PT97034B - Processo para a producao de moleculas de ligacao ao antigenio cd25 - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE MOLÉCULA: CD25

DE LIGAÇÃO AO ΑΝΤΙGÉNIO

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a produção de novos anticorpos monocionais contra o antigénio CD2S, os quais são caracterizados pela sequência de aminoácidos das suas regiões hipervariáveis. Iriicialmente produzidos na forma murina, eles podem ser convertidos em formas quiméricas ou humanizadas, imunoconjugados ou fragmentos de anticorpos (descri tas de uma forma geral como moléculas de ligação). Os produtos são úteis para a profilaxia ou tratamento da rejeição de transplantes, particularmente em combinação com outros anticorpos contra células T activadas, por exemplo anticorpos CD7.

Este invento está relacionado com imuno-supressSo e mais particularmente proporciona anticorpos monoclonais e outras moléculas de ligação ao antigénio CD25.

Na cirúrgia de transplante de orgãos, particularmente cirúrgia de transplante de rim, fígado, coração, pulmão e medula óssea, é necessário suprimir o sistema imune do recipiente do enxerto para minimizar a probabilidade de rejeição do enxerto após cirúrgia. Para esta finalidade foram propostas várias drogas imuno-supressoras mas a sua utilização tem de ser cuidadosamente controlada uma vez que para além dos efeitos secundários indesejáveis que surgem da utilização de certos agentes imuno-supressores existe também a dificuldade de a acção imuno-supressora tornar o recipiente do enxerto particularmente susceptível à infecção por bactérias e vírus que seriam controláveis por um sistema imune normal. Agentes imuno-supressores que têm sido usados com êxito na prática clínica incluem esteróides, azatioprina e ciclosporina ft. É necessário na prática clinica tentar equilibrar o grau de imune-supressão necessário para evitar ou tratar os casos de rejeição de enxertos com retenção de uma certa quantidade do sistema imune do recipiente para combater outros agentes infecciosos e ao mesmo tempo manter sob controle quaisquer efeitos secundários indesejáveis,

Para além da utilização de drogas imuno-supressoras, também se tem focado a atenção na utilização de certos anticorpos monoclonais írlAbs) para suprimir as reacçôes imunes, em particular tem sido dispensada atenção aos anticorpos monoclonais que reconhecem vários antigénios de superfície de células T. Aqui também foram encontrados problemas na prática clínica, nomeadamente os anticorpos de trabalhos anteriores eram muito fortes ou pouco eficazes e algumas graves tais como febre alta.

vezes causaram ©feitos secundários

Estes MAb's são geralmente designados por um número CD (Cluster Determination> atribuído pelas sucessivas reuniões de tipagem de leucócitos. Se bem gue um termo como CD3 seja freguentemente aplicado ao antigénio de superfície celular e um MAb contra este antigénio seja muitas vezes descrito como anti-CD3, na descrição gue se segue termos tais como CD3, CD25, etc. serão aplicados a MAbs e os correspondentes antigénios de superfície celular serão descritos como antigénio CD3, etc.

Em particular, anticorpos monoclonais contra antigénios de membrana presentes em todas as células T (também designados antigénios pan de células T ) tais como o antigénio CD3 são anticorpos muito potentes por possuírem uma actividade supressora global no sistema imune. Portanto, o corpo humano pode ser privado da resposta, imune imediata geralmente mediada por células T de memória quando ocorre uma infeccão. Certamente isto não é desejável guando se tenta prevenir em vez de curar os casos de rejeição de enxertos. Um tratamento adequado para usar na profiláxia deverá ser essencia1mente selectivo, i.e. o conjunto de células T de memória deverá manter-se intacto ao mesmo tempo gue a categoria de células T (células T activadas) gue poderão estar directamente envolvidas num caso de rejeição deverão ser inactivadas.

Este objectivo pode ser conseguido usando anticorpos contra células T activadas. Estas células T são caracterizadas pela presença de receptores de ,IL~2 de alta afinidade na sua superfície membranar. 0 receptor de IL-2 de alta afinidade é composto por pelo menos duas cadeias polipeptidicas diferentes, uma cadeia >x também conhecida como antigénio CD25 e uma cadeia β. As células T em repouso não expressam este receptor de alta afinidade mas antes receptores de afinidade baixa e intermédiague consistem em homodímeros da cadeia « ou β. Um anticorpo CD25 gue interfere com a ligação de IL-2 ao seu receptor de alta afinidade e portanto suprime selectivamente a resposta imune, é um anticorpo de eleição para a profiláxia de rejeição de enxertos.

As imunoglobulinas ou anticorpos naturais compreendem uma molécula muitimérica em forma de Y tendo um sítio de ligação ao antigénio no extremo de cada braço superior. A restante estrutura, em particular o pé do Y medeia funções efectoras associadas ãs imunoglobulinas. A estrutura geral de um anticorpo a classe Ig<3 estâ apresentada esquemáticamente na Figura IA. Tanto a cadeia pesada como a leve compreendem um domínio variável e uma parte constante. Um sítio de ligação ao antigénio consiste no domínio variável de uma cadeia pesada associado ao domínio variável de uma cadeia leve. Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve têm a mesma estrutura geral que está ilustrada na Figura 1B.

Mais particularmente, as características de ligação ao antigénio de um anticorpo são essencialmente determinadas por 3 regiões específicas no domínio variável das cadeias pesada e leve que são designadas regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Como se mostra na Figura 1B, estas três regiões hipervariáveis alternam com 4 regiões estruturais (FRs) cujas sequências são relativamente conservadas e não estão directamente envolvidas na ligação. As CDRs formam ansas e são mantidas em estreita proximidade pelas regiões estruturais que adoptam uma conformação em folha Í3. As CDRs de uma cadeia pesada juntamente com as CDRs da cadeia leve associada essencialmente constituem o sítio de ligação ao antigénio da molécula do anticorpo.

A determinação daquilo que constitui uma FR ou uma região CDR é geralmente feito por comparação da sequência de aminoácidos de uma série de anticorpos induzidos na mesma espécie. As regras gerais para a identificação das regiões de CDR e FR estão apresentadas na Tabela I.

Ainda, foi recentemente encontrado que a contribuição feita por um domínio variável da cadeia leve para a energia de ligação é pequena comparado com a contribuída pelo domínio variável da cadeia pesada associada e que os domínios variáveis da cadeia pesada isolados possuem uma actividade de ligação ao antigénio própria. Tais moléculas são agora normalmente referidas como anticorpos de domínios simples.

Já existem vários NAbs CD25 murinos e incluem 33B3-1 < Immunotech-Mer ieux), BD«IL-2R (Becton-Dickinson), 2C8 (Amersham), Campath 6 (MRC, Cambridge) e ATH207 (Universidade livre, Berlim). No entanto, encontrou-se agora que um novo anticorpo CD25 de murganho do isotipo IgG2a, daqui em diante designado RFT5-IgG2a, tem melhores propriedades do os anticorpos CD25 dos trabalhos anteriores especialmente no que respeita è afinidade de ligação e que é possível construir outras moléculas de ligação C02S tendo as mesmas regiões hipervariáveis de RFTS-IgQ2a.

Assim o invento proporciona uma molécula de ligação a CD2-5 que compreende pelo menos um sitio de ligação a antigénio compreendendo pelo menos um domínio que compreende em sequência, as regiões hipervar iáveis CDRl, CDR2 e CDR3J o referido CDRl tendo a sequência de aminoácidos Arg--Tir~Trp-Met~His, o referido CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ala-Ile-Tir-Pro-Gli-Asn-Ser-Asp-Tre-Ser-Tir-Asn-Gln-Lis-Fen-Glu-fíli e o refeirdo CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Asp~Tii—<31 i-Ti r-Ti r-Fen-Asp—Fen e seus equivalentes directos.

Num primeiro aspecto do invento, a molécula de ligação a CD25 compreende um sitio de ligação a antigénio simples compreendendo um domínio simples.

Num segundo aspecto do invento, a CD25 compreende pelo menos um sítio de compreendendo;

molécula de ligação a ligação a antigénio

a) um primeiro domínio compreendendo em sequência as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3j o referido CORí tendo a sequência de aminoácidos Arg-Tir-Trp-Net-His, o referido CDR2 tendo a sequência de aminoácidos Ala-Ile-Tir-Pro-Gli-Asn-Ser-Asp-Tre-Se)—Tir-Asn-Gln-Lis-Fen-Glu-61i e o referido CDR3 tendo a sequência de aminoácidos Asp-Tir-Qli-Tir-Tir-Fen-Asp-Fen e fc>) um segundo domínio compreendendo em sequência as regiões hi perva r i áve i s CDR1’, CDR2’ e CDR3’, o referi do CDR1' tendo a sequência de aminoácidos Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tir-Met-Qln, o referido CDR2' tendo a sequência de aminoácidos Asp-Tre-Ser-Lis-Leu-Ala-Ser e o referido CDR3' tendo a sequência de aminoácidos His-Qin-Arg-Ser-Ser-Tir-Tre;

e seus equ i va1en tes d i rec tos.

A menos que de outra forma seja indicado, qualquer cadeia polipeptídica é daqui em diante descrita como tendo uma sequência de aminoácidos começando na extremidade N e terminando na ex t r em i dade C.

«Suando o sitio de ligação ao antigénio compreende os primeiro © segundo domínios, estes podem estar situados na mesma molécula polipeptídica ou, de preferência cada domínio pode estar numa cadeia diferentes o primeiro domínio sendo parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento e o segundo domínio sendo parte de uma cadeia leve de imunoglobulina ou de um seu f ragmento.

