FI103131B - Menetelmä CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi - Google Patents

Description

x 103131

MENETELMÄ CD25 SITOVAN MOLEKYYLIN VALMISTAMISEKSI

Keksintö koskee menetelmää sitovan molekyylin, joka on kohdistettu CD25 antigeenille, valmistamiseksi .

5 Elimen siirtokirurgiassa, erityisesti munuai sen, maksan, sydämen, keuhkon ja luuytimen siirtokirurgiassa, on välttämätöntä supressoida siirrännäisen vastaanottajan immuunijärjestelmää leikkauksen jälkeisen siirrännäisen hylkimismahdollisuuden minimoimisek-10 si. Tähän tarkoitukseen on ehdotettu erilaisia immu- nosuppressiivisia lääkkeitä, mutta niiden käyttöä on seurattava huolellisesti, sillä sen lisäksi, että tietyt immunosuppressiiviset aineet aiheuttavat ei-toivottuja sivuvaikutuksia, vaikeutena on myös se, 15 että immunosuppressiivinen vaikutus aiheuttaa siirrän näisen vastaanottajan altistumisen bakteeri- ja virusinfektioille, jotka normaali immunijärjestelmä pystyisi hoitamaan. Immunosuppressiivisiin aineisiin, jotka ovat olleet kliinisessä käytössä menestykselli-20 siä, kuuluu steroidit, atsatiopriini ja syklosporiini A. Kliinisessä käytössä on välttämätöntä koettaa saavuttaa immunosuppressioasteen tasapaino välttämättömässä siirrännäisen hylkimistapahtumien estossa tai hoidossa ja tietyn määrän vastaanottajan immuunijär-25 jestelmän säilyttämisessä muita infektiivisiä aineita vastaan, ja samanaikaisesti pitää mahdolliset ei-toivotut sivuvaikutukset hallinnassa.

Immunosuppressiivisten aineiden lisäksi huomiota on kiinnitetty myös tiettyjen monoklonaalisten 30 vastaaineiden (MAbt) käyttöön immuunireaktioiden sup- pressoimiseksi, erityisesti huomiota on kiinnitetty monoklonaalisiin vasta-aineisiin, jotka tunnistavat erilaisia T-solujen pinta-antigeenejä. Myös tällöin ongelmia on syntynyt kliinisessä käytössä, nimittäin 35 tekniikan tasossa tunnetut vasta-aineet olivat joko liian tehokkaita tai liian tehottomia, ja ne aiheutti- 2 103131 vat toisinaan vakavia sivuvaikutuksia, kuten korkean kuumeen.

Näitä MAbita merkitään tavallisesti CDllä (Cluster Determination) numeron tullessa peräkkäisistä 5 leukosyyttien tyypitystyöryhmistä (Leucocyte Typing Workshops). Vaikka termiä, esim. CD3, käytetään nykyisin usein solun pinta-antigeenille ja MAb tälle antigeenille on usein kuvattu termillä "anti-CD3", tässä selitysosassa termejä, kuten CD3, CD2 5 jne. käytetään 10 MAbille ja vastaavia solun pinta-antigeenejä merkitään "CD3 antigeeni" jne.

Erityisesti, monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on kohdistettu kaikissa T-soluissa oleville mem-braaniantigeeneille (kutsutaan myös yleis-T-15 soluantigeeneiksi, pan T-cell antigens), kuten CD3 antigeenille, ovat hyvin tehokkaita vasta-aineita omaten yleistä immunosuppressiivistä aktiivisuutta immuunijärjestelmää kohtaan. Tällöin ihmisen keho jää ilman välitöntä immuunivastetta, jota T-muistisolut välittä-20 vät infektion esiintyessä. Tämä ei ole todellakaan toivottavaa yritettäessä hoitamisen sijasta ehkäistä siirrännäisen hylkimistapahtumia. Profylaksiaan sopivan hoidon pitäisi olla oleellisesti selektiivinen, so. T-muistisolujen joukko pitäisi pitää koskemattoma-25 na, kun taas T-solujen joukko (aktivoidut T-solut), ' jonka pitäisi olla suoraan yhteydessä hylkimistapahtu- man kanssa, pitäisi inaktivoida.

Tämä toivottu päämäärä voidan saavuttaa käyttämällä aktivoiduille T-soluille kohdistettuja vasta-30 aineita. Näille T-soluille on tunnusomaista, että niiden membraanipinnassa on suuren affiniteetin IL-2 re-« m • septori. Suuren affiniteetin IL-2 reseptori koostuu ainakin kahdesta erilaisesta polypeptidiketjusta, a-ketjusta, joka tunnetaan myös nimellä CD25 antigeeni, 35 ja β-ketjusta. Lepäävät T-solut eivät ilmennä tätä suuren affiniteetin reseptoria, vaan alhaisen tai keskinkertaisen affiniteetin reseptoreja, jotka koostuvat 3 103131 a- ja β-ketjuhomodimeereistä. CD25 vasta-aine, joka estää IL-2:n sitoutumista sen suuren affiniteetin reseptoriin ja siten suppressoi selektiivisesti immuunivastetta, on mahdollinen vasta-aine siirrännäisten 5 hylkimistapahtumien profylaksiaan.

Luonnon immunoglobuliinit tai vasta-aineet ovat rakenteeltaan yleensä Y-muotoisia multimeerisiä molekyylejä, joissa on antigeeni-sitova kohta kummankin ylemmän haaran päässä. Loppuosa rakenteesta, eri-10 tyisesti Y:n runko, välittää immunoglobuliineihin yhteydessä olevia efektoritoimintoja. IgG luokan vasta-aineen yleinen rakenne on esitetty kaaviomaisesti kuvassa IA. Sekä raskaat että kevyet ketjut sisältävät vaihtelevan domeenin (variable domain) ja vakio-osan 15 (constant part). Antigeenin sitova kohta koostuu raskaan ketjun vaihtelevasta domeenista yhdessä kevyen ketjun vaihtelevan domeenin kanssa. Raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevilla domeeneilla on sama yleinen rakenne, joka on esitetty kuvassa IB.

20 Yksityiskohtaisemmin, vasta-aineen antigeenin sitovan ominaisuuden määrää oleellisesti 3 spesifistä aluetta raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevassa domeenissa, joita kutsutaan hypervaihteleviksi alueiksi (hypervariable regions) tai komplementaarisuuden 25 määrääviksi alueiksi (complementarity determining regions, CDRt) . Kuvan IB mukaisesti nämä 3 hypervaihte-levaa aluetta vuorottelevat 4 lukuraamialueen (framework regions, FRt) kanssa, joiden sekvenssit ovat suhteellisen säilyneet ja jotka eivät ole suoraan 30 tekemisissä sitomisen kanssa. CDRt muodostavat silmukoita ja ne pysyvät lähekkäin lukuraamialueiden toi- « : mesta, jotka ovat mukautuneena suurelta osin β- laskoskonformaatioon. Raskasketjun CDRt yhdessä assosioituneiden kevyiden ketjujen CDRien kanssa muodosta-35 vat oleellisesti vasta-ainemolekyylin antigeenin sitovan kohdan.

4 103131 FR- tai CDR alueen määritys suoritetaan tavallisesti vertaamalla samassa lajissa muodostuneiden lukuisten vasta-aineiden aminohapposekvenssejä. Taulu- , kossa I on annettu yleiset säännöt CDR- ja FR alueiden 5 tunnistamiseksi.

Äskettäin on lisäksi havaittu, että kevyen ketjun vaihtelevan domeenin myötävaikutus sitomisener-giaan on pieni verrattuna assosioituneen raskaan ketjun vaihtelevan domeenin myötävaikutukseen ja että 10 eristetyillä raskaan ketjun vaihtelevilla domeeneilla on itsellään antigeenin sitovaa aktiivisuutta. Tällaisiin molekyyleihin viitataan nykyään yhden domeenin vasta-aineina.

Joitakin hiiren CD25 MAbeja tunnetaan jo, ja 15 niihin kuuluu 33B3-1 (Immunotech-Merieux), BDaIL-2R (Becton-Dickinson), 2C8 (Amersham), Campath 6 (MRC,

Cambridge) ja ATH207 (Avoin Yliopisto, Berliini).

Wijdenes et ai., Cell. Basis Immune Modulation 551-555 (1989), on tutkinut IL-2 aiheuttavan PHA/T solujen 20 proliferaation inhibitiota nähtävästi IgGl kappa iso-tyypin modifioimattomalla Mablla esittämättä aminohapposekvenssiä. Queen et ai. käyttämiä CDRiä humanisoitujen vasta-aineiden valmistamiseksi kuvataan useissa julkaisuissa [FI-A-895955, Queen et ai., Proc. Natl.

25 Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989), Junghans et ai.

Cancer Res. 50:1495-1502 (1990), FI-A-912436]. Ne kaikki eroavat keksinnön mukaisista CDRistä. Julkaisuissa Widjenes ja Queen ei myöskään esitetä tai ehdoteta esillä olevan keksinnön mukaisia CDR aminohappo-30 sekvenssejä. Nyt on kuitenkin havaittu, että uudella IgG2a isotyypin CD25 vasta-aineella, josta käytetään * myöhemmin nimitystä RFT5-IgG2a, on paremmat ominaisuudet kuin aikaisemmin tunnetuilla CD25 vasta-aineilla erityisesti sitomisaffiniteetin suhteen ja että muiden 35 CD25 sitovien molekyylien, joilla on samat hypervaih-televat alueet kuin RFT5-IgG2a:11a, muodostaminen on mahdollista.

5 103131

Keksintö tuo siten esiin menetelmän CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi, johon molekyyliin kuuluu ainakin yksi antigeenin sitova kohta, joka sisältää ainakin yhden domeenin, jonka sekvenssi puoles-5 taan sisältää hypervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3; ja mainitun CDRlrn aminohapposekvenssi on Arg-Tyr-Trp-Met-His, mainitun CDR2:n aminohapposekvenssi on Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly ja mainitun CDR3-.n aminohapposek-10 venssi on Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe; ja molekyylin välittömät ekvivalentit.

Keksinnön mukaisessa eräässä sovellutuksessa CD25 sitovaan molekyyliin kuuluu yksi antigeenin sitova kohta, joka sisältää yhden domeenin.

15 Keksinnön mukaisessa eräässä toisessa sovel lutuksessa CD25 sitovaan molekyyliin kuuluu ainakin yksi antigeenin sitova kohta, joka sisältää: a) ensimmäisen domeenin, jonka sekvenssi sisältää hypervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3; ja mainitun 20 CDRl:n aminohapposekvenssi on Arg-Tyr-Trp-Met-His, mainitun CDR2:n aminohapposekvenssi on Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly, ja mainitun CDR3:n aminohapposekvenssi on Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe; 25 b) toisen domeenin, jonka sekvenssi sisältää hypervaihtelevat alueet CDR1', CDR2'ja CDR3', ja mainitun CDRl':n aminohapposekvenssi on Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-

Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, mainitun CDR2':n aminohapposekvenssi on Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser, ja mainitun 30 CDR3':n aminohapposekvenssi on His-Gln-Arg-Ser-Ser-

Tyr-Thr; sovellutukseen kuuluessa sen välittömät joh- * dannaiset.

