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JPH10513350A - ＤＥＣ（樹状細胞及び上皮細胞、２０５ ｋＤａ）の同定、Ｃ型レクチンドメインを有するレセプター、ＤＥＣをコードする核酸、及びこれらの使用 - Google Patents

ＤＥＣ（樹状細胞及び上皮細胞、２０５ ｋＤａ）の同定、Ｃ型レクチンドメインを有するレセプター、ＤＥＣをコードする核酸、及びこれらの使用

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JPH10513350A
JPH10513350A JP8523726A JP52372696A JPH10513350A JP H10513350 A JPH10513350 A JP H10513350A JP 8523726 A JP8523726 A JP 8523726A JP 52372696 A JP52372696 A JP 52372696A JP H10513350 A JPH10513350 A JP H10513350A
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dec
cells
protein
cell
nucleic acid
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JP8523726A
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ラルフ エム スタインマン
マイケル シー ヌッセンツワイグ
ウィリアム ジェイ スウィッガード
ワンピン イーアン
Original Assignee
ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ filed Critical ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は免疫応答、エンドサイトーシス、及び経上皮輸送における抗原提示と関連するレセプターの同定及び特性決定に関する。レセプターの同定、10のレクチン結合ドメインを有するものとしてのその特性決定、及びオリゴ糖及びオリゴ糖修飾分子、例えば、糖タンパク質の摂取及びプロセシングにおけるその役割の証明は免疫応答の改善、及び分子の経上皮輸送に重要な関連問題を有する。該レセプター、すなわち、本明細書中で“ＤＥＣ”と称される、内在性膜タンパク質は、主として樹状細胞に見られるだけでなく、Ｂ細胞、脳毛細管、骨髄ストローマ、腸柔突起及び肺気道の上皮、並びに胸腺の皮質上皮及び末梢リンパ系臓器のＴ細胞領域中の樹状細胞に見られる。ＤＥＣのマウス及びヒト対応物は205 kDa の見掛分子量を有し、マウス対応物はpH7.5 で等電点を有し、また炭水化物がマウスＤＥＣの合計質量の約７kDa である。本発明は、DEC-205 レセプターの付加的なリガンドの同定に関するものであり、これは樹状細胞及びDEC-205 を有するその他の細胞を有利に標的とし得る。樹状細胞による提示のための抗原のターゲッティングは樹状細胞が静止している時に寛容性を与えることができ、または樹状細胞が、例えば、サイトカインまたはリンホカイン、例えば、コロニー刺激因子（CSF）による刺激により活性化される時に免疫刺激（即ち、予防接種）を与えることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＥＣ(樹状細胞及び上皮細胞、205 kDa)の同定、Ｃ型レクチンドメインを有す るレセプター、ＤＥＣをコードする核酸、及びこれらの使用 本発明に至る研究は国立健康協会助成金No.AI13013で一部支持された。政府は 本発明に或る種の権利を有する。 発明の分野 本発明は免疫応答、エンドサイトーシス、及び経上皮輸送における抗原提示と 関連するレセプターの同定及び特性決定に関する。レセプターの同定、10のレク チン結合ドメインを有するものとしてのその特性決定、及びオリゴ糖及びオリゴ 糖修飾分子、例えば、糖タンパク質の摂取及びプロセシングにおけるその役割の 証明は、免疫応答の改善、及び分子の経上皮輸送に重要な関連性を有する。 発明の背景 樹状細胞は、主たる機能がＴ細胞を捕獲し、プロセシングし、その抗原を提示 することである白血球の特異なクラスである(Steinman，1991，Annu.Rev.Immu-n ol．9:271-96)。樹状細胞と末梢免疫系中の特定のＴ細胞の間の相互作用は免疫 応答の誘導をもたらし、一方、胸腺中では樹状細胞による提示が負の選択をもた らす(Tanakaら，1993，Eur.J.Immunol．23:2614-2621; Matzingerら，1989,Natu re 338:74-76）。樹状細胞のように、胸腺上皮細胞はＴ細胞にＭＨＣ結合ペプチ ドを提示するが、Ｔ細胞活性化または負の選択を誘導する代わりに、胸腺上皮細 胞は正の選択を誘導する(Hugo ら，1993，Immunol.Rev．135:133-35; Elli-ott. Imunol.Rev．135:215-25)。Ｔ細胞との相互作用の既知の要件と合致して、樹状 細胞及び胸腺上皮細胞の両方が、細胞−細胞接触を促進し、かつＴ細胞活性化を 媒介する幾つかの細胞表面タンパク質を発現する(Steinman，1991，Annu．Rev I rnmunol．9:271-96; Hugo ら，1993，Irnmunol.Rev．135:133-35; Elliott． Immunol．Rev．135215-25)。樹状細胞及び胸腺上皮細胞の両方に関する付加的な 基本的要件は抗原の摂取及びプロセシングであり、いずれの細胞型も抗原捕獲ま たは提示に特殊化されるレセプターを発現することが未だに知られていない。 Kraal ら(J.Exp.Med．163:981)によるその初期の単離以降10年間にわたって、 モノクローナル抗体NLDC-145が種々の組織中でマウス樹状細胞（ＤＣ）の組織化 学マーカー及びフローサイトメトリーのマーカーとして利用されていた(Kraal らの上記文献; Crowley ら，1989，Cell Immunol．118:108; Vremec ら，1992， J.Exp.Med．176:47; Pollard及びLipscomb，1990，J.Exp.Med．172:159; Soesa- tyo ら，1990，Cell Tiss.Res．259:587; Austynら,1994，J.Immunol．152:2401 ; Luら，1994，J.Exp.Med．179:1823;及びBreel ら，1988，Immunol．63:657)。 また、NLDC-145により結合された抗原が胸腺皮質上皮に豊富にある。しかしなが ら、NLDC-145抗原のクローニング及び特性決定は、わかりにくいことが判明した 。一つの理由としては、樹状細胞ｃＤＮＡライブラリーが容易に調製されなかっ た。樹状細胞それ自体は稀であり、それらのＲＮＡを極めて稀にする。更に、モ ノクローナル抗体は通常発現ライブラリー、例えば、λgt-11 発現ライブラリー をスクリーニングするのに有効な試薬ではない。 それ故、モノクローナル抗体NLDC-145により認識された抗原をクローン化し、 特性決定することに対する要望が当業界にある。 樹状細胞の免疫調節能を利用し、例えば、寛容性または免疫を誘導することに 対する更なる要望が当業界にある。 本明細書中の文献の引用は、このような文献が本発明の従来技術であることの 自認と見なされるべきではない。 発明の要約 本発明は、主として樹状細胞に見られるだけでなく、Ｂ細胞、脳毛細管、骨髄 ストローマ、腸柔突起及び肺気道の上皮、並びに胸腺の皮質上皮及び末梢リンパ 系臓器のＴ細胞領域中の樹状細胞に見られる、本明細書中“ＤＥＣ”と称される 、内在性膜タンパク質に関する。その他に、痕跡量のこのタンパク質が肝臓、心 臓、 及び腎臓のような臓器中に見られる。ＤＥＣのマウス相対物及びヒト相対物は20 5kDa の見掛分子量を有し、マウス相対物はpH7.5 で等電点を有し、また炭水化 物がマウスＤＥＣの合計質量の約７kDa を含む。炭水化物は、８種の異なるが、 関連する２アンテナの(biantennary)Ｎ連鎖グリカンからなることが明らかであ り、Ｏ連鎖グリカンは存在しない。そのタンパク質は主として樹状細胞及び胸腺 上皮細胞に見られ、かつ205 kDa の分子量を有するので、それはDEC-205 と称さ れる。特別な実施態様において、本発明はヒトＤＥＣの単離及びクローニングに 関するものであり、これはカルボキシル末端配列RHRLHLAGFSSVRYAQGVNEDEIMLPSF HD（配列番号１）を有することにより特性決定され、また完全長マウスDEC-205 に対し生じたウサギポリクローナル抗体に結合するが、モノクローナル抗体NLDC -145と反応しないことにより特性決定される。更に特別な実施態様において、ヒ トＤＥＣは配列番号８に示されたアミノ酸配列を有する。それは配列番号７に示 されたヌクレオチド配列によりコードされ得る。dec ｃＤＮＡをクローニングす ることから得られた演繹アミノ酸配列情報に基く、ＤＥＣの別の特徴はそのタン パク質の細胞質テールにある特異な被覆されたピット局在化コンセンサスドメイ ンまたはモチーフであり、これは、図９に示されるように、２種の相対物タンパ ク質の間の相同性の領域及び相違の領域を有する。DEC-205 は被覆小胞により迅 速に内在化され、結合物質を抗原プロセシングに関与するMHC クラスIIを含む小 胞に近似する多小胞エンドソーム区画に送出することが更に発見された。 それ故、本発明は、その主たる局面において、DEC-205 レセプターの付加的な リガンドの同定に関するものであり、これは樹状細胞及びDEC-205 を有するその 他の細胞を有利に標的とし得る。樹状細胞による提示のための抗原のターゲッテ ィングは樹状細胞が静止している時に寛容性を与えることができ、または樹状細 胞が、例えば、サイトカインまたはリンホカイン、例えば、コロニー刺激因子（ CSF）による刺激により活性化される時に免疫刺激（即ち、予防接種）を与える ことができる。 更に、上皮細胞におけるＤＥＣの存在は、例えば、夫々、肺呼吸器上皮の基底 外側表面から肺気道へ、または腸上皮の基底外側表面から腸の管腔へ、またこれ らの上皮の先端（管腔）表面から肺または腸循環系への分子の経上皮輸送におけ る重要な役割を示唆する。こうして、本発明は、リガンドを有する薬理学的薬剤 をＤＥＣにターゲッティングすることによる肺または腸の感染への薬理学的薬剤 、例えば、抗生物質の非経口送出、並びにエアゾール適用及び肺による吸入、ま たは腸による摂取及び吸収による薬理学的薬剤の全身送出を提供する。 更に別の局面において、本発明は脳毛細管に配置されたＤＥＣにより血液脳関 門を横切る薬理学的薬剤のターゲッティングを提供する。 こうして、好ましい局面において、本発明は少なくとも一つのＤＥＣレクチン ドメインを含むタンパク質を候補リガンドと接触させ、ＤＥＣレクチンドメイン による候補リガンドの結合を検出することを特徴とするＤＥＣのリガンドの同定 方法を提供する。候補リガンドとＤＥＣレクチンドメインの結合は、リガンド候 補がＤＥＣのリガンドであることを示す。好ましい局面において、リガンドはサ ッカリドであり、これはＤＥＣの一つ以上のレクチンドメインに結合する。 本発明の一つの局面によれば、少なくとも一つのＤＥＣレクチンドメインを含 むタンパク質が内在性膜タンパク質として細胞により発現され、候補リガンドが 標識され、その結果、ＤＥＣレクチンドメインによる候補リガンドの結合が細胞 との標識の会合を検出することにより検出される。別の実施態様において、少な くとも一つのＤＥＣレクチンドメインを含むタンパク質が可溶化され、候補リガ ンドが固相担体により不可逆的に会合され、その結果、ＤＥＣレクチンドメイン による候補リガンドの結合が固相担体によるタンパク質の結合を検出することに より検出される。更に別の実施態様において、少なくとも一つのＤＥＣレクチン ドメインを含むタンパク質が固相担体と不可逆的に会合され、候補リガンドが標 識され、その結果、ＤＥＣレクチンドメインによる候補リガンドの結合が固相担 体との標識の会合を検出することにより検出される。一実施態様において、少な くとも一つのＤＥＣレクチンドメインを含むタンパク質はトランケートＤＥＣタ ンパク質である。別の実施態様において、少なくとも一つのＤＥＣレクチンドメ インを含むタンパク質は完全長ＤＥＣタンパク質である。 本発明はＤＥＣタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸を有利に提供す る。こうして、本発明はＤＥＣタンパク質、またはキメラタンパク質を含むその トランケートフラグメントの発現を提供し、これはＤＥＣリガンドを同定するの に使用し得る。更に、本発明の核酸は少なくとも15塩基対を含み、こうして、本 発明の核酸はＤＥＣのｍＲＮＡの発現を検出するのに有益なプローブ、ＲＮＡの 逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のためのPCR プライマー、またはＤＥ Ｃをクローニングするためのプローブ、及び、例えば、ライブラリーまたは細胞 中のＤＥＣｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在についてのプローブを提供する。 好ましい実施態様において、核酸はヒトＤＥＣタンパク質をコードする。下記の 特別な実施態様において、ヒトＤＥＣをコードする核酸が提供される。 更に、本発明はＤＥＣをコードする核酸を含む発現ベクターを提供し、その核 酸は発現調節配列と操作により会合された少なくともＤＥＣのレクチンドメイン をコードするＤＮＡ分子である。更に別の局面において、本発明はその発現ベク ターを含む組換え宿主細胞を提供する。種々の実施態様において、宿主細胞はチ ャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカン・グリーン・モンキーCOS 細胞、マ ジン−ダービィ・イヌ腎臓細胞、及びNIH-3T3 繊維芽細胞からなる群から選ばれ た哺乳類細胞である。 更に、本発明はヒトDEC-205 タンパク質と反応性の抗体、特にモノクローナル 抗体及びポリクローナル抗体を提供する。 上記のように、本発明はＤＥＣのリガンドの同定を有利に提供し、そのリガン ドは、それらがin vitroまたはin vivo でＤＥＣを有する細胞に付着、即ち、接 合される分子を標的とすることができる。in vivo でＤＥＣを発現する細胞を標 的とする能力は、例えば、胸腺、小腸、及び肺の樹状細胞、上皮細胞を特異的に 標的とすることの予想から重要な意味を有する。こうして当然に、本発明は肺循 環系、腸循環系、肺気道、小腸の管腔、皮膚中の樹状細胞及びリンパ系臓器のＴ 細胞領域、胸腺、及び脳からなる群から選ばれた組織を標的とする分子を含む医 薬組成物に関するものであり、その分子はＤＥＣ−リガンドに接合される。 ＤＥＣ−リガンドはＤＥＣを結合する炭水化物及び抗ＤＥＣ抗体、及び医薬上許 される担体からなる群から選ばれることが好ましい。特別な実施態様において、 その分子は抗癌薬、抗ウイルス薬、抗生物質、抗寄生虫薬、及び抗炎症薬からな る群から選ばれる。 ターゲッティングに関する本発明の別の局面において、ＤＥＣ−リガンドに接 合されたＤＮＡベクターを含む、樹状細胞、胸腺上皮細胞、肺上皮細胞、小腸上 皮細胞、及び脳毛細管細胞からなる群から選ばれた細胞への遺伝子の導入のため の組換えベクターが提供され、そのＤＥＣ−リガンドはＤＥＣを結合する炭水化 物及び抗ＤＥＣ抗体からなる群から選ばれる。特別な実施態様において、ＤＮＡ ベクターはウイルスベクター、リポソームベクター、及び裸のＤＮＡベクターか らなる群から選ばれる。 更に別の実施態様において、分子を樹状細胞にターゲッティングする能力に基 いて、本発明はＤＥＣ−リガンドに接合された病原体からの抗原を含むワクチン を提供し、そのＤＥＣ−リガンドはＤＥＣを結合する炭水化物及び抗ＤＥＣ抗体 、並びに免疫刺激物質からなる群から選ばれる。病原体の例として、ウイルス、 バクテリア、寄生虫、及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。免疫刺 激物質はサイトカイン、リンホカイン、及びアジュバントからなる群から選ばれ てもよい。特に、本発明は不十分な免疫原であり、または全く免疫原性ではない 分子を有効なプロセシング（ＤＥＣは樹状細胞の抗原プロセシングメカニズムと 関連していることが本明細書に示されているように）及び反応性Ｔリンパ球への 提示のために樹状細胞にターゲッティングすることを提供する。 また、本発明はＤＥＣ−リガンドに接合された自己抗原またはアレルゲンを含 む免疫抑制を誘導する組成物を提供し、ＤＥＣ−リガンドはＤＥＣを結合する炭 水化物及び抗ＤＥＣ抗体からなる群から選ばれ、但し、その組成物は免疫刺激物 質を欠いていることを条件とする。刺激物質、例えは、サイトカイン、リンホカ イン、またはアジュバントを含まないで、自己抗原またはアレルゲンを樹状細胞 にターゲッティングすることにより、静止樹状細胞は抗原をプロセシングし、提 示することができる。静止樹状細胞による抗原の提示は抗原特異性Ｔ細胞アネル ギーまたは免疫寛容を誘導するものと考えられる。自己抗原はミエリン塩基性タ ンパク質、コラーゲンまたはそのフラグメント、ＤＮＡ、核タンパク質、核小体 タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、及び膵臓β−細胞タンパク質からなる 群から選ばれてもよい。 本発明の主目的はＤＥＣのリガンドを提供することである。 それ故、本発明の重要な直接の目的はＤＥＣを特異的に結合するリガンドを同 定することである。 別の目的はＤＥＣをコードする核酸を提供することである。 関連目的はＤＥＣ、またはＤＥＣレクチンドメインの炭水化物結合部分を含む その一部をコードする核酸を発現することである。 本発明のこれらの目的及びその他の目的は、下記の図面、発明の詳細な説明、 及び実施例を参照することにより容易に理解し得る。 図面の簡単な説明 図１．NLDC-145により結合された抗原の見掛質量は205 kDa である。（A）固定 されたNLDC-145（右）による(35S)メチオニン−システイン標識骨髄ＤＣ抽出物 の免疫沈殿は見掛質量>200kDa を有する積極的に合成された抗原を明らかにする 。この抗原は固定された非特異性ラットIgG2a(左)により沈殿されない。(B)NLDC -145 は粗胸腺洗剤抽出物の非還元性ウェスタンブロット中205 kDa の抗原を結 合する。レーン当たり0.17胸腺当量で開始する抽出物の３倍連続希釈液を５％(v /v)の２−メルカプトエタノールの不在下（左フィルター）または存在下（右ス トリップ）で二重ゲルに装填し、ニトロセルロースにブロットした。フィルター を10μg/mlのNLDC-145 IgG、次にペルオキシダーゼ接合抗ラットIgG で探査した 。染色パターンをECL により視覚化した。バンドが還元性ゲルで観察されなかっ た。STD:初期のフィルターから現像フィルムにトレースされた前染色された広範 囲の分子量マーカー(Bio-Rad)の位置 図２．要約：胸腺からのDEC-205 の精製 全ての工程を０〜４℃で行った。ロイ ペプチン及びPMSFを使用直前に氷冷緩衝液に添加した。 図３．精製されたDEC-205 の分析及び精製中の工程収率（A）最初にクーマシー ブリリアントブルーR-250（左）で染色され、次いで銀（右）で対比染色された 、精製タンパク質５μg の還元性の８％アクリルアミドSDS-PAGE分析 (B)10 μ g/mlのNLDC-145 IgGで染色された、精製からの主要フラクションの等容積のウェ ス タンブロット レーン１−４及び６−８中のフラクションを後核上澄みの容積に 希釈し、その結果、それらの205 kDa バンドの強さを比較することができ、収率 を推定することができた。レーン10：見掛質量の約80kDa までの範囲の微小のmA b 反応性バンドの“ラダー”を示すための、抗原濃度の計画的な５倍の増加略号 ：nuc、核；memb、膜；extr、0.5 ％NP-40 抽出物；nonads、カラム装填プロセ スの早期(nonads-5)及び後期(nonads-15)からの個々の非吸着フラクション 図４．DEC-205 は7.5 のpIを有する内在性膜タンパク質である（A）洗剤、1MのK Cl または100 mMのNa2CO3、pH11.5で可溶化された胸腺膜タンパク質（レーン１ 、２、３）、及び高塩及び高pHの緩衝液に初期に不溶性であるが、次いで洗剤で 膜から放出されたタンパク質（レーン４及び５）のイムノブロット フィルター を10μg/mlのNLDC-145で染色した。（B）変性条件下の精製DEC-205 10μg の等 電点電気泳動 銀染色スラブゲルからの単一レーンが示され、pH値が隣接の未染 色レーンからの両性電解質の溶離後に指定された。 図５．DEC-205 に結合された炭水化物の研究 (A)DEC-205は糖タンパク質である 。精製205 kDa タンパク質、トランスフェリン(Tf、陽性対照)、及びクレアチナ ーゼ(cre、陰性対照）をニトロセルロースに電気ブロットし、フィルターをNaIO4 で酸化し、糖内のvic-ジオールを固定アルデヒドに変換した。ジゴキシゲニン （DIG）標識ヒドラジド、続いてアルカリ性ホスファターゼに接合された抗DIG 抗体との反応はブロット上の糖タンパク質の位置を明らかにした。トランスフェ リンと同様であるが、クレアチナーゼとは異なって、DEC-205 は糖について染色 する。(B)DEC-205のグリカンはその見掛分子量の約７kDa を含む。アポトランス フェリン(aTf)及びDEC-205 を無水トリフルオロメタンスルホン酸(TMFSA)で処理 し(+)、または処理しないで(-)、タンパク質結合炭水化物を非選択的に加水分解 した。処理されたタンパク質の両方が、アポトランスフェリンによる見掛質量の ５kDa 損失、及びDEC-205 による７kDa 損失に相当する、増大された電気泳動移 動度を示した。 (C)PNGaseFによりDEC-205 から放出されたＮ連鎖グリカンのFA CE分析 5.1〜10.1グルコース単位(Glc)5、(Glc)10:標準オリゴグルコースラ ダー中の選択されたバンドの位置の間で移動する８種のバンドを分解した。(D)D EC-205 から放出されたＮ連鎖グリカンの混合物のエキソグリコシダーゼ消化及 びFACE分析 レーン１：未消化のＮ連鎖オリゴ糖（レーン１−５中の(Glc)3の暗 いバンドは洗剤人工産物である） レーン２：α−ガラクトシダーゼで消化した レーン３：α−ガラクトシダーゼ＋NANaseIII で消化した レーン４：前の２ 種の酵素＋β−ガラクトシダーゼで消化した レーン５：前の３種の酵素＋β− Ｎ−アセチルヘキソースアミニダーゼで消化した レーン６：２倍高い濃度のβ −Ｎ−アセチルヘキソースアミニダーゼ以外は、レーン５と同様 レーン７：前 の 4種の酵素＋α−マンノシダーゼで消化した レーン８：２倍高い濃度のα− マンノシダーゼ＋α−フコシダーゼ以外は、レーン７と同様 レーン９：マンノ シルキトビオース・コア標準物質：FC、フコシル化コア；Ｃ、非フコシル化コア (E)レクチン染色及びFACE分析からの知見の要約 バイセクチングGlcNAcを含み 、またはそれを含まない、二つのフコシル化コア構造が存在する。末端における 更なる不均一性が(C)で観察された８種のグリカン変異体を生じる。 図６．DEC-205 のＮ末端アミノ酸配列、及びポリクローナル抗体によるブロッテ ィング（A）二つの異なるコア手段により測定されたアミノ末端配列（配列番号 ２） 最初の19残基をスパンするペプチドを合成し、免疫原としての使用のため にKLH にカップリングした。（B）前洗浄研究：NLDC-145は両方のポリクローナ ル抗体により検出された205 kDa バンドを特異的に枯渇する。粗胸腺膜抽出物の イムノブロット 同抽出物をNLDC-145イムノアフィニティーカラムに２回通すこ とにより枯渇フラクションを生成し、物質をカラムから溶離した。フィルターを 10μg/mlのNLDC-145 IgG、0.1 μg/mlの抗Ｎ末端ペプチドIgG、及び0.1 μg/ml の抗DEC-205 IgG で染色した。３種の抗体の全てが同タンパク質を結合する。 図７．DEC-205 の略図 図８．マウスDEC-205 及び関連タンパク質の配列 マウスDEC-205 の予想アミノ 酸配列（配列番号３）をウシPLA2レセプターの配列（配列番号４）及びヒトマク ロファージマンノースレセプターの配列（配列番号５）と整列させる。全ての３ 種のタンパク質中に同一性があるアミノ酸位置を影付きにする。タンパク質ドメ インを分離し、Ｃ型CRD(Weisら，Science 254:1608-15)を形成するコンセンサス アミノ酸を以下のように妥当な配列の下に示す。不変アミノ酸を一文字コード、 θ＝脂肪族、χ＝脂肪族または芳香族、φ＝芳香族、Ｚ＝ＥまたはＱ、Ｂ＝Ｄま たはＮ、Ω＝Ｄ、Ｎ、ＥまたはＱで示す。CDR8中の二つの掛けているシステイン はａ*で強調される。精製DEC-205 タンパク質から自動化エドマン分解により決 定されたペプチド配列が上線を施され、番号を付される（Ｎはアミノ末端を示し 、Ｔはトリプシンで生じたペプチドを示し、またＬはエンドプロテイナーゼlys- Cで生じたペプチドを示す）。 図９．ヒトDEC-205 のカルボキシル末端細胞質ドメイン配列(上)(配列番号１)と マウスDEC-205 のカルボキシル末端細胞質ドメイン配列（下）（配列番号６）の 比較 同一性の領域が下線を施される。類似性の領域がイタリック体で示される 。 図10．DEC-205 発現 マウス組織及びトランスフェクトされたCos-７細胞中のDE C-205 の発現 A.示された組織から抽出されたpoly-A+Aのノーザンブロット記号 ：Br、脳ｍＲＮＡ；ＤＣ、樹状細胞ｍＲＮＡ：Ht、心臓ｍＲＮＡ；Kd、腎臓ｍＲ ＮＡ；Lv、肝臓ｍＲＮＡ；LN、リンパ節ｍＲＮＡ；Sk、皮膚ｍＲＮＡ；Thm、胸 腺ｍＲＮＡ；tg、舌ｍＲＮＡ 図11．DEC-205のエンドサイトーシス ポリクローナルウサギ抗DEC-205 F(ab)' ２フラグメント及び10nmの金標識ヤギ抗ウサギIgG(Amersham)による樹状細胞に 関するDEC-205 の超構造分析 バーは100 μm を表す。 記号：MVV、多小胞エ ンドソーム；Ly、リソソーム；CP、被覆ピット；０’、時間０における固定；１ ’、37℃で１分間のインキュベーション後の固定；５’、37℃で５分間のインキ ュベーション後の固定;20’、37℃で20分間のインキュベーション後の固定；60 ’、37℃で60分間のインキュベーション後の固定 図12．抗原提示 ウサギ抗DEC-205 抗体または非反応性ウサギ抗体対照とともに インキュベートされた樹状細胞による抗原提示 2R.50 細胞によるIL-2産生を対 数スケールで培養中の抗体の濃度に対しプロットする。誤差バーは平均からの標 準偏差を示す。 記号：抗DEC-205、ウサギ抗DEC-205 ポリクローナルIgG の示 された量を受けた培養物；抗IgG2a、IgG2a 特異性ポリクローナルウサギ抗体の 示された量を受けた培養物；IgG 、非免疫ウサギIgG の示された量を受けた培養 物 図13．DEC-205 のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体によるランゲルハ ンス細胞の選択的染色 培養された表皮細胞をクラスII MHCタンパク質のPE標識 mAb（y軸）及び白血球抗原の多重抗体で二重標識し、続いてFITC抗Ig（x 軸）で 標識した。MHC-II(+)DC(例えば、Ｅ及びＨ中の矢印)に関する平均FITC蛍光強さ が夫々のパネルの上部右隅に示される。 (A-D)特異性：マクロファージ、Ｂ細胞またはＴ細胞抗原についてではなく、DEC -205 についてのランゲルハンス細胞染色 ラットIgG2a ハイブリドーマ上澄み が適用された。 (E-X)その後の研究に使用したモノクローナル試薬及びポリクローナル試薬の滴 定 (E-G)NLDC-145 mAb の段階的用量(0.6、２及び６μg/ml) (H)ポリクローナル非免疫ラットIgG2a（6μg/ml） (I-X)ウサギIgG 並びに3、10、30及び100 μg/mlのF(ab')2フラグメント 図14.DEC-205エピトープのトリプシン感受性及び再合成 一夜培養されたランゲルハンス細胞(A-F)またはリンパ節Ｂ細胞(G-L)を30分間に わたって氷の上で0.25％のトリプシンに暴露し、または処理しなかった。リンパ 節Ｂ細胞は生存を支持するためにLPS で刺激されていた。細胞を直ちに(d1)また は更に１日の培養後に(d2)染色した。抗体は30μg/mlの抗DEC-205 または非免疫 F(ab')2フラグメント（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、及びＫ）；２μg/mlのNLDC-145ま たは非免疫ラットIgG2、または抗CD45（クローンM1/9、ラットIgG2）ハイブリ ドーマ上澄み（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、及びＬ）であった。 図15．脾臓及び皮膚からの新鮮な樹状細胞及び培養された樹状細胞（矢印）によ るDEC-205 の発現 脾臓細胞の低密度フラクションに富む脾臓ＤＣを抗CD11c(y 軸、A-H)で同定し、NLDC-145; 抗DEC-205 ポリクローナルのF(ab')2フラグメン ト; 及び相当する非免疫対照で対比染色した。染色を浮遊直後（新鮮）、または 一夜培養後に行った。クラスII MHCタンパク質のmAb により表皮懸濁液中に同定 された新鮮なランゲルハンス細胞及び培養ランゲルハンス細胞(ｙ軸、I-P)が比 較のために示される。 図16．GM-CSFの存在下で先祖から増殖された骨髄ＤＣによるクラスII MHCタンパ ク質及びDEC-205 の発現 培養の６日目、７日目及び８日目に、10μg/mlのTIB- 120(クローンM5/114、抗I-Ab.d.q、抗I-Ed.k）または非免疫IgG(Ａ、Ｃ、Ｅ); 3 0μg/mlの抗DEC-205 または非免疫IgG(Ｂ、Ｄ、Ｆ）；または２μg/mlのNLDC-14 5(Ｇ、Ｈ、Ｉ）で染色した後にフローサイトメトリー(A-F)及び細胞遠心分離ス ライド(G-I)の両方により細胞を調べた。(d6)６日目に、培養物は不均一なレベ ルのクラスII MHCタンパク質を発現し、DEC-205 を殆ど発現しない大きい増殖細 胞凝集物を含んでいた。凝集物をプラスチック付着性ストロマ細胞から取り除い た。（d7、d8）培養の連続２日にわたって、凝集物は典型的な樹状形態、豊富な クラスII MHC タンパク質、及び高レベルのDEC-205 を有する多数の非付着性細 胞を放出した。 図17．腹膜細胞におけるDEC-205 の発現 レジデントまたは示されたプロ炎症剤 で誘導された浸出液中の腹膜細胞を30μg/mlの抗DEC-205 または非免疫F(ab')2 フラグメント及びFITC抗ウサギF(ab')2で染色した。次いで細胞をマクロファー ジ、Ｂ細胞及びＴ細胞のPE標識mAb で対比染色した。PE抗Mac-1/cd11b(mAb M1/7 07、ｙ軸)による染色がここに示される。Mac-1bright細胞はマクロファージ（矢 尻）であり、Mac-1dim細胞はＢ細胞（矢印）であり、Mac-1 は陰性細胞、Ｔ細胞 である。 略号：ConA、コンカナバリンＡ；TGC、チオグリコレート； BCG、ウシ型結核菌カルメット・ゲラン 図18．３種の臓器からの新鮮な細胞懸濁液中の白血球によるDEC-205 の発現Ｂ細 胞に矢印をつける。脾臓(A-J)、骨髄(K-T)、及び末梢血(U- δ)からの細胞を白 血球のサブセットのPE標識抗体で染色し（ｙ軸）、30μg/mlの非免疫(A-E、K-O 、及びU-Y)または抗DEC-205(F-J、P-T、及びZ-δ)F(ab')2フラグメントで対比染 色した（ｘ軸、FITC）。PE標識mAb は顆粒細胞(RB6-8C5、抗Gr-1)、顆粒細胞及 びマクロファージに豊富にあるインテグリンCD11b(M1/70、抗Mac-1)，Ｂ細胞(RA 3-6B2、抗B220/CD45RB)、Ｔ細胞(53-2.1、抗Thy-1.2/CD90)、及びクラスII MHC タンパク質(AMS-32.1、抗I-Ad)と反応した。 図19．イムノブロット 骨髄樹状細胞(BMDC)、塊脾臓白血球(SPL、約65％のＢ細 胞)及びレジデント腹膜細胞(PC、約70％のＢ細胞、30％のマクロファージ）の全 細胞NP-40 抽出物の段階的用量をフィルターに移した。フィルターを10μg/mlの NLDC-145 IgGで染色した。BMDCは脾臓Ｂ細胞よりも細胞当たり約10倍多いDEC-10 5 を発現し、腹膜Ｂ細胞よりも約50倍多く発現する。 図20．in vitroで樹状細胞刺激活性を阻止することのDEC-205 の抗体の不能混合 白血球反応、この場合、段階的用量のミトマイシンＣ処理脾臓樹状細胞を抗DEC- 205(これを30μg/mlで使用した)以外の示された抗体の夫々10μg/mlの連続存在 下で3x103同種リンパ節細胞に添加した。共刺激タンパク質B7-2（クローンGL-1 ）のmAb のみがＴ細胞増殖を抑制した。抗IgG:Ｂ細胞の表面Ig関連シグナリング タンパク質にポリクローナルの陰性対照(Sanchezら，1993，J.Exp.Med.178:1049 ) 図21．胸腺及びリンパ節中のDEC-205 の発現 (a-c):全て10μg/mlでモノクロー ナルNLDC-145(a);ポリクローナル抗DEC-205F(ab')2フラグメント(b);及びポリク ローナル抗DEC-205 IgG(c)で染色され、ヘマトキシリンで対比染色された、胸腺 皮質及び髄質(M)の低出力 推定樹状細胞（矢尻）は髄質中に散乱されるが、 最強の胸腺染色が皮質上皮にある。(d-f):mAb NLDC-145(d);ポリクローナル抗DE C-205F(ab')2フラグメント(e);及びポリクローナル抗DEC-205 IgG(f)で染色され た、Ｂ細胞小胞(B)、深部皮質のＴ細胞領域(T)、及び髄質(M)を示す腸間膜リン パ節の低出力の図 暗く染色された樹状細胞がＴ細胞領域中に分布されている。 (g-i):胸腺皮質と髄質の結合部(g)、リンパ節の深部皮質内(h、細静脈が矢印を 付されている）、及びＢ細胞小胞中(i、ヘマトキシリン対比染色なし）のDEC-20 5 の分布を示すための高出力の図 図22．脾臓中のDEC-205 の発現 (a-c):Ｂ細胞の抗体（ウサギ抗IgG、a); DEC-2 05 の抗体（ポリクローナル抗DEC-205 IgG、b)、及びクラスII MHCタンパク質の 抗体(mAb M5/114、c)で染色された、脾臓白色髄小節の低出力の図 Ｔ細胞領域 内の中央動脈が矢印を付されている。Ｔ細胞領域は少ないＢ細胞(a、抗IgG)を含 むが、多数の散乱されたDEC 陽性樹状細胞及びクラスII MHC陽性樹状細胞(b-c) を含む。Ｂ細胞小胞が“B”で表され、辺縁洞が矢尻により表される。(d-e):mAb NLDC-145(d);ポリクローナル抗DEC-205(g)、及び抗クラスII MHC(f)で染色され た脾臓Ｔ細胞領域の高出力の図(動脈周囲の鞘、中央動脈が矢印を付されている) DEC-205 の染色は、樹状細胞体の一層顕著な染色に加えて、小さな斑点のある品 質を有する。 図23．幾つかの非リンパ系臓器中のDEC-205 の発現 (a-d):mAb NLDC-145(a);ポ リクローナル抗DEC-205 F(ab')2フラグメント(b);及びポリクローナル抗DEC-205 IgG(c-d)で染色された、脳毛細管(矢印、a-c)及び小動脈（矢印、ｄ） (e-h): 肺、気道上皮（矢印、ｅ及びｈ）、肺柔組織内の分離細胞（矢尻、ｇ及びｈ）、 及び幾つかの推定の肺胞マクロファージ(*、h)の抗DEC-205 染色を示す。クラス IIMHC タンパク質(f)は気道上皮内で明らかではないが、気道周囲に多くの陽性 プロフィールがある（矢尻、ｆ）。(i):骨髄の突出栓 レース状ストロマ細胞（ 矢印）が低レベルのDEC-205 を発現する。丸形細胞の暗い染色はペルオキシダー ゼ発現好酸球によるバックグラウンド染色である。(j):舌、重層偏平上皮の例と して示される、口上皮内の基底上レベルの少数の推定ランゲルハンス細胞（矢印 ） のDEC-205 染色を示す。(k,l):空腸: DEC-205 が腸柔突起の吸収性上皮により発 現され、最高レベルが柔突起の先端で観察される。また、基底膜内の多数の細胞 が暗く染色するが、この染色は再度好酸球ペルオキシダーゼのバックグラウンド である。 図24．イムノブロッティングによるDEC-205 の組織分布 示された臓器の溶解産 物をブロットしてDEC-205 タンパク質（Ａ、mAb NLDC-145で染色されたフィルタ ー）及びLAMP-1リソソーム膜抗原（Ｂ、mAb 1D4Bで染色されたフィルター）の発 現の相対レベルを比較した。全タンパク質50μg を夫々のレーンに装填した。 図25．ヒト及びマウスのDEC-205 に関するアミノ酸及びヌクレオチドの配列比較 (A)翻訳されたマウス（ｙ軸）及びヒト（ｘ軸）のアミノ酸配列のマトリックス プロット(pam 250マトリックス) このプロットに関するウインドープロットは6 0であり、最小％スコアは60であり、ハッシュ値は２である。(B)マウス（ｙ軸） 及びヒト（ｘ軸）のＤＮＡ配列のマトリックスプロット（ＤＮＡ同一性マトリッ クス） ウインドープロットは60であり、最小％スコアは65であり、ハッシュ値 は６であり、かつジャンプ値は１であった。両方のストランドを評価した。 発明の詳細な説明 本発明は、主として樹状細胞に見られるが、またＢ細胞、脳毛細管、骨髄スト ロマ、腸柔突起及び肺気道の上皮、並びに胸腺の皮質上皮及び末梢リンパ系臓器 のＴ細胞領域中の樹状細胞に見られる、本明細書中“ＤＥＣ”と称される内在性 膜タンパク質に関する。加えて、痕跡量のこのタンパク質が肝臓、心臓、及び腎 臓のような臓器中に見られる。ＤＥＣのマウス相対物及びヒト相対物は205 kDa の見掛分子量を有し、マウス相対物はpH7.5 で等電点を有し、炭水化物はマウス ＤＥＣの全質量の約７kDa を含む。炭水化物は８種の異なるが、関連する２アン テナのＮ連鎖グリカンからなることが明らかであり、Ｏ連鎖グリカンは存在しな い。そのタンパク質は主として樹状細胞及び胸腺上皮細胞に見られ、205 kDa の 分子量を有するので、それはDEC-205 と称される。ＤＥＣのマウス相対物及びヒ ト相対物の特性決定は高度の相同性で10の炭水化物結合ドメインの存在を示すが 、その他の種からのＤＥＣは更に多いか、または少ないこのようなドメインを有 し得ることが可能である。同様に、ＤＥＣはその他の細胞型、例えば、その他の 組織または臓器からの上皮細胞により発現し得る。 更に、本発明はDEC-205 をコードする遺伝子のクローニング、及びコードされ たタンパク質の特性決定に関する。配列情報は、DEC-205 が10のＣ型レクチンド メインを有するレセプターであることを示し、これはマクロファージマンノース レセプター及び炭水化物を結合し、エンドサイトーシスを媒介するその他の関連 レセプターと相同、または同様である。また、ヒト相対物はレクチンドメインを 有することが明らかである。それ故、ＤＥＣは相当する数のレクチンドメインを 有し、樹状細胞による抗原プロセシングに関与するものと考えられる。 本発明の更に別の局面はヒトＤＥＣタンパク質及びそれをコードする遺伝子の 同定である。 dec ｃＤＮＡのクローニングから得られた演繹アミノ酸配列情報に基くＤＥＣ の別の特徴は、そのタンパク質の細胞質テールにある特異な被覆ピット局在化コ ンセンサスドメインまたはモチーフであり、これは、図９に示されるように、二 つの相対物タンパク質の間に相同性の領域及び相違の領域を有する。 更に、DEC-205 は被覆小胞により迅速に内在化され、結合された物質を抗原プ ロセシングに関係するMHC クラスIIを含む小胞に似ている多小胞エンドソーム区 画に送出することが発見された。また、本発明は、DEC-205 に特異性のウサギ抗 体が樹状細胞により有効にプロセシングされ、ウサギ特異性Ｔ細胞クローンに提 示されたという更なる発見に一部基いている。 それ故、最も重要なことには、本発明はDEC-205 レセプターの付加的なリガン ドの同定に関するものであり、これはDEC-205 を有する樹状細胞及びその他の細 胞に有利にターゲッティングし得る。樹状細胞による提示のための抗原のターゲ ッティングは、樹状細胞が静止している場合の寛容性、または樹状細胞が、例え ば、サイトカイン、またはリンホカイン、例えば、コロニー刺激因子(CSF)によ る刺激により活性化される時の免疫刺激（即ち、予防接種）を与えることができ る。 更に、上皮細胞におけるＤＥＣの存在は、例えば、夫々、肺呼吸上皮の基底外 側の表面から肺気道へ、または腸上皮の基底外側の表面から腸の管腔へ、またこ れらの上皮の先端（管腔）表面から肺循環系または腸循環系への分子の経上皮輸 送における重要な役割を示唆する。こうして、本発明は、リガンドを有する薬理 学的薬剤をＤＥＣにターゲッティングすることによる、肺または腸の感染への薬 理学的薬剤、例えば、抗生物質の非経口送出、並びにエアゾール適用及び肺によ る吸入、または腸による摂取及び吸収による薬理学的薬剤の全身送出を提供する 。 更に別の局面において、本発明は脳毛細管に配置されたＤＥＣにより血液脳関 門を横断する薬理学的薬剤のターゲッティングを提供する。 それ故、下記の意味を有する種々の用語が本明細書中に使用される。 “候補リガンド”という用語は、ＤＥＣに特異的に結合する能力に関する試験 の考慮中の分子を表すのに本明細書に使用される。以下に大いに詳しく説明され るように、候補リガンドとして、サッカリド（即ち、糖、炭水化物、またはグリ カン）が挙げられるが、これらに限定されない。また、本明細書に使用される“ リガンド”という用語はＤＥＣと反応性の抗体を表し得る。 分子は、それが免疫系の抗原認識分子、例えば、免疫グロブリン（抗体）また はＴ細胞抗原レセプターと特異的に相互作用することができる時に“抗原性”で ある。抗原性ポリペプチドは少なくとも約５、好ましくは少なくとも約10のアミ ノ酸を含む。分子の抗原性部分は、抗体またはＴ細胞レセプター認識について免 疫優性であるその部分であってもよく、またはそれは抗原性部分を免疫化のため にキャリヤー分子に接合することによりその分子の抗体を産生するのに使用され る部分であってもよい。抗原性である分子はそれ自体で免疫原性である必要はな く、即ち、キャリヤーなしに免疫応答を誘発することができる必要はない。 “Ａ”を含む組成物（この場合、“Ａ”は単一タンパク質、ＤＮＡ分子、ベク ター、組換え宿主細胞、等である）は、組成物中のタンパク質、ＤＮＡ、ベクタ ーの少なくとも約75重量％（Ａ及びＢが属する種のカテゴリーに依存する）が“ Ａ”である場合に“Ｂ”を実質的に含まない（この場合、“Ｂ”は一種以上の汚 染タンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター、等を含む）。“Ａ”は組成物中のＡ＋ Ｂ種の少なくとも約90重量％、最も好ましくは少なくとも約99重量％を構成する ことが好ましい。また、汚染物質を実質的に含まない組成物は関係する種の活性 または特徴を有する単一の分子量種のみを含むことが好ましい。 “医薬上許される”という用語は、生理的に寛容され、またヒトに投与された 時にアレルギー反応または同様の不利な反応、例えば、胃の不調、目眩等を典型 的に生じない分子物体及び組成物を表す。特別な実施態様において、本明細書に 使用される“医薬上許される”という用語は、連邦もしくは州政府の規制当局に より認可され、または動物、更に特別にはヒトにおける使用について米国薬局方 もしくはその他の一般に認められた薬局方にリストされることを意味する。“担 体”という用語は、化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または ビヒクルを表す。このような医薬担体は無菌液体、例えば、水及び油（石油、動 物油、植物油または合成源の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を 含む）であってもよい。水または水溶液、食塩溶液及び水性のデキストロース溶 液及びグリセロール溶液が、特に注射液のために、担体として使用されることが 好ましい。好適な医薬担体がE.W.Martin著、“レミントンの薬科学”に記載され ている。 “治療有効量”という用語は、宿主の活動、機能及び応答の臨床上重大な不足 を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも90 ％減少し、最も好ましくは阻止するのに充分な量を意味するのに本明細書に使用 される。また、治療有効量は宿主の臨床上重大な症状の改善を生じるのに充分で ある。 “アジュバント”という用語は抗原に対する免疫応答を増進する化合物または 混合物を表す。アジュバントは抗原を徐々に放出する組織デポー剤として、また 免疫応答を非特異的に増進するリンパ系アクチベーターとして利用できる(Hood ら，Imunology,第２編，1984，Benjamin/Cummings: Menlo Park.カリフォルニア ，384頁)。しばしば、抗原単独による一次抗原投与は、アジュバントの不在舌で は、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を誘発することができないであろう。ア ジュバントとして、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバン ト、サポニン、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば 、 リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭 化水素エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール 、及び潜在的に有益なヒトアジュバント、例えば、BCG(カルメット・ゲランウシ 型結核菌)及びコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)が挙げ られるが、これらに限定されない。アジュバントは医薬上許されることが好まし い。 本明細書に使用される種々の略号として、PBS、食塩加リン酸緩衝液；mAb 、 モノクローナル抗体；SPF、特定の病原体を含まない；PMSF、フェニルメチルス ルホニルフルオリド；DIFP、ジイソプロピルフルオロホスホネート；FACE、蛍光 体補助炭水化物電気泳動が挙げられる。 ＤＥＣ、またはそのフラグメント、誘導体、キメラ、もしくは類似体をコード する遺伝子 本発明は、あらゆる動物、特に哺乳類または鳥類、更に特別にはヒト起源から の本発明のＤＥＣレセプターの機能性部分（ＤＥＣの完全長、または天然産形態 を含む）、及びその抗原性フラグメントをコードする遺伝子の単離を意図してい る。本明細書に使用される“遺伝子”という用語は、ポリペプチドをコードする ヌクレオチドの集合を表し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸を含む。下記の特別 な実施態様において、ＤＮＡをコードするヒトＤＥＣの特定のヌクレオチド配列 が提供され（配列番号８）、また夫々配列番号３及び配列番号８に示されたアミ ノ酸配列を有するマウス及びヒトの両方のＤＥＣポリペプチドの演繹コード配列 が提供される。 それ故、当業界の技術水準内の通常の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮ Ａ技術が使用されてもよい。このような技術が文献に充分に説明されている。例 えば、Sambrook，Fritsch ＆Maniatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manu al,第２編（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，New York(本明細書中、“Sambrookら，1989”); DNA Cloning: A Practical A pproach，１巻及び２巻(D.N.Glover 編集，1985); Oligonucleotide Synthesis( M.J.Gait 編集，1984); Nucleic Acid Hybridization［B.D.Hames ＆S.J.Higgin s編集(1985)］；Transcription And Translation［B.D.Hames ＆S.J.Higgins 編集(1984)］；Animal Cell Culture［R.I.Freshney編集(1986)］；Immobilized Cells And Enzymes［IRL Press(1986)］；B.Perbal，A Practical Guide To Mo lecular Cloning(1984); F.M.Ausubel ら編集，Current Protocols in Molecula r Biology，John Wiley ＆Sons，Inc．（1994）を参照のこと。 それ故、本明細書に現れる場合、下記の用語は下記の定義を有するべきである 。 “核酸分子”は、一本鎖形態、または二本鎖らせんのリボヌクレオシド（アデ ノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；“ＲＮＡ分子”）またはデオキ シリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミ ジン、またはデオキシシチジン；“ＤＮＡ分子”）のリン酸エステルポリマー形 態を表す。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡらせん が可能である。核酸分子、特にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子という用語は、その 分子の一次構造及び二次構造のみを表し、それをいずれかの特別な三次形態に限 定しない。こうして、この用語は、とりわけ、直線状または環状のＤＮＡ分子( 例えば、制限フラグメント)、プラスミド、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡ を含む。特別な二本鎖ＤＮＡ分子の構造を説明する際に、配列はＤＮＡの非転写 ストランド（即ち、ｍＲＮＡに相同の配列を有するストランド）に沿って5'から 3'の方向の配列のみを示す通常の慣例に従って本明細書に記載し得る。“組換え ＤＮＡ分子”は分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。 核酸分子の一本鎖形態が温度及び溶液イオン濃度の適当な条件下でその他の核 酸分子にアニールし得る場合、核酸分子は別の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲ ノムＤＮＡ、またはＲＮＡに“ハイブリッドを形成することができる”(Sambroo kらの上記文献を参照のこと)。温度及び溶液イオン濃度の条件はハイブリダイゼ ーションの“ストリンジェンシー”を決定する。相同の核酸に関する予備スクリ ーニングについて、55°のＴm に相当する低ストリンジェンシーハイブリダイゼ ーション条件が使用し得る（例えば、5x SSC、0.1 ％のSDS、0.25％のミルク、 及びホルムアミドなし；または30％のホルムアミド、5x SSC、0.5 ％のSDS)。適 度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は更に高いＴm、例えば、4 0％のホルムアミド、5xまたは6x SSCに相当する。高ストリンジェンシーハイブ リダイゼーション条件は最高のＴm、例えば、50％のホルムアミド、5xまたは6x SSCに相当する。ハイブリダイゼーションは、２種の核酸が相補配列を含むこと を必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基 間の不適合が可能である。核酸をハイブリッドを形成するのに適したストリンジ ェンシーは核酸の長さ及び相補性の程度、当業界で公知の変数に依存する。２種 のヌクレオチド配列の間の類似性または相同性の程度が大きい程、これらの配列 を有する核酸のハイブリッドに関するＴm の値が大きい。核酸ハイブリダイゼー ションの相対的安定性（高いＴm に相当する）は下記の順に低下する：ＲＮＡ： ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが100 ヌクレオチドより大きい ハイブリッドについて、Ｔm を計算するための式が誘導された（Sambrookらの上 記文献、9.50-0.51 を参照のこと）。短い核酸、即ち、オリゴヌクレオチドを用 いるハイブリダイゼーションについて、不適合の位置が重要になり、オリゴヌク レオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrookらの上記文献、11.7-11.8 を 参照のこと）。ハイブリッドを形成することができる核酸の最小の長さは少なく とも10ヌクレオチドであることが好ましい。少なくとも約15ヌクレオチドである ことが更に好ましい。その長さが少なくとも約20ヌクレオチドであることが最も 好ましい。 ＤＮＡ“コード配列”は、適当な調節配列の制御下に置かれる時にin vitroま たはin vivo で細胞中で転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列 である。コード配列の境界は5'（アミノ）末端の開始コドン及び3'（カルボキシ ル）末端の翻訳終止コドンにより決められる。コード配列として、原核配列、真 核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）のＤＮＡからのゲ ノムＤＮＡ配列、及び更には合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定され ない。コード配列が真核生物細胞中の発現を目的とする場合、ポリアデニル化シ グナル及び転写終止配列が通常コード配列に対し3'に配置されるであろう。 発現調節配列、例えば、転写調節配列及び翻訳調節配列はＤＮＡ調節配列、例 えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、等であり、これらは宿主 細胞中でコード配列の発現を与える。真核生物細胞中で、ポリアデニル化シグナ ルは調節配列である。 “プロモーター配列”は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合することができ 、 下流(3'方向)のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である 。本発明を特定する目的で、プロモーター配列は転写開始部位によりその3'末端 で境界され、上流（5'方向）に延びてバックグラウンドより上の検出可能なレベ ルで転写を開始するのに必要な塩基または元素の最小数を含む。プロモーター配 列内に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼS1でマッピングすることにより都 合良く特定される）、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ド メイン（コンセンサス配列）が見られるであろう。 コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写する時に細 胞中で転写及び翻訳調節配列の“制御下”にあり、またはその配列と“操作によ り会合され”、これはその後にトランス−ＲＮＡスプライシングされ、コード配 列によりコードされたタンパク質に翻訳される。 “シグナル配列”は細胞の表面で発現すべきタンパク質のコード配列の開始部 に含まれる。この配列は成熟ポリペプチドにＮ末端のシグナルペプチドをコード し、それが宿主細胞を誘導してポリペプチドをトランスロケートする。“トラン スロケーションシグナル配列”という用語はこの種のシグナル配列を表すのに本 明細書に使用される。