JP2001501607A

JP2001501607A - 免疫調節のためのｃｄ４５ｒ白血球抗原に対する抗体の利用

Info

Publication number: JP2001501607A
Application number: JP10514798A
Authority: JP
Inventors: アイ．ラザロビッツ，アンドリュー; ポッペマ，シブラント
Original assignee: リサーチコーポレイションテクノロジーズ，インコーポレイティド
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-17
Publication date: 2001-02-06
Also published as: EP0939652A1; ATE301471T1; US6379668B1; DE69733960T2; US20020168362A1; WO1998011918A1; US7160987B2; ES2247638T3; CA2266684A1; EP0939652B1; US6106834A; DE69733960D1

Abstract

(57)【要約】移植拒絶反応の予防もしくは回復、又は自己免疫疾患の治療のための方法であって、１又は複数種の所定のCD45Ｒ白血球抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体の如き化合物を投与することを含んで成る方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】免疫調節のためのCD45Ｒ白血球抗原に対する抗体の利用発明の背景器官、細胞及び組織移植拒絶反応並びに様々な自己免疫疾患は主にＴ細胞媒介免疫反応の結果であると考えられている。このＴ細胞媒介免疫反応は特異的な抗原を認識することのできるヘルパーＴ細胞により主として誘導される。このようなヘルパーＴ細胞は事前の免疫応答から置き去りにされた記憶細胞又は胸腺により放出され且つ極めて多種多様な任意の抗原レセプターを発現しうるナイーブ細胞でありうる。このようなヘルパーＴ細胞のいづれかが抗原提示細胞(APC)又はマクロファージに抗原−MHC複合体の形で表層上に存在している抗原を認識すると、ヘルパーＴ細胞はこの抗原特異的Ｔ細胞レセプター、コレセプター、及びAP Cもしくはマクロファージにより分泌されるIL−１から発せられるシグナルにより刺激されてIL−２を生成する。次いでこのヘルパーＴ細胞は増殖する。増殖はＴ細胞の大集団を供し、それらは特定の抗原を認識するようにクローン選別される。Ｔ細胞活性化はＢ細胞活性化及び非特異的マクロファージ応答も剌激しうる。このような増殖細胞の一部は細胞障害Ｔ細胞へと分化し、特定の抗原を有する細胞を破壊する。抗原がもはや存在しなくなったら、成熟したクローン選別された細胞は記憶ヘルパー及び記憶細胞障害Ｔ細胞として残り、体内において循環し、そしてそれらが再び曝露される抗原を認識するであろう。もしこの応答を誘導する抗原が外来抗原でなく、自己抗原なら、その結果は自己免疫疾患である；もしその抗原が移植器官に由来する抗原なら、その結果は移植拒絶反応である。従って、かかるＴ細胞媒介免疫応答を調節することができることが所望される。 CD45抗原（CD45）はほとんどの白血球上で発現される。事実、一般のCD45抗原は全ての白血球上に存在しているものと前から考えられており、その理由のためこのレセプターは当初から白血球共通抗原(LCA)として知られていた。CD45に対するモノクローナル抗体(mAb)は、所望するときの、例えば非特異的CD45モノクローナル抗体を利用して移植すべき器官から移植以前にパッセンジャーの白血球を一掃するときの、白血球を全て効果的に排除する手段として提唱されている。例えばWO91／05568を参照のこと。 CD45の種々のアイソフォームがCD45遺伝子の単一の一次転写物の交互スプライシングにより作製されることが近年示された。このようなCD45アイソフォームにはCD45RA，CD45RB，CD45RC及びCD45ROが挙げられる。CD45RAはCD45遺伝子のエキソン４（時折りＲ_Aと称される）の発現生成物を含む；CD45Ｃはエキソン６の発現生成物を含む；CD45RBはエキソン５の発現生成物を含む；CD45ROは３つのエキソン４，５又は６のいづれの発現生成物も含まない。Hellら、「Complete Exon- Intron Organization of the Human Leukocyte Common Antigen(CD45)Gene」J ． Immunol .，141，2781（1988）及びstreuliら「Characterization of CD45 and C D45R Monoclonal Antibodies Using Transfected Mouse Cell Lines that Expre ss Individual Human Leukocyte Common Antigens」J ．Immunol.，141，3910（1 988）参照のこと。臨床器官移植における成功の増大には免疫抑制技術の平行した向上が伴う。しかしながら、増強する能力の免疫抑制薬は往々にしてその特異性の欠如を理由に合併症を供する。例えば、受容体は感染症に対して極めて感受性となりうる。それ故、高度に特異的な免疫抑制が所望される。理想的な特異的免疫抑制方法は、患者が受容する特定の移植片の拒絶反応を司るリンパ球の作用を、本来伴う免疫系に対して及ばされる影響なく、抑制する処置であろう。従って、ヒト、特に移植受容者、又は自己免疫疾患に冒された者における免疫応答を永続式且つ選択式に抑制又はそうでなければ調節するニーズがある。発明の概要本発明はヒト及び哺乳動物におけるin vivo免疫抑制のための方法を提供する。これらの方法には、移植細胞、組織及び器官の拒絶反応を予防するための予備処置in vivo療法、並びに病理学的免疫応答を回復させる移植後in vivo療法が含まれる。好ましくは、本方法は、受容者の拒絶反応を単に遅らせるというよりも、永続的な寛容性を授けることができる。詳しくは、本発明の方法はかかる処置を必要とする患者に、Ｔ細胞上に存在するCD45白血球抗原に特異的に結合する免疫抑制有効量の少なくとも一種の化合物を投与することを含んで成る。例えば、本発明の方法は、移植拒絶反応、例えば対宿主性移植片病を有する患者又は自己免疫疾患を冒す患者を処置するのに利用できうる。好ましくは、当該化合物はCD45RBレセプターに結合する。本発明は更に、CD45抗原に特異的に結合する免疫抑制有効量の少なくとも一種の化合物と薬理学的に許容される担体との組合せを含んで成る薬理組成物を提供する。「化合物」なる語は、例えば、本明細書において定義する抗体、及び抗体様機能を有する分子、例えば抗体の合成類似体、例えば一本鎖抗原結合分子、小型結合ペプチド又はそれらの混合物を意味する。好ましくは、本方法の化合物は抗体である。より好ましくは、投与する抗体は CD45RB白血球抗原、CD45RO白血球抗原、CD45RA白血球抗原又はCD45RC白血球抗原に結合できるであろう。最も好ましくは、この抗体はCD45RB又はCD45RO白血球抗原に結合できる。前述の通り、本発明の方法は移植拒絶の処置において有用である。より詳しくは、この方法は同種異系又は異種のいづれかである細胞組織又は器官移植を受けた患者の処置のために採用されうる。更に、本発明の方法は移植処置の前、後、もしくはその最中、又は任意のそれらの組合せで利用されうる。本発明の方法は、様々な移植状況、たとえ受容体が同じ又は異なる細胞、組織又は器官の連続移植片を受容しうるような状況のときでさえも、有益であると考えられる。例えば、本発明の方法は心臓、肝臓、骨髄かもしくは腎臓移植の際、又は膵臓半島もしくは血管組織の移植、例えば冠状バイパス処置の際に利用されうる。本発明の方法は自己免疫疾患、炎症症状及び関節炎又はリウマチ様疾患の処置又は予防においても有用でありうる。例えば、本発明の方法は自己免疫血液疾患、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クーロン病、多発性硬化症、真性Ｉ型糖尿病、等の処置のために利用されうる。本発明の方法の更なる態様において、抗炎症又は免疫抑制薬を上記の化合物の前、後又は一緒に投与してよい。例えば、この目的のために適当な薬には、限定することなく、シクロスポリン、FK−5C６、ラパマイシン、コルチコスチロイド、シクロホスファミド、マイコフェノレート、モフェチル、レフルノミド、抗リンパ球グロブリン、デオキシスペルグアリンOKT−３、等が挙げられる。更なる別の態様において、本発明の方法は患者に一定量の患者のリンパ球を、即ち、CD45白血球抗原結合化合物と組合せて投与することを更に含んで成りうる。本発明は、白血球、例えば様々なタイプのＴリンパ球、又は「Ｔ細胞」が主として何らかのCD45アイソフォームを発現しうるという発見に基づく。ナイーブヘルパーＴ細胞及び記憶Ｔ細胞は主にCD45RA及びCD45ROそれぞれを発現する。CD45 RB発現も多彩である；それはナイーブヘルパーＴ細胞（Th０）上で及び主にインターロイキン２を生成するＴ細胞上で高度に発現され（bright）、そして炎症及び細胞障害応答（Th１）を誘導しうる。主にインターロイキン４を生成し、且つ体液性免疫応答（Th２）を誘導しうるＴ細胞は低いCD45RB発現性（dim）を有する。 CD45RBと反応するいくつかの抗体（マウスのMB23G2、霊長類の６Ｇ３）は、記憶Ｔ細胞のプールを破壊することなく炎症及び細胞障害Ｔ細胞媒介免疫応答を選択的に阻害できることが示されている。従って、CD45RBサプレッサーは現状の免疫抑制因子よりも、（ｉ）それらが、総合的な免疫抑制効果を有するというよりは特定のＴ細胞集団に対して作用し、それ故免疫系の過剰抑制に伴う副作用の危険性が回避される；及び（ii）それらが、抗原に対する曝露と同時に投与されたとき、例えば器官移植の直前及び直後、又は自己免疫疾患の急性段階の際に投与されたとき、特定の抗原に対する長期寛容を授ける；という点で非常に有利である。本明細書において用いる語「免疫寛容」又は単に「寛容」とは、所定の又は特異的な抗原又は一連の抗原に対するリンパ細胞による持続的な非応答活性状態を意味するつもりである。かくしてその他の免疫原に対する免疫応答は影響されず、しかも持続式外因的免疫療法の必要性が軽減される又はなくなる。更に、寛容は外因的免疫療法のニーズを高めることなく同種の抗原又は一連の抗原を含んで成る材料のその後の移植を可能にする。一般に、本方法はアネルギー化する抗原に対するレセプターを有するＴ細胞を導き得、これによりＴ細胞クローンは、実際にはでないにしても、機能的に失われるものと信じられている。Ｔ細胞の完全機能的活性化のためには２つのシグナルが必要とされる。第一のシグナルはＴ細胞レセプターを介する抗原の認識を必要とする。第二のシグナルは補助刺激分子、例えば抗原提示細胞上のＢ７と、レセプター、例えばＴ細胞上のCD28との間での相互作用を必要とする。一般に、CD 28を介するこの第二シグナルの欠如はアネルギーを招くことが受け入れられている。しかしながら、CD45はＴ細胞レセプターを介する活性化を必要とし、そして CD45RBを介するこの過程の干渉は第一シグナルを妨害し、そしてアネルギーも招きうる。これは事実上Ｂ７−CD28相互作用のブロッキングよりも基本的なアプローチであり、なぜなら多種多様な補助刺激経路がある一方で、一つのＴ細胞レセプター複合体しかないからである。CD45は示差式に発現されるため、それはＴ細胞の特異的なサブセットに選択的に影響を及ぼす可能性もある。即ち、観察される作用はサブセット又は一般のＴ細胞集団の枯渇にのみ基づくのではなく、一過性の枯渇と受容体の寛容化を招く持続作用との組合せを包括する。例えば、マウス腎臓移植モデルにおいて、抗−CD45RBモノクローナル抗体による一次処置を経ての同種移植片寛容は永久に持続し、100日を超えて生存する。