Ellei toisin mainita, jokaisen myöhemmin kuvatun polypeptidiketjun aminohapposekvenssi alkaa N-35 terminaalipäästä ja loppuu C-terminaalipäähän.

Kun antigeenin sitova kohta koostuu sekä ensimmäisestä että toisesta domeenista, ne voivat sijai- 6 103131 ta samassa polypeptidimolekyylissä, tai edullisesti kumpikin domeeni on eri ketjussa ensimmäisen domeenin ollessa osa immunoglobuliinin raskasta ketjua tai sen fragmenttia ja toisen domeenin ollessa osa immunoglo-5 buliinin kevyttä ketjua tai sen fragmenttia.

"CD25 sitovalla molekyylillä" tarkoitetaan mitä tahansa molekyyliä, joka pystyy sitomaan CD25 antigeenin, joka on joko yksin tai assosioituneena toisiin molekyyleihin suuren affiniteetin IL-2 resep-10 toreiden muodostamiseksi. Sitomisreaktio voidaan osoittaa standardimenetelmin (kvalitatiiviset määritykset) , joihin kuuluu esim. biomääritys IL-2:n reseptoriin sitoutumisen inhibition määrittämiseksi tai mikä tahansa sitomismääritys, jonka referenssinä on 15 negatiivinen kontrollikoe, jossa käytetään ei ko. yh teyteen liittyvää spesifisyyttä omaavaa vasta-ainetta, esim. anti-lysosyymivasta-ainetta. Keksinnön mukaisen molekyylin CD25 antigeenin sitominen voidaan edullisesti osoittaa kompetitiivisellä sitomiskokeella käyt-20 täen AHT207-, BDccIL-2-R- tai 33B3-l-vasta-aineita kil pailijoina. Esimerkki sitomismäärityksestä on esitetty alla.

Ihmisen periferaalisia veren mononukleaari-soluja (HPBM) kasvatetaan RPMI 1640 kasvatusliuokses-25 sa, jota on täydennetty 2 mM L-glutamiinilla, 100 yk- ‘ sikköä/ml penisilliinillä, 100 μg/ml streptomysiinil lä, 25 mM natriumbikarbonaatilla ja 10 % vasikan siki-öseerumilla (FCS). 1 μg/ml fytohemagglutiinia (PHA) käytetään stimuloimaan HPBMä. Kolmen päivän kuluttua 30 blastit uudelleensuspendoidaan pitoisuuteen 3.106/ml fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, jota on täyden-• * • netty 2 % härän seerumialbumiinilla (BSA) ja 2 % atsi- « dilla. 50 μΐ tämän suspension näytteitä inkuboidaan 10 min 20°C lämpötilassa, ei-päällystetyissä olosuhteissa 35 blokkaavan vasta-aineen (kilpailija) asteittaisissa pitoisuuksissa 1-100 μg/ml. Sitten soluihin lisätään 1 μg/ml keksinnön mukaista biotinyloitua vasta-ainetta 7 103131 ja inkubointia jatketaan 10 min ajan. Solut pestään ja niitä inkuboidaan vielä 10 min ajan fluoresiini-leimatulla streptavidiinilla. Soluja pestään jälleen, ne kiinnitetään formaliinilla ja analysoidaan fluo-5 rosytometrillä, jolla todetaan biotinyloidun vasta-aineen sitominen. Samanaikaisesti suoritetaan negatiivisena kontrollina koe ei ko. yhteyteen liittyvän spesifisyyden omaavalla vasta-aineella.

Esimerkkeinä antigeenin sitovista molekyy-10 leistä mainittakoon B-solujen tai hybridoomien tuottamat vasta-aineet ja kimeeriset tai humanisoidut vasta-aineet tai niiden fragmentit, esim. F(ab'>2 ja Fab fragmentit, kuin myös yksiketjuiset tai yksidomeeniset vasta-aineet.

15 Yksiketjuinen vasta-aine koostuu vasta-aineen raskaiden ja kevyiden ketjujen vaihtelevista domee-neista, jotka on liitetty toisiinsa kovalenttisesti peptidilinkkerin avulla, ja se sisältää 10-30 aminohappoa, edullisesti 15-25 aminohappoa. Siten tällainen 20 rakenne ei sisällä raskaiden ja kevyiden ketjujen vakio-osia, ja oletetaan, että pieni kokoinen peptidi olisi vähemmän antigeeninen kuin kokonainen vakio-osa. "Kimeerisellä vasta-aineella" tarkoitetaan vasta-ainetta, jossa raskaiden tai kevyiden ketjujen, tai 25 molempien, vakiot alueet ovat peräisin ihmisestä, kun taas sekä raskaiden että kevyiden ketjujen vaihtelevat domeenit ovat peräisin ei-ihmisestä (esim. hiirestä). "Humanisoidulla vasta-aineella" tarkoitetaan vasta-ainetta, jossa hypervaihtelevat alueet (CDRt) ovat 30 peräisin ei-ihmisestä (esim. hiirestä), kun taas kaikki tai oleellisesti kaikki muut osat immunoglobulii-• nia, esim. vakiot alueet ja vaihtelevien domeenien erittäin konservoituneet osat, so. lukuraamialueet, ovat peräisin ihmisestä. Humanisoitu vasta-aine voi 35 kuitenkin säilyttää hiiren sekvenssistä muutamia aminohappoja lukuraamialueiden osissa, jotka ovat hyper-vaihtelevien alueiden vieressä.

e 103131

Hypervaihtelevat alueet voivat olla assosioituneena minkä tahansa lukuraamialueiden kanssa, edullisesti sellaisten, jotka ovat peräisin hiirestä tai ihmisestä. Sopivia lukuraamialueita on kuvattu teok-5 sessa, "Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E. A. et ai, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health. Edullisin raskasketjulukuraami on kuitenkin RFT5-IgG2a:n, joka on esitetty sekvenssitunnis-10 tus no 1:ssä. Sen sekvenssi sisältää FRI:n, FR2:n, FR3:n ja FR4:n alueet. Sekvenssitunnistus no 2:ssa on esitetty vastaavasti edullisin RFT5-IgG2a kevytketju-lukuraami, jonka sekvenssi sisältää FRl':n, FR2':n, FR3':n ja FR4':n alueet.

15 Keksintö tuo myös siten esiin CD25 sitovan molekyylin, johon kuuluu ainakin yksi antigeenin sitova kohta, joka sisältää joko ensimmäisen domeenin, jonka aminohapposekvenssi on oleellisesti identtinen sekvenssitunnistus no. l:ssä esitetyn kanssa alkaen 20 aminohaposta paikassa 1 ja päättyen aminohappoon paikassa 117, tai edellä kuvatun mukaisen ensimmäisen domeenin ja toisen domeenin, jonka aminohapposekvenssi on oleellisesti identtinen sekvenssitunnistus no. 2:ssa esitetyn kanssa alkaen aminohaposta paikassa 1 25 ja päättyen aminohappoon paikassa 104.

Kaikissa ihmisissä luonnostaan tavattaville proteiinille muodostuvat monoklonaaliset vasta-aineet täytyy välttämättä kehittää ei-ihmisjärjestelmässä, esim. hiiressä. Tästä johtuu, että hybridooman tuotta-30 ma ksenogeeninen vasta-aine, kun sitä annetaan ihmisille, aikaansaa ei-toivottavan immuunivasteen, joka välittyy pääasiallisesti ksenogeenisen immunoglobulii-nin vakio-osan toimesta. Tämä rajoittaa selvästi tällaisten vasta-aineiden käyttöä, sillä niitä ei voida 35 antaa pitkiä aikajaksoja. Siten on erityisen edullista käyttää yhtä ketjua, yhtä domeenia, kimeerisiä tai humanisoituja vasta-aineita, jotka eivät todennäköi- 9 103131 sesti aiheuta merkittävää allogeenistä vastetta ihmisille annettaessa.

Edellä esitetty huomioiden keksinnön mukainen erityisen edullinen CD25 sitova molekyyli on kimeeri-5 nen anti-CD25 vasta-aine, joka sisältää ainakin: a) yhden immunoglobuliinin raskaan ketjun tai sen fragmentin, johon kuuluu (i) vaihteleva domeeni, jonka sekvenssi sisältää hypervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3, ja (ii) ihmisen raskaan ketjun vakio-osa tai 10 sen fragmentti; ja CDRl:n aminohapposekvenssi on Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2:n aminohapposekvenssi on Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly ja CDR3:n aminohapposekvenssi on Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe, ja 15 b) yhden immunoglobuliinin kevyen ketjun tai sen fragmentin, johon kuuluu (i) vaihteleva domeeni, jonka sekvenssi sisältää hypervaihtelevat alueet CDR1', CDR21 ja CDR31, ja (ii) ihmisen kevyen ketjun vakio-osa tai sen fragmentti; ja CDRl':n aminohapposekvenssi 20 on Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2':n aminohapposekvenssi on Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser ja CDR3':n aminohapposekvenssi on His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr; ja sen välittömät ekvivalentit.

25 Keksinnön mukainen CD25 sitova molekyyli voi vaihtoehtoisesti olla yksiketjuinen sitova molekyyli, joka sisältää antigeenin sitovan kohdan, joka puolestaan sisältää: a) ensimmäisen domeenin, jonka sekvenssi sisältää hy- 30 pervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3, joiden hy- pervaihtelevien alueiden aminohapposekvenssit ovat sekvenssitunnistus no l:n mukaiset, b) toisen domeenin, jonka sekvenssi sisältää hyper vaihtelevat alueet CDR1', CDR2' ja CDR3', joiden hy- 35 pervaihtelevien alueiden aminohapposekvenssit ovat sekvenssitunnistus no 2:n mukaiset, ja 10 103131 c) peptidi linkkerin, joka on liitetty joko ensimmäisen domeenin N-terminaalipäähän ja toisen domeenin C-terminaalipäähän tai ensimmäisen domeenin C-terminaalipäähän ja toisen domeenin N-terminaali-5 päähän; ja sen välittömät ekvivalentit.

Kuten hyvin tiedetään, pienet muutokset aminohapposekvenssissä, kuten yhden tai useamman aminohapon deleetio, lisäys tai substituutio, voi johtaa al-10 kuperäisen proteiinin alleeliseen muotoon, jolla on oleellisesti identtiset ominaisuudet. Siten termillä "sen välittömät ekvivalentit" tarkoitetaan joko mitä tahansa yksidomeenista CD25 sitovaa molekyyliä (molekyyli X), 15 (i) jossa hypervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3 ovat kokonaisuutena ainakin 80 %, edullisesti ainakin 90 %, edullisemmin ainakin 95 %, homologisia sekvens-situnnistus no 1:ssä esitettyihin hypervaihteleviin alueisiin nähden, ja 20 (ii) joka kykenee inhiboimaan IL-2:n sitoutumista tämän reseptoriin oleellisesti yhtä paljon kuin refe-renssimolekyyli, jonka lukuraamialueet vastaavat molekyylin X vastaavia, mutta hypervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3 vastaavat sekvenssitunnistus no 25 l:ssä esitettyjä alueita; tai mitä tahansa CD25 sitovaa molekyyliä, joka sisältää ainakin kaksi domeenia per sitova kohta (molekyyli X’) , 3 0 (i) jossa hypervaihtelevat alueet CDR1, CDR2, CDR3, CDRl', CDR2' ja CDR3' ovat kokonaisuutena ainakin 80 %, edullisesti ainakin 90 %, edullisemmin ainakin 95 %, homologisia sekvenssitunnistus no l:ssä ja 2:ssa esitettyihin hypervaihteleviin alueisiin nähden, ja 35 (ii) joka kykenee inhiboimaan IL-2-.n sitoutumista tämän reseptoriin oleellisesti yhtä paljon kuin refe-renssimolekyyli, jonka lukuraamialueet ja vakio-osat 11 103131 vastaavat molekyylin X' vastaavia, mutta hypervaihte-levat alueet CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' ja CDR31 vastaavat sekvenssitunnistus no l:ssä ja 2:ssa esitettyjä alueita.