トランスロケーションシグナル配列は真核生物及び原核生 物に自生の種々のタンパク質と会合して見られ、しばしば両方の型の生物中で機 能性である。 本明細書に使用される、全ての文法上の形態の“配列相同性”という用語は、 スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタン パク質及び異種からの相同のタンパク質（例えば、ミオシンＬ鎖、等）を含む、 “共通の進化起源”を有するタンパク質間の関係を表す（Reeckら，1987，Cell5 0:667）。 それ故、全ての文法上の形態の“配列類似性”という用語は、共通の進化起源 を共有しないタンパク質の核酸配列またはアミノ酸配列の間の同一性または一致 の程度を表す（ReecK らの上記文献を参照のこと）。 二つのＤＮＡ配列は、そのヌクレオチドの少なくとも約75％（好ましくは少な くとも約80％、最も好ましくは少なくとも約90または95％）がＤＮＡ配列の特定 された長さにわたって適合する場合に“実質的に相同”または“実質的に同様” である。実質的に相同である配列は、配列データバンクで入手し得る通常のソフ トウェアを使用して、または、例えば、その特別な系について特定されたストリ ンジェント条件下のサザンハイブリダイゼーション実験において、これらの配列 を比較することにより同定し得る。適当なハイブリダイゼーション条件の特定は 当業界の技術水準内である。例えば、Maniatisらの上記文献; DNA Cloning，Ｉ 巻及びII巻、上記文献; Nucleic Acid Hybridization、上記文献を参照のこと。 同様に、二つのアミノ酸配列は、アミノ酸の70％より多くが同一、または機能 上同一である場合に“実質的に相同”または“実質的に同様”である。同様また は相同の配列は、例えば、GCG(Genetics Computer Group，Program Manual for the GCG Package，Version7，Madison，Wisconsin)パイルアップ・プログラムを 使用する整列により同定される。 “相当する”という用語は同様または相同の配列を表すために本明細書に使用 され、その正確な位置が、類似性または相同性を測定する分子と同一または異な るかを問わない。こうして、“相当する”という用語は配列類似性を表し、アミ ノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングを表すものではない。 ＤＥＣをコードする遺伝子（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを問わない）はあら ゆる起源、特にヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離し得る。ＤＥＣ 遺伝子を得る方法は、上記のように、当業界で公知である(例えば、Sambrookら ，1989，上記文献を参照のこと)。下記の特別な実施態様において、マウスDEC-2 05をコードするｃＤＮＡが樹状細胞ライブラリーから単離される。加えて、マウ ス遺伝子に由来するプローブが相当するヒトdec ｃＤＮＡ及びマウスゲノムdec 遺伝子を単離するのに使用された。 それ故、動物細胞がdec 遺伝子の分子クローニングのための核酸起源として潜 在的に利用し得る。そのＤＮＡがクローン化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ“ライブラ リー”）から当業界で知られている通常の操作により得られてもよく、好ましく は化学合成、ｃＤＮＡクローニング、または樹状細胞から精製された、ゲノムＤ ＮＡ、もしくはそのフラグメントのクローニングによりそのタンパク質の高レベ ルの発現を有する組織から調製されたｃＤＮＡライブラリー（例えば、樹状細胞 ｃＤＮＡまたは胸腺上皮ｃＤＮＡライブラリー、何となれば、これらがＤＥＣ の最高のレベルの発現を証明する細胞であるからである）から得られる（例えば Sambrookら，1989，上記文献；Glover,D.M．編集，1985，DNA Cloning: A Prac- tical Approach，MRL Press,Ltd.，Oxford，U.K.Ｉ巻，II巻を参照のこと）。ゲ ノムＤＮＡに由来するクローンはコード領域の他に調節領域及びイントロンＤＮ Ａ領域を含んでいてもよい。ｃＤＮＡに由来するクローンはイントロン配列を含 まないであろう。どのような起源であろうとも、その遺伝子が遺伝子の伝搬に適 したベクターに分子クローン化されるべきである。 ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡフラグメント が生成され、その幾つかが所望の遺伝子をコードするであろう。ＤＮＡは種々の 制限酵素を使用して特定の部位で開裂されてもよい。また、マンガンの存在下で ＤＮＡseを使用してＤＮＡを断片化してもよく、またはＤＮＡは、例えば、音波 処理により物理的に剪断し得る。次いで直線状ＤＮＡフラグメントが、アガロー ス及びポリアクリルアミドゲル電気泳動並びにカラムクロマトグラフィーを含む が、これらに限定されない通常の技術によりサイズに従って分離し得る。 ＤＮＡフラグメントが一旦生成されると、所望のdec 遺伝子を含む特定のＤＮ Ａフラグメントの同定が幾つかの方法で行い得る。例えば、或る量のdec 遺伝子 の一部またはその特定のＲＮＡ、またはこれらのフラグメントが入手でき、精製 され、標識し得る場合、生成されたＤＮＡフラグメントは標識プローブへの核酸 ハイブリダイゼーションによりスクリーニングし得る(Benton 及びDavis，1977, Science 196:180; Grunstein 及びHogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.7 2:3961)。例えば、ＤＥＣタンパク質について得られた部分アミノ酸配列情報に 相当するオリゴヌクレオチドの組が調製でき、下記の特定の実施例で行われたよ うにＤＥＣをコードするＤＮＡのプローブとして、またはｃＤＮＡもしくはｍＲ ＮＡのプライマー（例えば、RT-PCRのポリ-Tプライマーと組み合わせて）として 使用し得る。本発明のＤＥＣに高度に特異であるフラグメントが選ばれることが 好ましい。プローブに対し実質的な相同性を有するこれらのＤＮＡフラグメント がハイブリッドを形成するであろう。上記のように、相同性の程度が大きい程、 更にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が使用し得る。特別な実施 態様において、ヒトdec ｃＤＮＡがマウスdec ｃＤＮＡの3'コード配列から 誘導された300 塩基対プローブを使用してクローン化された。ヒトｃＤＮＡは高 ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件(0.1 SSC、65℃)を使用してＢ リンパ腫ライブラリーから得られた。こうして、高ストリンジェンシーハイブリ ダイゼーション条件が有利にされてその他の種からの相同のdec 遺伝子を同定す る。 例えば、遺伝子が等電点の電気泳動のアミノ酸組成を有するタンパク質生成物 、または本明細書に開示されたＤＥＣタンパク質の部分アミノ酸配列をコードす る場合、更なる選択が遺伝子の性質に基いて行い得る。こうして、遺伝子の存在 がその発現産物の物理的性質、化学的性質、または免疫学的性質に基くアッセイ により検出し得る。例えば、ｃＤＮＡクローン、または適当なｍＲＮＡをハイブ リッド選択するＤＮＡクローンが選択でき、これらは、例えば、ＤＥＣについて 知られているような同様または同一の電気泳動移動、等電点電気泳動または非平 衡pHゲル電気泳動挙動、タンパク質分解消化マップ、または抗原性を有するタン パク質を産生する。例えば、以下に詳しく記載されるマウスＤＥＣのウサギポリ クローナル抗体が、マウス相対物及びヒト相対物の両方のＤＥＣの発現を確かめ るのに使用し得る。別の局面において、205 kDa の見掛分子量を有し、特異的に 消化されて低分子量バンドの特定のラダー（スミアではない）を生成するタンパ ク質がＤＥＣの良好な候補である。 また、本発明のdec 遺伝子は、ｍＲＮＡ選択、即ち、核酸ハイブリダイゼーシ ョン、続いてin vitroの翻訳により同定し得る。この操作において、ヌクレオチ ドフラグメントがハイブリダイゼーションにより相補ｍＲＮＡを単離するのに使 用される。このようなＤＮＡフラグメントは入手し得る精製dec ＤＮＡに相当し てもよく、または部分アミノ酸配列情報から設計された合成オリゴヌクレオチド であってもよい。単離されたｍＲＮＡの産物のin vitro翻訳産物の免疫沈殿分析 または機能アッセイ（例えば、チロシンホスファターゼ活性）がｍＲＮＡ、ひい ては所望の配列を含む相補ＤＮＡフラグメントを同定する。加えて、特定のｍＲ ＮＡが、ＤＥＣに対し特異的に誘導された固定抗体、例えば、本明細書に記載さ れたウサギポリクローナル抗マウスＤＥＣ抗体への細胞から単離されたポリソー ムの吸着により選択し得る。 放射能標識dec ｃＤＮＡは鋳型として選択されたｍＲＮＡ（吸着されたポリソ ームから）を使用して合成し得る。次いで放射能標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが その他のゲノムＤＮＡフラグメントの中から相同のdec ＤＮＡフラグメントを同 定するためのプローブとして使用し得る。 また、本発明は、ＤＥＣと同じか、または相同の機能活性を有する、本発明の ＤＥＣの類似体及び誘導体、並びにその他の種からのその同族体をコードする遺 伝子を含むクローニングベクターに関する。ＤＥＣに関する誘導体及び類似体の 生産及び使用は本発明の範囲内である。特別な実施態様において、誘導体または 類似体は機能活性であり、即ち、完全長の野生型ＤＥＣと関連する一つ以上の機 能活性を示すことができる。 別の局面において、本発明のＤＥＣタンパク質は、DEC-205 中に見られるもの をレクチンドメインまたは別のタンパク質、例えば、マクロファージのマンノー スレセプターまたは筋肉のホスホリパーゼレセプターからのドメインに置換する ことにより調製し得る。 ＤＥＣ誘導体は、機能上均等の分子を与える置換、付加または欠失によりコー ドする核酸配列を変更することによりつくられる。天然ＤＥＣに対し増進または 増大された機能活性を有する誘導体がつくられることが好ましい。また、このよ うな誘導体は、本発明のＤＥＣの天然リガンドについて同じか、または大きいア フィニティーを有するＤＥＣ細胞外ドメインの可溶性フラグメントをコードし得 る。このような可溶性誘導体はＤＥＣに結合するリガンドの潜在的なインヒビタ ーであり得る。 ヌクレオチドをコードする配列の縮重のために、dec 遺伝子と実質的に同じア ミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列が本発明の実施に使用し得る。これ らとして、対立遺伝子、その他の種からの相同遺伝子、及び配列内の同じアミノ 酸残基をコードする異なるコドンの置換により変更され、こうしてサイレント変 化を生じるdec 遺伝子の全部または一部を含むヌクレオチド配列が挙げられるが 、これらに限定されない。同様に、本発明のＤＥＣ誘導体として、一次アミノ酸 配列として、機能上均等のアミノ酸残基が配列内の残基に代えられて保存アミノ 酸置換をもたらす変化された配列を含むＤＥＣタンパク質のアミノ酸配列の全部 ま たは一部を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、配列内の 一つ以上のアミノ酸残基が同様の極性の別のアミノ酸により置換でき、これが機 能上の均等物として作用して、サイレント変化をもたらす。配列内のアミノ酸の 置換体は、アミノ酸が属するクラスのその他の員から選択されてもよい。例えば 、無極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリ ン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる 。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロ シン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電される（塩基性） アミノ酸として、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電さ れる（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。 このような変化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により測定し て、見掛分子量に影響しないと予想されるであろう。 本発明のＤＥＣ誘導体及び類似体をコードする遺伝子は当業界で知られている 種々の方法により生産し得る。それらの生産をもたらす操作が遺伝子レベルまた はタンパク質レベルで起こり得る。例えば、クローン化遺伝子配列は、当業界で 知られている多数の戦略のいずれかにより変更し得る(Sambrook ら，1989，上記 文献)。その配列は適当な部位で一種以上の制限エンドヌクレアーゼで開裂でき 、続いて所望により更なる酵素修飾が行われ、単離され、in vitroでつながれる 。ＤＥＣの誘導体または類似体をコードする遺伝子の生産において、修飾遺伝子 が、所望の活性がコードされる遺伝子領域中で、翻訳終止シグナルにより中断さ れないで、ＤＥＣ遺伝子と同じ翻訳読み取り枠内に残ることを確実にするように 注意が払われるべきである。 更に、ＤＥＣをコードする核酸配列はin vitroまたはin vivo で突然変異され て、翻訳、開始、及び／または終止配列を生じ、かつ／または分解し、またはコ ード領域中に変化を生じ、かつ／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形 成し、または既存のものを分解して、in vitro修飾を更に促進し得る。このよう な突然変異は突然変異されたＤＥＣ遺伝子産物の機能活性を増進することが好ま しい。また、ＤＥＣのフラグメント、例えば、一つまたは二三のレクチンドメイ ンをコードする欠失変異体が生成し得る(Taylorら，1992，J.Biol.Chem．267: 1719を参照のこと)。in vitro部位誘導突然変異誘発(Hutchinson,C．ら，1978， J.Blol.Chem．253:6551; Zoller 及びSmith，1984，DNA 3:479-488; Oliphantら ，1986，Gene 44:177; Hutchinson ら，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．83:7 10)、 界で知られている突然変異誘発のあらゆる技術が使用し得る。PCR 技術が部位誘 導突然変異誘発に好ましい（Higuchi，1989，“Using PCR to Engineer DNA”， PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification，H.Erl ich編集，Stockton Press，６章，61-70 頁を参照のこと）。 次いで、同定され、単離された遺伝子が適当なクローニングベクターに挿入し 得る。当業界で知られている多数のベクター−宿主系が使用し得る。可能なベク ターとして、プラスミドまたは修飾ウイルスが挙げられるが、これらに限定され ず、そのベクター系は使用される宿主細胞と適合性である必要がある。ベクター の例として、E.coli、バクテリオファージ、例えば、λ誘導体、またはプラスミ ド、例えば、pBR32 誘導体もしくはpUC プラスミド誘導体、例えば、pGEXベクタ ー、pmal-c、pFLAG、等が挙げられるが、これらに限定されない。クローニング ベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡフラグメントをクローニングベクター（こ れは相補性付着末端を有する）につなぐことにより行い得る。しかしながら、Ｄ ＮＡを断片化するのに使用される相補制限部位がクローニングベクター中に存在 しない場合、ＤＮＡ分子の末端が酵素修飾されてもよい。また、あらゆる所望の 部位が、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端につなぐことにより生じら れてもよい。これらのつながれたリンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列を コードする特別に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。組換 え分子は形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、等 により宿主細胞に導入でき、その結果、遺伝子配列の多くのコピーが生じられる 。クローン化遺伝子はシャトルベクタープラスミドに含まれることが好ましく、 これはクローニング細胞、例えば、E.coli中の増加及び適当な発現細胞系へのそ の後の挿入のための容易な精製（このようなことが所望される場合）を与える。 例えば、シャトルベクター（これは一つより多い型の生物中で複製することがで きるベクターである）は、E.coliプラスミドからの配列を酵母２μプラスミドか らの配列と結合することによりE.coli及びサッカロミセス・セレビジアエ(Sacc- haromyces cerevisiae)の両方中の複製のために調製し得る。 別法において、所望の遺伝子は、“ショットガン”アプローチにおける好適な クローニングベクターへの挿入後に同定され、単離されてもよい。例えば、サイ ズ分別による所望の遺伝子の濃縮がクローニングベクターへの挿入の前に行い得 る。 ＤＥＣポリペプチドの発現 ＤＥＣ、またはその抗原性フラグメント、誘導体もしくは類似体、或いはその キメラタンパク質を含む、機能活性誘導体をコードするヌクレオチド配列が適当 な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写及び翻訳 に必要な要素を含むベクターに挿入し得る。このような要素が本明細書中“プロ モーター”と称される。こうして、本発明のＤＥＣをコードする核酸が本発明の 発現ベクター中でプロモーターと操作により会合される。ｃＤＮＡ配列及びゲノ ム配列の両方がクローン化され、このような調節配列の制御下で発現し得る。ま た、発現ベクターは複製開始点を含むことが好ましい。 必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは組換え発現ベクターに用意でき、また はそれらはＤＥＣ及び／またはその隣接領域をコードする自生遺伝子により供給 されてもよい。 潜在的な宿主−ベクター系として、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、 アデノウイルス等）で感染された哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウ イルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母の如き微生物；また はバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで 形質転換されたバクテリアが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの 発現要素はそれらの強さ及び特異性の点で変化する。使用される宿主−ベクター 系に応じて、幾つかの好適な転写要素及び翻訳要素のうちのいずれか一つが使用 し得る。 本発明の組換えＤＥＣタンパク質、またはその機能性フラグメント、誘導体、 キメラ構築物、もしくは類似体は、組換えによるコード配列の組込み後に染色体 発現し得る。これに関して、幾つかの増幅系のうちのいずれかが高レベルの安定 な遺伝子発現を達成するのに使用し得る（SambrooKら，1989，上記文献を参照の こと）。 ＤＥＣをコードする核酸を含む組換えベクターが導入された細胞は、細胞によ るＤＥＣの発現を与える条件下で適当な細胞培地中で培養される。 クローニングベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入について既に記載された 方法のいずれかが、適当な転写／翻訳調節シグナル及びタンパク質をコードする 配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築するのに使用し得る。これらの方 法として、in vitro組換えＤＮＡ及び合成技術並びにin vivo 組換え（遺伝子組 換え）が挙げられる。 ＤＥＣタンパク質の発現は当業界で知られているあらゆるプロモーター／エン ハンサー要素により調節し得るが、これらの調節要素は発現に選ばれた宿主中で 機能性である必要がある。ＤＥＣ遺伝子発現を調節するのに使用し得るプロモー ターとして、SV40早期プロモーター領域(Benoist及びChambon，1981，Nature 29 0:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端リピート中に含まれるプロモーター (Yamamoto ら，1980，Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ ー(Wagner ら，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．78:1441-1445)、メタロチオ ネイン遺伝子の調節配列(Brinster ら，1982，Nature 296:39-42)、原核生物発 現ベクター、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroff ら，1978 ，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．75:3727-3731）、またはtac プロモーター(DeBoe r ら，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．80:21-25):また“Useful proteins fr omrecombinant bacteria”，Scientific American，1980，242:74-94を参照のこ と、酵母またはその他の菌類からのプロモーター要素、例えば、Gal４プロモー ター、ADC（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスホグリセロ ールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、及び動 物転写調節領域（これらは組織特異性を示し、トランスジェニック動物中で使用 されていた）が挙げられるが、これらに限定されない。 本発明のＤＥＣをコードする核酸を含む発現ベクターは４つの一般的なアプロ ーチ：(a)所望のプラスミドＤＮＡまたは特定のｍＲＮＡのPCR 増幅、(b)核酸 ハイブリダイゼーション、(c)選択マーカー遺伝子機能の存在または不在、及び( d)挿入された配列の発現により同定し得る。第一のアプローチにおいて、核酸は PCR により増幅されて増幅産物の検出を与え得る。第二のアプローチにおいて、 発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたマーカー遺伝子に相 同である配列を含むプローブを使用して核酸ハイブリダイゼーションにより検出 し得る。第三のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクター中の 外来遺伝子の挿入により生じた或る“選択マーカー”遺伝子機能（例えば、β− ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転 換表現型、バキュロウイルス中の咬合体形成、等）の存在または不在に基いて同 定され、選択し得る。別の例では、ＤＥＣをコードする核酸がベクターの“選択 マーカー”遺伝子配列内に挿入される場合、ＤＥＣインサートを含む組換え体は ＤＥＣ遺伝子機能の不在により同定し得る。第四のアプローチにおいて、組換え 発現ベクターは、発現されたタンパク質が機能上活性なコンホメーションをとる ことを条件として、組換え体により発現された遺伝子産物の活性、生化学的特徴 、または免疫学的特徴について分析することにより同定し得る。 特別な組換えＤＮＡ分子が同定され、一旦単離されると、当業界で知られてい る幾つかの方法がそれを伝搬するのに使用し得る。好適な宿主系及び増殖条件が 一旦確立されると、組換え発現ベクターが増殖され、所定の量で調製し得る。先 に説明されたように、使用し得る発現ベクターとして下記のベクターまたはそれ らの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。二三名を挙げると、ヒトま たは動物ウイルス、例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス、昆虫ウ イルス、例えば、バキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクタ ー（例えば、λ）、及びプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター。 加えて、挿入された配列の発現を変調し、または所望の特定の様式で遺伝子産 物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が選択し得る。異なる宿主細胞はタン パク質の翻訳及び後翻訳のプロセシング及び修飾（例えば、グリコシル化、［例 えば、シグナル配列の］開裂）について特徴的かつ特定のメカニズムを有する。 適当な細胞系または宿主系が、発現された外来タンパク質の所望の修飾及びプロ セシングを確実にするように選ばれる。例えば、バクテリア系中の発現が非グリ コシル化コアタンパク質産物を生産するのに使用し得る。しかしながら、バクテ リア中で発現されたトランスメンブランＤＥＣタンパク質は適当に折り畳まれな くてもよい。酵母中の発現はグリコシル化産物を生じ得るが、グリコシル化のパ ターンは哺乳類細胞中の発現により得られたものとはおそらく異なるであろう。 真核生物細胞中の発現は異種タンパク質の“自然”グリコシル化及び折り畳みの 可能性を増大し得る。更に、哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)、アルリカン・グリーン・モンキーCOS 細胞、及び繊維芽細胞NIK-3T3 細 胞（例えば、293 細胞）中の発現は、ＤＥＣ活性を再生し、または構成するため の手段を与えることができる。更に、異なるベクター／宿主発現系はプロセシン グ反応、例えば、タンパク質分解開裂に異なる程度に影響し得る。 本発明の好ましい局面において、ＤＥＣはＤＥＣにターゲッティングされたリ ガンドまたは分子の経上皮移動の効力及び速度の研究のためにモデル上皮細胞、 例えば、マジン−ダービィイヌ腎臓(MDCK)細胞に導入される。また、以下に示さ れるように、dec 遺伝子が、in vivo またはex vivo の遺伝子移入により遺伝子 治療のために上皮細胞または樹状細胞に導入し得る。 ベクターは当業界で知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレ クトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融 合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム 融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートタンスポーター（例えば、Wu ら，1992，J.Biol.Chem．267:963-967; Wu及びWu，1988，J.Biol.Chem．263:146 21-14624;1990年３月15日に出願されたHartmut らのカナダ特許出願第2,012,311 号を参照のこと）により所望の宿主細胞に導入される。 