JPH03173899A - 生体由来のタンパク質 - Google Patents
生体由来のタンパク質Info
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- JPH03173899A JPH03173899A JP63205690A JP20569088A JPH03173899A JP H03173899 A JPH03173899 A JP H03173899A JP 63205690 A JP63205690 A JP 63205690A JP 20569088 A JP20569088 A JP 20569088A JP H03173899 A JPH03173899 A JP H03173899A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、脳・神経系の細胞増殖、分化あるいは他の臓
器・組織の成長・発育等に必須であり、その促進ないし
調節に重要な役割を果たし、脳・神経系の異常に基く疾
患、各臓器・組織の成長・発育の不全あるいは異常増殖
および癌等の治療剤および予防剤、あるいはこれらの診
断用剤などへ適用し得るマウス胎児脳等より単離された
分子量約６８．０００、等電点５．４〜５．６であるタ
ンパク質（以後ＧＰ６８タンパク質と略称する）に関す
る。
器・組織の成長・発育等に必須であり、その促進ないし
調節に重要な役割を果たし、脳・神経系の異常に基く疾
患、各臓器・組織の成長・発育の不全あるいは異常増殖
および癌等の治療剤および予防剤、あるいはこれらの診
断用剤などへ適用し得るマウス胎児脳等より単離された
分子量約６８．０００、等電点５．４〜５．６であるタ
ンパク質（以後ＧＰ６８タンパク質と略称する）に関す
る。
また、本発明は該ＧＰ６８タンパク質の分離精製方法、
該ＧＰ６８タンパク質に対するポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体生産能を
有するハイブリドーマならびにこれら抗体の製造方法に
関する。
該ＧＰ６８タンパク質に対するポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体生産能を
有するハイブリドーマならびにこれら抗体の製造方法に
関する。
更に、該ＧＰ６８タンパク質またはこれら抗体を含有す
る上記各種疾患の治療剤、予防剤、あるいは診断用剤と
して有用な医薬組成物に関する。
る上記各種疾患の治療剤、予防剤、あるいは診断用剤と
して有用な医薬組成物に関する。
［従来の技術］
脳・神経系の組織・細胞中に存在するタンパク質等に関
する研究は、他の臓器や器官に存在するタンパク質等の
研究に比して遅れているものの、近年多くの知見が集積
されつつある。
する研究は、他の臓器や器官に存在するタンパク質等の
研究に比して遅れているものの、近年多くの知見が集積
されつつある。
例えば、脳・神経系の組織・細胞中に存在するタンパク
質等として、チューブリン、微小管結合タンパク質（ｍ
ｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ。
質等として、チューブリン、微小管結合タンパク質（ｍ
ｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ。
ＭＡＰｓ） 、ニューロフィラメントトリブレット、ダ
リア繊維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌ
ａｒｙａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ 、ＧＦＡタンパ
ク質）［日本生化学金環、続生化学実験講座６、細胞骨
格の構造と機能、上、第１章、第２章および、下、第９
章参照］などが知られている。
リア繊維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌ
ａｒｙａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ 、ＧＦＡタンパ
ク質）［日本生化学金環、続生化学実験講座６、細胞骨
格の構造と機能、上、第１章、第２章および、下、第９
章参照］などが知られている。
脳・神経系の細胞中に含まれる各種物質、特に脳・神経
系の細胞の分化において機能するタンパク質などの検索
と、その機能の分析は、例えば各ｆ１脳・神経系疾患の
新しい治療薬および予防薬、あるいはそれらの診断方法
の開発に有用なタンパク質等を見い出す上で、極めて有
効な手段である。
系の細胞の分化において機能するタンパク質などの検索
と、その機能の分析は、例えば各ｆ１脳・神経系疾患の
新しい治療薬および予防薬、あるいはそれらの診断方法
の開発に有用なタンパク質等を見い出す上で、極めて有
効な手段である。
それ故、脳・神経系の細胞中に含まれる各種物質の検索
およびその機能の分析に対する要請が高まっている。
およびその機能の分析に対する要請が高まっている。
このような観点から種々の検討がなされているなかで、
脳・神経系の細胞由来のタンパク質として、マウス胎児
脳に時期特異的に出現するタンパク質の存在が本発明者
らによって既に明らかにされている［特開昭６０−１０
０５９７号公報、Ｎｏｇｕｃｈｉ。
脳・神経系の細胞由来のタンパク質として、マウス胎児
脳に時期特異的に出現するタンパク質の存在が本発明者
らによって既に明らかにされている［特開昭６０−１０
０５９７号公報、Ｎｏｇｕｃｈｉ。
Ｓ、、 ｅｔ ａｌ ； Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、
９６，８８１（＋９８４） ］ 。
９６，８８１（＋９８４） ］ 。
また、ヒト脳・神経系腫瘍細胞に特異的に出現するタン
パク質の存在が特開昭６１−２３３６２３号公報に本発
明者らによって開示されている。
パク質の存在が特開昭６１−２３３６２３号公報に本発
明者らによって開示されている。
一方、マウス、ラットの脳・神経系細胞腫などに検出さ
れるが、正常マウス脳および正常ラット脳には検出され
ないか、もしくはわずかしか検出されないタンパク質の
存在が本発明者らによって開示されている［特開昭６１
−２７５２２１号公報、およびＮｏｇｕｃｈｉ、Ｓ、、
ｅｔ ａｌ；Ｃｅ１ｌ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄＦ
ｕｎｃｔｉｏｎ、＋２．＋２７（１９８７） ］ 。
れるが、正常マウス脳および正常ラット脳には検出され
ないか、もしくはわずかしか検出されないタンパク質の
存在が本発明者らによって開示されている［特開昭６１
−２７５２２１号公報、およびＮｏｇｕｃｈｉ、Ｓ、、
ｅｔ ａｌ；Ｃｅ１ｌ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄＦ
ｕｎｃｔｉｏｎ、＋２．＋２７（１９８７） ］ 。
［発明が解決しようとする課題］
本発明者らは、上述のように脳・神経系の組織・細胞に
含まれるタンパク質の重要性に鑑み種々のタンパク質等
の物質の検索を行なってきたが、その過程で、マウス胚
（胎児）の脳に存在するタンパク質のなかで、最もその
存在比率が高く、脳・神経系の異常に基く疾患、各臓器
・組織の成長・発育の不全あるいは異常増殖および癌等
の治療剤、予防剤などへの適用が大いに期待される二次
元電気泳動法で分子量的６８．０００を示し、等電点が
５．４〜５．６であるタンパク質（ＧＰ６８タンパク質
）に着目した。
含まれるタンパク質の重要性に鑑み種々のタンパク質等
の物質の検索を行なってきたが、その過程で、マウス胚
（胎児）の脳に存在するタンパク質のなかで、最もその
存在比率が高く、脳・神経系の異常に基く疾患、各臓器
・組織の成長・発育の不全あるいは異常増殖および癌等
の治療剤、予防剤などへの適用が大いに期待される二次
元電気泳動法で分子量的６８．０００を示し、等電点が
５．４〜５．６であるタンパク質（ＧＰ６８タンパク質
）に着目した。
ところが、該ＧＰ６８タンパク質の存在量は極めて微量
であり、また従来の方法では夾雑する各種タンパク質の
混入が避けられない場合が多く、高い精製度で量的に十
分なＧＰ６８タンパク質を得ることが必要となっていた
。
であり、また従来の方法では夾雑する各種タンパク質の
混入が避けられない場合が多く、高い精製度で量的に十
分なＧＰ６８タンパク質を得ることが必要となっていた
。
そこで、本発明者らは、より効率良いＧＰ６８タンパク
質の分離精製方法について鋭意検討した結果、レクチン
を担体に結合したアフィニティークロマトグラフィーを
行なう工程をＧＰ６８タンパク質の単離精製工程に新た
に導入することにより、夾雑タンパク質の混入を効果的
に排除し、より純度の高い形で、十分な量のＧＰ６８タ
ンパク質を効率良く単離精製できることを見い出した。
質の分離精製方法について鋭意検討した結果、レクチン
を担体に結合したアフィニティークロマトグラフィーを
行なう工程をＧＰ６８タンパク質の単離精製工程に新た
に導入することにより、夾雑タンパク質の混入を効果的
に排除し、より純度の高い形で、十分な量のＧＰ６８タ
ンパク質を効率良く単離精製できることを見い出した。
更に、この新たな知見に基いた精製方法によって十分な
量のＧＰ６８タンパク質が得られるようになり、その結
果ＧＰ６８タンパク質に対する抗体の生産に成功し、ま
たそれを用いた確実なＧＰ６８タンパク質の分離精製方
法を確立するに至り、本発明を完成した。
量のＧＰ６８タンパク質が得られるようになり、その結
果ＧＰ６８タンパク質に対する抗体の生産に成功し、ま
たそれを用いた確実なＧＰ６８タンパク質の分離精製方
法を確立するに至り、本発明を完成した。
本発明の目的は、ＧＰ６８タンパク質の性質および機能
を分析し、その医薬、動物薬、あるいは診断薬としての
有用性を明確とするのに必要な技術である、量的に十分
なより精製度の高いＧＰ６８タンパク質を分離精製でき
る方法を提供することにある。
を分析し、その医薬、動物薬、あるいは診断薬としての
有用性を明確とするのに必要な技術である、量的に十分
なより精製度の高いＧＰ６８タンパク質を分離精製でき
る方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、例えば、脳・神経系の疾患のみな
らず各臓器・組織の成長・発育の不全あるいは異常増殖
および癌等を有する患者のマーカーとしてのＧＰ６８タ
ンパク質を、該タンパク質に対するポリクローナル抗体
あるいはモノクローナル抗体で検出する各種免疫測定法
の開発に必要な技術、およびこれら抗体自身ならびにそ
の製造方法、あるいは治療剤及び予防剤としての該抗体
を含有する医薬組成物を提供することにある。
らず各臓器・組織の成長・発育の不全あるいは異常増殖
および癌等を有する患者のマーカーとしてのＧＰ６８タ
ンパク質を、該タンパク質に対するポリクローナル抗体
あるいはモノクローナル抗体で検出する各種免疫測定法
の開発に必要な技術、およびこれら抗体自身ならびにそ
の製造方法、あるいは治療剤及び予防剤としての該抗体
を含有する医薬組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、脳神経系はじめ各臓器の成長・発
育の不全を予防あるいは治療するためのＧＰ６８タンパ
ク質を含有する医薬組成物を提供することにある。
育の不全を予防あるいは治療するためのＧＰ６８タンパ
ク質を含有する医薬組成物を提供することにある。
［課題を解決するための手段］
本発明のＧＰ６８タンパク質の第１の分離精製方法は、
ＧＰ６８タンパク質の単離段階に、レクチンを親和試薬
として担体に結合（固定化）して用いたアフィニティー
クロマトグラフィーによる工程が導入されていることに
特徴を有する。
ＧＰ６８タンパク質の単離段階に、レクチンを親和試薬