5 Tämä viimeinen kriteeri voidaan sopivasti tarkastaa erinäisillä määrityksillä, kuten sekoitetulla lymfosyytti -biomäärityksellä (Mixed Lymphosyte • Reaction, MLR), antigeenispesifisellä HPBM vaste biomäärityksellä ja IL-2 riippuvalla T lymfoblastipro-10 liferaatio -biomäärityksellä. Näitä määrityksiä on kuvattu myöhemmin tässä selitysosassa. Termillä, "yhtä paljon", tarkoitetaan, että referenssi- ja ekvivalent-timolekyyleillä on tilastollisesti tarkasteltaessa oleellisesti samanlaiset IL-2 sitoutumisen inhibitiota 15 kuvaavat kuvaajat yhdessä edellä esitetyistä määrityksistä .

Edullisimmin kimeerinen CD25 vasta-aine sisältää ainakin: a) yhden raskaan ketjun, johon kuuluu vaihteleva do- 20 meeni, jonka aminohapposekvenssi vastaa oleellisesti sekvenssitunnistus no l:ssä esitettyä sekvenssiä alkaen aminohappopaikasta 1 ja päättyen aminohappopaikkaan 117, ja ihmisen raskaan ketjun vakio-osa; ja b) yhden kevyen ketjun, johon kuuluu vaihteleva domee-25 ni, jonka aminohapposekvenssi vastaa oleellisesti sek- venssitunnistus no 2:ssa esitettyä sekvenssiä alkaen glutaamihaposta paikassa 1 ja päättyen glutaamihappoon paikassa 104, ja ihmisen kevyen ketjun vakio-osa.

Ihmisen raskaan ketjun vakio-osa voi olla γχ-, 30 J2-' Y3- / Y4-f μ-f «1-/ «2-» δ- tai ε-tyyppiä, edulli sesti γ-tyyppiä, edullisemmin Υι-tyyppiä, kun taas ihmisen kevyen ketjun vakio-osa voi olla k- tai λ-tyyppiä (sisältää λχ-, λ2- ja λ3-alatyypit), mutta se on edullisesti k-tyyppiä. Kaikkien näiden vakio-osien 35 aminohapposekvenssit on annettu teoksessa Kabat et ai (Supra).

12 103131

Keksinnön mukaisten CD25 molekyylien konju-gaatit, esim. entsyymi-, toksiini- tai radioisotooppi-konjugaatit, kuuluvat myös keksinnön piiriin.

Keksinnön mukainen CD25 sitova molekyyli voi-5 daan valmistaa yhdistelmä DNA menetelmillä. Näin ollen täytyy muodostaa yksi tai useampia sitovaa molekyyliä koodaavaa DNA molekyyliä, joka/jotka varustetaan sopivilla kontrollisekvensseillä ja siirretään sopivaan isäntäorganismiin ilmentymistä varten.

10 Yleisesti ottaen tuodaan esiin: (i) DNA molekyylejä, jotka koodaavat keksinnön mukaista yksidomeenista CD25 sitovaa molekyyliä, keksinnön mukaista yksiketjuista CD25 sitovaa molekyyliä, keksinnön mukaisen CD25 sitovan molekyylin raskasta tai 15 kevyttä ketjua tai niiden fragmentteja, ja (ii) keksinnön mukaisten DNA molekyylien käyttö keksinnön mukaisen CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi yhdistelmämenetelmin.

Tekniikan taso tällä hetkellä on sellainen, 20 että alan ammattilainen kykenee syntetisoimaan keksinnön mukaiset DNA molekyylit tässä yhteydessä annettujen tietojen, so. hypervaihtelevien alueiden aminohapposekvenssien ja niitä koodaavien DNA sekvenssien, perusteella. Menetelmä vaihtelevan domeenin geenien 25 muodostamiseksi on kuvattu esim. julkaisussa EPÄ 239 ' 400 ja menetelmä käsittää lyhyesti: Geeni, joka koodaa mitä tahansa spesifisyyttä omaavan MAb:n vaihtelevaa domeenia, kloonataan. Lukuraami- ja hypervaihtelevia alueita koodaavat DNA segmentit määritetään ja hyper-30 vaihtelevia alueita koodaavat DNA segmentit poistetaan siten, että lukuraamialueita koodaavat DNA segmentit fuusioidaan yhteen sopivilla restriktiokohdilla liitoskohdissa. Restriktiokohtia voidaan generoida sopiviin paikkoihin DNA molekyyliä standardimenetelmillä 35 tapahtuvan mutageneesin avulla. Kaksisäikeisiä synteettisiä CDR kasetteja valmistetaan DNA synteesillä sekvenssitunnistus no l:ssä tai 2:ssa esitettyjen sek- is 103131 venssien mukaisesti. Nämä kasetit varustetaan tarttuvilla päillä (sticky ends) siten, että ne voidaan sitoa lukuraamin liitoskohtiin. Kuvassa 5 on esitetty kaavio immunoglobuliinin vaihtelevaa domeenia koodaa-5 van DNA molekyylin aikaansaamiseksi.

Edelleen ei ole välttämätöntä, että tuottavan hybridoomasolulinjan mRNAta olisi saatavilla keksinnön mukaisia MAbeja koodaavien DNA kokoonpanojen muodostamiseksi. Siten PCT patenttihakemusjulkaisu WO 90/07861 10 sisältää täydelliset ohjeet MAbiden valmistamiseksi yhdistelmä DNA menetelmillä, kun geenin nukleotidisek-venssille annetaan pelkästään kirjallista tietoa. Menetelmässä syntetisoidaan lukuisia oligonukleotidejä, niitä lisätään PCR menetelmällä ja niitä silmukoidaan 15 haluttujen DNA sekvenssien saamiseksi.

Ilmentymisvektoreita, jotka sisältävät sopivia promoottoreita, tai geenejä, jotka koodaavat raskaiden ja kevyiden ketjujen vakioita alueita, on yleisesti saatavilla. Siten kun keksinnön mukainen DNA 20 molekyyli on valmistettu, se voidaan sopivasti siirtää asianmukaiseen ilmentymisvektoriin. Yksiketjuisia vasta-aineita koodaavia DNA molekyylejä voidaan myös valmistaa standardimenetelmin, esim. patenttijulkaisussa WO 88/1649 kuvatun mukaisesti.

25 Edellä esitetty huomioiden ja, koska hybri- dooman luonnollisesti erittämä hiiren MAb ei ole edullinen MAb tyyppi, uskotaan, että hybridoomatalletus ei ole välttämätön riittävän kuvauksen aikaansaamiseksi.

Keksinnön erääseen erityiseen sovellutukseen 30 CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi yhdistelmäkei-noin kuuluu ensimmäinen ja toinen DNA kokoonpano alla . kuvatun mukaisesti;

Ensimmäinen DNA kokoonpano koodaa raskasta ketjua tai sen fragmenttia ja se sisältää: 35 a) ensimmäisen osan, joka koodaa vaihtelevaa domeenia, johon kuuluu vuorottelevasti lukuraami- ja hypervaih-televat alueet, jotka hypervaihtelevat alueet ovat 14 103131 järjestyksessä CDR1, CDR2 ja CDR3 ja joiden aminohapposekvenssit on esitetty sekvenssitunnistus no l:ssä; tämän ensimmäisen osan alkaessa vaihtelevan domeenin ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päät-5 tyen vaihtelevan domeenin viimeistä aminohappoa koo-daavaan kodoniin, ja b) toisen osan, joka koodaa raskaan ketjun vakio-osaa tai sen fragmenttia alkaen raskaan ketjun vakio-osan ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päät-10 tyen vakio-osan tai sen fragmentin viimeistä aminohappoa koodaavaan kodoniin, jota seuraa nonsense-kodoni.

Tämä ensimmäinen osa koodaa edullisesti vaih-televaa domeenia, jolla on oleellisesti samanlainen aminohapposekvenssi kuin sekvenssitunnistus no l:ssä 15 esitetty aminohapposekvenssi alkaen aminohaposta paikassa 1 ja päättyen aminohappoon paikassa 117. Ensimmäisellä osalla on edullisemmin sekvenssitunnistus no l:n mukainen nukleotidisekvenssi alkaen nukleotidistä paikassa 142 ja päättyen nukleotidiin paikassa 492. 20 Edelleen edullisesti, toinen osa koodaa ihmisen raskaan ketjun vakio-osaa, edullisemmin ihmisen γΐ ketjun vakio-osaa. Tämä toinen osa voi olla genomista alkuperää oleva DNA fragmentti (sisältää intronit) tai cDNA fragmentti (ilman introneja).

25 Toinen DNA kokoonpano koodaa kevyttä ketjua ·; tai sen fragmenttia ja se sisältää a) ensimmäisen osan, joka koodaa vaihtelevaa domeenia, johon kuuluu vuorottelevasti lukuraami- ja hypervaih-televat alueet; jotka mainitut hypervaihtelevat alueet 30 ovat järjestyksessä CDR1', CDR2' ja CDR3'ja joiden aminohapposekvenssit on esitetty sekvenssitunnistus no 2:ssa; ensimmäisen osan alkaessa vaihtelevan domeenin ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päättyen vaihtelevan domeenin viimeistä aminohappoa koo-35 daavaan kodoniin, ja b) toisen osan, joka koodaa kevyen ketjun vakio-osaa tai sen fragmenttia alkaen kevyen ketjun vakio-osan 15 103131 ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päättyen vakio-osan tai sen fragmentin viimeistä aminohappoa koodaavaan kodoniin, jota seuraa nonsense-kodoni.

Ensimmäinen osa koodaa edullisesti vaihtele-5 vaa domeenia, jolla on oleellisesti samanlainen aminohapposekvenssi kuin sekvenssitunnistus no 2:ssa esitetty aminohapposekvenssi alkaen aminohaposta paikassa 1 ja päättyen aminohappoon paikassa 104. Ensimmäisellä osalla on edullisemmin sekvenssitunnistus no 2:n mu-10 kainen nukleotidisekvenssi alkaen nukleotidistä paikassa 244 ja päättyen nukleotidiin paikassa 555. Edelleen edullisesti toinen osa koodaa ihmisen kevyen ketjun vakio-osaa, edullisemmin ihmisen κ ketjun vakio-osaa .

