RS61010B1 - Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije protiv folr1 i cd3 - Google Patents

Description

OPIS

Lista sekvenci

Instant aplikacija sadrži listu sekvenci koja je poslata elektronskim putem u ASCII formatu. Navedena ASCII kopija, kreirana 9. novembra 2015. godine, se naziva 32186_SL.txt i veličine je 445.570 bajtova.

Oblast predmetnog pronalaska

Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na bispecifične antigen vezujuće molekule za aktiviranje T ćelija, posebno na bispecifična antitela koja ciljaju CD3 i folatni receptor 1 (FolR1). Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju takve bispecifične antigen vezujuće molekule, i na vektore i ćelije domaćina koji sadrže takve polinukleotide. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metode za proizvodnju bispecifičnih antigen vezujućih molekula predmetnog pronalaska, i na metode za primenu tih bispecifičnih antigen vezujućih molekula u lečenju bolesti.

Osnova

Selektivno uništenje pojedinačne ćelije ili specifičnog tipa ćelije je često poželjno u različitim kliničkim situacijama. Na primer, primarni cilj terapije za rak je da ciljano uništi tumorske ćelije, a da zdrave ćelije i tkiva ostavi netaknute i neoštećene.

Zanimljiv način da se to postigne je indukovanjem imunog odgovora protiv tumora da bi imunske efektorske ćelije, kao što su ćelije prirodne ubice (NK) ili citotoksični T limfociti (CTL), napale i uništile tumorske ćelije. CTL ćelije predstavljaju najsnažnije efektorske ćelije imunskog sistema, ali se ne mogu aktivirati efektorskim mehanizmom posredstvom Fc domena konvencionalnih terapijskih antitela.

U tom smislu, bispecifična antitela dizajnirana da se vežu jednim „krakom“ za površinski antigen na ciljnim ćelijama, i drugim „krakom“ za aktivacionu, nepromenljivu komponentu kompleksa T-ćelijskih receptora (TCR), postala su interesantna poslednjih godina. Istovremeno vezivanje takvog antitela za oba cilja će izazvati privremenu interakciju između ciljne ćelije i T ćelije, uzrokujući aktivaciju bilo koje citotoksične T ćelije, a nakon toga i lizu ciljne ćelije. Tako se imunski odgovor preusmerava na ciljne ćelije i ne zavisi od prezentacije peptidnog antigena od strane ciljne ćelije ili specifičnosti T ćelije, kao što je to relevantno za normalnu MHC-ograničenu aktivaciju CTL-a. U ovom kontekstu, ključno je da se CTL aktiviraju samo kada ciljna ćelija za njih predstavlja bispecifično antitelo, tj. imitira se imunološka sinapsa. Naročito su poželjna bispecifična antitela koja ne zahtevaju pretkondicioniranje limfocita ili kostimulaciju kako bi se izazvala efikasna liza ciljnih ćelija.

FOLR1 se eksprimira na epitelnim tumorskim ćelijama različitog porekla, npr. raku jajnika, raku pluća, raku dojke, raku bubrega, raku debelog creva, raku endometrijuma. Opisano je nekoliko pristupa ciljanja FOLR1 sa terapijskim antitelima, kao što su farletuzumab, konjugati lekova sa antitelima ili adoptivna T ćelijska terapija za snimanje tumora (Kandalaft et al., J Transl Med.2012 Aug 3;10:157. doi: 10.1186/1479-5876-10-157; van Dam et al., Nat Med. 2011 Sep 18;17(10):1315-9. doi: 10.1038/nm.2472; Cliftonet al., Hum Vaccin. 2011 Feb;7(2): 183-90. Epub 2011 Feb 1; Kelemen et al., Int J Cancer. 2006 Jul 15; 119(2):243-50; Vaitilingam et al., J Nucl Med. 2012 Jul;53(7); Teng et al., 2012 Aug;9(8):901-8. doi: 10.1517/17425247.2012.694863. Epub 2012 Jun 5. Učinjeni su neki pokušaji da se na tumore pozitivne na folatni receptor cilja konstruktima koji ciljaju folatni receptor i CD3 (Kranz et al., Proc Natl Acad Sci USA. Sep 26, 1995; 92(20): 9057-9061; Roy et al., Adv Drug Deliv Rev. 2004 Apr 29;56(8): 1219-31; Huiting Cui et al Biol Chem. Aug 17, 2012; 287(34): 28206-28214; Lamers et al., Int. J. Cancer. 60(4):450 (1995); Thompson et al., MAbs. 2009 Jul-Aug;1(4):348-56. Epub 2009 Jul 19; Mezzanzanca et al., Int. J. Cancer, 41, 609-615 (1988). WO2014151910 opisuje heteromerična bispecifična antitela. WO2015048272 opisuje dimerna bispecifična antitela. Međutim, dosadašnji pristupi imaju mnoge nedostatke. Do sada korišćeni molekuli nisu mogli brzo i pouzdano da se proizvedu jer su zahtevali hemijsko unakrsno povezivanje. Slično tome, hibridni molekuli ne mogu da se u velikoj meri proizvedu kao humani proteini i potrebno je koristiti proteine pacova, miševa ili drugih proteina koji su visoko imunogeni kada se daju ljudima i stoga imaju ograničenu terapijsku vrednost. Dalje, mnogi postojeći molekuli su zadržali vezivanje za FcgR.

Stoga ostaje potreba za novim, poboljšanim bispecifičnim antitelima za ciljanu imunoterapiju posredstvom T ćelija. Predmetni pronalazak predviđa bispecifične antigen vezujuće molekule, dizajnirane za ciljanu aktivaciju T ćelija, naročito bispecifične antigen vezujuće molekule koji su pogodni kao efikasni i bezbedni terapijski lekovi koji mogu brzo da se proizvedu i doziraju.

Rezime predmetnog pronalaska

Predmet pronalaska je definisan u priloženim patentnim zahtevima. U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3 i koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO:39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34; i

(ii) drugi antigen vezujući deo, sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1);

naznačen time što antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 obuhvata:

a) CDR1 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:16, CDR2 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:17, CDR3 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:18, CDR1 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:32, CDR2 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:33, CDR3 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:34;

b) CDR1 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:8, CDR2 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:56, CDR3 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:57, CDR1 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:59, CDR2 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:60, i CDR3 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:65: ili

c) CDR1 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:16, CDR2 teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 275, CDR3 teškog lanca sekvence SEQ ID NO:315, CDR1 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:32, CDR2 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:33, i CDR3 lakog lanca sekvence SEQ ID NO:34.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži prvi antigen vezujući deo koji sadrži varijabilni teški lanac, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži (iii) treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1. U jednoj realizaciji, drugi i treći antigen vezujući deo, koji su sposobni da se specifično vezuju za FolR1, sadže identične sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDR) teškog lanca i lakog lanca. U jednoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je identičan sa drugim antigen vezujućim delom.

U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama, ili drugi ili treći antigen vezujući deo je obavezno molekul Fab. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama, dodatno sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno udruživanje. U nekim realizacijama, prvi antigen vezujući deo i drugi antigen vezujući deo su spojeni na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U nekim realizacijama, treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, opciono preko peptidnog veznika.

U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama, antigen vezujući deo koji je sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabranu iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31. U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabranu iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabranog iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65. U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencuSEQ ID NO: 64.

U drugom aspektu, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabranu iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 50 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54. U jednom aspektu, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 sadrži (a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR-H1) teškog lanca 1 SEQ ID NO: 8; (b) aminokiselinsku sekvencu CDR-H2 SEQ ID NO: 9; (c) aminokiselinsku sekvencu CDR-H3 SEQ ID NO: 50; (d) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR-L1) lakog lanca 1 SEQ ID NO: 52; (e) aminokiselinsku sekvencu CDR-L2 SEQ ID NO: 53, i (f) aminokiselinsku sekvencu CDR-L3 SEQ ID NO: 54. U jednom aspektu, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51.

U drugoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabranu iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 275 and SEQ ID NO: 315 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34. U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 obuhvata (a) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR-H1) teškog lanca 1 SEQ ID NO: 16; (b) aminokiselinsku sekvencu CDR-H2 SEQ ID NO: 275; (c) aminokiselinsku sekvencu CDR-H3 SEQ ID NO: 315; (d) aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR-L1) lakog lanca 1 SEQ ID NO: 32; (e) aminokiselinsku sekvencu CDR-L2 SEQ ID NO: 33, i (f) aminokiselinsku sekvencu CDR-L3 SEQ ID NO: 34. U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 sadrži varijabilni teški lanac (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 274, i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama vezuje se za humani FolR1. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama vezuje se za FolR1 čoveka i FolR1 cinomolgus majmuna. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama vezuje se za FolR1 čoveka, FolR1 cinomolgus majmuna i FolR1 miša. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama vezuje se za FolR1 čoveka, FolR1 cinomolgus majmuna, ali ne i FolR1 miša.

U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, prvi antigen vezujući deo je unakrsno izmenjeni molekul Fab, pri čemu su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija obuhvata ne više od jednog antigen vezujućeg dela sposobnog da se specifično vezuje za CD3. U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina. U jednoj realizaciji, Fc domen je imunoglobulin klase IgG, posebno IgG1ili IgG4, Fc domena. U jednoj realizaciji, Fc domen je humani Fc domen.

U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, Fc domen obuhvata modifikaciju koja promoviše udruživanje prve i druge podjedinice Fc domena. U jednoj realizaciji, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domen je aminokiselinski deo zamenjen aminokiselinskim delom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domen je aminokiselinski deo zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice u koju izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira. U jednoj realizaciji, Fc domen obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, u poređenju sa prirodnim IgG1Fc domenom. U jednoj realizaciji, svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (Kabatova numeracija). U jednoj realizaciji, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednoj realizaciji, efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).

U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula prema bilo kojoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul indukuje in vitro proliferaciju humanih CD3 pozitivnih T ćelija. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija. U jednoj realizaciji, T ćelija je CD8 pozitivna T ćelija. U jednoj realizaciji, tumorska ćelija koja eksprimira FolR1 je Hela, Skov-3, HT-29 ili HRCEpiC ćelija. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 između oko 36 pM i oko 39573 pM nakon 24 sata. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 od oko 36 pM nakon 24 sata. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 od oko 178,4 pM nakon 24 sata. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 od oko 134,5 pM ili više nakon 48 sata.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija indukuje ushodnu regulaciju ekspresije na površini ćelije najmanje jednog od CD25 i CD69 na T ćeliji, koja je izmerena protočnom citometrijom. U jednoj realizaciji, T ćelija je CD4 pozitivna T ćelija ili CD8 pozitivna T ćelija. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 5,36 pM do oko 4 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje FolR1 čoveka i cinomolgusa sa prividnom KDod oko 4 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje mišji FolR1 sa prividnom KDod oko 1,5 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 1000 nM.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija je specifičan za FolR1 i ne vezuje se za FolR2 ili FolR3. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija ima vrednost afiniteta (jednovalentnog vezivanja) od 1 µM ili više. U jednoj realizaciji, vrednost afiniteta je oko 1,4 µM za humani FolR1. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija ima vrednost aviditeta (dvovalentnog vezivanja) od oko 1-100nM ili manje. U jednoj realizaciji, vrednost aviditeta je oko 10 nM ili manje. U jednoj realizaciji, vrednost aviditeta je 10 nM.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija vezuje se za FolR1 koji je eksprimiran na humanim tumorskim ćelijama. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija vezuje se za konformacioni epitop na humanom FolR1. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija ne vezuje se za humani folatni receptor 2 (FolR2) ili za humani folatni receptor 3 (FolR3). U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, antigen vezujući deo se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiseline od 25 do 234 humanog FolR1 (SEQ ID NO:227). U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, antigen vezujući deo FolR1 se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:227, 230 i 231, pri čemu se antigen vezujući deo FolR1 ne vezuje za polipeptid FolR koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:228 i 229.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak predviđa bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži prvi antigen vezujući deo, sposoban da se specifično vezuje za CD3 i drugi antigen vezujući deo, sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), pri čemu se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje za isti epitop na humanom FolR1 kao prvo referentno antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 274, i varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 31; i pri čemu se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje za isti epitop na humanom CD3 kao drugo referentno antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 36, i varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 31.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji je konkurent u vezivanju za humani FolR1 antitelu koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 274, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 31, pri čemu se konkurentnost u vezivanju meri upotrebom testa površinske plazmonske rezonance.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, pri čemu antigen vezujući molekul sadrži prvi, drugi, treći, četvrti i peti polipeptidni lanac koji formira prvi, drugi i treći antigen vezujući deo, pri čemu je prvi antigen vezujući deo sposoban za vezivanje na CD3 a drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni za vezivanje na folatni receptor 1 (FolR1), pri čemu a) prvi i drugi polipeptidni lanac sadrži, u smeru od amino (N)-terminalnog kraja do karboksil (C)-terminalnog kraja, VLD1 i CLD1; b) treći polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, VLD2 i CH1D2; c) četvrti polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, VHD1, CH1D1, CH2D1 i CH3D1; d) peti polipeptidni lanac sadrži VHD1, CH1D1, VHD2, CLD2, CH2D2 i CH3D2; pri čemu je VLD1 prvi varijabilni domen lakog lanca, VLD2 je drugi varijabilni domen lakog lanca, CLD1 je prvi konstantni domen lakog lanca, CLD2 je drugi konstantni domen lakog lanca, VHD1 je prvi varijabilni domen teškog lanca, VHD2 je drugi varijabilni domen teškog lanca, CH1D1 je prvi konstantni domen teškog lanca 1, CH1D2 je drugi konstantni domen teškog lanca 1, CH2D1 je prvi konstantni domen teškog lanca 2, CH2D2 je drugi konstantni domen teškog lanca 2, CH3D1 je prvi konstantni domen teškog lanca 3, i CH3D2 je drugi konstantni domen teškog lanca 3.

U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, (i) treći polipeptidni lanac i VHD2 i CLD2 petog polipeptidnog lanca formiraju prvi antigen vezujući deo sposoban za vezivanje na CD3; (ii) prvi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 četvrtog polipeptidnog lanca formiraju drugi vezujući deo sposoban za vezivanje na FolR1; i (iii) drugi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 petog polipeptidnog lanca formiraju treći vezujući deo sposoban za vezivanje na FolR1. U jednoj realizaciji, CH2D1, CH3D1, CH2D2 i CH3D2 formiraju Fc domen imunoglobulina klase IgG. U jednoj realizaciji, Fc domen je humani Fc domen. U jednoj realizaciji, Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše udruživanje prve i druge podjedinice Fc domena. U jednoj realizaciji, CH3D2 sadrži aminokiselinski deo koji ima veći volumen bočnog lanca, koji može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3D1. U jednoj realizaciji, Fc domen sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, u poređenju sa prirodnim IgG1Fc domenom. U jednoj realizaciji, svaka podjedinica Fc domena obuhvata tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju najmanje jedno vezivanje za Fc receptor i efektorsku funkciju, pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G, u skladu sa Kabatovom numeracijom. U jednoj realizaciji, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro proliferaciju humanih CD3 pozitivnih T ćelija. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija. U jednoj takvoj realizaciji, tumorska ćelija koja eksprimira FolR1 je Hela, Skov-3, HT-29 ili HRCEpiC ćelija. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 između oko 36 pM i oko 39573 pM nakon 24 sata. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 od oko 36 pM nakon 24 sata. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 od oko 178,4 pM nakon 24 sata. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 od oko 134,5 pM ili više nakon 48 sata. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje ushodnu regulaciju ekspresije na površini ćelije najmanje jednog od CD25 i CD69 na T ćeliji, koja je izmerena protočnom citometrijom. U jednoj takvoj realizaciji, T ćelija je CD4 pozitivna T ćelija ili CD8 pozitivna T ćelija. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji

1

aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 5,36 pM do oko 4 nM. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje FolR1 čoveka i cinomolgusa sa prividnom KDod oko 4 nM. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje mišji FolR1 sa prividnom KDod oko 1,5 nM. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 1000 nM. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za FolR1 koji je eksprimiran na humanim tumorskim ćelijama. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za konformacioni epitop na humanom FolR1. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ne vezuje se za humani folatni receptor 2 (FolR2) ili za humani folatni receptor 3 (FolR3). U jednoj od navedenih realizacija, antigen vezujući deo se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiseline od 25 do 234 humanog FolR1 (SEQ ID NO:227). U jednoj od navedenih realizacija, antigen vezujući deo FolR1 se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:227, 230 i 231, pri čemu se antigen vezujući deo FolR1 ne vezuje za polipeptid FolR koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:228 i 229. U jednoj od navedenih realizacija, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je humanizovani ili himerni molekul. U jednoj od navedenih realizacija, VHD2 i CH1D1 su povezani peptidnim linkerom.

U jednom od navedenih aspekata bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, prvi i drugi polipeptidni lanac sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:230. U jednoj od navedenih realizacija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86. U jednom od navedenih aspekata bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309. U jednom od navedenih aspekata bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, peti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308. U jednom od navedenih aspekata bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, prvi i drugi polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:230; treći polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:86; četvrti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309; i peti polipeptidni lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308.

U jednom aspektu, otkriće predviđa bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenoj realizaciji dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:230 i SEQ ID NO:86.

U jednom aspektu, predmetna objava predviđa izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:308. U jednom aspektu, predmetna objava predviđa izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenoj realizaciji dalje sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:277 i SEQ ID NO:35.

U jednom aspektu, predmetna objava predviđa izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:277. U jednom aspektu, predmetna objava predviđa izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj realizaciji predmetnog pronalaska.

U jednom aspektu, predmetna objava predviđa izolovani polipeptid koji se kodira polinukleotidom navedene realizacije. U drugom aspektu, predmetni pronalazak predviđa vektor, posebno ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj realizaciji predmetnog pronalaska. U drugom aspektu, predmetni pronalazak predviđa ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid ili vektor prema bilo kojoj realizaciji predmetnog pronalaska.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa metodu za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, sposobnog da se specifično vezuje za CD3 i antigen ciljne ćelije, koja obuhvata korak a) uzgajanja ćelije domaćina prema navedenim realizacijama pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i korak b) izolovanja bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji je proizveden metodom prema navedenoj realizaciji.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa farmaceutski preparat koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija ili farmaceutski preparat prema bilo kojoj od navedenih realizacija koji se upotrebljava kao lek.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija ili farmaceutski preparat prema bilo kojoj od navedenih realizacija, koji se primenjuje u lečenju bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno. U nekim realizacijama, bolest je rak. U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, za proizvodnju leka za lečenje bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa metodu za lečenje bolesti kod pojedinca, koja podrazumeva davanje datom pojedincu terapeutski efikasne količine preparata koji sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, u farmaceutski prihvatljivom obliku. U nekim realizacijama, navedena bolest je rak.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak predviđa metodu za indukovanje lize ciljne ćelije, koja se sastoji od kontakta na ciljnoj ćelijiji koji pravi bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija u prisustvu T ćelije.

Kratak opis slika

Slike 1A-I ilustruju primere konfiguracija bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije (TCB) predmetnog pronalaska. Svi konstrukti, izuzev formata kapalambda (Sl.1I), imaju P329G LALA mutacije i sadrže Fc fragmente tipa „dugme u rupici“ sa modifikacijama tipa „dugme u rupici“. (Sl. 1A) Ilustracija „FolR1 TCB 2+1 invertovani (zajednički laki lanac)“. Ligand FolR1 se na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab spaja sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koji sadrži modifikaciju „dugmeta“. Ovi konstrukti nisu ukršteni i imaju tri puta isti VLCL laki lanac. (Sl.1B) Ilustracija „FolR1 TCB 1+1 od glave do repa (zajednički laki lanac)“. Ovi konstrukti nisu ukršteni i imaju dva puta isti VLCL laki lanac. (Sl. 1C) Ilustracija „FolR1 TCB 1+1 klasičan (zajednički laki lanac)“. Ovi konstrukti nisu ukršteni i imaju dva puta isti VLCL laki lanac. (Sl.1D) Ilustracija „FolR1 TCB 2+1 klasičan (zajednički laki lanac)“. Ligand CD3 se na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab spaja sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koji sadrži modifikaciju „dugmeta“. Ovi konstrukti nisu ukršteni i imaju tri puta isti VLCL laki lanac. (Sl. 1E) Ilustracija „FolR1 TCB 2+1 klasičan crossfab“. Ovi konstrukti sadrže Ck-VH lanac za ligand CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH. Ligand CD3 se na C-terminalnom

1

kraju teškog lanca Fab spaja sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koji sadrži modifikaciju „dugmeta“. (Sl. 1F) Ilustracija „FolR1 TCB 2+1 invertovani crossfab“. Ovi konstrukti obuhvataju Ck-VH lanac za ligand CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH. Ligand FolR1 se na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab spaja sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena koji sadrži modifikaciju „dugmeta“. (Sl. 1G) Ilustracija „FolR1 TCB 1+1 od glave do repa crossfab“. Ovi konstrukti obuhvataju Ck-VH lanac za ligand CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH. (Sl. 1H) Ilustracija „FolR1 TCB 1+1 klasičan crossfab“. Ovi konstrukti obuhvataju Ck-VH lanac za ligand CD3 umesto konvencionalnog lanca CH1-VH. Slika 1I ilustruje format antitela kapa-lambda za CD3/FolR1. Ovi konstrukti obuhvataju ukršteni zajednički laki lanac VLCH1 i jedan ukršteni VHCL lanac specifičan za CD3 i jedan ukršteni VHCL lanac specifičan za FolR1.

Slike 2A-C prikazuju grafikone koji sumiraju vezivanje liganda FoLR1 IgG sa HeLa ćelijama. Vezivanje novonastalih liganda FolR1 za eksprimirani FolR1 na HeLa ćelijama određeno je protočnom citometrijom. Vezana antitela su detektovana pomoću fluorescentno obeleženog anti-humanog sekundarnog antitela.

Slike 3A-B prikazuju grafikone koji sumiraju specifičnost liganda FolR1 za FolR1. Vezivanje FolR1 IgG-ova na ćelijama HEK tranzijentno transfektovanih sa FolR1 ili FolR2, analizirano je protočnom citometrijom kako bi se identifikovali klonovi koji se specifično vezuju za FolR1, a ne za FolR2. Antitela su detektovana pomoću fluorescentno obeleženog anti-humanog sekundarnog antitela.

Slike 4A-B prikazuju grafikone koji sumiraju unakrsnu reaktivnost liganada FolR1 za cyFoLR1. Unakrsna reaktivnost antitela FolR1 na cino FolR1 je usmerena na ćelije HEK tranzijentno transfektovanih sa cyFolR1 putem protočne citometrije. Antitela su detektovana pomoću fluorescentno obeleženog anti-humanog sekundarnog antitela.

Slika 5 prikazuje grafikon koji ilustruje internalizaciju FolR1 TCB nakon vezivanja. Internalizacija četiri FolR1 TCB nakon vezivanja za FolR1 je testirana na HeLa ćelijama. Preostali FolR1 TCB na površini su detektovani pomoću fluorescentno obeleženog antihumanog sekundarnog antitela nakon određenih vremenskih intervala na 37°C. Izračunat je procenat internalizacije.

Slike 6A-E prikazuju grafikone koji sumiraju vezivanje FolR1 IgG na ćelijama sa različitim nivoima ekspresije FolR1. Vezivanje 9D11, 16D5 i Mov19 IgG za tumorske ćelije sa različitim nivoima ekspresije FolR1, analizirano je protočnom citometrijom. DP47 IgG je uključen kao kontrola izotipa, a MKN-45 je uključen kao negativna ćelijska linija FolR1. Antitela su detektovana pomoću fluorescentno obeleženog anti-humanog sekundarnog antitela.

Slike 7A-L prikazuju grafikone koji sumiraju ubijanje ćelija HT-29 i SKOV3 posredstvom T ćelija. FolR1 TCB su korišćeni za testiranje ubijanja tumorskih ćelija HT-29 i SKOV3 posredstvom T ćelija i ushodne regulacije aktivacionog markera na T ćelijama nakon ubijanja. (sl. 7A-D) Ubijanje ćelija HT-29 i SKOV3 posredstvom T ćelija u prisustvu 9D11 FolR1 TCB i 16D5 FolR1 TCB je izmereno oslobađanjem LDH nakon 24 h i 48 h. DP47 TCB je uključen kao negativna kontrola. Nakon 48 h inkubacije, ushodna regulacija aktivacionih markera CD25 i CD69 na CD8 T ćelijama i CD4 T ćelijama nakon ubijanja SKOV3 (Sl. 7E-H) ili HT-29 (Sl. 7I-L) tumorskih ćelija, ocenjena je protočnom citometrijom.

Slika 8 prikazuje grafikon koji pokazuje odsutnost vezivanja anti-FolR1 za eritrocite. Eritrociti su zatvoreni kao CD235a pozitivna populacija i vezivanje 9D11 IgG, 16D5 IgG, Mov19 IgG i DP47 IgG za ovu populaciju je određeno protočnom citometrijom. Antitela su detektovana pomoću fluorescentno obeleženog anti-humanog sekundarnog antitela.

Slike 9A-D opisuju grafikone koji sumiraju ushodnu regulaciju aktivacionih markera u punoj krvi. Ushodna regulacija aktivacionih markera CD25 i CD69 CD4 T ćelija i CD8 T ćelija 24 h nakon dodavanja 9D11 FolR1 TCB, 16D5 FolR1 TCB, Mov19 FolR1 TCB i DP47 TCB analizirana je protočnom citometrijom.

Slika 10 Vezivanje a-gliko varijanti 9D11 TCB za HeLa ćelije. Vezivanje a-gliko varijanti 9D11 FolR1 TCB za Hela ćelije upoređivano je sa vezivanjem originalnog 9D11 TCB za HeLa ćelije. Antitela su detektovana pomoću fluorescentno obeleženog antihumanog sekundarnog antitela i vezivanje je određeno protočnom citometrijom.

Slike 11A-F prikazuju grafikone koji sumiraju ubijanje a-gliko varijanti tumorskih ćelija 9D11 FolR1 TCB posredstvom T ćelija. Korišćene su a-gliko varijante 9D11 FolR1 TCB za testiranje tumorskih ćelija (Sl. 11A-D) SKOV3, MKN-45 (kao negativna kontrola FolR1) i (Sl. 11E-F) HT-29 u poređenju sa ubijanjem originalnog 9D11 FolR1 TCB. Korišćeno je očitavanje oslobađanja LDH nakon 24 h i 48 h.

Slike 12A-X opisuju grafikone koji sumiraju ubijanje primarnih epitelnih ćelija posredstvom T ćelija. Korišćene su primarne epitelne ćelije sa vrlo niskim nivoima FolR1 za testiranje ubijanja posredstvom T ćelija, uz uključivanje 16D5 FolR1 TCB i 9D11 FolR1 TCB, DP47 TCB kao negativne kontrole, dok su HT29 ćelije uključene kao pozitivna kontrola. (sl. 12A-H) Oslobađanje LDH humanog pigmenta mrežnjače (HRP), humanog korteksa bubrega (HRC), humanih bronhija (HB) i HT29 ćelija određeno je nakon 24 h i 48 h. Ushodna regulacija aktivacionih markera CD25 i CD69 na CD4 T ćelijama i CD8 T

1

ćelijama nakon ubijanja (Sl. 12I-L) HRP, (Sl. 12M-P) HRC, (Sl. 12Q-T) HB i (Sl. 12 U-X) HT29, određeno je nakon 48 h protočnom citometrijom.

Slike 13A-C prikazuju poređenje različitih TCB formata sa 16D5. Četiri različita TCB formata koji sadrže FolR1 ligand 16D5 upoređivana su, na Sl. 13A, u vezivanju za HeLa ćelije, na Sl. 14 B, u ubijanju ćelija SKOV3 posredstvom T ćelija nakon 24 h i 48 h, i na Sl. 14C u ushodnoj regulaciji aktivacionih markera CD25 i CD69 na CD4 T ćelijama i CD8 T ćelijama 48 h nakon ubijanja.

Slike 14A-C prikazuju poređenje različitih TCB formata sa 9D11. Tri različita TCB formata koji sadrže FolR1 ligand 9D11 upoređivana su u A) vezivanju za HeLa ćelije, u B) ubijanju ćelija SKOV3 posredstvom T ćelija nakon 24 h i 48 h i u C) ushodnoj regulaciji aktivacionih markera CD25 i CD69 na CD4 T ćelijama i CD8 T ćelijama 48 h nakon ubijanja.

Slika 15 prikazuje PK profil FOLR1 TCB kod NOG miševa za tri različite doze. Slika 16 ilustruje eksperimentalni protokol za studiju efikasnosti sa FOLR1 TCB. Slike 17A-B prikazuju krive rasta tumora. (Sl. 17A) Prosečne vrednosti i SEM zapremina tumora u različitim grupama za lečenje. (Sl. 17B) Rast tumora kod pojedinačnih miševa u svim grupama za lečenje. TGI (inhibicija rasta tumora) daje procenat prosečne zapremine tumora u odnosu na grupu sa vehikulumom.

Slika 18 prikazuje težine tumora na kraju studije.

Slike 19A-B prikazuju FACS analizu T ćelija koje se infiltriraju u tumore u 32. danu studije. (Sl. 19A) Suspenzije pojedinačnih tumorskih ćelija obojene su anti-humanim CD3/CD4/CD8 i analizirane protočnom citometrijom. (Sl. 19B) Prosečne vrednosti i SEM broja T ćelija po mg tumorskog tkiva u različitim grupama za lečenje.

Slike 20A-B prikazuju FACS analizu aktivacije / degranulacije i sekrecije citokina T ćelija u 32. danu studije. CD4+ (Sl. 20A) i CD8+ (Sl. 20B) T ćelije koje se infiltriraju u tumore obojene su radi identifikacije citokina, markera aktivacije i degranulacije. Prikazane su prosečne vrednosti i SEM broja T ćelija po mg tumorskog tkiva u različitim grupama za lečenje.

Slike 21A-B prikazuju procenat lize tumora. Ćelije SKOV3 su inkubirane sa PBMC u prisustvu kapa lambda FoLR1 TCB ili DP47 TCB. Ubijanje tumorskih ćelija nakon 24 h (Sl.

21A) i 48 h (Sl.21B) određeno je merenjem oslobađanja LDH.

Slike 22A-D prikazuju ushodnu regulaciju CD25 i CD69 na CD4 T ćelijama. Ćelije

1

SKOV3 su inkubirane sa PBMC u prisustvu kapa lambda FoLR1 TCB ili DP47 TCB. Nakon 48 h je izmerena ushodna regulacija CD25 i CD69 na CD4 T ćelijama (Sl. 22A-B) i CD8 T ćelijama (Sl.22C-D) protočnom citometrijom.

Slike 23A-B prikazuju procenat lize tumora. T ćelijsko ubijanje ćelija SKov-3 (srednji FolR1) je indukovano pomoću 36F2 TCB, Mov19 TCB i 21A5 TCB nakon 24h (Sl. 23A) i 48 h (Sl.23B) inkubacije (E:T = 10:1, efektori humanih PBMC).

Slike 24A-C prikazuju ubijanje T ćelijama, indukovano pomoću 36F2 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB klasično, 16D5 TCB 1+1 i 16D5 TCB HT, Hela (visok FolR1) (Sl. 24A), Skov-3 (srednji FolR1) (Sl. 24B) i HT-29 (nizak FolR1) (Sl. 24C) humanih tumorskih ćelija (E:T = 10:1, efektori humanih PBMC, vreme inkubacije 24 h). DP47 TCB je uključen kao kontrola nevezivanja.

Slike 25A-C prikazuju ushodnu regulaciju CD25 i CD69 na humanim CD8+ (Sl.

25A, B) i CD4+ (Sl.25C) T ćelijama nakon ubijanja, posredstvom T ćelija, Hela ćelija (visok FolR1) (Sl. 25A), SKov-3 ćelija (srednji FolR1) (Sl. 25B) i HT-29 ćelija (nizak FolR1) (Sl.

25C) (E:T = 10:1, inkubacija 48 h), indukovano pomoću 36F2 TCB, 16D5 TCB i DP47 TCB (kontrola nevezivanja).

Slike 26A-F prikazuju ubijanje T ćelijama, indukovano pomoću 36F2 TCB, 16D5 TCB i DP47 TCB, humanih epitelnih ćelija korteksa bubrega (Sl.26A, B), humanih epitelnih ćelija pigmenata mrežnjače bubrega (Sl. 26C, D) i HT-29 ćelija (Sl. 26E, F) nakon 24h (Sl.

26A, C, E) i 48 h (Sl.26B, D, F) inkubacije (E:T = 10:1, efektori humanih PBMC).

Slika 27 prikazuje tabelu koja sumira kvantifikaciju mesta za vezivanje FolR1 za različite normalne i kancerogene ćelijske linije.

Slike 28A-B prikazuju vezivanje 16D5 TCB i njegovih odgovarajućih CD3 varijanti deamidacije 16D5 TCB N100A i 16D5 TCB S100aA i 9D11 TCB i njegovih varijanti demidacije 9D11 TCB N100A i 9D11 TCB S100aA za humani CD3 koji je eksprimiran na Jurkat ćelijama.

Slike 29A-B prikazuju T ćelijsko ubijanje humanih tumorskih ćelija SKov-3 (srednji FolR1) indukovano pomoću 16D5 TCB i njegovih odgovarajućih CD3 varijanti deamidacije 16D5 TCB N100A i 16D5 TCB S100aA (Sl. 29A) i 9D11 TCB i njegovih varijanti demidacije 9D11 TCB N100A i 9D11 TCB S100aA (Sl.29B) (E:T = 10:1, efektori humanih PBMC, vreme inkubacije 24 h). DP47 TCB je uključen kao kontrola nevezivanja.

Slike 30A-B prikazuju T ćelijsko ubijanje humanih tumorskih ćelija HT-29 (nizak FolR1) indukovanog pomoću 16D5 TCB i njegovih odgovarajućih CD3 varijanti deamidacije 16D5 TCB N100A i 16D5 TCB S100aA (Sl. 30A) i 9D11 TCB i njegovih varijanti

1

demidacije 9D11 TCB N100A i 9D11 TCB S100aA (Sl.30B) (E:T = 10:1, efektori humanih PBMC, vreme inkubacije 24 h). DP47 TCB je uključen kao kontrola nevezivanja.

Slike 31A-C prikazuju prosečan intenzitet fluorescencije i lizu tumorskih ćelija.

Slike 32A-E prikazuju vezivanje 36F2 TCB, 16D5 TCB i 16D5 HC/LC varijanti za humani FolR1 koji je eksprimiran na Hela ćelijama.

Slika 33 prikazuje vezivanje 36F2 TCB, 16D5 TCB i dve varijante 16D5 smanjenog afiniteta 16D5 W96Y/D52E TCB i 16D5 G49S/S93A TCB za humani FolR1 na Hela ćelijama.

Slike 34A-E prikazuju vezivanje 36F2 TCB, 16D5 TCB i 16D5 HC/LC varijanti za humani FolR1 koji je eksprimiran na HT-29 ćelijama.

Slike 35A-D prikazuju vezivanje intermedijalnih liganada FolR1 (6E10 TCB, 14B1 TCB i 9C7 TCB), 16D5 TCB i 36F2 TCB za HEK293T ćelije koje eksprimiraju humani ili mišji FolR1 ili FolR2.

Slika 36A-F prikazuje T ćelijsko ubijanje humanih tumorskih ćelija Hela (visoka ekspresija FolR1), SKov-3 (srednja ekspresija FolR1) i HT-29 (niska ekspresija FolR1) indukovanog intermedijalnim ligandima FolR1 (6E10 TCB, 14B1 TCB i 9C7 TCB), 16D5 TCB i 36F2 TCB nakon 24 h (A-C) i 48 h (D-F) inkubacije. Humani PBMC su korišćeni kao efektorske ćelije (E:T = 10:1).

Slike 37A-F prikazuju T ćelijsko ubijanje humanih tumorskih ćelija Hela (visoka ekspresija FolR1), SKov-3 (srednja ekspresija FolR1) i HT-29 (niska ekspresija FolR1) indukovano varijantama 16D5 smanjenog afiniteta (16D5-G49S/S93A TCB, 16D5-G49S/K53A TCB, 16D5 W96Y TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB), 16D5 TCB i 36F2 TCB nakon 24 h (Sl. 38A-C) i 48 h (Sl. 38D-F) inkubacije. Humani PBMC su korišćeni kao efektorske ćelije (E:T = 10:1).

Slike 38A-F prikazuju T ćelijsko ubijanje primarnih humanih ćelija iz pigmentnog epitela mrežnjače i epitela korteksa bubrega, indukovanog varijantama 16D5 smanjenog afiniteta (16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB), 16D5 TCB, 36F2 TCB i intermedijalnim ligandom FolR1 14B1 TCB, ocenjeno nakon 24 h (Sl. 39A-C) i 48 h (Sl.

39D-F) inkubacije (E: T = 10: 1, efektori humanih PBMC). HT-29 ćelije (niska ekspresija FolR1) su uključene kao kontrolna ćelijska linija, dok je DP47 TCB služio kao kontrola nevezivanja.

Slike 39A-B prikazuju jednokratno doziranje PK konstrukata FOLR1 TCB kod ženke NOG miševa.

Slike 40A-G prikazuju efikasnost in vivo konstrukata FOLR1 TCB (16D5, 16D5

1

G49S/S93A i 16D5 W96Y/D52E) nakon prenosa humanog PBMC u NOG miševe koji nose Hela ćelije.

Slika 41 prikazuje da se Farletuzumab (tamnozelena, druga od vrha) i Mov19 (siva, na vrhu) mogu vezati za huFolR1 koji je uhvaćen na 16D5, pokazujući da ligandi serije 16D5 prepoznaju epitop različit od onog koji je prepoznao Farletuzumab ili Mov19.

Detaljan opis predmetnog pronalaska

Definicije

Termini se ovde koriste kao što se tipično koriste u struci, osim ako nije drugačije definisano u nastavku.

Kao što se ovde koristi, termin „antigen vezujući molekul“ se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri antigen vezujućih molekula su imunoglobulini i njihovi derivati, npr. fragmenti.