として担体に結合（固定化）して用いたアフィニティー
クロマトグラフィーによる工程が導入されていることに
特徴を有する。
すなわち、ＧＰ６８タンパク質および例えば種々の夾雑
タンパク質を含む混合物を、レクチンを担持（固定化）
した担体に接触させて該担体にＧＰ６８タンパク質を吸
着させ、更に該担体からＧＰ６８タンパク質を選択的に
単離する。
タンパク質を含む混合物を、レクチンを担持（固定化）
した担体に接触させて該担体にＧＰ６８タンパク質を吸
着させ、更に該担体からＧＰ６８タンパク質を選択的に
単離する。
この工程に用いることのできる担体としては、例えばア
ガロース、アクリルアミドゲル、各種トヨバール（東洋
曹達工業社製）、セルロースなどを挙げることができる
。
ガロース、アクリルアミドゲル、各種トヨバール（東洋
曹達工業社製）、セルロースなどを挙げることができる
。
また、担体に固定化させるレクチンとしては、ヒマ凝集
素（Ｒｉｃｉｎｕｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｓ Ａｇｇｌｕｔ
ｉｎｉｎ 。
素（Ｒｉｃｉｎｕｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｓ Ａｇｇｌｕｔ
ｉｎｉｎ 。
以下ＲＣＡと略記する）、小麦胚アグルチニン（Ｗｈｅ
ａｔ Ｇｅｒｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ 、 ＷＧＡ）
、コンカナバリンＡなどを用いることができるが、こ
れらの中では、ＲＣＡが特に好適である。
ａｔ Ｇｅｒｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ 、 ＷＧＡ）
、コンカナバリンＡなどを用いることができるが、こ
れらの中では、ＲＣＡが特に好適である。
レクチンを担体に担持（固定化）させる方法としては、
用いる担体およびレクチンの種類に応じて常法に従って
行なえば良い。
用いる担体およびレクチンの種類に応じて常法に従って
行なえば良い。
これらを用いてのアフィニティークロマトグラフィーは
、レクチンを担持した担体な適当な大きさ及び形状のカ
ラムに通して利用するカラム法や、レクチンを担持した
担体と処理すべき溶液あるいは溶出用溶液とを一度に混
合して処理するパッチ方式を用いた方法など所望に応じ
て適宜選択した方法によって実施すれば良い。
、レクチンを担持した担体な適当な大きさ及び形状のカ
ラムに通して利用するカラム法や、レクチンを担持した
担体と処理すべき溶液あるいは溶出用溶液とを一度に混
合して処理するパッチ方式を用いた方法など所望に応じ
て適宜選択した方法によって実施すれば良い。
このようなレクチンを用いたアフィニティークロマトグ
ラフィーにより、マウス胎児脳などの各種組織・細胞の
抽出液のみならず、各種精製段階で得られるＧＰ６８タ
ンパク質を含む溶液を処理して、ＧＰ６８タンパク質を
分離精製することが可能である。
ラフィーにより、マウス胎児脳などの各種組織・細胞の
抽出液のみならず、各種精製段階で得られるＧＰ６８タ
ンパク質を含む溶液を処理して、ＧＰ６８タンパク質を
分離精製することが可能である。
マウス組織・細胞からＧＰ６８タンパク質を分離する場
合には、例えば、２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１
００（ローム アンド ハース 社製）０、００５％フ
ェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
、０．１５Ｍ食塩を含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）中にマウス組織・細胞をホモジナイズして
所定時間の抽出操作を行ない、得られた粗抽出液から遠
心分離（例えば、４０． ＯＯＯｒｐｍ）で得られる上
清液を用いることができる。
合には、例えば、２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１
００（ローム アンド ハース 社製）０、００５％フ
ェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
、０．１５Ｍ食塩を含む１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）中にマウス組織・細胞をホモジナイズして
所定時間の抽出操作を行ない、得られた粗抽出液から遠
心分離（例えば、４０． ＯＯＯｒｐｍ）で得られる上
清液を用いることができる。
なお、この時用いるマウス組織・細胞としては、受精か
ら生後１週間までの、例えば、受精後ＩＩ日目胚〜１９
日目胚の胎児や、生後１週間のマウスの脳、神経組織、
胃腸管、平滑筋組織、肝臓、心臓、腎臓、・肺、肝臓等
の各臓器などを挙げることができるが、高濃度での抽出
分離を行いたい場合には胎児脳あるいは生後１週間位ま
でのマウス脳を用いるのが便利である。
ら生後１週間までの、例えば、受精後ＩＩ日目胚〜１９
日目胚の胎児や、生後１週間のマウスの脳、神経組織、
胃腸管、平滑筋組織、肝臓、心臓、腎臓、・肺、肝臓等
の各臓器などを挙げることができるが、高濃度での抽出
分離を行いたい場合には胎児脳あるいは生後１週間位ま
でのマウス脳を用いるのが便利である。
レクチンを担持する担体に吸着させたＧＰ６８タンパク
質は、溶出用の溶液としてＧＰ６８タンパク質を選択的
に溶出できる組成の溶液を選択して用いることにより、
ＧＰ６８タンパク質を溶出させて、これと他のタンパク
質とを分離することができる。
質は、溶出用の溶液としてＧＰ６８タンパク質を選択的
に溶出できる組成の溶液を選択して用いることにより、
ＧＰ６８タンパク質を溶出させて、これと他のタンパク
質とを分離することができる。
この溶出用の溶液は、レクチンおよび担体の種類などに
応じて適宜選択すれば良いが、例えば、０．０１Ｍ〜０
．２Ｍのラクトース溶液、Ｎ−７セチルグルコサミン溶
液、α−メチルマンノシド溶液、シアル酸溶液などを利
用−することができる。
応じて適宜選択すれば良いが、例えば、０．０１Ｍ〜０
．２Ｍのラクトース溶液、Ｎ−７セチルグルコサミン溶
液、α−メチルマンノシド溶液、シアル酸溶液などを利
用−することができる。
溶出画分中でのＧＰ６Ｂタンパク質の確認は、その分子
量および等電点の測定などによって行なうことができる
。
量および等電点の測定などによって行なうことができる
。
本発明のＧＰ６８タンパク質は、後述の実施例１に記載
の２次元電気泳動での測定で約６８．０００（６８，０
００±２，０００ ）の分子量を有し、その等電点が５
．４〜５．６である。
の２次元電気泳動での測定で約６８．０００（６８，０
００±２，０００ ）の分子量を有し、その等電点が５
．４〜５．６である。
以上のような操作によって分画したＧＰ６８タンパク質
を含む画分を、更に例えばゲル口過法などの必要に応じ
たその他の各種精製方法に用いられている各種工程で処
理して、より高純度のＧＰ６８タンパク質を効率良く得
ることが可能である。
を含む画分を、更に例えばゲル口過法などの必要に応じ
たその他の各種精製方法に用いられている各種工程で処
理して、より高純度のＧＰ６８タンパク質を効率良く得
ることが可能である。
このゲル口過法には、通常のタンパク質精製技術で用い
られている方法が適用できる。
られている方法が適用できる。
このようにして得られた純度の高いＧＰ６８タンパク質
は、後述の実施例１に示されるアミノ酸組成及び糖組成
を有し、そのアミノ末端部分のオリゴペプチドのアミノ
酸配列は、マウスのα−フェトプロティンのアミノ末端
のアミノ酸配列［Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ、 Ｇｏｒｉｎ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｓｍ、。
は、後述の実施例１に示されるアミノ酸組成及び糖組成
を有し、そのアミノ末端部分のオリゴペプチドのアミノ
酸配列は、マウスのα−フェトプロティンのアミノ末端
のアミノ酸配列［Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ、 Ｇｏｒｉｎ
ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｓｍ、。
上、 １９５４ （１９８１） ］ とほぼ同一であっ
た。また、糖の含有率は１２．７重量％であった。
た。また、糖の含有率は１２．７重量％であった。
該ＧＰ６［１タンパク質、は、脳・神経系はじめ各臓器
の成長・発育の不全を予防あるいは治療するための医薬
として有用な医薬組成物の有効成分として有用である。
の成長・発育の不全を予防あるいは治療するための医薬
として有用な医薬組成物の有効成分として有用である。
次に、上記ＧＰ６８タンパク質を用いて動物を免疫し、
該ＧＰ６８タンパク質に対する抗体を調製することがで
きる。
該ＧＰ６８タンパク質に対する抗体を調製することがで
きる。
すなわち、ＧＰ６８タンパク質を例えばラット、ウサギ
、ヤギ、ウマ、ウシなどの動物に免疫し、得られた抗血
清中にＧＰ６８タンパク質に対するポリクローナル抗体
を得ることができる。
、ヤギ、ウマ、ウシなどの動物に免疫し、得られた抗血
清中にＧＰ６８タンパク質に対するポリクローナル抗体
を得ることができる。
この免疫処理には、通常の方法が利用でき、例えば各種
動物の背中、足踵、腹腔内、血管内などに適当なアジュ
バントとともにＧＰ６８タンパク質を接種する。免疫後
、７〜２００日経過した動物から抗血清を採取して目的
とするポリクローナル抗体を得ることができる。
動物の背中、足踵、腹腔内、血管内などに適当なアジュ
バントとともにＧＰ６８タンパク質を接種する。免疫後
、７〜２００日経過した動物から抗血清を採取して目的
とするポリクローナル抗体を得ることができる。
なお、初回免疫後、適当な間隔をおいて追加免疫して抗
体価を高めることができる。
体価を高めることができる。
一方、上記のようにして免疫した動物や、Ｂａ１ｂ／Ｃ
などのようなマウスの脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ
細胞）株との融合によって、ＧＰ６８タンパク質に対す
るモノクローナル抗体生産能を有するハイブリドーマを
作製することができる。
などのようなマウスの脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ
細胞）株との融合によって、ＧＰ６８タンパク質に対す
るモノクローナル抗体生産能を有するハイブリドーマを
作製することができる。
この融合に用いるミエローマ細胞株としては、マウスＮ
５−１株、Ｘ ６３−Ａｇ８株、ＭＰＣ−１１株、５Ｐ
−２１０株などのマウ、ス系のミエローマ細胞株やラッ
ト２１０． ＲＣＹ、 Ａｇ１．２．３などを挙げるこ
とができる。
５−１株、Ｘ ６３−Ａｇ８株、ＭＰＣ−１１株、５Ｐ
−２１０株などのマウ、ス系のミエローマ細胞株やラッ
ト２１０． ＲＣＹ、 Ａｇ１．２．３などを挙げるこ
とができる。
また、ＧＰ６８タンパク質で免疫した動物としては、初
回免疫ｆ＆１０〜８０日経過したものが好適であ更に、
融合は公知の方法で行なえば良く、得られたハイブリド
ーマは、例えば５〜２０％の牛胎児血清とＩＩＡＴを含
むＲＰＭＩ培養液（日永製薬社製、Ｃｏｄｅ ０５９１
１） 、続いてＨＴを含むＲＰＭＩ培養液、最終的にＲ
ＰＭＩ培養液などの細胞培養用培地で培養して、培地中
に所望とするＧＰ６８タンパク質に対するモノクローナ
ル抗体を分泌、Ｍｔ蓄させて該モノクローナル抗体を生
産することができる。
回免疫ｆ＆１０〜８０日経過したものが好適であ更に、
融合は公知の方法で行なえば良く、得られたハイブリド
ーマは、例えば５〜２０％の牛胎児血清とＩＩＡＴを含