腎臓同種移植を経て100日を超えて生存したマウスにおいて、本方法は寛容にすべきドナー腎臓と同系の皮膚移植を可能にし、一方、受容体及びドナー腎臓の双方と同種異系の皮膚移植は拒絶される。「抗体」なる語にはヒト及び動物mAb、並びにポリクローナルの調製品、更には抗体フラグメント、合成抗体、例えば組換抗体、キメラ抗体、例えばヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体並びにそれらの誘導体が挙げられる。自己免疫疾患又は症状に関する本明細書において用いる語「処置」には疾患又は症状の開始又は発症の予防、並びにこの疾患又は症状の１又は複数の徴候の抑制又は消失を含む。図面の簡単な説明図１は未処置グループと対比させたMB23G2−処置動物の長期生存を示す。図２は犠牲にした時点での各グループ由来の血清クレアチニンレベルを示す。図３Ａ，３Ｂ及び３ＣはMB23G2が循環リンパ球の枯渇を誘導し、そして残留Ｔ及びＢリンパ球に結合することを示す。図４は同種移植片を受容した後の抗CD45RBmAb6G3で処置したサイノモルガス（ Cynomolgus）ザルの生存を示す。図５はCD45(R)抗体とOKT３刺激化末梢血液単核細胞との同時インキュベーションの結果を示す。図６は抗CD45RB試薬663がCD細胞よりもCD８細胞に対して強い阻害作用を有すことを示す。図７はOKT３誘導化CD25発現に対するCD45，CD45RB及びCD45RO抗体の阻害効果を示す。図８はMBPで免疫して５日目での抗CD45RB処置マウス由来のＴ細胞の増殖能力を示す。図９はMBPで免疫して10日目での抗CD45RB処置マウス由来のＴ細胞の増殖能力を示す。発明の詳細な説明本発明の化合物、抗体及び組成物は好ましくは下記の実施例において記載の通りに製造するか、又は当業者に自明である均等な手段４により製造する。本明細書におけるハイブリドーマは、同一の所望の特異性のモノクローナル抗体を生産する能力を保持しながら遺伝子突然変異又はその他の変化に委ねられうることを当業者は理解するであろう。従って本発明はハイブリドーマの突然変異体、その他の誘導体及びその子孫を包括する。モノクローナル抗体は、もとのモノクローナル抗体の特異性を保持するその他の誘導抗体、ヒト化もしくはキメラ分子、又は抗体フラグメントを作り出す組換 DNA工学の技術に委ねられることができることが当業者により更に理解されるであろう。かかる技術は、モノクローナル抗体のイムノグロブリン可変領域又は相補性決定領域をコードするDNAを別のイムノグロブリンの定常領域又は定常領域及びフレームワーク領域と組合せ、例えばマウス誘導モノクローナル抗体を大まかなヒトイムノグロブリン特徴を有するものへと変換することを包括する（EP18 4187A，GB2188638A参照）。CD45R アイソフォームに対する抗体 S．Poppemaら、J ．Immunol.，147，218(1991)は先にモノクローナル抗体MT３を発表している。しかしながらこの公開物はかかる抗体を作製するための詳細な方法は開示しておらず、またこの抗体についての任意の薬理学的用途も開示しておらず、それ故この抗体により認識されるＴ細胞集団を開示していない。A．Laz arovitsらTransplantation ，54，724（1992）はこの抗体のin vitro効果を特性決定している。LazarovitsらははじめてMT３mAbがCD45RBを妨害することによりＴ細胞の増殖及び構築を阻害することを示した。MT３mAbに加えて、Lazarovits らはCD45RBに対するモノクローナル抗体、例えばATCC Rockville MDより公共的に入手できる細胞系HB220 により生産される抗体（現在は抗CD45RBmAb(MB23G2)と命名）がCD45RBに結合し、そしてin vitro及びin vivoで免疫機能を抑制するうえでの有効な因子であることを報告している（米国特許出願第08／071,009号（1993年６月２日出願）参照のこと）。本発明者は６Ｇ３モノクローナル抗体がCD45RBに結合することをこの度見い出した。これはヒトCD45RBに対して特異的なマウスIgG１である。これはサルのCD4 5RBと交差反応する。本発明者はMB23G2，６Ｇ３及びMT３モノクローナル抗体がＴ細胞を含む白血球上のニューラミンダーゼ感受性エピトープに結合すること、並びに少なくともMB23G2及び６Ｇ３がホスホリパーゼＣ−γ１のチロシンリン酸化を増大することをこの度発見した。HB223(今はMB4B4と命名）、即ち本発明のものに対する類似の抗CD45RB抗体がニューラミニダーゼ感受性エピトープに対して結合しないということが見い出されたことは注目に値する。MB4B4mABがニューラミニダーゼ非感受性エピトープに結合し、そしてホスホリパーゼＣ−γ１のチロシンリン酸化を改変しないことも観察される。MB4B4はマウスの腎性同種移植拒絶を予防するのにも有効でない。概略した本発明において利用できる特異的な抗CD45mAbを以下の表１の通りである(StreuliらJ.Immunol.，141，3910(1988)) 。表Ｉ抗−CD45RmAb^aの分類キメラ及び再構築抗体 EP-A-0,120,694号（Bossら／Celltech）はキメラ抗体のクローニング及び発現を発表している。これらの誘導体においては、一のイムノグロブリンに由来する可変性ドメインを別のイムノグロブリンに由来する定常ドメインに融合させている。通常、可変性ドメインは一の種、例えばマウス又はラットのイムノグロブリン遺伝子に由来し、そして定常ドメインは別の種、おそらくはヒトのイムノグロブリン遺伝子に由来する。この技術は現在当業界において非常によく知られている。その後のヨーロッパ特許出願EP-A-0,125,023号と米国特許第4,816,567号もB ossの特許出願と同じくらいの対象を述べているが、組換DNA工学を利用するその他のイムノグロブリンタイプ分子のバリエーションの製造を述べている。その他に考えられるのはモノクローナル抗体の可変領域のみを別の非イムノグロブリン分子に付加させ、誘導キメラ分子を製造することである（WO86／015333，Neuberger and Rabbits/Celltech参照）。更に考えられるのは、例えば本発明のモノクローナル抗体における種々の可変領域において種々の特異性を有するキメライムノグロブリンを製造することであろう（EP68 763A参照）。更に別に考えられるのは、モノクローナル抗体をコードするDNAにおいて突然変異を設け、その本質的な特異性を変えることなくその所定の特徴を改変することであろう。これは部位特異的突然変異誘発又はその他の当業界公知の技術により成し遂げられうる。 Winterの特許出願EP-A-0,239,400号は、イムノグロブリンの可変性領域の相補性決定領域(CDR)を、組換DNA技術により別の特異性のイムノグロブリンのCDRと変換することにより改変・誘導抗体を作成するのがどのようにすれば可能であるかを述べている（いわゆる「CDR−グラフティング」）。これは抗体の抗原結合特異性を改変する。（本ケースの場合、それはMT３，６Ｇ３，MB23G2、これらの抗CD45RB抗体と同じ結合特異性をもつ抗体、又はMT３，６Ｇ３もしくはMB23G2と交差反応性であり、別の抗体へと移転された抗体のCDRでありうる。）かくして、CDRグラフティングは、フレームワーク領域の改変と共に抗体の「ヒト化」を可能にする。ヒト抗体は天然免疫系を欠くマウスにおけるヒト免疫系を再構成することにより直接供与されることもでき、かくしてこのような「ヒト化マウス」においてヒト抗体が製造される。注目の抗原に対して特異的なげっ歯類抗体のCDRを含む「ヒト化」抗体はヒトの免疫系により外来物質として認識されにくいであろう。例えばMT３又は６Ｇ３と同じ結合特異性を有する「ヒト化抗体」又はいづれかと交差反応する抗体（以降参照）がヒト療法及び／又は診断方法において極めて有用でありうる。説明の通り、当業者は特定のニーズに合った誘導体を作製するために任意の所定の抗体又はそれをコードする遺伝子を操作及び改変できることをよく知っている。抗イディオタイプ抗体抗体、例えばMT３又は６Ｇ３の提供は当業者が結合性パートナー、例えばそれを結合する抗原／エピトープ又は抗体／パラトープを獲得することを可能にする。従って、本発明は本発明に供与される抗体又はその誘導体、例えばMT３及び６Ｇ３に結合する結合性パートナー、例えば抗原及び／又は抗体も提供する。 MT3mAb及び6G3mAbの利用により得られる結合性パートナーは更なるリガンド、例えばMT３又は６Ｇ３以外の抗体（又は抗体様結合性機能を有する分子、例えば抗体のフラグメント、誘導体及び合成類似体、例えば一本鎖抗原結合性分子）を作製するためにも利用できうる。従って、更に提供するのは、リガンド、例えば MT3mAb及び6G3mAbに結合することのできる結合性パートナーに結合することのできるmAbである。かかるリガンド（「交差反応性リガンド」）、例えばmAbは当該結合性パートナー上のMT3mAb及び6G3mAbにより認識されるのと同じエピトープを認識しうる。本発明は更に言及し且つ前述した１又は複数の組換DNA工学の技術を利用して製造することのできる前記交差反応性リガンドの誘導機能性均等物（例えば、抗体様結合特異性を有する分子）、及び当該交差反応性リガンドのフラグメントも提供する。更に、WO90／05144に記載の一本鎖ドメインリガンド(mAb)が含まれる。抗原の単離標準の技術を利用し、リガンド、例えば本発明の抗体及びその誘導体を結合性パートナー抗原の免疫精製のために利用することが可能である。イムノアフィニティーカラム精製のための技術は公知である。例えば「Current Protcolsin Imm unology」編J．E．Coliga nら、John Wiley and Sons，Unit 8.2参照。例えば、CD45RBmAbMB23G2により同定されるエピトープが白血球共通抗原遺伝子のＢエキソンによりコードされることが現在公知である。エピトープ及びこのエピトープに結合する化合物の単離が本発明により考慮される。事実、抗原自体を単離する必要なく、上記の通りにして交差反応性リガンドを単離するようにイムノアフィニティーカラムを利用することが可能であろう。第一ラウンドのイムノアフィニティー精製はリガンド、例えばMT３，６Ｇ３等のmA bを利用し、サンプルから抗原含有結合性パートナーを取り出し、それはリガンドの不均質集団からMT3mAb，6G3mAb等と交差反応性であり且つ同一の結合性パートナーを認識するリガンドを選別するためのカラムに利用されうる。リガンド、例えばMT３，６Ｇ３等のmAbを用いて単離された結合性パートナー、例えばペプチド又は小型結合性分子が、雑多な手段により作製された抗体のレパートリー又は不均質集団から交差反応性リガンドを選別するのに利用されうる。一の方法は標準のハイブリドーマ技術によりモノクローナル抗体及びそれを生産する細胞系を選別することにある。また、本発明は不死化細胞、例えば前記交差反応性リガンドを生産するハイブリドーマを提供する。リガンド、例えばMT3mAb又は6G3mAbと交差反応性であるリガンドを選別する別の方法はWO92／01047号（Cambridge Antibody Technology Limited and MRC/McC affertyら）に開示の特異的な結合性ベアーの構成員を作製するための方法を利用することにある。この公開物は分泌型複製可能遺伝子ディスプレーパッケージ（RGDP）、例えばバクテリオファージの成分に融合した特異的結合性ペアー構成員、例えば抗体の遺伝子的に多様な集団のポリペプチド鎖成分の発現を開示し、これにかかるパッケージはその表層上にポリペプチドを表示する。表示の抗体の非常に大型のレパートリーが作製され、そして注目の１又は複数の抗体をそれをコードするDNAと一緒に得るために抗原結合を介してスクリーニングする。RGDPの表層上に表示されたポリペプチドをコードするDNAはRGDP内に含まれ、それ故発現のために簡単に単離及びクローニングされうる。