leukemiju, multipla mijelom i limfom.
[0008] Objava opisuje antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koje: (a) vezuje epitop na LY75 koji prepoznaje antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 2, ili (b) je u kompeticiji za vezivanje za LY75 sa antitelom koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 1, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 2.
[0009] U jednom primeru, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo vezuje se za humani LY75 i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži 1, 2 ili 3 CDR odabrana iz grupe koja se sastoji od CDR koji sadrže SEQ ID NO: 5, 6, i 7, i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži 1, 2 ili 3 CDR odabrana iz grupe koja se sastoji od CDR koji sadrže SEQ ID NO: 8, 9 i 10.
[0010] U poželjnim primerima izvođenja navedena antitela su izolovana antitela.
[0011] Antitela iz pronalaska se vezuju za LY75 (SEQ ID NO: 15) i internalizuje ih ćelija koja eksprimira LY75, izazivajući odgovor ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) u prisustvu efektorskih ćelija ili izazivajući citotoksični T-ćelijski odgovor u prisustvu efektorskih ćelija.
[0012] U jednom aspektu, antitelo sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) teškog i/ili lakog lanca ili varijabilne regione (VR) određenog ovde opisanog antitela (npr. ovde se označava kao "LY75_A1"). U skladu sa tim, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca (VH) antitela LY75_A1 koji ima sekvencu pokazanu u SEQ ID NO: 1, i/ili CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca (VL) od LY75_A1 koji ima sekvencu pokazanu u SEQ ID NO: 2. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5; drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6; i treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7; i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8; drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9; i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10, pri čemu bilo koji jedan ili više od CDR nezavisno sadrže jednu ili dve amino-kiselinske supstitucije.
[0013] U sledećem primeru izvođenja, antitela iz pronalaska se vezuju za humani LY75 i uključuju varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1, i/ili konzervativne modifikacije njegove sekvence. Antitelo može dodatno da uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 2, i/ili konzervativne modifikacije njegove sekvence.
[0014] U dodatnom primeru izvođenja, antitela iz pronalaska se vezuju za humani LY75 i uključuju varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, koji uključuju amino-kiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i/ili 2, respektivno, i konzervativne modifikacije njihovih sekvenci.
[0015] Izolovana antitela koja uključuju varijabilne regione teškog i lakog lanca koji imaju najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 91%, ili najmanje 92%, ili najmanje 93%, ili najmanje 94 %, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99%, ili više identičnosti sekvence sa bilo kojom od gornjih sekvenci su takođe uključena u predmetni pronalazak. Opsezi između gore navedenih vrednosti, npr. varijabilni regioni teškog i lakog lanca koji imaju najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95% ili 95-100% identičnosti sekvence sa bilo kojom od gornjih sekvenci su takođe namenjeni da budu obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1 ili sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična SEQ ID NO: 1. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična SEQ ID NO: 2. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži region okvira teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična regionu okvira varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 1 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 16, 17, 18 i 19. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži region okvira lakog lanca koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična regionu okvira varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 2 kao što je pokazano u SEQ ID NO: 20, 21, 22 i 23.
[0016] Takođe su opisana antitela koja su u kompeticiji za vezivanje za LY75 sa antitelima iz pronalaska. U jednom primeru, antitelo je u kompeticiji za vezivanje za LY75 sa antitelom koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže amino-kiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2, repektivno, ili amino-kiselinske sekvence najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identične njima. U sledećem primeru, antitelo je u kompeticiji za vezivanje za LY75 sa antitelom koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže amino-kiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2 (LY75_A1).
[0017] Druga antitela iz opisa vezuju se za isti epitop ili epitop na LY75 prepoznat od strane ovde opisanih antitela. U sledećem primeru, antitelo se vezuje za epitop na LY75 prepoznat od strane antitela koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno, ili amino-kiselinske sekvence najmanje 80% identične njima. U sledećem primeru, antitelo se vezuje za epitop na LY75 prepoznat od strane antitela koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže amino-kiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2 (LY75_A1).
[0018] U dodatnom primeru, antitela iz pronalaska se specifično vezuju za jedan ili više, na primer, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, peptid(a) odabranih iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ili 37 ili njihove fragmente, pri čemu navedeni fragmenti sadrže najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 susednih amino-kiselina. U dodatnom primeru izvođenja, epitop prepoznat od strane antitela predmetnog pronalaska sadrži jedan ili više peptida, dva ili više ili tri ili više peptida odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 27, 29, 30, 34, 35, 36 ili 37 ili njihovih fragmenata pri čemu navedeni fragmenti sadrže najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 susednih amino-kiselina. U dodatnom primeru, epitop prepoznat od stane antitela predmetnog pronalaska sadrži jedan ili više peptida, na primer, dva ili tri peptida odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 30, 36 i 37 ili njihovih fragmenata pri čemu navedeni fragmenti sadrže najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 susednih amino-kiselina.
[0019] U dodatnom primeru, antitela sadrže varijabilne CDR u poređenju sa ovde opisanim roditeljskim antitelima. Stoga, pronalazak obezbeđuje varijante antitela koje sadrže varijante varijabilnih regiona roditeljskog antitela, pri čemu roditeljsko antitelo sadrži prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5, drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6, treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7, prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8, drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9 i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10, pri čemu varijanta antitela ima 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 amino-kiselinskih supstitucija zajedno u skupu prvog vhCDR, drugog vhCDR, trećeg vhCDR, prvog vlCDR, drugog vlCDR i trećeg vlCDR, sa od 1 do 4, 1 do 3 ili 1 do 2 supstitucije posebne upotrebe, i pri čemu antitelo zadržava specifično vezivanje za LY75.
[0020] Antitela iz pronalaska mogu biti pune dužine, na primer, bilo koji od sledećih izotipova: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, i IgE. Alternativno, antitela mogu biti fragmenti kao što je antigen-vezujući deo ili jednolančano antitelo (npr. Fab, F(ab')2, Fv, jednolančani Fv fragment, izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) ili kombinacija dva ili više izolovana CDR). Antitela mogu biti bilo koja vrsta antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, humana, humanizovana, i himerna antitela.
[0021] U drugim primerima izvođenja, antitela iz pronalaska su u obliku imunokonjugata (tj., dodatno uključuju kovalentno prikačen ostatak). U određenom primeru izvođenja, ostatak je lek, kao što je majtansinoid, dolastatin, auristatin, trihotecen, kaliheamicin, CC1065 ili njihovi derivati. U poželjnom primeru izvođenja, ostatak leka je DM1 ili DM4.
[0022] U drugim primerima izvođenja, antitela iz pronalaska dodatno obuhvataju bispecifični molekul i kao takva mogu izazvati odgovor ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) u prisustvu efektorskih ćelija, stoga ubijajući ćelije koje eksprimiraju LY75.
[0023] U drugim primerima izvođenja, antitela iz pronalaska dodatno obuhvataju bispecifični molekul i kao takva mogu izazvati citotoksični T-ćelijski odgovor u prisustvu efektorskih ćelija, stoga ubijajući ćelije koje eksprimiraju LY75.
[0024] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca antitela iz pronalaska. U jednom primeru izvođenja, obezbeđena je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira teški lanac antitela iz pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo. U sledećem primeru izvođenja obezbeđena je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira laki lanac antitela iz pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo. U dodatnom primeru izvođenja obezbeđena je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela iz pronalaska.
[0025] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonalno antitelo koje se vezuje za humani LY75, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca kodirane sekvencama nukleinske kiseline koje sadrže SEQ ID NO: 3 i 4, respektivno, ili sekvence nukleinske kiseline koje imaju najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa prethodno pomenutim sekvencama nukleinske kiseline ili sekvence koje se razlikuju od SEQ ID NO: 3 i 4 usled degeneracije genetičkog koda.
U sledećem aspektu predmetnog pronalaska obezbeđeni su ekspresioni vektori koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca antitela iz pronalaska koje su operativno povezane sa jednim ili više regulatornih elemenata.
[0026] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje ćelije domaćina koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca ili njihove antigen-vezujuće delove prethodnih antitela. Poželjno, pri čemu ćelija domaćin eksprimira navedene varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca ili njihove antigen-vezujuće delove kada se ćelija domaćin uzgaja pod uslovima pri čemu se eksprimira nukleinska(e) kiselina(e).
[0027] U poželjnom primeru izvođenja ćelija domaćin sadrži: (i) ekspresioni vektor u skladu sa predmetnim pronalaskom; ili (ii) prvi ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela iz pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo i drugi ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira laki lanac antitela iz pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo.
[0028] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđena je izrada antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koja sadrži kultivisanje ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom pod uslovima gde se antitelo ili njegov antigen-vezujući deo eksprimira i opciono izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela. Takođe je opisan postupak lečenja kancera koji sadrži primenu pacijentu kome je to potrebno antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela u skladu sa predmetnim pronalaskom pri čemu antitelo ili antigenvezujući deo internalizuje ćelija koja eksprimira LY75, navedeno antitelo ili antigen-vezujući deo sadrži kovalentno prikačen lek konjugat. Podrazumeva se da je antitelo ili njegov antigenvezujući deo iz pronalaska ono koje se vezuje za LY75 (SEQ ID NO: 15). U jednom primeru, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5; drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6; i treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8; drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9; i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10 i kovalentno prikačen lek konjugat.
[0029] Takođe je opisan obezbeđen postupak lečenja kancera, pri čemu se pacijentu kome je to potrebno primenjuje antitelo ili antitela ili njihov antigen-vezujući deo iz pronalaska i pri čemu takvo antitelo ili antitela ili njihov antigen-vezujući deo iz pronalaska izazivaju ADCC odgovor u prisustvu efektorskih ćelija. U jednom primeru, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5; drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6; i treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8; drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9; i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10.
[0030] U dodatnom primeru obezbeđen je postupak lečenja kancera, pri čemu se pacijentu kome je to potrebno primenjuje antitelo ili antitela ili njihov antigen-vezujući deo iz pronalaska i pri čemu takvo antitelo ili antitela ili njihov antigen-vezujući deo iz pronalaska izaziva citotoksični T-ćelijski odgovor u prisustvu efektorskih ćelija. U jednom primeru, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5; drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6; i treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8; drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9; i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10.
[0031] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđeno je jedno ili više antitela iz pronalaska za upotrebu u lečenju kancera.
[0032] Takođe je opisana upotreba jednog ili više antitela iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za lečenje kancera.
U nekim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera pankreasa, kancera bubrega, kancera jetre, kancera jajnika, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera jednjaka, kancera glave i vrata, kancera kože, kancera štitne žlezde, kancera bešike, kancera želuca, kancera pluća, leukemije, mijeloma, poželjno multipla mijeloma, i limfoma. Posebno poželjni kanceri uključuju ne-Hočkinov (non-Hodgkin’s) limfom, difuzni krupnoćelijski B limfom (DLBCL), B-ćelijski limfom, folikularni limfom, limfom mantle ćelija, limfom limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom (MALT), T-ćelijama/histiocitima bogat B-ćelijski limfom, Burkitov (Burkitt’s) limfom, limfoplazmocitni limfom, limfom malih limfocita, limfom marginalne zone, T-ćelijski limfom, periferni T-ćelijski limfom, anaplastični krupnoćelijski limfom i angioimunoblastni T-ćelijski limfom, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, kancer bešike, kancer pankreasa i trostruko negativni kancer dojke.
[0033] Takođe je opisan postupak otkrivanja, dijagnostikovanja i/ili pretrage za ili praćenja progresije kancera pri čemu se LY75 eksprimira u navedenom kanceru, ili praćenja efekta leka protiv kancera ili terapije usmerene na navedeni kancer, kod subjekta koji sadrži detekciju prisustva ili nivoa antitela sposobnih za imunospecifično vezivanje za LY75, ili jednog ili više njegovih fragmenata. Kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera pankreasa, kancera bubrega, kancera jetre, kancera jajnika, kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera jednjaka, kancera glave i vrata, kancera kože, kancera štitne žlezde, kancera bešike, kancera želuca, kancera pluća, leukemije, mijeloma, poželjno multipla mijeloma, i limfoma. Posebno poželjni kanceri uključuju ne-Hočkinov limfom, difuzni krupnoćelijski B limfom (DLBCL), B-ćelijski limfom, folikularni limfom, limfom mantle ćelija, limfom limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom (MALT), T-ćelijama/histiocitima bogat B-ćelijski limfom, Burkitov limfom, limfoplazmocitni limfom, limfom malih limfocita, limfom marginalne zone, T-ćelijski limfom, periferni T-ćelijski limfom, anaplastični krupnoćelijski limfom i angioimunoblastni T-ćelijski limfom, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, kancer bešike, kancer pankreasa i trostruko negativni kancer dojke.
[0034] Takođe su opisani kompleti koji sadrže kompozicije (npr. antitela) iz pronalaska i, opciono, uputstva za upotrebu. Komplet može dodatno sadržati najmanje jedan dodatni reagens ili jedno ili više dodatnih antitela iz pronalaska.
[0035] Druga svojstva i prednosti trenutnog pronalaska biće očigledni iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0036]
Slika 1 prikazuje poravnanje teškog lanca LY75_A1 (SEQ ID NO: 1), humanog VH 3-15 germinativne linije (SEQ ID NO: 11) i humanog JH4 germinativne linije (SEQ ID NO: 12). CDR regioni teškog lanca LY75_A1 su podvučeni.
Slika 2 prikazuje poravnanje lakog lanca LY75_A1 (SEQ ID NO: 2), humanog VK 012 germinativne linije (SEQ ID NO: 13) i humanog JK4 germinativne linije (SEQ ID NO: 14). CDR regioni lakog lanca LY75_A1 su podvučeni.
Slika 3a prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 monoklonalnih antitela konjugovanih sa DM1 u HT-29 i pokazuje da dok se većina antitela vezuje za LY75 samo nekoliko pokazuje efikasnost.
Slika 3b prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u HT-29.
Slika 3c prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u RAJI ćelijama.
Slika 3d prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u Namalwa ćelijama.
Slika 3e prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u Karpas 299 ćelijama.
Slika 3f prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u BxPC3 ćelijama.
Slika 3g prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u HupT4 ćelijama.
Slika 3h prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u HPAFFII ćelijama.
Slika 3i prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u EHEB ćelijama.
Slika 3j prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u Mec-1 ćelijama.
Slika 3k prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u AML-193 ćelijama.
Slika 3l prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u HCC 70 ćelijama.
Slika 3m prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u HCC 1806 ćelijama.
Slika 3n prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u MDA-MB-468 ćelijama.
Slika 3o prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u RT4 ćelijama.
Slika 3p prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u 5637 ćelijama.
Slika 3q prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u SW780 ćelijama.
Slika 3r prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u SCC-9 ćelijama.
Slika 3s prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u OE 19 ćelijama.
1
Slika 3t prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u OVCAR-3 ćelijama.
Slika 3u prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u SK-OV-3 ćelijama.
Slika 3v prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u MOLP-8 ćelijama.
Slika 3w prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u RPMI8226 ćelijama.
Slika 4a prikazuje efikasnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u Raji Burkitov limfom SCID mišjem ksenograft modelu.
Slika 4b prikazuje efikasnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u Namalwa Burkitov limfom SCID mišjem ksenograft modelu.
Slika 4c prikazuje efikasnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u HPAFII adenokarcinom pankreasa atimičnom bezdlakom mišjem ksenograft modelu. Slika 4d prikazuje efikasnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u SW780 humani karcinom bešike SCID mišjem ksenograft modelu.
Slika 4e prikazuje efikasnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u MDA-MB-468 atimičnom bezdlakom mišjem ksenograft modelu.
Slika 4f prikazuje efikasnost anti-LY75 antitela konjugovanih bilo sa DM1 ili DM4 u COLO205 kolorektalni adenokarcinom atimičnom bezdlakom mišjem ksenograft modelu.
Slika 5a pokazuje kompetitivno vezivanje anti-LY75-mAb i anti-LY75-mAb konjugovanog sa MCC-DM1.
Slika 5b pokazuje nekompetitivno vezivanje LY75_A1 i anti-LY75-mAb konjugovanog sa MCC-DM1.
Na slici 6a-6j pokazuje grafičke prikaze vezivanja antitela LY75_A1 za LY75 peptide na peptidnom genskom čipu.
Slika 7 pokazuje amino-kiselinsko poravnanje peptida vezanih antitelom LY75_A1 i u testu peptidnog genskog čipa i u testu svlačenja peptida. Istaknuti peptidi su oni koji će verovatno formirati epitop prepoznat od strane antitela LY75_A1.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0037] Predmetna objava se odnosi na izolovana antitela koja se vezuju za LY75 protein opisan u SEQ ID NO: 15, kao što je ovde istaknuto.
[0038] Pored toga, LY75 antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti bispecifični molekul i kao takva mogu izazvati odgovor ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) u prisustvu efektorskih ćelija, stoga ubijajući ćelije koje eksprimiraju LY75.
[0039] Pored toga, LY75 antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti bispecifični molekul i kao takva mogu izazvati citotoksični T-ćelijski odgovor u prisustvu efektorskih ćelija, stoga ubijajući ćelije koje eksprimiraju LY75.
Pored toga, LY75 antitela iz predmetnog pronalaska mogu se internalizovati kada se dovedu u kontakt sa ćelijama koje eksprimiraju LY75 receptor. Kao što je ovde razmatrano, LY75 receptor je prekomerno eksprimiran i/ili diferencijalno eksprimiran na određenim ćelijama kancera, uključujući ali ne ograničavajući se na, kancer bubrega, kancer jetre, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer kože, kancer štitne žlezde, kancer želuca, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer dojke, kancer jajnika, kancer bešike, leukemiju, poželjno akutnu mijeloidnu leukemiju ili hroničnu limfocitnu leukemiju, mijelom, poželjno multipla mijelom, limfom, poželjno DLBCL B-ćelijski limfom, folikularni limfom, limfom mantle ćelija, limfom limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom (MALT), T-ćelijama/histiocitima bogati B-ćelijski limfom, Burkitov limfom, limfoplazmocitni limfom, limfom malih limfocita, limfom marginalne zone, T-ćelijski limfoma, periferni T-ćelijski limfom, anaplastični krupnoćelijski limfom i angioimunoblastni T-ćelijski limfom, i kancer pluća.
[0040] Kao takva, kada su LY75 antitela iz predmetnog pronalaska konjugovana sa lekovima (ovde se ponekad označavaju kao "antitelo-lek konjugati" ili "ADC"), internalizacija ovih ADC molekula u ćelije kancera rezultira ćelijskom smrću i stoga lečenjem tumora.
[0041] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja poseduju posebna strukturna svojstva kao što su CDR regioni sa određenim amino-kiselinskim sekvencama. Ovde je opisan skup CDR koji mogu da formiraju afinitetni reagens, npr. antitelo, koje pokazuje vezivanje za LY75.
[0042] Stoga, objava obezbeđuje antitela, poželjno izolovana antitela (koja, kao što je navedeno ispod, uključuju širok spektar dobro poznatih struktura, derivata, mimetika i konjugata antitela), nukleinske kiseline koje kodiraju ova antitela, ćelije domaćina upotrebljene za izradu antitela, postupke izrade antitela, i farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela i opciono farmaceutski nosač, postupke lečenja i dijagnoze koji sadrže upotrebu antitela i upotrebu antitela za lečenje kancera.
LY75 proteini
[0043] Limfocitni antigen 75 deluje kao endocitotski receptor za usmeravanje zarobljenih antigena iz vanćelijskog prostora u specijalizovani kompartment za obradu antigena i smatra se da uzrokuje smanjenje proliferacije B-limfocita.
[0044] U skladu sa SWISS-PROT, limfocitni antigen 75 eksprimira se u limfocitima slezine, timusa, kolona i periferne krvi. Detektovan je u mijeloidnim i B limfoidnim ćelijskim linijama. Izoforme označene ovde kao OGTA076b i OGTA076c eksprimiraju se u malignim ćelijama Hočkinovog limfoma zvanim Hočkinove i Rid-Sternbergove (Reed-Sternberg) (HRS) ćelije. LY75 deluje kao endocitotski receptor za usmeravanje zarobljenih antigena iz vanćelijskog prostora u specijalizovani kompartment za obradu antigena. To uzrokuje smanjenu proliferaciju B-limfocita.
[0045] Ekspresija LY75 je uočena kod kancera pankreasa, bešike, jajnika, dojke (uključujući trostruko negativni), kolorektalnog, jednjaka, kože, štitne žlezde i pluća (nesitnoćelijski) kao i kod multipla mijeloma i mnogih različitih podtipova limfoma (uključujući DLBCL) i leukemija.
[0046] Antitelo iz pronalaska može, u određenim slučajevima, unakrsno reagovati sa LY75 od drugih vrsta koje nisu ljudi. Na primer, kako bi se olakšalo kliničko testiranje, antitela iz pronalaska mogu unakrsno reagovati sa LY75 molekulima murina ili primata. Alternativno, u određenim primerima izvođenja, antitela mogu biti potpuno specifična za humani LY75 i ne moraju pokazivati vrste ili druge tipove ne-humane unakrsne reaktivnosti.
Antitela
[0047] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-LY75 antitela, generalno terapijska i/ili dijagnostička antitela kao što je ovde opisano. Antitela koja pronalaze upotrebu u predmetnom pronalasku mogu poprimiti brojne formate kao što je ovde opisano, uključujući tradicionalna antitela kao i derivate, fragmente i mimetike antitela, opisane ispod. Pronalazak obezbeđuje strukture antitela koje sadrže skup od 6 CDR kao što je ovde definisano (uključujući mali broj amino-kiselinskih promena kao što je opisano ispod).
[0048] "Antitelo" kao što se ovde upotrebljava uključuje širok spektar struktura, što će ceniti oni u struci, koji u nekim primerima izvođenja sadrže najmanje skup od 6 CDR kao što je ovde definisano; uključujući, ali ne ograničavajući se na tradicionalna antitela (uključujući i
1
monoklonalna i poliklonalna antitela), humanizovana i/ili himerna antitela, fragmente antitela, projektovana antitela (npr. sa amino-kiselinskim modifikacijama kao što je navedeno ispod), multispecifična antitela (uključujući bispecifična antitela), i druge analoge poznate u struci.
[0049] Strukturne jedinice tradicionalnog antitela tipično sadrže tetramer. Svaki tetramer se tipično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan "laki" (koji tipično ima molekulsku težinu od oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (koji tipično ima molekulsku težinu od oko 50-70 kDa). Humani laki lanci su klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotipove antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko potklasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgM ima potklase, uključujući, ali ne ograničavajući se na, IgM1 i IgM2. Stoga, "izotip" kao što se ovde upotrebljava znači bilo koju od potklasa imunoglobulina definisanu hemijskim i antigenim karakteristikama njenih konstantnih regiona. Poznati izotipovi humanog imunoglobulina su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD, i IgE. Treba razumeti da terapijska antitela takođe mogu sadržati hibride bilo koje kombinacije izotipova i/ili potklasa.
[0050] U mnogim primerima izvođenja, IgG izotipovi se upotrebljavaju u predmetnom pronalasku, pri čemu IgG1 pronalazi posebnu upotrebu u velikom broju primena.
[0051] Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više amino-kiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. U varijabilnom regionu, sakupljene su tri petlje za svaki od V domena teškog lanca i lakog lanca kako bi se formiralo antigen-vezujuće mesto. Svaka od petlji se označava kao region koji određuje komplementarnost (u daljem tekstu označeno kao "CDR"), u kojoj je varijacija aminokiselinske sekvence najznačajnija. "Varijabilni" označava činjenicu da se određeni segmenti varijabilnog regiona uveliko razlikuju u sekvenci među antitelima. Varijabilnost unutar varijabilnog regiona nije ravnomerno raspoređena. Umesto toga, V regioni se sastoje od relativno nevarijantnih nizova nazvanih regioni okvira (FR) od 15-30 amino-kiselina odvojenih kraćim regionima ekstremne varijabilnosti nazvanih "hipervarijabilni regioni" koji su svaki 9-15 amino-kiselina dugački ili duži.
[0052] Svaki VH i VL se sastoji od tri hipervarijabilna regiona ("regioni koji određuju komplementarnost", "CDR") i četiri FR, aranžirana od amino-terminusa do karboksiterminusa u sledećem redosledu: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3 -FR4.
[0053] Hipervarijabilni region generalno obuhvata amino-kiselinske ostatke od oko aminokiselinskih ostataka 24-34 (LCDR1; "L" označava laki lanac), 50-56 (LCDR2) i 89-97 (LCDR3) u varijabilnom regionu lakog lanca i oko 31-35B (HCDR1; "H" označava teški lanac), 50-65 (HCDR2), i 95-102 (HCDR3) u varijabilnom regionu teškog lanca; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) i/ili one ostatke koji formiraju hipervarijabilnu petlju (npr. ostaci 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) i 91-96 (LCDR3) u varijabilnom regionu lakog lanca i 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) i 96-101 (HCDR3) u varijabilnom regionu teškog lanca; Chothia i Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. Specifični CDR iz pronalaska su opisani ispod.
[0054] U celoj predmetnoj specifikaciji, Kabat sistem numeracije se generalno upotrebljava kada se poziva na ostatak u varijabilnom domenu (približno, ostaci 1-107 varijabilnog regiona lakog lanca i ostaci 1-113 varijabilnog regiona teškog lanca) (npr. Kabat et al., supra (1991)).
[0055] CDR doprinose formiranju antigen-vezujućeg, ili specifičnije, epitop vezujućeg mesta antitela. Termin "epitop" ili "antigena determinanta" označava mesto na antigenu za koje se imunoglobulin ili antitelo specifično vezuje. Epitopi se mogu formirati i od susednih aminokiselina ili od nesusednih amino-kiselina koje se blisko pozicioniraju tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi formirani od susednih amino-kiselina se tipično zadržavaju pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem tipično gube tretiranjem denaturišućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 amino-kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Kao što je ovde opisano, postupci za određivanje koji se epitopi vezuju za dato antitelo (tj., mapiranje epitopa) su dobro poznati u struci i uključuju, na primer, testove imunoblotovanja i imunoprecipitacije, pri čemu se preklapajući ili susedni peptidi iz LY75 testiraju na reaktivnost sa datim anti-LY75 antitelom. Postupci određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju tehnike u struci i one opisane ovde, na primer, rendgensku kristalografiju i dvodimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu (videti, na primer, Epitope Mapping Protocols u Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)). Termin "mapiranje epitopa" označava postupak identifikacije molekularnih determinanti za antiteloantigen prepoznavanje.
[0056] Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Kabat et al. su prikupili brojne primarne sekvence varijabilnih regiona teških lanaca i lakih lanaca. Na osnovu stepena konzervacije sekvenci, klasifikovali su pojedinačne primarne sekvence u CDR i region okvira i napravili njihov spisak (videti SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, peto izdanje, NIH publication, No.91-3242, E.A. Kabat et al.).
1
[0057] U IgG potklasi imunoglobulina postoji nekoliko domena imunoglobulina u teškom lancu. Pod "domenom imunoglobulina (Ig)" ovde se misli na region imunoglobulina koji ima posebnu tercijarnu strukturu. Od interesa u predmetnom pronalasku su domeni teškog lanca, uključujući, konstantne teške (CH) domene i domene zgloba. U kontekstu IgG antitela, svaki od IgG izotipova ima tri CH regiona. U skladu s tim, "CH" domeni u kontekstu IgG su sledeći: "CH1" označava pozicije 118-220 u skladu sa EU indeksom kao u Kabatu. "CH2" označava pozicije 237-340 u skladu sa EU indeksom kao u Kabatu, i "CH3" označava pozicije 341-447 u skladu sa EU indeksom kao u Kabatu.
[0058] Sledeći tip Ig domena teškog lanca je zglobni region. Pod "zglob" ili "zglobnim regionom" ili "zglobnim regionom antitela" ili "zglobnim regionom imunoglobulina" ovde se misli na fleksibilni polipeptid koji sadrži amino-kiseline između prvog i drugog konstantnog domena antitela. Strukturno, IgG CH1 domen se završava na EU poziciji 220, i IgG CH2 domen počinje na ostatku na EU poziciji 237. Stoga je za IgG zglob antitela ovde definisan tako da uključuje pozicije 221 (D221 u IgG1) do 236 (G236 u IgG1), pri čemu je numeracija u skladu sa EU indeksom kao u Kabatu. U nekim primerima izvođenja, na primer u kontekstu Fc regiona, uključen je donji zglob, gde se "donji zglob" generalno odnosi na pozicije 226 ili 230.
