PT88938B - Processo para a preparacao de uma nova variante do activador de plasminogeneo do tecido humano - Google Patents

Description

Campo do invento

O presente invento é dirigido a novas variantes do activador do plasminogénio tipo tecido humano modificados na sua estrutura de açúcares e suas composições, e meios e métodos para a sua produção em quantidades terapêuticamente significativas.

Fundamento do invento presente invento surge da descoberta de que o desaparecimento do activador do plasminogénio tipo tecido humano da circulação pode ser manipulado através da alteração da estrutura de açúcares da molécula.

activador do plasminogénio tipo tecido (t-PA) é uma protease serina que está envolvida na fibrinólise. A ligação do t-PA a um coágulo de fibrina provoca um aumento da activaçao do plasminogénio (Hoylarts, M. et al., J. Biol. Chem. 257:2912-2919 /1982_7; Rikken, D.C., et al. ,

J. Biol. Chem. 257:2920-2925 /~1982_7 ). 0 activador do plasminogénio tipo tecido humano converte o plasminogénio em plasmina. A plasmina assim produzida cliva proteolíticamente as matrizes de fibrina as quais constituem a estrutura dos coágulos sanguíneos. O activador do plasminogénio tipo tecido humano mechia assim a dissolução de coágulos sanguíneos e é consequentemente útil no tratamento de várias perturbações trombolíticas. Se bem que o t-PA tenha sido isolado a partir de muitas fontes tais como a linha celular de melanoma Bowes (Rijken, D.C. et al., J. Biol. Chem. 256:7035-7041 / 1981 7; Wallen, P. et al., Eur. J. Biochem. 132:681-686 / 1983_7), tecido uterino (Rijken, D.C. et al., Biochim. Biophys Ãcta 580:140-153 /”1979 7 e perfusantes de vasos sanguíneos (Binder, B.R., et al., J. Biol. Chem. 254:1998-2003 / 1979_7, o advento da tecnologia de DNA recombinante tem permitido a produção de t-PA (Pennica, D. et al., Nature (London)

301:214-221 / 1983_7 em quantidades suficientes para a realização de ensaios clínicos em pacientes com enfarte do miocárdio, trombos vasculares periféricos e embolia pulmonar. Estes ensaios mostraram que o t-PA recombinante (rt-PA) é um agente trombolítico extremamente eficaz com efeitos mínimos nos níveis de fibrinogénio no sangue. (Williams, D.O. , et al., Circulation 73:328-346 /”1986 7: Graor, R.A. et al., Circulation 74 (supl. 1): 1-15-120 /”1986 7; Collan, D. et al. , Circulation 73:511-517 /“1986_7 ).

A eliminação do rt-PA da circulação é relativamente rápida. 0 desaparacimento bifásico é dominado por uma fase alfa com uma semi-vida de cerca de 2 minutos em coelhos (Korninger, C., et al Thromb. Haemos. 46:658-661 /~1985_7; Nilsson, S. , et al. , Thromb. Res. .39:511-521; Bonnameaux, H., et al., Blood £/:1493-1497 /1986 7 o 4 minutos (Baughan, R.A., Tissue Plasminogen Activator in Thrombolytic Therapy (Sobel, et al., eds. ) pp. 41-53, Mareei Dekker, NY / 1987_/a 8 minutos (Wallen., P. et al supra) em humanos. O figado é o sítio mais importante da tomada e metabolismo do t-PA (Korninger, C., et al., Supra; Nilsson, S. et al., supra; Bonnameaux; H. et al., supra). Têm sido descrito uma série de sistemas receptores no fígado que reconhecem resíduos terminais específicos nas partes de oligossacárido das glicoproteínas. As proteínas que desaparecem da circulação por este mecanismo também têm semi-vidas da ordem de alguns minutos (Ashwell, G. et al., Ann Rev. Biochem. 51:531-554 /1982 7).

O t-PA recombinante tem quatro sítios potênciais para glicosilação em N. Na posição 117 está presente um oligossacárido rico em manose e na posição 448 um oligossacárido complexo. Na posição 184 um oligossacárido complexo está presente no rt-PA tipo I e ausente no rt-PA tipo II; a proporção de tipo I para tipo II é de cerca de 1 para 1. Um quarto potencial sítio de glicosilação no resíduo 218 não está glicosilado. O padrão de glicosilação do rt-PA é

-4semelhante ao do t-PA derivado de melanoma.

A abreviatura t-PA para activador do plasminogénio tipo tecido humano foi adoptada após proposta no XXVIII Meeting of the International Committee ou Thrombosis and Hemostatis, Bergamo, Itália, 27 de Julho de 1982. Conforme aqui são usados os termos activador do plasminogénio tipo tecido humano, t-PA, t-PA humano ou activador do plasminogénio de tecidd¹, significam activador do plasminogénio (tipo tecido) extrínseco humano, produzido, por exemplo, por extracção e purificação a partir de fontes naturais / ver Collen et al., Pedido de Patente Europeia N2 41766 (publicado em 16 de Dezembro de 1981 baseado num primeiro pedido de 11 de Junho de 1980) e Rijken et al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), aqui incluido por referência, e por sistemas de cultura de células recombinantes conforme descrito juntamente com a sua sequência de aminoácidos e características físicas e biológicas, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Europeia N2 93619, (publicado em 9 de Novembro de 1983) baseado num primeiro pedido de 5 de Maio de 1982), aqui incluido como referência.

A Patente U.S. 4326033 descreve um aumento da semi-vida da uroquinase pela modificação química da sua estrutura de açúcares. A utoquinase é imunológicamente distinta do activador do plasminogénio tipo tecido humano.

Não há justificação, quer da U.S. 4326033 ou outras, para considerar que tais modificações da estrutura de açúcar da uroquinase tenham aplicação noutras glicoproteínas. De facto, por exemplo, a remoção de ácido siálico da ceruloplasmina decresce a sua semi-vida dramaticamente; ainda, tratamento idêntico da transferrina, uma outra glicoproteína do soro não tem efeito significativo na sua semi-vida. (Sharon, Complex Carbohydrates, Addison-Wesley Publ. Co., p 194-196, (1975); ver também Ashwell et al., Adv. Enzymology 41, 99 (1974) e Alexander et al., Sciences 226, 1328 (1984 ).

A eliminação do t-PA derivado de melanoma em ratinhos foi descrita como não sendo afectada pela titulação do sítio activo com fluoreto de fenilmetilsulfonilo ou pela cciijecção de diisopropilfluorofosfato de trombina, asialoorosomucóide, macroalbumina ou excesso de t-PA não marcado (Fuchs, H.E., et al., Bloõd 65:539-544 /”1985_7. 0 resultado obtido com asailoorosomucóide e macroalbumina indicavam que a estrutura de açúcares não influenciam a eliminação do t-PA. 0 desaparecimento do t-PA derivado de melanoma tem sido descrito como não sendo afectado por monossacáridos em ratos (Emeis, C.M. et al. , Thromb. Haemos 54.:661-664 /”19857) Por outro lado, quando os componentes celulares do fígado de rato foram separados, as células endoteliais foram descritas como internalizando t-PA de melanoma por uma via que podia ser inibida por glicoproteínas com alto teor em manose; este resultado foi interpretado como significando que o t-PA é internalizado no fígado pelo menos em parte pelo receptor de manose.(Einarsson, M. , et al. , Throm. Haemos 54:270 /”1985 7) Noutros estudos in vitro, mostrou-se que rt-PA se liga com elevada afinidade a hepatócitos do fígado de rato. 0 receptor não pareceu ser dependente de açúcares (Bakhit, C., et al. , J. Biol. Chem. 262:8716-8720 /~1987_7).

Na Publicação Internacional do Pedido de Patente N2 W084/01786, publicado em 10 de Maio de 1984 com base num primeiro pedido de 28 de Outubro de 1982, descreve-se uma modificação indiscriminada do activador do plasminogénio tipo tecido resultando numa molécula com actividade biológica reduzida e com maior semi-vida do que o polipeptídeo não modificado. O único exemplo envolve tratamento de um activador do plasminogénio tipo tecido humano, parcialmente purificado, com periodato de sódio dando um produto descri to como tendo cerca de 70 a 90 por cento da actividade original (não modificada). Não há indicação em W084/01786 de uma apreciação da natureza e caracterização das estruturas de açúcares presentes no material nativo e mais importante, na forma modificada que elas produzem. De facto, sabe-se que o

-6periodato modifica ou destrói, por oxidação, todas as estruturas de açúcar com a sua concomitante remoção da ligação ao aminoácido.