内在性膜タンパク質として発現された組換えＤＥＣタンパク質は通常の方法に より単離され、精製し得る。一般に、内在性膜タンパク質は、その膜を洗剤、例 えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、トリトンX-100、ノニデットP-40（NP-40 ）、ジゴキシン、デオキシ葉酸ナトリウム等（これらの混合物を含む）（これら に限定されない）で溶解することにより得られる。可溶化は懸濁液の音波処理に より増進し得る。下記の特別な実施態様において、DEC-205 は0.5 ％のNP-40 を 含む緩衝液中で胸腺膜ペレットから可溶化される。タンパク質の可溶性形態は、 培養液を回収し、または、例えば、洗剤による処理、及び所望により上記の音波 処理またはその他の機械的方法により封入体を可溶化することにより得られる。 可溶化されたタンパク質または可溶性タンパク質は、種々の技術、例えば、ポリ アクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、等電点電気泳動、２−次元ゲル電気泳動、 クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、及びサイジン グカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解性、免疫沈殿を使用して、 またはタンパク質の精製のためのあらゆるその他の通常の技術により単離し得る 。下記の特別な実施態様において、DEC-205 が、モノクローナル抗体NLDC-145を 含むアフィニティーカラムを使用して精製された。下記の別の実施態様において 、DEC-205 がモノクローナル抗体NLDC-145による免疫沈殿により精製された。 ＤＥＣ構造の特性決定 ＤＥＣ遺伝子配列を発現する組換え体が一旦同定され、多量のタンパク質の発 現が得られると、組換えＤＥＣ産物が分析し得る。これは、産物の放射能標識、 続いてゲル電気泳動、イムノアッセイ、等による分析を含む、産物の物理的性質 及び機能性に基くアッセイにより達成される。 例えば、エンドサイトーシス及び被覆ピット、ひいてはクラスII MHCプロセシ ングと関連するエンドサイトーシスにより形成性の(endocytic)小胞へのターゲ ッティングを媒介する発現されたタンパク質、またはその細胞質ドメインを含む フラグメントの能力が測定し得る。下記の一実施態様において、エンドサイトー シスは抗ＤＥＣ抗体及び抗ＤＥＣ抗体と反応性の金標識二次抗体を使用して電子 顕微鏡により評価された。別の実施態様において、抗原をプロセシングし、提示 する能力が、抗ＤＥＣ抗体及び対照非特異性抗体のプロセシングに応答する抗体 特異性Ｔ細胞増殖を分析することにより評価される。 本発明のＤＥＣの構造は、当業界で知られている種々の方法により分析し得る 。種々のドメイン、特にレクチン結合ドメイン及び細胞質ドメインの構造が分析 されることが好ましい。構造分析は、その他の既知タンパク質との配列類似性を 同定することにより行い得る。類似性（または相同性）の程度はＤＥＣ、または そ のドメインの構造及び機能を予想するための基礎を与え得る。特別な実施態様に おいて、配列比較は、例えば、FASTA プログラム及びFASTP プログラム(Pearson 及びLipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-48)を使用して、ゲンバン クに見られる配列を用いて行い得る。 タンパク質配列は親水性分析(例えば、Hopp及びWoods，1981，Proc.Natl.Acad .Sci.U.S.A．78:3824)により更に特性決定し得る。親水性プロフィールはＤＥＣ タンパク質の疎水性領域及び親水性領域を同定するのに使用し得る。 また、二次構造分析（例えば、Chou及びFasman，1974，Biochemistry 13:222 ）が、特定の二次構造をとるＤＥＣの領域を同定するのに行い得る。 また、操作、翻訳、及び二次構造予想、並びに読み取り枠予想及びプロッティ ングは、当業界で利用できるコンピューター・ソフトウェア・プログラムを使用 して達成し得る。 組換えＤＥＣの豊富な起源を与えることにより、本発明はＤＥＣ、またはその ドメインの定量的構造決定を可能にする。特に、充分な物質が核磁気共鳴(NMR) 、赤外(IR)、ラマン、及び紫外線(UV)、特に円偏光二色(CD)分光分析に用意され る。特に、NMR が溶液中の分子の非常に強力な構造分析を与え、これがそれらの 自然環境の更に近似する(Marionら，1983，Biochem.Biophys.Res.Comm．113:967 -974;Bar ら，1985，J.Magn.Reson．65:355-360; Kimuraら，1980，Proc.Natl.A cad．Sci.U.S.A．77:1681-1685)。また、構造分析のその他の方法が使用し得る 。これらとして、Ｘ線結晶学(Engstom,A.，1974，Biochem.Exp.Biol．11:7-13) が挙げられるが、これに限定されない。 ＤＥＣ及びＤＥＣ特異性リガンドの共晶(co-crystal)が研究し得ることが更に 好ましい。共晶の分析は結合に関する詳しい情報を与え、これが順にリガンドア ゴニスト及びアンタゴニストの合理的な設計を可能にする。また、コンピュータ ーモデリングが、特にNMR方法またはＸ線方法と協力して使用し得る(Fletterick ,R.及びZoller,M．編集，1986，Computer Graphics and Molecular Modeling，C urrent Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laborator y，Cold Spring Harbor，New York)。 更に別の実施態様において、本発明の推定ＤＥＣは、それがマウスDEC-205 に 特異性の抗体と交差反応するか否かを測定するために試験し得る。例えは、推定 ＤＥＣは下記の実施例に記載されるようにウサギポリクローナル抗体と反応させ られて、それが結合するか否かを測定し得る。また、ＤＥＣタンパク質は抗体を 産生するのに使用でき、これがマウス起源またはヒト起源からのDEC-205 との交 差反応性について試験し得る。交差反応性の程度はタンパク質の構造相同性また は類似性に関する情報を与える。 ＤＥＣの炭水化物組成は、レクチン結合、化学分析、イムノアッセイ、免疫化 学分析（例えば、糖接合体をvic-ジオールの過ヨウ素酸塩酸化後にジゴキシゲニ ン標識ヒドラゾンに変換することによる）、化学脱グリコシル化、酵素脱グリコ シル化、及びエキソグリコシダーゼ消化、続いてFACE（蛍光体補助炭水化物電気 泳動）分析を含むが、これらに限定されない、当業界で知られている種々の手段 により研究し得る。 ＤＥＣのリガンド 最も重要なことに、本発明はＤＥＣのリガンド、例えば、ＤＥＣのレクチンド メインの一つ以上に結合する炭水化物リガンドの同定を有利に提供する。このよ うなリガンドはＤＥＣへの結合をターゲッティングするのに特に有益である。本 明細書に使用される“リガンド”はその通常の意味、即ち、レセプター、この場 合にはＤＥＣに特異的に結合することができる分子を有する。本明細書に使用さ れる“炭水化物リガンド”という用語はＤＥＣを特異的に結合することができる 炭水化物または糖を表す。一般に、また“グリカゾ”、“サッカリド”、または “オリゴサッカリド”と称される、このような炭水化物は糖タンパク質の炭水化 物部分である。 本発明のＤＥＣをコードする遺伝子の同定及び単離は、古典的レセプター結合 実験のための組換え細胞中、または細胞のトランスフェクションもしくは形質転 換後に発現されたレセプターの活性を示すように特別に操作されるインジケータ ー細胞中で、天然起源から単離し得るよりも大きい量で、レセプター、またはそ のトランケート部分の発現を与える。それ故、本発明は、当業界で知られている 種々のスクリーニングアッセイを使用してＤＥＣの特定のリガンドを同定するこ とを意図している。組換え発現されたタンパク質は一つ以上のＤＥＣレクチンド メインを含むことができ、また天然タンパク質のトランケート形態または別のタ ンパク質とのキメラ構築物として発現された天然タンパク質の部分であってもよ い。 当業界で知られているあらゆるスクリーニング技術がＤＥＣリガンドのスクリ ーニングに使用し得る。本発明は小分子リガンドまたはリガンド類似体及び擬態 のスクリーン、並びにin vivo でＤＥＣに結合する天然リガンドのスクリーンを 意図している。特に、本発明はＤＥＣを結合する炭水化物グループの同定、更に 特別には、高アフィニティー及び高特異性でＤＥＣを結合する炭水化物グループ の同定を提供する。 本発明の好ましい局面において、ＤＥＣリガンドの検出は、可溶化されたＤＥ ＣまたはＤＥＣフラグメントをセファロースの如き固相担体に結合された糖また はグリカンから調製されたカラムに結合することにより行われる(Taylorら，199 2，J.Biol.Chem．267:1719)。特に、本発明はドメインの一つまたは二三のみを 含むトランケート変異体ＤＥＣタンパク質を発現することにより種々のレクチン ドメインのリガンド特異性を分析することを意図している。また、候補グリカン がキャリヤータンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン(これは、例えば、125I で標識される)に接合でき、細胞、例えば、上記のような組換え細胞(Taylorら， 上記文献)により発現されたＤＥＣまたはＤＥＣフラグメントへの結合が検出し 得る。更に別の実施態様において、標識グリカン−キャリヤータンパク質の結合 が記載されたようなミクロタイタアッセイ(Taylor 及びDrickamer，1993，J.Bio l.Chem．268:399)において評価される。候補炭水化物リガンドとして、マンノー ス、フコース、Ｎ−アセチルーグルコサミン、グルコース、ガラクトース、Ｎ− アセチル−ガラクトサミン、その他の二三のこのような炭水化物が挙げられるが 、これに限定されない。その他のリガンド候補として、二糖、及び更に大きなオ ーダーの多糖、例えば、種々のレクチンにより認識されるようなものが挙げられ る。 本明細書に使用される“結合の検出”という用語は、別の分子との一種の 分子の会合、例えば、ＤＥＣとのＤＥＣリガンドの会合を検出するのに普通に使 用されるミリアド(miriad)技術のあらゆるものを表す。これらの技術として、 以下に説明されるイムノアッセイ技術、またはその改良が挙げられ、一般にその 他の物体（これは固相担体または細胞に見られる）との結合物体、ポリペプチド を含むＤＥＣ−レクチンまたは候補リガンドの一つで接合された標識の会合を検 出することに依存する。しかしながら、結合の検出は、例えば、上澄みからの標 識結合物体の不在を検出することにより間接的に行い得る。更に別の局面におい て、結合は、最初に未結合物質を除去し、続いて結合対から標識物体を除去する ことにより（例えば、カオトロピック剤を使用して）検出し得る。別の物体への 一つの物体の結合を検出するためのこれらの技術及びその他の技術が当業界で公 知である。 固相アッセイまたは不均一相アッセイについて、結合対の一つの物体は固相担 体、例えば、ビード（例えば、セファロース）、ラテックス粒子、クロマトグラ フィー担体、磁気粒子、シリカ粒子、シリコンウェハ、またはプラスチックミク ロタイタプレートと不可逆的に会合されるであろう。“不可逆的に会合される” という用語は、解離しないこと、またはそれが目視検出できないアッセイ時間と 比較して低い解離の速度を特徴とする共有結合または非共有結合を表す。 ＤＥＣの一次配列、及び既知機能の担体とのその配列の類似性の知識は、その タンパク質のインヒビターまたはアンタゴニストとしての初期の手掛かりを与え ることができる。この場合、マクロファージのマンノースレセプター及び筋肉の ホスホリパーゼレセプターの配列とのＤＥＣの演繹配列の相関関係は多数のレク チンドメインとのレセプターとしてのＤＥＣの特性決定を助けた。アンタゴニス トの同定及びスクリーニングは、例えば、Ｘ線結晶学、中性子回折、核磁気共鳴 スペクトロメトリー、及び上記の構造決定に関するその他の技術を使用して、タ ンパク質の構造上の特徴を測定することにより更に促進される。 特別な実施態様において、ＤＥＣの炭水化物リガンドの同定は、既知グリカン を古典的ネオ糖タンパク質、ウシ血清アルブミン、もしくは卵白アルブミン、ま たはクレアチナーゼの如きタンパク質に付着することにより行われるであろう。 特に、自然にグリコシル化されないタンパク質を使用することが有利であり、そ の結果、添加されたグリカンアークの効果のみが分析される。結合アッセイは上 記のような古典的結合アッセイを含んでもよく、または、抗原特異性Ｔリンパ球 の刺激を評価することによる抗原プロセシングアッセイを伴ってもよい。これに 関して、ＢＳＡ及び卵白アルブミンに特異性の多数のＴ細胞系及びクローンが利 用できる。特異性Ｔ細胞増殖を有効に刺激するネオ−グリコシル化ＢＳＡまたは 卵白アルブミンの能力は、ＤＥＣに結合するＢＳＡまたは卵白アルブミンに接合 されたグリカンの能力の指標である。 別の実施態様において、ウシ胎児血清中に存在する、重度にグリコシル化され たタンパク質フェチュインがグリカンリガンドを評価するのに使用し得る。Ｔ細 胞活性化またはマーカーのエンドサイトーシスに基くフェチュイン結合系が開発 し得る。特定のグリコシダーゼがグリカンを特異的に“ノック−アウト”するの に使用でき、結合系中で機能する修飾フェチュインの能力が評価し得る。機能活 性の消失は、酵素修飾された糖残基がＤＥＣへの結合に関与したことを示すであ ろう。 更に別の局面において、ＤＥＣの９番目及び10番目のレクチンドメインが抗体 をエンドソームに“チャペロニング(chaperoning)”することにより膜関連抗体 媒介抗原提示に関与し得るという観察は、これらのドメインが細胞表面免疫グロ ブリン分子に見られる炭水化物を結合するのに特異的であることを示唆する。 別のアプローチは組換えバクテリオファージを使用して大きいライブラリーを 生じる。“ファージ方法”(Scott 及びSmith，1990，Science 249:386-390; Cwi rla ら,1990，Proc.Natl.Acad.Sci．87:6378-6382; Devlinら，1990，Science 2 49:404-406)を使用して、非常に大きなライブラリーが構築し得る（106-108の化 学物体）。第二のアプローチは主として化学的方法を使用し、Geysen方法(Geyse nら，1986，Molecular Immunology 23:709-715; Geysen ら，1987，J.Immunolog ic Method 102:259-274)及びFodor らの最近の方法(1991，Science 251，767-77 3)がその例である。Furka ら(1988，14th International Congress of Biochemi stry,5巻，Abstract FR:013; Furka，1991，Int.J.Peptide Protein Res.37:487 -493）、Houghton（1986年12月に発行された米国特許第4,631,211 号）及びRutt erら(1991 年４月23日に発行された米国特許第5,010,175 号）は、アゴニストま たはアンタゴニストとして試験し得るペプチドの混合物を生成する方法を記載し ている。 別の局面において、合成ライブラリー(Needelsら，1993，“Generation and s creening of an oligonucleotide encoded synthetic peptide library”，Proc .Natl.Acad.Sci.USA 90:10700-4; Lam らの国際特許公開番号WO 92/00252 及び1 995年１月17日に発行された米国特許第5,382,513 号、これらの夫々が参考とし て本明細書にそのまま含まれる）等が本発明のリガンドをスクリーニングするの に使用し得る。 また、ＤＥＣの一つ以上のリガンド結合ドメイン（好ましくは複数のドメイン ）の組換え体を発現する細胞への可溶性リガンドの結合に関するアッセイが行い 得る。下記の実施例に説明されるように、ＤＥＣの多数のレクチンドメインの存 在はグリカンへの結合のアフィニティー及び特異性に寄与し得る。 スクリーニングはＤＥＣを発現する組換え細胞を用いて、または、例えば、上 記のように組換え生産された精製レセプタータンパク質を使用して行い得る。例 えば、リガンドに結合する、分子のリガンド結合部分を含む標識された、可溶性 または可溶化されたＤＥＣの能力が、以上の文献に記載されたように、ライブラ リーをスクリーニングするのに使用し得る。 ＤＥＣの抗体 本発明によれば、組換えまたは化学合成により生産されたＤＥＣ、及びそのフ ラグメントまたは融合タンパク質を含むその他の誘導体もしくは類似体が、ＤＥ Ｃを認識する抗体を産生するための免疫原として使用し得る。このような抗体と して、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fa b フラグメント、及びFab 発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定され ない。下記の特別な実施態様にいて、ウサギポリクローナル抗体がDEC-205 のＮ 末端アミノ酸配列に対し調製される。別の実施態様において、無傷の精製DEC-20 5 のポリクローナル抗体が産生された。 当業界で知られている種々の操作がＤＥＣ、またはその誘導体もしくは類似体 のポリクローナル抗体の産生に使用し得る。抗体の産生について、ウサギ、マウ ス、ラット、ヒツジ、ヤギ、等を含むが、これらに限定されない、種々の宿主動 物が、非同種ＤＥＣ、またはその誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タン パク質）による注射により免疫し得る。一実施態様において、ＤＥＣまたはその フラグメントが、免疫原キャリヤー、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)または キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に接合し得る。種々のアジュバントが 、上記の宿主種に応じて、免疫応答を増大するのに使用し得る。 ＤＥＣ、またはそのフラグメント、類似体、もしくは誘導体に誘導されるモノ クローナル抗体の調製について、培養中の連続細胞系により抗体分子の産生を与 えるあらゆる技術が使用し得る。これらとして、Kohler及びMilstein（1975,Nat ure 256:495-497）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、並びにトリオ ーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，1983，Immnunology Toda y 4:72）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技 術(Cole ら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss ．Inc.，77-96頁）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の付加的な 実施態様において、モノクローナル抗体は、最近の技術(PCT/US90/02545)を使用 して無菌動物中で産生し得る。本発明によれば、ヒト抗体が使用されてもよく、 ヒトハイブリドーマ(Cote ら，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A．80:2026-2030 )を使用することにより、またはヒトＢ細胞をin vitroでEBV ウイルス(Cote ら ，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，77-96頁) で形質転換することにより得られる。実際に、本発明によれば、適当な生物活性 のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にＤＥＣに特異性のマウス抗体分子からの遺 伝子をスプライシングすることにより、“キメラ抗体”（Morrisonら，1984，J. Bacteriol.159-870; Neuberger ら，1984，Nature 312:604-608; Takedaら，198 5，Nature 314:452-454）の産生について開発された技術が使用し得る。このよ うな抗体が本発明の範囲内である。 本発明によれば、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,94 6,778号）がＤＥＣ特異性一本鎖抗体を産生するのに採用し得る。本発明の付加 的な実施態様はFab 発現ライブラリーの構築について記載された技術（Huseら， 1989，Sience 246:1275-1281）を使用して、ＤＥＣ、またはその誘導体、もしく は類似体に対し所望の特異性を有するモノクローナルFab フラグメントの迅速か つ容易な同定を可能にする。 抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントが既知技術により生成し得 る。例えば、このようなフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化により生 成し得るF(ab')2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィドブリッジを 還元することにより生成し得るFab'フラグメント、及び抗体分子をパパイン及び 還元剤で処理することにより生成し得るFab フラグメントが挙げられるが、これ らに限定されない。 抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは当業界で知られている技 術、例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、“サン ドイッチ”イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散プレシ ピチン反応、免疫拡散アッセイ、in situ イムノアッセイ（例えば、コロイド金 、酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈殿反応 、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定ア ッセイ、イムノフルオレセンスアッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気 泳動アッセイ、等により行い得る。一実施態様において、抗体結合は一次抗体の 標識を検出することにより検出される。別の実施態様において、一次抗体は一次 抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。更に別の 実施態様において、二次抗体が標識される。結合をイムノアッセイで検出するた めの多くの手段が当業界で知られており、本発明の範囲内である。例えは、ＤＥ Ｃの特定のエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープ を含むＤＥＣフラグメントに結合する生成物について生じたハイブリドーマを分 析し得る。動物の特別な種からのＤＥＣに特異性の抗体の選択のために、動物の その種の細胞により発現され、またはその細胞から単離されたＤＥＣとの陽性結 合及び他の種からのＤＥＣへの結合の不在に基いて選択し得る。ＤＥＣへの結合 はＤＥＣを発現する樹状細胞への結合として検出し得る。 以上の抗体は、例えば、ウェスタンブロッティング、in situ のＤＥＣの画像 形成、適当な生理学的サンプル中のそのレベルの測定、等のために、ＤＥＣの局 在化及び活性に関する当業界で知られている方法に使用し得る。本発明の抗体は ヒト樹状細胞の検出及び計数を有利に与える。また、このような抗体は、例えば 、パンニングによりヒト樹状細胞を単離するのに使用し得る。更に別の実施態様 に おいて、本発明の抗体は分子をヒト樹状細胞にターゲッティングするのに使用し うう。これはかなりの利点であることが認められるであろう。何となれば、Kraa lらの従来の抗体はヒトＤＥＣを認識することができなかったからである。 ＤＥＣにターゲッティングされ、ＤＥＣの活性、例えば、エンドサイトーシス に関与する抗体が産生し得る。このような抗体は、リガンドを同定するための上 記アッセイを使用して試験し得る。特別な実施態様において、ウサギポリクロー ナル抗ＤＥＣ抗体がＤＥＣの結合を標的とし、エンドサイトーシスにかけられ、 免疫グロブリン特異性Ｔ細胞に有効に提示される。 ＤＥＣへの分子のターゲッティング 本発明は免疫調節、例えば、Ｔ細胞免疫の刺激、免疫の抑制またはＴ細胞アネ ルギーの誘導、及びクローンの欠失メカニズム；肺循環系または腸循環系への上 皮を横切る分子の送出、または血流から肺または腸の管腔への送出による経上皮 輸送；及び血液脳関門の横断のためにＤＥＣへの分子のターゲッティングを有利 に与える。特に、上記のＤＥＣのリガンド、または上記のＤＥＣ（またはそのＤ ＥＣ結合部分）と反応性の抗体が、ＤＥＣにターゲッティングされる分子に接合 される。 免疫調節 免疫調節に関して、本発明は、特に予防接種のためのＴ細胞媒介免 疫応答の刺激、及び特に自己免疫に関する寛容性の誘導の両方を与える。 Ｔ細胞免疫の刺激は、ＤＥＣ結合部分（リガンドまたは抗体）に接合された抗 原、例えば、弱いか、または不十分の免疫原性の抗原を、最初に抗原をＴ細胞に 提示する樹状細胞を活性化する因子とともに、被験者に導入することにより行い 得る。樹状細胞活性化は、アジュバント、例えば、上記アジュバント（これは普 遍免疫応答を誘導する能力を有する）の使用により行い得る。また、本発明の“ ワクチン”はＤＥＣ結合部分に接合された抗原及びサイトカインまたはリンホカ イン、例えば、顆粒細胞−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、または或 る種のその他のCSF を含んでもよい。このようなワクチン中の使用に適した抗原 として、バクテリア抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、及び腫瘍抗原が挙げられ る。 また、本発明は寛容性の誘導を提供する。寛容性は有害な免疫応答、特に、自 己免疫及び同種異系移植片拒絶を避けるのに望ましい。例えば、皮膚及びリンパ 系臓器のＴ細胞領域中の非活性化樹状細胞による抗原の提示はＴ細胞アネルギー を誘発し、応答クローンの分解をおそらく生じる。こうして、一実施態様におい て、寛容性は樹状細胞静止を促進する条件下で、例えば、感染の不在下で、アジ ュバントを使用しないで、発熱物質を含まない医薬担体を使用して、付加的なリ ンホカインまたはサイトカインの不在下で、ＤＥＣ結合部分との接合により修飾 された抗原を投与することにより誘導される。 更に、ＤＥＣの高レベルの発現が寛容化の影響として作用し得るものと考えら れる。それ故、更に、本発明はＤＥＣ結合部分に接合された抗原と一緒に、組換 え樹状細胞、またはＤＥＣ及びMHC クラスIIの両方を発現するように組換え修飾 された細胞を被験者に導入することに関する。また、dec 遺伝子が遺伝子治療の ためにin vivo の適当な細胞にターゲッティングし得る。 更に別の実施態様において、寛容性はクローン欠失メカニズムにより誘導し得 る。特に、ＤＥＣ結合部分に接合された抗原が、胸腺上皮及び脊髄樹状細胞によ るプロセシング及び提示のために、ターゲッティングまたは身体注射により、被 験者に、好ましくは胸腺に直接に導入し得る。このプロセシング及び提示工程は 自己反応性Ｔ細胞、即ち、クローン欠失を排除するための選択プロセスに関与す るものと考えられる。