[0059] Od posebnog interesa u predmetnom pronalasku su Fc regioni. Pod "Fc" ili "Fc regionom" ili "Fc domenom", kao što se ovde upotrebljava, misli se na polipeptid koji sadrži konstantni region antitela isključujući domen prvog konstantnog regiona imunoglobulina, i u nekim slučajevima, deo zgloba. Stoga Fc označava domene poslednja dva konstantna regiona imunoglobulina IgA, IgD, i IgG, domene poslednja tri konstantna regiona imunoglobulina IgE i IgM, i fleksibilni zglob N-terminalno od ovih domena. Za IgA i IgM, Fc može sadržati J lanac. Za IgG, Fc domen sadrži domene imunoglobulina Cγ2 i Cγ3 (Cγ2 i Cγ3) i donji zglobni region između Cγ1 (Cγ1) i Cγ2 (Cγ2). Iako granice Fc regiona mogu varirati, Fc region teškog lanca humanog IgG se uobičajeno definiše tako da uključuje ostatke C226 ili P230 na svom karboksilnom terminusu, pri čemu je numeracija u skladu sa EU indeksom kao u Kabatu. U nekim primerima izvođenja, kao što je detaljnije opisano ispod, amino-kiselinske modifikacije se vrše na Fc regionu, na primer kako bi se izmenilo vezivanje za jedan ili više FcγR receptora ili za FcRn receptor.
[0060] U nekim primerima izvođenja, antitela su pune dužine. Pod "antitelom pune dužine" ovde se misli na strukturu koja čini prirodni biološki oblik antitela, uključujući varijabilne i konstantne regione, uključujući jednu ili više modifikacija kao što je navedeno ovde.
1
[0061] Alternativno, antitela mogu biti različitih struktura, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fragmente antitela, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela (ponekad ovde označena kao "mimetici antitela"), himerna antitela, humanizovana antitela, fuzije antitela (ponekad ovde označena kao "konjugati antitela"), i fragment svakog, respektivno. Strukture koje se oslanjaju na upotrebu skupa CDR uključene su u definiciju "antitela".
[0062] U jednom primeru izvođenja, antitelo je fragment antitela. Specifični fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, (i) Fab fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, (ii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena, (iii) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog antitela; (iv) dAb fragment (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546) koji se sastoji od jednog varijabilnog regiona, (v) izolovane CDR regione, (vi) F(ab')2 fragmente, bivalentni fragment koji se sastoji od dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančane Fv molekule (scFv), pri čemu su VH domen i VL domen povezani peptidnim linkerom koji omogućava da se dva domena asociraju da formiraju antigen-vezujuće mesto (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
85:5879-5883), (viii) bispecifični jednolančani Fv (WO 03/11161) i (ix) "diatela" ili "triatela", multivalentne ili multispecifične fragmente konstruisane fuzijom gena (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol.326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:6444-6448).
Himerna i humanizovana antitela
[0063] U nekim primerima izvođenja, antitelo može biti smeša različitih vrsta, npr. himerno antitelo i/ili humanizovano antitelo. Odnosno, u predmetnom pronalasku, CDR skupovi se mogu upotrebljavati sa regionima okvira i konstantnim regionima, osim onih koji su ovde specifično opisani sekvencom.
[0064] Generalno, i "himerna antitela" i "humanizovana antitela" označavaju antitela koja kombinuju regione iz više od jedne vrste. Na primer, "himerna antitela" tradicionalno sadrže varijabilni(e) region(e) miša (ili pacova, u nekim slučajevima) i konstantni(e) region(e) čoveka. "Humanizovana antitela" generalno označavaju ne-humana antitela koja su imala regione okvira varijabilnog domena zamenjena za sekvence pronađene u humanim antitelima. Generalno, u humanizovanom antitelu, celo antitelo, osim CDR, kodirano je polinukleotidom humanog porekla ili je identično takvom antitelu osim unutar svojih CDR. CDR, od kojih su neki ili svi kodirani nukleinskim kiselinama poreklom iz ne-humanog organizma, graftovani
1
su u beta-ploču regiona okvira varijabilnog regiona humanog antitela kako bi se stvorila antitela čija je specifičnost određena graftovanim CDR. Stvaranje takvih antitela je opisano u, npr. WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536. Često je potrebna "sekundarna mutacija" odabranih ostataka akceptorskog regiona okvira u odgovarajuće donorske ostatke kako bi se povratio afinitet koji je izgubljen u inicijalnom graftovanom konstruktu (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213). Humanizovano antitelo optimalno će takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina, tipično onog od humanog imunoglobulina, i stoga će tipično sadržati humani Fc region. Humanizovana antitela takođe mogu da se generišu upotrebom miševa sa genetički modifikovanim imunskim sistemom. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog.20:639-654. Raznovrsne tehnike i postupci za humanizovanje i preoblikovanje ne-humanih antitela dobro su poznate u struci (videti Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), i reference koje su tamo citirane). Postupci humanizacije uključuju ali nisu ograničeni na postupke opisane u Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O’Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8. Humanizacija ili drugi postupci smanjenja imunogenosti varijabilnih regiona ne-humanih antitela mogu da uključuju postupke stvaranja nove površine, kao što je opisano na primer u Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973. U jednom primeru izvođenja, roditeljsko antitelo je afinitetno sazrelo, kao što je poznato u struci. Postupci zasnovani na strukturi mogu se koristiti za humanizaciju i afinitetno sazrevanje, na primer kao što je opisano u USSN 11/004,590. Postupci zasnovani na selekciji mogu se koristiti za humanizovanje i/ili afinitetno sazrevanje varijabilnih regiona antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupke opisane u Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem.272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759. Drugi postupci humanizacije mogu uključivati graftovanje samo delova CDR, uključujući ali ne ograničavajući se na postupke opisane u USSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol.
169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084.
1
[0065] U jednom primeru izvođenja, antitela iz pronalaska mogu biti multispecifična antitela, i naročito bispecifična antitela, koja se takođe ponekad označavaju kao "diatela". To su antitela koja se vezuju za dva (ili više) različitih antigena, ili različite epitope na istom antigenu. Dietala se mogu proizvesti na razne načine poznate u struci (Holliger i Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449), npr. pripremljena hemijski ili od hibridnih hibridoma.
[0066] U jednom primeru izvođenja, antitelo je minitelo. Minitela su minimizovani proteini nalik antitelima koji sadrže scFv spojen sa CH3 domenom. Hu et al., 1996, Cancer Res.
56:3055-3061. U nekim slučajevima, scFv može biti spojen sa Fc regionom, i može uključivati malo ili čitav zglobni region. Treba napomenuti da su minitela uključena u definiciju "antitela" uprkos činjenici da ona nemaju ceo skup CDR.
[0067] Antitela predmetnog pronalaska su generalno izolovana ili rekombinantna. "Izolovan", kada se upotrebljava za opisivanje različitih ovde objavljenih polipeptida, znači polipeptid koji je identifikovan i odvojen i/ili izdvojen iz ćelije ili ćelijske kulture koja ga je eksprimirala. Stoga, izolovano antitelo je namenjeno da označava antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za LY75 je suštinski bez antitela koja se specifično vezuju za antigene koji nisu LY75). Stoga, "izolovano" antitelo je ono koje se nalazi u obliku koji se normalno ne nalazi u prirodi (npr. ne javlja se u prirodi). Izolovano antitelo kao što je ovde definisano može, u jednom primeru izvođenja, uključivati najmanje jednu amino-kiselinu koja se ne javlja u antitelu koje se "prirodno" javlja. Ova amino-kiselina se može introdukovati putem dodavanja ili supstitucijom. Podrazumeva se da introdukovana amino-kiselina može biti amino-kiselina koja se javlja u prirodi ili koja se ne javlja u prirodi. U nekim primerima izvođenja, antitela iz pronalaska su rekombinantni proteini, izolovani proteini ili suštinski čisti proteini. "Izolovan" protein nije praćen najmanje nekim materijalom sa kojim je normalno povezan u svom prirodnom stanju, na primer, čini najmanje oko 5%, ili najmanje oko 50% po težini ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovan protein može činiti od 5 do 99,9% po težini ukupnog sadržaja proteina u zavisnosti od okolnosti. Na primer, protein se može napraviti u znatno višoj koncentraciji upotrebom inducibilnog promotora ili promotora visoke ekspresije, tako da se protein pravi na povećanim nivoima koncentracije. U slučaju rekombinantnih proteina, definicija uključuje proizvodnju antitela u širokom spektru organizama i/ili ćelija domaćina koje su poznate u struci u kojima se ona ne proizvode prirodno. Obično, izolovan polipeptid će se pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja. "Izolovano antitelo" označava antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja
1
imaju različite antigene specifičnosti. Na primer, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za LY75 suštinski je bez antitela koja se specifično vezuju za antigene druge od LY75.
[0068] Izolovana monoklonalna antitela, koja imaju različite specifičnosti, mogu se kombinovati u dobro definisanoj kompoziciji. Stoga, na primer, antitelo iz pronalaska može opciono i pojedinačno biti uključeno ili isključeno u formulaciji, kao što se dodatno razmatra ispod.
[0069] Anti-LY75 antitela predmetnog pronalaska specifično se vezuju za LY75 (npr. SEQ ID NO: 15). "Specifično vezivanje" ili "specifično se vezuje za" ili je "specifično za" određeni antigen ili epitop znači vezivanje koje se merljivo razlikuje od nespecifične interakcije. Specifično vezivanje se može izmeriti, na primer, određivanjem vezivanja molekula u poređenju sa vezivanjem kontrolnog molekula, koji je generalno molekul slične strukture koji nema aktivnost vezivanja. Na primer, specifično vezivanje se može odrediti kompeticijom sa kontrolnim molekulom koji je sličan cilju.
[0070] Specifično vezivanje za određeni antigen ili epitop može pokazati, na primer, antitelo koje ima KDza antigen ili epitop od najmanje oko 10-4 M, najmanje oko 10-5 M, najmanje oko 10-6 M, najmanje oko 10-7 M, najmanje oko 10-8 M, najmanje oko 10-9 M, alternativno najmanje oko 10-10 M, najmanje oko 10-11 M, najmanje oko 10<-12>M, ili veće, gde KDoznačava stopu disocijacije određene antitelo-antigen interakcije. Tipično, antitelo koje se specifično vezuje za antigen imaće KDkoja je 20-, 50-, 100-, 500-, 1.000-, 5.000-, 10.000- ili više puta veća za kontrolni molekul u odnosu na antigen ili epitop. Međutim, u predmetnom pronalasku, kada se primenjuju ADC LY75 antitela iz pronalaska, ono što je važno je da je KDdovoljna da omogući internalizaciju, i stoga ćelijsku smrt bez značajnih neželjenih efekata.
[0071] Takođe, specifično vezivanje za određeni antigen ili epitop može pokazati, na primer, antitelo koje ima KAili Kaza antigen ili epitop od najmanje 20-, 50-, 100-, 500-, 1.000-, 5.000 -, 10.000- ili više puta veću za epitop u odnosu na kontrolu, gde KAili Kaoznačavaju stopu asocijacije određene antitelo-antigen interakcije.
[0072] Standardni testovi za procenu sposobnosti vezivanja antitela prema LY75 mogu se izvršiti na proteinskom ili ćelijskom nivou i poznati su u struci, uključujući na primer ELISA, Western blot, RIA, BIAcore® testove i analizu protočne citometrije. Pogodni testovi su detaljno opisani u Primerima. Kinetika vezivanja (npr. afinitet vezivanja) antitela takođe se može proceniti pomoću standardnih testova poznatih u struci, kao što je Biacore® sistemska analiza. Kako bi se procenilo vezivanje za Raji ili Daudi B ćeliju tumorske ćelije, Raji (ATCC depozit br. CCL-86) ili Daudi (ATCC depozit br. CCL-213) ćelije se mogu dobiti iz javno
2
dostupnih izvora, kao što je Američka zbirka tipova kultura (American Type Culture Collection), i upotrebljavaju se u standardnim testovima, kao što je analiza protočne citometrije.
LY75 antitela
[0073] Predmetni pronalazak obezbeđuje LY75 antitela koja se vezuju za LY75 (SEQ ID NO: 15) i mogu se internalizovati kada se dovedu u kontakt sa ćelijama koje eksprimiraju LY75 na površini ćelije ili mogu izazvati ADCC odgovor u prisustvu efektorskih ćelija ili izazvati citotoksični T-ćelijski odgovor u prisustvu efektorskih ćelija. Ova antitela su ovde označena ili kao "anti-LY75" antitela ili, zarad lakšeg opisa, "LY75 antitela".
LY75 antitela se internalizuju nakon kontakta sa ćelijama, posebno ćelijama tumora, koje eksprimiraju LY75 na površini. Odnosno, LY75 antitela kao što je ovde definisano i koja takođe sadrže lek konjugate internalizuju se od strane ćelija tumora, što rezultira oslobađanjem leka i posledičnom ćelijskom smrću, omogućavajući lečenje kancera koji pokazuju LY75 ekspresiju. Internalizacija se u ovom kontekstu može izmeriti na nekoliko načina. U jednom primeru izvođenja, LY75 antitela iz pronalaska se dovode u kontakt sa ćelijama, kao što je ćelijska linija kao što je ovde naznačeno, upotrebom standardnih testova kao što je MAbZap. Stručoj osobi bi bilo jasno da je MabZap test reprezentativan za efekat koji bi se mogao očekivati da se vidi kod antitelo-lek konjugata (ADC). U potonjem slučaju, ADC bi se internalizovao, stoga unoseći lek u ćeliju. Toksični lek bi imao sposobnost da ubije ćeliju, tj., da ubije ciljanu ćeliju kancera. Podaci iz MabZap testova su lako prihvaćeni od strane osoba iskusnih u struci kao reprezentativni ADC testovi (Kohls, M. i Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, no.1, 162-165).
[0074] U ovim in vitro testovima primera izvođenja, LY75 antitela iz pronalaska su dodata, zajedno sa anti-LY75 antitelom koje sadrži toksin; na primer, LY75 antitelo može biti murinsko ili humanizovano i anti-LY75 antitelo može biti anti-murinsko ili antihumanizovano i sadržati toksin kao što je saporin. Nakon formiranja [LY75 antitelo iz pronalaska]-[anti-LY75 antitelo-lek konjugat] kompleksa, kompleks se internalizuje i lek (npr. saporin) se oslobađa, što rezultira ćelijskom smrću. Lek se oslobađa samo nakon internalizacije, i stoga ćelije ostaju vijabilne u odsustvu internalizacije. Kao što je navedeno ispod, bez da je vezano teorijom, u terapijskim primenama, anti-LY75 antitelo sadrži toksin, i nakon internalizacije, veza između antitela i toksina se iseca, oslobađajući toksin i ubijajući ćeliju.
[0075] Pored toga, LY75 antitela izazivaju ADCC odgovor u prisustvu efektorskih ćelija, posebno ćelija tumora, koje eksprimiraju LY75 na površini.
[0076] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) teškog i lakog lanca ili varijabilne regione (VR) određenog ovde opisanog antitela (npr. ovde označeno kao "LY75_A1"). U skladu sa tim, u jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 domene varijabilnog regiona teškog lanca (VH) antitela LY75_A1 koji ima sekvencu pokazanu u SEQ ID NO: 1, i CDR1, CDR2 i CDR3 domene varijabilnog regiona lakog lanca (VL) antitela LY75_A1 koji ima sekvencu pokazanu u SEQ ID NO: 2.
[0077] U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5; drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6; i treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8; drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9; i treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10.
[0078] U sledećem primeru, opisana antitela se vezuju za humani LY75 i uključuju varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 1, i konzervativne modifikacije njene sekvence. Antitelo može dodatno da uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 2, i konzervativne modifikacije njene sekvence.
[0079] U dodatnom primeru izvođenja, antitela iz pronalaska se vezuju za humani LY75 i uključuju varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1, i/ili 2, respektivno. Kao što se ovde upotrebljava, termin konzervativna modifikacija sekvence odnosi se, na primer, na supstituciju aminokiseline sa amino-kiselinom koja ima slične karakteristike. Opšte je poznato osobi iskusnoj u struci koje se takve supstitucije mogu smatrati konzervativnim. Ostale modifikacije koje se mogu smatrati konzervativnim modifikacijama sekvence uključuju, na primer, glikozilaciju.
[0080] Izolovana antitela koja uključuju varijabilne regione teškog i lakog lanca koji imaju najmanje 80%, ili najmanje 85%, ili najmanje 90%, ili najmanje 91%, ili najmanje 92%, ili najmanje 93%, ili najmanje 94 %, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99%, ili više identičnosti sekvence sa bilo kojom od gornjih sekvenci su takođe uključene u predmetni pronalazak. Opsezi između gore navedenih vrednosti, npr. varijabilni regioni teškog i lakog lanca koji imaju najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95% ili 95-100% identičnosti sekvence sa bilo kojom od gornjih sekvenci su takođe namenjeni da budu obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 1 ili sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična SEQ ID NO: 1. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična SEQ ID NO: 2. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži region okvira teškog lanca koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična regionu okvira varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 1 koji sadrži SEQ ID NO: 16, 17 i 18. U sledećem primeru izvođenja, antitelo sadrži region okvira lakog lanca koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična regionu okvira varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 2 koji sadrži SEQ ID NO: 19, 20 i 21.
[0081] U jednom primeru izvođenja, antitelo iz pronalaska je anti-LY75 antitelo (ovde se označava kao "LY75_A1 antitelo") koje sadrži sledeće CDR, kao i varijante koje sadrže ograničen broj amino-kiselinskih varijanti:
[0082] Ovde se takođe objavljuju varijabilni teški i laki lanci koji sadrže CDR skupove iz pronalaska, kao i teški i laki lanci pune dužine (npr. koji takođe sadrže konstantne regione). Kao što će ceniti iskusni u struci, CDR skupovi iz pronalaska mogu biti inkorporisani u murinske, humanizovane ili humane konstantne regione (uključujući regione okvira). U
2
skladu sa tim, predmetni pronalazak obezbeđuje varijabilne teške i lake lance koji su najmanje oko 90%-99% identični SEQ ID NO koje se ovde objavljuju, sa 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 i 99% svi pronalaze upotrebu u predmetnom pronalasku.
Antitela koja se vezuju za isti epitop kao LY75 antitela iz pronalaska
[0083] Takođe su opisana antitela koja se vezuju za isti epitop na humanom LY75 kao bilo koje od LY75 monoklonalnih antitela iz pronalaska. Termin "vezuje se za isti epitop" u pozivanju na dva ili više antitela znači da su antitela u kompeticiji za vezivanje za antigen i vezuju se za iste, preklapajuće ili obuhvatajuće kontinuirane ili diskontinuirane segmente amino-kiselina. Iskusni u struci razumeju da fraza "vezuje se za isti epitop" ne mora nužno da znači da se antitela vezuju za potpuno iste amino-kiseline, mada se u jednom primeru može definisati kao takva. U sledećem primeru, precizne amino-kiseline za koje se antitela vezuju mogu se razlikovati. Na primer, prvo antitelo se može vezati za segment amino-kiselina koji je u potpunosti obuhvaćen segmentom amino-kiselina koje vezuje drugo antitelo. U sledećem primeru, prvo antitelo vezuje jedan ili više segmenata amino-kiselina koji se značajno preklapaju sa jednim ili više segmenata koje vezuje drugo antitelo. Za ove svrhe, smatra se da se takva antitela "vezuju za isti epitop".
[0084] U skladu s tim, takođe su opisana antitela koja se vezuju za epitop na LY75 koji sadrži ceo ili deo epitopa prepoznatog od strane određenih ovde opisanih antitela (npr. isti ili preklapajući region ili region između ili koji obuhvata taj region). Takođe su opisana antitela koja se specifično vezuju za najmanje jedan, na primer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, peptida odabranih iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ili 37 ili njihov fragment, pri čemu navedeni fragment sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 susednih amino-kiselina. U dodatnom primeru, epitop prepoznat od strane antitela sadrži najmanje jedan peptid, najmanje dva ili najmanje tri peptida odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 27, 29, 30, 34, 35, 36 ili 37 ili njihovih fragmenata pri čemu navedeni fragmenti sadrže najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 susednih amino-kiselina. U dodatnom primeru, epitop prepoznat od strane antitela sadrži najmanje jedan peptid, na primer jedan, dva ili tri peptida odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 30, 36 i 37 ili njihovih fragmenata, pri čemu navedeni fragmenti sadrže: najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10 susednih amino-kiselina.
[0085] Takođe su opisana antitela koja vezuju isti epitop i/ili antitela koja su u kompeticiji za vezivanje za humani LY75 sa ovde opisanim antitelima. Antitela koja prepoznaju isti epitop ili su u kompeticiji za vezivanje mogu se identifikovati upotrebom rutinskih tehnika. Takve tehnike uključuju, na primer, imunotest, koji pokazuje sposobnost jednog antitela da blokira vezivanje drugog antitela za ciljni antigen, tj., test kompetitivnog vezivanja. Kompetitivno vezivanje se određuje u testu u kom imunoglobulin koji se testira inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen, kao što je LY75. Poznati su brojni tipovi testova kompetitivnog vezivanja, na primer: direktni ili indirektni radioimunološki test u čvrstoj fazi (RIA), direktni ili indirektni enzimski imunološki test u čvrstoj fazi (EIA), sendvič test kompeticije (videti Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); direktni biotin-avidin EIA u čvrstoj fazi (videti Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); direktno obeleženi test u čvrstoj fazi, direktno obeleženi sendvič test u čvrstoj fazi (videti Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); direktno obeležen RIA u čvrstoj fazi upotrebom 1-125 obeleživača (videti Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); direktni biotin-avidin EIA u čvrstoj fazi (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); i direktno obeležen RIA. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Tipično, takav test uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo koji od ovih, neobeleženi imunoglobulin koji se testira i obeleženi referentni imunoglobulin. Kompetitivna inhibicija se meri određivanjem količine obeleživača vezanog za čvrstu površinu ili ćelija u prisustvu imunoglobulina koji se testira. Uobičajeno je imunoglobulin koji se testira prisutan u višku. Uobičajeno, kada je antitelo koje je u kompeticiji prisutno u višku, ono će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-99% ili više.
[0086] Druge tehnike uključuju, na primer, postupke mapiranja epitopa, kao što su rendgenske analize kristala antigen:antitelo kompleksa koje obezbeđuju atomsku rezoluciju epitopa. Drugi postupci nadgledaju vezivanje antitela za fragmente antigena ili mutirane varijacije antigena gde se gubitak vezivanja usled modifikacije amino-kiselinskog ostatka unutar sekvence antigena često smatra indikacijom komponente epitopa. Pored toga, takođe se mogu upotrebljavati računarski kombinatorni postupci za mapiranje epitopa. Ovi postupci se oslanjaju na sposobnost antitela od interesa da afinitetno izoluju specifične kratke peptide iz biblioteka kombinatornih fag displej peptida. Peptidi se tada smatraju vodećim za definiciju epitopa koji odgovara antitelu koje se upotrebljava za pretragu biblioteke peptida. Za
2
mapiranje epitopa takođe su razvijeni računarski algoritmi za koje je pokazano da mapiraju konformacione diskontinuirane epitope.
[0087] U posebnom primeru, antitelo je u kompeticiji za vezivanje za LY75 sa antitelom koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže amino-kiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno, ili amino-kiselinske sekvence najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identične njima. U sledećem primeru, antitelo je u kompeticiji za vezivanje za LY75 sa antitelom koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2 (LY75_A1).
[0088] Druga opisana antitela se vezuju za epitop na LY75 prepoznat od strane ovde opisanih antitela. U sledećem posebnom primeru, antitelo se vezuje za epitop na LY75 prepoznat od strane antitela koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno, ili amino-kiselinske sekvence najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identične njima. U sledećem primeru izvođenja, antitelo se vezuje za epitop na LY75 prepoznat od strane antitela koje sadrži varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca koji sadrže amino-kiselinske sekvence iznete u SEQ ID NO: 1 i 2 (LY75).
Karakterizacija monoklonalnih antitela prema LY75
[0089] Monoklonalna antitela iz pronalaska mogu se okarakterisati za vezivanje za LY75 upotrebom različitih poznatih tehnika. Generalno, antitela su inicijalno okarakterisana pomoću ELISA. Ukratko, mikrotitar ploče se mogu obložiti prečišćenim LY75 u PBS, i zatim blokirati nerelevantnim proteinima kao što je goveđi serumski albumin (BSA) razblažen u PBS. Rablaženja plazme iz LY75-imunizovanih miševa se dodaju u svaki bunarić i inkubiraju tokom 1-2 sata na 37 °C. Ploče se ispiraju sa PBS/Tween 20 i zatim se inkubiraju sa kozjim anti-humanim IgG Fc-specifičnim poliklonalnim reagensom konjugovanim sa alkalnom fosfatazom tokom 1 sata na 37 °C. Nakon ispiranja, ploče se razvijaju sa ABTS supstratom, i analiziraju na OD od 405. Poželjno, miševi koji razviju najveće titre će se upotrebljavati za fuzije.
[0090] ELISA test kao što je opisano iznad može se upotrebljavati za pretragu antitela i, stoga, hibridoma koji proizvode antitela koja pokazuju pozitivnu reaktivnost sa LY75 imunogenom. Hibridomi koji se vezuju, poželjno sa visokim afinitetom, za LY75 mogu se zatim subklonirati i dodatno okarakterisati. Tada se može izabrati po jedan klon iz svakog
2
hibridoma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (pomoću ELISA), za izradu banke ćelija, i za prečišćavanje antitela.
[0091] Kako bi se prečistila anti-LY75 antitela, odabrani hibridomi se mogu uzgajati u valjkastim bocama, dvolitrskim spiner flaskovima ili drugim sistemima za kulturu. Supernatanti se mogu filtrirati i koncentrovati pre afinitetne hromatografije sa proteinim A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) radi prečišćavanja proteina. Posle zamene pufera za PBS, koncentracija se može odrediti pomoću OD280upotrebom 1,43 koeficijenta ekstinkcije ili poželjno nefelometrijskom analizom. IgG se može proveriti gel elektroforezom i antigen specifičnim postupkom.
[0092] Kako bi se odredilo da li se odabrana anti-LY75 monoklonalna antitela vezuju za jedinstvene epitope, svako antitelo se može biotinilisati upotrebom komercijalno dostupnih reagensa (Pierce, Rockford, IL). Vezivanje biotinilisanog MAb može se detektovati sa probom obeleženom streptavidinom. Kako bi se odredio izotip prečišćenih antitela, izotip ELISA testovi se mogu izvoditi upotrebom tehnika prepoznatih u struci. Na primer, bunarići mikrotitarskih ploča mogu se obložiti sa 10 µg/ml anti-Ig preko noći na 4 °C. Posle blokiranja sa 5% BSA, ploče reaguju sa 10 µg/ml monoklonalnih antitela ili prečišćenih izotipskih kontrola, na temperaturi okoline tokom dva sata. Tada bunarići mogu da reaguju ili sa IgG1 ili sa drugim konjugovanim probama specifičnim za izotip. Ploče se razvijaju i analiziraju kao što je opisano iznad.
[0093] Kako bi se testiralo vezivanje monoklonalih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju LY75 može se upotrebiti protočna citometrija. Ukratko, ćelijske linije i/ili humane PBMC koje eksprimiraju LY75 vezan za membranu (uzgajane pod standardnim uslovima rasta) mešaju se sa različitim koncentracijama monoklonalnih antitela u PBS koji sadrži 0,1% BSA na 4 °C tokom 1 sata. Posle ispiranja, ćelije reaguju sa fluoresceinom obeleženim anti-IgG antitelom pod istim uslovima kao za bojenje primarnim antitelom. Uzorci se mogu analizirati FACScan instrumentom upotrebom svetlosti i svojstava bočnog rasipanja kako bi se gejtovale pojedinačne ćelije i kako bi se odredilo vezivanje obeleženih antitela. Može se upotrebljavati alternativni test koji upotrebljava fluorescentnu mikroskopiju (pored ili umesto) testa protočne citometrije. Ćelije se mogu obojiti tačno kako je opisano iznad i ispitati fluorescentnom mikroskopijom. Ovaj postupak omogućava vizualizaciju pojedinačnih ćelija, ali može imati umanjenu osetljivost u zavisnosti od gustine antigena.
[0094] Anti-LY75 IgG mogu se dodatno testirati na reaktivnost sa LY75 antigenom Western blotovanjem. Ukratko, ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju LY75 mogu se pripremiti i podvrgnuti gel elektroforezi u natrijum dodecil sulfat poliakrilamidu. Posle elektroforeze,
2
odvojeni antigeni će se preneti na nitrocelulozne membrane, blokirati sa 20% mišjeg seruma, i sondirati monoklonalnim antitelima koja se testiraju. IgG vezivanje može se detektovati upotrebom anti-IgG alkalne fosfataze i razviti sa BCIP/NBT supstratnim tabletama (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
[0095] Postupci za analiziranje afiniteta vezivanja, unakrsne reaktivnosti, i kinetike vezivanja različitih anti-LY75 antitela uključuju standardne testove poznate u struci, na primer, analizu Biacore™ površinske plazmonske rezonance (SPR) upotrebom Biacore™ 2000 SPR instrumenta (Biacore AB, Uppsala, Švedska).
[0096] Antitelo se specifično vezuje za humani LY75 koji sadrži SEQ ID NO: 15. Poželjno, antitelo iz pronalaska se vezuje za humani LY75 sa visokim afinitetom.
