PL170321B1 - Sposób wytwarzania nowej czasteczki wiazacej CD25 PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowej czasteczki wiazacej CD25 zawierajacej co najmniej jedno miejsce wiazace antygen, obejmujace a) pierwsza domene, która zawiera regiony nadzmienne w kolejnosci CDR1, CDR2 i CDR3, przy czym region CDR1 ma sekwencje aminokwasów: Arg-Tyr-Trp-Met-His, region CDR2: Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly, a region CDR3: Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezposrednich równowazników; b) druga domene, która zawiera regiony nadzmienne w kolejnosci CDR1', CDR2' i CDR3' o nastepujacych sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser- Tyr-Met-Gln, CDR2' - Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr- Thr lub ich bezposrednich równowazników, znam ienny tym, ze prowadzi sie hodowle linii komórkowej hybrydomy lub organizmu stransformowanych sekwencjami DNA kodujacymi okreslona powyzej pierwsza i druga domene i z hodowli wydziela sie czasteczke wiazaca CD25. P L 170321 31 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25, a zwłaszcza monoklęnalnycr przeciwciał, które mają zastosowanie w immunosupresji.

W chirurgii przeszczepów organów, zwłaszcza nerek, wątroby, serca, płuc i szpiku kostnego konieczne jest ograniczenie odpowiedzi immunologicznej u biorcy przeszczepu w celu maksymalnego zmniejszenia prawdopodobieństwa odrzucenia przeszczepu po operacji. W tym celu proponuje się różne środki immunęsupresyjae, których użycie jednak musi być dokładnie kontrolowane, ponieważ oprócz niepożądanych efektów ubocznych związanych ze stosowaniem pewnych środków immunosupresyjnych, supresja odpowiedzi immunologicznej czyni biorcę przeszczepu szczególnie podatnym na zakażenia bakteryjnej wirusowe, które byłyby kontrolowane przez normalnie działający układ odpornościowy. Środki immunoeupresyjae, które z powodzeniem stosuje się w praktyce klinicznej obejmują steroidy, azatiopeynę i cyklosporynę A. W praktyce klinicznej konieczne jest osiągnięcie równowagi pomiędzy stopniem immunosupresji niezbędnym do zapobieżenia odrzuceniu przeszczepu lub do leczenia objawów odrzucenia, a zachowaniem w pewnym stopniu funkcji układu odpornościowego biorcy tak, aby zwalczał inne środki zakażające i równocześnie utrzymywał kontrolę nad możliwymi niepożądanymi efektami ubocznymi.

Należy też zwrócić uwagę na stosowanie pewnych monoklonalnych przeciwciał (MAb) w celu supresji reakcji immunologicznych, zwłaszcza moaoklęnalnych przeciwciał, które rozpoznają różne antygeny powierzchniowe limfocytów T. Tutaj także napotyka się na problemy w klinicznej praktyce, mianowicie znane dotychczas przeciwciała były albo zbyt silne, albo niewystarczająco skuteczne, a czasem powodowały poważne skutki uboczne, takie jak wysoka gorączka.

Takie przeciwciała oznacza się zwykle symbolem CD (Cluster-Deteeminatięn) z liczbą nadawaną kolejno przez Leucocyte Typing Workshope. Chociaż takim symbolem jak CD3

170 321 obecnie oznacza się często antygen powierzchniowy komórek, a MAb dla tego antygenu często oznacza się jako anty-CD3, w niniejszym opisie takie symbole jak CD3, CD25 itd. będą się odnosiły do MAb, a odpowiednie antygeny powierzchniowe komórek będą oznaczane jako antygen CD3 itd.

Zwłaszcza monoklonalne przeciwciała dla antygenów błony obecnych na wszystkich limfocytach T (zwanych także pan antygenami limfocytów T), takich jak antygen CD3, są bardzo silnymi przeciwciałami ze względu na ogólną aktywność supresyjną wobec układu odpornościowego. Zatem organizm ludzki może być pozbawiony natychmiastowej odpowiedzi immunologicznej, zwykle za pośrednictwem limfocytów pamięci T, występującej po zakażeniu.

Jest to z pewnością niepożądane, gdy usiłuje się raczej zapobiegać niż leczyć objawy odrzucenia przeszczepu. Działanie, które nadawałoby się do zastosowania w profilaktyce, powinno być selektywne, tj. pula limfocytów pamięci T powinna być nienaruszona, podczas gdy kategoria limfocytów T (aktywowane limfocyty T), które mogłyby być bezpośrednio włączone w odrzucenie przeszczepu, powinna ulec inaktywacji.

Taki cel można osiągnąć stosując przeciwciała dla aktywowanych limfocytów T. Komórki te charakteryzują się obecnością na powierzchni błony receptora T,-2 o wysokim powinowactwie. Receptor U.-2 o wysokim powinowactwie składa się z co najmniej dwóch różnych łańcuchów polipeptydowych, łańcucha a, znanego także jako antygen CD25 i łańcucha β. Na pozostałych komórkach nie występuje taki receptor o wysokim powinowactwie, występują natomiast receptory o niskim i pośrednim powinowactwie, które składają się z homodimerów a i β. Przeciwciało CD25, które przeszkadza w wiązaniu IL-2 z jej receptorem o wysokim powinowactwie, a zatem wywołuje selektywną supresję odpowiedzi immunologicznej, wybrano do stosowania w profilaktyce odrzucania przeszczepów.

Naturalne immunoglobuliny lub przeciwciała stanowią zwykle multimerową cząsteczkę w kształcie Y, która ma miejsce wiązania antygenu przy końcu każdego górnego ramienia. Pozostała część struktury, zwłaszcza ogonek litery Y, pośredniczy w funkcjach efektorowych związanych z immunoglobulinami. Ogólna struktura przeciwciała z klasy IgGjest przedstawiona schematycznie na fig. 1A. Łańcuchy lekkie i ciężkie mają zmienną domenę i część stałą. Miejsce wiązania antygenu składa się ze zmiennej domeny ciężkiego łańcucha związanej ze zmienną domeną lekkiego łańcucha. Zmienne domeny ciężkich i lekkich łańcuchów mają taką samą strukturę ogólną, która jest przedstawiona na fig. IB.

Bardziej szczegółowo, własności wiązania antygenu przez przeciwciało są zasadniczo określone przez 3 swoiste regiony w zmiennej domenie ciężkich i lekkich łańcuchów, zwane regionami nadzmiennymi lub regionami określającymi komplementarność (CDR). jak przedstawiono na fig. 1B, te 3 nadzmienne regiony leżą na przemian z 4 szklieletami (FR), ze stosunkowo zachowanymi sekwencjami, które nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu. Regiony CDR tworzą pętle i są utrzymywane blisko siebie przez szkielety, które w dużym stopniu przyjmują konformację β-arkusza. Regiony CDR ciężkiego łańcucha wraz z regionami CDR związanego lekkiego łańcucha zasadniczo tworzą miejsce wiązania antygenu w cząsteczce przeciwciała.

Skład regionu FR i CDR zwykle określa się przez porównanie sekwencji aminokwasów pewnej liczby przeciwciał powstających w tym samym gatunku. Ogólne zasady identyfikacji regionów CDR i FR są przedstawione w tabeli I.

Poza tym, stwierdzono ostatnio, że udział zmiennej domeny lekkiego łańcucha w energetyce wiązania jest mały w porównaniu z udziałem domeny związanego ciężkiego łańcucha i że wydzielone zmienne domeny ciężkiego łańcucha samodzielnie mają aktywność wiązania antygenu. Takie cząsteczki określa się teraz jako jednodomenowe przeciwciała.

Znanych jest już kilka mysich monoklonalnych przeciwciał CD25, które obejmują 33B3-1 (Immunotech-Merieux), BDaIL-2R (Becton-Dickinson), 2C8 (Amersham), Campath 6 (MRC, Cambridge) i ATH207 (Free University, Berlin). Jednakże stwierdzono teraz, że nowe mysie przeciwciało CD25 izotyp IgG2a, dalej określane jako RFT5-IgG2a ma lepsze właściwości niż znane przeciwciała CD25, zwłaszcza pod względem powinowactwa wiązania oraz, że można skonstruować inne cząsteczki wiążące CD25, zawierające takie same regiony nadzmienne jak RFT5-IgG2a.

170 321

Sposobem według wynalazku wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25, która zawiera co najmniej jedno miejsce wiążące antygen obejmujące a) pierwszą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3 o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1 - Arg-Tyr-Trp-Met-His; CDR2 - A!a-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser--Tyr-AsnGln-Lys-Phe-Glu-Gly, CDR3 -Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich równoważników, i b) drugą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CDR1', CDR2' i CDR3' o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-IleSer-Tyr-Met-Gln, CDR2' - Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' -His-Gln-Arg-Ser-Ser-TyrThr lub ich bezpośrednie równoważniki.

Sposób według wynalazku polega na tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej hybrydomy lub organizmu stransformowanych sekwencjami DNA kodującymi określoną powyżej pierwszą i drugą domenę i z hodowli wydziela się cząsteczkę wiążącą CD25.

Jeśli nie zaznaczono inaczej, łańcuchy polipeptydowe opisywane w niniejszym opisie zaczyna się od N-końca, a kończą się C-końcem.

Gdy miejsce wiążące antygen zawiera pierwszą i drugą domenę, mogą one być zlokalizowane na tej samej cząsteczce polipeptydu lub, korzystnie każda domena może być na innym łańcuchu, pierwsza domena może być częścią ciężkiego łańcucha immunoglobuliny lub jego fragmentu, a druga domena częścią lekkiego łańcucha immunoglobuliny lub jego fragmentu.