Também não existe inclinação em W084/01786 de quantas destas estruturas existem no activador do plasminogénio tipo tecido humano ou qual a composição em açúcares, quer da versão não modificada, quer da modificada. Assim, a molécula tratada com periodato foi provavelmente modificada por oxidação de todas as estruturas de açúcar indiscriminadamente, sem focagem num sítio particular.

Recetemente foi descrito que as velocidades de eliminação in vivo do activador do plasminogénio tipo tecido humano glicosilado e desglicosilado não são significativamente diferentes, forçando a conclusão de que a velocidade de eliminação do activador do plasminogénio tipo tecido humano não é afectada pela ausência de açúcares (Larsen et al., Proteases in Biological Control and Biotechnology, UCLA Symposium Park City. Utach, 9-14 Fevereiro, 1986. Ver Little et al., Biochemistry 23, 6191 (1984).

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar novas variantes do t-PA através da modificação da sua estrutura de açúcares. Um outro objectivo deste invento é proporcionar variantes do t-PA que possam ter diferentes velocidades de eliminação da circulação. Ainda um outro objectivo deste invento é proporcionar agentes trombolíticos eficazes adequados ao tratamento de diversos estados clínicos.

-ΊSumário do invento

Os objectivos deste invento são conseguidos por novas variantes do activador do plasminogénio tipo tecido modificadas na sua estrutura de açúcares, que retêm substâncialmente toda a actividade biológica e possuem uma semi-vida in vivo alterada, i.e. são eliminados do sangue a uma velocidade diferente da do t-PA natural. Em particular, as variantes do t-PA são modificadas na sua estrutura de açúcares nas posições 117, 184 ou 448. Até este invento não foi apreciado que alteração da estrutura de açúcar do t-PA pudesse alterar a eliminação da circulação. Em particular, este invento estabeleceu que a eliminação dos açúcares de um ou mais sítios de glicosilaçao do t-PA prolongam a sua semi-vida. Em particular, este invento também estabeleceu pela primeira vez que uma variante do t-PA tendo oligossacáridos ricos em manose nas posições 185 e 448 além dos presentes na posição 117 serão eliminados da circulação mais rapidamente.

presente invento é assim dirigido a novos activadores do plasminogénio tipo tecido humano sem a estrutura de açúcare funcional no resíduo de aminoácido 117, ainda tendo estrutura de açúcar não modificadas funcionalmente (nos resíduos de aminoácidos 184 e/ou 448) e tendo retido substâncialmente toda a actividade biológica e uma maior semi-vida in vivo (comparado com o activador do plasminogénio tipo tecido humano nativo tendo uma estrutura de açúcar intacta no resíduo de aminoácido 117).

presente invento é também dirigido a uma nova variante do activador do plasminogénio tipo tecido sem a estrutura de açúcar funcional nas posições 117, 184 e 448 e tendo mantido substâncialmente toda a actividade biológica e uma maior semi-vida in vivo (comparado com o activador do plasminogénio tipo-tecido humano nativo tendo estruturas de açúcares intactos naquelas posições).

presente invento é também dirigido a uma nova variante do activador do plasminogénio tipo tecido humano tendo substituido o oligossacárido rico em manose nas posições 184 e 448 além do presente na posição 117 e tendo mantido substâncialmente toda a actividade biológica e uma semi-vida reduzida (comparado com o activador do plasminogénio tipo tecido humano nativo que tem intactas as estruturas de açúcar não modificadas nas posições 184 e 448).

presente invento é ainda dirigido a equivalentes do activador do plasminogénio tipo tecido humano biologicamente activo diferindo em um ou mais aminoácidos na sequência global mas tendo o mesmo padrão de açúcares das novas variantes particulares do activador do plasminogénio tipo tecido aqui descritas. 0 presente invento é ainda dirigido a vectores recombinantes assoaciados, culturas e métodos úteis na preparação das novas variantes dos activadores do plasminogénio tipo tecido humano.

Um desse equivalentes de variante do activador do plasminogénio tipo tecido incluídas no âmbito deste invento é em mutante designado de cadeia simples em que o sítio de clivagem entre os aminoácidos 275 e 276 está destruído por eliminação da sequência de aminoácidos reconhecida por enzimas proteolíticas. A eliminação da sequência é efectuada mudando aminoácidos específicos, por exemplo, por mutagénese especifica de sítio dos codões do DNA de acordo com o método descrito infra.

Legendas das figuras

A Figura 1 representa um SDS-PAGE corado com Coomassie de activador do plasminogénio tipo tecido humano tratado (Galha 1) e tratado com Endo H (Calha 2). A banda de alto peso molecular é t-PA de 1 cadeia; as outras bandas principais são Kringle tipo I (Kl), Kringle tipo II (KII) e protease (P).

A Figura 2 representa digestões com glicosidases de t-PA earboximetilado reduzido. Calha 1: -N-glicanase; Calha 2: +N-glicanase; Calha 3: -EndoH; Calha 4: +EndoH. Identificações das bandas como na Figura 1.

A Figura 3 representa um mapa de restrição do plasmídeo de partida pUCPAhHD.

^z Figura 4. Concentração plasmática ao longo do tempo do rt-PA testemunha (A ) e rt-PA modificando com periodato de sódio (O) ou tendo H ( ®). Os resultados estão apresentados como a média + desvio padrão.

A Figura 5 representa a alteração ao longo do tempo da radioactividade de precipitável com ácido tricloroacético (TCA) para o t-PA humano testemunha (O) e glutamina^^^-t-PA (□ ).

A Figura 6 representa a alteração ao longo do tempo da radioactividade precipitável com ácido tricloroacético (TCA) para o t-PA humano testemunha (O) e glutamina₁^₇ ácido glutâmico275 t-PA (0).

Figura 7. Concentração no plasma ao 125 longo do tempo de rt-PA testemunha marcado com I (·) e não marcado (O). Os resultados estão apresentados como média + desvio padrão.

-10Figura 8. Concentração no plasma ao longo do tempo de rt-PA rico em manose (Δ), rt-PA testemunha (4 ), et-PA tratado com EndoH (β) e rt-PA tratado com periodato (O) marcado com 1251. Os dados estão apresentados como + desvio padrão.

Descrição detalhada

Geral

Encontrou-se que a estrutura de açúcar no resíduo de aminoácido 117 do activador do plasminogénio tipo tecido humano tem o seguinte tipo de composição

Man

Man

Man

Man—> 4GlcNAc—> 4GlcNAc—> ASN

Man2Man‘ enquanto as estruturas nos resíduos de aminoácidos 184 e 448 têm os seguintes tipos de composição:

Sia2—>3Gal —>4GlcNAc —>2Man

Fuc

Man—>4GlcNAc—>4GlcNAc—>ASN

S ia2 —>3Gal —>4GlcNAc —>2 /

Man

-11Abreviaturas: Man - manose; Gal - galactose; Fuc - fucose; Clc NAc -N-acetilglucosamina; Sia - ácido siálico;

R - H ou Sia 2 —> 3 Gal —4 Glc NAc.

Deve-se salientar que apesar das estruturas acima serem representativas dos tipos de oligossacáridos ligados em N encontrados no activador do plasminogénio tipo tecido humano, o presente invento não está limitado às estruturas apresentadas. Cada sítio de glicosilação contem provávelmente várias estruturas não idênticas estreitamente relacionadas. Isto é conhecido como micro-heterogeneidade e é uma característica comum aos glicanos de glicoproteínas / Ver J. Biol. Chem. 260, 4046 (1985) 7. Por exemplo os oligossacáridos ricos em manose podem variar no número de unidades de manose presentes. Nos oligossacáridos complexos, a micro-heterogeneidade pode envolver diferenças no grau de ramificação assim como no número de resíduos de ácido siálico, fucose, galactose e N-acetilglucosamida. Tal micro-heterogeneidade está incluída no âmbito do presente invento.