[0097] Poželjno je da se antitelo iz pronalaska vezuje za LY75 protein sa KDod 5 x 10-8 M ili manjom, vezuje za LY75 protein sa KDod 2 x 10-8 M ili manjom, vezuje za LY75 protein sa KDod 5 x 10-9 M ili manjom, vezuje za LY75 protein sa KDod 4 x 10-9 M ili manjom, vezuje za LY75 protein sa KDod 3 x 10-9 M ili manjom, vezuje za LY75 protein sa KDod 2 x 10-9 M ili manjom, vezuje za LY75 protein sa KDod 1 x 10-9 M ili manjom, vezuje za LY75 protein sa KDod 5 x 10-10 M ili manjom, ili se vezuje za LY75 protein sa KDod 1 x 10-10 M ili manjom.
[0098] U jednom primeru, antitela su u kompeticiji (npr. unakrsna kompeticija) za vezivanje za LY75 sa određenim anti-LY75 antitelima ovde opisanim (npr. LY75_A1). Takva antitela koja su u kompeticiji mogu se identifikovati na osnovu njihove sposobnosti da kompetitivno inhibiraju vezivanje za LY75 jednog ili više mAb u standardnim testovima vezivanja za LY75. Na primer, mogu se upotrebiti standardni ELISA testovi u kojima je rekombinantni humani LY75 protein imobilisan na ploči, jedno od antitela je fluorescentno obeleženo i procenjuje se sposobnost neobeleženih antitela da budu u kompeticiji u vezivanju obeleženih antitela. Dodatno ili alternativno, BIAcore analiza se može upotrebljavati za procenu sposobnosti antitela da budu u unakrsnoj kompeticiji. Sposobnost antitela koje se testira da inhibira vezivanje anti-LY75 antitela iz pronalaska za humani LY75 pokazuje da antitelo koje se testira može biti u kompeticiji sa antitelom za vezivanje za humani LY75.
[0099] U jednom primeru, antitelo koje je u kompeticiji je antitelo koje se vezuje za isti epitop na humanom LY75 kao određena ovde opisana anti-LY75 monoklonalna antitela (na primer, LY75_A1). Standardne tehnike mapiranja epitopa, kao što su rendgenska kristalografija i dvodimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca, mogu se upotrebljavati kako bi se odredilo da li se antitelo vezuje za isti epitop kao referentno antitelo (videti, npr.
2
Epitope Mapping Protocols u Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
[0100] U jednom primeru, antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje za LY75 i/ili se vezuje za isti epitop na humanom LY75 je humano antitelo.
[0101] Jednom kada je izolovano jedno, arhetipsko anti-LY75 mAb koje ima ovde opisana željena svojstva, mogu se generisati druga mAb sa sličnim svojstvima, npr. koja imaju isti epitop. Na primer, miševi mogu biti imunizovani sa LY75 kao što je ovde opisano, hibridomi proizvedeni, i rezultujuća mAb pregledana za sposobnost da budu u kompeticiji sa arhetipskim mAb za vezivanje za LY75. Miševi se takođe mogu imunizovati manjim fragmentom LY75 koji sadrži epitop za koji se vezuje arhetipsko mAb. Epitop se može lokalizovati, npr. pregledom za vezivanje za seriju preklapajućih peptida koji obuhvataju LY75. Alternativno, postupak Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994, može se upotrebiti kao vodič za odabir mAb koja imaju isti epitop i prema tome slična svojstva kao i arhetipsko mAb. Upotrebom fag displeja, prvo se teški lanac arhetipskog antitela sparuje sa repertoarom (poželjno humanih) lakih lanaca kako bi se odabralo LY75-vezujuće mAb, i zatim se novi laki lanac sparuje sa repertoarom (poželjno humanih) teških lanaca kako bi se odabralo (poželjno humano) LY75-vezujuće mAb koje ima isti epitop kao i arhetipsko mAb. Alternativno, varijante arhetipskog mAb se mogu dobiti mutagenezom cDNK koja kodira teške i lake lance antitela.
[0102] Mapiranje epitopa, npr. kao što je opisano u Champe et al. (1995) J. Biol. Chem.
270:1388-1394, može se izvršiti kako bi se odredilo da li antitelo vezuje epitop od interesa. "Skeniranje mutageneze alanina", kao što su opisali Cunningham i Wells (1989) Science 244: 1081-1085, ili neki drugi oblik tačkaste mutageneze amino-kiselinskih ostataka u humanom LY75, takođe se može upotrebiti za određivanje funkcionalnog epitopa za anti-LY75 antitelo predmetnog pronalaska. Studije mutageneze, međutim, takođe mogu otkriti amino-kiselinske ostatke koji su presudni za ukupnu trodimenzionalnu strukturu LY75, ali koji nisu direktno uključeni u antitelo-antigen kontakte, i stoga će biti potrebni drugi postupci za potvrđivanje funkcionalnog epitopa određenog upotrebom ovog postupka.
[0103] Epitop vezan od strane specifičnog antitela takođe se može odrediti procenom vezivanja antitela za peptide koji sadrže fragmente humanog LY75. Serija preklapajućih peptida koji obuhvataju sekvencu LY75 može se sintetisati i pregledati za vezivanje, npr. u direktnoj ELISA, kompetitivnoj ELISA (gde se peptid procenjuje za njegovu sposobnost da spreči vezivanje antitela za LY75 vezan za bunarić mikrotitarske ploče), ili na čipu. Takvi postupci pregleda peptida možda neće moći da detektuju neke diskontinuirane funkcionalne
2
epitope, tj., funkcionalne epitope koji uključuju amino-kiselinske ostatke koji nisu susedni duž primarne sekvence LY75 polipeptidnog lanca.
[0104] Epitop vezan od strane antitela iz predmetnog pronalaska takođe se može odrediti strukturnim postupcima, kao što su određivanje kristalne strukture rendgenskim zracima (npr. WO2005/044853), molekularno modeliranje i spektroskopija nuklearne magnetne rezonance (NMR), uključujući NMR određivanje stope promene H-D labilnih amidnih vodonika u LY75 kada su slobodni i kada su vezani u kompleksu sa antitelom od interesa (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
[0105] Što se tiče rendgenske kristalografije, kristalizacija se može postići upotrebom bilo kog od poznatih postupaka u struci (npr. Giege et al. (1994) Acta Cristallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189: 1-23), uključujući mikroseriju (npr. Chayen (1997) Structure 5: 1269-1274), difuziju pare sa visećom kapljicom (npr. McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), zasejavanje i dijalizu. Poželjno je upotrebljavati proteinski preparat koji ima koncentraciju od najmanje oko 1 mg/ml i poželjno oko 10 mg/ml do oko 20 mg/ml. Kristalizaciju je najbolje postići u taložnom rastvoru koji sadrži polietilen glikol 1.000-20.000 (PEG; prosečna molekulska težina u opsegu od oko 1.000 do oko 20.000 Da), poželjno oko 5.000 do oko 7.000 Da, poželjnije oko 6.000 Da, sa koncentracijama u opsegu od oko 10% do oko 30% (tež./zapr.). Takođe može biti poželjno uključiti agens za stabilizaciju proteina, npr. glicerol u koncentraciji u opsegu od oko 0,5% do oko 20%. Pogodna so, kao što su natrijum hlorid, litijum hlorid ili natrijum citrat, takođe mogu biti poželjne u taložnom rastvoru, poželjno u koncentraciji u opsegu od oko 1 mM do oko 1000 mM. Talog se poželjno puferiše do pH od oko 3,0 do oko 5,0, poželjno oko 4,0. Specifični puferi korisni u taložnom rastvoru mogu se razlikovati i dobro su poznati u struci (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York). Primeri korisnih pufera uključuju, ali nisu ograničeni na, HEPES, Tris, MES i acetatni. Kristali mogu rasti na širokom opsegu temperatura, uključujući 2 °C, 4 °C, 8 °C i 26 °C.
[0106] Antitelo:antigen kristali se mogu proučavati upotrebom dobro poznatih tehnika difrakcije rendgenskih zraka i mogu se rafinisati upotrebom računarskog softvera kao što je X-PLOR (Yale University, 1992, distributer Molecular Simulations, Inc.; videti npr. Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; Publikacija američke patentne prijave br. 2004/0014194), i BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).
[0107] Testovi kompetitivnosti antitela, kao što je ovde opisano, mogu se upotrebljavati za određivanje da li se antitelo "vezuje za isti epitop" kao drugo antitelo. Tipično, kompeticija od 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, kao što je 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, antitela za koje je poznato da interaguje sa epitopom od strane drugog antitela pod uslovima u kojima je drugo antitelo u višku i prvo zasićuje sva mesta, je indikativno da se antitela "vezuju za isti epitop". Kako bi se procenio nivo kompeticije između dva antitela, na primer, mogu se upotrebljavati radioimunotestovi ili testovi koji upotrebljavaju druge obeleživače za antitela. Na primer, LY75 antigen se može inkubirati sa zasićujućom količinom prvog anti-LY75 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta konjugovanog sa obeleženim jedinjenjem (npr.<3>H,<125>I, biotin, ili rubidijum) u prisustvu iste količine drugog neobeleženog anti-LY75 antitela. Zatim se procenjuje količina obeleženog antitela koja je vezana za antigen u prisustvu neobeleženog blokirajućeg antitela i upoređuje sa vezivanjem u odsustvu neobeleženog blokirajućeg antitela. Kompeticija se određuje procentualnom promenom signala vezivanja u prisustvu neobeleženog blokirajućeg antitela u poređenju sa odsustvom blokirajućeg antitela. Stoga, ukoliko postoji 50% inhibicije vezivanja obeleženog antitela u prisustvu blokirajućeg antitela u poređenju sa vezivanjem u odsustvu blokirajućeg antitela, onda postoji kompeticija između dva antitela od 50%. Stoga, pozivanje na kompeticiju između prvog i drugog antitela od 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, kao što je 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, znači da prvo antitelo inhibira vezivanje drugog antitela (ili vice versa) za antigen za 50%, 60%, 70 %, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više (u poređenju sa vezivanjem antigena od strane drugog antitela u odsustvu prvog antitela). Stoga, inhibicija vezivanja prvog antitela za antigen od strane drugog antitela od 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više ukazuje da se dva antitela vezuju za isti epitop.
Modifikacije antitela
[0108] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje varijante antitela, koje se ponekad označavaju kao "derivati antitela" ili "analozi antitela". Odnosno, postoji veliki broj modifikacija koje se mogu izvršiti na antitelima iz pronalaska, uključujući, ali bez ograničavanja na, amino-kiselinske modifikacije u CDR (afinitetno sazrevanje), aminokiselinske modifikacije u regionima okvira, amino-kiselinske modifikacije u Fc regionu,
1
varijante glikozilacije, kovalentne modifikacije drugih tipova (npr. za prikačinjanje lek konjugata, itd.).
[0109] Pod "varijantom" ovde se misli na polipeptidnu sekvencu koja se razlikuje od one od roditeljskog polipeptida na osnovu najmanje jedne amino-kiselinske modifikacije. U ovom slučaju, roditeljski polipeptid je bilo varijabilni teški ili laki lanac pune dužine, navedeni u SEQ ID NO: 1 ili 2, respektivno, ili CDR regioni ili regioni okvira teškog i lakog lanca navedeni u SEQ ID NO 5-10 i 16-21. Amino-kiselinske modifikacije mogu da uključuju supstitucije, insercije i delecije, s tim što su ove prve poželjne u mnogim slučajevima. Podrazumeva se da amino-kiselinska supstitucija može biti konzervativna ili nekonzervativna supstitucija, pri čemu su poželjne konzervativne supstitucije. Dodatno navedena supstitucija može biti supstitucija bilo sa amino-kiselinom koja se javlja u prirodi ili se ne javlja u prirodi.
[0110] Generalno, varijante mogu da uključuju bilo koji broj modifikacija, sve dok je funkcija antitela još uvek prisutna, kao što je ovde opisano. Odnosno, LY75_A1, na primer, antitelo bi i dalje trebalo specifično da se vezuje za humani LY75. Slično tome, ukoliko se na primer generišu varijante amino-kiselina sa Fc regionom, varijante antitela treba da održavaju potrebne funkcije vezivanja za receptor za određenu primenu ili indikaciju antitela.
[0111] "Varijante" u ovom slučaju mogu da se izrade ili u navedenim CDR sekvencama, u regionima okvira ili u Fc regionima antitela.
[0112] Međutim, generalno, od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino-kiselinskih supstitucija se generalno koriste uvek kada je cilj izmena funkcije sa minimalnim brojem modifikacija. U nekim slučajevima, postoji od 1 do 5 modifikacija (npr. pojedinačne amino-kiselinske supstitucije, insercije ili delecije), od kojih 1-2, 1-3 i 1-4 takođe pronalaze upotrebu u mnogim primerima izvođenja. Broj modifikacija može zavisiti od veličine regiona koji se modifikuje; na primer, generalno manje modifikacija je poželjno u CDR regionima. Stručnjak će razumeti da čak i unutar CDR regiona lokacija modifikacije može značajno izmeniti efekat. U jednom primeru izvođenja, modifikacije se mogu izvršiti u bilo kom od CDR1, CDR2 ili CDR3 teških i/ili lakih lanaca. U dodatnom primeru izvođenja, modifikacije su napravljene u bilo kom od CDR1 ili CDR2 teških i/ili lakih lanaca. U sledećem dodatnom primeru izvođenja, modifikacije su locirane u CDR1 teških i/ili lakih lanaca.
[0113] Treba napomenuti da broj amino-kiselinskih modifikacija može biti unutar funkcionalnih domena: na primer, može biti poželjno imati od 1-5 modifikacija u Fc regionu proteina divljeg tipa ili projektovanih proteina, kao i od 1 do 5 modifikacija u Fv regionu, na primer. Varijanta polipeptidne sekvence poželjno će posedovati najmanje oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa roditeljskim
2
sekvencama (npr. varijabilni regioni, konstantni regioni, i/ili sekvence teškog i lakog lanca i/ili CDR LY75_A1). Treba napomenuti da će u zavisnosti od veličine sekvence, procenat identičnosti zavisiti od broja amino-kiselina.
[0114] Pod "amino-kiselinskom supstitucijom" ili "supstitucijom" ovde se misli na zamenu amino-kiseline na određenoj poziciji u sekvenci roditeljskog polipeptida drugom aminokiselinom koja može biti amino-kiselina koja se javlja u prirodi ili se ne javlja u prirodi. Na primer, supstitucija S100A označava varijantu polipeptida u kojoj je serin na poziciji 100 zamenjen alaninom. Pod "insercijom amino-kiseline" ili "insercijom", kao što se ovde upotrebljava, misli se na dodavanje amino-kiseline na određenoj poziciji u sekvenci roditeljskog polipeptida. Pod "delecijom amino-kiseline" ili "delecijom", kao što se ovde upotrebljava, misli se na uklanjanje amino-kiseline na određenoj poziciji u sekvenci roditeljskog polipeptida.
[0115] Pod "roditeljskim polipeptidom", "roditeljskim proteinom", "prekursorskim polipeptidom", ili "prekursorskim proteinom", kao što se ovde upotrebljava, misli se na nemodifikovani polipeptid koji je naknadno modifikovan da generiše varijantu. Generalno, roditeljski polipeptidi ovde su LY75_A1. U skladu sa tim, pod "roditeljskim antitelom", kao što se ovde upotrebljava, misli se na antitelo koje je modifikovano da generiše varijantu antitela.
[0116] Pod "divlji tip" ili "WT" ili "nativni" ovde se misli na amino-kiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja se nalazi u prirodi, uključujući alelne varijacije. WT protein, polipeptid, antitelo, imunoglobulin, IgG, itd., imaju amino-kiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja nije namerno modifikovana.
[0117] Pod "varijanta Fc regiona" ovde se misli na Fc sekvencu koja se razlikuje od Fc sekvence divljeg tipa zahvaljujući najmanje jednoj amino-kiselinskoj modifikaciji. Fc varijanta se može odnositi na sam Fc polipeptid, kompozicije koje sadrže Fc varijantu polipeptida, ili amino-kiselinsku sekvencu.
[0118] U nekim primerima izvođenja, napravljena je jedna ili više amino-kiselinskih modifikacija u jednom ili više CDR LY75_A1. Generalno, samo 1 ili 2 amino-kiseline su supstituisane u bilo kom pojedinačnom CDR. Međutim, treba imati na umu da bilo koja kombinacija nikakvih supstitucija, 1 ili 2 supstitucije u bilo kom CDR može biti nezavisno i opciono kombinovana sa bilo kojom drugom supstitucijom. Biće očigledno da se supstitucije mogu izvršiti u bilo kom od 6 CDR. U jednom primeru izvođenja, supstitucije se vrše u CDR1 teških i/ili lakih lanaca.
[0119] U nekim slučajevima, amino-kiselinske modifikacije u CDR su označene kao "afinitetno sazrevanje". "Afinitetno sazrelo" antitelo je ono koje ima jednu ili više izmene(a) u jednom ili više CDR što rezultira poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa roditeljskim antitelom koje ne poseduje tu izmenu(e). U nekim slučajevima, mada retko, možda će biti poželjno smanjiti afinitet antitela prema njegovom antigenu, ali ovo generalno nije poželjno.
[0120] Afinitetno sazrevanje se može izvršiti kako bi se povećao afinitet vezivanja antitela za antigen za najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 100%, oko 110%, oko 120%, oko 130%, oko 140%, oko 150% ili više, ili 1, 2, 3, 4 do 5 puta u poređenju sa "roditeljskim" antitelom. Poželjna afinitetno sazrela antitela će imati nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljni antigen. Afinitetno sazrela antitela se proizvode poznatim procedurama. Videti, na primer, Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 koji opisuje afinitetno sazrevanje mešanjem domena varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL). Nasumična mutageneza CDR i/ili ostataka regiona okvira opisana je u: Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; i Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol.
226:889-896, na primer.
[0121] Alternativno, amino-kiselinske modifikacije mogu se izvršiti u jednom ili više CDR antitela iz pronalaska koje su "tihe", npr. koje ne menjaju značajno afinitet antitela za antigen. One se mogu napraviti iz više razloga, uključujući optimizaciju ekspresije (kao što se mogu napraviti za nukleinske kiseline koje kodiraju antitela iz pronalaska).
[0122] Stoga, u definiciju CDR i antitela iz pronalaska uključene su varijante CDR i antitela; to jest, antitela iz pronalaska mogu da uključuju amino-kiselinske modifikacije u jednom ili više CDR LY75_A1. Pored toga, kao što je istaknuto ispod, amino-kiselinske modifikacije se mogu takođe nezavisno i opciono napraviti u bilo kom regionu izvan CDR, uključujući region okvira i konstantne regione kao što je ovde opisano.
[0123] U nekim primerima izvođenja, anti-LY75 antitela iz pronalaska se sastoje od varijante Fc domena. Kao što je poznato u struci, Fc region antitela interaguje sa brojnim Fc receptorima i ligandima, dajući niz važnih funkcionalnih sposobnosti koje se označavaju kao efektorske funkcije. Ovi Fc receptori uključuju, ali nisu ograničeni na, (kod ljudi) FcγRI (CD64) uključujući izoforme FcγRIa, FcγRIb, i FcγRIc; FcγRII (CD32), uključujući izoforme FcγRIIa (uključujući alotipove H131 i R131), FcγRIIb (uključujući FcγRIIb-1 i FcγRIIb-2), i FcγRIIc; i FcγRIII (CD16), uključujući izoforme FcγRIIIa (uključujući alotipove V158 i
4
F158, u korelaciji sa ćelijskom citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC)) i FcγRIIIb (uključujući alotipove FcγRIIIb-NA1 i FcγRIIIb-NA2), FcRn (neonatalni receptor), C1q (komplement protein koji je uključen u u citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC)) i FcRn (neonatalni receptor koji je uključen u poluživot seruma). Pogodne modifikacije mogu se napraviti na jednoj ili više pozicija kao što je to generalno istaknuto, na primer u S.A.D. patentnoj prijavi 11/841,654 i tamo citiranim referencama, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, USSN 12/341,769, S.A.D. patentu br. 6,737,056, S.A.D. patentu br. 7,670,600, S.A.D. patentu br.6,086,875.
[0124] Pored modifikacija istaknutih iznad, mogu se napraviti i druge modifikacije. Na primer, molekuli se mogu stabilizovati inkorporacijom disulfidnih mostova koji povezuju VH i VL domene (Reiter et al., 1996, Nature Biotech.14:1239-1245).
[0125] Pored toga, modifikacije na cisteinima su posebno korisne u primenama antitelo-lek konjugata (ADC), dodatno opisanim ispod. U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela se može projektovati tako da sadrži jedan ili više cisteina koji su posebno "tiol reaktivni", kako bi se omogućilo specifičnije i kontrolisanije postavljanje ostatka leka. Videti na primer S.A.D. patent br.7,521,541.
[0126] Pored toga, postoji niz kovalentnih modifikacija antitela koje se mogu napraviti kao što je istaknuto ispod.
[0127] Kovalentne modifikacije antitela su uključene u obim ovog pronalaska, i generalno se, ali ne uvek, rade post-translaciono. Na primer, nekoliko tipova kovalentnih modifikacija antitela introdukuju se u molekul reakcijom specifičnih amino-kiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatnim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima.
[0128] Cisteinil ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, da daju derivate karboksimetila ili karboksiamidometila. Cisteinil ostaci se takođe mogu derivatizovati reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidatom, phloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom, ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.
[0129] Histidil ostaci se derivatizuju reakcijom sa dietilpirokarbonatom na pH 5,5-7,0, pošto je ovaj agens relativno specifičan za histidil bočni lanac. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0,1 M natrijum kakodilatu na pH 6,0.
[0130] Lizinil i amino terminalni ostaci reaguju sa anhidridima jantarne ili drugih karboksilnih kiselina. Derivatizacija ovim agensima ima za posledicu preokretanje naelektrisanja lizinil ostataka. Ostali pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino uključuju imidoestre kao što su metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentandion; i transaminaza-katalizovana reakcija sa glioksilatom.
[0131] Arginil ostaci se modifikuju reakcijom sa jednim ili nekoliko konvencionalnih reagensa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion, i ninhidrin. Derivatizacija arginin ostataka zahteva da se reakcija izvede u alkalnim uslovima zbog visoke pKa funkcionalne grupe guanidina. Osim toga, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina kao i sa arginin epsilon-amino grupom.
[0132] Može se napraviti specifična modifikacija tirozil ostataka, sa posebnim interesovanjem za introdukovanje spektralnih obeleživača u tirozil ostatke reakcijom sa aromatičnim jedinjenjima diazonijuma ili tetranitrometanom. Najčešće se N-acetilimidizol i tetranitrometan upotrebljavaju za formiranje O-acetil tirozil vrsta i 3-nitro derivata, respektivno. Tirozil ostaci se jodiraju upotrebom 1251 ili 1311 za pripremu obeleženih proteina za upotrebu u radioimunotestu, pri čemu je pogodan postupak hloramina T opisan iznad.
[0133] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) se selektivno modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N-R'), gde su R i R' opciono različite alkil grupe, kao što su 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil) karbodiimid. Osim toga, aspartil i glutamil ostaci se konvertuju u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum jonima.
[0134] Derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima je korisna za umrežavanje antitela na matriks ili površinu nerastvorljivu u vodi za upotrebu u različitim postupcima, pored postupaka opisanih ispod. Uobičajeni agensi koji se upotrebljavaju za umrežavanje uključuju, npr. 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimid estre, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalni imidoestri, uključujući disucinimidil estre kao što su 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalni maleimidi kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Agensi za derivatizaciju kao što je metil-3-[(pazidofenil)ditio]propioimidat stvaraju fotoaktivabilne intermedijere koji su sposobni da formiraju umrežavanja u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivni matriksi nerastvorljivi u vodi kao što su cinomolgusogeni bromidom-aktivirani ugljeni hidrati i reaktivni supstrati opisani u S.A.D. pat. br.3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4.330.440, koriste se za imobilizaciju proteina.
[0135] Glutaminil i asparaginil ostaci se često deamidiraju u odgovarajuće glutamil i aspartil ostatke, respektivno. Alternativno, ovi ostaci se deamidiraju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada unutar obima ovog pronalaska.
[0136] Druge modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina, i histidinskih bočnih lanaca (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]), acetilaciju N-terminalnog amina, i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.
[0137] Pored toga, kao što će ceniti oni iskusni u struci, obeleživači (uključujući fluorescentne, enzimske, magnetne, radioaktivne, itd.) se mogu dodati antitelima (kao i drugim kompozicijama iz pronalaska).
Bispecifični molekuli
[0138] U sledeđem aspektu, predmetni pronalazak predstavlja bispecifične molekule koji sadrže anti-LY75 antitelo, ili njegov fragment, iz pronalaska. Antitelo iz pronalaska, ili njegovi antigen-vezujući delovi, mogu se derivatizovati ili povezati sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom (npr. drugo antitelo ili ligand za receptor) da generišu bispecifični molekul koji se vezuje za najmanje dva različita vezujuća mesta ili ciljna molekula. Antitelo iz pronalaska može se u stvari derivatizovati ili povezati sa više od jednog drugog funkcionalnog molekula kako bi se generisali multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita vezujuća mesta i/ili ciljna molekula; takvi multispecifični molekuli su takođe namenjeni da budu obuhvaćeni terminom "bispecifični molekul" kao što se ovde upotrebljava. Kako bi se stvorio bispecifični molekul iz pronalaska, antitelo iz pronalaska može biti funkcionalno povezano (npr. hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što su drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, tako da rezultuje bispecifični molekul.
[0139] U skladu s tim, predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za prvi ciljni epitop (tj., LY75) i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop. Drugi ciljni epitop može biti prisutan na istom ciljnom proteinu kao onaj vezan od strane prve specifičnosti vezivanja; ili drugi ciljni epitop može biti prisutan na različitom ciljnom proteinu od onog koji je vezan od strane prvog proteina od onog koji je vezan od strane prve specifičnosti vezivanja. Drugi ciljni epitop može biti prisutan na istoj ćeliji kao i prvi ciljni epitop (tj., LY75); ili drugi ciljni epitop može biti prisutan na cilju koji nije prikazan od strane ćelije koja prikazuje prvi ciljni epitop. Kao što se ovde upotrebljava, termin "specifičnost vezivanja" označava ostatak koji sadrži najmanje jedan varijabilni domen antitela.
[0140] U jednom primeru izvođenja pronalaska, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr. humani FcγRI (CD64) ili humani Fcα receptor (CD89). Prema tome, pronalazak uključuje bispecifične molekule sposobne da se vezuju i za efektorske ćelije koje eksprimiraju FcγR ili FcαR (npr. monocite, makrofage ili polimorfonuklearne ćelije (PMN)), i za ciljne ćelije koje eksprimiraju LY75. Ovi bispecifični molekuli usmeravaju ćelije koje eksprimiraju LY75 do efektorske ćelije i pokreću aktivnosti efektorskih ćelija posredovane Fc receptorom, kao što su fagocitoza ćelija koje eksprimiraju LY75, ćelijski-posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), oslobađanje citokina, ili generisanje superoksidnog anjona.
[0141] U sledećem primeru izvođenja pronalaska, drugi ciljni epitop je CD3 ili CD5. Prema tome, pronalazak uključuje bispecifične molekule sposobne da se vezuju i za efektorske ćelije koje eksprimiraju CD3 ili CD5 (npr. citotoksične T ćelije koje eksprimiraju CD3 ili CD5), i za ciljne ćelije koje eksprimiraju LY75. Ovi bispecifični molekuli usmeravaju ćelije koje eksprimiraju LY75 do efektorske ćelije i pokreću aktivnosti efektorskih ćelija posredovane CD3 ili CD5, kao što je klonska ekspanzija T ćelija i T ćelijska citotoksičnost. U ovom primeru izvođenja, bispecifično antitelo iz pronalaska može imati ukupno bilo dva ili tri varijabilna domena antitela, pri čemu je prvi deo bispecifičnog antitela sposoban da regrutuje aktivnost humane imunske efektorske ćelije specifičnim vezivanjem za efektorski antigen lociran na humanoj imunskoj efektorskoj ćeliji, u kojoj je efektorski antigen humani CD3 antigen ili humani CD5 antigen, navedeni prvi deo se sastoji od jednog varijabilnog domena antitela, i drugi deo bispecifičnog antitela je sposoban za specifično vezivanje za ciljni antigen drugi nego efektorski antigen, npr. LY75, navedeni ciljni antigen se nalazi na ciljnoj ćeliji drugoj nego navedenoj humanoj imunskoj efektorskoj ćeliji, i navedeni drugi deo sadrži jedan ili dva varijabilna domena antitela.