Por molécula de ligação a CD25 pretende-se significar qualquer molécula capaz de se ligar ao antigénio CD25 sôzinha ou associada a outras moléculas para formar receptores IL-2 de alta afinidade. A reacção de ligação pode ser mostrada por métodos convencionais (ensaios qualitativos) incluindo, por exemplo, um bioensaio para determinação da inibição da ligação de IL.-2 ao seu receptor ou quaisquer tipos de ensaios de ligação, com referência a um teste de controlo negativo em que é usado um anticorpo de especificidade não relacionada e.g. um anticorpo anti-1isozima. Vantajosamente, a ligação da molécula do invento ao antigénio CD25 pode ser mostrado num ensaio de ligação competitivo usando o anticorpo AHT207, BDaIL-2-R ou 3363-1 como competidores. De preferência, o anticorpo AHT207 ou BD«IL~2-R será escolhido como competidor. Um exemplo particular de um ensaio de ligação está apresentado abaixo.

Células mononucleares de sangue periférico humano (HPBM) foram crescidas em meio de cultura RPKI 1640 suplementado com 2 mh L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 wg/ml de estreptomicina, 25 mM bicarbonato de sódio e 10% de soro fetal de vitela (FCS). l,ug/ml de fito-hemaglutinina (PHA) foi usado para estimular HPBM. Apôs 3 dias, os blastòcitos foram ressuspensos numa concentração de 3x10'/ml em tampão de fosfatos salino suplementado com 2% de albumina sérica bovina (BSA) e 2% de azida. Amostras de 50 ,ul desta suspensão foram incubadas durante 10 min a 20°C, em condições de não capping, com concentrações graduais de um anticorpo bloqueado? (competidor> de 1 a 100 Aig/ml. Em seguida 1 jjg/ml de anticorpo biotinilado do invento foi adicionado às células e a incubação continuou durante 10 min. As células foram lavadas e ainda incubadas durante 10 min com estreptavidina marcada com fluoresceína. As células foram novamente lavadas, fixadas coro formalina e analisadas com um fluorocitómetro que detecta a ligação do anticorpo biotinilado. Paralelamente, reali.sou-se uma experiência com um anticorpo biotinilado de uma especificidade não relacionada, como controlo negativo.

Exemplos de moléculas de ligação a antigénio incluem anticorpos tais como os produzidos pelas células B ou hibridomas e anticorpos quiméricos ou humanizados ou qualquer fragmento deles, e.g. FSab' e fragmentos Fab, assim como anticorpos de cadeia iroples ou anticorpos com domínios simples.

Um anticorpo de cadeia simples consiste em domínios variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo covalenteroente ligadas por um ligante peptídico geralmente consistindo em 10 a 30 aminoácidos, de preferência entre 15 e 25 aminoácidos. Portanto tal estrutura não inclui a parte constante das cadeias pesada e leve e pensa-se que o espaçador peptídico pequeno seja menos antigénico do que a parte constante total. Por anticorpo quimérico pretende-se significar um anticorpo em que as regiões

ou ambas são de origem das cadeias pesada eleve

Por anticorpo humanizaem que as regiões hipervaconstantes das cadeias pesada e leve humana enquanto os domínios variáveis são de origem não humana (e.g. murina). dopretende-se significar um anticorpo riáveis (CDRs) são de origem não humana (e.g. murina), enquanto que todas ou quase todas as outras partes da imunoglobulina e.g. as regiões constantes e as partes altamente conservadas dos domínios variáveis, i.e. as regiões estruturais são de origem humana. Um anticorpo humanizado pode no entanto reter alguns aminoácidos da sequência murina nas partes das regiões estruturais adjacentes às regiões hipervar iá.veis.

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As regiões hipervariáveis podem estar associadas com quaisquer tipos de regiões estruturais; de preferência de origem murina ou humana. Regiões estruturais adequadas estão descritas em Sequences of proteins of immunological interest, Kabat E.A. et al . , US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health. No entanto, a estrutura de cadeia pesada preferida é a de RFT5”IgG2a, que está apresentada na Seq. Id. N21. Ela consiste na sequência das regiões FRÍ, FR2, FR3 e FR4. De forma semelhante, Seq. Jd. N22 mostra a estrutura de cadeia leve preferida RFT5--IgG2a que consiste na sequência das regiões FRÍ’, FR2’, FR3’ e FR4‘.

Assim o invento também proporciona uma molécula de ligação a CD25 que compreende pelo menos um sitio ligação a antigénio compreendendo um primeiro domínio tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à apresentada em Seq. ID. NS1 começando com o aminoâcido na posição 1 e terminando com o aminoâcido na posição 117 ou um primeiro domínio como descrito atrás e um segundo domínio tendo uma sequência de aminoácidos substancialmenie idêntica â mostrada em -Seq. Id. N22, começando c om o am i noâ c i do na pos i ç ão 104.

Os anticorpos monoclonais induzidos contra uma proteína naturalmente encontrada em todos os humanos deve necessáriamente ser desenvolvida num sistema não humano e.g. em murganhos. Como uma consequência directa disto um anticorpo xenogénico como o produzido pos hibridomas, quando administrado a humanos, induz uma resposta imune indesejável que é predominantemente mediada pela parte constante da imunoglobulina xenogénica. Isto limita claramente a utilização de tais anticorpos uma vez que eles não podem ser administrados durante um período de tempo prolongado. Portanto é particularmente preferido usar anticorpos de cadeia simples, de domínio simples, quiméricos ou humanizados que tenham menos probabilidade de induzir uma resposta alogénica substancial quando administrados a humanos.

Face ao que foi dito, uma molécula de ligação a CD25 preferida do invento foi seleccionada a partir de um anticorpo quimérico anti-CD25 que compreende pelo menos

a) uma cadeia pesada de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende (i) um domínio variável compreendendo sequenciadamente as regiSes hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 e (ii? a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia pesada humanaj a referida CDR1 tendo a sequência de aminoâcidos Arg-Tir-Trp-Met-His, a referida CDR2 tendo a sequência de aminoác idos ftla-Ile-T i r-Pro-Qli-ftsn-Ser-Asp-T re-Ser-T i r~

-Asn-S1n-Lis~Fen~Q1u-Q1i e a referida CDR3 tendo a sequência de aminoác idos Asp-Ti r-Θ3. i~Ti r-Ti r-Fen-Asp-Fen e

b) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento que compreende (i? um domínio variável compreendendo sequencia— damente as regiões hipervariáveis CDR1', CDR2' e CDR3' e (ii) a parte constante ou seu fragmento de uma cadeia leve humana; a referida CDR1’ tendo a sequência de aminoâcidos Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tir-het-Qln, a referida CDR2' tendoi a sequência de aminoâcidos Asp-Tre-Ser-Lis-Leu-Ala-Ser e a referida CDR3’ tendo a sequência de aminoâcidos His-Qln-Arg-Ser-Ser-T i r-Tre;

e seus equivalentes directos.

Como alternativa, uma molécula de ligação a CD25 do invento pode ser seleccionada a partir de uma molécula de ligação de csideiã simples que compreende um sítio de ligação ao antigénio c omp reendendo

a) um p ri me i ro dom ini o c omp reendendo sequenc i adamen te as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3, as referidas regiões hipervariáveis tendo as sequências de aminoâcidos mostradas na Seq. Id. NQ1, b>

um segundo domínio compreendendo sequenciadamente as regiões h i pe r va r i á ve i s h i pe r va r i ãve i s mostra em Seq.

CDRiCDR2' e CDR3', as referidas regiões tendo as sequências de aminoâcidos como se Id. N22 e

c) um ligante peptídico que se liga «t extremidade N-terminal do primeiro domínio e â extremidade C-terminal do segundo domínio ou á extremidade C-terminal do primeiro domínio e â extremidade N-terminal do segundo domínio;

e seus equivalentes directos.

Como é do conhecimento geral,· alterações menores numa sequência de aminoâcidos tais como deleções, adições ou substituições de um ou vários aminoâcidos pode conduzir a uma forma alélica da proteína original que tem substancia.1 mente propriedades idênticas. Assim,· pelo termo seus equivalentes directos pretende-se significar qualquer molécula de ligação a CD25 de domínio simples (molécula X) (i) em que as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 tomadas como um todo são pelo menos 80% homólogas, de preferência pelo menos 80% homólogas, mais preferencialmente pelo menos 95% homólogas das regiões hipervariáveis como se mostra na Seq. Id. N2Í e que é capaz de inibir a substancialmen te no mesmo ligação de IL-2 ao seu receptor grau que uma molécula referência tendo regiões estruturais idênticas âs da molécula X mas tendo regiões hipervar.iâveis CDRi, CDR2 e CDR3 idênticas âs mostradas em Seq. Xd. N£l;

ou qualquer molécula de ligação a CD2S tendo pelo menos dois domínios por sitio de ligação (molécula X^;)

<i> ern que as regiões hipervariâveis CDRI, CDR2, CDR3, CDRI', CDR2' e CDR3 consideradas como um conjunto são pelo menos 80% homólogas, de preferência pelo menos 35% homólogas das regiões hipervariâveis como se mostra na Seq. Xd. NSÍ e 2 e <ii) que é capaz de inibir a ligação de IL-2 ao seu receptor substancialmente no mesmo grau que uma molécula referência tendo regiões estruturais idênticas às da molécula X' mas tendo regiões hipervariâveis CDRI, CDR2, CDR3, CDRI', e CDR3' idênticas às mostradas em Seq. Xd. N21 e 2,’

Este último critério pode ser convenientemente

CDR2' testado em vários ensaios incluindo um bioensaio de Reacção de Linfócitos Mistos (MLR), um bioensaio de resposta de HPBM especifica para um antigénio e um bioensaio de proliferação de linfoblastos T dependentes de IL-2. Tais ensaios são aqui descritos no texto que se segue. Pelo termo no mesmo grau pretende-se significar que as moléculas referência e seus equivalentes apresentam numa base estatística curvas de inibição de ligação a XL-2 essencíalmente idênticas num dos bioensaios referidos atrás.

Mais preferencialmente, o anticorpo quimérico CD25 compreende pelo menos

a) uma cadeia, pesada que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica á mostrada em Seq. Id. N.2 1 começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 117 e a parte constante de uma cadeia pesada humana: e

b) uma cadeia leve que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica â mostra™ da em Seq. Id. N22 começando com ácido glutámcio na posição 1 e terminando com ácido glutâmico na posição 104 e a parte constante de uma cadeia leve humana.

