KR920009521B1 - 신규 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
[발명의 명칭]
신규 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체
[도면의 간단한 설명]
제1도는 미처리(레인 1) 및 엔도 H 처리(레인 2) 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 코마시 염색 SDS-PAGE를 나타낸다. 고분자량 밴드는 1-사슬-t-PA이다. 다른 주 밴드들은 Ⅰ형 크링글(KI), Ⅱ형 크링글 및 프로테아제(P)이다.
제2도는 환원된 카르복시메틸화 t-PA에 대한 글리코시다제 절단을 나타낸다.
레인 1 : -N-글리카나제; 레인 2 : +N-글리카나제;
레인 3 : -N-엔도 H; 레인 4 : +엔도 H; 밴드 동정은 제1도에서와 같음.
제3도는 출발 플라스미드인 pUCPA ΔHD의 제한 지도를 나타낸다.
제4도는 대조 rt-PA(Δ) 및 과요오드산나트륨으로 변형시킨 rt-PA(○) 또는 엔도 H(●)의 혈장 농도의 시간에 따른 경로이다. 통계는 평균 ±표준 편차로써 나타냈다.
제5도는 대조 인체 t-PA(0) 및 글루타민 117 t-PF(■)에 대한 트리클로로아세트산(TCA) 침전되는 방사능 변화의 시간 경로를 나타낸다.
제6도는 대조 인체 t-PA(□) 및 글루타민 117 글루탐산 275 t-PA(○)에 대한 트리클로로아세트산(TCA) 침전되는 방사능 변화의 시간 경로를 나타낸다.
제7도는125I 표지(●) 및 비표지(○) 대조 rt-PA의 혈장 농도의 시간에 따른 경로를 나타낸다. 통계는 평균 ±표준편차로서 나타냈다.
제8도는125I 표지 고만노오스 rt-PA(Δ), 대조 rt-PA(
), 엔도 H처리 rt-PA(○) 및 과요오드산염처리 rt-PA(●)의 플라스마 농도의 시간에 따른 경로를 나타낸다. 통계는 평균 ±표준 편차로서 나타냈다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 영역]
본 발명은 탄수화물 구조 및 조성이 변형된 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 신규 변이체 및 이것들을 치료학상 유효량으로 생성시키는 방법에 관한 것이다.
[발명의 배경]
본 발명은 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 탄수화물 구조를 변경시킴으로서 순환으로부터 이 분자의 정화율이 조절될 수 있다는 발견으로부터 시작하였다.
조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA)는 피브린용해에 수반되는 세린 프로테아제이다. 피브린 응괴에 대한 t-PA의 결합은 피브리노겐 활성화의 증가를 유발한다[Hoylaerts, M. et al., J. Biol. Chem 257: 2912-2919(1982) Rijken, D. C., et al., J. Biol. Chem. 257: 2920-2925(1982)참조]. 인체 조직형 플라스미노겐 활성제는 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시킨다. 이렇게 생성된 플라스민은 혈액 응괴의 뼈대를 구성하는 피브린 기질들을 단백질 가수분해하여 절단한다. 인체 조직형 플라스미노겐 활성제는 혈액응괴의 용해를 매개하므로 결과적으로 여러가지 혈전붕괴 질병의 치료에 유용하다. t-PA는 보우스 멜라노마 세포주(Bowes melanoma cell line)[Rijken, D. C. et al., J. Biol. chem. 256: 7035-7041(1981); Wallen, P., et al., Eur. J. Biochem. 132: 681-686(1983)참조], 자궁조직[Rijken, D. C. et, al. Biochem. Biophys. Acta 580: 140-153(1979)] 및 혈관 관류액[(Binder, B. R., et al., J. Biol. Chem. 254: 1998-2003(1979)참조]과 같은 여러가지 원에서 분리해 왔지만 재조합 DNA 기술의 출현으로 심근 경색증, 말초 맥관 혈전증 및 폐동맥 색전증의 환자에 임상적으로 시도를 하기에 충분한 양으로 t-PA를 생성하게 되었다. 이러한 시도들은 재조합 t-PA(rt-PA)가 혈액 중의 피브리노겐 농도에 최소의 영향을 미치는 극히 유효한 혈전붕괴제임을 보여준다[(Williams, D.O., et al., Circulation 73: 338-346[(1986)]; Graor, R.A. et al., Circulation 74(suppl. 1) : 1-15-1-20[(1986)]; collen, D., et al., Circulation 73 : 511-517[(1986) : 참조)].
순환으로부터 rt-PA의 제거는 비교적 신속하다. 두 국면의 정화율에서 토끼에 있어서 약 2분 [(Korninger C., et al., Thromb. Haemos 46:658-661(1985); Nilsson, S., et al., Thromb. Res. 39-511-521; Bounameaux, H., et al., Blood 67:1493-1497(1986) 참조] 및 사람에 있어서 4분 [(Baughman, R.A., Tissue Plasminogen Activator in Thrombolytic Therapy(Sobel, et al., eds) 41-53 페이지, Marcel Dekker, NY(1987)참조] 내지 6분(Wallen, P. et. al., 상기함)의 반감기를 갖는 알파 국면이 두드러진다. 간은 t-PA 흡수 및 대사의 가장 중요한 부위이다. (Korninger, C., et al., 상기함; Nisson, S., et al., 상기함; Bounameaux, H., et al., 상기함). 간에 있어서 다수의 수용체 계가 당단백질의 과당류 부분 상의 특이 말단 잔기를 인식하는 것으로 기재되었다. 이 기작에 의해 정화된 단백질은 또한 몇 분의 주기의 반감기를 갖는다[(Ashwell, G, et all, Ann. Rev. Biochem. 51:53-554(1982)참조].
재조합 t-PA는 4개의 잠재적인 N-연관 글리코실화 부위를 갖는다. 고-만노오스 과당류는 117위치에 존재하고 448위치에는 복합 과당류가 존재한다. 184위치에서 복합 과당류는 Ⅰ형 rt-PA에는 존재하고 Ⅱ형 rt-PA에는 없다; Ⅱ형에 대한 Ⅰ형의 비율은 약 1:1이다. 218 잔기에서 네번째 잠재적인 글리코실화 부위는 글리코실화되어 있지 않다. rt-PA의 글리코실화 패턴은 멜라노마에서 유도한 t-PA의 패턴과 유사하다.
인체 조직형 플라스미노겐 활성제에 대한 약어 t-PA는 1982년 7월 27일 이탈리아의 베르가모에서 개최된 ＂International Committee on Thrombosis and Hemostatis＂의 28차 회의에서의 제안 후에 채택되었다. 본 명세서에 사용된, ＂인체 조직형 플라스미노겐 활성체＂, ＂t-PA＂, ＂인체 t-PA＂ 또는 ＂조직 플라스미노겐 활성제＂라는 용어는 예를 들면, 자연 원에서 추출 및 정제하여 생성한 인체 외래성(조직형) 플라스미노겐 활성제[본 명세서에서 참고 문헌으로 이용한 콜렌 등(collen et al,)의 유럽특허출원 제41766호(1980년 7월 11일 최초 출원을 기초로하여 1981년 12월 16일 공개됨) 및 리예켄 등(Rijken et al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035(1981) 참조] 및 예를 들면, 유럽특허 출원 공개 제93619호(1982년 5월 5일 최초 출원에 기초하여 1983년 11월 9일 공개됨)에 있어서 그의 아미노산 서열 및 물리적 및 생물학적 특성이 기재된 재조합 숙주 세포 배양계에 의해 생성된 플라스미노겐 활성제를 나타낸다.
미합중국 특허 제4,326,033호에는 그의 탄수화물 구조를 화학적으로 변형시킴으로서 유로키나제의 반감기를 연장시키는 것이 기재되어 있다. 유로키나제는 면역학적으로 인체 조직형 플라스미노겐 활성제와는 다르다. 미국 특허 제4,326,033호 또는 기타의 것에서 상기 유로키나제의 탄수화물 변형을 기타 당단백질에 적용할 가능성을 고려한 정당성은 없다. 실제로, 예를들면, 세룰로플라스민의 부터 시알산의 제거는 그의 반감기를 극적으로 줄이지만 또 다른 혈청 당단백질인 트랜스페린에 대한 동일한 처리는 반감기에 별다른 영향을 미치지 않는다[(Sharon, Complex Carbohydrates, Addison-Wesley 출판사, 194-196페이지(1975년) 참조]; 또한 Ashwell등의 Adv, Enzymology 41, 99(1974) 및 Alexander 등의 Science 226, 1328 (1984)참조 바람.