むＲＰＭＩ培養液（日永製薬社製、Ｃｏｄｅ ０５９１
１） 、続いてＨＴを含むＲＰＭＩ培養液、最終的にＲ
ＰＭＩ培養液などの細胞培養用培地で培養して、培地中
に所望とするＧＰ６８タンパク質に対するモノクローナ
ル抗体を分泌、Ｍｔ蓄させて該モノクローナル抗体を生
産することができる。
あるいは、該ハイブリドーマをヌードラット、または免
疫抑制されたラットの腹腔内に移植してその腹水癌化を
誘発し、該腹水中に該モノクローナル抗体を生産、備蓄
させる方法によって該モノクローナル抗体を生産するこ
とができる。
疫抑制されたラットの腹腔内に移植してその腹水癌化を
誘発し、該腹水中に該モノクローナル抗体を生産、備蓄
させる方法によって該モノクローナル抗体を生産するこ
とができる。
こうして得られたポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体は、先に述べたように、各種免疫測定法によっ
て脳・神経系の疾患のみならず各臓器・組織の成長・発
育の不全あるいは異常増殖および癌等を有する患者の疾
患マーカーとしてのＧＰ６８タンパク質を検出する際の
試薬の成分として、またこれらの抗体を含む治療剤およ
び予防剤の開発に有用である。−例として、ＧＰ６８タ
ンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体を用いて各種癌患者の癌組織を蛍光抗体法によ
り染色してみると、癌組織のみにおいて特異的に本発明
のこれら抗体によって組織・細胞が染色されることが明
らかとなり、癌の診断薬として抗ＧＰ６８タンパク質抗
体が有用であることが明かとされた。
ナル抗体は、先に述べたように、各種免疫測定法によっ
て脳・神経系の疾患のみならず各臓器・組織の成長・発
育の不全あるいは異常増殖および癌等を有する患者の疾
患マーカーとしてのＧＰ６８タンパク質を検出する際の
試薬の成分として、またこれらの抗体を含む治療剤およ
び予防剤の開発に有用である。−例として、ＧＰ６８タ
ンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体を用いて各種癌患者の癌組織を蛍光抗体法によ
り染色してみると、癌組織のみにおいて特異的に本発明
のこれら抗体によって組織・細胞が染色されることが明
らかとなり、癌の診断薬として抗ＧＰ６８タンパク質抗
体が有用であることが明かとされた。
また、ＧＰ６１１タンパク質に対する抗ＧＰ６８タンパ
ク質ポリクローナルウサギ（ラット）抗血清及び抗マウ
スα−フェトプロティンポリクローナルウサギ抗血清と
のオクタルロニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法による
ゲル内沈降反応を行なったところ、両抗血清はＧＰ６８
タンパク質に対して同様の沈降反応を示し、マウスＧＰ
６８タンパク質とマウスα−フェトプロティンとはここ
でもかなり近似したタンパク質であることが解った。
ク質ポリクローナルウサギ（ラット）抗血清及び抗マウ
スα−フェトプロティンポリクローナルウサギ抗血清と
のオクタルロニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法による
ゲル内沈降反応を行なったところ、両抗血清はＧＰ６８
タンパク質に対して同様の沈降反応を示し、マウスＧＰ
６８タンパク質とマウスα−フェトプロティンとはここ
でもかなり近似したタンパク質であることが解った。
他方、同時に行なったオクタムロニー法によるゲル内沈
降反応で、ＧＰ６８タンパク質に対するつサギ抗血清と
は異なり、ヒト胎盤α−フェトプロティンに対するウサ
ギ抗血清（ヘキスト社製）はＧＰ６８タンパク質と沈降
反応を示さなかった。これに対応する事実として、ヒト
癌患者組織抗原なベクタスティンＡＢＣ法あるいは蛍光
抗体法により染色してみると、両血清の反応性には明瞭
な差異があることが示された（表ＩＡ及び表ＩＢ）。
降反応で、ＧＰ６８タンパク質に対するつサギ抗血清と
は異なり、ヒト胎盤α−フェトプロティンに対するウサ
ギ抗血清（ヘキスト社製）はＧＰ６８タンパク質と沈降
反応を示さなかった。これに対応する事実として、ヒト
癌患者組織抗原なベクタスティンＡＢＣ法あるいは蛍光
抗体法により染色してみると、両血清の反応性には明瞭
な差異があることが示された（表ＩＡ及び表ＩＢ）。
そして、抗ＧＰ６８タンパク質抗血清は、抗ヒトα−フ
ェトプロティン抗血清よりもスペクトラムが広く、かつ
強度が高いことが明らかとなった。
ェトプロティン抗血清よりもスペクトラムが広く、かつ
強度が高いことが明らかとなった。
また、こうして得た抗体を用いて作製したアフィニティ
ークロマト担体を用いて本発明における第２のアフィニ
ティークロマトグラフィーを行なうことにより、ＧＰ６
８タンパク質の分離精製を行なうことができる。
ークロマト担体を用いて本発明における第２のアフィニ
ティークロマトグラフィーを行なうことにより、ＧＰ６
８タンパク質の分離精製を行なうことができる。
その除用いる担体としては、アガロース、セファデック
ス類、ＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂのようなセファ
０−ス類、Ａｆｉｇｅｌ １０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）
、各種トヨパールなどを利用することができ、担体への
結合方法は、適当な緩衝液などに抗体を溶解し、４℃で
数時間から一昼夜担体とまぜあわせて行なえば良い。
ス類、ＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂのようなセファ
０−ス類、Ａｆｉｇｅｌ １０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）
、各種トヨパールなどを利用することができ、担体への
結合方法は、適当な緩衝液などに抗体を溶解し、４℃で
数時間から一昼夜担体とまぜあわせて行なえば良い。
このＧＰ６８タンパク質に対する抗体を用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーを行なう場合、吸着したＧＰ
６Ｂタンパク質を溶出させる溶液としては、酸性緩衝液
、アルカリ性緩衝液あるいは高濃度の塩を含む中性緩衝
液などが利用できる。
ティークロマトグラフィーを行なう場合、吸着したＧＰ
６Ｂタンパク質を溶出させる溶液としては、酸性緩衝液
、アルカリ性緩衝液あるいは高濃度の塩を含む中性緩衝
液などが利用できる。
本発明のＧＰ６８タンパク質または抗ＧＰ６８タンパク
質抗体を有効成分とする医薬組成物は、必要に応じた各
種添加剤と混合することによって調製することができる
。該添加剤としては、例えばアルブミン、ゼラチン、デ
キストラン、Ｔｗｅｅｎ ８０などのポリソルベート系
等の非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油、脂肪酸アルコールエステル、ポリグリコールエー
テル、リン酸緩衝生理食塩水、各種アミノ酸、デキスト
ロース、マンニトール、グルコース、キシリトール、乳
糖、ショ糖、ガラクトース、フラクトース、マルトース
、サッカロース、ソルビトールなどの糖類等を挙げるこ
とができ、これらの１種または２以上を組み合せて用い
ることができる。
質抗体を有効成分とする医薬組成物は、必要に応じた各
種添加剤と混合することによって調製することができる
。該添加剤としては、例えばアルブミン、ゼラチン、デ
キストラン、Ｔｗｅｅｎ ８０などのポリソルベート系
等の非イオン界面活性剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油、脂肪酸アルコールエステル、ポリグリコールエー
テル、リン酸緩衝生理食塩水、各種アミノ酸、デキスト
ロース、マンニトール、グルコース、キシリトール、乳
糖、ショ糖、ガラクトース、フラクトース、マルトース
、サッカロース、ソルビトールなどの糖類等を挙げるこ
とができ、これらの１種または２以上を組み合せて用い
ることができる。
本発明の医薬組成物は、たとえば錠剤、カプセル剤、散
剤、顆粒、トローチ、カシェ−、エリキシル、乳濁液、
溶液、シロップ、懸濁液、エアロゾル、軟膏、無菌注射
器、成型パップ、テープ、軟質及び硬質ゼラチンカプセ
ル、生薬及び無菌包装粉末などの形態として利用できる
。
剤、顆粒、トローチ、カシェ−、エリキシル、乳濁液、
溶液、シロップ、懸濁液、エアロゾル、軟膏、無菌注射
器、成型パップ、テープ、軟質及び硬質ゼラチンカプセ
ル、生薬及び無菌包装粉末などの形態として利用できる
。
更に、本発明の医薬用組成物は、製薬的に許容される担
体等の添加剤として、上記の例示物の他に、充填剤、結
合剤、滑沢剤、湿潤剤、崩壊剤、乳濁および！！ＪｉＢ
剤、保存剤、希釈剤、甘味剤あるいは芳香剤等として作
用する各種物質を含有し得る。
体等の添加剤として、上記の例示物の他に、充填剤、結
合剤、滑沢剤、湿潤剤、崩壊剤、乳濁および！！ＪｉＢ
剤、保存剤、希釈剤、甘味剤あるいは芳香剤等として作
用する各種物質を含有し得る。
これらの添加剤の例としては、とうもろこし澱粉、結晶
セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、タルク
ネート、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビ
ニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラチン、シロッ
プ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、
メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキ
シ安磨、香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシ
ウム、不活性なポリマー類、水及び鉱油等が挙げられる
。
セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、タルク
ネート、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビ
ニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラチン、シロッ
プ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、
メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキ
シ安磨、香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシ
ウム、不活性なポリマー類、水及び鉱油等が挙げられる
。
なお、本発明の医薬組成物は、投薬の後の活性成分の放
出速度が所望に応じて制御されるように処方しても良い
。
出速度が所望に応じて制御されるように処方しても良い
。
本発明の医薬用組成物を経口投与する場合には、例えば
ＧＰ６８タンパク質または抗ＧＰ６８タンパク質抗体は
、上記担体等と混合され、錠剤、カプセル剤などの形と
することができる。
ＧＰ６８タンパク質または抗ＧＰ６８タンパク質抗体は
、上記担体等と混合され、錠剤、カプセル剤などの形と
することができる。
静脈内点滴もしくは注射、あるいは筋肉的注射等の非経
口投与の場合、例えばＧＰ６８タンパク質または抗ＧＰ
６ｇタンパク質抗体の有効量を、ブドウ糖水溶液、等張
食塩水、無菌水あるいは類似の液体に溶解し、バイアル
またはアンプルに密封することができる。
口投与の場合、例えばＧＰ６８タンパク質または抗ＧＰ
６ｇタンパク質抗体の有効量を、ブドウ糖水溶液、等張
食塩水、無菌水あるいは類似の液体に溶解し、バイアル
