[go: up one dir, main page]

NO315002B1 - Bibliotek av bio-oligomerer og fremgangsmåte for fremstilling av dette, samt for å bestemme sekvensen til en bio-oligomerligand for etakseptormolekyl, enbiologisk aktiv bio-oligomerligand eller en bio-oligomer somkatalyserer en reaksjon - Google Patents

Bibliotek av bio-oligomerer og fremgangsmåte for fremstilling av dette, samt for å bestemme sekvensen til en bio-oligomerligand for etakseptormolekyl, enbiologisk aktiv bio-oligomerligand eller en bio-oligomer somkatalyserer en reaksjon Download PDF

Info

Publication number
NO315002B1
NO315002B1 NO19930011A NO930011A NO315002B1 NO 315002 B1 NO315002 B1 NO 315002B1 NO 19930011 A NO19930011 A NO 19930011A NO 930011 A NO930011 A NO 930011A NO 315002 B1 NO315002 B1 NO 315002B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
bio
oligomer
peptide
library
solid phase
Prior art date
Application number
NO19930011A
Other languages
English (en)
Other versions
NO930011D0 (no
NO930011L (no
Inventor
Kit Sang Lam
Sydney E Salmon
Victor J Hruby
Evan M Hersh
Fahad Al-Obeidi
Original Assignee
Arizona Board Of Regents The U
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arizona Board Of Regents The U filed Critical Arizona Board Of Regents The U
Publication of NO930011D0 publication Critical patent/NO930011D0/no
Publication of NO930011L publication Critical patent/NO930011L/no
Publication of NO315002B1 publication Critical patent/NO315002B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/70—Enkephalins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00592—Split-and-pool, mix-and-divide processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/817—Entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

Et bibliotek av bio-oligomerer med definert størrelse og kjent sammensetning hvori. biblioteket inneholder alle mulige sekvenser til bio-oligomerene og en fremgangsmåte for syntese derav er beskrevet. Bio-oligomerene til biblioteket kan være peptider, nukleinsyrer eller kombinasjoner derav. Fremgangsmåte for identifisere bio-oligomerene fra et bibliotek som demonstrerer ønskede karaktertrekk så som bindning, bioaktivitet og katalyttisk aktivitet er også beskrevt. En unik og virkingsfull fremgangsmåte for å identifisere nyttige bio-oligomersekvenser fra et bibliotek hurtigere enn annen kjent teknologi er derfor tilveiebragt. Effektormolekyler for anvendelse ved behandling eller diagnostikk av sykdom er også beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et bibliotek av bio-oligomerer og en fremgangsmåte for å danne et bibliotek av biologisk aktive bio-oligomerer. Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en bio-oligomerligand for et akseptormolekyl og en fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en biologisk aktiv bio-oligomer ligand. Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en bio-oligomer som katalyserer en reaksjon.
Gjenkjennelse og binding av ligander regulerer nesten alle biologiske prosesser, så som immungjenkjennelse, cellesignalisering og kommunikasjon, transkripsjon og translasjon, intracellulær signalisering og katalyse, dvs. enzymreaksjoner. Det har lenge vært interesse for dette området å identifisere molekyler som virker som agonister eller som kan agonisere eller antagonisere aktiviteten til ligander så som hormoner, vekstfaktorer og neurotransmittere, som induserer B-celle (antistoff-formidlet) eller T-celle (celle-formidlet) immunitet og som kan katalysere kjemiske reaksjoner eller som kan regulere genekspresjonen på transkripsjons- eller translasjonsnivået.
Av spesiell interesse er protein- eller peptidligander. Disse omfatter fleste hormoner, vekstfaktorer, neuroaktive molekyler og immunepitoper. Som diskutert nedenfor, har de fleste forsøk på å danne antagonister eller agonister med reseptor-formidlet biologisk aktivitet, eller antistoff eller T-celleepitoper, hvert fokusert omkring peptider. Utvikling av farmasøytiske midler tilpasset reseptorbindingsseter har vært vanskelig på grunn av vanskeligheten når det gjelder å bestemme sekvensen til peptidiigandene. Det fullstendige antallet og variasjonen til slike peptidsekvenser har gjort dette til et uoppnåelig mål på et hvilket som helst grunnlag med unntagelse av omstendelig isolering av et spesifikt kompleks, identifisering av beliggenheten til epitopen og sekvensering av epitopen. Problemet blir ytterligere vanskeligere ved det faktum at epitopen ofte består av aminosyreresidier som ikke er sammenhengende i den primære sekvensen.
Noen forskere innenfor området har forsøkt å omgå denne tidkrevende prosessen ved å bestemme aminosyresekvensen til et protein basert på nukleotidsekvensen av dets komplement. Proteiner er store peptider bestående av aminosyrer. Hver aminosyre blir kodet av en eller flere kodoner bestående av tre nukleinsyreresidier. For eksempel, peptid A, inneholdende aminosyren glutamin, vil bli kodet av et kodon med tre nukleinsyrereisider: cytosin, adenin og guanin. Komplementet til dette kodonet vil være guanin (som bindes til cytosin), tymin (som bindes til adenin) og cytosin og det vil kode for en aminosyre i peptid B. Ifølge komplementaritetsteorien vil peptid B bindes til peptid A. Spesielt har Bost og Blalock (1989, Methods in Enzymology 168:16-28) foreslått at et hvilket som helst gitt peptid vil bli bundet til et annet peptid som blir kodet av en komplementær sekvens av nukleinsyreresidier og, med denne informasjon, forutsagt aminosyresekvensen til et komplementært peptid. De har anvendt sekvensen til å syntetisere et peptid og til å teste dets evne til å binde.
Denne metoden har ikke gitt løsningen på problemet på grunn av at affiniteten for binding mellom de komplementære peptidene var generelt meget lav og krevde komplementære peptider større enn 15 residier. Denne metoden krever derimot kunnskap om enten aminosyresekvensen eller nukleinsyresekvensen til bindingspartneren til proteinet av interesse. Denne metoden vil ikke kunne anvendes for epitoper som består av aminosyreresidier som ikke er sammenhengende i den primære sekvensen.
Det har nylig kommet flere rapporter angående preparering av peptidbiblioteker og anvendelse derav for identifisering av peptidligander som kan binde til aksepterer. En metode anvender rekombinant bakteriofag for å produsere store biblioteker. Ved anvendelse av "fagmetoden" (Scott og Smith, 1990, Science
249:386-390; Cwirla, et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei., 87:6378-6382; Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406), kan meget store biblioteker bli konstruert (10<6->10<8> kjemiske enheter), men den genetiske koden og det biologiske systemet gir flere iboende begrensninger på allsidigheten og mangfoldigheten til systemet. En annen metode anvender hovedsakelig kjemiske metoder, der Geysen-metoden (Geysen et al., 1986, Molecular Immunology 23:709-715; Geysen et al., 1987, J. Immunologic Method 102:259-274) og metoden til Fodor et al.
(1991, Science 251,767-773) er eksempler. Metodologien til Geysen et al. tilveiebringer et begrenset antall peptider (10<3->10<4>) og kan bli syntetisert på polyetylenpinner i løpet av noen få dager. Metoden til Fodor et al. anvender en "lys-rettet områdebestembar parallell kjemisk syntese"-teknikk. Denne teknikken er også begrenset av den relative mangelen på utvikling av fotokjemiske peptidsyntesemetoder.
Stor skala parallelle samtidige peptidsynteseteknikker er også blitt utviklet.
Houghton rapporterte syntetisering av hundrevis av analoge peptider samtidig i polypropylenmaskepakker (teposemetoden) (Houghton, 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 82:5131-5135). Berg et al. (1989, J. Am. Chem. Soc. 111:8024-8026) rapporterte en ny polystyren-podet polyetylenfilmbærer som er egnet for peptidsyntese på parallell måte. Begge teknikkene anvendte standard Boc-aminosyreharpiks med standard avspaltning, nøytralisering, kobling og vaskeprosedyrer som den opprinnelige fast faseprosedyren til Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Furka et al. (1988,14th International Congress of Biochemistry, Volum 5, Abstract FR:013) beskrev en fremgangsmåte for å produsere en blanding av peptider ved separat kobling av hver av tre forskjellige aminosyrer og deretter blanding av hele harpiksen. Prosedyren beskrevet av Furka et al. gir ingen tilfredsstillende metode for å isolere et peptid av interesse fra den mengden av peptider som blir produsert.
Furka et al. beskriver en fremgangsmåte for fast fase syntese av en blanding av peptider i motsetning til enkeltpeptider. Peptidene i blandingen avbeskyttes samtidig og spaltes fra den faste bæreren for å danne en blanding av peptider i løsning. Blandingen av peptidene kan utsettes for fraksjonering for å lete etter biologisk aktive peptider.
Merrifield beskriver konstruksjon av et enkelt peptid på en fast fase bærer. Denne fremgangsmåte gjør ikke fagpersonen innen teknikken i stand til å konstruere et stort bibliotek av ulike bio-oligomerarter, der hver er festet til en forskjellig fast fase bærer. Merrifield beskriver ikke at bio-oligomerartene bør avbeskyttes mens de er festet til den faste bæreren.
Houghtons U.S. patent nr, 4 631 211 angår syntese av peptider som anvender pakker av fast fase bærere. Houghton anvender Merrifield-teknikken for peptidsyntese, men syntesen involverer anvendelse av pakker med fast fase bærer der peptidene syntetiseres. Etter syntesen spaltes peptidene fra bæreren og gjenvinnes. Houghtons fremgangsmåte involverer ikke syntese av et bibliotek av ulike peptider der de enkelte avbeskyttede peptider er festet til et fast støttemateriale.
Til tross for at den er nyttig, muliggjør de kjemiske teknikkene til Geysen, Fodor, Houghton, Berg og Furke og medarbeidere syntese og testing av bare hundrevis til noen få tusen peptider av gangen. Disse teknikkene er meget begrensede i lys av de millioner av mulige peptidsekvenser der en eller flere kan tilsvare bindingssetene mellom enhetene av interesse. Med 20 kjente vanlige aminosyrer, i en hvilken som helst sekvens på fem aminosyrer, er det 20^ eller omtrent 3,2x10^, mulige aminosyrekombinasjoner. Ingen av prosedyrene muliggjør syntesen av så mange peptider på en gang. Ytterligere mangfold fremkommer ved varierende peptidkjedelengde. Konvensjonell peptidsyntese, så som den som er beskrevet i Stewart og Young (1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL), tilveiebringer ikke en metode for syntese av tusenvis til millioner av peptider av gangen.
Ingen av de andre konvensjonelle peptidsyntesemetodene tilveiebringer syntese av et bibliotek av peptider bundet til fast fase bærer og som virkelig er tilfeldig. Et virkelig tilfeldig peptidbibliotek er et med en god statistisk fordeling av alle molekylære enheter, slik at biblioteket inneholder omtrent ekvimolare forhold av alle individuelle peptidenheter.
Syntesen av et virkelig tilfeldig peptid kan generelt ikke bli oppnådd ved samtidig tilsetning av forskjellige aminosyrer i en enkelt reaksjonsbeholder på grunn av at koblingsratene for forskjellige aminosyrer er meget forskjellig i løpet av fast fastepeptidsyntesen (SPPS) (Ragnarsson et al., 1971, Acta Chem. Scand. 25:1487,1489; Ragnarsson et al., 1974, J. Org. Chem. 39:3837-3842). Koblingsraten til Fmoc-glycin til et voksende peptid er mye hurtigere enn den til Fmoc-valin og dette er sansynligvis forårsaket av sterisk hindring fra den utragende sidekjeden til valin. Hvis man skulle blande alle 20 aktiverte eukaryote L-aminosyrene med harpiksen i løpet av hver koblingssyklus ville de mest hurtigreagerende aminosyrene fortrinnsvis bli inkorporert i peptidet og ekvimolare forhold av hver peptidtype ville ikke bli oppnådd. Hver av de mulige nukleofilene vil videre har forskjellige reaktiviteter.
Ingen av tidligere peptidsyntesemetodene tilveiebringer for syntesen av et bibliotek med mer enn 10<5> peptider hvor en enkelt peptidtype er koblet til en enkelt fast fase bærer. Representasjonen av bare en type på en bærer vil forsterke gjeldende teknikker for isolering av peptider.
Det er derfor et behov innenfor dette området for et bibliotek med faktiske tilfeldige peptidsekvenser, og oligonukleotidsekvenser, dvs. bio-oligomersekvenser hvor en enkelt bio-oligomerart lett og hurtig kan bli isolert fra resten av biblioteket. Det er også et behov innenfor fagområdet for en fremgangsmåte for hurtig og billig syntetisering av fra tusenvis til millioner av disse faktisk tilfeldige bio-oligomersekvensene.
Foreliggende oppfinnelse angår således et bibliotek av bio-oligomerer, kjennetegnet ved at det består av en multiplisitet av arter av biologiske-aktive avbeskyttede biooligomerer og en multiplisert fast fase bærere som er grundig blandbare og egnede for reaksjonsbetingelsene ved bio-oligomer kjemisk syntese; hvor en enkelt avbeskyttet bio-oligomerart er koblet til hver fast fase bærer for å danne en fast fase bærer/bio-oligomer kombinasjon, og hvorfor hver art i biblioteket er identiteten til en subenhet av biooligomeren til stede i en hvilken som helst gitt ikke-uniform posisjon av bio-oligomerarten statistisk uavhengig av identiteten til subenhetene ved andre posisjoner av bio-oligomerarten.
Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for å danne et bibliotek av biologiske aktive bio-oligomerer, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) tilveiebringing av minst så mange alikvoter av en fast fase bærer som antall forskjellige arter av bio-oligomersubenheter som blir tilsatt, men minst to, for å danne bio-oligomerene; (b) separat introdusere et sett subenheter til alikvotene av fast fase bæreren slik at en subenhet er introdusert til hver alikvot; (c) fullstendig kobling av subenhetene til vesentlig alle setene av fast fase bæreren for å danne en fast fase bærer/ny subenhetskombinasjon; (d) vurdering av fullført kobling, og om nødvendig, tvinge reaksjonen til fullførelse; (e) grundig blanding av alikvotene til fast fase bærer/ny subenhet kombinasjon; og, etter gjentagelse av trinnene (a)-(e) ønsket antall ganger, et endelig trinn omfattende: (f) fjerning av beskyttelsesgruppene slik at hver biologisk aktiv bio-oligomer forblir koblet til fast fase bæreren.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en bio-oligomerligand for et akseptormolekyl, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: (a) innføring, til bibliotek ifølge oppfineisen et akseptormolekyl av interesse slik at nevnte akseptormolekyl vil gjenkjenne og bli bundet til en eller flere fast fase bærer/bio-oligomerart innenfor biblioteket (b) isolere en fast fase bærer/bio-oligomerart som utviser binding til akseptormolekylet; (c) bestemmelse av sekvensen til bio-oligomeren av fast fase bærer/bio-oligomeren isolert i trinn (b).
Foreliggende oppfinnelse angår ogso en fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en biologisk aktiv bio-oligomer ligand, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: (a) frigjøring, in situ, en del av bio-oligomerene til bio-oligomer biblioteket ifølge oppfinnelsen; (b) detektering, in situ, den biologiske aktiviteten av interesse til frigjort bio-oligomer; (c) isolering av en fast fase bærer/bio-oligomer, hvor det er koblet dertil, arter av bio-oligomeren som utviser den biologiske aktiviteten av interesse; og (d) bestemme sekvensen til bio-oligomerartene som er igjen på fast fase bæreren isolert i trinn (c).
Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en bio-oligomer som katalyserer en reaksjon, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) tilsetning, til biblioteket av bio-oligomerer ifølge oppfinnelsen, et substrat slik at et reaksjonsprodukt er detekterbart; (b) isolering av en fast fase bærer som har en bio-oligomer art som utviser aktiviteten av interesse; og (c) bestemme sekvensen av bio-oligomeren koblet til bæreren isolert i trinn (b).
Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er beskrevet i de uselvstendige kravene.
4. Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1. Skjema for tilfeldig peptidsyntese ved anvendelse av splittsyntesemetoden for et tilfeldig tripeptid med tilsatt terminal tryptofan: X-X-X-W (hvor X = S, A eller V; det er 3<3> eller 27 muligheter. Figur 2. Skjematiske tegninger av cykliske peptider, n = 0,1, 2, 3,og m = 1, 2, 3,n og m kan være ekvivalenter, men dette er ikke nødvendig. Heltrukne linjer angir bindinger til det lineære peptidet; stiplede linjer angir kryssbindinger. Par av spesifikke kryss-bindbare subenheter er angitt med A og B. A blir bare kryssbundet til A, B blir bare kryssbundet med B. (a) "Kurv" motiv; (b) "stige" motiv; (c) "lasso" motiv. Figur 3. Kromatogrammer (C-|8 revers fase HPLC, Vydac) av tilfeldige tetrapeptider (X-X-X-W hvor X = S, A eller V) syntetisert ved: (A) ny metode (se teksten), og (B) standard fast fasepeptidsyntese. Kromatogrammet ble oppnådd ved eluering av kolonnen med en lineære acetonitrilgradient. Oppløsningsmiddel A: 0,1% trifluoreddiksyre og 5% acetonitril; oppløsningsmiddel B: 0,1% trifluoreddiksyre og 100% acetonitril. Figur 4. Fotografi av "lang v-mos" peptid/kuler merket med anti-v-mos-antistoff og et sekundært antistoff. Figur 5. Fotografi av en blanding av "lang v-mos" kuler og "kort v-mos" kuler merket med anti-v-mos antistoff og et sekundært antistoff.
Ffgur 6. Fotografi av en blanding av "lang-v-mos" kuler og "kort-v-mos" kuler merket med anti-v-mos antistoff og et sekundært antistoff.
Figur 7. Fotomikrografi av en typisk peptidligandbibliotekscreening hvor en positiv (mørke blå) kule lett kan bit identifisert i en bakgrunn av mange tusener
negative (fargeløse) kuler.
Figur 8. Fotomikrografi som viser konsentrasjonsavhengig inhibitorisk effekt til biotin på farging av LHPQF-harpiks mimotop-kuler ved streptavidin-alkalisk fosfatase. A: 100 nM; B: 10 nM; C: 1 nM; og D: 0,1 nM biotin. Blanke kuler (li-Ala-aminokaproinsyre-harpiks) ble blandet 1:1 med LHPQFD-harpiks før inkubering med streptavidin-alkalisk fosfatase for å virke som en indre negativ kontroll.
5. Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Referanser vil nå bli gitt i detalj til de for tiden foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen.
Som anvendt heri, refererer betegnelsen "bibliotek" til en samling av vesentlig tilfeldige bio-oligomerer. Betegnelsen "bio-oligomer" refererer til en polymer med mindre enn omtrent 100 subenheter. En bio-oligomer ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et peptid, dvs. bestående av aminosyresubenheter, eller et oligonukleotid, dvs. bestående av nukleotidsubenheter eller en peptid-oligonukleotidchimer.
5.1. Fremgangsmåte for å danne et tilfeldig bio- oliqomerbibliotek Som angitt ovenfor, vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å danne et bio-oligomerbibliotek ved å syntetisere bio-oligomerer av tilfeldig monomersubenhetsekvenser. Som anvendt heri, refererer betegnelsen "tilfeldig monomersubenhetsekvenser" til sekvenser hvor en hvilken som helst monomersubenhet kan etterfølge eller følge en hvilken som helst annen monomersubenhet.
I en utføreisesform kan monomerenheten være en aminosyre, en aminosyreanalog eller en peptidomimetikk. Anvendt heri, betyr "peptidetterligner" et molekyl som strukturelt og kjemisk ligner et peptid med to eller flere aminosyrer. I en annen utføreisesform kan monomersubenheten være et nukleoskf og nukleosidet kan være ribonukleinsyre eller deoksyribonuklein-syre. I en annen utføreisesform kan monomersubenhetene være aminosyrer og nukleosider. Bio-oligomeren kan være et peptid (omfattende aminosyrer), et RNA oligonukleotid (omfattende ribonukleosider), et DNA oligonukleotid (omfattende deoksyribonukleosider), et DNA-RNA chimerisk oligonuklotid eller en peptid-oligonukleotidchimer. Et bibliotek omfattende peptider, oligonukleotider eller peptid-oligonukleotidchimerer kan bli dannet ved en fremgangsmåte omfattende gjentagelse av følgende trinn: (a) tilveiebringing av minst så mange alikvoter av en fast fase bærer som antall forskjellige arter av bio-oligomersubenheter som blir tilsatt, men minst to, for å danne bio-oligomerene; (b) separat introdusere et sett subenheter til alikvotene av fast fase bæreren slik at en subenhet er introdusert til hver alikvot; (c) fullstendig kobling av subenhetene til vesentlig alle setene av fast fase bæreren for å danne en fast fase bærer/ny subenhetskombinasjon; (d) vurdering av fullført kobling, og om nødvendig, tvinge reaksjonen til fullførelse; (e) grundig blanding av alikvotene til fast fase bærer/ny subenhet kombinasjon; og, etter gjentagelse av trinnene (a)-(e) ønsket antall ganger, et endelig trinn omfattende: (f) fjerning av beskyttelsesgruppene slik at hver biologisk aktiv bio-oligomer forblir
koblet til fast fase bæreren.