A parte constante de uma cadeia pesada humana pode ser do tipo Γΐ, Γ2, P3, P4, ju, «1, «2, & ou €,.de preferência do tipo Γ, mais preferencialmente do tipo #1, enquanto que a parte constante de uma cadeia leve humana pode ser do tipo k ou \· Co qual inclui os subtipos 5tl, )<2 e \'3) mas é pref erenc ialmente do tipo k. A sequência de aminoácidos de todas estas partes constantes estão apresentadas em Kabat et al. Csupra).

Os conjugados das moléculas de .ligação a CD25 do invento, e.g. conjugados de enzima ou toxina ou radioisótopo, estão também incluídos dentro do âmbito do invento.

Uma molécula de ligação a CD25 do invento pode ser produzida por técnicas de DMA recombinante do invento. Face a isto, uma ou mais moléculas de DNA codificadoras da molécula de ligação devem ser construídas, colocadas sob o controle de sequências adequadas e transferidas para um organismo hospedeiro adequado ã expressão.

Numa forma geral, são pois proporcionadas

Ci) moléculas de DNA codificadoras de uma molécula de ligação a CD25 com um domínio simples do invento, uma molécula de ligação a CD25 de cadeia simples do invento, uma cadeia pesada ou leve ou seus fragmentos de uma molécula de ligação a CD25 do invento e <ii) a utilização das moléculas de DNA do invento para a produção de uma molécula de ligação a CD25 do invento por meios recombinantes.

estado actual dos conhecimentos é tal que os familiarizados com a matéria serão capazes de sintetizar moléculas de DMA do invento tendo presente a informação aqui proporcionada i.e. as sequências de aminoácidos das regiões hipervariáveis e as sequências de DNA que as codificam. Um método para a construção de um gene do domínio variável está descrito por exemplo em EPA 239 400 e pode ser brevemente resumido como se segue,' Um gene codificador de um domínio variável de um MAb de qualquer especificidade é clonado. Os segmentos de DNA codificadores das regiões estruturais e hipervariáveis são determinados e os segmentos de DNA codificadores das regiões hipervariáveis são removidos de forma a que os segmentos de DNA codificadores das regiões estruturais sejam fundidos uns aos outros com sítios de restrição adequados nas junções. Os sítios de restrição podem ser gerados nas posições adequadas por mutagénese da molécula de DNA através de processos convencionais. As cassetes CDR sintéticas de cadeia dupla são preparadas por síntese de DNA de acordo com as sequências apresentadas em Seq. Id. N2 1 ou 2. Estas cassetes são proporcionadas com extremos coesivos de forma a que possam ser ligadas nas junções da parte estrutural. Na Figura 5 está apresentado um protocolo para se conseguir uma molécula de DNA codificadora de um domínio variável de imunoglobulina.

Ainda, não é necessário ter acesso ao mRNA de uma linha de células de hibridoma produtora para se obter uma construção de DNA codificadora dos MAfos do invento. Assim, o pedido F'CT W0

90/07861 dá instruções completas para a produção de um MAb por técnicas de DMA recomfoxnante dando apenas as informações escritas da sequência de nucleótidos do gene. 0 método compreende a síntese de uma série de oligonucleôtidos, a sua amplificação pelo método PCR e o seu splicing para dar a sequência de DMA pretend x da.

Vectores de expressão compreendendo um promotor adequado ou genes codificadores das partes constantes da cadeia leve e pesada estão disponíveis ao público. Assim, uma vez preparada uma molécula de DNA do invento ela pode ser convenientemente transferida num vector de expressão adequado. As moléculas de DMA codificadoras de anticorpos de cadeia simples podem também ser preparadas por métodos convencionais, por exemplo, como descrito em W0 88/164-9.

Face ao que foi dito e uma vez que o MAb de murganho tal como naturalmente secretado pelo hibridoma não é o tipo preferido de MAb, pensa-se que não seja necessário nenhum depósito de hibridoma para satisfazer os critérios da descrição.

Numa realização particular do invento, os meios recombinantes para a produção de uma molécula de ligação a CD25 incluem as primeira e segunda construções de DNA como descrito aba i xo:

A primeira construção de DNA codifica uma cadeia pesada ou seu fragmento e compreende

a) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo alternadamente regiões estruturais e hipervariáveis, as referidas regiões hipervariáveis sendo em sequência CDRi, CDR2 e CDR3 as sequências de aminoácidos das quais

- 16 estão apresentadas em Seq. Id. N21,' esta primeira parte começando com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio variável e terminando com um codão codificador do último aminoácido do domínio variável © b> uma segunda parte codificadora de uma parte constante da cadeia pesada ou seu fragmento que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cad&ia pesada e termina com um codão codificador do último aminoácido da parte constante ou seu fragmento seguido de um codão sem sentido.

De preferência, esta primeira parte codifica um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica á sequência de aminoácidos mostrada em Seq. Id. N.21 começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 117. Mais preferencialmente a primeira parte tem a sequência de nucleótidos como se mostra em Seq.ld. NS1 começando com o nucleótido na posição 142 e terminando com o nucieótido na posição 492. Também preferencialmente, a segunda parte codifica a parte constante de uma cadeia pesada humana, mais preferencialmente a parte constante da cadeia ri humana. Esta segunda parte pode ser um fragmento de DMA de origem genómica <compreendendo intrões) ou um fragmento de cDNA (sem intrões).

Uma segunda construção de DNA codifica uma cadeia leve ou seu fragmento e compreende

a) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo alternadamente regiões estruturais e hipervariáveis, as referidas regiões hipervariáveis sendo em sequência CDR1’, CDR.2' e CDR3' as sequências de aminoácidos das quais estão apresentadas em Seq. id. N22; esta primeira parte começando com um codão codificador do primeiro aminoâcido do domínio variável e terminando com um codão codificador do último aminoâcido do domínio variável e

b) uma segunda parte codificadora de uma parte constante da cadeia pesada ou seu fragmento que começa com um codão primeiro aminoâcido da parte constante da termina, com um codão codificador do último aminoâcido da parte constante ou seu fragmento seguido de um c odão sem sen t- i do .

codificador do cadeia leve e

De preferência, esta primeira parte codifica um domínio variável tendo uma sequência de aminoé.cidos substancialmente idêntica á sequência de aminoácidos mostrada em Seq. Id. N&2 começando com o aminoâcido na posição 1 e terminando com o aminoâcido na posição 104. Mais preferencialmente a primeira parte tem a sequência de nucleótidos como se mostra em Seq.Id. N22 começando com o nucleótido na posição 244 e terminando com o nucleótido na posição 555. Também preferencialmente, a. segunda parte codifics a parte constante de uma cadeia leve humana, mais preferencialmente a parte constante da cadeia k humana.

Na primeira e segunda construções a primeira e segunda parte estão preferencialmente separadas por um intrão. No intrão localizado entre a primeira e segunda parte preferencialmente é inserido um potenciador. A presença deste elemento genético que é transcrito mas não traduzido pode ser necessário para uma transcrição eficaz da segunda parte. Mais preferencialmente a primeira e segunda construções de DNA compreendem o potenciador de um gene de cadeia pesada vantajosamente de origem humana.

A primeira ou segunda compreende uma terceira parte construção de DNA vantajosamente que está situada a montante da

- IS primeira parte e que codifica parte de um peptídeo líder,’ esta terceira parte começando com o codão codificador do primeiro aminoãcido e terminando com o último aminoácido do peptídeo líder. Este peptídeo é necessário para a secreção das cadeias pelo organismo hospedeiro em que elas são expressas e é subsequentemente removido pelo organismo hospedeiro. De preferência, a terceira parte da primeira construção de DNA codifica um peptídeo líder tendo uma ssequência de aminoácidos substancialmente idêntica á sequêcia de aminoácidos que se mostra em Seq. ld. N21, começando com o aminoácido na posição ”19 e terminando com o aminoácido na posição -1 . Também preferencialmente, a terceira parte da segunda construção de DMA codifica um peptídeo líder tendo uma sequência de aminoácidos como se mostra em Seq. ld. N22, começando com o aminoãcido na posição 22 e terminando com o aminoácido na posição -1.

Cada uma das construções de DNA foi colocada sob o controle de sequências de controle adequadas, em particular sob o controle de um promotor adequado. Pode ser usado qualquer tipo de de promotor, desde que ele seja adaptado ao organismo hospedeiro para o qual as construções de DNA são transferidas para expressão. No entanto, se a expressão tomar lugar numa célula de mamífero, é particularmente preferido usar o promotor de um gene de i munog1obu1i na.

anticorpo pretendido pode ser produzido numa cultura celular ou num animal transgénico. Um animal transgênico adequado pode ser obtido segundo métodos convencionais que incluem microinjecção em ovos das primeira e segunda construções de DNA colocadas sob o controle de sequências reguladoras adequadas, transferência dos ovos assim preparados para fêmeas pseudo-grávidas adequadas e selecção de um descendente expressando o anticorpo p r e tend i do.

Quando as cadeias de anticorpos têm de ser produzidas numa cultura celular, as construções de DMA devem ser primeiro inseridas num único vector de expressão ou em dois separados mas compatíveis, sendo esta última possibi1 idade a preferida.

Assim, o invento também proporciona um vector de expressão capaz de se replicar numa linha celular procariôtica ou eucariótica que compreende pelo menos uma das construções de D-NA atrás desc ri tas.

Cada um dos vectores de expressão contendo uma construção de DNA foi então transferido para um organismo hospedeiro adequado. Quando as construções

DMA foram separadamente inseridas em dois vectores de expressão, elas podem ser transfer i das separadamerite, transfectados, esta

i.e. um tipo de vector por célula ou τού 11 i ma poss i b i .1 i dade é a preferida. Um organismo hospedeiro adequado pode ser uma bactéria, uma levedura ou uma linha celular de mamífero, esta última sendo a preferida. Mais preferencialmente, a linha de células de mamífero é de origem linfóide e.g. um mieloma, hibridoma ou uma célula B normal imortalizada, mas que não expresse qualquer cadeia pesada ou leve de antic o rpo endógeno.