15 Ensimmäisessä ja toisessa DNA kokoonpanossa ensimmäinen ja toinen osa on edullisesti erotettuna toisistaan intronilla. Ensimmäisen ja toisen osan välissä sijaitsevaan introniin on viety edullisesti käynnistäjä (enhancer). Tämän transkriptoituvan, mutta 20 ei translatoituvan geneettisen elementin läsnäolo voi olla välttämätön toisen osan tehokkaalle transkriptoi-tumiselle. Ensimmäinen ja toinen DNA kokoonpano sisältää edullisesti ihmisestä peräisin olevan raskaan ketjun geenin käynnistäjää.

25 Ensimmäinen ja toinen DNA kokoonpano sisältää edullisesti kolmannen osan, joka sijaitsee ensimmäisen osan edellä ja joka koodaa osaa johtopeptidistä (leader peptide); tämän kolmannen osan alkaessa johto-peptidin ensimmäistä aminohappoa koodavasta kodonista 30 ja päättyen johtopeptidin viimeiseen aminohappoon. Tätä peptidiä tarvitaan ketjujen erittymiseksi isäntä-·' organismista, jossa ne ilmentyvät ja josta ne sitten poistuu isäntäorganismin toimesta. Ensimmäisen DNA kokoonpanon kolmas osa koodaa edullisesti johtopepti-35 diä, jolla on oleellisesti samanlainen aminohapposekvenssi kuin sekvenssitunnistus no l:ssä esitetty sekvenssi alkaen aminohaposta paikassa -19 ja päättyen ie 103131 aminohappoon paikassa -1. Edelleen edullisesti toisen DNA kokoonpanon kolmas osa koodaa johtavaa peptidiä, jolla on sekvenssitunnistus no 2:ssa esitetyn mukainen aminohapposekvenssi alkaen aminohaposta paikassa -22 5 ja päättyen aminohappoon paikassa -1.

Kukin DNA kokoonpano saatetaan sopivien kont-rollisekvenssien kontrolloimiksi, erityisesti sopivan promoottorin kontrolloimaksi. Voidaan käyttää mitä tahansa promoottoria ehdolla, että se soveltuu isäntä-10 organismille, johon DNA kokoonpano siirretään ilmentymistä varten. Mikäli ilmentyminen kuitenkin tapahtuu nisakässolussa, on erityisen edullista käyttää immu-noglobuliinigeenin promoottoria.

Haluttu vasta-aine voidaan valmistaa soluvil-15 jelmässä tai · transgeenisessä eläimessä. Sopiva transgeeninen eläin voidaan saada standardimenetelmin, joihin kuuluu munien mikroinjektointi ensimmäisellä ja toisella DNA kokoonpanolla, jotka ovat sopivien kont-rollisekvenssien alaisia, ja näin valmistettujen muni-20 en siirto asianmukaisiin, valeraskaana oleviin naaraisiin sekä haluttua vasta-ainetta ilmentävän jälkeläisen valinta.

Kun vasta-aineketjut täytyy valmistaa soluviljelmässä, DNA kokoonpanot täytyy ensin insertoida 25 joko yhteen ilmentymisvektoriin tai kahteen erilli-’· seen, mutta yhteensopivaan ilmentymisvektoriin, jäl kimmäisen vaihtoehdon ollessa edullisempi.

Keksintö tuo siten esiin myös iImentyrnisvektorin, joka kykenee replikoitumaan prokariootti- ja 30 eukarioottisolulinjassa ja joka sisältää ainakin yhden edellä kuvatun DNA kokoonpanon.

« • Kukin DNA kokoonpanon sisältävä ilmentymis- vektori siirretään sitten sopivaan isäntäorganismiin. Kun DNA kokoonpanot insertoidaan erikseen kahteen il-35 mentymisvektoriin, ne voidaan siirtää erikseen, so. yhden tyyppinen vektori per solu, tai siirtää yhdessä, jälkimmäisen vaihtoehdon ollessa edullisempi. Sopivana 17 103131 isäntäorganismina voi olla bakteeri-, hiiva- tai nisä-kässolulinja, jälkimmäisen ollessa edullisin. Nisäkäs-solulinja on edullisesti lymfoidista alkuperää, esim. myelooma, hybridooma tai normaali immortalisoitu B-5 solu, joka ei kuitenkaan ilmennä mitään endogeenista vasta-aineen raskasta tai kevyttä ketjua.

Edelleen edullisesti isäntäorganismi sisältää suuria määriä vektorikopioita per solu. Mikäli isäntä-organismi on nisäkässolulinja, tämä haluttu tulos saa-10 vutetaan lisäämällä kopioiden lukumäärää standardimenetelmin. Lisäämismenetelmät perustuvat valintaan lisääntyneen lääkeresistenssin suhteen, ilmentymisvekto-rin koodatessa mainittua resistenssiä.

Edelleen keksintö tuo eräänä sovellutuksena 15 esiin menetelmän moniketjuisen CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi, jolloin (i) viljellään organismia, joka on transformoitu keksinnön mukaisella ensimmäisellä ja toisella DNA kokoonpanolla, ja (ii) otetaan talteen aktiivinen CD25 sitova molekyyli kasvatusvil-20 jelmästä.

Raskaat ja kevyet ketjut voidaan vaihtoehtoisesti ottaa talteen erikseen ja uudelleenkoota aktiiviseksi sitovaksi molekyyliksi in vitro uudelleenlas-kostuksen jälkeen. Uudelleenkokoamismenetelmät ovat 25 tekniikan tasossa hyvin tunnettuja; esimerkkeinä mene-telmistä mainittakoon julkaisut EPÄ 120 674 tai EPÄ 125 023.

Siten menetelmä voi myös sisältää: (i) viljellään ensimmäistä organismia, joka on trans-30 formoitu keksinnön mukaisella ensimmäisellä DNA kokoonpanolla, ja otetaan talteen mainittu raskas ketju : tai sen fragmentti kasvatusviljelmästä, ja (ii) viljellään toista organismia, joka on transformoitu keksinnön mukaisella toisella DNA kokoonpanolla, 35 ja otetaan talteen mainittu kevyt ketju tai sen fragmentti kasvatusviljelmästä, ja 18 103131 (iii) uudelleenkootaan in vitro kohdassa (i) saadusta raskaasta ketjusta tai sen fragmentista ja kohdassa (ii) saadusta kevyestä ketjusta tai sen fragmentista aktiivinen CD25 sitova molekyyli.

5 Samalla tavoin tuodaan esiin menetelmä yksi- ketjuisen tai yksidomeenisen CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi, jolloin (i) viljellään organismia, joka on transformoitu keksinnön mukaista yksiketjuista tai yksidomeenista CD25 sitovaa molekyyliä vastaavasti 10 koodaavalla DNA kokoonpanolla, ja (ii) otetaan talteen mainittu molekyyli kasvatusviljelmästä.

Keksinnön mukaiset CD25 sitovat molekyylit omaavat erittäin edullista immunomodulatorista aktiivisuutta, kuten on osoitettu esim. sekoitetussa lym-15 fosyyttireaktio (MLR) -biomäärityksessä (Akbar et ai, J. Immunol. 140. 2171-8). MLRn katsotaan tavallisesti vastaavan in vitro allogeenista siirrännäisen vastetta, joka johtaa hylkimiseen in vivo.

20 1. MLRn inhibitio

Ensimmäisen luovuttajan HPBM valmisteesta valmistetaan 100 μΐ näytteet, jotka sisältävät 105 HPBM ja joihin lisätään erilaisia pitoisuuksia keksin-25 nön mukaisia yhdisteitä pitoisuuksien vaihdellessa välillä 0-300 ng/ml (mukaan lukien raja-arvot). Sitten jokaiseen näytteeseen sekoitetaan 100 μΐ liuosta, joka sisältää io5 HLA-yhteen sopimatonta, röntgen säteily-tettyä HPBMä, joka on saatu toiselta luovuttajalta, 30 tai T-soluvajaata HPBMä. Seosta inkuboidaan 6 päivän , ajan 37°C, jonka jälkeen lisätään 1 μ(Ιϊ metyyli-3H- : tymidiiniä ( H-Tdr) 10 μΐ tilavuudessa. Soluprolife- raatio mitataan kuuden tunnin kuluttua radioaktiivi-suusliittymisenä.

35 Tässä erityisessä määrityksessä keksinnön mukaiset molekyylit osoittavat in vitro immunomoduloi-vaa aktiivisuutta pitoisuuksissa alkaen arvosta 0.3 103131 ng/rnl, kuvassa 6 esitetyn mukaisesti. N. 3 ng/ml inhiboi sellulaarista kasvua 50 %.

Keksinnön mukaisten molekyylien immunomodu-loivaa aktiivisuutta voidaan myös arvioida mittaamalla 5 antigeenispesifisen HPBL vasteen inhibitiota tai IL-2 riippuvan T-lymfoplastiproliferaation inhibitiota seuraavasti : 2. Antigeenispesifisen HPBM vasteen inhibitio 10

Keksinnön mukaiset yhdisteet inhiboivat tehokkaasti PPD (tuberkuliini) spesifisen, HLA luokka II rajoitetun T-solun vasteen generaatiota, mikä viittaa niiden kykyyn inhiboida endogeenisesti tuotetun IL-2:n 15 sitoutumista sen reseptoriin. Näiden antigeenispesi- fisten vasteiden oletetaan in vivo esittävän ratkaisevaa osaa autoimmuniteetin ja siirrännäisen hylkimisen alkuunpanossa.

HPBM valmisteesta valmistetaan 100 μΐ näyt-20 teitä, jotka sisältävät 105 HPBM ja joihin lisätään eri pitoisuuksia keksinnön mukaista molekyyliä pitoisuuden vaihdellessa välillä 0-300 ng/ml (mukaan lukien nämä raja-arvot) sekä tuberkuliinia (PPD) lopullisessa pitoisuudessa 30 μg/ml. Näytteitä inkuboidaan 6 päivän 25 ajan 37°C, jonka jälkeen lisätään 1 μΟί metyyli-H- " tymidiiniä 10 μΐ tilavuudessa. Soluproliferaatio mita taan kuuden tunnin inkuboinnin jälkeen radioaktiivi-suusi iit tyrni senä .

Tässä erityisessä määrityksessä keksinnön 30 mukaiset molekyylit osoittavat immunomoduloivaa aktiivisuutta lähtien pitoisuudesta n. 10 ng/ml, kuten ku-: vassa 7 on esitetty. N. 50 ng/ml inhiboi sellulaarista kasvua 50 %.

35 3. IL-2 riippuvan T-lvmfoblastiproliferaation inhibi tio 103131 20

Keksinnön mukaiset molekyylit inhiboivat tehokkaasti ihmisen T-solublastien, joita on indusoitu MLR- tai PPD stimulaatiolla, IL-2 riippuvaa kasvua. Näiden solujen oletetaan esittävän ratkaisevaa osaa 5 autoimmuniteetin ja hylkimistapahtumien kroonistumi-sessa.