[0142] U jednom primeru izvođenja pronalaska u kome je bispecifični molekul multispecifičan, molekul može dodatno da uključuje i treću specifičnost vezivanja, pored anti-Fc specifičnosti vezivanja ili anti-CD3 ili anti-CD5 specifičnosti vezivanja i anti-LY75 specifičnosti vezivanja. U jednom primeru izvođenja, treća specifičnost vezivanja je deo faktora anti-pojačavanja (EF), npr. molekul koji se vezuje za površinski protein uključen u citotoksičnu aktivnost i time povećava imunski odgovor prema ciljnoj ćeliji. "Deo faktora anti-pojačavanja" može biti antitelo, fragment funkcionalnog antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr. antigen ili receptor, i time rezultira pojačavanjem efekta vezujućih determinanti za Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. "Deo faktora anti-pojačavanja" može da vezuje Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. Alternativno, deo faktora anti-pojačavanja može se vezati za entitet koji je različit od entiteta za koji se vezuju prva i druga specifičnost vezivanja. Na primer, deo faktora anti-pojačavanja može da vezuje citotoksičnu T-ćeliju (npr. putem CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili druge imunske ćelije što rezultira povećanim imunskim odgovorom prema ciljnoj ćeliji).
[0143] U jednom primeru izvođenja, bispecifični molekuli iz pronalaska sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo, ili njegov fragment, uključujući, npr. Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fd, dAb ili jednolančani Fv. Antitelo može takođe biti dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili bilo kog njegovog minimalnog fragmenta, kao što je Fv ili jednolančani konstrukt, kao što je opisano u S.A.D. patentu br.4,946,778.
[0144] U jednom primeru izvođenja, specifičnost vezivanja za Fcγ receptor je obezbeđena monoklonalnim antitelom, čije vezivanje nije blokirano humanim imunoglobulinom G (IgG). Kao što se ovde upotrebljava, termin "IgG receptor" označava bilo koji od osam gena γ-lanca koji se nalaze na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih ili solubilnih izoformi receptora koji su grupisani u tri klase Fcγ receptora: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), i FcγRIII (CD16). U jednom poželjnom primeru izvođenja, Fcγ receptor je humani FcγRI sa visokim afinitetom. Humani FcγRI je molekul od 72 kDa, koji pokazuje visok afinitet za monomerni IgG (108-109 M-1).
[0145] Proizvodnja i karakterizacija određenih poželjnih anti-Fcγ monoklonalnih antitela su opisani u PCT publikaciji WO 88/00052 i u S.A.D. patentu br. 4,954,617. Ova antitela se vezuju za epitop FcγRI, FcγRII ili FcγRIII na mestu koje se razlikuje od mesta vezivanja Fcγ receptora i, stoga, njihovo vezivanje nije u značajnoj meri blokirano fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-FcγRI antitela korisna u ovom pronalasku su mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. Hibridom koji proizvodi mAb 32 dostupan je iz Američke zbirke tipova kultura, ATCC pristupni br. HB9469. U drugim primerima izvođenja, anti-Fcγ receptor antitelo je humanizovani oblik monoklonalnog antitela 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela opisana je u Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 i PCT publikaciji WO 94/10332. Ćelijska linija koja proizvodi H22 antitela deponovana je u Američkoj zbirci tipova kultura pod oznakom HA022CL1 i ima pristupni br. CRL 11177.
[0146] U još nekim poželjnim primerima izvođenja, specifičnost vezivanja za Fc receptor obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani IgA receptor, npr. Fc-alfa receptor [FcαRI (CD89)], čije vezivanje poželjno nije blokirano humanim imunoglobulinom A (IgA). Termin "IgA receptor" je namenjen da uključi genski proizvod jednog α-gena (FcαRI) koji se nalazi na hromozomu 19. Poznato je da ovaj gen kodira nekoliko alternativno splajsovanih transmembranskih izoformi od 55 do 110 kDa. FcαRI (CD89) se konstitutivno eksprimira na monocitima/makrofagima, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne i na populacijama neefektorskih ćelija. FcαRI ima srednji afinitet (≈ 5 x 10<7>M<-1>) i za IgA1 i za IgA2, koji se povećava nakon izlaganja citokinima kao što su G-CSF ili GM-CSF [Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. Opisana su četiri monoklonalna antitela specifična za FcαRI, identifikovana kao A3, A59, A62 i A77, koja vezuju FcαRI izvan ligand vezujućeg domena IgA [Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764].
[0147] FcαRI i FcγRI su poželjni okidač receptori za upotrebu u bispecifičnim molekulima iz pronalaska, pošto su (1) eksprimirani prvenstveno na imunskim efektorskim ćelijama, npr. monocitima, PMN, makrofagima i dendritskim ćelijama; (2) eksprimirani u visokim nivoima (npr. 5.000-100.000 po ćeliji); (3) posrednici citotoksičnih aktivnosti (npr. ADCC, fagocitoza); i (4) posreduju u pojačanoj antigenskoj prezentaciji antigena, uključujući samoantigene, koji su usmereni na njih.
[0148] Antitela koja se mogu koristiti u bispecifičnim molekulima iz pronalaska su murinska, humana, himerna i humanizovana monoklonalna antitela.
[0149] Bispecifični molekuli iz predmetnog pronalaska mogu se pripremiti konjugacijom konstituenatnih specifičnosti vezivanja, npr. specifičnosti vezivanja anti-FcR, anti-CD3, anti-CD5 i anti-LY75, upotrebom postupaka poznatih u struci. Na primer, specifičnost vezivanja svakog bispecifičnog molekula može se generisati odvojeno i zatim konjugovati jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu se upotrebljavati različiti agensi za kuplovanje ili umrežavanje. Primeri agenasa za umrežavanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoevu kiselinu) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) [videti npr. Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med.
160: 1686; Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648]. Drugi postupci uključuju one opisane u Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., (1985) Science 229: 81-83, i Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139:2367-2375. Poželjni
4
agensi za konjugaciju su SATA i sulfo-SMCC, oba dostupna od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)].
[0150] Kada su specifičnosti vezivanja antitela, mogu se konjugovati putem sulfhidrilnog vezivanja zglobnih regiona C-terminusa dva teška lanca. U posebno poželjnom primeru izvođenja, zglobni region je modifikovan da sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, poželjno jedan, pre konjugacije.
[0151] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu se kodirati u istom vektoru i eksprimirati i asemblirati u istoj ćeliji domaćina. Ovaj postupak je posebno koristan kada je bispecifični molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifični molekul iz pronalaska može biti jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i vezujuću determinantu, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve vezujuće determinante. Bispecifični molekuli mogu sadržati najmanje dva jednolančana molekula. Postupci za pripremu bispecifičnih molekula opisani su, na primer, u S.A.D. patentima brojevi 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; i 5,482,858.
[0152] Antitela iz pronalaska mogu biti Bi-specifični T-ćelijski engejdžeri (BiTE). BiTE su klasa veštačkih bispecifičnih monoklonalnih antitela. Oni usmeravaju imunski sistem domaćina, tačnije citotoksičnu aktivnost T ćelija, protiv ćelija kancera. BiTE su generalno fuzioini proteini koji se sastoje od dva jednolančana varijabilna fragmenta (scFvs) od različitih antitela, ili amino-kiselinskih sekvenci iz četiri različita gena, na jednom peptidnom lancu, poželjno od oko 55 kilodaltona. Poželjno, jedan od scFv se vezuje za T ćelije putem CD3 receptora, i drugi za tumorsku ćeliju putem molekula specifičnog za tumor.
[0153] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može se potvrditi, na primer, enzimski povezanim imunosorbent testom (ELISA), radioimunotestom (RIA), FACS analizom, biotestom (npr. inhibicija rasta), ili Western blot testom. Svaki od ovih testova generalno detektuje prisustvo protein-antitelo kompleksa od posebnog interesa korišćenjem obeleženog reagensa (npr. antitela) specifičnog za kompleks od interesa. Na primer, FcR-antitela kompleksi mogu se detektovati upotrebom npr. enzimski povezanog antitela ili fragmenta antitela koji prepoznaju i specifično se vezuju za antitelo-FcR komplekse. Alternativno, kompleksi se mogu detektovati upotrebom bilo kog od niza drugih imunotestova. Na primer, antitelo može biti radioaktivno obeleženo i upotrebljeno u radioimunotestu (RIA) (videti, na primer, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, mart, 1986). Radioaktivni izotop se može detektovati takvim načinima kao što su upotreba γ brojača ili scintilacionog brojača ili autoradiografijom.
Glikozilacija
[0154] Sledeći tip kovalentne modifikacije su izmene u glikozilaciji. U nekim primerima izvođenja, ovde objavljena antitela se mogu modifikovati tako da uključuju jednu ili više projektovanih glikoformi. Pod "projektovanom glikoformom", kao što se ovde upotrebljava, misli se na kompoziciju ugljenih hidrata koja je kovalentno prikačena za antitelo, pri čemu se kompozicija ugljenih hidrata hemijski razlikuje od one roditeljskog antitela. Projektovane glikoforme mogu biti korisne u različite svrhe, uključujući, ali ne ograničavajući se na pojačavanje ili smanjivanje efektorske funkcije. Na primer, može se napraviti aglikolizovano antitelo (tj., antitelo kojem nedostaje glikozilacija). Glikozilacija se može izmeniti tako da, na primer, poveća afinitet antitela za antigen. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu se postići, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može se izvršiti jedna ili više amino-kiselinskih supstitucija koje rezultiraju uklanjanjem jednog ili više mesta glikozilacije u regionu okvira varijabilnog regiona, čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela za antigen. Takav pristup je detaljnije opisan u S.A.D. patentima br. 5,714,350 i 6,350,861 od strane Co et al., i može se postići uklanjanjem asparagina na poziciji 297.
[0155] Poželjan oblik projektovane glikoforme je afukozilacija, za koju je pokazano da je korelisana sa povećanjem ADCC funkcije, verovatno kroz čvršće vezivanje za FcγRIIIa receptor. U ovom kontekstu, "afukozilacija" znači da je većina antitela proizvedenih u ćelijama domaćina suštinski lišena fukoze, npr. 90-95-98% generisanih antitela nema primetnu fukozu kao komponentu ostatka ugljenih hidrata antitela (generalno prikačenu na N297 u Fc regionu). Funkcionalno definisana, afukozilovana antitela generalno pokazuju najmanje 50% ili viši afinitet za FcγRIIIa receptor.
[0156] Projektovane glikoforme se mogu generisati različitim postupcima poznatim u struci (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1; (POTELLIGENT® technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb® glycosylation engineering technology [Glycart Biotechnology AG, Zürich, Switzerland]]). Mnoge od ovih tehnika su zasnovane na kontroli nivoa fukozilovanih i/ili bisektujućih oligosaharida koji su kovalentno prikačeni za Fc region, na primer ekspresijom IgG u različitim organizmima ili ćelijskim linijama, projektovanim ili drugim (na primer Lec-13 CHO ćelije ili YB2/0 ćelije hibridoma pacova), regulisanjem enzima uključenih u put glikozilacije (na primer FUT8 [α1,6-fukoziltranseraza] i/ili β1-4-N-acetilglukozaminil-transferaza III [GnTIII]), ili modifikovanjem jednog ili više ugljenih hidrata pošto je IgG eksprimiran. Na primer, "šećer projektovano antitelo" ili "SEA tehnologija" od Seattle Genetics funkcioniše dodavanjem modifikovanih saharida koji inhibiraju fukozilaciju tokom proizvodnje; videti na primer US2009/0317869. "Projektovana glikoforma" tipično označava različite ugljene hidrate ili oligosaharide u poređenju sa antitelom napravljenim u odsustvu tehnologije glikozilacije; stoga, antitelo može da uključuje projektovanu glikoformu.
[0157] Alternativno, projektovana glikoforma može označavati IgG varijantu koja sadrži različite ugljene hidrate ili oligosaharide. Kao što je poznato u struci, obrasci glikozilacije mogu zavisiti i od sekvence proteina (npr. od prisustva ili odsustva određenih aminokiselinskih ostataka glikozilacije, o kojima se govori u nastavku), ili od ćelije domaćina ili organizma u kom se protein proizvodi. U nastavku se govori o određenim ekspresionim sistemima.
[0158] Glikozilacija polipeptida je tipično ili povezana sa N ili povezana sa O. Povezana sa N označava prikačinjanje ostatka ugljenih hidrata za bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja amino-kiselina, izuzev prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko prikačinjanje ostatka ugljenih hidrata za bočni lanac asparagina. Stoga, prisustvo bilo koje od ovih tri-peptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. Glikozilacija povezana sa O označava prikačinjanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze, za hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se takođe mogu upotrebljavati 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.
[0159] Dodavanje mesta glikozilacije antitelu se pogodno postiže izmenom amino-kiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više gore opisanih tri-peptidnih sekvenci (za mesta glikozilacije povezana sa N). Izmena se takođe može izvršiti adicijom, ili supstitucijom jednog ili više ostataka serina ili treonina u početnoj sekvenci (za mesta glikozilacije povezana sa O). Zarad jednostavnosti, amino-kiselinska sekvenca antitela se poželjno menja kroz promene na DNK nivou, posebno mutiranjem DNK koja kodira ciljni polipeptid na prethodno odabranim bazama tako da se generišu kodoni koji će se translatirati u željene amino-kiseline.
4
[0160] Drugi načini za povećanje broja ostataka ugljenih hidrata na antitelu je hemijsko ili enzimsko kuplovanje glikozida za protein. Ove procedure su povoljne po tome što ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za glikozilaciju povezanu sa N i O. U zavisnosti od upotrebljenog načina kuplovanja, šećer(i) mogu biti prikačeni za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su one kod cisteina, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su one kod serina, treonina, ili hidroksiprolina, (e) aromatične ostatake kao što su oni kod fenilalanina, tirozina, ili triptofana, ili (f) amidne grupe kod glutamina. Ovi postupci su opisani u WO 87/05330 i u Aplin i Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306.
[0161] Uklanjanje ostataka ugljenih hidrata prisutnih na početnom antitelu (npr. posttranslaciono) može se postići hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonske kiseline. Ovaj tretman rezultuje isecanjem većine ili svih šećera, izuzev vezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), dok polipeptid ostaje intaktan. Hemijsku deglikozilaciju su opisali Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i Edge et al., 1981, Anal. Biochem.
118:131. Enzimsko isecanje ostataka ugljenih hidrata na polipeptidima može se postići upotrebom različitih endo- i egzoglikozidaza kao što su opisali Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350, uključujući uklanjanje ostataka fukoze upotrebom enzima fukozidaze kao što je poznato u struci. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunikamicin kao što su opisali Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem.
257:3105. Tunikamicin blokira formiranje protein-N-glikozidnih veza.
[0162] Sledeći tip kovalentne modifikacije antitela sadrži povezivanje antitela sa različitim neproteinskim polimerima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, različite poliole kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na načine iznete u, na primer, 2005-2006 PEG Catalog od Nektar Therapeutics (dostupan na veb prezentaciji Nektar) S.A.D. patentima 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Pored toga, kao što je poznato u struci, amino-kiselinske supstitucije se mogu izvršiti na različitim pozicijama unutar antitela kako bi se olakšalo dodavanje polimera kao što je PEG. Videti, na primer, S.A.D. publikaciju br.2005/0114037A1.
[0163] U dopunskim primerima izvođenja, na primer u upotrebi antitela iz pronalaska u dijagnostičke ili detekcione svrhe, antitela mogu sadržati obeleživač. Pod "obeleženim" ovde se misli da jedinjenje ima najmanje jedan prikačen element, izotop ili hemijsko jedinjenje kako bi se omogućila detekcija jedinjenja. Generalno, obeleživači spadaju u tri klase: a) izotopske obeleživače, koji mogu biti radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetne, električne, termičke; i c) obojene ili luminescentne boje; mada obeleživači takođe uključuju enzime i čestice kao što su magnetne čestice. Poželjni obeleživači uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescentne lantanidne komplekse (uključujući one od evropijuma i terbijuma), i fluorescentne obeleživače uključujući, ali bez ograničavanja na, kvantne tačke, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarine, piren, malahit zelenu, stilben, lucifer žutu, kaskada plavu, teksas crvenu, Alexa boje, Cy boje, i druge opisane u šestom izdanju Molecular Probes Handbook autora Richard P. Haugland.
Antitelo-lek konjugati
[0164] U nekim primerima izvođenja, anti-LY75 antitela iz pronalaska su konjugovana sa lekovima da bi se formirali antitelo-lek konjugati (ADC). Generalno, ADC se upotrebljavaju u onkološkim primenama, gde upotreba antitelo-lek konjugata za lokalnu isporuku citotoksičnih ili citostatskih agenasa omogućava ciljanu isporuku ostatka leka tumorima, što može omogućiti višu efikasnost, nižu toksičnost, itd. Pregled ove tehnologije je obezbeđen u Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14(3):154 (2008) i Senter, Current Opin. Chem. Biol.13:235-244 (2009).
[0165] Stoga pronalazak obezbeđuje anti-LY75 antitela konjugovana za lekove. Generalno, konjugacija se vrši kovalentnim prikačinjanjem za antitelo, kao što je dodatno opisano ispod, i uglavnom se oslanja na linker, često peptidnu vezu (koja, kao što je opisano ispod, može biti dizajnirana da bude osetljiva na isecanje proteazama na ciljnom mestu ili ne). Pored toga, kao što je opisano iznad, povezivanje jedinice linker-lek (LU-D) može se izvršiti prikačinjanjem za cisteine unutar antitela. Kao što će ceniti oni iskusni u struci, broj ostataka leka po antitelu se može promeniti, u zavisnosti od uslova reakcije, i može varirati od 1:1 do 10:1 lek:antitelo. Kao što će ceniti oni iskusni u struci, stvarni broj je prosek.
[0166] Stoga pronalazak obezbeđuje anti-LY75 antitela konjugovana za lekove. Kao što je opisano ispod, lek ADC može biti bilo koji broj agenasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na citotoksične agense, kao što su hemioterapijski agensi, agensi koji inhibiraju rast, toksini (na primer, enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (odnosno radiokonjugat) su obezbeđeni. U drugim primerima izvođenja, pronalazak dodatno obezbeđuje postupke upotrebe ADC.
[0167] Lekovi za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju citotoksične lekove, posebno one koji se upotrebljavaju za terapiju kancera. Takvi lekovi generalno uključuju agense koji oštećuju DNK, anti-metabolite, prirodne proizvode i njihove analoge. Primeri klasa
4
citotoksičnih agenasa uključuju inhibitore enzima kao što su inhibitori dihidrofolat reduktaze, i inhibitori timidilat sintaze, DNK interkalatore, DNK isecače, inhibitore topoizomeraze, porodicu antraciklin lekova, vinka lekove, mitomicine, bleomicine, citotoksične nukleozide, porodicu pteridin lekova, dijene, podofilotoksine, dolastatine, majtansinoide, inducere diferencijacije, i taksole.
[0168] Članovi ovih klasa uključuju, na primer, taksol, metotreksat, metopterin, dihlorometotreksat, 5-fluorouracil, 6-merkaptopurin, citozin arabinozid, melfalan, leurozin, leurozidein, aktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, mitomicin C, mitomicin A, kaminomicin, aminopterin, talisomicin, podofilotoksin i derivate podofilotoksina kao što su etopozid ili etopozid fosfat, vinblastin, vinkristin, vindesin, taksane uključujući taksol, taksoter retinoinsku kiselinu, buternu kiselinu, N8-acetil spermidin, kamptotecin, kaliheamicin, esperamicin, en-dijane, duokarmicin A, duokarmicin SA, kaliheamicin, kamptotecin, hemiasterline, majtansinoide (uključujući DM1), monometilauristatin E (MMAE), monometilauristatin F (MMAF), i majtansinoide (DM4) i njihove analoge.
[0169] Toksini se mogu upotrebljavati kao antitelo-toksin konjugati i uključuju bakterijske toksine kao što je toksin difterije, biljne toksine kao što je ricin, toksine malih molekula kao što je geldanamicin (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), majtansinoide (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), i kaliheamicin (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res.53:3336-3342), hemiasterline (WO2004/026293; Zask et al., (2004) J. Med. Chem, 47:4774-4786). Toksini mogu da ispolje svoje citotoksične i citostatske efekte mehanizmima koji uključuju tubulin vezivanje, DNK vezivanje, ili inhibiciju topoizomeraze.
[0170] Takođe se mogu upotrebljavati konjugati anti-LY75 antitela i jedan ili više toksina malih molekula, kao što su majtansinoidi, dolastatini, auristatini, trihotecen, kaliheamicin, i CC1065, i derivati ovih toksina koji imaju aktivnost toksina.
Majtansinoidi
[0171] Jedinjenja majtansina pogodna za upotrebu kao majtansinoid lek ostaci dobro su poznata u struci, i mogu se izolovati iz prirodnih izvora u skladu sa poznatim postupcima, proizvesti upotrebom tehnika genetičkog inženjeringa (videti Yu et al., (2002) PNAS 99:7968-7973), ili majtansinola i analoga majtansinola pripremljenih sintetički u skladu sa
4
poznatim postupcima. Kao što je opisano ispod, lekovi se mogu modifikovati inkorporacijom funkcionalno aktivne grupe kao što je tiol ili amino grupa za konjugaciju za antitelo.
[0172] Primeri majtansinoid lek ostataka uključuju one koji imaju modifikovani aromatični prsten, kao što su: C-19-dehloro (S.A.D. patent br. 4,256,746) (pripremljen litijum aluminijum hidrid redukcijom ansamitocina P2); C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /-C-19-dehloro (S.A.D. patenti br. 4,361,650 i 4,307,016) (pripremljen demetilacijom upotrebom Streptomyces ili Actinomyces ili dehlorinacijom upotrebom LAH); i C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (-OCOR), /-dehloro (S.A.D. patent br. 4,294,757) (pripremljen acilacijom upotrebom acil hlorida) i one koji imaju modifikacije na drugim pozicijama.
[0173] Primeri majtansinoid lek ostataka takođe uključuju one koji imaju modifikacije kao što su: C-9-SH (S.A.D. patent br. 4,424,219) (pripremljen reakcijom majtansinola sa H2S ili P2S5); C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (S.A.D. patent br. 4,331,598); C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH ili CH2OAc) (S.A.D. patent br. 4,450,254) (pripremljen od Nocardia); C-15-hidroksi/aciloksi (S.A.D. patent br. 4,364,866) (pripremljen konverzijom majtansinola pomoću Streptomyces); C-15-metoksi (S.A.D. patenti br.
4,313,946 i 4,315,929) (izolovan iz Trewia nudiflora); C-18-N-demetil (S.A.D. patenti br.
4,362,663 i 4,322,348) (pripremljen demetilacijom majtansinola pomoću Streptomyces); i 4,5-dezoksi (S.A.D. patent br. 4,371,533) (pripremljen titan trihlorid/LAH redukcijom majtansinola).
[0174] Od posebne koristi su DM1 (objavljen u S.A.D. patentu br. 5,208,020) i DM4 (objavljen u S.A.D. patentu br. 7,276,497). Videti takođe niz dopunskih derivata majtansinoida i postupke u 5,416,064, WO/01/24763, 7,303,749, 7,601,354, USSN 12/631,508, WO02/098883, 6,441,163, 7,368,565, WO02/16368 i WO04/1033272.
[0175] ADC koji sadrže majtansinoide, postupci za izradu istih, i njihova terapijska upotreba objavljeni su, na primer, u S.A.D. patentima br.5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 i evropskom patentu EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) opisali su ADC koji sadrže majtansinoid označen DM1 povezan sa monoklonalnim antitelom C242 usmerenim protiv humanog kolorektalnog kancera. Pronađeno je da je konjugat visoko citotoksičan prema kultivisanim ćelijama kancera kolona, i pokazao je antitumorsku aktivnost u in vivo testu rasta tumora.
[0176] Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) opisuju ADC u kojima je majtansinoid konjugovan putem disulfidnog linkera za murinsko antitelo A7 koje se vezuje za antigen na ćelijskim linijama humanog kancera kolona, ili za drugo murinsko monoklonalno antitelo TA.1 koje vezuje HER-2/neu onkogen. Citotoksičnost TA.1-majtansonoid konjugata
4
testirana je in vitro na ćelijskoj liniji humanog kancera dojke SK-BR-3, koja eksprimira 3x105 HER-2 površinskih antigena po ćeliji. Lek konjugat je postigao stepen citotoksičnosti sličan slobodnom majtansinoid leku, koji bi mogao da se poveća povećanjem broja molekula majtansinoida po molekulu antitela. A7-majtansinoid konjugat je pokazao nisku sistemsku citotoksičnost kod miševa.
Auristatini i dolastatini
[0177] U nekim primerima izvođenja, ADC sadrži anti-LY75 antitelo konjugovano za dolastatine ili peptidne analoge i derivate dolastatina, auristatine (S.A.D. patenti br.
5,635,483; 5,780,588). Pokazalo se da dolastatini i auristatini ometaju dinamiku mikrotubula, hidrolizu GTP, i nukleusnu i ćelijsku deobu (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) i imaju antikancersku (S.A.D. patent br. 5,663,149) i antifungalnu aktivnost (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Dolastatin ili auristatin lek ostatak može biti prikačen za antitelo preko N (amino) terminusa ili C (karboksi) terminusa ostatka peptidnog leka (WO 02/088172).
[0178] Ilustrativni primeri izvođenja auristatina uključuju N-terminus povezane monometilauristatin lek ostatke DE i DF, objavljene u "Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Apstrakt broj 623, predstavljen 28. marta 2004. i opisan u publikaciji patenata Sjedinjenih Država br.2005/0238648.
[0179] Ilustrativni primeri izvođenja auristatina je MMAE (pokazan na Slici 10, pri čemu talasasta linija označava kovalentno prikačinjanje za linker (L) antitelo lek konjugata; videti S.A.D. patent br.6,884,869).
[0180] Sledeći ilustrativni primer izvođenja auristatina je MMAF, pokazan na Slici 10, pri čemu talasasta linija označava kovalentno prikačinjanje za linker (L) antitelo lek konjugata (US 2005/0238649, 5,767,237 i 6,124,431):
Dopunski ilustrativni primeri izvođenja koji sadrže MMAE ili MMAF i različite komponente linkera (ovde dodatno opisane) imaju sledeće strukture i skraćenice (pri čemu Ab znači antitelo, i p je 1 do oko 8):
Tipično, lek ostaci na bazi peptida mogu se pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više amino-kiselina i/ili fragmenata peptida. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, u skladu sa postupkom sinteze tečne faze (videti E. Schroder i K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press) koji je dobro poznat u polju hemije peptida. Auristatin/dolastatin lek ostaci mogu se pripremiti u skladu sa postupcima iz: S.A.D.
4
patent br. 5,635,483; S.A.D. patent br. 5,780,588; Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc.
111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; i Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784.
Kaliheamicin
[0181] U drugim primerima izvođenja, ADC sadrži antitelo iz pronalaska konjugovano za jedan ili više molekula kaliheamicina. Na primer, Mylotarg je prvi komercijalni ADC lek i koristi kaliheamicin γ1 kao korisni teret (videti S.A.D. patent br. 4,970,198). Dopunski derivati kaliheamicina opisani su u S.A.D. patentima br. 5,264,586, 5,384,412, 5,550,246, 5,739,116, 5,773,001, 5,767,285 i 5,877,296. Porodica kaliheamicin antibiotika je sposobna da proizvede dvolančane prekide DNK u sub-pikomolarnim koncentracijama. Za pripremu konjugata iz kaliheamicin porodice, videti S.A.D. patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (svi za American Cyanamid Company). Strukturni analozi kaliheamicina koji se mogu upotrebljavati uključuju, ali nisu ograničeni na, γ1I, α2I, α2I, N-acetil- γ1I, PSAG i θI1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) i prethodno pomenuti S.A.D. patenti za American Cyanamid). Sledeći antitumorski lek za koji antitelo može biti konjugovano je QFA koji je antifolat. I kaliheamicin i QFA imaju unutarćelijska mesta delovanja i ne prelaze lako kroz ćelijsku membranu. Prema tome, ćelijski unos ovih agenasa internalizacijom posredovanom antitelom u velikoj meri poboljšava njihove citotoksične efekte.
Duokarmicini
[0182] CC-1065 (videti 4,169,888) i duokarmicini su članovi porodice antitumorskih antibiotika koji se koriste u ADC. Čini se da ovi antibiotici rade preko sekventno selektivne alkilacije DNK na N3 adenina u manjem žlebu, što inicira kaskadu događaja koji rezultiraju apoptozom.
[0183] Važni članovi duokarmicina uključuju duokarmicin A (S.A.D. patent br. 4,923,990) i duokarmicin SA (S.A.D. patent br. 5,101,038), i veliki broj analoga kao što je opisano u S.A.D. patentima br. 7,517,903, 7,691,962, 5,101,038; 5,641,780; 5,187,186; 5,070,092; 5,070,092; 5,641,780; 5,101,038; 5,084,468, 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545,
4
WO2007/089149, WO2009/017394A1, 5,703,080, 6,989,452, 7,087,600, 7,129,261, 7,498,302, i 7,507,420.
Pirolobenzodiazepini
[0184] Pirolobenzodiazepini (PBD) (Journal of Medicinal Chemistry 2001, 44, 737-748) su DNK interaktivni agensi sa značajnom citotoksičnošću. Trinaest struktura ove porodice je izolovano,
[0185] uključujući jedinjenja kao što su antramicin, mazetramicin, porotramicin, protrakarcin, sibanomicin, tomaimicin, sibiromicin, hikamicin A, neotramicin A, B, i DC-81 (Medicinal Chemistry and Drug Design, ISBN: 978-953-51-0513-8, Ahmed Kamal et al., DOI: 10.5772/38869). Pripremljeni su i drugi analozi ove porodice i konjugovani su za antitela kao što je opisano u patentima br. WO2011/130598 i WO2011/130616.
