PT733059E

PT733059E - Compostos e metodos para mutacoes dirigidas ao local em celulas eucarioticas

Info

Publication number: PT733059E
Application number: PT95905337T
Authority: PT
Inventors: Eric B Kmiec
Original assignee: Univ Jefferson
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1994-12-09
Publication date: 2001-03-30
Also published as: DE69425903D1; US5871984A; NZ278490A; CN1117866C; DK0733059T3; WO1995015972A1; EP0733059A4; AU691550B2; CA2178729A1; AU1399595A; EP0733059A1; GR3034988T3; ES2149962T3; DE733059T1; JP3585238B2; JPH09506511A; CN1215755A; KR960706500A; CN1048254C; KR100386337B1

Description

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DESCRICÃO "Compostos e métodos para mutações dirigidas ao local em células eucarióticas"

1. CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se ao campo da genética molecular. Particularmente refere-se a compostos de ácidos nucleicos e a métodos para sua utilização para introduzir alterações genéticas específicas em células eucarióticas vivas cultivadas. Mais particularmente refere-se substancialmente a ácidos nucleicos em dúplex emparelhada segundo Watson-Crick, em que uma porção de uma cadeia em dúplex compreende nucleótidos contendo uma 2'-0-ribose ou 2'-OMe-ribose e o restante compreende nucleótidos de desoxirribose.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO 2.1 Ácidos Nucleicos em Dúplex Quiméricos e/ou Híbridos O campo do invento refere-se a ácidos nucleicos. Os ácidos nucleicos são heteropolímeros, i.e., polímeros de subunidades diferentes, que são ligadas por ligações fosfodiéster orientadas ou derivadas destas, em polímeros. Os ácidos nucleicos em dúplex são ácidos nucleicos em que cada base de uma primeira cadeia da dúplex corresponde a uma base de uma segunda cadeia da dúplex de acordo com o esquema em que uracilo ou timina e adenina correspondem e citosina e guanina correspondem. Cadeias em dúplex anti-paralelas possuindo estas correspondências dizem-se emparelhadas segundo Watson-Crick. Os ácidos nucleicos em dúplex podem ser de dois tipos principais, ácidos ribonucleicos e ácidos desoxirribonucleicos. Cada ribonucleótido possui um desoxirribonucleótido equivalente, p. ex., adenosina e desoxiadenosina, citidina e desoxicitidina, guanosina e desoxiguanosina, uridina e timidina. Tal como utilizado na arte, um ácido nucleico no qual estão presentes na mesma cadeia ribonucleótidos e desoxirribonucleótidos é designado um ácido nucleico misto ou quimérico (a seguir designado "quimérico"). Um ácido nucleico em dúplex no qual desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos correspondem uns aos outros é designado em dúplex híbrida. Quando duas cadeias formam uma região de ácido nucleico em dúplex que não de todas as suas bases, a molécula resultante é designada em hetero-dúplex.

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Muito frequentemente, as duas cadeias de um ácido nucleico em dúplex não estão ligadas covalentemente mas estão associadas apenas através de emparelhamento de Watson-Crick. No entanto, as duas cadeias de uma dúplex podem estar ligadas através de um oligonucleótido para formarem um único polímero. O oligonucleótido de ligação não está emparelhado segundo Watson-Crick. A hetero-dúplex em que a primeira e a segunda cadeias são porções de um único polímero é designada uma "dúplex em gancho" ou uma estrutura de "caule e volta" ("stem and loop"). Aqui será utilizado o primeiro termo.

Tal como aqui se utiliza, quimerismo é uma propriedade de um polímero de ácido nucleico e hibridismo é uma propriedade de uma dúplex. Por exemplo, um ARNm e o seu molde formam uma dúplex híbrida embora nenhum seja quimérico, enquanto que, por exemplo, os octanucleótidos quiméricos 5'd(TTTT)-r(CCCC)3' e 5'r(GGGG)-d(AAAA)3' formarão uma dúplex de Watson-Crick um com o outro mas a dúplex resultante não é uma dúplex híbrida. Um ácido nucleico em dúplex que não é uma dúplex híbrida é designado a seguir uma "homo-dúplex". A menos que especificamente indicado em contrário, um ácido nucleico em homo-dúplex refere-se apenas a uma dúplex contendo um desoxinucleótido. Finalmente, observe-se que os peritos na arte se referem à formação de uma dúplex de Watson-Crick como "hibridação", mesmo quando não existem ácidos nucleicos em dúplex híbrida.

Os interessados na estabilidade de ácidos nucleicos em dúplex híbrida sintetizaram oligonucleótidos quiméricos possuindo uma conformação de "gancho" e 12 pares de bases em dúplex híbrida. Roberts, R.W. & Crothers, D.M., 1992 Science 258: 1463. Os interessados no estudo da estrutura de ácidos nucleicos em dúplex, quiméricos e/ou híbridos, através de difracção de raios X e de RMN bidimensional sintetizaram ácidos nucleicos quiméricos e ácidos nucleicos em dúplex híbrida para os utilizarem nos seus estudos. Ver, p. ex., Salazar, M., et a/., 1994, J. Mol. Biol. 241: 440-55 e Egli, M., et a!., 1993, Biochemistry 32: 3221-37 (em dúplex híbrida, quimérico, de duas cadeias na forma de r3d7.d10); Ban, C., et a/., 1994, J. Mol. Biol. 236: 275-85 (em dúplex híbrida, quimérico, auto-complementar na forma de d5r,d4); Chou, S.H., 1991, Biochemistry 30: 5248-57 (em dúplex híbrida, quiméricos, auto-complementares e não auto-complementares na forma de d4r4d4). As cadeias complementares destes ácidos nucleicos em dúplex não estavam

84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 3 ligadas covalentemente uma à outra; estavam associadas apenas através de emparelhamento de Watson-Crick.