Kolminkertaisia viljelmiä, jotka sisältävät 20 x 103 5 päivää vanhaa PPDllä tai MLRllä stimuloitua HPBMä lopullisessa tilavuudessa 200 μΐ, inkuboidaan 10 37°C 48 h ajan 5, 10 tai 20 ng/ml yhdistelmä IL-2:n ja keksinnön mukaisen molekyylin läsnäollessa keksinnön mukaisen yhdisteen ollessa vaihtelevissa pitoisuuksissa välillä 0-10 μ9/τη1 (mukaan lukien nämä raja-arvot) . Sitten lisätään H-Tdr. Soluproliferaatio mitataan 15 kuuden tunnin kuluttua radioaktiivisuusliittymisenä. Tässä erityisessä määrityksessä keksinnön mukaiset molekyylit osoittavat immunomoduloivaa aktiivisuutta lähtien pitoisuuksista 0.1 μ9/τη1, kuten on esitetty kuvissa 8A ja 8B, 8C ja 8D.

20 Hakemus tuo siten myös esiin: (i) keksinnön mukaisen CD25 sitovan molekyylin käytön ihmisen immuunijärjestelmän immunosuppressoinnissa, (ii) menetelmän ihmisen immuunijärjestelmän immunosup-pressoimiseksi, jolloin keksinnön mukaista CD25 sito- 25 vaa molekyyliä annetaan tällaista hoitoa tarvitsevalle * - - potilaalle immunosuppressiivisesti tehokas määrä, (iii) farmaseuttisen ainekokoomuksen ihmisen immuuni-järjestelmän immunosuppressoimiseksi, joka ainekokoo-mus sisältää keksinnön mukaista CD25 sitovaa molekyy- 30 liä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimennusainetta.

« ·. _ Keksinnön mukainen CD25 sitova molekyyli on erityisen hyödyllinen siirrännäisen hyikimistapahtuman estossa ja hoidossa.

35 Näitä indikaatioita varten sopiva annos vaih- telee luonnollisesti riippuen esim. käytetystä erityisestä keksinnön mukaisesta molekyylistä, isännästä, 103131 21 antotavasta ja hoidettavan tilan luonteesta ja vakavuudesta. Profylaktisessa käytössä tyydyttäviä tuloksia on kuitenkin tavallisesti indikoitu saatavan päiväannoksilla n. 0.1-1 mg per kg ruumiinpaino. Näitä 5 annoksia pitäisi suurentaa aina nelinkertaisiksi saakka hylkimistapahtuman hoitamiseksi sen todella ilmaantuessa. Keksinnön mukainen molekyyli annetaan edullisesti parenteraalisesti, tavallisesti laskimonsisäisesti, esim. antekubitaali- tai muuhun laskimoon. Pro-10 fylaktinen hoito käsittää tyypillisesti keksinnön mukaisen mlekyylin annon kerran päivässä - kerran viikossa 2-4 viikon ajan alkaen siirtopäivästä, edullisesti muutamia tunteja ennen siirtoa.

Keksinnön mukaiset molekyylit voivat olla 15 myös hyödyllisiä CD25 antigeeniä ilmentävien pahanlaatuisten solujen hoidossa, esim. T-soluleukemian ja tiettyjen muiden leukemioiden ja lymfoomien hoidossa. Tähän käyttötarkoitukseen CD25 sitovaa molekyyliä voidaan käyttää radiokonjugaatin muodossa, jolloin mole-20 kyyli on liittyneenä alfa-emittoivaan radionuklidiin.

Keksinnön mukaiset yhdisteet voivat olla myös hyödyllisiä HIV infektion hoidossa tai profylaksiassa. HIV virus näyttää tarvitsevan proliferoituvia T-soluja monistuakseen, joten T-soluproliferaation inhibointi 25 blokkaamalla CD25 antigeeni inhiboisi myös viruksen monistumista.

Farmaseuttiset ainekookoomukset voidaan valmistaa konventionaaliseen tapaan. Ainekokoomus on saatavilla tavallisesti lyofilisoidussa muodossa. Väli-30 töntä antoa varten se liuotetaan sopivaan vesikanta- jaan, esim. steriiliin injektoitavaan veteen tai ste-rilliin puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen. Mikäli katsotaan toivottavaksi valmistaa bolusinjekti-on sijasta suurempi tilavuus infuusioantoa varten, 35 suolaliuokseen lisätään edullisesti ihmisen seerumial- bumiinia tai potilaan omaa heparinisoitua verta formuloinnin aikana. Tällaisen fysiologisesti inertin pro- 22 103131 teiiniylimäärän läsnäololla vältytään monoklonaalisen vasta-aineen hävikiltä, jota tapahtuu vasta-aineen adsorboitumisesta infuusioliuokselle käytetyn astian ja letkujen seinämiin. Mikäli käytetään albumiinia, 5 sopiva pitoisuus on 0.5-4.5 p-% suolaliuoksesta laskettuna .

Keksinnön edelleen erään sovellutuksen mukaisesti, on havaittu, että voidaan saavuttaa erityisen edullisia tuloksia käyttämällä ainakin kahden aktivoi -10 duille T-soluille kohdistetun antigeeniä sitovan molekyylin yhdistelmää, jotka tunnistavat ainakin kaksi erilaista aktivoiduille T-soluille tunnusomaista antigeeniä .

Edullisesti käytetään kahden erilaisen anti-15 geeniä sitovan molekyylin yhdistelmää, jolloin kumpikin tunnistaa eri antigeenin. Siten vaikka molemmat antigeeniä sitovat molekyylit tunnistavat aktivoidun T-solupinnan antigeenin, ne eivät kilpaile keskenään samasta aktivoidun T-solun sitoutumiskohdasta.

20 Yksi antigeeniä sitovista molekyyleistä on edullisesti CD25 sitova molekyyli.

Esillä oleva keksintö tuo siten esiin myös immunosuppressiivisen ainekokoomuksen, joka sisältää ainakin yhden CD25 antigeeniä sitovan molekyylin ja 25 ainakin yhden antigeeniä sitovan molekyylin seosta, .. joka antigeeniä sitova molekyyli on kohdistettu aina kin yhdelle aktivoiduille T-soluille tunnusomaiselle antigeenille, joka on muu kuin CD25.

Keksintö tuo edelleen esiin ainakin kaksi 30 aktivoiduille T-soluille kohdistettua antigeeniä sito vaa molekyyliä, jotka ovat yhdistettyinä keskenään ja .· tarkoitettu käytettäväksi nisäkäsjärjestelmän immu- nosuppressoinnissa ja jotka antigeeniä sitovat molekyylit tunnistavat ainakin kaksi erilaista, aktivoi-35 duille T-soluille tunnusomaista antigeeniä, joista toinen on CD25 antigeeni.

103131 23 "Aktivoiduille T-soluille kohdistettu antigeeniä sitova molekyyli"- termillä tarkoitetaan sitovaa molekyyliä, joka reagoi voimakkaasti aktivoitujen T-solujen kanssa ja joka reagoi heikosti tai ei lain-5 kaan lepäävien T-solujen kanssa. Antigeeniä sitovat molekyylit ovat edullisesti täydellisiä immunoglobu-liinimolekyylejä, edullisemmin hiiren, kimeerisiä tai humanisoituja monoklonaalisia vasta-aineita, erityisesti kimeerisiä monoklonaalisia vasta-aineita. CD25 10 monoklonaalisista vasta-aineista edullisia ovat sel laiset, joilla on CDRiä edellä kuvattujen aminohappo-sekvenssien kanssa.

Ainekokoomus voi edullisesti myös sisältää tai sitä voidaan käyttää yhdessä immunosuppressiivisen 15 lääkkeen kanssa, kuten syklosporiini A:n.

Edullisia aktivoiduille T-solu antigeeneille kohdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita ovat tyypillisesti sellaiset, jotka on luokiteltu CD7 ryhmään, jonka on osoittanut Boston Workshop ja joka on esitet-20 ty julkaisussa "Leucocyte Typing II, Voi. I human T lymphocytes", Reinherz, Haynes, Nadler ja Berstein, Springer Verlag, 1985. CD7 antigeeniä ilmentää heterogeenisesi n. 80 %:a lepäävistä T-soluista. Ilmentyminen kuitenkin lisääntyy voimakkaasti aktivaation aika-25 na (2-3 kertainen intensiteetin nousu).

Siten edullinen vasta-aineiden yhdistelmä on CD7- ja CD25 vasta-aineiden yhdistelmä. Keksinnön mukainen ainekokoomus sisältää siten edullisesti ainakin yhden CD25 vasta-aineen ja ainakin yhden CD7 vasta-30 aineen, edullisemmin yhden CD25 vasta-aineen ja yhden . CD7 vasta-aineen, seoksen. Molemmat vasta-aineet ovat myös edullisesti IgG isotyyppiä.

Näitä kahta vasta-ainetta, valinnaisesti yhdessä immunosuppressiivisen lääkkeen kanssa, voidaan 35 käyttää monin tavoin kliinisissä sovellutuksissa. Ne on edullisesti sekoitettu keskenään ja fysikaalinen seos annetaan potilaalle. Vaihtoehtoisesti vasta- 103131 24 aineet ja valinnainen immunosuppressiivinen lääke voidaan antaa vastaanottajalle erillisistä säilytysastioista missä tahansa järjestyksessä, mutta yhtäaikaa. Ainekokoomus voidaan valmistaa ja antaa parenteraali-5 sesti edellä yhdelle CD25 vasta-aineelle kuvatun mukaisesti. Vaihtoehtoisesti immunosuppressiivinen lääke annetaan oraalisesti ja monoklonaaliset vasta-aineet annetaan parenteraalisesti, erillisinä tai seoksena.

Sopivien ainekokoomusten aikaansaamiseksi 10 monoklonaaliset vasta-aineet ja valinnainen immunosuppressiivinen lääke voidaan pakata erikseen saman pakkauksen sisälle, ja pakkaus varustetaan käyttöohjeilla sekoittamista tai samanaikaista antoa varten. Esimerkkeinä kiteistä mainittakoon monisylinterinen ruisku 15 tai kaksoispakkaus, joka sisältää erilliset yksikköan-nosmuodot ainakin kahta aktivoiduille T-soluille kohdistettua vasta-ainetta, jotka tunnistavat ainakin kaksi erilaista aktivoiduille T-soluille tunnusomaista antigeeniä, joista yksi on CD25 antigeeni.

20 Tähän mennessä tehdyt tutkimukset viittaavat siihen, että vasta-aineiden anto yhdessä sekä valinnaisesti immunosuppressiivisen lääkkeen kanssa ei aiheuta ei-toivottavia sivuvaikutuksia käytetyillä an-nostasoilla ja että yksittäisille vasta-aineille ha-25 vaittujen sivuvaikutuksien ei ole todettu tehostuneen. Profylaksiseen käyttöön sopiva antoannos on tavallisesti luokkaa 0.05-0.5 mg ensimmäistä vasta-ainetta (kuten CD25 vasta-ainetta) per kg potilaan ruumiinpaino ja 0.05-0.5 mg toista vasta-ainetta (kuten CD7 vas-30 ta-ainetta) per kg ruumiinpaino. Kun immunosuppressii-. vinen lääke on syklosporiini, valinnaisesti käytettä- • vän immunosuppressiivisen lääkkeen suositeltava annos on 2-5 mg per kg ruumiinpaino annettaessa parenteraalisesti ja 10-15 mg/kg ruumiinpaino annettaessa oraa-35 lisesti. Keksinnön mukainen ainekokoomus voi perustua päivittäiseen tai viikottaiseen antoon, edullisesti viikottaiseen antoon.