é também preferido que o organismo hospedeiro contenha um grande número de cópias dos vectores por célula. Se o organismo hospedeiro for uma linha de células de mamífero, este objectivo pode ser conseguido por amplificação do número de cópias de acordo com métodos convencionais. Os métodos de amplificação geralmente consistem na selecção de resistência crescente a uma droga, a referida resistência sendo codificada pelo vector de expressão.

Num outro aspecto do invento, processo para a produção de uma molécula de é p r opo r c i onado u rn ligação a CD25 com várias cadeias que compreende Ci) cultura de um organismo que foi transformado com as primeira e segunda construções de DMA do invento e Cii) recuperação de uma molécula de ligação a CD2S a c t i va a pa r t i r da c u11ura.

Como alternativa, as cadeias pesada e leve podem ser recuperadas separadamente e reconstituídas numa molécula de ligação activa apôs reenrolamento in vltro. Os métodos de reconstituição são bem conhecidos; Exemplos dos métodos são proporcionados particularmente em EPA 120 674 ou em EPA 12S 023.

Assim um processo pode também compreender

Ci) cultura de um primeiro organismo que foi transformado com uma primeira construção de DNA do invento e recuperação da referida cadeia pesada ou seu fragmento a partir da cultura e

Cii) cultura de um segundo organismo que foi transformado com uma segunda construção de DNA do invento e recuperação da referida cadeia leve ou seu fragmento a partir da cultura e

Ciii>reconstituição in vitro de uma molécula activa de ligação a CD25 a partir da cadeia leve ou seu fragmento obtido em Ci) e da cadeia leve ou seu fragmento obtido em Cii).

De forma semelhante, é proporcionado um processo para a produção de uma molécula de ligação a CD25 com um único domínio que compreende Ci) cultura de um organismo que foi transformado com uma construção de DNA respectivamente codificadora de uma molécula de ligação a CD25 de cadeia simples ou de domínio simples do invento e <ii) recuperação da referida molécula a partir da cultura.

As moléculas de ligação a CD25 do invento apresentam muito boa actividade imunomoduladora como se mostra por exemplo num bioensaio de reacção de linfócitos mistos (MRL) CAkbar et al. , J. Immunol. 140, 2171-8). A MLR é geralmente considerada como sendo o equivalente in vitro da resposta a transplantes alogeneicos que conduz â rejeição in vivo.

1. Inibição da MLR

A partir de uma preparação de HPBM de um primeiro dador ς

fizeram-se amostras de 100 ;j! contendo 10' HPBM aos quais se adicionou várias concentrações de uma molécula do invento variando entre 0 e 300 ng/ml (incluindo estes valores limites).

Em seguida cada uma das amostras foi misturada com uma amostra de q

100 ,u.l contendo 10’“ HRMB HLA-incompatíveis irradiadas com raios X de um segundo dador ou HPBM sem cálulas T. A mistura foi incubada durante & dias a 37°C e adicionado 1 (“Ή-Tdr) num volume de 10 ,ul . Após

AíC i de met i 1 -'Ή-1 i m i d i na 6 horas, a proliferação celular foi medida por incorporação de radioac ti vida.de.

Neste ensaio particular, as moléculas do invento apresentam uma activida.de imunomoduladora in vitro em concentrações a partir de aproximadamente 0,3 ng/ml, como se mostra na Figura 6. 50% do crescimento celular é inibido a cerca de 3 ng/ml.

A actividade imunomoduladora das moléculas do invento pode também ser calculada medindo a inibição da resposta de HPBL.. espe c if i c a de ant i gén i o ou a i ni b i ç ão da p ro1ife ra ç ão de 1i nfob las tos T dependente de XL—zí como se segue*

2. Inibição da resposta de HPBM específica de antigénio

As moléculas do invento inibem eficazmente a geração de uma resposta de células T restringida a

HLA classe II específica de PPD <tuberculina9, indicando a sua capacidade para inibir a ligação de IL-2 produzida endogenamertte ao seu receptor espera-se que estas respostas especificas de antigénio nhern um papel crucial na iniciação de auto-imunidade e

In vivo desemperejeição de t ransp 1 a.n tes.

ft partir de urna preparação de HPBM prepararam-se .P amostras de 100 .ul contendo 10 HPBM às quais se adicionou várias concentrações de uma molécula do invento variando entre 0 a 300 ng/m1 (incluindo estes va1ores 1imi tes) e tube r c u1i na ( PPD) numa concentração final de 30 jug/ml. As amostras foram incubadas

O durante 6 dias a 37°C e adicionou-se então í ;_iCi de meti l-‘*H-timidina num volume de 10 ,ul. Apôs 6 horas de incubação a proliferação celular foi medida por incorporação de radioactividade.

Neste ensaio particular, as moléculas do invento apresentam uma actividade imunomoduladora entre cerca de 10 ng/ml como se mostra na Figura 7. 50% do crescimento celular é inibido a cerca de 50 ng/ml.

3. Inibição da proliferação de linfoblastos T dependentes de IL-2

As moléculas do invento inibem eficazmente o crescimento de blastôcitos 7 humanos dependentes de IL-2 induzidos por estimulação com MLR ou PPD. Espera-se que estas células desempenhem um papel importante na cronicidade de casos de autoimunida.de e de rejeição.

Culturas em triplicado contendo 20 x 10''' HPBM dias estimulados com PPD ou MLR num volume final de 200 ,ul incubadas a 37^eC durante 48 horas na presença de 5, 10 ng/ml de IL-2 recombinante e uma molécula do invento em concentrações variando entre 0 e 10ug/ml (incluindo estes c om 5 foram ou 20 várias valores limites). Em seguida adicionou-se 'H-Tdr. Após 6 horas, a proli— feração celular foi medida por incorporação de radioactividade.

Neste ensaio particular as moléculas do invento apresentam uma actividade imunomoduladora em concentrações a partir de 0,1 jug/ml como se mostra nas Figuras 8A e 8B, 8C e 8D.

Assim o invento também proporciona

imuno-supressão de um sistema imune humano (ii) um método de imuno-supressão do sistema imune humano que se caracteriza pela administração de uma quantidade imune-supressora eficaz de uma molécula de ligação a CD25 do invento a um doente necessitado de tal tratamento.

(iiiluma composição farmacêutica para imuno-supressão do sistema imune humano que compreende uma molécula de ligação a CD2S do invento e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Em particular, uma molécula de invento é útil na prevenção ou tratamento de enxertos.

ligação a CD25 do casos de rejeição de

te indicados como sendo obtidos em dosagens diárias entre cerca de 0,1 mg e cerca de 1 mg por kilograma de peso de corpo. Estas dosagens devrão ser aumentadas até um factor de 4 para o tratamento de uma rejeição quando ela ocorre. Uma molécula do invento é convenientemente administrada parenteralmente, normalmente por via intravenosa, por exemplo na veia antecúbita ou outra veia periférica. Um tratamento profilático tipicamente compreende a administração da molécula do invento entre uma vez por dia e uma vez por semana durante 2 a 4 semanas, começando no dia do transplante, de preferência algumas horas antes do transplante.

As moléculas do invento podem também ser úteis no tratamento de doenças que afectem células T que expressem o antigénio CD25, por exemplo no tratamento de leucémia de células T e de outras leucémias e linfornas. Com esta finalidade, a molécula de ligação a CD25 pode ser usada na forma de um radioconjugado em que a molécula é acoplada a um radionuclido emissor alfa.

As moléculas do invento podem também ser úteis no tratamento ou profiláxia da infecção por HIV. Parece que o vírus HIV requere a proliferação de células T para se multiplicar e assim a inibição da proliferação de células T através do bloqueio do antigénio CD25 deverá também inibir a multiplicação do vírus.

As composições farmacêuticas do invento podem ser produzidas de forma converseional. Uma composição de acordo com o invento é de preferência proporcionada na forma liofilizada. Para a administração imediata ela é dissolvida num veiculo aquoso adequado por exemplo água estéril para injecção ou soro fisiológico tamponado estéril. Se se considerar desejável fazei um;

solução de maior volume para administração por infusão em vez de um bolus, é vantajoso incorporar albumina de soro humano ou o próprio sangue heparinizado do paciente em soro fisiológico na altura da formulação*. A presença de um excesso* de tal proteína fisiológicamente inerte evita a perda do* anticorpo monoclonal por adsorção âs paredes do recipiente e tubos usados com a solução de infusão. Se se usar albumina uma concentração adequada será0,5 a 4,5% por peso da solução salina.

De acordo com um outro aspecto do invento, encontraram-se resultados partxcularmente bons através da utilização, em combinação, de pelo menos duas moléculas de ligação a antigénio a células T activadas, as referidas moléculas de ligação reconhecendo pelo menos dois antigénios diferentes característicos de células T activadas.

De preferência pode ser usada uma combinação de duas moléculas diferentes de ligação a antigénio, cada uma delas reconhecendo um antigénio diferente. Assim, se bem que ambas as moléculas de ligação ao antigénio reconheçam antigénios de superfície de células T activadas, elas não competem uma com a outra para o mesmo sítio de ligação nas células T activadas.

De preferência uma das moléculas de ligação ao antigénio é uma molécula de ligação a CD25.

presente invento também proporciona uma composição imuno-supressora compreendendo uma mistura de pelo menos uma molécula de ligação a CD25 e pelo menos uma molécula de ligação a antigénio contra pelo menos um antigénio diferente de CD25 que é característico de células T activadas.

invento proporciona ainda pelo menos duas moléculas de ligação a antigénio contra células T activadas associadas umas è outra para usar na imuno-supressão do sistema de mamífero, as referidas moléculas de ligação a antigénio reconhecendo pelo menos dois antigénios diferentes caracteristicos de células T activadas um dos quais é o antigénio CD.25.