I en ytterligere utføreisesform kan det tilfeldige bio-oligomerbiblioteket bli fremstilt slik at for minst et trinn blir den samme subenheten koblet til alle fast fase bærerene, og i minst et ytterligere
trinn blir minst to subenheter koblet til fast fase bæreren. Et tilfeldig bio-oligomerbibliotek kan bli dannet ved en gjentagelse av trinnene (a)-(f) ovenfor. I en annen utføreisesform kan tilfeldig bio-oligomerbibliotek bli dannet ved mer enn en gjentagelse av trinnene (a)-(f) ovenfor. En fastfase bærer kan være utstyrt med en eller flere subenheter som allerede er koblet.
Et bio-oligomerbibliotek kan bestå av et forutbestemt, begrenset antall subenheter. I en annen utføreisesform kan tilfeldig bio-oligomerbiblioteket være sammensatt av alle tilgjengelige subenhetene.
I en ytterligere utføreisesform kan en bio-oligomer av interesse bli identifisert i en sekvensiell prosess ved først å danne et bibliotek og identifisere en bio-oligomersekvens som demonstrerer egenskapene av interesse. En fast fase bærer omfattende den identifiserte bio-oligomersekvensen er følgelig blitt dannet. Et nytt segment av monomersubenhetsekvensene blir tilsatt til den tidligere identifiserte sekvensen, og en ny sekvens som omfatter en kjent sekvens og en tilfeldig sekvens som demonstrerer egenskapene av interesse blir identifisert. Denne sekvensielle optimiserings-randomiseringsstrategien muliggjør hurtig identifikasjon av en bio-oligomer av interesse.
Bio-oligomerene til biblioteket ifølge oppfinneslen kan være, men behøver ikke å være, tilstede i biblioteket i vesentlig ekvimolare mengder. Som kjent for fagfolk innenfor dette området er en molar mengde en konsentrasjon der en molekyl-vekt i gram (et mol) av en forbindelse blir oppløst i nok oppløsningsmiddel for å danne en liter oppløsning. Som anvendt heri, refererer "vesentlig ekvimolare mengder" av bio-oligomerer til monomere subenhetarter som er til stede i omtrent samme konsentrasjon. Dersom det i en samling av 150 000 bio-oligomerer, er bio-oligomer A til stede ved 200 pmol/liter vil resten av alle 150 000 bio-oligomerarter være tilstede i konsentrasjoner på omtrent 200 pmol/liter. Betegnelsen vesentlig ekvimolar mengde slik det anvendes her skal utligne for de forskjellige størrelsene av fast fase bærere. Heterogenisitet til fast fase bæreren resulterer i variasjon i mengden av bio-oligomer som kan bli koblet til en gitt bærer. 1 fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er minst to alikvoter av fast fase bæreren tiiveiebragt hvori antallet fast fase bærere i alikvoten fortrinnsvis tilsvarer minst det antall bio-oligomerer som skal bli syntetisert. Dette muliggjør dannelsen av et bibliotek hvor hver fast fase bærer inneholder en enkelt bio-oligomerart, dvs. "én kule-én bio-oligomer." Som anvendt heri refererer "alikvot" til en del som er en bestemt fraksjon av hele mengden av fast fase bærere.
5.2. Tilfeldig peptidbibliotek
I en spesiell utføreisesform kan tilfeldig bio-oligomerbiblioteket omfatte peptider. Betegnelsen "peptid" blir anvendt for å referere til en forbindelse av to eller flere subenheter av aminosyrer, aminosyreanaloger eller peptidetterlignere. Subenhetene kan bli koblet med peptid bind inger. I en annen utføreisesform kan subenheten bli koblet av andre bindinger, f.eks. ester, eter, osv. Som anvendt heri, angir betegnelsen "aminosyre" enten naturlig og/eller unaturlig eller syntetiske aminosyrer, inkludert glycin og både D eller L optiske isomerer, og aminosyreanaloger og peptidetterlignere. Et peptid av tre eller flere aminosyrer blir vanligvis betegnet et oligopeptid dersom peptidkjeden er kort. Dersom peptidkjeden er lang, blir peptidet vanligvis betegnet et polypeptid eller protein.
Foreliggende oppfinnelse er basert på syntetisk peptid kjemi og vedrører ikke noe levende system for amplifikasjon eller screening. Peptidbibliotekene kan innbefatte unaturlige aminosyrer. Peptidene ifølge oppfinnelsen kan derfor omfatte D-aminosyrer, en kombinasjon av D- og L-aminosyrer og forskjellige "konstruerte" aminosyrer (f.eks. ft-metylaminosyrer, Ca -metylaminosyrer og Na-metylaminosyrer, osv.) for å gi spesielle egenskaper tii peptidene i biblioteket. I tillegg ved å tildele spesifikke aminosyrer ved spesifikke koblingstrinn kan peptidbibliotek med a-helikser, IJ-dreininger, ft-platestruktur, a-dreininger og cykliske peptider bli dannet.
Biblioteket av peptidene ifølge oppfinnelsen omfatter alle mulige kombinasjoner av aminosyrer som peptidene er sammensatt av. Ved å anvende som et eksempel et dipeptid dannet av de to aminosyrene glycin og prolin, er det fire mulige kombinasjoner: glycin-glycin, glycin-prolin, prolin-glycin og prolin-prolin og det tilfeldige biblioteket vil inneholde alle fire kombinasjonene.
Et sett av første aminosyrer blir separat introdusert til hver alikvot. Generelt er aminosyrene som blir anvendt for peptidsyntesen den baselabile Na - aminobeskyttende 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc) aminosyrene først beskrevet av Carpino og Han (1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409). Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelsen kan også bli anvendt med Boc-aminosyrene (Na<->aminobeskyttet Na<->t-butyloksykarbonyl). Både Fmoc og Boe Na-aminobeskyttede aminosyrer kan bli oppnådd fra Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemieal, Bachem eller Peninsula Labs eller andre kjemiske firmaer som er kjente for fagfolk. I tillegg kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bli anvendt med andre N"-beskyttende grupper som er kjente for fagfolk innenfor dette området.
Ved å fortsette med dipeptideksemplet beskrevet ovenfor, vil det første settet av aminosyre som ble innført omfatte glycin og prolin og hver alikvot mottar enten
en N° -Fmoo-glycin eller en Na<->Fmoc-prolin.
Etter introduksjonen er settet av første aminosyrer fullstendig koblet til vesentlig alle setene av fast faste bæreren. Som anvendt heri, betyr fullstendig kobling at koblingsreaksjonen fortsetter til fullstendig kobling uansett forskjeller i
koblingsrater for de individuelle aminosyrene. Aminosyrene blir i tillegg koblet til vesentlig alle tilgjengelige koblingssetene på fast fase bæreren slik at hver fast fase bærer vil inneholde vesentlig bare en peptidart. Fullstendig kobling vil resultere i fast fase bærer/første aminosyrekombinasjoner. Ved anvendelse av dipeptidet beskrevet ovenfor som et eksempel, vil fullføring av koblingen gi en kule-glycinkombinasjon og en kule-prolinkombinasjon.
Kobling av aminosyrene kan bli oppnådd ved teknikker som er kjente for fagfolk innenfor dette området og beskrevet f.eks. av Stewart og Young, 1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Som kjent for fagfolk innenfor dette området omfatter fremgangsmåten for peptidsyntesen på faste bærere generelt dannelse av et peptid fra karboksyl eller C-terminalenden hvor den C-terminale aminosyrene med dets beskyttede a-aminogruppe er koblet til en fast fasepolymer. Den beskyttende gruppen blir deretter avspaltet og den neste aminosyren, også beskyttet, blir koblet med en peptidbinding til a-aminogruppen av aminosyren koblet til den faste bæreren. Cyklus som omfatter avspaltning av den tidligere aminosyren og kobling av den neste aminosyren blir gjentatt helt til peptidet er fullført. Eventuelle reaktive sidekjeder av aminosyrene blir beskyttet med kjemiske grupper som kan motstå binding og en a-avspaltningsprosedyre, men kan bli fjernet ved slutten av syntesen.
For å koble en aminosyre til den voksende syntetiske kjeden må karboksylgruppen til den blokkerte aminosyren bli aktivert. Mange aktiveringsmetoder kan bli anvendt ved utførelse av oppfinnelsen og omfatter f.eks. fordannede symmetriske anhydrider (PSA), fordannet blandet anhydrid (PMA), syreklorider, aktive estere og in situ aktivering av karboksylsyren, som beskrevet i Fields og Noble, 1990, "Solid phase peptfde synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxykarbonyl amino acids", Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214.
Anvendelse av Fmoc-aminosyrene er bare en strategi for peptidsyntesen. En Boe (t-butyloksykarbokyl-beskyttet aminogruppe)-strategi kan også bli anvendt for å danne et bibliotek av peptider bundet til fast fase bæreren (f.eks. Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods 102:259-274).
Om koblingen er fullført bør kontrolleres. Fagfolk er kjente med de velkjente kvantitative overvåkingstestene så som ninhydrid (Kaiser test), pikrinsyre, 2,4,6-trinitrobenzensulfon (TNBS), fluoreskamin og kloranil, som er basert på reagensreaksjoner med fri aminogruppe for å danne en kromofor forbindelse. Dersom iminosyrene (f.eks. Pro og Hyp) blir anvendt, er isatinovervåking en foretrukket metode. Fields og Noble, ovenfor. Kvantifisering av fullført reaksjon kan overvåkes i løpet av reaksjonsforløpet, f.eks. som beskrevet av Salisbury et al. (International Patent Publication no. WO 91/03485).
Med Fmoc-syntesen er Kaiser testen foretrukket. I Kaiser testen kan en prøve fra hvert rør bli testet med ninhydrinreagenset oppnådd fra Pierce Chemical med fremgangsmåten beskrevet av Sarin et al. (1981, Anal. Biochem. 117:147-157).
Dersom koblingsreaksjonen er ufullstendig som bestemt ifølge denne testen kan reaksjonen ble tvunget til å bli fullført ved flere metoder som er kjent innenfor fagområdet, inkludert (a) en andre kobling ved anvendelse av en til fem ganger overskudd av beskyttet aminosyre, (b) en ytterligere kobling ved anvendelse av forskjellige eller ytterligere oppløsningsmidler (f.eks. trifluoretan), eller (c) tilsetning av kaotrofiske salter, f.eks., NaC04 eller LiBr (Kiis og Stewart, 1990, "Peptides: Chemistry, Structure and Biology", Rivier and Marshall, eds., ESCOM Publ., s. 904-906).
Etter at koblingsreaksjonen er fullført blir alikvotene av fast fase bærer/første aminosyrekombinasjoner grundig blandet. Grundig blanding blir oppnådd når en jevn blanding av alikvotene er et resultat, fortrinnsvis ved blanding av alikvotene i en enkelt reaksjonsbeholder. Til tross for at en hvilken som helst måte for grundig blanding hører inn under rammen av denne oppfinnelsen, og forskjellige metoder er kjente for fagfolk innenfor dette området, omfatter foretrukne måter f.eks. vorteksing eller risting i en hvilken som helst kommersielt tilgjengelig motorisert risteapparatur eller ved "bobling" med inert gass, f.eks. nitrogen eller argon.
Den resulterende blandingen blir fordelt i minst to alikvotdeler. Disse alikvotdelene har likt volum og dersom blandingen var tilstrekkelig grundig, bør det inneholde vesentlig like mengder av fast fase bærer/første aminosyrekombinasjoner. Ved anvendelse av dipeptideksempelet vil hver alikvot inneholde vesentlig like mengder av kule-glycinkombinasjonen og kule-prolinkombinasjonen.
Til hver alikvot blir det separat innført et annet sett av aminosyrer. Dette andre settet kan bestå av (a) de samme aminosyrene tilsatt i det første settet, dvs. glycin eller prolin; (b) et annet sett av aminosyrer, f.eks. tryptofan eller leucin; (c) bare en type aminosyre, f.eks. isoleucin.
Som med det første settet av aminosyrer, blir det andre settet av aminosyrer fullstendig koblet individuelt til fast fase bærer/første aminosyrekombinasjonen av hver alikvot for å danne peptider omfattende en første aminosyre og en andre aminosyre. Som ved tidligere kobling, kan koblingen bli oppnådd ved en hvilken som helst teknikk anvendt innen området for slike reaksjoner. Ved anvendelse av dipeptideksemplet beskrevet ovenfor: (a) ved tilsetning av samme sett aminosyrer er de resulterende peptidene enten glycin-glycin, glycin-prolin, prolin-glycin, eller prolin-prolin; (b) med et annet sett aminosyrer, de resulterende peptidene er enten Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Trp eller Pro-Leu; (c) med en type aminosyre, de resulterende peptidene er Gly-lle eller Pro-lle.
Denne fremgangsmåten kan bli gjentatt så mange ganger som det blir tilsatt aminosyrer. Dersom peptidet av interesse er et tetrapeptid X-X-X-Trp, hvor X for eksempel enten er valin, serin eller alanin, f.eks., kan fremgangsmåten bli gjentatt tre ganger for å danne X-X-X-Trp-tetrapeptidet. I første, andre og tredje innføring av aminosyrer, blir enten l\T -Fmoc valin, Na -Fmoc-serin (0-Bu<1>), eller l\T -Fmoc alanin tilsatt til alikvotene av fast fase bæreren for å gi 27 forskjellige peptider med vesentlig ekvimolare mengder (figur 1). Dersom et heksapeptid er ønskelig, blir prosessen gjentatt seks ganger. Dersom heksapeptidet skal bestå av fem forskjellige aminosyrer, bør metoden utføres ved anvendelse av fem alikvoter som hver inneholder en annen aminosyre ved hvert koblingstrinn. Dersom heksapeptidet skal bestå av hvilke som helst av hovedsettet på 20 aminosyrer, bør fremgangsmåten bli anvendt ved anvendelse av tyve alikvoter ved hvert koblingstrinn.
Fremgangsmåten for peptidsyntese ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt med fast fase bærere hvorpå en aminosyre enten er eller enda ikke er koblet. I tillegg kan man anvende en linker som allerede er blitt koblet til fast fase bæreren. En vanlig bærer hvor en aminosyre allerede er bundet ft-alanin-PAM-harpiksen (oppnådd fra Bachem Biochemical). Disse harpiksene er tilgjengelige fra mange forskjellige kommersielle kilder eller legges i laboratoriet av en med kunnskap innenfor peptidsyntese.
Dersom en fast fase bærer/aminosyrekombinasjon eller fast fase/bærerlinker blir anvendt som opprinnelig reagens blir den delt inn i minst to alikvoter som hver mottar en aminosyre fra et første sett av aminosyrer. Som beskrevet ovenfor, blir første settet av aminosyrer fullstendig koblet til vesentlig alle bindingssetene på fast fase bærer/aminosyrekombinasjonen eller fast fase bærer/linker og alikvoter inneholdende disse nylig tilsatte aminosyrene blir grundig blandet. Som beskrevet ovenfor, blir blandingen delt inn i minst to alikvoter og hver alikvot mottar en aminosyre fra et andre sett av aminosyrer, og koblingsreaksjonen blir gjentatt for å danne et voksende peptid. Som beskrevet ovenfor kan prosessen blir gjentatt så mange ganger som det er ønskelig å produsere peptidene av interesse.
Denne fremgangsmåten kan bli anvendt for syntese av tilfeldige peptider samt for syntese av et peptidbibliotek som omfatter på forhånd bestemte sekvenser. Syntesen av på forhånd bestemte sekvenser innbefatter anvendelse av spesifikke fsT-Boc-, Na<->Fmoc- eller andre hensiktsmessige beskyttede aminosyrer under de spesifikke koblingstrinn. Man kan f.eks. selektere aminosyrer ved spesifikke koblingstrinn slik at de resulterende peptidene vil ha en sannsynlighet eller preferanse for en bestemt sekundær struktur, f.eks. ft-platestruktur, a-heliks, R-dreining osv. For eksempel kan a-heliks være foretrukket dersom Glu, Ala, Leu, His, Trp blir anvendt som foretrukne aminosyrer, men IJ-platestruktur vil være foretrukket dersom Val, Ile, Tyr og Met blir anvendt. Dersom Gly, Asn, Ser, Pro, Asp blir anvendt, vil en B-dreiningsstruktur være foretrukket. Andre eksempler vil bli betraktet så som sure aminosyrer nær N-terminalen, og basiske aminosyrer nær C-terminalen, for åstabilisere en a-heliks. D-aminosyrene kan stabilisere visse dreininger og mange andre strukturelle motiver kan inkorporeres (se seksjonene 5.2.1 og 5.2.2., nedenfor). Det kan til og med være mulig å danne cykliske peptidbibliotek med disulfid, laktam, lakton eller andre ringlukkende andeler (se seksjon 5.2.1., nedenfor.)
Det er å bemerke at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør syntese av peptider slik at hver fast fase bærer, så som en harpikskule, vil inneholde bare en type peptid. Fremgangsmåten sikrer at hver individuelle harpikskule er i kontakt med bare en Fmoc-aminosyre i løpet av hver koblingssyklus og at koblingen er fullstendig." En kule-et peptid" -syntesen muliggjør forøket sensitivitet og effektivitet ved isolering av peptidet som er spesifikt for enheten som den bindes til.
Fremgangsmåten kan enkelt anvendes for å muliggjøre syntesen av en tilfeldig peptidblanding med 10<5> til 107 forskjellige peptidarter.
I et aspekt av oppfinnelsen kan peptidene ifølge biblioteket omfatte en spesialaminosyre ved C-terminusen som inkorporerer enten en CO2H- eller CONH2- sidekjede for åsimulere en fri glycin eller en glycin-amidgruppe. En annen måte å betrakte dette spesielle residiet ville bli som en D-eller L-aminosyreanalog med en sidekjede bestående av linkeren eller bindingen til kulen. I en utføreisesform kan det pseudo-frie C-terminale residiet ha D eller L optisk konfigurasjon og i en annen utfrelsesform kan en rasemisk blanding av D- og L-isomerene bli anvendt.
I en ytterligere utføreisesform kan pyroglutamat bli innbefattet som det N-terminale residiet til peptidene ifølge biblioteket. Til tross for at pyroglutamat ikke kan sekvenseres ved Edman degradering, vil det ved begrensende substitusjon til bare 50% av peptidene på en gitt kule med N-terminal pyroglutamat gjenstå nok ikke-pyroglutamatpeptid på kulen for sekvensering. Fagfolk vil lett oppdage at denne teknikken kan bli anvendt for sekvensering av et hvilket som helst peptid som inkorporerer et residie som er resistent overfor Edman degradering ved N-terminusen. Andre metoder for å karakterisere individuelle peptider som demonstrerer ønsket aktivitet er beskrevet i detalj nedenfor. Den spesifikke aktiviteten til et peptid som omfatteren blokkert N-terminal gruppe, f.eks., pyroglutamat, når den bestemte N-terminale gruppen er til stede i 50% av peptidet, vil lett bli demonstrert ved å sammenligne aktiviteten tii et fullstendig (100%) blokkert peptid med et ikke-blokkert (0%) peptid.