Przez cząsteczkę wiążącą CD25 należy rozumieć cząsteczkę zdolną do przyłączania antygenu CD25 samego lub związanego z innymi cząsteczkami i tworzącego receptory IL-2 o wysokim powinowactwie. Reakcję wiązania można wykazać standardowymi metodami (próby jakościowe), włącznie np. z biopróbą na określenie hamowania wiązania IL-2 z jej receptorem lub dowolne próby na wiązanie z uwzględnieniem negatywnego testu kontrolnego, w którym stosuje się przeciwciało o niespokrewnionej swoistości, np, przeciwciało dla lizozymu. Korzystnie, zdolność wiązania się cząsteczki wytwarzanej sposobem według wynalazku z antygenem CD25 można wykazać w kompetytywnej próbie wiązania stosując przeciwciało AHT207, BD aIL-2-R lub 33B3-1 jako kompetytory. Korzystnie jako kompetytory wybiera się przeciwciało AHT207 lub BDaIL-2-R. Przykład próby wiązania jest opisany poniżej.

Ludzkie komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej hoduje się w podłożu RPMJ 1640 uzupełnionym 2mM L-glutaminy, 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 gg/ml streptomycyny, 25 mM wodorowęglanu sodu i 10% płodową surowicą cielęcą /FCS/. Do stymulacji HpbM stosuje się 1 gg/ml fitohemaglutyniny /PHA/. Po 3 dniach wytwarza się zawiesinę komórek blastycznych o stężeniu 3 10/ml w solance buforowanej fosforanem, uzupełnionej 2% bydlęcą albuminą surowiczą /BSAJ i 2% azydkiem. 50 gl próbki tej zawiesiny inkubuje się w ciągu 10 min. w 20°C, w warunkach non-capping, z przeciwciałem blokującym /kompetytorem/ o stopniowanych stężeniach od 1 do 100 gg/ml. Następnie do komórek dodaje się 1 gg/ml biotynylowanego przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku i dalej inkubuje się w ciągu 10 minut. Komórki przemywa się i dalej inkubuje się przez 10 minut ze streptawidyną znakowaną fluoresceiną. Komórki znów się przemywa, utrwala się w formalinie i analizuje za pomocą fluorocytometru, który wykrywa przyłączenie biotynylowanego przeciwciała. Równolegle prowadzi się doświadczenie z biotynylowanym przeciwciałem o niezwiązanej swoistości, jako próbę kontrolną negatywną.

Przykłady cząsteczek wiążących antygen obejmują przeciwciała wytwarzane przez komórki B lub hybrydomy i chimeryczne lub humanizowane przeciwciała, lub ich fragmenty, np. fragmenty F/ab'/2 i Fabj jak również przeciwciała o pojedynczym łańcuchu lub z jedną domeną.

Przeciwciała o pojedynczym łańcuchu składają się ze zmiennych domen ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała kowalencyjnie związanych przez peptydowy łącznik zwykle składający się z 10 do 30, korzystnie 15 do 25 aminokwasów. Zatem taka struktura nie obejmuje stałej części ciężkich i lekkich łańcuchów i uważa się, że mały peptydowy spacer powinien być mniej antygenowy niż cała część stała. Przez przeciwciało chimeryczne należy rozumieć przeciwciało, w którym regiony stałe ciężkich lub lekkich łańcuchów lub obu łańcuchów są pochodzenia ludzkiego, podczas gdy domeny zmienne w obu łańcuchach nie są pochodzenia ludzkiego /np. mysiego/. Przez humanizowane przeciwciało należy rozumieć przeciwciało, w którym regiony nadziemne /CDR/ nie są pochodzenia ludzkiego /np. mysiego/, podczas gdy zasadniczo wszy170 321 stkie inne części immunoglobuliny, np. stałe regiony i wysoce zachowawcze części zmiennych domen, tj. regiony szkieletowe, są pochodzenia ludzkiego. Humanizowane przeciwciało może jednak zachować kilka aminokwasów z mysiej sekwencji w częściach regionów szkieletowych przylegających do regionów nadzmiennveh.

Nadzmienne regiony mogą być związane z regionami szkieletowymi dowolnego rodzaju, korzystnie pochodzenia mysiego lub ludzkiego. Odpowiednie regiony szkieletowe są opisane przez E.A. Kabata i wsp. w Sequences of proteins of immunological interest, US departament zdrowia i świadczeń społecznych, Publiczna służba zdrowia, Narodowy Instytut Zdrowia. Jednak korzystnym regionem szkieletowym ciężkiego łańcucha jest region z RFT5-IgG2a, który jest przedstawiony dalej w załączonej Identyfikacji Sekwencji nr 1 i składa się z regionów FR1, FR2, FR3 i FR4 we wskazanej kolejności. Podobnie, w Identyfikacji Sekwencji nr 2 przedstawiony jest korzystny szkielet lekkiego łańcucha z RFT5-IgG2a, który składa się w następującej kolejności z regionów FR1', FR2', FR3' i FR4'.

Sposobem według wynalazku wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25, która zawiera co najmniej jedno miejsce wiążące antygen obejmujące domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:

Glu Val Gin Leu Gin 5

Gin Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser 21

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Ile 37

Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala De Tyr Pro 53

Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys 69

Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 85

Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly 101

Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 117 i drugą domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile 10

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

170 321

Ser Ser De Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg

Ser Ser Tyr Thr Fhe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys

104

Monoklonalne przeciwciało, które powstaje dla białka występującego naturalnie we wszystkich organizmach ludzkich, musi być koniecznie hodowane w układzie innym niż ludzki, np. w myszy. Ksenogeniczne przeciwciało wytworzone przez hydrydoma, jako bezpośrednia tego konsekwencja, podane człowiekowi wywołuje niepożądaną odpowiedź immunologiczną, głównie za pośrednictwem stałej części ksenogenicznej immunoglobuliny. To wyraźnie ogranicza użycie takich przeciwciał, ponieważ nie można ich podawać przez dłuższy czas. Zatem szczególnie korzystne jest stosowanie chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał z pojedynczym łańcuchem i jedną domeną, które, podane ludziom, prawdopodobnie nie wywołują zasadniczej odpowiedzi allogenicznej.

W związku z powyższym, korzystniejsza jest cząsteczka wiążąca CD25 wybrana spośród chimerycznego przeciwciała anty-CD25, która obejmuje co najmniej a) jeden ciężki łańcuch immunoglobuliny lub jego fragment, który zawiera (i) zmienną domenę obejmującą regiony nadzmienne w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3 o następujących sekwencjach aminokwasów: CDRl - Arg- Tyr-Trp-Met-His; CDR2 - Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-AsnGln-Lys-Phe-Glu-Gly, CDR3 - Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego ciężkiego łańcucha i

b) jeden lekki łańcuch immunoglobuliny lub jego fragment, który zawiera (i) zmienną domenę obejmującą kolejno regiony nadzmienne CDR1', CDR2' i cDR3' o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2' - AspThr-Ser-LyS-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr lub ich bezpośrednich równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego lekkiego łańcucha.

Alternatywnie, sposobem według wynalazku, można wytwarzać cząsteczkę wiążącą CD25, która ma jeden łańcuch zawierający miejsce wiążące antygen obejmujące a/ pierwszą domenę zawierającą kolejno regiony nadzmienne CDR1, CDr2 i CDR3 o sekwencjach aminokwasów przedstawionych w Identyfikacji Sekwencji nr 1, b/ drugą domenę zawierającą kolejno regiony nadzmienne CDRT, CDR2' i CDR3' o sekwencjach aminokwasów przedstawionych w Identyfikacji Sekwencji nr 2 i c/ łącznik peptydowy, który jest związany z N-końcem pierwszej domeny i z C-końcem drugiej domeny lub z C-końcem pierwszej domeny i z N-końcem drugiej domeny i jej bezpośrednie równoważniki.

Jak dobrze wiadomo, małe zmiany jednego lub kilka aminokwasów, mogą prowadzić do formy allelicznej białka pierwotnego o zasadniczo takich samych właściwościach. Zatem przez termin bezpośrednie równoważniki należy rozumieć albo cząsteczkę wiążącą CD25 /cząsteczka X/z pojedynczą domeną, /i/ w której regiony nadzmienne CDR1, CDR2 i CDR3, rozważane jako całość, są co najmniej w 80%, korzystnie w 90%, a bardziej korzystnie co najmniej w 95% homologiczne z regionami nadzmiennymi przedstawionymi w Identyfikacji Sekwencji nr 1 oraz /ii/, która jest zdolna do hamowania wiązania IL-2 z jej receptorem zasadniczo w takim samym stopniu, jak odnośna cząsteczka zawierająca regiony szkieletowe identyczne jak regiony cząsteczki X ale z nadzmiennymi regionami CDR1, CDR2 i CDR3 identycznymi jak przedstawione w Identyfikacji Sekwencji nr 1, albo należy rozumieć cząsteczkę wiążącą CD25 zawierającą co najmniej dwie domeny na miejsce wiązania /cząsteczka X'/, /i/ w której nadzmienne regiony CDR1, CdR2, CDR3, CDR1', CDR2' i CDR3', jako całość, są co najmniej w 80%, korzystnie

170 321 w co najmniej 90%, bardziej korzystnie co najmniej w 95% homologiczne z regionami nadzmiennymi przedstawionymi w Identyfikacji Sekwencji nr 1 i 2, oraz /ii/ która jest zdolna do hamowania wiązania IL-2 z jej receptorem zasadniczo w takim samym stopniu, jak odnośna cząsteczka zawierająca regiony szkieletowe i części stałe identyczne jak regiony cząsteczki X' ale z nadzmiennymi regionami CDR1, CDR2, CDR3 i CDR1', cDr2' i CDR3' jak przedstawione w Identyfikacji Sekwencji nr 1 i 2.