Por molécula de ligação a antigénio contra células T activadas pretende-se significar uma molécula de ligação que reage fortemente com células T activadas ao mesmo tempo que reage fracamente ou não reage mesmo com células T não activadas. De preferência as moléculas de ligação a antigénio são moléculas de imunoglobulina completa, mais preferenc ialmente anticorpos monoclonais murinos, quiméricos ou humanizados, particularmente anticorpos monoclonais quiméricos. Os anticorpos monoclonais CD2S preferidos são os que possuem CDRs com a sequência de aminoácidos descritas atrás.

Vantajosamente, a composição do invento pode também incluir ou pode ser usado em combinação com uma. droga, imune-supressora como seja a ciclosporina A.

i

Os anticorpos monoclonais preferidos contra antigénios de células T activadas diferentes de CD25 são tipicamente os classifiçados no conjunto de genes CD7 conforme estabelecido pelo Boston Worksbop sobre Leucocyte Typing II, Vol. I humart T lymphocites por Reinherz, Haynes, Nadler e Berstein, Springer Verlag, 1985. 0 antigénio CD7 é heterogeneamente expresso em cerca de 80% de células T não activadas. No entanto, a expressão· aumenta fortemente quando da activacão (um aumento de 2-3 vezes na i n tens idade).

Uma combinação preferida de anticorpos é pois uma combinação de um anticorpo CD7 com um CD25. Assim, a composição do invento preferencialmente compreende uma mistura de pelo menos um anticorpo CD25 juntamente com pelo menos um anticorpo CD7, mais preferencialmente de um anticorpo CD25 juntamente com um anticorpo CD7. Também preferencialmente ambos os anticorpos são d o i s o f i p ο I g G.

Os dois anticorpos, facultativamente juntamente com uma droga imuno-supressora, podem ser usados na prática cl.íníca de várias formas. De preferência eles são e a mistura física é administrado ao dí misturados um com o outro •ente. Um processo alternativo é a administração ao recipiente dos anticorpos e facultativamente a droga imuno-supressora a partir de reservatórios separados por qualquer ordem mas ao mesmo tempo. A composição

I pode ser preparada e administrada parenteraimente como descrito atrás para o anticorpo CD25 sõsinho. Como alternativa, a droga imuno-supressora é administrada oralmente e os anticorpos monoclonais são administrados parenteraimente, separadamente ou como uma mistura.

Para melhor se reconstituir composições adequadas, os anticorpos monoclonais e facultativamente uma droga imune-supressora podem ser empacotados separadamente dentro da mesma embalagem, com instruções para a mistura ou concomitante administração. Exemplos de fcits incluem por exemplo uma seringa com vários reservatórios ou uma embalagem contendo formas de dosagem unitárias separadas de pelo menos dois anticorpos contra células T activadas, os referidos anticorpos reconhecendo pelo menos dois antigénios diferentes característicos de células T activadas, um dos quais ê o antigénio CD25.

Até agora as investigações indicaram que a administração dos anticorpos em combinação um com o outro e facultativamente com uma droga imuno-supressora é não origina efeitos secundários inaceitáveis nos níveis de dosagem empregues e que não existe potenciação dos efeitos secundários observados com os anticorpos individuais. Para usar na profiláxia, uma dosagem adequada requererá a administração de 0,05 a 0,5 miligramas de um primeiro anticorpo (como seja o anticorpo CD25) por fcilograma de peso de corpo do doente e 0,05 a 0,5 miligramas de um segundo anticorpo (como seja um anticorpo CD7>por kilograma de peso de corpo. Quando a droga imuno-supressora é a ciclosporina, a quantidade recomendada de droga imuno-supressora que pode ser facultativamente vai de 2 a 5 miligramas por kilograma de peso de corpo quando administrado parenteraimente e 10-15 mg/Kg de peso de corpo quando administrado oralmente. A composição do invento

F-ode ser administrada numa base diária ou semanal, de preferência numa base semana1.

Se bem que a composição do invento se destine particularmente a usar em profiláxia da rejeição de enxertos, a sua utilização pode ser convenientemente estendida ao tratamento de casos de rejeição quando eles de facto ocorrem. Neste caso, a dosagem deverá ser aumentada até um factor de 4.

Os anticorpos monoclonais murinos adequados para usar no presente invento são conhecidos per se. Muitos anticorpos monoclonais contra antigénios de superfície de células T activadas podem ser adquiridos em colecções de culturas de vários países e especialmente a American Type Culture Collection de Rockville, Maryland, USA pode fornecer anticorpos monoclonais adequados ou hibridomas que secretem tais anticorpos. Um exemplo de hibridomas que secretem anticorpos monoclonais C07 que possam ser usados no presente invento e que possam ser adquiridos â ATCC é T3-3A1. Outros anticorpos CD7 são RFT-2 e CHH 380 (um anticorpo quimérico). Os anticorpos CD25, para além do RFT-5 preferido e do seu derivado quimérico como descrito atrás, M7/2 (Qaulton et al., Clin. Immunol. and Irorounopath. (.1935) 36! 18); o anticorpo anti-tac (Uchiyama et al., J. Immunol. (1981) 126 (4)! 1393); e o anticorpo monoclonal Campath 6.

efeito sinergístico de uma combinação dos anticorpos monoclonais CD25 e CD7 foi demonstrado in vivo em testes clínicos em doentes humanos.

No bioensaio MLR, a inibição da incorporação de ’'H-TdR é observada em culturas a que um anticorpo monoclonal CD7 (RFT2) ou CD25 (RFT5) foi adicionado isbladamente e existe um grau substancialmente mais alto de inibição quando ambos os anticorpos

são usados simultâneamente na mesma concentração total. A MLR é o equivalente in vltro da resposta ao transplante alogénico que conduz à rejeição in vivo enquanto que a inibição descrita atrás é o equivalente á imunosupressão in vivo.

Em MLRs a que se adicionou ciclosporina numa gama de dosagem de 10 nanogramas/ml a 100 çig/ml, na presença dos anticorpos monodonais CD7 ou CD25 observa-se uma maior inibição de '“H-TdR comparado com a ciclosporina sôzinha em toda a gama de dosagem. A combinação de CD7, CD25 e ciclosporina apresenta um maior efeito inibido}* do que qualquer outra combinação.

Em testes clínicos, os doentes que vão ser sujeitos a transplante de rim, fígado ou coração são se.leccionados para terapia profilática. No dia do transplante, 2 horas antes dacirúrgia é dada uma primeira infusão intravenosa do anticorpo quimério CD25 do Exemplo 5 juntamente com o anticorpo quimérico CD7 (CHH 380) numa dose de 0,2 mg de cada anticorpo por Kg de peso de corpo. Dois dias após cirúrgia administra-se uma infusão idêntica dos dois anticorpos e depois repete-se com intervalos semanais durante um mês.

As infusões intravenosas são preparadas como se segue.’ os anticorpos liofilizados são misturados uns com os outros e dispersos em 100 ml de soro fisiológico tamponado estéril contendo 4,5% peso de albumina bovina. Esta dispersão em soro fisiológico é administrada a doentes ao longo de um período de 30 minutos. Os doentes também recebem terapia convencional com ciclosporina. Nenhum doente sofreu um caso de rejeição durante um período de terapia de um mês.

Breve descrição dos desenhos

A Figura IA é uma diagrama esquemático mostrando a estrutura de uma molécula de Ig<3 assim como os genes codificadores das cadeias pesada e leve. A Figura 1B representa esquematicamente o arranjo de um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve nas regiões estruturais (FR) e hipervariâveis (COR).

As Figuras 2A e 2B mostram a análise de DNA genômico digerido com EcoRI do hihridoma de murganho RFT5-IgQ2a (1), RFTS-IgGl (2), RFT4 (3) e NS-1 (4) por transferência Southern usando uma sonda de DNA marcada com ‘'‘P codificando o potenciador da cadeia pesada murina (Fig. 2A) ou codificando de murganho e cinco segmentos do gen (Fig. 2B). 10 ;jg de DNA genômico foram digeridos coro EcoRI e fFaccionados pelo tamanho num gel de 0,8% de agarose. Em seguida, os fragmentos foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose e hibridados com a sonda. Após lavagem, a membrana foi exposta durante a noite a um filme Kodak X-0 Mat.

As Figuras 3A e 3B mostram os vectores de expressão parentais pSV2-neo-huCrl e pSV2-DHFR-’E;j-huC_I.. Ambos os plasmídeos k R compreendem um gene de resistência à ampicilina (arop ) e a origem de replieação do pBR322 e 8V40 (pBR322 ori e SV40 ori). p3V2-neo-huC J. caracteriza-se pela presença de um gene da neomicina (neo ) e o gene codificador da parte constante ri humana (huC p, enquanto que p8V2-DHFR-E.u-huCK tem inserido um gene da di-hidrodolato-redutase (DHFR) (resistência ao metotrexato) e o gene codificador da parte constante K humana ChuC^). Os vectores finais para a expressão da cadeia pesada ou leve quimérica são respectivamente obtidos por inserção em p8V2-neo-hCrl de um fragmento de DNA codificador do peptídeo líder <L) e o domínio variável (VDJ._,) da cadeia pesada RFT5~Ig<32a juntamente com o potenciador da cadeia pesada humana e por inserção em

pSV2-DHFR-Eju-huCk de um fragmento de DMA codificador do peptídeo líder (L) e do domínio variável da cadeia leve RFT5”Igõ2a.

As Figuras 4A e 48 mostram a produtividade de conjuntos individuais de células cultivadas com concentrações crescentes de metotrexato (MTX) respectivamente de acordo rncí os processos A e

B descritos no Exemplo 5. 0 eixo dos Y do gráfico dá a quantidade q de anticorpo monoclonal produzido em mg/10~ células em 72 horas.

A Figura 5 mostra um protocolo para a construção de substituições de CDR por inserção das cassetes de CDR num vector contendo 4 regiões estruturais fundidas umas às outras.