A estrutura rica em manose no aminoácido 117 que se observou ser única, não só em estrutura relativamente às estruturas mais complexas nos resíduos de aminoácidos 184 e 448, mas também por a sua remoção funcional completa sem concomitante modificação funcional das estruturas em 184 e 448 ter resultado num activador do plasminogénio tipo tecido humano totalmente activo biologicamente tendo uma maior semi-vida in vivo.

A remoção da estrutura de açúcar funcional no resíduo de aminoácido 117 significa remoção completa quando o sinal de glicosilação é destruído por mutagénese dirigida específica de sitio conforme descrito infra ou remoção substancial, como seja por tratamento com endoglicosidases que podem deixar um resíduo de N-acetilglucosamina intacto ligado a Asn₁₁₇ ou remoção substâncial nas posições 117, 184

448 por tratamento com periodato de sódio que oxida grupos hidroxilo próximos, por exemplo. A estrutura de açúcar funcionalmente não modificada nos resíduos de aminoácidos 117,

184 e/ou 448 significa retenção das estruturas intactas ou de substâncialmente todas estas estruturas de modo - quesejam funcionalmente equivalentes à proteína nativa.

A alteração da estrutura de açúcar nos aminoácidos 184 no t-PA recombinante tipo I e 448 significa substituição de um oligossacárido complexo por um oligossacárido rico em manose através da produção de activador do plasminogénio tipo tecido recombinante numa célula hospedeira sem a enzima N-acetilglucosamina-transferase que converte um oligossacárido rico em manose num oligossacárido complexo. Esta variante do t-PA rica em manose resultou numa variante do activador do plasminogénio tipo tecido humano biologicamente activo tendo uma semi-vida reduzida in vivo.

Numa execução preferida, a remoção da estrutura de açúcar funcional no resíduo de aminoácido 117 é conseguida por mutagénese específica de sítio do DNA codificador do sinal de glicosilação Asn-X-Ser/Tre, onde X pode ser qualquer aminoácido. No caso do activador do plasminogénio tipo tecido a sequência representando este sinal é Asn_11? (Ser^g) ^Ser2j9· ^A remoção da estrutura de açúcar funcional no resíduo de aminoácido 117 resulta assim, por exemplo, da mutagenização dos codões correspondentes a estes resíduos de aminoácidos, destruindo a função do sinal. Em particular, a mutagénese pode ser efectuada em codões representativos do sinal de modo a que seja produzido, por exemplo, um activador do plasminogénio tipo-tecido humano tendo um resíduo de aminoácido que não seja Asparagina (Asn) na posição 117 e/ou que não seja serina (Ser) ou treonina (tre) na posição 119 ou uma prolina (Pro) na posição 118. Numa execução mais preferida, a asparagina 117 é substituída por glutamina, considerando a sua estreita semelhança estrutural, ou serina 119 é substituída com metionina, considerando a sequência análoga na

segunda região de ansas múltiplas.

A mutagénese é conseguida via técnicas conhecidas per se, por exemplo, de acordo com os métodos revistos por Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468 (1983). Por exemplo, mudando o codão codificador da asparagina AAC na posição 117 para CAA ou CAG, requerendo alteração de dois nucleotídeos, o produto de expressão conterá glutamina na posição 117. Outras mutações aqui incluídas derivam da análise do código genético.

Um método alternativo para a remoção do açúcar funcional no resíduo de aminoácido 117 envolve o uso de uma endoglicosidase como seja a Endoglicosidase H que é capaz de (substâncialmente) remover a estrutura de açúcar rica em manose no resíduo de aminoácido 117 (Asn) sem afectar funcionalmente as estruturas complexas nos resíduos de aminoácidos 184 e 448. Novamente, este tratamento é conseguido via técnicas conhecidas per se, por exemplo, de acordo com o método de Tarentino et al., J. Biol. Chem. 9, 811 (1974) e Trimble et al., Anal. Biochem 141 515 (1984).

Um outro método para remoção de açúcar funcional nos resíduos de aminoácidos 117, 184 e 448 é por tratamento com periodato de sódio, conseguido por técnicas conhecidas per se que oxida resíduos de açúcar que contenham grupos hidroxilo próximos. Os oligossacáridos nas três posições 117, 184 e 448 contêm resíduos susceptíveis de oxidação por periodato.

Ainda um outro método de alteração da estrutura de açúcar consiste nasubstituição de um oligossacárido complexo nas posições 184 no t-PA recombinante tipo I e 448 por um oligossacárido rico em manose usando técnicas recombinantes como por exemplo transfecção de uma célula hospedeira que não possua a enzima necessária à síntese de oligossacáridos do tipo complexo ligados em N (Gottlieb, C. et al. , J. Biol. Chem. 250:3303-3309 / 1975 7) com um vector de expressão codificador do t-PA.

Os exemplos que se seguem ilustram apenas o melhor modo conhecido para a realização do invento mas não devem ser considerados como limitantes do mesmo. Todas as citações da literatura feitas são expressamente incluídas por referência.

Exemplo 1

Variante de açúcar do t-PA Glu^^^ sem oligossacáridos rico em manose na posição 117

Usou-se mutagénese específica de sítio para construir um vector de expressão capaz de expressar DNA codificador do activador do plasminogenio tipo tecido tendo o resíduo de aminoácido glutamina na posição 117 em vez de asparagina, como se segue:

A. Definição do oligonucleotideo

Um oligonucleotideo de 24-meros tendo a sequência 5¹-TGC-ACC-AA-TGG-C*A*A*-AGC-AGC-GCG-3' (24-meros Q117) foi sintetizado pelo método fosfotriester de Crea et al. , Nucleic Acids Research 2331 (1980). Os asteriscos indicam o codão mutante (asn para gin).

B. Construção do molde M13 recombinante

O plasmideo pUCPAAHD (Figura 3) é um derivado do plasmideo designado pETPFR (também designado pPADHFR-6 quando divulgado em EPO 93619, supra) com as seguintes modificações: 1) 166 pb de DNA 5' não traduzido foi

removido do extremo 5' do gene do t-PA, usando exonuclease Bal31; 2) adicionou-se um sítio HindIII ao extremo 5' do gene do t-PA; 3) um poliadaptador, contendo sítios de reconhecimento para EcoRl, Saci, Smal, BamHI, Xbal, Sall e PvuII, foi adicionado ao extremo 5' do promotor precoce do SV10 que dirige a expressão do t-PA; 4) o sítio HindIII na posição 3539 do pETPFR foi destruído através de uma reacção de preenchimento com Klenow.

plasmideo pUCPAAHD (Figura 3) foi digerido com Smal e o fragmento de aproximadamente 2,0 kb contendo o gene do t-PA até ao codão N2 507 foi isolado por PAGE e dectroeluição do fragmento a partir do gel. O vector M13mpl0 (Messing, Methods in Enzymology 101, 20 (1983) foi também digerido com Smal, extraído uma vez com fenol, clorofórmio, precipitado com etanol e ressuspenso em 50 mM Tris pH 8,0, mM EDTA (TE). O fragmento com cerca de 2,0 kb do pUCPAAHD foi ligado ao M13mpl0 cortado com Smal usando DNA-ligase de T4 e o DNA resultante foi usado para transformar E. coli JM101. O fago resultante foi isolado e a presença da inserção foi verificada e a sua orientação determinada por análise de restrição de minipreparação de fagos. Um fago recombinante, M13/t-PA-SMA foi escolhido como molde para subsequente mutagênese.

C. Reacção de mutagênese

O iniciador de mutagênese (24-meros Q117) foi emparelhado como DNA de cadeia simples de M13/t-PA-SMA e tratado com DNA-polimerase de E.coli, fragmento Klenow, na presença de dNTPs e DNA-ligase de T4 para criar in vitro heteroduplexes de moléculas RF, como descrito por Adelman ei; al., DNA 2, 183(1983). Estas moléculas foram usadas para transformar E. coli estirpe JM101 (ATCC N2 53876) e os fagos que incorporaram a mutação pretendida foram detectados por hibridação de placas usando o iniciador de mutagênese como sonda (Adelman et al., DNA 2, 183 (1983). Um fago mutante

foi isolado e designado M13/t-PA-SMA-GLN117.