To ostatnie kryterium można dogodnie testować w różnych próbach, w tym także w reakcji mieszanych limfocytów /MLR/, w biopróbie na swoistą odpowiedź HPbM na antygen i w biopróbie na poliferację limfoblastów T zależnych od IL-2. Próby te opisane są dalej. Przez termin w tym samym zakresie należy rozumieć, że dana cząsteczka i jej równoważnik wykazują, statystycznie, zasadniczo takie same krzywe hamowania wiązania.

IL-2 w jednej z powyższych prób.

Najkorzystniej chimeryczne przeciwciało CD25 zawiera co najmniej

a) jeden eiężki ięńcuch, Ictóry obejmoje zmjenną domenę o sekwencji eminoawasów zasadniczo identycznej jak następująca:

Glu Val Gin Leu Gin 5

Gin Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser 21

Cys Lys ?Aa Ser Gly Tyr Ser Phh Th IAp Tyr Trp Met His Trp He 37

Lys Gin /Ap Pro Gly Gin Gly Ilu Gil Trp ite Gly Ala Ae Tyr Tyr 53

Gly Aso Set Asp ITh Ser Ty Asn. Gin Lvs Phe Glu Glv Lys AA Lyy 69

Leu Thr AA Val ITh Isu .Μι ^r TA Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ssu 85

Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly 101

Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 117 i stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha i

b) jeden lekki laócuca, któhy obryntye οιγππιπο dnmidę o selwen^! emjnokwnsów zasadniczo identycznej jak następująca:

Gin Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 10

Mrt Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 26

Ser Ser He Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gln Gin Lys Pro Gly Thr Ser

170 321

Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 58

Ala Arg Fhe Ser Gly Ser Gly Ssr Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr De 74

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Hii Gln Arg 90

Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu De Lys 104 i stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha.

Stała część ludzkiego ciężkiego łańcucha może być typu γι, γ2, γ3, γ4, μ, α1, α2, δ lub e, korzystnie typu y, bardziej korzystnie typu γπ podczas gdy stała część ludzkiego lekkiego łańcucha może być typu K lub λ (który obejmuje podtypy λι, λ2 i λ3), ale korzystnie jest typu k. Sekwencje aminokwasów tych wszystkich stałych części są podane przez Kabata i wsp. (jak wyżej).

W zakres wynalazku wchodzą także koniugaty cząsteczek wiążących CD25 wytwarzanych sposobem według wynalazku np. koniugaty z enzymem lub toksyną lub radioizotopem.

Sposobem według wynalazku cząsteczkę wiążącą CD25 wytwarza się metodą rekombinacji DNA. Konstruuje się jedną lub więcej cząsteczek DNA kodujących cząsteczkę wiążącą, umieszcza się ją pod kontrolą odpowiednich sekwencji i przenosi się do odpowiedniego organizmu gospodarza w celu przeprowadzenia ekspresji.

Wynalazek niniejszy dostarcza informacji odnośnie cząsteczek DNA kodujących cząsteczkę wiążącą CD25 z pojedynczą domeną, cząsteczkę wiążącą CD25 z pojedynczym łańcuchem, łańcuch ciężki lub lekki lub fragmenty tych łańcuchów cząsteczki CD25 oraz odnośnie zastosowania tych cząsteczek DNA do wytwarzania cząsteczki wiążącej CD25 metodą rekombinacji.

Obecny stan techniki pozwala fachowcom /.syntetyzować cząsteczki DNA na podstawie informacji, których dostarcza wynalazek, tj. sekwencji aminokwasów regionów nadzmiennych i kodujących je sekwencji DNA. Sposób konstruowania genu zmiennej domeny jest np. opisany w europejskim zgłoszeniu patentowym 239 400 i krótko można go streścić następująco: Klonuje się gen kodujący zmienną domenę MAb o każdej swoistości. Określa się segmenty DNA kodujące szkielet i regiony nadzmienne i usuwa się segmenty DNA kodujące regiony nadzmienne, a segmenty DNA kodujące szkielet fuzjuje się razem z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi w miejscach łączenia. Miejsca restrykcyjne można utworzyć w odpowiednich pozycjach przez mutagenezę cząsteczki DNA standardowymi metodami. Dwuniciowe syntetyczne kasety CDR wytwarza się na drodze syntezy DNA zgodnie z sekwencjami przedstawionymi w Identyfikacji Sekwencji nr 1 lub 2. Te kasety mają lepkie końce, tak że możnaje zligować ze szkieletem. Protokół wytwarzania cząsteczki DNA kodującej zmienną domenę immunoglobuliny jest przedstawiony na fig. 5.

Do skonstruowania DNA kodującego MAb nie jest konieczny dostęp do mRNA z produkującej linii komórkowej hybrydomy. W zgłoszeniuPCT WO 90/07861 znajduje się pełna instrukcja dotycząca wytwarzania MAb na drodze techniki rekombinacji DNA i podana jest pisemna informacja o sekwencji nukleotydowej genu. Metoda obejmuje syntezę kilku oligonukleotydów, ich amplifikację metodą PCR i ich składanie do żądanej sekwencji DNA.

Wektory zawierające odpowiedni promotor lub‘ geny kodujące stałe części ciężkiego i lekkiego łańcucha są publicznie dostępne. Zatem skonstruowaną cząsteczką DNA można dogodnie przenosić w odpowiednim wektorze. Cząsteczkę DNA kodującą przeciwciała z pojedynczym łańcuchem można także wytwarzać standardowymi metodami, np. jak opisano w Zgłoszeniu PCT WO 88/1649.

W związku z powyższym oraz ponieważ MAb pochodzenia mysiego jako naturalnie wydzielane przez hybrydoma nie jest korzystnym typem MAb, uważa się, że depozyt hybrodoma nie jest konieczny.

W konkretnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku stosowane środki rekombinantowe obejmują pierwszą i drugą konstrukcję DNA, opisane poniżej.

170 321

Pierwsza konstrukcja DNA koduje ciężki łańcuch lub jego fragment i obejmuje a/pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą alternatywnie szkielet i regiony nadzmienne w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3, które mają sekwencje aminokwasów przedstawione w Identyfikacji Sekwencji nr 1, przy czym ta pierwsza część zaczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny i b/ drugą część, która koduje stałą część ciężkiego łańcucha lub jego fragment i która zaczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas stałej części ciężkiego łańcucha, a kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas stałej części lub jej fragmentu, po którym następuje kodon nonsensowny.

Korzystnie, pierwsza część koduje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo takiej samej jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 1 zaczynającej się od aminokwasu w pozycji 1 i końrzacej się aminokwasem w pozycji 117. Bardziej korzystnie, pierwsza część ma taką sekwencję nukleotydopa jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 1 zaczynającą się od nukleotydu w pozycji 142 i kończącą się nukleotydem w pozycji 492. Druga część, korzystnie, koduje stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha, b. korzystnie stałą część ludzkiego łańcucha γ1. Tą drugą częścią może być genomowy fragment DNA /zawierający introny/ lub fragment cDNA /bez intronów/.

Druga konstrukcja DNA koduje lekki łańcuch lub jego fragment i obejmuje a/ pierwszą część, która koduje zmienną domenę obejmującą alternatywnie szkielet i regiony nadzmienne w kolejności CDR1', CDR2' i CDR3', w których sekwencje aminokwasów są przedstawione w Identyfikacji Sekwencji nr 2, przy czym ta pierwsza część zaczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas zmiennej domeny i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas zmiennej domeny i b/drugą część kodującą stałą część lekkiego łańcucha lub jej fragment, która zaczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas stałej części lekkiego łańcucha i kończy się kodonem kodującym ostatni aminokwas stałej części lub jej fragment, po którym następuje kodon nonsensowny.

Korzystnie, ta pierwsza część koduje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo takiej samej jak sekwencja w Identyfikacji Sekwencji nr 2 zbrzynbJarα się od aminokwasu w pozycji 1 i kończąca się aminokwasem w pozycji 104. Bardziej korzystnie pierwsza część ma sekwencję nukleotydową jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 2, zaczynającą się od nukleotydu w pozycji 244 i kończą się nukleotydem w pozycji 555. Korzystnie druga część koduje stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha, bardziej korzystnie stałą część ludzkiego łańcucha K.

W obu konstrukcjach DNA pierwsza i druga część jest rozdzielona intronem. Intron umieszczony jest pomiędzy pierwszą i drugą częścią, a korzystnie wstawiony jest wzmacniacz. Obecność tego elementu genetycznego, który ulega transkrypcji, ale nie ulega translacji, może być potrzebna dla skutecznej transkrypcji drugiej części. Bardziej korzystnie obie konstrukcje DNA zawierają wzmacniacz genu ciężkiego łańcucha, korzystnie pochodzenia ludzkiego.

Pierwsza lub druga konstrukcja DNA korzystnie zawiera trzecią część, która znajduje się za pierwszą częścią i koduje część peptydu lidera; trzecia część zaczyna się od kodonu kodującego pierwszy aminokwas peptydu lidera, a kończy się kodonem kodującym jego ostatni aminokwas. Ten peptyd jest potrzebny, aby łańcuchy, których ekspresja nastąpiła w organizmie gospodarza, zostały z niego wydalone. Korzystnie, trzecia część pierwszej konstrukcji DNA koduje peptyd lidera o sekwencji aminokwasów zasadniczo takiej samej jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 1, zaczynającej się aminokwasem w pozycji -19 i kończącej się aminokwasem w pozycji -1. Korzystnie, trzecia część drugiej konstrukcji DNA koduje peptyd lidera o sekwencji aminokwasów jak przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 2, zaczynającej się od aminokwasu w pozycji -22 i kończącej się aminokwasem w pozycji -1.