A Figura 6

C r._,a i k ) e C o) um MAb Ambos os MAbs têm os Id. N2 1 e 2.

A Figura 7 especifica de PPD por mur i no-humano.

iostra a inibição de MLR qu i mér i c o muri no-humano domínios variáveis como mostra a inibição da <x> RFT5~IgG2a e (o) o >

po r < x ? RFT5-1gG2a do invento <rl, k). se mostra em Seq.

resposta de HPBM esmo MAb qu i mé ri c o

A Figura 8 mostra o efeito de RFT5—IgG2a e do mesmo MAb quimérico murino-humano na. proliferação de 1 infoblastos T com PPD, <Fig. 8B e 8A> e na proliferação de linfoblastos T de MRL, CFig. 8D e 80 numa, concentração de J.L-2 de S ng/ml Co>, 10 ng/ml C) e 20 ng/ml Cx).

Apenas com fins .ilustrativos a produção de um anticorpo

CD25 quimérico do invento é exemplificada como se segue;

Exemplo 1 Clonagem do gene codificador do domínio variável da cadeia, pesada de RFT5—IgG2a

DNA genómico dos hibridomas RFT5-IgQ2a (CD25,‘ T2a,' k), RFTS-IgSl CCD25J rl; k) e RFT4; (CD4i rí, k) e da linha parental de células de mieloma dos hibridomas, nomeadamente NS-1, foi isolado e digerido com EcoRI. Cada um dos DNAs digeridos foi então fraccionado no mesmo gel de agarose. Após migração, o gel de agarose foi analisado por transferência Southern usando como sonda um fragmento de DNA Xbal-EcoRI de 0,7 fcfo marcado com '‘“P o gual codifica o potenciador da cadeia pesada murinaCHeinrich et al •J. Immunol. (1989) 143i 3589). Foram reveladas no gel 3 tipos de bandas após hibridação como se mostra, na Figura 2. 0 fragmento EcoRI de 6,5 Kb está presente no produto de digestão do DNA de todas as linhas celulares incluindo NS-1, a linha celular parental de mieloma e portanto não tem interesse. 0 fragmento EcoRJ. de 2,9 Kb é detectado apenas no produto de digestão do DNA do hibridoma RFT5—IgGl e pensa-se que seja o resultado de um rearranjo anormal, de genes. 0 fragmento EcoRI de 6,8 Kb que está ausente no produto da digestão de DNA da .linha celular parental NS-1 é pois um fragmento de eleição e posterior purificação deste fragmento foi subsequentemente realizada por electroforese em gel

preparativo de agarose.

Fragmentos de DNA de aproximadamenie 5-7 Kb foram clonados no sitio de restrição EcoRJ. do bacteri.ôfago ZAP (Straf·^ tagene). Usando a sonda descrita atrás, foram despistados 6x10 fagos recombinantes e encontraram-se 11 clones que hibridaram. A inserção de DNA dos 11 clones foi amplificada em lisados de placas fágicas por reaccão em cadeia com polimerase (PCR) usando como iniciadores um primeiro oligonucleótido codificador do começo da cadeia pesada RFT5 até ao aminoácido N.2 7 (sequência previamente determinada). 0 segundo iniciador foi projectado tendo em consideração a frequência de utilização de codões pelos genes. Os fragmentos de DNA obtidos a partir de cada um dos 11 clones foram analisados por transferência Southern usando como sonda um oligonucleótido codificador da sequência de aminoácidos entre os aminoácidos 20 e 27 da cadeia pesada RFT5 que foi também projectada de acordo com a utilização de codões mais frequente. Usando a sonda foram detectados 3 clones fágicos idênticos. Parte da inserção de DNAque codifica o domínio variável foi sequenciada pelo método de terminação didesoxi e pode-se ver em Seq. Id. N21 .

Exemplo 2 Construção de uaa gene da cadeia pesada quimérica RFT5

Um fragmento EcoRI de 6 Kb obtido por digestão do DNA de um dos 3 clones fágicos e compreende o gene do domínio variável da cadeia pesada de RFT5Cincluindo o promotor e o potência— dor) foi clonado no sítio de restrição EcoRI de neo-parte constante rido vector de expressão eucariótico pSV2 (Heinrich et al, supra) como se mostra, na. Figura 3A. Em seguida a sequência de nucleôtidos do gene codificador do domínio variável da cadeia pesada, de RFT5 foi determinada para e.xcluir a possibilidade de a. mutação neste gene ter ocorrido durante a propagação do plasmídeo.

Exemplo 3 Clonageea do gene codificador do domínio variável da cadeia leve de RFT5

DNA genómico dos hibridomas RFT5, RFTS-fc e RFT4 e da linha celular parental NS-1 foi isolado e digerido com EcoRI. Cada um dos DNAs digeridos foi então fraccionado no mesmo gel de agarose. Após migração, o gel de agarose foi analisado por transferência Southern usando como sonda um fragmento de DMA marcado com compreendendo os 5 genes J... de murganho e o gene C^. de murganho.

tipos principais de bandas de aproximadamente 12, e 18 Kb foram revelados no gel após hibridacão como se mostra na Figura 28. Os fragmentos maiores são os únicos específicos do hibridoma RFT5. Os fragmentos EcoRI fraccionados pelo tamanho de aproximadamente 18 Kb foram clonados no fago EMBL..4 CStratagene), 7 x 10’' clones fãgicos rscombinantes foram despistados com a sonda descrita atrás e encontrou-se 2 clones que hibridaram, cada um compreendendo uma inserção idêntica de 18 Kb. Mostrou-se que um subfragmento EcoRI-Xbal de 4,4 Kb contem o gene completo codificador do domínio variável da cadeia leve de RFT5 e foi cloua.do no plasmídeo pdEM4 (3tre. ta.gene). Determinou—se a sequência do fragmento de 4,4 Kb. Parte da inserção de DNA de 4,4 Kb variável foi sequenciada. A sequência Id. NQ2.

que c od i f i c a o dom i ηio pode—se observar na Seq

Exemplo 4 Construção de um gene quimérico da cadeia leve de RFT5

Um fragmento Xbal-Xbal de 1,1 Kb codificador do potenciador da cadeia pesada murina CHe3.nr.ich et alj supra? iuntamente c om um f ragmento Hi ndIII-SphI c od i f i c ador da par te c onstante K humana foi subclonado no fago mpl8 CSt-ratagene). Ap‘ós Destruição dos sítios de restrição por mutagénese um fragmento com extremos EcoRI-HindlII preenchidos compreendendo a. sequência do potênciador da cadeia pesada, murina <E,u> e a parte constante k ChuCk) foi clonado no sítio EcoRI-BamHI do PSV2-DHFR. pSV2-DHFR foi obtido por substituição do fragmento BamHI-HindlII do pSV2-neo com o fragmento BamHI-HindlII codificador do gene DHFR.

fragmento EcoRI-Xbal de 4,4 Kb do Exemplo 3 foi então inserido em pSV2-DHFR-E/j~huCk .

Exemplo 5 Expressão de um anticorpo quimérico RFT5

Os plasmídeos conforme obtidos nos Exemplos 2 e 4 foram cotransfectados na linha de células de mieloma de ratinho Sp2/0 <ATCC CRL 1581) por electroporação usando um sistema pulsador de genes da Biorad. Sabe-se que esta técnica cria, transfectantes estáveis com uma frequência elevada. A linha celular SF’2/0 não produz cadeias leve e pesada endógenas; e é sensível á Geneticin CG 418) nuisa concentração de 0,8 mg/ml .

As células SP2/0 foram cultivadas no meio de crescimen__c, to habitual <RPMI + 10% FC8 + 5x10 β-mercaptoetanol), colhidas na Fase log do crescimento e lavadas com o tampão de electropora— 7 cão CBio-Rad). A concentração celular foi ajustada a 2x10 células/ml. A 0,8 ml da suspensão celular foi adicionado 15-20 jug de cada plasmídeo. A mistura foi colocada em gelo e deixada em repouso durante 10 min. Em seguida as células foram sujeitas a um pulso eléctrico <280 Volt,' 25 /jF) e novamente deixado em repouso durante 15 min. As células foram transferidas para o meio de crescimento habitual e incubadas a 37°C numa estufa de C0.„,.

Após 3 dias de incubação, comecou a selecção da resistência â G418. As células foram ressusperssas em meio fresco contendo 1,4 mg/ml de G418. As culturas deram células em crescimento após 10-14 dias de incubação na presença de 6418. Após 2 semanas de incubação, os sobrenadantes das culturas confluentes foram testados relativamente à expressão de IgG humana numa ELISA tipo sanduíche <anti-cadeia leve k humana / sobrenadante / conjugado anti-IgG humana-fosfatase alcalina).

Este teste indica que as moléculas de anticorpo completas são secretadas em todas as culturas em concentrações varáveis na gama de 50-500 ng/ml.

i

Para seleccionar células em que o gene DHFR foi amplificado e portanto secreta grandes quantidades do anticorpo pretendido realiza.ra.m-se dois processos de seleccão para resistência ao metotrexato (MTX) como se descreve abaixo. Com esta finalidade, os conjuntos de células resistentes a G418 foram divididos e a amp.1 ificação prosseguiu de acordo com o processo A (MTX aumenta por um factor de 2 ou 2,5) ou processo B (MTX aumente por um factor de 5).

Processo A

Processo B

ΙΟΟηΜ MTX

200nM MTX

2S0nM MTX

1/jM MTX

SOOnM MTX

5,uM MTX l/.iM MTX

25/jM MTX células

2,5/jM MTX i

í !

SaíM MTX

IOO/jM MTX lOjuM MTX

I

2SaíM MTX

I í

I

ÍOO,uM MTX

Cada passo de amplificação compreende a i P a uma densisda.de de 2x10“ células/ml no me.i a 1,4 mg/m1 e mento habitual suplementado com S 418 noculação de o de crescicom MTX numa concentração escolhida. Apôs 72 horas de incubação, as células e o sobrenadante foram separadas. A secreção de anticorpos foi controlada por ELISA ou por HPLC usando uma coluna de proteína A.