更に別の局面において、ＤＥＣの発現のレベルは、例えば 、付加的なdec 遺伝子を胸腺上皮及び脊髄樹状細胞に導入することにより操作し 得る。 寛容性、Ｔ細胞アネルギー、またはクローン欠失を誘導するためのＤＥＣ−リ ガンドとの接合に魅力的な候補として、アレルゲン物質、自己抗原、例えば、ミ エリン塩基性タンパク質、コラーゲンまたはそのフラグメント、ＤＮＡ、核タン パク質及び核小体タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、膵臓β−細胞タンパ ク質、等が挙げられるが、これらに限定されない（Schwarz，1993，Fundamental Immunology，第３編，W.E.Paul編集，Raven Press,Ltd.：New York，1033-1097 頁を参照のこと）。 経上皮移動 別の実施態様において、分子はそれをＤＥＣ結合部分と接合する ことにより経上皮移動のためにターゲッティングし得る。本発明の一局面におい て、本発明は肺または腸上皮を横切る吸収のための治療分子のターゲッティング を提供する。こうして、本発明は吸入、即ち、薬剤の肺投与によりエアゾール適 用される治療薬を送出することを提供する。別の局面において、本発明は小腸を 横切るＤＥＣ媒介吸収による治療薬の送出を提供する。特に、本発明は親水性分 子の吸収、または更に正確には、経粘膜移動を提供し、これらの分子は通常疎水 性分子のようには容易に吸収されない。本発明のこの局面は上皮細胞の先端（ま たは管腔の）表面のＤＥＣの存在を利用する。 本発明の別の局面において、上皮細胞の基底外側表面のＤＥＣの存在は血流か ら肺または小腸の管腔へのＤＥＣ−リガンドに接合された分子の輸送の経路を与 える。この送出経路は腸への酸不安定の親水性治療薬の投与に非常に重要であり 得る。このような薬剤は摂取し得ない。何となれば、胃に存在する酸性条件がそ の分解をもたらすからである。血流から腸の管腔へのこのような薬剤の輸送は自 然には容易に起こらないであろう。何となれば、親水性薬剤は細胞膜を横切って かなりの分配係数を有しないからである。特別な実施態様において、本発明は、 化学治療薬及び抗生物質、特に抗寄生虫薬をＤＥＣのリガンドに接合し、その薬 剤を非経口投与、好ましくは静脈内投与することによりそれらの投与を与え、そ の結果、その薬剤は腸上皮の基底外側表面から管腔表面への輸送のためにターゲ ッティングされる。 同様に、治療薬は、ＤＥＣレセプターを肺上皮の基底外側表面にターゲッティ ングすることにより血流から肺の気道への送出のためにターゲッティングし得る 。このような送出系は損なわれた肺能力の個体、例えば、充分に吸入できず、こ うして血流による投与が指示される個体への薬剤の送出に特に有利であろう。こ のような肺機能障害として、肺炎、蓄膿、肺癌、成人性呼吸不全症候群、呼吸困 難、喀血、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、腺維形成誘導性粉塵症、肺繊維症、有機粉 塵症、化学的外傷、喫煙外傷、熱的外傷（火傷または凍結）、喘息（アレルギー 、気管支収縮、喘息のその他の原因、例えば、刺激物）、過敏症肺臓炎、グッド パスツール症候群、肺脈管炎、及び免疫複合体関連炎症が挙げられるが、これら に限定されない。こうして、本発明は肺の管腔への経上皮移動のための抗生物質 、抗炎 症薬、補体インヒビター（例えば、補体レセプター１[CD35]）、等の投与を提供 する。 経血液脳関門移動 更に別の実施態様において、脳にターゲッティングされる 分子はＤＥＣ結合部分に接合し得る。次いでその分子が脳の毛細管に見られるＤ ＥＣに結合し、これらが経血液脳関門輸送または移動を促進するものと考えられ る。現在、血液脳関門バリヤーを横切って分子を誘導するためのメカニズムは少 なく、または一般に有効ではない。血液脳関門バリヤーを横切る輸送のためのこ のような分子として、神経栄養因子（脳由来神経栄養因子、NT-3、NT-4、毛様体 神経栄養因子）、成長因子（例えば、神経成長因子）、等；脳の初期感染のため の抗生物質または抗ウイルス薬；並びに遺伝子治療のためのベクターが挙げられ るが、これらに限定されない。 遺伝子治療のためのベクターのターゲッティング 更に別の実施態様において 、本発明は、ＤＥＣを発現する細胞、特に、樹状細胞、胸腺、小腸、及び肺の上 皮並びに脳毛細管にＤＮＡベクターをターゲッティングするためのリガンドを提 供する。それ故、ウイルスベクターの如きＤＮＡベクターは、ＤＥＣを発現する 細胞へのターゲッティングのためにＤＥＣリガンドとの接合により修飾し得る。 ＤＮＡウイルスベクターの例として、欠損ヘルペスウイルス１(HSVI)ベクター (Kaplittら，1991，Molec.Cell.Neurosci．2:320-330)、弱毒化アデノウイルス ベクター、例えば、Stratford-Perricaudet ら(1992，J.Clin.Invest．90:626-6 30)により記載されたベクター、欠損アデノ関連ウイルスベクター(Samulski ら ，1987，J.Virol．61:3096-3101; Samulski ら，1989，J.Virol．63:3822-3828) 、並びに乳頭腫ウイルスベクター、エプスタインバーウイルス(EBV)ベクター、 等が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス粒子は、例えば、ＤＥＣリ ガンドをウイルスに化学的に架橋することにより、ＤＥＣのリガンドを含むよう に修飾し得る。 また、ベクターはリポフェクションによりin vivo 導入し得る。リボソーム媒 介トランスフェクションで遭遇される困難及び危険を制限するように設計された 合成陽イオン脂質が、ＤＥＣをコードする遺伝子のin vivo トランスフェクショ ンのためのリポソームを調製するのに使用し得る(Felgnerら，1987，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A．84:7413-7417; Mackeyら，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8 5:8027-8031を参照のこと)。陽イオン脂質の使用は負に帯電された核酸の封入を 促進し、また負に帯電された細胞膜との融合を促進し得る（Felgner 及びRingol d，1989，Science 337:387-388)。in vivo の特定の臓器へ外在性遺伝子を導入 するためのリポフェクションの使用は或る種の実用的な利点を有する。特定の細 胞へのリポソームの分子ターゲッティングは利益の一つの領域に相当する。それ 故、本発明は、ＤＥＣリガンドをリポソームベクターに接合することにより樹状 細胞及び胸腺上皮に遺伝子をターゲッティングすることを提供する。脂質はター ゲッティングの目的のためにその他の分子に化学的にカップリングし得る(Macke yら，1988，上記文献を参照のこと)。ターゲッティングされる抗体またはグリカ ンがリポソームに化学的にカップリングし得る。 露出したDNA プラスミドとして、in vivo でこのベクターを導入することが可 能であり、好ましくは、ベクタートランスポーターとしてDEC リガンドを用いる (Wuらの論文、J.Biol.Chem.、267:963-967頁(1992);Wu及びWuの論文、J.Biol．C hem.、263:14621-14624頁(1988)；1990年３月15日に出願されたHartmut らのカ ナダ特許出願第2,012,311 号参照)。 本発明は、下記の実施例を参照することによって、より理解されると思われる が、これらは例として提供され、限定するものではない。 実施例１：モノクローナル抗体NLDC-145によって検出される、マウスの樹状細胞 及び胸腺上皮に豊富な、205 kDa タンパク質であるDEC-205：精製、特徴付け、 及びN-末端のアミノ酸配列決定 この実施例は、モノクローナル抗体NLDC-145によって認識された抗原の精製及 び生化学的特徴づけを説明している（Krall らの論文、J.Exp.Med.、163:981 頁 (1986)）。我々は、このタンパク質を、樹状及び胸腺上皮の細胞(Dendritic and thymic Epithelial Cells)によって大量に発現されることから、DEC-205 と称 し、分子塊として観察した。このタンパク質は、直接生化学的研究ができる規模 で精製されている。この抗原は、弱アルカリ(pI7.5)の膜内在性糖タンパク質で あり、及び電気泳動による分子量が205kDaであり、当初報告された145kDa(Kraal らの前述の論文)ではないことが示されている。この質量の約7kDaには、糖質の 共有結合が寄与している。植物レクチンのパネルを用いて、これらのグリカンの 構造の予備情報を得た。その後、これらのグリカンに、様々なエキソグリコシダ ーゼ消化及び発蛍光団を用いた電気泳動(FACE)を行った（Jackson の論文、Bioc hem J.、270:705 頁（1990）；Jackson 及びWilliam の論文、Electrophoresis 、12:94頁(1991)；Jacksonの論文、Biochem.Soc.Trans、21:121頁(1993)；Jacks onの論文、Anal.Biochem．、216:243頁(1994)）。８種の異なるが関連のある二 分岐のN-結合型グリカン構造が解析された。これらの変異体は、それらの末端は 異なるが、２個のフコシル化されたトリマンノシルキトビオース核構造を基本と していた（二等分しているGlcNAcがあり及びなし）。O-結合型グリカンは、検出 されなかった。このタンパク質のアミノ末端は、ブロックされず、かつその最初 の25個のアミノ酸配列は、いずれの公知のタンパク質とも、明らかに相同ではな く、かつ類似していなかった。２種の新規ポリクローナル抗体が記載され、第一 の抗体はN-末端ペプチド配列に対し、第二は完全な精製されたタンパク質に対し て生じる。イムノブロットでは、これらのポリクローナルは両方とも、205kDaの バンドを認め、これは、NLDC-145による抽出物の前透明化(preclear)によって、 特異的に激減することができる。材料及び方法 NLDC-145 の精製及びイムノアフィニティー樹脂の調製 -NLDC-145(ラットIgG2a)腹 水を、正常な、６〜８週齢の非SPF,CD2(BALB/c×DBA/2 F1)雌マウス（トルド(Tr udeau)インスチチュート社）において、説明された方法で（North 及びIzzoの論 文、J.Exp.Med.、177:1723頁(1993)）調製した。このモノクローナルは、固定さ れたプロテインA 及びプロテインG（ピアス社）上で、逐次クロマトグラフィー することにより精製した。このモノクローナル及び非特異的ラットIgG2a（ジメ ッド(Zymed)社）は両方共、還元的アミノ化によって樹脂に結合された（AminoLi nk、ピアス社）。免疫沈降 −骨髄樹状細胞(BMDC)を、Inaba らの明らかにした方法（J.Exp.Med.、176: 1693頁(1992)）で、増殖している骨髄前駆体から調製した。培養開始後８日 目に、BMDC 4.8×107を、メチオニン及びシステインを含まない培地10mlで、１ 時間培養した。(35S)メチオニン−システイン(ICN)1mCi を添加することによっ て、標識を開始し、かつ４時間培養した後、細胞を収集した。BMDCを、氷冷した 溶解バッファー（50mMトリス-HCl、pH6.8、１％ノニデット(Nonidet)P-40 （カ ルバイオケム(Calbiochem)社）、50mg/ml BSA（インテルゲン(Intergen)社）、 更に下記のプロテアーゼ阻害剤混合物：5mM EDTA、0.5mg/mlペファブロック(Pef abloc)SC（ベーリンガーマンハイム社）、100mg/ml PMSF、5mg/mlアプロチニン 、5mg/mlペプスタチンA 、及び10mg/ml ロイペプチン(後の４種はシグマ社))700 mlに再懸濁することによって溶解した。ライゼートを、ラットのIgG（ジャクソ ンイムノリサーチ社）20mg、FCS 10ml、及び充填された固定されたプロテインG1 0ml（ピアス社）で前透明化した。この上清を、プロテインG 100ml で、１時間 かけて２回目の前透明化をした。この前透明化されたライゼートを、100ml のア リコートに分けた。２個のアリコート中のタンパク質（6.９×106BMDC当量）を 、充填し、洗浄したイムノアフィニティー樹脂50ml（NLDC-145又はラットIgG2a のいずれか）に吸着し、１時間循環(rotating)した。記載されたように、洗浄を 行った(Firestone 及びWinguth の論文、Methods Enzymol.、182:688 頁(1990) ）。タンパク質は、10％アクリルアミドミニゲルを用いるSDS-PAGEで分析した。 イムノブロット法−SDS-PAGEを、厚さ1.5mm の８％アクリルアミドミニゲルに おいて行った。ニトロセルロース（BA-85、シュレイヒャー・シュエル(Schleich er and Schuell)社）への転移を、４℃で、一晩かけて、定圧30V で行った。フ ィルターを、非脂肪乾燥ミルク(nonfat dry milk)を３重量／容量％及びツイー ン20を0.1 ％含有するPBS 中で、振盪しながら、室温で１時間ブロックした。一 次抗体（精製IgG 0.1〜10μg/ml、1:1000に希釈した腹水又は血清、又は1:1に希 釈したハイブリドーマ上清）と共にインキュベートを、熱シールバッグ中で、室 温で１時間行った。フィルターを洗浄し、その後ペルオキシダーゼ-F(ab')2ロバ の抗ラット又は抗ウサギIgG 複合体（ジャクソン社）を用い、免疫染色により可 視化し、引き続き化学発光（アメルシャム(Amersham)社）で強化した。 胸腺からのDEC-205 の精製−この方法を、図２にまとめた。１調製につき50匹 の異系交配したCD-1スイスマウス（タコニック(Taconic)社）から、胸腺を摘出 した。胸腺を、PMSF 200mg/ml 及び5mM EDTAを含有する氷冷したPBS 50ml中に入 れ、血液を除去し、かつ同じバッファーで１回洗浄した。洗浄した臓器は、-20 ℃で凍結することができる。その後の精製工程は全て、０〜４℃で行った。胸腺 を40mlのDounceホモジナイザー（キンブル／コンテス(Kimble/Kontes)社）に移 し、低張の溶解バッファー（10mMトリス-HCl、pH6.8、プロテアーゼ阻害剤混合 物を添加：5mM EDTA、100mg/ml PMSF、4mg/mlアプロチニン、0.5mg/mlペファブ ロックSC、4mg/mlペプスタチンA 、10μg/mlロイペプチン）30ml中で再懸濁した 。臓器は、ゆるい内箇（隙間0.2mm）の20ストロークでホモジナイズし、その後 きつい内筒（隙間0.1mm）の20ストロークでホモジナイズした。この懸濁液を、 氷中に20分間放置し、次にきつい内筒で20ストローク再度ホモジナイズした。核 及びデブリは、低速遠心分離（1200×g 、５分間、４℃）で、ペレット化した。 不透明な“後核(postnuclear)”上清を収集し、核のペレットを、低張の溶解バ ッファー15mlを５〜８回交換して、上清がほとんんど透明になるまで洗浄した。 各洗浄の上清は一緒にした。膜を収集するために、一緒にした後核上清を、100, 000×g で、１時間、４℃で遠心分離した（RC-28S遠心機、F28/36ローター、デ ュポン−ソルバル社）。膜ペレット中のタンパク質は、0.5 ％(8.3mM)NP-40を含 む低張溶解バッファー5ml 中で抽出した。この膜抽出物を、２回目の100,000 × g 、１時間の遠心分離で透明化した。 透明化された膜抽出物は、非特異的ラットIgG カラムを通して、前透明化した 。この前透明化カラムに吸着しなかった分画は一緒にし、その後NLDC-145アフィ ニティーカラムに加えた。洗浄は、２段階で行い：洗浄１は、6ml（吸着床容積 の3倍）（0.5M NaCl は含むが、NP-40 を含まず、0.5％(17mM)n-オクチルグルコ シド（ベーリンガーマンハイム社）と置換した、低張溶解バッファー）で；洗浄 ２（NaClを含まない洗浄１）は10mlで行った。このカラムは、床容積の５倍の50 mMグリシン-NaOH、pH11、0.5 ％n-オクチルグルコシドで、最大流速を10ml／cm2 ／時まで低下して溶出した。溶出分画(1ml)を、pH2 の2Mグリシン-HCl 20〜30m lを用いて、pH7 に調節した。ピークの溶出液を一緒にし、プラスチックに対す る非特異的損失を減少するために、0.1 ％SDS で予備被覆された限外ろ過Centri con-100 ユニット（アミコン社）を用いて、1ml 未満に濃縮した。典型的には、 50個の胸腺から、DEC-205 70〜150 μg を得ることができた。 等電点電気泳動−等電点電気泳動を、薄い(0.75mm)スラブゲル上で、変性条件 （8M尿素、４％全アンフォリン(pH3.5-10及び5-7の比2:1 、ファルマシア社)、0 .67％NP-40、10％グリセロールを含む、5.5 ％アクリルアミドゲル）下で行った 。試料は、定圧400Vで、最小6000V-時で一晩収束し、この時電流は1mA 未満であ った。列を、銀染色するか、もしくは0.5cm の断片に切出し、pH勾配測定のため に、脱気したdH2Oに溶出した。 グリカンの検出−DEC-205、トランスフェリン（陽性対照）及びクレアチナー ゼ（陰性対照）を、前述のようにニトロセルロース上にブロットした。複合糖質 を、vic-ジオールを緩和に非選択的過ヨウ素酸酸化し、アルデヒドとした後、ジ ゴキシゲニン(DIG)-標識のヒドラゾンに転化した。染色パターンは、アルカリホ スファターゼ−抗DIG-抗体複合体（First CHOice、ベーリンガーマンハイム社） で可視化した。 化学的脱グリコシル化−DEC-205(40μg)及びアポトランスフェリン（100 μg 、陽性対照）の２個の試料各100 μｌを、G-25 SF スピンクロマトグラフィーに よって、0.1 ％トリフルオロ酢酸、0.05％SDS に移し、その後凍結乾燥した。無 水トリフルオロメタンスルホン酸（Sojar らの論文、Methods Enzymol.、138:34 1頁(1987)）（オックスフォードグライコシステム社）で切断を行った。ポリペ プチドを、切断生成物から分離し、かつ過剰な試薬をTCA で沈殿し、その後８％ アクリルアミドミニゲルで、未処理の対照を、隣接して電気泳動した。 酵素的脱グリコシル化−フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム(Flavobact erium meningosepticum)由来のペプチド-N- グリコシダーゼ（PNGaseF、ベーリ ンガーマンハイム社）を用いて、アスパラギンが結合したグリカンを切断した（ Terentino らの論文、Biochem.、24:4665 頁(1985)）。DEC-205 のアリコート（ 最終的ゲル１列につき10μg）を、0.1 ％SDS 存在下で５分間煮沸し変成した。 氷上で冷却した後、微遠心管(microfuge)中で短くスピンし、液体を集め、５×P NGaseバッファー（250mM リン酸ナトリウム、pH7.0、50mM EDTA、2.5 ％ NP-40 、５ ％2-メルカプトエタノール）の1/5 量を添加し、その後PNGaseF １ユニッ ト(5μl)を添加した。反応を、一晩37℃でインキュベートし、その後4 ×非還元 SDS-PAGE試料バッファーの1/4量を添加し、かつ５分間煮沸することによって停 止した。 レクチンブロット法−いくつかのジゴキシゲニンで標識した植物レクチン（ベ ーリンガーマンハイム社）を用いて、DEC-205 並びに適当な陽性及び陰性対照の 糖タンパク質を、エレクトロブロティングし染色した。染色に使用したレクチン 、その特異性及び濃度は、表１に示した。 エキソグリコシダーゼ消化及びFACE分析−N-結合型オリゴ糖を、PNGaseF によ ってDEC-205 から取り出し、かつ発蛍光団ANTS（8-アミノナフタレン-1,3,6- ト リスルホン酸）で標識した（前掲のJackson の論文(1990)；Jackson 及びWillia msの論文(1993)；Jackson の論文(1993)；Jackson の論文(1994)）。組換えエキ ソグリコシダーゼは、グライコ社から得た。電気的蛍光光度は、SE1000FACEワー クステーション（グライコ社）上で可視化した。 アミノ酸配列決定−DEC-205 を、Duracryl（ミリポア社）を用いて調製した厚 さ1.5mm の４％ミニゲルの複数の列で電気泳動した。ゲルをポリジフッ化ビニリ デン（PVDF、バイオラド社）上にブロットした。転移した後、フィルターを１％ 酢酸に１分間浸漬し、0.1 ％Ponceau S で２分間染色し、次にdH2Oで素早く脱色 した。205kDaのバンドを切出し、かつ分析にまわした。このN-末端配列は、BLAS TPプログラム（Altschulらの論文、J.Med.Biol．、215:403頁(1990)）を用いて 、BLAST インターネットサービス（NCBI、国立医学図書館、NIH）の現時点の全 てのデーターベースと照合した。 完全なDEC-205 に対するポリクローナル抗体−２羽のニュージーランドホワイ トウサギ（ハゼルトン(Hazelton)社）に、クーマシー染色した厚さ1.5mm の４％ Duracryl SDS-PAGE ゲルから切り取った205kDaバンドを、６回注射した。用量は 、動物１羽の、一回の注射につき、染色したタンパク質40〜70μg の範囲（４〜 ６個の切片）であり、これを３週間毎に注射し、試験用血液（血清約15ml）を注 射後２週目に採取した。第一回目の注射について、切片は、フロイント完全アジ ュバント(CFA)中で乳化し、かつ背中の複数箇所に皮下注射した。フロイント不 完全アジュバント(IFA)を、追加免疫用アジュバントとした。応答を、血清の傾 斜用量で、粗胸腺膜抽出物をウェスタンブロットし、追跡した。これらの動物は 、前述のイムノアフィニティーカラムからの分画されていない溶出液、すなわち ゲル切片ではなく溶解性タンパク質で、更に追加免疫した。１回の注射につき平 均 50μg の４回の追加免疫を、両方のウサギに行った。IgG 分画を、プロテインA クロマトグラフィーで調製した。 N- 末端ペプチドに対するポリクローナル抗体−ハプテンと組合わせた方法は、 第19残基の単独のシステインに焦点を当てている（図6A）。ペプチドN1(SESSGND PFTIVHENTGKC)（配列番号２）は、マレイミド化学（Imject、ピアス社）を用い て、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)及びオボアルブミン(OVA)に結合し た。平均約250 個のペプチドが各KLH 分子に複合し、OVA 1分子につき６個のペ プチドが複合した。このKLH-ペプチド複合体を、各々400 〜500 μg のアリコー トに分割し、かつ２羽のニュージーランドホワイトウサギに８回注射し（200〜2 50μg ／注射）、再び初回免疫用にCFA に、及び追加免疫用にIFA に乳化した。 この血清から抗-KLH活性を除去するために、これらをKLH-システインカラム上で 前透明化した。抗ペプチド抗体を、このペプチドが無関係の担体に結合し、ペプ チド-OVAカラム上で単離した。結果 145kDa ではなく205kDa抗原のNLDC-145免疫沈降及びウェスタンブロット法−NL DC-145抗原の分子量を決定するために、DCを、in vitroで増殖した骨髄前駆細胞 から調製した（前掲のInaba らの論文）。この方法は、高純度の豊富なNLDC-145 (+)DC をもたらした。培養８日目に、このDCを代謝反応により、［35S］メチオ ニン−システインで標識した。抽出液を、固定したNLDH-145又は対照の非特異的 ラットIgG2a のいずれかを用いて免疫沈降した。SDS-PAGEで還元した後（図1A） 、これらの沈殿物のオートラジオグラフィーを行い、NLDC-145は、見かけの質量 が200kDa（ミオシンマーカー）よりもわずかに大きい１本の特異的バンドと結合 したが、当初報告されていた145kDa（前掲のKraal らの論文）とは結合しなかっ たことを明らかにした。おそらくG-アクチンと考えられる45kDa の目立つバンド を含む多数の非特異的バンドも、両方の列で可視化された（Fosmanの論文、生化 学及び分子生物学ハンドブック、第１巻タンパク質、CRC プレス、クリーブラン ド、オハイオ）。 この測定結果を証明するために、NLDC-145を、ウェスタンブロット法のプロー ブとして用いた。８週齢のBALB/cマウスから摘出した５個の胸腺を、免疫沈降で 用いたものと同じ溶解バッファー2ml 中でホモジナイズした。透明化した胸腺抽 出物の傾斜用量を、非還元及び還元条件下で電気泳動し、かつニトロセルロース にブロットした。NLDC-145は、205kDaの予備染色したミオシンマーカーと共に移 動する１本の主バンドに結合し（図1B）、免疫沈降による推定値（前述）が証明 された。非還元条件下（図1B左側のフィルター）では、わずか7×10-4の胸腺当 量が、このモノクローナルNLDC-145 IgGの用量で、明らかに可視化された。しか し、この粗抽出物中のジスルフィドがメルカプトエタノールで還元された後（右 側）は、このmAb は、例えライゼートの最大用量であっても染色することができ なかった。我々は、NLDC-145で認識された抗原は、質量205kDaであり、かつこの mAb で検出された抗原決定基は、分子内ジスルフィド結合を要求すると結論した 。 DEC-205 の精製−胸腺皮質の上皮細胞は、抗原を大量に発現し（前掲のKraal らの論文）、胸腺髄質のやや多い程度のDCよりも豊富である。従って、胸腺から 該タンパク質を単離する方法が、開発されている（図２）。簡単に述べると、胸 腺を、６種の高濃度のプロテアーゼ阻害剤“カクテル”の存在する、低張溶解条 件下で、ホモジナイズする。膜を単離し、かつNP-40 で抽出する。透明化後、こ の抽出物をラットIgG カラムで前透明化し、その後NLDC-145カラムでクロマトグ ラフする。 精製され、濃縮されたDEC-205 のSDS-PAGE分析（図3A）は、クマーシー染色に よって、目立つ205kDaバンド及びごく微量の混入バンドを明らかにした。銀染色 は、非常に多くの低分子量の混入物を明らかにし、アミノ酸配列決定の前に、分 取的電気泳動によって更に精製することが必要であることを示した。 精製工程において次の工程の収率を上げるために、重要な分画を同じ容積（後 核上清の容積）に希釈し、及びイムノブロットした（図3B）。この分画は、定容 であるので、該フィルター上の染色強度は、分離各相のDEC-205 の相対濃度を反 映するはずである。概して、最初の低張溶解の工程において、該タンパク質の30 ％は、明らかに核ペレット（１列）に失われていた。最初の超遠心分離の間に、 更に10％程（３列）が、膜ペレット（４列）を含む沈殿に失われた。一定の小さ い分画−おそらく累積5〜10％−が、初期及び後期の非吸着分画（６及び７列） として、NLDC-145カラムを通過した。その結果、最終溶出物（８列）の累積的収 率は約50％であった。 この溶出液が、意図的に、定容濃度で５倍過剰に負荷される場合は（10列）、 少なくとも６個のより小さい副バンドの“はしご”が、明確かつ一貫して認めら れた。これらのバンドは全て、NDLC-145抗原決定基を含むはずである。これらは 、かなりの強度の80kDa 成分まで、きちんとした形（すなわち連続した“塗沫” 状でない）で並んでいた。初期分画（特に２、３、４及び８列）を注意深く調べ ることによって、これらの副バンドが、単離の初期段階から存在することが明ら かになった。おそらく、これらのバンドは、完全な205kDaタンパク質のタンパク 質分解によって産生されたものであろう。 等電点7.5 の内在性膜タンパク質であるDEC-205 −DEC-205 タンパク質が、等 電点7.5 の内在性膜タンパク質であるかどうかを決定するために、胸腺膜ペレッ ト（図２で調製）を、下記液に再懸濁した：(1)0.5 ％NP-40 を含有する低張溶 解バッファー（通常）；(2)界面活性剤の代わりに1M KClを含有する同じバッフ ァー；(3)通常の増殖に使用される全部で６種のプロテアーゼ阻害剤を含有する 、100mM Na2CO3、pH11.5である。