Um segundo grupo de cientistas que sintetizaram ácidos nucleicos quiméricos são os interessados no estudo e utilização de ribozimas, i.e., moléculas de ARN que são auto-clivantes ou que clivam outros ARN. Perreault, J.P., et al., 1990, Nature 344: 565; Taylor, N.R., et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 4559-65; Shimaya, T., 1993, Nucleic Acids Research 21: 2605. Estas investigações verificaram que as ribozimas quiméricas são activas e são mais resistentes à digestão por nucleases que as ribosimas de ARN. As ribozimas quiméricas são auto-complementares, i.e., as cadeias emparelhadas segundo Watson-Crick estão ligadas covalentemente. Os compostos sintetizados durante os estudos de ribozimas quiméricas diferem das moléculas em dúplex híbrida acima indicadas, que foram sintetizadas e utilizadas para estudos estruturais, por as ribozimas quiméricas não conterem dúplices híbridas estáveis. Assim, uma ribozima quimérica possuindo braços de ligação a ADN liga-se ao seu substrato e forma uma dúplex híbrida. Yang, J.H., et al., 1990, Biochemistry 29: 11 156-60. Ver também, Sawata, S., et al., 1993, Nucleic Acids Research 21: 5656-60; Hendry, P., et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 5737-41 Shimayama, T., 1993, Nucleic Acids Research 21: 2605. A ribozima catalisa a clivagem do ARN substrato e a dúplex híbrida é assim dissolvida. A substituição numa ribozima de 2'-OH-ribonucleótidos por 2'-metoxirribonucleótidos e 2'-aliloxirribonucleótidos é descrita por Paolella, G., et al., 1992, The EMBO Journal 11: 1913-1919. 2.2 Alteração Genética Dirigida ao Local em Células Eucarióticas Os peritos na arte da biologia molecular reconhecem que em frequentes ocasiões é desejada não apenas a introdução de uma nova sequência de poli(ácido nucleico), i.e., um novo gene, numa célula eucariótica alvo, mas sim a alteração de um gene definido, preexistente na célula alvo. A célula alvo pode ser utilizada em cultura ou pode ser utilizada para construir um animal transgénico.

Uma grande variedade de técnicas foi desenvolvida para a introdução de ADN em células eucarióticas cultivadas. Estas técnicas incluem a precipitação

84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 4 com fosfato de cálcio e a endocitose mediada por DEAE-dextrano, a electroporação, a fusão mediada por lipossomas e a transdução com vírus incompetentes para replicação. No entanto, embora tais técnicas possam muito frequentemente introduzir genes funcionais nas células eucarióticas, estas técnicas não realizam prontamente uma alteração (mutação) num gene existente específico. Após a introdução é isolado ADN exógeno numa posição aleatória no genoma da célula através de recombinação ilegítima, em vez de ser numa posição específica através de recombinação homóloga.

Até hoje não existe um esquema geral satisfatório para a introdução de uma alteração genética dirigida a um local ou específica para um local (mutagénese) num eucariota superior, i.e., em células de mamíferos ou de aves. WO 93/16177 para J.G. Seidman descreve técnicas para utilização de recombi-nação homóloga para introduzir ADN numa célula eucariótica sob a circunstância especial de o ADN conter um marcador seleccionável. Embora a recombinação homóloga possa ser obtida em células eucarióticas superiores através da introdução de ácidos nucleicos muito longos (> 1 kb), estas técnicas requerem a aplicação de técnicas de selecção elaboradas porque a taxa de recombinação ilegítima em eucariotas superiores excede grandemente a da recombinação homóloga. Thomas, K.R. & Capecchi, M.R., 1987, Cell 52: 503. Ver, também, Valancius, V. & Smithies O., 1991, Mol. Cell Biol. 11: 4389 (comparação da recombinação homóloga de plasmídeos linearizados e de plasmídeos super-enrolados em células eucarióticas).

Uma abordagem para alcançar uma mutagénese predominantemente dirigida ao local foi a introdução de oligodesoxinucleótidos em cadeia simples directamente na célula. Estas técnicas foram empregues com sucesso na levedura Saccharomyces cerevisiae, na qual a recombinação homóloga é significativamente mais activa que em eucariotas superiores. Moerschell, R.P., et a!., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 524-28; Yamamoto, T., et aí., 1992, Yeast 8: 935-48. No entanto, até hoje não houve relatórios da transformação com sucesso de células de mamíferos ou de aves através de oligonucleótidos em cadeia simples.

Uma relação entre a estrutura do ADN alvo e a taxa de recombinação homóloga em células de mamífero pode ser inferida através de estudos que mostram que regiões de bases de purina e de pirimidina alternadas, i.e., 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ

demonstrados em estudos de plasmídeos não replicantes em células de mamífero cultivadas. Wahls, W.P., et a!., 1990, Mol. Cell Biol. 10: 785-93. Estas experiências não chegaram a demonstrar recombinação entre um ácido nucleico exógeno e o genoma da célula.

Foram feitas tentativas para utilizar RecA, uma proteína que promove a recombinação homóloga nas bactérias, E. coli, para promover a recombinação homóloga em células eucarióticas. No entanto, estas tentativas não tiveram um sucesso claro. Por exemplo a Patente U.S. No. 4950599 de W. Bertling divulga uma taxa muito reduzida de mutação dirigida ao local e nenhum aumento na taxa de recombinação homóloga através da utilização de RecA em células eucarióticas. As publicações de patentes WO 93/22443 de D. Zarling e E. Sena e a publicação 94/04032 de D.C. Gruenert e K. Kunzelmann dão ambas a entender corrigirem um defeito genético numa linha celular cultivada relacionado com a fibrose quística. Estas publicações divulgam principalmente dados experimentais que demonstram o princípio em vez de dados relacionados com exemplos de métodos operativos. Assim, para introduzir o acesso de complexos polinucleótido/RecA ao núcleo, Zarling e Gruenert empregam células cuja membrana foi permeabilizada, embora tais células sejam incapazes de continuarem a crescer. Além disso, mesmo quando foi afirmado que a recombinação homóloga promovida por RecA tinha lugar em células intactas, estas publicações não proporcionaram estimativas quantitativas da sua frequência. Assim, não se mostrou convincentemente que a utilização de RecA procariótica resultasse numa taxa de recombinação homóloga em qualquer célula eucariótica viável significativamente maior que a taxa expontânea de recombinação homóloga. O presente invento proporciona um ácido ribo-desoxirribonucleico misto possuindo no máximo uma extremidade 3' e uma extremidade 5', ácido nucleico que compreende ainda: (a) pelo menos uma região de bases desemparelhadas contíguas disposta de forma a que a região desemparelhada separa o ácido nucleico numa primeira cadeia e numa segunda cadeia ligadas através da referida região de bases desemparelhadas contíguas; (b) pelo menos uma região de ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick de pelo menos 15 pares de bases de comprimento, na qual as

84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 6 bases da primeira cadeia correspondem as bases da segunda cadeia; e no qual (c) a primeira cadeia compreende uma região de pelo menos três bases contendo ribose contíguas que formam uma dúplex híbrida dentro da região do ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick.