Termin „bispecifični“ znači da je antigen vezujući molekul sposoban da se specifično veže za najmanje dve različite antigenske determinante. Obično bispecifični antigen vezujući molekul sadrži dva mesta za vezivanje antigena, od kojih je svako specifično za različitu antigensku determinantu. U određenim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul je sposoban da istovremeno vezuje dve antigenske determinante, naročito dve antigenske determinante eksprimirane na dve različite ćelije.

Termin „valentno“, kao što se ovde koristi, označava prisustvo određenog broja mesta za vezivanje antigena u antigen vezujućem molekulu. Kao takav, termin „jednovalentno vezivanje za antigen“ označava prisustvo jednog (i ne više od jednog) mesta za vezivanje antigena specifičnog za antigen u antigen vezujućem molekulu.

„Mesto za vezivanje antigena“ se odnosi na mesto, tj. jedan ili više aminokiselinskih ostataka, antigen vezujućeg molekula koji osigurava interakciju sa antigenom. Na primer, mesto za vezivanje antigena nekog antitela sadrži aminokiselinske ostatke iz regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Prirodni molekul imunoglobulina obično ima dva mesta za vezivanje antigena, molekul Fab obično ima jedno mesto vezivanja antigena.

Kao što se ovde koristi, termin „antigen vezujući deo” se odnosi na molekul polipeptida koji se specifično vezuje za antigensku determinantu. U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo je u stanju da usmeri entitet za koji je vezan (npr. drugi antigen vezujući deo) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija ili stromu tumora koja nosi antigensku determinantu. U drugoj realizaciji, antigen vezujući deo je u stanju da aktivira signalizaciju putem svog ciljnog antigena, na primer antigen kompleksa receptora T ćelija. Antigen vezujući delovi obuhvataju antitela i njihove fragmente, kao što je ovde definisano.

1

Konkretni antigen vezujući delovi obuhvataju antigen vezujući domen antitela, koji sadrži varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U određenim realizacijama, antigen vezujući delovi mogu sadržavati konstantne regione antitela, kao što je ovde definisano i kao što je poznato u struci. Korisni konstantni regioni teškog lanca uključuju bilo koji od pet izotipa: α, δ, ε, γ ili µ. Korisni konstantni regioni lakog lanca uključuju bilo koji od dva izotipa: κ i λ.

Kao što se ovde koristi, termin „antigenska determinanta” je sinonim za „antigen” i „epitop”, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnom makromolekulu za koji se vezuje antigen vezujući deo, formirajući antigen vezujući kompleks deo-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM). Proteini koji se ovde navode kao antigeni, npr. FolR1 i CD3, mogu biti svi nativni oblici proteina koji potiču od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. U konkretnoj realizaciji, antigen je humani protein. Kada se ovde pominje specifični protein, termin obuhvata protein „pune dužine“ i neprerađen, kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat prerade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodne varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante. Primeri humanih proteina koji su korisni kao antigeni uključuju, ali nisu ograničeni na: FolR1 (folatni receptor alfa (FRA); protein koji veže folate (FBP); humani FolR1 UniProt br.: P15328; mišji FolR1 UniProt br.: P35846; cinomolgus FolR1 UniProt br.: G7PR14) i CD3, posebno epsilon podjedinica CD3 (videti UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO: 150 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]). Bispecifični antigen vezujući molekulpredmetnog pronalaska, koji aktivira T ćelije, vezuje se za epitop CD3 ili antigen ciljne ćelije koji je sačuvan među CD3 ili ciljnim antigenom iz različitih vrsta. U određenim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje se za CD3 i FolR1, ali se ne vezuje za FolR2 (folatni receptor beta; FRB; humani FolR2 UniProt br.: P14207) ili FolR3 (folatni receptor gama; humani FolR3 UniProt br.: P41439).

Pod „specifičnim vezivanjem” se podrazumeva da je vezivanje selektivno za antigen i da se može razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen vezujućeg dela da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti bilo putem

2

testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili putem drugih tehnika poznatih stručnim licima, npr. tehnikama površinske plazmonske rezonance (SPR) (analizirana na BIAcore instrumentu) (Liljeblad et al., Glyco J17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U jednoj realizaciji, stepen vezivanja antigen vezujućeg dela na nevezani protein je manji od oko 10% vezivanja antigen vezujućeg dela za antigen, kako je izmereno, npr. putem SPR. U određenim realizacijama, antigen vezujući deo koji se vezuje za antigen, ili antigen vezujući molekul koji sadrži taj antigen vezujući deo, ima konstantu disocijacije (KD) od ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr. 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M).

„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. receptora) i njegovog partnera u vezivanju (npr. liganda). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antigen vezujući deo i antigen, ili receptor i njegov ligand). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (KD), koja predstavlja odnos konstante brzine disocijacije i konstante brzine asocijacije (koff, odnosno kon). Stoga, ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim metodama poznatim u struci, uključujući one koje su ovde opisane. Posebna metoda za merenje afiniteta je Površinska plazmonska rezonanca (SPR).

„Smanjeno vezivanje”, na primer smanjeno vezivanje za Fc receptor, se odnosi na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kako je izmereno na primer SPR-om. Radi jasnoće, termin podrazumeva i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije date analitičke metode), odnosno potpuno ukidanje interakcije. Nasuprot tome, „povećano vezivanje” se odnosi na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.

„Aktivacija T ćelija“, kao što se ovde koristi, se odnosi na jedan ili više ćelijskih odgovora T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, odabranih od: proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, otpuštanja citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksične aktivnosti i ekspresije aktivacionih markera. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska su sposobni da indukuju aktivaciju T ćelija. Odgovarajući testovi za merenje aktivacije T ćelija su poznati u ovde opisanoj struci.

„Antigen ciljne ćelije“, kako se ovde koristi, se odnosi na antigensku determinantu koja je predstavljena na površini ciljne ćelije, na primer, ćelije u tumoru, kao što je ćelija raka ili ćelija tumorske strome. Konkretno, „antigen ciljne ćelije“ se odnosi na folatni receptor 1. Kao što se ovde koristi, termini „prvi“ i „drugi“ u odnosu na antigen vezujuće delove, itd., koriste se radi razlikovanja kada postoji više od jedne vrste svakog dela. Ovi termini se ne koriste da označe određeni redosled ili položaj bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, osim ako se to eksplicitno ne tvrdi.

„Molekul Fab“ se odnosi na protein koji se sastoji od VH i CH1 domena teškog lanca („teški lanac Fab“) i VL i CL domena lakog lanca („laki lanac Fab“) imunoglobulina.

Termin „molekuli Fab koji imaju identične VLCL lake lance“, kako se ovde koristi, se odnosi na ligande koji dele jedan laki lanac, ali i dalje imaju odvojene specifičnosti, npr. mogu vezati CD3 ili FolR1. U nekim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži najmanje dva molekula Fab koji imaju identične VLCL lake lance. Odgovarajući teški lanci su preoblikovani i daju bispecifičnom antigenu CD3 koji aktivira T ćelije, odnosno antigenu ciljne ćelije FolR1 sposobnost bispecifičnog vezivanja.

Pod „spojenim“ se podrazumeva da su komponente (npr. molekul Fab i podjedinica Fc domena) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih veznika.

Termin „jednolančani“, kao što se ovde koristi, se odnosi na molekul koji sadrži aminokiselinske monomere linearno vezane peptidnim vezama. U određenim realizacijama, jedan od antigen vezujućih ostataka je jednolančani molekul Fab, tj. molekul Fab gde su laki lanac Fab i teški lanac Fab povezani peptidnim linkerom da bi formirali jedan peptidni lanac. U jednoj takvoj posebnoj realizaciji, C-terminalni kraj lakog lanca Fab povezan je sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab u jednolančanom molekulu Fab.

Pod „unakrsno izmenjenim“ molekulom Fab (koji se naziva i „Crossfab“) se podrazumeva molekul Fab u kojem su varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni, tj. unakrsno izmenjeni molekul Fab sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca i konstantnog regiona teškog lanca, i peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca i konstantnog regiona lakog lanca. Radi jasnoće, u unakrsno izmenjenom molekulu Fab u kom su varijabilni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, peptidni lanac koji sadrži konstantni region teškog lanca ovde se naziva „teški lanac“ unakrsno izmenjenog molekula Fab. Suprotno tome, u unakrsno izmenjenom molekulu Fab, u kom su konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, peptidni lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca ovde se naziva „teški lanac“ unakrsno izmenjenog molekula Fab. Antitelo koje sadrži jedan ili više CrossFab-ova ovde se naziva „CrossMab.“

Nasuprot tome, „konvencionalnim“ molekulom Fab se smatra molekul Fab u svom prirodnom formatu, tj. sadrži teški lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih regiona teškog lanca (VH-CH1) i laki lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih regiona lakog lanca (VL-CL). Termin „molekul imunoglobulina“ se odnosi na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini klase IgG su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva laka lanca i dva teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N- do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina se može svrstati u jedan od pet tipova, koji se zovu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili μ (IgM), od kojih se neki mogu dalje podeliti na podtipove, npr. γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) i α2(IgA2). Laki lanac imunoglobulina se može svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva molekula Fab i Fc domena, povezana preko regiona šarke imunoglobulina.

Termin „antitelo“ se ovde upotrebljava u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, bez ograničavanja, monoklonska antitela, poliklonska antitela i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.

„Fragment antitela“ se odnosi na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela obuhvataju, ali se ne ograničavaju, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela (npr. scFv) i antitela sa jednim domenom. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražiti u Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražiti npr. u Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo videti u U.S. Patentu br. 5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Trijatela i

2

tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim realizacijama, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr. U.S. Patent No. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničavanja, proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

Termin „antigen vezujući domen“ se odnosi na deo antitela koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Antigen vezujući domen se može dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela (takođe se zovu varijabilni regioni antitela). Konkretnije, antigen vezujući domen sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).

Termin „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VL, datim redosledom) nativnog antitela u suštini imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Videti, npr., Kindt et al., Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti.

Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“). U suštini, nativna četvorolančana antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). HVR generalno sadrže ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao „regioni koji određuju komplementarnost“ (CDR), i ti termini se ovde koriste podjednako da označe delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj konkretni region su opisali Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) i Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka u poređenju jednih sa drugima. Pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije koje ukazuju na CDR antitela ili njihove varijante bude obuhvaćena terminom koji se ovde definiše i koristi. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR-ove, kao što je definisano u svakoj od gore citiranih referenci, prikazani su u Tabeli A u nastavku radi poređenja. Tačan broj ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručna lica iz ove oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona antitela.

TABELA A. Definicije CDR<1>

<1>Broj svih definicija CDR-a u Tabeli A je u skladu sa konvencijama o numeraciji koje su izradili Kabat et al. (videti u nastavku).

<2>„AbM“ sa malim slovom „b“, kao što je korišćeno u Tabeli A, se odnosi na CDR-ove kako se definiše pomoću softvera za modelovanje „AbM“ antitela centra Oxford Molecular.

Kabat et al. su takođe definisali sistem numerisanja sekvenci varijabilnih regiona koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatove numeracije“ na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim same sekvence. U smislu ovog dokumenta, „Kabatova numeracija“ se odnosi na sistem numeracije koji su postavili Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest“ (1983). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.

Polipeptidne sekvence na listi sekvenci nisu numerisane prema Kabatovom sistemu numerisanja. Međutim, lice sa standardnom stručnošću u ovoj oblasti može da konvertuje numerisanje sekvenci iz liste sekvenci na Kabatovu numeraciju.

2

„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

„Klasa“ antitela ili imunoglobulina se odnosi na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipe), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

Termin „Fc domen“ ili „Fc region“ se ovde koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži najmanje jedan deo konstantnog regiona. Izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG tipično se definiše tako da se proteže od Cys226 ili Pro230 do karboksil-terminalnog kraja teškog lanca. Međutim, lizin C-terminalnog kraja (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora da bude prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je rađeno prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. „Podjedinica“ Fc domena, kao što se ovde koristi, se odnosi na jedan od dva polipeptida koji formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži C-terminalne krajeve konstantnih regiona teškog lanca imunoglobulina, sposobne za stabilno samopovezivanje. Na primer, podjedinica Fc domena IgG sadrži IgG CH2 i konstantni domen IgG CH3.

Modifikacija koja promoviše udruživanje prve i druge podjedinice Fc domena“ je manipulacija peptidne osnove ili post-translaciona modifikacija podjedinice Fc domena koja smanjuje ili sprečava udruživanje polipeptida koji sadrže podjedinicu Fc domena sa identičnim polipeptidom za formiranje homodimera. Modifikacija koja promoviše udruživanje, kao što se ovde koristi, posebno podrazumeva odvojene modifikacije napravljene za svaku od dve podjedinice Fc domena koje treba da se udruže (tj. prva i druga podjedinica Fc domena), pri čemu su modifikacije komplementarne jedna drugoj, kako bi se promovisalo udruživanje dve podjedinice Fc domena. Na primer, modifikacija koja promoviše udruživanje može da promeni strukturu ili naelektrisanje jedne ili obe podjedinice Fc domena, da bi njihovo udruživanje bilo prostorno ili elektrostatički povoljno. Stoga se (hetero)dimerizacija javlja između polipeptida koji sadrži prvu podjedinicu Fc domena i

2

polipeptida koji sadrži drugu podjedinicu Fc domena, koja može biti neidentična u smislu da dalje komponente spojene na svaku od podjedinica (npr. antigen vezujući delovi) nisu iste. U nekim realizacijama, modifikacija koja promoviše udruživanje sadrži mutaciju aminokiselina u Fc domenu, posebno aminokiselinsku supstituciju. U posebnoj realizaciji, modifikacija koja promoviše udruživanje sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, posebno aminokiselinsku supstituciju, u svakoj od dve podjedinice Fc domena.

Termin „efektorske funkcije“ ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela obuhvataju: Vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje regulacije površinskih ćelijskih receptora (npr. receptor B ćelija), i aktivaciju B ćelija.

Kao što se ovde koriste, termini „konstruisati, konstruisano, inženjering“ uključuju neku manipulaciju peptidne osnove ili post-translacione modifikacije prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog obrasca ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.

Izraz „mutacija aminokiselina“, kao što se ovde koristi, obuhvata aminokiselinske supstitucije , brisanje, umetanje i modifikacije. Svaka kombinacija supstitucije, brisanja, umetanja i modifikacije može se načiniti tako da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za Fc receptor, ili povećano udruživanje sa drugim peptidom. Brisanja i ubacivanja aminokiselinske sekvence uključuju brisanja i umetanja aminokiselina na amino i/ili karboksi terminalnom kraju. Konkretne mutacije aminokiselina su aminokiselinske supstitucije. U cilju izmene npr. karakteristika vezivanja Fc regiona, naročito su poželjne nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, tj. zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva. Aminokiselinske supstitucije uključuju zamenu aminokiselinama koje ne nastaju prirodno, ili derivatima prirodnih aminokiselina, od dvadeset standardnih aminokiselina (npr. 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Mutacije aminokiselina se mogu generisati pomoću genetičkih ili hemijskih metoda koje su dobro poznate u struci. Genetske metode mogu obuhvatiti mutagenezu usmerenu na lokaciju, PCR, sintezu gena i slično. Smatra se da su takođe korisne metode izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim metodama osim genetskog

2

inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju aminokiselina. Na primer, supstitucija iz prolina u položaju 329 Fc domena u glicin se može označiti kao 329G, G329, G329, P329G ili Pro329Gly.

Kao što se ovde koristi, termin „polipeptid“ se odnosi na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) koji su linearno povezani amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Termin „polipeptid“ se odnosi na bilo koji lanac dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Stoga su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „aminokiselinski lanac“ ili bilo koji drugi termin koji se koristi da se ukaže na lanac dve ili više aminokiselina, obuhvaćeni definicijom „polipeptida“ i termin „polipeptid“ se može koristiti umesto ili kao sinonim bilo kog od ovih termina. Termin „polipeptid“ se takođe odnosi na proizvode post-ekspresione modifikacije polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja ili modifikacije sa neprirodno nastalim aminokiselinama. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno translatovan iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući i hemijsku sintezu. Polipeptid predmetnog pronalaska može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1000 ili više, ili 2000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se nazivaju preklopljeni, a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu usvojiti veliki broj različitih konformacija se nazivaju otvoreni.

Kao „izolovani“ polipeptid ili varijanta ili njegov derivat se smatra polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid se može ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu predmetnog pronalaska, kao što su nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom odgovarajućom tehnikom.

„Procenat ( %) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u poređenju sa sekvencom referentnog polipeptida definisan je kao procenat onih aminokiselinskih ostataka u sekvencikandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao

2

maksimalni procenat identičnosti sekvence, pri tom ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije delom identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može da se postigne na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog računarskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan kod Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako ovde nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću ALIGN-2 računarskog programa.

Termin „polinukleotid“ se odnosi na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNK), viralno dobijenu RNK ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržavati konvencionalnu vezu fosfodiestra ili

2

nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Termin „molekul nukleinske kiseline“ se odnosi na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu.

„Izolovanim“ molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom se smatra molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri izolovanog polinukleotida obuhvataju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterologim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid se odnosi na molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK obuhvataju in vivo ili in vitro transkripte RNK predmetnog pronalaska, kao i pozitivne i negativne lančane forme i dvolančane forme. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje obuhvataju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu biti ili mogu sadržavati regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.

Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu, na primer, najmanje 95% „identičnu“ referentnoj nukleotidnoj sekvenci predmetnog pronalaska, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, osim što polinukleotidna sekvenca može sadržavati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom, ili broj nukleotida ne veći od 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnoj poziciji referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. Da bi bilo praktično, klasično se pomoću poznatih računarskih programa (npr. ALIGN-2), kao što su oni gore navedeni za polipeptide, može odrediti da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci predmetnog pronalaska.

Termin „ekspresiona kaseta“ se odnosi na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljanu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može da se inkorporira u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora sadrži, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim realizacijama, ekspresiona kaseta predmetnog pronalaska sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule predmetnog pronalaska ili njihove fragmente.

Termin „vektor“ ili „ekspresioni vektor“ je sinonim za „ekspresioni konstrukt“ i odnosi se na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena na koji je operativno povezan u ciljanu ćeliju. Isti termin se odnosi i na vektor koji je samoumnožavajuća struktura nukleinske kiseline, i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ekspresioni vektor predmetnog pronalaska sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Kada se ekspresioni vektor nađe unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein koji je kodiran genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednoj realizaciji, ekspresioni vektor predmetnog pronalaska sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule predmetnog pronalaska ili njihove fragmente.

Termini „ćelija domaćin“, „ćelijska linija domaćina“ i „kultura ćelija domaćina“ koriste se podjednako, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini obuhvataju „transformante“ i „transformisane ćelije“, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovim je obuhvaćeno i mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula predmetnog pronalaska. Ćelije domaćini mogu biti uzgajane ćelije, npr. uzgajane ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.

„Aktivirajući Fc receptor“ je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc domena antitela

1

izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu ćeliju koja nosi receptor da izvede efektorske funkcije. Humani aktivirajući Fc receptori obuhvataju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89).

Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) je imunološki mehanizam koji dovodi do lize ciljnih ćelija obloženih antitelima pomoću imunoloških efektorskih ćelija. Ciljne ćelije su ćelije za koje se antitela ili njihovi derivati koji sadrže Fc region specifično vezuju, najčešće preko proteinskog dela koji je N-terminalni kraj Fc regiona. Kako se ovde koristi, termin „smanjeni ADCC“ definiše se ili kao smanjenje broja ciljnih ćelija koje su lizirane u datom vremenu, pri datoj koncentraciji antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, putem mehanizma ADCC definisanog iznad, i/ili povećanje koncentracije antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, potrebno da se postigne liza datog broja ciljnih ćelija u datom vremenu, putem mehanizma ADCC. Smanjenje ADCC je relativno u odnosu na ADCC posredovane istim antitelom koje proizvodi isti tip ćelija domaćina, korišćenjem istih standardnih metoda proizvodnje, prečišćavanja, formulisanja i čuvanja (koji su poznati stručnim licima iz ove oblasti), ali koje nije konstruisano. Na primer, smanjenje ADCC posredovane antitelom koje u svom Fc domenu sadrži aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje ADCC je relativno u odnosu na ADCC posredovane istim antitelom bez ove aminokiselinske supstitucije u Fc domenu. Odgovarajući testovi za merenje ADCC su dobro poznati u struci (videti, npr. PCT publikaciju br. WO 2006/082515 ili PCT publikaciju br. WO 2012/130831).

„Efikasna količina“ agensa se odnosi na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koje se primenjuje.

„Terapeutski efikasna količina“ agensa, npr. farmaceutski preparat, se odnosi na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agensa na primer eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava štetne efekte bolesti.

„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, bez ograničavanja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Konkretno, pojedinac ili ispitanik je čovek.

Termin „farmaceutski preparat“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

2

„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ se odnosi na sastojak farmaceutskog preparata koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač se odnosi, bez ograničenja, na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

Kako se ovde koristi, „lečenje“ (i gramatički oblici , kao što je „lečiti“) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti te remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti, ili da uspore napredovanje bolesti.

Termin „antagonist“ se koristi u najširem smislu, i podrazumeva bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira ili neutrališe biološku aktivnost nativnog polipeptida koji se ovde objavljuje. Na sličan način, termin „agonist“ se koristi u najširem smislu i odnosi se na bilo koji molekul koji oponaša biološku aktivnost prirodnog polipeptida koji se ovde objavljuje. Odgovarajući molekuli agonista ili antagonista se posebno odnose na agonistička ili antagonistička antitela ili fragmente antitela, fragmente ili varijante aminokiselinske sekvence prirodnih polipeptida, peptida antisens oligonukleotida, malih organskih molekula itd. Metode za identifikaciju agonista ili antagonista nekog polipeptida mogu da se sastoje od dovođenja u kontakt polipeptida sa potencijalnim agonističkim ili antagonističkim molekulom i merenja detektovane promene u jednoj ili više bioloških aktivnosti koje su inače povezane sa tim polipeptidom.

Termin „uputstvo za upotrebu“ se odnosi na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

Detaljan opis realizacija

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska je bispecifičan, tj. sadrži najmanje dva antigen vezujuća dela sposobna da se specifično vezuju za dve različite antigenske determinante, tj. za CDR3 i za FolR1. Shodno predmetnom pronalasku, antigen vezujući delovi su molekuli Fab (tj. antigen vezujući domeni sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni region). U jednoj realizaciji, navedeni molekuli Fab su humani. U drugoj realizaciji, navedeni molekuli Fab su humanizovani. U još jednoj realizaciji, navedeni molekuli Fab obuhvataju konstantne regione humanih teških i lakih lanaca.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska je sposoban da se istovremeno vezuje za antigen ciljne ćelije FolR1 i CD3. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je sposoban da unakrsno povezuje T ćelije i ciljne ćelije koje eksprimiraju FolR1 istovremenim vezivanjem za antigen ciljne ćelije FolR1 i CD3. U još konkretnijoj realizaciji, takvo istovremeno vezivanje dovodi do ekspresije FolR1 ciljne ćelije, posebno ekspresije FolR1 tumorske ćelije. U jednoj realizaciji, takvo istovremeno vezivanje dovodi do aktivacije T ćelija. U drugim realizacijama, takvo istovremeno vezivanje dovodi do ćelijskog odgovora T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, izabranog iz sledeće grupe: proliferacija, diferencijacija, sekrecija citokina, otpuštanje citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksična aktivnost i ekspresija aktivacionih markera. U jednoj realizaciji, vezivanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije za CD3, bez istovremenog vezivanja za antigen ciljnih ćelija FolR1, ne dovodi do aktivacije T ćelija.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je sposoban da preusmeri citotoksičnu aktivnost T ćelije na ciljnu ćeliju koja eksprimira FolR1. U posebnoj realizaciji, navedeno preusmeravanje je nezavisno od predstavljanja peptidnog antigena posredstvom MHC od strane ciljne ćelije i/ili specifičnosti T ćelije.

Konkretno, T ćelija prema nekoj od realizacija predmetnog pronalaska je citotoksična T ćelija. U nekim realizacijama, T ćelija je CD4<+>ili CD8<+>T ćelija, posebno CD8<+>T ćelija.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 (ovde se naziva i „antigen vezujući deo CD3“ ili „prvi antigen vezujući deo“). U konkretnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži ne više od jednog antigen vezujućeg dela sposobnog da se specifično vezuje za CD3. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije obezbeđuje jednovalentno vezivanje za CD3. U konkretnoj realizaciji, CD3 je CD3 čoveka ili CD3 cinomolgusa, najkonkretnije CD3 čoveka. U konkretnoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 je unakrsno reaktivan (tj. specifično se vezuje) za CD3 čoveka i cinomolgusa. U nekim realizacijama, prvi antigen vezujući deo je sposoban da se specifično vezuje za epsilon podjedinicu CD3 (videti UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO:150 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]).

4

U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.

U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: SEQ ID NO: 31.

U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska sadrži najmanje jedan antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za antigen ciljne ćelije FolR1 (ovde se naziva i „vezujući deo FolR1“ ili „drugi“ ili „treći“ antigen vezujući deo). U jednoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za antigen ciljne ćelije FolR1 ne vezuje se za FolR2 ili FolR3. U konkretnoj realizaciji, antigen vezujući deo FolR1 je unakrsno reaktivan (tj. specifično se vezuje) za FolR1 čoveka i cinomolgusa. U određenim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži dva antigen vezujuća dela sposobna da se vezuju za antigen ciljne ćelije FolR1. U jednoj takvoj konkretnoj realizaciji, svaki od ovih antigen vezujućih delova se specifično vezuje za istu antigensku determinantu. U još konkretnijoj realizaciji, svi ovi antigen vezujući delovi su identični. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži ne više od dva antigen vezujuća dela sposobna da se vezuju za FolR1.

Vezujući deo FolR1 je uopšteno molekul Fab koji se specifično vezuje za FolR1 i sposoban je da usmeri bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za koji je vezan na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3 i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34; i

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1).

U jednoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži

(iii) treći antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za FolR1.

U jednoj takvoj realizaciji, drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1, obuhvata identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednoj takvoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je identičan sa drugim antigen vezujućim ostatkom.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema navedenim realizacijama, sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno udruživanje.

U jednoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena.

U jednoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, opciono preko peptidnog veznika.

U još jednoj konkretnoj realizaciji, ne više od jednog antigen vezujućeg dela sposobnog da se specifično vezuje za CD3 je prisutno u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije (tj. bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije omogućava jednovalentno vezivanje za CD3).

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sa zajedničkim lakim lancem

Pronalazači predmetnog pronalaska su generisali bispecifično antitelo, pri čemu vezujući delovi imaju zajednički laki lanac koji zadržava specifičnost i efikasnost matičnog monospecifičnog antitela za CD3 i može da veže drugi antigen (npr. FolR1) koristeći isti laki lanac. Stvaranje bispecifičnog antitela sa zajedničkim lakim lancem koji zadržava svojstva vezivanja matičnog antitela nije jednostavno jer zajednički CDR-ovi hibridnog lakog lanca moraju da utiču na specifičnost vezivanja za oba cilja. U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži prvi i drugi antigen vezujući deo, od kojih je jedan molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, a drugi je molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za FolR1, pri čemu prvi i drugi molekul Fab imaju identične VLCL lake lance. U jednoj realizaciji, navedeni identični laki lanac (VLCL) sadrži CDR-ove lakog lanca SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34. U jednoj realizaciji, navedeni identični laki lanac (VLCL) sadrži SEQ ID NO. 35.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3 i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

U jednoj takvoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34 i antigen vezujući deo FolR1 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 17, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 18, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3 i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 275 i SEQ ID NO: 315 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3 i koji sadrži aminokiselinske sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, i aminokiselinsku sekvencu CDR lakog lanca SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34;

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži aminokiselinske sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 275 i SEQ ID NO: 315, i aminokiselinsku sekvencu CDR lakog lanca SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, i SEQ ID NO: 34.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31;

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 274, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

U još jednoj realizaciji, antigen vezujući deo koji se specifično vezuje za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 15, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži sekvencu polipeptida koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, sekvencu polipeptida koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 15, i sekvencu polipeptida koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži

(iii) treći antigen vezujući deo (koji predstavlja molekul Fab) sposoban da se specifično vezuje za FolR1.

U jednoj takvoj realizaciji, drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1, obuhvata identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednoj takvoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je identičan sa drugim antigen vezujućim ostatkom.

Tako u jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3 i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

(iii) treći antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) i koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

U jednoj takvoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34 i antigen vezujući deo FolR1 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 17, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:18, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

(iii) treći antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

Tako u jednoj realizaciji, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifične molekule, pri čemu najmanje dva vezujuća dela imaju identične lake lance i odgovarajuće preoblikovane teške lance koji daju specifično vezivanje za antigen CD3 koji aktivira T ćelije, odnosno za antigen ciljne ćelije FolR1. Upotreba ovog takozvanog principa „zajedničkog lakog lanca“, tj. kombinovanje dva liganda koji imaju jedan zajednički laki lanac, ali i dalje imaju odvojene specifičnosti, sprečava pogrešno sparivanje lakog lanca. Stoga, tokom proizvodnje ima manje nusproizvoda, što olakšava homogenu pripremu

4

bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije.

Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu biti međusobno spojene u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija su prikazani na slikama 1A-I i dodatno opisani u nastavku.

U nekim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno udruživanje. U nastavku su opisani primeri realizacija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, koji sadrži Fc domen.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sa unakrsno izmenjenim Fab fragmentom

Pronalazači predmetnog pronalaska su generisali drugi format bispecifičnog antitela, pri čemu je jedan od vezujućih ostataka unakrsno izmenjeni Fab fragment. U jednom aspektu predmetnog pronalaska se predviđa jednovalentno bispecifično antitelo, pri čemu je jedan od Fab fragmenata molekula IgG zamenjen unakrsno izmenjenim Fab fragmentom. Unakrsno izmenjeni Fab fragmenti su Fab fragmenti, pri čemu su izmenjeni ili varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca. Formati bispecifičnih antitela koji sadrže unakrsno izmenjene Fab fragmente su opisani, na primer, u WO2009080252, WO2009080253, WO2009080251, WO2009080254, WO2010/136172, WO2010/145792 i WO2013/026831. U konkretnoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo je unakrsno izmenjeni molekul Fab u kojem su razmenjeni ili varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab. Takva modifikacija sprečava pogrešno sparivanje teških i lakih lanaca iz različitih molekula Fab, čime se poboljšava prinos i čistoća bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije predmetnog pronalaska u rekombinantnoj proizvodnji. U određenom unakrsno izmenjenom molekulu Fab koji je koristan za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska, varijabilni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab su razmenjeni. U drugom unakrsno izmenjenom molekulu Fab koji je koristan za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska, konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab su razmenjeni.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži (i) prvi antigen vezujući deo koji je unakrsno izmenjeni molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(ii) drugi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.

U jednoj takvoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34 i antigen vezujući deo FolR1 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 56, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:57, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 59, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 60, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:65.

U jednoj realizaciji, drugi antigen vezujući deo je konvencionalni molekul Fab.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži (i) prvi antigen vezujući deo koji je unakrsno izmenjeni molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.

U jednoj realizaciji, drugi antigen vezujući deo je konvencionalni molekul Fab.

U još jednoj realizaciji, antigen vezujući deo koji je specifičan za FolR1 sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:55 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 64 ili njihove varijante koje zadržavaju funkcionalnost.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži sekvencu polipeptida koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 36, sekvencu polipeptida koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 31, sekvencu polipeptida koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO:55, i sekvencu polipeptida koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 64.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži

(iii) treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1.

U jednoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je konvencionalni molekul Fab. U jednoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je unakrsno izmenjeni molekul Fab.

U jednoj takvoj realizaciji, drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1, obuhvata identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednoj takvoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je identičan sa drugim antigen vezujućim delom.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži (i) prvi antigen vezujući deo koji je unakrsno izmenjeni molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34;

(ii) drugi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.

(iii) treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1) koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65.

U jednoj takvoj realizaciji, antigen vezujući deo CD3 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34 i antigen vezujući deo FolR1 sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 56, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:57, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 59, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 60, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:65.

U jednoj realizaciji, i drugi i treći antigen vezujući deo je konvencionalni molekul Fab.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži

4

(i) prvi antigen vezujući deo koji je unakrsno izmenjeni molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3, sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.

(ii) drugi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.

(iii) treći antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1), sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64.

U jednoj realizaciji, i drugi i treći antigen vezujući deo je konvencionalni molekul Fab.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dodatno sadrži

(iii) treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1.

U jednoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je konvencionalni molekul Fab. U jednoj realizaciji, drugi antigen vezujući deo predstavlja unakrsno izmenjeni molekul Fab.

U jednoj takvoj realizaciji, drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1, obuhvata identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednoj takvoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je identičan sa drugim antigen vezujućim delom.

Tako se u jednoj realizaciji predmetni pronalazak odnosi na bispecifične molekule, pri čemu dva vezujuća dela daju specifično vezivanje za FolR1, a jedan vezujući deo daje specifičnost za antigen CD3 koji aktivira T ćelije. Jedan od teških lanaca je modifikovan da bi se osiguralo pravilno sparivanje teškog i lakog lanca, čime se eliminiše potreba pristupa zajedničkog lakog lanca. Prisutnost dva mesta za vezivanje FolR1 omogućava odgovarajuće angažovanje sa ciljnim antigenom FolR1 i aktivaciju T ćelija.

Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu biti međusobno spojene u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija su prikazani na slikama 1A-I i dodatno opisani u nastavku.

U nekim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno udruživanje. U nastavku su opisani primeri realizacija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, koji sadrži Fc domen.

Formati bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije

Kao što je prikazano iznad i na slikama 1A-I, u jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži najmanje dva Fab fragmenta koja imaju identične lake lance (VLCL) i imaju različite teške lance (VHCL) koji daju specifičnosti dvama različitim antigenima , tj. jedan Fab fragment je sposoban da se specifično vezuje za antigen CD3 koji aktivira T ćelije, a drugi Fab fragment je sposoban da se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije FolR1.

U drugoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži najmanje dva vezujuća dela (molekuli Fab), od kojih je jedan unakrsno izmenjeni molekul Fab, a drugi konvencionalni molekul Fab. U jednoj takvoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, a drugi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR je konvencionalni molekul Fab.

Ove komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu biti međusobno spojene u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija su prikazani na Slici 1A-I.

U nekim realizacijama, prvi i drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednoj takvoj posebnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se u osnovi sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu su prvi i drugi antigen vezujući deo spojeni na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednoj takvoj realizaciji, i prvi i drugi antigen vezujući deo su Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U drugoj takvoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, a drugi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR je konvencionalni molekul Fab.

U jednoj realizaciji, drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena, a prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela. U jednoj takvoj posebnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog i

4

drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi antigen vezujući deo spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela, a drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednoj takvoj realizaciji, i prvi i drugi antigen vezujući delovi su Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U drugoj takvoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, a drugi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR je konvencionalni molekul Fab. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

U drugim realizacijama, prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U takvoj jednoj konkretnoj realizaciji, drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U takvoj jednoj specifičnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi antigen vezujući deo spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, a prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U jednoj takvoj realizaciji, i prvi i drugi antigen vezujući deo su Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U drugoj takvoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, a drugi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR je konvencionalni molekul Fab. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

Antigen vezujući delovi mogu biti spojeni sa Fc domenom ili međusobno direktno ili preko peptidnog veznika, koji sadrži jednu ili više aminokiselina, najčešće oko 2-20 aminokiselina. Peptidni veznici su poznati u struci i ovde su opisani. Pogodni, neimunogeni peptidni veznici uključuju, na primer, (G4S)n(SEQ ID NO: 300), (SG4)n(SEQ ID NO: 301), (G4S)n(SEQ ID NO: 300) ili G4(SG4)n(SEQ ID NO: 302) peptidni veznici, „n“ je uopšteno broj između 1 i 10, tipično između 2 i 4. Posebno pogodan peptidni veznik za međusobno spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog antigen vezujućeg dela je (G4S)2(SEQ ID NO: 303).

4

Primer peptidnog veznika pogodnog za povezivanje teških lanaca Fab prvog i drugog antigen vezujućeg dela je EPKSC(D)-(G4S)2(SEQ ID NO: 304 i 305). Dodatno, veznici mogu da sadrže region šarke imunoglobulina (ili njegov deo). Konkretno, tamo gde je antigen vezujući deo spojen sa N-terminalnim krajem podjedinice Fc domena, može se spojiti preko regiona šarke imunoglobulina ili njegovog dela, sa dodatnim peptidnim veznikom ili bez njega.

Pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, a sastoji se od dva vezujuća dela specifična za ciljni antigen FolR, ima superiorne karakteristike u poređenju sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije, koji sadrži samo jedan vezujući deo specifičan za antigen ciljne ćelije FolR.

Shodno tome, u određenim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska dodatno sadrži treći antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za FolR. U jednoj takvoj realizaciji, drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1, obuhvata identične sekvence regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca i CDR lakog lanca. U jednoj takvoj realizaciji, treći antigen vezujući deo je identičan sa drugim antigen vezujućim delom (tj. oni obuhvataju istu aminokiselinsku sekvencu).