D. Subclonagem do mutante GLN117 t-PA no plasmídeo de expressão pUCPÃ HD

O DNA de cadeia dupla do fago M13/t-PA-SMA-GLN117 foi digerido com 5mal, BglII e Ãpal e o fragmento de cerca de 1,4 kb foi purificado por PAGE. Este fragmento foi então usado para substituir o fragmento correspondente em pUCPA/\HD.

Os plasmídeos recombinantes contendo o fragmento do gene do t-PA foram identificados. Os plasmideos M119 e Q117 são introduzidos e amplificados em células CHO deficientes em DHFR (Urlab et al., Proc. Natl. Acid Sei.

77, 4216 (1980) como se segue: 1) DNA de plasmideo é introduzido nas células pelo método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham et al., J. Virol. 52, 455 (1973); 2) as colónias que surgem no meio selectivo / meio sem hipoxantina, glicina e timidina (-HGT) são testadas quanto à expressão de t-PA indirectamente por detecção da formação de plasmina conforme testado pela digestão de fibrina e plasminogénio, descrito por Granellia et al., J. Exp. Med. 148, 223 (1978); 3) cinco dos clones mais fortemente positivos são testados quantitativamente quanto à quantidade de t-PA secretado por célula usando um ensaio de ELISA; 4) o clone que secreta o: nível mais alto de t-PA é semeado em metotrexato (MTX) como se segue: 2x10 células são semeadas em placas de 100 mm contendo 50, 100 ou 250 nM MTX; 5) cinco clones que surgiram em HTX são extraídas e testadas quantitativamente (por ELISA) como no Passo 3) acima; 6) o clone que secreta o nível mais áLto do t-PA é semeado em concentrações mais altas de MTX como no Passo 4) acima, seguido do ensaio quantitativo dos cinco clones que surgiram e selecção do melhor produtor de t-PA.

processo de amplificação e despiste atrás é repetido até não se obter aumentos na produção de t-PA a partir da linha celular resultante e o t-PA mutante correspondente é separado para ser usado.

Exemplo 2

Variante de açúcar do t-PA ^Met-Qg sem oligossacárido rico em manose na posição 117

A glicosilação ligada em N na posição 117 requere uma sequência Asn-X-Ser/Tre para ocorrer. A mutagénese por substituição oudelecção na posição 119 evitará também a glicosilação na posição 117. Um processo semelhante ao descrito no Exemplo 1 foi usado para fazer o correspondente mutante usando um 24-mero com a sequência 5¹-CC-AAC-TGG

-AAC-AGC-A*T*G*-GCG-TTG-G-3¹ (24-meros M119) para dar pUCPAAHD M119. A produção do correspondente mutante M119 por expressão é como descrito acima no Exemplo 1.

Exemplo 3

Variante de açúcar do t-PA ^Glnjj7^Glu245

Um mutante do t-PA glutamina₁₁₇ ácido glutâmico2₇5 foi preparado como se segue:

plasmideo pUCPA HD, preparado como descrito acima foi digerido com BglII e Seal e o fragmento com aproximadamente 763 pb, correspondendo aos codões 1 a 254 da sequência de DNA do activador do plasminogénio tipo tecido, foi purificado em SDS-PAGE segundo uma técnica conhecida perse.

DNA de t-PA humano foi obtido a partir dos plasmideos pPADHFR-6 (também designado pETPFR) e

18pA2SE10. A preparação destes dois plasmídeos do t-PA está descrita na Publicação do Pedido de Patente Europeia NS 093619, referido atrás e aqui incluído como referência.

O plasmideo pA25E10 contem as sequências codificadoras dos últimos 508 aminoácidos do gene do t-PA e 722 pares de bases da região 3' não traduzida. Este plasmídeo foi digerido com Smal e BglII para produzir um fragmento de 744 pares de bases que foi isolado por métodos convencionais como préviamente descrito. Este fragmento contem os codões para os aminoácidos 411 a 527 do t-PA e inclui parte da região 3' não traduzida.

O plasmideo pPADHFR-6 contem todo ogene estrutural do t-PA eperto da região 3' não traduzida. Este plasmideo foi digerido com Saci e BglII para produzir um fragmento de 1230 pares de bases que foi isolado. Este fragmento contem codões para os primeiros 410 aminoácidos da forma madura do t-PA.

Estes fragmentos foram ligados uns aos outros usando métodos convencionais e digeridos com BglII. Isolou-se um fragmento de 1974 pares de bases contendo codões para toda a sequência do t-PA maduro mais perto da região 3' não traduzida. M13mpl8 de cadeia dupla, /Messing et al. , Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Editor A. Walter, Elsevier, Amsterdam (1981), p. 143 7 foi digerido com BamHI e emparelhado com t-PA digerido com BglII para formar M13mp8PABglII. Células E. coli JM101 (ATCC N2 33876) foram transformados com a forma replicativa de cadeia dupla de M13mp8PABglII. As formas de cadeia simples e de cadeia dupla (RF) de M13mp8PABglII podem ser isoladas a partir de células E. coli JM101 infectadas com este fago. A forma de cadeia simples foi usada para a mutagénese específica de sítio do t-PA.

O gene estrutural do t-PA humano foi mo19-

difiçado por mutagénese específica de sítio para expressar t-PA com substituição de aminoácidos em várias posições. Preparou-se um oligonucleotídeo sintético por exemplo pelo método fosfotriéster em fase sólida de Crea et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 75, 5765 (1978) e usou-se para a mutagénese especifica de sítio:

Sequência de DNA Glu

Iniciador 269 G CCT CAG TTT GAA ATG AAA GGA G método geral de Adelman et al., DNA £, 183 (1983), aqui incluído por referência, foi usado para gerar um clone de t-PA contendo a sequência mutagenizada do iniciador sintético. 0 clone do t-PA mutante M13RF2C9 foi gerado usando o iniciador contendo a mutação de um único aminoácido mostrado atrás.

No plasmídeo pPADHFR-6 (também designado pETPFR - ver Publicação do Pedido de Patente Europeia NP 93619 supra) a expressão do gene estrutural do t-PA nativo está sob o controle do promotor precoce do antigénio T do SV40. Este promotor também controla a expressão do gene DHFR. Um fragmento vector 1 foi obtido por isolamento do fragmento grande gerado por digestão de pPADHFR-6 com BglII e BstII.

Um outro fragmento 2 foi obtido por isolamento do fragmento de 400 pares de bases do t-PA obtido por digestão de pPADHFR-6 com BglII e BstXI. Um fragmento 3 do t-PA de 1141 pares de bases contendo a mutação pretendida foi obtido por digestão do DNA RF do clone de t-PA mutante M13RF2C9 com BstXI e BstII. Os fragmentos 1 e 2 foram ligados a o fragmento 3. A mistura de DNA foi usada para transformar E. coli para dar o vector de expressão eucariótico pPADHFR-6 2C9.

O plasmídeo pPADHFR-6 2C9, preparado como descrito acima na Publicação do Pedido de Patente Europeia NP 199.574, publicado em 29 de Outubro de 1986, contem uma sequência de DNA codificadora do mutante de activador do pias20-

minogénio tipo tecido com ácido glutâmico 275. Digeriu-se com Seal e AspI e o fragmento com cerca de 630 pb, correspondendo aos codões 254 a 466 da sequência do DNA do activador do plasminogénio tipo tecido foi purificado em SDS-PAGE de modo conhecido per se.

Os dois fragmentos BglII-Scal (pUCPAÔHD) e Scal-Apal (pPADHFR-6 2C9) foram ligados ao fragmento grande BglII (pb 531)-ApaI (1926 pb) de pUCPA HD digerido e o plasmideo resultante portador do DNA de t-PA mutante glutami^na117 ^aci^do Çflutâmico27₅ foi despistado como é habitual. O plasmideo resultante foi introduzido e amplificado em células CHO deficientes em DHFR como descrito acima e o t-PA mutante correspondente foi separado para ser usado.