Drugi citotoksični agensi
[0186] Drugi antitumorski agensi koji mogu biti konjugovani za antitela iz pronalaska uključuju BCNU, streptozoicin, vinkristin i 5-fluorouracil, porodicu agenasa poznatih kolektivno kao LL-E33288 kompleks opisan u S.A.D. patentima br. 5,053,394, 5,770,710, kao i esperamicine (S.A.D. patent br.5,877,296).
[0187] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu upotrebljavati uključuju lanac A difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac A egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), lanac A ricina, lanac A abrina, lanac A modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor saponaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene. Videti, na primer, WO 93/21232 objavljen 28. oktobra 1993.
[0188] Predmetni pronalazak dodatno razmatra ADC formiran između antitela i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr. ribonukleaza ili DNK endonukleaza kao što je dezoksiribonukleaza; DNaza).
[0189] Za selektivno uništavanje tumora, antitelo može sadržati visoko radioaktivni atom. Dostupni su različitii radioaktivni izotopi za proizvodnju radio-konjugovanih antitela. Primeri uključuju At211, 1131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu.
[0190] Radio- ili drugi obeleživači mogu biti inkorporisani u konjugat na poznate načine. Na primer, peptid se može biosintetisati ili se može sintetisati hemijskom sintezom aminokiselina upotrebom pogodnih prekursora amino-kiselina koji uključuju, na primer, fluor-19 umesto vodonika. Obeleživači kao što su Tc99m ili 1123, Re186, Re188 i In111 se mogu prikačiti putem ostatka cisteina u peptidu. Itrijum-90 se može prikačiti putem ostatka lizina. IODOGEN postupak (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun.80: 49-57 može se upotrebljavati za inkorporisanje joda-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) detaljno opisuje druge postupke.
[0191] Za kompozicije koje sadrže mnoštvo antitela, koncentracija leka je predstavljena sa p, prosečnim brojem molekula leka po antitelu. Koncentracija leka može biti u opsegu od 1 do 20 lekova (D) po antitelu. Prosečan broj lekova po antitelu u pripremi reakcije konjugacije može se okarakterisati konvencionalnim načinima kao što su masena spektroskopija, ELISA test, i HPLC. Kvantitativna distribucija antitelo-lek-konjugata u smislu p takođe može da se odredi.
[0192] U nekim slučajevima, odvajanje, prečišćavanje, i karakterizacija homogenih antitelolek konjugata, gde je p određena vrednost od antitelo-lek-konjugata sa drugim koncentracijama leka može se postići načinima kao što su HPLC reverzne faze ili elektroforeza. U ilustrativnim primerima izvođenja, p je 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 ili njihova frakcija.
[0193] Generisanje jedinjenja antitelo-lek konjugata može se postići bilo kojom tehnikom poznatom stručnjaku. Ukratko, jedinjenja antitelo-lek konjugata mogu da uključuju anti-LY75 antitelo kao jedinicu antitela, lek, i opciono linker koji spaja lek i vezujući agens.
[0194] Dostupno je više različitih reakcija za kovalentno prikačinjanje lekova i/ili linkera za vezujuće agense. Ovo se može postići reakcijom amino-kiselinskih ostataka vezujućeg agensa, na primer, molekula antitela, uključujući amino grupe lizina, grupe slobodnih karboksilnih kiselina glutaminske i asparaginske kiseline, sulfhidrilne grupe cisteina i različite ostatke aromatičnih amino-kiselina. Često upotrebljavani nespecifični postupak kovalentnog prikačinjanja je karbodiimidna reakcija za povezivanje karboksi (ili amino) grupe jedinjenja sa amino (ili karboksi) grupama antitela. Pored toga, bifunkcionalni agensi kao što su dialdehidi ili imidoestri upotrebljeni su za povezivanje amino grupe jedinjenja sa amino grupama molekula antitela.
[0195] Takođe je za prikačinjanje lekova za vezujuće agense dostupna reakcija Šifove (Schiff) baze. Ovaj postupak uključuje perjodatnu oksidaciju leka koji sadrži glikol ili hidroksi grupe, stoga formirajući aldehid koji zatim reaguje sa vezujućim agensom.
1
Prikačinjanje se dešava putem formiranja Šifove baze sa amino grupama vezujućeg agensa. Izotiocijanati se takođe mogu upotrebljavati kao agensi za kuplovanje za kovalentno prikačinjanje lekova za vezujuće agense. Druge tehnike su poznate stručnjaku i unutar su obima predmetnog pronalaska.
[0196] U nekim primerima izvođenja, intermedijer, koji je prekursor linkera, reaguje sa lekom pod odgovarajućim uslovima. U drugim primerima izvođenja, reaktivne grupe se upotrebljavaju na leku i/ili intermedijeru. Proizvod reakcije između leka i intermedijera, ili derivatizovani lek, posle toga reaguje sa anti-LY75 antitelom iz pronalaska pod odgovarajućim uslovima.
[0197] Treba razumeti da se takođe mogu izvršiti hemijske modifikacije željenog jedinjenja kako bi se reakcije tog jedinjenja učinile pogodnijim za svrhe pripreme konjugata iz pronalaska. Na primer funkcionalna grupa npr. amino, hidroksi, ili sulfhidril, mogu se dodati leku na poziciji koja ima minimalan ili prihvatljiv efekat na aktivnost ili druga svojstva leka.
Linker jedinice
[0198] Tipično, jedinjenja antitelo-lek konjugata sadrže linker jedinicu između jedinice leka i jedinice antitela. U nekim primerima izvođenja, linker se može isecati pod unutarćelijskim ili vanćelijskim uslovima, tako da isecanje linkera oslobađa jedinicu leka od antitela u odgovarajuće okruženje. Na primer, čvrsti tumori koji sekretuju određene proteaze mogu poslužiti kao cilj linkera koji se može isecati; u drugim primerima izvođenja, koriste se unutarćelijske proteaze. U još nekim primerima izvođenja, linker jedinica se ne može isecati i lek se oslobađa, na primer, razgradnjom antitela u lizozomima.
[0199] U nekim primerima izvođenja, linker se može isecati agensom za isecanje koji je prisutan u unutarćelijskom okruženju (na primer, unutar lizozoma ili endozoma ili kaveola). Linker može biti, na primer, peptidil linker koji se iseca unutarćelijskim enzimom peptidazom ili proteazom, uključujući, ali bez ograničavanja na, lizozomsku ili endozomsku proteazu. U nekim primerima izvođenja, peptidil linker je dugačak najmanje dve amino-kiseline ili je dugačak najmanje tri amino-kiseline ili više.
[0200] Agensi za isecanje mogu, bez ograničenja, uključivati katepsine B i D i plazmin, za koje je poznato da hidrolizuju derivate dipeptidnog leka što rezultuje oslobađanjem aktivnog leka unutar ciljnih ćelija (videti, na primer, Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Peptidil linkeri koji se mogu isecati enzimima koji su prisutni u ćelijama koje eksprimiraju LY75. Na primer, može se upotrebljavati peptidil linker koji se može isecati tiol
2
zavisnom proteazom katepsinom B, koja je visoko eksprimirana u kancerskom tkivu (npr. Phe-Leu ili Gly-Phe-Leu-Gly linker (SEQ ID NO: X)). Drugi primeri takvih linkera opisani su, npr. u S.A.D. patentu br.6,214,345.
[0201] U nekim primerima izvođenja, peptidil linker koji se može isecati unutarćelijskom proteazom je Val-Cit linker ili Phe-Lys linker (videti, na primer, S.A.D. patent br.6,214,345, koji opisuje sintezu doksorubicina sa val-cit linkerom).
[0202] U drugim primerima izvođenja, linker koji se može isecati je osetljiv na pH, odnosno, osetljiv na hidrolizu pri određenim pH vrednostima. Tipično, linker osetljiv na pH se hidrolizuje pod kiselim uslovima. Na primer, može se upotrebljavati linker labilan na kiselinu koji se hidrolizuje u lizozomu (na primer, hidrazon, semikarbazon, tiosemikarbazon, cisakonitni amid, ortoestar, acetal, ketal) (videti, npr. S.A.D. patente br. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik i Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Takvi linkeri su relativno stabilni u uslovima neutralnog pH, kao što je onaj u krvi, ali su nestabilni pri pH ispod 5,5 ili 5,0, približnog pH u lizozomima. U određenim primerima izvođenja, linker koji se može hidrolizovati je tioetar linker (kao što je, npr. tioetar prikačen za terapijski agens putem acilhidrazon veze (videti, npr. S.A.D. patent br.
5,622,929).
[0203] U još nekim primerima izvođenja, linker se može isecati pod uslovima redukcije (na primer, disulfidni linker). U struci su poznati različiti disulfidni linkeri, uključujući, na primer, one koji se mogu formirati upotrebom SATA (N-sukcinimidil-5-acetiltioacetat), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) butirat) i SMPT (N-sukcinimidil-oksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)toluen)-, SPDB i SMPT. (Videti, npr. Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., U Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Videti takođe S.A.D. patent br.4,880,935).
[0204] U drugim primerima izvođenja, linker je malonat linker (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), maleimidobenzoil linker (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem.
3(10):1299-1304), ili analog 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).
[0205] U još nekim primerima izvođenja, linker jedinica se ne može isecati i lek se oslobađa razgradnjom antitela. (Videti S.A.D. publikaciju br.2005/0238649).
[0206] U mnogim primerima izvođenja, linker je samoimolativan. Kao što se ovde upotrebljava, termin "samoimolativni spejser" označava bifunkcionalni hemijski ostatak koji je sposoban da kovalentno povezuje dva razmaknuta hemijska ostatka u stabilan tripartitni molekul. Spontano će se odvojiti od drugog hemijskog ostatka ukoliko se njegova veza za prvi ostatak iseče. Videti, na primer, WO 2007/059404A2, WO06/110476A2, WO05/112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 i WO02/083180, koji su usmereni na lek-supstrat koji se može isecati konjugate gde su lek i supstrat koji se može isecati opciono povezani preko samoimolativnog linkera.
[0207] Linker često nije suštinski osetljiv na vanćelijsko okruženje. Kao što se ovde upotrebljava, "nije suštinski osetljiv na vanćelijsko okruženje", u kontekstu linkera, znači da se ne više od oko 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, ili ne više od oko 1% od linkera, u uzorku jedinjenja antitelo-lek konjugata, iseca kada se jedinjenje antitelo-lek konjugata nalazi u vanćelijskom okruženju (na primer, u plazmi).
[0208] Može se odrediti da li linker nije suštinski osetljiv na vanćelijsko okruženje, na primer, inkubiranjem sa plazmom jedinjenja antitelo-lek konjugata tokom unapred određenog vremenskog perioda (na primer, 2, 4, 8, 16 ili 24 sata) i zatim kvantifikovanjem količine slobodnog leka prisutnog u plazmi.
[0209] U drugim, međusobno neisključujućim primerima izvođenja, linker promoviše ćelijsku internalizaciju. U određenim primerima izvođenja, linker promoviše ćelijsku internalizaciju kada je konjugovan sa terapijskim agensom (to jest, u miljeu linker-terapijski agens ostatka jedinjenja antitelo-lek konjugata kao što je ovde opisano). U još nekim primerima izvođenja, linker promoviše ćelijsku internalizaciju kada je konjugovan i sa jedinjenjem auristatina i sa anti-LY75 antitelima iz pronalaska.
[0210] Različiti primeri linkera koji se mogu upotrebljavati sa predmetnim kompozicijama i postupci opisani su u WO 2004/010957, S.A.D. publikaciji br. 2006/0074008, S.A.D. publikaciji br.20050238649, i S.A.D. publikaciji br.2006/0024317.
Koncentracija leka
[0211] Koncentracija leka predstavljena je sa p i predstavlja prosečni broj ostataka leka po antitelu u molekulu. Koncentracija leka ("p") može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više ostataka (D) po antitelu, mada je često prosečan broj frakcija ili decimalni broj. Generalno, koncentracija leka od 1 do 4 je često korisna, i od 1 do 2 je takođe korisna. ADC iz pronalaska uključuju kolekcije antitela konjugovanih sa opsegom ostataka leka, od 1 do 20, na primer 1-15, 1-10, 2-9, 3-8, 4-7, 5-6. Prosečan broj ostataka leka
4
po antitelu u preparatima ADC iz reakcija konjugacije može se okarakterisati konvencionalnim načinima kao što je masena spektroskopija i ELISA test.
[0212] Kvantitativna raspodela ADC u smislu p takođe može da se odredi. U nekim slučajevima, odvajanje, prečišćavanje, i karakterizacija homogenog ADC gde je p određena vrednost od ADC sa drugim koncentracijama leka može se postići načinima kao što je elektroforeza.
[0213] Za neke antitelo-lek konjugate, p može biti ograničen brojem mesta prikačinjanja na antitelu. Na primer, tamo gde je prikačinjanje cistein tiol, kao u ilustrativnim primerima izvođenja iznad, antitelo može imati samo jednu ili nekoliko cistein tiol grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiol grupa preko kojih se linker može prikačiti. U određenim primerima izvođenja, veća koncentracija leka, npr. p>5, može prouzrokovati agregaciju, insolubilnost, toksičnost, ili gubitak ćelijske permeabilnosti određenih antitelo-lek konjugata. U određenim primerima izvođenja, koncentracija leka za ADC iz pronalaska je u opsegu od 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; od oko 3 do oko 5; od oko 3 do oko 4; od oko 3,1 do oko 3,9; od oko 3,2 do oko 3,8; od oko 3,2 do oko 3,7; od oko 3,2 do oko 3,6; od oko 3,3 do oko 3,8; ili od oko 3,3 do oko 3,7. Zaista, pokazalo se da za određene ADC optimalni odnos ostataka leka po antitelu može biti manji od 8, i može biti oko 2 do oko 5. Videti US 2005/0238649 A1.
[0214] U određenim primerima izvođenja, manje od teorijskog maksimuma ostataka leka je konjugovano za antitelo tokom reakcije konjugacije. Antitelo može sadržati, na primer, ostatke lizina koji ne reaguju sa lek-linker intermedijerom ili linker reagensom, kao što se razmatra ispod. Generalno, antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih cistein tiol grupa koje mogu biti povezane sa ostatkom leka; zaista većina cistein tiol ostataka u antitelima postoji kao disulfidni mostovi. U određenim primerima izvođenja, antitelo se može redukovati redukcionim agensom kao što je ditiotreitol (DTT) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), pod delimično ili potpuno redukcionim uslovima, kako bi se generisale reaktivne cistein tiol grupe. U određenim primerima izvođenja, antitelo je podvrgnuto uslovima denaturacije kako bi se otkrile reaktivne nukleofilne grupe kao što su lizin ili cistein.
[0215] Koncentracija (odnos lek/antitelo) ADC se može kontrolisati na različite načine, npr.: (i) ograničavanjem molarnog viška lek-linker intermedijera ili linker reagensa u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanjem vremena ili temperature reakcije konjugacije, (iii) delimični ili ograničavajući reduktivni uslovi za modifikaciju cistein tiola, (iv) projektovanjem aminokiselinske sekvence antitela rekombinantnim tehnikama tako da se broj i pozicija ostataka cisteina modifikuje radi kontrole broja i/ili pozicije linker-lek prikačinjanja (kao što su tioMab ili tioFab pripremljeni kao što se ovde objavljuje i u WO 2006/034488).
[0216] Treba razumeti da tamo gde više od jedne nukleofilne grupe reaguje sa lek-linker intermedijerom ili sa linker reagensom zatim sa reagensom ostatka leka, tada je rezultujući proizvod smeša ADC jedinjenja sa raspodelom jednog ili više ostataka leka prikačenih za antitelo. Prosečan broj lekova po antitelu može se izračunati iz smeše dualnim ELISA testom antitela, koji je specifičan za antitelo i specifičan za lek. Pojedinačni ADC molekuli se mogu identifikovati u smeši masenom spektroskopijom i odvojiti pomoću HPLC, npr. hromatografijom hidrofobnih interakcija.
[0217] U nekim primerima izvođenja, homogeni ADC sa jednom vrednošću koncentracije može se izolovati iz smeše konjugacije elektroforezom ili hromatografijom.
Postupci za određivanje citotoksičnog efekta ADC
[0218] Poznati su postupci određivanja da li lek ili antitelo-lek konjugat pokazuje citostatski i/ili citotoksični efekat na ćeliju. Generalno, citotoksična ili citostatska aktivnost antitelo-lek konjugata može se izmeriti: izlaganjem ćelija sisara koje eksprimiraju ciljni protein antitelolek konjugatu u medijumu ćelijske kulture; kultivisanjem ćelija tokom perioda od oko 6 sati do oko 5 dana; i merenjem vijabilnosti ćelija. In vitro testovi zasnovani na ćelijama mogu biti upotrebljeni za merenje vijabilnosti (proliferacije), citotoksičnosti, i indukcije apoptoze (aktivacija kaspaze) antitelo-lek konjugata.
[0219] Za određivanje da li antitelo-lek konjugat pokazuje citostatski efekat, može se upotrebiti test inkorporacije timidina. Na primer, ćelije kancera koje eksprimiraju ciljni antigen sa gustinom od 5.000 ćelija/bunariću ploče sa 96 bunarića mogu se kultivisati tokom perioda od 72 sata i izložiti prema 0,5 μCi<3>H-timidina tokom poslednjih 8 sati perioda od 72 sata. Inkorporacija<3>H-timidina u ćelije u kulturei meri se u prisustvu i odsustvu antitelo-lek konjugata.
[0220] Za određivanje citotoksičnosti mogu se meriti nekroza ili apoptoza (programirana ćelijska smrt). Nekrozu tipično prati povećana permeabilnost ćelijske membrane; bubrenje ćelije, i pucanje ćelijske membrane. Apoptozu tipično karakterišu pojava mehuranja membrane, kondenzacija citoplazme, i aktiviranje endogenih endonukleaza. Utvrđivanje bilo kog od ovih efekata na ćelije kancera ukazuje na to da je antitelo-lek konjugat koristan u lečenju kancera.
[0221] Vijabilnost ćelija može se meriti određivanjem unosa boje kao što je neutral red, tripan blue, ili ALAMAR™ blue u ćeliju (videti, npr. Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476). U takvom testu, ćelije se inkubiraju u medijumu koji sadrži boju, ćelije se isperu, i preostala boja, koja odražava ćelijski unos boje, se meri spektrofotometrijski. Proteinvezujuća boja sulforodamin B (SRB) takođe se može upotrebljavati za merenje citoksičnosti (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12).
[0222] Alternativno, so tetrazolijuma, kao što je MTT, upotrebljava se u kvantitativnom kolorimetrijskom testu za preživljavanje i proliferaciju ćelija sisara detektovanjem živih, ali ne i mrtvih ćelija (videti, npr. Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55- 63).
[0223] Apoptoza se može kvantifikovati merenjem, na primer, fragmentacije DNK. Dostupni su komercijalni fotometrijski postupci za kvantitativno in vitro utvrđivanje fragmentacije DNK. Primeri takvih testova, uključujući TUNEL (koji detektuje inkorporaciju obeleženih nukleotida u fragmentisanu DNK) i testove zasnovane na ELISA, opisani su u Biochemica, 1999, no.2, pp.34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
[0224] Apoptoza se takođe može odrediti merenjem morfoloških promena u ćeliji. Na primer, kao i kod nekroze, gubitak integriteta ćelijske membrane može se odrediti merenjem unosa određenih boja (npr. fluorescentne boje kao što su, na primer, akridin orange ili etidijum bromid). Postupak za merenje broja apoptotskih ćelija opisali su Duke i Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Ćelije takođe mogu biti obeležene DNK bojom (npr. akridin orange, etidijum bromid, ili propidijum jodid) i uočavaju se ćelije u kojima se primećuje kondenzacija i nakupljanje hromatina duž unutrašnje nukleusne membrane. Druge morfološke promene koje se mogu izmeriti za određivanje apoptoze uključuju, npr. citoplazmatsku kondenzaciju, pojačano mehuranje membrane, i ćelijsko skupljanje.
[0225] Prisustvo apoptotskih ćelija može se izmeriti i u prikačenim i u "plutajućim" kompartmentima kultura. Na primer, oba kompartmenta se mogu sakupljati uklanjanjem supernatanta, tripsinizacijom prikačenih ćelija, kombinovanjem preparata posle koraka ispiranja centrifugiranjem (npr. 10 minuta pri 2000 o/min), i otkrivanjem apoptoze (npr. merenjem fragmentacije DNK). (Videti, npr. Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16).
[0226] In vivo, efekat terapijske kompozicije anti-LY75 antitela iz pronalaska može se proceniti na pogodnom životinjskom modelu. Na primer, mogu se upotrebljavati ksenogeni modeli kancera, pri čemu se eksplantati kancera ili pasažirana ksenograft tkiva introdukuju u imunski kompromitovane životinje, kao što su bezdlaki ili SCID miševi (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Efikasnost se može izmeriti upotrebom testova koji mere inhibiciju formiranja tumora, regresiju tumora ili metastaze.
[0227] Terapijske kompozicije upotrebljene u praksi prethodnih postupaka mogu se formulisati u farmaceutske kompozicije koje sadrže nosač pogodan za željeni postupak isporuke. Pogodni nosači uključuju bilo koji materijal koji u kombinaciji sa terapijskom kompozicijom zadržava antitumorsku funkciju terapijske kompozicije i generalno nije reaktivan sa imunskim sistemom pacijenta. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od brojnih standardnih farmaceutskih nosača, kao što su sterilni fiziološki rastvori puferisani fosfatom, bakteriostatska voda, (videti, generalno, Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, A. Osal., Ed., 1980).
Postupci za proizvodnju antitela iz pronalaska
[0228] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje postupke za proizvodnju objavljenih anti-LY75 antitela. Ovi postupci obuhvataju kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži izolovanu(e) nukleinsku(e) kiselinu(e), koje kodiraju antitela iz pronalaska. Kao što će ceniti oni u struci, ovo se može uraditi na različite načine, u zavisnosti od prirode antitela. U nekim primerima izvođenja, u slučaju kada su antitela iz pronalasku tradicionalna antitela pune dužine, na primer, varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca pod uslovima takvim da se antitelo proizvodi i može se izolovati.
[0229] Ovde se objavljuju varijabilni teški i laki lanci LY75_A1 (i sekvence proteina i sekvence nukleinske kiseline); kao što će biti cenjeno u struci, oni se lako mogu povećati da bi se proizveli teški i laki lanci pune dužine. Odnosno, obezbedivši DNK fragmente koji kodiraju VHi VKsegmente kao što je ovde istaknuto, ovim DNK fragmentima može se dodatno manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer, za konvertovanje gena varijabilnog regiona u gene lanca pune dužine antitela, u gene Fab fragmenata, ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VKili VHje operativno povezan sa drugim DNK fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Termin "operativno povezan", kao što se upotrebljava u ovom kontekstu, je namenjen da znači da su dva DNK fragmenta spojena tako da amino-kiselinske sekvence kodirane sa dva DNK fragmenta ostanu u okviru.
[0230] Izolovana DNK koja kodira VHregion može se konvertovati u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK koja kodira VHsa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena konstantnog regiona teškog lanca murina su poznate u struci [videti npr. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, Ministarstvo zdravlja i socijalne zaštite SAD (US Department of Health and Human Services), NIH publikacija br. 91-3242] i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region, ali je najpoželjnije IgG1 ili IgG4 konstantni region. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VHmože se operativno povezati sa drugim molekulom DNK koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.
[0231] Izolovana DNK koja kodira VL/VKregion može se konvertovati u gen lakog lanca pune dužine (kao i gen lakog lanca Fab) operativnim povezivanjem DNK koja kodira VLsa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona lakog lanca murina su poznate u struci [videti npr. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, Ministarstvo zdravlja i socijalne zaštite SAD, NIH publikacija br. 91-3242] i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. U poželjnim primerima izvođenja, konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.
[0232] Kako bi se kreirao scFv gen, fragmenti DNK koji kodiraju VHi VL/VKoperativno su povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr. koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da se sekvence VHi VL/VKmogu eksprimirati kao susedni jednolančani protein, sa VL/VKi VHregionima spojenim fleksibilnim linkerom [videti npr. Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferti et al., (1990) Nature 348:552-554].
[0233] Generalno, obezbeđene su nukleinske kiseline koje kodiraju antitela iz pronalaska. Takvi polinukleotidi kodiraju i za varijabilne i za konstantne regione svakog od teških i lakih lanaca, iako su i druge kombinacije predviđene predmetnim pronalaskom u skladu sa ovde opisanim kompozicijama. Predmetni pronalazak takođe razmatra fragmente oligonukleotida poreklom od objavljenih polinukleotida i sekvence nukleinskih kiselina komplementarne ovim polinukleotidima.
[0234] Polinukleotidi mogu biti u obliku RNK ili DNK. Polinukleotidi u obliku DNK, cDNK, genomske DNK, analoga nukleinske kiseline, i sintetičke DNK su u obimu predmetnog pronalaska. DNK može biti dvolančana ili jednolančana, i ukoliko je jednolančana, može biti kodirajući (sens) lanac ili nekodirajući (anti-sens) lanac. Kodirajuća sekvenca koja kodira polipeptid može biti identična kodirajućoj sekvenci koja je ovde obezbeđena ili može biti drugačija kodirajuća sekvenca, koja sekvenca, kao rezultat redundantnosti ili degeneracije genetičkog koda, kodira iste polipeptide kao ovde obezbeđena DNK.
[0235] U nekim primerima izvođenja, nukleinska(e) kiselina(e) koje kodiraju antitela iz pronalaska inkorporisane su u ekspresione vektore, koji mogu biti ekstrahromozomski ili dizajnirani da se integrišu u genom ćelije domaćina u koju se introdukuju. Ekspresioni vektori mogu sadržati bilo koji broj prikladnih regulatornih sekvenci (uključujući, ali bez ograničavanja na, transkripcione i translacione kontrolne sekvence, promotore, vezujuća mesta ribozoma, enhansere, oridžin replikacije, itd.) ili druge komponente (selekcioni geni, itd.), i sve su operativno povezane, kao što je dobro poznato u struci. U nekim slučajevima upotrebljavaju su dve nukleinske kiseline i svaka se stavlja u različit ekspresioni vektor (npr. teški lanac u prvi ekspresioni vektor, laki lanac u drugi ekspresioni vektor), ili se alternativno mogu staviti u isti ekspresioni vektor. Iskusni u struci će ceniti da dizajn ekspresionog(ih) vektora, uključujući odabir regulatornih sekvenci može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina, nivo ekspresije željenog proteina, itd.
[0236] Generalno, nukleinske kiseline i/ili ekspresija mogu se introdukovati u pogodnu ćeliju domaćina kako bi se stvorila rekombinantna ćelija domaćina upotrebom bilo kog postupka koji odgovara odabranoj ćeliji domaćina (npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, infekcija), tako da su molekul(i) nukleinske kiseline operativno povezani sa jednim ili više kontrolnih elemenata ekspresije (npr. u vektoru, u konstruktu kreiranom procesima u ćeliji, integrisani u genom ćelije domaćina). Rezultujuća rekombinantna ćelija domaćin može se održavati pod uslovima pogodnim za ekspresiju (npr. u prisustvu inducera, u pogodnoj nehumanoj životinji, u pogodnim medijumima za kulturu suplementovanim odgovarajućim solima, faktorima rasta, antibioticima, nutritivnim suplementima, itd.), pri čemu se proizvode kodirani polipeptid(i). U nekim slučajevima, teški lanci se proizvode u jednoj ćeliji i laki lanac u drugoj.
[0237] Ćelijske linije sisara dostupne kao domaćini za ekspresiju poznate su u struci i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz Američke zbirke tipova kultura (ATCC), Manassas, VA, uključujući, ali bez ograničavanja na ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HEK 293 ćelije, NSO ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2), i brojne druge ćelijske linije. Ćelije ne-sisara, uključujući, ali bez ograničavanja na bakterije, kvasac, insekte, i biljke takođe se mogu upotrebljavati za ekspresiju rekombinantnih antitela. U nekim primerima izvođenja, antitela se mogu proizvesti u transgenim životinjama, kao što su krave ili pilići.
[0238] Opšti postupci za molekularnu biologiju, ekspresiju, prečišćavanje, i pregled antitela su dobro poznati, na primer, videti S.A.D. patente br. 4,816,567, 4,816,397, 6,331,415 i 7,923,221, kao i Antibody Engineering, koji su priredili Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 i 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; i Morrison, S. (1985) Science 229:1202.
Farmaceutske kompozicije
[0239] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jedno ili kombinaciju LY75 antitela, ili njihov antigenvezujući deo(delove), iz predmetnog pronalaska, formulisane zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključuju jedno ili kombinaciju (npr. dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugate ili bispecifične molekule iz pronalaska. Na primer, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može da sadrži kombinaciju antitela (ili imunokonjugata ili bispecifika) koja se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koja imaju komplementarne aktivnosti.