１時間穏やかに攪拌した後、懸濁液を透明化し （100,000 ×g 、60分、４℃）、かつ上清を収集した。次に、高塩及び高pHでの 抽出で得られた沈殿を、0.5 ％NP-40 を含有する低張溶解バッファーに再懸濁し 、かつ前述の抽出及び透明化工程を繰り返した。この方法で生成された５種の抽 出物のウェスタンブロット（図4A）の結果は、DEC-205 は、高いイオン強度(２ 列)又は極端なpH（３列）の条件下では、膜ペレットからは放出されないことを 明らかにした。その可溶化のためには、界面活性剤が必要であった(１、４及び ５列)。従ってDEC-205 は、内在性膜タンパク質である（Fujikiらの論文、J.Cel l Biol.、93:97頁(1982)）。 等電点電気泳動を、変性条件下で、スラブゲルで、銀染色して行った。比較的 均一の等電点が、pH7.5 に認められた（図4B）。このpHでは、鋭い収束中心バン ドが、pH7.4 からpH7.6 にかけて広がるかすかに染色した狭い“フリンジ”によ って、はっきりと縁取られていた。 不均一のN-結合型グリカンを生じる糖タンパク質であるDEC-205 −DEC-205 が グリコシル化されたかどうかを決定するために、精製した205kDaタンパク質を、 トランスフェリン（公知の糖タンパク質）及びクレアチナーゼ（糖タンパク質で ないことが公知）試料も流したゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース上に電気 的にブロットした。フィルターを、メタ- 過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、室温 で酸化し、非選択的に糖質中の隣接するジオールをアルデヒドに転化した。ジゴ キシゲニン(DIG)-標識のヒドラジドを、このフィルターに適用し、このアルデヒ ドをDIG-ヒドラゾンに転化した。このフィルターをブロックし、次に共有結合し たDIG を、抗ジゴキシゲニン抗体−アルカリホスファターゼ複合体で染色し、検 出した。この染色パターン（図5A）は、DEC-205（２列）が、トランスフェリン （１列）類似の糖タンパク質であることを明らかにした。 見かけの分子量にグリカンがどの程度関わっているかを調べるために、この精 製したタンパク質を、化学的に脱グリコシル化した。無水トリフルオロメタンス ルホン酸(TFMSA)は、タンパク質の一次構造は攻撃しないが、アスパラギンに結 合した及びセリン／スレオニンに結合した両方のグリカンを、そのアミノ酸側鎖 の結合した部位で加水分解する（前掲のSojar らの論文；Dabichらの論文、Bioc hem.Biophys.Acta、1164:47頁（1993））。TFMSA 処理（図5A）した、アポトラ ンスフェリン（２列）及びDEC-205（４列）の両方を、未処理の試料（１及び３ 列）と比較すると、電気泳動移動度が増大したことが示された。この処理試料の 泳動距離の線型回帰分析から、予想されたように、脱グリコシル化されたアポト ランスフェリンが、見かけの分子量を5kDa失う（MacGillverayらの論文、J.Biol .Chem.、258:3543頁(1983)）一方で、DEC-205 はおおまかに7kDa失ったことが明 らかになった。この7kDaのシフトは、この205kDaタンパク質のN-結合型グリカン の２〜３個の複合型の除去と一致した。より小さいO-結合型グリカンも、いくつ か除去された。 このタンパク質上に存在する糖質残基型の決定を始めるために、ブロットされ た精製物質を、ジゴキシゲニン標識の植物レクチンのパネルでプローブした。ア スパラギン結合型グリカンを、ペプチドN-グリコシダーゼF(PNGaseF)で処理する ことによって、DEC-205 のアリコートから除去した。処理及び未処理のタンパク 質を、糖タンパク質の陽性及び陰性対照と共に、ニトロセルロースにブロットし た。PonceauS（示さず）でフィルターを染色し、転移を確認した後、膜をブロッ クし、かつ表１の濃度のDIG-レクチンを用いて、染色した。 レクチン染色パターン（表１）は、N-結合型グリカンは、このタンパク質が、 レクチンSNA 及びMAA と結合しないことから、それぞれ最も一般的な２種のガラ クトース結合であるα2-6 及びα2-3 のいずれかに結合したN-アセチルノイラミ ン酸を有さないことを示した。PNA が結合しなかったので、O-結合型グリカンの 二糖の核は、未置換体では存在しない。このタンパク質のノイラミニダーゼによ る前処理は、PNA により染色しやすくすることはなく（図示せず）、そのため存 在するあらゆるO-グリカンの存在が、シアル酸で覆われなかった。N-結合型グリ カンのPNFGaseFによる選択的除去が、このタンパク質の見かけの質量を7kDa減少 する（図示せず）ために、存在するとしても、これらの数は少なく、非選択的化 学的脱グリコシル化のみが生じる。未消化のDEC-205 は、DSA によって濃く染色 され、かつこの染色はPNGaseF 消化によって除かれる。従って、N-グリカンの１ 種以上が、Gal β1-4GlcNAc を末端とする。未消化のタンパク質はAAA によって 濃く染まるので、GlcNAcにα1-6 で結合した末端フコースも、このN-グリカンの 少なくとも１種に存在する。レクチンGNA は、DSA(+)及びAAA(+)バンドよりもわ ずかに大きく移動するバンドを薄く染色する。おそらくこの200kDaバンドは、高 マンノース型N-結合型グリカンを含み、これは、未だゴルジ複合体におけるオリ ゴ糖処理反応を受けていない、新規合成された分子の亜群を表している。 DEC-205 のN-結合型グリカンの構造を、更に発蛍光団を用いた糖質電気泳動(F ACE)により定義した。PNGaseF は、DEC-205 から８種の異なるN-結合型グリカン 構造を放出し、電気泳動移動度は、5.1 〜10.1グルコースユニットであった（図 5C）。このグリカンの収率は非常に低いので、これらの８種のバンドの各々の切 出し及び配列決定はできず、そのためこの混合物を、エキソグリコシダーゼで分 析した（図5D）。α- ガラクトシダーゼによる消化（２列）は、パターンを簡略 化し、一部のグリカンが、Gal α1-(1又は2)Gal を末端とすることを示している 。NANaseIII（３列、α2-3 、α2-6 及びα2-8 結合したN-アセチルノイラミン 酸に特異的）の追加も更にパターンを簡略化し（シアル酸の喪失はバンドの移動 度を低下した。）、これはこれらのグリカンの一部が、シアル酸を末端とするこ とを示した。NANaseI（α2-3 結合に選択的）もNANaseII（α2-3 及びα2-6 結 合の両方に選択的）も、バンドパターンを変更しなかった（図示せず）。これは 、レクチンSNA 及びMAA による染色の欠如（前述）と一致し、特定のDEC-205グ リカン上に存在する末端シアル酸が、α2-8 結合であることを示した。更にβ- ガラクトシダーゼ処理（４列）は、２種のガラクトースの喪失をもたらし（DSA 染色に一致する二分岐構造）、かつ二重線に対する該パターンの複雑性が低下し た。この酵素混合物へのβ-N- アセチルヘキソサミニダーゼの添加（５列）にお いては、この二重線の小さいバンドは、2GalNAc を放出し、フコシル化されたト リマンノシルキトビオース核に特有のバンドを生じた。しかし、上側のバンドは 消化に耐え、この分岐間のトリマンノシル核に結合した“二等分”GlcNAcか、も しくはおそらくフコースの分枝が存在することを示唆した。二等分GlcNacが、該 酵素濃度が２倍の場合（６列）、上側のバンドが少なくとも部分的に消化される （蛍光強度が２倍以上低下）という事実によって明らかになった。更にα- マン ノシダーゼによる消化（７列）は、不完全であり、ほとんどの場合単一のマンノ ース（主バンド）を放出したが、フコシル化されたマンノシルキトビオース核構 造（９列"F C"）と一緒に移動するバンドが放出されることを示している。α- マンノシダーゼの量を２倍とし、かつGlcNAcへα1-2,-3,-4 及び-6で結合したフ コースに特異的なα- フコシダーゼを添加することによって（列８）、実質的に 完全に消化され、フコシル化されていないマンノシルキトビオース核と共に移動 するバンド（９列"C"）を放出した。 レクチン染色及びFACE分析を組み合わせることによって、DEC-205 は、二等分 GlcNAcが有るもの又は無いものという、２種のフコシル化された核構造を伴う、 二分岐のN-結合型グリカンを含むことが明らかになった（図5E）。更に不均質性 が、これらの構造の外端に導入され、これは全８種の変異において、α-結合ガ ラクトース、β1-4 結合ガラクトース、又はα2-8 結合シアル酸のいずれかを末 端とする。 N- 末端アミノ酸配列、及びN-末端ペプチドの及び完全なDEC-205 に対するポリ クローナル抗体 −精製されたDEC-205 を、アミノ酸末端配列決定に送り、かつ最 初の25残基を、明確に同定した（図6A）。この配列を、全ての入手可能なタンパ ク質配列のデーターベースと比較したところ、顕著な相同性は認められなかった 。我々が精製した205kDaタンパク質が、NLDC-145によって認識される抗原である ことを証明するために、19残基のN-末端ペプチド（図6A、最初の19アミノ酸）を 合成し、精製し、キーホールリンペットヘモシアニンと結合し、かつ１対のウサ ギに注射した。高度免疫血清から得たペプチド反応性抗体を、無関係の担体オボ アルブミンに該ペプチドを結合することによって調製したアフィニティー樹脂上 で精製した。これに平行して、精製したDEC-205 を、第二のウサギ対に注射し、 高度免疫IgG を、プロテインA クロマトグラフィーにより精製した。イムノブロ ット法において、両方のポリクローナル抗体は、NLDC-145同様、粗抽出物中の20 5kDaバンドを染色した（図6A“抽出物”列）。両方のポリクローナル抗体のブロ ットされた205kDaタンパク質に対する親和性は、モノクローナル抗体よりもおよ そ100 倍高かった。ここでいずれかのポリクローナル抗体0.1 μg/mlは、NLDC-1 45 IgG 10 μg/mlで得られるものと同等の染色強度を示した。両方のポリクロ ーナル抗体は、mAb で認められるものと同様に、副バンドの“はしご”に結合し た。205kDaバンドの染色は、該抽出物が、固定されたNLDC-145で前透明化された 場合（図6B“枯渇”）に、特異的に除去されるが、前透明化用樹脂から溶出され たタンパク質上に保持され （図6B“溶出”）、このことは、正確なタンパク質 が精製されかつ配列決定されたことを証明している。考察 イムノアフィニティークロマトグラフィーを基本とした精製法を用いて、mAbN LDC-145と結合した抗原を単離したが、この抗原は、マウスの樹状細胞及び胸腺 上皮によって高レベルに発現されることが報告されている（前掲のKraal らの論 文）。タンパク質源として、多数のDCの精製という手のかかる作業を試みるので はなく、マウスの全胸腺を溶解した。この単離されたタンパク質は、純度が約95 ％であり、かつN-末端のアミノ酸配列決定及び基本的な生化学試験に十分な数百 μg の範囲の収量を得た。タンパク質の同等量を得るには、ほぼ109〜1010個のD Cが必要であろう。 このタンパク質の電気泳動による分子量は、一貫して205kDaであった。Kraal らの当初の報告（前掲）では、NLDC-145を使用して、表面がヨウ素化された低密 度リンパ節細胞由来の界面活性剤抽出物を免疫沈降した。単一のセリンプロテア ーゼ阻害剤1mM PMSFのみが、この溶解バッファー中に存在した。１種の顕著な標 識されたタンパク質が、還元及び非還元の両方の電気泳動条件下で、見かけの分 子量145kDaと結合し、著者はこのクローンの名称に数字“145”をつけた。Pure らがこの免疫沈降の再現を試みた時には（J.Exp.Med.、172:1459頁(1990)）、複 数のセリンプロテアーゼ阻害剤（1mM PMSF、１μg/mlアプロチニン及び0.1 ％DI FP）を含有する溶解バッファーを用いて、この(35S)メチオニン標識の培養され た上皮DC（ランゲルハンス細胞）の界面活性剤抽出物を調製した。彼らは、還元 条件下で、200kDa以上の見かけの分子量を持つタンパク質を分析した。 本実施例においては、セリンプロテアーゼのみではなく、スルヒドリル、アス パラギン酸及び金属プロテアーゼにも対する阻害剤の高用量存在下での、骨髄樹 状細胞由来の抗原の免疫沈降が、見かけの分子量が200kDa以上のタンパク質を生 じ、これはPureらの論文と一致した。mAb を用いて、非還元条件下でウェスタン ブロット染色し、この方法で独自に分子量205kDaを算出した。NLDC-145のイムノ アフィニティーカラムから溶出したタンパク質は、分子量205kDaであり、このタ ンパク質のアミノ末端は、現在のデーターベースのあらゆる他のタンパク質と顕 著な相同性又は類似性がないことが明らかになった。この205kDaの精製タンパク 質がNLDC-145で検出された抗原であることを証明するために、N-末端ペプチド及 び完全な精製タンパク質に対するポリクローナル抗体を調製した。両方のポリク ローナル抗体は、イムノブロットの205kDaバンドを染色した。この染色は、NLDC -145によって前処理された抽出物で取り除くことができ、このことは正確なタン パク質が精製されかつ配列決定されたことを示した。従って、ここで精製された 205kDaのタンパク質は、NLDC-145モノクローナル抗体によって認識された信頼で きる抗原である。我々は、最小の抗タンパク質分解性の保護範囲である、Kraal らの論文（前掲）で使用された溶解条件は、このタンパク質の限定的分解を可能 にすると考える。 我々は、このタンパク質に関して、その樹状細胞及び胸腺上皮細胞による高レ ベルの発現を示し、及び電気泳動による分子量の先の推定値を補った名称“DEC- 205”を提唱した。DEC-205 は、内在性膜糖タンパク質であり、電気泳動の全分 子量の約7kDaを含む、2-3 箇所二分岐した複合型N-結合型グリカンを生じる。こ れらのグリカンは、２種の異なる核構造で形成され、かつ更にその末端が異なり 、８種の変異体を生じ、その一部はシアル酸を含有する。しかしながら、等電点 電気泳動において、DEC-205 の等電点は、わずかにアルカリ性(pH7.5)であり、 このタンパク質には比較的塩基残基が多いことを示している。このpIは、かなり 均一であり：主pIの周囲を、タンパク質の薄く染まった狭い“フリンジ”が囲む が、これはわずかにpH7.4 から7.6 であり、このことは荷電の不均一性が限定さ れたことを反映している。このタンパク質の大きい全分子量及び結合した糖質の 相対的小ささを考慮すると、検出されたシアル化されたグリカン変異体は、過剰 にDEC-205 のpIを混乱することはない。 DEC-205 は、タンパク質分解に非常に敏感である。その増幅時には、広範なプ ロテアーゼを阻害しないよう、及び低張溶解後のサイトゾル分画を除去するよう に注意しないと、収量は非常に低くなる。このタンパク質分解は、明らかに無作 為でない経路で進行することは明らかである。我々のバッファー中には、高濃度 の６種のプロテアーゼ阻害剤が常に存在するにもかかわらず、抗原を高レベルで ブロットした場合は、我々は常に、約80kDa までの範囲で、かつNLDC-145抗原決 定基を含む、6-8 個の分離した低分子量の副バンドの“はしご”を認めた。この タンパク質分解性の断片の整然とした配列は、粗胸腺膜抽出物（図４で最も良く 認められるが、図1B及び3Bにも存在する）から、精製され限外ろ過されたイムノ アフィニティー溶出液（図3B）に至る各調製物のブロットでも認められる。主等 電点の周りに染まっている“フリンジ”は、おそらくこれらの比較的大きいタン パク質分解性の断片によって少なくとも一部は産生されたであろう。 大きさが大きく、無作為でなく分布し、及び比較的プロテアーゼ抵抗性である 副バンドの“はしご”は、我々に、DEC-205 の完全な一次構造は、よりプロテア ーゼ感受性の接続セグメントによって連結した複数のプロテアーゼ抵抗性ドメイ ンを伴う、モジュール構造を示すことを示唆している。 実施例２：10種のC-型レクチンドメインを有し抗原処理に関与している、樹状細 胞及び胸腺上皮細胞によって発現されたレセプター、DEC-205 この実施例は、DEC-205 が、マクロファージマンノースレセプター(MMR)と相 同である、10個のC-型レクチンドメインを伴うレセプター、及び糖質に結合し、 かつエンドサイトーシスに介在する他の関連したレセプターであることについて 報告した。DEC-205 の分画を、モノクローナル及びポリクローナルの抗DEC-205 抗体で調べた。樹状細胞のDEC-205 が、被覆小胞を介して迅速に内在化され、抗 原処理に不可欠なMHC クラスII含有小胞のようである、多胞エンドソーム区画に 送られることが決定された。更にウサギの抗DEC-205 抗体は、樹状細胞によって 効果的に処理され、かつウサギのIgG に特異的T 細胞クローンに提示される。こ れらの実験は、DEC-205 が、樹状細胞及び胸腺上皮細胞によって、その処理区画 に細胞外空間から捕獲された抗原の提示することに使用することができる、新規 のエンドサイトーシスレセプターであることを示唆している。材料及び方法 樹状細胞の精製−図11に示したように、骨髄細胞の７日培養物から得た樹状細 胞を、ポリクローナル性ウサギ抗DEC-205-F(ab)'２断片及び10nm金標識のヤギの 抗ウサギIgG で処理し、電子顕微鏡用に調製した。各時点について、10グリッド を試験し、金で標識された全細胞を写真撮影し、金粒子を数え、かつ標準の形態 学的判定基準を基に詳細を知らされていない観察者がスコア化した。括弧の数は 、各区画についてスコア化された全金粒子の百分率を表している。 ノーザンブロッティング法−ノーザンブロットのために、mRNA 2μg を、0.8 ％アガロースホルムアルデヒドゲルで電気泳動した。試料をナイロン膜に転移し 、かつDEC-205 cDNAの3688-5200 位のヌクレオチドに及ぶアンチセンスRNA プロ ーブと結合した。その後このブロットを取出し、かつ負荷対照(loading control )としてグリセラルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナーゼプローブを用い、再 度ハイブリダイゼーションした。 電子顕微鏡−マウスの骨髄の７日培養物から採取した樹状細胞を、ポリクロー ナル抗DEC-205 のポリクローナル抗DEC-205-Fab'２断片；又はビオチン化したモ ノクローナルNLDC-145のいずれか10μg/mlと共に、氷上で、30分間インキュベー トした。過剰な一次抗体を、RPMI-1640、10％FCS、0.02％NaN3で、３回細胞を洗 浄し除去した。その後これらの細胞は、それぞれ、10nm金標識のヤギの抗ウサギ IgG の1:5 希釈物；又は10nm金標識のストレプタビジン1:5 希釈物のいずれかと 共に、氷上で30分間インキュベートした。過剰な二次試薬を、前述の洗浄で除去 した。その後樹状細胞は、０時に2.5 ％グルタルアルデヒドで固定するか、もし くは固定前に一定時間37℃でインキュベートし、かつ電子顕微鏡用に調製した。 抗原提示−105 匹のBALB/cマウスの骨髄の７日培養物から得た樹状細胞を、10 5 2R.50 ウサギIgG に特異的なT ハイブリドーマ細胞と共に、48時間、トリプリ ケートで培養した（Boomらの論文、J,Exp.Med.、167:1350-64 頁(1988)）。上清 を、HT-2指示細胞株を用いて、IL-2濃度を測定した。2R.50 細胞によるIL-2の産 生を、該培養物中の抗体濃度に対して、対数目盛りでプロットした。エラーバー は、平均からの標準偏差を示す。結果及び考察 本実施例は、実施例１で説明された205kDa細胞表面タンパク質の分子特性を報 告している。該タンパク質の配列を基にしたオリゴヌクレオチドプローブを用い て、14種のcDNAクローンを、３種の個別の胸腺及び樹状細胞のcDNAライブラリー から得た。これらのcDNAクローンは全て、同じmRNAに由来した。DEC-205 cDNAの 推定の5'末端を含むクローンは、DEC-205 抗原のN-末端ペプチドをコードし、か つこれに、シグナル配列と一致する疎水性リーダー配列が先行していた。このタ ンパク質は、10個のC-型レクチンドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン を含んでいた（図７）。 この複合cDNAは、あいまいでないDEC-205 ペプチド配列29個を全て含む、予想 分子量195kDaの1,722a.aタンパク質をコードしている、単一の5.2kDaのオープン リーディングフレームを有していた（図８）。マウス及びヒトの両方のDEC の細 胞質ドメイン配列の高度の同一性及び類似性が特に注目される（図９）。このcD NAに相当する7.5Kb mRNAが、樹状細胞、胸腺及びリンパ節において高レベルに発 現され、これに相当するパターンが、NLDC-145モノクローナル抗体による組織染 色によって得られた（前掲のKraal らの論文）（図10）。 DEC-205 の配列を、データーベースの公知のペプチドと比較して、マクロファ ージマンノースレセプター(MMR)（Taylorらの論文、J.Biol.Chem.、265:12156-6 2頁(1990)；Ezekowitz らの論文、J.Exp.Med.、172:1785-94頁(1990)）、及びウ サギの骨格筋のホスホリパーゼA2(PLA2)レセプター（Lambeau らの論文、J.Biol .Chem.、269:1575-8頁(1994)）、ウシ膵臓のそれ（Ishizakiらの論文、J.Biol． Chem．、269:5897-904頁(1994)）と相同であると決定した（図８）。グループVI C型動物レクチンとして定義される（Drickamer 及びTaylorの論文、Annu.Rev． Cell Biol．、9:237-64頁(1993)）、このファミリーの公知の一員は全て、レセ プターのエンドサイトーシスを仲介する、短い細胞質ドメインを有するI 型膜貫 通タンパク質である（Ezekowitz らの論文、J.Exp.Med.、172:1785-94 頁(1990) ；Ishizakiらの論文、J.Biol.Chem.、269:5897-904頁(1994)；Taylorらの論文、 J.Biol.Chem.、267:1719-26頁(1992)）。MMRタンパク質ファミリーの細胞の外側 部分は、明らかにシステインが豊富なN-末端ドメインを有し、それにフィブロネ クチンII型の反復、及び８個のCa++依存の糖鎖認識ドメイン（C-型CRD）が続い た（Taylorらの論文、J.Biol.Chem.、265:12156-62頁(1990)；Lambeau らの論文 、J.Biol.Chem.、269:1575-8頁(1994)；Ishizakiらの論文、J.Biol．Chem.、269 : 5897-904頁(1994)）。DEC-205 は、通常の８個のC-型CRD の代わりに10個を 有するこのパターンのみから分岐している（図７）。グループVIレクチンのシス テインが豊富な領域及びフィブロネクチン反復の機能は、確定されていない。対 照的に、このC-型CRD が、糖鎖結合ドメインであること（(Drickamer及びTaylor の論文、Annu.Rev.Cell Biol．、9:237-64頁(1993)）で再検討）、並びにMMR 及 びウサギのPLA2レセプターの両方が糖鎖と結合するということ（Lambeau らの論 文、J.Biol.Chem.、269:1575-8頁(1994)；Drickamer 及びTaylorの論文、Annu.R ev.Cell Biol.、9:237-64頁(1993)）詳細な実験的証拠がある。ラット血清のマ ンノースータンパク質及びE-セレクチン(selection)のC-型CRD と定義された、 糖鎖接触残基（Drickamer の論文、Nature、360:183-86頁(1992)；Weisらの論文 、Science、254:1608-15 頁(1991)；Weisらの論文、Nature、360:127-34頁(1992 )；Gravesらの論文、Nature、367:532-8頁(1994)）は、DEC-205 においては保存 されない。しかし、糖鎖結合に“必須”と最初に定義された配列の性質も、糖鎖 リガンドと強く結合するNKR1及びウサギPLA2レセプターのCRD には存在しない（ Lambeau らの論文、J.Biol.Chem.、269:1575-8頁(1994)；Bezouskaらの論文、Na ture、372:150-57頁(1994)）ので、C-型CRD による糖鎖結合のために追加の機能 が存在するはずである。CRD は、100 種以上の他のタンパク質においても発見さ れているが（Drickamer 及びTaylorの論文、Annu.Rev.Cell Biol．、9:237-64頁 (1993)）、DEC-205 中のCRD は、ウシ及びウサギのPLA2レセプター、及びMMRに おいて発見されたものと最も密に関連している（bPLA2 レセプターと34.6％、及 びhMMRと36.7％の同一性）。実際、DEC-205 のCRDI-5及び7-8 、並びに他のグル ープVI動物レクチンのCRDI-5及び7-8 の間には、順序のある対応があり、DEC-20 5 のCRD6が、最も密に他のファミリーの一員のCRD1に類似している。通常でない DEC-205 のCRD、９及び10は、他のグループVIレクチンのCRD7及び8 に最も密に 関連し、かつ遺伝子複製時に生じることができる。MMR 中の少なくとも２種のCR D が、マンノースに結合し（Taylorらの論文、J.Biol.Chem.、267:1719-26 頁(1 992)）、及びいくつかのCRD グループ化が、糖鎖リガンドに対するMMR の親和性 を増加することが公知である（Taylor及びDrickamer の論文、J.Biol.Chem.、26 8: 399-404 頁(1993)）。これと同じ機序が、DEC-205 によって、このレセプター による糖質結合の親和性及び多様性の両方を増すために利用される。 このレセプター機能は、モノクローナル及びポリクローナルの抗DEC-205 抗体 の組合わせを用いて調べた。DEC-205 のサイトゾルドメインは、保存された芳香 族アミノ酸を含有し（図９、配列番号１及び６）、これがエンドサイトーシスの 動機の一部として関連しているという知見（Ezekowitz らの論文、J.Exp.Med.、172: 1785-94頁(1990)；Ishizakiらの論文、J.Biol.Chem.、269:5897-904頁(1994 )；Chenらの論文、J.Biol.Chem.、265:3116-3123頁(1990)；Collawn らの論文、 Cell、63:1061-72頁(1990)）は、このレセプターが、樹状細胞及び胸腺上皮細胞 によって、様々な細胞外糖タンパク質抗原の、細胞内抗原処理区画への送達に使 用され得ることを示唆してる。この理論を検証するために、樹状細胞のDEC-205 に結合した、免疫金標識したモノクローナル及びポリクローナル抗DEC-205 抗体 の変化(fate)を、経時的実験において電子顕微鏡で調べた（図11）。２種の個別 の実験において、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体の完全な又はF( ab)'2断片を用いて、同様の結果が得られた。０時には、原形質膜上に、細胞に 連結した金粒子の95％が認められた。この試料を37℃でわずかに１分間暖めた後 には、この粒子の38％が、被覆小胞(vesicle又はpit)に認められた。20分間架橋 した後には、金粒子の79％は、樹状細胞に特徴的で（Steinmann らの論文、J.Ex p.Med.、149:1-16頁(1979)；Kleijmeer らの論文、J.Invest.Dermatol.