I en ytterligere utføreisesform vil subenheter av peptider som utviser nyttige kjemiske og strukturelle egenskaper bli valgt. For eksempel peptider omfattende D-aminosyrer vil være resistente overfor L-aminosyre-spesifikke proteaser in vivo. Foreliggende oppfinnelse betrakter i tillegg preparering av biblioteker av peptider som har mere veldefinerte strukturelle egenskaper, og anvendelse av peptidomimetiks og peptidomimetiksbindinger, så som esterbindinger, for å danne bibliotek med nye egenskaper. I en annen utføreisesform kan et peptidbibliotek bli dannet som inkorporerer en redusert peptidbinding, dvs. R-|-CH2-NH-R2, hvor Ri og R2 er aminosyreresidier eller sekvenser. En redusert peptidbinding kan bli innført som en dipeptidsubenhet. Et slikt molekyl vil være resistent overfor hydrolyse av peptidbindingen, f.eks., proteaseaktivitet. Slike bibliotek vil tilveiebringe ligander med unik funksjon og aktivitet, så som utvidet halveringstider in vivo forårsaket av resistens overfor metabolittisk nedbrytning, eller proteaseaktivitet. Det er videre velkjent at i visse systemer utviser tvungede peptider forsterket funksjonell aktivitet (Hruby, 1982, Life Sciences 31:189-199; Hruby et al., 1990, Biochem J. 268:249-262); og foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å produsere et tvunget peptid som inkorporerer tilfeldige sekvenser ved alle andre posisjoner.
5.2.1 . Tvunaede oa cvkliske peptider
Et tvunget, cyklisk eller rigidgjort peptid kan bli dannet ifølge fremgangsmåten
beskrevet ovenfor, forutsatt at i minst to posisjoner i sekvensen til alle peptidene i biblioteket blir en aminosyre eller aminosyreanalog skutt inn som tilveiebringer en kjemisk funksjonell gruppe med evne for kryssbinding for å tvinge (constrain), cyklisere eller rigidgjøre peptidet etter behandling for å danne kryssbindingen. Cyklisering vil bli foretrukket når en dreinings-induserende aminosyre blir inkorporert. Eksempler på aminosyrer som kan kryssbinde et peptid er cystein for ådanne disulfider, asparaginsyre for å danne en lakton eller en laktam, og en chelator så som y-karboksylglutaminsyre (Gla) (Bachem) for å chelatere et overgangsmetall og å danne en kryssbinding. Beskyttet y-karboksylglutaminsyre kan bli dannet ved modifisering av syntesen beskrevet av Zee-Cheng og Olson (1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 94:1128-1132). Et peptidbibliotek hvor peptidsekvensen omfatter minst to aminosyrer med evne for kryssbinding kan bli behandlet f.eks. ved oksydasjon av cysteinresidiene for å danne et disulfid eller addisjon av et metallion for ådanne et chelat, for åkryssbinde peptidet og danne et tvunget, cyklisk elle rigidgjort peptid.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et sett med generelle rigid-motiver for anvendelse ved preparering av bibliotekene ifølge foreliggende oppfinnelse. I en utføreisesform vist i figur 2a, blir to par med kryssbindende residier arrangert for å danne en "kurv". Et slikt "kurv" motiv kan ha spesiell anvendelse som en katalyttisk lomme, i tillegg til nye bindingsegenskaper som er et resultat fra dets tvungede konformasjon. I en annen utføreisesform omfattende to par kryssbindende residier kan et "stige" motiv, vist i figur 2b, bli konstruert. Ved den alternerende bruken av D- og L-aminosyrene i et "stige" motiv, kan et peptid hvor alle sidekjedene blir orientert i en overflate, analogt med R-barrel som finnes i gramicidir, bli preparert. En slik overflate kan potensielt gi et unikt katalytisk sete. I en ytterligere utføreisesform kan et enkelt "lasso" motiv bli dannet hvor to residier danner en kryssbinding, som vist i figur 2c. I tillegg til åtilveiebringe en peptidløkke vil et kortere "lasso" motiv resultere i et konformasjonstvunget lineært peptid som derved stabiliserer sekundær struktur, f.eks. en alfa heliks.
Det er videre betraktet at interpeptidkryssbindere kan bli dannet som resulterer i en rigid peptid matrise.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer strategier for systematisk preparering av kryssbindere. Dersom f.eks. fire cysteinresidier er inkorporert i peptidsekvensen, kan forskjellige beskyttelsesgrupper bli anvendt (Hiskey, 1981, i The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press: New York, s. 137-167; Ponsanti et al., 1990, Tetrahedron 46:8255-8266). Det første cysteinparet kan bli avbeskyttet og oksydert. På denne måten kan et definert sett av disulfidkryssbindere bli dannet. Alternativt kan et cysteinpar og et par chelaterende aminosyreanaloger bli inkorporert slik at kryssbinderene har forskjellig kjemisk natur.
5.2.2. lkke- klassiske aminosyrer som induserer tvungenhet i konformasionen Følgende ikke-klassiske aminosyrer kan bli inkorporert i det tilfeldige peptidbiblioteket for å introdusere bestemte konformasjonsmotiver: 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-3-karboksylat (Kazmierski et al., 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-metylfenylalanin, (2S,3R)-metylfenylalanin, (2R.3S)-metylfenylalanin og {2R,3R)-metylfenylalanin (Kazmierski og Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.); 2-aminotetrahydronaftalen-2-karboksylsyre (Landis, 1989, Ph. D. Thesis, University of Arizona); hydroksy-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-3-karboksylat (Miyake et al., 1989, J. Takeda Res. Labs. 43:53-76); li-karbolin (D og L) (Kazmierski, 1988, Ph.D. Thesis, University of Arizona); HIC (histidinisokinolinkarboksylsyre) (Zechel et al., 1991, Int. J. Pep. Protein Res.
43); og HIC (histidincyklisk urea) (Dharanipragada).
Følgende aminosyreanaloger og peptidetterliknere kan bli inkorporert i et selektert bibliotek for å indusere eller favorisere spesifikke sekundære strukturer: LL-Acp (LL-3-amino-2-propenidon-6-karboksylsyre), en IJ-dreiet induserende dipeptidanalog (Kemp et al., 1985, J. Org. Chem. 50:5834-5838); ft-arkinduserende analoger (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); ft-dreiede induserende analoger (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5057-5060); a-heliksinduserende analoger (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:4935-4938); y-dreiende induserende analoger (Kemp et al., 1989, J. Org. Chem. 54:109-115); og analoger som er tilveiebragt ved følgende referanser: Nagai og Sato, 1985, Tetrahedron Lett. 26:647-650; DiMaio et al., 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans. s. 1687; og også en Gly-Ala dreiet analog (Kahn et al., 1989, Tetrahedron Lett. 30:2317); amidbindingisosterer (Jones et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856); tretrazol (Zabrocki et al., 1988, J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880); DTC (Samanen et al., 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509); og analoger beskrevet i Olson et al., 1990, J. Am. Chem. Sei. 112:323-333 og Garvey et al., 1990, J. Org. Chem. 56:436.
Til tross for at foregående ikke-klassiske peptider og peptidetterliknere kanskje ikke kan anvendes for klassisk Edman degraderingssekvensanalyse, kan en kombinasjon av opprinnelig Edman degradering etterfulgt av aminosyreanalyse av den gjenværende kjeden bli anvendt for å bestemme strukturen til et peptid med ønsket aktivitet. Alternativt kan massespektralanalyse bli anvendt.
5.2.3. Derivatiserte og modifiserte peptider
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre modifikasjon eller derivatisering av peptider i et bibliotek. Modifikasjoner av peptider er velkjent for fagfolk innenfor dette området og omfatter fosforylering, karboksymetylering og acylering. Modifikasjoner kan bli oppnådd kjemisk eller enzymatisk.
I et annet aspekt, kan glykosylerte eller fettacylerte peptidderivater bli fremstilt. Fremstilling av glykosylerte eller fettacylerte peptider er velkjent innenfor fagområdet som eksemplifisert i følgende referanser: 1. Garg og Jeanloz, 1985, i Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press.
2. Kunz et al. i Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308.
3. Horvat et al., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 31:499-507.
4. Bardaji et al., 1990, Ang. Chem. Int. Ed. English, 23:231.
5. Toth et al., 1990, i Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, s. 1078-1079.
6. Torres et al., 1989, Experientia 45:574-576.
7. Torres et al., 1989, EMBO J. 8:2925-2932.
8. Hordever and Musiol, 1990, i Peptides: Chemistry, Structure and Biology, loe. eit, s. 811-812. 9. Zee-Cheng og Olson, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 94:1128-1132.
10. Marki et al„ 1977, Heiv. Chem. Acta., 60:807.
11. Fuju et al., 1987, J. Chem. Soc. Chem. Commun., s. 163-164. 12. Ponsati et al., 1990, Peptides 1990, Giralt and Andreu, eds., ESCOM Publ., s. 238-240. 13. Fuji et al., 1987,1988, Peptides: Chemistry and Biology, Marshall, ed., ESCOM Publ.,
Leiden, s. 217-219.
Det er to hovedklasser av peptid-karbohydratbindinger. Eterbindinger kobler serin eller treoninhydroksyl til en hydroksyl av sukkeren. For det andre kobler
amidbindingene glutamat eller aspartatkarboksylgrupper til en aminogruppe på sukkeren. Referansene 1 og 2, ovenfor, beskriver spesielt fremgangsmåter for fremstilling av peptid-karbohydratetere og amider. Acetal og ketalbindinger kan også binde karbohydrat til peptid.
Fettacylpeptidderivater kan også bli preparert. For eksempel og uten å være begrenset derav, kan en fri aminogruppe (N-terminal eller lysyl) bli acylert, f.eks. myristoylert. I en annen utføreisesform kan en aminosyre omfattende en alifatisk sidekjede med struktur (CH2)nCH3 bli inkorporert i peptidene til biblioteket. Disse og andre peptid-fettsyrekonjugater egnede for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er beskrevet i U.K. patent GB-8809162.4, internasjonal patentsøknad PCT/AU89/00166 og referanse 5, ovenfor.
5.3. Tilfeldige oligonukleotidbibliotek
Fremgangsmåten for fremstilling av et selektert bibliotek bestående av nukleinsyre kan bli tilpasset for fast fasesyntese av DNA ved fosforamidatmetoden konstruert av Caruthers (1985, Science 230:281; Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymology 154:287-313).
Både silika-basert uoppløselig polymerisk bærer samt beskyttede deoksynukleosider er kommersielt tilgjengelig (f.eks. Peninsula Laboratories, Inc., California, Applied Biosystems, Inc.). Eksempler på beskyttede deoksynukleosider er 5'-0-dimetoksytrityldeoksytymidin, 5'-0-dimetoksytrityl-4-N-benzoyldeoksycytidin, 5-0-dimetoksytrityl-N-benzoyldeoksyadenosin, og 5-0-dimetoksytrityl-N-isobutyldeoksyguanosin. Andre spesifikke beskyttelsesgrupper kan bli anvendt avhengig av anvendelsen. De tilsvarende deoksynukleosid 3'-fosforamiditer kan bli syntetisert og deretter koblet til den faste bæreren ifølge Caruthers et al., 1987, ovenfor. Det første deoksynukleosidet kan bli fiksert f.eks. som deoksyadenosin. Etter detritylering og vasking med diklormetan etterfulgt av acetonitril, blir den faste bæreren separert i fire like alikvoter og overført til fire separate reaksjonsbeholdere. De fire deoksynukleosid 3'-fosforamiditene blir deretter tilsatt individuelt inn i de fire separate reaksjonsbeholderene. Etter endt kobling, blir de faste bærerne fra de fire reaksjonsbeholderene blandet sammen, grundig vasket og deretter utsatt for oksydering med en blanding av l2/H20/lutidin/THF. Etter oksydering, blir den faste bæreren grundig vasket med acetonitril og ovennevnte cyklus blir gjentatt. Etter at den tilfeldige polydeoksynukleotidkjedesyntesen er blitt fullført (f.eks. etter 11 koblingstrinn), vil metyletergruppene bli spaltet av tiofenol og DMT gruppen vil bli spaltet av trikloreddiksyre. Avspaltede polynukleotidkjeder kan forbli kovalent koblet til den faste bæreren (når hensiktsmessige linkere er valgt), klar til bruk i valgt screeningsmetodologi som beskrevet ovenfor.
Foreliggende oppfinnelse beskriver at oligonukleotider med andre enn fosfodiesterbindinger kan bli anvendt. For eksempel kan et oligonukleotid inkorporere en fosforotionatbinding. Andre modifiserte fosfordiesterbindinger eller bindingsanaloger er velkjente innenfor dette området. Slike modifiserte bindinger er kjent for å være resistente overfor eksonuklease- og endonukleaseaktivitet. På grunn av at det er bare fire DNA eller RNA nukleosider pr. koblingstrinn, vil det i et bibliotek med 12 nukleosidbaser være 4<12> mulige polynukleotidsekvenser, dvs. totalt 1,68 x 107 muligheter. Et oligonukleotid kan bli syntetisert ved anvendelse av både DNA og RNA nukleosider. Fagfolk er klarover at det i tillegg til de viktigste nukleosidene kan uvanlige og modifiserte nukleosider også bli anvendt. Uvanlige og modifiserte nukleosider omfatter inosin, metylerte purinnukleosider, uridinderivater og 2-0-metylribose som kan oppstå med et hvilket som helst ribonukleosid.
5.4. Fase fase bærere oa linkere for anvendelse i et tilfeldig bio-oli<g>omerbibliotek
En fast fase bærer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse vil være inert overfor reaksjonsbetingelsene for bio-oligomersyntese, f.eks. peptidsyntese eller oligonukleotidsyntese eller begge. En fast fase bærer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse må ha reaktive grupper for å koble en monomerenhet, eller for kobling av en linker eller utspring som kan virke som det første bindingspunktet for en monomersubenhet. I en utføreisesform kan fast fase bæreren være egnet for in vivo anvendelse, dvs. den kan virke som en bærer for eller bærer for direkte applikasjoner av bio-oligomerbiblioteket (f.eks. TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, Tyskland; se seksjon 5.8., nedenfor). I en bestemt utføreisesform kan fast fase bæreren være velsmakende og oralt konsumerbar.
I en annen utføreisesform kan fast fase bæreren være en nyttig kromatografisk bærer.
Som anvendt heri, er fast fase bæreren ikke begrenset til en spesifikk type bærer. Et stort antall bærere er tilgjengelige og er kjent for fagfolk innenfor dette området. Fast fase bærere omfatter silikageler, harpikser, derivatiserte plastfilmer, glasskuler, bomull, plastkuler, aluminiumoksydgeler, En egnet fast fase bærer kan bli valgt på grunnlag av ønsket sluttbruk og egnethet for forskjellige syntetiske protokoller. For eksempel på peptidsyntese kan fast fase bæreren være harpikser så som polystyren (f.eks. PAM-harpiks oppnådd fra Bachem Inc., Peninsula Laboratories, ete.), POLYHIPE harpiks (oppnådd fra Aminotech, Canada), polyamidharpiks (oppnådd fra Peninsula Laboratories), polystyrenharpiks podet med polyetylenglykol (TetaGel, Rapp Polymere, Tubingen, Tyskland) elelr polydimetylakrylamidharpiks (oppnådd fra Milligen/Biosearch, California). I en foretrukket utførelse for peptidsyntese refererer fast fase bæreren til polydimetylakrylamidharpiks.
Fast fase bærerne kan også omfatte en linker. Som anvendt heri, refererer en linker til et hvilket som helst molekyl som tilveiebringer rommelig avstand mellom bæreren og peptidet som skal bli syntetisert. Linkerene kan bli koblet kovalent på fast fase bæreren før kobling til en Na<->Boc eller NT<->Fmoc eller på annen måte hensiktsmessige beskyttede aminosyrer. Forskjellige linkere kan bli anvendt for å koble oligomeren til fast fase bæreren. Eksempler på linkere omfatter aminosmørsyre, aminokapronsyre, 7-aminoheptansyre og 8-aminokaprylsyre. Fmoc-aminokapronsyre er kommersielt tilgjengelig fra Bachem Biochem, og er den foretrukne formen. I en ytterligere utføreisesform kan linkere i tillegg omfatte en eller flere IJ-alaniner som spacere. 1 tillegg kan fastbæreren bli modifisert for åoppfylle spesifikke krav for den spesielle hensikten i bioanalysen eller deteksjonen. Modifikasjon av fast fase bæreren kan bli utført ved inkorporering av en spesifikk linker. For eksempel kan modifisert fast fase bærer bli gjort syre-sensitiv, base-sensitiv, nukleofil-sensitiv, elektrofil-sensitiv, fotosensitiv, oksidasjonssensitiv eller reduksjonssensitiv.
I tillegg til linkerene beskrevet ovenfor, kan selektivt spaltbare linkere bli anvendt. Anvendelse av en ultrafiolett lyssensitiv linker, ONb, er vist i seksjon 12, ovenfor (se Barany og Albenicia, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942). Andre spaltbare linkere krever hydrogenolyse eller fotolyse. Eksempler på fotosensitive (fotospaltbare) linkere finnes i Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer et al. (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:41-45), og Kreib-Cordonier et al. (1990, i Peptides -Chemistry, Structure and Biology, Rivier og Marshall, eds., s. 895-897). Landen (1977, Methods Enzym. 47:145-149) anvendte vandig maursyre for spalte Asp-Pro bindinger. Denne måten er blitt anvendt for å karakterisere T-celledeterminanter i sammenheng med Geysen pinsyntesemetoden (Van derZee et al., 1989, Eur.J. Immunol. 191:43-47). Andre potensielle linkergrupper som er spaltbare under basiske betingelser omfatter de som er basert på p-(hydroksylmetyl)benzosyre (Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin 1:538-546) og hydroksyeddiksyre (Baleaux et al., 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28). Geysen et al. (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33) rapporterte peptidspaltning ved en diketopiperazinmekanisme. Et enzym kan spesifikt spalte en linker som omfatter en sekvens som er sensitiv eller et substrat for enzymspaltning, f.eks. proteasespaltning av et peptid; endonukleasespaltning av et oligonukleotid. I visse tilfeller kan man derivatisere 10-50% av harpiksen ved substitusjon med den spaltbare linkere, og gjenværende 50-90% substituert med en ikke-spaltbar linker for å forsikre at tilstrekkelig peptid vil forbli etter spaltning av linkeren for sekvensering. Kombinasjoner av spaltbare linkere kan også bli anvendt for muliggjøre sekvensiell spaltning fra en enkelt kule.
En fast fase bærer for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan videre omfatte en bio-oligomer av interesse hvortil en tilfeldig subenhetsekvens kan bli tilsatt. Den pre-koblede bio-oligomeren kan bli valgt ifølge fremgangsmåter beskrevet heri, eller kan omfatte en sekvens kjent å ha de ønskede egenskapene.
Ved syntese av oligonukleotider kan en silikabasert fast fase bærer være foretrukket. Som diskutert i seksjon 5.3., ovenfor, er silikabaserte fast fase bærere kommersielt tilgjengelig (f.eks. fra Peninsula Laboriatories, Inc., og Applied Biosystems, Inc.).
5.5. Fremgangsmåter for deteksjon og identifikasjon av bio- oligomerer av
interesse
I tillegg til å tilveiebringe sanne tilfeldige biblioteker av bio-oligomerer, og fremgangsmåte for syntese derav omfatter foreliggende oppfinnelse videre en fremgangsmåte for screening av et bio-oligomerbibliotek for å identifisere bio-oligomerer innenfor biblioteket som demonstrerer en biologisk aktivitet av interesse, så som binding, stimulering, inhibisjon, toksisitet, smak osv. Andre bio-oligomerbibliotek kan bli screenet ifølge fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for enzymaktivitet, enzyminhibitorisk aktivitet og kjemiske og fysiske egenskaper av interesse.
Bio-oligomerene av interesse oppdaget i løpet av en innledende screening trenger ikke å være de endelige ligandene. Det er foretrukket å syntetisere et bibliotek nummer to basert på de vanlige sekvensene til ligandene valgt i løpet av den første screeningen. På denne måten kan man identifisere ligandene med selv høy aktivitet forutsatt at den andre screeningen blir utført under betingelser med høy stringenthet.
5.5.1. Bindirtqsanalvser
Foreliggende oppfinnelse muliggjør identifikasjon av bio-oligomerligander som binder akseptormolekyler. Som anvendt heri, refererer betegnelsen "akseptormolekylet<n> en hvilken som helst forbindelse som bindes til en bio-ofigomerligand. Akseptormolekyler kan være et biologisk makromolekyl så som, men ikke begrenset til, antistoffer, reseptorer eller vimser. I tillegg kan akseptormolekylene være en kjemisk forbindelse så som, men ikke begrenset til, proteiner, karbohydrater, nukleinsyrer, lipider, medikamenter, metaller eller små molekyler. Bio-oligomerbiblioteket ifølge oppfinnelsen kan potensielt reagere med mange forskjellige akseptormolekyler. Ved identifisering av den bestemte bio-oligomerarten som et spesifikt akseptormolekyl er bundet til, er det mulig åfysisk isolere bio-oligomerartene av interesse.