U jednom realizaciji, prvi i treći antigen vezujući deo je svaki spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena, a drugi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U takvoj jednoj specifičnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi i drugi antigen vezujući deo svaki spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena, a treći antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela. U jednoj takvoj realizaciji, prvi, drugi i treći antigen vezujući delovi su konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U drugoj takvoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, a drugi i treći antigen vezujući deo, koji su sposobni da se specifično vezuju za FolR, su konvencionalni molekul Fab. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

Shodno tome, u određenim realizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži pet polipeptidnih lanaca koji formiraju prvi, drugi i treći antigen

4

vezujući deo, pri čemu je prvi antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3, a drugi i treći antigen vezujući deo su sposobni da se vezuju za folatni receptor 1 (FolR1). Prvi i drugi polipeptidni lanac sadrže, u smeru od amino (N)-terminalnog kraja do karboksilnog (C)-terminalnog kraja, prvi varijabilni domen lakog lanca (VLD1) i prvi konstantni domen lakog lanca (CLD1). Treći polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, drugi varijabilni domen lakog lanca (VLD2) i drugi konstantni domen teškog lanca 1 (CH1D2). Četvrti polipeptidni lanac sadrži, u smeru od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, prvi varijabilni domen teškog lanca (VHD1), prvi konstantni domen teškog lanca 1 (CH1D1), prvi konstantni domen teškog lanca 2 (CH2D1) i prvi konstantni domen teškog lanca 3 (CH3D1). Peti polipeptidni lanac sadrži VHD1, CH1D1, drugi varijabilni domen teškog lanca (VHD2), drugi konstantni domen lakog lanca (CLD2), drugi konstantni domen teškog lanca 2 (CH2D2) i drugi konstantni domen teškog lanca 3 (CH3D2). Treći polipeptidni lanac i VHD2 i CLD2 petog polipeptidnog lanca formiraju prvi antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3. Drugi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 petog polipeptidnog lanca formiraju treći vezujući deo sposoban da se vezuje za FolR1. Prvi polipeptidni lanac i VHD1 i CH1D1 četvrtog polipeptidnog lanca formiraju drugi vezujući deo sposoban da se vezuje za FolR1.

U drugoj realizaciji, drugi i treći antigen vezujući deo su spojeni na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve ili druge podjedinice Fc domena, a prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab drugog antigen vezujućeg dela. U takvoj jednoj specifičnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg antigen vezujućeg dela, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi i treći antigen vezujući deo svaki spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem prve podjedinice Fc domena, a prvi antigen vezujući deo je spojen na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab trećeg antigen vezujućeg dela. U jednoj takvoj realizaciji, prvi, drugi i treći antigen vezujući delovi su konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL). U drugoj takvoj realizaciji, prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, a drugi i treći antigen vezujući deo, koji su sposobni da se specifično vezuju za FolR, su konvencionalni molekul Fab. Opciono, laki lanac Fab prvog antigen vezujućeg dela i laki lanac Fab drugog antigen vezujućeg dela mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.

Antigen vezujući delovi mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko

4

peptidnog veznika. U posebnoj realizaciji, antigen vezujući delovi su svaki spojeni sa Fc domenom preko regiona šarke imunoglobulina. U posebnoj realizaciji, region šarke imunoglobulina je region šarke humanog IgG1.

U jednoj realizaciji, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina. U jednoj konkretnoj realizaciji, molekul imunoglobulina je imunoglobulin klase IgG. U još konkretnijoj realizaciji, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG1. U drugoj realizaciji, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG4. U jednoj drugoj konkretnoj realizaciji, imunoglobulin je humani imunoglobulin. U drugim realizacijama, imunoglobulin je himerni imunoglobulin ili humanizovani imunoglobulin.

U konkretnoj realizaciji navedenog bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo se spaja na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, pri čemu su prvi, drugi i treći antigen vezujući deo konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL), pri čemu prvi antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se veže za FolR1, sadrže najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34.

U konkretnoj realizaciji navedenog bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo se spaja na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela, pri čemu su prvi, drugi i treći antigen vezujući deo konvencionalni Fab fragmenti i imaju identične lake lance (VLCL), pri čemu prvi antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 36, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 31; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1, sadrže varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 15, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 31.

U konkretnoj realizaciji navedenog bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula

4

imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo se spaja na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela i prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, pri čemu su varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni i sadrže najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se veže za FolR1, sadrže najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 56 i SEQ ID NO: 57 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 i SEQ ID NO: 65.

U konkretnoj realizaciji navedenog bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, prvi i drugi antigen vezujući deo i Fc domen su deo molekula imunoglobulina, a treći antigen vezujući deo se spaja na C-terminalnom kraju teškog lanca Fab sa N-terminalnim krajem teškog lanca Fab prvog antigen vezujućeg dela i prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 je unakrsno izmenjeni molekul Fab, pri čemu su varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, pri čemu prvi antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za CD3 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 36, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 31; i drugi i treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1, sadrže varijabilni teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 55, varijabilni laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 65.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je jednovalentan za svaki antigen. U posebnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije može da se vezuje za humani CD3 i humani folatni receptor alfa (FolR1), a napravljen je bez upotrebe pristupa hetero-dimerizacije, kao što je, npr., tehnologija „dugme u rupici“. Na primer, molekul se može proizvesti upotrebom biblioteke zajedničkog lakog lanca i tehnologije CrossMab. U posebnoj realizaciji, varijabilni region liganda CD3 se spaja sa domenom CH1 standardnog humanog IgG1 antitela da bi se formirao VLVH ukrštenog molekula (spojen sa Fc) koji je zajednički za obe specifičnosti. Da bi se generisali ukršteni pandani (VHCL), specifični varijabilni domen teškog lanca CD3 se spaja sa konstantnim humanim λ lakog lanca, dok se varijabilni domen teškog lanca specifičan za humani FolR1 (npr. izolovan iz biblioteke zajedničkog lakog lanca) spaja sa konstantnim humanim κ lakim lancem. Dobijeni željeni molekul sa pravilno uparenim lancima sadrži i kapa i lambda lake lance ili njihove fragmente. Shodno tome, ova željena vrsta bispecifičnog molekula može biti prečišćena od pogrešno uparenih ili homodimernih vrsta sekvencijalnim koracima prečišćavanja birajući kapa i lambda laki lanac, u bilo kojoj sekvenci. U jednoj konkretnoj realizaciji, prečišćavanje željenog bispecifičnog antitela koristi naredne korake prečišćavanja korišćenjem KappaSelect i LambdaFabSelect kolone (GE Healthcare) radi uklanjanja neželjenih homodimernih antitela.

Fc domen

Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sastoji se od para polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, od kojih svaka podjedinica sadrži konstantne domene teškog lanca CH2 i CH3 IgG. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedne sa drugom. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ne sadrži više od jednog Fc domena.

U jednoj realizaciji shodno predmetnom pronalasku, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije je Fc domen IgG. U konkretnoj realizaciji, Fc domen je Fc domen IgG1. U drugoj realizaciji, Fc domen je Fc domen IgG4. U konkretnijoj realizaciji, Fc domen je Fc domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji S228 (Kabatova numeracija), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Ova aminokiselinska supstitucija umanjuje in vivo razmenu kraka Fab IgG4antitela (videti Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). U jednoj drugoj konkretnoj realizaciji, Fc domen je humani. Primer sekvence Fc regiona humanog IgG1je dat u SEQ ID NO: 245.

Modifikacije Fc domena koje promovišu heterodimerizaciju

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije shodno predmetnom pronalasku sadrže različite antigen vezujuće ostatke, spojene sa jednom ili drugom podjedinicom Fc domena, stoga su dve podjedinice Fc domena tipično sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšali prinos i čistoća bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije u rekombinantnoj proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije uvede modifikacija koja unapređuje povezivanje željenih polipeptida.

Shodno tome, u konkretnim realizacijama, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg

1

molekula koji aktivira T ćelije shodno predmetnom pronalasku sadrži modifikaciju koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najobimnije proteinskoproteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Stoga, u jednoj realizaciji, navedena modifikacija je u domenu CH3 domena Fc.

U određenoj realizaciji, navedena modifikacija je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju „dugmeta“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena.

Tehnologija „dugme u rupici“ je opisana npr. u US5.731.168; US7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Generalno, metoda podrazumeva uvođenje izbočine („dugmeta“) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine („rupice“) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može postaviti u šupljinu da bi se promovisalo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su konstruisane zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujuće šupljine iste ili slične veličine kao izbočine stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjima (npr. alanin ili treonin).

Shodno tome, u posebnoj realizaciji, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina u CH3 domenu prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina u CH3 domenu druge podjedinice unutar koje izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira.

Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida.

U specifičnoj realizaciji, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena, treoninski ostatak na poziciji 366 je zamenjen triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, tirozinski ostatak na poziciji 407 je zamenjen valinskim ostatkom (Y407V). U jednoj realizaciji, u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak na poziciji 368 je zamenjen alaninskim ostatkom (L368A).

U još jednoj realizaciji, u prvoj podjedinici Fc domena, dodatno je serinski ostatak na

2

poziciji 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), a u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je tirozinski ostatak na poziciji 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C). Uvođenje ova dva cisteinska ostatka dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248,7-15 (2001)).

U konkretnoj realizaciji, antigen vezujući deo sposoban da se vezuje za CD3 je spojen (opciono putem antigen vezujućeg dela koji je sposoban da se vezuje za FolR1 na antigenu ciljne ćelije) sa prvom podjedinicom Fc domena (koja sadrži modifikaciju „dugmeta“). Bez želje da se ograničimo teorijom, spajanje antigen vezujućeg dela koji je sposoban da se vezuje za CD3 sa podjedinicom Fc domena koja sadrži dugme će (dodatno) smanjiti stvaranje antigen vezujućih molekula koji sadrže dva antigen vezujuća dela sposobna da se vezuju za CD3 (sterni sukob dva polipeptida koji sadrže dugme).

U alternativnoj realizaciji, modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje u elektrostatičkim efektima upravljanja, na primer, kao što je opisano u PCT publikaciji WO2009/089004. Generalno, ova metoda podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija je elektrostatički povoljna.

Modifikacije Fc domena koje ukidaju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju Fc domen daje bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dug poluživot u serumu, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom odnosu distribucije tkivo-krv. Istovremeno, on može dovesti do nepoželjnog ciljanja bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, koaktivacija Fc receptorskih signalnih puteva može dovesti do otpuštanja citokina koji, u kombinaciji sa svojstvima aktiviranja T ćelija i dugim poluživotom antigen vezujućeg molekula, dovode do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata kod sistemske primene. Aktivacija imunskih ćelija (koje nose Fc receptor), osim T ćelija, može čak i smanjiti efikasnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije zbog potencijalne destrukcije T ćelija, npr. NK ćelijama.

Shodno tome, u konkretnim realizacijama, Fc domen bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije shodno predmetnom pronalasku ispoljava smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1. U jednoj takvoj realizaciji, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja prema Fc receptoru, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1), i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1). U jednoj realizaciji, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) ne vezuje se značajno za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. U posebnoj realizaciji, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednoj realizaciji, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednoj realizaciji, Fc receptor je aktivacioni Fc receptor. U konkretnoj realizaciji, Fc receptor je aktivacioni humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. U jednoj realizaciji, efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe od CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnoj realizaciji, efektorska funkcija je ADCC. U jednoj realizaciji, Fc domen pokazuje suštinski sličan afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1. Suštinski slično vezivanje za FcRn se postiže kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje afinitet vezivanja veći od oko 70%, konkretno veći od oko 80%, konkretnije veći od oko 90% Fc domena nativnog IgG1(ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1) za FcRn.

U određenim realizacijama, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. U konkretnim realizacijama, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Najčešće su jedna ili više aminokiselinskih mutacija prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. U jednoj realizaciji, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor. U jednoj realizaciji, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor za najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U realizacijama gde postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor za najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U

4

jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži konstruisani Fc domen pokazuje manje od 20%, konkretno manje od 10%, konkretnije manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen. U posebnoj realizaciji, Fc receptor je Fcγ receptor. U nekim realizacijama, Fc receptor je humani Fc receptor. U nekim realizacijama, Fc receptor je aktivacioni Fc receptor. U konkretnoj realizaciji, Fc receptor je aktivacioni humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. Poželjno je da vezivanje za svaki od ovih receptora bude smanjeno. U nekim realizacijama je afinitet vezivanja za komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q takođe smanjen. U jednoj realizaciji, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena prema navedenom receptoru, postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) ima više od oko 70% afiniteta vezivanja nekonstruisanog oblika Fc domena (ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži navedeni nekonstruisani oblik Fc domena) za FcRn. Fc domen, ili bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska koji sadrže navedeni Fc domen, mogu pokazivati više od oko 80%, a čak i više od oko 90% takvog afiniteta. U nekim realizacijama, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije je konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može da obuhvata, ali nije ograničena na, jednu ili više od sledećih stvari: smanjenu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), smanjenu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen-prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenu direktnu signalizaciju koja indukuje apoptozu, smanjeno unakrsno povezivanje antitela vezanih za cilj, smanjenu zrelost dendritskih ćelija, ili smanjeno prajmovanje T ćelija. U jednoj realizaciji, smanjena efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe od smanjenog CDC, smanjenog ADCC, smanjenog ADCP i smanjene sekrecije citokina. U jednoj konkretnoj realizaciji, smanjena efektorska funkcija je smanjeni ADCC. U jednoj realizaciji, smanjeni ADCC je manji od 20% ADCC-a indukovanog nekonstruisanim Fc domenom (ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen).

U jednoj realizaciji, aminokiselinska mutacija koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je aminokiselinska supstitucija. U jednoj realizaciji, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe od E233, L234, L235, N297, P331 i P329. U specifičnijoj realizaciji, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe od L234, L235 i P329. U nekim realizacijama, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A. U jednoj takvoj realizaciji, Fc domen je Fc domen IgG1, posebno Fc domen humanog IgG1. U jednoj realizaciji Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329. U konkretnijoj realizaciji, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, konkretno P329G. U jednoj realizaciji, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329 i drugu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj od E233, L234, L235, N297 i P331. U konkretnijoj realizaciji, dalja aminokiselinska supstitucija je E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U posebnim realizacijama, Fc domen obuhvata aminokiselinske supstitucije na pozicijama P329, L234 i L235. U konkretnijim realizacijama, Fc domen obuhvata mutacije aminokiselina L234A, L235A i P329G („P329G LALA“). U jednoj takvoj realizaciji, Fc domen je Fc domen IgG1, posebno Fc domen humanog IgG1. „P329G LALA“ kombinacija aminokiselinskih supstitucija skoro potpuno ukida vezivanje Fcγ receptora za Fc domen humanog IgG1, kao što je opisano u PCT publikaciji br. WO2012/130831. WO 2012/130831 takođe opisuje metode za pripremu takvih mutantnih Fc domena i metode za određivanje njihovih svojstava, kao što su vezivanja Fc receptora ili efektorske funkcije.

IgG4antitela pokazuju smanjen vezujući afinitet prema Fc receptorima i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1antitelima. Zato je u nekim realizacijama Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska Fc domen IgG4, konkretno Fc domen humanog IgG4. U jednoj realizaciji Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije na poziciji S228, konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Da bi se dodatno smanjio afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegova efektorska funkcija, u jednoj realizaciji Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji L235, konkretno aminokiselinsku supstituciju L235E. U drugoj realizaciji, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329, konkretno aminokiselinsku supstituciju P329G. U jednoj konkretnoj realizaciji, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama S228, L235 i P329, posebno aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i P329G. Takvi mutanti Fc domena IgG4i njihova svojstva vezivanja Fcγ receptora opisani su u PCT publikaciji br. WO 2012/130831.

U jednoj konkretnoj realizaciji, Fc domen koji ispoljava smanjen afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1je Fc domen humanog IgG1koji sadrži aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i opciono P329G, ili Fc domen humanog IgG4koji sadrži aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i opciono P329G.

U određenim realizacijama, N-glikozilacija Fc domena je eliminisana. U jednoj takvoj realizaciji, Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju na poziciji N297, posebno aminokiselinsku supstituciju koja asparagin zamenjuje alaninom (N297A) ili asparaginskom kiselinom (N297D).

Pored Fc domena opisanih gore i u PCT publikaciji br. WO 2012/130831, Fc domeni sa smanjenim vezivanjem za Fc receptor i/ili efektorskom funkcijom, takođe uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US Patent broj 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više pozicija aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).

Mutantni Fc domeni se mogu pripremiti brisanjem , supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom aminokiseline, uz korišćenje genetičkih ili hemijskih metoda dobro poznatih u struci. Genetičke metode mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.

Vezivanje za Fc receptore može se lako odrediti npr. ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) pomoću standardnih instrumenata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Ovde je opisan takav pogodan test vezivanja. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju ćelije koji sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju FcγIIIa receptor.

Efektorska funkcija Fc domena ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži Fc domen, može se izmeriti metodama poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC-a. Drugi primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br.5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No.5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, mogu biti korišćene neradioaktivne metode analiza (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc.

Mountain View, CA); i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može da se odredi in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je objavljeno u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

U nekim realizacijama, vezivanje Fc domena za komponentu komplementa, posebno za C1q, je smanjeno. Shodno tome, u nekim realizacijama, naznačenim time što je Fc domen konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, navedena smanjena efektorska funkcija uključuje smanjeni CDC. Testiranje vezivanja C1q se može obaviti da bi se utvrdilo da li je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sposoban da vezuje C1q i stoga ima CDC aktivnost. Videti, npr., ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg i Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Biološka svojstva i funkcionalne karakteristike bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije

Stručno lice u ovoj oblasti može proceniti povoljnu efikasnost molekula koji selektivno razlikuje kancerogene od nekancerogenih, zdravih ćelija. Jedan od načina da se to postigne je odgovarajućom selekcijom cilja. Markeri eksprimirani isključivo na tumorskim ćelijama se mogu koristiti za selektivno ciljanje efektorskih molekula ili ćelija na tumorskim ćelijama, čime se pošteđuju normalne ćelije koje ne eksprimiraju takav marker. Međutim, u nekim slučajevima se takozvani markeri tumorskih ćelija takođe eksprimiraju u normalnom tkivu, iako na nižim nivoima. Ova ekspresija u normalnom tkivu povećava mogućnost toksičnosti. Stoga se u struci javila potreba za molekulima koji mogu selektivnije ciljati tumorske ćelije. Ovde opisani predmetni pronalazak predviđa bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije i koji selektivno ciljaju FolR1 pozitivne tumorske ćelije, a ne normalne, nekancerogene ćelije koje eksprimiraju FolR1 na niskom nivou ili uopšte ne ekprimiraju. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži najmanje dva, poželjno dva, FolR1 vezujuća dela sa relativno malim afinitetom koji daju efekat avidnosti, što omogućava diferencijaciju između ćelija sa visokom i niskom ekspresijom FolR1. Budući da tumorske ćelije eksprimiraju FolR1 na visokom ili srednjem nivou, ova realizacija predmetnog pronalaska se selektivno vezuje za i/ili indukuje ubijanje tumorskih ćelija, a ne normalnih, nekancerogenih ćelija koje FolR1 eksprimiraju na niskom nivou ili ga uopšte ne eksprimiraju. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije je u 2+1 invertovanom formatu.

U jednoj određenoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ne indukuje ubijanje normalnih ćelija koje na svojoj površini imaju manje od 1000 kopija FolR1.

Pored gore navedenih povoljnih karakteristika, jedna realizacija predmetnog pronalaska ne zahteva hemijsko unakrsno povezivanje ili hibridni pristup za proizvodnju. Shodno tome, u jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji se može proizvoditi u CHO ćelijama. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži humanizovane i humane polipeptide. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ne prouzrokuje unakrsno povezivanje FcgR.

Kao što je gore navedeno, neke realizacije koje se ovde razmatraju uključuju bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije koji imaju dva vezujuća dela koji daju sposobnost specifičnog vezivanja za FolR1 i jedan vezujući deo koji daje specifičnost antigenu CD3 koji aktivira T ćelije, pri čemu svaki pojedinačni vezujući deo FolR1 angažuje antigen sa malim afinitetom. Budući da se molekul sastoji od dva antigen vezujuća dela koja daju sposobnost vezivanjae za FolR1, ukupna avidnost molekula, pored toga, obezbeđuje efikasno vezivanje za ciljne ćelije koje eksprimiraju FolR1 i aktivaciju T ćelija da indukuju efektorsku funkciju T ćelija. Uzimajući u obzir da se FolR1 eksprimira na različitim nivoima na tumorskim ćelijama i da se istovremenoeksprimira na vrlo niskim nivoima (npr. manje od oko 1000 kopija na površini ćelije) u određenim normalnim ćelijama, stručno lice u ovoj oblasti može brzo prepoznati povoljnu efikasnost takvog molekula za primenu u vidu terapijskog sredstva. Takav molekul selektivno cilja tumorske ćelije u odnosu na normalne ćelije. Takav molekul se stoga može dati pojedincu kojem je to potrebno uz znatno manje razloga za zabrinutost zbog toksičnosti koju stvaraju FolR1 pozitivne normalne ćelije u poređenju sa molekulima koji se vezuju za FolR1 sa velikim afinitetom za indukovanje efektorske funkcije. U jednoj poželjnoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije imaju afinitet za jednovalentno vezivanje za huFolR1 u mikromolarnom opsegu i avidnost za huFolR1 u nanomolarnom opsegu.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 10 nM do oko 40 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 10 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje FolR1 čoveka i cinomolgusa sa prividnom KDod oko 10 nM, odnosno oko 30 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 1000 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 1400 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 1400 nM, i FolR1 cinomolgusa sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 5600 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 10 nM i sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 1400 nM.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa prividnom KDod oko 5,36 pM do oko 4 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje FolR1 čoveka i cinomolgusa sa prividnom KDod oko 4 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje mišji FolR1 sa prividnom KDod oko 1,5 nM. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije vezuje humani FolR1 sa vrednošću jednovalentnog vezivanja KDod oko 1000 nM.

Kao što je gore opisano, ovde razmatrani bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu indukovati efektorsku funkciju T ćelija, npr. ekspresija markera na površini ćelije, proizvodnja citokina, ubijanje posredstvom T ćelija. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju FolR1, kao što su humane tumorske ćelije, posredstvom T ćelija. U jednoj realizaciji, T ćelija je CD8pozitivna T ćelija. Primeri humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 uključuju, ali se ne ograničavaju na, Hela, Skov-3, HT-29, i HRCEpiC ćelije. Druge FolR1 pozitivne ćelije humanog raka koje se mogu koristiti za in vitro testiranje su lako dostupne stručnom licu. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro ubijanje humanih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 posredstvom T ćelija sa vrednošću EC50 između oko 36 pM i oko 39573 pM nakon 24 sata. Konkretno se razmatraju bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije, koji indukuju in vitro T ćelijski posredovano ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa vrednošću EC50 od oko 36 pM nakon 24 sata. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro T ćelijski posredovano ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa vrednošću EC50 od oko 178,4 pM nakon 24 sata. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije indukuje in vitro T ćelijski posredovano ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 sa vrednošću EC50 od oko 134,5 pM ili više nakon 48 sata. Vrednost EC50 se može izmeriti metodama poznatim u struci, na primer, metodama koje su ovde otkrivene u primerima.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija indukuje ushodnu regulaciju ekspresije na površini ćelije najmanje jednog od CD25 i CD69 na T ćeliji, koja je izmerena protočnom citometrijom. U jednoj realizaciji, T ćelija je CD4 pozitivna T ćelija ili CD8 pozitivna T ćelija.

U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija vezuje se za FolR1 eksprimiran na humanim tumorskim ćelijama. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija vezuje se za konformacioni epitop na humanom FolR1. U jednoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija ne vezuje se za humani folatni receptor 2 (FolR2) ili za humani folatni receptor 3 (FolR3). U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, antigen vezujući deo se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiseline od 25 do 234 humanog FolR1 (SEQ ID NO:227). U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, antigen vezujući deo FolR1 se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:227, za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu of SEQ ID NO:230 i za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu of SEQ ID NO: 231, pri čemu se antigen vezujući deo FolR1 ne vezuje za polipeptid FolR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:228 ili 229. U jednoj određenoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži antigen vezujući deo FolR1 koji se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:227, 230 i 231, pri čemu se antigen vezujući deo FolR1 ne vezuje za polipeptid FolR koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:228 ili 229 i sadrži antigen vezujući deo CD3 koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34 i dva antigen vezujuća dela FolR1 koji svaki sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 9, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:50, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 52, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 53, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:54.

U jednoj realizaciji bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije prema bilo kojoj od navedenih realizacija, antigen vezujući deo FolR1 se vezuje za polipeptid

1

FolR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:227 i za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu of SEQ ID NO: 231, pri čemu se antigen vezujući deo FolR1 ne vezuje za polipeptid FolR koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:228, 229 ili 230. U jednoj određenoj realizaciji, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži antigen vezujući deo FolR1 koji se vezuje za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:227 i za polipeptid FolR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:231, pri čemu se antigen vezujući deo FolR1 ne vezuje za polipeptid FolR koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:228, 229 ili 230 i sadrži antigen vezujući deo CD3 koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 37, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 38, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:39, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34 i dva antigen vezujuća dela FolR1 koji svaki sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 275, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:315, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.

U odnosu na FolR1, ovde razmatrani bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu imati agonistički, antagonistički ili neutralni efekat. Primeri agonističkog efekta uključuju indukciju ili pojačavanje signalizacije kroz FolR1 nakon angažmana od strane vezujućeg dela FolR1 sa FolR1 receptorima na ciljnoj ćeliji. Primeri antagonističke aktivnosti uključuju ukidanje ili smanjenje signalizacije kroz FolR1 nakon angažmana od strane vezujućeg dela FolR1 sa FolR1 receptorima na ciljnoj ćeliji. Do ovoga može doći, na primer, blokiranjem ili smanjenjem interakcije između folata i FolR1. Sekvencijalne varijante ovde otkrivenih realizacija sa nižim afinitetom uz zadržavanje gore opisanih bioloških svojstava posebno su razmotrene.

Imunokonjugati

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, konjugovan sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapijsko sredstvo, sredstvo za inhibiranje rasta, toksin (npr. enzimski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porijekla ili njegovi fragmenti) ili radioaktivni izotop (tj. radiokonjugat).

Polinukleotidi

Ova objava dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je ovde opisano, ili njegov fragment.

Polinukleotidi uključuju one koji su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sekvencama prikazanim u SEQ ID NO: 151-226, uključujući

2

funkcionalne fragmente ili njihove varijante.

Polinukleotidi koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska mogu se eksprimirati kao jedan polinukleotid koji kodira ceo bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotidi koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati putem, na primer, disulfidnih veza ili drugih sredstava, i tako formirati funkcionalan bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije. Na primer, laki lanac antigen vezujućeg dela može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz segmenta bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži teški lanac antigen vezujućeg dela, podjedinicu Fc domena i opciono drugi antigen vezujući deo (ili njegov segment). Kad su koeksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca kako bi formirali antigen vezujući deo. U drugom primeru, segment bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, koji sadrži jednu od dve podjedinice Fc domena i opciono jedan ili više antigen vezujućih delova (ili njihov segment) može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz segmenta bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koji sadrži drugu od dve podjedinice Fc domena i opciono antigen vezujući deo (ili njegov segment). Kada su koeksprimirane, podjedinice Fc domena će se udružiti da formiraju Fc domen.

U nekim aspektima, izolovani polinukleotid kodira celi bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije shodno predmetnom pronalasku, kao što je ovde opisano. U drugim aspektima, izolovani polinukleotid kodira polipeptide sadržane u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije shodno predmetnom pronalasku, kao što je ovde opisano.

U drugim aspektima, objava obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 i 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223.

U drugim aspektima, objava obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu polipeptida, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 1, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244. U drugim aspektima, objava obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična polinukleotidnoj sekvenci koja je prikazana u SEQ ID NO: 97, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 12, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 246, 247. U drugom aspektu, objava obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je prikazana u SEQ ID NO: 97, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 12, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 246, 247. U drugom aspektu, objava obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona, koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 11,13, 15, 19, 21, 12, 25, 27, 29, 31, 36, 41, 45, 49, 51, 55, 58, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 82, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 12, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135. U drugom aspektu, objava obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptid koji sadrži jednu ili više sekvenci koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične aminokiselinskoj sekvenci u SEQ ID NO: 8, 9, 50, 37, 38 i 39. Ova objava obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ili njegov fragment, pri čemu

4

polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 i 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. Objava takođe obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu polipeptida SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 1, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 i 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.

U određenim realizacijama, polinukleotid ili nukleinska kiselina jeste DNK. U drugim realizacijama, polinukleotid predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK predmetnog pronalaska može biti jednolančana ili dvolančana.

Rekombinantne metode

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska mogu se dobiti, na primer, sintezom peptida na čvrstoj podlozi (npr. Merifildova sinteza u čvrstoj fazi) ili rekombinantnom proizvodnjom. Za rekombinantnu proizvodnju, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul (fragment) koji aktivira T ćelije, npr. kao što je gore opisano, izoluju se i ubacuju u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran korišćenjem konvencionalnih procedura. U jednoj realizaciji, obezbeđuje se vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više polinukleotida predmetnog pronalaska. Metode koje su dobro poznate stručnim licima iz ove oblasti mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula (fragmenta) koji aktivira T ćelije, uz odgovarajuće signale transkripcione/translacione kontrole. Te metode uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Videti, na primer, tehnike opisane u Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili može biti fragment nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji klonira bispecifični antigen vezujući molekul (fragment) koji aktivira T ćelije (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region“ je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona translatovanih u aminokiseline. Iako „stop kodon“ (TAG, TGA ili TAA) nije translatovan u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslatovani regioni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru ili u odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Štaviše, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region, ili može da obuhvata dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona, npr. vektor predmetnog pronalaska može da kodira jedan ili više polipeptida, koji su post- ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina predmetnog pronalaska mogu kodirati heterologe kodirajuće regione, spojene ili nespojene sa polinukleotidom koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije (fragment) predmetnog pronalaska, njegovu varijantu ili njegov derivat. Heterologi kodirajući regioni uključuju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologi funkcionalni domen. Funkcionalna asocijacija se odvija kada se kodirajući region genskog proizvoda, npr. polipeptida, poveže sa jednom regulatornom sekvencom ili više regulatornih sekvenci, tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (regulatornih sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) „funkcionalno su asocirani“ ukoliko indukcija promoterske funkcije dovodi do transkripcije mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne utiče na sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci za usmeravanje ekspresije genskog proizvoda ili na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga bi seregion promotera funkcionalno asocirao sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid da je promoter sposoban za sprovođenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude promoter određen ćelijom koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer, pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu se funkcionalno asocirati sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koji kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, a funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intronom-A), SV40 (npr. rani promoter) i retrovirusa (takav je, npr. Rausov sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i â-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je osobama standardne stručnosti za ovu oblast. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Ekspresiona kaseta može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elemente integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).

Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranih od strane polinukleotida predmetnog pronalaska. Na primer, ako je poželjna sekrecija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, DNK koja kodira signalnu sekvencu može biti postavljena ushodno od nukleinske kiseline koja kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska ili njegov fragment. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz rastućeg lanca proteina širom endoplazmatičnog retikuluma. Lica standardne stručnosti iz ove oblasti su svesne da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka imaju signalni peptid spojen za N-terminalni kraj polipeptida, koji je otcepljen iz translatovanog polipeptida radi stvaranja sekretornog ili „zrelog“ oblika peptida. U određenim realizacijama, koristi se nativni signalni peptid, npr. teški lanac imunoglobulina ili laki lanac signalnog peptida, ili funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja polipeptida sa kojim je funkcionalno asocirana. Alternativno, može se koristiti heterologi signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa se može supstituisati vodećom sekvencom humanog tkivnog aktivatora plazminogena (TPA) ili β-glukuronidaze miša.

DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšavanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, može biti uključena unutar, ili na krajevima bispecifičnog antigen vezujućeg molekula (fragmenta) koji aktivira T ćelije koji kodira polinukleotid.

U još jednoj realizaciji, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan takav polinukleotid predmetnog pronalaska ili više njih. U određenim realizacijama, obezbeđena je ćelija domaćin predmetnog pronalaska koja sadrži jedan takav vektor ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima i vektorima, datim redom. U jednoj takvoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži (npr. prethodno je transformisana ili transfektovana njime) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska. Kao što se ovde koristi, termin „ćelija domaćin“ se odnosi na bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska ili njihove fragmente. Ćelije domaćini koje imaju sposobnost replikacije i podržavanja ekspresije bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transfektovane ili transdukovane u skladu sa određenim ekspresionim vektorom, a velike količine ćelija koje sadrže vektor mogu se uzgajati za zasejavanje velikih fermentora za dobijanje dovoljnih količina bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr. US Patent br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (koji opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); humana embrionska linija bubrega (ćelije 293 ili 293T, kao što opisuju npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što opisuje npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT060562), TRI ćelije (kao što opisuju npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)); MRC5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, npr., uzgajane ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije sadržane u transgenim životinjama, transgenim biljkama ili uzgajanom biljnom ili životinjskom tkivu. U jednoj realizaciji, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija).

U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži teški ili laki lanac antigen vezujućeg domena, kao što je antitelo, mogu se projektovati tako da takođe eksprimiraju i drugi lanac antitela tako da je eksprimirani proizvod antitelo koje ima teški i laki lanac.

U jednoj realizaciji, predviđena je metoda za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije shodno predmetnom pronalasku, pri čemu ova metoda obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je ovde predviđeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, i za izolovanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije genetski su spojene jedna sa drugom. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije može biti projektovan tako da se njegove komponente spoje direktno jedna sa drugom, ili indirektno putem sekvence veznika. Kompozicija i dužina veznika se može odrediti u skladu sa metodama dobro poznatim u struci, i njihova efikasnost se može ispitati. Primeri za sekvence veznika između različitih komponenata bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije nalaze se u ovde navedenim sekvencama. Dodatne sekvence mogu takođe biti uključene da pripoje mesto cepanja da bi se razdvojile pojedine komponente fuzije ako je potrebno, na primer endopeptidazna sekvenca prepoznavanja.

U određenim realizacijama, jedan ili više antigen vezujućih ostataka bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije obuhvataju najmanje jedan varijabilni region antitela sposoban za vezivanje antigenske determinante. Varijabilni regioni mogu da budu deo ili derivati prirodnih ili neprirodno nastalih antitela i njihovih fragmenata. Metode za proizvodnju poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznate u struci (videti npr. Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se ne nalaze u prirodi mogu se izgraditi pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patentu br. 4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih kolekcija koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br.5,969,108 McCafferty).

Antitelo, fragment antitela, antigen vezujući domen ili varijabilni region antitela bilo koje životinjske vrste može se koristiti u bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska. Neograničavajuća antitela, fragmenti antitela, antigen vezujući domeni ili varijabilni regioni korisni u predmetnom pronalasku mogu biti mišjeg, primatskog ili humanog porekla. Ako je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije namenjen za humanu upotrebu, himerni oblik antitela može da se koristi, pri čemu su konstantni regioni antitela humani. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela takođe se može dobiti u skladu sa metodama dobro poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br. 5,565,332, Winter). Humanizacija se može postići različitim metodama uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje nehumanih CDR-ova (npr. donorskih antitela) na humani okvir (npr. antitelo primalac) i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkcija antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci ključni za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju“ sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i metode njihovog stvaranja su pregledani, npr., u Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), i dodatno opisani, npr., u Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent br. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al. Methods 36, 25-34 (2005) (opisuje SDR (a-CDR) graftovanje); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opisuje „površinske promene“); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opisuje „mešanje FR“); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83, 252-260 (2000) (opisuje pristup „vođene selekcije“ kod mešanja FR). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da budu deo ili derivati humanih monoklonskih antitela dobijenih metodom ćelija hibridoma (videti, npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigen (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se takođe generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz biblioteka prikaza faga humanog porekla (videti, npr., Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al., izd., Human Press, Totowa, NJ, 2001); i McCafferty et al., Nature 348, 552–554; Clackson et.al., Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično vrše prikaz fragmenata antitela, bilo kao Fv (scFv) fragmenti s jednim lancem ili kao Fab fragmenti.

U određenim realizacijama, antigen vezujući delovi korisni u predmetnom pronalasku mogu biti projektovani tako da imaju poboljšan afinitet vezivanja shodno, na primer,

1

metodama objavljenim u US Pat. Appl. Publ. br. 2004/0132066. Sposobnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (ispitana na sistemu BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J17, 323-329 (2000)) i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela, fragmenta antitela, antigen vezujućeg domena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen, npr. antitelo koje se takmiči sa antitelom V9 za vezivanje na CD3. U određenim realizacijama, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljni primeri metoda za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) „Epitope Mapping Protocols,“ u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilisani antigen (npr. CD3) je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen (npr. antitelo V9, opisano u US 6,054,297) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije pripremljeni u skladu sa ovde navedenim uputstvom mogu se prečistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, ekskluziona hromatografija, i slično. Stvarni uslovi korišćeni za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd. i biće jasni stručnjacima iz ove oblasti. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom se može koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se vezuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije. Na primer, za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom bispecifičnih antigen vezujućih

2

molekula koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska koristi se matrica sa proteinom A ili proteinom G. Afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i ekskluziona hromatografija se mogu koristiti za izolovanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije suštinski kao što je opisano u Primerima. Čistoća bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom, i slično. Na primer, dokazano je da je teški lanac fuzionog proteina eksprimiran prema opisu u Primerima netaknut i pravilno povezan, kao što je pokazala redukovana SDS PAGE (videti npr. Sliku 2). Tri trake su razložene na približno Mr 25.000, Mr 50.000 i Mr 75.000, što odgovara predviđenim molekulskim masama lakog lanca, teškog lanca i fuzionog proteina teškog lanca/lakog lanca bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije.

Testovi

Ovde navedeni bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.

Testovi za merenje afiniteta

Afinitet bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije prema Fc receptoru ili ciljnom antigenu se može odrediti metodama koje su navedene u primerima pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), pomoću standardnih instrumenata kao što je „BIAcore“ instrument (GE Healthcare), i receptore ili ciljne proteine, kakve je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, vezivanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije za različite receptore ili ciljne antigene može se proceniti korišćenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju određeni receptor ili ciljni antigen, na primer, putem protočne citometrije (FACS). Specifično ilustrativan i egzemplaran primer realizacije za merenje afiniteta vezivanja opisan je u daljem tekstu i u Primerima.

Prema jednoj realizaciji, KDse meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25 °C.