Um tal ácido ribo-desoxirribonucleico misto que compreende ainda duas regiões homólogas com uma sequência alvo e uma região heteróloga, disposta entre elas, codificando a alteração, pode ser utilizado para introduzir uma alteração predeterminada numa sequência alvo do genoma de uma célula cultivada, célula que contém um núcleo, num método que compreende a manutenção do referido ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada, pelo que a alteração é introduzida na sequência alvo. Uma célula cultivada possuindo características alteradas pode ser seleccionada. 0 presente invento proporciona ainda um composto para a introdução de uma alteração predeterminada num gene alvo, composto que é um ácido ribo-desoxirribonucleico misto possuindo uma primeira cadeia e uma segunda cadeia, em que a primeira cadeia compreende: (a) uma primeira região homóloga e uma segunda região homóloga que juntas possuem de 20 a 60 nucleótidos de comprimento, regiões que são homólogas ao gene alvo e que formam uma dúplex com a segunda cadeia, em que cada uma das referidas regiões homólogas da primeira cadeia compreende um segmento de pelo menos 4 nucleótidos contíguos que formam uma dúplex híbrida com desoxinucleótidos da segunda cadeia; e (b) uma região heteróloga, que se dispõem entre a primeira e a segunda região homóloga e possui de 1 a 20 nucleótidos de comprimento, que é heteróloga ao gene alvo e que contém a alteração predeterminada, em que o gene alvo é um gene de uma célula procariótica, que não é uma levedura nem um fungo.

Um tal ácido ribo-desoxirribonucleico misto pode ser utilizado para introduzir uma alteração predeterminada numa sequência alvo do genoma de uma célula cultivada que não é uma levedura nem um fungo, célula que contém um núcleo, num método que compreende a manutenção do referido ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada, pelo que a alteração é introduzida na sequência alvo.

84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 7 Ο presente invento proporciona também um composto para a introdução de uma alteração predeterminada num gene alvo, composto que é um ácido ribo-desoxirribonucleico misto possuindo no máximo uma extremidade 3' e uma extremidade 5', ácido nucleico que compreende ainda: (a) pelo menos uma região de bases desemparelhadas contíguas disposta de forma a que a região desemparelhada separa o ácido nucleico numa primeira cadeia e numa segunda cadeia ligadas através da referida região de bases desemparelhadas contíguas; (b) pelo menos uma região de ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick de pelo menos 1 5 pares de bases de comprimento, em que as bases da primeira cadeia correspondem as bases da segunda cadeia; e no qual (c) a segunda cadeia compreende uma região de pelo menos nove desoxirribonucleótidos que formam uma dúplex híbrida com nucleótidos da primeira cadeia, e (d) as extremidades 5' e 3' estão emparelhadas segundo Watson-Crick com as bases adjacentes de uma cadeia complementar de ácido nucleico emparelhado segundo Watson-Crick.

Este composto pode ser utilizado para introduzir uma alteração predeterminada numa sequência alvo do genoma de uma célula cultivada, célula que contém um núcleo, através da manutenção do referido ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada, pelo que a alteração é introduzida na sequência alvo. 0 presente invento refere-se a oligonucleótidos em dúplex únicos ligados covalentemente que são homólogos a um gene de interesse possuindo desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. Para efectuar uma alteração genética existem dentro da região de homologia um ou mais pares de bases não correspondentes (a seguir designados "heterólogos" ou "mutadores"). Os processos normais, constitutivos celulares dos recombinantes homólogos fazem com que os nucleótidos mutadores sejam inseridos no local genómico alvo. Os oligonucleótidos em dúplex do invento (a seguir "vectores quiméricos") podem ser utilizados para alterar especificamente um gene de interesse através da introdução no gene dos pares de bases heterólogos. Os pares de bases heterólogos podem ser pares de bases diferentes do gene de interesse, ou pares de bases adicionais aos presentes no gene de interesse (uma inserção), ou, 8 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ

finalmente, os pares de bases heterólogas podem ser a ausência de pares de bases encontrados no gene de interesse (uma deleção). O presente invento baseia-se, em parte, na verificação de que a inclusão de uma região de entre cerca de 15 e 50 pares de bases de um ácido nucleico em duplex híbrida no vector causa uma taxa grandemente aumentada de alteração do gene de interesse. Quando a região dos pares de bases heterólogos é de entre 1 e 50 pares de bases, os pares de bases heterólogos podem estar presentes nos vectores do invento como uma homo-dúplex ou como uma dúplex híbrida. Quando os pares de bases heterólogos são de mais de 50 pares de bases de comprimento é preferido que estejam presentes como uma homo-dúplex. O vector pode ser introduzido na célula alvo através de qualquer método conhecido para permitir a introdução de ácidos nucleicos em células eucarióticas. Sem limitação teórica, erê-se que o vector quimérico participe nos mecanismos de recombinação/reparação da célula alvo e que dirija a alteração do gene alvo através de conversão génica ou através de recombinação homóloga.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta uma representação esquemática de dois vectores quiméricos. Estão especificamente marcados os seguintes: 1, uma primeira cadeia; 2, uma segunda cadeia; 3, uma região heteróloga; 4, uma região homóloga; 5, um ligante; 6, um local de ligação. Código dos Símbolos para a Figura 1

dúplex híbrida (tetrâmero) DNA'

DNA homo-dúplex (tetrâmero) DNA- desemparelhado 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 9

A Figura 1Α é um vector quimérico ligado na forma R-D-R. A Figura 1B é uma vector quimérico em gancho na forma R-D-R possuindo uma extremidade 3' e 5' simples.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 5.1. Descrição dos Vectores Quiméricos do Invento O presente invento engloba ácidos nucleicos em dúplex que contêm bases contendo desoxirribose e ribose. Assim eles contêm regiões de ADN e de ARN e são portanto designados "vectores quiméricos". O 2'-0 dos ribonucleótidos do vector quimérico pode ser metilado. Qualquer fosfodiéster pode ser substituído por um fosforotiodiéster ou metifosfonodiéster.