생쥐에 있어서 멜라노마 유도 t-PA의 제거는 페닐메틸술포닐 플루오리드로 활성 부위를 처리하거나 또는 디이소프로필플루오로포스페이트 트롬빈, 어시알루로소뮤코이드, 거대알부민 또는 과량의 비표지 t-PA의 동시주입에 의해서는 영향을 받지 않았다[Fuchs, H. E., et al., Blood 65 : 539-554(1985)참고]. 어시알루로소뮤코이드 및 거대알부민 처리하여 얻은 결과는 탄수화물 구조가 t-PA의 정화율에는 영향을 미치지 않음을 지적한다. 멜라노마 유도 t-PA의 정화율은 쥐에 있어서 단당류에 의해 영향을 받지 않는 것으로 알려졌다(Emeis, C.M., et al., Thromb. Haemos. 54 : 661-664(1985)참조]. 반대로 쥐 간의 세포 성분을 분리했을 때, 내피 세포는 고-만노오스 당단백질에 의해 억제될 수 있는 통로에 의해 멜라노마 t-PA를 흡수하는 것으로 보고되었다. 이 결과는 t-PA가 적어도 부분적으로는 만노오스 수용체에 의해 간에 흡수된다는 것을 의미한다(Einarsson, M., et al., Thromb. Haemos. 54 : 270(1985)참조]. 다른 시험관내 연구에 있어서, rt-PA는 쥐의 간 세포에 대한 높은 친화력으로 결합하는 것으로 나타났다. 수용체는 탄수화물-의존성인 것으로 나타나지 않았다(Bakhit, C., et al., J. Biol. Chem. 262 : 8716-8720(1987)참조].
1982년 10월 28일 최초 출원을 기초로 1984년 5월 10일 공개된 국제특허 출원 공개 제 WO84/01786호에는 변형시키지 않은 플리펩티드와 비교하여 감소된 생물 활성 및 증가된 반감기를 갖는 것으로 주장된 분자를 초래하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 분별하기 힘든 변형체가 기재되었다. 이 한 예는 본래(변형 시키지 않은) 활성의 약 70내지 90%를 갖는 것으로 보고된 생성물을 얻는, 부분적으로 정제한 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 과요오드산 나트륨으로 처리하는 방법을 포함한다. 제 WO84/01786호에 있어서 천연 물질 및 보다 중요하게는, 그들이 생성한 변형된 형태로 존재하는 탄수화물 구조의 성질 및 특징의 식별에 관해서는 지적한 바가 없다. 실제로 과요오드산염은 산화에 의하여 아미노산 결합의 동시적, 실질적인 결합을 제거함이 없이 모든 탄수화물 구조를 변형하거나 붕괴시키는 것으로 알려졌다.
또한 Wo 84/01786호에 있어서, 비변형 또는 변형된 의미에 대해 인체 조직형 플라스미노겐 활성제가 얼마나 많은 상기 구조를 갖는가 또는 실제 탄수화물 구성성분은 무엇인가 하는 지적은 없다. 따라서, 이것들의 과요오드산염 처리-분자는 특별한 부위에 촛점을 맞춤이 없이 무분별하게 모든 탄수화물 구조를 산화시킴으로서 가정 적절하게 변형되었다.
최근에 글리코실화 및 탈글리코실화된 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 생체내 정화율은 특별히 다르지 않음이 보고됨으로서 인체 조직형 플라스미노겐 활성제가 탄수화물의 부재에 의해 영향을 받지 않는다는 결론을 뒷받침한다. [Larsen et al., Proteases in Biological Control and Biotechnology, UCLA Symposium Park City, Utah, 1986년 2월 9일-14일; Little et al., Biochemisry 23, 6191(1984)참조].
본 발명의 목적은 t-PA의 탄수화물 구조를 변형시킴으로서 신규 t-PA 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 순환으로부터 다른 속도로 정화될 수 있는 t-PA 유도체를 제공하는 것이다. 본 발명의 더욱 다른 목적은 여러가지 임상 질병의 치료에 적합한 유효 혈전용해제를 제공하는 것이다.
[발명의 요약]
본 발명의 목적은 실질적으로 충분한 생물학적 활성을 지니고 생체내에서 반감기가 변경된, 즉, 순환으로부터 자연 생성 t-PA의 속도와의 다른 속도로 정화되고, 이들의 탄수화물 구조가 변형된 신규 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체에 의해서 이루어진다. 특히, 이 t-PA 변이체는 117, 184 또는 448 위치에서 이것의 탄수화물 구조가 변형되어 있다. t-PA의 탄수화물 구조의 변경이 순환으로부터 이것의 정화율을 변경시킬 수 있다는 것은 본 발명에 의해서야 이해되었다. 특히 본 발명에서는 탄수화물에서 t-PA의 한개이상의 글리코실화 부위의 제거는 t-PA 반감기를 연장시킨다는 것을 확립하였다. 특히, 또한 185 및 448 위치에서 고 만노오스 과당류를 갖는 t-PA 변이체 이외에 117 위치에 존재하는 것도 순환으로부터 보다 신속하게 정화될 수 있다는 것도 본 발명에 의해 처음으로 확립되었다.
따라서 본 발명은 117번 아미노산 잔기에서 기능적인 탄수화물 구조가 결핍되거나 그러지 않으면 184 및 (또는) 448 아미노산 잔기에서 기능적으로 변형되지 않은 탄수화물 구조를 갖는 것 및 117번 아미노산 잔기에서 완전한 탄수화물 구조를 갖는 ＂천연＂ 인체 조직형 플라스미노겐 활성제와 비교하여 실질적으로 충분한 생물 활성 및 증가된 생체내 반감기를 갖는 신규 인체 조직형 플라스미노겐 활성제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 117, 184 및 448 위체에서 기능적인 탄수화물 구조가 결핍되고, 상기 위치에서 완전한 탄수화물 구조를 갖는 ＂천연＂인체 조직형 플라스미노겐 활성제와 비교하여 실질적으로 충분한 생물학적 활성을 지니며 증가된 생체내 반감기를 갖는 신규 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 117번 위치에 존재하는 것 이외에 184번 및 448번 위치에 치환 고 만노오스 과당류를 가지고, (84번 및 448번 위치에서 비변형된 완전한 탄수화물 구조를 갖는 ＂천연＂인체 조직형 플라스미노겐 활성제와 비교하여) 실질적으로 충분한 생물 활성 및 감소된 반감기를 갖는 신규 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체에 관한 것이다.
본 발명은 더 나아가 전체 서열 중 한개 이상의 아미노산이 다르지만 특정 신규 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체와 동일한 탄수화물 형태를 갖는 생물 활성인 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 등가물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 신규 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체의 제조와 관련된 유용한 재조합 벡터, 배양체 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 영역 내에 속하는 상기 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체 중 하나는 아미노산 275 및 276 사이의 절단 부위가 단백질 가수분해 효소에 의해 인식되는 아미노산 서열을 제거함으로서 파괴된 소위 단일 사슬 변이체이다. 서열의 제거는, 예를 들면, 다음에 기재된 방법에 의해 기초가 되는 DNA 코돈을 부위-특이성돌연변이유발에 의하여 특정 아미노산을 변경시킴으로서 이루어진다.
[일반적 개요]
인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 아미노산 잔기 117에서 탄수화물 구조는 다음의 배치 형태를 가짐이 밝혀졌다.
반면에, 아미노산 잔기 184 및 448에서 구조는 다음의 배치 형태를 갖는다.
약어 : Man-만노오스; Gal-갈락토스; Fuc-푸코오스, GlcNAc-N-아세틸글루코자민; Sia-시알산; R-H 또는 Sia2…＞3 Gal…＞4 GlcNAc.
상기 구조가 인체 조직형 플라스미노겐 활성제에서 발견되는 N-연관 과당류 유형의 대표적인 것이지만 본 별명은 이들 구조에 한정하지 않음은 주목해야 할 것이다. 각각의 글리코실화 부위는 몇개의 밀접하게 관계된 동일하지 않은 구조를 가지고 있을 수도 있다. 이것은 미불균일성(microhetrogenity)으로 알려져있으며 당 단백질 글리칸의 일반적인 특징이다[J. Biol. Chem. 260, 4046(1985) 참조]. 예를 들면, 고-만노오스 과당류는 단위당 존재하는 만노오스의 수에 있어서 다양할 수 있다. 복합 과당류에 있어서, 미불균일성은 살린산, 푸코오스, 갈락토오스 및 N-아세틸글루코자민의 잔기의 수에 있어서 뿐만아니라 분지쇄화 정도에 있어서 차이가 있을 수 있다. 상기 미불균일성은 본 발명은 영역 내에 있는 것으로 의도하였다.