Każda z konstrukcji DNA znajduje się pod kontrolą odpowiednich sekwencji kontrolujących, zwłaszcza pod kontrolą odpowiedniego promotora. Może być użyty dowolny promotor, pod warunkiem, że będzie odpowiedni dla organizmu gospodarza, do którego będą wprowadzane konstrukcje DNA w celu ekspresji. Gdy ekspresję przeprowadza się w komórkach ssaków, szczególnie korzystny jest promotor genu immunoglzbuliny.

170 321

Żądane przeciwciało może być wytworzone w hodowli komórek lub w organizmach zwierząt tra^g^^nych. Odpowiednie zwierzę transg^^m można uzyskać standardowymi metodami, które obejmują mikeowstrzyCiwanie pierwszej i drugiej konstrukcji DNA znajdującej się pod kontrolą odpowiednich sekwencji do jaj, przenieeieaia takich jaj do odpowiednich osobników żeńskich pseudo-ciężarnych i wybór potomstwa, w którym przeprowadza się ekspresję żądanego przeciwciała.

Gdy łańcuchy przeciwciał mają być wytwarzane w hodowli komórek, konstrukcje DNA muszą być najpierw wstawione do pojedynczego wektora lub do dwóch oddzielnych ale zgodnych wektorów, przy czym ta druga możliwość jest korzystna.

Wektory ekspresji, które zawierają co najmniej jedną z opisanych powyżej konstrukcji DNA, są zdolne do ekspresji w linii komórkowej peokariotycznej lub eukariotycznej.

Następnie każdy wektor zawierający konstrukcję DNA przenosi się do odpowiednich organizmów gospodarzy. Gdy konstrukcje DNA są wstawione oddzielnie do dwóch wektorów, mogą też być przeniesione oddzielnie, tj. jeden typ wektora na komórkę, lub mogą być przeniesione razem i ta możliwość jest korzystna. Odpowiednim organizmem gospodarza może być linia komórek bakterii, drożdży lub ssaków, przy czym korzystna jest linia komórkowa ssaków. Bardziej korzystnie, linia komórkowa ssaków jest pochodzenia limfoidalnego, np. komórki myeloma, hybrydoma lub normalne uśmiercone komórki B, komórki B, w których nie zachodzi ekspresja ciężkiego lub lekkiego łańcucha endogennego przeciwciała.

Korzystnie, organizm gospodarza zawiera dużą liczbę kopii wektora na komórkę. Jeżeli organizmem gospodarza jest linia komórkowa ssaków, żądany cel można osiągnąć przez amplifikację kilku kopii standardowymi metodami. Metody amplifikacji zwykle polegają na selekcji ze względu na zwiększoną oporność na lek, która jest kodowana przez wektor ekspresji.

Sposób wytwarzania wielołańcuchowej cząsteczki wiążącej CD25 polega na prowadzeniu hodowli organizmu gospodarza etraasfoemowanego pierwszą i drugą konstrukcją DNA i odzyskaniu z hodowli tej aktywnej cząsteczki.

Alternatywnie ciężkie i lekkie łańcuchy można odzyskać oddzielnie i zrekęastytuować je w aktywną cząsteczkę wiążącą po złożeniu in viteo. Sposoby rekonstytuowania są dobrze znane w technice. Przykłady takich metod są szczególnie opisane w EPA 120 674 lub EPA 125 023.

Sposób może zatem także obejmować prowadzenie hodowli pierwszego organizmu, który jest steansformowany pierwszą konstrukcją DNA i odzyskiwanie z hodowli ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu i b/ prowadzenie hodowli drugiego organizmu, etransfoemowanego drugą konstrukcją DNA i odzyskiwanie lekkiego łańcucha lub jego fragmentów i c/ rekonstytuowanie in vitro aktywnej cząsteczki wiążącej CD25 z ciężkiego łańcucha lub jego fragmentu otrzymanego w a/ i lekkiego łańcucha lub jego fragmentu otrzymanego w b/.

Podobnie wytwarza się także cząsteczkę wiążącą CD25 z pojedynczym łańcuchem lub pojedynczą domeną, przez prowadzenie hodowli organizmu stransformowanego konstrukcją DNA, która koduje odpowiednio cząsteczkę wiążącą CD25 o pojedynczym łańcuchu lub z jedną domeną, i odzyskanie z hodowli takiej cząsteczki.

Cząsteczka wiążąca CD25, wytwarzana sposobem według wynalazku, wykazuje bardzo dobrą aktywność immunomoeulatorowk, jak przedstawiono np. w próbie z reakcją mieszanych limfocytów /MLR/ /Akbar i wsp., J. Immunol., 140, 2171-8/. Uważa się, że MLR in vitro jest równoważne allogenicznej odpowiedzi na przeszczep, która prowadzi do odrzucenia przeszczepu in vivo.

1. Hamowanie MLR

Z preparatu HPBM od pierwszego dawcy pobiera się 100 μΐ próbki, zawierające 10⁵ HPBM, do których dodaje się cząsteczkę wytwarzaną sposobem według wynalazku w różnych stężeniach od 0 do 300 μg/ml /z włączeniem tych granicznych wartości/. Następnie każdą próbkę miesza się ze 100 μΐ próbki zawierającej 105 HPBM niezgodnych z HLA napromienionych promieniami X od drugiego dawcy lub komórki T z wyczerpanych HPBM. Mieszaninę inkubuje się przez 6 dni w 37°C, po czym dodaje się 1 μθ ³H tymidyny metylu rH-Tdr/ w objętości 10 μΐ. Po 6 godzinach mierzy się proliferację komórek wykorzystując radioaktywne znakowanie.

170 321

W tej próbie cząsteczki wykazują aktywność immunomodulatorową in vitro w stężeniach od 0,3 pg/ml jak to przedstawiono na fig. 6. Przy stężeniu około 3 gg/ml zahamowany jest wzrost komórek w 50%.

Aktywność immunomodulatorową cząsteczek wytwarzanych sposobem według wynalazku można także ocenić mierząc stopień hamowania swoistej odpowiedzi HPBM na antygen lub hamowania proliferencji limfoblastów T zależnej od IL-2, w następujący sposób:

2. Hamowanie swoistej odpowiedzi HPBM na antygen

Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku skutecznie hamują powstawanie odpowiedzi ograniczonych komórek T HLA klasa II, swoistej dla PPD /tuberkulina/, co wskazuje na ich zdolność do hamowania wiązania endogennie wytworzonej IL-2 z jej receptorem. Uważa się, że te swoiste odpowiedzi na antygen in vivo odgrywają zasadniczą rolę w zapoczątkowaniu autoimmunizacji i odrzuceniu przeszczepu.

Z preparatów HPBM pobiera się 100 μΐ próbki zawierające 10³ HPBM, do których dodaje się cząsteczkę wytworzoną sposobem według wynalazku w różnych stężeniach od 0 do 300 gg/ml /z włączeniem tych granicznych wartości/ i tuberkulinę /PPD/ w ilości, która daje stężenie końcowe 30 gg/ml. Próbki inkubuje się przez 6 dni w 37°C, po czym dodaje się 1 gCi ³H-tymidyny metylu w objętości 10 μΐ. Po 6 godzinach inkubacji mierzy się proliferację komórek przez wbudowywanie radioaktywnych znaczników.

W tej próbie cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują aktywność immunomodulacyjną w stężeniach od około 10 gg/ml jak przedstawiono na fig. 7. Przy około 50 gg/ml zahamowany jest wzrost komórek w 50%.

3. Hamowanie proliferacji limfoblastów T zależnych od IL-2.

Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku skutecznie hamują wzrost blastów ludzkich komórek T zależnych od IL-2 wywołany przez stymulację MLR lub PPD. Uważa się, że komórki te odgrywają główną rolę w chronicznej autoimmunizacji i epizodach odrzucenia.

Potrójne hodowle zawierające 20 x 10³ 5-dniowych HPBM stymulowanych PPD lub MLR w objętości końcowej 200 gl inkubuje się przez 48 godzin w 37°C w obecności 5, 10 lub 20 gg/ml rekombinantowej IL-2 i cząsteczki wytwarzanej sposobem według wynalazku w różnych stężeniach w zakresie od 0 do 10 gg/ml /z włączeniem tych granicznych wartości/. Następnie dodaje się ³H-Tdr. Po 6 godzinach mierzy się proliferację komórek przez wbudowanie radioaktywnych znaczników. W tej próbie cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują aktywność immunomodulacyjną w stężeniach od 0,1 gl/ml jak przedstawiono na fig. 8A i B, 8C i 8D.

Wynalazek zatem umożliwia zastosowanie cząsteczki wiążącej CD25 do immunosupresji ludzkiego układu immunologicznego, przez podawanie skutecznej ilości takiej cząsteczki wymagającym takiego leczenia pacjentom.

Cząsteczka wiążąca CD25, wytwarzana sposobem według wynalazku, nadaje się do wytwarzania środków framaceutycznych wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Szczególnie cząsteczka taka nadaje się do zapobiegania odrzuceniu przeszczepu lub do leczenia objawów odrzucenia.