Da bi se analizirala interakcija između Fc dela i Fc receptora, His-označeni rekombinantni Fc receptor je uhvaćen anti-Penta His antitelom („Penta His“ objavljen kao SEQ ID NO: 306) (Qiagen) imobilisan na CM5 čipovima i bispecifični konstrukti se koriste kao analiti. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Anti Penta-His antitelo („Penta-His“ objavljeno kao SEQ ID NO: 306) je razblaženo sa 10 mM natrijum acetat, pH5,0, do 40 μg/ml pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 6500 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja liganda, 1 M etanolamin se injektuje da bi blokirao neizreagovale grupe. Nakon toga se Fc receptor hvata tokom 60 s na 4 ili 10 nM. Za kinetička merenja, četvorostruka serijska razblaženja bispecifičnog konstrukta (raspon između 500 nM i 4000 nM) su injektovana u HBS-EP (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % surfaktant P20, pH 7,4) na 25 °C pri protoku od oko 30 μl/min tokom 120 s.

Da bi se odredio afinitet prema ciljnom antigenu, bispecifični konstrukti su uhvaćeni anti-humanim Fab specifičnim antitelom (GE Healthcare) koje je imobilisano na aktiviranoj površini CM5-senzorskog čipa, kao što je opisano za anti Penta-His antitelo („Penta-His“ objavljeno kao SEQ ID NO: 306). Konačna količina vezanog proteina je oko 12.000 RU. Bispecifični konstrukti su hvatani tokom 90 s na 300 nM. Ciljni antigeni su propuštani kroz protočne ćelije tokom 180 s u opsegu koncentracija od 250 do 1000 nM, uz protok od 30 μl/min. Disocijacija je praćena tokom 180 s.

Varijacije u indeksu prelamanja su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Odgovor stacionarnog stanja je korišćen da bi se dobila konstanta disocijacije KDnelinearnim uklapanjem krive Lengmirove izoterme vezivanja. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) su izračunate pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® T100 Evaluation Software verzija 1.1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol. 293, 865-881 (1999).

Testovi za merenje aktivnosti

Biološka aktivnost bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska može se meriti različitim testovima, kao što je opisano u Primerima. Biološka aktivnost može, na primer, uključivati indukciju proliferacije T ćelija, indukciju signalizacije u T ćelijama, indukciju ekspresije aktivacionih markera u T ćelijama, indukciju sekrecije citokina pomoću T ćelija, indukciju lize ciljnih ćelija, kao što su tumorske ćelije i indukciju regresije tumora i/ili poboljšanje preživljavanja.

Kompozicije, formulacije i načini primene

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak daje farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koji od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska, npr. za primenu u bilo kojoj od metoda lečenja datih u nastavku. U

4

jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugoj realizaciji, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska i najmanje jedno dodatno terapijsko sredstvo, npr. kao što je opisano u nastavku.

Također se obezbeđuje i metoda za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska u obliku pogodnom za davanje in vivo, pri čemu metoda sadrži (a) dobijanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije shodno predmetnom pronalasku, i (b) formulisanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu je priprema bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije formulisana za davanje in vivo.

Farmaceutski preparati predmetnog pronalaska sadrže terapeutski efikasnu količinu jednog ili više bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije rastvorenih ili dispergovanih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo“ se odnose na molekulske entitete i preparate koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama, kao što je, na primer, čovek, po potrebi. Priprema farmaceutskog preparata koji sadrži barem jedan bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije i, opciono, dodatni aktivni sastojak, biće poznata stručnim licima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990. Pored toga, za primenu na životinjama (npr. ljudima), podrazumevaće se da preparati treba da ispune standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima FDA Kancelarije za biološke standarde ili odgovarajućeg autoriteta u drugim zemljama. Poželjni preparati su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Kao što se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljivi nosač“ podrazumeva sve rastvarače, pufere, disperzione medije, premaze, surfaktante, antioksidanse, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungicidne agense), izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije, soli, konzervanse, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijense, dezintegratore, lubrikante, zaslađivače, arome, boje, slične materijale i njihove kombinacije, kao što je poznato stručnim licima u ovoj oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990, str. 1289-1329). Osim u slučaju da je neki od konvencionalnih nosača nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim preparatima se razmatra.

Ovaj preparat može da sadrži različite vrste nosača u zavisnosti od toga da li treba da se primeni u čvrstom, tečnom ili u obliku aerosola i da li je potrebno da bude sterilan za takvu vrstu primene u obliku injekcije. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska (i svi dodatni terapijski agensi) mogu se primenjivati intravenski, intradermalno, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intraslezinski, intrarenalno, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intravaginalno, intrarektalno, intratumoralno, intramuskularno, intraperitonealno, supkutano, supkonjuktivalno, intravezikularno, mukozalno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, topički, lokalno, inhalacijom (npr. inhalacija aerosola), injekcijama, infuzijom, koninualnom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom ciljanih ćelija direktno putem katetera, ispiranja, u kremama, lipidnim kompozicijama (npr. lipozomima) ili drugom metodom ili kombinacijom prethodno navedenog, kao što je poznato stručnim licima iz ove oblasti (videti, na primer. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990). Parenteralna primena, posebno intravenska injekcija, najčešće se koristi za primenu molekula polipeptida, kao što su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska.

Parenteralni preparat obuhvata one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno injektovanje. U pogledu injekcija, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska mogu biti formulisani kao vodeni rastvori, poželjno fiziološki kompatibilni puferi, kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može da sadrži agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni rastvori za injektovanje su pripremljeni mešanjem bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim dolenavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Generalno, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom nosaču koji sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjne metode pripreme su vakuum sušenje ili liofilizacija, kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferisan, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre injektovanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima stvaranja i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil-alkohol ili benzil-alkohol; alkilne parabene, kao što je metilparaben ili propil-paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visokokoncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka se mogu pripremiti u obliku odgovarajućih uljanih suspenzija za injekcije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikulumi uključuju masna ulja, kao što su susamovo ulje ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleati ili trigliceridi ili lipozomi.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences (18. izd. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnim realizacijama, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agenasa za odlaganje apsorpcije, kao što su aluminijummonostearat, želatin ili njihove kombinacije.

Pored prethodno opisanih preparata, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu se formulisati i kao depo preparat. Takve dugodelujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga, na primer, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije se mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju), jonoizmenjivačkim smolama ili slabo rastvorljivim derivatima, na primer, kao slabo rastvorljiva so.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, inkapsuliranja ili liofilizacije. Farmaceutski preparati mogu biti formulisani na konvencionalne načine pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenasa ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije mogu se formulisati u kopreparat u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju kisele adicione soli, npr. one formirane sa slobodnim amino grupama proteinskog sastava ili one formirane sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama poput sirćetne, oksalne, vinske ili bademove kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid, ili organskih baza, kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli uglavnom budu rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.

Metode lečenja i kompozicije

Bilo koji od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije koji su ovde navedeni može se koristiti u metodama lečenja. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska mogu se koristiti kao imunoterapijski agensi, na primer u lečenju raka.

Za upotrebu u metodama lečenja, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska formulišu se, doziraju i primenjuju na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, metodu primene, raspored primene i druge faktore poznate lekarima.

U jednom aspektu, obezbeđuju se bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska koji se koriste kao lek. U daljim aspektima, obezbeđuju se bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim realizacijama, obezbeđuju se bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska za upotrebu u metodi lečenja. U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu u metodi lečenja pojedinca koji ima bolest, koja se sastoji od davanja pojedincu terapeutski efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije. U određenim realizacijama, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnoj realizaciji bolest je rak. U određenim realizacijama, metoda se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest rak. U dodatnim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je ovde opisano, za upotrebu u indukciji lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. U određenim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije za upotrebu u indukciji lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, da izazove lizu ciljne ćelije. Shodno svim gorenavedenim realizacijama, „pojedinac“ je sisar, poželjno čovek.

U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska u proizvodnji ili pripremi medikamenta. U jednoj realizaciji, lek se koristi za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U dodatnoj realizaciji, lek je namenjen za upotrebu u metodi lečenja bolesti koja podrazumeva davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efikasne količine leka. U određenim realizacijama, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U jednoj konkretnoj realizaciji bolest je rak. U jednoj realizaciji, metoda se dalje sastoji od davanja pojedincu terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest rak. U daljnoj realizaciji, lek služi za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. U još jednoj realizaciji, lek je za upotrebu u metodi indukcije lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora, kod pojedinca, koja uključuje davanje pojedincu efikasne količine leka za indukovanje lize ciljnih ćelija. Prema svim gorenavedenim realizacijama „pojedinac“ može da bude sisar, poželjno čovek.

U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za lečenje bolesti. U jednoj realizaciji, metoda se sastoji od davanja pojedincu koji ima takvu bolest terapeutski efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska. U jednoj realizaciji, pomenutom pojedincu se daje prepara, koji sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska, u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim realizacijama, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnoj realizaciji bolest je rak. U određenim realizacijama, metoda se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest rak. Prema svim gorenavedenim realizacijama „pojedinac“ može da bude sisar, poželjno čovek.

U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. U jednoj realizaciji, metoda se sastoji od dovođenja u kontakt ciljne ćelije sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska u prisustvu T ćelije, posebno citotoksične T ćelije. U dodatnom aspektu, obezbeđena je metoda za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora, kod pojedinca. U jednoj takvoj realizaciji, metoda se sastoji od davanja pojedincu efikasne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, za indukovanje lize ciljne ćelije. U jednoj realizaciji, „pojedinac“ je čovek.

U određenim realizacijama, bolest koja se tretira je proliferativni poremećaj, konkretno rak. Neograničavajući primeri raka uključuju rak bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, materice, grlića materice, endometrijalni rak, rak jednjaka, debelog creva, kolorektalni rak, rektalni rak, rak želuca, rak prostate, krvi, kože, karcinom skvamoznih ćelija, rak kostiju i rak bubrega. Ostali poremećaji proliferacije ćelija koji se mogu lečiti pomoću bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja, neoplazme locirane u: stomaku, kostima, dojkama, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (adrenalinskoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajnicima, grudnoj, tiroidnoj žlezdi), očima, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, grudnom košu i urogenitalnom sistemu. Obuhvaćena su i pretkancerozna stanja ili lezije i metastaze raka. U određenim realizacijama, rak je izabran iz grupe koja obuhvata rak renalnih ćelija, rak kože, rak pluća, kolorektalni rak, rak dojke, rak mozga, rak glave i vrata. Stručno lice zna da u mnogim slučajevima bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim realizacijama, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim realizacijama, količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije koja obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „efikasnom količinom“ ili „terapeutski efikasnom količinom“. Ispitanik, pacijent ili pojedinac kome treba lečenje tipično je sisar, konkretnije čovek.

U nekim aspektima, efikasna količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska se daje ćeliji. U drugim aspektima, terapeutski efikasna količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska se daje pojedincu radi lečenja bolesti.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa jednim terapeutskim agensom, ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, načina primene, telesne težine pacijenta, vrste bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, težine i toka bolesti, bilo da se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili istovremene terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnih sastojaka u kompoziciji i odgovarajuću dozu (odgovarajuće doze) za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije se pogodno daje pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg − 10 mg/kg) bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorenavedenih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedan primer doze

1

bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije bio bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim primerima bez ograničenja, doza može da obuhvati od približno 1 mikrogram/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine, približno 10 mikrograma/kg telesne težine, približno 50 mikrograma/kg telesne težine, približno 100 mikrograma/kg telesne težine, približno 200 mikrograma/kg telesne težine, približno 350 mikrograma/kg telesne težine, približno 500 mikrograma/kg telesne težine, približno 1 milligram/kg telesne težine, približno 5 milligrama/kg telesne težine, približno 10 milligrama/kg telesne težine, približno 50 milligrama/kg telesne težine, približno 100 milligrama/kg telesne težine, približno 200 milligrama/kg telesne težine, približno 350 milligrama/kg telesne težine, približno 500 milligrama/kg telesne težine, do približno 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i svaki opseg koji se dobija iz toga. U primerima bez ograničenja opsega dobijenog iz ovde navedenih brojeva, može se primenjivati, na osnovu gore opisanih brojeva, opseg od približno 5 mg/kg telesne težine do približno 100 mg/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine do približno 500 miligrama/kg telesne težine, itd. Stoga jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu da se primenjuju povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od približno dve do približno dvadeset ili npr. približno šest doza bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska će se generalno koristiti u količini efektivnoj za postizanje željene svrhe. Za lečenje ili prevenciju bolesti, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska ili njihovi farmaceutski preparati, daju se ili primenjuju u terapeutski efikasnim količinama. Određivanje terapeutski efikasne količine poznato je stručnjacima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.

U pogledu sistemske administracije, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi kulture ćelija. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao opseg koncentracija u krvotoku koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.

Inicijalne doze mogu se takođe proceniti na osnovu in vivo podataka, npr. životinjski modeli, pomoću tehnika koje su dobro poznate u struci. Lice standardne stručnosti iz ove

2

oblasti može brzo da optimizuje davanje leka ljudima na osnovu podataka o životinjama. Doza i interval primene mogu se pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije u plazmi koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza primene za pacijente putem injekcija ima raspon od oko 0,1 mg/kg/dan do 50 mg/kg/dan, tipično od oko 0,5 mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan. Terapeutski efektivni nivoi plazme mogu se dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi mogu se meriti, na primer, HPLC hromatografijom.

U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, efikasna lokalna koncentracija bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efektivnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.

Terapeutski efikasna doza ovde opisanih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T ćelije uglavnom obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajnije toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili na eksperimentalnim životinjama. Testovi kulture ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50(doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski efikasna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije koji pokazuju velike terapeutske indekse. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije shodno predmetnom pronalaskom pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje opsega doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u opsegu koncentracija u krvotoku koji uključuje ED50sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru opsega u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjenog oblika doze, načina primene, stanja ispitanika i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon uvida u stanje pacijenta (videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, gl.1, str.1).

Lekar zadužen za pacijente koji se leče ovde opisanim bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T ćelije zna kada i kako treba da okonča, prekine ili uskladi primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa i slično. Sa druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načina primene i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim metodama prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.

Ostali agensi i tretmani

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim agensom ili više agenasa tokom terapije. Na primer, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska može biti primenjen uz barem jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens“ obuhvata sve agense za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim realizacijama, dodatni terapeutski agens je imunomodulatorski agens, citostatički agens, inhibitor ćelijske adhezije, citotoksični agens, aktivator ćelijske apoptoze ili agens koji povećava osetljivost ćelija na apoptičke induktore. U posebnoj realizaciji, dodatni terapeutski agens je antikancerogeni agens, na primer, uništavač mikrotubula, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, DNK interkalator, alkilujući agens, hormonska terapija, inhibitor kinaze, antagonist receptora, aktivator apoptoze tumorske ćelije ili antiangiogenski agens.

Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od primenjene količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji se razmatraju u gornjem tekstu. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je ovde opisano, ili od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Takve kombinovane terapije koje su pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u isti preparat ili u različite preparate) i odvojenu primenu, što znači da primena bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T ćelije predmetnog pronalaska mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa zračenjem.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži

4

a) prvo mesto za vezivanje antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 274, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 31; i b) drugo mesto za vezivanje antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 36, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 31 za primenu u kombinaciji sa antitelima na PD-L1 ili FAP-4-1BBL. U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo dalje sadrži treće mesto za vezivanje antigena koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 274, i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 31.

Proizvodi

U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju prethodno opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje sadrži, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za intravenski rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u preparatu je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska. Oznaka ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa preparatom koji se u njemu nalazi, pri čemu preparat sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije predmetnog pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa preparatom koji se u njemu nalazi, pri čemu preparat sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji predmetnog pronalaska može dalje da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da preparat može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Alternativno, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dalje da obuhvata druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Primeri

U nastavku su dati primeri metoda i preparata predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjene razne druge realizacije, na osnovu opšteg opisa koji je ovde dat.

Opšte metode

Tehnike rekombinantne DNK

Za manipulaciju DNK korišćene su standardne metode, kao što je opisano u radu Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača. Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., NIH Publication br.91-3242.

Sekvenciranje DNK

Sekvenciranje DNK je određeno standardnim dvolančanim sekvenciranjem kod Synergene (Schlieren).

Genska sinteza

Željeni segmenti gena, po potrebi, dobijeni su putem PCR pomoću odgovarajućih obrazaca, ili su sintetisani od strane Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR proizvoda pomoću automatizovane genske sinteze. U slučajevima kada nije bila dostupna tačna sekvenca gena, prajmeri oligonukleotida su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa i geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koja potiče iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena okruženi mestima cepanja jedinstvenom restrikcionom endonukleazom klonirani su u standardne klonirajuće/sekvencione vektore. DNK plazmida je prečišćena iz transformisane bakterije i koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranog genskog fragmenta je potvrđena sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima da bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Svi su konstrukti dizajnirani sa DNK sekvencom na 5' kraju koja kodira vodeći peptid koji cilja proteine za izlučivanje u eukariotske ćelije.

Izolovanje primarnih humanih pan T ćelija iz PBMC

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi zdravih humanih donora. Ukratko, sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i pažljivo raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, H8889). Nakon centrifugiranja tokom 30 minuta na 450 x g na sobnoj temperaturi (kočnica je isključena), deo plazme iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačen. PBMC su prebačeni u nove Falcon epruvete od 50 ml i epruvete su napunjene PBS-om do ukupne zapremine od 50 ml. Smeša je centrifugirana na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta na 400 x g (kočnica je uključena). Supernatant je odbačen i pelet PBMC je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja na 4 °C tokom 10 minuta na 350 x g). Dobijena PBMC populacija je prebrojana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u inkubatoru do početka testa.

Obogaćivanje T ćelija iz PBMC-a je izvršeno korišćenjem kompleta za izolaciju pan T ćelija II (Miltenyi Biotec br. 130-091-156), prema uputstvu proizvođača. Ukratko, ćelijski peleti su razblaženi u 40 μl hladnog pufera na 10 miliona ćelija (PBS sa 0,5% BSA, 2 mM EDTA, sterilno filtrirano) i inkubirani sa 10 μl koktela biotin-antitelo na 10 miliona ćelija tokom 10 minuta na 4 °C. Dodato je 30 µl hladnog pufera i 20 μl antibiotinskih magnetnih perlica na 10 miliona ćelija, a zatim je smeša inkubirana još 15 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane dodavanjem zapremine pufera koja je 10-20x veća od trenutne, a zatim centrifugiranjem na 300 x g tokom 10 minuta. Do 100 miliona ćelija je ponovo suspendovano u 500 μl pufera. Magnetno odvajanje neoznačenih humanih pan T ćelija izvršeno je korišćenjem LS kolona (Miltenyi Biotec br. 130-042-401) prema uputstvu proizvođača. Dobijena populacija T ćelija je automatski prebrojana (ViCell) i čuvana u AIM-V medijumu na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru do početka testa (ne duže od 24 h).

Izolovanje primarnih humanih naivnih T ćelija iz PBMC

Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi zdravih humanih donora. Obogaćivanje T ćelija iz PBMC-a izvršeno je korišćenjem kompleta za izolaciju naivnih CD8<+>T ćelija, kompanije Miltenyi Biotec (br.130-093-244), prema uputstvu proizvođača, ali uz preskočen poslednji korak za izolaciju CD8<+>T ćelija (takođe videti opis za izolaciju primarnih humanih pan T ćelija).

Izolovanje mišjih pan T ćelija iz splenocita

Slezine su izolovane iz C57BL/6 miševa, prebačene u GentleMACS C-epruvetu (Miltenyi Biotech br. 130-093-237) koja sadrži MACS pufer (PBS+0,5% BSA 2 mM EDTA) i disocirane sa GentleMACS disocijatorom da bi se dobile suspenzije pojedinačnih ćelija prema uputstvu proizvođača. Ćelijska suspenzija je propuštena kroz filter za predseparaciju kako bi se uklonile preostale nedisocirane čestice tkiva. Nakon centrifugiranja na 400 x g tokom 4 min na 4 °C, ACK pufer za lizu je dodat radi lize crvenih krvnih zrnaca (inkubacija 5 minuta na sobnoj temperaturi). Preostale ćelije su dva puta isprane MACS puferom, prebrojane i korišćene za izolovanje mišjih pan T ćelija. Negativna (magnetna) selekcija je izvršena upotrebom kompleta za izolovanje pan T ćelija, kompanije Miltenyi Biotec (br. 130-090-861), prema uputstvu proizvođača. Dobijena populacija T ćelija automatski je prebrojana (ViCell) i odmah korišćena za dalje testove.

Izolacija primarnih PBMC cinomolgusa iz heparinizovane krvi Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim centrifugiranjem sveže krvi zdravih cinomolgusa kao donora na sledeći način: Heparinizovana krv je razblažena 1:3 sterilnim PBS-om, a Lymphoprep medijum (Axon Lab br. 1114545) je razblažen do 90 % sterilnim PBS-om. Dve zapremine razblažene krvi nanete su preko jedne zapremine razblaženog gradijenta gustine, i PBMC frakcija je odvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta pri 520 x g, bez kočenja, na sobnoj temperaturi. PBMC traka je prebačena u novu Falcon epruvetu od 50 ml i isprana sterilnim PBS-om, centrifugiranjem tokom 10 min pri 400 x g na 4 °C. Izvršeno je jedno centrifugiranje male brzine radi uklanjanja trombocita (15 min pri 150 x g, 4 °C), i dobijena populacija PBMC je automatski prebrojana (ViCell) i odmah korišćena za dalje analize.

Primer 1

Prečišćavanje biotinilovanih Fc fuzija folatnih receptora

Da bi se generisala nova antitela protiv humanog FolR1, generisani su sledeći antigeni i alati za skrining kao jednovalentni Fc fuzioni proteini (ekstracelularni domen antigena povezan sa regionom šarke Fc-dugmeta koji je koeksprimiran sa Fc-rupica molekulom). Geni antigena su sintetisani (Geneart, Regensburg, Njemačka) na osnovu sekvenci dobijenih od GenBank ili SwissProt i umetnuti u ekspresione vektore, da bi se generisali fuzioni proteini sa Fc-dugmetom sa Avi-tagom na C-terminalnom kraju za biotinilaciju in vivo ili in vitro. In vivo biotinilacija je postignuta koekspresijom bakterijskog gena birA koji kodira bakterijsku biotinsku ligazu tokom proizvodnje. Ekspresija svih gena je bila pod kontrolom himernog MPSV promotora na plazmidu koji sadrži oriP element za stabilno održavanje plazmida u EBNA koji sadrži ćelijske linije.

Za pripremu biotinilovanih monomernih molekula antigena/Fc fuzije, eksponencijalno rastuća suspenzija HEK293 EBNA ćelija je kotransfektovana sa tri vektora koji kodiraju dve komponente fuzionog proteina (lanci dugmeta i rupice) kao i BirA, enzim potreban za reakciju biotinilacije. Odgovarajući vektori korišćeni su u odnosu 9,5: 9,5: 1 („antigen ECD-Fc dugme-avi tag“: „Fc rupica“: „BirA“).

Za proizvodnju proteina u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 g, i supernatant je zamenjen prethodno zagrejanim CD CHO medijumom. Ekspresioni vektori su ponovo suspendovani u 20 mL CD CHO medijuma koji sadrži 200 μg vektorske DNK. Nakon dodavanja 540 μg polietilenimina (PEI), rastvor je mešan tokom 15 sekundi, a zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 mL i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 mL medijuma F17 i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije u kulturu je dodata 1 mM valproinska kiselina i 7% Feed 1 (Lonza). Proizvodni medijum je takođe dopunjen sa 100 μM biotina. Nakon uzgajanja tokom 7 dana, ćelijski supernatant je sakupljen centrifugiranjem ćelija tokom 15 minuta na 210 g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 μm), dopunjen natrijum azidom do krajnje koncentracije od 0,01 % (m/V), i čuvan na 4 °C.

Izlučeni proteini su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom proteina A, a zatim ekskluzionom hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap ProteinA HP (CV = 5 mL, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 40 ml 20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata pH 7,5. Vezani protein je eluiran upotrebom linearnog pH gradijenta stvorenog preko 20 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. Kolona je zatim isprana sa 10 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0.

pH prikupljenih frakcija podešen je dodavanjem 1/10 (v/v) 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, pH 6,0.

Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa FolR1-Fc-fuzije analizirana je SDS kapilarnom elektroforezom u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa prateći uputstvo proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Ukupni sadržaj u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorida, 0,02 % (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C.

Prečišćeni antigen-Fc-fuzioni proteini analizirani su testovima površinske plazmonske rezonance upotrebom komercijalno dostupnih antitela, da bi se potvrdila tačna i prirodna konformacija antigena (podaci nisu prikazani).

Tabela 1: Antigeni proizvedeni za izolaciju, selekciju i kontra selekciju humanih antitela FolR1

Tabela 2: Sažetak prinosa i konačnog sadržaja monomera u FolR- Fc- fuzijama.

Primer 2

Generisanje zajedničkog lakog lanca sa CD3ε specifičnošću

Ovde opisani bispecifični molekuli koji aktiviraju T ćelije sadrže barem jedan deo koji vezuje CD3. Ovaj deo može da se generiše imunizacijom laboratorijskih životinja, skriningom biblioteke faga ili upotrebom poznatih anti-CD3 antitela. Zajednički laki lanac sa CD3ε specifičnošću generisan je humanizovanjem lakog lanca mišjeg matičnog anti-CD3ε antitela (CH2527). Za humanizaciju antitela nehumanog porekla, CDR ostaci iz nehumanih antitela (donora) moraju se transplatovati na okvir humanog (akceptorskog) antitela. Generalno, sekvence akceptorskog okvira se biraju poravnavanjem sekvence donora sa kolekcijom potencijalnih akceptorskih sekvenci i odabirom one koja ima ili razumnu homologost sa donorom, ili pokazuje slične aminokiseline na nekim položajima kritičnim za strukturu i aktivnost. U predmetnom slučaju, pretraga akceptorskog okvira antitela je izvršena poravnavanjem sekvence VL domena miša matičnog antitela sa kolekcijom sekvenci humane germinativne linije i odabirom humane sekvence koja je pokazala veliku identičnost sekvence. Iznenađujuće je to da je dobro podudaranje u smislu homologije sekvence okvira pronađeno u prilično retkom humanom lakom lancu koji pripada familiji V-domena 7 tipa lambda, tačnije, hVL_7_46 (IMGT nomenklatura, GenBank prist. br. Z73674). Ovaj retki humani laki lanac je naknadno izabran kao akceptorski okvir za humanizaciju lakog lanca CH2527. Tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) mišjeg varijabilnog domena lakog lanca su graftovana na ovaj akceptorski okvir. Pošto region okvira 4 nije deo varijabilnog regiona germinativne linije gena V, poravnavanje za taj region (J-element) je izvršeno pojedinačno. Stoga je za humanizaciju ovog lakog lanca izabrana sekvenca IGLJ3-02. Generisano je trinaest humanizovanih varijanti (CH2527-VL7_46-1 do VL7_46-10, VL7_46-12 do VL7_46-14). One se razlikuju po ostacima okvira (i njihovim kombinacijama) koji su mutirano vraćeni u sekvencu mišjeg V-domena ili po CDR ostacima (Kabatova definicija) koji se mogu zadržati identičnim sa sekvencom humane germinativne linije. Sledeći ostaci okvira van CDR-a su mutirano vraćeni u mišje ostatke u konačnoj varijanti humanizovanog VL domena VL7_46-13 (navedeni mišji ostaci): V36, E38, F44, G46, G49 i G57, datim redosledom. Humani J-element IGLJ3-02 bio je 100% identičan J-elementu mišjeg matičnog antitela.

Primer 3

SPR procena humanizovanih varijanti sa CD3ε specifičnošću

Humanizovane VL varijante su ocenjene kao himera u 2+1 klasičnom formatu (Slika

1

1D), tj. humanizovani V-domeni lakog lanca su upareni sa mišjim V-domenama teškog lanca. SPR procena je obavljena na instrumentu ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Tačnije, varijante su uhvaćene direktno iz supernatanta kulture na anti-Fab derivatizovanom GLM senzorskom čipu (kozji anti-humani IgG, specifični fragment F(ab’)2, Jackson ImmunoResearch) u vertikalnoj orijentaciji.

Sledeći analiti su nakon toga horizontalno injektovani kao pojedinačne koncentracije, da bi se procenilo vezivanje za CD3ε čoveka i cinomolgusa: 3μM hu CD3ε(-1-26)-Fc(dugme)-avi (ID807) i 2.5μM cy CD3ε-(-1-26)-Fc(dugme)-Avi-Fc(rupica) (ID873), datim redosledom. Odgovori na vezivanje su kvalitativno upoređivani sa vezivanjem mišjeg kontrolnog konstrukta i ocenjeni su (uočeno uporedivo vezivanje), /- (uočeno smanjeno vezivanje) i -(nije uočeno vezivanje). Antitelo za hvatanje je regenerisano nakon svakog ciklusa hvatanja liganda i vezivanja analita, a zatim je mišji konstrukt ponovo injektovan na kraju studije, da bi se potvrdila aktivnost površine hvatanja. Rezultati su sumirani u Tabeli 3.

Tabela 3 Kvalitativna procena vezivanja na osnovu SPR-a za humanizovane varijante

2

lakog lanca u kombinaciji sa mišjim teškim lancem CH2527. Samo je humanizovana varijanta lakog lanca koja je na kraju izabrana, CH2527-VL7_46-13, istaknuta podebljanim slovima, pokazala uporedivo vezivanje za CD3ε čoveka i cinomolgusa.

Primer 4

Svojstva humanizovanog lakog lanca sa CD3ε specifičnošću

Varijanta V-domena lakog lanca koja je izabrana za humanizovani vodeći molekul je VL7_46-13. Određen je stepen humanosti, tj. homologije sekvence humanizovanog V-domena sa sekvencom V-domena humane germinativne linije. Za VL7_46-13, ukupna identičnost sekvence sa najbližim homologom humane germinativne linije iznosi 65% pre humanizacije i 80% nakon toga. Izostavljajući CDR regione, identičnost sekvence iznosi 92% najbližem homologu humane germinativne linije. Kao što se može videti iz tabele 3, VL7_46-13 je jedina humanizovana VL varijanta od panela od 13 varijanti koja je pokazala uporedivo vezivanje za matično mišje antitelo i takođe je zadržala svoju unakrsnu reaktivnost na CD3ε cinomolgusa. Ovaj rezultat ukazuje na to da nije bilo jednostavno humanizovati mišji VL domen bez gubitka afiniteta vezanja za CD3ε što je zahtevalo nekoliko povratnih mutacija na ostatke mišjeg okvira (posebno G46) uz zadržavanje G24 u CDR1. Pored toga, ovaj rezultat pokazuje da VL-domen ima presudnu ulogu u prepoznavanju cilja. Važno je da je humanizovani VL domen VL7_46-13 zasnovan na retkoj humanoj germinativnoj liniji koja pripada familiji V-domena 7 tipa lambda i zadržava afinitet i specifičnost za CD3ε, takođe je pogodan za upotrebu kao zajednički laki lanac u bibliotekama antitela prikazanih faga Fabformata i omogućava uspešnu selekciju za nove specifičnosti što umnogome olakšava stvaranje i proizvodnju bispecifičnih molekula koji se vezuju za CD3ε i npr. cilj tumora i deli isti „zajednički“ laki lanac.

Primer 5

Stvaranje biblioteke antitela prikazanih faga korišćenjem zajedničkog lakog lanca humane germinativne linije izvedene iz HVK1-39

Nekoliko pristupa za stvaranje bispecifičnih antitela koja podsećaju na humani IgG pune dužine koriste modifikacije u Fc regionu koje indukuju heterodimerizaciju dva različita teška lanca. Takvi primeri podrazumevaju tehnologiju dugme-u-rupici (Merchant et al., Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81) SEED (Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202) and electrostatic steering technologies (Gunasekaran et al., J Biol Chem.

2010 Jun 18;285(25):19637-46). Iako ovi pristupi omogućavaju efikasnu heterodimerimizaciju dva različita teška lanca, i dalje ostaje problem odgovarajućeg uparivanja srodnih lakih i teških lanaca. Upotreba zajedničkog lakog lanca (LC) može rešiti ovaj problem (Merchant, et al. Nat Biotech 16, 677-681 (1998)).

Ovde opisujemo stvaranje biblioteke antitela za prikaz na M13 fagu. U osnovi, dizajnirali smo biblioteku sa više okvira za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem. Ova biblioteka je dizajnirana za stvaranje multispecifičnih antitela bez potrebe da se koriste sofisticirane tehnologije, da bi se izbeglo pogrešno uparivanje lakih lanaca.

Upotrebom zajedničkog lakog lanca može se olakšati proizvodnja ovih molekula jer se više ne dolazi do pogrešnog uparivanja i olakšava se izolacija vrlo čistog bispecifičnog antitela. U poređenju sa drugim formatima, upotreba Fab fragmenata kao gradivnih blokova za razliku od npr. upotrebe scFv fragmenata dovodi do veće termičke stabilnosti i nedostatka agregacije scFv i intermolekularne scFv formacije.

Stvaranje biblioteke

U nastavku je opisano stvaranje biblioteke antitela za prikaz na M13 fagu. U osnovi, dizajnirali smo biblioteku sa više okvira za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem.

U biblioteci smo koristili ove teške lance (u zagradama su pristupni brojevi GenBank):

IGHV1-46*01 (X92343) (SEQ ID NO: 104),

IGHV1-69*06 (L22583), (SEQ ID NO: 105)

IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO:106)

IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO: 107)

IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO: 108)

IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO: 109)

Svi teški lanci koriste IGHJ2 kao J-element, osim IGHV1-69*06 koji koristi sekvencu IGHJ6. Dizajn randomizacije je uključivao CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3. Za CDR-H1 i CDR-H2 je izabrana strategija „meke“ randomizacije, a randomizovani oligonukleotidi su bili takvi da je kodon za aminokiselinu sekvence germinativne linije bio prisutan na 50%. Sve ostale aminokiseline, izuzev cisteina, bile su zbirno činile preostalih 50%. U CDR-H3, gde nije prisutna aminokiselina germinativne linije zbog prisustva genetskog D-elementa, dizajnirani su oligonukleotidi koji omogućavaju upotrebu randomizovanih umetaka između V-elementa i J-elementa dužine od 4 do 9 aminokiselina. Ti oligonukleotidi su sadržani u svom randomizovanom delu, npr. tri aminokiseline G/Y/S su prisutne po 15% svaka, dok su aminokiseline A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E prisutne po 4,6% svaka.

Primeri metoda za stvaranje biblioteka antitela su opisani u Hoogenboom et al.,

4

Nucleic Acids Res.1991, 19, 4133-413; Lee et., al J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093. Laki lanac je izveden iz humane sekvence hVK1-39 i koristi se na neizmenjen i nerandomizovan način. To će osigurati da se isti laki lanac može koristiti za druge projekte bez dodatnih modifikacija.

Primeri selekcije biblioteke:

Selekcije sa svim bibliotekama sazrevanja afiniteta se izvode u rastvoru prema sledećem postupku, upotrebom monomernog i biotinilovanog ekstracelularnog domena ciljnog antigena X.

1. 10^12 čestica fagemida svake biblioteke vezano je na 100nM biotinilovanog rastvorljivog antigena tokom 0,5 sati u ukupnoj zapremini od 1ml.2. Biotinilovani antigen se hvata i specifično vezane čestice faga se izoluju dodavanjem ~5 × 10^7 magnetnih perlica obloženih streptavidinom tokom 10 min. 3. Perlice se ispiru korišćenjem 5-10x 1ml PBS/Tween20 i 5-10x 1ml PBS. 4. Elucija čestica faga se vrši dodavanjem 1 ml 100 mM TEA (trietilamin) tokom 10 minuta, a neutralizacija dodavanjem 500ul 1M Tris/HCl pH 7,4 i 5. Ponovna infekcija eksponencijalno rastućom bakterijom E. coli TG1, infekcija pomoćnim fagom VCSM13, a zatim taloženje PEG/NaCl čestica fagemida primenjuje se u sledećim krugovima selekcije. Selekcije se sprovode u 3-5 krugova korišćenjem konstantnih ili smanjenih koncentracija antigena (od 10^-7M do 2x10^-9M). U drugom krugu, hvatanje kompleksa antigen/fag obavljeno je korišćenjem neutravidinskih ploča umesto streptavidinskih perlica. Sve reakcije vezivanja su dopunjene ili sa 100 nM goveđeg serumskog albumina ili sa nemasnim mlekom u prahu, da bi se uhvatili neželjeni klonovi koji nastaju iz samog lepljivog vezivanja antitela za plastičnu podlogu.

Selekcije se sprovode tokom tri ili četiri kruga korišćenjem sve manje koncentracije antigena od početnog antigena od 100 nM i smanjujući na 5 nM u poslednjem krugu selekcije. Specifični ligandi se definišu kao signali oko 5 × viši od osnovnog, i identifikovani su ELISA testom. Specifični ligandi se identifikuju ELISA testom na sledeći način: 100 μl 10nM biotinilovanog antigena po bunarčiću se oblaže na mikrotitarskim pločama neutravidina. Dodaju se bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detektuju se vezujući Fab preko njihovih Flag-tag epitopa korišćenjem sekundarnog antitela anti-Flag/HRP. ELISA-pozitivni klonovi se bakteriološki eksprimiraju kao rastvorljivi Fab fragmenti u formatu sa 96 bunarčića, a supernatanti se podvrgavaju eksperimentu kinetičkog skrininga pomoću SPR analize upotrebom ProteOn XPR36 (BioRad). Identifikuju se klonovi koji eksprimiraju Fab sa najvišim konstantama afiniteta i odgovarajući fagemidi se sekvenciraju. Za daljnju karakterizaciju, Fab sekvence se pojačavaju putem PCR-a iz fagemida i kloniraju se putem odgovarajućih restrikciinih mesta u ekspresione vektore humanog IgG1 za proizvodnju sisara.