Os vectores quiméricos do invento são um polímero de ácido nucleico simples. De acordo com isto, os vectores quiméricos do invento têm de conter pelo menos uma região de entre pelo menos 1 base e mais usualmente 3 ou 4 bases que não estão emparelhadas segundo Watson-Crick. Estas regiões desemparelhadas servem como ligantes entre as duas cadeias de bases emparelhadas segundo Watson-Crick. Em contraste com outros nucleótidos quiméricos que foram sintetizados possuindo regiões de nucleótidos desemparelhados, os vectores quiméricos não possuem actividade enzimática i.e., não catalisam reacções químicas nem sofrem eles próprios reacção química na ausência de uma fonte energética biológica tal como ATP.

As bases dos ligantes na concretização preferida são desoxirribonucleótidos. Um vector quimérico possuindo dois ligantes pode ser construído de forma a que as extremidades 3' e 5' do polímero estejam emparelhadas segundo Watson-Crick com nucleótidos adjacentes da cadeia complementar. Elas podem então ser prontamente ligadas de forma a que o vector quimérico forme um polímero de ácido nucleico circular contínuo simples.

Substancialmente todas as restantes bases do vector quimérico estão emparelhadas segundo Watson-Crick. Tal como aqui se utiliza a afirmação de que as bases estão emparelhadas segundo Watson-Crick ou de que formam um ácido nucleico em dúplex deve ser entendida significar que sob as condições apropriadas de temperatura e salinas são capazes de formar pares de bases ou 10 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ um ácido nucleico em dúplex. Deve ser entendido que em algumas condiçóeáfde baixa salinidade e/ou temperatura elevada os pares de bases de Watson-Crick podem deixar de ser termodinamicamente estáveis de forma que o ácido nucleico em dúplex funde ou desnatura. Deve também ser compreendido que um ou dois pares de bases mal emparelhados não afectam a operatividade do invento.

Os vectores quiméricos do presente invento são concebidos com o objectivo de introduzir especificamente alterações (uma mutação) num gene alvo. O local genético da alteração é determinado seieccionando uma porção do vector quimérico para possuir a mesma sequência que a (para ser homólogo à) sequência do local alvo, a seguir designada uma região homóloga. A área de diferenças entre a sequência do vector quimérico e o gene alvo é designada a região heteróloga. Note-se que o vector quimérico é heterólogo ao gene alvo, mas não é uma hetero-dúplex nesta região do vector. De acordo com a concretização preferida do invento existem duas regiões homólogas em cada vector quimérico flanqueando a região heteróloga interposta, estando as três regiões presentes num ácido nucleico em dúplex contínuo único. Ainda de acordo com o invento cada região homóloga contém uma porção de ácido nucleico em dúplex híbrida. A porção de cada dúplex híbrida pode ser de pelo menos 4 pares de bases e de preferência é de 8 pares de bases sendo ainda mais preferível de cerca de 20 a 30 pares de bases. A função do vector quimérico não é afectada por um par de bases dinucleotídico em homo-dúplex dentro de uma região em dúplex híbrida, colocado para permitir a ligação das extremidades 3' e 5' uma à outra. O comprimento total das duas regiões homólogas pode ser de pelo menos 20 pares de bases e de preferência é de entre 40 e 60 pares de bases.

De acordo com o invento, uma região de ácido nucleico em homo-dúplex pode ser disposta entre as regiões em dúplex híbrida/homóloga do vector. A homo-dúplex interposta pode conter a região heteróloga. Quando a região heteróloga tem menos de cerca de 50 pares de bases e de preferência de menos de cerca de 20 pares de bases, a presença de uma região em homo-dúplex interposta é opcional. Quando a região heteróloga excede cerca de 20 pares de bases, é preferida uma homo-dúplex interposta que contenha a região heteróloga.

84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 11 5.2. Construção dos Vectores Quiméricos do Invento

Os vectores quiméricos do invento podem ser sintetizados através de qualquer método. Os vectores quiméricos podem ser o mais prontamente sintetizados através de modificação das técnicas utilizadas na síntese de ADN em fase sólida. Caruthers, M.H., 1985, Science 230: 281-85 revisto; Itakura, K., et a!., 1984, Ann. Rev. Biochem. 53: 523-56. Modificações que permitem a síntese de ARN e de ácidos nucleicos quiméricos são divulgadas em Scaringe, S.A., et a!., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5433-41; Usman, N., et a/., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6695-99; e Swiderski, P.M., et al., 1994, Anal. Biochem 216: 83-88. Os avanços recentes em relação à síntese de ácidos nucleicos quiméricos estão revistos em Usman, N. & Cedergren, R., 1992, Trends Bioch. Sei. 17: 334-9.

Os vectores quiméricos possuindo uma região em homo-dúplex interposta entre duas regiões em dúplex híbrida podem ser construídos utilizando técnicas semi-sintéticas. Têm de ser construídos dois poli (ácido nucleico) quiméricos sintéticos possuindo uma conformação em gancho. As extremidades 5' e 3' livres dos dois ácidos nucleicos quiméricos são construídas com extremidades alternadas sobrepostas complementares à sobreposição de dois produtos de digestão por enzimas de restrição diferentes. É proporcionada uma região em homo-dúplex possuindo as extremidades complementares digeridas por enzimas de restrição. A adição de locais para uma enzima de restrição às extremidades de um fragmento de ADN clonado pode ser alcançada através de técnicas bem compreendidas pelos peritos na arte, p. ex., sem limitação, amplificação por PCR com iniciadores estendidos ou ligação em extremidades lisas de ligantes contendo o local de restrição. Os dois nucleótidos quiméricos e a região em homo-dúplex podem ser ligados através de técnicas enzimáticas convencionais. 0 produto, possuindo oligonucleótidos quiméricos ligados em ambas as extremidades pode ser separado dos substratos que reagiram de forma incompleta através de electroforese em gel de poliacrilamida a 6% em tampão de Tris Borato EDTA sob condições não desnaturantes. As moléculas lineares coroadas são constrangidas e correm em electroforese sob estas condições mais devagar.