103131 25

Vaikka ainekokoomus on erityisesti suunniteltu käytettäväksi siirrännäisen hylkimistapahtumissa, sen käyttöä voidaan helposti laajentaa hylkimistapah-tumien hoitoon niiden ilmaantuessa. Tällöin annoksia 5 tulisi suurentaa nelinkertaisiksi.

Hiiren monoklonaaliset vasta-aineet, jotka sopivat esillä olevaan keksintöön, ovat tunnettuja per se. Monia aktivoitujen T-solun pinta-antigeenien vastaisia vasta-aineita on saatavilla useiden maiden vil-10 jelmätalletuslaitoksista, ja erityisesti American Type Culture Collection of Rockville, Maryland, USA, voi toimittaa sopivia monoklonaalisia vasta-aineita tai tällaisia vasta-aineita erittäviä hybridoomia. Esimerkkinä CD7 monoklonaalisia vasta-aineita erittävästä 15 hybridoomasta, jota voidaan käyttää esillä olevassa keksinnössä ja joka on saatavilla ATCCstä, mainittakoon T3-3A1. Muita CD7 vasta-aineita ovat RFT-2 ja CHH 380 (kimeerinen vasta-aine). CD25 vasta-aineisiin kuuluu, edellä mainittujen edullisten RFT-5 ja sen kimee-20 risten johdannaisten lisäksi, M7/2 (Gaulton et ai, Clin. Immunol: ja Immunopath. (1985) 36: 18), anti-tac vasta-aine (Uchiyama et ai, J. Immunol. (1981) 126 (4) : 1393) ja Campath 6 monoklonaalinen vasta-aine.

CD25 ja CD7 monoklonaalisten vasta-aineiden 25 yhdistelmän synergistinen vaikutus on esitetty in vit-• ro edellä kuvatulla MLR biomäärityksellä, sekä in vivo ihmisille tehdyillä kliinisillä kokeilla.

MLR biomäärityksessä 3H-Tdr oton inhibitio havaitaan viljelmissä, joihin on lisätty yksinään CD7 30 (RFT2) tai CD25 (RFT5) monoklonaalista vasta-ainetta, ja huomattavasti suurempi inhibitioaste havaitaan, kun näitä molempia vasta-aineita käytetään yhdessä samassa kokonaispitoisuudessa. MLR vastaa in vitro allogeenis-tä siirrännäisvastetta, joka aiheuttaa hylkimisen in 35 vivo, jolloin edellä kuvattu inhibitio vastaa immu-nosuppressiota in vivo.

103131 26 MLRissä, joihin lisätään syklosporiinia annosväliltä 10 nanog/ml-100 μο/πιΐ CD7 tai CD25 monoklo-naalisen vasta-aineen läsnäollessa, havaitaan lisääntynyt 3H-Tdr inhibitio verrattuna pelkästään syklospo-5 riinin antoon koko kyseisellä annosvälillä. CD7, CD25 ja syklosporiinin yhdistelmä osoittaa suurempaa inhiboivaa vaikutusta kuin yksikään muu yhdistelmä.

Kliinisissä kokeissa munuaisen, maksan tai sydämen siirtoon joutuvia potilaita valittiin profy-10 laksiseen hoitoon. Siirtopäivänä, 2 h ennen leikkausta, annetaan ensimmäinen laskimonsisäinen infuusio esimerkin 5 mukaista kimeeristä CD25 vasta-ainetta yhdessä kimeerisen CD7 vasta-aineen (CHH 380) kanssa annoksena 0.2 mg kutakin vasta-ainetta per kg ruumiin-15 paino. Kaksi päivää leikkauksen jälkeen annetaan samanlainen infuusio näitä kahta vasta-ainetta annoksena 0.4 mg/kg ruumiinpaino, ja sitten anto toistetaan viikon välein kuukauden ajan.

Laskimonsisäiset infuusiot valmistetaan seu-20 raavasti: lyofilisoidut vasta-aineet sekoitetaan kes kenään ja dispergoidaan 100 ml steriiliin, puskuroituun suolaliuokseen, joka sisältää 4.5 p-% ihmisen albumiinia. Tämä suolaliuosdispersio annetaan potilaille 30 min aikana. Potilaat saavat myös standardi-25 syklosporiinihoitoa. Yhdellekään potilaalle ei tule hylkimistapahtumaa tämän yhden kuukauden hoitojakson aikana.

Keksintöä selostetaan seuraavien kuvien avulla, joissa: 30 kuva IA esittää kaaviomaisesti IgG molekyylin raken-. netta sekä raskaita ja kevyitä ketjuja koodaavien gee- nien rakennetta, kuva IB esittää lukuraami (framework, FR) - ja hyper-vaihtelevien (CDR) alueiden järjestäytymistä raskaan 35 tai kevyen ketjun vaihtelevassa domeenissa.

103131 27 kuvat 2A ja 2B esittävät hiiren hybridooman, RFT5-IgG2a (1), RFT5-IgGl (2), RFT4 (3) ja NS-1 (4), EcoRI-digestoidun genomisen DNAn Southern blot -analyysiä, jossa käytetään P leimattua DNA koetintä, joka koo-5 daa joko hiiren raskaan ketjun käynnistäjää (kuva 2A) tai hiiren Ck- ja viittä Jk geenisegmenttiä (kuva 2B). 10 μg genomista DNAta digestoidaan EcoRI:llä ja fraktioidaan koon suhteen 0.8 % agaroosigeelillä. Sitten fragmentit siirretään nitroselluloosakalvolle ja hy-10 bridoidaan koettimella. Pesun jälkeen kalvoa valote taan yön yli Kodak X-0 Mat filmillä.

Kuvissa 3A ja 3B on esitetty parentaali ilmentymisvek-torit pSV2-neo-huCyl ja ρ3ν2-0ΗΡΡ-Εμ-1ηα(Γκ. Molemmat 15 plasmidit sisältävät ampisilliiniressistentin geenin (amp ) ja pBR322:n ja SV40:n replikaatioaloituksen (origin) (pBR322 ori ja SV40 ori). pSV2-neo-huCyl: lie on tunnusomaista neomysiinigeenin (neo ) ja ihmisen γ vakio-osaa (huCyl) koodaavan geenin olemassaolo, kun 20 taas ρ3ν2-ϋΗΡΚ-Εμ-^Οκ:iin on insertoitu dihydrofo- laattireduktaasi (DHFR) geeni (metotreksaatti-resistenssi) ja geeni, joka koodaa ihmisen κ vakio-osaa (huCK) . Lopulliset vektorit kimeeristen raskaiden tai kevyiden ketjujen ilmentämistä varten saadaan vas-25 taavasti insertoimalla pSV2-neo-huCyl:een DNA frag mentti, joka koodaa johtopeptidiä (L) ja RFT5-IgG2a raskaan ketjun vaihtelevaa domeenia (VDJ2) sekä ihmisen raskaan ketjun käynnistäjää, ja insertoimalla ρεν^-ϋΗΡΒ-Εμ-ΙιηΟκ:aan DNA fragmentti, joka koodaa joh-30 topeptidiä (L) ja RFT5-IgG2a kevyen ketjun vaihtelevaa . .. domeenia (VJ2) .

%

Kuvat 4A ja 4B esittävät yksittäisten soluseosten, joita on kasvatettu kasvavissa metotreksaattipitoi-35 suuksissa (MTX) vastaavasti, kuten on esitetty esimerkissä 5 kuvatuissa menetelmissä A ja B. Kuvaajan Y- 103131 28 akselilla on monoklonaalisen vasta-aineen määrä, joka g on tuotettu mg/10 solua 72 h aikana.

Kuva 5 esittää mallia CDRien korvauksien muodostami-5 seksi, jossa mallissa CDR kasetit insertoidaan 4 yhteen fuusioitua lukuraamialuetta sisältävään vektoriin .

Kuva 6 esittää MLRn inhibitiota (x) RFT5-IgG2a:11a 10 (Y2a, K) ja (°) keksinnön mukaisella hiiren-ihmisen kimeerisellä MAbllä (Υι,κ) . Molemmilla vasta-aineilla on sekvenssitunnistus no l:ssä ja 2:ssa esitetyn mukaiset vaihtelevat domeenit.

15 Kuva 7 esittää PPD spesifisen HPBM vasteen inhibitiota (x) RFT5-IgG2a:11a ja (o) samalla hiiren-ihmisen kimeerisellä MAbllä.

Kuva 8 esittää RFT5-IgG2a:n ja saman hiiren-ihmisen 2 0 kimeerisen MAbn vaikutusta PPD T- lymfoblastiproliferaatioon, (kuva 8B ja 8A) ja MLR T-lymfoblastiproliferaatioon, (kuva 8D ja 8C) IL-2 pitoisuudessa 5 ng/ml (o), 10 ng/ml () ja 20 ng/ml(x).

Seuraava esimerkki keksinnön mukaisen kimee-25 risen CD25 vasta-aineen valmistamiseksi on tarkoitettu ainoastaan havainnollistamaan keksintöä:

Esimerkki 1 RFT5-IgG2a:n raskaan ketjun vaihtelevaa domeenia koodaavan geenin kloonaus 30 RFT5-IgG2a:n (CD25; y2a; K> , RFT5-IgGl:n l (CD25; γχ; k) ja RFT4:n (CD4; γ1;· κ) hybridoomien ja hybridoomien parentaalimyeloomasolulinjan, nimittäin NS-l:n, genominen DNA eristetään ja digestoidaan Eco-35 Rlllä. Jokainen digestoitu DNA sitten fraktioidaan samalla agaroosigeelillä. Kulkeutumisen jälkeen aga-roosigeeli analysoidaan Southern blot- menetelmällä 103131 29 käyttäen koettimena 32P-leimattua 0.7 kb Xbal-EcoRI DNA fragmenttia, joka koodaa hiiren raskaan käynnistäjää (Heinrich et ai, J. of Immunol. (1989) 143: 3589).

Geelistä paljastuu kolmen tyyppisiä täpliä hybridisaa-5 tion jälkeen kuvassa 2 esitetyn mukaisesti. 6.5 kb EcoRI fragmentti esiintyy kaikkien solulinjojen DNA digestiossa mukaan lukien NS-1 parentaali myeloomaso-lulinja ja siten se ei ole kiinnostuksen kohteena. 2.9 kb EcoRI fragmentti todetaan hybridooma RFT5-IgGl:n 10 DNA digestiosta ja sen arvellaan olevan tuloksena epänormaalista geenin uudelleenjärjestäytymisestä. 6.8 kb EcoRI fragmentti, joka puuttuu parentaali solulinjan NS-1 DNA digestiosta, valitaan siten mahdolliseksi fragmentiksi ja tämän fragmentin edelleenpuhdistus 15 suoritetaan preparatiivisen agaroosigeelielektroforee-sin avulla.

N. 5-7 kb DNA fragmentit kloonataan ZAP sijoitettuna bakteriofagin (Stratagene) EcoRI restrik-tiokohtaan. Edellä kuvattua koetinta käyttäen skriina-; ; 20 taan 6 x 106 yhdistelmäfaagia ja 11 kloonin havaitaan hybridoituneen. 11 kloonin DNA inserttiä lisättiin faagimaljalysaatilla polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla käyttäen primereinä hiiren J2 geeniä koodaavaa ensimmäistä oligonukleotidia ja RFT5 raskaan ketjun 25 alkua aina aminohappoon no 7 saakka (sekvenssi määri-’· tetty aikaisemmin) koodaavaa toista oligonukleotidiä.