아미노산 117에서 고-만노오스 함유 구조는 아미노산 잔기 184 및 448에서의 보다 복잡한 구조와는 구조에 있어서 뿐만아니라, 184 및 448에서 구조의 관능기의 부수적인 변형이 없이 그의 완전한 관능기의 제거시 증가된 생체내 반감기를 갖는 생물학적으로 충분히 활성인 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 생성하는 점에 있어서 유일한 것으로 입증되었다.
아미노산 잔기 117에서 관능성 탄수화물 구조의 제거란 다음에 기재하는 바와 같은 부위-특이성 돌연변이유발에 의해 글리코실화 신호가 파괴된 것과 같은 완전한 제거 또는 Asn 117에 연결된 온전한 N-아세틸글로코자민 잔기를 남기는 엔도글리코시다제로 처리한 바와 같은 실질적인 제거 또는 예를 들면, 근접한 히드록실기를 산화시키는 과요오드산 나트륨의 처리에 의한 117, 184 및 448 위치에서의 실질적인 제거를 의미한다. 아미노산 잔기 117, 184 및 (또는) 448에서 기능적으로 변형되지 않은 탄수화물 구조는 이들이 기능적으로 천연 단백질과 동등한 완전한 구조 또는 실질적으로 이들 모든 구조를 보유하는 것을 의미한다. I형 재조합 t-PA에 있어서 아미노산 184 및 448에서 탄수화물 구조의 변형은 고-만노오스 과당류를 복합 과당류로 전환시키는 효소인 N-아세틸글로코자민 전이효소가 결핍된 숙주 세포 중에서 재조합 조직형 플라스미노겐 활성제의 생성에 의해 고-만노오스 과당류를 복합 과당류로 치환시킨 것을 의미한다. 이 고 만노오스 t-PA변이체는 감소된 생체내 반감기를 갖는 실질적으로 충분히 생물 활성인 인체 조직형 플라스미노겐 활성체 변이제를 생성하였다.
바람직한 실시태양에 있어서, 아미노산 잔기 117에서 관능성 탄수화물 구조의 제거는 글리코실화 신호 Asn-X-Ser/Thr(여기에서 X는 어떠한 아미노산일 수 있음)로 된 기초 DNA의 부위-특이성 돌연변이 유발에 의해 일어난다. 조직형 플라스미노겐 활성제의 경우에 있어서, 이 신호를 나타내는 서열은 Asn 117(Ser 118) Ser 119를 나타낸다. 따라서 아미노산 잔기 117에 있어서 기능적인 탄수화물 구조의 제거는, 예컨대, 이들 아미노산 잔기에 해당하는 코돈의 돌연변이화에 의한, 신호의 가능성을 파괴하는 것을 초래한다. 특히, 돌연변이유발은 신호의 대표적인 코돈에서 일어나서 예를 들면, 117위치에서 아스파라긴 이외의 및 (또는) 119위치에서 레닌(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 또는 118위치에서 프롤린(pro) 이외의 아미노산 잔기를 갖는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제가 생성된다.
가장 바람직한 실시태양에 있어서, 아스파라긴 117은 이들의 밀접한 구조적 유사성의 견지에서 글루타민으로 대체하거나 세린 119는 제2 크링글 영역에서 유사 서열의 견지에서 메티오닌으로 대체시켰다.
돌연변이유발은 그 자체로 공지된 방법, 예컨대, 졸러 등 (Zoller et al., Methods in Enzymology 100, 468(1983)에 의해 재검토된 방법에 의해 행할 수 있다. 그 일례로, 117번 위치에서 아스파라긴을 암호화하는 코돈 AAC를 두 뉴클레오티드의 변경에 필요한 CAA 또는 CAG로 변화시킴으로서, 발현 산물은 117번 위치에서 글루타민을 포함할 것이다. 본 발명에서 고려된 다른 돌연변이도 유전 암호 분석에 의거하였다.
아미노산 잔기 117에서 관능성 탄수화물 제거에 대한 별법은 아미노산 잔기 184 및 448에서 복합 구조에 기능적으로 영향을 끼치지 않고 아미노산 잔기 117(Asn)에서 고-만노오스 탄수화물 구조를 실질적으로 제거하는 엔도글리코시다제 H와 같은 엔도글리코시다제의 사용을 수반한다. 또, 이러한 처리는 그 자체로 공지된 기술, 예컨대, 타렌티노 등(Tarentino et al., J. Biol. Chem. 9, 811(1974) 및 트림블 등(Trimble et al., Anal, Biochem. 141, 515(1984)의 방법에 의하여 행한다.
아미노산 잔기 117, 184 및 448에서 관능성 탄수화물을 제거하는 또 다른 방법은, 그 자체로 공지된 방법에 의해 수행되는, 근접한 히드록실기를 함유한 탄수화물 잔기를 산화시키는 과요오드산 나트륨처리에 의한 방법이다. 117, 184 및 448의 모든 세 부위에서 과당류는 과요오드산염 산화에 민감한 잔기들을 함유한다.
I형 재조합 t-PA의 184 및 448 위치의 복합 과당류를 고-만노오스 과당류로 변화시킴으로서 탄수화물 구조를 변형시키는 또 다른 방법은, 예컨데, 복합형 N-결합 과당류[Gottlieb, C. et al. J. Biol. Chem. 250:3303-3309(1975)참조]의 합성에 필요한 효소가 결핍된 숙주 세포를 t-PA를 암호하는 발현 벡터로 형질감염시키는 것과 같은 재조합 기술이다.
다음의 실시예는 다만 본 발명을 실시하기 위한 최선의 방법을 설명하는 것이나 본 발명을 한정하는 것으로 간주되어서는 아니될 것이다. 본 명세서의 모든 문헌 인용은 참고 문헌으로 병합시켰다.
[실시예 1]
117 위치에서 고-만노오스 과당류가 결핍된 t-PA탄수화물 변이체 Gln 117
부위 특이성 돌연변이유발은 117위치에 아스파라긴 이외의 아미노산 잔기 글루타민을 갖는 조직형 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 다음과 같이 구성하는데 사용하였다.
A. 과당류 설계
5'-TGC-ACC-AAC-TGG-C*A*A*-AGC-AGC-GCG-3' (24량체 Q117)의 서열을 갖는 24량체 올리고뉴클레오티드를 크레아 등[Crea et al., Nucleic Acids Research 8, 2331(1981)]의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성하였다. 별표는 돌연변이(asn에서 gln으로)코돈을 나타낸다.
B. 재조합 M13 주형의 조립
플라스미드 pUCPA ΔHD(제3도)는 플라스미드 pETPFR로 명명한 플라스미드(상기 유럽 특허 제93619호에 pPADHFR-6으로 달리 기재됨)을 다음과 같이 변형시킨 유도체이다; 1) 5'-비번역 DNA의 166 b.p를 엑소뉴클레아제 Bal 31을 사용하여 t-PA 유전자의 5' 말단으로부터 제거하였다; 2) Hind Ⅲ 부위를 t-PA 유전자의 새로운 5' 말단에 첨가하였다; 3) EcoR1, SacⅠ, SmaⅠ, BamHⅠ, XbaⅠ, SalⅠ 및 PvuⅡ에 대한 인식 부위를 함유한 폴리링커를 t-PA 발현을 유도하는 SV40의 초기 프로모터의 5' 말단에 첨가하였다; 4) pETPER의 3539 위치에서 Hind Ⅲ 부위는 클레나우 필-인 반응(Klnow fill-in reaction)에 의해 파괴시켰다.
플라스미드 pUCPA ΔHD(제3도)를 Smal으로 절단한 후, 제507번 코돈을 통한 t-PA 유전자를 함유한 약 2.0kb를 단편을 PAGE 및 겔로부터 이 단편의 전기용출에 의해서 분리하였다. M13mp10(Messing, Methods in Enzymology 101, 20(1983)] 벡터 역시 SamⅠ으로 절단하고 페놀, 크로로포름으로 1회 추출하고 에탄올 침전시킨 후, 50mM 트리스 pH 8.0, 1mM EDTA(TE)중에 현탁시켰다. pUCPAΔHD의 약 2.0kb 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 SmaⅠ 절단 M13mp10에 결합시키고, 이 결과의 DNA를 대장균 JM101을 형질전환시키는데 사용하였다. 결과의 파지를 분리하고 삽입체의 존재를 확인한 후 이것의 방향은 파지 소규모-준비물의 제한 분석에 의하여 결정하였다. 한 재조합 파지인 M13/t-PA-SMA를 다음의 돌연변이유발을 위한 주형으로서 선택하였다.