Dla tych wskazań odpowiednia dawka będzie oczywiście zmieniać się w zależności od np. konkretnej stosowanej cząsteczki, gospodarza, sposobu podawania oraz charakteru i powagi stanu, który ma być leczony. W profilaktyce zadowalające wyniki uzyskuje się zwykle przy dziennej dawce od około 0,1 mg do około 1 mg na kg ciężaru ciała. Dawkę tę można zwiększyć 4-krotnie w przypadku objawów odrzucenia przeszczepu. Cząsteczkę wytwarzaną sposobem według wynalazku dogodnie podaje się pozajelitowo, zwykle dożylnie, np. do żyły przedłokciowej lub do innej żyły obwodowej. Profilaktycznie typowo podaje się raz dziennie do raz tygodniowo przez 2 do 4 tygodni, zaczynając w dniu transplantacji, korzystnie na kilka godzin przed transplantacją.

Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być także użyteczne do leczenia zjadliwości komórek wytwarzających antygen CD25, np. do leczenia białaczki T-komórkowej i pewnych innych typów białaczki i chłoniaków. W tym celu cząsteczkę wiążącą

170 321

CD25 można stosować w postaci radiokoniugatu, w którym cząsteczka jest sprzężona z emitującym promienie a radionuklidem.

Cząsteczki wytwarzane sposobem według wynalazku nadają się także do leczenia lub profilaktyki infekcji HIV.

Wydaje się, że wirus HIV do mnożenia się wymaga proliferacji komórek T, zatem zahamowanie tej proliferacji przez blokowanie antygenu CD25 powinno także hamować mnożenie się wirusa.

Środki farmaceutyczne można wytwarzać konwencjonalnym sposobem. Korzystnie wytwarza się je w postaci zliofilizowanej. Do bezpośredniego podawania rozpuszcza się je w odpowiednim wodnym nośniku, np. w jałowej wodzie do iniekcji lub w jałowej buforowanej soli fizjologicznej. Jeśli potrzebny jest roztwór o większej objętości do podawania przez infuzję, korzystnie do soli podczas wytwarzania dodaje się ludzką albuminę surowiczą lub heparynizowaną własną krew pacjenta. Nadmiar takiego fizjologicznie obojętnego białka zapobiega stracie monoklonalnego przeciwciała przez adsorpcję na ścianach pojemnika i próbówek stosowanych z roztworem infuzyjnym. Jeżeli stosuje się albuminę, odpowiednie jej stężenie jest w zakresie od 0,5 do 4,5% wagowych roztworu soli.

Okazało się, że szczególnie dobre wyniki można uzyskać stosując w kombinacji co najmniej dwie cząsteczki wiążące antygen aktywowanych komórek T, przy czym - cząsteczki te rozpoznają co najmniej dwa różne antygeny charakterystyczne dla aktywowanych komórek T.

Korzystnie stosuje się kombinację dwóch różnych cząsteczek wiążących antygen, z których każda rozpoznaje inny antygen. Tak więc chociaż obydwie cząsteczki wiążące antygen rozpoznają powierzchniowe antygeny komórek T, nie zachodzi między nimi konkurencja wobec samego miejsca wiązania na aktywowanych komórkach T:

Korzystnie jedną cząsteczkę wiążącą antygen jest cząsteczka wiążąca CD25.

Środek immunosupersyjny zawiera mieszaninę co najmniej jednej cząsteczki wiążącej CD25 i co najmniej jeden antygen inny niż CD25, który jest charakterystyczny dla aktywowanych komórek T.

Do immunosupresji układu ssaków nadaje się kombinacja co najmniej dwóch cząsteczek wiążących antygen aktywowanych komórek T z jedną inną cząsteczką, przy czym cząsteczki wiążące antygen rozpoznają co najmniej dwa różne antygeny charakterystyczne aktywowanych komórek T, z których jednym jest antygen CD25.

Przez cząsteczkę wiążącą antygen aktywowanych komórek T należy rozumieć cząsteczkę wiążącą, która mocno reaguje z aktywowanymi komórkami T, natomiast słabo reaguje lub wcale nie reaguje z komórkami spoczynkowymi T. Korzystnie cząsteczkami wiążącymi antygen są kompletne cząsteczki immunoglobuliny, bardziej korzystnie mysie, chimeryczne lub humanizowane monoklonalne przeciwciała, zwłaszcza chimeryczne monoklonalne przeciwciała. Korzystne są te monoklonalne przeciwciała CD25, które zawierają CDR o sekwencjach aminokwasów opisanych powyżej.

Korzystnie powyższe środki farmaceutyczne mogą także zawierać lub mogą być stosowane w kombinacji z lekami immunosupresyjnymi, takimi jak cyklosporyna A.

Korzystnymi monoklonalnymi przeciwciałami dla antygenów aktywowanych komórek T innymi niż CD25 są typowo przeciwciała zaklasyfikowane do grupy CD7, opisane przez Reinherza, Haynesa, Nadlera i Bersteina w Leucocyte Typing II, vol. I human T lymphocytes, Springer Verlag, 1985. Antygen CD7 powstaje heterogenicznie na około 80% spoczynkowych komórek T. Jednak ekspresja znacznie zwiększa aktywację /2-3-krotny wzrost intensywności/.

Korzystną kombinacją przeciwciał jest zatem kombinacja przeciwciała CD7 z CD25. Środek farmaceutyczny korzystnie zawiera mieszaninę co najmniej jednego przeciwciała CD25 z co najmniej jednym przeciwciałem CD7, bardziej korzystnie jednego przeciwciała CD25 z jednym przeciwciałem CD7. Korzystnie oba przeciwciała są izotypu IgG.

Dwa przeciwciała, ewentualnie razem z lekiem immunosupresyjnym, mogą być stosowane w praktyce klinicznej w różny sposób. Korzystnie miesza się je razem i pacjentowi podaje się ich fizyczną mieszaninę. Alternatywnie można podawać przeciwciała i ewentualnie lek immunosupresyjny z oddzielnych zbiorników w dowolnej kolejności, ale w tym samym czasie. Środek można wytwarzać i podawać pozajelitowo, jak opisano powyżej w odniesieniu do pojedynczego

170 321 przeciwciała CD25. Alternatywnie leki immunosupresyjne podaje się doustnie, a monoklonalne przeciwciała podaje się pozajelitowo, oddzielnie lub w postaci mieszaniny.

Środek farmaceutyczny może zawierać monoklonalne przeciwciała i ewentualnie lek immunosupresyjny, zapakowane oddzielnie, w tym samym pojemniku, z instrukcją polecającą zmieszanie lub równoczesne podawanie. Takie zestawy obejmują np. wielocyiindrową strzykawkę lub podwójne opakowanie zawierające oddzielnie dawkę jednostkową co najmniej dwóch przeciwciał dla aktywowanych komórek T, rozpoznających co najmniej dwa różne antygeny charakterystyczne dla aktywowanych komórek T, z których jednym jest antygen CD25.

Dotychczasowe badania wskazują, że podawanie przeciwciał w kombinacji z jednym innym przeciwciałem i ewentualnie z lekiem immunosupresyjnym nie wywołuje niedopuszczalnych efektów ubocznych przy stosowanych poziomach dawek oraz że nie zachodzi synergizm efektów ubocznych, które obserwuje się podczas stosowania indywidualnych przeciwciał. W celach profilaktycznych odpowiednia dawka zwykle zawiera 0,05 - 0,5 mg pierwszego przeciwciała /takiego jak przeciwciało CD25/ na kg ciężaru ciała pacjenta i 0,05 - 0,5 mg drugiego przeciwciała /takiego jak CD7/ na kg ciężaru ciała.

Gdy jako lek immunosupresyjny stosuje się cyklosporynę, zaleca się stosować 2-5 mg/kg ciężaru ciała przy podawaniu pozajelitowym i 10 - 15 mg/kg ciężaru ciała przy podawaniu doustnym. Środek taki może być podawany codziennie lub co tydzień, korzystnie co tydzień.

Chociaż środek taki jest szczególnie przeznaczony do stosowania w profilaktyce odrzucania przeszczepu, można go także stosować do leczenia symptomów odrzucenia, które aktualnie występują. W tym przypadku dawkę należy zwiększyć 4-krotnie.

Nadające się do zastosowania mysie monoklonalne przeciwciała są znane per se. Wiele monoklonalnych przeciwciał dla antygenów powierzchniowych aktywowanych komórek T jest dostępnych z Kolekcji Kultur w różnych krajach świata, a zwłaszcza American Type Culture Collection of Rockville, Maryland, USA może dostarczyć odpowiednie monoklonalne przeciwciała lub hybridoma wydzielające takie przeciwciała. Przykładem takiej hybridoma wydzielającej monoklonalne przeciwciało CD7, którajest dostępna z ATCC, jest T3-3A1. Inne przeciwciała CD7 to RFT-2 i CHH 380 /chimeryczne przeciwciało/. Przeciwciała CD25 obejmują oprócz korzystnego RFT-5 i jego chimerycznej pochodnej, opisanej powyżej, M7/2 /Gaulton i wsp., Clin. Immunol, and Immunopath. /1985/, 36, 18/, przeciwciało anty-tac /Uchiyama i in., J. Immunol. /1981 /, 126, /4/, 1393/ i monoklonalne przeciwciało Campath 6.

Synergistyczne działanie kombinacji monoklonalnych przeciwciał CD25 i CD7 jest widoczne in vitro w opisanej powyżej biopróbie MLR, a także w testach klinicznych in vivo przeprowadzonych na ludziach.