またはアンプルに密封することができる。
なお、バイアルまたはアンプル剤とした場合には、その
安定性を向上させるために、ＧＰ６Ｂタンパク質または
抗ＧＰ６Ｂタンパク質抗体の凍結乾燥品をバイアルやア
ンプル内で調製しても良い。
安定性を向上させるために、ＧＰ６Ｂタンパク質または
抗ＧＰ６Ｂタンパク質抗体の凍結乾燥品をバイアルやア
ンプル内で調製しても良い。
本発明の医薬組成物中でのＧＰ６８タンパク質または抗
ＧＰ６８タンパク質抗体の含有量は、必要に応じて適宜
選択すれば良いが、例えば単位投薬量形状あたり、０．
１μｇ〜５０ｍｇ程度とすることができる。
ＧＰ６８タンパク質抗体の含有量は、必要に応じて適宜
選択すれば良いが、例えば単位投薬量形状あたり、０．
１μｇ〜５０ｍｇ程度とすることができる。
［実施例］
以下、実施例、実験例をもって本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
１００個のＩＣＲマウス胎児脳（受精後１３日胚脳）を
、＋００＋＋ｌの２％トリトン Ｘ −１００，０，０
０５％ＰＭＳＦ、Ｏ，１５Ｍ食塩を含む１０ｍＭトリス
・塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）中でホモジェナイズして、
４℃、３０分の抽出を行ない、得られた粗抽出液を１２
０．０００Ｘｇ、１時間の条件の高速遠心にかけた後、
更に得られた上清液を以下のようにして調製したＲＣＡ
アガロース アフィニティークロマトグラフィーカラム
（４ｎｌ）に通した後、上記緩衝液４０ ｎ＋４２でこ
のカラムを洗浄した。
、＋００＋＋ｌの２％トリトン Ｘ −１００，０，０
０５％ＰＭＳＦ、Ｏ，１５Ｍ食塩を含む１０ｍＭトリス
・塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）中でホモジェナイズして、
４℃、３０分の抽出を行ない、得られた粗抽出液を１２
０．０００Ｘｇ、１時間の条件の高速遠心にかけた後、
更に得られた上清液を以下のようにして調製したＲＣＡ
アガロース アフィニティークロマトグラフィーカラム
（４ｎｌ）に通した後、上記緩衝液４０ ｎ＋４２でこ
のカラムを洗浄した。
カラムへの充填；
ＲＣＡアガロース（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社
製）の４ｍβを円筒状カラムに充填し、これを１％トリ
トンＸ−１００、０，００５％ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で処理し平衡化した
。
製）の４ｍβを円筒状カラムに充填し、これを１％トリ
トンＸ−１００、０，００５％ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で処理し平衡化した
。
次に該カラムに１％トリトンＸ−１００、０，００５％
ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）に更に０．１Ｍラクトースを加えた２０ｍβの溶
液を通し、溶出液を得た。
ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）に更に０．１Ｍラクトースを加えた２０ｍβの溶
液を通し、溶出液を得た。
この溶出液の一部を充分透析して精製タンパク質溶液を
得た後、これを凍結乾燥してタンパク質標品を得た。
得た後、これを凍結乾燥してタンパク質標品を得た。
なお、タンパク質標品の収量は、１００個のマウス胚の
脳あたり２．０ｍｇタンパク質であった。
脳あたり２．０ｍｇタンパク質であった。
また、タンパク質量は、ローリ−（Ｌｏｗｒｙ ）法に
より、牛血清アルブミン（シグマ社製）を標準として求
めた。なお、以下の各種操作でのタンパク質量の測定も
同様の方法により行なった。
より、牛血清アルブミン（シグマ社製）を標準として求
めた。なお、以下の各種操作でのタンパク質量の測定も
同様の方法により行なった。
一方、これとは別に、先の溶出液の残りにエタノールを
最終濃度が８０〜９０％となるように加えてエタノール
沈殿タンパク質を得て、これをタンパク質標品とした。
最終濃度が８０〜９０％となるように加えてエタノール
沈殿タンパク質を得て、これをタンパク質標品とした。
得られたタンパク質標品の一部を以下の条件の二次元電
気泳動にかけて、その分子量および等電点を測定したと
ころ、この標品から分子量的６８、０００、等電点５，
４〜５．６のタンパク質のみが検出された。
気泳動にかけて、その分子量および等電点を測定したと
ころ、この標品から分子量的６８、０００、等電点５，
４〜５．６のタンパク質のみが検出された。
なお、分子量測定での対照のタンパク質としては、いず
れもシグマ社製のチログロブリン（分子量３３０．００
０） Ｊラクトフェリン（分子量ａａ、 ｏｏｏ）、ウ
シ血清アルブミン（分子量６７．０００） 、卵白アル
ブミン（分子ｆｉ４３，０００） 、アルドラーゼ（分
子量３４、０００）を使用した。
れもシグマ社製のチログロブリン（分子量３３０．００
０） Ｊラクトフェリン（分子量ａａ、 ｏｏｏ）、ウ
シ血清アルブミン（分子量６７．０００） 、卵白アル
ブミン（分子ｆｉ４３，０００） 、アルドラーゼ（分
子量３４、０００）を使用した。
二次元電気泳動の条件；
ａ）一次元目
泳動用媒体として、尿素２．７６ｇ 、３０％アクリル
アミド０．６７ ｍｆ２、１０％ＮＰ−４０の１ ＋
ｎｊ２、アンホライン（ｐＨ３，５−１０）の０．２５
ｍ（１，１０％過硫酸アンモニアＩＯμβ、５％テト
ラメチルエチレンジアミン［ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅ
ｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ （ＴＥＭＥＤ ） 、
半井化学社製］ ０．１４ ｍｌｌ、水０．９１ ｍｎ
の組成のものを使用し、サンプルをこの一次元ゲルにか
け、陽極液として１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４、陰極液として
２０ｍＭ ＮａＯＨをそれぞれ用い、４００ｖで１３
時間、次で８００ｖで１時間電気泳動を行なった。
アミド０．６７ ｍｆ２、１０％ＮＰ−４０の１ ＋
ｎｊ２、アンホライン（ｐＨ３，５−１０）の０．２５
ｍ（１，１０％過硫酸アンモニアＩＯμβ、５％テト
ラメチルエチレンジアミン［ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅ
ｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ （ＴＥＭＥＤ ） 、
半井化学社製］ ０．１４ ｍｌｌ、水０．９１ ｍｎ
の組成のものを使用し、サンプルをこの一次元ゲルにか
け、陽極液として１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４、陰極液として
２０ｍＭ ＮａＯＨをそれぞれ用い、４００ｖで１３
時間、次で８００ｖで１時間電気泳動を行なった。
ｂ）二次五目
一次元泳動後、ゲルをソジウムドデシルサルフェート（
ＳＤＳ）試料緩衝液［１０％グリセリン、５％ β−メ
ルカプトエタノール、２３％ＳＯ３、６２，５ｍＭトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐ）１６．８ ） ］と平衡化し、７
．５％のアクリルアミドスラブゲル（２５ｍＭ）リス、
１９２ｍＭグリシン、０．１％Ｓ［ｌＳ）にかけ、１２
０Ｖで４時間の二次五目の泳動を行なった。
ＳＤＳ）試料緩衝液［１０％グリセリン、５％ β−メ
ルカプトエタノール、２３％ＳＯ３、６２，５ｍＭトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐ）１６．８ ） ］と平衡化し、７
．５％のアクリルアミドスラブゲル（２５ｍＭ）リス、
１９２ｍＭグリシン、０．１％Ｓ［ｌＳ）にかけ、１２
０Ｖで４時間の二次五目の泳動を行なった。
泳動後、０．０５％クマシブルー、１０％メチルアルコ
ール、１０％酢酸で１時間ゲルを染色した後、更に１０
％メチルアルコール、１０％酢酸で処理し、得られた各
スポットを測定した。
ール、１０％酢酸で１時間ゲルを染色した後、更に１０
％メチルアルコール、１０％酢酸で処理し、得られた各
スポットを測定した。
次に、先に得たＧＰ６８タンパク質の凍結乾燥標品（１
ｍｇタンパク質）における糖含有率を、バアティら（Ｂ
ｈａｔｔｉ ｅｔ ａｌ）の方法に従って、メタノリシ
ス反応を行なった後にガス液体クロマトグラフィーによ
り求めた。
ｍｇタンパク質）における糖含有率を、バアティら（Ｂ
ｈａｔｔｉ ｅｔ ａｌ）の方法に従って、メタノリシ
ス反応を行なった後にガス液体クロマトグラフィーによ
り求めた。
一方、該凍結乾燥標品中のシアル酸の含有率を、０．０
５ Ｍ ＨａＳＯ＜を用いた８０℃、３０分の加水分解
反応を行なった後に、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉ
ｎｉｃ ａｃｉｄを標準として用いたＴｈ１ｏｂａｒｂ
ｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ反応により求めた。
５ Ｍ ＨａＳＯ＜を用いた８０℃、３０分の加水分解
反応を行なった後に、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉ
ｎｉｃ ａｃｉｄを標準として用いたＴｈ１ｏｂａｒｂ
ｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ反応により求めた。
更に、該ＧＰ６８タンパク質の凍結乾燥標品（タンパク
質量としてそれぞれ１ｍｇあるいは９８μｇ）を４Ｍ
Ｈ（［での１００℃、４時間の処理あるいは６Ｍ１（
ｔ［での１０５℃、２４時間の処理によって加水分解し
、得られた加水分解物中のヘキソサアミンあるいはアミ
ノ酸を、日立アミノ酸分析器８３５型により分析した。
質量としてそれぞれ１ｍｇあるいは９８μｇ）を４Ｍ
Ｈ（［での１００℃、４時間の処理あるいは６Ｍ１（
ｔ［での１０５℃、２４時間の処理によって加水分解し
、得られた加水分解物中のヘキソサアミンあるいはアミ
ノ酸を、日立アミノ酸分析器８３５型により分析した。
以上の分析操作の結果を以下に示す。
糖組成（モル比）；
ガラクトース １
マンノース １．４２
フルクトース ０．３２グルコース
グルコサミン
ガラクトサミン
シアル酸
０．０７
Ｉ、０６
０．１０
０、Ｉ８
アミノ酸組成（モル比）
アスパラギン酸
スレオニン
セリン
グルタミン酸
グリシン
アラニン
システィン
バリン
メチオニン
イソロイシン
ロイシン
チロシン
フェニルアラニン
リジン
４３．２
２６．１
３５．８
５８．４
３０．２
３０．６
６．９
２３．３
５．２
９．５
４８．４
８．６
１７．４
２６．３
アンモニア
ヒスチジン
アルギニン
プロリン
９０．１
１０．６
１８．２
２６．５
更に、上記ＧＰ６８タンパク質の凍結乾燥標品（１０５
μｇ）を２５μβの水に溶解させ、その１７μｌ２（７
１、４μｇ）をベプチドシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅ
ｄＳｃｉｅｎｃｅ社Ｍｏｄｅｌ ４７７Ａ ）に適用し
て、そのアミン末端のアミノ酸配列を分析したところ、
以下の結果が得られた。
μｇ）を２５μβの水に溶解させ、その１７μｌ２（７
１、４μｇ）をベプチドシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅ
ｄＳｃｉｅｎｃｅ社Ｍｏｄｅｌ ４７７Ａ ）に適用し
て、そのアミン末端のアミノ酸配列を分析したところ、