På grunn av at bare et lite antall kuler vil bli fjernet i løpet av hvert screening/deteksjon/isoleringstrinn, vil hovedmengden av kulene forbli i blandingen. Derfor kan det tilfeldige bio-oligomerbiblioteket bli anvendt mange ganger. Dersom forskjellige farger eller identifikasjonsskjemaer blir anvendt for forskjellige akseptormolekyler (f.eks. med fluorescensrapporterende grupper så som fluorescein (grønn), Texasrød (rød) og DAPl (blå) koblet på akseptorene), og med egnede eksitasjonsfiltere i fluorescensmikroskop eller fluorescensdetektoren, kan forskjellige akseptorer (reseptorer) bli tilsatt til et peptidbibliotek og vurdert samtidig for å muliggjøre hurtig screening for spesifikke ligander. Disse strategiene reduserer ikke bare kostnaden, men øker også antallet akseptormolekyler som kan bli screenet.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir et akseptormolekyl av interesse introdusert tii biblioteket av bio-oligomerene hvor det vil gjenkjenne og binde et eller flere bio-oligomerarter innenfor biblioteket. Hver bio-oligomerart som akseptormolekylet er bundet til finnes på en enkelt fast fase bærer stik at bæreren, og dermed bio-oligomeren, lett kan bli identifisert og isolert.
Bio-oligomeren kan bii isolert ved en hvilken som helst konvensjonell måte kjent for fagfolk innenfor området og oppfinnelsen er ikke begrenset av fremgangsmåten for isolering. For eksempel og uten å være begrenset derav, er det mulig å fysisk isolere en fast fase bærer/bio-oligomerkombinasjon som utviser sterkest fysisk-kjemisk interaksjon med det spesifikke akseptormolekylet. I en utføreisesform basert på fysisk-kjemisk interaksjon er en oppløsning av et spesifikt akseptormolekyl tilsatt til et tilfeldig peptidbibliotek som er ekvivalent med omtrent 10<5> til 107 fast fase bærere. Akseptormolekylet blir inkubert med harpiksen i en tid som er tilstrekkelig for å muliggjøre kobling mellom peptidet og antistoffet, f.eks., 1 time ved 22°C. Deretter blir akseptormolekylbelagt bio-oligomer (fast fase bærer) isolert. Mer spesifikke utførelsesformer er angitt i følgende fremgangsmåter som beskriver anvendelsen av et monoklonalt antistoff som et oppløselig akseptormolekyl. Disse fremgangsmåtene kan lett bli tilpasset for å detektere binding av et hvilket som helst akseptormolekyl. Til tross for at følgende refererer til bibliotek av peptider, er det åbemerke at bibliotekene til oligonukleotidene eller peptid-oligonukleotidchimerer også kan bli analysert. (i) Det monoklonale antistoffet blir først merket med en fluorescensdel eller "fluorescensbehandlet" ved teknikker som hører inn under dette området og som er kjent for fagfolk. Antistoffet ved en konsentrasjon på 1 ug/ml blir deretter ført inn i biblioteket av peptider og etter forsiktig blanding ved 22°C i 1 time blir fast fase bærerne vasket og fluorescensantistoff fast fase bærer/peptidkombinasjonene blir identifisert og isolert med en fluorescensaktivert cellesorterer. Alternativt blir fluorescensantistoff fast fase bærer/peptidkombinasjonene identifisert og fysisk plukket opp under et diseksjonsmikroskop med fluorescenskobling ved anvendelse av en mikromanipulator. Den relative intensiteten til fluorescensen er generelt proporsjonal med affiniteten til peptid-liganden overfor det monoklonale antistoffet. (ii) Det monoklonale antistoffet blir først konjugert på jern-magnetiske kuler ved teknikker som er rutinemessige innenfor dette området. Det konjugerte antistoffet i en konsentrasjon på 1 ug/ml blir deretter inkubert med biblioteket i 1 time ved 22°C. De magnetiske kulene vil danne en rosett rundt fast fase bæreren/peptidet av interesse som deretter kan bli fysisk isolert med en sterk magnet. (iii) Det monoklonale antistoffet blir først konjugert til et enzym så som alkalisk fosfatase ved teknikker som er rutinemessige innenfor dette området. Dette antistoff-enzymkonjugatet blir deretter inkubert med det tilfeldige peptidbiblioteket i 30 minutter til 1 time ved 22°C. Etter vasking blir hele biblioteket helt inn i en petriskål som inneholder et substrat for alkalisk fosfatase, f.eks., 5-brom-4-klor-3-indoylfosfat (BCIP) og nitro-blå tetrazoleum (NBT). Etter inkubering i flere minutter, forandrer antistoff-fast fase bæreren/peptidkombinasjonen farge (blir blå) på grunn av presipitasjon av det omdannede substratet på fast fase bæreren, og kan lett bli identifisert og isolert fysisk under et disekerende mikroskop med en mikromanipulator. Den relative intensiteten til fargereaksjonen er generelt proporsjonal med affiniteten til peptidet for det gjeldende monoklonale antistoffet. (iv) Det monoklonale antistoffet blir først konjugert til et enzym så som pepperrotperoksydase ved teknikker som er rutinemessige innenfor dette området. Dette antistoff-enzymkonjugatet blir deretter inkubert med det tilfeldige peptidbiblioteket i 30 minutter til 1 time ved 22°C. Etter vasking blir hele biblioteket helt inn i en petriskål som inneholder et substrat for peroksydase, f.eks. 3,3',4,4-diaminobenzidin (DAB); 3,3',5,5-tetrametylbenzidin (TMB) eller 4-klor-1-naftol (4CN). Etter inkubering i flere minutter av antistoff-fast fase bæreren/peptidkombinasjonen forandrer farge og kan bli identifisert og isolert fysisk underet dissekerende mikroskop med en mikromanipulator. Den relative intensiteten til fargereaksjonen er generelt proporsjonal med affiniteten til peptidet for det gjeldende monoklonale antistoffet. (v) Det monoklonale antistoffet blir først merket med biotin eller "biotinylert" ved teknikker som er rutinemessige innenfor dette området og blir deretter inkubert med et tilfeldig peptidbibliotek i 30 minutter til 1 time ved 22°C. Etter vasking, blir et streptavidin-alkalisk fosfatase eller streptavidin-pepperrotperoksydasekompleks tilsatt og inkubert i 30 minutter. Bæreren blir deretter vasket og farven blir utviklet som beskrevet ovenfor i (iii) med enzym-metoden. Peptidet/fast fase bæreren av interesse blir fysisk isolert som ovenfor.
I tillegg til anvendelse av oppløselige akseptormolekyler, i en annen utføreisesform, er det mulig å detektere bio-oligomerer som bindes til celleoverflatereseptorer ved anvendelse av intakte celler. Anvendelse av intakte celler er foretrukket for anvendelse med reseptorer med multi-subenheter eller labile eller med reseptorer som krever at lipiddomenen til cellemembranen er funksjonell. Cellene anvendt i denne teknikken kan være enten levende eller fikserte celler. Cellene vil bli inkubert med det tilfeldige peptidbiblioteket og vil bli bundet til visse peptider i biblioteket for å danne en "rosett" mellom målcellene og den relevante fast fase bæreren/peptidet. Rosetten kan deretter bli isolert ved differensialsentrifugering eller fjernet fysisk under et disseksjonsmikroskop. Alternativt, kan man screene biblioteket ved anvendelse av en panningprosedyre med cellelinjer så som (i) en "parental" cellelinje hvor reseptoren av interesse er fraværende fra celleoverflaten og (ii) en reseptorpositiv cellelinje, f.eks. en cellelinje som er avledet ved transfektering av den parentale linjen med genet kodende for reseptoren av interesse. Oet er deretter mulig å screene biblioteket ved følgende strategi: (i) først tappe biblioteket for uspesifikke kuler som vil bli bundet til cellene som mangler reseptoren ved å innføre et monolag av parental cellelinje ved standard "panningteknikk" for å etterlate reseptorspesifikke ikke-bindende kuler, eller relevante ikke-bindende kuler (ii) fjerne de ikke-bindende kulene som vil innbefatte reseptor-spesifikke eller irrelevante kuler og appiisering av disse på et monolag av reseptorpositiv cellelinje hvor den reseptor-spesifikke kulen vil bli bundet til den reseptorpositive cellelinjen, (iii) fjerne gjenværende irrelevante ikke-bindende kulene ved forsiktig vasking og dekantering, og (iv) fjerne den reseptor-spesifikke kulen(ene) med en mikromanipulator.
Som et alternativ til helcelleanalyser for membranbundede reseptorer eller reseptorer som krever at lipiddomenen til cellemembranen er funksjonell kan reseptormolekylene bli rekonstituert til liposomer hvor den rapporterende gruppen eller enzymet kan bli koblet.
Til tross for at de foregående eksemplene refererer til peptidligander, kan hvilken som helst av bio-oligomerene beskrevet i seksjonene 5.1., 5.2 og 5.3, ovenfor, bli anvendt ved utførelse av foreliggende oppfinnelse. Akseptormolekylet kan derfor bli bundet til ikke-klassiske, sirkulariserte, konformasjonsinfluerte eller strukturelt tvungede peptider, til oligonukleotider eller til peptid-oiigonukleotidchimerer.
I en utføreisesform, kan akseptormolekylet bli merket direkte. I en annen utføreisesform kan et merket sekundært reagens bli anvendt for å detektere bindingen av et akseptormolekyl til en fast fase bærer som inneholder en bio-oligomer av interesse. Binding kan bli detektert ved in situ dannelse av en kromofor av en enzymmarkør. Egnede enzymer omfatter, men er ikke begrenset til, alkalisk fosfatase og pepperrotperoksydase. I en ytterligere utføreisesform kan en tofargeanalyse ved anvendelse av to kromogene substrater med to enzymer merket på forskjellige akseptormolekyler av interesse bli anvendt. Kryss-reaktive og enkelt-reaktive ligander kan bli identifisert med en tofargeanalyse.
Andre markører for anvendelse i oppfinnelsen omfatter fargede latekskuler, magnetiske kuler, fluorescensmarkører (f.eks. fluorescensisotiocyanat (FITC), fykoerytrin (PE), Texasrød (TR), rodamin, frie eller chelaterte lantanidseiresalter, spesielt Eu<3+>, for å nevne noen fluoroforer), kjemiluminiscensmolekyler, radio-isotoper eller magnetisk resonansbilleddannende markører. Tofargeanalysene kan bli utført med to eller flere fargede latekskuler, eller fluoroforer som emitterer ved forskjellige bølgelengder. Merkede kuler kan bli isolert manuelt eller mekanisk. Mekaniske metoder omfatter fluorescensaktivert sortering, dvs. analogt med FACS, og mikromanipulatorfjerningsmidler.
I spesifikke eksempler ovenfor, blir enzym-kromogenmarkører og fluorescens (FITC) markører anvendt.
Reaktive kuler kan bli isolert på grunnlag av intensiteten til markøren, f.eks. fargeintensitet, fluorescensintensitet, magnetisk styrke eller radioaktivitet for å nevne noen kriterier. De mest intenst merkede kulene kan bli valgt og sekvensert eller på annen måte karakterisert når det gjelder struktur, f.eks. ved massespektralanalyse. I en annen utføreisesform kan en tilfeldig seleksjon av kuler med en markørintensitet over en vilkårlig avspaitning bli selektert og sekvensert. Man kan potensielt anvende moderne billeddannende analysemikroskopi for å kvantifisere fargeintensiteten og dermed nøyaktig definere den relative affiniteten til liganden overfor akseptormolekylet før sekvensanalyse av kulen. Kvantitativ immunofluorescensmikroskopi kan likeledes bli anvendt dersom akseptaren blir tilkoblet en fluorescensmarkør. I en ytterligere utføreisesform blir kuler som demonstrerer en viss markørintensitet valgt for komposisjonsanalyse, f.eks., bestemmelse av aminosyresammensetning. Et raffineringsbibliotek omfattende et begrenset sett av monomerenheter identifisert som viktige ut i fra sammensetningsanalysen kan bli dannet og screenet.
I en annen utføreisesform kan bio-oligomeren(e) med størst bindingsaffinitet, dvs. bindingskonstant, bli identifisert ved progressiv fortynning av akseptormolekylet av interesse helt til binding til bare noen få fast fase bærere av biblioteket er detektert. Stringentheten til bindingsoppløsningen, eller når det gjelder nukleinsyrer, hybridisering med en målnukleinsyre, dvs. akseptormolekyl, kan bli øket. Fagfolk vil forstå at stringentheten til binding eller hybridisering kan bli øket ved (i) økning av oppløsningsionestyrken; (ii) økning av konsentrasjonen til denaturerende forbindelser så som urea; (iii) økning eller redusering av pH relativt til nøytral (pH 7); (iv) når det gjelder nukleinsyrer, tilnærming til Tm (smeltetemperatur). Andre metoder for å forandre oppløsningsbetingelsene for åbegrense bindingen til interaksjoner med høy affinitet er velkjente innenfor området. Høy fortynning eller høy stringenthetbinding til et akseptormolekyl til en fast fase bærer/bio-oligomer kan bli anvendt for å detektere en ligand av interesse i et tilfeldig bibliotek omfattende alle eller nesten alle mulige monomersubenheter, eller i et begrenset raffineringsbibliotek.
I en annen utføreisesform kan bio-oligomerer som demonstrerer binding med lav affinitet være av interesse. Disse kan bli valgt ved først å fjerne alle bio-oligomerer med høy affinitetsbinding og deretter detektere binding under lav stringenthet eller mindre fortynnede tilstander.
I en foretrukket utføreisesform kan en dobbel markøranalyse bli anvendt. Den første markøren kan bli anvendt for ådetektere uspesifikk binding av et akseptormolekyl av interesse til kuler i nærvær av oppløselig ligand. Merkede kuler blir deretter fjernet fra biblioteket og den oppløselige liganden blir fjernet. Deretter blir spesifikk bindende akseptormolekyl til gjenværende kuler detektert. Bio-oligomerer på slike kuler kan bli ventet å binde akseptormolekylet med det samme bindingssetet som liganden av interesse og dermed etterligne liganden av interesse. Den doble markøranalysen tilveiebringer den fordelen at akseptormolekyl av interesse ikke behøver å bli renset på grunn av at det første trinnet i analysen muliggjør fjerning av uspesifikke positivt reagerende kuler.
5.5.2. Bioaktivitetsanalvser
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre analyser for biologisk aktivitet til en bio-oligomer fra et bibliotek behandlet for å fjerne eventuelle toksiske molekyler som er igjen fra syntesen, f.eks. ved nøytralisering og omfattende vasking med oppløsningsmiddel, sterilt vann og kulturmedium. Biologiske aktiviteter som kan bli vurdert omfatter toksisitet og dreping, stimulering og vekstfremming, og fysiologisk forandring.
I en foretrukket utføreisesform blir bio-oligomere ifølge biblioteket selektivt spaltet fra fast-fase bæreren, også referert til heri som "kule". I en utføreisesform blir kuler preparert slik at bare en fraksjon av bio-oligomerene blir selektivt spaltet. Selektivt spaltbare bio-oligomerer, linkere og kuler er beskrevet i seksjon 5.4., ovenfor. Et bibliotek blir behandlet med et spaltningsmiddel, slik at spaltningen av en fraksjon av bio-oligomerene oppstår. Eksempler på spaltningsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, UV lys, syre, base, enzym eller katalysator. I en utføreisesform blir biblioteket behandlet slik at 10-90% av bio-oligomerene blir frigjort. I en mer foretrukket utføreisesform blir 25-50% av bio-oligomerene frigitt. Når alle bio-oligomerer er spaltbare, kan ikke-kvantitativ spaltning bli oppnådd ved begrensning av spaltningsmiddel. I et aspekt er eksponeringstid og intensitet av UV-lys begrenset. I en annen utføreisesform er konsentrasjonen av reagenset begrenset. Etter behandling for å oppnås spaltning kan biblioteket bli ytterligere behandlet f.eks. ved nøytralisering for å gjøre det biologisk kompatibelt med den ønskede analysen. I praksis kan fagfolk lett bestemme hensiktsmessige spaltningsbetingelser for partiell spaltning når alle bio-oligomerer av biblioteket er koblet til den faste fasen av spaltbare linkere eller bindinger. Fagfolk vet videre at den relative konsentrasjonen av frigjort bio-oligomer kan bli påvirket av varierende spaltningsbetingelser.
På grunn av at kulene i biblioteket er immobiliserte, vil en
konsentrasjonsgradient av en bestemt bio-oligomer bli dannet. Høye konsentrasjoner av bio-oligomeren vil bli funnet i nærheten av kulen som den var frigjort fra. Bevis for biologisk aktivitet av interesse, i nærheten av en kule, vil muliggjøre identifikasjon.og isolering av kulen, og sekvensering eller annen karakterisering av bio-oligomeren. Identifikasjon av bio-oligomeren er mulig på grunn av at nok vil være igjen på kulen etter delvis spaltning for sekvensering eller annen karakterisering. I en annen utføreisesform kan kulene bli fordelt i
mikrotiterbrønner (f.eks. 10 kuler/brønn) og en prosent av bio-oligomer frigitt og testet for biologisk aktivitet, for derved åeiiminere det potensielle problemet med diffusjon. Som beskrevet nedenfor, kan forskjellige fraksjoner av bio-oligomeren bli koblet til fast fase bæreren eller kulen via forskjellige spaltbare linkere for sekvensielle analyser. I disse eksemplene refererer betegnelsen "kule" til fast fase bæreren.
Følgende eksempler er tilveiebrakt for å illustrere hvordan de biologiske analysene kan bli anvendt.
(i) En populasjon av celler i en enkelt cellesuspensjon blir lagt over
flytende medium eller en semifast matrise inneholdende et tilfeldig bio-oligomerbibliotek. I en utføreisesform blir denne prosedyren utført i 96 brønn mikrobrønn vevskulturskåler med en eller flere kuler pr. brønn pluss cellesuspensjonen. I en annen utføreisesform blir en bærermatrise eller "cookie-cutter" tilført suspensjonen av cellene og kulene til et bibliotek for ådanne individuelle rom. En proporsjon av peptidet på hver kule blir koblet med en vannspaltbar (f.eks. diketopiperazin) eller fotospaltbar linker. Tilstrekkelig peptid kan bli frigjort for å utøve en biologisk effekt, mens nok peptid fortsatt forblir koblet til kulen for sekvensering. Cellesuspensjonen kan være i oppløsning eller kan i seg selv være i en semi-fast matrise. Etter en egnet inkubasjonsperiode, blir cellepopula-sjonen undersøkt for vekst eller proliferasjon, f.eks. ved identifikasjon av kolonier. I en annen utføreisesform kan tetrazoliumsaltet MTT (3-(4,5-dimetyl-tazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) bli tilsatt (Mossman, 1963, J. Immunol. Methods 65:55-63; Niks and Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151). Suksinatdehydrogenase som finnes i mitokondriene til levedyktige celler omdanner MTT til formazanblå. Konsentrert blå farge vil derfor indikere metabolsk aktive celler. I en ytterligere utføreisesform kan inkorporering av radiomerking, f.eks. tritiert tymidin, bli analysert for åindikere proliferasjon av celler. Proteinsyntese kan videre vises ved inkorporering av <35>s-metionin. Kuler som frigjør peptid som enten stimulerer eller inhiberer celleveksten kan deretter bli isolert og sekvensert, idet de identifiserte peptidsekvensene deretter blir testet på ny i oppløsningen i bekreftende kulturer mot indikatorcelletype.