W biopróbie MLR obserwuje się hamowanie poboru 3H-TdR w hodowli, do której pojedynczo dodaje się monoklonalne przeciwciało CD7/RFT2/ lub CD25/RFT5/. Zasadniczo większy stopień hamowaniajest przy stosowaniu tych przeciwciał razem w tym samym stężeniu całkowitym.-MLR in vitro jest równoważna allogenicznej odpowiedzi transplantacyjnej, która prowadzi do odrzucenia in vivo, podczas gdy opisane powyżej hamowanie odpowiada immunosupresji in vivo.

W MLR, do której dodaje się cyklosporynę w zakresie dawkowania od 10 pg/ml do 100 pg/ml w obecności CD7 lub CD25 jest większe hamowanie 3H-TdR w porównaniu z samą cyklosporyną przez cały zakres dawkowania. Kombinacja CD7, CD25 i cyklosporyny wykazuje większy efekt hamujący niż inna kombinacja.

Do testów klinicznych w zakresie profilaktyki wybiera się pacjentów poddawanych transplantacji nerki, wątroby lub serca. W dniu transplantacji na 2 goaz. przed operacją przeprowadza się pierwszą dożylną infuzję chimerycznego przeciwciała z przykładu V, razem z chimerycznym przeciwciałem CD7 /CHH 380/, w dawce 0,2 mg każdego przeciwciała/kg ciężaru ciała. W dwa dni po operacji podaje się identyczną infuzję dwóch przeciwciał, w dawce 0,4 mg/kg ciężaru ciała, następnie powtarza się przez 1 miesiąc co tydzień.

Dożylnie infuzję przygotowuje się w następujący sposób: liofilizowane przeciwciała miesza się razem i dysperguje się w 100 ml jałowej buforowanej soli zawierającej 4,5% wagowego ludzkiej albuminy. Taką dyspersję w soli podaje się pacjentom w ciągu 30 minut.

Pacjenci poddawani są także standardowej terapii cyklospoeynk. U żadnego z pacjentów nie wystąpiły objawy odrzucenia w ciągu 1 miesiąca terapii.

Krótki opis rysunków

Na fig 1A nb7PΓl«ΐawięnę schematycznie strukturę cząsteczki I^G jak również «*eniy kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy. Fig. 1B przedstawia schematycznie zestawienie zmiennych domen ciężkiego lub lekkiego łańcucha w szkielety /FR/ i regiony nadbmieane /CDR/.

Na fig. 2A i 2B przedstawiono analizę genomowego DNA trawionego za pomocą EcoRI z mysich hybridoma RFT5 - IgG2a /1/, RTF5 - IgG 121, RFT4 /3/ i NS-1 /4/ metodą Southema, stosując sondę DNA znakowaną ³²P, kodującego mysi wzmacniacz ciężkiego łańcucha /fig. 2A/ lub kodującego mysi ^cc, oraz pięciu segmentów genu Jc /fig. 2B/. 10 μg genomowego DNA trawi się EcoRI i poddaje się frakcjonowaniu ze względu na wielkość w 0,8% żelu agarozowym. Następnie fragmenty przenosi się na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzuje się z sondą. Po przemyciu błonę poddaje się naświetlaniu przez noc na kliszy Kodak X-0 Mat.

Na fig. 3A i 3B przedstawione są wektory macierzyste pSV2-neo-huCyl i pSV2-DHF R-Eμ-HuCc. Obydwa plazmidy zawierają gen oporności na ampicylinę /amp^R/ i sekwencję początku replikacji p ² i SV40 /pBR322ori i SV40 ori/.

pSV2-aeo-huCγl charakteryzuje obecność genu oporności na neomycynę /moR i genu kodującego ludzką stałą część γι /huCYi/, natomiast w wektorze pbV2-DHFR-Eμ-huCκ jest wstawiony gen reduktazy dihydrofolanowej /DHFR/ /oporność na metotrexat/ i gen kodujący ludzką stałą część K /huCc/· Końcowe wektory, w których zachodzi ekspresja chimerycznego ciężkiego i lekkiego łańcucha wytwarza się odpowiednio przez wstawienie do pbV2-aeo-rCγl fragmentu DNA kodującego peptyd liderowy FJ i zmienną domenę /VDJ2/ ciężkiego łańcucha RFT-IgG2a razem ze wzmacniaczem ludzkiego ciężkiego łańcucha oraz przez wstawienie do pSV2-DHFR-Eμ-huCκ fragmentu DNA kodującego peptyd liderowy /l/ i zmienną domenę /VJ2/ lekkiego łańcucha RFT5-IgG2a.

Na fig. 4A i 4B przedstawiono produktywność puli pojedynczych komórek hodowanych w obecności metotrexatu /MTX/ o wzrastającym stężeniu, zgodnie z procedurą A i B opisaną w przykładzie V. Na osi Y podano ilość wytworzonego męaoCloaalaego przeciwciała w mg/10⁹ komórek w ciągu 72 godzin.

Na fig. 5 przedstawiono protokół dla przeprowadzenia inserc-ji kaset CDR do wektora zawierającego 4 regiony zrębu sfuzowane razem.

Na fig.6 przedstawiono hamowanie MLR przez /x/RFT5-IgG2a/Y2a, c/ i /o/ chimeryczne Mab mysz x człowiek, wytwarzane sposobem według wynalazku/fi, c/. Obydwa Mab zawierają zmienne domeny jak przedstawione w Identyfikacji Sekwencji nr 1 i 2.

Na fig. 7 przedstawiono hamowanie odpowiedzi HPBM swoistej dla PPD przez /x/ RFT5-IgG2a i /o/ takiego samego chimerycznego Mab mysz-człowieC.

Na fig. 8 przedstawiono działanie RFT5-IgG2a i takiego samego chimerycznego Mab mysz - człowiek na proliferację PPD limfoblastów T /fig. 8A i 8B/ i na proliferację MLR limfoblastów T /fig. 8C i 8D/ przy stężeniu IL-2 5 ng/ml /o/, 10 ng/ml /·/ i / 20 ng/ml /x/.

Sposób według wynalazku wytwarzania chimerycznego przeciwciała CD25 jest zilustrowany następującymi przykładami.

Przykład I. Klonowanie genu kodującego zmienną domenę ciężkiego łańcucha RFT5-IgG2a.

Wydziela się genomowy DNA z komórek hybridoma RFT5-IgG2a /CD25; Y2a, c/, RFT5-IgGl /CD25; γι; c/ i RFT4 /CD4; γι; c/ i z hybrydoma macierzystej linii komórek szpiczaCu, mianowicie z NS-1 i trawi się EcoRI. Następnie Cażdy trawiony DNA frakcjonuje się na taCim samym żelu agarozowym. Po migracji żel agarozowy analizuje się metodą Southema stosując jako sondę znakowany ³²P fragment DNA Xbal-EcoRI o długości 0,7 Cz, który koduje mysi wzmacniacz ciężkiego łańcucha /Heinrich i wsp., J. of Immunol. /1989/ 143, 3589/. Na żelu po hybrydyzacji widoczne są 3 typy pasm, jaC przedstawiono na fig. 2. Fragment EcoRI o długości 6,5 Cz jest obecny w produktach trawienia DNA z wszystkich linii komórkowych, w tym NS-1, macierzystej linii komórek szpiczaCu, a zatem nie jest interesujący. Natomiast fragment EcoRI o długości 2,9 Cz wykryto tylko w produktach trawienia DNA z hybridoma RFT5-IgG1, prawdopodobnie w wyniku nienormalnego przegrupowania genów. Zatem wybra170 321 nym fragmentem jest fragment EcoRI o długości 6,8 kz, który nie występuje w produktach trawienia DNA z macierzystej linii komórkowej i ten fragment konsekwentnie oczyszcza się dalej na drodze preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym.

Fragmenty DNA o długości w przybliżeniu 5-7 kz klonuje się w miejsce restrykcyjnę EcoRI bakteriofaga ZAP /Stratagene/. Stosując opisaną powyżej sondę selekcjonuje się 6x10^o nrekombioowaoych fagów i wybiera się do hybrydyzacji 11 klonów. Inserty Dna z 11 klonów amplifikuje się na lizacie faga na płytce metodą PCR stosując jako primer pierwszy oligonukleotyd kodujący mysi gen J i drugi oligonukleotyd kodujący początek ciężkiego łańcucha RFT5 do 7-go aminokwasu /sekwencję określono uprzednio/.

Drugi primer jest zaprojektowany z uwzględnieniem najczęściej stosowanych kodonów genu. Fragmenty dNa otrzymane z każdego z 11 klonów poddaje się analizie Southema stosując jako sondę oligonukleotyd kodujący sekwencję aminokwasów od aminokwasu 20 do 27 ciężkiego łańcucha RFT5, który jest także zaprojektowany z użyciem najczęściej stosowanych kodonów. Stosując tę sondę wykryto 9 identycznych klonów fagowych. Część insertu dNa, która koduje zmienną domenę, sekweocjonuje się metodą zakończenia dideoksy, co jest widoczne w Identyfikacji Sekwencji nr 1

Przykład Π. Konstrukcja chimerycznego genu ciężkiego łańcucha RFT5

Fragment DNA o długości 6 kz otrzymany przez trawienie za pomocą EcoRI DNA jednego z 9 klonów fagowych i zawierający gen zmiennej domeny ciężkiego łańcucha RFT5 /obejmujący promotor i wzmacniacz/ klonuje się w miejsce restrykcyjne Eco RI w stałej części eukariotycznego wektora ekspresji pSV2 neohuman γι /Heinrich i wsp., j.w./jak przedstawiono na fig. 3A. Następnie ponownie -określa się sekwencję nukleotydów genu kodującego zmienną domenę ciężkiego łańcucha RFT5, aby wykluczyć możliwość mutacji genu podczas propacji plazmidu.