[0240] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska takođe se mogu primenjivati u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovano sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje anti-antitelo iz predmetnog pronalaska kombinovano sa najmanje jednim drugim antitumorskim agensom, ili antiinflamatornim ili imunosupresivnim agensom. Primeri terapijskih agenasa koja se mogu upotrebljavati u kombinovanoj terapiji detaljnije su opisani u nastavku u odeljku o upotrebi antitela iz pronalaska.
[0241] Kao što se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agense za usporavanje apsorpcije, koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno je da je nosač pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta primene, aktivno jedinjenje, tj., antitelo, imunokonjugat, ili bispecifični molekul, može biti obloženo materijalom radi zaštite jedinjenja od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati jedinjenje.
[0242] Farmaceutska jedinjenja iz pronalaska mogu da uključuju jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" označava so koja zadržava željenu biološku aktivnost roditeljskog jedinjenja i ne daje nikakve neželjene toksikološke efekte [videti, npr. Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19]. Primeri takvih soli uključuju kisele
1
adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one dobijene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline. Bazne adicione soli uključuju one poreklom od zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain.
[0243] Farmaceutska kompozicija iz pronalaska takođe može da uključuje farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilisani hidroksianizol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol; i (3) metal helatne agense, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina.
[0244] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol), i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organske estre za injekcije, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.
[0245] Ove kompozicije mogu takođe sadržati adjuvanse kao što su konzervansi, agensi za vlaženje, emulgatori i agensi za dispergovanje. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti i postupcima sterilizacije, supra, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline. Takođe može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid. Pored toga, produžena apsorpcija farmaceutskog oblika za injekcije može biti ostvarena uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin.
[0246] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za iznenadnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzije. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Izuzev u slučaju da je bilo koji uobičajeni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem,
2
razmatra se njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska. Suplementarna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporisati u kompozicije.
[0247] Terapijske kompozicije tipično moraju biti sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol), i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, bilo bi poželjno da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može biti ostvarena uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatin.
[0248] Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih iznad, prema potrebi, posle čega sledi sterilizaciona mikrofiltracija. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne ostale sastojke od onih nabrojanih iznad. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje-zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0249] Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosačem za proizvodnju pojedinačnog doznog oblika variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči i određenog načina primene. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosačem da bi se proizveo pojedinačni dozni oblik generalno će biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat. Generalno, od 100%, ova količina će biti u opsegu od oko 0,01% do oko 99% aktivnog sastojka, poželjno od oko 0,1% do oko 70%, najpoželjnije od oko 1% do oko 30% aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0250] Dozni režimi su prilagođeni kako bi se obezbedio optimalni željeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može se primeniti pojedinačni bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati, kao što je naznačeno hitnošću terapijske situacije. Naročito je korisno formulisati parenteralne kompozicije u jediničnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Jedinični dozni oblik kao što se ovde upotrebljava označava fizički odvojene jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za jedinične dozne oblike iz pronalaska diktiraju i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja svojstvenih struci stvaranja jedinjenja kao aktivnog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
[0251] Za primenu antitela, doza je u opsegu od oko 0,0001 do 100 mg/kg, na primer, 0,001 do 50 mg/kg, 0,005 do 20 mg/kg, 0,01 do 10 mg/kg i češće 0,01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti 0,05 mg/kg telesne težine, 0,1 mg/kg telesne težine, 0,3 mg/kg telesne težine, 0,3 mg/kg telesne težine, 0,5 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 2 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 4 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine, 6 mg/kg telesne težine, 7 mg/kg telesne težine, 8 mg/kg telesne težine, 9 mg/kg telesne težine težine, 10 mg/kg telesne težine, 12 mg/kg telesne težine, 15 mg/kg telesne težine, 20 mg/kg telesne težine, 25 mg/kg telesne težine, 30 mg/kg telesne težine ili unutar opsega od 0,1-20 mg/kg, 0,5-15 mg/kg, 1-10 mg/kg, 2-8 mg/kg, 3-7 mg/kg, 4-6 mg/kg. Primer režima lečenja podrazumeva primenu jednom dnevno, jednom svaka 2 dana, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom svakih 6 nedelja, jednom svaka 3 meseca ili jednom svaka tri do 6 meseci. Poželjni dozni režimi za anti-LY75 antitelo iz pronalaska uključuju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine intravenskom primenom, pri čemu se antitelo daje upotrebom jednog od sledećih doznih rasporeda: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne težine jednom posle čega sledi 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.
[0252] U nekim postupcima, istovremeno se primenjuju dva ili više monoklonalna antitela sa različitim specifičnostima vezivanja, u kom slučaju doza svakog primenjenog antitela spada u naznačene opsege. Antitelo se uobičajeno primenjuje u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti, na primer, dnevno, dva puta nedeljno, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca, svakih šest meseci, ili godišnje. Intervali takođe mogu biti neredovni, kao što je naznačeno merenjem nivoa antitela u krvi na ciljni antigen kod pacijenta. U nekim postupcima doza se prilagođava da bi se postigla koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 μg/ml, 5-750 μg/ml, 10-600 μg/ml, 15-500 μg/ml, 20-400 μg/ml i u nekim postupcima oko 25-300 μg/ml.
4
[0253] Alternativno, antitelo se može primeniti kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna ređa primena. Doziranje i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela kod pacijenta. Generalno, humana antitela pokazuju najduži poluživot, zatim humanizovana antitela, himerna antitela, i ne-humana antitela. Doziranje i učestalost primene mogu varirati u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da se leče do kraja svog života. U terapijskim primenama, ponekad je potrebna relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima dok se progresija bolesti ne smanji ili ne zaustavi, i poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno ublažavanje simptoma bolesti. Posle toga, pacijentu se može primenjivati profilaktički režim.
[0254] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu varirati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju, i način primene, bez da je toksična za pacijenta. Odabrani dozni nivo zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija iz predmetnog pronalaska koje se koriste, ili njihovih estara, soli ili amida, puta primene, vremena primene, stope izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se upotrebljavaju u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravstvenog stanja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj struci.
[0255] "Terapijski efikasna doza" anti-LY75 antitela iz pronalaska poželjno rezultuje smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili sprečavanjem oštećenja ili invaliditeta usled oboljevanja od bolesti. Na primer, za lečenje tumora posredovanih LY75, "terapijski efikasna doza" poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, poželjnije za najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, još poželjnije za najmanje oko 60%, najmanje oko 70% i još poželjnije za najmanje oko 80% ili najmanje oko 90%, u odnosu na nelečene subjekte. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može se proceniti u sistemu životinjskog modela koji predviđa efikasnost u humanim tumorima. Alternativno, ovo svojstvo kompozicije se može proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija, takva inhibicija se može izmeriti in vitro testovima poznatim stručnjaku iz prakse. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora, ili na drugi način poboljšati simptome kod subjekta. Prosečan stručnjak u ovoj oblasti bio bi u stanju da odredi takve količine na osnovu takvih faktora kao što su veličina subjekta, ozbiljnost simptoma subjekta, i određena odabrana kompozicija ili put primene.
[0256] Kompozicija iz predmetnog pronalaska se može primeniti putem jednog ili više puteva primene upotrebom jednog ili više različitih postupaka poznatih u struci. Kao što će ceniti stručnjak, put i/ili način primene variraće u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni putevi primene antitela iz pronalaska uključuju intravenske, intramuskularne, intradermalne, intraperitonealne, subkutane, spinalne ili druge parenteralne puteve primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Termin "parenteralna primena", kao što se ovde upotrebljava, znači načine primene druge nego enteralnu i topikalnu primenu, uobičajeno injekcijom, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0257] Alternativno, antitelo iz pronalaska se može primeniti neparenteralnim putem, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.
[0258] Aktivna jedinjenja se mogu pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere, i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se upotrebljavati biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktična kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili su opšte poznati stručnjacima [videti, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y].
[0259] Terapijske kompozicije se mogu primenjivati sa medicinskim uređajima poznatim u struci. Na primer, u poželjnom primeru izvođenja, terapijska kompozicija iz pronalaska može se primeniti sa uređajem za hipodermijsko ubrizgavanje bez igle, kao što su uređaji objavljeni u S.A.D. patentima br.5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implantata i modula korisnih u predmetnom pronalasku uključuju: S.A.D. patent br. 4,487,603, koji objavljuje implantabilnu mikro-infuzionu pumpu za izdavanje leka kontrolisanom stopom; S.A.D. patent br. 4,486,194, koji objavljuje terapijski uređaj za primenu lekova kroz kožu; S.A.D. patent br. 4,447,233, koji objavljuje pumpu za infuziju lekova za isporuku lekova sa preciznom stopom infuzije; S.A.D. patent br.
4,447,224, koji objavljuje implantabilni aparat za infuziju promenljivog protoka za kontinuiranu isporuku leka; S.A.D. patent br. 4,439,196, koji objavljuje osmotski sistem za isporuku lekova koji ima višekomorne odeljke; i S.A.D. patent br. 4,475,196, koji objavljuje osmotski sistem za isporuku lekova. Mnogi drugi takvi implantati, sistemi za isporuku, i moduli poznati su iskusnima u struci.
[0260] U određenim primerima izvođenja, monoklonalna antitela iz pronalaska mogu se formulisati kako bi se obezbedila pravilna distribucija in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Kako bi se osiguralo da terapijska jedinjenja iz pronalaska pređu BBB (ukoliko se želi), mogu se formulisati, na primer, u lipozomima. Za postupke proizvodnje lipozoma, videti, npr. S.A.D. patente br.
4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu sadržati jedan ili više ostataka koji se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, stoga poboljšavajući ciljnu isporuku leka [videti, npr. V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685]. Primeri za ostatke koji ciljno deluju uključuju folat ili biotin (videti, npr. S.A.D. patent br. 5,416,016.); manozide [Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophyis. Res. Commun. 153:1038]; antitela [P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180]; surfaktant protein A receptor [Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol.
1233:134]; p120 [Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090]; videti takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Imunomethods 4:273.
Upotrebe i postupci
[0261] Antitela, kompozicije antitela i postupci iz predmetnog pronalaska imaju brojne in vitro i in vivo dijagnostičke i terapijske korisnosti koje uključuju dijagnozu i lečenje poremećaja posredovanih LY75.
[0262] U nekim primerima izvođenja, ovi molekuli se mogu primenjivati na ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr. in vivo, za lečenje, prevenciju i dijagnostikovanje različitih poremećaja. Kao što se ovde upotrebljava, termin "subjekat" je namenjen da uključi humane i ne-humane životinje. Ne-humane životinje uključuju sve vertebrate, npr. sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, pilići, vodozemci, i gmizavci. Poželjni subjekti uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje posredovane LY75 aktivnošću. Postupci su posebno pogodni za lečenje humanih pacijenata koji imaju poremećaj povezan sa aberantnom LY75 ekspresijom. Kada se antitela na LY75 primenjuju zajedno sa drugim agensom, ta dva se mogu primeniti bilo kojim redosledom ili istovremeno.
[0263] S obzirom na specifično vezivanje antitela iz pronalaska za LY75, antitela iz pronalaska se mogu upotrebljavati za specifično detektovanje LY75 ekspresije na površini ćelija i, povrh toga, mogu se upotrebljavati za prečišćavanje LY75 imunoafinitetnim prečišćavanjem.
Osim toga, s obzirom na LY75 ekspresiju na ćelijama tumora, antitela, kompozicije antitela i postupci iz predmetnog pronalaska mogu se upotrebljavati za lečenje subjekta sa tumorigenim poremećajem, npr. poremećaj koji se karakteriše prisustvom tumorskih ćelija koje eksprimiraju LY75 ili u proizvodnji medikamenta za lečenje takvog poremećaja, uključujući, na primer kancer želuca, kancer bubrega, kancer štitne žlezde, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer kože, kancer jetre, kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer bešike, kancer prostate, kancer dojke uključujući trostruko negativni kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća, mijelom, leukemiju, uključujući hroničnu limfocitnu leukemiju i akutnu mijeloidnu leukemiju, ne-Hočkinov limfom, uključujući DLBCL, B-ćelijski limfom, folikularni limfom, limfom mantle ćelija, limfom limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom (MALT), T-ćelijama/histiocitima bogat B-ćelijski limfom, Burkitov limfom, limfoplazmocitni limfom, limfom malih limfocita, limfom marginalne zone, T-ćelijski limfom, periferni T-ćelijski limfom, anaplastični krupnoćelijski limfom i angioimunoblastni T-ćelijski limfom. Pokazano je da se LY75 internalizuje po vezivanju antitela kao što je ilustrovano u Primerima 5 i 7 ispod, stoga omogućava antitelima iz pronalaska da se upotrebljavaju u bilo kom mehanizmu delovanja korisnog tereta, npr. ADC pristupu, radioimunokonjugatu, ili ADEPT pristupu.
[0264] U jednom primeru, antitela (npr. monoklonalna antitela, fragmenti antitela, Nanobody®, multispecifični i bispecifični molekuli i kompozicije, itd.) mogu se upotrebljavati za detekciju nivoa LY75, ili nivoa ćelija koje sadrže LY75 na svojoj membranskoj površini, koji nivoi tada mogu biti povezani sa određenim simptomima bolesti. Alternativno, antitela, koja se generalno primenjuju kao ADC, mogu se upotrebljavati za inhibiranje ili blokiranje LY75 funkcije što, zauzvrat, može biti povezano sa prevencijom ili ublažavanjem određenih simptoma bolesti, što implicira LY75 kao posrednika bolesti. To se može postići dovođenjem u kontakt uzorka i kontrolnog uzorka sa anti-LY75 antitelom pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i LY75. Bilo koji kompleksi formirani između antitela i LY75 se detektuju i upoređuju u uzorku i kontroli.
[0265] U sledećem primeru, antitela (npr. monoklonalna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i kompozicije) se mogu inicijalno testirati na aktivnost vezivanja povezanu sa terapijskom ili dijagnostičkom upotrebom in vitro. Na primer, kompozicije se mogu testirati upotrebom testova protočne citometrije opisanih u Primerima ispod.
[0266] Antitela (npr. monoklonalna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli, imunokonjugati i kompozicije) iz pronalaska imaju dodatnu korist u terapiji i dijagnozi bolesti povezanih sa LY75. Na primer, monoklonalna antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli i imunokonjugati mogu se upotrebljavati za izazivanje in vivo ili in vitro jedne ili više od sledećih bioloških aktivnosti: da inhibiraju rast i/ili ubiju ćeliju koja eksprimira LY75; da posreduju u fagocitozi ili ADCC ćelije koja eksprimira LY75 u prisustvu humanih efektorskih ćelija, ili da blokira vezivanje LY75 liganda za LY75.
U posebnom primeru izvođenja, antitela (npr. monoklonalna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i kompozicije) se upotrebljavaju in vivo za lečenje, prevenciju ili dijagnozu različitih bolesti povezanih sa LY75. Primeri bolesti povezanih sa LY75 uključuju, između ostalih, humana tkiva kancera koja predstavljaju kancer želuca, kolorektalni kancer, kancer prostate, kancer dojke, kancer jajnika, kancer bubrega, kancer štitne žlezde, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer kože, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer bešike, mijelom, leukemiju, uključujući hroničnu limfocitnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, ne-Hočkinov limfom, uključujući DLBCL, B-ćelijski limfom, folikularni limfom, limfom mantle ćelija, limfom limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom (MALT), T-ćelijama/histiocitima bogat B-ćelijski limfom, Burkitov limfom, limfoplazmocitni limfom, limfom malih limfocita, limfom marginalne zone, T-ćelijski limfom, periferni T-ćelijski limfom, anaplastični krupnoćelijski limfom, angioimunoblastni T-ćelijski limfom i kancer pluća.
[0267] Pogodni putevi primene kompozicija antitela (npr. monoklonalnih antitela, multispecifičnih i bispecifičnih molekula i imunokonjugata) iz pronalaska in vivo i in vitro dobro su poznati u struci i mogu ih odabrati oni sa prosečnim iskustvom. Na primer, kompozicije antitela mogu se primenjivati injekcijom (npr. intravenski ili subkutano). Pogodne doze upotrebljenih molekula zavisiće od starosti i težine subjekta i koncentracije i/ili formulacije kompozicije antitela.
[0268] Kao što je prethodno opisano, anti-LY75 antitela iz pronalaska mogu se zajedno primenjivati sa jednim ili više drugih terapijskih agenasa, npr. citotoksični agens, radiotoksični agens ili imunosupresivni agens. Antitelo se može povezati sa agensom (kao imunokompleks) ili se može primeniti odvojeno od agensa. U potonjem slučaju (odvojena primena), antitelo se može primeniti pre, posle ili istovremeno sa agensom ili se može zajedno primenjivati sa drugim poznatim terapijama, npr. antikancerska terapija, npr. zračenje. Takvi terapijski agensi uključuju, između ostalih, anti-neoplastične agense kao što su doksorubicin (adriamicin), cisplatin bleomicin sulfat, karmustin, hlorambucil, i ciklofosfamid hidroksiurea, koji su sami po sebi efikasni samo na nivoima koji su toksični ili subtoksični za pacijenta. Cisplatin se primenjuje intravenski u dozi od 100 mg/kg jednom svake četiri nedelje i adriamicin se primenjuje intravenski u dozi od 60-75 mg/ml jednom svakih 21 dan. Drugi agensi pogodni za zajedničku primenu sa antitelima iz pronalaska uključuju i druge agense koji se upotrebljavaju za lečenje kancera, npr. kancera želuca, kolorektalnog kancera, kancera prostate, kancera dojke, kancera jajnika ili kancera pluća, kao što su Avastin®, 5FU i gemcitabin. Zajednička primena anti-LY75 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, iz predmetnog pronalaska sa hemioterapijskim agensima obezbeđuje dva antikancerska agensa koja deluju putem različitih mehanizama koji daju citotoksični efekat na ćelije humanog tumora. Takva zajednička primena može da reši probleme usled razvoja rezistencije na lekove ili promene antigenosti ćelija tumora što bi ih učinilo nereaktivnim sa antitelom.
[0269] Efektorske ćelije specifične za cilj, npr. efektorske ćelije povezane sa kompozicijama (npr. monoklonalna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) iz pronalaska takođe se mogu upotrebljavati kao terapijski agensi. Efektorske ćelije za ciljno delovanje mogu biti humani leukociti kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Druge ćelije uključuju eozinofile, ćelije prirodne ubice i druge ćelije koje nose IgG- ili IgA-receptor. Ako se želi, efektorske ćelije se mogu dobiti od subjekta koji se leči. Efektorske ćelije specifične za cilj mogu se primenjivati kao suspenzija ćelija u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj primenjenih ćelija može biti reda 10<8>-10<9>, ali će varirati u zavisnosti od terapijske svrhe. Generalno, količina će biti dovoljna da se dobije lokalizacija u ciljnoj ćeliji, npr. ćeliji tumora koja eksprimira LY75, i da utiče na ubijanje ćelije, npr. fagocitozom. Putevi primene takođe mogu varirati.
[0270] Terapija efektorskim ćelijama specifičnim za cilj može se izvoditi zajedno sa drugim tehnikama za uklanjanje ciljanih ćelija. Na primer, antitumorska terapija koja upotrebljava kompozicije (npr. monoklonalna antitela, multispecifične i bispecifične molekule) iz pronalaska i/ili efektorske ćelije naoružane ovim kompozicijama može se upotrebljavati u sprezi sa hemioterapijom. Pored toga, kombinovana imunoterapija se može upotrebljavati za usmeravanje dve različite populacije citotoksičnih efektora ka odbacivanju ćelija tumora. Na primer, anti-LY75 antitela povezana sa anti-Fc-gama RI ili anti-CD3 mogu se upotrebljavati u sprezi sa vezujućim agensima specifičnim za IgG- ili IgA-receptor.
[0271] Bispecifični i multispecifični molekuli iz pronalaska mogu se takođe upotrebljavati za modulaciju FcγR ili FcγR nivoa na efektorskim ćelijama, kao što je poklapanje i uklanjanje receptora na ćelijskoj površini. Smeše anti-Fc receptora takođe se mogu upotrebljavati u tu svrhu.
[0272] Kompozicije (npr. monoklonalna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) iz pronalaska koji imaju mesta vezivanja komplementa, kao što su delovi IgG1, -2 ili -3 ili IgM koji vezuju komplement, takođe se mogu upotrebljavati u prisustvu komplementa. U jednom primeru izvođenja, ex vivo lečenje populacije ćelija koja sadrži ciljne ćelije sa vezujućim agensom iz pronalaska i odgovarajuće efektorske ćelije može se suplementovati dodatkom komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih vezujućim agensom iz pronalaska može se poboljšati vezivanjem proteina komplementa. U sledećem primeru izvođenja ciljne ćelije obložene kompozicijama (npr. monoklonalna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) iz pronalaska takođe mogu biti lizirane komplementom. U još jednom primeru izvođenja, kompozicije iz pronalaska ne aktiviraju komplement.
[0273] Kompozicije (npr. monoklonalna antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) iz pronalaska takođe se mogu primenjivati zajedno sa komplementom. U određenim primerima izvođenja, trenutna objava obezbeđuje kompozicije koje sadrže antitela, multispecifične ili bispecifične molekule i serum ili komplement. Ove kompozicije mogu biti povoljne kada se komplement nalazi u neposrednoj blizini antitela, multispecifičnih ili bispecifičnih molekula. Alternativno, antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli iz pronalaska i komplement ili serum mogu se primenjivati odvojeno.
[0274] Takođe su opisani kompleti koji sadrže kompozicije antitela iz pronalaska (npr. monoklonalna antitela, bispecifični ili multispecifični molekuli, ili imunokonjugati) i uputstva za upotrebu. Komplet može dodatno da sadrži jedan ili više dodatnih reagenasa, kao što su imunosupresivni reagens, citotoksični agens ili radiotoksični agens, ili jedno ili više dopunskih antitela iz pronalaska (npr. antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koje se vezuje za epitop u LY75 antigenu različit od prvog antitela).
[0275] U skladu sa tim, pacijentima koji se leče kompozicijama antitela iz pronalaska može se dopunski primeniti (pre, istovremeno sa, ili nakon primene antitela iz pronalaska) drugi terapijski agens, kao što je citotoksični ili radiotoksični agens, koji pojačava ili uvećava terapijski efekat antitela.
[0276] U drugim primerima izvođenja, subjekt se može dodatno lečiti agensom koji modulira, npr. pojačava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Fcγ ili Fcγ receptora, na primer, lečenjem subjekta citokinom. Poželjni citokini za primenu tokom lečenja multispecifičnim molekulom
1
uključuju faktor stimulisanja kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ), i faktor nekroze tumora (TNF).
[0277] Kompozicije (npr. antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) iz pronalaska mogu se takođe upotrebljavati za ciljanje ćelija koje eksprimiraju FcγR ili LY75, na primer, za obeležavanje takvih ćelija. Za takvu upotrebu, vezujući agens se može povezati sa molekulom koji se može detektovati. Stoga, opis obezbeđuje postupke za lokalizaciju ex vivo ili in vitro ćelija koje eksprimiraju Fc receptore, kao što su FcγR, ili LY75. Obeleživač koji se može detektovati može biti, npr. radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili enzimski kofaktor.
[0278] U jednom primeru, opis obezbeđuje postupke za detekciju prisustva LY75 antigena u uzorku, ili merenje količine LY75 antigena, koji sadrže dovođenje u kontakt uzorka, i kontrolnog uzorka, sa monoklonalnim antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim delom, koji se specifično vezuje za LY75, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili njegovog dela i LY75. Zatim se detektuje formiranje kompleksa, pri čemu razlika formiranja kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom ukazuje na prisustvo LY75 antigena u uzorku.
[0279] U drugim primerima, pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje poremećaja posredovanog LY75 kod subjekta, npr. humanih kancera, uključujući kancer želuca, kancer bubrega, kancer štitne žlezde, kancer jednjaka, kancer glave i vrata, kancer kože, kancer jetre, kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer bešike, kancer prostate, kancer dojke uključujući trostruko negativni kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća, mijelom, leukemiju, uključujući hroničnu limfocitnu leukemiju i akutnu mijeloidnu leukemiju, i ne-Hočkinov limfom, uključujući DLBCL, B-ćelijski limfom, folikularni limfom, limfom mantle ćelija, limfom limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom (MALT), T-ćelijama/histiocitima bogat B-ćelijski limfom, Burkitov limfom, limfoplazmocitni limfom, limfom malih limfocita, limfom marginalne zone, T-ćelijski limfom, periferni T-ćelijski limfom, anaplastični krupnoćelijski limfom i angioimunoblastni T-ćelijski limfom.
[0280] U svim primerima izvođenja pronalaska, poželjni kanceri uključuju ne-Hočkinov limfom, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju i trostruko negativni kancer dojke, kancer bešike i kancer pankreasa.
[0281] Predmetni pronalazak je dodatno ilustrovan sledećim primerima koje ne treba tumačiti kao dodatno ograničavanje.
Primer 1: Generisanje humanih monoklonalnih antitela prema LY75-antigenu
2
[0282] Sledeći standardne procedure, miševi (xenomouse IgG1) su imunizovani sa CHO ćelijama transfektovanim sa LY75 pune dužine.
[0283] Specifičnost antitela uzgajanih prema LY75 testirana je protočnom citometrijom na HEK293 ćelijama transfektovanim sa LY75 i zatim na HT29 ćelijama koje eksprimiraju LY75. Kako bi se testirala sposobnost antitela da se vezuju za LY75 protein na ćelijskoj površini, antitela su inkubirana sa ćelijama koje eksprimiraju LY75. Ćelije su isprane u FACS puferu (DPBS, 2% FBS), centrifugirane i resuspendovane u 100 μl razblaženog primarnog LY75 antitela (takođe razblaženog u FACS puferu). Kompleks antitelo-ćelijska linija je inkubiran na ledu tokom 60 min i zatim dva puta ispran FACS puferom kao što je opisano iznad. Pelet ćelija-antitelo je resuspendovan u 100 μl razblaženog sekundarnog antitela (takođe razblaženog u FACS puferu) i inkubiran na ledu tokom 60 min. Pelet je ispran kao pre i resuspendovan u 200 μl FACS pufera. Uzorci su stavljeni na BD FACScanto II protočni citometar i podaci su analizirani upotrebom BD FACSdiva softvera (rezultati nisu pokazani).
Primer 2: Strukturna karakterizacija monoklonalnih antitela za LY75
[0284] cDNK sekvence koje kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca monoklonalnog antitela LY75_A1 dobijene su upotrebom standardnih PCR tehnika i sekvencirane su upotrebom standardnih tehnika DNK sekvenciranja.
[0285] Sekvence antitela mogu biti mutagenizovane kako bi se vratile na ostatke germinativne linije na jednom ili više ostataka.
[0286] Nukleotidne i amino-kiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca LY75_A1 pokazane su u SEQ ID NO: 3 i 1, respektivno.
[0287] Nukleotidne i amino-kiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca LY75_A1 pokazane su u SEQ ID NO: 4 i 2, respektivno.
[0288] Poređenje sekvence teškog lanca imunoglobulina LY75_A1 sa poznatim sekvencama teškog lanca imunoglobulina humane germinativne linije demonstriralo je da teški lanac LY75_A1 koristi VHsegment iz humane germinativne linije VH3-15 i JHsegment iz humane germinativne linije JHJH4. Dodatna analiza LY75_A1 VHsekvence upotrebom Kabat sistema za određivanje CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca kao što je pokazano u SEQ ID NO: 5, 6 i 7, respektivno. Poravnanja LY75_A1 CDR1, CDR2 i CDR3 VHsekvenci sa sekvencama germinativne linije VH3-15 i germinativne linije JHJH4 pokazane su na Slici 1.
[0289] Poređenje sekvence lakog lanca imunoglobulina LY75_A1 sa poznatim sekvencama lakog lanca imunoglobulina humane germinativne linije demonstriralo je da laki lanac LY75_A1 koristi VKsegment iz humane germinativne linije VK012 i JKsegment iz humane germinativne linije JKJK4. Dodatna analiza LY75_A1 VKsekvence upotrebom Kabat sistema za određivanje CDR regiona dovela je do razgraničenja CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca kao što je pokazano u SEQ ID NO: 8, 9 i 10, respektivno. Poravnanja LY75_A1 CDR1, CDR2 i CDR3 VKsekvenci sa sekvencama germinativne linije VK012 i germinativne linije JKJK4 pokazane su na Slici 2.
Primer 3: Imunohistohemija upotrebom monoklonalnog antitela za LY75
[0290] Upotrebom humanih monoklonalnih antitela specifičnih za LY75, imunohistohemija je izvedena na FFPE HT-29 i A549 ćelijskim peletima, čipovima FFPE ne-Hočkinovog limfoma i kancera pankreasa, i čipovima sveže zamrznutih preseka limfom/leukemija tumora, kancera jajnika, kancera pankreasa, i kancera dojke i normalnog tkiva.