C. 돌연변이유발 반응
돌연변이유발 프라이머(24량체 Q117)를 단일 가닥 M13/t-PA-SMA DNA에 연결시키고, dNTPs 및 T4 DNA리가아제의 존재 하에서 E. coli DNA 폴리머라제 클레나우 단편으로 처리하여 아델만 등(Adelman et al., DNA 2, 183(1983)]이 기재한 바와 마찬가지로 시험관 내에서 이형복합체 RF 분자를 생성하였다. 이러한 분자들은 E. coli 균주 JM101을 형질전환 시키는데 사용하고 목적하는 돌연변이를 가진 파지는 프로브로서 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 프라그 혼성화(plague Hybridization)에 의해 탐지하였다. [Adelman et al., DNA 2, 183(1983)참조]. 한 돌연변이 파지를 분리하여 M13/t-PA-SMA GLN 117로 명명하였다.
D. GLN 117 t-PA 돌연변이체의 발현 벡터 pUCPAΔHD로의 서브클로닝
파지 M13/t-PA-SMA- GLN 117의 이중 가닥 DNA를 SamⅠ, Bal11 및 ApaⅠ으로 절단하여 약 1.4kb 단편을 PAGE에 의해 정제하였다. 이어서 이 단편을 pUCPA ΔHD 중의 대응 단편으로 대체하는데 사용하였다.
t-PA 유전자 단편을 포함한 제조합 플라스미드를 동정하였다. 플라스미드 M119 및 Q117을 DHFR 결핍 CHO 세포 [Urlab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 4216(1980)]에 다음과 같이 도입시키고 증폭시켰다; 1)플라스미드 DNA를 그라함 등[Graham et al., J. Virol. 52, 455(1973)]의 인산 칼슘 침전법에 의해 세포에 도입시켰다; 2) 선별 배지[하이포크산틴, 글리신, 및 티미딘(-HGT)이 없는 배지임]에서 생성된 콜로니를 그라넬리아 등(Granellia et al., J. Exp. Med. 148, 223(1978)이 기재한 바와 같이 피브린 및 플라스미노겐을 함유한 아가 플레이트 중에서 피브린이 분해에 의해 평가되는 바와 같이 플라스민 형성을 탐지함으로서 간접적으로 t-PA 발현에 대해 분석하였다; 3) 5개의 가장 강한 양성 클론을 효소 면역분석법(이후 ELISA 법이라 함)을 사용하여 세포 당 분비된 t-PA의 양을 정량 분석하였다; 4) 고 농도의 t-PA를 분비하는 클론을 다음과 같이 메토트렉세이트(MTX)에 위치시켰다. 즉 2×105세포들을 50, 100또는 250nM MTX를 함유한 100mm 플레이트에 위치시켰다 : 5) MTX에서 형성된 다섯 클론을 추출하고 상기 3단계에서와 같이 ELISA에 의해 정량 분석하였다 : 6) 고 농도의 t-PA를 분비하는 클론을 상기 4) 단계에서와 같이 보다 고농도의 MTX내에 위치시키고, 이어서 생성된 다섯 클론을 정량적으로 분석하고 가장 높은 t-PA생성체를 선별하였다.
상기 증폭 및 선별 절차는 결과의 세포로부터 t-PA 생성에 있어서 더 이상의 증가가 없을 때까지 반복한 후 해당 t-PA를 사용하기 위하여 분리하였다.
[실시예 2]
117 위치에서 고-만노오스 과당류가 결핍된 t-PA 탄수화물 변이체 Met 119
117 위치에서 N-연관 글리코실화는 Asn-X-Ser/Thr 서열이 형성되는 것을 필요로 한다. 119 위치에서의 치환 또는 결실에 의한 돌연변이 유발은 또한 117위치에서 글리코실화를 방지할 것이다. 5'-CC-ACC-TGG-AAC, AGC-A*T*G*-GCG-TTG-G-3'(24량체 m119) 서열을 갖는 24량체를 사용하여 해당하는 Met119를 만드는데 실시예 1에 기재한 바와 동일한 방법을 사용하여 pUCPAΔHD119를 얻었다. 발현에 의한 대응 M119 돌연변이체의 생성은 상기 실시예 1에서 기재한 바와 같다.
[실시예 3]
t-PA 탄수화물 변이체 Gln117Glu275등가물
글루타민117글루탐산275t-PA 돌연변이체는 다음에 기재하는 바와 같이 제조하였다.
상기한 바와 같이 제조한 플라스미드 pUCPAΔHD를 BglⅡ 및 ScaⅠ으로 절단하고, 조직형 플라스미노겐 활성화제 DNA 서열의 1 내지 254 코돈에 해당하는 약 763bp 단편을 그 자체로 공지된 방법으로 SDS-PAGE에 의해 정제하였다.
인체 t-PA DNA를 플라스미드 pPADHER-6(또한 pETPER로 명명함) 및 pA25E10으로부터 얻었다.
이두 t-PA 플라스미드의 제조는 상기 언급하고 본 명세서에 참고문헌으로 첨부한 유럽 특허 출원 공개 제093,619호에 기재되어 있다.
플라스미드 pA25E10은 t-PA 유전자의 마지막 508 아미노산을 암호화하는 서열 및 3' 비번역 부위의 772 염기쌍을 포함한다. 이 플라스미드를 SacⅠ 및 BglⅡ로 절단하여 염기 단편을 생성하고 이것을 앞서 기재한 바와 같은 표준 방법에 의하여 분리하였다. 이 단편은 t-PA 아미노산 411 내지 527에 대한 코돈을 포함하고 3' 비번역 부위의 일부를 포함한다.
플라스미드 pPADHFR-6은 t-PA에 대한 전체의 구조 유전자 및 3' 비번역 부위의 일부를 포함한다. 이 플라스미드를 SacⅠ 및 BglⅡ로 절단하여 1,230bp 단편을 생성시켜 이것을 분리하였다. 이 단편은 성숙형의 t-PA의 처음 410 아미노산을 암호화하는 코돈을 함유한다.
이들 플라스미드를 표준 방법을 사용하여 함께 연결시킨 후 BglⅡ로 절단하였다. 전체의 성숙 t-PA 서열에 대한 코돈 및 3' 비번역 영역의 일부를 함유하는 1,974bp 단편을 분리하였다. 이중 가닥 M13MP8[Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Editor A. Walter, Elsevier, Amsterdam(1981년), 143]을 BamHⅠ으로 절단한 후 BglⅡ 절단시킨 t-PA에 연결시켜 M13mp8PABglⅢ를 형성시켰다. E. coli Jm101 세포(ATCC 제 33876호)를 이중 가닥 복제형의 M13mp8PABglⅡ으로 형질전환 시켰다. 단일 가닥 및 이중 가닥(RF) 형태의 M13mp8PABgLⅢ는 이 파지로 감염시킨 E. coli Jm101 세포로부터 분리해도 좋다. 이 단일 가닥 형태는 t-PA의 부위 특이성 돌연변이 유발에 사용하였다.
인체 t-PA 구조 유전자는 여러 위치에 아미노산 치환체를 갖는 t-PA를 발현하도록 부위 특이성 돌연변이 유발에 의하여 변형시켰다. 합성 올리고뉴클레오티드를 크레아 등[Grea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 페이지(1978년)]의 고상 포스포트리에스테르 방법에 의한 바와 같이 제조하고 다음의 부위특이성 돌연변이 유발에 사용하였다.
본 명세의 참고문헌으로 인용한 아델만 등[Adelman et al., DNA 2, 183(1983)년]의 일반적인 방법을 합성 프라이머의 돌연변이된 서열을 함유한 t-PA 클론을 생성하는데 사용하였다. 돌연변이 t-PA 클론 M13RF2C9는 앞서 나타낸 단일 아미노산에 대한 돌연변이를 포함한 프라이머를 사용함으로써 발생시켰다.
플라스미드 pPADHFR-6(또한 pETPFR로 명명함-상기 유럽 특허 출원 공개 제93619호 참조)에 있어서, 천연 t-PA 구조 유전자의 발현은 SV 40 T-항원의 초기 프로모터의 조절 하에 있다. 이 프로모터는 또한 DHFR 유전자의 발현을 조절한다. 벡터 단편 1은 pPADHFR-6를 BglⅡ 및 BstEⅡ로 절단시킴으로써 얻은 큰 단편을 분리하여 얻었다. 다른 단편 2는 pPADHFR-6를 BglⅡ 및 BstXI으로 절단하여 얻은 400 bpt-PA 단편을 분리함으로써 얻었다. 목적하는 돌연변이부를 함유하는 1,141 bp t-PA 단편 3은 돌연변이 t-PA 클론 M13RF2C9로부터의 RF DNA를 stXI 및 BstEⅡ로 절단시킴으로써 얻었다. 단편 1 및 2를 단편3과 연결시켰다. DNA 혼합물은 E coli를 형질전환시키는데 사용하여 진핵성 발현 벡터 pPADHFR-6 2C9를 얻었다.
상기 및 1986년 10월 29일 공개된 유럽특허 출원 공개 제199,574호에서와 같이 제조한 플라스미드 pPADHFR-6 2C9는 글루탐산 275 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 함유한다. 이것을 Scal 및 ApaⅠ으로 절단하고 조직형 플라스미노겐 활성화제 DNA 서열의 코돈 254 내지 466에 해당하는 약 630 bp 단편을 그 자체로 공지된 방식으로 SDS-PAGE에 의해 정제하였다.
두 BglⅡ-ScaⅠ(pUCPAΔHD) 및 Scal-ApaⅠ(pPADHFR-6 2C9) 단편을 절단한 pUCPAΔHD로부터의 큰 BglⅡ(bp 531)-ApaⅠ(1926 bp) 단편에 연결시키고 글루타민 117 글루탐산 275 t-PA 돌연변이 DNA를 지닌 결과적인 플라스미드를 통상적인 방법으로 소규모 선별하였다. 이 결과의 플라스미드를 상기한 바와 같이 DHFR 결핍 CHO 세포에 도입 및 증폭시키고 해당하는 변이체 t-PA를 사용하기 위하여 분리하였다.
[실시예 4]
t-PA 탄수화물 구조의 특성화
t-PA의 아미노산 서열은 4개의 잠재적인 N-결합 글리코실화 부위를 함유한다[Asn-X-Ser/Thr:Ann. Rev. Biochem. 41, 673페이지(1972)년]. 이것들은 아스파라긴 잔기 117, 184, 218 및 448이다 [Nature 301, 214페이지(1983년)]. 그러나 218 위치는 t-PA에서는 글리코실화되지 않는 것으로 밝혀졌다. 184 위치는 Ⅰ형에서는 글리코실화 되어 있으나 ⅠⅠ형 t-PA에서는 그렇지 않다[Biochemistry, 23, 3701페이지(1984)].
프로나제-절단 rt-PA의 겔 여과 크로마토그라피는 두 종류의 N-결합 과당류를 용해하였다.(다음 표 1 참조). 더 높은 분자량 물질의 조성은 푸코실화된 복합형 과당류의 일치하였다. 더 낮은 분자량 물질은 소량의 고 만노오스 과당류(Man6GlcNAc2으로 추정됨)에 대한 예측한 조성물을 가졌다.
고-만노오스 과당류의 부착 위치는 다른 특이성을 갖는 배당체 효소를 사용함으로서 결정하였다. 사용한 효소는 고-만노오스 과당류를 제거하지만 복합형 과당류에는 영향을 미치지 않는 엔도-β-N-아세틸글루코자미니다제 H[엔도 H: 겐자임사(Genzyme, Inc)로부터 입수] 및 고-만노오스 및 복합형 과당류를 제거하는 펩티도-N-글리코시다제 F(N-글리카나제: 겐자임사 제품)이었다. 이들 시험에 사용한 t-PA는 두-사슬 형태를 플라스민으로 전환시켰고 이어서 환원 후 카르복시메틸화시켰다.
SDS-PAGE는 환원 카르복시메틸화된 두-사슬 rt-PA를 Ⅰ형 크링글(117 및 184에서 글리코실화), Ⅱ형 크링글(117에서 글리코실화) 및 프로테아제(448에서 글리코실화)로 용해시켰다. t-PA의 N-글리카나제 절단은 크링글 밴드가 Ⅱ형 크링글 보다 약간 더 큰 이동성의 위치에서 합치는 것을 유발하고, 또한 프로테아제의 증가된 이동성을 유발시켰다(제2도의 레인2). t-PA의 엔도 H절단은 각 크링글의 전기영동적 이동성을 증가시키나 프로테아제 밴드의 이동성에는 영향을 미치지 않았다(제2도의 4레인). 엔도 H결과는 각각 Ⅰ형 및 Ⅱ형 크링글이 고 만노오스 과당류를 함유함을 의미한다: 이것은 두 Ⅰ형 및 Ⅱ형 크링글 모두에서 클리코실화되는 유일한 위치인 117번 잔기에 위치해야 한다. 엔도 H 처리는 Ⅰ형 크링글을 Ⅱ형으로 전환시키지 않는다; 따라서, Ⅰ형 크링글에서 글리코실화되어 있으나 ⅠⅠ형 크링글에서는 되어 있지 않은 184번 잔기는 복합 과당류를 함유한다. 448 위치는 마찬가지로 N-글리카나제를 처리할 경우 rt-PA의 프로테아제 위치의 유동성은 증가시키나 엔도 H에는 영향을 미치지 않기 때문에 복합 구조를 함유한다.
[표 1]
프로나제-절단 t-PA로부터 과당류 분획의 탄수화물 조성
약어 Fuc=푸코오스, Man=만노오스, Gal=갈락토오스
GlcNAc=N-아세틸글루코자민, Sia=시알산
b 디오바르비투르산 분석
c 3 만노오스로 정상화시킴
d 2 GlcNAc로 정상화시킴
[실시예 5]
엔도 H처리 t-PA
엔도-β-N-아세틸글루코자미니다제 H(엔도 H)를 겐자임 인코포레이티드로부터 구매하였다. 엔도 H는 고-만노오스형의 N-연관 과당류를 제거하지만 복합 과당류에는 영향을 미치지 않았다. SDS-PAGE는 램믈리(Laemmli, Nature 227, 680(1970)에 의해 기재된 방법으로 행하였다. 상기 EPA 93619에 기재한 바와 같이 제조한 (0.01% 트윈 80을 함유한 0.2M 아르기닌 포스페이트, pH6로된 제형완충액 0.2ml 중의)인체 조직형 플라스미노겐 활성제 0.8mg을 엔도 H(25mM 인산 나트륨(pH 6), 0.05ml 중의 0.1 단위) 소듐 이자이드(0.02%)와 함께 혼합하였다. 이 시료를 20시간 동안 37℃에서 배양시켰다. 엔도 H 용액 25mM 인산 나트륨 완충액 0.05ml을 대체한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 대조 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 시료를 제조하여 배양하였다. 배양 후, 시료들을 제형완충액으로 전체 용적 0.75ml까지 희석하고 동일한 제형 완충액으로 광범위하게 투석하였다. 시료들은 0.4μHV여과기[(아미콘(Amicon)사 제품)]로 여과시킨 후 4˚에서 저장하였다.
탈클리코실화는 환원 및 카르복시메틸화 후 SDS-PAGE에 의하여 검사하였다. 이와 같이 제조한 인체조직형 플라스미노겐 활성제의 정제수(제형 완충액 0.01ml 중의 0.05mg)를 25mM 인산나트륨 pH6 0.015ml 및 20mM 디티오트레이톨 0.025ml을 함유하는 2X 램믈리 시료 완충액과 혼합시켰다. 시료들은 5분 동안 95℃에서 가열하고 냉각 시켰다. 1N NH4OH 중의 0.67M 요오드 아세트산 용액 0.015ml을 첨가 하고 시료를 암실에서 3시간 동안 실온에서 배양시켰다. 환원된 카르복시메틸화 시료들은 SDS-PAGE로 분석하였다.
이 분석에 있어서, 미처리 대조 2-사슬 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 Ⅰ형 크링글(117 및 184 위치에서 글리코실화), Ⅱ형 크링글(117 위치에서 글리코실화) 및 프로테아제(제1도의 레인 1)에 해당하는 세주요 밴드에 용해시켰다. 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 엔도 H 절단은 각 크링글 밴드의 전기 영동적 이동성을 증가시켰으나 프로테아제 밴드(제1도의 레인 2)의 이동성에는 영향을 미치지 않았다. 엔도-H처리 t-pA의 중성 아미노당 조성은 표 2에 나타냈다. 엔도 H처리 결과는 만노오스 함량을 몰 당 5.6잔기로 N-아세틸글루코자민 함량을 몰 당 0.9잔기로 감소시켰다. 이 결과는 117 위치로부터 고-만노오스 과당류의 화학 얄온적 제거와 일치한다.
엔도 H-처리 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 피브린용해 활성은 콜렌 등[collen et al., J. Clin. Path. 21, 705페이지(1968년)]의 시험관 내 응괴 용해 분석법(Clot lysis assay)에 의해 분석하였다. 엔도 H-처리 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 활성은 이 분석에 있어서 미처리 대조군의 활성과 구별할 수 없었다.
인체 조직 플라스미노겐 시료들을 약 2μCil.μg의 특이 활성까지 요오도비드 방법[Markwell, Anal, Biochem. 125, 427(1982)]에 의하여 요오드화시켰다. 아르기닌 0.2M 및 시트르산염 0.1M(pH 6.0) 및 트윈 80, 0.01%는 항시 사용한 완충액이었다. 모든 시료를 요오드화에 앞서 이 완충액에 투석시켰다. pH는 요오드화에 앞서 트리스 염기로 8.2까지 조정하였다. 요오드화 혼합물은 pH 6.0 완충액으로 평형시킨 PD-10칼럼(파마시아사 제품)을 통하여 통과시키고, 공간 용적으로부터 방사성 분획을 모아서 SDS-PAGE에 의해 이동시킨 후 건조 겔을 자동방사선 사진화하였다. 표지시킨 인체 조직형 플라스미노겐의 자동방사선 사진은 95%이상의 방사능이 인체 조직형 플라스미노겐 활성제내에 병합되었음을 나타냈다.
각각의 표지된 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 1:200(표지:비표지, W/W)의 비율로 비표지 물질과 혼합하여 귀에 동맥의 도뇨관을 가진 토끼에 거환약으로 정맥내 주사하였다. 각각의 토끼는 1mg/kg의 비표지 및 10μCi/kg의 표지 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 수용하였다. 치료 농도를 얻고, 정화 경로에 있어서 농도 의존성으로부터 생길 수 있는 약리역학의 변형을 피하기 위해 미량의 표지 인체 조직형 플라스미노겐 활성제에 대한 담체로서 비표지 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 사용하였다. 연속적인 동맥혈 시료를 26분 기간에 걸쳐 수집하고 D-phe-pro-arg-클로로메틸케텐(PPACK) 및 EDTA를 동결조건시킨 혼합물을 각각 1μM 및 4.8mM의 최종 농도로 튜브 내에 곧바로 위치시켰다. 튜브를 얼음 위에 놓고 혈장을 분리하였다. 침전가능한 트리클로로아세트산(온전한 인체 조직형 플라스미노겐 활성제) 및 전체 방사능을 각 혈장 시료 중에서 측정하였다. 면역반응성 인체 조직형 플라스미노겐 활성제는 또한 다클론 항체를 이용한 샌드위치 ELISA 방법에 의해 측정한 결과 적어도 30ng/ml의 유효 감수성을 가졌다.
혈장 농도 시간 경로 통계는 잉여의 방법(resideul metod)[Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics. 2nd ed., New York, Marcel Dekker Inc., PP 433-444페이지(1982년)]을 이용하는 상호작용 곡선 스트리핑방법(stripping procedure)을 사용한 거환약 주입에 대한 두분획 모델에 적합하였다. 다음의 지수 방정식을 사용하였다: cp=Ae-αt+ Be-αt(여기에서, Cp는 불특정 시간에 있어서 혈장 중의 rt-PA의 농도이고, t 및 A와 B는 각각 α 및 β의 기울기를 갖는 빠르고 느린 정화 국면의 y절편이다. α 및 β 국면에 대한 t1/2은 In2/경사의 비율로써 계산하였다. 곡선 스트리핑 방법으로부터 얻은 결과는 PC NONLIN을 사용한 2지수모델에 대한 통계에 맞도록 처음의 근사값으로서 사용하였다. 한 통계 세트(제4도)는 PC NONLIN을 사용하여 맞지 않으므로 곡선 스트리핑 방법의 통계를 사용하였다. 시간 0에서 혈장 농도 Co는 A 및 B의 합이다. Vo는 Co에 의해 나뉘어진 복용량으로 계산하였다. 곡선하의 구역(AUC)은 식 AUC=A/α+B/β에 의하여 결정하였다. 모든 경우에 있어서 외삽법으로 추정한 구역은 전체 AUC의 20% 이하였다. 이어서
의 식을 사용하여 정화도를 계산하는데 사용하였다. α 및 β 국면의 상대적 공헌도는 다음의 식으로부터 계산하였다.
표 2로부터 통계는 중앙 구획(K10)으로부터 직접 제거 및 주변 구획(K12및 K21)으로 평행시킨 모델에 적합하였다.
토끼에 있어서 생체내 정화도 연구로부터 두 형태의 통계가 나왔다. 하나는 비표지 물질의 정화도의 척도인 면역 반응성 인체 조직형 플라스미노겐 활성제로부터의 것이고 두 번째 형태의 통게는 95% 이상의 온전한 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 나타내는 TCA 침전되는 방사능이다. 면역 반응성 및 TCA 침전되는 횟수로부터의 혈장 농도 대 시간의 곡선은 적합한 다지수의 모델에 적합하였으며 유도한 약물동역학 변수를 비교하였다.
[실시예 6]
과요오드산염 처리 rt-PA
0.2M 인산 아르기닌 완충액, pH 6.0 중의 재조합 t-PA 1mg/ml 얼음 욕조 중에 냉각시켰다. 과요오드산 나트륨을 10mM의 농도까지 첨가하고, 이 혼합물을 암실에서 1시간 동안 4℃에 유지시켰다. 글리세롤 100mM 및 에탄올아민 50mM을 첨가하여 반응을 중시키셨다. 이어서, 시료를 pH6 인산 아르기닌 완충액에 대하여 완전히 투석시키고 0.22μ 필터(밀리포어)를 통하여 여과시킨 후 4℃에 저장하였다. 과요오드산 나트륨은 근접한 히드록실기를 함유한 탄수화물 잔기의 산화를 유발하였다. rt-PA의 모든 세 글리코실화 부위에서 N-연관 과당류는 과요오드산염 산화에 감성인 잔기들을 포함한다. rt-PA 및 과요오드산엄-처리 rt-PA의 중성 아미노 당조성물은 표 2에 나타내었다. 예견한 바와 같이, 푸코오스는 과요오드산염의 작용에 의해 완전히 파괴되었다. 만노오스 함량의 저하는 117 위치에서 고-만노오스 과당류의 말단 잔기 및 184 및 448 위치에서 복합 과당류의 2-연관 잔기의 파괴와 일치하였다. 갈락토스 농도에 있어서 약간의 감소가 관찰 되었으며 말단 갈락토오스 부분(즉 시알산으로 치환되지 않은 것)의 산화의 결과인 것으로 보인다.
환원 및 카르복시메틸화되지 않은 아미노산에 대한 분석 결과 시스테인 잔기가 과요오드산염 처리에 의해 시스테인 산으로 산화되지 않음이 입증되었다. 환원 및 카르복시메틸화 후, rt-PA nM당 카르복시메틸 시스테인의 34.2nM(추정한 수는 35임)이 과요오드산염-처리 시료에서 회수되었다. 과요오드산염 처리 rt-PA중의 메티오닌의 회수는 5.0nM 중의 0.9nM 몰 뿐이었다 : 미처리 rt-PA는 2.5nM의 값이었다. 그러나 환원 및 카르복시메틸화에 있어서, 메티오닌 회수는 과요오드산엄 처리 및 미처리 물질에 대해 각각 3.3 및 2.8nM 이었다. 이러한 결과는 처리한 시료 중의 메티오닌 슬폭시드의 존재를 암시한다. 과요오드산염-처리 및 비처리 rt-PA사이의 다른 아미노산의 회수에 있어서는 별차이가 없었다.(통계는 나타내지 않음). 과요오드산염 처리는 rt-PA의 활성을 의미있게 변화시키지 않았다. 과요오드산염-처리 rt-PA의 특이활성은 시험관내 응괴 용해 분석[Collen, D. et. al., J. Clin. Path. 21: 705-707(1986)]에 의해 측정한 바와 같이 대조군 rt-PA의 91%이었다.
[실시예 7]
고-만노오스 t-PA 변이체
차이니스 햄스터 난소 클론 15B 세포[Gottleib, C. et al., J. Biol, Chem. 250:3303-3309(1975)]를 조직 플라스미노겐 활성제를 암호화하는 플라스미드 및 유럽 특허 출원 공개 제093619호에 기재된 디하이드 로폴레이트 리덕타제 pETPFR 및 네오마이신 내성을 운반하는 단백질을 발현하는 pSVENEOBal6(유럽 특허 공개 제160457호에 기재됨)에 동시형질감염시켰다. 클론 15B는 N-아세틸글루코자민 전이효소 I(Gottleib, C. et al., 상기함)가 결핍된 CHO 세포 변이체이다. ChO 15H 세포내로의 동시형질감염은 그라함 및 반 데르엡[Graham, F, 및 Van Der Eb, A. Virology 52: 456-467(1973)의 인삼 칼슘 동시침전법을 번형시켜 행하였다. 플라스미드 DNA(2.5μg)는 인산칼슘 동시침전시킨후 3시간 동안 106세포를 도입시켰다. 계속해서 세포들을 60초 동안 20% 글리세롤로 처리하고 비-선별배지를 공급하였다. 2일 후 세포들을 선별배지(G 418을 함유한 Ham F12-DMEM)으로 통과시켜 보충하였다. 세포들을 3주 동안 성장시킨 후 4개의 60nm 접시에 통과시켰다. 80% 융합(confluency)에 이르렀을 때, 세포들에 또다른 선별 배지(0, 50, 100 또는 250nM 메토트렉세이트를 함유한 Ham 12 DMEM)를 공급하였다.
2주 후에, 세포들은 제한 희석에 의해 96웰 접시에 클로닝 시켰다. 개개의 웰은 효소면역분석법(ELISA)에 의해 rt-PA에 대해 분석하였다. rt-PA를 생성하는 웰들은 성장시켜 24웰 접시에서 융합체를 이루게 하여 500, 1000, 3000 및 10,000nM 메토트렉세이트로 더욱 증폭시켰다. 3,000 및 10,000nM 메토트렉세이트까지 증폭시킨 한 클론을 선별하고 돌연변이 rt-PA의 생성을 확장시켰다. rt-PA는 아연 삽입 세파로오스(세파로오스를 삽입함, 파마시아사제품)를 사용하여 정제한 후 고정화된 토끼 다클론 항체를 야생형 rt-PA에 대하여 성장시켰다. 야생형 rt-PA와 유사한 특히 활성은 크로모겐 기질 S2251(카비사 제품) 및 폴리클론에 기초한 ELISA를 사용하여 결정하였다.
모든 세 부위에서 고 만노오스 과당류를 갖는 rt-PA 시료를 CHO15B 세포주 중의 t-PA에 대한 유전자를 발현시킴으로서 제조하였다. 15B 세포주는 당단백질 프로세싱 효소인 N-아세틸글루코자민 전이효소 I이 없으며 그 결과로서 복합형 N-연관 과당류를 합성할 수 없다. 15B 세포주에서 생성된 rt-PA의 중성아미노당 조성물은 모든 세 글리코실화 부위에서 고-만노오스 과당류의 존재와 일치하였다.(표 2)
[표 2]
변형된 rt-PA의 탄수화물 조성
a 약어 Fuc=푸코오스, Man=만노오스, Gal=칼락토오스
GlcNAc=N-아세틸글루코자민
b 갈락토스로 정상화시킴
c GlcNAc로 정상화시킴
[실시예 8]
조직형 플라스미노겐 활성제 변이체의 약물동역학
엔도 H 및 과요오드산염 변형 형태의 rt-PA의 혈장 시간 경로를 표 4에 나타내었다. 두 처리결과는 rt-PA가 느리게 제거됨이 나타났다. 과요오드산염 처리 rt-PA 대한 t1/2에서만 의미있는 증가가 있었다.
두 엔도 -H 및 과요오드산염 처리 rt-PA는 대조 rt-PA보다 각각 1.9 및 2.7배 차이로 더 느린 정화율을 가졌다. 엔도-H 및 과요오드산염 처리 rt-PA의 정화율의 차이는 의미있는 것이었다(P＜0.005). Vo 또는 t1/2베타에 있어서는 별 차이가 없었다(표 3).
rt-PA의 잔여 변형형은 상기 기술을 사용하여 약물역학을 특성화하는 양으로 얻지 못했다. 따라서, 이러한 물질들의 약물동역학적 특성은 다음의 요오드화에 의해 결정되었다. 이 방법의 한 제약은 표지 및 비표지 형태의 rt-PA의 제거가 다르다는 것이다(제7도). 면역반응성 및 TCA 침전되는 횟수는 역 90% 비표지투여량이 정화될 때까지 동일한 양상으로 감소하였다. 이어서, 곡선들은 보다 느리게 정화되는 표지 rt-PA에서 갈라진다. 이 두 곡선으로부터 약물동역학적 변수들은 표 4에 나타냈다. Vo, t1/2알파 및 t1/2베타의 값은 크게 다르지는 않았으나, 정화율 뿐만아니라 %AUCd 및 %AUCβ의 상대적 크기는 크게 달랐다.
방사 표지 rt-PA의 약물동역학적 분석으로 앞서 나타냈던 제거에 있어서 차이를 예측할 수 있는가를 판단하기 위하여, 엔도-H 및 과요오드산염 처리 rt-PA를 표지시키고 이들의 약물동역학을 측정하였다. 표지시킨 rt-PA는 언제나 비변형 rt-PA 1mg/kg과 함께 동시주입하였다. 이들 변형 rt-PA로부터 TCA 침전되는 횟수의 제거패턴은 표 8에 나타냈다. 모든 글리코실화 부위에 고-만노오스 과당류 구조를 갖고 CHO 15B 세포주에서 생성된rt-PA는 또한 본 실험에 포함된다. 모두 4형태의 rt-PA는 유사한 배치의 초기 용적을 가졌다. 제4도에 나타낸 바와 같이, 엔도 H 및 과요오드산염처리 rt-PA는 대조 rt-PA보다 더 낮은 정화율을 갖는다: 즉, 엔도-H 및 과요오드산염 처리 rt-PA의 제거 패턴에 있어서 돋보이는 변화는 α 및 β국면의 상대적인 크기로 나타난다. HM rt-PA의 정화율은 거의 4배 더 컸다. HM t-PA의 정화도에 있어서 가장 실질적인 변화는 α국면 반감기의 감소에 기인한 것으로 나타났다(표 5).
아미노산 잔기 117에서 엔도 H에 의한 고 만노오스 과당류의 제거 및 과요오드산염에 의한 산화는 약물역학에 있어서 비슷한 변화를 초래하는 것으로 나타났다. 결과적으로 Gln117 변이체는 아미노산 117에서 글리코실화가 rt-PA의 제거에 작용하는 역할을 결정하기 위한 또 다른 기구로 사용하였다. 제5도는 이 돌연변이체가 보다 느리게 제거하는 다른 형태의 rt-PA와 유사하게 작용함을 보여준다. Gln117의 정화율은 대조군보다 2배 적으며 보다 현저한 베타국면으로 이동이 있었다. Vo, t1/2알파 및 t1/2베타에 있어서 별다른 변화는 없었다.
[표 3]
비표지 변형 및 야생형 rt-PAa
a 모든 통계는 표준 편차에 걸친 평균으로 나타내었다. 중요한 차이(P＜0.05)가 변이의 분석에 의한 군에서 검출되었을 경우, 학생들의 T-시험을 행하여 유의성의 수준을 결정하였다.(*)P＜0.01. 대조군 엔도 및 과요오드산염에 대한 복용량은 각각 1.0, 0.83 및 0.95였다.
b 엔도는 엔도 H처리한 rt-PA이다.
c 미세상수 K10, K12, K21(분-1×03)
[표 4]
표지 및 비표지 야생형 rt-PAa의 약물 역학
a 모든 통계는 표준 편차에 걸친 평균으로 나타내었다. (*) 두 고정 학생의 t-시험에 의한 P＜0.01 약어는 b 면역반응성 rt-PA(IR) 및 트리클로로아세트산 침전되는 방사능(TCA)이다. 복용량은 IR 및 TCA에 대해 각각 1mg/kg 및 3.4μCi/kg이었다.
[표 5]
엔도- 또는 과요오드산염 및 고 만노오스 rt-PA로 처리한 표지 rt-PA의 약물역학적 변수
a 모든 통게는 표준 편차에 걸친 평균으로 나타내었다. 표 2의 통계 분석에 대한 설명 참조
b 대조군은 야생성 rt-PA이고 과요오드산염은 과요오드산 나트륨 처리한 rt-PA이고 HM은 CHO-15B 세포주에서 생성된 고만노오스 rt-PA이며 엔도는 엔도 H처리한 rt-PA이다. 모든 복용량은 10μCi/kg이었다.
글루타민 117 t-PA 및 대조 인체 t-PA의 약물동역학은 제5도에 나타냈다. 글루타민 117 t-PA는 대조군보다 더 느리게 정화되었다.
유사한 일면이 실시예 3에서 기재한 바와 같이 제조한 글루타민117글루탐산275t-PA에 의해 제6도에서와 같이 입증하였다.
피브린 결합 특성
피브린 결합은 인체 조직형 플라스미노겐 활성제가 생체 내에서 지닌 피브린 특이성과 직접적으로 관련된 것으로 보이는 가장 중요한 요인이다. 엔도 H 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 피브린 결합은 두 공정으로 평가하였다. 첫번째 공정은 표준 미세적정 접시중의 웰에 피복시킨 피브린에 의한 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 포착을 이용하였다. 이이서, 각 웰을 세척하고 플라스미노겐 및 플라스민(S-2251, 카비사 제품)에 대한 색소원 기질을 첨가하였다. 발생된 색은 초기 단계에서 포착된 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 양에 비례하였다[(Angles-Cano, Thrombosis and Haemostais 54, 171(1985)]. 피브린 결합에 대한 두번째 유형의 분석은 트롬빈을 플라스미노겐이 없는 피브리노겐 및 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 용액에 첨가하였을 때, 용액 중에 남아 있는 인체-조직형 플라스미노겐 활성제의 양을 ELISA에 의해 측정하는 것이다[Rijken et al., J. Biol Chem. 257(1982)]. 현재 어느 분석법이 변형된 인체 조직형 플라스미노겐 활성체가 피브린과 결합한 생체내 결과를 적절하게 예측하는지는 명확하지 않다. 각각의 분석을 기초로하여, 본 발명자들은 엔도 H-처리 인체 조직형 플라스미노겐 활성제가 만약 피브린 특이성이 개선되지 않았다면 최소한 변형되지 않는 것으로 추정하였다.
유사하게, 실시예 3의 글루타먼 117 글루탐산 275 t-PA의 피브린 결합 시험 통계는 글루타민 117 글루탐산 275 t-PA가 글루탐산 275 t-PA와 유사하고 피브린 및 특히 활성에 있어서 t-PA 대조군보다 뛰어남을 입증하였다.
[실시예 9]
t-PA 변이체 Gln117Met119의 피브린 용해 활성
실시예 1 및 2에 기재한 바와 같이 제조한 gln117및 met119변이체들은 상기한 바와 같은 엔도 H-처리물질과 같이 유사한 결과를 갖는 피브린용해 활성에 대해 각각 시험하였다. 또한 각각의 약물동역학은 상기 대조군 인체 조직형 플라스미노겐 활성제와 비교하여 엔도 H-처리 물질의 약물동역학과 유사하였다.
[실시예 10]
제약 조성물
본 발명의 화합물은 제약학상 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 생성물을 제약학상 허용되는 담체와 혼합시킴으로서 제형할 수 있다. 적합한 담체 및 다른 인체 단백질(예, 인체 혈청 알부민0을 포함한 이들의 제형은 본 명세서에 참고문헌으로 인용한 마틴(E. W. Martin)에 의한 레밍톤의 Pharmaceutical Science에 기재되어 있다. 상기 조성물은 숙주에 유효하게 투여하기에 적합한 제약학상으로 허용되는 조성물을 제조하기 위해 적합한 양의 담체와 혼합시킨 본 발명에 따른 단백질을 포함한다.
예컨데, 본 발명의 인체 조직형 플라스미노겐 활성제는 심장혈관 질병으로부터 고통을 겪는 환자에게 비경구투여할 수 있다. 복용량 및 복용 속도는 예컨데, 심근 협착증 폐동맥색전증으로부터 고통을 받는 환자에 있어서 1.5 내지 12시간에 걸친 정맥내 또는 동맥내 복용량으로서 약 1-2mg/kg 체중으로 다른 심장혈관 및 혈전붕괴제를 임상적 연구에 현재 사용하는 것에 일치시킬 수 있다.
적절한 복용형의 한 예로서, 인체조직형 플라스미노겐 활성제, 아르기닌, 인산 및 폴리소르베이트 80을 50mg 함유하는 바이알을 주사용 살균수 50ml로 재구성시켜 적합한 용적의 염화나트륨 주사액 0.9%와 혼합시킨다.
연장 또는 감소된 반감기의 인체 조직형 플라스미노겐 활성제는 신속한 정맥내 주사용으로 적합하다. 이것은 복합 투여 방법에 대한 필요성을 제거하고 한정된 2차 의료 인원으로 이루어진 긴급 운반자와 같은 제한된 의학 장비로 장치하여 t-PA의 사용을 위한 기회를 증가시킬 것이다. 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 연장된 반감기는 또한 보다 낮고 안전한 초기 복용량을 허용하며 45분 이상 혈전붕괴에 유효한 플라스민 농도를 유지시킬 수 있다. 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 긴 반감기는 또한 연속적인 급성 혈전붕괴 후의 재폐쇄를 막는데 필요한 치료에 의도하거나 또는 주변부 혈관 폐쇄의 경우에 있어서 필요한 혈전붕괴에 의도한 낮은 복용량에 유용하다. 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 감소된 반감기는 특정 환자에 있어서 단축된 기간에 걸쳐 유효한 플라스미노겐 농도를 제공함으로써 혈전붕괴의 치료의 목적하는 종류에 바람직한 형태일 수 있다.
상기한 것은 특히 바람직한 실시예에 관한 것이나 본 발명은 이에 한정하지 않음을 이해해야할 것이다. 당업계에서 통상의 숙련된 자들에게는 상기 실시예에 따라 여러가지 변형을 행할 수 있으며 그러한 변형은 본 발명의 영역내에 있는 것으로 쉽게 이해될 것이다.
Claims (30)
- (a) 실질적으로 충분한 생물학적 활성을 보유하고, (b) 변형된 탄수화물 구조를 가지며, (c) 변경된 생체내 반감기를 갖고 (d) 기능적으로 변형된 탄수화물 구조를 갖지아니할 경우에는 아미노산 잔기(117)에 관능성 탄수화물 구조를 갖는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 구조가 1개 이상의 관능성 탄수화물 구조의 결실에 의해 변형된 것인 증가된 생체내 반감기를 갖는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제2항에 있어서, 상기 탄수화물 구조가 아미노산 117 위치에서 관능성 탄수화물 구조가 제거되어 변형된 것인 증가된 생체내 반감기를 갖는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제3항에 있어서, 117 위치에서 아스파리긴 이외의 아미노산을 함유하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제3항에 있어서, 119 위치에서 세린 또는 트레오닌 이외의 아미노산을 함유하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제3항에 있어서, 117 위치에서 글루타민을 함유하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제3항에 있어서, 119 위치에서 메티오닌을 함유하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제3항에 있어서, 118 위치에서 프롤린을 함유하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제3항에 있어서, 단일 사슬 인체 조직형 플라스미노겐 활성제인 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제9항에 있어서 117 위치에서 글루타민을, 275 위치에서 글루탐산을 함유하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성체 변이체.
- 제2항에 있어서, 상기 탄수화물 구조가 아미노산 117, 184 및 448 위치에서 관능성 탄수화물 구조가 제거되어 변형되는 것인 증가된 생체내 반감기를 갖는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 구조가 아미노산 184 및 448 위치에서 고 만노오스 과당류의 치환에 의해 변형된 것인 감소된 생체내 반감기를 갖는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체.
- 제약학상 허용되는 담체와 함께 혼합시킨 제1항에 따르는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체를 포함하는 제약 조성물.
- 제약학상 허용되는 담체와 함께 혼합시킨 제2항에 따르는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체를 포함하는 제약 조성물.
- 제약학상 허용되는 담체와 함께 혼합시킨 제12항에 따르는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체를 포함하는 제약 조성물.
- 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 탄수화물의 구조를 변형시킴을 특징으로 하는 실질적으로 충분한 생물학적 활성을 보유하고, 변경된 생체내 반감기를 갖는 제1항에 따르는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체의 제조 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 변형이 1개 이상의 탄수화물 구조의 제거에 의한 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 관능성 탄수화물 구조가 117번 아미노산 잔기에서 제거된 방법.
- 제17항에 있어서, 관능성 탄수화물 구조가 117, 184 및 448번 아미노산 잔기에서 제거된 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 변형이 아미노산 184 및 448 위치에서 고 만노스 과당류의 치환에 의한 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체를 재조합 DNA 세포 배양물 중에서 117 위치에 아미노산 아스파라긴을 암호화하는 코돈 이외의 코돈을 갖거나 또는 119 위치에서 아미노산 세린 및 트레오닌을 암호화하는 코돈 이외의 코돈을 갖는 상기 인체 조직형 플라스미노겐 활성제 변이체를 암호화하는 DNA를 발현시킴으로써 제조하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 코돈이 117 위치에서 글루타민을 암호화하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 코돈이 119 위치에서 메티오닌을 암호화하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 코돈이 117 위치에서 글루타민을 암호화하고, 275위치에서 글루탐산을 암호화하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 인체조직형 플라스미노겐 활성제를 탄수화물의 구조를 변형시키는 시약으로 처리함으로써 탄수화물이 변형되는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 시약이 효소인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 효소가 엔도 H인 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 시약이 과요오드산염인 방법.
- 복합 탄수화물 치환체를 갖는 당단백질을 형성할 수 있는 포유동물의 숙주 세포를 인체 조직형 플라스미노겐 활성제를 암호화 하는 DNA로 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 배양시킨 후, 세포 배양물로부터 상기 변이체를 회수함을 특징으로 하는 인체 조직형 플라스미노겐 활성제의 제조방법
- 제29항에 있어서, 상기 숙주 세포가 효소 N-아세틸글루코사민 아미노트랜스퍼라제를 가지고 있지 않은 방법.
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