(ii) I en ytterligere utføreisesform ifølge (i) ovenfor, blir kulene i biblioteket fordelt inn i mikrotiterbrønner slik at hver brønn inneholder omtrent 10 kuler. Kulene blir suspendert i oppløsningsfasen. Tilstrekkelig peptid blir frigjort fra hver kule for å utvise en biologisk effekt mens tilstrekkelig peptid forblir på kulen for sekvensering. Supematanten inneholdende frigjort peptid kan bli overført til en replikaplate eller latt være i brønnene med kulene. Biologisk aktivitet, f.eks. vekst eller proliferasjon til en cellelinje, blir bestemt. Kuler fra brønner med biologisk aktivitet blir sekvensert og hver sekvens preparert og testet for å bestemme hvilke av sekvensene som demonstrerer biologisk aktivitet. (iii) I en ytterligere utføreisesform ifølge (ii), ovenfor, blir bio-oligomerer koblet til kuler, slik at omtrent 1/3 av bio-oligomeren kan bli frigjort i et første trinn, og omtrent 1/3 i et andre trinn og gjenværende 1/3 forblir på kulen Sekvensiell frigjøring kan resultere fra anvendelse av to forskjellige spaltbare linkere, eller ved å begrense spaltningsmidlet til bare å frigjøre en del av bio-oligomeren i hvert trinn. I sistnevnte kan kontrollert bestrålning av en fotospaltbar linker være foretrukket, til tross for at forsiktig tidsbestemt eksponering for et kjemisk eller enzymatisk spaltningsmiddel kan tilveiebringe delvis spaltning. Et bibliotek med sekvensielt spaltbare bio-oligomerer blir dannet og fordelt i brønnene til mikrotiterskåler slik at hver brønn inneholder mer enn omtrent 50, og mer foretrukket fra omtrent 50 til omtrent 250 kuler pr. brønn. Kulene blir behandlet for å spalte omtrent 1/3 av bio-oligomerene. Supematanten blir analysert for biologisk aktivitet i en replikatanalyse. Kuler fra brønner som demonstrerer biologisk aktivitet blir deretter suspendert og fordelt i brønnene til en mikrotiterplate, slik at hver brønn inneholder omtrent 1 til 10 kuler. Kulene blir testet for å frigjøre ytterligere 1/3 bio-oligomer og supematanten analysert for biologisk aktivitet. Kuler fra brønner som demonstrerer biologisk aktivitet blir isolert og den koblede bio-oligomeren blir sekvensert. Når mer enn en kule blir funnet, blir alle identifiserte sekvensene preparert og individuelt testet for biologisk aktivitet. Denne to-trinnssekvensielle biologiske analysen tilveiebringer en effektiv, sterk fremgangsmåte for åscreene et meget stort bibliotek for bio-oligomerer med spesifikk biologisk aktivitet. (iv) Stimulering av frigjøring av cytokin kan bli analysert ved tilsetning av en enkelt cellesuspensjon immobilisert i en semi-fast matrise, f.eks. agarosegel. Når en bio-oligomer ifølge oppfinnelsen induserer frigjøring av cytokin, f.eks. lymfokin, vekstfaktor, hormon, osv., kan tilstedeværelse av cytokin bli detektert fra aktiviteten til en indikatorcellelinjé. Spesifikke analyser med en indikatorcellelinje kan bli utført som beskrevet i (i), ovenfor. I en annen utføreisesform kan cytokin frigjort fra stimulerte celler blir blottet på en membran, f.eks. nitrocellulose, og cytokin detektert ved immunanalyse eller en reseptorbindingsanalyse. (v) I en annen utføreisesform kan toksisiteten til en bio-oligomer bli observert. Soner eller plakk uten vekst, f.eks. av en transformert eller cancercellelinje belagt over et bio-oligomerbibliotek, vil indikere cytotoksisk aktivitet. I et spesifikt aspekt kan to cellepopulasjoner i en semi-fast matrise bli belagt, en over den andre. På denne måten kan en cytotoksisk bio-oligomer spesifikk for målcellen, men ikke cytotoksisk for en tilstedeværende celle bli identifisert. En slik analysert vil hurtig identifisere biomolekyler for anvendelse som kjemoterapeutiske midler. Cytotoksiske bio-oligomerer innbefatter toksiske peptider og anti-sensoligonukleotider. (vi) Fysiologisk forandring kan også bli analysert. I en utføreisesform blir en myokardialceilesuspensjon belagt over et bibliotek. "Beating" av celler stimulert av en bio-oligomer kan bli observert. I en annen utføreisesform kan oppregulering av et bestemt enzym bli analysert ved detektering av økning i en spesifikk enzymaktivitet dersom et egnet substrat er tilgjengelig, så som et kromogen (f.eks. MTT, (i), ovenfor), fluorofor eller kjemiluminiscent. Alternativt, kan oppregulering av et enzym bli detektert ved en immunologisk analyse. I en ytterligere utføreisesform kan histologiske teknikker indikerer fysiologiske eller morfologiske forandringer oppnådd i en bio-oligomer ifølge biblioteket. (vii) Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for analysering av aktiviteten til en bio-oligomer i et bibliotek på polariserte celler, f.eks., celler med en basolateral og en luminal side. Polare cellekulturer kan bli dannet på en semi-permeabel membran som tilsvarer hulrommet. Et bibliotek blir tilsatt i en semi-fast matrise til hulromssiden eller den basolaterale siden. Forskjellige effekter av en bio-oligomer ifølge oppfinnelsen kan bli analysert, så som polar transport, proliferasjon, intercellulær kommunikasjon osv. Ved merking av bio-oligomeren, f.eks. med en radiomarkør eller en fluorofor kan transporterbare bio-oligomere bli identifisert. Det er et stort behov innenfor området for spesifikt absorberbare molekyler. Slike molekyler vil være nyttig for oral eller nasal adminstrasjon av legemidler hvor transporten fra hulromsoverflaten til den basolaterale overflaten til epitelet er ønsket.
Biologiske analyser med uspaltede bio-oligomerer blir også betraktet. Den biologiske aktivitetentil hele bio-oligomer-belagte kuler kan deretter bli screenet. I et aspekt, kan et bibliotek bli introdusert inn i et dyr. Kulene av interesse kan bli isolert fra et spesifikt vev. Kuler kan bli isolertsom ble spesifikt absorbert etter oral, nasal eller kutan adminstrering. I en foretrukketutførelsesform er slike kuler magnetiske eller har visse andre identifiserende trekk ogkan derfor lett bli isolert fra vevet.
Fagfolk er klar over at alle foregående biologiske analyser gjelder for bio-oligomerer som omfatter peptider, oligonukleotider eller peptid-oligonukleotidchimerer. Peptider og peptidanaloger er velkjente som vekstfremmere, vekstinhibitorer og regulatoriske molekyler. Peptider kan virke som genregulatorer ved binding til regulatoriske sekvenser på et gen, f.eks. ved agonisering eller antagonisering av virkningen til promoter, enhancer og regulatoriske proteiner. Likeledes kan nukleinsyrer virke som inhibitorer, på indusere av genekspresjon på transkripsjonsnivået ved (f.eks. binding eller blokkeringspromotere, enhancere, transkripsjonsstoppseter osv.), prosessering (f.eks. ved interferering eller være behjelpelig med mRNA prosessering) og translasjon. Det er velkjent innenfor området å anvende et oligonukleotid eller en oligonukleotidanalyg for å blokkere translasjonen av et spesifikt mRNA. Et hvilket som helst og alle bibliotek beskrevet i seksjonene 5.1. - 5.3., ovenfor, kan bli analysert for biologisk aktivitet.
Det er videre kjent for fagfolk at en hvilken som helst celle som kan bli opprettholdt i vevskultur enten i kort eller lang tid kan bli anvendt i en biologisk analyse. Betegnelsen "celle" som anvendt her antas å innbefatte prokaryotiske (f.eks. bakteriell) og eukaryotiske celler, gjær, mugg og sopp. Primære celler eller linjer opprettholdt i kultur kan bli anvendt. Søkere har videre betraktet at biologiske analyser på viruser kan bli utført ved infisering eller transformering av cellene med virus. For eksempel og uten å være begrenset derav, kan evnen som en bio-oligomer har for å inhibere lysogenisk aktivitet av lambda bakteriofagen bli vurdert ved identifisering av transfekterte E. coli kolonier som ikke danner klare plakk når infisert.
Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse for analysering av aktiviteten til en bio-oligomer fra et tilfeldig bibliotek av bio-oligomerer er ikke begrenset til følgende eksempler. Et hvilket som helst analysesystem kan bli modifisert for åinkorporere den beskrevne oppfinnelsen.
5.5.2.1. Bioanalvse for en ervtropoietinaaonist
I en bestemt utføreisesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en analyse for en bio-oligomeragonist av erytropoietin. Det er å bemerke at den bestemte metoden beskrevet heri vil tilveiebringe en nyttig strategi for identifisering av en hvilken som helst agonist, f.eks. agonisten til vekstfaktorer, hormoner, cytokiner, lymfokiner og andre intercellulære messengers, som er beskrevet i seksjon 5.5.2., ovenfor.
I foreliggende eksempel kan bio-oligomerbiblioteket bestå av pentapeptider preparert med 19 vanlige aminosyrer (ekskludert cystein). Det teoretiske antallet bestemte peptider er 2,476,099. Biblioteket kan bli produsert i 19 stadier for ålette screeningen. Dette vil bli oppnådd ved åvelge en enkelt aminosyre fra C-terminalen ved hvert stadium, slik at bare de andre 4 aminosyreposisjonene vil bli randomiserte. Sekvensen for hvert stadium vil derfor være XXXXY-linker-harpiks, hvor Y bli valgt for det stadiet og X representerer tilfeldig aminosyreinkorporering. Dette reduserer antall potensielle peptider for hvert stadium til 130,321. Distribuert som 10 kuler (peptider) i hver brønn av 96 brønn mikrotiterskåler er antall skåler som er nødvendig 136 (en ytterligere skål er nødvendig for bioanalysestandarder og kontroller for å tilveiebringe totalt 137. Metoden muliggjør fordeling av hele stadiet av biblioteket over dette antall skåler i løpet av en arbeidsdag.
En hoveddel (50-80%) av peptidet syntetisert på kulene kan bli spaltet for anvendelse i bioanalysen slik at minst 50 pmol av peptidet vil bli frigjort fra hver kule. En diketopipiperazinbinding er foretrukket som spaltbar linker til tross for at en fotospaltbar linker også kan bli anvendt. Bindingen er tilstrekkelig stabil under svakt sure betingelser (f.eks. 0,1-1,0 mM HCI) for å muliggjøre fordeling av kulene over en 6-8 timers periode. Spaltningen blir fremmet ved tilsetning av 20 pl 1,0-10 HEPES buffer (pH 8,5) til hver brønn. Spaltning oppstår over natt (12-18 timer) som er i samsvar med opprettholdelse av det endelige brønnvolumet. Avdampning kan bli kontrollert ved lagring av platene i en fuktbeholder.
Peptidoppløsningen som resulterer fra spaltningen av kulene i biblioteket bør være aseptiske, om ikke sterile. Aseptiske betingelser er nødvendig på grunn av at oppløsningen vil omfatte 25% av det endelige kulturvolumet og på grunn av at dyrkningstidene vil være minst 24 timer. Aseptiske betingelser kan bli oppnådd ved (1) hydrering av kulene i sterilt vann etter syntesen, (2) fortynning av den opprinnelige kulesuspensjonen i surgjort sterilt vann og (3) ved anvendelse av steril teknikk distribuere kulene inn i sterile kuiturskåler. Den endelige kulesuspensjonen kan inneholde mindre enn omtrent 20% DMSO for åhjelpe solubiliseringen av hydrofobe peptider. DMSO bør bli tilsatt, dersom det blir tilsatt, tidlig i hydreringsprosessen for å lette solubiliseringen. Den endelige kulesuspensjonen bør tilveiebringe en konsentrasjon på 10 kuler/50 pl. Opprettholdelse av kulene i suspensjon i løpet av pipetteringen kan bli oppnådd ved tilsetning av metylcellulose til omtrent 0,8-3,2%. Anvendelse av metylcellulose kan muliggjøre reduksjon av DMSO anvendt for åfremme oppløseligheten. Den endelige konsentrasjonen til metylcellulose i kulturene blir holdt under 0,8% for å ikke interferere med bioanalysen.
De frigjorte peptidene kan bli overført til bioanalysekulturskåler som 50 pl prøver, og opprettholde et nøyaktig samsvar mellom prøveskåler og kulturskåler. Det er viktig at sterile betingelser blir opprettholdt i løpet av denne overføringen. Human rekombinant EPO kan bli tilsatt til selekterte brønner av skålene for å virke som en positiv kontroll (hver skål) og for konstruksjon av standardkurver (første og siste skåler). Kontrollbrønnene kan bli tilført 0,1 IL) EPO og standardkurver oppnådd fra seks sett av duplikate brønner som mottar 1,0-100 millienheter EPO (D'Andrea, et al. 1991, Mol. Cell. Biol. 11:1980-1987).
Bioanalysen kan bli dannet med Ba/F3-T rekombinant cellelinje som uttrykker erytropoietinreseptoren (EPO-R). Disse cellene er avhengig av tilstedeværelse av enten interieukin-3 (1L-3) eller EPO. En kultur av disse cellene i nærvær av IL-3 (tilført som 10% (v/v) WEHK-kondisjonert kulturmedium) vil forhindre den mulige interferensen av EPO i mediet med bioanalysen. Det grunnleggende vekstmediet for Ba/F3-T celler er RPM11640 medium inneholdende 2,0 g/L NaHC03 10% (v/v) fetalt bovint serum, 1x penicillin-streptomycin, 5 pl fi-merkaptoetanol/L og 10 mM HEPES (sluttkonsentrasjon) justert til pH 7,40. Dette mediet må bli supplementert med 10% (v/v) WHEI-kondisjonert medium som tilfører IL-3. WHEI-kondisjonert medium blir dannet ved dyrking av WHEI celler til sammenløp i det samme mediet. Det kondisjonerte mediet blir sentrifugert for å fjerne celler, sendt igjennom et 0,22 pm filter og lagret i frossen tilstand. Ba/F3-T cellene blir dyrket for ågi 1,31x10<?> celler som vil bli fordelt som 1x10<3> celler/brønn i et volum på 150 pl som beskrevet (Yoshimura et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 87:4139^4143).
Ba/F3-T cellene blir overført fra rulleflasker til større (250 ml) sterile sentrifugerar. Cellene vil bli samlet ved sentrifugering ved omtrent 500 x g i 5 minutter. Cellene blir deretter resuspendert i 200 ml friskt vanlig medium uten IL-3 for celletelling. Det endelige volumet blir justert for å gi 6,67 x 10<3> celler/ml (1 x 10<3> celler/150 pl) med ytterligere medium. Det vil være nødvendig å dele den endelige cellesuspensjonen i 4-8 alikvoter for lagring i inkubatoren i løpet av den lange fordelingsprosessen. Celleantall og levedyktighet bør bli bestemt på prøver tatt i begynnelsen og i slutten av distribusjonsprosessen for åforsikre at lignende antall levedyktige celler er tilstede i de første og siste kulturskålene. Cellene blir fordelt inn i kulturskålene inneholdende de frigjorte peptidsupernatantene. Skålene blir inkubert i 3 dager (Yoshimura et al., ovenfor).
Sluttpunktet for bioanalysen er antallet levende celler tilstede i hver kulturbrønn. Dette kan bli bestemt ved anvendelse av MTT analysen til Mosmann (1983, J. Immunol. Methods 65:55-63) som modifisert av Niks og Otto (1990, J. Immunol. Methods 130:140-151). Den modifiserte analysen muliggjør måling av det levende celleantallet uten å fjerne kulturmediet.
MTT (3(4,5-dimetyltiazol-2-yl)2,5-difenyltetrazoliumbromid) blir dannet som en 5 mg/ml oppløsning i PBS (omtrent 270 ml er nødvendig). Hver brønn i bioanalyseskålen mottar 20 pl av denne oppløsningen og skålen blir inkubert i 4 timer ved 37°. Etter denne perioden, blir 100 pl ekstraheringsoppløsning tilsatt til hver brønn og skålen blir plassert i en badsonikator i 120 sekunder. Ekstraheringsoppløsningen omfatter 50% (v/v) N,N-dimetylformamid i en 20%
(vekt/volum) oppløsning av natriumdodecylsulfat (SDS) justert til pH 4,7 med eddik-HCI syre som beskrevet av Hansen et al., (1989, J. Immunol. Methods 119:203). Denne behandlingen oppløser formazanproduktet av MTT metabolismen for måling av optisk tetthet ved 570 nm ved en mikroskålavleser.
OD-data oppnådd fra bioanalysen blir tatt et gjennomsnitt av ved alle prøvebrønnene for å bestemme et 95% sikkerhetsintervall for gjennomsnittsverdien. OD-verdierfor brønner utenfor dette intervallet blir anvendt for en Students t test bestemmelse på signifikans. Signifikansverdiene vil bli sammenlignet med EPO standardkurver for å oppnå et potensiert estimat som IU relativt til EPO. Standardkurven blir bestemt ved ulineær regressjonsanalyse ved anvendelse av den logistiske ligningen. Data for begge standardkurvene vil bli analysert sammen og separat for å bestemme om det er en signifikant forskjell i responsen målt i begge ender av bioanalyseprosedyren (F-forholdtesten). En sammenligning av kontroll verdiene målt for hver skål over hele analysen vil bli anvendt for å bestemme om det er en samsvarende forandring i analyseresponsen.
Det er viktig å gjenkjenne at det er to vekstfaktorreseptorer (IL-3R og EPO-R) tilstede på Ba/F3-T cellene og at aktivering av disse vil produsere en positiv bioanalyserespons. Bioanalysen som er beskrevet ovenfor, vil derfor selektere for både IL-3 og EPO reseptoragonistene. Det er to løsninger på dette problemet. En er å anvende en annen cellelinje eller kanskje miltceller fra fenylhydrazinbehandlede mus (Krystal, 1983, Exp. Hematol. 11:649-660). En annen er å teste syntetiske peptider for både EPO og IL-3 aktivitet i en annen bioanalyse eller ved radioligandbindingsmetoden.
5.5.3. Enzvmetterlianinaer/ enzvminhibitorer
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre bio-oligomerer som katalyserer reaksjoner, dvs. enzymbibliotek, som virker som koenzymer, eller som inhiberer enzymreaksjonene. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for åanalysere for enzym eller ko-enzymaktivitet, eller for inhibisjon av enzymaktiviteten.
Enzymaktiviteten kan bli observert ved dannelse av et detekterbart reaksjonsprodukt. I en bestemt utføreisesform katalyserer en bio-oligomer til et bibliotek enzymreaksjonen til det alkaliske fosfatasesubstratet, f.eks. 5-brom-4-klor-3-indoylfosfat (BCIP) og danner et blått, uoppløselig reaksjonsprodukt på fast fase bæreren (se eksempel 13, nedenfor).
I en annen utføreisesform kan en sone av observerbart produkt, f.eks. farge eller fluorescens, bli dannet i en semi-fast matrise. Et bibliotek blir belagt i en semi-fast matrise, f.eks. agarosegel, og et kromogent eller annen indikatorsubstrat blir tilsatt. Der hvor en bio-oligomer/fast fase bærer viser den ønskelige enzymaktiviteten, vil en sone av produktet bli dannet. For eksempel, og uten å være begrenset derav, kan en bio-oligomeranalog av pepperrotperoksydase bli identifisert ved tilsetning av en oppløsning av aminoantipyren (0,25 mg/ml; Kodak), fenol (8 mg/ml) og H2O2 (0,005%) i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,0. Kuler med enzymaktivitet vil danne en fiolett farvesone. I en annen utføreisesform kan bio-oligomerer/kuler med proteaseaktivitet bli identifisert ved tilsetning av de velkjente kolorimetriske proteasesubstratene.
Ko-enzymaktiviteten kan bli observert ved analysering for enzymaktiviteten formidlet av en ko-enzym hvor det naturlige eller vanlige ko-enzymet er fraværende.
Aktiviteten til enzyminhibitoren kan bli detektert med en delvis-frigjort bio-oligomer. Frigjøring av bio-oligomerer er diskutert i seksjonene 5.4 og 5.5.2, ovenfor. I et eksempel, og uten å være begrenset derav, blir et bio-oligomerbibliotek belagt i en semi-fast matrise som inneholder et enzym. Biblioteket blir behandlet for delvis å frigjøre bio-oligomeren. Hvor bio-oligomeren inhiberer enzymaktiviteten kan en sone som mangler produkt bli identifisert. I en utføreisesform er enzymsubstratet kromogent og et farvet produkt blir dannet. Tilstedeværelse av en enzyminhibitor vil tilveiebringe en sone uten farve. I en annen utføreisesform kan inhibisjon av en proteolyse av hemoglobin eller et indikatorenzym så som alkalisk fosfatase bli detektert ved tilstedeværelse av en opak sone i den semi-faste matrisen. Dette er tilfelle på grunn av at tilstedeværelse av proteolyseinhibitor vil forhindre degradering av hemoglobin eller indikatorenzymet.