この抗体レパートリースクリーニングはむろんヒト起源に由来しうる。組換抗体明らかに、一旦不死化細胞系、例えばハイブリドーマ、又は結合リガンドの少なくともポリペプチド成分をコードするDNAを含むRGDPを獲得できたら、当業者は細胞により分泌されるリガンド、例えばmAbをコードする全ヌクレオチド配列を得ることができる（当業界において周知の技術に従う；例えばEPA449,769号参照）。従って、本発明は当該リガンド、例えば上記のmAbをコードする一次ヌクレオチド配列を、このような一次配列並びにかかる一次ヌクレオチド配列の誘導体、突然変異体及びハイブリダイズパートナーを含んで成る二次ヌクレオチド配列のフラグメントと一緒に包括もする。このようなヌクレオチド配列は標準の技術に従って発現生成物を作り出すための組換系において利用されうる。従って、本発明は前記ヌクレオチド配列を含むベクター（クローニング及び発現ベクター）、当該ベクターの組込まれた形質転換細胞、及び任意のかかるベクター又は形質転換細胞を利用して組換系を介して製造された発現生成物を含む。融合タンパク質の製造も考慮される。例えばStamenkovicら「The B Lymphocyt e Adhesion Molecule CD22 Interacts with Leukocyte Common Antigen CD45RO on T Cells and α2-6 Sialytransferase，CD75，on B Cells」CELL，Vol．66， pp．11-33-1144(1991)を参照のこと。本発明は更に、上記のヌクレオチド配列、ベクター又は形質転換細胞を利用することを含んで成る、リガンド、例えばmAb、誘導体、機能性均等物又はそれらのフラグメントを発現するための方法も含む。より詳しくは、ヒトCD45RB抗原に対して特異的であるMT３及び６Ｇ３はCD45RB を発現するヒト細胞におけるCD45RB上のエピトープに結合するであろう。このエピトープは例えばイムノアフィニティーカラム（前述）を利用して精製し得、そして例えばエドマン分解の反復ラウンドを利用して部分的又は完全に配列決定されうる。免疫抑制及び免疫寛容の誘導本発明の抗体及び薬理組成物は免疫調節、特に免疫抑制、例えば以下の処置において有用である：ａ）例えば心臓、肺、半島、骨髄、クロマフィン又はドーパミン生産細胞、併合心肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、小腸、血管組織移植片又は冠状移植片のヒト受容者の処置のための、器官、細胞又は組織同種又は異種移植拒絶反応の処置及び予防。それらは、例えば骨髄移植の後に時折り起こる対宿主移植病(GvH)の予防のために利用される。本発明の方法及び組成物は哺乳動物、例えばげっ歯類及び霊長類における器官移植の拒絶反応を回復及び予防もする。例えば、当該抗体はマウスが腎臓移植片を拒絶するのを防ぎ、そして長期生存を誘導する。ｂ）自己免疫疾患及び炎症症状、特に自己免疫成分を包括する病因の炎症症状、例えば関節炎(例えばリウマチ様関節炎、慢性移行性関節炎(arthritis chroni ca progrediente)及び慢性関節リウマチ(arthritis deformans))並びにリウマチ病の処置及び予防。本発明の方法が採用されうる特異的な自己免疫疾患には、自己免疫血液疾患（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろう及び特発性血小板減少症）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、水腫性硬化症、ウェーゲーナー肉芽腫症、皮膚筋炎、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、乾癖、スチーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫炎症腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン症）、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、一次胆汁性肝硬変、若年糖尿病（Ｉ型真性糖尿病）、（前部及び後部）ブドウ膜炎、角結膜炎、間隙性肺線維症、乾癖性関節炎、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群、例えば特発性ネフローゼ症候群又は最小変化ネフロパシーを伴う及び伴わない）、及び若年皮膚筋炎が挙げられる。ｃ）Ｔ−リンパ球の過剰増殖を特徴とする白血病、例えばウィルス誘導白血病、例えばHTLV−１誘導白血病及び急性リンパ球白血病の処置。用量及び剤型本発明は異種移植を受けた患者に対する投与のためのCD45に結合することのできる１又は複数の化合物を含むキットを提供する。このキットは適当な薬理製剤において、例えば単値投与形態において当該化合物を、現存の抗体により誘導される拒絶反応を抑制するのに利用される１又は複数種の薬剤と一緒に含みうる。かかる薬剤はシクロホスホナミド、デオキシスペルグアリン等を含みうる。当該化合物の適当な用量はむろん、例えば処置する症状（例えば、病気のタイプ又は耐性の性質）、所望の効果、及び投与の態様に依存して変わるであろう。ヒトにおいて有効な用量は当業界において公知の方法、即ち、米国特許第5,035, 878号の方法によりマウス及びその他の哺乳動物において有効な用量から誘導できうる。しかしながら、一般に満足たる結果は、例えばi.v．ドリップ又は点滴により、0.01〜2.5から５mg／kg程度、例えば0.05又は0.1から1.0mg／kg程度の用量での非経腸式、例えば静脈内式投与で得られる。ヒト患者にとって適当な用量はかくして0.5〜125から250mg i.v．程度、例えば2.5〜50mg i.v．程度である。当該化合物は毎日又は１日置き、又はより少ない頻度で、抗原負荷の際、例えば器官移植の後又は自己免疫疾患の急性段階にて血液中の化合物の最低限レベルを保つように用量を減少させて投与してよい。本発明の薬理組成物は慣用の方式で製造できうる。本発明に係る組成物は凍結乾燥形態で供与するのが好ましい。緊急投与のためにそれを適当な水性担体、例えば注射用無菌水又は無菌緩衝生理食塩水の中に溶解させる。ボーラス注射よりも点滴による投与のために大容量の溶液を作ることが所望されると考えられるなら、処方時に食塩水の中にヒト血清アルブミン又は患者自身のヘパリン処理済血液を含ませることが好都合である。かかる生理不活性タンパク質の過剰な存在は点滴溶液と一緒に用いる容器及びチューブの壁に対する吸着による抗体の損失を防ぐ。アルブミンを使用するなら、適当な濃度は食塩溶液の重量の0.5〜4.50％である。臨床試験において、例えば患者が腎臓、肝臓又は心臓移植を受けようとする患者を予防治療のために選別する。移植の日、手術の２時間前に、当該化合物、抗体又はそれらの混合物の第一回目の静脈内点滴を体重１kg当り0.2mgづつの化合物又は抗体の用量において投与する。手術の２日後、0.4mg／体重１kgでの当該化合物及び／又は抗体の同じ点滴を投与し、そして１ヶ月にわたり毎週繰り返す。静脈内点滴物は下記の通りに調製する：凍結乾燥化合物及び／又は抗体を一緒に混合し、そして4.51重量％のヒトアルブミンを含む100mlの無菌緩衝食塩水に分散させる。この食塩水分散物を患者に30分かけて投与する。本発明の化合物は特定の白血球サブ集団を特定するための診断助剤、診断試薬又は診断キット成分としても有用である。これらの化合物は慣用の技術を利用してラベル化例えばフルオロラベル化、又はラジオラベル化してよい。例えば、0. 25mlの0.12Ｍのリン酸ナトリウムpH6.8中の25マイクログラムのモノクローナル抗体を2mCi¹²⁵Ｉ及び10マイクログラムのクロラミンＴを用いてヨウ素化する。 23℃で５分後、反応を20マイクログラムのメタ亜硫酸水素ナトリウム、３mgのKI 及び１mgのBSAの添加により停止させる。ヨウ素化タンパク質をクロマトグラフィーで分離させる。ラベル化化合物を例えば移植拒絶反応、又は白血球の浸潤を示す自己免疫疾患の徴候を示す患者由来の凍結組織切片、に曝露する。過剰の化合物を洗い流し、そして結合した化合物をアッセイする。組織切片に存在する白血球に対する当該化合物の大量の結合は関与する白血球の大半が記憶白血球であるよりはナイーブ白血球であることを示唆し、それ故Ｔ細胞媒介免疫反応に主に作用する当該化合物及び／又は免疫抑制剤、例えばシクロスポリン又はFK−506 による治療が適切であることを示す。最後に、当該化合物はCD45RBの生物活性を調節できる薬剤の同定のためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。アジュバント薬抗CD45 CD45RB化合物は単独で、又は標準の免疫抑制剤又は抗炎症剤と一緒に付与してよいものとも考えられる。これらにはシクロスポリン、FK−506、レフルノミド、ラパマイシン、シクロホスファミド、マイコフェノレートモフェチル、デオキシスペルグアリン、コルチコステロイド、抗リンパ球グロブリン等、及びその他が挙げられる。本発明の化合物及び／又は抗体の利用はかかる薬剤のための用量条件を緩和し、それ故所望されない副作用を軽減するものと予想される。当該化合物は特定のリンパ球サブ集団を特異的に認識するその他のモノクローナル抗体又はその他の化合物、例えばCD25mAb，CTLA4-Ig融合ぺプチド等と組合せて用いてもよい。受容体のリンパ球のex vivoコンディショニングあるケースにおいては、免疫抑制及び／又は寛容は本発明において有用な抗CD 45R抗体によりin vivo又はex vivoコンディショニングした受容体に由来する一定量のリンパ球を投与することにより高めることができうる。このコンディショニングされた又はアネルギー化されたリンパ球は、受容体における免疫寛容を誘導する量又は誘導を補助するのに有効な量で、移植及び／又は抗CD45R抗体の投与の前、同時又は後に付与してもよい。これらのリンパ球を移植又はその他の処置の前に受容体から獲得し、本発明の方法において採用する抗体に対する曝露によりプレコンディショニングし、そしてドナー材料上の抗原に曝露し、しかる後に受容体に再導入する。実施例１：CD45RBに対するマウスモノクローナル抗体ヒトCD45RBに対するマウスモノクローナル抗体は慣用の技術、本質的にはKohl er and Milstein Nature 256：49に記載の技術を利用することにより製造する。雌のBALB/Cマウス（20〜25g）それぞれにヒトCD45RBを含む抗原100μｇ、例えばホッジキン(Hodgkin)細胞系DEV(公共的に入手可能)をi.p.注射により与える（他方、この抗原はヒトCD45RBを発現するように形質転換されたマウス細胞を含んで成りうる）。２週間後、50μｇの抗原を含んで成る第二ブースター注射物をここでもi.p.注射により投与する。動物の血清中の抗原に対して反応性である抗体の存在は免疫組織学的スクリーニングにより確認する。CD45RB抗体の最大血清レベルを示すマウスに20μｇの抗原を含む更なるブースター注射を与える。４日後、それらを殺し、その脾臓細胞を単離し、そして適当なミエローマ系、例えばミエローマX63（公共的に入手可能）と融合させる。得られるハイブリドーマを培養し、そしてCD45RBに対して高親和力を有する抗体の発現について選別する。ヒトCD45RBに対するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ系は MT３ハイブリドーマ系であり、それはブダペスト条約のもとで1993年３月29日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）12301 Park Drive，Ro ckville，Maryland 20852/U.S.AにATCC番号HB11312として寄託してある。