Vectores quiméricos contendo apenas nucleótidos de ocorrência natural podem ser utilizados para o presente invento. Verifica-se, que os vectores quiméricos possuindo regiões em dúplex híbrida de cerca de 20 ribonucleótidos 12 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ são irt vitro resistentes a ARNase Η. A resistência à degradação enzimática pode ser obtida através da substituição dos ribonucleótidos por ribonucleótidos metilados em 2'-0. Adicionalmente ou alternativamente as ligações fosfodiéster do ácido nucleico podem ser substituídas por fosforotiodiésteres. Shimayama, T. et a!., Nucleic Acids Research 21: 2605. Podem também ser utilizados nucleótidos contendo arabinose. Tal como aqui se utiliza o termo ácido nucleico pretende englobar ácidos nucieicos possuindo estas modificações. 5.3. Utilização dos Vectores Quiméricos do Invento

Os vectores quiméricos do presente invento podem ser utilizados para introduzir uma mutação num local específico no genoma de uma célula alvo. A localização específica do local alvo é definida através da sua sequência nucleica a seguir designada sequência alvo. De acordo com invento é construído um vector quimérico no qual as regiões de homologia são idênticas à sequência alvo, excepto quanto à presença de algumas regiões em duplex híbrida. A alteração a ser introduzida é codificada pela região heteróloga. A alteração pode ser uma alteração de uma ou mais bases da sequência ou a adição de uma ou mais bases. Quando a alteração na sequência alvo é a adição de menos de cerca de 20 bases o invento pode ser praticado utilizando uma ou mais regiões em dúplex híbrida. Quando a alteração na sequência alvo é a adição de mais de cerca de 50 bases é preferido que a região heteróloga esteja contida dentro de uma região em homo-dúplex. A prática do invento requer que o vector quimérico seja introduzido no núcleo da célula alvo. Qualquer método que conduza a tal introdução pode ser utilizado. Tais métodos incluem electroporação, DEAE-dextrano, precipitação com CaPO*, fusão mediada por lipossomas (UPOFECTIN, Marca Registada) e injecção directa. A electroporação é particularmente adequada.

Numa concretização do invento o vector quimérico pode ser utilizado para construir animais transgénicos. O vector quimérico pode ser introduzido no pronúcleo de um óvulo através de injecção directa, de acordo com o método descrito por Brinster, R.L. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. 86: 7087; ver também Patent U.S. No. 4873191 de T.E. Wagner e P.C. Hope. Alternativamente, o vector quimérico pode ser introduzido num hemocitoblasto embrionário, os animais quiméricos podem ser produzidos através da agregação do hemocitoblasto embrionário com células de blastocistos normais e os animais 13 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ transgénicos podem ser recuperados como descendência dos áííiffiais quiméricos, de acordo com o método de Capecchi, M.R., 1989, Science 244: 1288.

Utilizando a electroporação, pode ser especificamente mutada na sequência alvo 1 célula por 10000 células tratadas (a seguir "transformada"). A prática do invento, assim, inclui a utilização de um método para seleccionar as células transformadas de entre o número maior de células não mutadas. Numa concretização a transformação das células confere uma vantagem de crescimento. Exemplos não limitantes de tais vantagens de crescimento incluem resistência a drogas, alterações na regulação do crescimento e alterações na capacidade para utilizarem metabolitos. Numa concretização alternativa o método de selecção pode ser de selecção negativa pelo qual as células transformadas se tornam incapazes de crescerem sob as condições de selecção e as células não transformadas são removidas através de exposição a condições que selectivamente destroem células proliferantes.

Alternativamente, as células transformadas podem possuir um fenótipo antigénico da superfície celular alterado que pode ser detectado através de imunofluorescência e a selecção pode ser efectuada através de um Separador de Células Activadas por Fluorescência.

Quando o método de introdução do vector quimérico na célula é a injecção directa, tal como por exemplo quando se constroem animais transgénicos através de injecção pronuclear, a taxa de transformação pode ser superior a 1 por 10000 células. A necessidade de selecção é deste modo consideravelmente reduzida.

Tipicamente as quantidades úteis de um vector quimérico estão entre 10 e 1000 ng de vector quimérico por milhão de células em cultura a serem transformadas através de electroporação.

6. EXEMPLOS 6.1. Exemplo 1: Actividade in vivo em fungos Ustilago O Usti/ago de tipo selvagem possui um gene ura-3 funcional cujo produto é parte da via biossintética do uracilo. Quando o Ustilago de tipo selvagem

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EP 0 733 059/PT 14 cresce em meios de ácido 5'-fluororótico (5F0A) as células morrem de incorporação do ácido na via. Se o gene ura-3 for mutado de forma a que o ARNm de ura-3 não seja produzido, as células sobrevivem nos meios de 5FOA. A sequência do gene ura-3 endógena é conhecida na arte. Num conjunto de experiências, a base 358 da sequência foi mudada de uma timidina para uma adenina mutação que resulta numa proteína disfuncional.

Um vector quimérico foi sintetizado como se segue:

Vector para a mutação na base 358: (Vector 358 de ARN) 5' TGCCGATCGGCAAC7T7TGUUGCCGAUCGGCAAA7TT 3' (SEQ ID No. 1) O vector 358 adopta conformações em gancho. As bases sublinhadas indicam resíduos de ácidos ribonucleicos. A letra a negrito indica o mutador (região heteróloga). Os "T" em itálico indicam as bases desemparelhadas.

Um vector possuindo a mesma sequência mas não contendo ácidos ribonucleicos foi também construído para utilizar como controlo. No vector o uracilo foi substituído por timidina. O vector controlo para a mutação na base 358: (Vector 358 de ADN) 5' TGCCGATCGGCAAC7T7TGTTGCCGATCGGCAAA7TT 3' (SEQ ID No. 2) também adopta uma conformação em gancho. Novamente, o resíduo a negrito é o mutador.