Przykład HI. Klonowanie genu kodującego zmienną domenę lekkiego łańcucha RFT5.

Wydziela się genomowy DNA z hybridoma RFT5, RFT5^X i RFT4 i z linii komórek macierzystych NS-1 i trawi się EcoRI. Następnie każdy trawiony DNA frakcjonuje się w tym samym żelu agarozowym. Po migracji analizuje się żel agarozowy metodą Southema stosując jako sondę fragment DNA znakowany ^J2P, zawierający 5 mysich genów Jo i gen mysi Co.

Na żelu po hybrydyzacji widoczne są 3 główne typy pasm odpowiadających fragmentom o długości w przybliżeniu 12, 16 i 18 kz, jak przedstawiono na fig. 2B. Największe fragmenty są tylko specyficzne dla hybridoma RFT5. Frakcjonowane fragmenty EcoRI o długości w przybliżeniu 18 Oz klonuje się w fagu EMBL4 /Stratagene/. 7 x1ο⁵ nrekombioowαnyóh klonów fagowych poddaje się selekcji za pomocą opisanej powyżej sondy i do hybrydyzacji wybiera się dwa klony, z których każdy zawiera identyczne inserty o długości 18 kz. Przedstawiony jest podfragment EcoRI - Xbal o długości 4,4 Oz, który zawiera pełny gen kodujący zmienną domenę lekkiego łańcucha RFT5 i który jest klonowany do plazmidu pGEM4 /Stratagene/. Określa się sekwencję fragmentu o długości 4,4 Oz. SeOwenójonuje się część insertu DNA 4,4 Oz, która koduje zmienną domenę. Sekwencja jest przedstawiona w Identyfikacji Sekwencji nr 2.

Przykład IV. Konstrukcja genu chimerycznego lekkiego łańcucha RFT5.

Fragment Xbal - Xbal o długości 1,1 kz kodujący mysi wzmacniacz ciężkiego łańcucha /Heinrich i wsp., j.w./ razem z fragmentem Hmdin - SphI kodującym ludzką stałą część k subklonuje się w fagu mp18 /Stratagene/. Po rozerwaniu miejsc restrykcji przez mutagenezę wypełniony w EcoRI - HmdIII fragment, zawierający sekwencję kodującą mysi wzmacniacz ciężkiego łańcucha /Rg/ i ludzką stałą część K /huCk/ klonuje się w wypełnionym w miejscu EcoRI - BamHI plazmidzie pSV2 - DHFR. pSV2 - DHFR wytwarza się przez zastąpienie fragmentu BamHI - HindIII w plazmidzie pSV2-neo fragmentem BamHI - HindIH kodującym gen DHFR.

Następnie· do pSV2-DHFR-E μ-huCK wstawia się fragment EcoRI-XbaI o długości 4,4 kz z przykładu III.

Przykład V. Ekspresja chimerycznego przeciwciała RFT5.

Mysią linię komórkową szpiczaku SP2/O /ATCC CRS1581/ ko^^fikuje się plazmidami wytworzonymi jak w przykładach II i IV, metodą elektroporacji aparat pulser genowy firmy Biorad. Jest to znana metoda wytwarzania trwałych transfeOtaotów przy wysokiej częstotliwości.

170 321

Linia komórkowa SP2/O nie wytwarza endogennych ciężkich i lekkich łańcuchów i jest wrażliwa na genetycynę /G-418/ o stężeniu 0,8 mg/l.

Prowadzi się hodowlę komórek SP2/O w zwykłej pożywce hodowlanej RPMI, 10%o FCS, 5x10' p-merkaptoetanolu/, w fazie logarytmicznej wzrostu zbiera się i przemywa buforem elektroporacji /Bio-Rad/. Stężenie komórek doprowadza się do wartości 2x10⁷ komórek/ml. Do 0,8 ml zawiesiny komórek dodaje się 15 - 20 pg każdego plazmidu. Mieszaninę umieszcza się na lodzie i pozostawia do odstania na 10 minut. Następnie komórki poddaje się działaniu impulsu elektrycznego /280 V; 25 uF/ i znów pozostawia się do odstania na 15 minut. Komórki przenosi się do zwykłej pożywki hodowlanej i inkubuje się w 37°C w inkubatorze w atmosferze CO2.

Po 3 dniach inkubacji zaczyna się przeprowadzać selekcję ze względu na oporność na G 418. Komórki zawiesza się w świeżej pożywce zawierającej 1,4 mg/ml G 418. Określa się wydajność wzrostu komórek po 10 -14 dniach inkubacji w obecności G 418. Po 2 tygodniach inkubacji supernatanty ze zlewających się hodowli bada się na ekspresję ludzkiej IgG w układzie typu sandwich ELISa /anty-ludzki lekki łańcuch κ /supernatant/koniugat anty-ludzka IgG-alkaliczna fosfataza/.

Ten test wykazuje, że we wszystkich hodowlach wydzielana jest kompletna cząsteczka przeciwciała w zmiennych stężeniach w zakresie 50 - 500 ng/ml.

Selekcję komórek, w których został zamplifikowany gen DHFR, a więc wydzielających dużą ilość żądanego przeciwciała przeprowadza się według dwóch procedur wykorzystując oporność na Metotreksat /ΜΤλ/, j ak opisano poniżej. W tym celu każdą z pul komórek opornych na G 418 dzieli się i amplifikuje według procedury A /współczynnik wzrostu ilości mTx 2 lub 2,5/ lub procedury B /współczynnik wzrostu ΜΤλ 5/.

Procedura A |	Procedura B
100 nM ΜΤλ	| 200 nM ΜΤλ
| 250 nM ΜΤλ	1 μΜΜΤλ
500 nM ΜΤλ |	5 μΜ ΜΤλ
1 pmmtx	25 μΜ ΜΤλ
2,5 μΐ^ ΜΤλ	100 μΜ ΜΤλ
5 μΜ ΜΤλ
10 μΜΜΤλ
25 μΜ ΜΤλ
| 100 μΜ ΜΤλ

Każdy etap amplifikacji obejmuje zaszczepianie komórek z gęstością 2 x 10⁵ komórek/ml w zwykłej pożywce uzupełnionej G 418 w ilości 1,4 mg/ml i ΜΤλ w wybranym stężeniu. Po 72 godzinach inkubacji rozdziela się komórki i supernatant. Wydzielanie przeciwciała rejestruje się metodą ELISA albo HPLC stosując kolumnę z białkiem A.

Na fig. 4A i 4B przedstawiono produktywność niektórych stransfekowanych puli w wytwarzaniu przeciwciała. Większość osiąga maksymalną produkcję specyficznego przeciwciała przy pewnych stężeniach ΜΤλ. Najlepsze pule klonuje się przez ograniczające rozcieńczenie. Z kilkuset analizowanych klonów wybiera się 15 najlepszych pod względem produkcji przeciwciała. Produktywność klonów jest w zakresie od 30 do 50 mg MAb/109 komórek w ciągu 72 godzin.

Przeciwciało wydziela się z supernatantu przez elucję na kolumnie powinowactwa z białkiem A.

Identyfikacja Sekwencji nr 1

Podmiot: Zmienna domena ciężkiego łańcucha immunoglobuliny przeciwciała

RFT5

Typ sekwencji: Sekwencja nukleotydów i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów Typ cząsteczki: Genomowy DNA

170 321

Długość: 492 nukleotydy

Pochodzenie: hybridoma mysia

Cechy sekwencji nukleotydów:

Intron jest zlokalizowany od nukleotydu 47 do 130 V segment genu od nukleotydu 142 do 435 D segment genu od nukleotydu 436 do 447 J segment genu od nukleotydu 448 do 492

Cechy sekwencji aminokwasu:

Peptyd liderowy: od aminokwasu /a.k./ -19 do -1 FR1: od a.k. 1 do 30

CDR1: od a.k. 31 do 35 FR2: od a.k. 36 do 49 CDR2: od a.k. 50 do 66 FR3: od a.k. 67 do 98 CDR3: od a.k. 99 do 106 FR4: od a.k. 107 do 117.

ATG GAA TGT ΛΛΑ TGG ΑΊΑ CG A CCT TTT ATT CCT TCG GTA ATT TCA G 4(5

Met Glu Cts Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Len Ser Val Ile Ser