第二ハイブリドーマ細胞系はマウスCD45RBに対するラットモノクローナル抗体を産生するHB220である（今はMB23G2と命名）。この細胞系はATCCに寄託してあり、そしてATCCから購入することにより入手できる。第三のハイブリドーマ細胞系（ATCCにHB-11873として寄託）は本発明の抗体を生産する（6G3mAb）。このハイブリドーマ細胞系はミエローマ細胞系SP２／０と、ヒト巨大細胞Ｂ細胞非ホッジキンリンパ腫細胞系VERで免疫したマウス由来の脾臓細胞との融合により製造されたものである。得られるクローンをヒト扁桃及びアカゲザル脾臓の凍結組織切片に対するイムノペルオキシダーゼ手順によりスクリーニングした。クローン６Ｇ３を、双方の組織におけるＴ及びＢリンパ球のサブセットとの6G3mAbの高い反応性を理由に選別した。６Ｇ３の抗体反応性は、ヒトCD45RB発現トランスフェクタントとのその選択的反応性及び220，204及び19 0kDの分子量を有する３本のバンドとしての６Ｇ３により免疫沈澱した抗原の分子量の特徴により抗CD45RBと特性決定された。この抗体の反応性はニューラミンダーゼによる組織、細胞又はブロットの予備処理により消失し得、抗原のシアル酸依存性を示唆する。第四のハイブリドーマ細胞系HB223はMB23G2に対する類似のモノクローナル抗体を生産する。これも寄託されており、そしてATCCを介して入手できる。実施例２：CD45RBに対するキメラモノクローナル抗体ａ）重鎖の可変性ドメインをコードする遺伝子のクローニング所望のハイブリドーマのゲノムDNA（本実施例においては実施例１のMT３又は６Ｇ３ハイブリドーマ）及びハイブリドーマ（ミエローマＸ63又はSP２／０）の親ミエローマ細胞系のゲノムDNAを単離し、そしてEcoRIで消化する。消化したDN Aそれぞれを同一のアガロースゲルで分画する。泳動後、アガロースゲルをサザンブロットにより、マウス重鎖エンハンサーＥμ(Heinrichら、J．OF IMMUNOL．（1989）143:3589)をコードする³²Ｐラベル化0.7kb XbaI-EcoRI DNAフラグメントをプローブとして用いて分析し、所望の可変性重鎖フラグメントを同定する。即ち、所望のフラグメントはMT３及び６Ｇ３ハイブリドーマの中にあり、Ｘ63又はSP２／０ミエローマにはない。このフラグメントの更なる精製を調製アガロースゲル電気泳動により実施する。所望のフラグメントと同じサイズのDNAフラグメントをバクテリオファージZAP (Stratagene)のEcoRI制限部位の中にクローニングする。上記のプローブを用い、組換ファージをスクリーニングし、そしてこのプローブにハイブリダイズするクローンを選別する。選別したクローンのDNAインサートをファージプレートリゼント上でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、第一プライマーとしてのマウスＪ_z遺伝子をコードする第一オリゴヌクレオチド並びにMT３又は６Ｇ３重鎖の開始をコードする第二オリゴヌクレオチドを用いて増幅させる。選別したクローンそれぞれから得られるDNAフラグメントをサザンブロットにより、上記のＥμプローブの一部をコードするオリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより分析する。ｂ）キメラ重鎖遺伝子の構築 EcoRIフラグメント（（プロモーター及びエンハンサーを含む）MT３又は６Ｇ３重鎖可変ドメインの遺伝子を含んで成る）を、工程ａ）において選別したファージクローンの一つのDNAの消化により獲得し、真核発現ベクターpSV2ネオーヒトγ₁定常部（Heinrichら、前掲）のEcoRI制限部位の中にクローニングする。得られるプラスミドの増殖後、MT３又は６Ｇ３重鎖可変ドメインをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を再決定し、この遺伝子において突然変異が生じた可能性を排除する。ｃ）軽鎖の可変性ドメインをコードする遺伝子のクローニング MT３又は６Ｇ３ハイブリドーマのゲノムDNA及び親細胞系X63又はSP２／０のゲノムDNAを単離し、そしてEcoRIで消化する。消化したDNAのそれぞれを同じアガロースゲルで分画する。泳動後、このアガロースゲルをサザンブロットにより、プローブとしての５本のマウスＪ_K遺伝子及びマウスＣ_K遺伝子を含んで成る³²Ｐ −ラベル化DNAフラグメントを用いて分析する。所望のMT３又は６Ｇ３軽鎖可変性ドメインとサイズで対応するサイズ分画化EcoRIフラグメントをファージEMBL ４（Stratagene）の中にクローニングする。 MT３又は６Ｇ３軽鎖をコードするDNAフラグメントを含むクローンを前述のプローブによる組換ファージクローンのスクリーニングにより同定する。次いで所望のDNAフラグメントをpGEM４(Promega)のEcoRI-XbaI部位にサブクローニングし、そしてその配列を決定する。ｄ）キメラ軽鎖遺伝子の構築マウス重鎖エンハンサー（Heinrichら、前掲）をコードする配列を含むXbaI-X baIフラグメント及びヒトκ定常部（huＣ_K）の配列を含むHindIII−SphI DNAフラグメントをファージmp18（Stratagene）の中に一緒にクローニングする。部位特異的突然変異誘発を得られる組換ファージに対して実施して所望のコード領域中のHindIII部位を破壊し、次いでEcoRI及びHindII Iにより消化し、Ｅμ及びhuＣ_Kの双方の配列を含むDNAフラグメントを作製する。このフラグメントの末端をフィル・インした後、このフラグメントをpSV2-DHF Rのブラント末端化EcoRI-BamHI部位にサブクローニングし、pSV2-DHFR-Ｅμ−hu Ｃ_Kを作製する。プラスミドpSV2-DHFRはジヒドロフォレートリダクターゼ遺伝子をコードするBamHI-HindIIIフラグメントによりpSV2−ネオのBamHI-HindIIIフラグメントを置き換えることにより得られる。最後に、MT３又は６Ｇ３軽鎖配列を含むEcoRI-XbaI DNAフラグメントを段階３の組換pGEm４プスミドから単離し、そしてpSV2-DHFR-Ｅμ−huＣ_Kにサブクローニングし、pSV2-DHFR-Ｅμ−huＣ_K−MT３_L又はpSV2-DHFR-Ｅμ−huＣ_K-6G3_Lを作製する。ｅ）キメラ抗体の発現工程ｂ）及びｄ）で得られたプラスミドをBiorad社の遺伝子パルサー装置を用いるエレクトロポレーションによりマウスミエローマ細胞系SP２／０(ATCC CRL 1581)の中に同時トランスフェクションする。この技術は安定なトランスフェクタントを高頻度で構築することで知られる。SP２／０細胞系は内因性重鎖及び軽鎖を生成せず、そしてGeneticin(G418)に0.8mg／Ｌの濃度で感受性である。 SP２／０細胞を通常の増殖培地（RPMI+10％のFCS,５×10^-5のβメルカプエタノール）の中で増殖させ、対数増殖期において回収し、そしてエレクトロポレーションバッファー(Bio-Rad)で洗浄する。0.8mlの細胞懸濁物に15〜20μｇづつのプラスミドを添加する。この混合物を氷の上に載せ、そして10min放置する。次いで細胞を電気パルス(280ボルト；25°Ｆ)にかけ、そして再び15min放置する。細胞を通常の増殖培地に移し、そしてCO₂インキュベーターの中で37℃でインキュベーションする。３日間のインキュベーション後、Ｇ418耐性についての選別を開始する。細胞を1.4mg／mlのＧ418を含む新鮮培地の中に再懸濁する。これらの培養物をＧ418 の存在下で10〜14日間インキュベーションした後、増殖中の細胞を供する。２週間のインキュベーション後、集密培養物の上清液をサンドイッチ型ELISA(抗ヒト κ−軽鎖／上清液／抗ヒトIgG−アルカリホスファターゼコンジュゲート)においてヒトIgG発現について試験する。この試験は完全な抗体分子が50〜500ng／mlの範囲において濃度を変動させた全ての培養物において分泌されることを示唆する。 DHFR遺伝子が増幅し、それ故大量の所望の抗体を分泌する細胞を選別するため、メトトレキセート(MTX)耐性についての２通りの選別手順を下記の通りに実施する。この目的のため、Ｇ418耐性プールをそれぞれ分割し、そして手順Ａ(MTX を２又は2.5倍増大)又は手順Ｂ(MTXを５倍増大)のいづれかに従って増幅を実施する（表II）。表 II 各増幅工程は細胞を２×10⁵細胞／mlの密度においてＧ418が1.4mg／ml、そしてMTXが選定の濃度で添加された通常の増殖培地に播種することを含んで成る。7 2時間のインキュベーション後、細胞及び上清液を分離する。抗体分泌はELISAにより又はプロテインＡカラムを用いるHPLCによりモニターする。ほとんどのプールが一定のMTX濃度で最大の特異的抗体産生に達する。最大の産生プールを限界希釈によりクローニングする。数百の分析クローンのうち、15の最良の産生クローンが選別される。クローンの生産性は72時間で30〜50mg mAb／10⁹細胞に凝固する。この抗体をプロテインＡアフィニティーカラムでの溶出により培養上清液から精製する。実施例３：マウスにおける腎臓移植の拒絶反応のin vivo予防本実験において、右側腎摘出を、同種移植（別のマウス系由来の腎臓移植）と同時に18匹のマウスに対して実施した。対側腎摘出を術後７日目(POD７)に実施し、その時点から、動物が同種移植腎臓を頼りとするようにした。９匹のマウスを最初の２日間(POD０及びPOD１)細胞系HB220及びHB2 23から生成されたラット抗マウスCD45RBモノクローナル抗体の混合物50μｇで処理し、次いで９日間(POD２〜POD10)にわたり100μｇづつの抗体で腹腔内（i.p. ）処理した。抗CD45RB抗体を受理していない９匹のコントロール動物のうち７匹が第二腎臓を取り出してから３日後に死亡し、そして残り２匹は１週間後に重篤な拒絶反応を示した。抗CD45RB抗体で処理した９匹の動物のうち、３匹が任意の免疫応答とは無関係な手術的合併症により死亡したが、めざましいことに、残り６匹の動物は更なる処置なく、且つ同種移植拒絶反応の徴候を全く示さずに長期間生存した（例えば 100日超）。10匹の未処理同系移植受容体の第三のグループにおいて、手術的合併症に基づく死亡の発生は同じであった。モノクローナル抗体を受理した同種移植グループと同系移植グループとの間での血清クレアチニンレベルに有意差はなく、双方のグループにおける腎臓が正常に機能することを示唆する。実施例４：マウスにおける腎臓移植の拒絶反応の回復未実験においては、右側腎摘出を、10匹のマウスに対し、同種移植（別のマウス系からの腎臓移植）の実施と同時に実施した。 10匹の動物全てを免疫抑制療法なしで５日間観察した。これらの動物はこの段階で重篤な拒絶反応を冒っていることがわかり、なぜなら腎摘出及び同種移植腎臓移植にかけて犠牲にしたコントロール動物が５日目の重篤な拒絶反応を示していたからである。 POD５にて、４匹の動物に毎日25μｇの用量の抗CD45RB抗体（細胞系HB220（抗 CD45RB MB23G2mAb）及びHB223(抗CD45RB MB4B4mAb)由来のモノクローナル抗体の混合物）をそれから３日間にわたり腹腔内式に与えた。４匹の動物全てが、正常なレベルのクレアチニンへの復帰を含むその拒絶反応徴候の急速回復を示し、そして100日超生存した。未処理の動物は器官拒絶反応により９日目に死亡した。表IIIはこの実験の結果をまとめる。表 III マウスにおける腎臓移植の拒絶反応の復帰回復に関するこのデータは本抗体療法が免疫応答を抑制するうえで極めて有効であることを明白に確証する。処置及び治療は抗体療法により成し遂げられる。実施例５：マウスにおける腎臓移植とは別のMB23G2及びMB4B4を利用する結果の確認受容Balb/C（h-2d）マウスは、ドナーC57B1(h-2b)マウス由来の移植腎臓を受理する前に右側腎臓を除去されている。左側の自然腎摘出をその後７日目に実施した。