Toinen primeri on suunniteltu ottamalla huomioon kaikkein useimmin käytetyt kodonigeenit. Kustakin 11 kloonista saadut DNA fragmentit analysoidaan Southern 30 blot- menetelmällä käyttäen koettimena oligonukleoti-diä, joka koodaa RFT5 raskaan ketjun aminohapposekvenssiä aminohappovälillä 20-27 ja joka on myös suunniteltu kaikkein useimmin käytetyn kodonin mukaisesti. Koettimella paljastuu 9 identtistä faagikloonia. Osa 35 DNA insertistä, joka koodaa vaihtelevaa domeenia, on sekvenssoitu dideoksiterminaatiomenetelmällä ja tämä on esitetty sekvenssitunnistus no l:ssä.

30 103131

Esimerkki 2 Kimeerisen RFT5 raskasketiuaeenin muodostaminen 5 6 kb EcoRI fragmentti, joka on saatu diges- toimalla erään yhdeksästä faagiklOonista DNA ja joka sisältää RFT5 raskaan ketjun vaihtelevan domeenin geenin (mukaan lukien promoottori ja käynnistäjä), kloonataan sijoitettuna eukarioottisen ilmentymisvektorin, 10 pSV2 neo-ihmisen vakio kohta (Heinrich et ai, supra) , EcoRI restriktiokohtaan kuvan 3A esityksen mukaisesti. Sitten RFT5 raskaan ketjun vaihtelevaa domeenia koodaavan geenin nukleotidisekvenssi uudelleenmäärite-tään sellaisen mahdollisuuden poissulkemiseksi, että 15 olisi tapahtunut tämän geenin mutatoituminen plasmidin lisäämisen aikana.

Esimerkki 3 RFT5:n kevyen ketjun vaihtelevaa domeenia koodaavan geenin kloonaus 20 RFT5:n, RFT5*:n ja RFT4:n hybridoomien ja parentaalisolulinjan NS-1 genominen DNA eristetään ja digestoidaan EcoRIllä. Kukin digestoitu DNA fraktio-daan sitten samalla agaroosigeelillä. Kulkeutumisen 25 jälkeen agaroosigeeli analysoidaan Southern blot- me-netelmällä käyttäen koettimena P leimattua DNA fragmenttia, joka sisältää 5 hiiren JK geeniä ja hiiren CK geenin.

Geelistä paljastuu hybridisaation jälkeen 3 30 päätyyppistä täplää, jotka ovat n. 12, 16 ja 18 kb kuvassa 2B esitetyn mukaisesti. Vain suurimmat frag- * mentit ovat spesifisiä RFT5 hybridoomalle. N. 18 kb koko-fraktioidut EcoRI fragmentit kloonataan sijoitettuna EMBL4 faagiin (Stratagene) 7 x 105 yhdistelmä-35 faagikloonia skriinataan edellä kuvatulla koettimella ja kahden kloonin havaitaan hybridisoituneen kummankin sisältäessä identtisen 18 kb insertin. 4.4 kb EcoRI- 103131 31

Xbal alafragmentin osoitetaan sisältävän täydellisen, RFT5 kevyen ketjun vaihtelevaa domeenia koodaavan geenin ja se kloonataan sijoitettuna plasmidiin pGEM4 (Stratageeni). 4.4 kb fragmentin sekvenssi määrite- 5 tään. Osa vaihtelevaa domeenia koodaavaa 4.4 kb in-serttiä sekvenssoidaan. Sekvenssi on esitetty sekvens-situnnistus no 2:ssa.

10 Esimerkki 4 Kimeerisen RFT5 kewtketiuaeenin muodostaminen 1.1 kb Xbal-Xbal fragmentti, joka koodaa hiiren raskaan ketjun käynnistäjää (Heinrich et ai; sup- 15 ra), yhdessä Hindlll-Sphl fragmentin kanssa, joka koodaa ihmisen K vakio-osaa, subkloonataan sijoitettuna faagiin mpl8 (Stratagene). Restriktiokohtien mutage-neesillä rikkomisen jälkeen täydennetty (filled-in) EcoRI-Hindlll fragmentti, joka sisältää skvenssit hii-: 20 ren raskaan ketjun lisääjälle (Εμ) ja ihmisen κ vakio- osalle (huCK) , kloonataan sijoitettuna pSV2-DHFRn täydennettyyn EcoRI-BamHI kohtaan. pSV2-DHFR saadaan korvaamalla pSV2-neo:n BamHI-Hindlll fragmentti DHFR geeniä koodaavalla BamHI-Hindlll fragmentilla.

25 Esimerkin 3 mukainen 4.4 kb EcoRI-Xbal frag- mentti insertoidaan sitten pSV2-DHFR-Εμ-huCK:iin.

Esimerkki 5 RFT5 kimeerisen vasta-aineen ilmetvminen 30 Esimerkeissä 2 ja 4 saadut plasmidit siirre tään yhdessä hiiren myeloomasolulinjaan SP2/0 (ATCC CRL 1581) elektroporaatiolla käyttäen Bioradin geeni-pulssilaitetta. Tämän menetelmän tiedetään aikaansaavan suuria määriä pysyviä transfektantteja. SP2/0 so- 35 lulinja ei kykene tuottamaan endogeenisiä raskaita ja kevyitä ketjuja ja se on herkkä genetisiinille (G 418) pitoisuudessa 0.8 mg/ml.

103131 32 SP2/0 soluja kasvatetaan tavanomaisessa kas-vatusliuoksessa (RPMI + 10 % FCS + 5 x 10~5 β- merkaptoetanolia), kerätään kasvun log-vaiheessa ja pestään elektroporaatiopuskurilla (Bio-Rad). Solukon-5 sentraatioksi sovitetaan 2 x 107 solua/ml. 0.8 ml so-lususpensioon lisätään 15-20 μ9 kutakin plasmidia. Seos laitetaan jäihin ja sen annetaan seistä 10 min.

'Soluihin kohdistetaan sähköinen pulssi (280 volttia; 25 μΡ) ja niiden annetaan jälleen seistä 15 min. Solut 10 siirretään tavanomaiseen kasvatuslluokseen ja niitä inkuboidaan 37°C CO2 inkubaattorissa.

3 päivän inkuboinnin jälkeen aloitetaan valinta G 418 resistenssin suhteen. Solut uudelleensus-pendoidaan tuoreeseen kasvatuslluokseen, joka sisältää 15 1.4 mg/ml G 418. Viljelmät tuottavat kasvavia soluja 10-14 päivän inkuboinnin jälkeen G 418 läsnäollessa. 2 viikon inkuboinnin jälkeen viljelmien supernatanteista tutkitaan ihmisen IgG ilmentymistä sandwich tyyppisellä ELISA määrityksellä (anti-ihmis κ-kevyt-; 20 ketju/supernatantti/anti-ihmis IgG-alkaalifosfataasi- konjugaatti).

Tämä koe osoittaa, että täydellisiä vasta-ainemolekyylejä erittyy kaikissa viljelmissä pitoisuuksien vaihdellessa välillä 50-500 ng/ml.

25 Sellaisten solujen valikoimiseksi, joissa DHFR geeni on lisääntynyt ja siten erittyy suuria määriä haluttua vasta-ainetta, suoritetaan kaksi valinta-menetelmää metotreksaatti(MTX)resistenssin suhteen alla kuvatun mukaisesti. Tätä tarkoitusta varten G 418 30 resistenttisoluseokset jaetaan kukin ja lisääminen toteutetaan joko manetelmän A (MTX lisäys 2- tai 2.5-·, kertaiseksi) tai menetelmän B (MTX lisäys 5- kertaiseksi) mukaisesti.

35 103131 33

Menetelmä A Menetelmä B

I I

ΙΟΟηΜ MTX 200nM MTX

5 I I

250nM MTX ΙμΜ MTX

I I

500nM MTX 5μΜ MTX

I I

10 ΙμΜ MTX 25μΜ MTX

I I

2.5μΜ MTX ΙΟΟμΜ MTX

5μΜ MTX

15 I

ΙΟμΜ MTX

25μΜ MTX

; 20 ΙΟΟμΜ MTX

Jokaiseen lisäysvaiheeseen kuuluu solujen siirostaminen tiheydessä 2 x 105 solua/ml tavanomai- 25 seen kasvatusliuokseen, jota on täydennetty 1.4 mg/ml ' G 418:11a ja valitussa pitoisuudessa olevalla MTXllä.

72 h inkuboinnin jälkeen solut ja supernatantti erotetaan. Vasta-aine-eritystä seurataan joko ELISAlla tai HPLCllä käyttäen proteiini A pylvästä.

30 Kuvissa 4A ja 4B on esitetty eräiden trans- . fektanttiseoksien vasta-ainetuottavuus. Suurin osa seoksista saavuttaa maksimaalisen spesifisen vasta-aineen tuoton tietyssä MTX pitoisuudessa. Parhaiten tuottavat seokset kloonataan rajoittavalla laimennok- 35 sella. Useista sadoista analysoiduista klooneista valitaan 15 parhaiten tuottavaa kloonia. Kloonien tuot- 103131 34 tavuus vaihtelee välillä 30-50 mg MAb/10 solua 72 h aikana.

Vasta-aine puhdistetaan viljelmäsupernatan-tista eluoimalla proteiini A affiniteettipylväästä.

35 1 03 1 31 SEKVENSSITUNNISTUS NO 1

Kohde: RFT5 vasta-aineen immunoglobuliinin raskaan ketjun vaihteleva domeeni 5

Sekvenssityyppi: Nukleotidisekvenssi ja sitä vastaava aminohapposekvenssi

Molekyylityyppi: Genominen DNA

10

Pituus: 492 nukleotidiä

Alkuperäinen lähde: hiiren hybridooma 15 Nukleotidisekvenssin yksityiskohtia: Yksi introni si jaitsee nukleotidivälillä 47 - 130 V segmenttigeeni: nukleotidit 142 - 435 D segmenttigeeni: nukleotidit 436 - 447 J segmenttigeeni: nukleotidit 448 - 492 : : 20

Aminohapposekvenssin yksityiskohtia: Johtopeptidi: aminohapot (a.a.) -19 - (-1) FRI: a.a. 1 - 30 CDR1: a.a. 31 - 35 2 5 FR2: a.a. 3 6 - 4 9 *· CDR2 : a. a. 50 - 66 FR3: a.a. 67 - 98 CDR3: a.a. 99 - 106 FR4: a.a. 107 - 117 30 ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT CCT TTT ATT CTG TCG GTA ATT TCA G 46 ·. Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Vai Ile Ser -15 -10 -5 35 GTAAGGGGCT CACCAGTTCC ATATCTGAAA GAGGATACAG GGTCTGAAGT GACAATGACA 106 36 103131 5 TCTACTCTGC TGTTCTCTCC ACAG GG GTC TAC TCA GAG GTT CAG CTC CAG 156

Gly Vai Tyr Ser Glu Val Gin Leu Gin -1 1 5 CAG TCT GGG ACT GTG CTG GCT AGG CCT GGG GCT TCC GTG AAG ATG TCC 204