Foi efectuada uma experiência de transformação in vivo na qual células {107) de U. maydis foram preparadas em protoplastos com uma recuperação de 106 células em 50 μΙ de solução tampão de transformação seguindo métodos bem conhecidos na arte e foram transfectadas com quantidades diferentes dos vectores quiméricos ou do vector homogéneo (só ADN) misturadas com os protoplastos a 37°C. As células foram então plaqueadas em meios selectivos e o número de colónias sobreviventes (transformantes) foi contado. Os resultados são apresentados na tabela abaixo:

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Quantidade de Tipo de ..... ' .............— 1 ^ Número de Colónias transfecção (pg) Vector - 358 Sobreviventes 0,1 ADN 0 0,1 quimérico 13 0,25 •ADN 1 0,25 quimérico 49 0*,75 ADN 12 0,75 quimérico 131 1,0 ADN 19 1,0 quimérico 573

Estes dados mostram que a transfecção de células com o Vector 358 de ARN aumenta a sobrevivência das células numa taxa muito superior que a transfecção com o vector correspondente de ADN. 6.2. Exemplo 2: Transformação de células NIH 3T3

As células NIH 3T3 são células humanas que possuem características de crescimento benigno (controlado). As características de crescimento maligno (descontrolado) são conferidas pela mutação pontual única no oncogene H-ras que substituí Gly12 por Thr. Assim, a mutação G—»T12 conduz a uma alteração prontamente seleccionável nas características de crescimento. Taparowsky, E., et a!., 1982, Nature 300: 762; Sukumar S., et al., 1983, Nature 306: 658.

Foram construídos vectores quiméricos para dirigirem a mutação G-»T12 possuindo a seguinte sequência: 5'-CACACCGACGGCGCCCACCAC77TGTGGTGGGCGCCGTCGGTGTGGG7~7TGCC-3' (SEQ ID No. 3) A sequência é apresentada no código de letra única convencional com as características adicionais de ARN (sublinhadas), as bases desemparelhadas em itálico e a base mutadora a negrito.

Note-se que após a circularização o vector quimérico é dividido em duas cadeias substancialmente complementares através das duas sequências

84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 16 tritimidinilo e que todos os nucleótidos contendo ribose estão presen apenas uma das duas cadeias.

Foram sintetizadas duas formas do vector quimérico utilizando bases de 2'-OMe-ribose possuindo respectivamente uma região ("R") e duas regiões ("R-D-R") em dúplex híbrida flanqueando quatro resíduos de desoxirribose. A forma R-D-R é mostrada acima, SEQ ID No. 3, a forma R é idêntica excepto que as bases 6-9 ("CGAC") eram desoxinucleótidos. Note-se que os terminais 5' e 3' são desoxirribonucleótidos. Isto permite que os vectores quiméricos sejam circularizados após a síntese utilizando os mesmos procedimentos de ADNligase tal como são vulgarmente empregues em ADN recombinante. Após a ligação, os vectores quiméricos de circularização foram isolados do substrato através de duas iterações de electroforese preparativa em gel D600 (AT Biochem, Malvern, PA).

Os vectores de controlo foram: 1) a mesma sequência sem dúplex híbrida (dados mostrados, "homo-dúplex"); 2) o ADN desemparelhado (dados mostrados "ADNu") possuindo a sequência 5'-GCCCACACCGACGGCGCCACCAC-3' (SEQ ID No. 4); 3) o vector quimérico sem região heteróloga e por isso sem nucleótido mutador (dados não mostrados). A experiência foi conduzida através de transformação de células NIH 3T3 (1x106 células) utilizando um procedimento de electroporação. Após a electroporação, as células foram plaqueadas numa densidade de 4x103 células/cm2 e deixadas a crescer durante 14 dias em cultura. Os transformantes foram visualizados corando as células que formavam pontos de convergência com violeta de cristal. Como controlo positivo, foi empregue o plasmídeo pT24 que codifica a forma T12 de H ras. Este controlo foi utilizado para determinar o nível de recombinação ilegítima nas célula NIH 3T3 transfectadas. A experiência foi repetida cinco vezes e um resumo dos resultados é apresentado na tabela abaixo. Adicionalmente aos resultados apresentados abaixo as experiências de controlo que utilizaram um vector quimérico sem códão mutador não apresentaram pontos de convergência transformados de células NIH 3T3.

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Tipo de Vector Amt Transfectadas Transformantes Dor 106 células (por 106 células) (14 dias) pT24 (controlo 10 pg 57 positivo) ADNu 1 pg 2 ADNu 10 pg 13 homo-dúplex 1 μ9 0 homo-dúplex 10 pg 2 quimérico 50 ng R-D-R R 19 12 quimérico 200 ng 55 43 quimérico 1 μ9 139 103

Estes resultados mostram que os vectores quiméricos introduziram uma mutação específica através de recombinação homóloga de forma a transformarem células de mamífero. A taxa de transformação nesta experiência foi superior à taxa de transformação através de recombinação ilegítima que foi observada através de transfecção com o vector de controlo positivo p24T, o qual continha um gene H-ras completo mutado. Assim, através da utilização de vectores quiméricos foi alcançada uma taxa de recombinação homóloga numa célula de mamífero que foi superior à taxa de recombinação ilegítima.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Kmiec, Eric (ii) TÍTULO DO INVENTO:Compostos e Métodos para Mutações Dirigidas ao Local em Células Eucarióticas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Pennie & Edmonds (B) RUA: 1 1 55 Avenue of the Américas (C) CIDADE: New York

(D) ESTADO: NY (F) CÓDIGO POSTAL: 10036-2711 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: US (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Friebel, Thomas E. (B) NÚMERO DE REGISTO: 29258 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/REGISTO: 7991-009 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (212) 790-9090 (B) TELEFAX: (212)869-8864/9741

37 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 19 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO DE CADEIA: ácido nucleico (C) CADEIA: auto-complementar (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN/ARN (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: - (B) LOCALIZAÇÃO: 19..32 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = a /note = "ARN"

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: TGCCGATCGG CAACTTTTGU UGCCGAUCGG CAAATTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: auto-complementar (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: TGCCGATCGG CAACTTTTGT TGCCGATCGG CAAATTT 37 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 20 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ (C) TIPO DE CADEIA: auto-complementar (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN/ARN (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: - (B) LOCALIZAÇÃO: 2..5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = b /note = "ARN" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: -(¾ LOCALIZAÇÃO: 10..21 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = d /note = "ARN" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: - (B) LOCALIZAÇÃO: 51..52 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = f /note = "ARN" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: CACACCGACG GCGCCCACCA CTTTGTGGTG GGCGCCGTCG GTGTGGGTTT GCC 53 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: auto-complementar (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN

Claims

84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 1/8 REIVINDICAÇÕES 1. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto possuindo no máximo uma extremidade 3' e uma extremidade 5', ácido nucleico que compreende ainda: (a) peio menos uma região de bases desemparelhadas contíguas disposta de forma a que a região desemparelhada separa o ácido nucleico numa primeira cadeia e numa segunda cadeia ligadas através da referida região de bases desemparelhadas contíguas; (b) pelo menos uma região de ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick de pelo menos 1 5 pares de bases de comprimento, em que as bases da primeira cadeia correspondem a bases da segunda cadeia; e no qual (c) a primeira cadeia compreende uma região de pelo menos três bases contíguas contendo ribose que formam uma duplex híbrida dentro da região de ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick.
2. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação, no qual a segunda cadeia não contém bases contendo ribose.
3. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, no qual as bases contendo ribose são ribonucleótidos 2'-0-metilados e/ou que compreendem um fosforotioato substituindo um fosfodiéster e/ou que compreendem um nucleótido contendo arabinose.
4. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, que compreende entre 15 e 50 pares de bases em dúplex híbrida.
5. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, no qual as extremidades 5' e 3' estão emparelhadas segundo Watson-Crick com bases adjacentes de uma cadeia complementar na região de ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick.
6. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, no qual as extremidades 5' e 3' estão emparelhadas segundo Watson-Crick com bases adjacentes da primeira cadeia.

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7. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicaçõe qual compreende ainda uma segunda região de bases desemparelhadas contíguas disposta de forma que a região desemparelhada separa o ácido nucleico numa primeira cadeia e numa segunda cadeia ligadas através da referida segunda região de bases desemparelhadas contíguas.
8. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, no qual a primeira cadeia compreende duas regiões de bases contendo ribose que formam duas regiões em dúplex híbrida, possuindo cada região em duplex híbrida pelo menos 8 pares de bases de comprimento, e uma região interposta de pelo menos 4 pares de bases em homo-dúplex disposta entre as regiões em dúplex híbrida.
9. Ácido nucleico de-acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, no qual a região interposta em homo-dúplex consiste em de entre 4 e 50 pares de bases de 2'- desoxirribose.
10. Método de introdução de uma alteração predeterminada numa sequência alvo do genoma de uma célula cultivada, célula que contém um núcleo, que compreende os passos de: a) proporcionar o ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, que compreende ainda duas regiões homólogas a uma sequência alvo e uma região heteróloga, disposta entre elas, que codifica a alteração; e b) manter o referido ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada, pelo que a alteração é introduzida na sequência alvo.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a primeira cadeia do ácido ribo-desoxirribonucleico misto compreende duas regiões de nucleótidos contíguos que formam duas regiões em dúplex híbrida, possuindo cada região em dúplex híbrida pelo menos 4 pares de bases de comprimento, e uma região interposta de pelo menos 1 par de bases em homo-dúplex disposta entre as regiões em dúplex híbrida que compreende a região heteróloga.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou a reivindicação 11, em que a célula não é uma levedura nem um fungo.

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13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-12, que compreende ainda um passo de introdução do ácido ribo-desoxirribonucleico misto no núcleo através da utilização de um lipossoma.
14. Método de acordo com a reivindicação 10 ou a reivindicação 11, em que o núcleo é um pronúcleo de um óvulo e o vector do ácido ribo-desoxirribonucleico misto é introduzido no pronúcleo através de injecção.
15. Método de acordo com a reivindicação 10 ou a reivindicação 11, em que o núcleo é um núcleo de um hemocitoblasto embrionário e a introdução é através da utilização de um lipossoma ou através de electroporação.
16. Método de obtenção de uma célula cultivada possuindo características alteradas que compreende os passos de: a) proporcionar o ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 que compreende ainda duas regiões homólogas a uma sequência alvo e uma região heteróloga, disposta entre elas, codificando a alteração; b) manter do referido ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada pelo que o ácido nucleico misto e a sequência alvo se recombinam e a célula é alterada; e c) seleccionar de uma célula alterada.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a primeira cadeia do ácido ribo-desoxirribonucleico misto, compreende duas regiões de nucleótidos contíguos que formam duas regiões em dúplex híbrida, possuindo cada uma das regiões em dúplex híbrida pelo menos 4 pares de bases de comprimento e uma região interposta de pelo menos 1 par de bases em homo-dúplex disposta entre as regiões em dúplex híbrida que compreende a região heteróloga.
18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou na reivindicação 17, em que a célula é uma célula de mamífero.
19. Método de acordo com a reivindicação 1 6 ou na reivindicação 17, em que a célula não é uma levedura nem um fungo. 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 4/8
20. Método de introdução de uma alteração predeterminada num gene alvo do genoma de uma célula eucariótica cultivada, que não é uma levedura nem um fungo, célula que contém um núcleo, que compreende os passos de: a) proporcionar o ácido ribo-desoxirribonucleico misto possuindo uma primeira cadeia e uma segunda cadeia, em que a primeira cadeia compreende: i. uma primeira região homóloga e uma segunda região homóloga que juntas têm de 20 a 60 nucleótidos de comprimento, que são homólogas ao gene alvo e que formam uma dúplex com a segunda cadeia, em que cada uma das regiões homólogas da primeira cadeia compreende um segmento de pelo menos 4 nucleótidos contíguos que formam uma dúplex híbrida com desoxinucleótidos da segunda cadeia; e ii. uma região heteróloga, que se dispõem- entre a primeira e a segunda região homóloga e que tem de 1 a 20 nucleótidos de comprimento, que é heteróloga ao gene alvo e que contém a alteração predeterminada; e b) manter o ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada, pelo que a alteração é introduzida no gene alvo.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que cada um dos nucleótidos que formam a dúplex híbrida da primeira cadeia é uma base contendo ribose.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, em que um nucleótido que forma a dúplex híbrida da primeira cadeia está 2'-0-metilada.
23. Método de acordo com a reivindicação 20, em que cada um dos nucleótidos que formam a dúplex híbrida da primeira cadeia está 2'-0-metilada.
24. Método de acordo com as reivindicações 20-23, em que a região heteróloga consiste em desoxirribonucleótidos.
25. Método de acordo com as reivindicações 20-24, em que a região heteróloga tem um nucleótido de comprimento.