As Figuras 4A e 48 mostram a produtividade de anticorpos do mesmo conjunto de transfectantes. A maior parte dos conjuntos atinge um máximo de produção de anticorpos específicos numa certa concentração de metotrexato. Os melhores conjuntos de produtores foram clonados por diluição limite. De entre centenas de clones analisados seleccionaram-se os 15 melhores clones produtores. A produtividade dos clones variou entre 30 e 50 mg de MAb/lO^ células em 72 horas.

anticorpo foi purificado a partir de um sobrenadante de cultura por eluição numa coluna de afinidade de proteína A.

Matéria

Ti po de

IDENTIFICADOR PE SEQUÊNCIAS N21 em causa!

sequência

T i po de mo1 é c u 1 a !

Domínio variável da cadeia pesada de i rnunogIotouIi na do an t i c o r po RFT5

Sequência de nucleótidos e correspondente sequênc i a de am i noác idos

DNA genóm i c

Comprimento ί

492 nuc1eótidos

Fonte originalί

Um hibridoma murino

Características da sequência de nucleótidos;

Um intrão está situado entre o nucleótido 47 e 3.30

Gene	do	segmento	V!	do	nucleótido	142	ao	435
Gene	do	segmento	D!	do	nuc 3.eót ido	4·.·6	ao	447
Sene	do	segmento		do	nuc1eótido	448	ao	432

Características da sequência de aminoácidos!

Pept í deo 1í de r!

FR1 !	desde a.a.
CDR1	; desde a.a
FR2:	desde a.a.
CDR3	! desde a.a
FR3 !	desde a.a.
CDR3	! desde a.a

desde o aminoâcido até 30 31 a té 35 até 49 50 a té 66 até 98 107 até 117.

-19 até —1

ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT CCT TTT ATT CTG TCG GTA ATT TCA G Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe He Leu Ser Vai Ile Ser

-15 -10 -5

GTAAGGGGCT CACCAGTTCC ATATCTGAAA GAGGATACAG GGTCTGAAGT GACAATGACA 106 TCTACTCTGC TGTTCTCTCC ACAG GG GTC TAC TCA GAG GTT CAG CTC CAG 156

Gly Vai

Tyr Ser Glu Vai Gin Leu Gin

-1

1

5

CAG

TCT

GGG

ACT

GTG

CTG

GCT

AGG

CCT

GGG

GCT

TCC

GTG

AAG

ATG

TCC

204

Gin

Ser

Glu

Thr

Vai

Leu

Ala

Arg

Pro

Gly

Ala

Ser

Vai

Lys

Met

Ser

10

15

20

TGC

AAG

GCT

TCT

GGC

TAC

AGC

TTT

ACC

AGG

TAC

TGG

ATG

CAC

TGG

ATA

252

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Thr

Arg

Tyr

Trp

Met

His

Trp

Ile

25

30

35

AAA

CAG

AGG

CCT

GGA

CAG

GGT

CTA

GAA

TGG

ATT

GGT

GCT

ATT

TAT

CCT ·

300

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Ala

Ile

Tyr

Pro

40

45

50

GGA

AAT

AGT

GAT

ACT

AGT

TAC

AAC

CAG

AAG

TTC

GAG

GGC

AAG

GCC

AAA

348

Gly

Asn

Ser

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Glu

Gly

Lys

Ala

Lys

55

60

65

CTG

ACT

GCA

GTC

ACA

TCC

GCC

AGC

ACT

GCC

TAC

ATG

GAG

CTC

AGC

AGC

396

Leu

Thr

Ala

Vai

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

75 80 85

CTG

ACA

CAT

GAG

GAC

TCT

GCG

GTC

TAT

TAC

TGT

TCA

AGA

GAC

TAC

GGC

Leu

Thr

His

Glu

Asp

Ser

Ala

Vai

Tyr

Tyr

Cys

Ser

Arg

Asp

Tyr

Gly

90

95

100

TAC

TAC

TTT

GAC

TTC

TGG

GGC

CAA

GGC

ACC

ACT

CTC

ACA

GTC

TCC

TCA

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Phe

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Vai

Ser

Ser

105

110

115

Matéria

T i po de

Tipo de

IDENTIFICADOR DE SEQUÊNCIAS NS2^:

C<SLÍ£>$tÍ sequênci a í molécula

Compr imento;

Fonte original

Ca r a c te r £ st i c as da

Domínio variável da cadeia leve de imunoglobul ina do anticorpo RFT5

Sequência de nucleótidos © correspondente sequênci a de am i noá c i dos

DMA genómico

455 nu c1eô t i dos

Um bibridoma murino sequênc i a de nucIeót i dos;

Um intrâo está situado entre o nucleétido 50 e 22b

Cene do segmento V»' Gene do segmento ·$,*·>

do nucleétido 244 ao 513 do nucleétido 520 ao 455

Características da sequência de aminoâcidos:

Peptídeo líder: desde o aminoácido <a.a.> -22 até -1

FRí ’; CDR1’ FR2’ : CDR3¹

Fe» o > « no j

CDR3 ’ FR4 ’ :

desde a desde a.a. desde a.a.

desde a.a. desde a.a.

desde a.a desde a.a.

a té 33 até 48 43 até 55 até 87 88 até 34.

até 104

ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA G 49 Het Asp Phe Gin Vai Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

-20 -15 -10

GTAACAGAGG GCAGGGAATT TGAGATCAGA ATCCAACCAA AATTATTTTC CCTGGGGAAT 109

TTGAGTCTAA AATACAGTTT TTTTTTCTTT TTCTTCATCT GAATGTTGGG TGGTATAAAA 169

TTATTTTTGT TTCTCTATTT CTACTAATCC CTTTCTCTCT ATTTTGCTTT TTTCTAG 226

TC ATA CTG TCC AGA GGA CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC 273

Vai Ile Leu i

Ser Arg (

Gly Gin :

Ile '

Vai '

Leu Thr 1

Gin !

5er '

Pro .

Ala

Ile

-5

-1

1

5

10

ATG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACC

ATG

ACC

TGC

AGT

GCC

AGC

321

Het

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Vai

Thr

Het

Thr

Cys

Ser

Ala

Ser

15

20

25

TCA

AGT

ATA

AGT

TAC

ATG

CAG

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGC

ACC

TCC

369

Ser

Ser

Ile

Ser

Tyr

Met

Gin

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Thr

Ser

30

35

40

CCC

AAA

AGA

TGG

ATT

TAT

GAC

ACA

TCC

AAA

CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

417

Pro

Lys

Arg

Trp

Ile

Tyr

Asp

Thr

Ser

Lys

Leu

Ala

Ser

Gly

Vai

Pro-

45

50

55

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAT

TCT

CTC

ACA

ATC

465

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

60

65

70

AGC

AGC

ATG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAT

CAG

CGG

513

Ser

Ser

Het

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Bis

Gin

Arg

75

80

85

90

AGT

AGT

TAC

ACG

TTC

GGA

GGG

GGG

ACC

AAA

CTG

GAA

ATA

AAA

555

Ser

Ser

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

Tabela 1

Região

FRI

CDRI

FR2

CDR2

FR3

CDR3

FR4

Local i za ç ões na c ade i a poisada aminoácidos 1 a 30 (com ura resíduo ocasional em 0) aminoácidos 31 a 35 (cora possíveis .inserções numeradas com 35A, 35B5 aminoácido 36 e 49 aminoácido 50 a 65 (com possíveis inserções numeradas como 52A B e C) aminoácido 66 a 94 (com aminoácido 95 a 102 (com possíveis inserções numeradas como 100A, B, C, D, E, F, G, Η, I,

J, e Kl aminoáeido 103 a 113

Loca1izações na cadeia 1 e ve aminoácidos 1 a 23 (com um resíduo ocasional em 0 e uma delecçSo em 10 nas cadeias >

aminoácidos 24 a 34 (com poss i ve1 i nse r ç ão numerada com 27A, B, C, D, e F) aminoácido 35 a 49 aminoácido 50 a 56 aminoácido 57 a 88 aminoácido 89 a 97 com possíveis inserções numeradas como 95A, B, C, D, E e F1 am i noá c i do 98-107 (c om uma possível inserção numerada com 106A1

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para a produção de t ligação a CD25 que compreende pelo menos um sítio de ligaçãt antigénio compreendendo pelo menos um domínio sequência, as regiões hipervariâveis DCDR1, CDR2 e CDRS,’ tende referida CDRÍ a sequência de aminoácidos Argtendo a referida CDR2 a sequência de aminoácidos Ala-Ile-Tir-Pro-Gli-Asn-Tre-Ser-TirAsn-Gln-Lis-Fen-Slu-Sli, © tendo a referida CDRS a sequência de aminoácidos Asp-Tir-”Sli-’Tir-Tir-Fen-Asp~Fenj ou seus equivalentes directos,’ caracterizado por compreender o passo de cultura de uma linha celular de hibridoma ou de um organismo transformado com uma construção de DNA compreendendo sequências de nucleótidos codificando sequenciadamente as referidas regiões hipervariâveis CDRÍ, CDR2 e CDRS, e isolamento de uma molécula de ligação a CD25 a partir da cultura.

   molécula de de Iigação ao engloba na CDRS,' tendo a r- Trp-Met-Hi s,
2. 2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carácter isado por a molécula de ligação a CD25 compreender pelo menos um sitio de ligação ao antigénio compreendendo a? um primeiro domínio compreendendo sequenciadamente as regiões hipervariâveis CDRÍ, CDR2 e CDRS/ tendo a referida CDRÍ a sequência de aminoácidos Arg-Tir-Trp-Net-His, tendo a referida CDRS a sequência de aminoácidos Ala-IIe-Tir-Pro-SIi-Asn-Ser-Asp-Tre-Ser-Tir-Asn-Sln-Lis-Fen-GluSIi e tendo a referida CDRS a sequência de aminoácidos Asp-Tir-Gli-Tir-Tir-Fen-Asp-Fen e um segundo domínio compreendendo sequenciadamente as regiões í

   hipervar iâveis CDRÍ', CDR2' e CDRS', tendo a. referida CDRÍ a sequência de aminoácidos Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Ile-Ser-Tir-•Net-SIn, tendo a referida CDR2' sequên cia de am i noá c i dos

   Asp-Tre-Ser-Lis-Leu-Ala-Ser e tendo a sequência de aminoác idos His~G1n--Ar g--Ser· ref erida CDR3¹ er-Tir-Tre;

   ou seus equivalentes directos.
3. 3â. ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a molécula de ligação a CD25 compreender pelo menos um sitio de ligação ao antigénio compreendendo um domínio tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada em Seq. I d. N& .1!

   ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT CCT TTT ATT CTG TCG GTA ATT TCA G Het Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Vai Ile Ser -15 -10 - -5

   GTAAGGGGCT CACCAGTTCC ATATCTGAAA GAGGATACAG GGTCTGAAGT GACAATGACA 106

   TCTACTCTGC TGTTCTCTCC ACAG GG GTC TAC TCA GAG GTT CAG CTC CAG 156

   Gly Vai Tyr Ser Glu Vai Gin Leu Gin -1 1 5 CAG TCT GGG ACT GTG CTG GCT AGG CCT GGG GCT TCC GTG AAG ATG TCC 204 Gin Ser Glu Thr Vai Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Vai Lys Met Ser 10 15 20 TGC AAG GCT TCT GGC TAC AGC TTT ACC AGG TAC TGG ATG CAC TGG ATA 252 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr Trp Met His Trp Ile 25 30 35 AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTA GAA TGG ATT GGT GCT ATT TAT CCT 300 Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro 40 45 50 GGA AAT AGT GAT ACT AGT TAC AAC CAG AAG TTC GAG GGC AAG GCC AAA 348 Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Glu Gly Lys Ala Lys 55 60 65 - CTG ACT GCA GTC ACA TCC GCC AGC ACT GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC 396 Leu Thr Ala Vai Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Het Glu Leu Ser Ser 70 75 80 85 CTG ACA CAT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TAC TGT TCA AGA GAC TAC GGC 444 Leu Thr His Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Tyr Gly 90 95 100 TAC TAC TTT GAC TTC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA 492 Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser

   105 110 115 começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 117 ou compreendendo um primeiro domínio como descrito atrás e um segundo domínio tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada na Seq. Id. N.2 2;

   ATG GAT TTT CAG GTG ÇAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCC TCA G 49 Het Asp Phe Gin Vai Gin Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser

   -20 -15 -10

   GTAACAGAGG GCAGGGAATT TGAGATCAGA ATCCAACCAA AATTATTTTC CCTGGGGAAT 109

   TTGAGTCTAA AATACAGTTT TTTTTTCTTT TTCTTCATCT GAATGTTGGG TGGTATAAAA 169

   TTATTTTTGT TTCTCTATTT CTACTAATCC CTTTCTCTCT ATTTTGCTTT TTTCTAG ' 226

   TC ATA CTG TCC AGA GGA CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC 273

   Vai Ile Leu Ser Arg Gly Gin Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile

   -5 -1 1 5 10 ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC 321 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Vai Thr Het Thr Cys Ser Ala Ser 15 20 25 TCA AGT ATA AGT TAC ATG CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGC ACC TCC 369 Ser Ser. Ile Ser Tyr Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Thr Ser 30 35 40 CCC AAA AGA TGG ATT TAT GAC ACA TCC AAA CTG GCT TCT GGA GTC CCT 417 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro 45 50 55 GCT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAT TCT CTC ACA ATC 465 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 60 65 70 AGC AGC ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAT CAG CGG 513 Ser Ser Het Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Arg 75 80 85 90 AGT AGT TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAA CTG GAA ATA AAA 555 Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 95 100

   começando com o aminoácido na posição e terminando com o aminoácido 104.
4. 4â. - Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 8, caracterizado por a molécula de ligação a CD25 compreender pelo menos uma cadeia esada de imunoglobulxna ou seu fragmento que compreende Ci) um domínio variável compreendendo na sequên- cia as regiões hipervariáveis CDRÍ, CDR2 e parte constante ou seu fragmento de uma humana; tendo a referida CDRÍ a sequência

   CDR3 e < i i) a cadeia pesada de a.m i noá c i dos

   Arg-Tir-Trp-Met-His, tendo a referida CDR2 a sequência Ala-Ile-Ti r-Pro-Sli-Asn-Sei—Ti r-Asn-Sln-Lis-Fen-Glu-fíli e tendo a referida CDR3 a sequência de aminoâcidos Asp-Tir— -SIi-Ti r-Ti r-Fen-Asp-Fen e to) uma cadeia leve de imunoglobulina ou seu fragmento que comn- preende <i) um domínio variável compreendendo sequenciadamente as regiões hipervariáveis CDRÍ', CQR2' e CDR3' e Cii) a parte constante ou um seu fragmento de uma cadeia leve humana; tendo a referida CDRÍ' a sequência de aminoâcidos Ser-Ala-Ser-Ser-Ssr-Ile-Ser-Tir-Met-Qln, tendo a referida

   CDR2' a sequência de aminoâcidos Asp-Tre-Ser-Lis-Leu-Ala— -Ser, e tendo a referida CDR3' a sequência de aminoâcidos His-Qln-Arg-Ser-Ser-T ir-T re;

   ou seus equivalentes directos.

   Sã. - Processo de acordo com a reivindicação 4, carácter izado por a molécula de ligação a CD25 compreender pelo menos

   I

   a) uma cadeia pesada que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à mostrada na 8eq. Id. N2 i começando com o aminoácido na posição 1 e terminando com o aminoácido na posição 117 e a parte constante de uma cadeia pesada humana; e

   b) uma cadeia leve que compreende um domínio variável tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntico á mostrada na Seq. Id. N.2 2 começando com ácido glutâroico na posição 1 e terminando com ácido glutâmico na posição 104 e a parte constante de uma cadeia leve humana.

   Sã. _ Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por, na molécula de ligação a CD2S, a parte constante ou seu fragmento da cadeia pesada humana ser do tipo gama e a parte constante ou seu fragmento da cadeia leve humana ser do tipo feapa.

   7ê. - Processo para a produção de uma molécula de ligação a CD25 de muiti~cadeias, caracterizado por compreender

   A) a cultura de um organismo que é transformado com

   i) uma construção de DNA correcta que codifica uma cadeia pesada ou seu fragmento e compreende

   a) uma primeira parte que codifica um domínio variável compreendendo alternaiivamente regiões estruturais e hipervar iáveis, sendo as referidas regiões hipervar iá.veis sequencialmente CDR1, CDR2 e CDR3, cujas sequências de aminoácidos estão apresentadas em Seq. Id. N2 1; começando esta primeira parte com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio c-7» variável e terminando com um codão codificador do último aminoàeido do domínio variável e fo? uma segunda parte que codifica uma parte constante da cadeia pesada ou um seu fragmento que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cadeia pesada e termina com um codão codificador do último aminoácido da parte constante ou seu fragmento, seguido de um codão sem sentido!

   s* c o»y» ii? uma construção de DMA que codifica uma cadeia leve ou seu fragmento e compreende

   a) uma primeira, parte que codifica um domínio variável compreendendo alternativamente regiões estruturais e hipervariáveis,’ sendo as referidas regiões hipervariáveis sequencialmente CDR1', CDR2’ e CDR3’, cujas sequências de aminoècidos estão apresentadas em Seq. Id. NS 2; começando esta primeira parte com um codão codificador do primeiro aminoácido do domínio variável e terminando com um codão codificador do último aminoácido do domínio variável e fo? uma segunda parte que codifica uma parte constante da cadeia leve ou seu fragmento que começa com um codão codificador do primeiro aminoácido da parte constante da cadeia leve e termina com um codão codificador do último aminoâcidoda parte constante ou seu fragmento seguido de um codão sem sentido;

   e B? a recuperação de uma molécula activa de ligação a CD2S a partir da cu1 tura.

   Processo para a preparação de uma

   8é. - Processo para a preparação de uma composição imuno-supressora, caracterizado por compreender o passo de mistura de peio menos uma molécula de ligação a CD25 e pelo menos uma molécula de ligação ao antigénio contra pelo menos um antigénio diferente de CD25 que seja característico de células T activadas.

   9ã. - Processo de acordo com a reivindicação 8, carácter izado por compreender ainda a mistura de ciclosporina A.

   ÍVã. Processo de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 9, caracterizado por a molécula de ligação a CD25 ser o anticorpo quimérico CD25 do Exemplo 5 e a outra molécula de ligação ao antigénio ser um anticorpo quimérico CD7.

   i sfo fUtí .

   14 de Marco de 1991

   J. PEREIRA DA CRUZ

   Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VfCTOR CORDON, 10-A 3« 1200 LISBOA i

   FOLHA 1 (9 FOLHAS)

   Fig. 1A

   Genes codificadores da cadeia leve Ig L Vl J Enhancer Cl

   -DtK]-□

   Fig. 1B

   FRl FR2

   COR Ϊ

   CDR2

   COR3

   FOLHA 2 (9 FOLHAS)

   Fig, 2A [kb]

   22 —

   9.05.04.33.52.3

   12 34

   Fig. 2B [kb]

   9.06.5 —
5. 5.0 —

   4.3 —

   15-43 2 I

   FOLHA 3

   9 FOLHAS)

   Fig. 3A

   FOLHA 4 (9 FOLHAS) =□ Tl/3a • T2/23a Δ T2/45a o T2/89a

   0,1

   100

   FOLHA 5 (9 FOLHAS) figure 5

   Sítios de restrição

   1 2 3

   YECTOR _FR, _{FR2 fR3 FR4} YECTOR (1) (2)

   Vector digerido/FR1-4 nos sítios de restrição 1, 2 e 3

   Ligar duplexes CDR de coesivos 1. 2 e 3.