Exemplo 4

Caracterização da estrutura do açúcar do t-PA

A sequência de aminoácidos do t-PA inclui 4 potências sítios de glicosilação ligada em N /~Asn-X-Ser/Tre^ Ann. Rev. Biochem. 41,.673 (1972)_7- Estes são os resíduos asparagina 117, 184, 218 e 448 /Nature 301, 214 (1983)_7. A posição 218, no entanto, verificou-se não ser glicosilada no t-PA. A posição 184 é glicosilada no t-PA tipo I mas não no t-PA tipo II /Biochemistry 23, 3701 (1984) /

A cromatografia por filtração em gel de rt-PA digerido com Pronase separou duas classes de oligossacáridos ligados em N (Tabela 1 abaixo). A composição do material de mais alto peso molecular foi consistente com oligossacáridos tipo complexo fucosilados. 0 material de peso molecular máis baixo tinha a composição esperada para um oligossacárido pequeno rico em manose (provávelmente MangGlcNAc2).

A posição de ligação do oligossacárido

-20-a

rico em manose foi determinada utilizando enzimas glicosídicas de diferentes especificidades. As enzimas usadas foram endo- Ç> -N-acetilglucosaminidase H (Endo H; Genzyme, Inc.), que remove olígossacáridos ricos em manose mas não tem efeito sobre os olígossacáridos tipo complexo e peptídeo-N-glicosidase F (N-glicanase; Genzyme, Inc.), que remove oligossacáridos ricos em manose e do tipo complexo. 0 t-PA usado para estas experiências tinha sido convertido na forma de duas cadeias com plasmina e depois reduzido e carboximetilado.

SDS-PAGE resolve rt-PA de duas cadeias carboximetilado e reduzido em Kringle tipo I (Glicosilação em 117 e 184); Kringle tipo II (glicosilação em 117) e proteína (glicosilação'em 448). A digestão do t-PA com N-glicanase provoca a coalesância das bandas de Kringle numa posição de mobilidade ligeiramente maior do que Kringle tipoll e também provoca uma maior mobilidade da protease (calha 2, Fig. 2). A digestão do t-PA com EndoH aumenta a mobilidade electroforética da banda de Kringle mas não afecta a mobilidade da banda de protease (calha 4, Figura 2). O resultado de endo H indica que Kringle tipo I e tipo II contem um oligossacárido rico em manose; este deve estar situado no resíduo 117, o qual é a única posição glucosilada nas Kringle tipo I, e tipo II. 0 tratamento com Endo H não converte Kringle tipo I em Kringle tipo II; portanto o resíduo 184, que é glicosilado na Kringle tipo I mas não na Kringle tipo II, contem um oligossacárido complexo. A posição 448 deve também conter uma estrutura complexa, pois o tratamento com N-glicanase aumenta a mobilidade da posição protease do rt-PA, enquanto que endo H não tem qualquer efeito.

-21Tabela 1

Composição em açúcares das fracções de oligossacárido do t-PA digerido com Pronase

Amostra	Fu	Man	Gal	GlcNAc	Siab
c Tipo complexo	1,0	3,0	2,8	4,2	2,4
Tipo rico em manose^	0,6	6,2	vestigios	2,0	0

Abreviaturas: Fuc = Fucose, Man = Manose, Gal = Galactos

GlcNAc = N-acetilglucosamina, Sia = ácido siálico lo

Ensaio com ácido tiobarbitúrico c

Normalizado para 3 Manose ^Normalizado para 2 GlcNAc

Exemplo 5

Tratamento do t-PA com Endo H

Endo- p-N-acetilglucosaminidase H (Endo H) foi adquirido à Genzyme, Incorporated. Endo H remove oligossacáridos ligados em N do tipo rico em manose mas não afecta oligossacáridos complexos. SDS-PAGE foi efectuado como descrito por Laemmli, Nature 227, 680 (1970). 0,8 mg de activador do plasminogénio tipo tecido humano (preparado como descrito em EPA 93619, supra) (em 0,2 ml de tampão de formulação consistindo em 0,2M fosfato de arginina, pH6 , con tendo 0,01% de Tween 80) foi misturado com Endo H (0,1 unida de em 0,05 ml de fosfato de sódio 25 mM, pH 6) e azida de só dio (0,02 por cento). A amostra foi incubada a 37 graus durante 20 horas. Uma amostra testemunha de activador do plasminogénio tipo tecido humano foi preparada e incubada do mesmo modo excepto o tampão fosfato de sódio (0,05 ml de 25 mM) ser substituído por solução Endo H. Após incubação, as amostras foram diluídas para um volume total de 0,75 ml com tampão de formulação e extensivamente dialisadas contra o mesmo tampão de formulação. As amostras foram filtradas (filtros HV de 0,4 microns, Amicon) e guardadas a 4 graus.

A desglicosilação foi controlada por SDS-PAGE após redução e carboximetilação. Amostras do activador do plasminogenio tipo tecido assim preparado (0,05 mg em 0,01 ml de tampão de formulação) foram misturadas com fosfato de sódio 25 mM pH 6 (0,015 ml) e tampão de amostra Laemmli 2x contendo ditiotreitol 20 mM (0,025 ml). As amostras foram aquecidas durante 5 minutos a 95 graus e deixadas arrefecer. Adicionou-se ácido iodoacético (0,015 ml de uma solução 0,67 M em IN NH₄OH) e as amostras foram incubadas no escuro durante 3 horas à temperatura ambiente. As amostras carboximetiladas reduzidas foram analisadas por SDS-PAGE.

Nesta análise, o activador do plasminogénio tipo tecido humano de duas cadeias, não tratado, testemunha é resolvido em três bandas principais correspondendo a Kringle tipo I (glicosilação nas poisções 117 e 184), Kringle tipo II (glicosilação na posição 117) e protease (calha 1, Fig. 1). A digestão do activador do plasminogenio tipo tecido humano com Endo H aumenta a mobilidade electroforé tica de cada uma das bandas de Kringle mas não afecta a mobilidade da banda de protease (calha 1, Fig. 1). A composição em açúcares neutros e amino do t-PA tratado com Endo H está apresentada na Tabela 2. 0 tratamento com Endo H reduziu o teor em manose em 5,6 resíduos por mole e o têor em acetilglucosamina em 0,9 resíduos por mole. Este resultado é consistente com a remoção estequiométrica do oligossacárido rico em manose da posição 117.

-23tí»™

A actividade fibrinolítica do activador do plasminogénio tipo tecido humano tratado com Endo H foi testado pelo ensaio in vitro da lise de coágulos de Collen et al., J. Clin. Path. 21, 705 (1986). A actividade do activador do plasminogénio tipo tecido humano tratado com Endo H era indistinta da da testemunha não tratada neste ensaio.

As amostras de plasminogénio de tecido humano foram iodinadas pelo processo de Iodobead /Markwell, Anal. Biochem. 125, 427 (1982)_7 para uma actividade específica de aproximadamente 2 yuCi/pg. Arginina, 0,2M, citrato O,1M, (pH 6,0) e Tween 80, 0,01 por cento, foi o tampão usado sempre. Todas as amostras foram dialisadas contra este tampaõ antes da iodinação. 0 pH foi ajustado a 8,2 com a base Tris antes da iodinação. A mistura de iodinação foi passada através de uma coluna PD-10 (Pharmacia) zquilibrada com tampão pH 6,0, as fracções radioactivas do volume de exclusão foram reunidas, fez-se SDS-PAGE e o gel seco foi autorradiografado. A autorradiografia dos activadores do plasminogénio tipo tecido humanos marcados mostrou que mais de 95 por cento da radioactividade foi incorporada no activador do plasmhogénio tipo tecido humano.

Cada um dos activadores do plasminogénio tipo tecido humano marcado foi misturado com material não marcado numa proporção de 1:200 (marcado: não marcado, p/p) e injectado i.v. como um bolus em coelhos que tinham um catéter arterial na orelha. Cada coelho recebeu 1 mg/kg de activador do plasminogénio tipo tecido humano não marcado e 10 pCi/kg de marcado. O activador do plasminogénio tipo tecido humano não marcado foi usado como veículo para a diminuta quantidade de activador do plasminogénio tipo tecido humano marcado para se conseguir níveis terapêuticos e para evitar alterações na farmacocinética que pudessem surgir da dependência de concentração das vias de eliminação. Colheram-se amostras de sangue arterial seriadas durante um período de 26 minutos e colocaram-se imediatamente em tubos contendo uma

-24mistura liofilizada de D-phe-pro-arg-clorometilceteno (PPACK) e EDTA em concentrações finais de 1 yuM e 4,8 mM respectivamente. Os tubos foram colocados em gelo e o plasma separado. Em cada amostra de.plasma mediu-se a radioactividade precipitável (activador do plasminogénio tipo tecido humano intacto) com ácido tricloroacético (TCA) e a radioactividade total. O activador do plasminogénio tipo tecido humano imuno-reactivo foi também medido por um processo ELISA de sanduíche que utilizou anticorpos policlonais e que tinha uma sensibilidade de pelo menos 30 ng/ml.