Det er velkjent for fagfolk at en bio-oligomer som demonstrerer enzymaktivitet, ko-enzymaktivitet eller som inhiberer enzymaktiviteten kan være et peptid, et oligonukleotid eller en peptid-oligonukleotidchimer. Av spesiell interesse er de tvungede eller sirkulariserte peptidene som kan danne en unik katalyttisk bindingslomme eller overflate (seksjon 5.2.1., ovenfor). En peptid-oligomernukleotidchimer kan også ventet å utvise unike kjemiske egenskaper, så som enzym eller ko-enzymaktivitet, forårsaket av unik grenseposisjon til de respektive funksjonelle gruppene. Bio-oligomer/fast fase bæreren kan videre demonstrere enzym- eller ko-enzymaktivitet, mens den frie bio-oligomeren ikke behøver å aktivitet. Dette er tilfelle på grunn av at proksimiteten til en høy tetthet av bio-oligomeren kan gi unike kjemiske egenskaper til bio-oligomer/fast fase bæreren. Det blir også betraktet at en bio-oligomer kan utvise enzym eller ko-enzymaktivitet når frigjort fra kulen. Det blir betraktet at kjente ko-enzymer (ko-faktorer) kan bli kjemisk inkorporert inn i den tvungede bio-oligomeren for å stimulere et enkelt eller kompleks enzym inkludert f.eks. elektrontransportkjede.
5.6. Metoder for å karakterisere en bio- oligomer
Når en kule inneholdende en bio-oligomer av interesse blir selektert ifølge hvilke som helst av fremgangsmåtene ifølge seksjon 5.5.1, nedenfor, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et middel for å bestemme strukturen og sekvensen til bio-oligomeren.
Når bio-oligomeren er et peptid, er foretrukket sekvenseringsmetode Edman degradering. En spesielt foretrukket fremgangsmåte anvender Applied
Biosystems 477A proteinsekvenator. Aminosyresekvensen til peptidene kan også bli bestemt enten ved fast atom bombardement massespektroskopi (FAB-MS) eller med andre analyttiske metoder.
Peptidene kan bli sekvensert enten koblet til eller spaltet fra den faste bæreren. For å spalte peptidet, blir de isolerte peptid-kulene behandlet med tradisjonelle spaltningsmidler som er kjent for fagfolk for å separere polymeren fra fast fase bærerene. Valg av spaltningsmiddel vil avhenge av hvilken fast fase bærer som blir anvendt. For å spalte peptider fra Wang harpiksen er det foretrukket åanvende 50% trifluoreddiksyre (TFA) i diklormetan.
Alternativt, i en annen utføreisesform innenfor rammen av oppfinnelsen, er det mulig å isolere en enkelt fast fase bærer, så som en kule, med koblede bio-oligomerer og tilføre kulen til en sekvenator uten på forhånd å spalte bio-oligomerene fra kulen. Dersom bio-oligomeren f.eks. er et peptid, blir det estimert at en enkelt 100 pm diameter harpiks med 0,5 mEq/g harpikssubstitusjon inneholder omtrent 200 pmol peptid. En enkelt 250 pm diameter PAM harpiks med 0,5 mEq/g harpiks substitusjon inneholder omtrent 3125 pmol peptid. Med gjeldende peptidsekvenator er bare 5-10 pmol nødvendig for adekvat sekvensering. En standardstørrelse, enkelt PAM harpiksbærer på 100 pm diameter inneholder derfor mere enn en adekvat mengde peptid for sekvensering.
I tilfelle hvor peptider omfatter aminosyrer eller peptidomimetiks som ikke kan anvendes for Edman analyse, kan kulen bli preparert slik at 10-50% av peptidene ikke inkorporerer det ikke-sekvenserbare residiet. Den gjenværende sekvensen kan bli bestemt og sekvensen inkludert det ikke-sekvenserbare residiet kan bli ekstrapolert derifra.
En annen tilnærmelse for ikke-sekvenserbare residier er temporært å belegge en del av peptidet før inkorporering av det ikke-sekvenserbare residiet i løpet av syntese av biblioteket. I løpet av den påfølgende strukturelle identifikasjonen, kan man anvende Edman degradering opp til det ikke-sekvenserbare residiet og deretter avspalte det temporært innførte belegget og gjenoppta sekvensering distalt (dvs. C-terminalt) for det ikke-sekvenserbare residiet.
Når det gjelder oligonukleotider kan sekvensering bli utført på en automatisert oligonukleotidsekvenator (f.eks. Applied Biosystems). Et foretrukket alternativ er å anvende teknikken til Maxam og Gilbert (1977, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74:560-564). En annen fremgangsmåte for sekvensering av oligonukleotider som er kjent innenfor dette området kan også bli anvendt.
Fast ion bombardement massespektrometri tilveiebringer kanskje den mest sterke strukturelle analysen. Ved detektering av fragmenter, samt bio-oligomerartene kan en sekvens bli omkonstruert. Elektrospray-høy ytelse massespektrometri (Finnigan MAT) kan tilveiebringe strukturelle data og sekvensdata. Når sekvensen til den valgte bio-oligomeren er bestemt, kan en stor mengde bli syntetisert kjemisk ved anvendelse av en automatisk peptidsyntesemaskin eller andre metoder for bio- eller kjemisk syntese. Når en bio-oligomersekvens er blitt identifisert, kan subenhetanaloger i tillegg blir substituert for å forsterke aktiviteten til den spesifikke bio-oligomeren.
5.7. Terapeutiske og diagnostiske midler fra tilfeldige bio- oligomerbibliotek Når en bio-oligomersekvens av interesse er blitt bestemt, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse molekyler som omfatter bio-oligomersekvensen for anvendelse ved behandling eller diagnostisering av sykdom. Sekvensen til bio-oligomeren alene kan tilveiebringe et diagnostisk eller terapeutisk middel, eller kan bli inkorporert inn i et større molekyl. Et molekyl som omfatter en bio-oligomersekvens med biologisk eller bindingsaktivitet kan bli betegnet et "effektormolekyr. Biblioteket ifølge oppfinnelsen kan anvendes i forskjellige anvendelsesområder. "Effektor" funksjonen til nevnte effektormolekyl kan være hvilke som helst av funksjonene beskrevet heri, eller kjent innenfor fagområdet.
Fremgangsmåten beskrevet heri tilveiebringer ikke bare et nytt redskap for å søke etter spesifikke ligander med potensiell diagnostisk eller terapeutisk verdi, men tilveiebringer også viktig informasjon når det gjelder serier av ligander med potensielt meget forskjellige primærsekvenser eller kjemisk sammensetning som kan reagere fysisk med det samme akseptormolekylet. Integrering av slik informasjon med molekylær modellering og moderne datateknikker tilveiebringer sansynligvis ny fundamental forståelse angående ligand-reseptorinteraksjoner.
De terapeutiske midlene omfatter effektormolekyler som vil bli bundet til det biologiske aktive setet til cytokiner, vekstfaktorer eller hormonelle midler og derved forsterke eller nøytralisere deres virkning, og som vil blokkere eller
forsterke transkripsjonen og/eller translasjonen.
De terapeutiske midlene omfatter f.eks. effektormolekyler som blir bundet til en reseptor av farmakologisk interesse så som vekstfaktorreseptorer, neurotransmrtterreseptorer eller hormonreseptorer. Disse effektormolekylene kan bli anvendt som enten agonister eller antagonister for virkningen av den naturlige reseptorliganden.
En annen anvendelse av effektormolekylene som blir bundet til reseptorer, vil være å anvende bindingen for å blokkere koblingen av vimser eller mikrober som kommer til en celle ved kobling tii en normal cellulær reseptor og blir inntatt. Eksempler på dette fenomenet omfatter binding av human immunsviktvirus til CD4 reseptoren og herpes simplex virus til fibroblastvekstfaktorreseptoren. Effektormolekyler som okkuperer reseptoren kan bli anvendt som farmakologiske midler for å blokkere den virale infeksjonen av målcellene. Parasittinvasjon av cellene kan likeledes bli inhibert etter at egnede effektormolekyler ble identifisert ifølge denne oppfinnelsen.
I en annen utføreisesform, kan et effektormolekyl som omfatter en bio-oligomersekvens som bindes til et akseptormolekyl av interesse bli anvendt for å målsøke et medikament eller toksin. I en foretrukket utføreisesform er akseptormolekyl av interesse en reseptor eller et antigen som finnes på overflaten av en tumorcelle, dyreparasitt eller mikrobe, f.eks. bakterie, virus, encellet parasitt, encellet patogen, sopp eller mugg.
Det er i tillegg mulig at noen få av millionene av bio-oligomerer i blandingen kan gi sekvenser som har biologisk aktivitet. Man kan isolere bio-oligomerer som har antitumor, anti-dyreparasitt eller antimikrobiell, f.eks. anti-sopp, antibakterieli, anti-encellulær parasitt, anti-enceilulær patogen eller antiviral aktivitet. I tillegg kan noen av disse bio-oligomerene virke som agonister eller antagonister for vekstfaktorer, f.eks. erytropoietin, epidermal vekstfaktor, fibroblastvekstfaktor, tumorvekstfaktorer for å nevne noen, samt hormoner, neurotransmittere, immunmodulatorer eller andre regulatoriske molekyler. I en utføreisesform er bio-oligomerene peptider.
De terapeutiske midlene omfatter også effektormolekyler omfattende en bio-oligomersekvens som har en høy affinitet for medikamenter, f.eks., digoksin, benzodiazepam, heroin, kokain eller teofyllin. Slike peptider kan være nyttige som motgift for overdoser med slike medikamenter. Likeledes omfatter terapeutiske midler effektormolekyler som blir bundet til små molekyler eller metallioner, inkludert tungmetaller. Bio-oligomersekvenser med høy affinitet for bilirubin vil være nyttig for behandling av nyfødte med hyperbilirubinemea.
Generelt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for identifisering av bio-oligomersekvenser for terapi av sykdommer som er oppført i Product Category Index of The Physicians Desk Reference (PDR, 1992,45th Edition, Medical Economics Data: Oradell, NJ, s. 201-202). Et effektormolekyl med antiparasitt-, anti-koaguleirngsmiddel-, anti-koaguleringsmiddelantagonist-, anti-diabetisk middel-, anti-sammentrekkende middel-, antidepressivt middel-, anti-diaremiddel-, motgift-, antigonadotropin-, antihistamin-, antihøyt blodtrykksmiddel-, antiinflammatorisk middel-, antikvalmemiddel-, antimigrenemiddel-, antiparkinsonisme-, antiblodplate-, antiklø-, antipsykotisk-, antrfeber-, antitoksin-(f.eks. antivenum-), bronkial dilator-, vasodilator-, gelateringsmiddel-, befruktningshindrende middel-, muskelrelakserende middel-, antigleukom- eller beroligende-aktivitet, kan bli identifisert.
De terapeutiske midlene kan også inneholde hensiktsmessige farmasøytisk akseptable bærere, fortynningsmidler og adjuvanter. Slike farmasøytiske bærere kan være sterile væsker, så som vann og oljer, inkludert de fra petrolum, dyr, av vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, så som peanøttolje, soyabønneolje, mineralolje, sesamolje og lignende. Vann er en foretrukket bærer når den farmasøytiske sammensetningen blir administrert intravenøst. Saltvannsoppløsninger og vandig dekstrose og glyseroloppiøsninger kan også bli anvendt som flytende bærere, spesielt for injiserbare oppløsninger. Egnede farmasøytiske eksipienter omfatter stivelse, glukose, laktose, sukrose, gelatin, malt, ris, mel, kalk, silikagel, magnesiumkarbonat, magnesiumstearat, natriumstearat, glyserolmonostearat, talk, natriumklorid, tørket skummet melk, glyserol, propylen, glykol, vann, etanol og lignende. Disse sammensetningene kan ta form som oppløsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, pulvere, vedvarende-frigivelseses formuleringer og lignende. Egnede farmasøytiske bærere er beskrevet i "Remington's Pharmaceutical Sciences" av E.W. Martin. Slike sammensetninger vil inneholde en effektiv terapeutisk mende av den aktive forbindelsen sammen med en egnet mengde bærer for åtilveiebringe en form som er egnet for administrering til pasienten. Intravenøs injeksjon er en meget effektiv form for administrering, men andre måter kan også bli anvendt så som ved injeksjon eller ved oral, nasal eller parenteral administrasjon.
Et molekyl omfattende en bio-oligomersekvens bestemt ifølge denne oppfinnelsen kan også bli anvendt for å danne diagnostiske midler. Det diagnostiske midlet kan bli dannet av en eller flere bio-oligomersekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. mere enn en peptidsekvens eller oligonukleotidsekvens. I tillegg kan det diagnostiske midlet inneholde hvilke som helst av bærerne beskrevet ovenfor for terapeutiske midler.
Som anvendt heri, refererer "diagnostisk middel" til et middel som kan bli anvendt for deteksjon av tilstander så som, men ikke begrenset til, cancer så som T eller B cellelymfom og infeksiøse sykdommer som angitt ovenfor. Deteksjon blir anvendt i videste forstand for å omfatte en indikasjon på eksistensen av tilstand, beliggenhet av kroppsdel som er involvert i tilstanden eller indikasjon på alvorlighet til tilstanden. For eksempel kan et peptid-pepperrotimmunperoksydasekompleks eller beslektet immunhistokjemisk middel bli anvendt for å detektere og kvantifisere spesifikke reseptor- eller antistoffmolekyler i vev, serum eller kroppsvæsker. Diagnostiske midler kan være egnede for anvendelse in vitro eller in vivo, og som diagnostiske reagenser nyttige for anvendelse i immunanalyser, Southern eller Northern hybridisering og in situ analyser.
I tillegg kan det diagnostiske middelet inneholde en eller flere markører så som, men ikke begrenset til, radioisotop, fluorescensmarkører, paramagnetiske forbindelser eller andre billedforsterkende midler. Fagfolk er kjent med omfanget av markører og fremgangsmåter for å inkorporere dem inn i midlet for å danne diagnostiske midler.
De terapeutiske midlene og diagnostiske midlene kan bli anvendt for behandling og/eller diagnostikk av dyr, og fortrinnsvis, pattedyr, inkludert mennesker, samt pattedyr så som hunder, katter, hester, kuer, griser, marsvin, mus og rotter. Terapeutiske og diagnostiske midler kan også bli anvendt for å behandle og/eller diagnostisere platesykdommer.
Sykdommer og tilstander mottagelig for terapi eller diagnostikk oppdaget med bio-oligomerer ifølge foreliggende oppfinnelse er så vidt omfattende som permutasjonene til strukturene i et tilfeldig bio-oligomerbibliotek. Følgende eksempler er tilveiebragt for å illustrere og ikke begrense oppfinnelsen.
5.7.1. Cvtotoksiske sammensetninger
Et molekyl omfattende en bio-oligomersekvens kan i seg selv ha en spesifikk cytotoksisk aktivitet. En bio-oligomer som binder en aksepter av interesse kan også bli modifisert ved teknikker som hører inn under dette fagområdet som f.eks. ved konjugasjon til cytotoksiske forbindelser, så som medikamenter eller radionuleider, for å danne et cytotoksisk molekyl. Bio-oligomeren, f.eks. peptidet, kan "målsøke" den cytotoksiske forbindelsen og spesifikt ødelegge cellene som utviser et bestemt akseptormolekyl. For eksempel kan slike cytotoksiske peptidkonjugater direkte eliminere uønskede B cellepopulasjoner, B cellelymfomer, T cellepopulasjoner eller T cellelymfomer i en pasient. Potensielle kliniske anvendelser omfatter behandling av autoimmune sykdommer, lymfomer og spesifikk immunsuppressiv immunterapi for organtransplantasjon. Andre cancerformer hvor tumorcellene utviser reseptor-formidlet binding av ligand, så som bryst-eller ovariecancer hvor epidermal vekstfaktor (EGF) reseptorer antas å spille en rolle kan også bli behandlet på denne måten.
Cytotoksiske midler spesifikke for en målcelle, så som en cancercelle eller viralt infisert celle, men som ikke dreper vedsidenavliggende celler, vev eller organer, kan bli oppnådd ifølge foreliggende fremgangsmåter. I tillegg til målsøking av detrimentale celler så som tumorer, kan disse spesifikke toksinene være nyttige antimikrobielle midler. Slike terapeutiske midler kan spesielt utvise bakteriostatisk aktivitet, bakteriosidal aktivitet, antiviral aktivitet, anti-parasittaktivitet eller fungisidal aktivitet. Likeledes kan toksiner bli identifisert som har insektisidal aktivitet eller herbisidal aktivitet.
I en utføreisesform kan bio-oligomeren være et peptid. Peptidet kan virke som et målsøkende middel hvorpå et toksin er koblet. Selve peptidet kan målsøke en celle og virke som et toksin. I en annen utføreisesform kan bio-oligomeren være et oligonukleotid. Oligonukleotidet kan formidle dets toksiske effekt ved interferering med transkripsjon eller translasjonen som er viktig for levedyktigheten til cellen.
5.7.2. Immunmodifiserende midler
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer molekyler og sammensetninger for anvendelse som immunmodifiserende midler. Betegnelsen "immunmodifiserende middel" omfatter molekyler eller forbindelser som kan tilveiebringe forandringer i immunsystemet. Immunmodifiserende middel kan spesielt stimulere eller inhibere T celleresponser, B celleresponser og uspesifikke immunresponser så som de som er formidlet ved virkning av makrofager, neutrofiler, polymorfonukleære fagocytter, granulocytter og andre myeloidlinjeceller. Effektormolekyler kan bli anvendt for å behandle følgende immuntilstander: (1) forskjellige autoimmune sykdommer inkludert myasthenia gravis, multippel sklerose, Grave's sykdom, reaumatoid artritis, systemisk lupus erytematosis (SLE), Pemphigus Vulgaris, autoimmun hemolyttisk anemi og immun trombocytopeni, (2) ikke-Hodgkin's lymfom og forskjellige andre cancerformer, (3) allergi, (4) immune komplekssykdommer, (5) transplantatorganavstøtning, (6) infeksiøs sykdom og (7) diabetes mellitus.
Det immunmodifiserende midlet kan stimulere immunaktiviteten ved å etterligne aktiviteten til et stimulatorisk lymfokin så som interieukin (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-6, granulocytt-kolonistimulerende faktor (CSF), makrofag-CSF og granulocytt-/makrofag-CSF for å nevne noen. Stimulering kan oppstå ved peptidbinding av ligand til en lymfokinreseptor eller ved oligonukleotidformidiet aktivering av det cellulære transkripsjonene maskineriet. Et immunmodifiserende middel kan virke ved binding til en leukocytt eller en lymfocytt så som Frj reseptor, LAF-1, LAF-2 osv., og induserer aktivitet så som fagcytose eller frigjøring av cytotoksiner. Et effektormolekyl ifølge oppfinnelsen kan virke som et kjemotaksin.
I en spesiell utføreisesform kan et molekyl omfattende en bio-oligomer etterligne antigenet. Bio-oligomeren kan være en nyttig vaksine for å utløse T celle eller B celleaktivitet spesifikk for et bestemt patogen. Alternativt kan et antigen, dvs. epitope, etterligne anvendelsen ved "boosting" av en spesifikk immunrespons.
Effektormolekylene vil være effektive i frigjort form. En bestemt bio-oligomer kan demonstrere høyere effektivitet når den forblir bundet til en fast fase bærer. Den høye tettheten av epitopemimikken kan mer effektivt stimulere en B cellerespons ved binding og cappingmembranimmunoglobulin eller andre reseptorformidlete responser.
Det blir videre betraktet at et begrenset bibliotek ifølge oppfinnelsen kan være nyttig som en vaksine for et patogen som har forskjellige epitoper. For eksempel er det kjent at den primære strukturen (sekvensen) til VSG (variabel overflateglykoprotein) til trypanosom varierer over tid i løpet av infeksjonen. Ved å endre VSG epitopen unngår trypanosom immungjenkjennelse. Malarieparasitt er likeledes funnet å uttrykke diverse antigene epitoper over artene ved forskjellige stadier av livssyklusen og innenfor underarter. Et peptidbibliotek med begrenset diversitet, kan derfor immunisere mot den variable antigene diversiteten presentert av trypanosom eller malarieparasitter. Et begrenset bibliotek kan anvendes som en vaksine i et hvert tilfelle hvor immunitet overfor forskjellige antigener er ønskelig.