以下の結果が得られた。
ＧＰ６８タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列；Ｌｅ
ｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ
−１１ｓ−＾１ａ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
３ｅｒ−Ｘ −Ｇｉｎ−Ｙ −Ｌｙｓ−丁ｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−（Ｘ、Ｙは未確定ン なお、参考のためにマウスα−フェトプロティンのアミ
ノ末端のアミノ酸配列［Ｍｉｃｈａｅｌ ＢＧｏｒｉｎ
ｅｔ ａｌ、、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２
５６． １９５４〜（＋９８１） ］は以下のとおりで
ある。
ｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ
−１１ｓ−＾１ａ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
３ｅｒ−Ｘ −Ｇｉｎ−Ｙ −Ｌｙｓ−丁ｈｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−（Ｘ、Ｙは未確定ン なお、参考のためにマウスα−フェトプロティンのアミ
ノ末端のアミノ酸配列［Ｍｉｃｈａｅｌ ＢＧｏｒｉｎ
ｅｔ ａｌ、、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２
５６． １９５４〜（＋９８１） ］は以下のとおりで
ある。
マウスα−フェトプロティンのアミン末端のアミノ酸配
列； Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−１１ｅ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌａｕ−Ａｓ
ｐ−５ｅｔ−５ｅｒ−Ｇ １ｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ Ｉ −
Ｔｈｒ−Ｇ ｌ ｕ−Ｌｙｓ −更に、ＧＰＳ８タンパ
ク質（上記凍結乾燥標品）に対する抗マウスＧＰ６８タ
ンパク質ポリクローナルウサギ抗血清（実施例２で調製
）及び抗マウスα−フェトプロティンポリクローナルウ
サギ抗血清（ヘキスト社製）のオクタルロニ（Ｇｕｃｈ
ｔｅｒ Ｉｏｎｙ）法によるゲル内沈降反応を行なった
ところ、両抗血清はＧＰ６８タンパク質に対して同様の
沈降反応を示した。
列； Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ−１１ｅ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌａｕ−Ａｓ
ｐ−５ｅｔ−５ｅｒ−Ｇ １ｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ Ｉ −
Ｔｈｒ−Ｇ ｌ ｕ−Ｌｙｓ −更に、ＧＰＳ８タンパ
ク質（上記凍結乾燥標品）に対する抗マウスＧＰ６８タ
ンパク質ポリクローナルウサギ抗血清（実施例２で調製
）及び抗マウスα−フェトプロティンポリクローナルウ
サギ抗血清（ヘキスト社製）のオクタルロニ（Ｇｕｃｈ
ｔｅｒ Ｉｏｎｙ）法によるゲル内沈降反応を行なった
ところ、両抗血清はＧＰ６８タンパク質に対して同様の
沈降反応を示した。
実施例２
実施例１で得たＧＰ６８タンパク質の凍結乾燥標品とエ
タノール沈殿標品の１＝１での混合物１００μｇを、２
週問おきにフロイントの完全アジュバント（半井化学社
製）とともに計４回ウサギにニージーランドホワイト種
）の足踏に接種してこれを免疫した。
タノール沈殿標品の１＝１での混合物１００μｇを、２
週問おきにフロイントの完全アジュバント（半井化学社
製）とともに計４回ウサギにニージーランドホワイト種
）の足踏に接種してこれを免疫した。
最終免疫後１０日目に全採血し、血清を調製した。得ら
れた血清は、ＢＳＡを結合したＡｆｉｇｅｌ １０（Ｂ
ｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）カラム
に通し、流出液を更に、１ｍｇ／ ｍ（２濃度のＧＰ６
８タンパク質を含む重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，
ｏｌと接触させたＡｆｉｇｅｌ １０を充填したカラム
に通し、抗体を吸着させた０次に、 ３Ｍのチオシアン
酸カリウム溶液で吸着抗体を溶出させ、流出液を集めた
。この操作を必要な回数繰り返し抗体溶液を備蓄した。
れた血清は、ＢＳＡを結合したＡｆｉｇｅｌ １０（Ｂ
ｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）カラム
に通し、流出液を更に、１ｍｇ／ ｍ（２濃度のＧＰ６
８タンパク質を含む重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，
ｏｌと接触させたＡｆｉｇｅｌ １０を充填したカラム
に通し、抗体を吸着させた０次に、 ３Ｍのチオシアン
酸カリウム溶液で吸着抗体を溶出させ、流出液を集めた
。この操作を必要な回数繰り返し抗体溶液を備蓄した。
この抗体を含む流出液を充分透析し、２０μｇ／ｒｔｌ
ｌのタンパク濃度とし、イムノブロッティング法により
分析したところ、ＧＰ６８タンパク質に対するポリクロ
ーナル抗体が含まれていることが確認された。
ｌのタンパク濃度とし、イムノブロッティング法により
分析したところ、ＧＰ６８タンパク質に対するポリクロ
ーナル抗体が含まれていることが確認された。
実施例３
実施例１で得たＧＰ６８タンパク質の凍結乾燥標品とエ
タノール沈殿標品の１＝１での混合物５００μｇを、２
週問おきにフロイントの完全アジュバントとともに計４
回ヤギの各所皮内、皮下に投与して、これを免疫し、経
時的に採血した。
タノール沈殿標品の１＝１での混合物５００μｇを、２
週問おきにフロイントの完全アジュバントとともに計４
回ヤギの各所皮内、皮下に投与して、これを免疫し、経
時的に採血した。
十分抗体価が上った５箇月後に全採血した。得られた血
清を実施例２と同様にカラム処理して、ＧＰ６８タンパ
ク質に対するポリクローナル抗体を集積し、その一部を
分析したところ、ＧＰ６８タンパク質に対する特異的抗
体であることが確認された。
清を実施例２と同様にカラム処理して、ＧＰ６８タンパ
ク質に対するポリクローナル抗体を集積し、その一部を
分析したところ、ＧＰ６８タンパク質に対する特異的抗
体であることが確認された。
実施例４
免疫する動物としてウマを用いる以外は実施例３と同様
にしてポリクローナル抗体を集積した。
にしてポリクローナル抗体を集積した。
実施例５
免疫する動物としてウシを用いる以外は実施例３と同様
にしてポリクローナル抗体を集積した。
にしてポリクローナル抗体を集積した。
実施例６
実施例１で得たＧＰ６８タンパク質の凍結乾燥標品とエ
タノール沈殿標品の１：ｌでの混合物を以下に示す量で
、２週間間隔でウィスターラット（５〜６週令）に投与
し、これを免疫した。
タノール沈殿標品の１：ｌでの混合物を以下に示す量で
、２週間間隔でウィスターラット（５〜６週令）に投与
し、これを免疫した。
１回目（皮下）５０μｇ
２回目（皮下） ５０μｇ
３回目（腹腔内）！００μｇ
４回目（腹腔内）１００μｇ
最終免疫から３日目の脾細胞のｌＸｌ０”個と、ミエロ
ーマ細胞としてのマウスＮ５−１細胞株の２×１０’個
とをポリエチレングリコール４００の存在下でＫｏｅｈ
ｌｅｒらの方法に従って融合させた。
ーマ細胞としてのマウスＮ５−１細胞株の２×１０’個
とをポリエチレングリコール４００の存在下でＫｏｅｈ
ｌｅｒらの方法に従って融合させた。
ポリエチレングリコールを除き、得られたハイブリドー
マを２００ｎｌのＤＡＴ培地（）ＩＡＴ及びｌＯ％ｆｅ
ｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ （Ｆｅ２）を含むＲＰ
Ｍ［１６４０ｍｅｄｉｕｍ）に浮遊させ、これを９６ウ
エルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に各ウェル当りの細
胞数がｌＸｌ０’個となるように移した。
マを２００ｎｌのＤＡＴ培地（）ＩＡＴ及びｌＯ％ｆｅ
ｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ （Ｆｅ２）を含むＲＰ
Ｍ［１６４０ｍｅｄｉｕｍ）に浮遊させ、これを９６ウ
エルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に各ウェル当りの細
胞数がｌＸｌ０’個となるように移した。
次に３７℃で１週間〜ｌＯ日培養を続けた。
培養１０日、目より３日ごとに各ウェル培養上清の半分
を用いて（その９新しい培養液を加えて培養を続ける）
、ベクタスティンＡＢＣ法（Ｖｅｃｔａｓｔａ １ｎＡ
ＢＣｍｅｔｈｏｄ、アビジン−ビオチン化ワサビペルオ
キシダーゼコンプレックス法、フナコシ社販売）による
ＥＬ［ＳＡ （ｅｎｚｙｍｅ １ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｏ ５ｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）を行ない、陽性クロ
ーンを含むウェルを検索し、更に陽性のものを含むウェ
ルから限界希釈法によるクローニングを行なって所望と
するクローンを得た。
を用いて（その９新しい培養液を加えて培養を続ける）
、ベクタスティンＡＢＣ法（Ｖｅｃｔａｓｔａ １ｎＡ
ＢＣｍｅｔｈｏｄ、アビジン−ビオチン化ワサビペルオ
キシダーゼコンプレックス法、フナコシ社販売）による
ＥＬ［ＳＡ （ｅｎｚｙｍｅ １ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕ
ｎｏ ５ｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）を行ない、陽性クロ
ーンを含むウェルを検索し、更に陽性のものを含むウェ
ルから限界希釈法によるクローニングを行なって所望と
するクローンを得た。
なお、ＥＬＩＳＡ法に用いたアッセイブレート２０９５
（Ｆａｌｃｏｎ社製）には、常法に従い実施例１で得
たエタノール沈殿ＧＰ６８タンパク質を溶解したリン酸
緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ）と１〜数時間接触させる
ことによって、各ウェルにＧＰ６８タンパク質を１１０
ｎｌ吸着させて使用した。
（Ｆａｌｃｏｎ社製）には、常法に従い実施例１で得
たエタノール沈殿ＧＰ６８タンパク質を溶解したリン酸
緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ）と１〜数時間接触させる
ことによって、各ウェルにＧＰ６８タンパク質を１１０
ｎｌ吸着させて使用した。
以上の操作で、計８個の陽性クローンが得られた。
これらのクローンのうちの２種（ＥＢＲ３、ＥＢＲ７）
をそれぞれ個々に用いて以下のようにしてＥＢＲ３−１
モノクロ一ナル抗体、ＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗体
を得た。
をそれぞれ個々に用いて以下のようにしてＥＢＲ３−１
モノクロ一ナル抗体、ＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗体
を得た。
なお、これらクローンＥＢＲ３及びＥＢＲ７は、昭和６
３年（１９８８年）８月１８日付けで、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（日本国茨城県つくば宙乗