４グループの動物とした。13匹は同系移植を受け、17匹は免疫抑制なしで同種移植を受け（ビヒクルコントロール）、44匹は同種移植を受け且つ０日目及び１日目に精製ラット抗− マウスCD45RBmAb MB23G2 １mg／kg（30μｇ）の投与を２回静脈内式に受け、そして16匹は同種移植を受けたが０及び１日目に精製ラット抗マウスCD45RBmAb MB 4B4 １mg／kg（30μｇ）の投与を２回静脈内式に受けた。更なる抗体は与えなかった。予想通り、MB23G2処置動物は未処置グループと比べて長い生存率を示し（ｐ＜ 0.002）(図１参照)、そして同系移植グループと匹敵した。驚くべきことに、抗C D45RB MB4B4mAbは拒絶反応の予防においてビヒクル単独よりも良くなかった。双方のmAbはFACSによるアッセイに従いBalb/C白血球に結合した。しかしながら、M B23G2結合はニューラミニダーゼにより阻害され、MB4B4の結合はかかる処理により影響されなかった。図２は犠牲時点、又は長期生存動物の100日超えた日での各グループに由来する動物の血清クレアチニンレベルを示す。同系移植及びMB23 G2処理グループとの間では差はなく、未処理及びMB4B4処理グループは尿毒症により死亡した。従って、MB23G2についてのグリコシル化エピトープはCD45RBの生化学活性に関与する部位に含まれる、又はその付近にある。MB4B4についての非グリコシル化エピトープはCD45RB活性にとって重要でないようである。イムノペルオキシダーゼ顕微鏡観察研究を３つのグループのマウスにおいて腎臓同種移植の７日目に実施した：未処理、MB4B4処理及びMB23G2処理。切片をマウスCD３，CD４，CD８，CD45RB及びIaと反応性のラット抗マウスmAbで染色した。スライドをIbrahimら、TRANSPLANTATION Vol.59，pp.724-728に記載の通りにして凝集物及び拡散浸潤物についてマスキングして評価した。拡散浸潤物中の細胞数をグループ当り５匹のマウスの各切片における10箇所の(Ｘ400)強力領域(HP F)で数え、そしてそのデーターを以下の表IVに示す。表 IV ７日目の腎臓同種移植における拡散細胞浸潤（MEDIANS/HPF）興味深いことに、３グループのマウス間での差は凝集物及び拡散浸潤物中の細胞を別々に計測した後に明白となった。Iaについての染色は他のグループと比べ MB23G2処理同種移植において明らかに弱く、しかしその他の間隙細胞タイプの陽性染色により、リンパ球の数は定量できるほどに信頼できないものであった。その凝集物は３つのグループ全てにおいて多量のCD４+及びCD８+細胞を含んだ。拡散浸潤物中のCD４+及びCD45RB+細胞の数は３つのグループ全てにおいてほぼ均等であったが（表III、第二及び第四列）、拡散浸潤物中のCD３+細胞及びCD８+細胞の数はMB23G2処理グループと他のグループとの間で有意差があった（表III、第一及び第三列）。かくして、MB23G2処理動物はMB4B4処理及び未処理動物と比べて高まったCD４：CD８比を示した。驚くべきことに、わずかな浸潤細胞がCD45 RB陽性であり、CD45RB mAb MB23G2が急性拒絶反応を回復できうることに関する極めて注目すべき発見である。実施例６：免疫寛容抗原特異的寛容の可能性を評価するため、腎臓同種移植時にMB2 3G2mAbの２回の投与を受けた後に100日を超えて腎臓移植を維持した実施例５由来の動物13匹に皮膚移植を施した。各動物にC57B1/6マウス（腎臓同種移植のドナーと同系）及びコントロール皮膚移植に由来する完全な厚みの皮膚同種移植を施した：９匹はBalb/C同系移植を受け、そして４匹はCBA同種移植を受けた（第三ドナー）。更なる免疫抑制は施さなかった。腎臓特異的寛容を有する13匹の動物のうち、C57B1/6皮膚を拒絶しなかったことを理由にドナー同種抗原特異的寛容を示す４匹のサブセットがあった。４匹の動物は全て第三CBA皮膚を拒絶し、一方９匹のBalb/C同系移植体は全てずっと生き続けた。腎臓同種移植拒絶反応は皮膚移植により刺激されなかった。実施例７：同種移植拒絶反応の回復 MB23G2mAbが急性拒絶反応を回復できうるかを決定するため、７回の同種移植を実施例５に記載の通りに実施したが、免疫療剤は４日目まで投与しなかった。未処理の同種移植腎臓はこの時点で拒絶反応を示した。処理動物にMG23G2を4.5 及び６日目に毎日1.5mg／kg（50μｇ）のi.v.で与え、そしてその後の治療は施さなかった。MG23G2処理グループの３匹の動物が尿毒合併症で死亡した。移植組織学は８，９及び25日目での死亡時に拒絶反応を示さなかった。動物は全て拒絶反応が回復し、そして残り４匹は正常な血清クレアチニンで＞60日生存した。実施例８：血液組成に対するMB23G2の効果マウスにおける末梢血液に対するMB23G2の薬理効果を多重パラメーターFACS分析を利用して評価した。マウスを２日連続30μｇのMB23G2mAb静脈内処理した。図３Ａに示す通り、MB23G2は循環リンパ球の有意な枯渇を誘導し、それはmAbを止めてから１週間して正常にもどった。MB23G2は残留循環Ｔ及びＢリンパ球のほぼ全てに結合した（図３Ｂ及び３Ｃ）。FACS分析は８日目まで血漿中の過剰MB23G2抗体を示さなかった。脾臓のFACS分析は投与した療剤がMB23G2の２回目の投与の24時間後にリンパ組織に侵入したことを示した。FACS阻害アッセイは治療の２週間後までMB 23G2に対するどのマウスの感作も示さなかった。 CD45はタンパク質チロシンホスファターゼであるため、MB23G2mAbによる同種移植寛容の誘導が、シグナル変換が生ずるのに必要なＴ細胞基質のチロシンリン酸化における変化に関係するかを示す試験をデザインした。実施例９：CD45RBモノクローナル抗体による寛容誘導のメカニズム：ホスホリパーゼＣ−γ１のチロシンリン酸化の増強及び炎症性サイトカインの発現の減少マウスＴ細胞ハイブリドーマＡ 1.1細胞をMB23G2又はMB4B4mAbの有無でCD3mAb 2C11で刺激した。これらの細胞をBrij 96の中で溶解し、そしてホスホチロシン含有タンパク質を抗ホスホチロシンmAbPY72で免疫沈澱させた。この免疫沈澱したタンパク質を抽出し、そして10％のSDS−ポリアクリルアミドゲルで分け、PVD F膜に電気泳動式に転写し、そして抗ホスホチロシンmAb4G10を利用するイムノブロッティング手順にかけた(Lazarovitsら、J ．Immunol.，153，3956(1994))。 CD45RB MB23G2の存在下での145kDへの基質のチロシンリン酸化の増強が認められた。MB4B4mAbはこの基質のチロシンリン酸化を改変しなかった。PLC−γ１としてのこの145kDのバンドの同定を、4G10mAbをこのブロットから引き抜き、そしてホスホリパーゼＣ−γ１(PLC−γ１)(Upstate Biotech，Lake Placid，NY) に対するモノクローナル抗体の再プロービングにより確認した。かくして、MB23 G23の存在下で、実質的により多くのチロシンリン酸化PLC−γ １がその非存在よりも同定でき、一方MB4B4は免疫沈澱しうる量でPLC−γ１を改変しなかった。PLC−γ１の増強したチロシンリン酸化はGajeuskiら(PROC．NATL ．ACAD．SCI．USA，Vol.91，pp.38-42(1994))によりアネルギーＴ細胞の性質であると認識されている。遺伝子の活性化はＴ細胞におけるシグナル変換の結果であるため、MB23G2mAb が同種移植の拒絶反応を強めることで知られているサイトカイン遺伝子のin viv o発現を改変するかを調べる実験を実施した。いわゆるTH１サイトカインプロフィール（IL−２，γ−インターフェロン）は拒絶反応に関与し、一方TH２表現型（IL−４，IL−５，IL−６及びIL−10、は非応答性に関与しうるものと一般に信じられている（T．R．Mosmann，ら、J ．Immunol.，136，2348（1986）参照）。マウス腎臓同種移植における遺伝子発現を調べるため、定常レベルの特異的mR NAを³²Ｐ−ラベル化cDNAプローブを用いるノーザンブロット分析により評価した。４つのグループの動物における遺伝子発現を調べた：術後７日目での同系移植、術後７日目での未処理動物由来の同種移植、並びに術後７日及び28日目でのMB 23G2処理動物由来の同種移植。IL−１，IL−２，IL−４，IL−５，IL−６又はIL −10の特異的なパターンは検出されなかった。しかしながら、未処理同種移植と比べ、γ−インターフェロン及び腫瘍壊死因子αについてのmRNA転写物の28日目での選択的な減少があった。７日目では相違は認められなかった。興味深いことに、細胞内接着分子−１（ICAM）mRNAも、７日目では差は観察されなかったが、 28日目にMB23G2処理動物において減少した。かくして、MB23G2療法はシグナル変換カスケードの妨害を理由に炎症性サイトカインの発現をある程度阻害することによって寛容を誘導しうる。更にその他の実験において、抗CD45RB抗体の利用は霊長類に投与したときに有効であることがわかった。実施例10：霊長類における器官拒絶反応の予防及び器官拒絶反応の回復腎臓同種移植を２匹のサイノモルガスザルに対し、免疫抑制剤としてCD45RBモノクローナル抗体（これはニューラミンダーゼ感受性エビトープに結合する）を用いて実施した。詳細は下記の通りである：詳細な実験手順：１．動物の取扱い：動物はウェスタン・オンタリオ大学霊長類施設の中で飼育した。それらを、動物に麻酔をかける必要がなく、それ故ストレスを軽減するよう薬剤注射及びサンプル集収を可能にするスクイーズケージに入れた。それらに標準のサル用飼料及び分類のためのその他の食事を与えた。それらは運動ケージの中で規則的に運動させた。動物の取扱いは獣医サービスにより提供された非ヒト霊長類のための標準の作業手順に従った。動物を血液グループに分類した。到着したら、それらの動物を少なくとも２週間休息させた。動物を経口Ｂウィルス検査、TB検査を含む身体検査のためにアトロピン及びケタミンで麻酔し、そしてIvernectin 2828で蠕虫駆除した。動物は麻酔の前夜は絶食させた。２．腎臓移植１．ドナーの処置：２匹のドナー動物にケタミンを注射し、ORを与え、挿管を施し、そしてインソフルオラン／酸化窒素に付した。３段階手術処置を利用した。２匹の中央線分切開の後、左腎動脈、静脈及び尿管を慎重に取り出し、そして分割した。移植片を in vivo灌流に処し、そして４℃のウィスコンシン大学溶液の中に保存した。その創傷を閉じ、そして動物をケージにもどし、麻酔から回復させた。200〜300mlの食塩水を手術中連続i.v. 付与した。手術中、動物を加熱ランプ、加熱食塩水及び加熱パッド等を用いて保温した。術後の介護は標準の作業手順に従った。簡単には、動物を温水ブランケット上、且つ加熱ランプ下に24時間保った。ジプレノルフィンを手術の24時間後に与えた。動物を毎日監視した。十分に回復したドナー動物をその後の移植における受容体として利用した。２回の手術の間の期間は２週間以上とした。２．受容体の処置：受容体を麻酔し、そしてドナーについて前述した通りに術前準備を施した。中央線分切開の後、腹部大動脈及び下大静脈を露出させた。端・側吻負をドナーの腎大動脈と受容体の大動脈との間、及びドナーの腎静脈と受容体の下大静脈との間で実施した。ドナーの尿管を受容体の膀胱に縫合した。右側の腎臓を取り出し、そして傷口を閉じた。３．術後の取扱い：手術後の取扱いはドナーについて上記したものと同じである。動物を術後少なくとも24時間、必要ならもっと長く連続監視した。それらは食事を取り、そして通常通りに毛づくろいするまで密接に監視した（即ち、１日数回）。その後、それらを少なくとも毎日、それらがモノクローナル抗体を受容するまで監視した。動物に４mgの抗CD45RB 6G3mAb4を７日間毎日i.v.で与えた。腎臓移植の結果を毎週の経皮生検及び週２回の血液クレアチニンレベルにより測定した。これらの手順のため、動物をケタミンで麻酔した。