Det er betraktet at effektormolekylene også kan inhibere immunresponsen ved (i) blokkering av den spesifikke immungjenkjennelsen ved antistoffnivå eller T celleantigenreseptoren; (ii) ved en blokkering av Fq eller andre immunresep-torer; eller (iii) binding til og inhibering av aktiviteten til lymfokiner og cytokiner; (iv) ved å tilveiebringe negative feedbacksignaler til immuncellene. Effektormolekylene kan bli anvendt for å tolerere immunsystemet, spesielt overfor autoimmune antigener. For eksempel kan immuntoleransen overfor DNA bli oppnådd med et oligonukleotid eller oligonukleotidbiblioteket og kan være nyttig for behandling av SLE. Immuninhibisjonen kan videre bli oppnådd ved mekanismer beskrevet i seksjonen 5.7.1., ovenfor.
I tillegg kan de terapeutiske midlene innbefatte valgte syntetiske antigene peptider med hvilke det kan være mulig å manipulere immunsystemet for å indusere toleranse overfor det antigene og dermed undertrykke eller lege den tilsvarende autoimmune sykdommen. Likeledes, med spesifikke syntetiske antigene peptider, er det mulig å inhibere dannelsen av multimere immunkomplekser og derved forhindre spesifikke immun-komplekssykdommer.
Peptider som blir bundet til tumor-spesifikke monoklonale antistoffer kan bli isolert, sekvensert og syntetisert for anvendelse som et immunogen for å indusere aktiv immunitet overfor tumoren.
Spesifikke peptider som har høy affinitet overfor Fc reseptorer kan bli anvendt som terapeutiske midler for å blokkere Fc reseptorene til
retikuloendotelsystemet og dette vil være potensielt fordelaktig for pasienter med autoimmune sykdommer så som idiopatisk trombocytopeni og autoimmun
hemolyttisk anemi.
Potensialet for behandling med slike peptider kan være ytterligere mer signifikante. Peptider som etterligner epitoper til invaderende organismer kan bli anvendt for åblokkere infeksjonen med en organisme. For eksempel har studer for ervervet immunsvikt (AIDS) vist at infeksjon med AIDS virus begynner med gjenkjenning og binding mellom et spesifikt glykoprotein (gp120) på kappen til AIDS virusen og CD4 overflatereseptoren på cellen. Administrering av et peptid som etterligner gp120 kan effektivt blokkere CD4 reseptorer slik at AIDS viruset ikke vil kunne bli bundet til å infisere den cellen. Likeledes kan invasjon og infeksjon av parasitt også bli inhibert.
5.7.3. Neureaktive aanoster oa antagonister
Det er betraktet at effektormolekylene vil agonisere (etterligne) eller antagonisere (inhibere) virkningene til hormoner, neurotransmittere, smertestillende midler, bedøvende midler, anti-psykotiske midler, anti-depressive midler elter narkotika. Slike effektormolekyler vil være nyttige for oppdagelsen av apetittregulerende midler, psykiatriske medikamenter, oppmerksomhet og læringsmodulerende midler og hukommelseshjelpemidler. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en kilde for smak- og lukanaloger, f.eks. "kunstige" søtningsmidler, salt og luktmidler.
5.8. Begrensede bibliotek
Det blir videre betraktet at et begrenset bibliotek ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe en omfattende smak, f.eks., som et krydder, ved lavere kostnader eller uten de tidvis allergiske virkningene av smaksstoffer. På denne måten kan dyre smaksstoffer som safran bli erstattet, t et annet aspekt, kan en ny klasse av smaksmidler bli dannet.
I en annen utføreisesform kan et begrenset bibliotek tilveiebringe en unik kromatografisk bærer. Det blir betraktet at et bibliotek av bio-oligomerer, f.eks. peptider som har felles generelle kjemiske egenskaper, men som har forskjellige sekvenser, vil være mer nyttig kromatografisk bærer enn de som for tiden er tilgjengelige. En slik kromatografisk bærer vil være mer selektiv enn en ionebytter eller revers fase bærer. Et akseptormolekyl som skal bli renset kan lett bli eluert fra bæreren under mye forsiktige betingelser enn det som er mulige ved anvendelse av f.eks. en immun-affinitetsbærer for derved å redusere sannsynligheten for denaturering. I en utføreisesform kan en bærer bli dannet basert på sammensetningen eller strukturen til bio-oligomerene som ble funnet å ha en mellomliggende affinitet, f.eks. en mellomliggende merkningsintensitet, eller bare bundet i en høy konsentrasjon med et spesifikt akseptormolekyl. En bærer med høy selektiv og lavere stringenthet kan lett bli identifisert uten renset materiale (se seksjon 5.5.1., ovenfor).
I en annen utføreisesform kan kuler med lav affinitetsbinding bli selektert og et begrenset bibliotek dannet basert på sammensetning av de selekterte kulene. I en annen utføreisesform kan en vanlig lav affinitet eller høy affinitetsbærer omfattende en eller noen få bi-oligomersekvenser identifisert ut i fra millioner av sekvenser tilveiebrakt ifølge oppfinnelsen bli anvendt for kromatografi. Oppfinnelsen vil bli ytterligere forklart ved følgende eksempler som bare skal illustrere oppfinnelsen.
6. Eksempel: Syntese av et tetrapeptidbibliotek
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble anvendt for åsyntetisere en tetrapeptidfamilie med formel X-X-X-Trp hvor X kan enten være en valin, en serin eller en alanin og den første aminosyren er alltid en tryptofan. Tryptofan er blitt inkorporert ved karboksylterminusen for å lette den elektrofotometriske registreringen ved OD280-
Na -Fmoc-tryptofan-alkoksymetylpolystyrenharpiks som beskrevet i Wang (1973, J. Amer. Chem. 95:1328-1333) ble oppnådd fra Bachem Inc., Torrence, Ca., og plassert inn i en beholder for standard fast fasepeptidsyntese. Aminosyrene som skal bli tilsatt var også Fmoc-modifisert aminosyrer oppnådd fra Bachem Inc. De andre reagensene som ble anvendt er vesentlige de samme som de som blir rutinemessig anvendt i fast fasesyntese som de som er beskrevet av Austen, (1988, "Peptide Synthesis" Methods i Molecular Biology, vol. 3, s. 311-331).
Reaksjonsbeholderene med teflonbelagte lokk ble anvendt for koblingsreaksjonene og standard fast faseproteinsyntesereaksjonsbeholderen virket som blandingsbeholderen hvori alikvotene ble blandet etter koblingsreaksjonen.
Omtrent 0,5 g Fmoc-Trp alkoksymetylharpiks ble svellet med 20 ml diklormetan (DCM). Harpiksen ble deretter vasket to ganger med DCM, en gang med en 1:1 blanding av DCM og dimetylformamid (DMF) og tre ganger med DMF. Harpiksen ble deretter avspaltet med 20% (v/v) piperidin i DMF. Etter grundig vasking av den avspaltede harpiksen med DMF (3 ganger), DCM (3 ganger og 1:1 blanding av DCM og DMF (2 ganger), ble harpiksen resuspendert i omtrent 7,5 ml DMF og fordelt inn i tre separate alikvoter med omtrent 2,5 ml hver og fordelt inn i tre nummererte koblingsrør.
Mengden av beskyttet aminosyre som skal bli tilsatt blir beregnet basert på antall mol tryptofan som allerede er koblet til harpiksen. For hver aminosyre som skal bli tilsatt, ble et fem-ganger molart overskudd aminosyre tilsatt til hver reaksjonsbeholder hvori den vaskede harpiksen allerede var blitt alikvotet. Hver reaksjonsbeholder mottok et fem-ganger overskudd av forskjellige aminosyrer. Hver beholder ble ristet i 2 minutter og et fem-ganger molart overskudd diisopropylkarbodiimid (DIC) i 3 ml DCM ble tilsatt og etterfulgt av risting i 1 time.
For å teste fullført kobling, ble en prøve fra hvert rør testet med ninhydrinreagens oppnådd fra Pierce Chemical i fremgangsmåten beskrevet av Sarin et al. (1981, Anal. Biochem. 117:147-157), spesifikt inkorporert heri som referanse. Dersom koblingsreaksjonen var ufullstendig som bestemt ifølge denne testen ble reaksjonen tvunget fullført ved flere fremgangsmåter som er kjent innenfor dette området, inkludert (a) en andre kobling ved anvendelse av et en- til frem-ganger overskudd av beskyttet aminosyre, (b) en ytterligere kobling ved anvendelse av forskjellige eller ytterligere oppløsningsmidler, (f.eks. trifluoretanol) eller (c) tilsetning av kaotrofiske salter, f.eks. NaCIC-4 eller LiBr (Klis og Stewart, 1990, "Peptides: Chemistry, Structure and Biology," Rivierog Marshall, eds., ESCOM Publ., s. 904-906).
Etter kobling ble harpiksene fra de tre koblingsrørene forsiktig overført og kombinert i en enkelt blandingsbeholder. Harpiksen ble vasket to ganger med DCM/DMF (1:1), tre ganger med DCM, tre ganger med DMF og avbeskyttet med 20% (v/v) piperdin/DMF. Etter grundig vasking med DCM og DMF som beskrevet ovenfor, ble blandingen fordelt inn i tre alikvoter og fordelt inn i de tre separate reaksjonsbeholderene. Et annet sett av aminosyrer ble tilsatt. Etter koblingen var fullført, ble harpiksen først avbeskyttet med 20% piperidin etterfulgt av grundig vasking med DCM og DMF som beskrevet ovenfor. Et tredje sett av aminosyrer ble tilsatt på samme måte.
For å spalte peptidene fra fast fase bærerne ble 30 ml 50% (v/v) trifluoreddiksyre (TFA) pluss 5% (v/v) anisol og 0,9% (v/v) etanditiol i DCM tilsatt til harpiksen. Blandingen ble ristet i 4 timer og peptidsupernatanten ble oppsamlet. Peptidsupernatanten ble deretter konsentrert i en roterende avdamper og peptidene ble presipitert i eter. Etter grundig vasking ble peptidpresipitatet tørket og klar for å bli anvendt for ytterligere analyse. Det lyofiliserte peptidet (i pulverform) ble lagret i frossen tilstand.
7. Eksempel: Sammenligning av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med den konvensjonelle fremgangsmåten for peptidsyntese
7.1. Materialer og metoder
Et bibliotek med tilfeldige tetrapeptider ble produsert i henhold til eksempel 6 ovenfor. I tillegg ble et bibliotek av tetrapeptider produsert ved anvendelse av standard fast fasepeptidsyntese (nedenfor "SPPS") teknikker angitt i Austen, ovenfor. Not<->Fmoc-tryptofan-alkoksymetylharpiks, oppnådd fra Biochem, Inc., ble anvendt som fast fase bærer/aminosyre kombinasjon. Ekvimolare mengder av et fem-ganger overskudd av Na<->Fmoc-valin, Na<->Fmoc-serin (0-1 Bu), og Na-Fmoc-alanin ble tilsatt reaksjonsbeholderen i løpet av hvert koblingstrinn. Etter tre påfølgende koblingstrinn ble tetrapeptidene spaltet i 50% (v/v) TFA, 5% (v/v) anisol og 0,9% (v/v) etanditiol i DCM som beskrevet i Austen, ovenfor.
7.2. Resultater
Begge peptidbibliotekene ble analysert på en C-18 reversfase HPLC kromatografikolonne (Vydac) for å demonstrere antall peptidarter i biblioteket (antall topper), relativ konsentrasjon av peptider (areal av toppene) og relativ hydrofil natur til peptidene (tidlig eller sen eluering fra kolonnen). Resultatene er angitt i figur 1. Kromatogrammet i det øvre panelet (fig. 1A) reflekterer mønsteret oppnådd med biblioteket av peptidene preparert ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen og kromatogrammet i det lavere panelet (fig. 1B) reflekterer mønsteret oppnådd SPPS.
Begge mønstre utviser 21 bestemte topper som indikerer tilstedeværelse av minst 21 forskjellige peptidarter innenfor hvert bibliotek. SPPS mønsteret utviser derimot betraktelig høyere topper ved #1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7, og indikerer at SPPS biblioteket innholdet en høyere konsentrasjon av peptidene 1-7 enn av peptidene 8-21. Det økte antallet peptidet 1-7 demonstrerer at disse peptidene fortrinnsvis ble syntetisert over resten av de 21 peptidene. I tillegg, ble disse toppene eluert tidlig, dvs. disse peptidene utviser en kortere retensjonstid innenfor kolonnen som indikerer at peptidene var mer hydrofile av natur.
Dette resultatet er ikke uventet med SPPS systemet. Det er kjent innenfor dette området at valin er hydrofob og bulkete og har en betraktelig saktere koblingsrate (antatt forårsaket av sterisk hindring) enn det som blir funnet med enten alanin eller serin. I løpet av en konvensjonell tilfeldig peptidsyntese som utført her, hvor valin vesentlig "konkurrerer" med alanin og serin for koblingsseter, inneholdt peptidene som ble syntetisert lite valin og peptidbiblioteket som ble produsert utviste ikke en ekvimolar distribusjon av de tilfeldige peptidene.
Mønsteret til biblioteket med tilfeldige peptider produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen indikerte en ekvimolar fordeling av peptider. Til tross for at toppene 3, 6,12,13 og 18 har omtrent to ganger arealet av andre topper, som indikerer tilstedeværelse av to peptider ved det punktet, hadde de fleste av de gjenværende 16 toppene nesten identiske mønstre. Alle 21 topper dekker i tillegg området for retensjonstid og dette indikerer en ekvimolar distribusjon av peptidene.
Sekvensering av selekterte topper tilveiebrakte ytterligere støtte. De mindre toppene 8, 9 og 21 og den store toppen 6 ble sekvensert med en Applied Biosystems 477A proteinsekvenator:
#8 = Val-Ala-Ser-Trp
#9 - Val-Ser-Ala-Trp
#21 = Val-Val-Val-Trp
#6 = (Ser-Val)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)-Trp
Disse valin-inneholdende sekvensene bekrefter at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen muliggjør tilfeldig syntese av peptider selv når kjente saktekoblende aminosyrer blir anvendt.
Sekvensen for topp #6 var ikke avgjørende sannsynligvis på grunn av tilstedeværelse av mer enn et peptid under toppen. De to hovedtoppene er sansynligvis Ser-Ala-Ala-Trp og Val-Ser-Ser-Trp.
7.3. Konklusjon
Resultatene demonstrerer at den tilfeldige peptidsyntesemetoden ifølge oppfinnelsen muliggjør syntese av et bibliotek av tilfeldig peptider i vesentlig ekvimolare mengder i kontrast til standard SPPS teknikken, hvor et sett av peptidet som inneholder aminosyrer med en hurtigere koblingsrate predomi-nerer. 8. Eksempel: Isolering av en peptidligand som bindes til et reseptormolekyl For å demonstrere anvendelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for å isolere et bestemt peptid, ble et 12 aminosyrepeptid med forutbestemt sekvens fra v-mos genproduktet syntetisert, v-mos er et onkogen isolert fra musesarkom og er relatert til Moloney murinsarkomviruset. v-mos genproduktet er kjent for å ha serin/treoninkinaseaktivitet.
8.1. Materialer og metoder
Sekvensen, Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala, ble syntetisert på polyakrylamidkuler (+ 300 pm diameter) ved anvendelse av Na<->Fmoc kjemi og standard fast fasepeptidsyntesereagenser og teknikker. Sidekjedebeskyttende grupper ble fjernet med 50% TFA og peptidet forble kovalentlig koblet til polyakrylamidharpiksen via en linker, aminokapronsyre-etylendiamin for å tilveiebringe en endelig struktur: Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala-aminokapronsyre-etylendiaminharpiks (nedenfor "lang v-mos kule"). Denne peptidsekvensen tilsvarer residiene 100 til 111 i v-mos genproduktet.
Ved anvendelse av samme metode, ble et kortere peptid med residiene 106-111 av v-mos genproduktet (Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala) syntetisert på polyakrylamidkuler via samme linker (nedenfor "kort v-mos kule"). Dette peptidet var en negativ kontroll.
En hybridomcellelinje som produserer monoklonale antistoffer spesifikke overfor lang v-mos peptidet, kjent som anti-v-mos (Hybridoma nr. 165-28E7, SCRF 354, Lot nr. 165-119), ble oppnådd kommersielt fra Microbiological Associates Inc., Maryland. I ELISA testing detekterer dette antistoffet den homologe sekvensen til v-mos, MOS, neu/HER-1, HER-2 genproduktene. Dette antistoffet er kjent for å ha neglisjerbar affinitet overfor kort v-mos peptidet. Et sekundært geite-anti-muse IgG (tung- og lettkjedespesifikk) merket med alkalisk fosfatase ble oppnådd fra Sigma.
Ved anvendelse av konvensjonelle teknikker for produksjonen av monoklonalt antistoff som beskrevet i Methods in Enzymology, Vol. 121 (1986), ble monoklonale antistoffer produsert i form av ascites og vesentlig renset på en protein G-kolonne oppnådd fra Pharmacia.
8.2. Resultater
De lange v-mos kulene ble blandet med et tusen ganger overskudd av korte v-mos kuler. To milliliter av renset anti-v-mos monoklonalt antistoff (1 pg/ml) i PBS med 0,1% Tween 20 ble tilsatt til blandingen av lang og kort v-mos kuler og inkubert ved romtemperatur i 1 time ved forsiktig blanding. Kulene ble deretter vasket i 1 time ved forsiktig blanding. Kulene ble deretter vasket på en liten potypropylenengangskolonne (oppnådd fra Isolab) hvor kulene ble tilbakeholdt ved fritten. Kulene ble deretter blandet med 2 ml av et sekundært antistoff ved 1:2000 fortynning i 1 time. Etter vasking ble kulene helt inn i en polystyrenpetriskål og latt stå. Supematanten ble fjernet og en oppløsning av 5-brom-4-klor-3-indoylfosfat og nitroblå tetrazolium ble forsiktig tilsatt som et substrat.
Etter inkubasjon ved romtemperatur i 15 minutter, ble lange v-mos kulene
fiolette i forhold til korte v-mos kuler som forble fargeløse. Dette gjorde det mulig å øyeblikkelig detektere en enkelt mørk kule innenfor et dekke med tusenvis av fargeløse kuler. Forskjellen mellom kulene er illustrert i figurene 2 til 4 og alle er fotografier ved 40 ganger forstørrelse av kulene fordelt i petriskålene. Figur 2 viser et dekke av lang v-mos kuler merket med det monoklonale antistoffet.
Figur 3 viser en blanding av lange og korte v-mos kuler merket med anti-v-mos monoklonalt antistoff, og figur 4 viser den enkle deteksjonen av den enkelte blå kulen i et dekke av fargeløse kuler. Kulene som inneholdt peptidsekvensen av interesse ble derfor lett skjelnet og isolert fra de andre kulene i biblioteket.
Etter isolering, ble Applied Biosystems 477A proteinsekvenator anvendt for å bestemme de N-terminale aminosyresekvensene til en enkelt "lang v-mos" harpikskule.
8.3. Konklusjon
Dette eksemplet demonstrerer evnen som foreliggende oppfinnelse har til å selektere en kule inneholdende en bio-oligomerligand, i dette tilfellet peptid, av interesse ut i fra et tusen ganger overskudd av ikke-bindende, irrelevante kuler. Dette eksemplet demonstrerer videre at en reaktiv kule kan bli isolert og sekvensen av peptidet bestemt.
9. Eksempel: Isolering av en kortere peptidliqand som bindes til et reseptormolekyl
For ytterligere å demonstrere anvendelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse når det gjelder å isolere et bestemt peptid, ble et heksapeptid med den forutbestemte sekvensen Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr syntetisert på standard 100 pm PAM harpiks ved anvendelse av N_-Fmoc kjemi og andre reagenser fra standard fast fasepeptidsyntesen.
9.1. Materialer og metoder
Koblingsreaksjonene ble utført som beskrevet i seksjon 8.1. ovenfor. Alfa-amino-blokkerende grupper ble fjernet med 20% piperidin, sidekjedebeskyttende grupper ble fjernet med 50% TFA og peptidet forble kovalentlig koblet til polystyrenharpiksen via en aminokapronsyre-ft-alaninlinker for å tilveiebringe en endelig struktur Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr-aminokapronsyre-li-Ala-harpiks. Denne peptidsekvensen tilsvarer residiene 104 til 109 av v-mos genproduktet beskrevet i eksempel 8, ovenfor.