１丁目１番３号、郵便番号３０５）にブタベスト条約に
基いて寄託された。
３年（１９８８年）８月１８日付けで、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（日本国茨城県つくば宙乗
１丁目１番３号、郵便番号３０５）にブタベスト条約に
基いて寄託された。
これらクローンの原寄託日は、昭和６３年（１９８８年
）８月１８日であり、クローンＥＢＲ３の受託番号はＦ
ＥＲＭ ＢＰ−２００２、クローンＥＢＲ７の受託番
号はＦＥＲＭ ＢＰ−２００３である。
）８月１８日であり、クローンＥＢＲ３の受託番号はＦ
ＥＲＭ ＢＰ−２００２、クローンＥＢＲ７の受託番
号はＦＥＲＭ ＢＰ−２００３である。
実施例７
実施例６で得たハイブリドーマ（クローンＥＢＲ３、Ｅ
ＢＲ７）を用いたＧＰ６８タンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体の生産を実施した。
ＢＲ７）を用いたＧＰ６８タンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体の生産を実施した。
まず、クローンＥＢＲ３、ＥＢＲ７を別々にＲＰＭ［１
６４０培地で、ＩＯａｍシャーレ中で培養した。
６４０培地で、ＩＯａｍシャーレ中で培養した。
得られた２種の培養上清から５０％硫安で沈殿した沈殿
物を１〜２ ｍｆ２のＰＢＳに溶解し、３日間ＰＢＳで
透析した０次いで、透析処理後の溶液をセファデックス
Ｇ −２５０カラムに通し、精製ＥＢＲ３−１モノクロ
ーナル抗体および精製ＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗体
を得た。
物を１〜２ ｍｆ２のＰＢＳに溶解し、３日間ＰＢＳで
透析した０次いで、透析処理後の溶液をセファデックス
Ｇ −２５０カラムに通し、精製ＥＢＲ３−１モノクロ
ーナル抗体および精製ＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗体
を得た。
更に、ブリスタン処理［２，６，ｔｏ、 ！４−テトラ
メチルペンタデカンｏ、 ５ｍＩ２／匹を腹腔内に投与
し、１〜２週飼育する］した８週令ヌードラットに実施
例６で得られたクローンＥＢＲ３、ＥＢＲ７を個々にＩ
Ｘ １０’ ／匹となるように腹腔内に投与した。
メチルペンタデカンｏ、 ５ｍＩ２／匹を腹腔内に投与
し、１〜２週飼育する］した８週令ヌードラットに実施
例６で得られたクローンＥＢＲ３、ＥＢＲ７を個々にＩ
Ｘ １０’ ／匹となるように腹腔内に投与した。
１０〜２１日目に腹水のたまったラットから腹水（５０
ｍ４７匹）を採取し、これから遠心分離により固形分を
除去した。
ｍ４７匹）を採取し、これから遠心分離により固形分を
除去した。
得られた上溝を５０％硫安塩析、４０％硫安塩析し、更
にＰＢＳ （ｐＨ７，２）で３日間透析した。
にＰＢＳ （ｐＨ７，２）で３日間透析した。
得られた粗精製モノクローナル抗体は、セファデックス
Ｇ−２００カラムにかけて、ＰＢＳで溶出させ、精製モ
ノクローナル抗体（ＥＢＲ３−２モノクロ一ナル抗体お
よびＥＢＲ７−２モノクロ一ナル抗体）をそれぞれ個々
に含む２種の溶液を回収した。
Ｇ−２００カラムにかけて、ＰＢＳで溶出させ、精製モ
ノクローナル抗体（ＥＢＲ３−２モノクロ一ナル抗体お
よびＥＢＲ７−２モノクロ一ナル抗体）をそれぞれ個々
に含む２種の溶液を回収した。
実施例８
ハイブリドーマの形成に、ウィスターラットの代りにＢ
ａ！ｂ／ｃマウスを用いる以外は、実施例６及び実施例
７と同様の操作を繰り返して、精製モノクローナル抗体
（ＥＢＲ３−３モノクロ一ナル抗体およびＥＢＲ７−３
モノクロ一ナル抗体）を得ることができた。
ａ！ｂ／ｃマウスを用いる以外は、実施例６及び実施例
７と同様の操作を繰り返して、精製モノクローナル抗体
（ＥＢＲ３−３モノクロ一ナル抗体およびＥＢＲ７−３
モノクロ一ナル抗体）を得ることができた。
実施例９
常法に従って、Ａｆｉｇｅｌ １０と実施例２で得られ
たポリクローナル抗体の緩衝液溶液とを４℃で１昼夜接
触させる方法を用いて、ポリクローナル抗体を固定化し
たカラムを作製した。
たポリクローナル抗体の緩衝液溶液とを４℃で１昼夜接
触させる方法を用いて、ポリクローナル抗体を固定化し
たカラムを作製した。
このカラムで、実施例１で得たマウス胎児脳抽出液を処
理したところ、ＧＰ６８タンパク質を効率良く単離、精
製することができた。
理したところ、ＧＰ６８タンパク質を効率良く単離、精
製することができた。
実施例１０
実施例７で得た精製モノクローナル抗体（ＥＢＲ３−１
モノクロ一ナル抗体およびＥＢＲ７−１モノクロ一ナル
抗体）をそれぞれ用いる以外は実施例９と同様にしてマ
ウス胎児脳抽出液を処理したところ、ＧＰ６８タンパク
質を効率良く単離、精製することができた。
モノクロ一ナル抗体およびＥＢＲ７−１モノクロ一ナル
抗体）をそれぞれ用いる以外は実施例９と同様にしてマ
ウス胎児脳抽出液を処理したところ、ＧＰ６８タンパク
質を効率良く単離、精製することができた。
実施例１１
実施例１で得た精製タンパク質溶液（ＲＣＡアガロース
カラムからの溶出液を透析処理して得たもの）を、１バ
イフル中ＧＰ６８タンパク質の１００μｇが含まれるよ
うに充填し、凍結乾燥させた後、これにＴｗｅｅｎ ８
０を０．００１〜０．１％となるように加えた生理食塩
水溶液１．０ｍＩ２を加えて栓をして、ＧＰ６８タンパ
ク質を有する医薬組成物を得た実施例１２ Ｔｗｅｅｎ ８０の代りに、アルブミンを０．００１〜
１０％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外
は実施例１１と同様にしてＧＰ６８タンパク質を有する
医薬組成物を得た。
カラムからの溶出液を透析処理して得たもの）を、１バ
イフル中ＧＰ６８タンパク質の１００μｇが含まれるよ
うに充填し、凍結乾燥させた後、これにＴｗｅｅｎ ８
０を０．００１〜０．１％となるように加えた生理食塩
水溶液１．０ｍＩ２を加えて栓をして、ＧＰ６８タンパ
ク質を有する医薬組成物を得た実施例１２ Ｔｗｅｅｎ ８０の代りに、アルブミンを０．００１〜
１０％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外
は実施例１１と同様にしてＧＰ６８タンパク質を有する
医薬組成物を得た。
実施例１３
Ｔｗｅｅｎ ８０の代りに、マンニトールを０．０１〜
５％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は
実施例１１と同様にしてＧＰ６Ｂタンパク質を有する医
薬組成物を得た。
５％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は
実施例１１と同様にしてＧＰ６Ｂタンパク質を有する医
薬組成物を得た。
実施例１４
Ｔｗｅｅｎ ８０の代りに、グルコースを０．０１〜５
％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実
施例１１と同様にしてＧＰ６８タンパク質を有する医薬
組成物を得た。
％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実
施例１１と同様にしてＧＰ６８タンパク質を有する医薬
組成物を得た。
実施例１５〜１８
１バイアル中ＧＰ６８タンパク質の量を１ｍｇとなるよ
うに凍結乾燥を行なう以外は、実施例１１〜１４と同様
にしてＧＰ６Ｂタンパク質を有する医薬組成物をそれぞ
れ得た。
うに凍結乾燥を行なう以外は、実施例１１〜１４と同様
にしてＧＰ６Ｂタンパク質を有する医薬組成物をそれぞ
れ得た。
実施例１６
実施例７で得た２種の精製モノクローナル抗体を含む溶
液をそれぞれ個々に用い、ｌパイフル中杭ＧＰ６８タン
パク質モノクローナル抗体の１００μｇが含まれるよう
に充填し、凍結乾燥させた後、これにＴｗｅｅｎ ８０
を０．００１〜０．１％となるように加えた生理食塩水
溶液を加えて栓をして、抗ＧＰ６８タンパク質モノクロ
ーナル抗体を有する医薬組成物を得た。
液をそれぞれ個々に用い、ｌパイフル中杭ＧＰ６８タン
パク質モノクローナル抗体の１００μｇが含まれるよう
に充填し、凍結乾燥させた後、これにＴｗｅｅｎ ８０
を０．００１〜０．１％となるように加えた生理食塩水
溶液を加えて栓をして、抗ＧＰ６８タンパク質モノクロ
ーナル抗体を有する医薬組成物を得た。
実施例１７
Ｔｗｅｅｎ ８０の代りに、アルブミンを０．００１−
１（１％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以
外は実施例１６と同様にして抗ＧＰ６８タンパク質モノ
クローナル抗体を有する医薬組成物を得た。
１（１％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以
外は実施例１６と同様にして抗ＧＰ６８タンパク質モノ
クローナル抗体を有する医薬組成物を得た。
実施例１８
Ｔｗｅｅｎ ８０の代りに、マンニトールを０．０１〜
５％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は
実施例１６と同様にして抗ＧＰ６８タンパク質モノクロ
ーナル抗体を有する医薬組成物を得た。
５％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は
実施例１６と同様にして抗ＧＰ６８タンパク質モノクロ
ーナル抗体を有する医薬組成物を得た。
実施例１９
Ｔｗｅｅｎ ８０の代りに、グルコースを０．０１〜５
％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実
施例！６と同様にして抗ＧＰ６Ｂタンパク質モノクロー
ナル抗体を有する医薬組成物を得た。
％となるように加えた生理食塩水溶液を用いる以外は実
施例！６と同様にして抗ＧＰ６Ｂタンパク質モノクロー
ナル抗体を有する医薬組成物を得た。
実験例１
実施例２で得たポリクロナール抗体を用いたマウス胚お
よび生後１〜３０日のマウスの各臓器のトリトンＸ−１
００による抽出物のウェスタンプロット法による分析を
以下のようにして実施した。
よび生後１〜３０日のマウスの各臓器のトリトンＸ−１
００による抽出物のウェスタンプロット法による分析を
以下のようにして実施した。
まず、マウス（１３日胚）およびマウスの各臓器（脳、
神経節、心臓、肺、肝臓、胃腸管、肺臓等）を用い以下
のようにして処理し抽出物を得た。
神経節、心臓、肺、肝臓、胃腸管、肺臓等）を用い以下
のようにして処理し抽出物を得た。
試料を２％トリトンＸ−１００，５０μｇ ７ｍｆ２の
ＰＭＳＦを含む０．０ＩＭ）リス・塩酸緩衝液中でホモ
ジェナイズし、氷上で３０分間抽出を行なった。得られ
た抽出液を４０，０００ｒｐｍ 、−時間の遠心分離処
理し、得られた上清液をエタノール沈殿処理した。ここ
で得られた沈殿に含まれるタンパク質量をローリ−法に
より定量しておいた。
ＰＭＳＦを含む０．０ＩＭ）リス・塩酸緩衝液中でホモ
ジェナイズし、氷上で３０分間抽出を行なった。得られ
た抽出液を４０，０００ｒｐｍ 、−時間の遠心分離処
理し、得られた上清液をエタノール沈殿処理した。ここ
で得られた沈殿に含まれるタンパク質量をローリ−法に
より定量しておいた。
次に、レムリ（１，ａｅｍｍｌｉ）の方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ 、２２７ 。
ｅ 、２２７ 。
６８０〜６８５．１９７０ ］に従って、ＳＤＳ可溶化
溶液［９，５Ｍ尿素２％ＮＰ−４０（半井社製）、２％
アンホライン（ファルマシア社製）、５％メルカプトエ
タノール、０．２５％ＳＤＳ］に沈殿物が４ ｍｇ７ｍ