Stvaranje biblioteke antitela prikazanih faga korišćenjem zajedničkog lakog lanca specifičnog za humanizovani CD3ε

Ovde je opisano stvaranje biblioteke antitela za prikaz na M13 fagu. U osnovi, dizajnirali smo biblioteku sa više okvira za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem. Ova biblioteka je dizajnirana za generisanje bispecifičnih antitela neaktivnih T ćelija koji sadrže Fc, ali vezuju FcgR izotipa IgG1 P329G LALA ili IgG4 SPLE PG u kojem jedan ili dva Fab prepoznaju površinski antigen tumora eksprimiran na tumorskoj ćeliji, dok preostali krak Fab antitela prepoznaje CD3e na T ćeliji.

Stvaranje biblioteke

U nastavku je opisano stvaranje biblioteke antitela za prikaz na M13 fagu. U osnovi, dizajnirali smo biblioteku sa više okvira za teški lanac sa jednim konstantnim (ili „zajedničkim“) lakim lancem. Ova biblioteka je dizajnirana isključivo za generisanje bispecifičnih antitela neaktivnih T ćelija koji sadrže Fc, ali vezuju FcgR izotipa IgG1 P329G LALA ili IgG4 SPLE PG.

Raznovrsnost je uvedena putem randomizacije oligonukleotida samo u CDR3 različitih teških lanaca. Metode za stvaranje biblioteka antitela dobro su poznate u struci i opisane su u (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 4133-413; ili u: Lee et., al J. Mol. Biol. (2004) 340, 1073-1093).

U biblioteci smo koristili ove teške lance:

IGHV1-46*01 (X92343), (SEQ ID NO:104)

IGHV1-69*06 (L22583), (SEQ ID NO:105)

IGHV3-15*01 (X92216), (SEQ ID NO:106)

IGHV3-23*01 (M99660), (SEQ ID NO:107)

IGHV4-59*01 (AB019438), (SEQ ID NO:108)

IGHV5-51*01 (M99686), (SEQ ID NO:109)

U biblioteci smo koristili laki lanac izveden iz humanizovanog CH2527 specifičnog antitela CD3 ε čoveka i cinomolgusa: (VL7_46-13; SEQ ID NO:112). Ovaj laki lanac nije randomizovan i korišćen je bez dodatnih modifikacija, da bi se osigurala kompatibilnost sa različitim bispecifičnim ligandima.

Svi teški lanci koriste IGHJ2 kao J-element, osim IGHV1-69*06 koji koristi sekvencu IGHJ6. Dizajn randomizacije je bio fokusiran samo na CDR-H3, a dizajnirani su i PCR oligonukleotidi koji omogućavaju upotrebu randomizovanih umetaka između V-elementa i Jelementa dužine od 4 do 9 aminokiselina.

Primer 6

Selekcija fragmenata antitela iz biblioteka zajedničkog lakog lanca (sadrži laki lanac sa CD3ε specifičnošću) do FolR1

Antitela 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8, 19H3, 20G6 i 20H7 koja sadrže zajednički laki lanac VL7_46-13 sa CD3ε specifičnošću, dobijena su selekcijama prikaza faga prema različitim vrstama (čovek, cinomolgus i miš) FolR1. Klonovi 16A3, 15A1, 18D3, 19E5, 19A4, 15H7, 15B6, 21D1, 16F12, 19H3, 20G6 i 20H7 su izabrani iz podbiblioteke u kojoj je zajednički laki lanac bio uparen sa repertoarom teških lanaca na osnovu humane germinativne linije VH1_46. U ovoj podbiblioteci je CDR3 od VH1_46 randomizovan na osnovu 6 različitih dužina CDR3. Klonovi16D5, 15E12, 21A5 i 21G8 su izabrani iz podbiblioteke u kojoj je zajednički laki lanac bio uparen sa repertoarom teških lanaca na osnovu humane germinativne linije VH3_15. U ovoj podbiblioteci je CDR3 od VH3_15 randomizovan na osnovu 6 različitih dužina CDR3. Da bi se dobile vrste unakrsno reaktivnih (ili kod miševa FolR1-reaktivnih) antitela, različite vrste FolR1 su se izmenjivale (ili održavale konstantnim) na različite načine tokom 3 kruga biopanovanja: 16A3 i 15A1 (FolR1 čoveka - cinomolgusa - čoveka); 18D3 (FolR1 cinomolgusa − čoveka − miša); 19E5 i 19A4 (3 kruga prema FolR1 miša); 15H7, 15B6, 16D5, 15E12, 21D1, 16F12, 21A5, 21G8 (FolR1 čoveka − cinomolgusa - čoveka); 19H3, 20G6 i 20H7 (3 kruga prema FolR1 miša).

FolR1 čoveka, miša i cinomolgusa kao antigeni za selekcije faga, kao i ELISA− i skrining na bazi SPR-a, tranzijentno su eksprimirani kao N-terminalna monomerna Fc-fuzija u ćelijama HEK EBNA i in vivo biotinilovani specifično za mesto putem koekspresije biotinske ligaze BirA na avi-tag sekvenci prepoznavanja koja se nalazi na C-terminalnom kraju Fc dela koji nosi receptorski lanac (lanac Fc dugmeta). Da bi se procenila specifičnost za FolR1, dva srodna receptora, humani FolR2 i FolR3 su na isti način generisana.

Krugovi selekcije (biopanovanja) su izvedeni u rastvoru prema sledećem obrascu: 1. Predčišćenje ~ 10<12>čestica fagemida na maxisorp mikrotitarskim pločama obloženim sa 10 ug/ml nevezanog humanog IgG, da bi se iscrple biblioteke antitela koja prepoznaju Fc-deo antigena.

2. Inkubiranje čestica fagemida koje se ne vezuju za Fc sa 100nM biotinilovanog FolR1 čoveka, cinomolgusa ili miša tokom 0,5 sata u prisustvu 100nM nevezanog nebiotinilovanog Fc konstrukta „dugme u rupici“ za dodatnu depleciju Fc liganda u ukupnoj zapremini od 1 ml.

3. Hvatanje biotinilovanog FolR1 i spojenog faga koji se specifično vezuje putem prenosa u 4 bunarčića mikrotitarske ploče koja je prethodno obložena neutravidinom tokom 10 minuta (u krugu 1 i 3).

4. Ispiranje odgovarajućih bunarčića korišćenjem 5x PBS/Tween20 i 5x PBS.

5. Eluiranje čestica faga dodavanjem 250 ul 100 mM TEA (trietilamin) po bunarčiću tokom 10 minuta i neutralizacija dodavanjem 500 ul 1 M Tris/HCl pH 7,4 u sakupljene eluate iz 4 bunarčića.

6. Nakon čišćenja neutralizovanih eluata inkubacijom na mikrotitarskoj ploči koja je prethodno obložena neutravidinom sa 100 nM FolR2 ili FolR3 uhvaćenih biotinom radi konačnog uklanjanja Fc i nespecifičnih liganada.

7. Ponovna infekcija ćelija tokom logaritamske faze E. coli TG1 sa supernatantom eluiranih čestica faga, infekcija pomoćnim fagom VCSM13, inkubacija na vibracionom uređaju na 30 °C preko noći i naknadno taloženje PEG/NaCl čestica fagemida koje će se koristiti u sledećem krugu selekcije.

Selekcije su vršene tokom 3 kruga upotrebom konstantnih koncentracija antigena od 100nM. U 2. krugu, da bi se izbeglo zasićenje liganada neutravidinom, obavljeno je hvatanje kompleksa antigen:fag dodavanjem 5,4 × 10<7>magnetnih perlica obloženih streptavidinom. Specifični ligandi se identifikuju ELISA testom na sledeći način: 100ul 25 nM biotinilovanog FolR1 čoveka, cinomolgusa ili miša i 10 ug/ml humanog IgG naneto je na mikrotitarske ploče sa neutravidinom i maxisorp mikrotitarske ploče, datim redosledom. Dodaju se bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detektuju se vezujući Fab preko njihovih Flag-tag epitopa korišćenjem sekundarnog antitela anti-Flag/HRP. Klonovi koji pokazuju signale na humanom FolR1 i koji su negativni na humani IgG ušli su u uži izbor za daljnje analize i takođe su testirani na sličan način na preostale dve vrste za FolR1. Oni su bakterijski eksprimirani u 0,5 litra zapremine kulture, afinitetno prečišćeni i dalje okarakterisani SPR analizom upotrebom BioRad biosenzora ProteOn XPR36.

Afiniteti (KD) izabranih klonova su izmereni površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom instrumenta ProteOn XPR36 (Biorad) na 25 °C sa biotinilovanim FolR1 čoveka, cinomolgusa i miša, kao i humanim FolR2 i FolR3 (negativne kontrole) imobilisani na NLC čipovima hvatanjem neutravidina. Imobilizacija antigena (ligand): Rekombinantni antigeni su razblaženi PBST-om (10 mM fosfata, 150 mM natrijum hlorid pH 7,4, 0,005% Tween 20) na 10 μg/ml, a zatim injektovani na 30 μl/minut u vertikalnoj orijentaciji.

Injektovanje analita: Za merenja „kinetike u jednom pokušaju“, smer injektovanja je promenjen u vodoravnu orijentaciju, dve serije razblaživanja prečišćenog Fab (različiti opsezi koncentracija) istovremeno su injektovani duž odvojenih kanala 1-5, sa vremenima asocijacije od 200 s i vremenima disocijacije od 600 s. Pufer (PBST) je injektovan duž šestog kanala da bi se dobila „linijska“ slepa proba za referenciranje. Konstante brzine asocijacije (kon) i konstante brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja pomoću softvera ProteOn manager verzija 3.1 simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Tabela 4 prikazuje ravnotežne konstante disocijacije (KD) izabranih klonova specifičnih za FolR1.

Tabela 4: Ravnotežne konstante disocijacije (KD) za antitela anti-FolR1 (Fab-format) izabrane prikazom faga iz podbiblioteka zajedničkog lakog lanca koje sadrže VL7_46-13, humanizovani laki lanac specifičan za CD3ε. KD u nM.

Primer 7

Selekcija fragmenata antitela iz generičkih biblioteka sa više okvira za FolR1 Antitela 11F8, 36F2, 9D11, 5D9, 6B6 i 14E4 dobijena su selekcijama prikaza faga na osnovu generičkih podbiblioteka sa više okvira prema različitim vrstama (čovek, cinomolgus i miš) za FolR1. U ovim podbibliotekama sa više okvira, različiti VL domeni sa randomizovanim CDR3 (3 različite dužine) upareni su sa različitim VH domenima sa randomizovanim CDR3 (6 različitih dužina). Izabrani klonovi su iz sledećih VL/VH uparivanja: 11F8 (Vk_1_5/VH_1_69), 36F2 (Vk_3_20/VH_1_46), 9D11 (Vk2D_28/VH1_46), 5D9 (Vk3_20/VH1_46), 6B6 (Vk3_20/VH1_46) i 14E4 (Vk3_20/VH3_23). Da bi se dobile vrste unakrsno reaktivnih (ili kod miševa FolR1-reaktivnih) antitela, različite vrste FolR1 su se izmenjivale (ili održavale konstantnim) na različite načine tokom 3 ili 4 kruga biopanovanja: 11F8 (FolR1 cinomolgusa − miša − čoveka); 36F2 (FolR1 čoveka − miša − cinomolgusa − miša); 9D11 (FolR1 cinomolgusa − čoveka − cinomolgusa); 5D9 (FolR1 čoveka − cinomolgusa − čoveka); 6B6 (FolR1 čoveka − cinomolgusa − čoveka) i 14E4 (3 kruga prema FolR1 miša).

FolR1 čoveka, miša i cinomolgusa kao antigeni za selekcije faga, kao i ELISA− i skrining na bazi SPR-a, tranzijentno su eksprimirani kao N-terminalna monomerna Fc-fuzija u ćelijama HEK EBNA i in vivo biotinilovani specifično za mesto putem koekspresije biotinske ligaze BirA na avi-tag sekvenci prepoznavanja koja se nalazi na C-terminalnom

1

kraju Fc dela koji nosi receptorski lanac (lanac Fc dugmeta). Da bi se procenila specifičnost za FolR1, dva srodna receptora, humani FolR2 i FolR3 su na isti način generisana.

Krugovi selekcije (biopanovanja) su izvedeni u rastvoru prema sledećem obrascu: 1. Predčišćenje ~ 10<12>čestica fagemida na maxisorp mikrotitarskim pločama obloženim sa 10 ug/ml nevezanog humanog IgG, da bi se iscrple biblioteke antitela koja prepoznaju Fc-deo antigena.

2. Inkubiranje čestica fagemida koje se ne vezuju za Fc sa 100nM biotinilovanog FolR1 čoveka, cinomolgusa ili miša tokom 0,5 sata u prisustvu 100nM nevezanog nebiotinilovanog Fc konstrukta „dugme u rupici“ za dodatnu depleciju Fc liganda u ukupnoj zapremini od 1 ml.

3. Hvatanje biotinilovanog FolR1 i spojenog faga koji se specifično vezuje putem prenosa u 4 bunarčića mikrotitarske ploče koja je prethodno obložena neutravidinom tokom 10 minuta (u krugu 1 i 3).

4. Ispiranje odgovarajućih bunarčića korišćenjem 5x PBS/Tween20 i 5x PBS.

5. Eluiranje čestica faga dodavanjem 250 ul 100 mM TEA (trietilamin) po bunarčiću tokom 10 minuta i neutralizacija dodavanjem 500 ul 1 M Tris/HCl pH 7,4 u sakupljene eluate iz 4 bunarčića.

6. Nakon čišćenja neutralizovanih eluata inkubacijom na mikrotitarskoj ploči koja je prethodno obložena neutravidinom sa 100 nM FolR2 ili FolR3 uhvaćenih biotinom radi konačnog uklanjanja Fc i nespecifičnih liganada.

7. Ponovna infekcija ćelija tokom logaritamske faze E. coli TG1 sa supernatantom eluiranih čestica faga, infekcija pomoćnim fagom VCSM13, inkubacija na vibracionom uređaju na 30 °C preko noći i naknadno taloženje PEG/NaCl čestica fagemida koje će se koristiti u sledećem krugu selekcije.

Selekcije su vršene tokom 3 kruga upotrebom konstantnih koncentracija antigena od 100nM. U 2. i 4. krugu, da bi se izbeglo zasićenje liganada neutravidinom, obavljeno je hvatanje kompleksa antigen:fag dodavanjem 5,4 × 10<7>magnetnih perlica obloženih streptavidinom. Specifični ligandi se identifikuju ELISA testom na sledeći način: 100ul 25 nM biotinilovanog FolR1 čoveka, cinomolgusa ili miša i 10 ug/ml humanog IgG naneto je na mikrotitarske ploče sa neutravidinom i maxisorp mikrotitarske ploče, datim redosledom. Dodaju se bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detektuju se vezujući Fab preko njihovih Flag-tag epitopa korišćenjem sekundarnog antitela anti-Flag/HRP. Klonovi koji pokazuju signale na humanom FolR1 i koji su negativni na humani IgG ušli su u uži izbor za daljnje analize i takođe su testirani na sličan način na preostale dve vrste za FolR1. Oni su bakterijski

1 1

eksprimirani u 0,5 litra zapremine kulture, afinitetno prečišćeni i dalje okarakterisani SPR analizom upotrebom BioRad biosenzora ProteOn XPR36.

Afiniteti (KD) izabranih klonova su izmereni površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom instrumenta ProteOn XPR36 (Biorad) na 25 °C sa biotinilovanim FolR1 čoveka, cinomolgusa i miša, kao i humanim FolR2 i FolR3 (negativne kontrole) imobilisani na NLC čipovima hvatanjem neutravidina. Imobilizacija antigena (ligand): Rekombinantni antigeni su razblaženi PBST-om (10 mM fosfata, 150 mM natrijum hlorid pH 7,4, 0,005% Tween 20) na 10 μg/ml, a zatim injektovani na 30 μl/minut u vertikalnoj orijentaciji. Injektovanje analita: Za merenja „kinetike u jednom pokušaju“, smer injektovanja je promenjen u vodoravnu orijentaciju, dve serije razblaživanja prečišćenog Fab (različiti opsezi koncentracija) istovremeno su injektovani duž odvojenih kanala 1-5, sa vremenima asocijacije od 150 s ili 200 s i vremenima disocijacije od 200 s ili 600 s, datim redosledom. Pufer (PBST) je injektovan duž šestog kanala da bi se dobila „linijska“ slepa proba za referenciranje. Konstante brzine asocijacije (kon) i konstante brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja pomoću softvera ProteOn manager verzija 3.1 simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Tabela 5 prikazuje ravnotežne konstante disocijacije (KD) izabranih klonova specifičnih za FolR1.

Tabela 5: Ravnotežne konstante disocijacije (KD) za antitela anti-FolR1 (Fab-format) izabrane prikazom faga iz generičkih podbiblioteka sa više okvira. KDu nM.

1 2

Primer 8

Proizvodnja i prečišćavanje novih liganada FolR1 u formatima IgG i bispecifičnih T ćelija

Da bi se identifikovali ligandi FolR1 koji su u stanju da indukuju ubijanje, koje zavisi od T ćelija, izabranih ciljnih ćelija antitela izolovanih iz biblioteke zajedničkog lakog lanca ili Fab biblioteke, konvertovani su u odgovarajući format humanog IgG1. Ukratko, varijabilni teški i varijabilni laki lanci jedinstvenih liganada FolR1 iz prikaza faga pojačani su standardnim PCR reakcijama upotrebom Fab klonova kao obrasca. PCR proizvodi su prečišćeni i umetnuti (restrikcionom endonukleazom i kloniranjem na osnovi ligaze ili „rekombinacijom“ pomoću InFusion kompleta od Invitrogena) u pogodne ekspresione vektore u kojima su spojeni sa odgovarajućim humanim konstantnim teškim ili humanim konstantnim lakim lancem. Ekspresione kasete u tim vektorima se sastoje od himernog MPSV promotora i sintetičkog mesta za poliadenilaciju. Pored toga, plazmidi sadrže oriP region iz virusa Epstein Barr za stabilno održavanje plazmida u ćelijama HEK293 koje sadrže EBV nuklearni antigen (EBNA). Nakon transfekcije posredstvom PEI, antitela su tranzijentno proizvedena u ćelijama HEK293 EBNA i prečišćena standardnom afinitetnom hromatografijom ProteinA, za kojom sledi ekskluziona hromatografija, kao što je opisano:

Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

Sva (bispecifična) antitela (ako nisu dobijena iz komercijalnog izvora) koja se ovde koriste, tranzijentno su proizvedena u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. HEK293 EBNA ćelije su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije (za alternativne razmere, sve količine su shodno tome prilagođene). Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 μg DNK. Nakon dodavanja 540 μl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije

1

dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7 % Feed 1. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 μm), dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i čuvan je na 4 °C. Nakon proizvodnje supernatanti su sakupljeni i antitela koja sadrže supernatante su filtrirana kroz sterilne filtere od 0,22 μm i čuvana na 4 °C do prečišćavanja.

Prečišćavanje antitela

Svi molekuli su prečišćeni u dva koraka primenom standardnih postupaka, kao što je afinitetno prečišćavanje proteina A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na HiTrap PA FF (GE Healthcare, zapremina kolone (cv) = 5 ml) ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, pH 7,5). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH gradijenta za pufer B (20 mM natrijum citrat pH 3, 100 mM NaCl, 100 mM glicin) preko 12 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein su objedinjene i pH rastvora pažljivo podešen na pH 6,0 (upotrebom 0,5 M Na2HPO4pH 8,0).

Uzorci su koncentrovani na 2 ml pomoću ultrakoncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius), a zatim su naneti na preparat HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidin, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% Tween-20. Ukupni sadržaj eluiranih frakcija je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 μl svake frakcije naneto na analitičku gel kolonu TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisano u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02 % (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25°C. Frakcije koje sadrže manje od 2 % oligomera su sakupljene i koncentrovane u konačnoj koncentraciji od 1 - 1,5 mg/ml upotrebom ultrakoncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa prateći uputstvo proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su zamrznuti u tečnom N2i čuvani na -80 °C.

Na osnovu in vitro rezultata karakterizacije, izabrani ligandi su konvertovani u format bispecifičnih T ćelija. U tim molekulima, vezujući delovi FolR1:CD3 su poređani po redosledu 2:1 sa FolR1 Fab koji se nalaze na N-terminalnom kraju. Za klonove izolovane iz standardne Fab biblioteke, vezujući deo CD3 je generisan kao CrossFab (CH1Cҡ ukrštanje), dok za klonove iz biblioteke zajedničkog lakog lanca nije bilo potrebno ukrštanje. Ovi

1 4

bispecifični molekuli su proizvedeni i prečišćeni analogno IgG-ima.

Tabela 6: Prinos i sadržaj monomera u novim ligandima FolR1 u formatu IgG, odnosno TCB.

CLC: Zajednički laki lanac

Primer 9

Formati bispecifičnih T ćelija 2+1 i 1+1

Četiri različita formata bispecifičnih T ćelija su pripremljena za jedan ligand

1

zajedničkog lakog lanca (16D5) i tri formata za jedan ligand iz Fab biblioteke (9D11) radi upoređivanja njihovih svojstava ubijanja in vitro.

Standardni format je 2+1 invertovani format, kao što je već opisano (vezujući delovi FolR1:CD3 su poređani po redosledu 2;1 sa FolR1 Tab koji se nalaze na N-terminalnom kraju). U 2+1 klasičnom formatu, vezujući delovi FolR1:CD3 su poređani po redosledu 2:1 sa CD3 Fab koji se nalazi na N-terminalnom kraju. Takođe su pripremljena dva jednovalentna formata. 1+1 od glave do repa ima vezujuće ostatke FolR1:CD3 poređane po redosledu 1:1 na istom kraku molekula sa FolR1 Fab koji se nalazi na N-terminalnom kraju. U 1+1 klasičnom formatu, vezujući delovi FolR1:CD3 su prisutni jednom, svaki na jednom kraku molekula. Za klon 9D11 izolovan iz standardne Fab biblioteke, vezujući deo CD3 je generisan kao CrossFab (CH1Cҡ ukrštanje), dok za 16D5 iz biblioteke zajedničkog lakog lanca nije bilo potrebno ukrštanje. Ovi bispecifični molekuli su proizvedeni i prečišćeni analogno standardno invertovanom formatu bispecifičnih T ćelija.

Tabela 7: Sažetak prinosa i konačnog sadržaja monomera u različitim formatima bispecifičnih T ćelija.

1

Primer 10

Biohemijska karakterizacija liganada FolR1 površinskom plazmonskom rezonancom

Vezivanje liganada FolR1 kao IgG ili u formatu bispecifičnih T ćelija za različite rekombinantne folatne receptore (FolR1, 2 i 3 čoveka, FolR1 miša i FolR1 cinomolgusa; svi kao Fc fuzije) ocenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti su obavljeni na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka).

Pojedinačne injekcije

Prvo su anti-FolR1 IgG analizirani pojedinačnim injekcijama (Tabela 1) kako bi se okarakterisala njihova unakrsna reaktivnost (na humani, mišji i cino FolR1) i specifičnost (na humani FolR1, humani FolR2, humani FolR3). Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša ili folatni receptor 2 i 3 (FolR2-Fc, FolR3-Fc) čoveka, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU. IgG su injektovani tokom 60 sekundi u koncentraciji od 500 nM. IgG koji se vezuju za huFolR2 i huFolR3 su odbačeni zbog nedostatka specifičnosti. Većina liganada je unakrsno reaktivno samo između humanog i cino FolR1, dodatna unakrsna reakcija na mišji FolR1 se većinu vremena odvijala paralelno sa gubitkom specifičnosti.

Tabela 8: Unakrsna reaktivnost i specifičnost 25 novih liganada za folni receptor 1 (kao IgG), kao i dva kontrolna IgG (Mov19 i Farletuzumab). znači vezivanje, − znači da nema vezivanja, /− znači slabo vezivanje.

1

Avidnost prema folatnom receptoru 1

Avidnost interakcije između anti-FolR1 IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđena je kao što je opisano u nastavku (Tabela 9).

Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU. Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije propušteni su u opsegu koncentracija od 2,1 do 500 nM sa protokom od 30 μL/minuti kroz protočne ćelije tokom 180 sekundi. Disocijacija je praćena tokom 600 sekundi. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog IL2 receptora. Za analizu interakcije 19H3 IgG i mišjeg folatnog receptora 1, folat (Sigma F7876) je dodat u radni pufer HBS-EP u koncentraciji od 2,3 μM. Krive vezivanja koje se dobijaju iz dvovalentnog vezivanja IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija, aproksimovane su na Lengmirovo vezivanje 1:1 i uklopljene tim

1

modelom (koje nije pravilno, ali daje ideju o avidnosti). Prividne konstante avidnosti za interakcije su izvedene iz konstanti brzine ovog uklapanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 9: Dvovalentno vezivanje (avidnost sa prividnom KD) izabranih liganada FolR1 kao IgG ili kao bispecifični produkti T ćelija (TCB) za humani i cino FolRl.

1. Afinitet prema folatnom receptoru 1

Afinitet interakcije između anti-FolR1 IgG-a ili bispecifičnih T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđen je kao što je opisano u nastavku (Tabela 10).

Za merenje afiniteta, direktno kuplovanje oko 6000-7000 rezonantnih jedinica (RU) anti-humanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije su uhvaćeni na 20 nM pri protoku od 10 μl/min tokom 20 ili 40 sek., referentna protočna ćelija je ostavljena bez hvatanja. Serija razblaživanja (6,17 do 500 nM ili 12,35 do 3000 nM) Fc fuzije humanog ili cino folatnog receptora 1 propuštene su na svim protočnim ćelijama pri 30 μl/min tokom 120 ili 240 s kako

1

bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 240 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem tokom 60 s 10 mM glicin-HCl pH 2,1 ili pH 1,5. Razlike indeksa prelamanja u rasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem prema Lengmirovom vezivanju 1:1 pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 10: Jednovalentno vezivanje (afinitet) izabranih liganada FolR1 kao IgG ili kao bispecifični produkti T ćelija (TCB) za humani i cino FolR1.

2. Afinitet prema CD3

Afinitet interakcije između anti-FolR1 bispecifičnih T ćelija i rekombinantnih humanih CD3εδ-Fc utvrđen je kao što je opisano u nastavku (Tabela 11).

Za merenje afiniteta, direktno kuplovanje oko 9000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 bispecifične T ćelije su uhvaćene na 20 nM pri protoku od 10 μl/min tokom 40 sek., referentna protočna ćelija je ostavljena bez hvatanja. Serija razblaživanja (6,17 do 500 nM) Fc fuzije humanog CD3εδ propuštene su kroz sve protočne ćelije pri 30 μl/min tokom 240 s da bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 240 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana

11

nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH2,1. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem prema Lengmirovom vezivanju 1:1 pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 11: Jednovalentno vezivanje (afinitet) izabranih FolR1 bispecifičnih T ćelija (TCB) za humani CD3-FC.

Deo za vezivanje CD3 je identičan za sve konstrukte, a afinitet je sličan za izmerene bispecifične T ćelije (opseg KD između 60 i 90 nM).

Primer 11

Istovremeno vezivanje bispecifičnih T ćelija za folatni receptor 1 i CD3

Istovremeno vezivanje anti-FolR1 bispecifičnih T ćelija za rekombinantni folatni receptor 1 i rekombinantni humani CD3εδ-Fc određeno je površinskom plazmonskom rezonancom, kao što je opisano u nastavku. Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU. anti-FolR1 bispecifične T ćelije su injektovane tokom 60 s na 500 nM sa protokom od 30 μL/minuti kroz protočne ćelije, praćeno injektovanjem hu CDεδ-Fc tokom 60 s na 500 nM. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog IL2 receptora. Četiri testirane bispecifične T ćelije (16D5 TCB, 21A5 TCB, 51C7 TCB i 45D2 TCB) mogle su istovremeno da se vezuju za folatni receptor 1 i humani CD3, kao što se očekivalo.

Primer 12

Binovanje epitopa

Za binovanje epitopa, anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije su direktno imobilisane na CM5 čipu pri pH 5,0 pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare), sa konačnim odgovorom oko 700 RU. 500 nM huFolR1-Fc je zatim uhvaćeno tokom 60 s, nakon čega je sledilo 500 nM različitih liganada tokom 30 s. Površina je regenerisana sa dva injektovanja 10 mM glicin pH 2 tokom 30 s svaki. Procenjuje se da li se različiti ligandi mogu vezati za huFolR1 uhvaćen na imobilisanim ligandima (Tabela 12).

Tabela 12: Karakterizacija epitopa izabranih liganada FolR1 kao IgG ili kao bispecifični produkti T ćelija (TCB) za humani FolR1. znači vezivanje, − znači da nema vezivanja, /− znači slabo vezivanje

Na osnovu ovih rezultata i dodatnih podataka sa istovremenim vezivanjem na imobilisanom huFolR1, ligandi su razdvojeni u tri grupe. Nije jasno da li 9D11 ima odvojeni epitop jer istiskuje sve ostale ligande. Čini se da su 16D5 i 21A5 u istoj grupi, a Mov19, Farletuzumab (Coney et al., Cancer Res.1991 Nov 15;51(22):6125-32; Kalli et al., Curr Opin Investig Drugs. 2007 Dec;8(12):1067-73) i 36F2 u drugoj (Tabela 13). Međutim, 36F2 se vezuje za drugačiji epitop od Mov 19 i Farletuzumaba, jer se vezuje za humani, cinomni i mišji FolR1.

Tabela 13: Grupisanje epitopa izabranih liganada FolR1 kao IgG ili kao bispecifični produkti T ćelija (TCB) za humani FolR1

Primer 13

Selekcija liganada

Ligandi FolR1 u IgG formatima su ispitani površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) i in vitro testom na ćelijama, da bi se izabrali najbolji kandidati.

Anti-FolR1 IgG su analizirani SPR-om kako bi se okarakterisala njihova unakrsna reaktivnost (na FolR1 čoveka, miša i cinomolgusa) i specifičnost (na humani FolR1, humani FolR2, humani FolR3). Nespecifično vezivanje za humani FolR2 i 3 se smatralo faktorom isključenja. Vezivanje i specifičnost za humani FolR1 je potvrđeno na ćelijama. Neki ligandi se nisu vezali za ćelije koje eksprimiraju FolR1 iako su prepoznali rekombinantni humani FolR1 u SPR. Temperatura agregacije je određena ali nije bila faktor isključenja, jer su svi izabrani ligandi bili stabilni. Izabrani ligandi su testirani u polireaktivnom ELISA testu radi provere nespecifičnog vezivanja, što je dovelo do isključenja četiri liganda. Ovaj proces je doveo do početne selekcije tri liganda: 36F2 (Fab biblioteka), 9D11 (Fab biblioteka) i 16D5 (zajednički laki lanac). 36F2 se brzo disocirao iz huFolR1 i zbog toga u početku nije bio favorizovan.

Primer 14

Specifično vezivanje novonastalih liganada FolR1 za humane FolR1 pozitivne tumorske ćelije

Novi ligandi FolR1 su generisani putem prikaza faga uz korišćenje Fab biblioteke ili putem biblioteke zajedničkog lakog lanca uz korišćenje lakog lanca CD3. Identifikovani ligandi su konvertovani u humani IgG1 format i usmereni na vezivanje za HeLa ćelije koje visoko ekspremiraju FolR1. Kao referentni molekul je uključen humani FolR1 ligand Mov19. Većina liganada testiranih u ovom testu pokazala je srednje do dobro vezivanje za FolR1, s tim da su se neki klonovi jednako dobro vezali kao Mov19 (videti Sliku 2). Klonovi 16A3, 18D3, 15H7, 15B6, 21D1, 14E4 i 16F12 su isključeni jer se vezivanje za FolR1 na ćelijama nije moglo potvrditi protočnom citometrijom. U sledećem koraku, izabrani klonovi su testirani na specifičnost za humani FolR1 isključivanjem vezivanja za usko povezani humani FolR2. HEK ćelije su tranzijentno transfektovane sa humanim FolR1 ili humanim FolR2 kako bi se navele specifičnosti. Klonovi 36F2 i 9D11 izvedeni iz Fab biblioteke i klonovi 16D5 i 21A5 izvedeni iz CLC biblioteke, vezuju se specifično za humani FolR1, a ne za humani FolR2 (videti Slike 3A-B). Svi ostali testirani klonovi su pokazali najmanje neko vezivanje za humani FolR2 (videti Slike 3A-B). Zbog toga su ti klonovi isključeni iz daljnje

11

karakterizacije. Paralelno je razmatrana unakrsna reaktivnost FolR1 klonova na cino FolR1 izvođenjem studija vezivanja za HEK ćelije koje su tranzijentno transfektovane sa cino FolR1. Svi testirani klonovi su mogli da vežu cino FolR1, a četiri izabrana klona specifična za humani FolR1, 36F2, 9D11, 16D5 i 21A5 vežu uporedivo dobro humani i cino FolR1 (Slika 4). Nakon toga su tri liganda unakrsno reaktivna na humani FolR1 specifično cino konvertovana u TCB format i testirana na indukciju T ćelijskog ubijanja i aktivaciju T ćelija. Ti klonovi su bili 9D11 iz Fab biblioteke i 16D5 i 21A5 iz CLC biblioteke. Kao referentni molekul Mov19 FolR1 TCB je uključen u sve studije. Ovi FolR1 TCB su zatim korišćeni za upoređivanje indukcije internalizacije nakon vezivanja za FolR1 na HeLa ćelijama. Sva tri testirana klona se internalizuju nakon vezivanja za FolR1 što je uporedivo sa internalizacijom nakon vezivanja Mov19 FolR1 TCB (Slika 5).21A5 FolR1 TCB je obustavljen zbog znakova polireaktivnosti.

Primer 15

Ubijanje posredstvom T ćelija ciljnih tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 indukovano FolR1TCB antitelima

FolR1 TCB su korišćeni za određivanje ubijanja posredstvom T ćelija tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1. Panel potencijalnih ciljnih ćelijskih linija je korišćen za određivanje mesta za vezivanje FolR1 putem Qifikit analize.

Korišćeni panel tumorskih ćelija sadrži tumorske ćelije sa visokom, srednjom i niskom stopom ekspresije FolR1 i FolR1 negativnu ćelijsku liniju.

Tabela 14: Mesta za vezivanje FolR1 na tumorskim ćelijama

Vezivanje tri različita FoLR1 TCB (koji sadrže ligande 9D11, 16D5 i Mov19) za ovaj panel tumorskih ćelijskih linija je određeno, da bi se pokazalo da se FolR1 TCB specifično vezuje za FolR1 koji eksprimiraju tumorske ćelije, a ne za FolR1 negativne tumorske ćelijske linije. Količina vezanog konstrukta proporcionalna je nivou ekspresije FolR1 i još uvek postoji dobro vezivanje konstrukata za FolR1 ćelijske linije HT-29 sa niskom stopom ekspresije koja se može detektovati. Pored toga, ne postoji vezivanje negativne kontrole DP47 TCB ni za jednu od korišćenih ćelijskih linija (Slike 6A-E).

Ćelijska linija sa srednjom stopom ekspresije SKOV3 i ćelijska linija sa niskom stopom ekspresije HT-29 dalje su korišćene za ubijanje posredstvom T ćelija i aktivaciju T ćelija pomoću 16D5 TCB i 9D11 TCB; DP47 TCB je uključen kao negativna kontrola. Obe ćelijske linije su ubijene u prisustvu već vrlo niskih nivoa 16D5 TCB i 9D11 TCB i nije bilo razlike u aktivnosti između oba TCB, iako se 9D11 TCB jače vezuje za FolR1 od 16D5 TCB. Ukupno ubijanje ćelija SKOV3 je bilo veće u poređenju sa HT-29, što odražava više nivoe ekspresije FolR1 na ćelijama SKOV3 (Slike 7A-D). U skladu s tim, detektovana je snažna ushodna regulacija aktivacionog markera CD25 i CD69 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama. Aktivacija T ćelija je bila vrlo slična u prisustvu ćelija SKOV3 i ćelija HT-29. Negativna kontrola DP47 TCB ne indukuje nikakvo ubijanje pri korišćenim koncentracijama i nije bilo značajne ushodne regulacije CD25 i CD69 na T ćelijama.

Tabela 15: Vrednosti EC50 za ubijanje tumorskih ćelija i aktivaciju T ćelija sa ćelijama SKOV3

Tabela 16: Vrednosti EC50 za ubijanje tumorskih ćelija i aktivaciju T ćelija sa ćelijama HT-29

11

Primer 16

Vezivanje za eritrocite i aktivacija T ćelija u punoj krvi

Da bismo dokazali da ne dolazi do spontane aktivacije u odsustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1, testirali smo da li postoji vezivanje klonova FolR1 za eritrocite koji mogu potencijalno eksprimirati FolR1. Nismo mogli da uočimo nikakvo specifično vezivanje 9D11 IgG, 16D5 IgG i Mov19 IgG za eritrocite, jer je bila uključena negativna kontrola DP47 IgG (Slika 8).

Da bi se isključilo svako daljnje nespecifično vezivanje za krvne ćelije ili nespecifična aktivacija preko FolR1 TCB, u punu krv su dodati 9D11 TCB, 16D5 TCB i Mov19 TCB i ushodna regulacija CD25 i CD69 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama analiziralna je protočnom citometrijom. DP47 TCB je uključen kao negativna kontrola. Nije se mogla uočiti nikakva aktivacija T ćelija ni sa jednim testiranim konstruktom analizom ushodne regulacije CD25 i CD69 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama (Slika 9).

Primer 17

Uklanjanje mesta N-glikozilacije u lakom lancu 9D11

Tokom analize različitih liganada FolR1 za identifikovanje potencijalnih kritičnih tačaka sekvence, na kraju CDR L3 klona 9D11 identifikovano je putativno mesto N-glikozilacije. Obično se motiv konsenzusa za N-glikozilaciju definiše kao N-X-S/T-X (gde X nije P). Sekvenca CDR L3 (MQASIMNRT) (SEQ ID NO: 61) savršeno odgovara ovom motivu konsenzusa koji ima sekvencu N-R-T. Budući da glikozilacija možda neće biti u potpunosti ponovljiva među različitim proizvodnim serijama, to bi moglo da utiče na vezivanje FolR1, ako glikozilacija u CDR L3 doprinosi vezivanju antigena. Da bi se procenilo da li je ovo mesto N-glikozilacije važno za vezivanje FolR1 ili da li može biti zamenjeno bez narušavanja vezivanja, generisane su različite varijante lakog lanca 9D11 u kojima je mesto N-glikozilacije izmenjeno mutagenezom specifičnom za mesto.

1. Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

11

Četiri bispecifične T ćelije su tranzijentno proizvedene u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. Ćelije HEK293 EBNA su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije (za alternativne razmere, sve količine su shodno tome prilagođene). Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 μg DNK. Nakon dodavanja 540 μl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5 % CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7 % Feed 1. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 μm), dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i čuvan je na 4 °C. Nakon proizvodnje supernatanti su sakupljeni i antitela koja sadrže supernatante su filtrirana kroz sterilne filtere od 0,22 μm i čuvana na 4 °C do prečišćavanja.

2. Prečišćavanje antitela

Svi molekuli su prečišćeni u dva koraka primenom standardnih postupaka, kao što je afinitetno prečišćavanje proteina A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na HiTrap PA HP (GE Healthcare, zapremina kolone (cv) = 5 ml) ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, 0,5 M NaCl, 0,01% Tween-20, pH 7,5). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH gradijenta za pufer B (20 mM natrijum citrat pH 2,5, 0,5 M NaCl, 0,01% Tween-20) preko 20 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein su objedinjene i pH rastvora pažljivo podešen na pH 6,0 (upotrebom 2 M Tris pH 8,0). Uzorci su koncentrovani na 1 ml pomoću ultrakoncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius), a zatim su naneti na Superdex™ 200 10/300 GL (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidin, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% Tween-20. Ukupni sadržaj eluiranih frakcija je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 μl svake frakcije naneto na analitičku gel kolonu TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisano u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02 % (m/v) NaN3, pH 6,7 na

11

25°C. Frakcije koje sadrže manje od 2 % oligomera su sakupljene i koncentrovane u konačnoj koncentraciji od 1 - 1,5mg/ml upotrebom ultrakoncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius). Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa prateći uputstvo proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su zamrznuti u tečnom N2i čuvani na -80 °C.

3. Temperatura agregacije

Stabilnost četiri konstrukta je testirana na Optim1000 (Avacta, PALL Corporation) gradijentnim zagrevanjem od 25° do 80° pri 0,1°C/min. Temperatura se beleži na početku agregacije.

Tabela 34: Prinos, sadržaj monomera i temperatura agregacije četiri isključena mutantna mesta N-glikozilacije liganda 9D11 u 2+1 invertovanom formatu bispecifičnih T ćelija. Sva četiri mutanta su se ponašala slično kao ligand 9D11 divljeg tipa

Generisane su sledeće varijante: N100S (N95S); N100Q (N95Q), T102A (T97A) i T102N (T97N) (Kabatova numeracija je naznačena u zagradi) i konvertovani u format bispecifičnih T ćelija. Nakon tranzijentne proizvodnje u ćelijama HEK293 EBNA i prečišćavanja, analizirane su različite varijante aktivnosti ciljnog vezivanja i ubijanja ćelija u poređenju sa originalnim klonom 9D11.

Tabela 17: Prajmeri koji se koriste za uklanjanje mesta N-glikozilacije u CDR L3 od 9D11 (sekvence videti u nastavku)

11

Primer 18

Vezivanje i ubijanje posredstvom T ćelija sa a-gliko varijantama 9D11

Zbog mesta glikozilacije u CDR-ima proizvedene su četiri različite varijante 9D11 uklanjanjem mutacija mesta glikozilacije (Primer 17). Ove četiri varijante su testirane u poređenju sa originalnim 9D11 na vezivanje za FolR1 na HeLa ćelijama (Slika 10) i indukciju ubijanja tumorskih ćelija na SKOV3 i HT-29 (Slika 11A-B, E-F). Nijedna od varijanti nije pokazala razlike u vezivanju ili indukciji ubijanja tumorskih ćelija. Paralelno je razmatrano nespecifično ubijanje FolR1 negativnih ćelijskih linija MKN-45 (Slike 11C-D). Takođe, nisu uočene razlike između varijanti i originalnog liganda. Nijedan od konstrukata nije indukovao nespecifično ubijanje na FoLR1 negativnim tumorskim ćelijama.

Primer 19

Ekspresija FolR1 na primarnim epitelnim ćelijama

FolR1 se eksprimira na niskim nivoima na primarnim epitelnim ćelijama. Ovde smo željeli da testiramo da li su ti nivoi dovoljni za indukovanje ubijanja posredstvom T ćelija u prisustvu FolR1 TCB. Da bismo to testirali, koristili smo primarne humane epitelne ćelije bronhija, primarnu epitelnu ćeliju horoidnog pleksusa, primarne humane epitelne ćelije korteksa bubrega i primarne humane epitelne ćelije pigmenata mrežnjače. Kao pozitivna kontrola uključene su FolR1 pozitivne ćelije SKOV3 ili ćelije HT-29. Prvo smo potvrdili ekspresiju FolR1 na korišćenim primarnim ćelijama i odredili broj mesta vezivanja FolR1 na tim ćelijama. Epitelne ćelije bronhija, epitelne ćelije korteksa bubrega i epitelne ćelije pigmenata mrežnjače eksprimiraju vrlo niske, ali značajne nivoe FolR1 u poređenju sa eksprimiranim nivoima na tumorskim ćelijama. Epitelne ćelije horoidnog pleksusa ne eksprimiraju značajne nivoe FolR1.

Tabela 18: Mesta za vezivanje FolR1 na primarnim epitelnim ćelijama

11

Primarne epitelne ćelije koje su pokazale ekspresiju FolR1 na površini su korišćene za razmatranje pitanja da li se te ćelije mogu ubiti T ćelijama u prisustvu FolR1 TCB. Značajni nivoi ubijanja nisu mogli biti izmereni, ali je detektovana indukcija aktivacije T ćelija u prisustvu epitelnih ćelija pigmenata mrežnjače, epitelnih ćelija bronhija i ćelija korteksa bubrega, što je dovelo do ushodne regulace CD25 i CD69. Najsnažnija aktivacija je uočena sa epitelnim ćelijama pigmenata mrežnjače, što dovodi do ushodne regulacije CD25 i CD69, kako na CD4<+>T ćelijama, tako i na CD8<+>T ćelijama. U prisustvu epitelnih ćelija bronhija indukuje se niža aktivacija T ćelija sa ushodnom regulacijom CD69 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama, ali vrlo niskom ushodnom regulacijom CD25 samo na CD4<+>T ćelijama, ne i na CD8<+>T ćelijama. Najniža aktivacija T ćelija se dobija u prisustvu epitelnih ćelija bubrega bez ushodne regulacije CD25 na CD4<+>T ćelijama i CD8<+>T ćelijama, a CD69 je ushodno regulisan samo na CD8<+>T ćelijama (Slike 12A-X).

Primer 20

Poređenje različitih formata TCB koji sadrže ligand 16D5 ili 9D11

Da bi se utvrdilo da li je TCB 2+1 invertovani format najaktivniji format sa izabranim ligandom FolR1, proizvedeni su različiti formati koji sadrže 16D5 ili 9D11 i upoređivani su na vezivanje ciljne ćelije, ubijanje posredstvom T ćelija i aktivaciju T ćelija. Ligand 16D5 je testiran u TCB 2+1 invertovanom formatu (Sl. 1A), TCB 2+1 klasičnom formatu (Sl. ID), TCB 1+1 klasičnom formatu (Sl. 1C) i TCB 1+1 od glave do repa formatu (Sl. 1B); ligand 9D11 je testiran u TCB 2+1 invertovanom formatu (Sl.1A), TCB 1+1 klasičnom formatu (Sl.

1C) i TCB 1+1 od glave do repa formatu (Sl.1B).

Svi konstrukti su testirani na vezivanje za FolR1 na HeLa ćelijama. Dvovalentni molekuli za vezivanje na FolR1 se vezuju jače u poređenju sa jednovalentnim konstruktima zbog avidnosti. Razlika između dvovalentnih i jednovalentnih konstrukata je izraženija za 16D5. Razlog može biti taj što je zbog manjeg afiniteta 16D5 efekat avidnosti za ovaj ligand jači. Između dva 1+1 TCB ne postoji značajna razlika u vezivanju, ali postoji razlika između dva 2+1 konstrukta. Invertovani 2+1 konstrukt se jače vezuje za FolR1 od klasičnog 2+1 konstrukta. To ukazuje na to da u klasičnom 2+1 konstruktu na vezivanje za FoLR1 utiče prisustvo CD3 Fab, dok manji uticaj na vezivanje ima u invertovanom konstruktu.

12

Testiranjem ubijanja posredstvom T ćelija, ovim konstruktima bismo mogli da pokažemo da je snažnije vezivanje 2+1 invertovanog TCB konvertovano u jače ubijanje tumorskih ćelija i aktivaciju T ćelija u poređenju sa 2+1 klasičnim TCB. 16D5 FoLR1 TCB 2+1 klasičan je samo malo aktivniji od odgovarajućeg 1+1 konstrukta od glave do repa. Konstrukt 1+1 od glave do repa je znatno aktivniji od 1+1 klasičnog konstrukta. To ne odražava situaciju koja se vidi u vezivanju i može biti zbog boljeg unakrsnog povezivanja sa konstruktom od glave do repa. Ukupno ubijanje tumorskih ćelija i aktivacija T ćelija su uporedivi sa svim testiranim konstruktima, razlike u potenciji koje se vide sa razlikama su samo u pogledu vrednosti EC50. Generalno se može zaključiti da je FolR1 TCB 2+1 invertovan, nezavisno od korišćenog liganda, poželjan format za indukovanje ubijanja tumorskih ćelija posredstvom T ćelija i aktivaciju T ćelija (videti Sl.13A-C i Sl.14A-C).

Tabela 19 Vrednosti EC50 za vezivanje ciljne ćelije i ubijanje posredstvom T ćelija sa različitim formatima TCB

Tabela 20 Vrednosti EC50 za aktivaciju T ćelija u prisustvu ćelija SKOV3 sa različitim formatima TCB

Primer 21

Ćelijske linije tumora i primarne ćelije

HeLa ćelije (CCL-2) su dobijene iz ATCC i uzgajane u DMEM-u sa 10% FCS i 2 mM glutamina, SKOV3 (HTB-77) su dobijene iz ATCC i uzgajane u RPMI sa 10% FCS i 2 mM glutamina, OVCAR5 su dobijene iz NCI i uzgajane u RPMI sa 10% FCS i 2 mM glutamina, HT-29 (ACC-299) su dobijene iz DSMZ i uzgajane u McCoy-evom 5A medijumu sa 10% FCS i 2 mM glutamina, MKN-45 (ACC-409) su dobijene iz DSMZ i uzgajane u RPMI sa 10% FCS i 2 mM glutamina.

Sve testirane primarne epitelne ćelije su dobijene iz ScienCell Research Laboratories. Humane ćelije epitela bronhija (HBEpiC, kataloški broj 3210 su uzgajane u medijumu za epitelne ćelije bronhija (BEpiCM, kat. br. 3211, ScienCell). Humane epitelne ćelije debelog creva (HCoEpiC), kataloški broj 2950 su uzgajane u medijumu za epitelne ćelije debelog creva (CoEpiCM, kat. br. 2951, ScienCell). Humane epitelne ćelije pigmenata mrežnjače (HRPEpiC), kataloški broj 6540 su uzgajane u medijumu za epitelne ćelije (EpiCM, kat. br.

4101, ScienCell). Humane epitelne ćelije korteksa bubrega (HRCEpiC), kataloški broj 4110 su uzgajane u medijumu za epitelne ćelije (EpiCM, kat. br. 4101, ScienCell). Humane epitelne ćelije horoidnog pleksusa (HCPEpiC), kataloški broj 1310 su uzgajane u medijumu za epitelne ćelije (EpiCM, kat. br.4101, ScienCell).

Primer 22

Ciljno vezivanje protočnom citometrijom

Ciljne ćelije, kao što je naznačeno, sakupljene su puferom za disocijaciju ćelija, isprane PBS-om i ponovo suspendovane u FACS puferu. Bojenje antitela je izvedeno u mikrotitracionoj ploči sa okruglim dnom od 96 bunarčića. Zbog toga je zasejano 200.000 ćelija po bunarčiću. Ploča je centrifugirana 4 min na 400 g i supernatant je uklonjen. Testirana antitela su razblažena u FACS puferu i 20 μl rastvora antitela je dodato ćelijama tokom 30 minuta na 4 °C. Da bi se uklonile nevezana antitela , ćelije su isprane dva puta FACS puferom pre dodavanja razblaženog sekundarnog antitela (FITC konjugovani AffiniPure F(ab’)2 fragment kozjeg anti-humanog IgG, Fcg fragment, Jackson ImmunoResearch br.109-096-098 ili PE- konjugovani AffiniPure F(ab')2 fragment kozjeg anti-humanog IgG, specifični Fcg fragment, Jackson ImmunoResearch br. 109-116-170. Nakon 30 minuta inkubacije na 4 °C nevezana sekundarna antitela su isprana. Pre merenja su ćelije ponovo suspendovane u 200 μl FACS pufera i analizirane protočnom citometrijom pomoću BD Canto II ili BD Fortessa.

Primer 23

Internalizacija

Ćelije su sakupljene i određena je vijabilnost. Ćelije su ponovo suspendovane u svežem hladnom medijumu sa 2 miliona ćelija po ml, a ćelijska suspenzija je prebačena u falcon epruvetu od 15 ml za svako antitelo. Antitela koja treba testirati na internalizaciju dodata su u ćelije u konačnoj koncentraciji od 20 μg po ml. Epruvete su inkubirane 45 minuta u hladnoj sobi na vibracionom uređaju. Nakon inkubacije ćelije su isprane tri puta hladnim PBS-om radi uklanjanja nevezanih antitela. 0,2 miliona ćelija po bunarčiću prebačeno je na mikrotitracionu ploču FACS kao nulti vremenski interval. Označene ćelije su ponovo suspendovane u toplom medijumu i inkubirane na 37 °C. U naznačenim vremenskim intervalima, 0,2 miliona ćelija po bunarčiću prebačeno je u hladni PBS, isprano u nanetom stanju na mikrotitracionoj ploči FACS. Da bi se detektovali konstrukti koji ostaju na površini, ćelije su obojene PE-obeleženim anti-humanim Fc sekundarnim antitelom. Zbog toga je

12

dodato 20 μl razblaženog antitela po bunarčiću i mikrotitraciona ploča se inkubirala 30 minuta na 4 °C. Zatim su ćelije isprane dva puta da bi se uklonila nevezana antitela, a zatim fiksirane sa 1% PFA kako bi se sprečila daljnja internalizacija. Fluorescencija je merena pomoću BD FACS CantoII.

Primer 24

QIFIKIT® analiza

QIFIKIT® sadrži niz perlica prečnika 10 μm presvučenih različitim, ali dobro definisanim količinama molekula mišjeg Mab (anti-humani CD5 visokog afiniteta, klon CRIS-1, izotip IgG2a). Perlice oponašaju ćelije sa različitim gustinama antigena koje su obeležene primarnim mišjim Mab, izotipom IgG. Ukratko, stanice su obeležene primarnim mišjim monoklonskim antitelom usmerenim protiv željenog antigena. U odvojenom ispitnom bunarčiću, ćelije su obeležene irelevantnim mišjim monoklonskim antitelom (kontrola izotipa). Zatim su ćelije, perlice za postavljanje i perlice za kalibraciju obeležene anti-mišjim sekundarnim fluorescentno-konjugovanim antitelom, uključenim u komplet. Primarno antitelo koje se koristi za obeležavanje ćelija mora da se koristi u koncentraciji zasićenja. Primarno antitelo može biti bilo koji mišji izotip IgG. U tim uslovima, broj vezanih molekula primarnog antitela odgovara broju antigenih mesta prisutnih na površini ćelije. Sekundarno antitelo se takođe koristi u koncentraciji zasićenja. Shodno tome, fluorescencija je u korelaciji sa brojem vezanih molekula primarnog antitela na ćelijama i perlicama.

Primer 25

Ubijanje tumorskih ćelija posredstvom T ćelija i aktivacija T ćelija

Ciljne ćelije su sakupljene pomoću Trypsin/EDTA, prebrojane i proverena je vijabilnost. Ćelije su ponovo suspendovane u odgovarajućem medijumu u konačnoj koncentraciji od 300.000 ćelija po ml. Zatim je 100 μl suspenzije ciljnih ćelija prebačeno u svaki bunarčić mikrotitracione ploče od 96 bunarčića sa ravnim dnom. Mikrotitraciona ploča je inkubirana preko noći na 37 °C u inkubatoru, da bi se omogućilo lepljenje ćelija za mikrotitracionu ploču. Sledećeg dana su PBMC izolovani iz pune krvi zdravih donora. Krv je razblažena 2:1 PBS-om i prekrivena na 15 ml Histopaque-1077 (br.10771, Sigma-Aldrich) u Leucosep epruvetama i centrifugirana 30 minuta na 450 g bez prekida. Nakon centrifugiranja, traka koja sadrži ćelije je sakupljena pipetom od 10 ml i prebačena u epruvete od 50 ml. Epruvete su napunjene PBS-om do 50 ml i centrifugirane (400 g, 10 min, sobna temperatura). Supernatant je uklonjen i pelet je ponovo suspendovan u PBS-u. Nakon centrifugiranja (300 g, 10 min, sobna temperatura), supernatanti su odbačeni, 2 epruvete su spojene i ponovljen je korak ispiranja (ovaj put centrifugiranje 350xg, 10 min, sobna temperatura). Nakon toga, ćelije su ponovo suspendovane i peleti spojeni u 50 ml PBS-a radi brojanja ćelija. Nakon brojanja, ćelije su centrifugirane (350 g, 10 min, sobna temperatura) i ponovo suspendovane na 6 miliona ćelija po ml u RPMI sa 2% FCS i 2 nM glutamina. Medijum je uklonjen iz obloženih ciljnih ćelija i takođe su dodata testirana antitela razblažena u RPMI sa 2% FCS i 2 nM glutamina. 300.000 ćelija rastvora efektorskih ćelija prebačeno je u svaki bunarčić, što je dovelo do odnosa E:T od 10:1. Da bi se utvrdilo maksimalno otpuštanje, ciljne ćelije su lizirane sa Triton X-100. Oslobađanje LDH je određeno nakon 24 h i 48 h upotrebom kompleta za detekciju citotoksičnosti (br. 1644793, Roche Applied Science). Ushodna regulacija aktivacionog markera na T ćelijama nakon ubijanja tumorskih ćelija izmerena je protočnom citometrijom. Ukratko, PBMC su prikupljeni, prebačeni u mikrotitracionu ploču sa okruglim dnom od 96 bunarčića i obojeni antitelima CD4 PE-Cy7 (br.3557852, BD Bioscience), CD8 FITC (br.555634, BD Bioscience), CD25 APC (br.555434, BD Bioscience), CD69 PE (br.310906, BioLegend) koji su razblaženi u FACS puferu. Nakon 30 minuta inkubacije na 4 °C, ćelije su isprane dva puta FACS puferom. Pre merenja fluorescencije pomoću BD Canto II, ćelije su ponovo suspendovane u 200 μl FACS pufera.

Primer 26

Aktivacija T ćelija u punoj krvi

280 μl sveže krvi je dodato u mikrotitracionu ploču sa konusnim dubokim bunarčićem od 96 bunarčića. Zatim, 20 μl razblaženih TCB je dodato u krv i dobro promešano protresanjem mikrotitracione ploče. Nakon 24 h inkubacije na 37 °C u inkubatoru, krv je pomešana i 35 μl je prebačeno na mikrotitracionu ploču sa okruglim dnom od 96 bunarčića. Zatim je dodato 20 μl smeše za bojenje antitela koja se sastoji od CD4 PE-Cy7 (br.3557852, BD Bioscience), CD8 FITC (br.555634, BD Bioscience), CD25 APC (br.555434, BD Bioscience), CD69 PE (br.310906, BioLegend) i CD45 V500 (br.560777, BD Horizon) i inkubirano 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Pre merenja, u krv je dodato 200 μl sveže pripremljenog rastvora za liziranje BD FACS (br. 349202, BD FCAS). Nakon 15 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, ćelije su izmerene pomoću BD Fortessa.

Primer 27

Studija SDPK (farmakokinetika jednokratnog doziranja) humanizovanog FOLR1 TCB (klon 16D5) na imunodeficijentnim NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) miševima

Ženke NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) miševa, starosti od 6-7 nedelja na početku eksperimenta (odgajane u kompaniji „Taconic“, Danska) su održavane u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim

12

smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2011/128). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.

Miševi su intravenski injektovani sa 10 / 1 / 0,1 μg/mišu FOLR1 TCB, dok je od 3 miša uzeta krv po grupi i vremenskom intervalu. Svi miševi su injektovani ukupnom zapreminom od 200 μl odgovarajućeg rastvora. Da bi se dobila odgovarajuća količina FOLR1 TCB na 200 μl, standardni rastvori su razblaženi PBS-om kada je bilo potrebno. Uzorci seruma su sakupljani 5 min, 1h, 3h, 8h, 24h, 48h, 72h, 96h i 168h nakon terapije injekcijama.

Slika 15 prikazuje da 16D5 FOLR1 TCB pokazuje tipična i prema dozi proporcionalna PK svojstva slična IgG kod NOG miševa sa sporim klirensom.

Tabela 21: Eksperimentalni uslovi.

Primer 28

Efikasnost in vivo FOLR1 TCB (klon 16D5) nakon prenosa humanog PBMC u NOG miševe koji nose Skov3 ćelije

FOLR1 TCB je testiran u humanoj ćelijskoj liniji karcinoma jajnika Skov3, supkutano injektovan u PBMC ugrađen u NOG miševe.

Ćelije karcinoma jajnika Skov3 su dobijene iz ATCC (HTB-77). Ćelijska linija tumora je kultivisana u RPMI-u i sadrži 10% FCS (Gibco) na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom sa 5% CO2. Presejavanje 35 je korišćeno za transplantaciju, pri vijabilnosti > 95%.

5x10<6>ćelija po životinji je supkutano injektovano u desni bok životinja, ukupno 100 μl RPMI

12

medijuma za uzgajanje ćelija (Gibco).

Ženke NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) miševa, starosti od 6-7 nedelja na početku eksperimenta (odgajane u kompaniji „Taconic“, Danska) su održavane u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2011/128). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.

Shodno protokolu (Slika 16), miševi su supkutano injektovani u 0. danu studije sa 5x10<6>ćelija Skov3. U 21. danu studije, humani PBMC zdravog donora je izolovan Ficoll metodom i 10x10<6>ćelija je i.p. injektovano u miševe koji nose tumor. Dva dana kasnije, miševi su randomizovani i u podjednakom broju raspoređeni u pet tretiranih grupa (n=12), a zatim intravenski injektovani sa 10 / 1 / 0,1 μg/mišu FOLR1 TCB ili 10 μg/mišu DP47 kontrolnog TCB jednom nedeljno tokom tri nedelje. Svi miševi su intravenski injektovani sa 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima iz grupe sa vehikulumom ubrizgan je PBS. Da bi se dobila odgovarajuća količina TCB na 200 μl, standardni rastvori su razblaženi PBS-om kada je potrebno. Rast tumora je meren jednom nedeljno pomoću caliper instrumenta (Slika 17), a zapremina tumora je izračunata na sledeći način:

Tv: (W<2>/2) x L (W: Širina, L: Dužina)

Injektovanje FOLR1 TCB jednom nedeljno, dovelo je do antitumorskog efekta zavisnog od doze. Dok je doza od 10 μg/mišu i 1 μg/mišu indukovala smanjenje tumora, to je doza od 0,1 μg/mišu indukovala stagnaciju tumora (Slika 17, Tabela 22). Maksimalno smanjenje tumora je postignuto pri dozi od 10 μg/mišu u poređenju sa neciljanim kontrolnim DP47 TCB.

Tabela 22: Efikasnost in vivo.

12

Za očitavanja PD, žrtvovana su tri miša po tretiranoj grupi u 32. danu studije, tumori su uklonjeni i pripremljene su suspenzije pojedinačnih ćelija enzimskom digestijom pomoću Collagenase V, Dispase II i DNAse za naknadnu FACS analizu (Slika 19 i 20). Pojedinačne ćelije koje su ili direktno koristile za bojenje ekstracelularnih antigena i aktivacionih markera ili su ponovo stimulisane upotrebom 5 ng/ml PMA i 500 ng/ml Ionomicina u prisustvu inhibitora transporta proteina Monensin tokom 5 h u uobičajenom medijumu za uzgajanje. Nakon ponovne stimulacije, ćelije su obojene površinskim antigenima, nakon čega je sledio korak fiksacije i permeabilizacije. Fiksni uzorci su zatim obojeni intracelularno za TNF-α, IFN-γ, IL-10 i IL-2 i analizirani protočnom citometrijom. Isti postupak je korišćen za degranulaciju ćelija, ali je tokom perioda ponovne stimulacije dodato antitelo anti-CD107a i fiksni uzorci su obojeni za intracelularne sadržaje perforina i granzima-B. FACS analiza je otkrila statistički veći broj infiltrirajućih CD4<+>i CD8<+>T ćelija u tumorskom tkivu nakon tretmana sa FOLR1 TCB u poređenju sa nosačem i neciljanim kontrolnim TCB. Štaviše, veći broj TNF-α, IFN-γ i IL-2 koji se proizvode, kao i perforin<+>/granzim-B<+>CD4<+>i CD8<+>T ćelija je detektovano u FOLR1 TCB tretiranim tumorima. T ćelije koje se infiltriraju u tumore tretirane sa FOLR1 TCB takođe su pokazale veće stope degranulacije u odnosu na kontrolne grupe.

U 38. danu kraja studije, sve životinje su žrtvovane; tumori su uklonjeni i izmereni (Slika 18). Težina tumora tretiranih sa 10 i 1 μg/mišu FOLR1 TCB pokazala je statistički značajnu razliku u odnosu na kontrolne skupine.

Tabela 23: Eksperimentalni uslovi.

12

Primer 29

Generisanje bispecifičnog FolR1 / CD3− kapa − lambda antitela

Da bi se generisalo bispecifično antitelo (jednovalentno za svaki antigen) koje se istovremeno može vezati za humani CD3 i humani folatni receptor alfa (FolR1) bez upotrebe bilo kakvog pristupa hetero-dimerizacije (npr. tehnologija „dugmeta u rupici“), primenjena je kombinacija biblioteke zajedničkog lakog lanca sa takozvanom tehnologijom CrossMab: Varijabilni region humanizovanog liganda CD3 (CH2527_VL7_46/13) se spajao sa domenom CH1 standardnog humanog IgG1 antitela kako bi se formirao VLVH ukrštenog molekula (spojen sa Fc) koji je zajednički za obe specifičnosti. Da bi se generisali ukršteni pandani (VHCL), specifični varijabilni domen teškog lanca CD3 (CH2527_VH_23/12) se spajao sa konstantnim humanim λ lakog lanca, dok se varijabilni domen teškog lanca specifičan za humani FolR1 (clone 16D5, izolovan iz biblioteke zajedničkog lakog lanca) spajao sa konstantnim humanim κ lakim lancem. To omogućava prečišćavanje željenog bispecifičnog antitela primenom narednih koraka prečišćavanja korišćenjem KappaSelect i LambdaFabSelect kolone (GE Healthcare) radi uklanjanja neželjenih homodimernih antitela.

Svi ekspresioni vektori antitela su generisani primenom standardne tehnologije rekombinantne DNK, kao što je opisano u Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema preporukama proizvođača. Geni ili fragmenti gena su pojačani lančanom reakcijom polimeraze (PCR) ili su generisani iz sintetičkih oligonukleotida u Geneart AG (Regensburg, Nemačka) automatizovanom sintezom gena. PCR-pojačani ili subklonirani DNA fragmenti su potvrđeni DNK sekvenciranjem (Synergene GmbH, Švajcarska). Plazmidna DNK je transformisana i pojačana u odgovarajućim sojevima domaćina E. coli za pripremu plazmidne DNK transfekcione klase korišćenjem standardnih kompleta Maxiprep (Qiagen). Za proizvodnju

12

bispecifičnih molekula gde su HEK293 EBNA ćelije transfektovane plazmidima koji kodiraju odgovarajuće gene primenom standardne metode na bazi polietilenimina (PEI). Upotrebljeni odnos plazmida tri ekspresiona vektora bio je 1:1:1. Transfektovane ćelije su uzgajane 7 dana pre nego što su sakupljeni supernatanti za prečišćavanje. Bispecifična FolR1 / CD3− kapa − lambda antitela su proizvedena i prečišćena na sledeći način.

1. Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

Bispecifična kapa-lambda antitela su tranzijentno proizvedena u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. Ćelije HEK293 EBNA su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije (za alternativne razmere, sve količine su shodno tome prilagođene). Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 μg DNK. Nakon dodavanja 540 μl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5 % CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7 % Feed 1. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 μm ) i dodat je natrijum azid u finalnoj koncentraciji od 0,01 % m/V, i čuvan je na 4 °C.

2. Prečišćavanje

Bispecifično kapa-lambda antitelo je prečišćeno u tri koraka, primenom koraka afiniteta specifičnog za kapa lake lance, zatim koraka afiniteta specifičnog za lambda lake lance i konačno koraka ekskluzione hromatografije za uklanjanje agregata. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na matricu kapa afiniteta Capture Select, ili HiTrap KappaSelect, GE Healthcare, zapremina kolone (cv) = 1 ml, ekvilibrisan sa 5 zapremina kolone (cv) pufera A (50 mM Tris, 100 mM glicin, 150 mM NaCl, pH 8,0). Nakon ispiranja sa 15 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH gradijenta za pufer B (50 mM Tris, 100 mM glicin, 150 mM NaCl, pH 2,0) preko 25 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein su objedinjene i pH rastvora podešen na pH 8,0 (upotrebom 2 M Tris pH 8,0). Neutralisane objedinjene frakcije su nanete na matricu lambda afiniteta Capture Select (sada: HiTrap LambdaFabSelect, GE Healthcare, zapremina

1

kolone (cv) = 1 ml) ekvilibrisan sa 5 zapremina kolone (cv) pufera A (50 mM Tris, 100 mM glicin, 150 mM NaCl, pH 8,0). Nakon ispiranja sa 15 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH gradijenta za pufer B (50 mM Tris, 100 mM glicin, 150 mM NaCl, pH 2,0) preko 25 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein su objedinjene i pH rastvora podešen na pH 8,0 (upotrebom 2 M Tris pH 8,0). Rastvor je koncentrovan pomoću ultrakoncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius), a zatim su naneti na Superdex™ 200 10/300 GL (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidin, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% Tween-20. Objedinjene frakcije su nakon ekskluzije veličine ponovo koncentrovane pomoću ultrakoncentratora (Vivaspin 15R 30.000 MWCO HY, Sartorius).

Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa, po uputstvu proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Samo male količine proteina su mogle da se prečiste sa konačnim prinosom od 0,17 mg/L.

Primer 30

Ubijanje posredstvom T ćelija sa bispecifičnim FolR1 / CD3− kapa - lambda antitelom

Aktivnost kapa lambda FolR1 TCB testirana je na ćelijama SKOV3 u prisustvu sveže izolovanih PBMC-a. Kao negativna kontrola je uključen DP47 TCB. Ubijanje ćelija SKOV3 posredstvom T ćelija određeno je nakon 24 h i 48 h oslobađanjem LDH. Nakon 48 h, T ćelije su sakupljene i ushodna regulacija CD69 i CD25 na CD4 T ćelijama i CD8 T ćelijama je izmerena protočnom citometrijom.

Kapa lambda FolR1 konstrukt indukuje ubijanje ćelija SKOV3 na način zavistan od koncentracije, koji je praćen ushodnom regulacijom CD69 i CD25 i na CD4 T ćelijama i na CD8 T ćelijama.

Ćelije SKOV3 su inkubirane sa PBMC u prisustvu kapa lambda FoLR1 TCB ili DP47 TCB. Ubijanje tumorskih ćelija nakon 24 h i 48 h određeno je merenjem oslobađanja LDH (Sl. 21). Ćelije SKOV3 su inkubirane sa PBMC u prisustvu kapa lambda FoLR1 TCB ili DP47 TCB. Nakon 48 h, ushodna regulacija CD25 i CD69 na CD4 T ćelijama i CD8 T ćelijama je izmerena protočnom citometrijom (Sl.22).

Primer 31

Biohemijska karakterizacija FolRl liganada 16D5 i 36F2 površinskom plazmonskom rezonancom

1 1

Vezivanje anti-FolR1 16D5 u različitim jednovalentnim ili dvovalentnim formatima bispecifičnih T ćelija i anti-FolR1 36F2 kao IgG ili kao bispecifične T ćelije za rekombinantni folatni receptor 1 čoveka, cinomolgusa i miša (svi kao Fc fuzije) ocenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, GE Healthcare).

1. Testirani molekuli

Molekuli koji su korišćeni za određivanje afiniteta i avidnosti su opisani u Tabeli 24. Tabela 24: Naziv i opis 6 konstrukata koji su korišćeni u SPR analizi

2. Avidnost prema folatnom receptoru 1

Avidnost interakcije između anti-FolR1 IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđena je kao što je opisano u nastavku (Tabela 25).

Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, GE Healthcare). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU.

1 2

Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije propušteni su u opsegu koncentracija od 3,7 do 900 nM sa protokom od 30 μL/minuti kroz protočne ćelije tokom 180 sekundi. Disocijacija je praćena 240 ili 600 sekundi. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 30 s 10 mM glicin-HCl pH 2. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog mišjeg CD134. Krive vezivanja koje se dobijaju iz dvovalentnog vezivanja IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija, aproksimovane su na Lengmirovo vezivanje 1:1 (čak i da je to 1: 2 vezivanje) i uklopnjene tim modelom da bi se dobila prividna KD koja predstavlja avidnost dvovalentnog vezivanja. Prividne konstante avidnosti za interakcije su izvedene iz konstanti brzine ovog uklapanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare). Za 1+1 format bispecifičnih T ćelija, interakcija je realno 1:1, a KD predstavlja afinitet jer u ovom konstruktu postoji samo jedan ligand FolR1.

Tabela 25: Dvovalentno vezivanje (avidnost sa prividnom KD) anti-FolR1 16D5 i 36F2 kao IgG ili kao bispecifični produkti T ćelija (TCB) za humani, cino i mišji FolR1.

3. Afinitet prema folatnom receptoru 1

Afinitet interakcije između anti-FolR1 IgG ili bispecifičnih T ćelija i rekombinantnih

1

folatnih receptora utvrđen je kao što je opisano u nastavku (Tabela 26).

Za merenje afiniteta, direktno kuplovanje oko 12000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije su hvatani na 20 nM pri protoku od 10 μl/min tokom 40 sek., referentna protočna ćelija je ostavljena bez hvatanja. Serija razblaživanja (12,3 do 3000 nM) Fc fuzije humanog, cino ili mišjeg folatnog receptora 1 propuštene su kroz sve protočne ćelije pri 30 μl/min tokom 240 s da bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 300 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH 1,5. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem prema Lengmirovom vezivanju 1:1 pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 26: Jednovalentno vezivanje (afinitet) anti-FolR116D5 i 36F2 kao IgG ili kao bispecifični produkti T ćelija (TCB) za humani, cino i mišji FolR1.

1 4

Afinitet (jednovalentno vezivanje) prema humanom i cino FolR1-Fc za 36F2 TCB sličan je kod oba i iznosi oko 1000 nM, dok je afinitet za mišji FolR1-Fc nešto bolji i iznosi oko 300 nM. 36F2 se može koristiti u modelima miševa i primata, nema potrebe za surogatom. Avidnost (prividna KD) 36F2 TCB za humani FolR1 je oko 30 puta niža od afiniteta 16D5 TCB za humani FolR1. U dvovalentnom formatu, 36F2 TCB se nalazi u niskom nanomolarnom opsegu, dok je 16D5 TCB u niskom pikomolarnom opsegu (razlika 1000 puta).

FolR1 se eksprimira na prekomerno eksprimiranim tumorskim ćelijama, na nestalnim i visokim nivoima, na površini ćelija raka u spektru epitelnih malignih tumora, uključujući rak jajnika, dojke, bubrega, debelog creva, pluća i drugih čvrstih vrsta raka, a takođe je eksprimiran na apikalnoj površini ograničenog podskupa polarizovanih epitelnih ćelija u normalnom tkivu. Ove netumorske, normalne ćelije eksprimiju FolR1 samo na niskim nivoima i uključuju, npr., bronhiolalne epitelne ćelije na alveolarnoj površini, luminalnoj granici korteksa bubrega ćelija tubula, pigmentni epitel mrežnjače (bazolateralna membrana) i horoidni pleksus.

16D5 TCB se vezuje na ćelije normalnog tkiva koje eksprimiraju male količine FolR1 što dovodi do ubijanja posredstvom T ćelija. To bi, barem delimično, moglo da objasni ograničenu podnošljivost uočenu na 10 µg/kg kod cinomolgus majmuna. Pronalazači su želeli da utvrde da li smanjenje afiniteta bispecifičnog molekula T ćelija može da poveća diferencijaciju između tkiva velike i male ciljne gustine, a time i nižu toksičnost primenom dvovalentnog vezivanja i avidnosti. Ligandi sa niskim afinitetom se obično ne biraju kao pogodni kandidati za daljnju analizu, jer je nizak afinitet često povezan sa niskom potencijom i efikasnošću. Pored toga, ligand FolR1 sa niskim afinitetom 36F2 je razvijeno u nekoliko formata i okarakterisan svojim biološkim svojstvima. Za 36F2 koji se koristi u dvovalentnom formatu bispecifičnih T ćelija, efekat avidnosti (razlika između jednovalentnog i dvovalentnog vezivanja) je oko 250 puta (1000 nM u odnosu na 4 nM). Pri niskoj ciljnoj gustini afinitet je definisao interakciju i sa 1000 nM je doveo do niske potencije TCB. Međutim, pri visokoj ciljnoj gustini ističe se avidnost molekula i sa 4 nM dovodi do velike aktivnosti TCB (videti Primer 32).