-15 -10 -5

GTGAGTGTTT TATTAGTTTT ATATTTGAAA GATTATTTAG GGTTTTAAGA GATAATGATA 106

TTTGCTTTTT TGTTTTCTCC ATAG	GG GTT TAT TTA	GGG GGu 1	GGT Val	CAG Gin	CCT! Leu	TAG Gin 5	156
Gly	Val	Tyr	Ser -1
TAG TTT GGG ATT GTG TTG GTT	AGG	CCT	GGG	GGA	TTC	GGT	AU	AAT	TAC	220
Gln Ser Glu Thr Val Leu Hi	Arg	Pro	GGy	AA a	Ser	Vvl	Lls	Met	SSr
10			15					20
TGT AAG GTT TTT GGT TAT AGC	ttt	AAT	AAG	TAA	TGG	AAT	CTA	TAG	AAT	225!
Cys Lys Ali Ser Gly Tyr Ser	rhe	Thh	Aao	TTy	Tao·	Met	HSs	Tao	He
25		30					35
AAA TAG AGG TTT GGA TAG GGT	TTA	GGA	TGG	AAT	GGG	GCA	AAT	TA!	CCC	300
Lys Gin Arg rro Gly Gin Gly	Leu	Glu	Ττρ	Ile	GGy	AAa	Ile	Tai1	Pro
40	45					50
GGA AAT AGT GAG ATT AGT TAT	AAT	CAG	JAG	TTC	GGG	GGG	AU	GGT	JAJA	33413
Gly Asn Ser Asp Tho Ser Tyr	Asn	GGn	Lls	Phh	GGU	GGy	Lls	AAa	Lls
55 60					65
TTG ATT GCG AGT ATA TTT GGT	AGT	ACT	GTT	TAC	AAG	GAG	CAC	AAG	AAG	396
Leu Thr Ala Vvl TAh Ser Ala	Ser	Thr	Hi	TTr	Met	GGu	Leu	Ser	Ser
70 75				80					85
TTG ATA CAC TGA GGA TCT GGT	GTT	TAT	GAC	TGG	TCA	AGJA	GAC	TAC	GGG	444
Leu Tho His GGu AAP Ser AAa	Val	Tyr	Tyr	Cts	Sei·	AAg	AAP	Tai·	GGy
90			95					100
TAT TAT TTT ATC TTC TGG GGT	TAA	GAC	ACC	ACT	CCC	AAA	GGT	TTT	TCA	492
Tyr Tyr Phe Aap Phr Trp Gly	Gin	yiy	Thr	Wir	Ler	Thr	Val	Ser	STh
105		110					115

170 321

Identyfikacja Sekwencji nr 2

Podmiot: Zmienna domena lekkiego łańcucha immunoglobuliny przeciwciała

RFT5

Typ sekwencji· Sekwencja nukleotydów i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasów

Typ cząsteczki: Genomowy DNA

Długość· 455 nukleotydów

Pochodzenie: Hybridoma mysia

Cechy sekwencji nukleotydów:

Intron jest zlokalizowany od nukleotydu 50 do 226 V segment genu: od nukleotydu 244 do 510 J2 segment genu: od nukleotydu 520 do 555

Cechy sekwencji aminokwasów:

Peptyd liderowy: od aminokwasu /a.k./-22 do -1 FR1': od a.k. 1 do 23

CDR1': od a.k. 24 do 33 FR2'· od a.k. 34 do 48 CDR2': od a.k. 49 do 55 FR3': od a.k. 56 do 87 CDR3'· od a.k. 88 do 94 RF4': od a.k. 95 do 104.

ATG GAT TTT TCG GTG CAG ATT TCC AGC TTC CCC CCC ATC ATT CCC CCA G 49

Mot Asp Phe GAn Val Gin Ile Phe Ser Phe Leu Len Ile Ser ACa Ser —20 -15 -10

GTAACGAGGA GCAGAAAATT TGAGATCGAG ATCCGACCAA GATTATTTTC CCTGGGAAGT 109 TTGAGTCTAG GCTCCGGTTT CTTTTTCTTT TTCTTCATCT lGACGCCGGG TlGCGCGGAG 119 TTATTTTTGT TTCTCTATTT CTACTGCTCC CTCTCCCCCC GTTTTGCTTT TTTCTAG 226

TC

ATA

CTC

GCC

AGA

GGA

CCA.

ATT

GGT

CTC

ACC

CAG

TCC

CAA

GA

CC C

277

Val

Ile

Leu

Ser

Arg

Gly

Gin

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ile

-5

-1

1

5

10

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GG

dG

GCC

ACC

ATG

ACC!

CGC

agt

GCC

AGC

32A

Met

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Tir

Cys

Ser

Ala

Ser

15

20

25

CCA

AGT

ATA

AGT

TAC

ATG

dG

GGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGC

CCC

TCC

369

Ser

Ser

Ile

Ser

Tyr

Met

Gin

Tpp

Tyr

Gin

Gln

Lys

Pro

Gly

Tha

Srr

30

35

90

CCC

AAG

AGA

TCG

ATT

ACT

GAC

ACA

CCC

AAA

CTG

GCT

CCC

GGA

CCC

CCC

417

Pro

Lys

Arg

TTr

Ile

Tyr

Asp

Tiar

Ser

Lys

Leu

Ala

Ser

GGy

Val

Pro

95

50

555

GCT

CGC

TTC

AGC

GGC

AU

HG

TCT

GH

ACC

TTC

Td

TCT

CTC

ACA

ACC

465

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Hy

Thr

Ser

Tti

Ser

Leu

Thr

Ile

90

95

70

AGC

AGC

ATG

GAG

GCC

GGA

GAT

GCC

GCC

ACC

TCA

TG

TGC

CAT

CAG

CGG

513

Ser

Ser

Met

Glu

Ala

Glu

Asp

Ha

Ala

Thr

Tti

tci

Cys

His

Gin

Arg

75

80

85

90

AGT

AGT

TAC

ACG

TTC

GGA

GG

UG

ACC

GGC

CTG

UlA

ACA

AAG

555

Ser

Ser

Cyr

Chr

Phe

Gly

Hy

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

95

100

170 321

Tabela

Region	Lokalizacja w ciężkim łańcuchu	Lokalizacja w lekkim łańcuchu
FR1	aminokwas 1 do 30/czasem z resztą w pozycji 0/	aminokwas 1 do 23 /czasem z resztą w pozycji 0 i 2 i delecją w 10 w łańcuchach/
CDR1	aminokwas 31 do 35/ z możliwymi insertami oznaczonymi jako 35A, 35B/	aminokwas 24 do 34 /z możliwymi insertami oznaczonymi jako 27A, B, C, D, E i F/
FR2	aminokwas 36 do 49	aminokwas 35 do 49
CDR2	aminokwas 50 do 65 /z możliwymi insertami oznaczonymi jako 52A, B i C/	aminokwas 50 do 56
FR3	aminokwas 66 do 94 / z możliwymi insertami oznaczonymi jako 82A, B i C/	aminokwas 57 do 88
CDR3	aminokwas 95 do 102 /z możliwymi insertami oznaczonymi jako 100A, B, D, E, F, G, H, I, J i K/	aminokwas 89 do 97 /z możliwymi insertami oznaczonymi jako 95A, B, D, E i F/
FR4	aminokwas 103 do 113	aminokwas 98 do 107 / z możliwymi insertami oznaczonymi jako 106A/

Claims (5)

1. Zastizcżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowej cząsteczki wiążącej CD25 zawierającej co najmniej jedno miejsce wiążące antygen, obejmujące

   a) pierwszą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3, przy czym region CDR1 ma sekwencję aminokwasów: Arg-Tyr-Trp-Met-His, region CDR2: Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly, a region CDR3: Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich równoważników;

   b) drugą domenę, która zawiera regiony nadzmienne w kolejności CDR1', CDR2' i CDR3' o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ue-Ser-Tyr-MetGln, cDr2' - Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr lub ich bezpośrednich równoważników, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej hybrydomy lub organizmu stransformowanych sekwencjami DNA kodującymi określoną powyżej pierwszą i drugą domenę i z hodowli wydziela się cząsteczkę wiążącą CD25.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25, która zawiera co najmniej jedno miejsce wiążące antygen obejmujące domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:

   Glu Val Gin Leu Gin 5

   Gin Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser 21

   Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Ile 37

   Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ee Gly Ala De Tyr Pro 53

   Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys 69

   Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 85

   Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly 101

   Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 117 i drugą domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:

   Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile 10

   Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser

   170 321

   Ser Ser Ile Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser 42

   Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Giy Val FPo 58

   Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He 74

   Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg 90

   Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Be Lys 104
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25, która obejmuje co najmniej

   a) jeden ciężki łańcuch immunoglobuliny lub jego fragment, która zawiera (i) zmienną domenę obejmującą regiony nadziemne w kolejności CDR1, CDR2 i CDR3 o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR.1 - Arg-Tyr-Trp-Met-His; CDR2 - Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-AsnSer-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly, CDR3 - Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe lub ich bezpośrednich równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego ciężkiego łańcucha i

   b) jeden lekki łańcuch immunoglobuliny lub jego fragment, który zawiera (i) zmienną domenę obejmującą kolejno regiony nadziemne CDR1', CDR2' i CDR3' o następujących sekwencjach aminokwasów: CDR1' - Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CdR2' - AspThr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, CDR3' - His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr lub ich bezpośrednich równoważników i (ii) stałą część lub jej fragment ludzkiego lekkiego łańcucha.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wytwarza się cząsteczkę wiążącą CD25, która zawiera co najmniej

   a) jeden ciężki łańcuch, który obejmuje zmienną domenę o sekwencji aminokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:

   Glu Val Gin Leu Gin 5

   Gin Ser Glu Thr Val Leu .Ala Arg Pro Gly Ala Ser val Lys Met Ser 21

   Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Ile 33

   Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Ala De Tyr Pro 5Ź3

   Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys 69

   Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 85

   Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser ARg Asp Tyr Gly 101

   Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 117 i stałą część ludzkiego ciężkiego łańcucha i

   170 321

   b) jeden lekki łeńcuca, który oóejmuje zmjenną dnmenę o sękwencji amjnokwasów zasadniczo identycznej jak następująca:

   r»_ ΐΓΜ τ nu p-* au tu> i n ^lTi ύό v «U .UCU im i IV rua ne iv

   Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 26

   Ser Ser Ee Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser 42

   Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 58

   Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ee 7-4

   Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg 90

   Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu De Lys 104 i stałą część ludzkiego lekkiego łańcucha.
5. 5. Sposób wedbug edstig . a albo 4, znamienay tym, że wytw arza wa zaąsteczkę witkęcą CD25, w której stała część lub jej fragment ludzkiego ciężkiego łańcucha jest typu γι, a stała część lub jej fragment ludzkiego lekkiego łańcucha jest typu K.