（１（Ｒ終濃度）となるように溶解し、これを５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％、１
０〜１５μβ／レーン、すなわち４０〜６０μｇタンパ
ク質／レーン）にかけた。
溶液［９，５Ｍ尿素２％ＮＰ−４０（半井社製）、２％
アンホライン（ファルマシア社製）、５％メルカプトエ
タノール、０．２５％ＳＤＳ］に沈殿物が４ ｍｇ７ｍ
（１（Ｒ終濃度）となるように溶解し、これを５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％、１
０〜１５μβ／レーン、すなわち４０〜６０μｇタンパ
ク質／レーン）にかけた。
泳動が終了した後、トウビンらの方法［Ｔｏｗｂｉｎｅ
ｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、、７６４３５０〜４３５４１９７９］に従って、上記
の分画された各タンパク質の位置を保ちながら、これら
をニトロセル−ロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
５ｃｈｕｅｌ１社製またはＢｉｏ−Ｒａｄ社製）にブロ
ッティングした（１アンペアで２時間）。
ｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、、７６４３５０〜４３５４１９７９］に従って、上記
の分画された各タンパク質の位置を保ちながら、これら
をニトロセル−ロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
５ｃｈｕｅｌ１社製またはＢｉｏ−Ｒａｄ社製）にブロ
ッティングした（１アンペアで２時間）。
ブロッティング終了後、ニトロセル−ロース膜を３％ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳと室温で１時
間接触させた６ その後、ニトロセル−ロース膜を１％トリトンＸ−１０
０を含むＰＢＳで洗浄後、これを実施例２で得た抗ＧＰ
６８タンパク質に対する抗体（１００〜５００倍に希釈
したラットあるいはウサギ血清）で２〜３時間室温で処
理した。
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳと室温で１時
間接触させた６ その後、ニトロセル−ロース膜を１％トリトンＸ−１０
０を含むＰＢＳで洗浄後、これを実施例２で得た抗ＧＰ
６８タンパク質に対する抗体（１００〜５００倍に希釈
したラットあるいはウサギ血清）で２〜３時間室温で処
理した。
更に、１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳでの１時間
の洗浄を数回行なった後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄ
ｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、 Ｃａｐｐｅ１社製）結
合抗ラットＩｇＧあるいは抗つサギＩｇＧマウスＩｇＧ
抗体（１００倍希釈）を含む溶液で１時間処理した。
の洗浄を数回行なった後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄ
ｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、 Ｃａｐｐｅ１社製）結
合抗ラットＩｇＧあるいは抗つサギＩｇＧマウスＩｇＧ
抗体（１００倍希釈）を含む溶液で１時間処理した。
次に、１％トリトンＸ−１０ｎを含むＰＢＳでの１時間
の洗浄を５〜６回行なった後、０．０５％の４−ｃｈｌ
ｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｏｌの４０ｍＭトリス・塩酸溶
液（ｐ）Ｉ７．６）で膜を処理し、灰褐色に染色された
バンドの出現を目視で観察した。
の洗浄を５〜６回行なった後、０．０５％の４−ｃｈｌ
ｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｏｌの４０ｍＭトリス・塩酸溶
液（ｐ）Ｉ７．６）で膜を処理し、灰褐色に染色された
バンドの出現を目視で観察した。
その結果マウス胚の各組織の抽出物では、どの抽出物か
らも染色されたスポットが検出された。
らも染色されたスポットが検出された。
例えば、１３．１５及び１７日胚の頭部、腹部及び尾部
の抽出物のいずれにおいても染色されたスポットが検出
された。
の抽出物のいずれにおいても染色されたスポットが検出
された。
一方、生後１〜７日のマウスの各組織・細胞からの抽出
物においても染色されたスポットが検出された。
物においても染色されたスポットが検出された。
例えば、誕生直後のマウスの頭部、腹部及び尾部の抽出
物のいずれにおいても染色されたスポットが検出され、
更に生後７日目のマウスの脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、
皮膚、肺臓、筋肉からの抽出物のいずれにおいても染色
されたスポットが検出された。このうち、肝臓、心臓の
染色の程度は強く、脳はびまん性の弱い染色を示した。
物のいずれにおいても染色されたスポットが検出され、
更に生後７日目のマウスの脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、
皮膚、肺臓、筋肉からの抽出物のいずれにおいても染色
されたスポットが検出された。このうち、肝臓、心臓の
染色の程度は強く、脳はびまん性の弱い染色を示した。
これに対して、生後１週間を越えたマウスの各組織・細
胞からの抽出物では染色されたスポットは全く検出され
なかった。
胞からの抽出物では染色されたスポットは全く検出され
なかった。
例えば、生後１４日、２１日のマウスの脳、肝臓、腎臓
、肺、心臓、皮膚、肺臓、筋肉からの抽出物、及びマウ
ス成体の脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、皮膚、肺臓、筋肉
、子宮、を髄からの抽出物のいずれにおいても染色され
たスポットは検出されなかった。
、肺、心臓、皮膚、肺臓、筋肉からの抽出物、及びマウ
ス成体の脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、皮膚、肺臓、筋肉
、子宮、を髄からの抽出物のいずれにおいても染色され
たスポットは検出されなかった。
従って、ＧＰ６８タンパク質は、増殖あるいは分化の極
めて盛んな胎児および生後間もない時期に特異的に出現
する生物活性を有するタンパク質であると考えられる。
めて盛んな胎児および生後間もない時期に特異的に出現
する生物活性を有するタンパク質であると考えられる。
実験例２
マウス！５日胚をドライアイスアセトン中で急冷して、
クリオスタットで切片を切り出し、これらに実施例７で
得たＥＢＲ３−１モノクロ一ナル抗体およびＥＢＲ７−
１モノクロ一ナル抗体を含む溶液のそれぞれの１０倍希
釈液を個々に加え、更にこれらにＨＲＰ結合抗ラッうＩ
ｇＧマウスＩｇＧ抗体を１〜２週間反応させ、洗浄後染
色する臓器を光学顕微鏡で観察した。また、実施例６に
示したＡＢＣを用いて更に観察した。
クリオスタットで切片を切り出し、これらに実施例７で
得たＥＢＲ３−１モノクロ一ナル抗体およびＥＢＲ７−
１モノクロ一ナル抗体を含む溶液のそれぞれの１０倍希
釈液を個々に加え、更にこれらにＨＲＰ結合抗ラッうＩ
ｇＧマウスＩｇＧ抗体を１〜２週間反応させ、洗浄後染
色する臓器を光学顕微鏡で観察した。また、実施例６に
示したＡＢＣを用いて更に観察した。
その結果、ＥＢＲ３−１モノクロ一ナル抗体では神経お
よび平滑筋が染り、またＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗
体では脳、神経節、肝臓が染ったことが観察された。
よび平滑筋が染り、またＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗
体では脳、神経節、肝臓が染ったことが観察された。
実験例３
経日的にマウス胚の脳細胞を取り出し、Ｍｍ培養を行な
った。これに実施例７で得られたＥＢＲ３−１モノクロ
一ナル抗体およびＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗体を加
え、脳細胞の活動を観察した。
った。これに実施例７で得られたＥＢＲ３−１モノクロ
一ナル抗体およびＥＢＲ７−１モノクロ一ナル抗体を加
え、脳細胞の活動を観察した。
実験例４
実施例２で得た抗マウスＧＰ６８タンパク質ウサギ抗血
清及び抗ヒトα−フェトプロティンウサギ抗血清をそれ
ぞれ用いて、ＡＢＣ法により各種癌患者の癌組織の染色
を行なった。
清及び抗ヒトα−フェトプロティンウサギ抗血清をそれ
ぞれ用いて、ＡＢＣ法により各種癌患者の癌組織の染色
を行なった。
得られた結果を表ＩＡ及び表１Ｂに示す、なお、評価結
果における、「−」は染色せず、「十−」は弱いかつび
まん性の染色、「＋」は中程度の染色、「＋＋」は顕著
だが「＋＋＋」よりは弱い染色、「＋＋＋」は顕著な染
色を示す。
果における、「−」は染色せず、「十−」は弱いかつび
まん性の染色、「＋」は中程度の染色、「＋＋」は顕著
だが「＋＋＋」よりは弱い染色、「＋＋＋」は顕著な染
色を示す。
一方、同様に行なったマウス線維芽細胞、健常人の各細
胞、及び癌患者の癌組織以外の正常組繊細胞では何ら染
色されず、抗マウスＧＰ６８タンパク質ウサギ抗血清は
、癌組織抗原特異的に反応する抗体を有することが示さ
れた。
胞、及び癌患者の癌組織以外の正常組繊細胞では何ら染
色されず、抗マウスＧＰ６８タンパク質ウサギ抗血清は
、癌組織抗原特異的に反応する抗体を有することが示さ
れた。
また表ＩＡおよび表ＩＢに示されるように、抗ＧＰ６８
タンパク質ウサギ抗血清は、抗ヒトα−フェトプロティ
ンウサギ抗血清が染色しなｌ／）癌患者組織を染色し、
かつ染色強度も後者に比べて、弱いものはなく、同等か
それ以上の強度を示すことが歴然であり、癌診断薬の成
分として有用性の高いものであることがわかった。
タンパク質ウサギ抗血清は、抗ヒトα−フェトプロティ
ンウサギ抗血清が染色しなｌ／）癌患者組織を染色し、
かつ染色強度も後者に比べて、弱いものはなく、同等か
それ以上の強度を示すことが歴然であり、癌診断薬の成
分として有用性の高いものであることがわかった。
表ＩＡ
表ＩＢ
〔発明の効果ｊ
本発明により、脳・神経系の発生分化の過程で時期特異
的に消長し、その発生分化の過程で、重要な役割を果す
可能性のあるＧＰ６８タンパク質が単離された状態で提
供された。
的に消長し、その発生分化の過程で、重要な役割を果す
可能性のあるＧＰ６８タンパク質が単離された状態で提
供された。
また、本発明の精製分離方法により十分な量の純度の高
いＧＰ６８タンパク質を得ることが可能となった。
いＧＰ６８タンパク質を得ることが可能となった。
更に、本発明のＧＰ６８タンパク質に対する抗体を用い
ることにより、該抗体を用いた各種研究の促進が容易と
なる。
ることにより、該抗体を用いた各種研究の促進が容易と
なる。
本発明のＧＰ６８タンパク質は、受精から生後１週間ま
での特定な時期にしか存在せず、成体においてはその生
産が欠失していることから、該タンパク質を成体に投与
して新たな機能の発現が期待できる。
での特定な時期にしか存在せず、成体においてはその生
産が欠失していることから、該タンパク質を成体に投与
して新たな機能の発現が期待できる。
また、本発明のＧＰ６８タンパク質は生体各器官、組織
、細胞、膜の発育促進、遺伝的、器質的な各臓器・組織
の成長・発育の不全の解消・回復、脳・神経系の再生・
修復などの効果が期待できる。
、細胞、膜の発育促進、遺伝的、器質的な各臓器・組織
の成長・発育の不全の解消・回復、脳・神経系の再生・
修復などの効果が期待できる。