、103:51 6-523 頁(1994)）、かつ抗原処理に関連していると考えられるMHC クラスII含有 小胞に類似した（Amigorena らの論文、Nature、369:113-120 頁(1994)；Qiu ら の論文、J.Cell biol.、125:595-609 頁(1994)；Westらの論文、Nature、369:14 7-151 頁(1994)；Tulpらの論文、Nature、369:120-26頁(1994)；Schmid及びJack son の論文、Nature、369:103-4 頁(1994)）、多胞区画中に存在した（図11及び 表２）。従って、DEC-205 は、被覆小胞により迅速に内在化され、かつ内在化さ れたレセプターに結合した抗体は、多胞エンドソーム区画に送達される。 DEC-205 が抗原を活性抗原処理区画に送達することができるかどうかを決定す るために、樹状細胞をウサギの抗DEC-205 抗体で処理し、かつウサギIgG-ペプチ ド/MHC複合体のT 細胞クローンへの提示をアッセイした（Boomらの論文、J.Exp. Med.、167:1350-64 頁(1988)）。陰性対照は、非特異的ウサギ抗体、及びB 細胞 系によって効果的に提示されたIgG2a に対するウサギ抗体を含んだ（Boomらの論 文、J.Exp.Med.、167:1350-64 頁(1988)）。樹状細胞は、T 細胞クローンに対す るウサギ抗DEC-205 抗体を、非特異的ウサギ抗体又はウサギ抗IgG2a 抗体よりも 、2桁多く提示したことがわかった（図12）。従ってDEC-205 は、架橋したレセ プターが効果的に内在化され、かつ結合したリガンドが抗原処理の活性がある細 胞内区画に送達されている、B細胞の膜型免疫グロブリンに類似している(Chestn ut及びGrayの論文、J.Immunol.、126:1075-79 頁(1981)；Rockらの論文、J.Exp. Med.、160:1102-25頁(1985)；Lanzavecchiaの論文、Nature、314:538-39頁(1985 ))。 結論として、樹状細胞及び胸腺上皮細胞は、新規レセプターDEC-205 を発現し ていて、これは抗原提示に貢献している。前述の複数のレクチンドメイン構造は 、このレセプターを、樹状細胞及び胸腺上皮細胞によって、抗原を生じる多様な 糖質の捕獲及びエンドサイトーシス、並びにそれらへの抗原処理区画の指示に使 用することができることを示唆している。 実施例３：マウス白血球の樹状細胞及び他のサブセット上でのDEC-205 の発現 様々なグループによるこれまでの研究は、mAb NLDC-145が、樹状細胞(DC)及び 胸腺皮質の上皮細胞と主に反応することを明らかにしている。実施例１に示した ように、このmAb は、独自のアミノ末端配列を有する、205kDaの内在性膜糖タン パク質であるDEC-205 を認識し、かつ精製されたDEC-205 に対するウサギポリク ローナル抗体は、元来のmAb よりも、ブロットされた抗原に対しより高い親和性 があった。この実施例では、ポリクローナル及びNLDC-145抗体の両方を、白血球 上のDEC-205 の発現及び機能を再評価するために使用した。細胞蛍光光度法は、 上皮（ランゲルハンス細胞）及び増殖している骨髄前駆細胞に由来するDCが、高 レベル（2-3 対数倍）のDEC-205 を発現する一方で、新鮮な単離された脾のDCは 、２種のサブセットを有し、その殆ど（80％）は染色が低レベル（≦1 対数倍） で、残りは中程度（1.5 対数倍）であることを明らかにした。DEC-205 抗原決定 基は、トリプシンに対し感受性が有るが、培養では再生されない。常在性及び炎 症性腹腔マクロファージは、チオグリコレート誘発細胞上での少量を除いて、こ の抗原を発現しなかった。脾、リンパ節、骨髄、血液及び腹水のB 細胞のDEC-20 5 発現レベルは、BMDC上のそれよりも10〜50倍低かった。骨髄のプロ−及びプレ −B 細胞は、DEC-205 を発現しなかった。ポリクローナル抗DEC-205 は、親のT 細胞がF1マウスに注入された場合は、in vitroでのDCによる一次混合リンパ球反 応の刺激も、in vivo での局所的移植片対宿主反応も、阻害しなかった。従って 、DEC-205 は、白血球上で、これまで予想されていたよりもより広範に発現する 。 Kraal らの論文（J.Exp.Med.、163:981 頁(1986)）に記載されたモノクローナ ル抗体は、in vitro又は誕生時からNLDC-145 IgGを長期投与したマウスのいずれ においても、試験したいずれのDC機能もブロックできなかった（Breel らの論文 、Immunol.、63:331頁(1988)）。NLDC-145によって認識された抗原の独自の組織 分布のため、及びわずかの限定されたmAb が同定された細胞型（樹状細胞）での その豊富な発現のために、DEC-205 の細胞特異性及び潜在的機能を再試験した。 新規のポリクローナル抗体（実施例１に記載）を用い、DEC-205 の検出を向上し 、かつDC機能の混乱を試みた。材料及び方法 マウス−トルドインスチチュート社（サラナックレーク、NY）の(C57BL/6×DB A/2)及び(BALB/C XDBA/2)F1マウス、並びに日本SLC 社（浜松、静岡、日本）の( C57BL/6×BALB/C)F1 及びBALB/Cマウスを含む、成熟した（６〜10週齢）両性 のマウスについて試験した。 細胞の懸濁−動物から摘出した直後、又は５％FCS、50μM 2-メルカプトエタ ノール及び20μg/mlゲンタマイシンを添加したRPMI-1640 培地で培養した後に、 細胞を試験した。脾、胸腺及びリンパ節を、ピンセットで細く裂くか、もしくは コラゲナーゼで更に消化し（Swiggardらの論文、免疫学の最新プロトコール、Co ligan らの編集、グリーン出版協会及びワイルインターサイエンス：NY、増補 3 版、3.7.1-11頁：Crowlyらの論文、Cell Immunol．、118:108頁(1989)）、同様 の結果を得た。骨髄細胞は注射筒で大腿骨及び脛骨から吸引し、血液は心臓穿刺 によりヘパリン中に採取した。全ての細胞懸濁液を、0.83％塩化アンモニウム溶 液中で溶解し、赤血球を枯渇した。樹状細胞を、３種の源から得、各々：マウス の耳の表皮シート（Schuler 及びSteinmanの論文、J.Exp.Med.、161:526 頁(198 5)）、脾の低密度プラスチィック付着群（前掲のSaveggard らの論文；前掲のCr owley らの論文）、及びrGM-CSF で増加された増殖骨髄前駆細胞（Inaba らの論 文、J.Exp.Med.、176:1693頁(1992)）であった。腹腔細胞は、常在群又は各種炎 症刺激によって誘発されたものであり：３日前にプロテオースペプトン、４日前 にチオグリコレートブロス、２日前に50μg コンカナバリンA 、又は７日前に107 生存微生物ミコバクテリウムボビスBCG を投与した。培養１〜３日後にも、い くつかの群を試験した。リンパ節懸濁液のB 細胞は、B 細胞のマイトジェンであ るリポ多糖（10μg/ml LPS、E.coli 0111:B4由来、ディフコ社、デトロイト、MI ）、抗IgM ＋IL-4（10μg/mlヤギF(ab')2抗マウスIgM（ジャクソンイムノリサー チ社、ウェストグローブ、PA）、更にDr.T.Sudo（東レ工業基礎研究所、鎌倉、 日本）の好意により得た組換えマウスIL-4 50U/ml）、並びにCD40リガンド(CD40 L ：CD40L（Dr.H.Yagita（順天堂医科大学、日本）の好意により得た）でトラン スフェクションされたL 細胞で、１％パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで３ 回洗浄し、B細胞と1:1で共培養した。)で、刺激した。皮膚の樹状細胞は、全表 皮懸濁液として培養し、その後濃ウシ血清アルブミンで浮上(flotation)し濃縮 し（前掲のSchuler 及びSteinmanの論文）、脾の樹状細胞は、前述のように（Wi tner-Pack らの論文、J.Exp.Med、166:1484頁(1987)）、rGM-CSF(200U/ml)補充 が有又は無の、又は角化細胞馴化培地で、低密度脾付着性細胞から培養した。 ２色標識法を用いて、白血球の特定のサブセット（PE標識抗体）及びDEC-205 （NLDC-145ラットmAb、又はウサギのポリクローナル抗DEC-205 の後、FITC標識 抗Ig）を同時に同定した。非反応性対照抗体は、非免疫性ラットIgG2a（ジメッ ド社、サウスサンフランシスコ、CA）及びウサギIgG（ジャクソンイムノリサー チ社：完全なIgG 又はF(ab')2は我々が調製）であった。染色の順番は：(a)一次 抗DEC-205 又は非免疫性；(b)二次抗Ig（マウスの抗ラットIgG 又はヤギの抗ウ サギF(ab')2とのFITC複合体、両方ともジャクソンイムノリサーチ社より入手）( c)消光のために、ラット又はウサギのIgG 10μg/ml；及び(d)PE- 又はビオチン −標識抗体であった。最後の試薬は、ファールミンゲン社（ラ・ホラ、CA）から 購入し：ビオチン複合体は、クラスIIMHC（クローンAMS-32.1)、B220/CD45RB（ クローンRA3-6B2）、及びThy-1.2/CD90（クローン53-2.1）抗原と定め；又はPE 複合体は、Mac-1/CD11b（クローンM1/70）、及びGr-1顆粒球(クローンRB6-8C5) 抗原と定めた。１試料につき少なくとも10,000個の細胞を、FACScan 蛍光細胞分 析装置（ベクトンディキンソンイムノサイトメトリーシステム社、マウンテンビ ュー、CA）で試験した。 イムノブロッティング−これは、前述のように、モノクローナル及びポリクロ ーナル試薬で行った（前述の実施例１）。 免疫細胞化学−サイトスピン(cytospine)を、純粋なアセトンを用いて、室温 で、10分間固定し、風乾し、かつ蛍光細胞分析法と全く同じように抗体で染色し た。FITC複合体の代わりにペルオキシダーゼ複合体を使用した以外は、同じ二次 試薬を使用した。染色は、ジアミノベンジジンで可視化した（Stable DAB、リサ ーチジェネティック社、ハンスビルAL）。 機能試験−モノクローナル（10及び１μg/ml）及びポリクローナル（30及び10 μg/ml）抗体を、飽和に近い又は飽和以上の用量で連続して、二方向同種混合リ ンパ球反応(MLR)に用い、ここでは3 ×105ナイロンウールを通過したリンパ節の T 細胞を、同種のX 線照射した又はマイトマイシン処理したDCの段階的用量で刺 激した（Inaba 及びSteinmanの論文、J.Exp.Med.、160:1717頁(1984)；Inaba ら の論文、J,Exp.Med、166:182頁(1987)）。同系MLR を、ほぼ同時に実施した。ML R 阻害のための陽性対照には、B7共同刺激系を妨害する試薬（B7-2に対するGL -1ラットmAb）を利用した（Hathcockらの論文、Science、262:905 頁(1993)）。 In vivo 実験では、我々は局所的移植片対宿主(GVH)反応を行い（Atkin 及びFor dの論文、J.Exp.Med.、141:664 頁(1975)）、ここで後足蹠に注入された親のリ ンパ節細胞は、F1マウスの排液している膝窩節においてGVH を誘発し、おそらく リンパ節皮質にF1樹状細胞を出現した。対照（PBS 注射）のリンパ節及びGVH 節 の重量を、１群につきマウス５匹を用いて、７日目に測定した。このプロトコー ルでは、抗DEC-205 又は対照IgG の200 μgを、０時点に足蹠に注射し、Ig注射 を以後８時間毎に反復し、注射液には107の親リンパ節細胞又は対応する量のPBS のいずれかを加えた。結果 上皮樹状細胞によるDEC-205 の発現−DEC-205 に対する３種類の抗体（モノク ローナルNLDC-145、ポリクローナル抗DEC-205 IgG、及びポリクローナル抗DEC-2 05 F(ab')2断片）を、培養した上皮細胞に作用させた。これまでのデータは、NL DC-145によるランゲルハンス細胞の濃い染色を示していた。このNLDC-145の抗原 決定基はトリプシン感受性（下記）であり、かつトリプシンを最初に使用して、 ランゲルハンス細胞が放出された表皮シートを調製したので、我々は、一晩培養 した上皮細胞を濃縮し、細胞表面に該タンパク質が多くなるようにした。この培 養期間は、ほとんどの角化細胞がプラスチック表面に付着し、かつ非付着性のラ ンゲルハンス細胞が低い浮上密度を獲得する時間も提供した（前掲のCrowley ら の論文；前掲のSchuler 及びSteinmanの論文）。結果として、20〜50％樹状細胞 の調製物を、上皮細胞の非付着性、一晩培養試験により、特に密BSA カラム上で の浮上後に得ることができた。 上皮細胞は、クラスII MHCタンパク質に対するフィコエリトリン(PE)標識した mAb で染色し、角化細胞からランゲルハンス細胞を区別し、かつ他の白血球系に 対するNLDC-145及びmAb 類のハイブリドーマ上清で対比染色した（図13A-D）。 樹状細胞に対するNLDC-145の特異性（図13A）は、マクロファージ（SER-4抗シア ロアドヘシン(Coocker及びGordonの論文、J.Exp.Med.、169:1333頁(1989))、B 細胞（RA3-6B2 抗B220（Hoffman 及びWeissmanの論文、Nature、289:681 頁(198 1)））、及びT 細胞（53-6.72抗CD8（Ledbetter 及びHerzenbergの論文、 Immunol.Rev.、47:63 頁(1979)））に対する、イソタイプが合致したIgG2a mAb は、NLDC-145(+)細胞とは反応性でないという事実を明らかにした（図13、パネ ルB-D）。同じ懸濁液を、精製したNLDC-145 IgG（ラットIgG2ak）、又は非反応 性対照としてポリクローナル非免疫性ラットIgG2a のいずれかの、段階的用量で 対比染色した場合、NLDC-145によるランゲルハンス細胞の染色は、２μg/mlでプ ラトーに達した(図13、パネルE-G,H の矢印のMHC-II(+)樹状細胞の染色を比較) 。 更に、このF(ab')2断片及び完全なIgG の両方の抗DEC-205 ウサギポリクロー ナルを用い、幅広い用量について（0.3 〜100 μg/ml）、非免疫性のF(ab')2及 びIgG と比較した。このウサギの試薬は、クラスII MHC-陰性角化細胞とは反応 しなかったが、この染色は免疫性及び非免疫性試薬に関して同等であったので、 この結合は完全に非特異的であった（図13、パネルI-L とM-P 、及びQ-T とU-X の比較）。しかしMHC-II(+)ランゲルハンス細胞の染色は、濃く、特異的であり 、かつ完全なIgG又はF(ab')2断片の抗DEC-205 抗体を、見かけの飽和30μg/mlで 用いた場合と同等であった（図13、F(ab')2に関してパネルI-L 及びIgG に関し てパネルQ-T）。 第二のウサギのポリクローナル抗体は、DEC-205 の最初の19残基に及ぶ合成ペ プチドで生じ、これはランゲルハンス細胞を染色せず、代わりに非免疫性IgG 様 のパターンを示した（図示せず）。 DEC-205 抗原決定基のトリプシン感受性を試験した。一部濃縮した培養したラ ンゲルハンス細胞を、トリプシン（0.25％、PBS 溶媒、氷上30分間）で処理又は 暴露のいずれかを行った。モノクローナル性及びポリクローナル性試薬の両方で 染色したところ、10倍低かった（図14のA 及びB をC 及びD と比較、蛍光強度の １対数）。引き続き一晩培養する間に、これらの抗原決定基を再度発現し、未処 理の細胞のレベルと同等にした（図14のE 及びF をA 及びB と比較）。 他の樹状細胞群によるDEC-205 の発現−脾のDCを、低浮上密度の脾細胞懸濁液 中(実施例１：及び前掲のSurggardの論文参照)で、それらのインテグリンCD11c の発現によって（図15A,C.E 及びG）、mAb N418で検出し（Metlayらの論文、J.E xp.Med、171:1753頁(1990)）同定した。NLDC-145又は抗DEC-205 ポリクローナル 抗体のいずれかによる対比染色は、新鮮な、単離又は一晩培養されたこれらの 細胞は、その表面にDEC-205 を、ランゲルハンス細胞よりも少なく発現したこと を明らかにした（図15C,D,G 及びH ）。新鮮で単離された脾DCは、前述のように 、２種の表現型サブタイプを含んだ（前掲のCrowley らの論文）。ほとんど（ほ ぼ80％）は、比較的低いが検出可能なレベル（≦１対数倍）の抗原を発現し、よ り小さい群が中程度に染まった（ca.1.5対数倍：矢印、図15C,D,G 及びH）。一 晩培養した後、全てのCD11c(+)DCs によるDEC-205 の発現が、中程度（1.5 対数 倍）レベル生じたが、決して上皮樹状細胞で観察されたレベル（ca.2対数倍：矢 印、図15K,L,O 及びP）ではなく、更にrGM-CFS 中での細胞培養によって、もし くはGM-CFSを含有する角化細胞の馴化培地において、DEC-205 の発現の強化(upr egulate)を試みたが、収量は、培養のみで誘発された量よりも増えなかった（図 示せず）。 対照的に、樹状細胞が、GM-CSFにより骨髄前駆細胞から生じた場合（前掲のIn aba らの論文(1972)）は、それらのDEC-205 の発現は、一貫して高く、ランゲル ハンス細胞のレベルと同等であった（図示せず）。興味深いことに、骨髄培養物 の６日目の活性のある増殖群は、DEC-205 を発現した細胞を比較的わずかに含ん だが（図16）、発現は８日目まで一貫して高かった。 常在性及び誘発性腹腔細胞による発現−常在性腹腔細胞（マクロファージ約30 ％及びB 細胞70％を含有）を、コンカナバリンA(ConA)、チオグリコレート(TGC) 又は生存微生物M.ボビス・カルメットゲラン杆菌(BCG)で誘発された滲出液中の 炎症性腹腔細胞と比較した（図17）。このデータは、ポリクローナルの非免疫性 及び免疫性F(ab')2断片について示した。NLDC-145モノクローナルについて同様 の染色を得た（図示せず）。しかし、非免疫性及び免疫性の完全なウサギIgG は 、腹腔マクロファージで強力なバックグラウンド染色を生じ、これはおそらくFc レセプターへの結合のためと思われる（図示せず）。常在性Mac-1(+)腹腔マクロ ファージは、表面DEC-205 を発現しなかったが、腹腔B 細胞は、測定可能なレベ ルで発現した（バックグラウンドよりもほぼ１対数倍以上：図17E-H の矢印）。 ConA及びBCG −誘発滲出液中のマクロファージも、抗DEC-205 により、ほとんど もしくは全く染色しなかったが（図17E-H、矢尻）、これらのマクロファージは 、全て強力なクラスII MHC- 陽性であった（図示せず）。このConA及びBCG 滲出 液 は、著しい数のT 細胞を含有したが、これらは、抗DEC-205 では染まらなかった （抗Thy-I 二重標識、図示せず）。試験した他の腹腔群とは対照的に、TGC-誘発 マクロファージは、DEC-205 を、低レベル（バックグラウンドの0.5〜1 対数倍 ）で発現した。常在性及び誘発性群の各々において、B 細胞は同等に染まった。 複数の組織の常在性白血球、特にB 細胞による、DEC-205 の発現−常在性腹腔 B 細胞はDEC-205 を発現するという驚くべき所見が得られたので、我々は、更に 脾、骨髄、末梢血、リンパ節及び胸腺由来の細胞懸濁液を、いくつかの白血球マ ーカーを用い、DEC-205 の共発現について試験することにより、該抗原の分布を 調べた。最初の３臓器の結果を、ここに示した（図18）。脾及びリンパ節に関す る結果は、同じであった（図示せず）。胸腺細胞のみ、バックグラウンドよりも 極わずかに（＜0.5 対数倍）強く染まった（図示せず）。 脾懸濁液においては、B 細胞（B220及びMHC-II(+)；Gr-I、Mac-1 及びThy-1(- )：図F-J、矢印）は、同じくDEC-205 を発現し、バックグラウンドのおよそ１対 数倍以上に染色した。T 細胞（Thy-1(+)）及び顆粒球（Gr-I(+)、Mac-1(+)）も 、同じく染まったが、B 細胞よりも薄かった。 骨髄において（図18K-T）、顆粒球は、バックグラウンドのほとんど１対数倍 以上に染まったのに対し、骨髄B 細胞は、DEC-205 の不均一レベルを示した。ほ とんどのB220(+)細胞は、骨髄において弱く染まったか、もしくは全く染まらな かったが、より高レベルのB220の細胞サブセット（図18P-T、矢印、B220二重標 識）は、末梢血のB 細胞と同レベルの、DEC-205 を共発現した。これらのB220br ight DEC-205(+)細胞も、表面IgM を発現し、これらは成熟B 細胞と同定された（ 図示せず）。おそらく単球と思われる、Mac-1(+)、B220(-)細胞の小さいサブセ ットは、DEC-205 を発現しなかった。 末梢血において（図18U-δ）、B 細胞（矢印）は、リンパ系組織のB 細胞と同 等に染色されたが、顆粒球及びT 細胞は、弱いが測定可能な染色を示した。 異なる細胞種で発現したDEC-205 の相対量に関する知見を得るために（図19） 、骨髄樹状細胞、脾細胞（約65％B 細胞）及び末梢血（約70％B 細胞及び30％マ クロファージ）の全細胞のNP-40 の溶解物を、段階的用量で、イッムノブロット した。BMDC 10,000 個のシグナルは、脾細胞100,000 個のシグナルよりも約２倍 強 力であり、これは、BMDC中の細胞１個当たりDEC-205 が、脾のB 細胞の少なくと も10倍であることに対応していた。腹腔細胞100,000 個のシグナルは更に弱く、 DC 10,000 個のシグナルよりも、５〜10倍弱く、これは腹腔B 細胞中のDEC-205 が、BMDCよりも約50倍少ないことに対応していた。 DEC-205 の表面レベルに対応するB 細胞活性化因子の作用を試験するために、 B細胞を、LPS、CD40リガンド、並びに抗IgM 及びIL-4の組合わせ存在下で、２日 間培養した。DEC-205 の表面レベルは、モノクローナル性及びポリクローナル性 試薬の両方で検出した場合に、顕著な増加は誘発しなかったが、最後の組合わせ は、中程度の（２倍）減少を誘発をした（図示せず）。 マウスのB 細胞の生存度は、培養で刺激する間に非常に増強され、このことは 我々にB 細胞上のDEC-205 抗原決定基が、細胞外起源からその表面に吸着された のではなく、この細胞によって活発に合成されたのではないかと疑問を抱かせた 。B 細胞について、ランゲルハンス細胞同様、トリプシン処理は、NLDC-145及び 抗DEC-205 による殆どの染色を除去したが、その抗原決定基は、一晩培養する間 に再度合成された。 樹状細胞の機能をDEC-205 に対する抗体でブロックする試み−一方向混合リン パ球反応を、10μg/ml NLDC-145 又は30μg/mlポリクローナル抗DEC-205 抗体の いずれかが常に存在する中で行うと、同種T 細胞の増殖の阻害は認められなかっ た（図20）。共同刺激タンパク質B7-2（前掲のHathcockらの論文；Freeman らの 論文、J.Exp.Med.、178:2185頁(1993)；Inaba らの論文、J.Exp.Med.、180:1849 頁(1994)）に対するラットIgG2a モノクローナルGL-1を、陽性ブロック対照とし て使用した。GL-1は、このシステムの増殖を阻害したが、これを終止することは なく、このことから：複数の共同刺激因子の遮断が、同種MLR の増殖を完全に除 去するには必要である（Young らの論文、Clin.Invest.、90:229頁(1992)）こと が予想された。 樹状細胞がDEC-205 を高レベルに発現する（前掲のKraal らの論文；前述の実 施例４）リンパ系組織のT-依存領域へのT 細胞のホーミングにおいて、DEC-205 が役割を果たすかどうかを確かめるために、局所的移植片対宿主(GVH)反応を試 験した（前掲のAtkins及びFordの論文）。親系統のリンパ節細胞を、後足蹠に注 射した場合に、F1マウスの排液されている膝窩リンパ節に、反応が生じる。T 細 胞は、排液している節に移行し、ここで、おそらく最初に樹状細胞上で、及び皮 質T 細胞領域内で、同種MHC タンパク質に遭遇する。非免疫性又は抗DEC-205 F( ab')2断片(200μg)の実質的用量を、０時に、足蹠に注射した。８時間後、２回 目の抗体用量を、10,000,000個のリンパ節細胞（ca.70 ％T 細胞）と共に注射し た。このT 細胞は、強力なGVH 反応を誘発し：排液しているリンパ節が、７日以 内に、通常の大きさの５〜６倍に膨張した。ポリクローナル抗DEC-205は、in vi voでは、この一次T 細胞反応を阻害することができなかった（表３）。 考察 これまでの研究では、樹状細胞以外ほとんどの種類の白血球でDEC-205 抗原の 検出に失敗していた（前掲のKraal らの論文；前掲のCrowley らの論文）。本実 施例では、低レベルではあるが、他の白血球、特にB 細胞が、DEC-205 を発現で きることが明らかになった。実施例４は、組織切片における、B 細胞によるDEC- 205 の低レベルの発現を報告している。DEC-205 のN-末端ペプチドに対するポリ クローナルウサギ抗体、及び実施例１で明らかにされた完全なタンパク質が、使 用された。この抗ペプチド試薬は、生存細胞を染色することができず、このこと は、天然の条件下では、DEC-205 のアミノ末端は、19残基の合成免疫原に関する そのコンホメーションを変化するか、もしくは抗原によるアクセスの立体障害と なる、より高次のタンパク質構造に関連していることを示唆している。抗ペプチ ドポリクローナルが細胞に結合できなかったことは、組織のDEC-205 のN-末端セ リンの共有結合修飾によっては、この残基は胸腺から単離されたタンパク質にお いてエドマン分解を受けやすいので、説明することができない。対照的に、完全 なDEC-205 に対するポリクローナルは、NLDC-145に非常に似通った反応性のパタ ーンを伴う細胞を染色した。 白血球の様々なクラス間でDEC-205 発現の差異が認められた。樹状細胞以外に 、B 細胞が最大のDEC-205 を発現したが、それらのレベルは、BMCDよりも10〜50 倍低かった（図19）。トリプシン処理後に、培養によってDEC-205 抗原決定基は 再生されるので、B 細胞表面で検出されたDEC-205 は、その細胞自身で活発に合 成されたものであり、細胞外起源からその表面に吸着されるとは考えられなかっ た。DEC-205 の発現は、骨髄において、プレ-B細胞から表面IgM(+)B 細胞へと発 生的に転移することと同等であることは明らかである。しかし、様々なマイトジ ェン（LPS、CD40リガンド、抗IgM ＋IL-4）による末梢B 細胞の刺激は、DEC-205 の表面発現の顕著な増加を伴わなかった。顆粒球は、DEC-205 を、血中よりも 骨髄の顆粒球においてより高いレベルで発現した。胸腺細胞並びに脾及びリンパ 節の成熟T 細胞は、非常に低いが検出可能なレベルのDEC-205 を発現する一方で 、血液及び腹水中のT 細胞は、検出可能なレベルを発現しなかった。この顆粒球 及びT 細胞上で検出されたDEC-205 は、おそらく骨髄間質、胸腺上皮、及び末梢 リンパ組織のT 細胞領域の樹状細胞のような、DEC-205 が豊富な周囲の間質細胞 から吸着されるであろう。前述のように（Wiffels らの論文、Immunobiol．、18 4: 83頁(1991)）、チオグリコレートで誘発された細胞は、弱い陽性であるにもか かわらず、ほとんどのマクロファージ群は、DEC-205 を有さない。 他の白血球系統もDEC-205 を発現するが、イムノブロッティング法で評価され るように、樹状細胞が、該抗体を10〜50倍多く発現することは明白である。DEC- 205 の発現は、樹状細胞上では、いくつかの方法で調節される。新鮮な単離され た脾DCは、比較的少ないDEC-205 を有し、かつそのレベルは、培養においてわず かに増加するのみである。高レベルのDEC-205 を発現する樹状細胞は、皮膚、末 梢リンパ器官のT 細胞領域の樹状細胞、及び高用量GM-CSF存在下で増殖している 骨髄前駆細胞から成長した樹状細胞である。 組織培養システムにおける免疫応答へのDEC-205 の寄与を調べるために、我々 は、一次同種MLR を阻害することを試みた。