Os dados de concentração no plasma ao longo do tempo foram adaptados a um modelo de dois compartimentos para a injecção de bolus usando um processo de análise de curvas interactivo que usa o método de residuais (Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2& ed., New York, Mareei Dekker, Inc., Pág. 433-444 /^-1982_7). Usou-se a equação exponencial que se segue: Cp = Ae~ + Be^- P , onde Cp é a concentração de rt-PA no plasma em qualquer tempo, t e A e B são as intercepções do eixo dos y das fases de eliminação rápida e lenta que têm declives de e respectivamente.

A t^/2 para as fases / e foram calculadas como a razão: Cn2 /declive. Os resultados do processo de análise de curva foram usados como aproximações iniciais para ajustar os resultados a um modelo biexponencial usando PC NONLTN. Uma série de dados (Figura 4) não puderam ser ajustados usando PC NONLIN assim usaram-se os dados do processo de análise da curva,

C a concentração no plasma no tempo zero foi a soma de A e o

B.

V foi calculado como a dose dividida por C . A área o o sob a curva (AUC) foi determinada pela fórmula AUC = + B/yS

Em cada um dos casos a área extrapolada foi inferior a 20% de AUC total. AUC foi então usado para calcular a eliminação usando a fórmula, Eliminação = Dose. As contribuições relatiAUC vas das fases alfa e beta foram calculadas a partir das fórmulas, seguintes:

%Αυθρς = Α/ο( χΙΟΟ AUC %AUCβ = B/ft χΙΟΟ AUC

Os dados para a Tabela 2 foram ajustados a um modelo com eliminação directa a partir do compartimento central (K_1Q) ® equilibrado com um compartimento periférico (Kj2 ^{e K}21^

A partir dos estudos de eliminação in vivo em coelhos resultaram dois tipos de dados. Um é do activador do plasminogénio tipo tecido humano imuno-reactivo que deverá ser uma medida de eliminação do material não marcado. 0 segundo tipo de dados, é a reactividade precipitável com TCA que representa mais de 95 por cento do activador do plasminogénio tipo tecido humano intacto. As curvas de concentração no plasma versus tempo derivadas da imuno-reactividade e das contagem precipitáveis com TCA foram ajustadas aos modelos multiexponenciais adequados e os parâmetros f armacocíneticos derivados foram comparados.

Exemplo 6 rt-PA tratado com periodato t-PA recombinante (1 mg/ml em tampão fosfato de arginina 0,2M, pH6) foi arrefecido num banho de gelo. Adicionou-se periodato de sódio para uma concentração de 10 mM e a mistura foi mantida no escuro durante 1 hora a 4°C. Adicionou-se glicerol (100 mM) e etanolamina (50 mM) para parar a reacção. A amostra foi então dialisada exaustivamente contra tampão fosfato de arginina pH 6, filtrada através de um filtro de 0,32 microns (Millipore) e guardada a 4°c. O pe-26-

riodato de sódio provoca oxidação dos resíduos de açúcar que tenham grupos hidroxilo. Os oligossacáridos ligados em N nos três locais de glicosilação do rt-PA contêm resíduos susceptíveis de oxidação com periodato. As composições em açúcares neutros e amino de rt-PA e rt-PA tratado com periodato estão apresentadas na Tabela 2. Conforme esperado, a fucose foi completamente destruída pela acção do periodato. A descida do conteúdo em manose foi consistente com a destruição dos resíduos terminais do oligossacárido rico em manose na posição 117 e dos resíduos ligados em 2 dos oligossacáridos complexos nas posições 184 e 448. Também se obãervou algum decréscimo nos níveis de gálactose, presumivelmente como resultado da oxidação das partes de galactose terminal (i.e. as não substituídas com ácido siálico).

A análise de aminoácidos sem redução e carboximetilação demonstrou que os resíduos de cisteina não foram oxidados para ácido cisteico pelo tratamento com periodato. Após redução e carboximetilação, 34,2 moles (o número esperado é 35) de carboximetilcisteina por mmole de rt-PA foram recuperados na amostra tratada com periodato. A recuperação de metionina no rt-PA tratado com periodato foi apenas de 0,9 mmoles em 5,0 mmoles, rt-PA não tratado tinha um valor de 2,5 mmoles. No entanto, com redução e carboximetilação, as recuperações de metionina aumentaram para 3,3 e 2,8 mmoles para osmateriais tratados e não tratados com periodato respectivamente. Estes resultados podem sugerir a presença de sulfóxido de metionina na amostra tratada. Não houve diferença significativa na recuperação dos outros aminoácidos entre o rt-PA tratado e não tratado com periodato (resultados não apresentados). 0 tratamento com periodato não alterou a actividade do rt-PA significativamente. A actividade especifica do rt-PA tratado com periodato foi de 91% a do rt-PA controle conforme medido por um ensaio de lise de coágulos in vitro (Collen, D. et al. J, Clin. Path. 21:705-707 /“19687).

Exemplo 7

Variante do t-PA rico em manose

Células do clone 15B de ovário de hamster chinês (Gottleib, C. et al., J. Biol. Chem. 250: 3303-3309 /~1975_7 são cotransfectados com um plasmideo codificador do activador do plasminogénio de tecido e dihidrofolato redutase pETPFR descrito na Publicação Europeia NQ 093619 e pSVENEOBall (Publicação Europeia NQ 160457) expressando uma proteína que confere resistência à neomicina. O clone 15B é um mutante das células CHO sem a enzima N-acetilglucosamina transferase I (Gottleib, C. et al, supra). A cotransfecção de células CHO 15B é pela modificação da técnica de coprecipitação com fosfato de cálcio de Graham e Van Der Eb (Graham, F. e Van Der Eb, A. Virology. 52:456-467 /”19737). O DNA de plasmideo (2,5 pg) foi coprecipitado com fosfato de cálcio e introduzido em 10 células durante 3 horas. As células foram subsequentemente tratadas com 20% de glicerol durante 60 segundos e depois alimentadas com meio não selectivo. Apés 2 dias as células foram passadas e alimentadas com meio selectivo (Han F 12-DMEM contendo G418). As células foram cultivadas durante três semanas e depois passadas para quatro placas de 60 mm. Quando atingiram 80% de confluência, as células foram alimentadas com um outro meio selectivo (Ham F-12 DMEM contendo 0,50, 100 ou 25 nM de metotrexato). Após duas semanas, as células foram clonadas em placas de 96 poços por diluição limite. Os poços individuais foram testados quanto a rt-PA por Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Os poços que produziram rt-PA foram cultivados até à confluência em placas de 24 poços e amplificadas ainda com 500, 1000, 3000 e 10.000 nM metotrexato. Um clone amplificado para 3000 e 10.000 nM metotrexato foi seleccionado e expandido para produção do rt-PA mutante. O rt-PA foi purificado usando sefarose com quelato de zinco (sepharose quelante, Pharmacia) e um anticorpo policlonal de coelho imobilizado induzido contra rt-PA tipo selvagem. Uma actividade especifica semelhante

ao rt-PA tipo selvagem foi determinada usando um substracto cromogénico S2251 (Kabi) e uma ELISA baseada em policlonal.

Uma amostra de rt-PA com oligossacáridos ricos em manose nos três locais de glicosilação foi preparada por expressão do gene de t-PA na linha celular CHO 15B. A linha celular 15B não possui a enzima de processamento de glicoproteínas N-acetilglucosamina transferase I e como resultado não pode sintetizar oligossacáridos ligados em N do tipo complexo. As composições em açúcares neutros e amino do rt-PA produzido na linha celular 15B foram consistentes com a presença de oligossacáridos ricos em manose nos três locais de glicosilação (Tabela 2).