本発明によりＧＰ６８タンパク質に対するポリクローナ
ル抗体およびモノクローナル抗体が得られたことによっ
て、ＧＰ６８タンパク質をコードするｍ−ＲＮＡおよび
ｃ−ＤＮＡの調製が容易となり、遺伝子組み換え技術を
用いた例えば大腸菌、枯草菌、酵母、各種動物細胞を宿
主としたＧＰ６８タンパク質の生産への道がひらかれた
。
ル抗体およびモノクローナル抗体が得られたことによっ
て、ＧＰ６８タンパク質をコードするｍ−ＲＮＡおよび
ｃ−ＤＮＡの調製が容易となり、遺伝子組み換え技術を
用いた例えば大腸菌、枯草菌、酵母、各種動物細胞を宿
主としたＧＰ６８タンパク質の生産への道がひらかれた
。
ＧＰ６８タンパク質あるいはそれの活性中心ペプチドお
よびそれらに特異的な抗体は、各種箱・神経系疾患の治
療剤、予防剤、また各種成長・発育促進剤、各種成長不
全治療剤あるいは異常増殖、肺瘍、癌などの医薬、動物
薬、または脳・神経系疾患、各臓器・組織の成長・発育
不全あるいは異常増殖および癌などの疾患のマーカー、
更には診断薬としての有用性が期待される。
よびそれらに特異的な抗体は、各種箱・神経系疾患の治
療剤、予防剤、また各種成長・発育促進剤、各種成長不
全治療剤あるいは異常増殖、肺瘍、癌などの医薬、動物
薬、または脳・神経系疾患、各臓器・組織の成長・発育
不全あるいは異常増殖および癌などの疾患のマーカー、
更には診断薬としての有用性が期待される。
手続補
正
書
（自発）
昭和８３年
９月１４日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）受精から生後１週間までの生体に特異的に見い出さ
れ、分子量約６８，０００、等電点５．４〜５．６であ
ることを特徴とするタンパク質。 ２）前記生体がマウスである請求項１記載のタンパク質
。 ３）受精から生後１週間までのマウス組織あるいは細胞
の抽出液から、レクチンを親和試薬として用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーにより単離されたものであ
る請求項１記載のタンパク質。 ４）受精から生後１週間までの生体の組織あるいは細胞
の抽出液をレクチンを担持した担体と接触させる過程と
、該担体に吸着した成分から分子量約６８，０００、等
電点５．４〜５．６であるタンパク質を選択的に溶出し
単離する過程とを含むことを特徴とするタンパク質の製
造方法。 ５）前記抽出液が、受精から生後１週間までのマウス組
織または細胞の抽出液である請求項４記載の製造方法。 ６）受精から生後１週間までの生体に特異的に見い出さ
れ、分子量約６８，０００、等電点５．４〜５．６であ
ることを特徴とするタンパク質を動物に免疫する過程を
経て得られることを特徴とする該タンパク質に対するポ
リクローナル抗体。 ７）前記生体がマウスである請求項６記載のポリクロー
ナル抗体。 ８）受精から生後１週間までの生体に特異的に見い出さ
れ、分子量約６８，０００、等電点５．４〜５．６であ
るタンパク質で免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細胞株と
の融合により得られ、該タンパク質に特異的であるモノ
クローナル抗体生産能を有することを特徴とするハイブ
リドーマ。 ９）前記生体がマウスである請求項８記載のハイブリド
ーマ。 １０）受精から生後１週間までの生体に特異的に見い出
され、分子量約６８，０００、等電点５．４〜５．６で
あるタンパク質に特異的であることを特徴とするモノク
ローナル抗体。 １１）受精から生後１週間までの生体に特異的に見い出
され、分子量約６８，０００、等電点５．４〜５．６で
あるタンパク質で免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細胞株
との融合により得られたハイブリドーマにより生産され
たものである請求項１０記載のモノクローナル抗体。 １２）前記生体がマウスである請求項１１記載のモノク
ローナル抗体。 １３）受精から生後１週間までの生体に特異的に見い出
され、分子量約６８，０００、等電点５．４〜５．６で
あるタンパク質で免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細胞株
とを融合させることによりハイブリドーマを得る過程（
Ａ）と、得られたハイブリドーマから前記タンパク質に
対するモノクローナル抗体の生産能を有するハイブリド
ーマを選択し、該選択されたハイブリドーマに前記モノ
クローナル抗体を生産させる過程（Ｂ）とを有すること
を特徴とする前記タンパク質に対するモノクローナル抗
体の製造方法。 １４）前記過程（Ｂ）が、前記モノクローナル抗体生産
能を有するハイブリドーマを組織培養液中で培養し、該
培養液内に前記モノクローナル抗体を生産、備蓄させる
過程からなり、その後、該培養液から前記モノクローナ
ル抗体を分離する請求項１３記載のモノクローナル抗体
の製造方法。 １５）前記過程（Ｂ）が、前記モノクローナル抗体生産
能を有するハイブリドーマを、ヌードラットまたは免疫
抑制されたラットの腹腔内に移植してその腹水癌化を誘
発し、該腹水中に該モノクローナル抗体を生産、備蓄さ
せる過程からなり、その後、該腹水から前記モノクロー
ナル抗体を分離する請求項１３記載のモノクローナル抗
体の製造方法。 １６）前記生体がマウスである請求項１３〜１５のいず
れかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。 １７）請求項１記載のタンパク質に対する抗体を担持し
た担体に、請求項１記載のタンパク質を含む混合物を接
触させる過程と、該担体に吸着した成分から該タンパク
質を選択的に溶出し、単離する過程とを含むことを特徴
とするタンパク質の分離方法。 １８）前記抗体が請求項６記載のポリクローナル抗体で
ある請求項１７に記載の分離方法。 １９）前記抗体が請求項１０記載のモノクローナル抗体
である請求項１７に記載の分離方法。 ２０）請求項１記載のタンパク質を含有することを特徴
とする医薬組成物。 ２１）請求項６記載の抗体を含有することを特徴とする
医薬組成物。 ２２）請求項１０記載の抗体を含有することを特徴とす
る医薬組成物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63205690A JP2690956B2 (ja) | 1987-08-22 | 1988-08-20 | 生体由来のタンパク質 |
| DE3885735T DE3885735T2 (de) | 1987-08-22 | 1988-08-22 | Von einem lebenden körper abgeleitetes protein. |
| EP88907375A EP0331743B1 (en) | 1987-08-22 | 1988-08-22 | Protein derived from living body |
| PCT/JP1988/000833 WO1989001947A1 (en) | 1987-08-22 | 1988-08-22 | Protein derived from living body |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-207403 | 1987-08-22 | ||
| JP20740387 | 1987-08-22 | ||
| JP63205690A JP2690956B2 (ja) | 1987-08-22 | 1988-08-20 | 生体由来のタンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03173899A true JPH03173899A (ja) | 1991-07-29 |
| JP2690956B2 JP2690956B2 (ja) | 1997-12-17 |
Family
ID=26515202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63205690A Expired - Lifetime JP2690956B2 (ja) | 1987-08-22 | 1988-08-20 | 生体由来のタンパク質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0331743B1 (ja) |
| JP (1) | JP2690956B2 (ja) |
| DE (1) | DE3885735T2 (ja) |
| WO (1) | WO1989001947A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010510773A (ja) | 2006-11-24 | 2010-04-08 | アグリカルチュラル バイオテクノロジー センター | 免疫応答が向上したトランスジェニック動物及びその作製方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5763575A (en) | 1993-07-26 | 1998-06-09 | Cor Therapeutics, Inc. | Agonist and antagonist peptides of the C140 receptor |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60100597A (ja) * | 1983-11-05 | 1985-06-04 | Mitsui Pharmaceut Inc | タンパク質 |
| WO1993013089A1 (en) * | 1985-01-25 | 1993-07-08 | Urban Frank J | Macrocyclic polyether carboxylic acids |
| JPS61275221A (ja) * | 1985-05-30 | 1986-12-05 | Mitsui Pharmaceut Inc | タンパク質 |
-
1988
- 1988-08-20 JP JP63205690A patent/JP2690956B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-22 WO PCT/JP1988/000833 patent/WO1989001947A1/ja active IP Right Grant
- 1988-08-22 EP EP88907375A patent/EP0331743B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-22 DE DE3885735T patent/DE3885735T2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010510773A (ja) | 2006-11-24 | 2010-04-08 | アグリカルチュラル バイオテクノロジー センター | 免疫応答が向上したトランスジェニック動物及びその作製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0331743A1 (en) | 1989-09-13 |
| DE3885735T2 (de) | 1994-07-07 |
| DE3885735D1 (de) | 1993-12-23 |
| JP2690956B2 (ja) | 1997-12-17 |
| EP0331743A4 (en) | 1990-06-27 |
| WO1989001947A1 (en) | 1989-03-09 |
| EP0331743B1 (en) | 1993-11-18 |
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