Materijali i postupci
Materijali
[0291] Ksiloli (X5P-1gal) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0292] Histoprep 100% etanol (HC-800-1GAL) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0293] 10x citratni pufer za toplotom indukovano otkrivanje epitopa (AP9003125) od Thermo Scientific, MA, USA. Thermo Scientific* Pierce* Supresor peroksidaze (35000) od Thermo Scientific, MA, USA. Proteinski blok bez seruma (X0909) od Dako, CA, USA.
[0294] Sekundarno antitelo: kozje anti-humano IgG Fab-FITC konjugovano (109-097-003) od Jackson Immunoresearch, PA, USA.
[0295] Chrom pure humani IgG, ceo molekul (09-000-003) od Jackson Immunoresearch, PA, USA Tercijarno antitelo: mišje anti-FITC (ab10257) od Abcam, MA, USA
[0296] Prečišćena humana IgG izotipska kontrola (1-001A) od R&D Systems, MN, USA [0297] Tween-20 (BP337-100) od Fisher Scientific, PA, USA
[0298] Aceton (BP2403-4) od Fisher Scientific, PA, USA
[0299] Dual Link EnVision+HRP-konjugovani polimer, mišji i zečiji (K4063) od Dako, CA, USA. DAB 2-rastvor komplet (882014) od Invitrogen, NY, USA.
4
[0300] Harisov (Harris) hematoksilin (23-245-677) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0301] Faramount medijum za montiranje (S302580) od Dako, CA, USA.
[0302] Preseci tkiva i čipovi su kupljeni od US Biomax Inc., MD, USA ili Origene, MD, USA.
Priprema FFPE pločica: Deparafinizacija i rehidratacija
[0303] FFPE pločice su deparafinisane u ksilolu (2 x 3 minuta), zatim rehidratisane kroz 1:1 ksilol:100% etanol (1 x 3 minuta), 100% etanol (2 x 3 minuta), 95% etanol (1 x 3 minuta) 70% etanol (1 x 3 minuta), 50% etanol (1 x 3 minuta), i česmensku vodu (1 x 3 minuta). Priprema FFPE pločica: Otkrivanje antigena (mikrotalasna).
[0304] LY75 antigen je otkriven upotrebom mikrotalasne toplote, visoka snaga do ključanja i zatim niska snaga tokom 10 minuta u 50 ml 1x citratnog pufera u kiveti (Coplin jar). Zatim su pločice ostavljene da se ohlade na sobnu temperaturu tokom dodatnih 15 min, zatim su isprane u česmenskoj vodi, 3 minuta. Oko svakog preseka tkiva/TMA opcrtani su krugovi hidrofobnom ogradnom olovkom i pločice su zatim isprane 3 puta u PBS, 3 minuta svako ispiranje.
Priprema FF pločica
[0305] Pločice su sklonjene iz skladišta na -80 °C i omogućeno je da se osuše na sobnoj temperaturi u digestoru tokom 20-30 minuta. Pločice su fiksirane tokom 10 min u ledeno hladnom acetonu na -20 °C, zatim ostavljene da se suše tokom 20 min u digestoru na sobnoj temperaturi. Pločice su isprane i rehidratisane u PBS, 3 ispiranja po 3 min svako. Preseci su okruženi hidrofobnom ogradnom olovkom.
Priprema kompleksa antitela
[0306] Primarno anti-LY75 antitelo je razblaženo u proteinskom bloku bez seruma (SFPB) kako bi se dobio rastvor koncentracije 20 puta veće od konačne željene koncentracije (20 μg/ml za 1 μg/ml konačno). Sekundarno antitelo, kozji anti-humani imunoglobulin G (IgG) antigen-vezujući fragment (Fab), je pripremljeno na sličan način u SFPB kako bi se dobio rastvor jednake koncentracije.
[0307] Jednake zapremine primarnih i sekundarnih antitela kombinovane su u obeleženoj tubi, lagano pomešane, i inkubirane tokom 3 minuta na sobnoj temperaturi, rezultujući koncentracijom primarnog antitela 10 puta većom od željene konačne koncentracije (10 μg/ml za 1 μg/ml konačno). Ova smeša je razblažena 1:5 sa SFPB, lagano pomešana, i inkubirana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, rezultujući koncentracijom primarnog antitela dvostruko većom od željene konačne koncentracije (2 μg/ml za 1 μg/ml konačno).
[0308] Kako bi se proizveli konačni kompleksi za bojenje, pripremljen je 1% (10 μg/ml) rastvor humanog IgG u SFPB i jednaka zapremina je dodata smeši primarnog/sekundarnog antitela. Ova kombinacija je lagano pomešana i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, razblažujući za polovinu koncentraciju primarnog antitela smeše primarnog/sekundarnog antitela i rezultirajući željenom konačnom koncentracijom primarnog antitela (1 μg/ml).
Imunobojenje
[0309] U međuvremenu, aktivnost endogene tkivne peroksidaze blokirana je inkubiranjem tkiva sa supresorima peroksidaze tokom 5-10 minuta na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori. Zatim su pločice isprane u PBS 3 x 3 minuta svako ispiranje. Tkiva su inkubirana u SFPB tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori. Konačni kompleksi za bojenje su naneti na svaki presek tkiva i/ili čip, i pločice su inkubirane tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori. Zatim su pločice isprane jednom u PBS i jednom u PBST (PBS+0,125% Tween-20), 3 minuta svako ispiranje. Tercijarno antitelo mišje anti-FITC, naneto je u koncentraciji od 2 μg/ml tokom 30 minuta, sobna temperatura, u vlažnoj komori. Zatim su preseci isprani jednom u PBS i jednom u PBST, 3 minuta svako ispiranje. Dual link EnVision anti-mišji/zečiji-HRP-konjugovani polimer je zatim nanet na tkiva i pločice su inkubirane tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u vlažnoj komori. Zatim su pločice isprane jednom u PBS, jednom u PBST, 3 minuta svako ispiranje. Tkiva su inkubirana u DAB rastvoru pripremljenom u skladu sa uputstvima proizvođača na sobnoj temperaturi tokom 10 min. Zatim su pločice isprane jednom u tekućoj česmenskoj vodi tokom 2 minuta i jednom u PBS tokom 3 minuta. Pločice su obojene hematoksilinom tokom 30 sekundi na sobnoj temperaturi, i isprane tekućom česmenskom vodom. Pločice su osušene na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta i pokrovna stakalca su zatim montirana na pločice upotrebom Faramount medijuma za montiranje.
Rezultati
[0310] LY75_A1 je pokazalo pozitivnost u FFPE uzorcima trostruko negativnog kancera dojke, gde je 77% preseka pokazalo pozitivno bojenje i 55% robusno (+++) bojenje.
[0311] Bojenje za LY75 u FF normalnim tkivima uglavnom je bilo odsustno do nisko. Duktalni epitel dojke, pljuvačna žlezda, i pankreas pokazali su izrazito slabo do umereno bojenje, i slezina se obojila slabo pozitivno. Prema tome antitela usmerena na LY75 mogu biti korisna kao terapeutici i dijagnostici kod nekih od testiranih kancera i moguće kod drugih tipova kancera koji pokazuju ekspresiju LY75.
Primer 4: Efikasnost DM1-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u HT-29 ćelijama
Materijali
[0312] Skidač ćelija (Cell stripper) (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0313] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0314] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0315] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0316] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0317] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0318] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0319] Rezultati prikazani na Slici 3a pokazuju subpopulaciju antitela, za koja se zna da se vezuje za LY75, što može da indukuje ćelijsko ubijanje HT-29 ćelija. Ovo sugeriše da dok se antitela mogu vezati za LY75 samo nekoliko pokazuje efikasnost kada su konjugovana za DM1. Antitela su zatim odabrana iz subpopulacije za dodatnu analizu citotoksične aktivnosti.
Primer 5: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijama kolorektalnog kancera
Materijali
[0320] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0321] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0322] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0323] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0324] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0325] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0326] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0327] Slika 3b pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema HT-29 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela i drugih anti-LY75 antitela konjugovanih sa toksinom (odabrana iz Primera 1).
Primer 6: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama limfoma
Materijali
[0328] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0329] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0330] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0331] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0332] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0333] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0334] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0335] Slika 3c pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema RAJI ćelijama. Slika 3d pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema Namalwa ćelijama. Slika 3e pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema Karpas 299 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela i drugih anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 (odabrana iz Primera 1).
Primer 7: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama kancera pankreasa
Materijali
[0336] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0337] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0338] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0339] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0340] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0341] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0342] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0343] Slika 3f pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema BxPC3 ćelijama. Slika 3g pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema HupT4 ćelijama. Slika 3h pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema HPAFFII ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela i drugih anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 (odabrana iz Primera 1).
Primer 8: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama hronične limfocitne leukemije
Materijali
1
[0344] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0345] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0346] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0347] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0348] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0349] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0350] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0351] Slika 3i pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema EHEB ćelijama. Slika 3j pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema Mec-1 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela i drugih anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 (odabrana iz Primera 1).
2
Primer 9: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama akutne monocitne leukemije
Materijali
[0352] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0353] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0354] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0355] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0356] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0357] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0358] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0359] Slika 3k pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema AML-193 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela i drugih anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 (odabrana iz Primera 1).
Primer 10: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama kancera dojke
Materijali
[0360] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0361] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0362] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0363] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0364] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0365] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0366] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i
4
vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0367] Slika 3l pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema HCC 70 (ER negativne, PR negativne i Her2 negativne) ćelijama. Slika 3m pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema HCC 1806 (ER negativne, PR negativne i Her2 negativne) ćelijama. Slika 3n prikazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema MDA-MB-468 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela.
Primer 11: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama kancera bešike
Materijali
[0368] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0369] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0370] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0371] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0372] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0373] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0374] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0375] Slika 3o pkazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema RT4 ćelijama. Slika 3p pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema 5637 ćelijama. Slika 3q pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema SW780 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela.
Primer 12: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama kancera glave i vrata
Materijali
[0376] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0377] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0378] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0379] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0380] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0381] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0382] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0383] Slika 3r pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema SCC-9 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela.
Primer 13: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama kancera jednjaka
Materijali
[0384] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0385] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0386] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0387] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0388] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0389] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0390] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0391] Slika 3s pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema OE 19 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela.
Primer 14: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama kancera jajnika
Materijali
[0392] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0393] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0394] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0395] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0396] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0397] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0398] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0399] Slika 3t pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema OVCAR-3 ćelijama. Slika 3u pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema SK-OV-3 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela.
Primer 15: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ćelijskim linijama multipla mijeloma
Materijali
[0400] Skidač ćelija (neenzimska disocijacija ćelija) (MT-25-056CI) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0401] PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0402] RPMI 1640 Medijum (MT-10-041-CM) od Fisher Scientific, PA, USA.
[0403] Cell Titer Glo (G7572) od Promega, WI, USA.
Postupak
[0404] Ćelije su disocirane upotrebom skidača ćelija i prebrojane. 5e3 ćelija/bunariću je staloženo u pelet (za suspenziju ćelija, može se upotrebiti više u zavisnosti od vremena udvostručavanja ćelija, kao što je 10e3 ćelija/bunariću). Pelet je resuspendovan u medijumu za kulturu do koncentracije 1e5 ćelija/ml.
[0405] 50 μl/bunariću ćelijske suspenzije dodato je u bunariće ploče sa 96 bunarića sa belim stranama, prozirnim dnom. Antitela su razblažena i titrirana do 8 tačaka (trostruke titracije) što odgovara koncentracijama između 0-20 nM (dvostruke test koncentracije). Razblažena antitela ili medijum (za netretirane uzorke) (50 μl/bunariću) dodati su u odgovarajuće bunariće. Višak medijuma (200 μl/bunariću) dodat je spoljnim redovima i kolonama ploče kako bi se sprečilo isparavanje. Ploča je inkubirana tokom 72 h na 37 °C.
[0406] Ploča je sklonjena iz inkubatora i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. U međuvremenu Cell Titer Glo rastvor je otopljen. Ploča je protrešena i isprana 1x sa 100 μl/bunariću PBS (za suspenziju ćelija, ploča je prvo centrifugirana da se ćelije peletiraju). U svaki bunarić je dodato 100 μl/bunariću PBS i 100 μl Cell titer glo i triturisano je kako bi se pomešalo. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta i vizualizovana mikroskopijom kako bi se osiguralo da se dogodila efikasna liza ćelija. Ploča je zatim očitana na Glomax luminometru.
Rezultati
[0407] Slika 3v pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema MOLP-8 ćelijama. Slika 3w pokazuje citotoksičnu aktivnost anti-LY75 antitela konjugovanih za DM1 i DM4 prema RPMI8226 ćelijama. Ovi rezultati demonstriraju porast citotoksične aktivnosti srazmerno koncentraciji antitela.
Primer 16: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u Raji ksenograft modelima
[0408] Efikasnost LY75_DM1 i LY75_DM4 testirana je u subkutanom Raji Burkitov limfom SCID mišjem ksenograft modelu.
[0409] Imunodeficijentni SCID miševi su inokulirani subkutano sa Raji (humani Burkitov limfom) tumorskim ćelijama. Tumorima je omogućeno da se uspostave i miševi su sortirani u pet grupa tretmana od 3-6 miševa po grupi. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla prosečnu veličinu od 129-132 mm<3>po grupi, svaka grupa je tretirana jednim od sledećih jedinjenja, primenjenih intravenski u naznačenim dozama: Grupa 1 (nosač; fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS)); Grupa 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupa 3 (izotipska kontrola-DM1; 10 mg/kg), Grupa 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupa 5 (izotipska kontrola-SPBDDM4; 5 mg/kg). Druga doza je primenjena nedelju dana kasnije. Praćene su telesne težine (BW), miševima je često proveravano zdravlje i neželjeni sporedni efekti, i tumori su mereni dva puta nedeljno. Miševi su eutanazirani kada su njihovi tumori dostigli krajnju tačku zapremine tumora od 2000 mm3 ili posle 60 dana, šta god se prvo desilo. Efikasnost je određena na osnovu odlaganja rasta tumora (TGD), povećanja medijane vremena do krajnje tačke (TTE) i iz log rank analize razlika u Kaplan Majer (Kaplan Meier) krivama preživljavanja kod ADC-tretiranih prema PBS-tretiranim miševima. Prvih pet kontrolnih miševa tretiranih nosačem koji su dostigli krajnju tačku su uzorkovani za tumore koji su obrađeni fiksacijom u formalinu i ukalupljeni u parafin.
Rezultati
[0410] Slika 4a pokazuje da je svako od LY75_DM1 i LY75_DM4 demonstriralo značajnu antitumorsku aktivnost i značajno produženo preživljavanje u Raji Burkitov limfom SCID mišjem ksenograft modelu u poređenju sa kontrolama; međutim, doze LY75_DM4 od 5 mg/kg bile su značajno efikasnije od doza LY75_DM1 od 10 mg/kg, rezultujući u 5 od 6 miševa sa potpunom ali prolaznom regresijom tumora. Svi tretmani su dobro podneti i nisu uočeni klinički znaci toksičnosti. Ovi podaci sugerišu na potencijal da ADC usmereni prema LY75, na primer LY75_DM1 i LY75_DM4, obezbeđuju kliničku korist u lečenju humanih pacijenata sa kancerom koji imaju ne-Hočkinov limfom.
1
Primer 17: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u Namalwa ksenograft modelima
[0411] Efikasnost LY75_DM1 i LY75_DM4 testirana je u subkutanom Namalwa Burkitov limfom SCID mišjem ksenograft modelu.
[0412] Imunodeficijentni SCID miševi su inokulirani subkutano sa Namalwa (humani Burkitov limfom) tumorskim ćelijama. Tumorima je omogućeno da se uspostave i miševi su sortirani u pet grupa tretmana od po 6 miševa po grupi. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla prosečnu veličinu od 114 mm<3>po grupi, svaka grupa je tretirana jednim od sledećih jedinjenja, primenjenih intravenski u naznačenim dozama: Grupa 1 (nosač; fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS)); Grupa 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupa 3 (izotipska kontrola-DM1; 10 mg/kg), Grupa 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupa 5 (izotipska kontrola-SPBDDM4; 5 mg/kg). Praćene su telesne težine (BW), miševima je često proveravano zdravlje i neželjeni sporedni efekti, i tumori su mereni dva puta nedeljno. Miševi su eutanazirani kada su njihovi tumori dostigli krajnju tačku zapremine tumora od 2000 mm<3>ili posle 60 dana, šta god se prvo desilo. Efikasnost je određena na osnovu odlaganja rasta tumora (TGD), povećanja medijane vremena do krajnje tačke (TTE), i iz log rank analize razlika u Kaplan Majer krivama preživljavanja kod ADC-tretiranih prema PBS-tretiranim miševima. Prvih pet kontrolnih miševa tretiranih nosačem koji su dostigli krajnju tačku su uzorkovani za tumore koji su obrađeni fiksacijom u formalinu i ukalupljeni u parafin.
Rezultati
[0413] Slika 4b pokazuje da je svako od LY75_DM1 i LY75_DM4 demonstriralo značajnu antitumorsku aktivnost i produženje preživljavanja u Namalwa Burkitov limfom SCID mišjem ksenograft modelu u poređenju sa kontrolama; međutim, doza LY75_DM4 od 5 mg/kg je bila značajno efikasnija od doze LY75_DM1 od 10 mg/kg, uzrokujući kratkotrajno smanjenje zapremine tumora. Svi tretmani su dobro podneti i nisu uočeni klinički znaci toksičnosti. Ovi podaci sugerišu na potencijal da ADC usmereni prema LY75, na primer LY75_DM1 i LY75_DM4, obezbeđuju kliničku korist u lečenju humanih pacijenata sa kancerom koji imaju ne-Hočkinov limfom.
Primer 18: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ksenograft modelima kancera pankreasa
2
[0414] Efikasnost LY75_DM1 i LY75_DM4 testirana je u subkutanom HPAFII adenokarcinom pankreasa atimičnom bezdlakom mišjem ksenograft modelu.
[0415] Imunodeficijentni atimični bezdlaki miševi su inokulirani subkutano sa HPAFII (humani adenokarcinom pankreasa) tumorskim ćelijama. Tumorima je omogućeno da se uspostave i miševi su sortirani u pet grupa tretmana od po 6 miševa po grupi. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla prosečnu veličinu od ~114 mm<3>/grupi, svaka grupa je tretirana jednim od sledećih jedinjenja, primenjenih intravenski u naznačenim dozama: Grupa 1 (nosač; fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS)); Grupa 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupa 3 (izotipska kontrola-DM1; 10 mg/kg), Grupa 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupa 5 (izotipska kontrola-SPBDDM4; 5 mg/kg). Praćene su telesne težine (BW), miševima je često proveravano zdravlje i neželjeni sporedni efekti, i tumori su mereni dva puta nedeljno. Miševi su eutanazirani kada su njihovi tumori dostigli krajnju tačku zapremine tumora od 2000 mm<3>ili posle 90 dana, šta god se prvo desilo. Efikasnost je određena iz efekta tretmana na zapreminu tumora i iz log rank analize razlika u Kaplan Majer krivama preživljavanja kod ADC-tretiranih ili PBS-tretiranih miševa. Tumori su uzorkovani od kontrolnih miševa tretiranih nosačem i obrađeni fiksacijom u formalinu i ukalupljeni u parafin.
Rezultati
[0416] Slika 4c pokazuje da su LY75_DM1 i LY75_DM4 pokazala značajnu i slično potentnu antitumorsku aktivnost i produženje preživljavanja u HPAFII atimičnom bezdlakom mišjem ksenograft modelu u poređenju sa kontrolama. Svi tretmani su dobro podneti i nisu uočeni klinički znaci toksičnosti. Ovi podaci sugerišu na potencijal da ADC usmereni prema LY75, na primer LY75_DM1 i LY75_DM4, obezbeđuju kliničku korist u lečenju humanih pacijenata sa kancerom pankreasa.
Primer 19: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ksenograft modelima kancera bešike
[0417] Efikasnost LY75_DM1 i LY75_DM4 testirana je u subkutanom SW780 humani karcinom bešike SCID mišjem ksenograft modelu.
[0418] Imunodeficijentni atimični bezdlaki miševi su inokulirani subkutano sa HPAFII (humani adenokarcinom pankreasa) tumorskim ćelijama. Tumorima je omogućeno da se uspostave i miševi su sortirani u pet grupa tretmana od po 6 miševa po grupi. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla prosečnu veličinu od ~114 mm<3>/grupi, svaka grupa je tretirana jednim od sledećih jedinjenja, primenjenih intravenski u naznačenim dozama: Grupa 1 (nosač; fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS)); Grupa 2 (LY75_DM1; 1 mg/kg), Grupa 3 (LY75_DM1; 2,5 mg/kg), Grupa 4 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupa 5 (LY75_DM4; 1 mg/kg), Grupa 6 (LY75_DM4; 2,5 mg/kg), Grupa 7 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupa 8 (izotipska kontrola-SPBDDM4; 5 mg/kg). Praćene su telesne težine (BW), miševima je često proveravano zdravlje i neželjeni sporedni efekti, i tumori su mereni tri puta nedeljno. Miševi su eutanazirani kada su njihovi tumori dostigli krajnju tačku zapremine tumora od 2000 mm<3>ili posle 90 dana, šta god se prvo desilo. Efikasnost je određena iz efekta tretmana na zapreminu tumora i iz log rank analize razlika u Kaplan Majer krivama preživljavanja kod ADC-tretiranih ili PBS-tretiranih miševa. Tumori su uzorkovani od kontrolnih miševa tretiranih nosačem i obrađeni fiksacijom u formalinu i ukalupljeni u parafin.
Rezultati
[0419] Slika 4d pokazuje da su LY75_DM1 i LY75_DM4 pokazala značajnu i slično potentnu antitumorsku aktivnost i produženje preživljavanja u SW780 bezdlakom mišjem ksenograft modelu u poređenju sa kontrolama. Svi tretmani su dobro podneti i nisu uočeni klinički znaci toksičnosti. Ovi podaci sugerišu na potencijal da ADC usmereni prema LY75, na primer LY75_DM1 i LY75_DM4, obezbeđuju kliničku korist u lečenju humanih pacijenata sa karcinomom bešike.
Primer 20: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ksenograft modelima kancera dojke
[0420] Efikasnost LY75_DM1 i LY75_DM4 testirana je u subkutanom MDA-MB-468 atimičnom bezdlakom mišjem ksenograft modelu.
[0421] Imunodeficijentni atimični bezdlaki miševi su inokulirani subkutano sa MDA-MB-468 (humani trostruko negativni adenokarcinom dojke) tumorskim ćelijama. Tumorima je omogućeno da se uspostave i miševi su sortirani u sedam grupa tretmana od po 10 miševa po grupi. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla prosečnu veličinu od 167 mm<3>po grupi, svaka grupa je tretirana jednim od sledećih jedinjenja, primenjenih intravenski u naznačenim dozama: Grupa 1 (nosač; 20 mM natrijum sukcinat, pH 5,0, 6% trehaloza, 0,04%
4
polisorbat); Grupa 2 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupa 3 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupa 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupa 5 (LY75_DM4; 2,5 mg/kg), Grupa 6 (LY75_DM4; 1 mg/kg), Grupa 7 (izotipska kontrola-DM4; 5 mg/kg). Praćene su telesne težine (BW), miševima je često proveravano zdravlje i neželjeni sporedni efekti, i tumori su mereni dva puta nedeljno. Miševi su eutanazirani 82 dana posle inokulacije tumora. Efikasnost je određena iz antitumorske aktivnosti (srednja vrednost veličine tumora u tretiranoj grupi/srednja vrednost veličine tumora u kontrolnoj grupi x 100) i povećanja srednje vrednosti vremena do krajnje tačke (TTE) kod ADC-tretiranih prema PBS-tretiranim miševima. Pet najvećih tumora kod kontrolnih miševa tretiranih nosačem na dan 71 posle inokulacije je uzorkovano obrađeno fiksacijom u formalinu i ukalupljeno u parafin.
Rezultati
[0422] Slika 4e pokazuje da je svako od LY75_DM1 i LY75_DM4 demonstriralo dramatičnu antitumorsku aktivnost u MDA-MB-468 bezdlakom mišjem ksenograft modelu u poređenju sa kontrolama. Aktivnost zavisna od doze uočena je sa LY75_DM4, gde su 2,5 i 5 mg/kg bile mnogo potentnije od 1 mg/kg. Na 5 mg/kg, LY75_DM1 i LY75_DM4 su bili slično efikasni. Trajne regresije u srednjoj vrednosti zapremine tumora uočene su za LY75_DM1 na 10 i 5 mg/kg i LY75_DM4 na 5 i 2,5 mg/kg. Svi tretmani su dobro podneti i nisu uočeni klinički znaci toksičnosti. Ovi podaci sugerišu na potencijal da ADC usmereni prema LY75, na primer LY75_DM1 i LY75_DM4, obezbeđuju kliničku korist u lečenju humanih pacijenata sa trostruko negativnim kancerom dojke.
Primer 21: Efikasnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela u ksenograft modelima kolorektalnog kancera
[0423] Efikasnost LY75_DM1 i LY75_DM4 testirana je u subkutanom COLO205 kolorektalni adenokarcinom atimičnom bezdlakom mišjem ksenograft modelu.
[0424] Imunodeficijentni atimični bezdlaki miševi su inokulirani subkutano sa COLO205 (humani kolorektalni adenokarcinom) tumorskim ćelijama. Tumorima je omogućeno da se uspostave i miševi su sortirani u pet grupa tretmana od po 6 miševa po grupi. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla prosečnu veličinu od 117 mm<3>po grupi, svaka grupa je tretirana jednim od sledećih jedinjenja, primenjenih intravenski u naznačenim dozama: Grupa 1 (nosač; fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS)); Grupa 2 LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupa 3 (izotipska kontrola-DM1; 10 mg/kg), Grupa 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupa 5 (izotipska kontrola-DM4; 5 mg/kg). Druga doza je primenjena dvanaest dana posle prve. Praćene su telesne težine (BW), miševima je često proveravano zdravlje i neželjeni sporedni efekti, i tumori su mereni dva puta nedeljno. Miševi su eutanazirani kada su njihovi tumori dostigli krajnju tačku zapremine tumora od 1000 mm<3>ili posle 60 dana, šta god se prvo desilo. Efikasnost je određena iz odlaganja rasta tumora (TGD), povećanja medijane vremena do krajnje tačke (TTE) i iz log rank analize razlika u Kaplan Majer krivama preživljavanja kod ADC-tretiranih prema PBS-tretiranim miševima. Prvih pet kontrolnih miševa tretiranih nosačem koji su dostigli krajnju tačku uzorkovani su za tumore koji su obrađeni fiksacijom u formalinu i ukalupljeni u parafin.
Rezultati
[0425] Slika 4f pokazuje da su LY75_DM1 i LY75_DM4 pokazali sličnu umerenu antitumorsku aktivnost i produženje preživljavanja u COLO205 kolorektalni adenokarcinom bezdlakom mišjem ksenograft modelu u poređenju sa kontrolama. Svi tretmani su dobro podneti i nisu uočeni klinički znaci toksičnosti. Ovi podaci sugerišu na potencijal da ADC usmereni prema LY75, na primer LY75_DM1 i LY75_DM4, obezbeđuju kliničku korist u lečenju humanih pacijenata sa kolorektalnim kancerom.
Primer 22: Toksičnost DM1-konjugovanih i DM4-konjugovanih anti-LY75 monoklonalnih antitela kod cinomolgus majmuna
[0426] Šest mužjaka majmuna je dodeljeno studiji sa 2 majmuna/grupi. Bilo nosač (PBS), LY75_DM4 (koji se može isecati) ili LY75_DM1 (koji se ne može isecati) je primenjen dva puta (na dan 1 i dan 29) 15-minutnom intravenskom infuzijom na 0 mg/kg/dozi (PBS, nosač), 5 mg/kg/dozi (LY75_DM4, koji se može isecati) ili 10 mg/kg/dozi (LY75_DM1, koji se ne može isecati). Uzorci krvi su sakupljeni za toksikokinetičke procene pre inicijalne doze (dan 1), i 1, 2, 3, 7, 14, 21 i 28 dana posle svake doze. Uzorci krvi za kliničke patološke analize sakupljeni su pre inicijalne doze (dan 1), i 1, 3, 7, 14, 21 i 28 dana posle svake doze (28 dana posle 1. doze takođe je služilo kao vremenska tačka pre doze za 2. dozu). Sve ispitivane životinje su eutanazirane i nekropsirane nakon završnog uzimanja krvi na dan 57. Plazma odvojena od svakog vađenja krvi je izolovana, zamrznuta i otpremljena u Oxford BioTherapeutics, Inc. kako bi se analizirala za koncentraciju ADC pomoću ELISA.