早期安楽死の基準には嗜眼、毛づくろい又は食事摂取の喪失、有意な体重減少（＞20％）及び腎不全（高いクレアチニンレベル）が挙げられる。前述の通り、受容動物に４mg（１mg／kg）の抗CD45RB 6G3mAbを術後７日間与えた。かかる点滴に関連する副作用は認められなかった。双方の動物はそれぞれが急性拒絶反応危機を迎える16日まで正常に生き続けた。第２動物は４mg／kg（ 16mg）の抗CD45RB 6G3mAbで再処置した。この療剤は４日間毎日i.v.で与えた。驚くべきことに、拒絶反応危機は、動物が正常に活動し、そしてクレアチニンレベルが738μmol／Ｌの「危険」レベルから366μmol／Ｌにまで低下することが観察されたことにより、完全回復した。動物は次の拒絶反応危機が生ずる36日まで良好であり続いた。そして動物を安楽死させた。同種移植の組織学は、回復へと導く次の療剤の投与の直前の術後15日目に強い内皮炎を示した。この動物の同種移植生検を術後25日目に実施し、内皮炎が治療していることを示した。コントロール動物はこのタイプのモデルにおいて療剤を投与しないと10日で死亡するであろうことがわかっている(Lazarovitsら、Kidney Inter.，25，344(19 84))。このデーターは二通りの結論を示唆する。〔１〕双方のサルがコントロール既知の日を超えて生存したため、本発明の療剤は霊長類における有意義な移植−生存を示す。〔２〕より劇的なのは抗CD45RBモノクローナル抗体による急性拒絶反応を回復できるという観察である。実施例11：追加のサル実験更に２匹のサイノモルガスザル（＃３及び＃４）に腎臓移植を施し、そして単に免疫抑制の形態でのCD45RBモノクローナル抗体６Ｇ３で処置した。血液分類を実施してABO適合性をコントロールし、そして主要組織適合性複合体プロフィールをPCRベースDNA分類を利用して獲得し、同種腎臓移植が実行されたかを確認した。０日目に、腎摘出を受容動物において施し、そして腎臓同種移植を実施した。７日目、第二の自然腎臓を取り出し、そしてその時点からその動物はその移植腎臓を頼りとするようになった。免疫抑制を受けていない動物又は無効な免疫抑制を受けた動物は平均して10±２日目に拒絶するであろう(LazarovitsらKidney In term .，25，344(1984))。サル＃３この動物は６Ｇ３抗体２mg／kg／日（８mg）で７日間、そして更に次の２週間にわたり月、水、金曜日に更に６回の投与を施すことで処置した。従って、３週間にわたり８mgの６Ｇ３抗体が計画された。この動物は14日目に拒絶を示し、そして安楽死させた。サル＃４この動物にはサル＃３と同じ療剤を与えた。即ち、８mgの６Ｇ３抗体を３週間にわたり13回の投与で静脈内付与した。この動物は著しく健康であり、70日超生存し続けた。拒絶反応は診断されなかった。かくして、６Ｇ３で処置した動物＃３及び＃４は有意に延長した同種移植を有し、それを図４に示す。実施例８のサル＃２が特に関心がもたれ、なぜなら抗体は、マウス腎臓移植実験により予定される急性拒絶反応を有効に回復させたからである。更なる実験を、サル１及び３（たとえ双方の動物が有意に延長した同種移植生存を有していたとしても）における比較的早期の移植不全の原因を決定するために試みた。実施例12：マウスにおける心臓移植の拒絶反応のin vivo予防 BALB/CドナーのC57B1/6マウス由来の異所性心臓移植をR．L．Kirkmanら(1985) Transplantation 40:719-722に本質的に記載の通りにして実施した。７匹のマウスに心臓移植して０及び１日目に30 μｇのラット抗マウスCD45RBmAb MB23G2をi.v.で与えた。他の４匹のマウスには心臓移植して２〜11日目に毎日０び１日目に30μｇのラット抗マウスCD45RBmAb MB23G2、そして２〜11日目に毎日それを100μｇ i.v．で与えた。14匹のコントロールマウスには抗体を与えなかった。異所性移植の生存を心臓が拍動しているかにより決定し、そして拒絶反応は組織学的分析により確認した。コントロールマウスは全て術後14日までにその心臓を拒絶し、平均生存期間は９日であった。２日間にわたり抗体を受容したグループにおける心臓の平均生存期間はわずか20日であり、そして11日間抗体を受容したグループにおける心臓の平均生存期間は34日であった。表Ｖはこの実験由来の結果をまとめる。表Ｖマウス心臓同種移植抗CD45RBの有用性の更なる徴候を下記の研究において実証した。実施例13：マウスにおける膵臓半島同種移植の拒絶反応のin vivo予防膵臓半島同種移植をCBA／Ｊドナー由来の腎腔（Kidney capsule）の下において、M．C．Fabianら、Transplantation，56，1137(1 993)に本質的に記載の通りにしてストレプトゾトシン処理BALB/C受容体に移植した。５匹のコントロールマウスには抗体は与えず、一方11匹のマウスには術後０〜１日目に30μｇのラット抗マウスCD45RBmAb MB23G2をi.v.で与えた。拒絶反応は糖尿の開始と規定する。コントロールマウス由来の全ての半島同種移植が17日の平均拒絶期間をもって24日目までに拒絶された。抗体処理マウスは34日の平均拒絶期間を示し、２匹のマウスは50日目でも拒絶反応の徴候を示さず、実験を終了させた。表VIはこの実験由来の結果をまとめる。表 IV マウス膵臓半島同種移植実施例14：ラットからマウスに至る移植モデルにおける異種移植寛容の誘導抗CD45RBモノクローナル抗体が異種腎臓移植拒絶反応を予防できるかを評価するため、正常位腎臓異種移植をBALB/Cマウスで、ドナーとしてLewisラットを用いて実施した。５グループの受容体を研究した：処理なし（コントロール）、シクロスポリン(CsA)処理（５mg／kgS.C．毎日）、脾摘出(SpL)、シクロホスファミド(CyP)処理(POD O，２，４及び７で20mg／kg)、MB23G2mAb処理(100μｇ毎日 ×11日、I．P.)及びMB23G2mAb（100μｇ×11日）及びCyP(POD０，２，４及び７での20mg／kg I.V.)による併合処理。以下の表VIIに示す通り、MB23G2mAb及びCy Pで処理した動物はmAbのみ又はC yPのみで処理した動物より有意に長い平均生存期間を有し、CD45RBmAb及びCyPがマウスにおける腎臓異種移植に対して相乗効果を有すことが実証された。表 VII ラットからマウスへの腎臓異種移植臨床異種移植の究極的な目標は異種移植寛容を誘導し、毒性で高用量の免疫抑制剤の連続使用を排除することにある。ハムスター心臓、対、マウス異種移植モデルにおいて最近実証されている通り、パルス療法とCyP及び連続CsA処置との併合は長期化移植生存を誘導する。Hasanら、Transplantation，54，408（1992）参照。しかしながら、シクロスポリン療法を終了させると、異種移植は短期間内で拒絶される。即ち、平均生存期間は３週間未満となった。かくして、CyP及びC sAによる療法は異種移植寛容を誘導できない。対照的に、上記表VIIに示す通り、CD45RBmAb及びCyPで処理した動物における異種移植は免疫抑制療法を中止してから数ヶ月生存し続けた。更に、mAb及びCyPで処理した長期生存腎臓異種移植はPOD100にて犠牲にしたときに正常な腎機能及び正常な病理を有した。これらの結果はCD45RBmAb及びCyPによる処理がラット、対、マウスモデルにおいて機能的な異種移植寛容を誘導しうることを示した。この療法はヒトの移植拒絶反応の予防に応用できる。実施例15：糖尿病の発症を阻害するためのNODマウスのin vivo処置５匹の雌NODマウスを生後28，29及び30日目に30μｇのラット抗マウスCD45RBm Ab MB23G2でi.v.処理した。５匹のコントロールには抗体処理を施さなかった。2 7週目までに、全てのコントロールマウスが糖尿病の結果死亡した。抗体処理したマウスのうち、２匹が糖尿病で死亡し、他の３匹はそれらを殺してその膵臓を組織学検査にかけるまで35週間健康に生存した。３匹の生存動物のいづれにおいてもインスリン炎の徴候は認められなかった。表VIIIはこの実験由来の結果をまとめる。表 VIII NODマウスにおける糖尿病の発症この第一実験を実施してから更なる実験を実施した。これらの実験における療法は２〜35週に週２回100μｇのMG23G2を投与することを含んで成り、35週目に残ったマウス全てを安楽死させた。その結果を以下の表IXに示す。表 IX NODマウス生存（週）データーからわかる通り、コントロールと比べて有意に多い数の動物が無期限に、即ち、35週間の実験の終了時まで生存した。MB23G2により誘導された改善は動物の生存の証拠においてのみならず、血糖の証拠においても認められ、処理グループにおける35週間生存した動物は全て高血糖症の徴候を示さなかった。MB23 G2の有益な効果は膵臓の慎重な組織学的評価であるインスリン炎評点によっても確認した。1.81及び0.99の差は共に生物学的及び統計学的に有意義である。実施例16：皮膚移植拒絶反応の予防４グループのＡ系マウス（白色）にC57BL/10系マウス（黒）由来の皮膚移植を付与した：グループＩ及びIIはラット抗マウスCD45RBmAbによる前処理を施し、そしてグループIII及びIVはラットマウスCD45RBmAbによる処理を施さなかった。皮膚移植手術の後に、グループＩ及びIIIを日を変えて抗マウスCD45RBmAbで処理し、グループII及びIVに更なる抗体処理を施さなかった。皮膚移植の拒絶反応を予防するうえでの抗体処理の効果は４グループにおける白色受容マウスに基づく黒色皮膚移植が生存する期間の対比により決定する。実施例17：局在対宿主移植(GvH)反応当該化合物のin vivo効能をFordらTransplantation，10，258（ 1970）に記載の通りにして適当な動物モデルにおいて実証する。生後６週間の雌マウス由来の脾臓細胞（１×10⁷）を体重約100ｇの種々の系のマウスの左後足に０日目にて皮下注射する。動物を４日連続処理し、そして７日目に膝窩リンパ節を取り出し、秤量する。２つのリンパ節の間の重量差を反応の評価のためのパラメーターとして採用する。実施例18：フロインドアジュバント関節炎実験誘導関節炎に対する効能は、例えばin Winter & Nuss，ARTHRITIS & RHEU MATISM 9（1966）394;Billingham Davies，HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACO L．（Vane & Ferreira Eds，Springer-Verlag，Berlin）50/11（1979）108-144 に記載の手順を利用して実証できる。マウス（雄又は雌、体重150ｇ）に、0.6mg の凍結乾燥加熱死滅マイコバクテリアスメグマチス(Mycobacterium smegmatis )を含む0.1mlのミネラル油を尾のつけ根又は後足に注射する。発達中の関節炎モデルにおいては、アジュバンドの注射の直後に処理を開始し（１〜１８日）；確立された関節炎モデルにおいては、処理は14日目に開始し、そのときには炎症は十分に発達している（14〜20日）。実験の終了時に、関節の膨れをノギスにより測定する。ED₅₀は膨れ（一次又は二次）をコントロールのそれの半分にまで縮小するmg／kgの経口用量である。実施例19：狼瘡様自己免疫疾患の発症を阻止するためのNZBマウスのin vivo処理ニュージーランド黒色系(NZB)マウスは溶血性貧血、糸球体硬化症及び脈管炎（どれもヒト全身性エリテマトーデス(SLE)を非常に想起する）の広範且つ多彩な徴候をもって死亡する。SLEを処置するうえでの本発明の効果は新生NZBマウスをラット抗マウスCD45RBmAb MB23G2により生後様々な時間で処理し、次いで処理及び未処理のマウスを自己免疫疾患の発症、詳しくは糸球体硬化症（これはヒトSLEの主たる特徴でもある）の発症について分析することによってこのマウスモデルで評価される。