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26. Método de acordo com as reivindicações 20-25, em que a alteração é uma inserção ou deleção no gene alvo.
27. Composto para introdução de uma alteração predeterminada num gene alvo, composto .que é um ácido ribo-desoxirribonucleico misto para introdução de uma alteração predeterminada num gene alvo, possuindo uma primeira cadeia e uma segunda cadeia, em que a primeira cadeia compreende (a) uma primeira região homóloga e uma segunda região homóloga que juntas têm de 20 a 60 nucleótidos de comprimento, regiões que são homólogas ao gene alvo e que formam uma dúplex com a segunda cadeia, em que cada uma das referidas regiões homólogas da primeira cadeia compreende um segmento de pelo menos 4 nucleótidos contíguos que formam uma dúplex híbrida com desoxinucleótidos da segunda cadeia; e (b) uma região heteróloga, que se dispõem entre a primeira e a segunda região homóloga e tem de 1 a 20 nucleótidos de comprimento, que é heteróloga ao gene alvo e que contém a alteração predeterminada, em que o gene alvo é um gene de uma célula procariótica, que não é uma levedura nem um fungo.
28. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com a reivindicação 27, em que cada um dos nucleótidos que formam a dúplex híbrida da primeira cadeia é uma base contendo ribose.
29. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com a reivindicação 27, em que um nucleótido que forma a dúplex híbrida da primeira cadeia está 2'-0-metilado.
30. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com a reivindicação 27, em que cada um dos nucleótidos que formam a dúplex híbrida da primeira cadeia está 2'-0-metilado.
31. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-30, em que a região heteróloga consiste em desoxirribonucleótidos. 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 6/8
32. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-31, em que a região heteróloga tem um nucleótido de comprimento.
33. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-32, em que a região heteróloga contém uma inserção ou uma deleção do gene alvo.
34. Composto para a introdução de uma alteração predeterminada num gene alvo, composto que é um ácido ribo-desoxirribonucleico misto possuindo no máximo uma extremidade 3' e uma extremidade 5', ácido nucleico que compreende ainda: a) pelo menos uma região de bases desemparelhadas contíguas disposta de forma a que a região desemparelhada separa o ácido nucleico numa primeira cadeia e numa segunda cadeia ligadas através da referida região de bases desemparelhadas contíguas; b) pelo menos uma região de ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick de pelo menos 15 pares de bases de comprimento, em que as bases da primeira cadeia correspondem a bases da segunda cadeia; e, no qual c) a segunda cadeia compreende uma região de pelo menos nove desoxirribonucleótidos, que formam uma dúplex híbrida com os nucleótidos da primeira cadeia, e d) as extremidades 5' e 3' estão emparelhadas segundo Watson-Crick com bases adjacentes de uma cadeia complementar de ácido nucleico emparelhada segundo Watson-Crick.
35. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 34, no qual a primeira cadeia compreende um ribonucleótido 2'-0-metilado.
36. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 34, que compreende pelo menos nove pares de bases contíguos em dúplex híbrida.
37. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 36, em que a segunda cadeia compreende as extremidades 5' e 3'.
38. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 34- 37, que compreende pelo menos quinze pares de bases em dúplex híbrida.

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39. Ácido nucleico tal como reivindicado em qualquer u reivindicações 34-38, em que a primeira cadeia compreende duas regiões de nucleótidos contíguos que formam duas regiões em dúplex híbrida, possuindo cada região em dúplex híbrida pelo menos 4 pares de bases de comprimento, e uma região interposta de pelo menos 1 par de bases em homo-dúplex disposta entre as regiões em dúplex híbrida.
40. Método de introdução de uma alteração predeterminada numa sequência alvo do genoma de uma célula cultivada, célula que contém um núcleo, que compreende os passos de: a) proporcionar o ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com qualquer uma das reivindicações 33-38 que compreende ainda duas regiões homólogas a uma sequência alvo e uma região heteróloga, disposta entre elas, codificando a alteração; e b) manter o referido ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada, pelo que a alteração é introduzida na sequência alvo.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a primeira cadeia do ácido ribo-desoxirribonucleico misto, compreende duas regiões de nucleótidos contíguos que formam duas regiões em dúplex híbrida, possuindo cada região em dúplex híbrida pelo menos 4 pares de bases de comprimento, e uma região interposta de pelo menos 1 par de bases em homo-dúplex disposta entre as regiões em dúplex híbrida que compreende a região heteróloga.
42. Método de acordo com a reivindicação 40 ou a reivindicação 41, em que a célula não é uma levedura nem um fungo.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, que compreende ainda um passo de introdução do ácido ribo-desoxirribonucleico misto no núcleo através da utilização de um lipossoma.
44. Método de acordo com a reivindicação 40 ou a reivindicação 41, em que o núcleo é um pronúcleo de um óvulo e o vector do ácido ribo-desoxirribonucleico misto é introduzido no pronúcleo através de injecção. 84 964 ΕΡ Ο 733 059/ΡΤ 8/8
45. Método de acordo com a reivindicação 40 ou a reivindicação 41, em que o núcleo é um núcleo de um hemocitoblasto embrionário e a introdução é através da utilização de um lipossoma ou através de electroporação.
46. Método de obtenção de uma população de células cultivadas possuindo características alteradas que compreende os passos de: a) proporcionar o ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com a reivindicação 34, que compreende ainda duas regiões homólogas a uma sequência alvo e uma região heteróloga, disposta entre elas, codificando a alteração; b) manter o referido ácido ribo-desoxirribonucleico misto dentro do núcleo da célula cultivada pelo que o ácido nucleico misto e a sequência alvo se recombinam e a célula é alterada; e c) seleccionar uma célula alterada.-
47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que a primeira cadeia do ácido ribo-desoxirribonucleico misto, compreende duas regiões de nucleótidos contíguos que formam duas regiões em dúplex híbrida, possuindo cada região em dúplex híbrida pelo menos 4 pares de bases de comprimento, e uma região interposta de pelo menos 1 par de bases em homo-dúplex disposta entre as regiões em dúplex híbrido que compreende a região heteróloga.
48. Método de acordo com a reivindicação 46 ou a reivindicação 47, em que a célula é uma célula de mamífero.
49. Método de acordo com a reivindicação 46 ou a reivindicação 47, em que a célula não é uma levedura nem um fungo.
50. Ácido ribo-desoxirribonucleico misto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, de 27 a 33 ou de 34 a 39, para utilização na produção de um animal transgénico. Lisboa,

Por THOMAS JEFFERSON UNIVERSITY 0 AG3%»

ENG. . DA CUNHA FERRE1RA] Âg. 0[. Pr. Ind. Rao das Flores, 74 - 4.e