Gin Ser Glu Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Mec Ser 10 15 20 10 TGC AAG GCT TCT GGC TAC AGC TTT ACC AGG TAC TGG ATG CAC TGG ATA 252

Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp lie 25 30 35 AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTA GAA TGG ATT GGT GCT ATT TAT CCT 300

Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Ala lie Tyr Pro 40 45 50 GGA AAT AGT GAT ACT AGT TAC AAC CAG AAG TTC GAG GGC AAG GCC AAA 348 , 20 Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala'Lys 55 60 65 CTG ACT GCA GTC ACA TCC GCC AGC ACT GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC 396

Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 25 70 75 80 85 CTG ACA CAT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT TCA AGA GAC TAC GGC 444

Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Tyr Gly 90 95 100 30 TAC TAC TTT GAC TTC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA 492

Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 105 110 115 103131 37 SEKVENSSINTUNNISTUS NO. 2

Kohde: RFT5 vasta-aineen immunoglobuliinin kevyen ketjun vaihteleva domeeni 5

Sekvenssityyppi: Nukleotidisekvenssi ja sitä vastaava aminohapposekvenssi

Molekyylityyppi: Genominen DNA

10

Pituus: 455 nukleotidiä

Alkuperäinen lähde: Hiiren hybridooma 15 Nukleotidisekvenssin yksityiskohtia: Yksi introni si jaitsee nukleotidivälillä 50 - 226 V segmenttigeeni: nukleotidit 244 - 519 J2 segmenttigeeni: nukleotidit 520 - 455 20 Aminohapposekvenssin yksityiskohtia: Johtopeptidi: a.a. -22 - (-1) FRI1 : a.a. 1 - 23 CDR1': a.a. 24 - 33 FR2': a.a. 34 - 48 25 CDR2': a.a. 49 - 55 FR3': a.a. 56 - 87 CDR3': a.a. 88 - 94 FR4': a.a. 95 - 104 ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA G 49 3® Met Asp Phe Gin Vai Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser -20 -15 -10 • · GTAACAGAGG GCAGGGAATT TGAGATCAGA ATCCAACCAA AATTATTTTC CCTGGGGAAT 109 35 TTGAGTCTAA AATACAGTTT TTTTTTCTTT TTCTTCATCT GAATGTTGGG TGGTATAAAA 169 103131 38 TTATTTTTGT TTCTCTATTT CTACTAATCC CTTTCTCTCT ATTTTGCTTT TTTCTAG 226 5 TC ATA CTG TCC AGA GGA CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC 273

Val lie Leu Ser Arg Gly Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie -5 -11 5 10 10 ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC 321

Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 15 20 25 TCA AGT ATA AGT TAC ATG CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGC ACC TCC 369 15 Ser Ser He Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser 30 35 40 CCC AAA AGA TGG ATT TAT GAC ACA TCC AAA CTG GCT TCT GGA GTC CCT 417

Pro Lys Arg Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 20 45 50 55 GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAT TCT CTC ACA ATC 465

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He 60 65 70 25 AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAT CAG CGG 513

Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg 75 80 85 90 30 AGT AGT TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATA AAA 555

Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Ϊ" - 95 100 35 103131 39

TAULUKKO I

Alue Sijainti raskaassa ket- Sijainti kevyessä jussa ketjussa FRI aminohappo 1-30 aminohappo 1-23 (ajoittainen tähde (ajoittainen tähde paikassa 0) paikassa 0 ja delee- tio paikassa 10 λ ketjuissa) CDR1 aminohappo 31-35 aminohappo 24-34 (mahdolliset insertiot (mahdollinen insertio numeroituna 35A, 35B) numeroituna 27A, B, C, D, E ja F)’ FR2 aminohappo 36-49 aminohappo 35-49 CDR2 aminohappo 50-65 aminohappo 50-56

(mahdolliset insertiot numeroituna 52A, B ja C

FR3 aminohappo 66-94 aminohappo 57-88 (mahdolliset insertiot numeroituna 82A, B ja C) CDR3 aminohappo 95-102 aminohappo 89-97 (mahdolliset insertiot (mahdolliset inser- numeroituna 100A, B, C, tiot numeroituna 95A, D, E, F, G, H, I, J ja B, C, D, E ja F) K) FR4 aminohappo 103-113 aminohappo 98-107 (mahdollinen insertio numeroituna 106A)

Claims (7)

40 1 03 1 31

1. Menetelmä CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi, johon CD25 sitovaan molekyylin kuuluu ainakin yksi antigeenin sitova kohta, joka sisältää aina- 5 kin yhden domeenin, jonka sekvenssi sisältää hyper-vaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3, jolloin CDRl:n aminohapposekvenssi on Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2:n aminohapposekvenssi on Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly ja CDR3:n ami-10 nohapposekvenssi on Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe tai niiden välittömät ekvivalentit, tunnettu siitä, että viljellään hybridoomasolulinjaa tai organismia, joka on transformoitu DNA kokoonpanolla, joka sisältää nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat mai-15 nittuja hypervaihtelevia alueita järjestyksessä CDR1, CDR2 ja CDR3, ja eristetään viljelmästä CD25 sitova molekyyli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CD25 sitovaan molekyy- 20 liin kuuluu ainakin yksi antigeenin sitova kohta, joka sisältää: a) ensimmäisen domeenin, jonka sekvenssi sisältää hy-pervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3, jolloin CDR1:n aminohapposekvenssi on Arg-Tyr-Trp-Met-His,

25 CDR2.-n aminohapposekvenssi on Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly ja CDR3:n aminohapposekvenssi on Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe; j a b) toisen domeenin, jonka sekvenssi sisältää hyper-30 vaihtelevat alueet CDR11, CDR2'ja CDR31, jolloin . CDR1':n aminohapposekvenssi on Ser-Ala-Ser-Ser-Ser- Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2':n aminohapposekvenssi on Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser ja CDR3':n aminohapposekvenssi on His-Gln-Arg-Ser-Ser-Tyr-Thr tai näiden vä-35 littömät ekvivalentit. 103131

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CD25 sitovaan molekyyliin kuuluu ainakin yksi antigeenin sitova kohta, joka sisältää joko domeenin, jonka aminohapposekvenssi on 5 oleellisesti samanlainen kuin Seq. Id. no l:ssä esitetty sekvenssi alkaen aminohaposta paikassa 1 ja päättyen aminohappoon paikassa 117 tai joka sisältää edellä kuvatun mukaisen ensimmäisen domeenin ja toisen domeenin, jonka aminohapposekvenssi on oleellisesti 10 samanlainen kuin Seq. Id. no 2:ssa esitetty sekvenssi alkaen aminohaposta paikassa 1 ja päättyen aminohappoon paikassa 104.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CD25 sitova mole- 15 kyyli sisältää ainakin: a) yhden immunoglobuliinin raskaan ketjun tai sen fragmentin, johon kuuluu (i) vaihteleva domeeni, jonka sekvenssi sisältää hypervaihtelevat alueet CDR1, CDR2 ja CDR3 ja (ii) ihmisen raskaan ketjun vakio-osa tai 20 sen fragmentti, jolloin CDRl:n aminohapposekvenssi on Arg-Tyr-Trp-Met-His, CDR2:n aminohapposekvenssi on Ala-Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Asp-Thr-Ser-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Glu-Gly ja CDR3:n aminohapposekvenssi on Asp-Tyr-Gly-Tyr-Tyr-Phe-Asp-Phe, ja 25 b) yhden immunoglobuliinin kevyen ketjun tai sen fragmentin, johon kuuluu (i) vaihteleva domeeni, jonka sekvenssi sisältää hypervaihtelevat alueet CDR1', CDR2' ja CDR3' ja (ii) ihmisen kevyen ketjun vakio-osa tai sen fragmentti, jolloin CDRl':n aminohapposekvens-30 si on Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tyr-Met-Gln, CDR2':n aminohapposekvenssi on Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser ja j' CDR3':n aminohapposekvenssi on His-Gln-Arg-Ser-Ser- Tyr-Thr tai näiden välittömät ekvivalentit.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CD25 sitova molekyyli sisältää ainakin: 103131 a) yhden raskaan ketjun, johon kuuluu vaihteleva do-meeni, jonka aminohapposekvenssi vastaa oleellisesti Seq.Id. no l:ssä esitettyä sekvenssiä alkaen aminohaposta paikassa 1 ja päättyen aminohappoon paikassa 5 117, ja ihmisen raskaan ketjun vakio-osa; ja b) yhden kevyen ketjun, johon kuuluu vaihteleva domee-ni, jonka aminohapposekvenssi vastaa oleellisesti Seq. Id. no 2:ssa esitettyä sekvenssiä alkaen glutaamiha-posta paikassa 1 ja päättyen glutaamihappoon paikassa 10 104, ja ihmisen kevyen ketjun vakio-osa.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CD25 sitovassa molekyylissä ihmisen raskaan ketjun vakio-osa tai sen fragmentti on γχ tyyppiä ja ihmisen kevyen ketjun va- 15 kio-osa tai sen fragmentti on κ tyyppiä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä moniketjuisen CD25 sitovan molekyylin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että A) viljellään organismia, joka on transformoitu: 20 i) DNA kokoonpanolla, joka koodaa raskasta ketjua tai sen fragmenttia ja sisältää: a) ensimmäisen osan, joka koodaa vaihtelevaa domeenia, johon kuuluu vuorottelevasti lukuraami- ja hypervaih-televat alueet, jotka hypervaihtelevat alueet ovat 25 järjestyksessä CDR1, CDR2 ja CDR3 ja joiden aminohapposekvenssit on esitetty Seq. Id. no l:ssä, tämän ensimmäisen osan alkaessa vaihtelevan domeenin ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päättyessä vaihtelevan domeenin viimeistä aminohappoa koodaavaan 30 kodoniin, ja . b) toisen osan, joka koodaa raskaan ketjun vakio-osaa - ' tai sen fragmenttia alkaen raskaan ketjun vakio-osan ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päättyen vakio-osan tai sen fragmentin viimeistä aminohap-35 poa koodaavaan kodoniin, jota seuraa nonsense-kodoni; ja 103131 ii) DNA kokoonpanolla, joka koodaa kevyttä ketjua tai sen fragmenttia ja sisältää: a) ensimmäisen osan, joka koodaa vaihtelevaa domeenia, johon kuuluu vuorottelevasti lukuraami- ja hypervaih- 5 televat alueet, jotka hypervaihtelevat alueet ovat järjestyksessä CDR1', CDR2' ja CDR3'ja joiden aminohapposekvenssit on esitetty Seq. ID. no 2:ssa, tämän ensimmäisen osan alkaessa vaihtelevan domeenin ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päättyessä 10 vaihtelevan domeenin viimeistä aminohappoa koodaavaan kodoniin, ja b) toisen osan, joka koodaa kevyen ketjun vakio-osaa tai sen fragmenttia alkaen kevyen ketjun vakio-osan ensimmäistä aminohappoa koodaavasta kodonista ja päät- 15 tyen vakio-osan tai sen fragmentin viimeistä aminohappoa koodaavaan kodoniin, jota seuraa nonsense-kodoni; ja B) viljelmästä otetaan talteen aktiivinen CD25 sitova molekyyli. = * 44 103131