実施例20：CD45試薬の免疫調節活性のin vitro評価ヒトＴ細胞活性化を抑制する抗ヒトCD45抗体の能力を下記の方法によりin vit roで評価した。単核細胞をFicdl-Hypaque密度勾配遠心分離によってボランティアの末梢血液から単離した。細胞をOKT３を含む又は非反応性コントロール抗体を含む10％のF CS入りRPMI1640の中で１〜４日間刺激した。早期活性化のマーカーとしてのCD69 及び後期活性化のマーカーとしてのCD25について陽性であるCD３，CD４及びCD８細胞のパーセンテージをFACScan分析により決定した。Poppemaら、Leukemia and Lymphoma ，20，217（1996）。CD45及びCD45Ｒ抗体の効果を単体又はカクテルとしてこれらの試薬を添加することにより測定した。細胞リゼートのウェスタンブロットを抗リン酸化チロシン抗体４Ｇ10で染色し、CD45のチロシンホスファターゼ活性の結果としての脱リン酸化の潜在的な機能を調べた。Juneら、J ．Immunol .，144，1591（1990）。以下の表ＸIIIに示す通り、OKT３は４日目にＴ細胞の約70％にCD25発現を引き起こし、一方で非反応性コントロール抗体に対する曝露は約10％のCD25発現をもたらした。どのCD45(R)抗体もＴ細胞活性化を供さなかった。CD45(R)抗体とOKT ３刺激化末梢血液単核細胞との同時インキュベーションの結果を図５にまとめる。４種の試験したCD45RA試薬は効果がなく、弱い刺激をもたらした。試験した４種のCD45RB試薬のうち、２種（６Ｂ６，６Ｇ３）が有意な阻害を示し、他の２種（MT３，PD７）は最低限の効果しかなかった。試験した３種のCD45ROのうち１種が有意な阻害を示し（UCHL１）、一方他の２種（Ａ６，OPD４）ははるかに弱い阻害を示した。試験した４種のCD45試薬のうち、１種（４Ｃ９）は効果がなく、２種（４Ｄ11，２Ｇ１）が阻害を示し、そして１種（４Ｆ９）はOKT３のみの効果をはるかに上まわる刺激をもたらした。表Ｘ活性化とチロシンリン酸化との相関 CD25及びCD69の発現もCD４+又はCD８+Ｔ細胞を追い出した後に分析した。その結果は、抗CD45RB試薬６Ｇ３がCD４細胞に対してよりもCD８細胞に対してはるかに強い阻害作用を有することを示した。試薬の併合も試験し、そして図７に示す通り、CD45，CD45RB及びCD45RO混合物の明確な相乗が認められ、それはCD25発現のレベルを非刺激コントロールとは有意差がないものまで低下させた。この研究の結果はCD45(R)特異的抗体がCD３媒介Ｔ細胞活性化をin vitroで調節しうることを示す。抗体の併合の結果は様々なメカニズムが実際の効果に寄与しうることを示す。全てでないにしても一部の抗CD45RB抗体がＴ細胞活性化を阻害するという発見は一のCD45RB特異的抗体がマウスモデルにおける腎臓同種移植生存を長期化し、他のものがそうしないという発見に従う。実施例５参照。CD８細胞に対するCD45 RB抗体の主たる阻害作用は、効果的に処理したマウスにおける主たる免疫表現型の発見が同種移植における CD８細胞の数の減少にあるという発見と一致する。まとめると、in vitro CD3刺激化末梢血液Ｔ細胞のCD25発現の分析は抗CD45(R )抗体の免疫調節活性を実証する。抗ヒトCD45(R)抗体の混合物はin vitroでのＴ細胞活性化の強力なインヒビターであり、そして同種移植拒絶反応の予防及び回復によく適しうる。実施例21：MBPで免疫したNZWマウスにおけるEAEの発症を予防するための抗CD45R BmAB MB23G2の能力Ａ．材料及び方法１．動物： NZWマウス（生後６〜８週）及びB6.SJLマウスをJackson Laboratory，Bar Har bor，Maineから入手した。２．抗体：精製したモノクローナル抗体MB23G2(HB220)抗CD45RBを利用した（ATCC，Rockv ille，Maryland）。ポリクローナルラットIgGをJackson Research Laboratories ，Bar Harbor，Maineより入手した。３．ウシMBPの調製ウシ骨髄組織（Pel-Freeze，Inc.，Rogers，AR）をホモジネーションし、そして２：１のクロロホルム：メタノールで脱脂した。固体残渣をpH 3.0で１時間抽出し、そしてその抽出物を６Ｍの尿素0.08ＭのグリシンpH10.4で平衡にしたCM− 52でクロマトグラフィーにかけた。その溶出液を0.1Ｍの酢酸中の6000〜8000Ｍチューブを用いて一夜透析した。次いでそれを凍結乾燥し、そしてSDS-PAGEに泳動させて純度を検定した。４．EAE の誘導：マウスを完全フロイドアジュバント(CFA)＋H37Ra(４mg／ml)中の乳化ウシMBP （100μｌ）で皮下的に免疫した。それらに500ngの百日咳毒素（List Biological Laboratories，Campbell，CA）を免疫後０及び10 日目にIP注射した。マウスは免疫後10〜14日目にEAEの徴候を示した。臨床症度は等級スケールに基づき、０は正常；１は弱まった尾の緊張；２は尾の麻痺；３は不全対麻痺；４は対麻痺；５は瀕死／死亡とした。症度評点は動物の数に各動物についての臨床症度を乗じた値を基礎とする。５．抗CD45RB抗体の処理マウスに40μｇの抗CD45RB抗体又はポリクローナルIg（Jackson Research Lab oratories，Bar Harbor，Maine）をコントロールとして100μｌの全容量で免疫後０及び５日目にIP注射した。６．増殖アッセイＶβ８及びCD３特異的刺激のため、マイクロタイタープレートに50μｇ／mlの精製抗−Ｖβ８又は抗−CD３をそれぞれコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベーションし、そして脾臓細胞を添加するまで無菌PBSで３回洗浄した。脾臓細胞はEAE陽性（コントロール処理）及びEAE陰性（抗CD45RB処理）マウスから得た。細胞を0.84％の塩化アンモニウムに室温で５分処理して赤血球を除去し、無菌PBSで３回洗い、そしてウェル当り１×10⁵細胞の濃度でプレーティングした。細胞を最適濃度のPMA／イオノマイシンでも刺激した。インキュベーション２日目に培養細胞に１μCi(37kBq)の〔メチル−³Ｈ〕チミジンで18時間パルスに処し、そしてPHD細胞回収器(Cambridge Technology，Cambridge，MA)で回収した。７．TNF −αELISA：上清液をPMA／イオノマイシン、抗CD３、抗Ｖβ８及びCon-Ａで活性化した細胞から集めた。TNF−αELISAキットをGenzyme Immunologicals，Cambridge，MA から購入した。TNF−αの濃度を用意した陽性コントロールの系列希釈に由来する標準曲線から決定した。サンプルを二重測定した。８．フローサイトメトリー：リンパ節をコントロール及び処理動物から集め、そしてプールした。単一の細胞懸濁物を調製し、そして全ての赤血球を0.84％のNH₄Clで溶解した。細胞をPBS で２回洗い、計測し、そして１×10⁶の細胞を染色のための96穴マイクロタイタープレートの中に入れた。飽和量の適当な抗体（フィコエリスリン（DE）に直接コンジュゲーションされたVL４−Ａビオチニル化LFA−１、及びビオチニル化ICA M−Ｉ；全てPharmingen，San Diego，CAより入手）を加えた。第二工程は、必要なら、PEコンジュゲーション化ストレプトアビジン（Jackson Immunoresearch， West Grove，PA）とのインキュベーションより成る。細胞をPBSで３回洗い、当容量の２％のパラホルムアルデヒドで固定した。フローサイトメトリーをFACSca nフローサイトメトリー(Becton Dickinson，Palo Alto，CA)でPC Lysisソフトウェアを用いて実施した。死んだ細胞をフォワード及びサイドスキャッターゲッティングにより排除した。データーをLysis IIソフトウェアを用いて分析した。９．総IgEについてのELISA 総血清IgEをサンドイッチELISAを用いて決定した。固相の準備のため、EM95.3 （捕獲のためにラット抗のマウスIgEモノクローナル抗体を使用）をホウ酸食塩水(BBS；25mMのNa₂B₄O₇×10H₂O,75mMのNaCl,100mMのH₃BO₃，pH8.4)の中に３mg／ mlに希釈した。Immulon（登録商標）２マイクロタイタープレート（Dynatech La boratories，Inc.，Chantilly，VA）にこの溶液100mlをコーティングし、そして４℃で一夜放置した。全てのインキュベーション工程の間、マイクロプレートを 0.05％のTween 20含有BBSで３回洗った。全てのインキュベーションは何らかのことわりのない限り室温で１時間とした。血清をBBT(0.5％のBSA及び0.4％のTween 80の添加したBBS)に１：40〜1：200で希釈した。ビオチニル化Ｂ１Ｅ３(検出のために用いるラット抗マウスIgE)を第二抗体として加えた。表示システムはExtr Avidin(登録商標)アルカリ性ホスファターゼ及びSigma 104(登録商標)ホスファターゼ基質（γ−ニトロフェニルホスフェート、ニナトリウム、六水和物）より成る。この基質はOD₄₀₅間の差により決定し、そして血清総IgEは標準の対照B6.SJL血清の等価希釈係数で報告する。これは次式により規定される： EDF＝（試験血清の等価ODを供する標準対照血清の希釈率）×10⁴ 10．間接イムノフルオレッセンスマウス血清を商業的に調製されたマウス凍結腎臓スライド（Sanofi，Chaska， MN）を用いる間接イムノフルオレセンスによりIgG ANoAの存在について試験した。これらのスライドを室温で30分PBSに希釈した血清とインキュベーションした。未結合の血清をPBSでの更に３回の洗浄により除去した。次にスライドを室温で30分、PBSに１：50で希釈した50μｌのFITC−コンジュゲーション化ヤギ抗− マウスIgG(FCフラグメント特異的、Jackson Immuno Research，West Grove，PA) とインキュベーションした。未結合の第二抗体を、各ウェルをPBSで３回洗浄することにより除去した。細胞は、96穴プレートを顕微鏡(Carl Zeiss，Inc.，Tho rnwood，NY)の台の上で逆さまにすることにより蛍光照射のもとで調べた。抗核小体染色は核小体の強い均一染色により証明された。 11．統計学的評価統計学的評価をSigmaStat統計ソフトウェア(Jandel Scientific，San Rafael ，CA)を用いて実施した。全ての対合対比に関してスチューデントｔ検定を利用した。ANA力価の分析のため、Mann-Whi tneyランク合計検定を利用した。Ｂ．結果１．EAE の経過に対する抗CD45RB抗体の臨床効果 MBPで免疫したNZWマウスにおけるEAEの発症を予防する抗CD45RBの能力をまず調べた。表XIに示す通り、一の状況を除き、０及び５日目に抗CD45RBで処理したマウスはEAEを発症しなかった。表 XI 21匹のマウスのうち１匹のみが処理グループの中で病気を発症し、対してコントロール抗体処理グループでは17／22であった。CNSの調査は処理動物においてリンパ球浸潤物がないことを示した（各グループにおいて２匹の動物を調べた）。しかしながら、コントロールグループはCNSにおいて有意な損傷を示した。従って、MBPによる免疫時での抗CD45RBによる処理はEAEの発症を阻止できた。２．抗CD45RBによる処理はＴ細胞増殖能力を変化させる抗CD45RBがEAEを予防するメカニズムを調べるため、細胞数及び機能に作用する抗CD45RBの能力を調べた。最初に、処理した及びコントロール動物の脾臓の中に存在する総細胞数を決定し、またリンパ節中のＴ細胞の総数を処理して５及び10日目に決定した。処理及びコントロール動物間での細胞数の一貫した低下は認められなかった。処理マウスにおけるＴ細胞の増殖能力を次に調べた。Ｔ細胞をCD45RB及びコントロール処理動物のリンパ節から単離し、そしてPMA／イオノマイシン、抗CD３、抗Ｖβ８及びCon A in vitro刺激に対して増殖する能力を調べた。図８に示す通り、抗CD45RBによるin vivo処理は、MBPの投与後５回目において（更には、抗 CD45RBの一回目の投与の５日後）、単離Ｔ細胞の増殖能力を、全てのin vitro刺激モードに有意に下げた。驚くべきこと、10日までに(MBPの10日後、しかし２回目の抗CD45RBの５日後)、リンパ節Ｔ細胞の増殖は処理、対、コントロールマウスにおいて事実上増強した（図９）。にもかかわらず、どの動物も数週間経ても病気とならなかった。従って、Ｔ細胞機能が10日までに復帰するようであるが、臨床EAE徴候は認められなかった。Ｂ細胞がEAEの発症において主たる機能を果たしているようには思えないが、抗CD45RB処理はＢ細胞がLPSによる活性化に対して応答する能力を弱めることも見い出された（図示せず）。かくして、抗CD45RB がＴ細胞の数多くの活性化シグナルに応答する能力に有意な衝撃を与えるようである。これはＴ細胞活性化に対するCD45の報告されている作用と一致する。しかしながら、このモデルにおいて、細胞数に対する抗体の一貫した作用は実証されなかった。かくして、本発明に従い、自己免疫疾患を有する者及び器官移植を受けた者を実質的に改善する方法及び製品を提供する。本発明はその特定の態様との関係で説明してきたが、本発明にはその範囲を逸脱することなく様々な改良、変更が施されるであろうことを当業者は理解する。