U alternativnom pristupu, pronalazači su generisali jednovalentne formate 16D5 i varijantu niskog afiniteta 16D5 (afinitet oko 10-40 nM) u dvovalentnom formatu. Ligand 16D5 koji se koristi u jednovalentnom formatu (1+1) ima afinitet oko 50 nM. Diferencijacija između tkiva visoke i niske ciljne gustine može bolje da se postigne korišćenjem prednosti efekta avidnosti.

1

Primer 32

T ćelijsko ubijanje ćelija SKov-3 indukovano pomoću 36F2 TCB, Mov19 TCB i 21A5 TCB

Ubijanje T ćelija posredstvom 36F2 TCB, Mov19 TCB i 21A5 TCB ocenjeno je na ćelijama SKov-3 (medijum FolR1). Humani PBMC su korišćeni kao efektori i ubijanje je detektovano u 24 h i 48 h inkubacije sa bispecifičnim antitelima. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina/EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću pomoću tripsina/EDTA mikrotitracione ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se zalepe preko noći. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama (opseg od 0,005 pM − 5 nM u tri ponavljanja). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 24 h i 48h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100 %) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1 % Triton X-100. Minimalna liza (= 0 %) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta.

Rezultati pokazuju da je ubijanje indukovano pomoću 36F2 veoma smanjeno u poređenju sa Mov19 TCB i 21A5 TCB (Slike 23A-B). Vrednosti EC50 koje se odnose na testove ubijanja, izračunate pomoću softvera GraphPadPrism6, sumirane su u Tabeli 27.

Tabela 27: Vrednosti EC50 (pM) za ubijanje posredstvom T ćelija SKov-3 koje eksprimiraju FolR1 indukovano pomoću 36F2 TCB, Mov19 TCB i 21A5 TCB.

1

*kriva nije dostigla zasićenje, vrednost je hipotetička

Primer 33

Ubijanje T ćelijama indukovano pomoću 36F2 TCB i 16D5 TCB u različitim jednovalentnim i dvovalentnim formatima bispecifičnih T ćelija

Procenjeno je ubijanje T ćelijama posredstvom 36F2 TCB, 16D5 TCB, 16D5 TCB klasičan, 16D5 TCB 1+1 i 16D5 TCB HT antitela humanih tumorskih Hela ćelija (visok FolR1, oko 2 miliona kopija, Tabela 14, Sl. 27), ćelija Skov-3 (medijum FolR1, oko 70000-90000 kopija, Tabela 14, Sl.27) i ćelija HT-29 (niska vrednost FolR1, oko 10000, Tabela 14, Sl. 27). DP47 TCB antitelo je uključeno kao negativna kontrola. Humani PBMC su korišćeni kao efektori i ubijanje je detektovano u 24 h inkubacije sa bispecifičnim antitelom. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina/EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću pomoću mikrotitracione ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se zalepe preko noći. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama (opseg od 0,01 pM − 100 nM u tri ponavljanja). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 24 h inkubacije na 37 °C, 5 % CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih

1

ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100 %) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1 % Triton X-100. Minimalna liza (= 0 %) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta.

Rezultati pokazuju da je ciljano ubijanje sva tri FolR1+ ciljanih ćelijskih linija indukovano pomoću 36F2 TCB mnogo slabije u odnosu na ubijanje indukovano pomoću 16D5 TCB (Slike 24A-C, Tabela 29). Ciljano ubijanje indukovano pomoću jednovalentnih 16D5 TCB (16D5 HT i 16D51+1) je lošije u odnosu na dvovalentne 16D5 TCB (16D5 TCB i 16D5 TCB klasičan). Vrednosti EC50 koje se odnose na testove ubijanja, izračunate pomoću softvera GraphPadPrism6, sumirane su u Tabeli 28. Važno je da ovi podaci pokazuju da upotreba liganda 36F2 FolR1 u dvovalentnom 2+1 TCB formatu proširuje terapijski prozor u odnosu na 16D5 FOLR1 TCB (Sl. 24A-C). Dok je smanjenje potencije između 16D5 i 36F2 FOLR1 TCB približno 45 puta za Hela ćelije (visoka ekspresija FOLR1, videti Tabelu 28: 16D5 TCB = 0,8 u odnosu na 36F2 TCB 36,0) i približno 297 puta za ćelije Skov3 (srednja ekspresija FOLR1, videti Tabelu 28: 16D5 TCB = 0,6 u odnosu na 36F2 TCB 178,4), ovo smanjenje je skoro 7000 puta za HT29 sa niskim nivom FOLR1 (videti Tabelu 28: 16D5 TCB = 5,7 u odnosu na 36F2 TCB 39573). Stoga, 36F2 FOLR1 TCB diferencira ćelije sa visokom i niskom ekspresijom, što je od posebne važnosti za smanjenje toksičnosti, jer ćelije nekih normalnih, netumorskih tkiva eksprimiraju vrlo niske nivoe FolR1 (približno manje od 1000 kopija po ćeliji). U skladu sa ovim opažanjem, rezultati razmotreni u Primeru 35 u nastavku pokazuju da 36F2 TCB ne indukuje T ćelijsko ubijanje primarnih ćelija (Slike 26A-D), dok se za 16D5 TCB može uočiti izvesno ubijanje na ćelijama HRCEpiC i HRPEpiC nakon 48 h od inkubacije (Slike 26B i C). Ova važna karakteristika 36F2 TCB omogućava doziranje za lečenje FolR1-pozitivnih tumora tako što posreduje u snažnom ubijanju tumorskih tkiva sa visokom ili srednjom ekspresijom FOLR1, ali ne i normalnih tkiva sa niskom ekspresijom (delimično polarizovanih). Značajno je da je ova karakteristika izgleda posredovana avidnošću 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 invertovanom formatu, jer nije uočena pri korišćenju 1+1 jednovalentnih formata koji nose isti ligand 36F2 niskog afiniteta.

Drugim rečima, 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 formatu sadrži vezujuće ostatke FolR1 relativno niskog afiniteta, ali poseduje efekat avidnosti koji omogućava diferencijaciju između ćelija koje eksprimiraju visok i nizak FolR1. Budući da tumorske ćelije eksprimiraju FolR1 na visokom ili srednjem nivou, ovaj TCB se selektivno vezuje za tumorske ćelije, a ne normalne, nekancerogene ćelije koje FolR1 eksprimiraju na niskom nivou ili ga uopšte ne

1

eksprimiraju.

Pored gore navedenih povoljnih karakteristika, 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 invertovanom formatu ima i tu prednost što ne zahteva hemijsko unakrsno povezivanje ili drugi hibridni pristup. To ga čini pogodnim za proizvodnju leka za lečenje pacijenata, na primer pacijenata koji imaju FolR1-pozitivne kancerogene tumore. 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 invertovanom formatu može da se proizvede primenom standardnih CHO procesa sa malim agregatima. Dalje, 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 sadrži humane i humanizovane sekvence što ga čini superiornim u odnosu na molekule koji koriste polipeptide pacova i miša koji su visoko imunogeni kada se daju ljudima. Štaviše, 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 formatu je konstruisan da ukine vezivanje FcgR i kao takav ne izazove reakcije unakrsnog povezivanja i infuzije FcgR, dodatno povećavajući njegovu bezbednost kada se daje pacijentima.

Kao što su pokazali prethodno opisani rezultati, njegova geometrija od glave do repa čini 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 invertovanom formatu visoko potentnim molekulom koji indukuje apsolutno ubijanje ciljanih ćelija. Njegova dvovalentnost pojačava avidnost i potenciju, ali omogućava i diferencijaciju ćelija sa visokom i niskom ekspresijom. Njegova preferencija ciljnih ćelija sa visokom ili srednjom ekspresijom zbog svoje avidnosti utiče na smanjenje toksičnosti, što dovodi do ubijanja posredstvom T ćelija normalnih ćelija koje eksprimiraju FolR1 na niskim nivoima.

Još jedna prednost 36F2 TCB u dvovalentnom 2+1 formatu i ostalim ovde objavljenim realizacijama je ta što njihov klinički razvoj ne zahteva upotrebu surogat molekula jer se vezuju za humani, cinomni i mišji FolR1. Kao takvi, ovde objavljeni molekuli prepoznaju drugačiji epitop od antitela na FolR1 prethodno opisanih, koji ne prepoznaju FolR1 iz sve tri vrste.

Tabela 28: Vrednosti EC50 (pM) za ubijanje posredstvom T ćelija tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1 indukovano pomoću 36F2 TCB i 16D5 TCB u različitim jednovalentnim i dvovalentnim formatima bispecifičnih T ćelija nakon 24 h inkubacije.

1

*kriva nije dostigla zasićenje, vrednost je samo hipotetička

Tabela 29 prikazuje poređenje vrednosti EC50 za 16D5 TCB i 36F2 TCB na različitim testiranim ćelijskim linijama. Od dobijenih vrednosti EC50 izračunata je delta (EC50 za 16D5 TCB minus EC50 za 36F2 TCB) i x-puta razlika (EC50 za 16D5 TCB podeljena sa EC50 za 36F2 TCB).

Tabela 29: Poređenje vrednosti EC50 za 16D5 TCB i 36F2 TCB.

*kriva nije dostigla zasićenje, vrednost je samo hipotetička

Izračunate vrednosti EC50 jasno pokazuju da razlika između 36F2 TCB i 16D5 TCB postaje veća što je ekspresija FolR1 na ciljnim ćelijama niža.

Ista izračunavanja, kao što je učinjeno za poređenje vrednosti EC50 za 16D5 TCB i 36F2 TCB, izvršena su za 16D5 TCB i dva jednovalentna 16D5 TCB (16D5 TCB HT i 16D5 1+1). Tabele 30 i 31 pokazuju poređenje vrednosti EC50 za 16D5 TCB u odnosu na 16D5 TCB HT (Tabela 30) i 16D5 TCB u odnosu na 16D5 TCB 1+1 (Tabela 31), kao i odgovarajuće delte (EC50 za 16D5 TCB minus EC50 za 16D5 TCB HT/1+1) i x-puta razlike (EC50 za 16D5 TCB podeljeno sa EC50 za 16D5 TCB HT/1+1).

Tabela 30: Poređenje vrednosti EC50 za 16D5 TCB (2+1 invertovani) i 16D5 TCB HT.

14

Tabela 31: Poređenje vrednosti EC50 za 16D5 TCB i 16D5 TCB 1+1.

*kriva nije dostigla zasićenje, vrednost je samo hipotetička

Poređenje vrednosti EC50 za 16D5 TCB i 36F2 TCB (Tabela 29) pokazuje da je razlika u vrednostima EC50 sve veća što je ekspresija FolR1 na ciljnim ćelijama niža. Ovaj efekat se ne može videti u upoređivanju 16D5 TCB i monovalentnih 16D5 TCB (Tabela 29 i Tabela 30). Za 16D5 TCB 1+1 (Tabela 31) takođe dolazi do blagog povećanja razlike između EC50 za 16D5 TCB i 16D5 TCB 1+1 sa smanjenjem ekspresije FolR1, ali ne toliko izražene kao što se može videti u upoređivanju 16D5 TCB u odnosu na 36F2 TCB.

Primer 34

Ushodna regulacija CD25 i CD69 na CD8+ i CD4+ efektorskim ćelijama nakon T ćelijskog ubijanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju FolR1, indukovanog pomoću 36F2 TCB i 16D5 TCB antitelom

Aktivacija CD8<+>i CD4<+>T ćelija nakon T ćelijskog ubijanja tumorskih ćelija Hela, SKov-3 i HT-29 koje eksprimiraju FolR1 posredstvom 36F2 TCB i 16D5 TCB ocenjena je FACS analizom koristeći antitela koja prepoznaju T ćelijske aktivacione markere CD25 (marker kasne aktivacije) i CD69 (marker rane aktivacije). DP47 TCB je uključen kao kontrola nevezivanja. Antitela i uslovi testova ubijanja su suštinski opisani gore (Primer 32), uz korišćenje istog opsega koncentracija antitela (0,01 pM − 100 nM u tri ponavljanja), odnos E:T od 10:1 i vreme inkubacije od 48 h.

Nakon inkubacije, PBMC su prebačeni na mikrotitracionu ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, centrifugirani na 400 x g tokom 4 min, i dva puta isprani PBS-om koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (PE anti-humani CD8, BD br. 555635), CD4 (Brilliant Violet 421™ anti-humani CD4, Biolegend br. 300532), CD69 (FITC anti-humani CD69 BD br. 555530) i CD25 (APC anti-humani CD25, BD br. 555434) izvršeno je prema uputstvima proizvođača. Ćelije su isprane dva puta sa 150 µl/bunarčiću PBS-a koji je sadržao 0,1% BSA. Nakon centrifugiranja, uzorci su ponovo suspendovani u 200 µl/bunarčiću PBS-a 0,1% za FACS merenje. Uzorci su analizirani na BD FACS Canto II.

36F2 TCB je indukovao ushodnu regulaciju ciljanih aktivacionih markera (CD25, CD69) na CD8+ i CD4+ T ćelijama nakon ubijanja Hela ćelija (Slika 25A) i ćelija SKov-3 (Slika 25B). U poređenju sa 16D5 TCB, ushodna regulacija CD25 i CD69 na CD8+ i CD4+ T ćelijama indukovana pomoću 36F2 je mnogo slabija.

Na HT-29 (nizak FolR1), ushodna regulacija aktivacionih markera se može videti samo pri najvećoj koncentraciji 36F2 TCB. Nasuprot tome, kod 16D5 TCB se ushodna regulacija CD25 i CD69 može videti već pri mnogo manjim koncentracijama antitela (Slika 25C).

Kao što se vidi i u eksperimentu sa lizom tumora, analiza aktivacionih markera (CD25 i CD69) na T ćelijama (CD4+ i CD8+) nakon ubijanja jasno pokazuje da razlika između 16D5 TCB i 36F2 TCB postaje veća što je niži nivo ekspresije FolR1 na ciljnim ćelijama.

Primer 35

T ćelijsko ubijanje primarnih ćelija indukovano pomoću 36F2 TCB i 16D5 TCB T ćelijsko ubijanje posredstvom 36F2 TCB i 16D5 TCB procenjeno je na primarnim ćelijama (humane epitelne ćelije korteksa bubrega (HRCEpiC) (ScienCell Research Laboratories; kat. br. 4110) i humane epitelne ćelije pigmenata mrežnjače (HRPEpiC) (ScienCell Research Laboratories; kat. br. 6540)). Ćelije HT-29 (nizak FolR1) su uključene kao kontrolna ćelijska linija. DP47 TCB je služio kao kontrola nevezivanja. Humani PBMC su korišćeni kao efektori i ubijanje je detektovano u 24 h i 48 h inkubacije sa bispecifičnim antitelima. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina/EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću koristeći mikrotitracione ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se zalepe preko noći. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889).

Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama (opseg od 0,01 pM − 10 nM u tri ponavljanja). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 24 h i 48h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100 %) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1 % Triton X-100. Minimalna liza (= 0 %) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta.

Rezultati pokazuju da 36F2 TCB ne indukuje T ćelijsko ubijanje primarnih ćelija (Slike 26A - D), dok se za 16D5 TCB može uočiti neko ubijanje na ćelijama HRCEpiC i HRPEpiC nakon 48 h od inkubacije (Slike 26B i D). Kao što je gore opisano, uočena je velika razlika u T ćelijskom ubijanju ćelija HT-29 između 16D5 TCB i 36F2 TCB (Sl. 26E, F).

Primer 36

Priprema DP47 GS TCB

(2+1 Crossfab-IgG P329G LALA invertovani = „neciljani TCB“)

„Neciljani TCB“ je korišćen kao kontrola u prethodnim eksperimentima. Bispecifično antitelo angažuje CD3e, ali se ne vezuje za bilo koji drugi antigen i zbog toga ne može unakrsno povezati T ćelije sa bilo kojim ciljnim ćelijama (i naknadno ne može indukovati ubijanje). Zbog toga je korišćeno kao negativna kontrola u testovima za praćenje svake nespecifične aktivacije T ćelija. Ovaj neciljani TCB je pripremljen kao što je opisano u WO2014/131712. Ukratko, sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca DNK su supklonirane u okvir bez konstantnog teškog lanca ili konstantnog lakog lanca, prethodno ubačen u odgovarajući ekspresioni vektor sisara koji je primalac. Ekspresiju antitela pokreće MPSV promoter i nosi sintetičku signalnu sekvencu polyA na 3’ kraju CDS. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.

Molekul je proizveden kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija ekspresionim

14

vektorima sisara, koristeći polietilenimin. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 („vektorski teški lanac Fc(rupica)“: „vektorski laki lanac“: „vektorski laki lanac Crossfab“: „vektorski teški lanac Fc(dugme)-FabCrossfab“).

Za transfekciju, HEK293 EBNA ćelije su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 g DNK. Nakon dodavanja 540 µl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5 % CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7 % Feed 1. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 µm) i dodat je natrijum azid u finalnoj koncentraciji od 0,01 % m/V, i čuvan je na 4 °C.

Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanta ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom upotrebom proteina A. Supernatant je nanet na kolonu HiTrap ProteinA HP (CV=5 mL, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 40 ml 20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, 0,5 M natrijum hlorid, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, 0,5 mM natrijum hlorid, pH 7,5. Ciljni protein je eluiran tokom gradijenta preko 20 zapremina kolone, od 20 mM natrijum citrat, 0,5 M natrijum hlorid, pH 7,5 do 20 mM natrijum citrat, 0,5 M natrijum hlorid, pH 2,5. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/10 0,5 M natrijum fosfata, pH 8. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidin, 140 mM natrijum hlorid pH 6,0.

Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence.

Čistoća i molekulska masa molekula analizirani su CE-SDS analizama u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa. Caliper LabChip GXII sistem (Caliper lifescience) korišćen je prema uputstvu proizvođača. Za analizu je korišćen uzorak od 2ug.

Ukupni sadržaj u uzorcima antitela je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02 % (m/V) NaN3, pH6,7 na 25 °C.

Tabela 32: Sažetak proizvodnje i prečišćavanja DP47 GS TCB.

Tabela 33: CE-SDS analiza DP47 GS TCB.

Primer 37

Vezivanje 16D5 TCB i 9D11 TCB i njihovih odgovarajućih CD3 varijanti deamidacije N100A i S100aA na Jurkat ćelijama koje eksprimiraju CD3

Vezivanje 16D5 TCB i njegovih odgovarajućih CD3 varijanti deamidacije 16D5 TCB N100A i 16D5 TCB S100aA i 9D11 TCB i njegovih varijanti demidacije 9D11 TCB N100A i 9D11 TCB S100aA za humani CD3 procenjeno je na imortalizovanoj liniji T limfocita

14

(Jurkat) koja eksprimira CD3. Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane pri 2x10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 µl PBS 0,1% BSA). 100 µl suspenzije ćelija (koja sadrži 0,2x10<6>ćelija) inkubirano je na mikrotitacionim pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom 30 minuta na 4 °C sa različitim koncentracijama bispecifičnih antitela (686 pM − 500 nM). Nakon dva koraka ispiranja hladnim PBS-om 0,1% BSA, uzorci su ponovo inkubirani još 30 minuta na 4 °C sa PE-konjugovanim AffiniPure F(ab')2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fcg fragmenta specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Fab PE br. 109-116-170). Nakon dva ispiranja uzoraka hladnim PBS-om 0,1% BSA, odmah su analizirani FACS testom upotrebom FACS CantoII (softver FACS Diva). Krive vezivanja su dobijene pomoću softvera GraphPadPrism6 (Sl.28A-B).

Rezultati pokazuju smanjeno vezivanje varijanti deamidacije N100A i S100aA za CD3 u poređenju sa matičnim antitelima 16D5 TCB (Sl.28A) i 9D11 TCB (Sl.28B).

Primer 38

T ćelijsko ubijanje ćelija SKov-3 i HT-29 indukovano pomoću 16D5 TCB i 9D11 TCB i njihovih CD3 varijanti deamidacije N100A i S100aA

T ćelijsko ubijanje posredstvom 16D5 TCB i odgovarajućih CD3 varijanti deamidacije 16D5 TCB N100A i 16D5 TCB S100aA i 9D11 TCB i varijanti demidacije 9D11 TCB N100A i 9D11 TCB S100aA procenjeno je na ćelijama SKov-3 (srednji FolR1) i HT-29 (nizak FolR1). Humani PBMC su korišćeni kao efektori i ubijanje je detektovano nakon 24 h inkubacije sa bispecifičnim antitelima. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina/EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću koristeći mikrotitracione ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se zalepe preko noći. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama

14

(opseg od 0,01 pM − 10 nM u tri ponavljanja). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 24 h inkubacije na 37 °C, 5 % CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br. 11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100 %) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1 % Triton X-100. Minimalna liza (= 0 %) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta.

Rezultati pokazuju da je na ćelijama SKov-3 ubijanje indukovano CD3 varijantama deamidacije 16D5 TCB N100A i 16D5 S100aA uporedivo sa onim koje je indukovano pomoću 16D5 TCB (Sl.29A). Isto važi za 9D11 TCB i njegove varijante 9D11 TCB N100A i 9D11 TCB S100aA (Sl. 29B). Na ćelijama HT-29 sa niskom ekspresijom FolR1, varijanta S100aA pokazuje umanjenu efikasnost ubijanja, što je slučaj za 16D5 TCB (Sl. 30A), kao i za 9D11 TCB (Sl. 30B). Vrednosti EC50 koje se odnose na testove ubijanja, izračunate pomoću softvera GraphPadPrism6, date su u Tabeli 35.

Tabela 35: Vrednosti EC50 (pM) za ubijanje posredstvom T ćelija SKov-3 i HT-29 ćelija koje eksprimiraju FolR1, indukovano pomoću 16D5 TCB i 9D11 TCB i njihovih varijanti deamidacije N100A i A100aA.

14

*nije određeno

Primer 39

Biohemijska karakterizacija površinskom plazmonskom rezonancom kao TCB dve varijante liganda CD3 (N100A i S100aA) za uklanjanje mesta deamidacije Vezivanje dva16D5 TCB sa varijantama liganda CD3 (N100A ili S100aA) za humani rekombinantni CD3 (CD3epsilon-CD3delta heterodimer kao Fc fuzija) ocenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti su obavljeni na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka).

Afinitet prema CD3ed-Fc

Afinitet interakcije između anti-FolR1 bispecifičnih T ćelija i rekombinantnih CD3 epsilon-delta heterodimera utvrđen je kao što je opisano u nastavku (Tabela 36).

Za merenje afiniteta, direktno kuplovanje oko 6000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 bispecifične T ćelije su uhvaćene na 200 nM pri protoku od 20 µl/min tokom 60 sek., referentna protočna ćelija je ostavljena bez hvatanja. Serija razblaživanja (4,1 do 3000 nM) Fc fuzije humanog i cino folatnog receptora 1 propuštena je kroz obe protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 240 s da bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 240 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH 1,5. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem prema Lengmirovom vezivanju 1:1 pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 36: Jednovalentno vezivanje (afinitet) dve varijante deamidacije 16D5 CD3 kao TCB na humanom CD3ed-Fc.

14

Dve CD3 varijante deamidacije imaju neznatno smanjeni afinitet u odnosu na ligand CD3 divljeg tipa (CH2527), ali ta razlika nije velika.

Primer 40

Proizvodnja i prečišćavanje dve varijante 16D5 bispecifičnih T ćelija sa mutacijama za uklanjanje mesta deamidacije u ligandu CD3: 16D5 TCB N100A, 16D5 TCB S100aA

Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

Dve varijante deamidacije 16D5 TCB su tranzijentno proizvedene u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. HEK293 EBNA ćelije su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije (za alternativne razmere, sve količine su shodno tome prilagođene). Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 µg DNK. Nakon dodavanja 540 µl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7 % Feed 1. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 µm), dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i čuvan je na 4 °C. Nakon proizvodnje supernatant je sakupljen, filtriran kroz sterilne filtere od 0,22 µm i čuvan na 4 °C do prečišćavanja.

Prečišćavanje

Dve varijante deamidacije 16D5 TCB su prečišćene u dva koraka primenom standardnih postupaka, kao što je afinitetno prečišćavanje proteina A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na MabSelect SuRe (GE Healthcare, zapremina kolone (cv) = 2 ml) ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfat pH 7,5, 20 mM natrijum citrat). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH gradijenta za pufer B (20 mM natrijum citrat pH 3,0, 100 mM NaCl, 100 mM glicin) preko 20 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein su objedinjene i pH rastvora

14

pažljivo podešen na pH 6,0 (upotrebom 0,5 M Na2HPO4pH 8,0). Uzorci su koncentrovani na 1 ml pomoću ultrakoncentratora (Amicon Ultra-15 ,30,000 MWCO, Millipore), a zatim su naneti na preparat HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidin, pH 6,0, 140 mM NaCl. Ukupni sadržaj eluiranih frakcija je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 µl svake frakcije naneto na analitičku gel kolonu TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisano u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02 % (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25°C. Frakcije koje sadrže manje od 2 % oligomera su sakupljene. Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom (CE-SDS) u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa prateći uputstvo proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su zamrznuti u tečnom N2i čuvani na -80 °C.

Tabela 36: Prinos, sadržaj monomera i čistoća prema CE-SDS za dve 16D5 varijante deamidacije u formatu bispecifičnih T ćelija.

Oba TCB su kvalitetno proizvedena, slično konstruktu sa ligandom CD3 divljeg tipa.

Primer 41

Proizvodnja i prečišćavanje dve varijante liganda 16D5 (D52dE i D52dQ) kao IgG za uklanjanje kritične tačke iz CDR-a

Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

Dva IgG su tranzijentno proizvedena u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. HEK293 EBNA ćelije su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije (za alternativne razmere, sve količine su shodno tome prilagođene). Za

1

transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 µg DNK. Nakon dodavanja 540 µl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7 % Feed 1. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 µm), dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i čuvan je na 4 °C. Nakon proizvodnje supernatanti su sakupljeni i antitela koja sadrže supernatante su filtrirana kroz sterilne filtere od 0,22 µm i čuvana na 4 °C do prečišćavanja.

Prečišćavanje antitela

Dva IgG su prečišćena u dva koraka primenom standardnih postupaka, kao što je afinitetno prečišćavanje proteina A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na POROS MabCapture A (Applied Biosystems, zapremina kolone (cv) = 1 ml) ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, pH 7,5). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH koraka za pufer B (20 mM natrijum citrat pH 3,0, 100 mM NaCl, 100 mM glicin) preko 5 cv.

5 ml sa sadržajem željenog proteina se čuva u petlji na Äkta Explorer-u, a zatim nanosi na HiLoad 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidin, pH 6,0, 140 mM NaCl (nije korišćen TWEEn). Frakcije koje sadrže IgG su spojene i koncentrovane pomoću ultrakoncentratora (Amicon Ultra-15, 30.000 MWCO, Millipore). Ukupni sadržaj konačnog spoja je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 µl naneto na analitičku gel kolonu TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisano u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02 % (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25 °C. Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom (CE-SDS) u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa prateći uputstvo proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su čuvani na 4 °C.

Tabela 37: Prinos, sadržaj monomera i čistoća prema CE-SDS za dve varijante

1 1

kritičnih tačaka 16D5 IgG.

Oba IgG su dobro i kvalitetno proizvedena.

Primer 42

Biohemijska karakterizacija površinskom plazmonskom rezonancom dve varijante liganda 16D5 (D52dE i D52dQ) kao IgG za uklanjanje kritične tačke iz CDR-a Vezivanje dve varijante liganda 16D5 (D52dE i D52dQ) kao IgG za humani i cino rekombinantni folatni receptor 1 (obe kao Fc fuzije) ocenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti su obavljeni na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka).

1. Avidnost prema folatnom receptoru 1

Avidnost interakcije između anti-FolR1 IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđena je kao što je opisano u nastavku (Tabela 38).

Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 160. Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije propušteni su u opsegu koncentracija od 3,7 do 900 nM sa protokom od 30 µL/minuti kroz protočne ćelije tokom 180 sekundi. Disocijacija je praćena tokom 600 sekundi. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog mišjeg IL2 receptora. Krive vezivanja koje se dobijaju iz dvovalentnog vezivanja IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija, aproksimovane su na Lengmirovo vezivanje 1:1 (čak i da je to 1: 2 vezivanje) i uklopnjene tim modelom da bi se dobila prividna KD koja predstavlja avidnost dvovalentnog vezivanja. Prividne konstante avidnosti za interakcije su izvedene iz konstanti brzine ovog uklapanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

1 2

Tabela 38: Dvovalentno vezivanje (avidnost sa prividnom KD) dve varijante kritičnih tačaka 16D5 kao IgG za humani, mišji i cino FolR1 (bez vezivanja za muFolR1, kao što se očekuje).

2. Afinitet prema folatnom receptoru 1

Afinitet interakcije između anti-FolR1 IgG-a ili bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđen je kao što je opisano u nastavku (Tabela 39).

Za merenje afiniteta, direktno kuplovanje oko 10000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije su hvatani na 20 nM pri protoku od 10 µl/min tokom 40 sek., referentna protočna ćelija je ostavljena bez hvatanja. Serija razblaživanja (12,35 do 3000 nM) Fc fuzije humanog i cino folatnog receptora 1 propuštana je kroz obe protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 240 s da bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 300 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH 1,5. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem prema Lengmirovom vezivanju 1:1 pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 39: Jednovalentno vezivanje (afinitet) dve varijante kritičnih tačaka 16D5 kao IgG za humani i cino FolR1.

1

Dve varijante kritičnih tačaka 16D5 imaju sličnu avidnost (dvovalentno vezivanje) kao i ligand 16D5 divljeg tipa. Avidnost je neznatno smanjena za varijantu D52dQ i ta razlika je još vidljivija kod afiniteta (jednovalentno vezivanje).

Primer 43

Proizvodnja i prečišćavanje kao IgG dvanaest varijanti liganda 16D5 sa mutacijama u teškom i lakom lancu za smanjenje afiniteta prema FolR1 Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

Dvanaest IgG su tranzijentno proizvedena u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. HEK293 EBNA ćelije su kultivisane u suspenziji bez seruma u CD CHO medijumu za uzgajanje. Za proizvodnju u boci za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije (za alternativne razmere, sve količine su shodno tome prilagođene). Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 200 µg DNK. Nakon dodavanja 540 µl rastvora PEI, smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su kultivisane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7 % Feed 1. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 15 minuta na 210 x g, rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 µm), dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i čuvan je na 4 °C. Nakon proizvodnje supernatanti su sakupljeni i antitela koja sadrže supernatante su filtrirana kroz sterilne filtere od 0,22 μm i čuvana na 4 °C do prečišćavanja.

Prečišćavanje antitela

Svi molekuli su prečišćeni u dva koraka primenom standardnih postupaka, kao što je

1 4

afinitetno prečišćavanje proteina A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na POROS MabCapture A (Applied Biosystems, zapremina kolone (cv) = 1 ml) ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, pH 7,5). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH koraka za pufer B (20 mM natrijum citrat pH 3,0, 100 mM NaCl, 100 mM glicin) preko 5 cv.

5 ml sa sadržajem željenog proteina se čuva u petlji na Äkta Explorer-u, a zatim nanosi na HiLoad 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidin, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% TWEE-20. Frakcije koje sadrže IgG su spojene i koncentrovane pomoću ultrakoncentratora (Amicon Ultra-15, 30.000 MWCO, Millipore). Ukupni sadržaj konačnog spoja je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 µl naneto na analitičku gel kolonu TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisano u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02 % (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25 °C. Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom (CE-SDS) u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa prateći uputstvo proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su čuvani na 4 °C.

Tabela 40: Prinos, sadržaj monomera i čistoća prema CE-SDS za dvanaest varijanti 16D5 IgG

1

Svih dvanaest IgG su dobro i kvalitetno proizvedena.

Primer 44

Biohemijska karakterizacija varijanti kombinovanog teškog i lakog lanca 16D5 kao IgG površinskom plazmonskom rezonancom

Vezivanje FolR1 liganada kao IgG u varijantama kombinovanog teškog i lakog lanca 16D5 za različite rekombinantne folatne receptore (FolR1 čoveka, miša i cinomolgusa; svi kao Fc fuzije) ocenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti su obavljeni na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka).

Avidnost prema folatnom receptoru 1

Avidnost interakcije između anti-FolR1 IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđena je kao što je opisano u nastavku (Tabela 41).

Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300. Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije propušteni su u opsegu koncentracija od 11,1 do 900 nM sa protokom od 30 µL/minuti kroz protočne ćelije tokom 180 sekundi. Disocijacija je praćena 240 ili 600 sekundi. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog mišjeg IL2 receptora. Krive vezivanja koje se dobijaju iz dvovalentnog vezivanja IgG ili bispecifičnih produkata T ćelija, aproksimovane su na Lengmirovo vezivanje 1:1 (čak i da je to 1: 2 vezivanje) i uklopnjene tim modelom da bi se dobila prividna KD koja predstavlja avidnost dvovalentnog vezivanja. Prividne konstante avidnosti za interakcije su izvedene iz konstanti brzine ovog uklapanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare). Za kinetiku niskog afiniteta sa prebrzim fazama asocijacije i disocijacije da se mogla prilagoditi Lengmirovom modelu vezivanja 1:1, primenjen je model analize stacionarnog stanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare). Analiza stacionarnog stanja daje KD za reakciju vezivanja u ravnoteži.

1

Tabela 41: Dvovalentno vezivanje (avidnost sa prividnom KD) liganada kao IgG u dvanaest varijanti 16D5 za humani, mišji i cino FolR1.

1

Afinitet prema folatnom receptoru 1

Afinitet interakcije između anti-FolR1 IgG-a ili bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđen je kao što je opisano u nastavku (Tabela 42).

Za merenje afiniteta, direktno kuplovanje oko 10000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoću standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 IgG ili bispecifične T ćelije su hvatani na 200 nM pri protoku od 10 ul/min tokom 40 sek., referentna protočna ćelija je ostavljena bez hvatanja. Serija razblaživanja (12,35 do 3000 nM) Fc fuzije humanog folatnog receptora 1 propuštana je kroz obe protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 240 s da bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 300 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH 1,5. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem prema Lengmirovom vezivanju 1:1 pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 42: Jednovalentno vezivanje (afinitet) liganada FolR1 kao IgG u dvanaest varijanti 16D5 za humani, cino i mišji FolR1.

1

Dvanaest varijanti 16D5 „smanjenog afiniteta“ za ligande FolR1 analizirano je površinskom plazmonskom rezonancom u poređenju sa ligandom 16D5 divljeg tipa i ligandom 36F2. Cilj je bio pronaći varijantu 16D5 sa afinitetom i avidnošću uporedivom sa 36F2. Prilikom merenja jednovalentnog vezivanja (afiniteta) bilo je varijanti sa višim i varijanti sa nižim afinitetom od 36F2. Međutim, u dvovalentnom vezivanju (avidnost) sve varijante imaju veću vrednost prividne KD od 36F2. To je uglavnom dešava zbog brze stope asocijacije (ka) 36F2 koja rezultuje malom vrednošću prividne KD za 36F2. Veliki efekat avidnosti kada se 36F2 vezuje dvovalentno je izgleda jedinstven za ovaj ligand. Kao što je gore navedeno, 36F2 je bio jedini humani, mišji i cino unakrsno reaktivni ligand koji se mogao identifikovati.

Primer 45

Vezivanje HC/LC varijanti 16D5 za humani FolR1 eksprimiran na Hela ćelijama Vezivanje 36F2 TCB, 16D5 TCB i različitih HC/LC varijanti 16D5 za humani FolR1

1

ocenjeno je na Hela ćelijama. Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane pri 2x10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 µl PBS 0,1% BSA). 100 µl suspenzije ćelija (koja sadrži 0,2x10<6>ćelija) inkubirano je na mikrotitacionim pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom 30 minuta na 4 °C sa različitim koncentracijama bispecifičnih antitela (229 pM − 500 nM). Nakon dva koraka ispiranja hladnim PBS-om 0,1% BSA, uzorci su ponovo inkubirani još 30 minuta na 4 °C sa PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fcg fragmenta specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Lab PE br. 109-116-170). Nakon ispiranja uzoraka dva puta hladnim PBS-om 0,1% BSA, fiksirani su sa 1% PFA preko noći. Nakon toga su uzorci centrifugirani, ponovo suspendovani u PBS-u 0,1% BSA i analizirani FACS testom upotrebom FACS CantoII (softver FACS Diva). Krive vezivanja su dobijene pomoću softvera GraphPadPrism6 (Sl. 32A-E). 36F2 TCB vezan za FolR2 nije bio dobro podnesen kod miševa i nije pokazao željenu efikasnost.

Primer 46

Proizvodnja i prečišćavanje četiri varijante 16D5 bispecifičnih T ćelija sa mutacijama za smanjenje afiniteta prema FolR1 čoveka i cinomolgusa: 16D5 TCB G49S/S93A, G49S/K53A, W96Y, W96Y/D52E

Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

Četiri dodatne varijante 16D5 TCB sa smanjenim afinitetom prema FolR1 su tranzijentno proizvedene u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. Za transfekciju, HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u suspenziji bez seruma u Excell medijumu za uzgajanje sa 6 mM L-glutaminom i 250 mg/l G418. Za proizvodnju u tubespin boci od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 mL), 600 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 400 µg DNK. Nakon dodavanja 1080 µl rastvora PEI (2,7 µg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 360 ml Excell 6 mM L-glutamina 5 g/L Pepsoy 1,0 mM VPA medijuma, i ćelije su uzgajane 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 7% Feed 7. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 20 - 30 minuta na 3600 x g (Sigma 8K centrifuga), rastvor je sterilno

1

filtriran (filter od 0,22 mm) i dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i čuvan na 4 °C.