[0427] Nalazi kliničke patologije povezani sa tretmanom uključivali su blagu regenerativnu anemiju i prolazno smanjenje profila leukocita u krvi, najprimetnije u broju neutrofila. Anemija je uočena kod obe životinje tretirane sa 5 mg/kg LY75_DM4 i kod jedne od dve životinje tretirane sa 10 mg/kg LY75_DM1. Ozbiljna neutropenija sa najnižim nivoom na jednoj nedelji posle doze i brz oporavak u brojevima uočeni su kod svih životinja; najniži nivo apsolutnog broja neutrofila bio je niži kod životinja tretiranih sa LY75_DM4. Nije bilo efekata povezanih sa testnim artiklom na APTT i PT parametre koagulacije. Hemijske promene u serumu uključivale su prolazni porast AST, CK, LDH (kod 1 od 2 životinje u svakoj grupi tretmana) i globulina nakon primene 5 mg/kg LY75_DM4 i 10 mg/kg LY75_DM1. Pored toga, prolazno povećanje enzima ALT specifičnog za jetru uočeno je samo kod životinja tretiranih sa LY75_DM4. Kratko trajanje i/ili magnituda povećanja hemijskih parametara u serumu sugerišu da nisu bili nepovoljni. Nije bilo nalaza urinalize povezane sa testnim artiklom. Nakon pregleda na nekropsiji posle 4-nedeljnog perioda oporavka nije bilo velikih patoloških nalaza povezanih sa tretmanom ili promena apsolutne i relativne težine organa. Histopatološki nalazi samo na štitnoj žlezdi (promena u morfologiji koloida u folikulima) i bubrezima (prošireni kanalići u spoljašnjem korteksu), ocenjeni su kao minimalne ozbiljnosti; nisu povezane sa promenama u drugim parametrima studije; i, nema štetnu i minimalnu toksikološku ozbiljnost. Zaključak: Ponovljena doza tretmana sa dve doze od 5 mg/kg LY75_DM4 ili 10 mg/kg LY75_DM1 dobro je podneta kod cinomologus majmuna. Svi nalazi toksičnosti povezani sa tretmanom bili su reverzibilni nakon 4-nedeljnog perioda oporavka.
Primer 23: Karakterizacija epitopa LY75 A1 pomoću analize kompetitivnog vezivanja na osnovu sortiranja ćelija aktiviranih florescencijom (FACS)
Postupak
[0428] COLO205 ćelije (ATCC, katalog # CCL-222) su odvojene od flaskova za kulturu tkiva sa skidačem ćelija (Cellgro, katalog # MT-25-056CI). Ćelije su isprane i resuspendovane u FACS puferu (PBS 2% FBS), neutralizovane medijumom za rast, i prebrojane. Ćelije su zasejane na 50.000 ćelija po bunariću u ploču sa 96 bunarića sa V dnom. Ćelije su isprane jednom FACS puferom (PBS (Fisher, katalog # SH30028-03) 2% FBS). Anti-LY75-mAb (odabrano iz Primera 1) ili LY75_A1 je dodato u bunariće počevši od 250 nM i razblaženo serijski 3 puta i naneto na odgovarajuće bunariće tokom 45 minuta na ledu.
Testni bunarići za koje su bili potrebni jedan ili više koraka bojenja ostavljeni su u FACS puferu kako bi se osiguralo da završno bojenje bude završeno istovremeno za sve testirane uslove. Dva bunarića su ostala neobojena u FACS puferu kao kontrole.
[0429] Posle inkubacije sa blokirajućim antitelom, ćelije su isprane dva puta u FACS puferu. Ćelije su resuspendovane u FACS puferu koji je sadržao anti-LY75-mAb konjugovano za MCC-DM1 (1 nM) i inkubirane na ledu tokom 45 minuta. Ćelije su isprane kao iznad i resuspendovane u FACS puferu plus 1 μg/ml mišjeg anti-majtansin antitela i inkubirane na ledu tokom 45 minuta. Ćelije su isprane kao iznad i resuspendovane u FACS puferu koji je sadržao 2 μg/ml kozjeg anti-mišjeg kapa RPE. Ćelije su inkubirane na ledu tokom 45 minuta, i zatim isprane kao iznad. Ćelije su resuspendovane u FACS puferu na 200 μl po bunariću. Srednji intenzitet fluorescencije svakog uzorka određen je upotrebom Guava EasyCyte Plus HT protočnog citometra (formati ploče sa 96 bunarića) i sirovi podaci su analizirani upotrebom Guava Cytosoft.
Rezultati
[0430] Slika 5a pokazuje da je blokiranje sa anti-LY75-mAb-MCC-DM1 smanjilo vezivanje anti-LY75-mAb. Analiza vezivanja LY75_A1 za COLO205 ćelije pokazala je da LY75_A1 nije u stanju da blokira vezivanje anti-LY75-mAb-MCC-DM1 (videti Sliku 5b). Prema tome se može utvrditi da su anti-LY75-mAb i LY75_A1 nekompetitivna antitela i LY75_A1 prepoznaje drugačiji i jedinstveni epitop LY75 u odnosu na druga anti-LY75 antitela.
Primer 24: Karakterizacija epitopa LY75 A1 pomoću testa peptidnog čipa
Postupak
[0431] Analizu peptidnog čipa izvela je LC Sciences, Houston TX, ukratko postupak je sadržao sledeće korake: - susedni 8mer peptidi LY75 proteina koji imaju jedno aminokiselinsko preklapanje koji obuhvataju ostatke 216 do 1666 pune dužine LY75 proteina su sintetisani i imobilizovani na čip. Čip se sastojao od tri panela tako da je eksperiment izveden u triplikatu. Čip je adresiran sa LY75_A1 kako bi se identifikovali peptidi za koje se antitelo vezuje. Test vezivanja je izveden pod sledećim uslovima: - čip koji sadrži susedne peptide u tri primerka ispran je sa 1 ml vezujućeg pufera na 4 °C tokom 20 min. Zatim je inkubiran sa 1 μg/ml LY75_A1 u vezujućem puferu (pH 7,0) na 4 °C tokom 2 h. Čip je ponovo ispran sa 0,5 ml pufera za ispiranje na 4 °C tokom 30 min, i zatim inkubiran sa 25 ng/ml anti-humanog IgG Alexa 647 konjugata u vezujućem puferu (pH 7,0) na 4 °C tokom 1 h. Čip je ponovo ispran sa 0,5 ml pufera za ispiranje na 4 °C tokom 30 min.
[0432] Čip je potom skeniran na 635 nm i PMT 500 i zabeležen je intenzitet signala. Peptid je klasifikovan kao detektabilan ukoliko je bio prisutan u najmanje 2/3 legalnih duplikata. Prosečni intenzitet signala replikata je saopšten kao konačni intenzitet signala.
Rezultati
[0433] Kao što se može videti sa Slike 6 antitelo LY75_A1 je pokazalo specifično vezivanje za određeni broj peptida smeštenih u čipu. Maksimalan signal viđen za LY75_A1 vezivanje bio je 25000 (skala 1-65535), pri čemu je prosečni signal za sva mesta na čipu bio oko 885. Intenzitet signala od 3000 postavljen je kao granična vrednost pozadine za nespecifično vezivanje. Na osnovu viđenog nivoa intenziteta signala vezivanja antitela identifikovane su potencijalne sekvence koje formiraju epitop za LY75_A1. Ovi regioni su pokazani na Slikama 6a - 6j i kao SEQ ID NO: 22-31.
Primer 25: LY75 A1 test svlačenja peptida
Postupak
1.1 Test svlačenja
[0434] Rekombinantni LY75 protein je digestiran pomoću tripsinske proteolize na perlama (Promega, SAD). Rezultujući digestirani peptidi su prikupljeni upotrebom C18 kolone za hvatanje (Thermo Fisher Scientific). Prečišćeni peptidi su zatim inkubirani sa 200 μl protein A perli umreženih sa LY75A1 antitelom preko noći na 4 °C. Sledećeg dana su sakupljeni nevezani peptidi i perle su isprane sa 1 ml PBS dva puta. Peptidi vezani za antitela su eluirani sa perli zagrevanjem na 90 °C u 100 μl PBS tokom 5 minuta. Ovaj korak eluiranja je ponovljen.
1.2 Masena spektrometrija
[0435] Uzorci su analizirani tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom upotrebom Waters nanoACQUITY UPLC sistema opremljenog nanoACQUITY UPLC BEH 130 C18 kolonom, 75 μm x 250 mm (186003545) i LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). Peptidi su eluirani sa gradijentom od 300 nl/min povećavajući sa 3% na 35% acetonitrila tokom 120 min. Maseni spektri punog skeniranja dobijeni su pri 60000 rezolucione snage između 400-2000 m/z masenog opsega u Orbitrap. U svakom ciklusu, odabrano je dvadeset najintenzivnijih peptida za CID MS/MS skeniranje u linearnoj jonskoj zamci sa izvorom nanosprej jona postavljenim na instrument.
1.3 Analiza amino-kiselinske sekvence peptida
[0436] Sirovi podaci generisani iz LTQ Orbitrap Velos su obrađeni kroz Mascot softver (Matrix Science) koji upotrebljava Movs (Mowse) algoritam (Curr Biol.1993, jun 1;3(6):327-3) za zaključivanje amino-kiselinskih sekvenci sa listi pika pretraživanjem baze podataka sekvenci koja se sastoji od Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), IPI (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) i SwissProt (http://www.uniprot.org) zajedno sa sekvencama kontaminirajućih proteina. Kriterijumi za identifikaciju peptida uključivali su tripsinsku digestiju, do 2 propuštena mesta isecanja i različite biološke i hemijske modifikacije (oksidisani metionin, modifikacija cisteina pomoću MMTS ili jodoacetamidom i fosforilacija serina, treonina i tirozina). Peptidi rangirani na mestu 1 sa očekivanom vrednošću od 0,05% ili manje, ocena jona od 28 ili više učitani su u našu OGAP bazu podataka.
1.4 Diskriminacija peptida asociranih sa LY75
[0437] Postupak identifikacije LY75 upotrebljavao je peptidne sekvence dobijene eksperimentalno masenom spektrometrijom, kao što je opisano iznad, humane proteine koji se javljaju u prirodi za identifikaciju i organizaciju kodirajućih egzona u objavljenoj sekvenci humanog genoma. Ove eksperimentalno određene sekvence su upoređene sa OGAP® bazom podataka koja je sastavljena obradom i integracijom peptidnih masa, peptidnih potpisa, EST i javnog domena podataka o sekvenci genoma (Public Domain Genomic Sequence Data) kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2009/087462.
Rezultati
1
[0438] Rezultati testa svlačenja peptida upotrebom antitela LY75_A1 pokazani su u Tabeli 1 ispod i na Slici 7. Peptidi koji su identifikovani u obe elucije peptida 1a i 1b u testu svlačenja i u testu čipa smatrani su najverovatnijim kandidatima za formiranje epitopa.
Tabela 1 Poređenje eksperimenata sa peptidnim čipom i svlačenjem peptida
[0439] Tabela 1 pokazuje da je određen broj preklapajućih peptidnih regiona LY75 identifikovan i u testu peptidnog čipa i u obe elucije 1a i 1b u testu svlačenja peptida. Smatra se da je najverovatnije da ovi regioni sadrže epitop prepoznat od strane antitela LY75_A1, pošto su vezani od strane LY75_A1 testiranim u obe korišćene tehnike.
Lista sekvenci:
1 1
12
1
14
1
1

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koje se vezuje za LY75, pri čemu navedeno antitelo sadrži:
a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:
i) prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5;
ii) drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6; i
iii) treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7; i
b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:
i) prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8;
ii) drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9; i
iii) treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10,
pri čemu bilo koja jedna ili više od gore navedenih SEQ ID NO nezavisno sadrže jednu ili dve amino-kiselinske supstitucije i pri čemu je antitelo internalizovano.
2. Izolovano antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koje se vezuje za LY75, pri čemu navedeno antitelo sadrži:
a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:
i) prvi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 5;
ii) drugi vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 6; i
iii) treći vhCDR koji sadrži SEQ ID NO: 7; i
b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:
i) prvi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 8;
ii) drugi vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 9; i
iii) treći vlCDR koji sadrži SEQ ID NO: 10.
3. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, koje sadrži teški lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identičnosti amino-kiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 1 i laki lanac koji ima najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identičnosti amino-kiselinske sekvence sa SEQ ID NO: 2.
4. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 koje dodatno sadrži kovalentno vezani ostatak, opciono pri čemu je navedeni ostatak lek.
5. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što je navedeni lek odabran iz grupe koja se sastoji od majtansinoida, dolastatina, hemiasterlina, auristatina, trihotecena, kaliheamicina, CC1065 i njihovih derivata, poželjno pri čemu je navedeni lek majtansinoid odabran iz grupe koja se sastoji od DM4 i DM1.
6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa bilo kojim od prethodnih patentnih zahteva, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača, ekscipijenasa ili nosača.
7. Nukleinska kiselina koja kodira:
i) teški lanac antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5; i
ii) laki lanac antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.
8. Ekspresioni vektor koji sadrži jednu ili obe od nukleinskih kiselina prema patentnom zahtevu 7 operativno povezane sa jednim ili više regulatornih elemenata.
9. Ćelija domaćin koja sadrži:
1
(i) ekspresioni vektor koji sadrži nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 7 operativno povezane sa jednim ili više regulatornih elemenata; ili
(ii) prvi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira teški lanac antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 7 operativno povezanu sa jednim ili više regulatornih elemenata i drugi ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira laki lanac antitela ili njegov antigenvezujući deo prema patentnom zahtevu 7 operativno povezanu sa jednim ili više regulatornih elemenata.
10. Postupak za izradu antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koji sadrži uzgajanje ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 9 pod uslovima gde se antitelo ili njegov antigen-vezujući deo eksprimira i opciono izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela.
11. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju kancera.
12. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačeno time što je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo internalizovan ćelijom koja eksprimira LY75.
13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 11 ili 12, naznačeno time što antitelo ili antigen-vezujući deo sadrži kovalentno vezan lek konjugat, poželjno, pri čemu je kovalentno vezan lek konjugat majtansinoid, poželjnije DM4.
14. Antitelo ili njegov antigen-vezujući deo za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 11 do 13 naznačeno time što je navedeni kancer odabran iz grupe koja se sastoji od kancera pankreasa, kancera jajnika, kancera dojke poželjno trostruko negativnog kancera dojke, kolorektalnog kancera, kancera jednjaka, kancera kože, kancera štitne žlezde, kancera pluća, kancera bubrega, kancera jetre, kancera glave i vrata, kancera bešike, kancera želuca, leukemije, poželjno akutne mijeloidne leukemije ili hronične limfocitne leukemije, mijeloma, poželjno multiplog mijeloma i limfoma, poželjno difuznog krupnoćelijskog B limfoma (DLBCL), B-ćelijskog limfoma, folikularnog limfoma, limfoma mantle ćelija, limfoma limfoidnog tkiva povezanog sa mukozom
1
(MALT), T-ćelijama/histiocitima bogatog B-ćelijskog limfoma, Burkitovog limfoma, limfoplazmocitnog limfoma, limfoma malih limfocita, limfoma marginalne zone, T-ćelijskog limfoma, perifernog T-ćelijskog limfoma, anaplastičnog krupnoćelijskog limfoma i angioimunoblastnog T-ćelijskog limfoma.
15. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5 za upotrebu u terapiji ili za upotrebu kao medikament.
11
RS20210352A 2013-10-11 2014-10-10 Konjugovana antitela prema ly75 za lečenje kancera RS61620B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361890098P 2013-10-11 2013-10-11
US201361890104P 2013-10-11 2013-10-11
PCT/GB2014/053057 WO2015052537A1 (en) 2013-10-11 2014-10-10 Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer
EP14789591.6A EP3055331B1 (en) 2013-10-11 2014-10-10 Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61620B1 true RS61620B1 (sr) 2021-04-29

Family

ID=51795649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210352A RS61620B1 (sr) 2013-10-11 2014-10-10 Konjugovana antitela prema ly75 za lečenje kancera

Country Status (34)

Country Link
US (4) US10081682B2 (sr)
EP (1) EP3055331B1 (sr)
JP (1) JP6657075B2 (sr)
KR (1) KR102357173B1 (sr)
CN (1) CN105745224B (sr)
AU (1) AU2014333563B9 (sr)
BR (1) BR112016007402B1 (sr)
CA (1) CA2926324C (sr)
CL (1) CL2016000770A1 (sr)
CR (1) CR20160156A (sr)
CU (1) CU24320B1 (sr)
CY (1) CY1124006T1 (sr)
DK (1) DK3055331T3 (sr)
DO (1) DOP2016000072A (sr)
EA (1) EA036927B1 (sr)
ES (1) ES2859604T3 (sr)
GE (1) GEP20176805B (sr)
HR (1) HRP20210410T1 (sr)
HU (1) HUE055190T2 (sr)
IL (1) IL244884B (sr)
LT (1) LT3055331T (sr)
MX (1) MX365742B (sr)
MY (1) MY174562A (sr)
PE (1) PE20160561A1 (sr)
PH (1) PH12016500580B1 (sr)
PL (1) PL3055331T3 (sr)
PT (1) PT3055331T (sr)
RS (1) RS61620B1 (sr)
SG (1) SG11201602460QA (sr)
SI (1) SI3055331T1 (sr)
SM (1) SMT202100180T1 (sr)
TW (1) TWI649334B (sr)
UA (1) UA119047C2 (sr)
WO (1) WO2015052537A1 (sr)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20210410T1 (hr) 2013-10-11 2021-04-30 Oxford Bio Therapeutics Limited Konjugirana antitijela prema ly75 za liječenje raka
US10260109B2 (en) 2015-05-29 2019-04-16 Universiteit Maastricht Method for identifying subjects with aggressive melanoma skin cancer at diagnosis
GB201703876D0 (en) * 2017-03-10 2017-04-26 Berlin-Chemie Ag Pharmaceutical combinations
US20200347138A1 (en) * 2017-10-27 2020-11-05 Indian Institute Of Science Dendritic cells-targeting vaccine
GB201809746D0 (en) * 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
AU2022282609A1 (en) 2021-05-26 2023-11-30 Oxford Biotherapeutics Ltd Pharmaceutical combination comprising an anti-cd205 antibody and an immune checkpoint inhibitor
US20250073346A1 (en) 2021-11-18 2025-03-06 Oxford Bio Therapeutics Ltd Pharmaceutical combinations
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
US12311033B2 (en) 2023-05-31 2025-05-27 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
US20250302763A1 (en) 2024-02-22 2025-10-02 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4169888A (en) 1977-10-17 1979-10-02 The Upjohn Company Composition of matter and process
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
EP0271581B1 (en) 1986-04-17 1993-01-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel compounds dc-88a and dc-89a1 and process for their preparation
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
FI102355B1 (fi) 1988-02-11 1998-11-30 Bristol Myers Squibb Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjugaattien valmistamiseksi
US5084468A (en) 1988-08-11 1992-01-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-88a derivatives
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU652936B2 (en) 1990-05-07 1994-09-15 Scripps Clinic And Research Foundation Intermediates in the formation of the calicheamicin and esperamicin oligosaccharides
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5837242A (en) 1992-12-04 1998-11-17 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5767237A (en) 1993-10-01 1998-06-16 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Peptide derivatives
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
WO1995029179A1 (en) 1994-04-22 1995-11-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-89 derivative
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US6048972A (en) * 1994-07-13 2000-04-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant materials for producing humanized anti-IL-8 antibodies
JP3865418B2 (ja) * 1994-07-13 2007-01-10 中外製薬株式会社 ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体
US5550246A (en) 1994-09-07 1996-08-27 The Scripps Research Institute Calicheamicin mimics
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US20040258688A1 (en) 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
JPH10513350A (ja) * 1995-01-31 1998-12-22 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ ＤＥＣ（樹状細胞及び上皮細胞、２０５ ｋＤａ）の同定、Ｃ型レクチンドメインを有するレセプター、ＤＥＣをコードする核酸、及びこれらの使用
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
ES2195036T3 (es) 1995-12-22 2003-12-01 Bristol Myers Squibb Co Conectores de hidrazona ramificados.
ATE332372T1 (de) 1996-05-29 2006-07-15 Derek Nigel John Hart Rezeptor von dendritischen zellen.
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK1176195T3 (da) 1999-04-09 2013-06-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle
US6939545B2 (en) 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
WO2001024763A2 (en) 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2001029246A1 (fr) 1999-10-19 2001-04-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production d'un polypeptide
WO2001057251A2 (en) 2000-02-04 2001-08-09 Aeomica, Inc. Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6900016B1 (en) 2000-09-08 2005-05-31 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with inflammatory autoimmune disease, methods of detection and uses thereof
EA013224B1 (ru) 2000-10-06 2010-04-30 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Клетки, продуцирующие композиции антител
JPWO2002030954A1 (ja) 2000-10-06 2004-02-19 協和醗酵工業株式会社 抗体を精製する方法
IT1320715B1 (it) 2000-10-19 2003-12-10 Cselt Centro Studi Lab Telecom Modulo generatore di circuiti per la decodifica di codiciconvoluzionali, metodo per la generazione di tale tipo di circuito e
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2002237972B2 (en) 2001-01-31 2007-11-29 Biogen Idec Inc. Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
AU2002307145B2 (en) 2001-04-05 2007-11-29 The John Hopkins University Chimeric vaccines
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
KR20030033007A (ko) 2001-05-31 2003-04-26 코울터 파머수티컬, 인코포레이티드 세포독소, 약물전구체, 링커 및 이에 유용한 안정화제
MXPA03011979A (es) 2001-06-18 2005-04-08 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de ovario composiciones y metodos para rastrear moduladores de cancer de ovario.
CA2453822C (en) 2001-08-03 2011-02-22 Tyco Healthcare Group Lp Tissue marking apparatus and method
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003217966A1 (en) 2002-03-07 2003-10-08 Licentia, Ltd. Lymphatic and blood endothelial cell genes
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
PT2357006E (pt) 2002-07-31 2016-01-22 Seattle Genetics Inc Conjugados de fármacos e sua utilização para tratamento do cancro, de uma doença autoimune ou de uma doença infeciosa
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US20060251667A1 (en) 2002-08-29 2006-11-09 Chua Kaw Y Recombinant nucleic acid useful for inducing protective immune response against allergens
WO2004024097A2 (en) 2002-09-16 2004-03-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
AU2003275126A1 (en) 2002-09-20 2004-04-08 Wyeth Holdings Corporation Hemiasterlin derivatives for treating resistant tumors
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
US20040146948A1 (en) 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
WO2004043493A1 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
US20060281672A1 (en) 2002-12-06 2006-12-14 Hart Derek N J Dec-205 (ly 75)/dcl-1 intergenic splice variants associated with hodgkin's disease, and uses thereof
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
US20080181906A1 (en) 2003-05-19 2008-07-31 Haynes Barton F Polyvalent Immunogen
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
FR2855046B1 (fr) 2003-05-23 2005-07-22 Oreal Composition tinctoriale comprenant au moins un precurseur de colorant et un coplolymere sequence amphiphile
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
PT1725249E (pt) 2003-11-06 2014-04-10 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina capazes de conjugação a ligandos
US20100190150A1 (en) 2004-01-07 2010-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
CA2564076C (en) 2004-05-19 2014-02-18 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
WO2006093524A2 (en) 2004-07-16 2006-09-08 The General Hospital Corporation Antigen-carbohydrate conjugates
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
EP1695981A1 (de) 2005-02-25 2006-08-30 Forschungsverbund Berlin e.V. Verfahren zum Redox-Potential-abhängigen Nachweis von Targetmolekülen durch wechselwirkende Polypeptide
US7608413B1 (en) 2005-03-25 2009-10-27 Celera Corporation Kidney disease targets and uses thereof
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
CA2617907A1 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
WO2007030531A2 (en) 2005-09-06 2007-03-15 Molecular Image Inc. Reagents for testing and molecular imaging of liver cancer
US7842466B1 (en) 2005-09-16 2010-11-30 Celera Corporation Colon disease targets and uses thereof
CA2624189A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
CA2627190A1 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
KR20080114709A (ko) 2006-02-02 2008-12-31 신타가 비.브이. 수용성 ｃｃ-1065 유사체 및 그들의 결합체
GB0611116D0 (en) 2006-06-06 2006-07-19 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Proteins
WO2008016356A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 Genizon Biosciences Genemap of the human genes associated with psoriasis
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
WO2009017394A1 (en) 2007-08-01 2009-02-05 Syntarga B.V. Substituted cc-1065 analogs and their conjugates
AU2013201417B2 (en) 2007-11-07 2015-05-21 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (DEC-205)
AU2008323848B2 (en) * 2007-11-07 2014-09-25 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (DEC-205)
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
JP2011509079A (ja) 2007-12-24 2011-03-24 オックスフォード ビオトヘラペウトイクス エルティーディー． エフリンａ型受容体１０タンパク質
PL2282773T3 (pl) 2008-05-02 2014-08-29 Seattle Genetics Inc Sposoby i kompozycje do wytwarzania przeciwciał i pochodnych przeciwciał o obniżonej fukozylacji rdzeniowej
EP2159291A1 (en) 2008-09-01 2010-03-03 Agendia B.V. Means and method for determining tumor cell percentage in a sample
HUE035798T2 (en) 2008-11-03 2018-05-28 Syntarga Bv CC-1065 analogues and conjugates
WO2011011677A2 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Aderans Research Institute, Inc. Potency markers
CA2813494A1 (en) 2009-10-08 2011-04-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for amelioration of autoimmune disease using fusion proteins of anti-dendritic cell receptor antibody to peptide sequences
BR112012026410B8 (pt) 2010-04-15 2023-01-31 Spirogen Dev Sarl Composto e conjugado de pirrolobenzodiazepinas e usos dos mesmos
TWI540136B (zh) 2010-04-15 2016-07-01 梅迪繆思有限公司 吡咯并苯并二氮呯及其共軛物
TW201247706A (en) 2011-03-08 2012-12-01 Baylor Res Inst Novel vaccine adjuvants based on targeting adjuvants to antibodies directly to antigen-presenting cells
GB201220010D0 (en) * 2012-11-07 2012-12-19 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic amd diagnostic target
CN103044552B (zh) 2012-12-11 2019-01-29 中国医学科学院病原生物学研究所 人源化的抗树突状细胞表面dec-205分子的单克隆抗体
HRP20210410T1 (hr) 2013-10-11 2021-04-30 Oxford Bio Therapeutics Limited Konjugirana antitijela prema ly75 za liječenje raka
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Also Published As

Publication number Publication date
CU24320B1 (es) 2018-02-08
ES2859604T8 (es) 2022-01-11
MX2016004304A (es) 2016-11-10
TW201605898A (zh) 2016-02-16
PL3055331T3 (pl) 2021-09-06
CA2926324C (en) 2023-10-03
PH12016500580B1 (en) 2020-10-30
AU2014333563B9 (en) 2020-04-02
CU20160042A7 (es) 2016-08-31
JP2016533711A (ja) 2016-11-04
NZ718617A (en) 2022-03-25
BR112016007402A2 (pt) 2017-09-12
DOP2016000072A (es) 2016-06-15
EP3055331A1 (en) 2016-08-17
HK1222869A1 (en) 2017-07-14
PH12016500580A1 (en) 2016-05-30
CN105745224B (zh) 2019-11-05
IL244884B (en) 2021-12-01
WO2015052537A1 (en) 2015-04-16
GEP20176805B (en) 2018-01-10
SI3055331T1 (sl) 2021-04-30
KR20160065872A (ko) 2016-06-09
HUE055190T2 (hu) 2021-12-28
PT3055331T (pt) 2021-04-05
SMT202100180T1 (it) 2021-05-07
CR20160156A (es) 2016-11-01
CN105745224A (zh) 2016-07-06
TWI649334B (zh) 2019-02-01
EP3055331B1 (en) 2021-02-17
DK3055331T3 (da) 2021-03-22
ES2859604T3 (es) 2021-10-04
IL244884A0 (en) 2016-05-31
BR112016007402B1 (pt) 2023-03-28
UA119047C2 (uk) 2019-04-25
HRP20210410T1 (hr) 2021-04-30
AU2014333563A1 (en) 2016-04-28
LT3055331T (lt) 2021-03-25
US20210371541A1 (en) 2021-12-02
MX365742B (es) 2019-06-12
US10081682B2 (en) 2018-09-25
KR102357173B1 (ko) 2022-01-27
MY174562A (en) 2020-04-26
PE20160561A1 (es) 2016-06-03
EA201690599A1 (ru) 2016-07-29
AU2014333563B2 (en) 2020-03-05
SG11201602460QA (en) 2016-04-28
EA036927B1 (ru) 2021-01-15
US20250163174A1 (en) 2025-05-22
US20160257760A1 (en) 2016-09-08
US20190106506A1 (en) 2019-04-11
CY1124006T1 (el) 2022-05-27
JP6657075B2 (ja) 2020-03-04
CL2016000770A1 (es) 2017-01-27
CA2926324A1 (en) 2015-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250163174A1 (en) Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer
US20250297014A1 (en) Pharmaceutical combinations
EP3219731A1 (en) Anti-ror1 antibodies
US9932411B2 (en) Antibodies
HK1222869B (en) Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer
HK40096180A (en) Pharmaceutical combinations comprising an anti-ly75 antibody
NZ718617B2 (en) Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer