JPH03500843A

JPH03500843A - 新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体

Info

Publication number: JPH03500843A
Application number: JP1500176A
Authority: JP
Inventors: ホッチキス，アデア・ジェイ; オコーナー，ジョン・ブイ; スペルマン，マイケル・ダブリュー
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1987-11-06
Filing date: 1988-11-02
Publication date: 1991-02-28
Also published as: IL88247A0; ZA888250B; KR920009521B1; DK112290D0; ATE151812T1; PT88938A; AU2804989A; EP0754753A1; NO307612B1; NO901995L; DD286613A5; HU215230B; EP0387290A1; KR890701733A; NO901995D0; PT88938B; PH30064A; NZ226829A; CA1341609C; AU658909B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規ヒト組織型プラスミ／−ゲン活性化因子変異体発明の分野本発明は、炭水化物構造が改良された新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体、その組成物、および治療学的に有効な童のそれらを製造する為の手段および方法に関する。

発明の背景本発明は、循環系からのヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の消失は、その分子の炭水化物構造を変換することにより操作し得るということを発見したことに基づいている。

組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、繊維素溶解に関与しているセリンプロテアーゼの１種である。フィブリン血餅にｔ−ＰＡが結合することによって、プラスミノーゲン活性化が増強される（Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ、Ｍ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：２９１２−２９１９　［１９８２］；Ｒｉｊｋｅｎ、Ｄ、Ｃ，、ら、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２５７：２９２０− ２９２５［１９８２］）。ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する。生成したプラスミンは、血餅の骨組となっているフィブリンマトリックスを蛋白分解し、解裂させる。この様にして、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子は血餅溶解の仲立ちをし、従って、各種の血栓性障害の治療に有効である。ｔ−ＰＡは多くの起源、例えば“ボウズ（Ｂ　ｏｗｅｓ）メラノーマセルライン（Ｒ１ｊｋｅｎ、Ｄ、Ｃ，ら、Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ。

−１５３［１９７９コ）、および血管潅流液（Ｂｉｎｄｅｒ、Ｂ、Ｒ，ら、Ｊ。

び肺塞栓症の患者に臨床試験を行うことが可能となった。臨床試験の結果、組換ｔ　−Ｐ　Ａ　（ｒｔ　−Ｐ　Ａ）は、血中のフィブリノーゲン濃度にはほとんど影響を与えることなく、極めて優れた血栓溶解剤であることがわかった（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、　Ｏ，ら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　ユ３：３３８　３４６［１９８６］；Ｇｒａｏｙ、Ｒ，Ａ、ら、Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ循環系からのｒｔ−ＰＡの消失は比較的早い。二相性の消失は、ウサギに於イテは、半減期約２分（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｒ、　Ｃ，ら、Ｔ　ｈｒｏｍｂ。

ｇｈｍａｎ、　Ｒ，Ａ、＋Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｏ＋ｂｏｌｙｔｉｃ　Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｓ　ｏｂｅｌら、ｅｄｓ）、ｐ４１−５３、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　ＮＹ［１９８７コ）から６分（Ｗａｌｌｅｎ　Ｐ、ら、上掲）の半減期を持つα相により支配されている。ｔ−ＰＡの摂取と代謝の最も重要な部位は肝臓である（Ｋｏｒｎｉｎｇｅｒ、　Ｃ，ら、上掲；Ｎ　１ｌｓｓｏｎ、Ｓ　、ら、上掲；　Ｂ　ｏｕｎａｍｅａｕｘ、Ｈ、ら、上掲）。糖タンパクのオリゴ糖部分に存在する特異な末端残基を認識する、肝臓中の多くのりセブター系が報告されている。この機構で消失するタンパク類の半減期は数分のオーダーである（Ａｓｈｗｅｌｌ、　Ｇ、ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５１：５３１−５５４［１９８２］）。

組換ｔ−ＰＡは、Ｎ−結合グリコシル化の可能性のある４個の部位を持っている。高マンノースオリゴ糖が１１７位にあり、複合（Ｃｏｍｐｌｅｘ）オリゴ糖が４４８位にある。Ｉ型ｒｔ−ＰＡの１８４位には複合オリゴ糖が存在するが、■ 型ｒｔ−ＰＡには存在しない。■型と■型の比は約１：１である。第４の潜在的なグリコジル化部位である残基２１８は、グリコジル化されない。ｒｔ−ＰＡのグリフシル化のパターンは、メラノーマ由来のｔ−ＰＡのそれと類似している。

ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子をｔ−ＰＡと略すことは、１９８２年７月２７日、イタリア国、バアルガモでの血栓症と止血に関する第２８回国際委員会で提案、採用された。本明細書では、「ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子」、ｒｔ−ＰＡＪ、「ヒｈｔ−Ｐ、　Ａ　Ｊ、「組織プラスミノーゲン活性化因子」なる用語は、例えば、天然起源からの抽出精製［Ｃｏｌ　ｌｅｎら、ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、４１７６６（１９８０年６月１１日の第−国出願に基づき、１９８１年１２月１６日公開）およびＲｉｊｋｅｎら、Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

ｌ五６．７０３５（１９８１）参照］、およびアミノ酸配列、物理的及び生物学的特性と共に記載されている組換細胞培養系（例えばヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ、９３６１９号、１９８２年５月５日の第１国出願に基づいて１９８３年１１月９日公開）により生産された、ヒトの、外部からの（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を意味する。これら文献記載の内容は本明細書の一部を構成する。

米国特許第４４３２６０３３号には、ウロキナーゼの半減期を、その炭水化物構造の修飾により延長させることが記載されている。

ウロキナーゼは、免疫学的にヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子と区別される。この様な、ウロキナーゼに於ける炭水化物の修飾が、その他の糖タンパクにも応用できるであろうことを正当化する記載は米国特許第４３２６０３３号にも、その他にもない。事実、例えばセルロブラスミンからシアル酸を除去すると、その半減期は激減する。一方、もう１つの血清糖タンパク、トランスフェリンに同じ処置を施しても半減期に有意な影響が見られない（Ｓ　ｈａｒｏｎ、　Ｃｏｌ１ｌｐｌｅｘ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｏｓｌｅｙ出版、ｐ１９４−１９６、（１９７５）：Ａｓｈｗｅｌｌら、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　４１．　９９（１９７４）＋　Ａ　１ｅｘａｎｄｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２６．　１３２８（１９８４））。

マウスに於いて、メラ／−マ由来ｔ−ＰＡの消失は、フェニルメチルスルホニルフルオライドによる活性部位のタイトレージョン（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）、または、ジイソプロピルフルオロホスフェート・トロンビン、アシアロオロソムフイド、およびマクロアルブミン、または過剰の非標識ｔ−ＰＡの同時注射によって影響を受けなかったという報告がある（Ｆｕｃｈｓ、Ｈ，Ｅ、ら、Ｂ］ｏｏｄ　６５：５３９　５４４［１９８５］）。このアシアロオロソムコイドおよびマクロアルブミンについて得られた結果は、炭水化物構造は、ｔ−ＰＡの消失に影響を与えないことを示している可能性がある。ラットに於いて、メラノーマ由来のｔ−ＰＡの消失は、単糖類によっては影響されないという報告がある（Ｅｍｅｉｓ、Ｃ，Ｕ、ら、Ｔ　ｈｒｏｍｂ、　Ｈｅａｍｏｓ、５４：６６１−６６４［１９８５］）。一方、ラット肝臓の細胞成分を分離した際、内皮細胞が、高マンノース糖タンパクによって阻害されることもある経路によって、メラノーマｔ−ＰＡを摂取するという報告があり、この結果は、ｔ−ＰＡは少なくとも一部は、マンノースリセブターによって肝臓に取り込まれることを意味していると解釈されている（Ｅ　１ｎａｒｓｓｏｎ、　Ｍ、ら、Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈｅａｍｏｓ、５４　：２７０［１９８５］）。その他のインビトロ試験で、ｒｔ−ＰＡは高い親和性でラットの肝細胞に結合することが示された。このリセブターは、炭水化物依存性ではなさそうである（Ｂａｋｈｉｔ、　Ｃ，ら、Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６２：８７１６　８７２０［１９８１コ）。

１９８２年１０月２８日第一国出願に基づき、１９８４年５月１０日に公開された特許国際公開第ＷＯ３４１０１７８６号には、組織型プラスミノーゲン活性化因子を無差別に修飾すると、その非修飾ポリペプチドと比較して生物活性の低下した、しかし目的とする半減期が増大した分子が得られたと記載されている。ただ１つの実施例は、ある程度精製したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を過ヨウ素酸ナトリウムで処理し、もとの（修飾していない）活性の約７０〜９０％の活性を持った産物が得られたことを示している。

このＷＯ８，４１０１７８６号には、天然物質および特に重要なことモあるが、発明者らが生産した修飾型の物質、に存在する炭水化物構造の種類や特性について評価はなされていない。事実、過ヨウ素酸塩は、酸化により全ての炭水化物構造を修飾または破壊するが、同時にアミノ酸結合から実質的にこれを除去することはないことが知られている。

さらに、ＷＯ３４１０１７８６は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子はこの様な構造をいくら持っているか、あるいは実際の炭水化物の構成がどの様になっているかについては、修飾されていないｔ−ＰＡおよび修飾されたもののいずれについても記載していないＪ従って、この過ヨウ素酸塩で処理された分子は多分、酸化により、全ての炭水化物構造が無差別に修飾されており、特定の部位に焦点があてられたものではなかったと思われる。

最近、グリコジル化されたヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子とグリフシル化されていないものとのインビボに於ける消失速度に、有意な差がなく、従ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の消失速度は炭水化物の非存在により影響を受けるものではないと結論せざるを得ない、という報告がなされている（　Ｌ　ａｒｓｅｒ＋ら、Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｐａｒｋ　Ｃ１ｔｙ、　Ｕｔａｈ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ　９　１４、１９８６．　Ｌｉｔｔｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ　２３．６１９１　（１９８４））。

本発明の目的は、炭水化物構造を修飾することによる、新規を−ＰＡ変異体を提供することにある。本発明の別の目的は、異なった速さで循環系から消失することのできるｔ−ＰＡ変異体を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、種々の臨床状態を処置するのに適した有効な血栓症治療剤を提供することにある。

本発明の要約本発明の目的は、炭水化物構造が修飾を受けており、実質的に完金な生物活性を保持しており、変更されたインビボ半減期を有する−即ち、天然のｔ−ＰＡとは異なつた速さで循環系から消失する新規な組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体によって達成された。

具体的には、このｔ−ＰＡ変異体は、１１７．１８４または４４８位の炭水化物構造が修飾されている。ｔ−ＰＡの炭水化物構造の変換が循環系からの消失をかえるということは、本発明まで知られてイナかった。特に本発明は、ｔ−ＰＡのグリコジル化部位の１またはそれ以上から炭水化物を除去すればｔ−ＰＡの半減期が延長されるということを確立したのである。具体的には、本発明はまた、１１７位に存在するものに加えて１８５位および４４８位に高マンノースオリゴ糖を有するｔ−ＰＡ変異体は、循環系からより早く消失する、ということを初めて確立したものである。

従って、本発明は、機能的に修飾を受けていない炭水化物構造を（アミノ酸残基１８４位および／または４４８位に）持ってはいるが、アミノ酸残基１１７位に機能的な炭水化物構造を持９ておらず、実質的に完全な生物活性を保持しており、インビボに於ける半減期が（アミノ酸残基１１７位に無傷の炭水化物構造を持った“天然”のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子と比べて）増大している新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子に関するものである。

本発明はまた、１１７．１８４および４４８位に機能的に炭水化物構造を持っておらず、実質的に完全な生物活性を保持しており、かつ、（これらの位置に無傷の炭水化物構造を持っている“天然”のヒト組織型プラスミ／−ゲン活性化因子と比べて）増大したインビボ半減期を有する新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体に関するものである。

本発明は更に、１１７位に存在するものに加えて、置換された高マンノースオリゴ糖を１８４位および４４８位に有し、実質的に完全な生物活性を保持しており、（１８４位および４４８位に無傷の炭水化物構造を持っている”天然”のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子と比べて）減少した半減期を持っている新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体に関するものである。

更に本発明は、本発明の個々の新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体と同じ炭水化物パターンを持っているが、全アミノ酸配列中の１若しくはそれ以上のアミノ酸が異なっている生物学的に活性なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子等価物に関するものである。更に、本発明は、本発明の新規ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体を生産するのに有用な、関連する組換ベクター、培養、および方法に関するものである。

本発明の範囲に含まれるヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体等価物の１つは、タンパク分解酵素によって認識されるアミノ酸配列を除去することによって、アミノ酸２７５および２７６の間の開裂部位が破壊されている、いわゆる１本鎖変異体である。この配列の除去は、特定のアミノ酸を変えることによって、例えば、以下に記載されている方法に従って、そのもとのＤ　Ｎ　Ａコドンを部位特異的に変異させることによって行われる。

図面の解説第１図は、未処理（レーン１）およびエンドＨで処理した（レーン２）ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のコマシー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥである。高分子量のバンドは１本鎖ｔ−ＰＡ、その他の主要なバンドはＩ型クリングル（Ｋｌ）、ＩＩ型ツクリングルＫＩＩ）、およびプロテアーゼ（Ｐ）である。

第２図は還元されたカルボキシメチル化ｔ−ＰＡのグリコシダーゼ消化を表わす。レーン１ニーＮ−グリカナーゼ；レーン２：十Ｎ−グリカナーゼ；レーン３ニーエンドＨ；レーン４：十エンドＨ，バンドの意味は第１図と同じ。

第３図は出発プラスミドｐＵＣＰＡ△ＨＤの制限地図である。

第４図は対照ｒｔ　−Ｐ　Ａ　（△）および過ヨウ素酸ナトリウム（○）またはエンドＨ（・）で修飾したｒｔ−ＰＡの血漿中濃度の経時変化を表わす。データは平均値上標準偏差で表わしである。

第５図は、対照ヒトｔ−Ｐ’Ａ（○）およびグルタミン１１７ｔ−ＰＡ（ロ）のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）で沈降可能な放射活性の経時変化を表わす。

第６図は、対照ヒトｔ−ＰＡ（ロ）およびグルタミン７，７グルタミン酸ｔ７ｓｔ−Ｐ　Ａ　（０）のトリクロル酢酸（ＴＣＡ）で沈降可能な放射活性の経時変化を表わす。

第７図は、１″５Ｉ標識（・）および非標識（○）の対照ｒｔ　−Ｐ　Ａの血漿中濃度の経時変化を表わす。

データは平均値上標準偏差で表わしである。

第８図は、１′Ｉ標識ヒトマンノースｒｔ−ＰＡ（△）、対照ｒｔ−ＰＡ（ム）、エンドＨ処理ｒｔ−ＰＡ（○）および過ヨウ素酸塩処理ｒｔ−ＰＡ（○）および過ヨウ素酸塩処理ｒｔ　−Ｐ　Ａ　（・）の血漿中濃度の経時変化を表わす。

データは平均値上標準偏差で表わしである。

ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸残基１１７に於ける炭水化物構造は、以下のタイプの組成を有することがわかった。

ＭａｎＭａｎ　＋　２Ｍａｎ一方、アミノ酸残基１８４および４４８に於ける構造は、以下のタイプの組成を持っている。

Ｍａｎ−＋４Ｇ１ｃＮＡｃ−”４ＧｌｃＮＡｃ−＋ＡＳＮ５ｉａ２−”３Ｇａｌ −＋４０１＋ＪＡｃ−＋２　７ａｎ略号の説明：Ｍａｎ：マンノース；Ｇａｌニガラクトース；Ｆｕｃ：フコース；ＧＩｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｓｉａニジアル酸、　Ｒ−Ｈまたは５ｉａ２・・・＞３０ａｌ・＝＞４ＧＩｃＮａｃ。

上記の構造は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子に存在するタイプのＮ− 結合オリゴ糖類を代表してはいるが、本発明は上に示した構造に限定されるものではないことに留意すべきである。それぞれのグリコジル化部位は、多分、数種の非常に関係の深い、未確認の構造を含んでいよう。このことは、微不均−性として知られており、糖タンパクのグリカンに共通する性質である（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、２６０．４０４６（１９８５）参照）。例えば、高マンノースオリゴ糖は、その存在するマンノース単位の数が変化し得る。複合（ｃｏｍｐｌｅｘ）オリゴ糖では、その微不均−性はシアル酸、フコース、ガラクトースおよびＮ− アセチルグルコサミン残基の数のみならず、分岐の程度の違いにも及ぶことがある。この様な微不均−性は本発明の範囲に包含されるものである。

１１７位のアミノ酸に於ける高マンノース含有構造は、アミノ酸残基１８４および４４８に於けるもっと複雑な構造と、その構造の面で特異であるのみならず、次の点、即ち、１８４および４４８位の構造を機能的に修飾することなくこれを完全に機能的に除去すると、インビボに於いての半減期が増大した、完全な生物活性を有するヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子が得られる、という点に於いて特異的であるということが判明した。

アミノ酸残基１１７位の機能的炭水化物構造を除去するということは、後述する部位特異的突然変異によってグリコジル化シグナルを破壊してしまう場合の様な完全な除去、またはＡ　Ｓｎ＋＋ｖに結合した無傷のＮ−アセチルグルコサミン残基を残すこともあるエンドグリコシダーゼで処理する場合の様な実質的な除去、あるいはまた、例えばビシナル水酸基を酸化する過ヨウ素ナトリウムで処理することにより１１７．１８４、および４４８位の実質的な除去を意味する。アミノ酸残基、１１７．１８４および／または４４８位の機能的に修飾されていない炭水化物構造とは、無傷の構造を保持しているか、または天然のタンパクと機能的に等価な程度にその全ての構造を実質的に保持しているものを意味する。

■型組換ｔ−ＰＡの１８４位アミノ酸および４４８位アミノ酸に於ける炭水化物構造の変化とは、高マンノースオリゴ糖を複雑な、あるいは複合（ｃｏｎ＋ｐｌｅｘ）オリゴ糖に変換する酵素、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼを持っていない宿主中で組換組織型プラスミノーゲン活性化因子を生産することにより、その複合オリゴ糖を高マンノースオリゴ糖で置き換えることを意味する。この高マンノースｔ−ＰＡ変異体は、インビボにおける半減期が減少した、実質的に完全な生物活性を有するヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体となる。

好ましい態様では、アミノ酸残基１１７に於ける機能的炭水化物の除去は、グリコジル化シグナル、Ａ　ｓｎ　−Ｘ　−Ｓ　ｅｒ／　Ｔ　ｈｒ’（ここでＸはいかなるアミノ酸であってもよい）の基礎となるＤＮＡに部位特異的突然変異を施すことにより達成される。組織型プラスミノーゲン活性化因子の場合、このシグナルを表わす配列はＡｓｎ＋＋、（Ｓ　ｅｔ＋＋ａ）Ｓｅｔ＋＋ｓである。従って、アミノ酸残基１１７の機能的炭水化物構造の除去は、例えば、これらのアミノ酸残基に相当するコドンに突然変異を施し、シグナルとしての機能を破壊することにより行なう。具体的には、例えば１１７位にアスパラギン（Ａｓｎ）以外のアミノ酸を持ち、モして／または１１９位のセリン（Ｓｅｔ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）、または１１８位のプロリンの代りにそれ以外のアミノ酸を持っているヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子が生産される様に、シグナルを表わすコドンに突然変異を施せばよい。

最も好ましい態様では、アスパラギン１１７を、その構造が非常に類似しているが故に、グルタミンに置き換えるか、あるいは、セリン１１９’ｔ、第２のクリングル領域に於ける類似配列に鑑み、メチオニンに置き換える。

突然変異は、自体既知の方法、例えばＺ　ｏｌ　ｌｅｒらの総説（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ工００，４６８（１９８３））に記載の方法で行なうことができる。例えば、１１７位のアスパラギンをコードしているＡＡＣをＣＡＡまたはＣＡＧに変えると（２個のヌクレオチドの変換が必要）、発現産物は１１７位にグルタミンを含有するものとなる。本発明に於けるその他の突然変異は、遺伝暗号の分析に従って行われる。アミノ酸残基１１７位の機能的炭水化物の他の除去法は、アミノ酸残基１１７　（Ａｓｎ）の高マンノース炭水化物構造を（実質的に）除去することができ、アミノ酸残基１８４および４４８の複雑な構造には機能的な影響を与えないエンドグリコツダーゼＨの様なエンドグリコンダーゼを使用することである。この処置法もまた、目体既知の方法、例えばＴ　ａｒｅｎｔｉｎｏらの方法（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

９　８１１（１９７４））およびＴ　ｒｉｍｂｌｅらの方法（Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　１アミノ酸残基１１７．１８４および４４８の機能的炭水化物を除去するその他の方法は、自体既知の方法で行われる過ヨウ素酸ナトリウムによる処理であり、この方法は、ビシナル水酸基を含んでいる炭水化物残基を酸化するものである。３つの位置、１１７．１８４および４４８位のオリゴ糖は全て、過ヨウ素酸酸化を受ける残基を持っている。

■型組換ｔ−ＰＡの１８４位、および４４８位の複雑なオリゴ糖を組換技術を使って高マンノースオリゴ糖に変えることにより炭水化物構造を変化させるもう１つの方法は、例えば、複合型（Ｃｏａｐｌｅｘ　ｔｙｐｅ）Ｎ−結合オリゴ糖の合成に必要な酵素を欠失している宿主細胞（Ｇ　ｏｔｔｌｉｅｂ、　Ｃ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５０　：　３３０３−３３０９［１９７５］）を、ｔ −ＰＡをコードしている発現ベクターでトランスフェクトすることである。

以下の実施例は、現在知られている、本発明を実施するための最良の方法を例示するものに過ぎず、これらのものに本発明が限定されるものと解釈してはならない。実施例に於いて参照した文献は全て、文献名を記載した。

実施例ＩＧ１ｎ＋＋、を欠失したｔ−ＰＡ炭水化物変異体１１７位に高−マンノースオリゴ糖以下に記載のごとく、部位特異的突然変異誘発を用いて１１７位にアスパラギンではなくグルタミンをアミノ酸残基として有する組織型プラスミノーゲン活性化物質をコードするＤＮＡを発現し得る発現ベクターを構築した。

Ａ、オリゴヌクレオチドの設計タレアら（ＣｒｅａＸＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８．　２３３１（１９８０））のホスホトリエステル法に従って、配列：５’−ＴＧＣ −ＡＣＣ−ＡＡＣ−ＴＧＧ−Ｃ＊Ａ＊Ａ＊−ＡＧＣ−ＡＧＣ−ＧＣＧ−３’（２４７−Ｑ１１７）を有する２４マーオリゴヌクレオチドを合成した。＊印は突然変異（アスパラギンからグルタミン）を表す。

８０組換えＭ１３テンプレート（鋳型）の構築プラスミドｐＵＣＰＡ△ＨＤ（第３図）はプラスミドｐＥＴＰＦＲ（またはＥＰＯ９３６１９（前掲）に開示されたｐＰＡＤＨＦＲ−６とも称する）の誘導体であって、以下の修飾が施されている。ｌ）工牛ソヌクレアーゼＢａ１３１を用いて、ｔ−ＰＡ遺伝子の５”末１側の１６６ｂｐ５°非翻訳ＤＮＡが切り落とされている。２）ｔ−ＰＡ遺伝子ｌ　の新たな５“末端にＨｉｎｄｌ１１部位が付加されている。３）ＥｃｏＲＩ。

５ａｃｒ、　Ｓｍａｌ、ＢａｍＨＩ、　ＸｂａＩ、５ａｉｌおよびＰｖｕＩＩ認識部位を含有するポリリンカーがｔ−ＰＡの発現を導＜ＳＶ４０早期プロモーターの５゛末端に付加されている。４）ｐＥＴＰＦＲの３５３９位におけるＨｉｎｄｌ１１部位がフレノウ充填（フィルイン）反応によって破壊されている。

プラスミドｐＵ　ＣＰ　Ａ△ＨＤ（第３図）をＳｍａｌで消化し、ＰＡＧＥにかけて、ゲルから断片を電気溶出することによりコドン番号５０７までのｔ−ＰＡ遺伝子含有約２．０ｋｂ断片を単離した。Ｍ　１３　ｒｎｐｌＯベクター（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ乙　１０１．　２０（１９８３））をもＳｍａｌで消化し、フェノール、クロロホルムで一回抽出し、エタノール沈殿に付Ｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）、１＋Ｍ　ＥＤＩＡ（ＴＥ）に懸濁した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＣＰＡ八）（Ｄ由来の約２．　Ｏｋｂ断片をＳｍａｌ切断Ｍ１３ＩＩｌｐｌＯに結合させ、得られたＤＮＡを用いて大腸菌（Ｅ、　ｃ―■−■■１を一一− ｏｌｉ）ＪＭＩＯＩを形質転換した。得られたファージを単離し、ファージミニプレブス（ｍｉｎｉ　−ｐｒｅｐｓ）の制限酵素分析によって挿入体の存在の確認と方向の決定を行った。−個の組換え体ファージ、Ｍ１３／ｌ−ＰＡ−ＳＭＡを以後の突然変異誘発の鋳型として選択した。

Ｃ０突然変異誘発反応アデルマンら（Ａｄｅｌｍａｎ、ＤＮＡ　２．　１８３（１９８３））記載のごと（、突然変異誘発プライマー（２４７−Ｑ１１７）を−重鎖Ｍ１３／ｌ−ＰＡ −３ＭＡ　ＤＮＡにアニーリングし、ｄＮＴＰ類とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片で処理してインビトロでヘテロ２本鎖ＲＦ分子を得た。これらの分子を用いて大腸菌ＪＭＩＯ１株（ＡＴＣＣＮｏ、３３８７６）を形質転換し、突然変異プライマーをプローブに用いるブラークハイプリザイゼーシ箇ンによって所望の突然変異を導入するファージを検出した０アデルマンら（Ａｄｅｌｍａｎ、ＤＮＡ　２．　１８３（１９８３））。−個の突然変異ファージを単離し、Ｍ１３／ｌ−ＰＡ−ＳＭＡ−ＧＬＮｌ　１７と命名した。

ファージＭ１３／ｌ−ＰＡ−ＳＭＡ−ＧＬＮＩ　１７の２本鎖ＤＮＡをＳｍａＩ、ＢｇｌｌｌおよびＡｐａｌで消化し、約１．４ｋｂ断片をＰＡＧＥ精製した。

次いで、この断片を用いてｐｕ　ＣＰ　Ａ△ＨＤの対応する断片と置き換えた。

ｔ−ＰＡ遺伝子断片を含有する組換えプラスミドを同定した。プラスミドＭ１１９およびＱ１１７を下記のごとく、ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞（ウランら（Ｕｒｌａｂ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ’、　Ｓｃｉ、ヱｌ。

４２１６（１９８０））に導入し、増幅させた。■）プラスミドＤＮＡを、グラハムら（Ｇｒａｈａ＠、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、５２．４５５（１９７３））のりん酸カルシウム沈殿法によって細胞に導入した。２）選択培地［ヒボキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠（（−ＨＧＴ）培地］で生じたコロニーにおけるｔ−ＰＡの発現を、グラネリアら（Ｇ　ｒａｎｅｌｌｉａｊ、ＥＸＩ：１．　Ｍｅｄ、１４８．　２２３（１９７８））の記載に従い、フィブリンとプラスミノーゲンとを含有する寒天プレートでのフィブリンの消化によって評価されるプラスミノーゲン生成を検出することにより、間接的に分析した。３）最も陽性であるクローンの内５個についてＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにより、細胞アたりのｔ− ＰＡ分泌皿を定量分析した。４）最高濃度のｔ−ＰＡを分泌するクローンを以下のようにメトトレキセート（ＭＴＸ）中で平板培養した。

２Ｘ１０’個の細胞を５０，１．、ＯＯまたは２５０ｎＭのＭＴＸを含有する１００ｏ＋＋ｎプレートで平板培養した。５）ＭＴＸ中で生えてきた５個のクローンを抽出し、上記３）記載のごと（ＥＬＩ　ＳＡで定量分析した。６）高濃度のｔ−ＰＡを分泌するクローンをより高濃度のＭＴＸ中で、上記４）と同様に平板培養し、生じたクローンを定量分析し、最高のｔ−ＰＡ生産体を選択した。

上記の増幅およびスクリーニング工程は、得られたセルラインからのｔ−ＰＡ生産の増大が最早得られなくなくまで継続し、対応する突然変異体ｔ−ＰＡを使用のために分離した。

実施例２Ｍｅｔ＋＋ｓを欠失したｔ−ＰＡ炭水化物変異体１１７位に高−マンノースオリゴ糖１１７位におけるＮ−結合グリコシル化が起きるためにはＡｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒ配列が必要である。１１９位における置換または欠失突然変異誘発は、同時に、１１７位におけるグリコジル化を妨げることにもなる。ｐＵＣＰＡ△ＨＤ　Ｍｌ１９を得るために、実施例１記載の方法と同様にして、配列：５”−ＣＣ−ＡＡＣ−ＴＧＧ−ＡＡＣ−ＡＧＣ−Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊−ＧＣＧ−ＴＴＧ −Ｇ−３’（２４７−Ｍ１１９）を有する２４７−を用いて対応するＭｅｔ＋＋。突然変異体を構築した。

発現による対応するＭ１１９突然変異体の製造法は上記実施例１の記載と同様である。

グルタミン＋１７グルタミン酸ｔ、ｓｔ　ＰＡ突然変異体を以下の方法で製造した。　上記のごとくして構築したプラスミドｐＵＣＰＡ△ＨＤをＢｇｌｒｌおよびＳ　ｃａ　Ｉで消化し組織型プラスミノーゲン活性化物質ＤＮＡ配列のコドン１から２５４に対応する約７６３ｂｐ断片を自体既知の方法で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより精製した。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６（ｐＥＴＰＦＲとも称する）およびｐＡ２５Ｅ１０からヒトｔ−ＰＡ　ＤＮＡを得た。これら２個のｔ−ＰＡプラスミド標品は欧州特許出願公開Ｎｏ、０９３６１９に記載されている。

プラスミドｐＡ２５Ｅ１０はｔ−ＰＡ遺伝子の最後の５０８アミノ酸と３″非翻訳領域の７７２塩基対をコードしている。このプラスミドを５ａｃｌおよびＢｇｌｌｌで消化し７４４塩基対断片を生成させ、記述の標準的手法で単離した。この断片はｔ−ＰＡアミノ酸４１１から５２７までをコードするコドンを含有しており、さらに３′非翻訳領域の一部をも含む。

プラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６はｔ−ＰＡの全構造遺伝子と３°非翻訳領域の一部を含有する。このプラスミドを５ａｃｌおよびＢｇｌｌＩで消化し、１，２３０ｂｐ塩基対断片を生成させ、単離した。この断片は成熟型ｔ−ＰＡの最初の４１０アミノ酸をコードするコドンを含有する。

これらの断片を標準的手法で結合させ、Ｂｇｌｌｌ消化した。成熟ｔ−ＰＡの全配列と３°非翻訳領域の一部とをコードするコドンを含有する１、９７４塩基対断片を単離した。２本鎖Ｍ１３ｍｐ８［メッシングら（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ　ＤＮＡ、Ｅｄｉｔｏｒ　Ａ、　Ｗａｉｔｅｒ、Ｅｌｓｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｒｅｒｄａｍ（１９８１）、　ｐ、１４３］をＢａｍＨＩで消化し、ＢｇｌｌＴ消化ｔ−消化色アニーリングし、Ｍ　１３ｍｐ８　Ｐ　Ａ　ＢｇｌＩＩを構築した。この２本鎖複製型Ｍ１３１ｐ８ＰＡＢｇｌｌ　Ｉで大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞（ＡＴＣＣＮｏ、３３８７６）を形質転換した。

このファージに感染した大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞からは１本鎖および２本鎖複製型（ＲＦ）のＭ１３ｍｐ８ＰＡＢｇｌｌ　Ｉが単離され得る。ｔ−ＰＡの部位特異的突然変異誘発は１本鎖型を用いて行った。

様々な部位のアミノ酸が置換されたｔ−ＰＡを発現させるために、ヒ）　ｔ　− Ｐ　Ａ構造遺伝子を部位特異的突然変異誘発によって修飾した。フレアら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７５゜５７６５（１９８０））の固相りん酸カルシウム法によって合成オリゴヌクレオチドを合成し、それらの部位特異的突然変異誘発に用いた。

ブライ７−２Ｃ９ＧｌｕＤＮＡ配列　Ｇ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＧＡ＾＾ＴＣＡＡＡ　ＧＧＡ　Ｇ本明細書に引用したアデルマンら（Ｄ　Ｎ　Ａ　２．１８３（１９８３））の一般的手法を用いて合成プライマーの突然変異した配列を含有するｔ−ＰＡクローンを生成させた。上記の１個のアミノ酸の突然変異を含有するプライマーを用いて突然変異ｔ−ＦＡクローンＭ１３ＲＦ２Ｃ９を生成させた。

プラスミドＰＰＡＤＨＦＲ−６（ｐＥＴＰＦＲとも称する、欧州特許出願公開Ｎｏ、９３６１９参照）においてはＳＶ４０　Ｔ抗原の早期プロモーターのフントロール下で天然のｔ−ＦＡ構造遺伝子が発現される。このプロモーターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子の発現をもコントロールしている。ｐＰＡＤＨＦＲ−６をｌ１１１および且５ｔＥＩＩで消化して生じた大きい断片を単離することにより、ベクター断片１を得た。もう１つのベクター断片２はｐＰＡＤＨＦＲ−６のＢｇｌＩＩおよびＢｓｔＸＩ消化物から４００塩基対のｔ−ＰＡ断片を単離することにより、得られた。突然変異ｔ−ＰＡクローンＭ１３ＲＦ２Ｃ９由来のＲＦ　ＤＮＡを胆ＸＩおよび胆Ｅｌｆで消化することにより所望の突然変異を有する１、１４１塩基対のｔ−ＰＡ断片３を得た。断片１および２を断片３と結合させた。ＤＮＡ混合物を用いて大腸菌を形質転換し、真核性発現ベクターｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９を得た。

上記のごとく調製され、欧州特許出願公開Ｎｏ、１９９５７４（１９８６年１０月２９日発行）に記載されているプラスミドｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９はグルタミン酸１９６組織型プラスミノーゲン活性化因子突然変異体をコードするＤＮＡ配列を含有している。これをＳ　ｃａ　ＩおよびＡｐａｌで消化し組織型プラスミノーゲン活性化因子ＤＮＡ配列のコドン２５４から４６６に対応する約６３０ｂｐ断片を、自体既知の方法で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより精製した。

ＢｇＩＩ　Ｔ−３ｃａｌ（ｐＵＣＰＡ△ＨＤ）および５ｅａｌ−ＡｐａＩ（ｐＰＡＤＨＦＲ−６２Ｃ９）の２断片をｐＵＣＰＡ△ＨＤ消化で得た大きいＢｇｌＩ　Ｉ（ｂｐ５３１）−Ａｐａｌ（１９２６ｂｐ）断片に結合させ、得られた、グルタミン１１？グルタミン酸ｚ７ｓｔ　ＰＡ突然変異体Ｄ　Ｎ　Ａを含有するプラスミドを通常の方法でミニスクリーニングした。得られたプラスミドを上記のようにしてＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞に導入し、増幅させ、対応する突然変異ｔ− ＰＡを使用のために分離した。

実施例４ｔ−ＰＡ炭水化物構造の特性化ｔ−ＰＡのアミノ酸配列は４つの可能なＮ−結合グリコシル化部位［Ａｓｎ−Ｘ −５ｅｒ／Ｔｈｒ；　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４Ｌ　６７３（１９７２）］を含有する。これらはアスパラギン残基１１７．１８４．２１８および４４８である［Ｎａｔｕｒｅ　３０１．２１４（１９８３）］。しかしながら、位置２１８はｔ−ＰＡ内ではグリフシル化されていないことが分かった。１８４位はＩ型ｔ−ＰＡ内ではグリフシル化されているがＩＩ型ｔ−ＰＡ内ではグリコジル化されていない［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３＋３７０１（１９８４）コ。

プロナーゼ消化ｒｔ　−Ｐ　Ａのゲル−ろ過クロマトグラフィーによって２クラスのＮ−結合オリゴ糖が分離した（下記表１）。より高分子量の物質の組成はフコシル化複合型（フンブレックス型）オリゴ糖と一致した。低分子量物質の組成は小さい、高−マンノースオリゴ糖に関する予測組成を有していた（おそら＜　ＭａｎｓＧ　ｌｃＮ　Ａ　ｃｔ）。高マンノースオリゴ糖の付着部位は特異性の異なるグリコシド酵素を用いて決定した。用いた酵素はエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（エンドＨ；Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｉ　ｎｃ、　）、これは高マンノースオリゴ糖を除去するが、複合型オリゴ糖には影響を及ぼさない、およびペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎ−グリカナーゼ；　Ｇ　ｅｎｚｙｔｎｅ。

Ｉｎｃ、）、これは高マンノースオリゴ糖と複合型オリゴ糖の両者を除去する、である。これらの実験に用いたｔ−ＰＡはプラスミンによって２本鎖型に変換した後、還元し、カルボキシメチル化されていた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによって還元カルボキシメチル化２本鎖ｒｔ−ＰＡは■型クリングル（１１７および１８４位がグリフシル化）、ＩＩ型ツクリングル１１７位がグリコジル化）およびプロテアーゼ（４４８位がグリコジル化）に分割された。ｔ−ＰＡのＮ−グリカナーゼ消化によってクリングルバンドがＩＩ型ツクリングルりもやや大きい移動度の位置に合体し、プロテアーゼの移動度も増加した（第２図レーン２）。ｔ−ＰＡのエンドＨ消化によって各クリングルバンドの電気泳動的移動度が増大したが、プロテーゼバンドには影響しなかった（第２図レーン４）。エンドＨの結果はＩ型およびＩＩ型ツクリングルそれぞれ高マンノースオリゴ糖を含有していることを示唆するものであり；これはＩ型およびＩＩ型の両者のクリングルにおけるグリコジル化位置である残基１１７位でなければならない。エンドＨ処理によってＩ型クリングルがＩＩ型ツクリングル変換されることはない；従って、■型クリングルのグリコジル化位置であってＩ■型ツクリングルそれでない残基１８４は複合体なオリゴ糖を含有する。Ｎ−グリカナーゼ処理によってｒｔ　−ＲＡのプロテアーゼ部分の移動度は増大するがエンドＨは影響を及ぼさないことから、４４８位もまた複雑な構造を持つに相違ない。

表Ｉプロナーゼ消化ｔ−ＰＡから得たオリゴ糖画分の炭水化物組成コンプレックス型 ’　１．０　３．０　２．８　４．２　２．４高−マンノース型″０．６　６．２　微量　２．ＯＯ略語：Ｆｕｃ−フコース、Ｍａｎ＝マンノース、Ｇａ１−ガラクトース、Ｇ１ｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｓ　ｉａ＝ミニシアル＝りオバルビッール酸アッセイｃ；３マンノースについて標準化ｄ：　２ＧｌｃＮＡｃについて標準化エンド−β−Ｎ−グルコサミニダーゼ　Ｈ（エンドＨ）をＧ　ｅｎｚｙｍｅ社から購入した。エンドＨは高マンノース型のＮ−結合オリゴ糖を除去するが複合型オリゴ糖には影響しない。レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、＼ａｔｕｒｅ　２２７　、　６８０（１，９７０））の記載に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子０．８ｚｇ（ＥＰＡ９３６１９、前掲、記載の方法に従って調製された）（０，０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有０．２Ｍりん酸アルギニン、ｐＨ６，０からなる処方（４ｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）バッファー中０．　２ｚＱ）をエンドＨ（２５ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ６，０，０５１１２中０．１単位）およびナトリウムアジド（０，０２％）と混合した。試料を３７度で２０時間インキュベートした。エンドＨ溶液の代わりにりん酸ナトリウムバッファー（２５開のものＯ，ｏｓｚのを用いるほかは同様の方法でヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子対照試料を調製し、インキュベートした。インキュベーション後、処方バッファーで全量０．７５ＲＱに希釈し、同じ処方バッファー中で十分に（広範に）透析した。試料をろ過（０，４ミクロンＨＶフィルター、Ａｍ１ｅｏｎ）Ｌ、４度で保存した。

還元およびカルボキシメチル化の後、５ＤＳ−ＰＡＧＥで脱グリコジル化をモニターした。このようにして調製したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の一部（処方バッファーｏ、ｏｔｘｃ中、０゜○５　ｒｌｇ）を２５＋１１Ｍりん酸ナトリウムｐＨ６（０，０１５＋Ｑ）および２０ＬＩＩＭジチオスレイトール含有２Ｘレムリ試料バッファー（０，０２５駁）と混合した。試料を９５度で５分間加熱し放冷した。ヨウ化酢酸（ＩＮ　ＮＨ，ＯＨ中、０．６７Ｍ溶液０．０１５貫のを加え、試料を暗所で３時間、室温でインキュベートした。還元し、カルボキシメチル化した試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

この分析では、未処理の対照２本鎖ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子がＩ型クリングル（１１７および１８４位のグリコジル化）、ＩＩ型ツクリングル１１７位のグリコジル化）およびプロテアーゼ（第１図レーン１）に対応する３本の主要バンドに分解された。

ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のエンドＨ消化によって各クリングルバンドの電気泳動における移動度が増大したが、プロテアーゼバンドは影響を受けなかった（第１図レーン２）。エンドＨ処理ｔ−ＰＡの中性およびアミノ糖組成を表２に示す。エンドＨ処理によってモルあたりのマンノース含量が５．６残基少なくなり、Ｎ−アセチルグルコサミン含量がモルあたり０．　９残基少なくなった。

この結果は１１７位からの高マンノースオリゴ糖の化学量論的除去に一致する。

エンドＨ処理ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の線維素溶解（分解）活性をインビトロの血餅溶解アッセイ［コレンら（Ｃｏｌｌｅｎ。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、　２１．　７０５（１９６８）］によって分析した。

エンドＨ処理ヒト、ＩＪＩＩ型プラスミノーゲン活性化因子の活性はこのアッセイにおける未処理対照のそれと差異なかった。

ヒト組織型プラスミノーゲン試料をヨードピーズ法［マークウェル（Ｍａｒｋｗｅｌｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２５．　４２７（１９８２）］で比活性約２μＣｉ／μｇまで沃素化した。用いたバッファーは、全て０．２Ｎアルギニン、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ６，０および０゜Ｏ１％Ｔｗｅｅｎ８０である。

沃素化に先立って全試料をこのバッファーに対して透析した。沃素化の前にバッファーのｐＨをＴｒｉｓ塩基で８．２に調節した。沃素化混合物をｐＨ６，ｏバッファーで平衡化したＰＤ−１０カラム（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）に通し、空げき容量からの放射活性画分を分取し、５ＤＳ−ＰＡＧＥを行い乾燥ゲルをオートラジオグラフィーにかけた。標識（ラベル）ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のオートラジオグラフィーにより９５％以上の放射活性が組織型ヒトプラスミノーゲン活性化因子に取り込まれたことが分かった。

各標識ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を非標識物質と、１：２００の比率（標識化：非標識化；　Ｗ／Ｗ）で混合し、耳の動脈カテーテルを挿入したウサギにポーラス注入した。各ウサギは１　ｘｇ／ｋｇの非標識ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子と１０μＣ４／ｋｇの標識ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を与えられた。非標識ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子は、治療有効濃度の達成とクリアランス経路において濃度に依存して起こり得る薬物動力学の変化を避けるために、標識ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の担体として用いられた。２６分間にわたって一連の動脈血試料を採取し、直ぐにＤ　− ｐｈｅ　−ｐｒｏ　−ａｒｇ−りｏｏメチルケテン（ＰＰＡＣＫ）およびＥＤＴＡの終濃度がそれぞれ１μＭおよび４．３ｍＭである凍結乾燥混合物を含有する試験管に入れた。試験管を氷上に置き、血漿を分離した。各血漿試料中のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿可能性（無傷のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子）および全放射活性を測定した。また、免疫反応性のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子をポリクローナル抗体を用いるサンドイッチＥＬｒＳＡ法で測定したところ、少なくとも３０ｎｇ／ｘＱの有効感度（感受性）を有していた。

血漿の濃度タイムツースデータを、残余（ｒｅｓ　１ｄｕａｌ）の方法を用いる相互作用曲線ストリッピング法″［ギバルデイら（Ｇｉｂａｌｄｉ、Ｍ、　）、　ＰｈａｒＩＩｌａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、２ｎｄ　ｅｄ、　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、　、ｐｐ、　４３３−４４４（１９８２）コを用いた、ポーラス注入の為の２コンパートメントモデルに適合させた。以下の指数等式を用いた。

ここで、Ｃｐは任意の時間、ｔ、における血漿中ｒｔ−ＰＡ濃度、ＡおよびＢは、それぞれ、傾きαおよびβを有する速いおよび遅い、クリアランス相のｙ切片である。αおよびβ相のｔ１１＊は１ｎ２／傾斜の比から計算した。曲線ストリッピング法の結果を、ＰＣＮ０ＮＬＩＮＥを用い、二元指数モデルにデータをあてはめる上での初期近似に用いた。１セツトのデータはＰＣＮ０ＮＬＩＮＥを用いてあてはめることができず（第４図）、従って、曲線ストリッピング法で得たデータを用いた。Ｃｏ、時間Ｏにおける血漿濃度をＡおよびＢの合計とした。Ｖｏは用ｆｉ　／　Ｃｏからめた。曲線下方の面積（ＡＵＣ）は式：％式％により決定した。いずれの場合でも、外挿面積は全ＡＵＧの２０％以下であった。次いで、ＡＵＧを用いて式：クリアランス経路量／ＡＵＧからクリアランスを算出した。アルファおよびベータ相の相対的寄与度を下記式に従って計算した。

％ＡＵＣα＝［（Ａ／α）／Ａ　Ｕ　Ｃコｘｉｏ。

％ＡＵＣβ＝［（Ｍβ）／ＡＵＣコ×　１００表２のデータは中央コンパートメントからの直接の消失（Ｋｌ−）および末梢フンバートメントにおける平衡化（Ｋｌ！およびＫｆ＋）を用いるモデルとよく適合していた。

ウサギを用いたインビボでのクリアランス研究から２つのタイプのデータが得られた。１つは免疫反応性のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子に由来し、非標識物質のクリアランスの目安となるものである。他のタイプのデータはＴＣＡ沈殿可能放射活性であって、これは９５％以上の無傷なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を表している。免疫反応性およびＴＣＡ沈殿可能計数からの血漿濃度二時間曲線は、適当な多重指数モデルに適合しており、導かれた所望の薬動力学パラメーターを比較した。

実施例６組換ｔ−ＰＡ（０，２Ｍアルギニンホスフェート緩衝液、ｐＨ６、中ｌｘｇ／ｘ１２）を、水浴中で冷却した。過ヨウ素酸ナトリウムを１０ｍＭの濃度にまで加え、混合物を暗所で１時間４℃に置いた。グリセロール（１００ｍＭ）およびエタノールアミン（５０＋ｎＭ）を加えて反応を止めた。この試料をｐＨ６のアルギニンホスフェート緩衝液に対して十分に透析し、０．２２ミクロンのフィルター（Ｍ　ｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ）で濾過し、４°Ｃで保存した。過ヨウ素酸ナトリウムは、ビシナル水酸基を有する炭水化物残基を酸化する。ｒｔ−ＰＡの３つのグリコジル化部位全てのＮ−結合オリゴ糖は、過ヨウ素酸酸化を受ける残基を含んでいる。ｒｔ−ＰＡおよび過ヨウ素酸酸化したｒｔ　−Ｐ　Ａの中性およびアミノ糖組成を表２に示す。期待した通り、フコースは過ヨウ素酸塩の作用により完全に破壊された。マンノース含量の低下は、１１７位の高マンノースオリゴ糖の末端残基および１．８４および４４８位の複合オリゴ糖の２−結合残基の破壊と合致していた。ガラクトースレベルの低下がいくらか観察された。これは、末端のガラクトース部分の酸化の結果であろう（即ち、シアル酸で置換されていないもの）。

還元およびカルボキシメチル化を伴わないアミノ酸分析の結果、システィン残基は過ヨウ素酸処理によりシスティン酸に酸化されないことがわかった。還元およびカルボキシメチル化の後、ｌｎＭのｒｔ−ＰＡ当たり３４．２ｎＭ（期待値は３５）のカルボキシメチルシスティンが過ヨウ素酸処理した試料から回収された。過ヨウ素酸処理したｒｔ−ＰＡ中のメチオニンの回収は５．ＯｎＭ中わずかに０．９ｎＭであ１バ未処理のｒｔ　−Ｐ　Ａは２．５ｎＭの値を示した。しかし、還元とカルボキシメチル化により、メチオニンの回収は、過ヨウ素酸処理および未処理の物質に対し、それぞれ３．３および２．８ｎＭに増加した。この結果は、処理試料中にメチオニンスルホキシドが存在することを示しているようである。過ヨウ素酸処理したｒｔ−ＰＡおよび未処理のｒｔ　−Ｐ　Ａ間には、他のアミノ酸の回収において有意な差は見られなかった（データは示していない）。

過ヨウ素酸塩による処理は、ｒｔ−ＰＡの活性に有意な変化を与えなかった。過ヨウ素酸処理したｒｔ−ＰＡの比活性は、イン・ビトロにおける血餅溶解分析（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、ら、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、２１ニア０５　７０７［１９６８コ）により測定した結果、対照ｒｔ−ＰＡＯ比活性の９１％であった。

チャイニーズハムスター・卵巣クローン１５Ｂ細胞（Ｇｏｔｔｌｅｉｂ。

Ｃ１ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５０＋３３０３　３３０９［１９７５］）を、組織プラスミノーゲンアクティベーターおよびジヒドロ葉酸リダクターゼをコードしているプラスミド（ヨーロッパ特許出願公開第０９３６１９号に記載されているｐＥＴＰＦＲ）およびｐＳＶＥＮＥＯＢａｌ　６（ヨーロッパ特許出願公開第１６０４５７号）（ネオマイシン耐性を与えるタンパクを発現する）でコトランスフェクトする。

クローン１５Ｂは、酵素、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩ　（Ｇｏｔｔｌｅｉｂ、　Ｃ，ら、上掲）を欠失しているＣ）（Ｏ細胞変異体である。ＣＨＯ１５Ｂ細胞へのコトランスフェクションは、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂのリン酸カルシウム共沈澱法の変法による（Ｇ　ｒａｈａｍ、　Ｆ　、およびＶａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ、、　Ａ、Ｖｉｒｏｌｏｇ）’　５２　：　４５６−４６７［１９７３］）。プラスミドＤＮＡ（２，５μｇ）をリン酸カルシウムで共沈澱させ、３時間で１０６細胞に導入した。次いで、細胞を２０％グリセロールで６０秒間処理し、非選択培地を加えた。

２日後、細胞を継代し、選択培地（Ｇ４１８を含むＨａｍＦ１２−ＤＭＥＭ）を加えた。細胞を３週間増殖させ、４個の６０ｎｍ皿に入れて継代した。８０％全面成長に達した時、この細胞に別の選択培地（Ｇ１５０．１００、または２５０ｎＭメトトレキセートを含むＨａｌｌＦ−１２ＤＭＥＭ）を加えた。２週間後、細胞を制限希釈法により９６ウ工ル皿にクローンした。個々のウェルのｒｔ　− Ｐ　Ａを酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）で分析した。ｒｔ　−Ｐ　Ａを生産するウェルを２４ウ工ル皿中、完全成長になるまで増殖させ、５００，１０００．３０００、および１１００００ｎのメトトレキセートを加えて更に増幅させた。３ｏ００および１１００００ｎメトトレキセートに増幅した１つのクローンを選択し、突然変異ｒｔ−ＰＡの生産用に増殖させた。ｒｔ　−Ｐ　Ａを亜鉛牛レートセファロース（キレートセファロース、Ｐ　ｈａｒｍａｃ　ｉａ）、および野生型ｒｔ　−Ｐ　Ａに対して惹起した固定化ウサギポリクローナル抗体を使って精製した。野生型ｒｔ　−Ｐ　Ａに類似した比活性を、色素基質Ｓ　２２５１　（Ｋａｂｉ）およびポリクローナルに基づ＜ＥＬＩＳＡを使って測定した。

３個のグリコジル化部位全てに高マンノースオリゴ糖を有するｒｔ−ＦＡの試料を、ＣＨ０１５Ｂセルライン中でｔ−ＰＡ遺伝子を発現させることによって調製した。１５Ｂセルラインは酵素、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩを加工する糖タンパクを欠失しており、その結果、複合型Ｎ−結合オリゴ糖を合成することができない。１５Ｂセルライン中で生産されたｒｔ−ＰＡの中性およびアミン糖組成は、３個のグリコジル化部位全てに高マンノースオリゴ糖が存在することと一致した（表２）。

表２　修飾ｒｔ　−Ｐ　Ａの炭水化物組成残基ｌ′（モル１モルｒｔ−ＰＡ）Ｆｕｃ　Ｍａｎ　Ｇａｌ　ＧｌｃＮＡｃエンドＨｂ　対照群　２．４　９．１　４．５　７．１処置群　２．２　３．５　４．５　６．’２過ヨウ素酸塩　対照群　２．２　９．２　３．６　８．９処置群　−４，４１，９８，９高マンノ一ス突然変異体’　１．５　１６．２　０．９　６．Ｏａ　略記号；Ｆｕｃ＝フコース、ＭＢｎ＝７ンノース、Ｇａ１＝ガラクトース、ＧＬｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルフサミン。

ｂ　ガラクトースを標準とした。

ＣＧｌｃＮＡｃを標準とした。

実施例８組織型プラスミノーゲンアクティベーター変異体の動力学エンドＨおよび過ヨウ素酸塩により修飾したｒｔ　−Ｐ　Ａの血漿中経時変化を第４図に示す。この両方の処置は、ｒｔ　−Ｐ　Ａの消失を遅延させるようである。過ヨウ素酸塩処理したｒｔ　−Ｐ　Ａにだけｔ　１／２αに有意な増加があった。エンドＨおよび過ヨウ素酸塩処理したｒｔ−ＰＡは、両者とも対照ｒｔ　−Ｐ　Ａより消失速度が遅（、それぞれ１゜９および２．７倍であった。エンドＨ処理と過ヨウ素酸塩処理のｒｔ−ＰＡの消失速度の間には、有意差があった（Ｐ＜０．００５）。Ｖ。

またはｔ　１／２　βには、有意な差がなかった（表３）。

ｒｔ−ＰＡのその他の修飾体は上記の手法で動力学を測定できるほどの量がなかったので、それらの動力学的特性はヨウ素化法によって測定した。この方法の１つの制限は、標識または非標識型のｒｔ　−ＰＡの除去が異なっていることである（第７図）。免疫反応性およびＴＣＡ沈降可能カウントは、約９０％の非標識量が消失するまで同一のパターンで減少する。その後、このカーブは分岐し、標識ｒｔ　−ＰＡはより遅（消失する。これらの２つのカーブからの動力学的パラメーターを表４に示す。ｖＯｌｔ　１／２αおよびｔ　１／２βの値には有意な差がないが、消失速度並びに％ＡＵＣαおよび％ＡＵＣβの相対的サイズには有意な差が見られる。

放射活性標識したｒｔ−ＰＡの動力学的分析により、先に示された消失の差を予測し得るかどうか調べるために、エンドＨおよび過ヨウ素酸塩処理したｒｔ−ＰＡを標識し、それらの動力学を測定した。

標識したｒｔ−ＦＡは常に、１ｍｇ／ｋｇの非修飾ｒｔ−ＰＡと共に注入した。

修飾ｒｔ−ＰＡからのＴＣＡ沈降可能カウントの消失パターンを第８図に示す。

全てのグリコジル化部位に高マンノースオリゴ糖構造を持つ、ＣＨＯＩ、５Ｂセルラインで生産したｒｔ−ＰＡもこの実験に含めた。４種のｒｔ−ＰＡは全て、類似した初期分散容量を持っていた。第４図に示すように、エンドＨおよび過ヨウ素酸塩処理したｒｔ−ＰＡは、対照ｒｔ　−Ｐ　Ａより消失速度が小さい。エンドＨおよび過ヨウ素酸塩処理したｒｔ−ＰＡの消失パターンにおける優勢的な変化は、ここでもやはり、αおよびβ相の相対的サイズにあるようである。ＨＭｒｔ−ＰＡの消失速度は、約２倍大きかった。ＨＭｔ−ＰＡの消失における最も実質的な変化はアルファ相半減期の減少によると思われる（表５）。

１１７位アミノ酸の高マンノースオリゴ糖のエンドＨによる除去および過ヨウ素酸塩による酸化は、動力学において類似の変化を起こすようである。従って、Ｇ１ｎ＋＋７変異体を、ｒｔ−ＰＡの消失に及ぼす１１７位アミノ酸のグリコジル化の役割を調べるためのもう１つの手段として用いた。第５図は、この変異体が、消失速度の遅いｒｔ−ＰＡの他の形のものと同様に挙動することを示している。

ＧＩｎ＋＋、の消失速度は対照より２倍小さく、より特徴的なベーター相へのシフトが見られる。Ｖｏ、ｔ　１／２アルフアおよびｔ　１／２ベーターには有意差は観察されなかった。