Claims

【特許請求の範囲】 1. 哺乳動物受容体における細胞、組織又は器官移植拒絶反応を処置又は予防するための方法であって、CD45RB白血球抗原に結合する抗体、CD45RO白血球抗原に結合する抗体又はそれらの混合物を、前記移植に対する前記受容体のＴ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量で投与することを含んで成る方法。 2. 前記細胞、組織又は器官移植が前記受容体にとって同種異系移植である、請求項１記載の方法。 3. 前記細胞、組織又は器官移植が前記受容体にとって異種移植である、請求項１記載の方法。 4. 前記抗体が前記抗原上のニューラミンダーゼ感受性エピトープに結合する、請求項１記載の方法。 5. 前記抗体を前記細胞、組織又は器官の移植の前記投与する、請求項１記載の方法。 6. 前記抗体を前記細胞、組織又は器官の移植の後に投与する、請求項１又は５記載の方法。 7. 前記抗体を前記細胞、組織又は器官の移植と同時に投与する、請求項１又は５記載の方法。 8. 前記抗体を抗CD45RBモノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント及びそれらの混合物から成る群より選ばれる、請求項１，２，３又は４記載の方法。 9. 前記抗体が抗CD45RBモノクローナル抗体である、請求項７記載の方法。 10．前記抗体が抗CD45ROモノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント又はそれらの混合物である、請求項１記載の方法。 11．前記抗体が抗CD45ROモノクローナル抗体である、請求項10記載の方法。 12．抗CD45RB及び抗CD45Ｏ抗体の混合物を投与する、請求項１記載の方法。 13．少なくとも一種の抗炎症薬又は免疫抑制薬を投与することを更に含んで成る、請求項１，２，３又は４記載の方法。 14．前記抗炎症薬又は免疫抑制薬がシクロスポリン、シクロホスアミド、FK− 506、ラパマイシン、コルチコステロイド、マイコフェノレートモフェチル、レフルノミド、抗−リンパ球グロブリン、デオキシスペルグアリン又はOKT−３である、請求項13記載の方法。 15．予め前記抗体にex vivoで曝露された前記受容体のリンパ球を一定量投与することを更に含んで成る、請求項１，２，３又は４記載の方法。 16．CD45RA白血球抗原に結合する化合物、CD45RC白血球抗原に結合する化合物、又はそれらの混合物を一定量投与することを更に含んで成る、請求項１記載の方法。 17．哺乳動物受容体における細胞、組織又は器官移植拒絶反応を処置又は予防するための方法であって、CD45RC白血球抗原に結合する抗体を前記移植に対する前記受容体のＴ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量で投与することを含んで成る方法。 18．前記量が前記移植に対する前記受容体の免疫寛容を誘導するのに有効である、請求項１，10又は17記載の方法。 19．前記受容体が連続細胞、組織又は器官移植を受ける、請求項18記載の方法。 20．前記受容体に一定量のリンパ球を投与することを更に含んで成る、請求項 16又は17記載の方法。 21．前記組織が膵臓半島である、請求項１，２，３又は４記載の方法。 22．前記器官が腎臓である、請求項１，２，３又は４記載の方法。 23．前記器官が心臓である、請求項１，２，３又は４記載の方法。 24．前記組織が血管組織である、請求項１，２，３又は４記載の方法。 25．前記細胞が造血細胞である、請求項１，２，３又は４記載の方法。 26．前記器官が肝臓である、請求項１，２，３又は４記載の方法。 27．前記受容体がヒトである、請求項１，２，３又は４記載の方法。 28．自己免疫疾患を処置するための方法であって、自己免疫疾患を有する哺乳動物に、CD45RB白血球抗原に結合する抗体、CD45RO白血球抗原に対する抗体又はそれらの混合物を、Ｔ細胞媒介免疫反応を阻害するのに有効な量で投与することを含んで成る方法。 29．前記抗体が抗CD45RBモノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント又はそれらの混合物である、請求項28記載の方法。 30．前記抗体が抗CD45RBモノクローナル抗体である、請求項29記載の方法。 31．前記抗体が抗CD45ROモノクローナル抗体、その抗原結合性フラグメント又はそれらの混合物である、請求項28記載の方法。 32．前記抗体が抗CD45ROモノクローナル抗体である、請求項31記載の方法。 33．前記自己免疫疾患が炎症性腸炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス又はリウマチ様関節炎である、請求項28 記載の方法。 34．CD45RA白血球抗原に結合する抗体、CD45RC白血球抗原に結合する化合物、又はそれらの混合物を投与することを更に含んで成る、請求項28記載の方法。 35．自己免疫疾患を処置するための方法であって、自己免疫疾患を有する哺乳動物に、Ｔ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量のCD45RC白血球抗原に結合する抗体を投与することを含んで成る方法。 36．予め前記抗体にex vivoで曝露された前記哺乳動物のリンパ球を一定量投与することを更に含んで成る請求項35記載の方法。 37．前記リンパ球を前記抗体と組合せて投与する、請求項36記載の方法。 38．免疫抑制量の、CD45RB白血球抗原に結合する抗体、CD45RO抗原に結合する抗体、又はそれらの混合物を、薬理学的に許容されるビヒクルと組合さって含んで成る、薬理組成物。 39．抗CD45RBモノクローナル抗体、抗CD45ROモノクローナル抗体又はそれらの混合物を含んで成る、請求項34記載の薬理組成物。 40．前記量が同種異系又は異種器官、組織又は細胞移植の哺乳動物受容体の免疫寛容を誘導するのに有効である、請求項38又は39記載の薬理組成物。 41．CD45RA白血球抗原に結合する化合物、CD45RC白血球抗原に結合する化合物又はそれらの混合物を更に含んで成る、請求項38又は39記載の薬理組成物。 42．抗CD45RAモノクローナル抗体、抗CD45RCモノクローナル抗体又はそれらの混合物を含んで成る、請求項41記載の薬理組成物。 43．CD45RC白血球抗原に結合する免疫抑制有効量の抗体を薬理学的に許容されるビヒクルと組合さって含んで成る、薬理組成物。 44．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項42記載の薬理組成物。 45．前記組成物の意図する哺乳動物受容体に由来する一定量のリンパ球を更に含んで成る、請求項38，39又は40記載の薬理組成物。 46．前記量が同種異系又は異種器官、組織又は細胞移植の哺乳動物受容体の免疫寛容を誘導するのに有効である、請求項43又は45記載の薬理組成物。 47．哺乳動物受容体における細胞、組織又は器官移植拒絶反応を処置又は予防するための方法であって、CD45R白血球抗原に特異的に結合する一定量の化合物を投与することを含んで成り、当該量が前記移植に対する前記受容体のＴ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量である、方法。 48．前記細胞、組織又は器官移植が前記受容体にとって同種異系である、請求項47記載の方法。 49．前記細胞、組織又は器官移植が前記受容体にとって異種である、請求項47 記載の方法。 50．前記化合物を前記細胞、組織又は器官の移植の前に投与する、請求項47記載の方法。 51．前記化合物を前記細胞、組織又は器官の移植の後に投与する、請求項47記載の方法。 52．前記化合物を前記細胞、組織又は器官の移植と同時に投与する、請求項47 記載の方法。 53．前記化合物が一本鎖抗原結合性分子、小型結合性ペプチド又はそれらの混合物である、請求項47，48又は49記載の方法。 54．少なくとも一種の抗炎症薬又は免疫抑制薬を投与することを更に含んで成る、、請求項47，48又は49記載の方法。 55．前記抗炎症薬又は免疫抑制薬がシクロスポリン、シクロホスアミド、FK−506、ラパマイシン、コルチコステロイド、マイコフェノレートモフェチル、レフルノミド、抗リンパ球グロブリン、デオキシスペルグアリン又は OKT−３である、請求項54記載の方法。 56．一定量の前記受容体のリンパ球を投与することを更に含んで成る、請求項 47，48又は49記載の方法。 57．前記量が前記移植に対する前記受容体の免疫寛容を誘導するのに有効な量である、請求項47記載の方法。 58．前記受容体が連続細胞、組織又は器官移植を受容する、請求項57記載の方法。 59．前記化合物に対して予めex vivo曝露された一定量の前記受容体のリンパ球を投与することを更に含んで成る、請求項57又は58記載の方法。 60．前記組織が膵臓半島である、請求項47，48又は49記載の方法。 61．前記器官が腎臓である、請求項47，48又は49記載の方法。 62．前記器官が心臓である、請求項47，48又は49記載の方法。 63．前記組織が血管組織である、請求項47，48又は49記載の方法。 64．前記細胞が造血細胞である、請求項47，48又は49記載の方法。 65．前記器官が肝臓である、請求項47，48又は49記載の方法。 66．前記受容体がヒトである、請求項47，48又は49記載の方法。 67．自己免疫疾患を処置するための方法であって、自己免疫疾患を有する哺乳動物に、CD45Ｒ白血球抗原に特異的に結合する少なくとも一種の化合物を一定量で投与することを含んで成り、ここで当該量はＴ細胞媒介免疫応答を阻害するのに有効な量である、方法。 68．前記化合物が一本鎖抗原結合性分子、小型結合性ペプチド又はそれらの混合物である、請求項67記載の方法。 69．前記自己免疫疾患が炎症性腸炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、全身性エリトマトーデス又はリウマチ様関節炎である、請求項68記載の方法。 70．前記化合物に予めex vivo曝露された一定量の前記の哺乳動物のリンパ球を投与することを更に含んで成る、請求項68記載の方法。