Prečišćavanje

Varijante 16D5 TCB smanjenog afiniteta su prečišćene u dva koraka primenom standardnih postupaka, kao što je afinitetno prečišćavanje proteina A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na HiTrap Protein A (GE Healthcare, zapremina kolone (cv) = 5 ml) ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfata pH 7,5, 20 mM natrijum citrata). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH gradijenta za pufer B (20 mM natrijum citrata pH 3,0, 100 mM NaCl, 100 mM glicina) preko 20 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein su objedinjene i pH rastvora pažljivo podešen na pH 6,0 (upotrebom 0,5 M Na2HPO4pH 8,0). Uzorci su koncentrovani na 1 ml pomoću ultrakoncentratora (Amicon Ultra-15 ,30,000 MWCO, Millipore), a zatim su naneti na preparat HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidina, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% Tween 20. Ukupni sadržaj eluiranih frakcija je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 µl svake frakcije naneto na analitičku gel kolonu TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisano u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorida, 0,02 % (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25°C. Frakcije koje sadrže manje od 2 % oligomera su sakupljene. Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom (CE-SDS) u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa po uputstvu proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su zamrznuti u tečnom N2i čuvani na -80 °C.

Tabela 43: Prinos, sadržaj monomera i čistoća prema CE-SDS za varijante 16D5 smanjenog afiniteta u formatu bispecifičnih T ćelija.

1 1

Sve varijante sa smanjenim afinitetom mogu biti kvalitetno proizvedene.

Primer 47

Vezivanje 36F2 TCB, 16D5 TCB i dve varijante 16D5 smanjenog afiniteta 16D5 W96Y/D52E TCB i 16D5 G49S/S93A TCB za humani FolR1 eksprimiran na Hela ćelijama

Vezivanje 36F2 TCB, 16D5 TCB i dve varijante 16D5 smanjenog afiniteta 16D5 W96Y/D52E TCB i 16D5 G49S/S93A TCB za humani FolR1 ocenjeno je na Hela ćelijama. Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane pri 2x10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 µl PBS 0,1% BSA). 100 µl suspenzije ćelija (koja sadrži 0,2x10<6>ćelija) inkubirano je na mikrotitacionim pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom 30 minuta na 4 °C sa različitim koncentracijama bispecifičnih antitela (30 pM − 500 nM). Nakon dva koraka ispiranja hladnim PBS-om 0,1% BSA, uzorci su ponovo inkubirani još 30 minuta na 4 °C sa FITC-konjugovanim AffiniPure F(ab')2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fcg fragmenta specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Fab PE br. 109-096-098). Nakon dva ispiranja uzoraka hladnim PBS-om 0,1% BSA, uzorci su centrifugirani, ponovo suspendovani u PBS-u 0,1% BSA i analizirani FACS testom upotrebom FACS CantoII (softver FACS Diva). Krive vezivanja su dobijene pomoću softvera GraphPadPrism6 (Sl.33).

Primer 48

Proizvodnja i prečišćavanje tri bispecifična produkta T-ćelija sa srednjim afinitetom prema FolR1 čoveka i cinomolgusa: 14B1, 6E10, 2C7

Tranzijentna transfekcija i proizvodnja

TCB sa srednjim afinitetom su tranzijentno proizvedeni u ćelijama HEK293 EBNA primenom procedure transfekcije posredstvom PEI za tražene vektore, kao što je opisano u nastavku. Za transfekciju, HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u suspenziji bez seruma u Excell medijumu za uzgajanje sa 6 mM L-glutaminom i 250 mg/l G418. Za proizvodnju u tubespin boci od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 mL), 600 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma.

1 2

Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 400 µg DNK. Nakon dodavanja 1080 µl rastvora PEI (2,7 µg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 360 ml Excell 6 mM L-glutamina 5 g/L Pepsoy 1,0 mM VPA medijuma, i ćelije su uzgajane 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 7% Feed 7. Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 20 - 30 minuta na 3600 x g (Sigma 8K centrifuga), rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 µm) i dodat je natrijum azid u konačnoj koncentraciji od 0,01% m/V i čuvan je na 4 °C.

Prečišćavanje

TCB sa srednjim afinitetom su prečišćeni u dva koraka primenom standardnih postupaka, kao što je afinitetno prečišćavanje proteina A (Äkta Explorer) i ekskluziona hromatografija. Supernatant dobijen tranzijentnom proizvodnjom je prilagođen na pH 8,0 (upotrebom 2 M TRIS pH 8,0) i nanet na HiTrap Protein A (GE Healthcare, zapremina kolone (cv) = 5 ml) ekvilibrisan sa 8 zapremina kolone (cv) pufera A (20 mM natrijum fosfata pH 7,5, 20 mM natrijum citrata). Nakon ispiranja sa 10 cv pufera A, protein je eluiran upotrebom pH gradijenta za pufer B (20 mM natrijum citrata pH 3,0, 100 mM NaCl, 100 mM glicina) preko 20 cv. Frakcije koje sadrže željeni protein su objedinjene i pH rastvora pažljivo podešen na pH 6,0 (upotrebom 0,5 M Na2HPO4pH 8,0). Uzorci su koncentrovani na 1 ml pomoću ultrakoncentratora (Amicon Ultra-15 ,30,000 MWCO, Millipore), a zatim su naneti na preparat HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 (GE Healthcare) ekvilibrisan sa 20 mM histidina, pH 6,0, 140 mM NaCl, 0,01% Tween 20. Ukupni sadržaj eluiranih frakcija je analiziran analitičkom ekskluzionom hromatografijom. Zbog toga je 30 µl svake frakcije naneto na analitičku gel kolonu TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisano u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorida, 0,02 % (m/v) NaN3, pH 6,7 na 25°C. Frakcije koje sadrže manje od 2 % oligomera su sakupljene. Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa konstrukata analizirani su SDS kapilarnom elektroforezom (CE-SDS) u prisustvu i odsustvu redukcionog agensa po uputstvu proizvođača (instrument Caliper LabChipGX, Perkin Elmer). Prečišćeni proteini su zamrznuti u tečnom N2i čuvani na -80 °C.

Tabela 44: Prinos, sadržaj monomera i čistoća prema CE-SDS za TCB sa srednjim afinitetom.

1

Svi bispecifični produkti T ćelija sa srednjim afinitetom mogli su se proizvesti. Prinosi nisu visoki. Kvalitet je dobar za 9C7, a prihvatljiv za 14B1 i 6E10.

Primer 49

Vezivanje HC/LC varijanti 16D5 za humani FolR1 eksprimiran na HT-29 ćelijama

Vezivanje 36F2 TCB, 16D5 TCB i različitih HC/LC varijanti 16D5 (Slika 34A-E) za humani FolR1 ocenjeno je na HT-29 ćelijama. Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane pri 2x10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 µl PBS 0,1% BSA).100 µl suspenzije ćelija (koja sadrži 0,2x10<6>ćelija) inkubirano je na mikrotitacionim pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom 30 minuta na 4 °C sa različitim koncentracijama bispecifičnih antitela (229 pM − 500 nM). Nakon dva koraka ispiranja hladnim PBS-om 0,1% BSA, uzorci su ponovo inkubirani još 30 minuta na 4 °C sa PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fcg fragmenta specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Lab PE br. 109-116-170). Nakon ispiranja uzoraka dva puta hladnim PBS-om 0,1% BSA, fiksirani su sa 1% PFA preko noći. Nakon toga su uzorci centrifugirani, ponovo suspendovani u PBS-u 0,1% BSA i analizirani FACS testom upotrebom FACS CantoII (softver FACS Diva). Krive vezivanja su dobijene pomoću softvera GraphPadPrism6 (Slika 34A-E).

Primer 50

Vezivanje intermedijalnih liganada FolR1 za humani i mišji FolR1 i FolR2 Unakrsna reaktivnost intermedijalnih liganada FolR1 (6E10 TCB, 14B1 TCB i 9C7 TCB), kao i 16D5 TCB i 36F2 TCB na humani i mišji FolR1 i FolR2 ocenjena je u FACS testu vezivanja na transfektovanim ćelijama HEK293T.

Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane pri 2x10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 µl PBS 0,1% BSA). 100 µl suspenzije

1 4

ćelija (koja sadrži 0,2x10<6>ćelija) inkubirano je na mikrotitacionim pločama sa 96 bunarčića sa okruglim dnom 30 minuta na 4 °C sa 100 nM bispecifičnih antitela. Nakon dva koraka ispiranja hladnim PBS-om 0,1% BSA, uzorci su ponovo inkubirani još 30 minuta na 4 °C sa Fluorescein (FITC) AffiniPure F(ab')2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG, Fcγ fragmentom specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Lab PE br. 109-096-098). Nakon ispiranja uzoraka dva puta hladnim PBS-om 0,1% BSA, fiksirani su sa 1% PFA preko noći. Nakon toga su uzorci centrifugirani, ponovo suspendovani u PBS-u 0,1% BSA i analizirani FACS testom upotrebom FACS CantoII (softver FACS Diva). Grafikoni su dobijeni pomoću softvera GraphPadPrism6 (Sl.35A-D).

Rezultati pokazuju da su 36F2 TCB i 14B1 TCB unakrsno reaktivni na mišji FolR1 i humani i mišji FolR2. Za 6E10 TCB može se uočiti slabo vezivanje za humani FolR2.16D5 TCB i 9C7 TCB au specifični za humani FolR1 i ne pokazuju unakrsnu reaktivnost na mišji FolR1 ili humani i mišji FolR2.

Primer 51

Biohemijska karakterizacija površinskom plazmonskom rezonancom varijanti 16D5 sa smanjenim afinitetom i dodatnih liganada srednjeg afiniteta u formatu bispecifičnih T ćelija

Vezivanje varijanti anti-FolR1 16D5 sa smanjenim afinitetom i dodatnih liganada srednjeg afiniteta u dvovalentnom formatu bispecifičnih T ćelija za rekombinantni folatni receptor 1 čoveka, cinomolgusa i miša (svi kao Fc fuzije) ocenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, GE Healthcare). Molekuli koji su korišćeni za određivanje afiniteta i avidnosti su opisani u Tabeli 45.

Tabela 45: Naziv, opis i referentna oznaka devet konstrukata korišćenih u SPR analizi.

1

Pojedinačne injekcije

Prvo su anti-FolR1 TCB analizirani pojedinačnim injekcijama (Tabela 46) kako bi se okarakterisala njihova unakrsna reaktivnost (na humani, mišji i cino FolR1) i specifičnost (na humani FolR1, humani FolR2, humani FolR3). Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša ili folatni receptor 2 i 3 (FolR2-Fc, FolR3-Fc) čoveka, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 300-400 RU. TCB su injektovani tokom 60 sekundi u koncentraciji od 500 nM.

Tabela 46: Unakrsna reaktivnost i specifičnost 7 folatnih receptora 1 bispecifičnih produkata T ćelija. znači vezivanje, − znači da nema vezivanja, /− znači slabo vezivanje.

Avidnost prema folatnom receptoru 1

1

Avidnost interakcije između anti-FolR1 bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđena je kao što je opisano u nastavku (Tabela 47).

Rekombinantne biotinilovane monomerne Fc fuzije za folatni receptor 1 (FolR1-Fc) čoveka, cinomolgusa i miša, direktno su kuplovane na SA čipu primenom standardnog uputstva za kuplovanje (Biacore, GE Healthcare). Nivo imobilizacije je bio oko 200-300 RU. Anti-FolR1 bispecifičnih produkata T ćelija propuštani su u opsegu koncentracija od 11,1 do 900 nM (za varijante 16D5 sa smanjenim afinitetom) ili od 0,2 do 500 nM (za dodatne ligande srednjeg afiniteta i 36F2) sa protokom od 30 µL/minuti kroz protočne ćelije tokom 180 sekundi. Disocijacija je praćena 240 ili 600 sekundi. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 30 s 10 mM glicin-HCl pH 1,5. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji imobilisanoj Fc fuzijom rekombinantnog biotinilovanog mišjeg IL2R (nepovezani Fc spojeni receptor). Krive vezivanja koje se dobijaju iz dvovalentnog vezivanja bispecifičnih produkata T ćelija, aproksimovane su na Lengmirovo vezivanje 1:1 (čak i da je to 1: 2 vezivanje) i uklopnjene tim modelom da bi se dobila prividna KD koja predstavlja avidnost dvovalentnog vezivanja. Prividne konstante avidnosti za interakcije su izvedene iz konstanti brzine ovog uklapanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare).

Tabela 47: Dvovalentno vezivanje (avidnost sa prividnom KD) anti-FolR1 bispecifičnih produkata T ćelija (TCB) za humani, cino i mišji FolR1.

1

3. Afinitet prema folatnom receptoru 1

Afinitet interakcije između anti-FolR1 bispecifičnih produkata T ćelija i rekombinantnih folatnih receptora utvrđena je kao što je opisano u nastavku (Tabela 48).

Za merenje afiniteta, direktno kuplovanje oko 12000 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fab specifičnog antitela (komplet za hvatanje Fab, GE Healthcare) izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, pomoćuu standardnog kompleta za kuplovanje amina (GE Healthcare). Anti-FolR1 bispecifične T ćelije su uhvaćene na 20 nM pri protoku od 10 µl/min tokom 40 sek., referentna protočna ćelija je ostavljena bez hvatanja. Serija razblaživanja (12,3 do 3000 nM) Fc fuzije humanog, cino ili mišjeg folatnog receptora 1 propuštene su kroz sve protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 240 s da bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 300 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH2,1. Razlike indeksa prelamanja u nerasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Konstante afiniteta za interakcije su izvedene iz konstanti brzine uklapanjem prema Lengmirovom vezivanju 1:1 pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare). Za kinetiku niskog afiniteta sa prebrzim fazama asocijacije i disocijacije da se mogla prilagoditi Lengmirovom modelu vezivanja 1:1, primenjen je model analize stacionarnog stanja pomoću softvera Bia Evaluation (GE Healthcare). Analiza stacionarnog stanja daje KD za reakciju vezivanja u ravnoteži.

Tabela 48: Jednovalentno vezivanje (afinitet) anti-FolR1 bispecifičnih produkata T ćelija (TCB) za humani, cino i mišji FolR1.

1

1

Mutacije uvedene u ligande 16D5 smanjuju njihov afinitet prema FolR1 čoveka i cinomolgusa, kao što je određeno površinskom plazmonskom rezonancom. Poredak sa smanjenim afinitetom je 16D5 WT (57 nM)> W96Y (6,5 puta niži)> G49S/S93A (14,5 puta niži)> W96Y/D52E (24,5 puta niži)> G49S/K53A (30 puta niži). Isti poredak je vidljiv u vrednostima za avidnost, međutim te razlike su manje u pogledu koliko puta 16D5 WT (3 nM)> W96Y, G49S/S93A, W96Y/D52E (3 puta niža)> G49S/K53A (13 puta niža).

Ligandi srednjeg afiniteta imaju sledeći poredak po afinitetu 16D5 (57 nM)>14B1 (8,5 puta niži)> 9C7 (15 puta niži) > 6E10 (21 puta niži)>36F2 (24,5 puta niži). Međutim, te razlike nestaju u merenju aviditeta 14B1, 9C7, 6E10 (1nM)> 16D5 (3 nM) > 36F2 (7 nM).

16D5 W96Y/D52E TCB rešava probleme uočene kod prethodnih kandidata. 16D5 W96Y/D52E TCB se zasniva na ligandu 16D5 zajedničkog lakog lanca i ima dve tačkaste mutacije na teškom lancu u odnosu na matični ligand 16D5. Mutacija W96Y smanjuje afinitet liganda prema FolR1 u odnosu na matični ligand, a mutacija D52E uklanja mesto deamidacije i takođe doprinosi smanjenju afiniteta. 16D5 W96Y/D52E TCB se vezuje za

1

FolR1 čoveka i cinomolgusa, ali ne i za mišji FolR1. Specifičan je za FolR1 i ne vezuje se za rekombinantni humani FolR2 ili humani FolR3. Afinitet (jednovalentno vezivanje) 16D5 W96Y/D52E je oko 1,4 µM za humani FolR1 (24,5 puta niži od matičnog liganda 16D5), a avidnost (dvovalentno vezivanje) je oko 10 nM (3 puta niža od matičnog liganda 16D5).

Primer 52

T ćelijsko ubijanje ćelija Hela, SKov-3 i HT-29 indukovano pomoću intermedijalnih FolR1 TCB

Ubijanje posredstvom T ćelija pomoću intermedijalnih liganada FolR1 (6E10 TCB, 14B1 TCB i 9C7 TCB), ocenjeno je na ćelijama Hela (visok FolR1), SKov-3 (srednji FolR1) i HT-29 (nizak FolR1). 16D5 TCB i 36F2 TCB su uključeni kao referentna merila. Humani PBMC su korišćeni kao efektori i ubijanje je detektovano u 24 h i 48 h inkubacije sa bispecifičnim antitelima. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina/EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću pomoću mikrotitracione ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se zalepe preko noći. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS-a. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i čuvana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama (opseg od 0,01 pM − 10 nM u tri ponavljanja). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno nakon 24 h i 48h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100 %) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1 % Triton X-100. Minimalna liza (= 0 %) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta.

Rezultati pokazuju da se liza tumora indukovana intermedijalnim ligandima FolR1 (6E10 TCB, 14B1 TCB i 9C7 TCB) kreće između one dobijene za visoki afinitet 16D5 TCB i

1 1

nizak afinitet 36F2 TCB (Slika 36A-F). Među intermedijalnim ligandima FolR1, 14B1 TCB pokazuje najsnažnije ubijanje, što se može videti nakon 48 h inkubacije (Slika 36D-F). Vrednosti EC50 povezane sa testovima ubijanja nakon 24 h i 48 h inkubacije, izračunate su pomoću softvera GraphPadPrism6 i date su u Tabeli 49 i Tabeli 50.

Tabela 49: Vrednosti EC50 (pM) za ubijanje posredstvom T ćelija Hela, SKov-3 i HT-29 ćelija, indukovano pomoću intermedijalnih FolR1 TCB nakon 24 h inkubacije.

* nije određeno

Tabela 50: Vrednosti EC50 (pM) za ubijanje posredstvom T ćelija Hela, SKov-3 i HT-29 ćelija, indukovano pomoću intermedijalnih FolR1 TCB nakon 48 h inkubacije.

* nije određeno

Primer 53

T ćelijsko ubijanje ćelija Hela, SKov-3 i HT-29 indukovano varijantama 16D5 smanjenog afiniteta

Ubijanje posredstvom T ćelija varijantama 16D5 smanjenog afiniteta (16D5-G49S/S93A TCB, 16D5-G49S/K53A TCB, 16D5 W96Y TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB),

1 2

ocenjeno je na ćelijama Hela (visok FolR1), SKov-3 (srednji FolR1) i HT-29 (nizak FolR1).

16D5 TCB i 36F2 TCB su uključeni kao referentna merila. Kultivacija je obavljena kao što je gore opisano (Primer 52).

Rezultati pokazuju da se liza tumora indukovana varijantama 16D5 smanjenog afiniteta (16D5-G49S/S93A TCB, 16D5-G49S/K53A TCB, 16D5 W96Y TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB) kreće između one dobijene za visoki afinitet 16D5 TCB i nizak afinitet 36F2 TCB. Vrednosti EC50 povezane sa testovima ubijanja nakon 24 h i 48 h inkubacije, izračunate su pomoću softvera GraphPadPrism6 i date su u Tabeli 51 i Tabeli 52 (Sl.37A-F).

Tabela 51: Vrednosti EC50 (pM) za ubijanje posredstvom T ćelija HeLa, SKov-3 i HT-29 ćelija koje eksprimiraju FolR1, indukovano pomoću 16D5 TCB i njegovih varijanti smanjenog afiniteta nakon 24 h inkubacije.

* nije određeno

Tabela 52: Vrednosti EC50 (pM) za ubijanje posredstvom T ćelija HeLa, SKov-3 i HT-29 ćelija koje eksprimiraju FolR1, indukovano pomoću 16D5 TCB i njegovih varijanti smanjenog afiniteta nakon 48 h inkubacije.

1

* nije određeno

Stoga, kao i kod gore opisanog 36F2 FOLR1 TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB diferencira ćelije sa visokom i niskom ekspresijom, što je od posebne važnosti za smanjenje toksičnosti, jer ćelije nekih normalnih, netumorskih tkiva eksprimiraju vrlo niske nivoe FolR1 (približno manje od 1000 kopija po ćeliji). U skladu sa ovim opažanjem, rezultati razmotreni u Primeru 54 u nastavku pokazuju da 16D5 W96Y/D52E TCB indukuje mnogo niže nivoe ubijanja primarnih ćelija posredostvom T ćelija (Slika 38A-F) u odnosu na matični 16D5 TCB. Kao takav, 16D5 W96Y/D52E TCB posreduje u snažnom ubijanju tumorskih tkiva sa visokom ili srednjom ekspresijom FOLR1, ali ne i normalnih tkiva sa niskom ekspresijom. 16D5 W96Y/D52E TCB u dvovalentnom 2+1 formatu sadrži vezujuće ostatke FolR1 relativno niskog afiniteta, ali poseduje efekat avidnosti koji omogućava diferencijaciju između ćelija koje eksprimiraju visok i nizak FolR1. Budući da tumorske ćelije eksprimiraju FolR1 na visokom ili srednjem nivou, ovaj TCB se selektivno vezuje za tumorske ćelije, a ne normalne, nekancerogene ćelije koje FolR1 eksprimiraju na niskom nivou ili ga uopšte ne eksprimiraju. Kao dodatna prednost nad gore opisanim 36F2 FOLR1 TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB se specifično vezuje za FolR1, a ne za FolR2 ili FolR3, što dodatno povećava njegovu bezbednost za in vivo lečenje.

1 4

Pored gore navedenih povoljnih karakteristika, 16D5 W96Y/D52E TCB u dvovalentnom 2+1 invertovanom formatu ima i tu prednost što ne zahteva hemijsko unakrsno povezivanje ili drugi hibridni pristup. To ga čini pogodnim za proizvodnju leka za lečenje pacijenata, na primer pacijenata koji imaju FolR1-pozitivne kancerogene tumore. 16D5 W96Y/D52E TCB u dvovalentnom 2+1 invertovanom formatu može da se proizvede primenom standardnih CHO procesa sa malim agregatima. Dalje, 16D5 W96Y/D52E TCB u dvovalentnom 2+1 sadrži humane i humanizovane sekvence što ga čini superiornim u odnosu na molekule koji koriste polipeptide pacova i miša koji su visoko imunogeni kada se daju ljudima. Štaviše, 16D5 W96Y/D52E TCB u dvovalentnom 2+1 formatu je konstruisan da ukine vezivanje FcgR i kao takav ne izazove reakcije unakrsnog povezivanja i infuzije FcgR, što dodatno povećava njegovu bezbednost kada se daje pacijentima.

Kao što su pokazali prethodno opisani rezultati, njegova geometrija od glave do repa čini 16D5 W96Y/D52E TCB u dvovalentnom 2+1 invertovanom formatu visoko potentnim molekulom koji indukuje apsolutno ubijanje ciljanih ćelija. Njegova dvovalentnost pojačava avidnost i potenciju, ali omogućava i diferencijaciju ćelija sa visokom i niskom ekspresijom. Njegova preferencija ciljnih ćelija sa visokom ili srednjom ekspresijom zbog njegove avidnosti utiče na smanjenje toksičnosti, što dovodi do ubijanja posredstvom T ćelija normalnih ćelija koje eksprimiraju FolR1 na niskim nivoima.

Još jedna prednost 16D5 W96Y/D52E TCB u dvovalentnom 2+1 formatu i ostalim ovde objavljenim realizacijama je ta što njihov klinički razvoj ne zahteva upotrebu surogat molekula jer se vezuju za humani i cinomni FolR1. Kao takvi, ovde objavljeni molekuli prepoznaju drugačiji epitop od antitela na FolR1 prethodno opisanih, koji ne prepoznaju FolR1 iz obe vrste (videti i Sl.41).

Primer 54

T ćelijsko ubijanje primarnih ćelija, indukovano varijantama 16D5 smanjenog afiniteta i intermedijalnim FolR1 TCB

T ćelijsko ubijanje posredstvom varijanti 16D5 smanjenog afiniteta (16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB) i intermedijalnog liganda FolR1 14B1 TCB, procenjeno je na primarnim ćelijama (humane epitelne ćelije korteksa bubrega (HRCEpiC) (ScienCell Research Laboratories; kat. br. 4110) i humane epitelne ćelije pigmenata mrežnjače (HRPEpiC) (ScienCell Research Laboratories; kat. br.6540)). Ćelije HT-29 (nizak FolR1) su uključene kao kontrolna ćelijska linija. 16D5 TCB i 36F2 TCB uključeni su kao referentna merila, dok je DP47 TCB služio kao kontrola nevezivanja.

Test je izveden, kao što je opisano u Primeru 52, sa opsegom koncentracije antitela od

1

0,1 pM − 100 nM (u tri ponavljanja).

Kada se humane primarne ćelije koriste kao ciljevi, ukupna liza je mnogo manja zbog niže stope ekspresije FolR1 na tim ćelijama (slika 38A-F). Za ligand FolR1 sa visokim afinitetom 16D5 TCB, može se uočiti liza posredovana T ćelijama na obe korišćene vrste primarnih ćelija. Kao što je već uočeno kada su se tumorske ćelijske linije koristile kao ciljevi, liza indukovana intermedijalnim ligandom FolR1 14B1 TCB i varijantama 16D5 smanjenog afiniteta (16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB) kreće se između one dobijene za visoki afinitet 16D5 TCB i nizak afinitet 36F2 TCB. Značajno smanjena liza ćelija koje eksprimiraju FolR1 na niskim nivoima saglasno je sa niskom ciljanom aktivnošću, i za varijante 16D5 smanjenog afiniteta 16D5-G49S/S93A TCB i 16D5 W96Y/D52E TCB se stoga očekuje da će biti dobro podnošljiv in vivo.

Primer 55

Jednokratno doziranje PK konstrukata FOLR1 TCB kod ženke NOG miševa Ženke NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (NOG) miševa, prosečne starosti 8 do 10 nedelja na početku eksperimenta (kupljene od kompanije Taconic, SOPF facility) održavane su u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (ZH193/2014). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.

Sprovedena je farmakokinetička studija jednokratnog doziranja (SDPK) za procenu izloženosti FOLR1 TCB konstrukata (36F2, 16D5, 16D5 G49S/S93A i 16D5 W96Y/D52E). Davanje intravenskog bolusa od 0,5 mg/kg primenjeno je na NOG miševima, i uzorci krvi su uzeti u odabranim vremenskim intervalima za farmakokinetičku procenu. Uzorci mišjeg seruma analizirani su pomoću ELISA. Biotinilovani a-huCD3-CDR (mAb<ID-mAb<CD3>>M-4.25.93-IgG-Bi), test-uzorci, digoksigeninom obeleženo a-huFc antitelo (mAb<H-FC pan>M-R10Z8E9-IgG-Dig) i antitelo za detekciju anti-digoksigenina (POD) u koracima su dodati na mikrotitracionu ploču sa 96 bunarčića obloženu streptavidinom i inkubirani nakon svakog koraka 1 h na sobnoj temperaturi. Ploča se ispire tri puta nakon svakog koraka za uklanjanje nevezanih supstanci. Konačno, kompleks vezan za peroksidazu je vizuelizovan dodavanjem rastvora ABTS supstrata da bi se formirao obojeni proizvod reakcije. Intenzitet proizvoda reakcije koji je fotometrijski određen na 405 nm (sa referentnom talasnom dužinom na 490 nm) proporcionalan je koncentraciji analita u uzorku seruma. Opseg kalibracije standardne krive konstrukata bio je 0,078 do 5 ng/ml, gde je 1,5

1

ng/ml donja granica kvantifikacije (LLOQ).

Studija SDPK je otkrila PK profil sličan IgG za konstrukte 16D5, 16D5 W96Y/D52E i 16D5 G49S/S93A (Slika 39A-B). Zbog toga je za studiju efikasnosti izabran raspored jednom nedeljno (Sl. 40B). Poluživot za 36F2 je manji u odnosu na druge klonove. 36F2 je jedini od četiri testirana molekula koji je unakrsno reaktivan na mišji FOLR1, čime se može objasniti manji poluživot ovog molekula i ukazuje na TMDD (ciljno posredovanu dispoziciju leka).

Primer 56

Efikasnost in vivo konstrukata FOLR1 TCB (16D5, 16D5 G49S/S93A i 16D5 W96Y/D52E) nakon prenosa humanog PBMC u NOG miševe koji nose Hela ćelije Konstrukti FOLR1 TCB su testirani u HeLa ćelijskoj liniji humanog cervikalnog raka koja eksprimira FOLR1, supkutano injektovani u PBMC ugrađen u NOG miševe.

Hela ćelije su originalno dobijene od ATCC (CCL2) i posle ekspanzije deponirane u internoj banci ćelija Roche-Glycart. Ćelijska linija tumora je rutinski kultivisana u RPMI-u i sadrži 10% FCS (Gibco) na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom sa 5% CO2. Presejavanje 13 je korišćeno za transplantaciju, pri vijabilnosti > 95%. 1x106 ćelija po životinji je supkutano injektovano u desni bok životinja, ukupno 100 µl RPMI medijuma za uzgajanje ćelija (Gibco).

60 ženki NOG miševa; starosti od 8-10 nedelja na početku eksperimenta (kupljene od kompanije „Taconic“, Danska) su održavane u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (ZH193/2014). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.

Shodno protokolu studije (Sl.40B), miševi su supkutano injektovani u 0. danu studije sa 1x106 Hela ćelija. U 30. danu studije, kada je tumor dostigao veličinu od oko 150 mm3, humani PBMC zdravog donora je izolovan Ficoll metodom i 10x106 ćelija je intravenski injektovano u miševe sa tumorom. Dva dana kasnije (32. dan), miševi su randomizovani i u podjednakom broju raspoređeni u šest tretiranih grupa (n=10), a zatim intravenski injektovani sa 16D5 (0,5mg/kg), 16D5 G49S/S93A (2,5 ili 0,5 mg/kg) i 16D5 W96Y/D52E (2,5 ili 0,5 mg/kg). Sve tretirane grupe su injektovane jednom nedeljno tokom ukupno tri nedelje. Miševima je intravenski injektovano 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima iz grupe sa vehikulumom ubrizgan je PBS. Da bi se dobila odgovarajuća količina TCB na 200 µl, standardni rastvori su razblaženi PBS-om kada je potrebno. Rast tumora je meren jednom

1

nedeljno pomoću caliper instrumenta (Slika 40C-E), a zapremina tumora je izračunata na sledeći način:

Tv: (W2/2) x L (W: Širina, L:

Dužina)

Injektovanje konstrukata FOLR1 TCB jednom nedeljno, dovelo je do značajne regresije tumora (Sl. 40C-E). Efikasnost 16D5 (0,5 mg/kg) i 16D5 W96Y/D52E16D5 (0,5 mg/kg) bila je slična, dok je 16D5 G49S/S93A (0,5 mg/kg) pokazao nešto manju potenciju. Veće doze od 2,5 mg/kg za 16D5 W96Y/D52E16D5 i 16D5 G49S/S93A nisu pokazale povećanu efikasnost u poređenju sa dozama od 0,5 mg/kg. Za očitavanja PD, miševi su žrtvovani u 52. danu studije, tumori su uklonjeni, izmereni i pripremljene su suspenzije pojedinačnih ćelija enzimskom digestijom pomoću Collagenase V, Dispase II i DNAse za naknadnu FACS analizu. Eksplantirani tumori svih tretiranih grupa su pokazali značajno manju težinu tumora na kraju studije u odnosu na tumore kontrolnih nosača (slika 40F). Suspenzije pojedinačnih ćelija iz tumora gde su obojene za huCD45 i huCD3 i DAPI radi isključivanja mrtvih ćelija i analizirane na BD Fortessa. FACS analiza je otkrila statistički veći broj infiltriranih CD3-pozitivnih humanih T ćelija u tumorskom tkivu nakon tretmana sa 16D5, kao i 16D5 W96Y/D52E16D5 u odnosu na tumore kontrolnih nosača (Sl.40C).

Primer 57

Studija toksičnosti kod cinomolgus majmuna

Farmakokinetička (PK), farmakodinamička (PD) i studija podnošljivosti se sprovodi da bi se istražili podnošljivost, efekti PK i PD jedne intravenske doze TCD varijante 16D5 smanjenog afiniteta (npr.16D5-G49S/S93A TCB, 16D5 W96Y/D52E TCB ) kod cinomolgus majmuna. U ovoj studiji, naivni cinomolgus majmuni (1 mužjak i 1 ženka majmuna / grupi) primaju jednu intravensku dozu TCB varijante 16D5 smanjenog afiniteta, uključujući 16D5 W96Y/D52E TCB, prateći protokol za povećanje doze. Primeri nivoa doza uključuju 0,003, 0,03 i 0,09 mg/kg. Ocenjuju se standardni parametri toksičnosti (klinički znakovi, telesne težine, hematologija i klinička hemija), kao i kinetika broja T ćelija i status aktivacije u krvi i kinetika otpuštanja citokina. Uzimaju se i uzorci krvi za PK tokom perioda od 28 dana za merenje TCB varijante 16D5 smanjenog afiniteta, uključujući 16D5 W96Y/D52E TCB i antitela protiv leka.

Aminokiselinske sekvence u primerima realizacija

1) Ligandi FolR korisni u formatu zajedničkog lakog lanca, varijabilnog teškog

1

lanca

1

1

11

2) Zajednički laki lanac liganda CD3 (CLC)

12

3) ligand CD3, teški lanac

1

4) Ligandi FolR korisni za crossfab format

14

1

1

1

5) Ligand CD3 koristan u crossfab formatu

1

6) - Primeri aminokiselinskih sekvenci CD3-FolR bispecifičnih antitela u 2+1 invertovanom crossmab formatu

1

1

7) Primeri aminokiselinskih sekvenci CD3-FolR bispecifičnih antitela sa zajedničkim lakim lancem

1 1

12

1

14

1

8) Primeri varijanti 16D5 sa smanjenim afinitetom a. Primeri varijanti lakog lanca sa smanjenim afinitetom

b. Primeri varijanti teškog lanca sa smanjenim afinitetom

1

1

9) Dodatni primeri realizacija generisani iz biblioteke prikaza faga (CDR su podcrtani)

1

1

2

21

10) 9D11 Varijante glikozita: varijabilni laki lanac u primerima realizacija (CDR su podcrtani)

2 2

11) Varijante deaminacije

2

24

2

12) TCB bazirani na Mov19 u primerima realizacija (CDR su podcrtani)

2

13) Dodatni FolR1 TCB sa ligandima srednjeg afiniteta (CDR prema Kabatu, podcrtani):

2

2

14) Sekvence antigena

2

21

15) Sekvence nukleotida u primerima realizacija

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2

2

Iako je gornji pronalazak opisan prilično detaljno pomoću ilustracija i primera za lakše razumevanje, opise i primere ne treba tumačiti kao ograničenja za opseg primene predmetnog pronalaska koji je isključivo definisan priloženim patentnim zahtevima.

2

2

24

24

24

24

24

24

24

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

�

24

�

�

2

�

2

2

21

22

2

24

2

2

�

�

2

1

2

�

�

11

��

1

��

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

4

41

42

�

44

4

�

�

4

4

1

�

4

1

�

1

2

4

1

2

4

1

2

�

4

41

42

4

44

�

4

4

4

4

41

41

41

41

41

41

41

42

42

42

42

42

42

42

4

41

42

4

44

4

4

�

�

4

44

44

44

44

44

44

44

�

41

42

4

44

�

�

4

4

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

�

�

41

42

4

44

�

�

4

�

4

4

41

42

�

44

4

4

4

4

4

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

1

�

4

�

Claims (24)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije koji sadrži

(i) prvi antigen vezujući deo koji predstavlja molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD3 i koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu regiona koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca, izabran iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 i SEQ ID NO:39 i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe u kojoj se nalaze SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34;

(ii) drugi antigen vezujući ostatak, sposoban da se specifično vezuje za folatni receptor 1 (FolR1);

pri čemu antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 sadrži: a) CDR1 teškog lanca SEQ ID NO:16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO:17, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:18, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO:32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO:33, CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34;

b) CDR1 teškog lanca SEQ ID NO:8, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO:56, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:57, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO:59, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO:60, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:65: ili

c) CDR1 teškog lanca SEQ ID NO:16, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO:275, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO:315, CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 32, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO:33, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO:34.

2. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema patentnom zahtevu 1, pri čemu prvi antigen vezujući deo sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:36, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31.

3. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji dodatno sadrži

(iii) treći antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1.

4. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema patentnom zahtevu 3, pri čemu je treći antigen vezujući deo identičan sa drugim antigen vezujućim delom.

5. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 3 ili 4, pri čemu najmanje drugi ili treći antigen vezujući deo predstavlja molekul Fab.

6. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koji dodatno sadrži

(iv) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju.

7. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31.

8. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:55, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:64.

9. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu antigen vezujući deo sposoban da se specifično vezuje za FolR1 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:274, i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31.

10. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema patentnom zahtevu 8, pri čemu prvi antigen vezujući deo predstavlja unakrsno izmenjeni molekul Fab, pri čemu su razmenjeni varijabilni ili konstantni regioni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab.

11. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 10, pri čemu, Fc domen je imunoglobulin klase IgG, posebno IgG1 ili IgG4 Fc domen.

12. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 11, pri čemu je Fc domen, humani Fc domen.

13. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 12, pri čemu Fc domen sadrži modifikaciju koja podstiče udruživanje prve i druge podjedinice Fc domena.

14. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena aminokiselinski deo zamenjen aminokiselinskim delom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, aminokiselinski deo je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice u koju izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira.

15. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 14, pri čemu Fc domen sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, u odnosu na Fc domen nativnog IgG1.

16. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema patentnom zahtevu 15, naznačen time što svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za aktivirajući Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su pomenute aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (Kabatova numeracija).

17. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276 i dodatno sadrži i aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:277 i SEQ ID NO:35.

18. Izolovani polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17.

19. Vektor, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 18.

20. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 18 ili vektor prema patentnom zahtevu 19.

21. Metoda za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije, sposobnog da se specifično vezuje za CD3 i antigen ciljne ćelije, koja obuhvata korake a) uzgajanja ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 20 pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije i b) izolovanja bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T ćelije.

22. Farmaceutski preparat koji sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

23. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17, ili farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 22, koji se koriste kao lek.

24. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 17, ili farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 22, za primenu u lečenju raka.

1