Tabela 2

Composição em açúcares do rt-PA modificado

	✓ 3. Resíduo (mole/mole rt-PA)
Fuc	Man	Gal	GlcNAc
EndoH° testemunha	2,4	9,1	4,5	7,1
tratada	2,2	3,5	4,5	6,2
. c Penodato testemunha	2,2	9,2	3,6	8,9
tratado	-	4,4	1,9	8,9
Q Mutante rico em manose	1,5	16 ,2	0,9	6,0

Abreviaturas; Fuc = fucose, Man = manose, Gal = galactose, GlcNAc = N-acetilglucosamina.

Normalizado em galactose

Normalizado em GlcNAc

Exemplo 8

Farmacocinética de variantes do activador do plasminogénio tipo tecido

As concentrações no plasma ao longo do tempo das formas de rc-PA modificadas com EndoH e periodato estão apresentadas na Figura 4. Ambos os tratamentos pareem baixar a eliminação do rt-PA. Houve um aumento significativo na ^alfa apenas para o rt-PA tratado com periodato.

Tanto o rt-PA tratado com EndoH como com periodato têm velocidades de eliminação mais lentas do que o rt-PA testemunha, com diferenças de 1,9 e 2,7 vezes, respectivamente. A diferença entre a velocidade de eliminação de rt-PA tratado com EndoH e periodato foi significativa (P < 0,005). Não houve diferenças significativas em V_q ou t^^ beta (Tabela 3).

As restantes formas modificadas do rt-PA não existiam em quantidades que permitissem a caracterização de farmacocinética usando as técnicas atrás. Portanto as características farmacocinéticas destes materiais foram determinadas após iodinação. Uma limitação deste processo é que a eliminação das formas marcada e não marcada do rt-PA é diferente (Figura 7). A imunorreactividade e as contagens precipitáveis com TCA descreveram um padrão idêntico até apro ximadamente 90% da dose não marcada ter sido eliminada. As curvas divergiram então com o rt-PA marcado sendo eliminado mais lentamente. Os parâmetros farmacocíneticos destas duas curvas estão apresentados na Tabda 4. Apesar dos valores de V_q , ^{e nao} serem significativamente diferentes, os tamanhos relativos de %AUC_O( e %AUC^ assim como a velocidade de eliminação sao significativamente diferentes.

Para determinar se a análise farmacocinética com rt-PA marcado radioactivamente poderia prever as diferenças de eliminação que tinham sido préviamente mostradas , rt-PA tratado com Endo-H e periodato foi marcado e a sua

-30farmacocinética foi determinada. 0 rt-PA marcado foi sempre coinjectado com 1 mg/kg de rt-PA não modificado. Os padrões de eliminação das contagens precipitáveis com TCA destes rt-PA modificados estão apresentados na Figura 8. O rt-PA com estruturas de oligossacáridos ricos em manose em todos os sítios de glicosilação produzido na linha celular CHO15B foi também incluido nesta experiência. Todas as quatro formas de rt-PA tinham volumes de distribuição iniciais semelhantes. Como se mostrou na Figura 4, os rt-PA, tratados com EndoH e com periodato têm velocidades de eliminação semelhantes ao rt-PA testemunha; a alteração dominante no padrão de eliminação do rt_PA tratado com EndoH e com Periodato parece ser novamente no tamanho relativo da fase alfa e beta. A velocidade de eliminação do rt-PA HM foi aproximadamente duas vezes maior. A alteração mais substancial na eliminação do t-PA HM parece ser devida a um decréscimo na semi-vida da fase alfa (Tabela 5).

A remoção do oligossacárido rico em manose no resíduo de aminoácido 117 pela EndoH e a oxidação pelo periodato parece causar alterações semelhantes na farmacocinética. Consequentemente o mutante Glnll7 foi usado também para determinar o papel que a glicosilação no aminoácido 117 possa ter na eliminação do rt-PA, A Figura 5 mostra que este mutante se comporta de modo semelhante às outras formas de rt-PA com eliminação mais lenta. A velocidade de eliminação de Glnll7 é mais duas vezes inferior à da testemunha e existe um desvio para uma fase beta mais acentuada. Não se observaram alterações significativas em V_q , tj^alfa

310)

Tabela 3. Farmacocinética de rt-PA não marcado, modificado

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E-t	O	CQ	ιΰ	CQ	-	0
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Tabela 4

Farmacocinética de rt-PA selvagem marcado e não marcado³

rt-PAb	n	V o ml/kg	Tl/2^	Tl/2^	%AUCo(	%AUC£	Cl ml/min/kg
IR	4	30,0	21,3	3,05	81,5	18,5	5 ,51
		3	2,0	9,42	14	3,2	0,85
TCA	4	27,7	30,0	3,36	62,1*	3 7,9*	3,92*
		1,9	9,5	0,28	0,72	5,5	0,40

Todos os dados estão apresentados com a média sem o desvio padrão (*) Pk.0,01 por dois testes t do Student adaptados.

As abreviaturas são rt-PA imunorreactivo (IR) e radioactividade precipitável com ácido tricloroacético (TCA). As doses foram de 1 mg/kg e 3,4 pCi/kg para IR e TCA respectivamente.

ν' v

Tabela 5

Parâmetros f armacocíneticos de rt-PA marcado tratado com Endo-H ou periodato e rt-PÃ rico em manose

rt-PAb	n	V o ml/kg	Tl/2°<	Tl/2^	%AUC<X	%AUC(S	Cl ml/min/kg
Testemunha	5	31,5	2 ,55	14,9	52	48	5,72
		8,5	0,66	3,8	5	6	0,45
ENDO	4	31,1	3,25**	24,1	33**	67**	2,84**
		2,35	0,36	1,8	1,1	9	0,24
Periodato	4	32,6	3,30**	30,3	32**	68**	2,74**
		2,3	0,49	3,7	3,1	7	0,25
HM	4	35 ,4	1,54**	38,0	63**	36**	10,1**
		15,1	0,11	21,2	35	13	4,0

Todos os dados estão apresentados com a média sem o desvio padrão. Ver Tabela 2 para a explicação da análise estatística.

Testemunha é rt-PA tipo selvagem; Periodato é rt-PA tratado com periodato de sódio; HM é rt-PA rico em manose produzido na linha celular CHO-15B; ENDO é rt-PA tratado com EndoH. Todas as doses foram lOuCi/Kg.

As farmacocinéticas de t-PA glutamina^^^ e t-PA testemunha humano estão apresentadas na Figura 5. 0 t-PA glutamina^7 é eliminado muito mais lentamente do que o controle.

Um perfil semelhante é apresentado pelo IP ácido glutâmico27₅, preparado como descrito como se mostra na Figura 6.

t-PA glutamina no Exemplo 3,

Características de ligação à fibrina

A ligação à fibrina é um factor extremamente importante que está presumivelmente directamente relacionado com a especificidade da fibrina que o activador do plasminogénio tipo tecido humano possui in vivo. A ligação do activador do plasminogénio tipo tecido humano EndoH à fibrina foi avaliada por dois processos. O primeiro processo utilizou a captura de activador do plasminogénio tipo tecido humano por poços revestidos com fibrina numa placa de microtitulação convencional; cada poço é então lavado e adicionado uma solução de plasminogénio e um substrato cromogénico para a plasmina (S-2251, Kabi). A côr gerada é proporcional-à quantidade de activador do plasminogénio tipo tecido humano que é capturado no passo inicial (Angles-Cano, Thrombosis and Haemostasis 54, 171 (1985). O segundo tipo de ensaio de ligação à fibrina mede a quantidade de activador do plasminogénio tipo tecido humano que?é deixado em solução (por ELISA) quando se adiciona trombina à solução de fibrinogénio sem plasminogénio e activador do plasminogénio tipo tecido humano (Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982). Presentemente não é claro qual o ensaio que prevê adequadamente as consequências in vivo da ligação alterada do activador do plasminogénio tipo tecido humano à fibrina. Com base nos dados de cada um dos ensaios podemos concluir que o activador do plasminogénio tipo tecido humano tratado com EndoH tem uma especificidade para a fibrina pelo menos não alterada, mesmo talvez melhorada.