DEC-205 は、ヘルパーT 細胞と相互 作用する樹状細胞の能力において重要であると仮定された。しかしながら、モノ クローナルもポリクローナル抗体も、このT 細胞のモノクローナル又はポリクロ ーナル抗体のいずれかとの反応をブロックできなかった。更に我々は、in vivo 反応である、局所的GVH 反応を阻害することを試み、この場合、非リンパ組織に 注射された親のT 細胞は、この注射液を排液し、かつF1樹状細胞及びB 細胞に対 して同種反応性の反応を開始しているリンパ節に移行した。同様に、DEC-205 に 対する抗体は、作用を示さなかった。これらの陰性の結果については、抗体の除 去、又は新規DEC-205 タンパク質の代償的再合成というような一般的な説明をす ることができる。DEC-2055の分子量が大きいと仮定するならば、モノクローナル 及びポリクローナル抗体の両方は、その研究した反応においてその機能を妨害し ないような、天然のタンパク質上の抗原決定基と結合することが可能である。あ るいは、このアッセイシステムは、DEC-205 が重要な役割を果たさないようなシ ステムである。免疫応答におけるDEC-205 の推定機能は、ここで研究した事象よ りももっと早期の事象、例えばアクセサリー細胞による抗原獲得、又はリンパ球 発現における選択事象などに関連していることが明らかである。更にDEC-205 の 機能を調べることが、前述の実施例２に記載した抗原の分子クローニングによっ て可能である。 実施例４：リンパ系及び非リンパ系組織におけるDEC-205 タンパク質のin situ 発現 この実施例では、DEC-205 に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体を 用いて、様々な臓器の凍結切片の免疫組織化学的染色法、及び複数の臓器のイム ノブロッティング法により、DEC-205 の分布を再評価した。 DEC-205 の組織分布をより良く理解するために、我々は、モノクローナル及び ポリクローナル抗体の両方を、以前の試験で使用されたものよりも感受性が高い 二次的抗Ig試薬と共に用いて、様々な組織を組織学的に及びイムノブロットで試 験した（Kraal らの論文、J.Exp.Med.、163:981 頁(1986)；Crowley らの論文、 Cell Immunol．、118:108 頁(1989)；Vremecらの論文、J.Exp.Med.、176:47頁(1 992)；Austynらの論文、J.Immunology、152:2401頁(1994)；Luらの論文、J.Exp. Med.、179:1823頁(1994)；Breel らの論文、Immunology、63:657頁(1988)）。DE C-205 の豊富な発現が、胸腺及び腸の上皮において、並びに末梢リンパ器官のT 細胞領域の樹状細胞において、組織学的に確認された。更に、DEC-205 が、いく つかの別の領域：B 細胞ろ胞B リンパ球、骨髄間質、肺気道の上皮、及び脳の毛 細血管においても可視化された。イムノブロッティング法は、リンパ組織、並び に肺、骨髄及び腸から調製したライゼート中にDEC-205 タンパク質が実質的レベ ルで存在することを確認した。従ってDEC-205 は、樹状細胞によって高レベルに 発現された一方で、更に多くの他の細胞種によってもin situ で発現された。材料及び方法 マウス−３系統の成熟した（６〜12週齢）雌のマウスを試験した：近交系C57B L/6 ×DBA/2（トルドインスティチュート社、サラナックレイク、NY）、並びにB ALB/C及び異系交配したCD-1スイス−ウェブスター系（後者２系統は、タコニッ クファーム社、ジャーマンタウン、NY）である。 免疫組織学的方法−臓器摘出直後、これらを、-20 ℃で、O.C.T.組織包埋剤（ ミルス社、エルカート、IN）中で凍結し、かつ-20 ℃で保存した。通常厚さ10μ m の組織切片を、ミノトームクリオスタット(ダーモン社のIEC部門、ニーダムハ イト、MA)で切断し、かつ10個のウェルのあるスライド(カールソン(Carlson)サ イエンティフィック社、ペオトン、IL)に乗せた。これらの切片を、純粋なアセ トンで、室温で10分間固定し、かつ風乾した。次の工程は、加湿チャンバーで行 った。切片をPBS 滴(30〜50μl)中で再度水和し、次に一次抗体を塗布した。未 希釈、又はPBS ＋１％BSA 中に1:5 で希釈のいずれかの、ハイブリドーマ上清 を、その力価に応じて使用した。精製したIgG 類、腹水及び抗血清を、同じ溶媒 に希釈し、滴定によって決定された最適用量になるよう同じ溶媒で希釈し、これ は通常精製タンパク質については1〜10μg/ml、並びに腹水及び高度免疫血清に ついては1:3000〜1:1000であった。これらの一次抗体は、NLDC-145mAb であり、 ハイブリドーマ培養物上清又は精製IgG（プロテインG 溶出液）のいずれかとし て用い、もしくはウサギのポリクローナル抗DEC-205(前述の実施例１)を、完全 なIgG（プロテインA 溶出液）又はF(ab')2として用いた。陽性対照は、他の白血 球サブセット（RA3-6B2 抗-B220/CD45RB(TIB 146、ATCC、ロックビル、MD）、SE R-4 抗マクロファージ、及び53-6.72 抗CD-8（TIB 105、ATCC）及びMHC クラスI Iタンパク質（M5/114(TIB 120、ATCC)）に対するラットのmAb 類、それに加えB 細胞表面Igに連結したシグナル鎖の１種である、ウサギのIgβに対するポリクロ ーナルを含んだ（Sanchez らの論文、J.Exp.Med、178:1049頁(1993)）。陰性対 照は、ポリクローナルのラットのIgG2a（ジメッド社、サウスサンフランシスコ 、CA）及びウサギのIgG（ジャクソンイムノリサーチ社、ウェストグローブ、PA ）の、完全な又はF(ab')2断片のいずれかであった。一次抗体は、前述の切片に 、室温で45分間接触させ、その後これらの切片を、PBS で５回洗浄したが、これ らの切片を、数秒以上乾燥することはなかった。次に、抗Ig二次抗体を添加し、 これは通常ロバのF(ab')2−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ジャ クソンイムノリサーチ社）を、PBS ＋１％BSA 中に1:300 で希釈して添加した。 45分間インキュベーションした後、切片をPBSで５回洗浄した。色素基質は、H2O2 を含有するジアミノベンジジンの用時調製物であった（Stable DAB、リサーチ ジェネティック社、ハンツビル、AL）。切片をPBS で５回洗浄し、かつ通常は、 ギルのヘマトキシリン#1（フィッシャー社、フェアローン、NJ）で対比染色した 。Permaunt組織学的装着基質（フィッシャー社）を用いて、カバーグラスを乗せ た。 複数の臓器からのタンパク質の抽出及びイムノブロッティング−臓器は、10倍 量のフェノール及びグアニジウムイソチオシアネート（TRIzol、ギブコ-BRL社、 ゲーサスバーグ、MD）の１相溶液に入れた（Chomczynskiの論文、BioTechniques 、15:532頁(1993)）。臓器を、15〜30秒間ホモジナイズした(Polytron、ブリン クマン社、ウェストバリー、NY）。RNA 及びDNA を、CHCl3抽出で除去し、かつ エ タノールで沈殿した。タンパク質は、フェノール−エタノール上清から、イソプ ロパノール（当初のTRIzol容量の150 ％）で沈殿し、かつ１％SDS（当初のTRIzo l容量の30％、50℃、１時間）に再度溶解した。抽出物を透明化し（3000×ｇ、1 0分間、室温）、かつ全タンパク質濃度を測定した（BCA アッセイ、ピアス社、 ロックフォード、IL）。イムノブロッティングを、前述のように（前掲のChomcz ynski の論文）行い、１列につき標準化したタンパク質50μg を流した。フィル ターを、NLDC-145 IgG 10 μg/ml又は1:1 に希釈したmAb 1D4B(抗LAMP-1)ハイブ リドーマ上清のいずれかで染色した。結果 試験した各臓器について、精製されたDEC-205 タンパク質に対して生じた、NL DC-145モノクローナル抗体及びウサギのポリクローナル抗体に関して、同様の結 果が得られた。これは、いくつかのリンパ系及び非リンパ系組織において説明さ れるであろう。多くの例において、DEC-205 がその場で発現することが認められ 、このことは、これまでの研究では明らかにされていない。 胸腺：この臓器の染色パターンは、NLDC-145 mAbについて示された当初のもの （前掲のKraal らの論文）と同一であった。非常に強力なペルオキシダーゼ免疫 標識が、胸腺皮質上皮において認められた一方で、弱い染色が髄質の散在性の樹 状形で認められた（M、図21、パネルa-c 及びg）。 リンパ節：強力なDEC-205 発現が、その皮質のT 細胞領域全体で、樹状形で明 らかであった（T、図21、d-f）。高出力では、深皮質のT 細胞領域を染色する斑 点の特徴が認められた（図21h）。この斑点のあるパターンは、樹状細胞の細胞 内顆粒中のDEC-205、及び／又は多くの細かい突起の表面上のDEC-205 の存在を 示している。髄質が染色されていないことは明らかであった（M、図21d-f）。DE C-205 の弱い染色は、ろ胞のB 細胞上で明らかであった（B、図21d-f）。この染 色は、ヘマトキシリンを使用して核を対比染色した場合には不明瞭であった（図 21d-f）が、ヘマトキシリンを使用しない場合は、明瞭に可視化された（図21i） 。 脾臓：DEC-205の強力な染色が、 T細胞領域、すなわち動脈周囲の鞘において 認められた（図22：T 領域の中央動脈は、各顕微鏡写真において矢印で示した。 ）。 T 領域におけるDEC-205 の染色の程度は、抗MHC クラスIIで見られるものと同様 であったが（図21、b をc と、並びにd 及びe をf と比較）、このDEC-205 染色 は、リンパ節のT 細胞領域（前述）のように、実際に斑点が有った（図22d-e） 。リンパ節（前述）のように、B 細胞ろ胞（B、図22a-c）は、dec-205 が染色し たが、この染色はあまりにも弱かったので、ヘマトキシリンによる標本の対比染 色の顕微鏡の白黒写真では明らかではない（図22、強力なB 細胞染色を、パネル a の抗Igβ、並びにパネルc の抗MHC-IIを、パネルb の抗DEC-205 染色と比較） 。抗DEC-205 は、辺縁領域は染色しなかった（強力なB 細胞の染色に起因する、 パネルa 及びc で顕著な、辺縁静脈洞の矢尻を参照）。 脳：NLDC-145及びポリクローナル抗DEC-205 試薬の両方が、大脳及び小脳にお いて、毛細血管（矢印、図23a-c）及び小動脈（矢印、図23d）に沿って直線状の 染色を生じた。毛細血管の染色は、いずれの他の研究においても認められなかっ た。 肺：多くの強力な染色されたDEC-205 形状が、肺実質に散在した(図23e,g,h) 。我々は、これらの形状が、樹状細胞、マクロファージ又は両方を表しているか どうかは、まだ決定してはいない。おそらく肺胞マクロファージであろうと考え られる、気道内の一部の強力に染色された細胞が明らかであった（＊、図23h） 。DEC-205は、小気道全ての上皮に存在した（矢印、図23e,h）。対照的に、抗MH CクラスIIは、気道上皮は染めなかったが、気道周辺の細胞を染色した（図23f、 矢印）。 骨髄：骨髄が大腿から完全なプラグ(plug)として突出しかつ切断された場合は 、DEC-205 のレース状のパターンの染色が、このプラグ全体に明らかであり、こ れはおそらく骨髄の間質細胞であろう（矢印、図23i）。円形細胞の暗染色のほ とんどは、好酸球のバックグラウンド染色を示し、これは内因性ペルオキシダー ゼを発現している。あらゆる抗体が欠如していることは明らかである（図示せず ）。 上位消化管：舌の口腔上皮を、階層化された扁平上皮の例として提供した。い くつかの陽性の形のDEC-205 は、おそらくランゲルハンス細胞であり、上位基底 部に(suprabasally)認められた（矢印、図23j）。抗MHC クラスII抗体は、これ らの上皮内樹状細胞を、より頻繁に及び／又はより強力に染色し、更に多くの 真皮上側の多くの上皮下組織を染色した（図示せず）。 下位消化管：強力な染色が、小腸及び大腸の円柱上皮に認められた。この染色 は、上皮中央よりも柔突起の先端のほうが強力であった（図23k-l）。最良の切 片において、個々の上皮細胞の先端よりも、基底面に沿ってのほうが染色が強力 であった。柔突起の固有層の中の多くの細胞は、暗色に染まったが、この染色も 好酸球の内因性ペルオキシダーゼに起因するものである。 肝臓：DEC-205 の染色は、門脈の三管に稀に見られる以外は、明らかではなか った（図示せず）。 心臓：DEC205の染色は明らかではなかった（図示せず）。 腎臓：DEC-205の強力な発現は認められなかったが、若干の非常に弱いDEC-205 染色が、散在して皮質管上に認められた（図示せず）。 複数の臓器のイッムノブロッティングによるDEC-205 の分布：DEC-205 タンパ ク質の組織分布を試験するために、いくつかの異なる臓器のTRIzolタンパク質抽 出物（方法の項）を、モノクローナルNLDC-145 IgG（図24A）及びポリクローナ ル抗DEC-205 IgG（図示せず）の両方で、イムノブロットした。各列に流した臓 器ライゼートのタンパク質量は、タンパク質負荷量（50μg ／列）になるよう互 いに標準化した。リソソーム膜のマーカーLAMP-1（Chenらの論文、Arch.Biochem .Biophys.、239:574 頁(1985)）の染色は、同等数のリソソームが各列に出現し たことを明らかにした（図24B）。リンパ系組織間では、DEC-205 のシグナルは 、胸腺において最大であり、かつ骨髄及びリンパ節の方が脾よりも強力であった 。これらの所見は、前述の組織学的染色レベルに密接に関連していた。非リンパ 系組織において、胸腺と同等の強力なシグナルが、肺及び腸において明らかであ った（図24A）。肝、腎及び脳の抽出物は、極微量のDEC-205 を含有した。考察 抗原検出の感度を強化するように改良されたロバのF(ab')2二次抗ラットIg試 薬を用いて、我々は、NLDC-145モノクローナル抗体が、これまで明らかになって いるよりもより多くの組織と反応することを示した。特に、明確な染色が、脳の 毛細血管、骨髄間質、腸柔突起の上皮及び肺の気道において、並びに全ての末梢 リンパ組織のろ胞中にB 細胞が認められた。これらの新たに認識されたDEC-205 抗原の蓄積は、当初DEC-205 タンパク質を発現することが注目された組織、すな わち胸腺皮質上皮及び末梢リンパ器官のT 細胞領域の樹状細胞ほど、強力には染 まらなかった。 DEC-205 タンパク質の組織分布は、精製DEC-205 に対して生じたポリクローナ ル抗体によって証明された。ウサギの抗体のF(ab')2及び完全なIgG 形の両方が 、モノクローナルNLDC-145で得られたものと類似の染色パターンをもたらした。 更にこの組織分布を、モノクローナル性及びポリクローナル性試薬のイムノブロ ッティング法で追跡し、免疫組織学的染色の相対強度に対応する、複数の臓器に おける発現の相対濃度が、組織切片において認められた。例外は、DEC-205 タン パク質の微量が、DEC-205 陽性細胞の枯渇を識別することが困難な、肝、心臓及 び腎などの臓器の抽出物で明らかであることであった。このことは、非常に微量 のこのタンパク質が、多くの細胞種において存在するかもしれないが、そのレベ ルは組織学的に可視化するには非常に低いことを示唆している。 実施例：ヒトDEC-205 の配列決定 ヒトのdec cDNAを、マウスのdec cDNAの3'コード配列に由来した、300 塩基対 のプローブを用いて、クローン化した。このヒトのcDNAは、B 細胞性リンパ腫の ライブラリーから、高い厳密性のハイブリダイゼーション条件（0.1 SSC 65℃） を用いて得た。ヒトDEC-205 遺伝子の配列を決定し、配列番号７に示した。推定 アミノ酸配列を、配列番号８に示した。配列番号８の推定アミノ酸配列は、第17 43番目のアミノ酸以降の停止位置以後に、推定断片を含むが；これらは、関連性 がなく、無視することができる。 ヒトの推定アミノ酸配列及び核酸配列をそれらのマウスの同族体と比較し、そ れぞれ、図25A 及び25B に示した。この比較は、タンパク質類及び該遺伝子（cD NA類）のタンパク質コード領域の両方の全長に関して、配列の高度の類似性又は 同一性を示している。 本発明は、本願明細書中に記載された具体的な実施態様によって範囲が限定さ れるものではなく、これは、このような実施態様は、本発明のひとつの態様を説 明することを意図しているが、唯一のものではなく、かつ機能的に同等のあらゆ る実施態様が、本発明の範囲内であるためである。全ての分子量及びヌクレオチ ドに関するヌクレオチド塩基対の大きさは、概数であり、かつ説明を目的として 使用されることも理解されるであろう。実際には、本願明細書に記載されかつ説 明されたものに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の内容及び添付図面から、 当業者には明らかであろう。このような修飾は、添付されたクレームの範囲に収 まることが意図されている。 様々な参照文献を、本願明細書において引用し、それらの内容は、そのまま、 本願明細書に参照として組込まれている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ヌッセンツワイグ マイケル シー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク イースト シックスティ サード ストリート 450 アパートメン ト ３イー (72)発明者 スウィッガード ウィリアム ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク ヨーク アベニュー 1230 (72)発明者 イーアン ワンピン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク ヨーク アベニュー 1230 ザ ロックフェラー ユニヴァーシ ティ内 【要約の続き】 状細胞が静止している時に寛容性を与えることができ、 または樹状細胞が、例えば、サイトカインまたはリンホ カイン、例えば、コロニー刺激因子（CSF）による刺激 により活性化される時に免疫刺激（即ち、予防接種）を 与えることができる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．DEC のリガンドの同定法であって、ここにおいてDEC は、樹状細胞、胸腺上 皮細胞、肺上皮細胞、小腸上皮細胞及び脳毛細血管によって発現された、内在性 膜タンパク質であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量20 5kDaを有し、かつ10個のレクチンドメイン、１個の膜貫通ドメイン、及び被覆小 胞局在コンセンサス配列を有する１個の短い細胞質テールを有するものであり、 並びに下記の工程を含む方法： a)少なくとも１個のDEC レクチンドメインを含むタンパク質を、候補リガンド と接触する工程；及び b)前記候補リガンドの、該DEC レクチンドメインとの結合を検出する工程で； ここにおいて、該候補リガンド及び該DEC レクチンドメインの結合の検出が 、この候補リガンドが、DEC のリガンドであることを示す、方法。 ２．前記リガンドが、サッカライドである、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前述の少なくとも１個のDEC レクチンドメインを含むタンパク質が、内在性 膜タンパク質として細胞によって発現され、かつ前記候補リガンドが標識され、 その結果この候補リガンドの該DEC レクチンドメインとの結合が、該細胞と該標 識の連結を検出することによって検出される、請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前述の少なくとも１個のDEC レクチンドメインを含むタンパク質が、可溶化 され、かつ前記候補リガンドが、固相支持体と不可逆的に連結し、その結果この 候補リガンドの該DEC レクチンドメインとの結合が、該タンパク質の固相支持体 との結合を検出することによって検出される、請求の範囲第１項記載の方法。 ５．前述の少なくとも１個のDEC レクチンドメインを含むタンパク質が、固相支 持体と不可逆的に連結し、かつ前記候補リガンドが標識され、その結果この候補 リガンドのDEC レクチンドメインとの結合が、該固相支持体との標識との連結の 検出によって検出される、請求の範囲第１項記載の方法。 ６．少なくとも１個のDEC レクチンドメインを含む、前記タンパク質がトランス ケートＤＥＣタンパク質である請求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記少なくとも１個のDEC レクチンドメインを有するタンパク質が、完全長 ＤＥＣタンパク質である、請求の範囲第１項記載の方法。 ８．ヒトのDEC-205 が、樹状細胞によって発現された内在性膜タンパク質であり 、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量205kDaを有し、かつ10 個のレクチンドメイン、１個の膜貫通ドメイン、及び被覆小胞局在コンセンサス 配列を有する１個の短い細胞質テールを含み、カルボキシ末端配列、RHRLHLAGFS SVRYAQGVNEDEIMLPSFHD（配列番号１）を有し、完全長マウスDEC-205 に対するウ サギポリクローナル抗体とは結合するが、モノクローナル抗体NLDC-145とは反応 しないことを特徴とする、ヒトDEC-205 。 ９．配列番号８に示されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲第８項記載のヒト DEC-205 。 10．核酸が、少なくとも15個の塩基対で特徴付けられていることを特徴とする、 請求の範囲第８項記載のヒトDEC-205 の少なくとも一部をコードしている精製さ れた核酸。 11．レクチン結合ドメインをコードしている、請求の範囲第９項記載の核酸。 12．下記の群から選択される、請求の範囲第１０項記載の核酸： a)配列番号７に記された配列に相当する配列を有する核酸； b)核酸(a)の対立遺伝子変異体； c)アミノ酸1743までの、配列番号８に記されたアミノ酸配列を有するポリペプ チドをコードしている核酸；及び d)核酸(c)の対立遺伝子変異体。 13．前記DEC タンパク質が、樹状細胞によって発現された内在性膜タンパク質で あり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量205 kDa を有し、 かつ10個のレクチンドメイン、１個の膜貫通ドメイン、及び被覆小胞局在コンセ ンサス配列を有する１個の短い細胞質テールを含み、少なくとも15個の塩基対を 含む核酸である、DEC タンパク質の少なくとも一部をコードしている精製された 核酸。 14．ヒトのDEC タンパク質をコードしている、請求の範囲第13項記載の核酸。 15．マウスのDEC タンパク質をコードしている、請求の範囲第13項記載の核酸。 16．前記核酸が、発現制御配列に機能的に連結している、少なくとも１個のDEC レクチンドメインをコードしているDNA 分子である、請求の範囲第10〜15のいず れか１項記載の核酸を含む発現ベクター。 17．請求の範囲第16項記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。 18．チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカグリーンモンキーCOS 細胞、マ ディン・ダービーイヌの腎細胞、及びNIH-3T3 繊維芽細胞からなる群から選択さ れた哺乳類細胞である、請求の範囲第17項記載の組換え宿主細胞。 19．前記DNA 分子が、DEC タンパク質の全長をコードしている、請求の範囲第18 項記載の組換え宿主細胞。 20．前記DNA 分子が、ヒトDEC タンパク質をコードしている、請求の範囲第18項 記載の組換え宿主細胞。 21．ヒトDEC-205 が、樹状細胞によって発現された内在性膜タンパク質であり、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動による見かけの分子量205kDaを有し、かつ10個 のレクチンドメイン、１個の膜貫通ドメイン、及び被覆小胞局在コンセンサス配 列を有する１個の短い細胞質テールを有し、かつマウスの全長DEC-205 に対して 生じたウサギのポリクローナル抗体とは結合するが、モノクローナル抗体NLDC-1 45とは反応しないことを特徴とする、ヒトDEC-205 タンパク質と反応性の抗体。 22．ヒトDEC-205 が、下記の群から選択された特性によって特徴づけられる、請 求の範囲第21項記載の抗体： a)下記カルボキシ末端配列を有すること； RHRLHLAGFSSVRYAQGVNEDEIMLPSFHD（配列番号１）； b)アミノ酸1743までの、配列番号８に記されたアミノ酸配列を有すること；及 び c)配列番号７に記されたヌクレオチド配列を有するDNA 分子によってコードさ れていること。 23．モノクローナル抗体である、請求の範囲第21又は22項記載の抗体。 24．ポリクローナル抗体である、請求の範囲第21又は22項記載の抗体。 25．肺循環、腸循環、肺気道、小腸管、皮膚及びリンパ器官のT 細胞領域の樹状 細胞、胸腺、及び脳からなる群から選択された組織を標的とする分子で、DEC と結合する炭水化物及び抗DEC 抗体からなる群から選択されたDEC-リガンドに複 合した分子、並びに医薬として許容できる担体を含む、医薬組成物。 26．前記分子が、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗生物質、抗寄生虫薬、及び抗炎症 薬からなる群から選択される、請求の範囲第25項記載の医薬組成物。 27．肺循環、腸循環、肺気道、小腸管、皮膚及びリンパ器官のT 細胞領域の樹状 細胞、胸腺、及び脳からなる群から選択された組織を標的とする分子の製造にお いて、DEC-リガンドが、DEC と結合する炭水化物及び抗DEC 抗体からなる群から 選択される、DEC-リガンドの使用。 28．樹状細胞、胸腺上皮細胞、肺上皮細胞、小腸上皮細胞、及び脳の毛細血管細 胞からなる群から選択された細胞への、遺伝子の導入のための組換えベクターで 、DEC と結合する炭水化物及び抗DEC 抗体からなる群から選択されるDEC-リガン ドに結合したDNA ベクターを含む、組換えベクター。 29．前記DNA ベクターが、ウイルスベクター、リポソームベクター及び露出した DNA ベクターからなる群から選択される、請求の範囲第28項記載の組換えベクタ ー。 30．DEC と結合する炭水化物及び抗DEC 抗体からなる群から選択される、DEC-リ ガンドに結合した病原体に起因した抗原、並びに免疫刺激剤を含有するワクチン 。 31．前記病原体が、ウイルス、細菌、寄生虫、及び腫瘍からなる群から選択され る、請求の範囲第30項記載のワクチン。 32．前記免疫刺激剤が、サイトカイン、リンホカイン及びアジュバントからなる 群から選択される、請求の範囲第30項記載のワクチン。 33．前記組成物が、免疫賦活剤を含まない条件で、DEC と結合する炭水化物及び 抗DEC 抗体からなる群から選択されるDEC-リガンドに結合した、自己抗原又はア レルゲンを含む、免疫抑制を誘導する組成物。 34．前記自己抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、コラーゲン又はその断片、DN A、核タンパク質、核小体タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、及び膵のβ 細胞タンパク質からなる群から選択される、請求の範囲第33項記載の組成物。
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