グルタミン＋＋ｔｔ　ＰＡおよび対照ヒトｔ−ＰＡの動力学を第５図に示す。グルタミン＋＋ｙｔ　ＰＡは対照よりもずっと遅く消失する。

第６図に示す様に、実施例３で記載した方法により作成されたグルタミン、１．グルタミン酸ｚｔｓｔ　ＰＡも同様の挙動を示す。

フィブリン結合特性フィブリン結合は、イン・ピボにおいてヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子が示すフィブリン特異性に多分直接関係している非常に重要な因子である。エンドＨヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のフィブリン結合を２つの方法で評価した。最初の方法は、標準的な微量滴定器のウェルに被覆したフィブリンによるヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の捕獲を利用するものである。それぞれのウェルを洗浄し、プラスミノーゲンおよびプラスミン用色素基質（Ｓ−２２５１、Ｋ　ａｂｉ）を含む溶液を加える。発色した色は、初期段階で捕獲されたヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の量に比例している（Ａｎｇｌｅｓ−Ｃａｎｏ、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓラスミノーゲンを含まないフィブリ／−ゲンとヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を含む溶液にトロンビンを加えた時、溶液中に残存するヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の量を測る方法である（Ｒ１ｊｋｅｎら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２５７．２９２０（１９８２））。修飾されたヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子のフィブリン結合のイン・ビボにおける結果をどちらの分析法が適切に予測するかは、現在のところ不明である。それぞれの分析データに基づき、本発明者らは、エンドＨ処理したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子は、フィブリン特異性が改善されていないとしても、少なくとも変わっていないと結論することができる。

同様に、実施例３のグルタミン１１？グルタミン酸ｘｔｓｔ　ＰＡのフィブリン結合試験結果は、グルタミン、１７グルタミン酸＊ｔｓｔ　ＰＡはグルタミン酸ｔ？ｓと類似しており、フィブリン刺激および比活性においてｔ−ＰＡ対照よる優れていることを示している。

実施例９ｔ−ＰＡ変異体Ｇ　ｌｎ＋＋ｔＭｅｔ＋＋ｓの線維素溶解活性Ｇｌｌ’ｌ１１？およびＭ　ｅ　ｔ　、Ｉ＊および実施例１および２に記載の変異体をそれぞれ、線維素溶解活性について試験すると、前記のエンドＨ処理物質と同様の結果を得る。それぞれの動力学も、前記の対照ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子と比較した場合、エンドＨ処理物質のそれと同様である。

本発明の化合物は、既知の方法に従って製剤化し、医薬として有用な組成物を調製することができる。この場合、本発明のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子産物は、医薬的に許容し得る担体媒体と混合する。好適な媒体およびその製剤化（他のヒトタンパク、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐ　ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｂｙ　Ｅ、Ｗ、Ｍａｒｔｉｎに記載されている（この文献は、本明細書の一部を構成する）。この様な組成物は、有効量の本漁明のタンパクを、患者に有効に投与するのに適した医薬的に許容し得る組成物を調製するための適当量の媒体と共に含んでいる。

例えば、本発明のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子は、心臓血管系の病気または症状を呈している患者に非経口投与することができる。投与量および投与速度は、他の心臓血管系薬剤、線維素溶解剤の臨床試験に最近使用されている量と同様であってよく、例えば心筋梗塞、肺動脈塞栓症などの患者に１．５〜１２時間かけて静脈内投与または動脈内投与される量、即ち約１〜２ｘｇ／ｋｇ体重であってよい。

適当な投与形態の１つの例は、５０ｘｇのヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子、アルギニン、リン酸およびポリソルベート８０を含んでいるバイアルを５０戚の注射用滅菌水で再構成し、適量の０．９％注射用食塩水と混合することである。

半減期が延長した、あるいは減少したヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子は、敏速な静脈注射に適している。これは複雑な投与法を必要としないので、救急隊員を乗せた救急車のような医療設備の不完全な環境においてｔ−ＰＡを使用する機会を増すことになろう。ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の半減期が増大することにより、低い、より安全な初期投与量を可能とし、４５分あるいはそれ以上線維素溶解活性を有するプラスミンレベルを維持することが可能となろう。ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の半減期が長くなることはまた、迅速な線維素溶解に成功した後の再閉塞を避けるために必要な低用量の長期の治療に有用であり、また、末梢血管の閉塞の場合に必要となる長期の血栓溶解にも有用であろう。

ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の半減期が減少したものは、有効濃度のプラスミンを短期間与えることにより、線維素溶解治療を行うのが望ましいある種の患者に好適である。

以上、特定の好ましい態様について記載したが、本発明はそれらに限定されるものではない。当業者には、ここに開示した態様に種々の修飾を加えることができること、およびその様な修飾は本発明の範囲内に含まれることは容易に理解されよう。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）実質的に完全な生物活性を保持しており、ｂ）修飾された炭水化物構造を有し、ｃ）イン・ビボにおいて変化した半減期を示すヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
２．炭水化物構造が、１またはそれ以上の機能的炭水化物構造の削除により修飾されている、イン・ビボにおいて増大した半減期を示す請求項１に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
３．炭水化物構造が、アミノ酸１１７の機能的炭水化物構造の削除により修飾されている、イン・ビボにおいて増大した半減期を示す請求項２に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
４．１１７位にアスパラギン以外のアミノ酸を含んでいる請求項３に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
５．１１９位にセリンまたはスレオニン以外のアミノ酸を含んでいる請求項３に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
６．１１７位にグルタミンを含んでいる請求項３に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
７．１１９位にメチオニンを含んでいる請求項３に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
８．１１８位にプロリンを含んでいる請求項３に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
９．１本鎖ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子である請求項３に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
１０．１１７位にグルタミンを、２７５位にグルタミン酸を含んでいる請求項９に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
１１．炭水化物構造が、アミノ酸１１７、１８４および４４８位の機能的炭水化物構造の除去により修飾されている、イン・ビボにおける半減期が増大している請求項２に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
１２．炭水化物構造が、アミノ酸１８４および４４８位が高マンノースオリゴ糖の置換により修飾されている、イン・ビボにおける半減期が減少している請求項１に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体。
１３．請求項１に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体と医薬的に許容し得る担体との混合物からなる医薬組成物。
１４．請求項２に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体と医薬的に許容し得る担体との混合物からなる医薬組成物。
１５．請求項１２に記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体と医薬的に許容し得る担体との混合物からなる医薬組成物。
１６．ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の炭水化物構造を修飾することからなる、実質的に完全な生物活性を保持し、イン・ビボにおける半減期が変化しているヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体の製造方法。
１７．修飾が１またはそれ以上の炭水化物構造の削除からなる請求項１６に記載の方法。
１８．削除された機能的炭水化物構造がアミノ酸残基１１７位にある請求項１７に記載の方法。
１９．削除された機能的炭水化物構造がアミノ酸残基１１７、１８４および４４８位にある請求項１７に記載の方法。
２０．修飾がアミノ酸１８４位および４４８位における高マンノースオリゴ糖の置換によるものである請求項１６に記載の方法。
２１．１１７位にアミ／酸アスパラギンをコードしているコドン以外のコドンを有するか、または１１９位にアミノ酸セリンおよびスレオニンをコードしているコドン以外のコドンを有する、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体をコードしているＤＮＡを、組換ＤＮＡ細胞培養中で発現させることによりヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子変異体が生産される請求項１８に記載の方法。
２２．１１７位のコドンがグルタミンをコードしている請求項２１に記載の方法。
２３．１１９位のコドンがメチオニンをコードしている請求項２１に記載の方法。
２４．１１７位のコドンがグルタミンをコードしており、２７５位のコドンがグルタミン酸をコードしている請求項２１に記載の方法。
２５．ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を、炭水化物構造を変化させる試剤で処理することにより炭水化物を修飾する請求項１６に記載の方法。
２６．試剤が酵素である請求項２５に記載の方法。
２７．酵素がエンドＨである請求項２６に記載の方法。
２８．試剤が過ヨウ素酸塩である請求項２５に記載の方法。
２９．該プラスミノーゲン活性化因子をコードしているＤＮＡで、複合炭水化物置換分を有する糖タンパクを形成し得ない哺乳動物細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培養し、細胞培養から該変異体を回収することからなるヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を生産する方法。
３０．宿主細胞が、酵素Ｎ−アセチルグルコサミンアミノトランスフェラーゼを欠失している請求項２９に記載の方法。