De modo idêntico, os resultados do teste de ligação à fibrina do t-PA glutamina^^^ ácido glutâmico₂^₃, do Exemplo 3 , demonstraram que o t-PA glutamina^? ácido glutâmico₂75 é semelhante aot-PA ácido glutâmico^^ e é superior ao t-PA testemunha na estimulação com fibrina e actividade especifica.

-35Exemplo 9

Actividade fibrinolítica do t-PA variante Gln^^q ^MetH9

Os gln^^ç e met^^g e mutantes preparados como descrito nos Exemplos 1 e 2 foram testados quanto à actividade fibrinolítica com resultados semelhantes aos do material tratado com EndoH, conforme descrito acima. A sua farmacocinética é também semelhante à do material tratado com Endo-H, quando comparado com activadores do plasminogénio tipo tecido humano testemunhas.

Exemplo 10

Composições farmacêuticas

Os compostos do presente invento podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmacêuticamente úteis, nas quais o processo activador do plasminogénio tipo tecido humano é combinado por mistura com um veículo farmacêuticamente aceitável. Tais vazulos e sua formulação, inclusive de outras proteínas humanas, e.g. albumina do soro humana, estão descritos por exem pio em Remigton's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin, que aqui é incluido como referência. Tais composições conterão uma quantidade eficaz da proteína aqui tratada juntamente com uma quantidade adequada de veículo para preparar composições farmacêuticamente aceitáveis adequadas à administração eficaz no hospedeiro.

Por exemplo, o activador do plasminogénio tipo tecido humano aqui tratado pode ser administrado paréntericamente a indivíduos que sofrem de doenças cardiovasculares. A dosagem e velocidade das doses podem ser semelhan tes âs normalmente usadas em investigações clinicas de outros agentes trombolíticos cardiovasculares, e.g. cerca de 1-2 mg/

/kg de peso do corpo com a dose intravenosa ou intro-arterial durante 1,5-12 horas em pacientes que sofram de enfarte do miocárdio, embolia pulmonar, etc.

Como no exemplo de uma forma de dosagem adequada, uma ampola contendo 50 mg de activador do plasminogénio tipo tecido humano, arginina, ácido fosfórico e polissorbato 80 podem ser reconstituídos com 50 ml de água estéril para injecção e misturado com um volume adequado de 0,8 por cento de Cloreto de Sódio para Injecção.

activador do plasminogénio tipo tecido humano com semi-vida prolongada ou reduzida pode ser adequado para injecção intravenosa rápida. Isto eliminaria a necessidade de processos de administração complexos e poderá aumentar a opurtunidade para o uso de t-PA em locais com equipamento médico limitado como sejam veículos de emergência tendo pessoal paramédico. Uma semi-vida prolongada do activador do plasminogénio tipo tecido humano pode também permitir doses iniciais mais seguras e poderá manter níveis de plasmina trombolíticamente eficazes mais seguras e poderá manter níveis de plasmina trombolíticamente eficazes até 45 minutos ou mais. Uma maior semi-vida do activador do plasminogénio tipo tecido humano pode também ser útil na terapia prolongada com doses baixas que pode ser necessário para evitar reoclusão após trombólise aguda com êxito ou durante trombólise prolongada que pode ser necessária em casos de oclusão vascular periférica. Uma semi-vida reduzida do activador do plasminogénio tipo tecido humano poderá em certos pacientes ser o tipo de terapia trombolítica pretendida ao proporcionar níveis de plasma eficazes durante um período de tempo curto.

Apesar do que foi descrito se referir a realizações partieularmente preferidas, compreende-se que o presente invento não lhes está limitado. Os familiarizados com a matéria verão que várias modificações podem ser feitas em relação às realizações aqui divulgadas e que tais modificações estão dentro do âmbito do presente invento.

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES:

   I^a. - Processo para a preparação de uma variante do activador de plasminogénio do tecido humano, caracterizado por compreender a modificação da estrutura hidrocarbonada do activador de plasminogénio do tipo humano a qual é levada a cabo por:

   1) tratamento com a enzima endoglicosidade;
2. 2) introdução de substituições de aminoácidos relativa a pelo menos um resíduo em um, ou mais do que um, dos quatro sinais Asn-X-(Ser/Tre) de glicolização correspondendo às posições 117-119, 184-186, 218-220 e 448-450 na sequência de aminoácidos 527 do activador de plasminogénio do tecido humano, de forma a que o referido sinal seja destruído; ou
3. 3) mutagénese dirigida ao sítio do DNA subjacente em um, ou mais do que um, dos quatro sinais referidos em 2), de tal forma que o sinal seja destruído.

   2^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por possuir uma semi-vida in vivo aumentada, na qual a estrutura hidrocarbonada é modificada através da delecção de uma ou mais das estruturas funcionais hidrocarbonadas.

   3^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por a referida variante ter uma semi-vida in vivo aumentada, em que a estrutura hidrocarbonada é modificada através da eliminação da estrutura funcional hidrocarbonada do aminoácido 117.

   4^a. - Processo de acordo ' cóm ã Reivindica- ção 3, caracterizado por incluir um aminoácido diferente da asparagina na posição 117. 5^a. - Processo de acordo com a Reivindica- ção 3, caracterizado por incluir um aminoácido diferente da serina ou treonina na posição 119. 6^a. - Processo de acordo com a Reivindica-

   ção 3, caracterizado por incluir glutamina na posição 117.

   7^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por incluir metionina na posição 117.

   8^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por incluir prolina na posição 118.

   9^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida variante ser um activador de plasminogénio do tecido do tipo humano de uma só cadeia.

   10^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por incluir glutamina na posição 117 e ácido glutâmico na posição 275.

   11^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por a referida variante possuir uma semi-vida aumentada e em que a estrutura hidrocarbonada é modificada pela eliminação das estruturas funcionais hidrocarbonadas nas posições dos aminoácidos 117, 184 e 448.

   12⁴. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a referida variante conter uma semi-vida in vivo reduzida e em que a estrutura hidrocarbonada é modificada

   X pela substituição de oligossacáridos de manose altos na posição dos aminoãcidos 184 e 448.

   13^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por incluir na referida composição uma variante do activador de plasminogénio do tecido humano da Reivindicação l, misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

   14^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por incluir na referida composição uma variante do activador de plasminogénio do tecido humano da Reivindicação 2 misturado com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

   15^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por incluir na referida composição uma variante do activador de plasminogénio do tecido humano da Reivindicação 12 misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

   16^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a modificação consistir na eliminação de uma ou mais estruturas hidrocarbonadas.

   17^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por a estrutura funcional hidrocarbonada eliminada estar situada no resíduo 117 do aminoácido.

   18^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por a estrutura funcional hidrocarbonada eliminada estar situada nos resíduos 117, 184 e 448 dos aminoácidos.

   19^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a modificação consistir na substituição de oligossacarídeos de manose altos na posição dos aminoácidos

   184 e 448.

   20- Processo de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por a variante do activador de plasminogénio do tecido humano ser produzida por expressão numa cultura celular de DNA recombinante, de um DNA que codifica para a dita variante do activador de plasminogénio de tecido humano que contém um codão na posição 117 no lugar de um outro que codifica para o aminoácido aspargina ou um codão na posição 119 no lugar de outro que codifica para os aminoácidos serina e treonina.

   21^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por o codão na posição 117 codificar para a glutamina.

   22- Processo de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por o codão na posição 119 codificar para a meteonina.

   23^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por o codão na posição 117 codificar a glutamina e o codão na posição 275 codificar para o ácido glutâmico .

   24^à. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o hidrocarboneto ser modificado através do tratamento do activador de plasminogénio do tecido humano com um agente para alterar a estrutura hidrocarbonada.

   25^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 24, caracterizado por o agente ser um enzima.

   26-. - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por o enzima ser endo H.

   27^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 24, caracterizado por o agente ser o periodato.

   28^a. - Processo para produzir um activador de plasminogénio do tecido humano, caracterizado pela transformação de células hospedeiras de mamífero incapazes de formar glicoproteínas e possuidoras de complexos substituídos de hidrocarbonatos com DNA que codifica para o dito activador de plasminogénio, pela cultura das células transformadas e pela recolha da dita variante a partir da cultura das células.

   29^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 28, caracterizado por as células hospedeiras serem deficientes no enzima aminotransferase de N-acetilglucosamina.