Som i eksempel 8, ble anti-v-mos antistoffene samlet fra hybridomcellelinjen som produserer musemonoklonalt antistoff spesifikt overtor dette v-mos peptidet. Den merkede sekundære geite-anti-mus IgG-alkaliske fosfatasen ble oppnådd fra Sigma.
9.2. Resultater
Omtrent 0,1 mg PAM harpiks/v-mos peptid beskrevet ovenfor ble blandet med et hundre ganger overskudd av NIJ-Fmoc-alanin PAM harpikskuler oppnådd fra Bachem, Inc. 2 ml av det rensede monoklonale antistoffet (1 pg/ml) i PBS pluss 0,1% Tween 20 ble tilsatt tii peptid/bærerblandingen og inkubert ved romtemperatur i 45 minutter med forsiktig blanding.
Kulene ble vasket på en liten polypropylenengangskolonne (oppnådd fra Isolab) som tilbakeholdt kulene på en fritte. Kulene ble deretter blandet med 2 ml alkalisk fosfatase-merket sekundært antistoff (1:100 fortynning) i en 1 time. Etter vasking ble kulene spredd ut på et stykke glassfilter og dynket i 2I2'-azinobis(3-etylbenztiozolinsulfonsyre) (ABTS) substrat med H2O2. Etter inkubasjon ved romtemperatur i 15 minutter ble PAM harpiks/v-mos peptidkulene mørkegrønne. En mindre omgivende lysegrønn ring ble dannet på glassfilteret. Hovedmengden av fast fase bærerene som manglet v-mos peptidet reagerte ikke med det monoklonale antistoffet og viste derfor ingen farveforandring. v-mos kulene kunne lett sjeldnes fra hverandre.
9.3. Konklusjon
Dette eksemplet demonstrerer at et akseptormolekyl av interesse ikke vil reagere uspesifikt med en fast fase bærer, men er spesifikk for en fast fase bærer/peptid kombinasjon. Som i eksempel 8, ovenfor, kan en positivt reagerende kule bli isolert og det koblede peptidet sekvensert. 10. Eksempel: Bestemmelse av ligander for streptavidin og anti- R- endorfin MAB Dette eksemplet illustrerer videre den meget forskjellige tilnærmelsen til peptidligandidentifikasjon ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. I stedet for å være basert på et biologisk system (f.eks. fusjonsfilamentinneholdende fag) for å danne et tilfeldig bibliotek, anvender foreliggende fremgangsmåte effektivt kjemisk syntese av store peptidbibliotek med hver forskjellig peptid på en individuell kule. Individuelle spesifikt bindende peptidkuler blir deretter fysisk isolert på kulen og sekvensen til det koblede peptidet blir bestemt. Denne metoden avhenger av evnen til kjemisk syntese av et stort tilfeldig peptidbibliotek og å koble dette til et hensiktsmessig system for deteksjon, isolering og strukturbestemmelse.
Metoder for å eliminere dette problemet tilveiebrakt ifølge foreliggende oppfinnelse er å separere harpikskulene til en serie med individuelle like alikvoter i løpet av hver koblingssyklus, og å muliggjøre at hver alikvot av harpiksen reagerer fullstendig med en individuell aktivert aminosyre. Etter fullstendig kobling blir de forskjellige alikvotene til harpiksen grundig blandet, vasket, avspaltet, vasket og på ny separert i alikvoter for en ny koblingssyklus. Derfor er ikke en harpikskule eksponert overfor mer enn en aminosyre i en hvilken som helst koblingssyklus og i slutten av flere slike trinn vil hver kule inneholde en enkelt unik peptidsekvens. Peptidbiblioteket som blir dannet ved hjelp av denne fremgangsmåten vil teoretisk være fullstendig tilfeldig. Ekvimolare forhold av hver peptidart, vil i tillegg bli oppnådd. Det totale antallet permutasjoner og derfor antallet peptider vil avhenge av antall alikvoter og aminosyrer som blir valgt i hvert koblingstrinn, og det totale antallet koblingstrinn i syntesen (lengde på peptidet).
Den nye tilnærmelsen for simultan syntetisering av en mengde peptider tilveiebringer ikke bare et sant randomisert og ekvimolart bibliotek, men resulterer i et bibliotek med fast fasepeptidharpikskuler hvor hver kule omfatter bare en unik peptidsekvens. Den siste egenskapen er tilfelle på grunn av at i løpet av hver syklus av peptidsyntese er hver kule i kontakt med bare en individuell aminosyre av gangen og hver koblingsreaksjon blir drevet fullstendig. Kule-et peptidkonseptet er av viktighet for vellykketheten til den heri beskrevne fremgangsmåten.
Med denne syntetiske metoden kan omtrent et hvilket som helst peptidbibliotek bli syntetisert med veldefinert sammensetning. Opp til alle 20 naturlige L-aminosyrer i individuelle alikvoter kan f.eks. bli anvendt hvert koblingstrinn, eller et enkelt eller noen få aminosyrer kan bli anvendt ved visse koblingstrinn.
10.1. Materialer og metoder
10.1.1. Syntese av et peptidbibliotek
Et stort bibliotek med strukturen X-X-X-X-X-li-Ala-aminokapronsyre-etylendiamin-harpiks ble syntetisert (X = 19 av de 20 vanlige aminosyrene, unntatt cystein, i hvert koblingstrinn). Fast faseharpikskulene som blir valgt for peptidsyntese var polydimetylakrylamid (PDA) (Milligen, Inc. U.S.A.).
Kjemien og fremgangsmåtene for peptidsyntese med denne harpiksen ble utført ifølge Atherton og Sheppard (1988, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, IRL Press). 3 g harpiks (omtrent 2 millioner kuler) ble forsiktig blandet med etylendiamin over natt. Etter en grundig vasking, ble aminokapronsyre etterfulgt av li-alanin koblet tii harpiksen ved anvendelse av Fmoc kjemi, men uten en spaltbar linker. Randomiseringen ble utført i de neste fem koblingstrinnene og alle 19 Fmoo-aminosyre-OPfp unntatt cystein ble anvendt separat i løpet av hvert koblingstrinn. Etter at fem koblingstrinn var fullført ble Fmoc gruppen fjernet i 20% piperidin (v/v) i DMF. Sidekjedebeskyttende grupper ble fjernet med en blanding av 90% TFA (v/v), 1% anisol (v/v), og 0,9% etanditiol (v/v). Harpiksen ble nøytralisert med 10% diisopropyletylamin (i DMF) og lagret i DMF ved 4°C.
Linkeren (i-alaninaminokapronsyre-etylendiamin består av totalt 11 C-atomer og 4 N-atomer med en maksimum armlengde på 17,6 A. På grunn av at 19 forskjellige aminosyrer ble anvendt i hvert av de fem tilfeldige koblingstrinnene, var det teoretiske antallet peptider 19<5>, eller 2,476,099 individuelle pentapeptider i dette biblioteket.
Som tidligere nevnt består den generelle metoden i åsyntetisere et stort bibliotek med tilfeldige peptider på individuelle fast faseharpikskuler slik at hver harpikskule inneholder en enkelt peptidart. En individuell harpikskule som reagerer med et akseptormolekyl kan deretter bli identifisert, isolert fysisk og aminosyresekvensen til peptidliganden vil deretter bli bestemt ved Edman degradering. Vellykketheten til metoden krever derfor nøyaktig identifikasjon av en peptidsekvens på en enkelt kule. Ved anvendelse av en automatisk proteinsekvenator (Model 477A-01 Pulsed Liquid Automatic Protein/Peptide Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, California), 50-500 pmol peptider rutinemessig isolert fra hver harpikskule. Forhåndsanalyser (MiMarch et al., 1990, "Peptides: Chemistry, Structure and Biology," Proceedings of the Eleventh American Peptide Symposium; juli 9-14,1988, La Jolla, Ca., ESCOM, Leiden, s. 229-230) av sekvenseringsdata viste at koblingseffektiviteten til fast fasepeptidsyntesen var i overskudd av 98%.
10.1.2. Spesifikk identifikasjon og seleksjon av peptidligander fra biblioteket Identifikasjon og seleksjon av spesifikke peptidligander fra det tilfeldige biblioteket kan lett bli oppnådd med immunologiske teknikker, så som en enzymbundet immunabsorbansanalyse (ELISA), immunfluorescens eller med immunmagnetiske kuler. For eksperimentene beskrevet heri, ble immunhistokjemiske teknikker anvendt i deteksjonssystemet. Spesifikk-bindingakseptormolekyler anvendt i denne studien var (i) det biotinbindende streptavidinprotein og (ii) et anti-li-endorfinmonoklonalt antistoff (MAb). Ved anvendelse av fusjonsfilamentøs fagepitopebiblioteksystemet (Cwirls et al.; Devlin et al., Seksjon 2, ovenfor), har peptidligander blitt vellykket identifisert med begge av disse akseptormolekylene.
Immunhistokjemiske teknikker ble anvendt for deteksjon av streptavidin bindende kulene. Det tilfeldige biblioteket av peptidkulene ble forsiktig blandet ved å gradvis øke dobbeltdestillert vann til fortynnet DMF. Kulene ble deretter grundig vasket med PBS og gelatin (0,1% vekt/vol.) ble anvendt for å blokkere eventuell uspesifikk binding. En 1:20000 fortynning av streptavidinalkalisk fosfatase (Pierce, Rockford, Illinois) ble deretter tilsatt til kulene med forsiktig blanding i 1 time. Kulene bie deretter grundig vasket og standardsubstratet 5-brom-4-klor-4-indolylfosfat/nitroblå tetrazolium (BCIP/NBT) ble tilsatt. Kulene sammen med substratoppløsningen ble overført til 15 polystyrenpetriskåler (100 x 20 nm) og reaksjonen ble utført i opp til 2 timer. Kuler med bundet streptavidin-alkalisk fosfatase ble mørkeblå, mens hoveddelene av kulene i biblioteket forble fargeløse.
10.1.3. Bestemmelse av peptidligandaffiniteter
Peptidligandbindingsaffinitetene til anti-R-endorfinmonoklonalt antistoff ble bestemt i oppløsningsfasen. Anti-ft-endorfinbindingsanalysen målte peptidligandinhibisjonen til 5,0 nM [<3>|H][Leu]enkefalin (spesifikk aktivitet = 39,0 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) binding til 125-200 ng/ml anti-fi-endorfin NAb i 1,0 ml 40 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,4 buffer inneholdende 1,0 mg/ml boving serumalbumin, 0,1% (v/v) Tween 20 og 0,05%
(vekt/volum) natriumazid. Spesifikk binding ble bestemt som forskjellen mellom bindingen målt i nærvær eller fravær av 1,0 pm umerket [Leujenkefalin. Bundet radioligand ble presipitert ved tilsetning av et 10-gangers overskudd protein-G Sepharose (Pharmacia) etterfulgt av over natt inkubasjon (23-24°C). Protein-G Sepharose ble samlet ved sentrifugering (13000 x g i 5 minutter) og pelletene ble suspendert i 250 pl 5% (v/v) eddiksyre før overføring til beholdere for væskescintillasjonstelling. K^-verdiene (n = 3) ble bestemt ved met-ningsanalyser ved anvendelse av 5 radioligandkonsentrasjoner (1,87 - 30 nM) for [<3>H][Leujenkefalin med duplikat total og uspesifikk bindingsprøverfor hver. Gjennomsnittlig Kd-verdi som ble målt var 9,79 ± 4,63 nM. Peptidligandinhibisjonskurvene ble produsert i åtte konsentrasjoner av peptidet over et 400 ganger område. Bindingsdata for metning og inhibisjonsstudier ble analysert ved vekt-ulineær regresjonsmetoder ved anvendelse av hensiktsmessige enkeltsete-modeller rapportert av Knapp et al. (1990, J.Pharmacol. Exp. Ther. 255:1278-1282). Ki-verdiene for
inhibisjonsbindingskonstantene ble beregnet ved anvendelse av metoden til Cheng og Prusoff (1973, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3102). Hver Ki-verdi ble beregnet for tre til fire uavhengige bestemmelser.
10.2. Resultater
Et stort syntetisk tilfeldig peptidbibliotek (X-X-X-X-X-harpiks, hvor X = 19 vanlige aminosyrer (cystein ble ikke anvendt) for totalt 19<5> = 2,476,099 permutasjoner) ble screenet. Omtrent 2 millioner kuler var tilstede i den delen av biblioteket som ble screenet. I en første-stadiumscreening med streptavidin-alkalisk fosfatase alene (se seksjon 10.1.2., ovenfor), ble omtrent 75 kuler farget med forskjellige fargeintensiteter og ble fysisk selektert og fjernet under et dissekteringsmikroskop ved hjelp av en mikromanipulator. Hver kule ble deretter vasket i 8M guanidinhydroklorid for å fjerne bundet streptavidinenzymkonjugat. Deretter ble hver kule individuelt applisert på et glassfilter for en Applied Biosystems proteinsekvenator (ABI) beholder. Sekvensene til 28 av de 75 kulene er vist i tabell 1. Alle disse kulene har konsensussekvens på enten HPQ eller HPM. Fotomikrografiet i figur 5 illustrerer hvordan en positiv (mørkeblå) kule lett kan bli identifisert i en bakgrunn av mange tusener negative (farveløse) kuler i løpet av screening av peptidligandbiblioteket.
For å bevise av HPQ konsensussekvensene virkelig bindes til biotin-bindingssetet i streptavidinmolekylet ble LHPQF-R-Ala-aminokapronsyre-etylendiaminharpiksen (LHPQF-harpiks) syntetisert. LHPQF-harpiksen ble deretter blandet med streptavidin-alkalisk fosfatase i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av biotin. Resultatene er vist i figur 6. Biotin i 100 nM blokkerte fullstendig fargingen av LHPQF-harpiksen. Ved 10 og 1,0 nM inhiberte biotin delvis farvingen, og ved 0,1 nM konsentrasjonen hadde den ingen virkning på fargingen av LHPQ-harpiksen ved streptavidin-alkalisk fosfatase. Inhibisjonsstudien fastslår at HPQ-konsensussekvensen bindes til biotin-bindingssetet tit streptavidin.
Før anvendelse av det samme tilfeldige peptidbiblioteket for å screene med anti-li-endorfin MAb, ble alle kulene som var blitt farget for streptavidin-alkalisk fosfatase alene fjernet. De gjenværende kulene ble deretter behandlet med 8M guanidinhydroklorid for å fjerne eventuelt bundet protein. Dette resirkulerte biblioteket ble deretter blandet med biotinylert anti-ft-endorfin MAb (anti-fi-endorfin, klon 3-E7, ble oppnådd kommersielt fra Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) i 16 timer. Etter omfattende vasking ble et annet trinn med streptavidin-alkalisk fosfatase anvendt for å utløse farvingsreaksjonen for ELISA. Seks peptider med konsensussekvens som har en nære likhet med den native liganden, Leu-enkafalin (YGGFL), ble identifisert i denne screeningen: YGGMV, YGALQ, YGGLS, YGGFA, YGGFT og YGGFQ. Peptidanaloger med forskjellige karboksylterminus til disse ligandkulene ble syntetisert og deres affinitet (Ki) ble bestemt ved anvendelse av [^H] Leu-enkafaln (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) som merket ligand og umerkede peptider som konkurrerende ligand (anti-fi-endorfinanalyse, seksjon 10.1.2, ovenfor). Resultatene fra disse studiene er oppsummert i tabell 2.
10.3. Diskusjon
Evnen til å syntetisere individuelle peptider på hver kule
kombinert med et sensitivt og spesifikt deteksjonssystem og seleksjonssystem er nøkkelen til vellykketheten til metoden ifølge foreliggende oppfinnelse. Denne nye metoden er betegnet "selektidprosess". En individuell peptidkule selektert fra biblioteket og behandlet med 8M guanidinhydroklorid (for å fjerne bundet
protein) er blitt effektivt renset, idet peptidet forblir kovalentlig koblet til harpiksen og klar for sekvensering. Automatiske peptidsekvenatorer kan sekvensere et peptid i konsentrasjoner som er så lave som 5-10 pmol. Den blå fargen som irreversibelt bindes til kulen interfererer ikke med sekvenseringen. I løpet av hver koblingssyklus for randomisering ble det gjort forsøk på å optimalisere den syntetiske metodologien, inkludert anvendelse av store overskudd N°-Fmoc-aminosyrer. Prøveanalysene av sekvenseringsrådataene demonstrerer klart at koblingseffektiviteten til de syntetiske kjemiske reaksjonene overskred 98%.
På grunn av at de fargede kulene fremkommer i en bakgrunn av fargeløse kuler (f.eks. figur 7) er det enkelt å screene visuelt 2 millioner kuler under et dissekeringsmikroskop i en serie på 10-15 petriskåler og velge ut reaktive kuler for sekvensering. Det er videre mulig å beregne den relative affiniteten til forskjellige ligander ved å undersøke den relative fargingsintensiteten til hver positive kule. Denne egenskapen muliggjør også å velge kuler med spesifikk fargeintensitet for sekvensering.
Devlin et al. (1990, Science 259:404-406, seksjon 2, ovenfor) rapporterte viktigheten av HPQ, HPM, og HPN sekvenser i deres 20
streptavidinbindingsligander isolert med den fusjonsfilamentøse fagteknikken. Av 20 isolater hadde 15 HPQ, 4 hadde HPM og 1 hadde HPN konsensussekvenser. Peptidbiblioteket ga 28 forskjellige peptider og 23 har en HPQ konsensussekvens og 5 har en HPM konsensussekvens (tabell 1). Det ser ut som om posisjonen til HPQ-HPM sekvensen i pentapeptidet ikke var viktig for streptavidin-bindingen. Av alle HPQ eller HPM pentapeptidsekvensene som ble identifisert, ble bare to gjentatt (THPHPQ og MHPMA). Dette står i en sterk kontrast til data rapport av Devlin et al., ovenfor, hvor det var mange gjentagelser blant deres 20 isolater som foreslår at seleksjonsfravik fremkom i deres biosyntetiske metode.
I anti-ft-endorfinsystemet ble 6 peptider med sekvenser som var meget like som den native liganden YGGFL identifisert (tabell 2). Disse resultatene er i samsvar med de som ble oppnådd med fusjonsfilamentøs fagteknikk som anvendte det samme monoklonale antistoffet (klon 3-E7) (Cwirla, et al., 1990, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 87:6378-6382, ovenfor). Til tross for at peptidbiblioteket ga færre ligandsekvenser enn det som ble oppnådd av Cwirla et al., hadde 50% av de oppnådde ligandene mye høyere affinitet for antistoffet enn noe av de som
bie selektert ved fagteknikken.
11. Eksempel: Et begrenset peptidbibliotek
I et annet sett av eksperimenter ble foreliggende oppfinnelse testet med et annet antistoffsystem hvor epitopen var beliggende i midten av peptidkjeden i steden for ved dets N-terminus (som når det gjelder ft-endorfin). Antistoffet som ble anvendt var et anti-v-mos peptid monoklonalt antistoff (anti-v-mos MAb) (se seksjon 11.1., nedenfor). Dette antistoffet ble tilveiebragt fra immuniserte mus med et 12 aminosyrepeptid (LGSGGFGSVYKA) som tilsvarer residiene 100 til 111 av v-mos onkogenproduktet. Peptider ble konjugert til et bærerprotein før immuniseringen. I ELISA testing detekterer dette anti-v-mos MAb homolog sekvens til v-mos, MOS, neu/HER-1, og HER-2 genproduktene.
11.1. Materialer og metoder
Ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig multi-pinnsystem (Geysen et al., 1986, Mol. Immunol. 23:709-715) epitopekartleggingskit (Cambridge Research Biochemical, Boston) for å syntetisere overlappende peptider (sett av tetrapeptider, pentapeptider og heksapeptider) ble epitopen innenfor 12 aminosyre v-mos peptidet gjenkjent av anti-v-mos MAb kartlagt til pentapeptidsekvensen (FGSVY) (dvs. residiet 6-10 av v-mos dodekapeptidet).
I foreliggende eksperiment bie et redusert tilfeldig bibliotek anvendt der aminosyrene valin og serin som er til stede i v-mos epitopen med hensikt ble utelatt. Dette reduserte tilfeldige biblioteket har følgende sammensetning: G-X-X-X-X-X-ft-Ala-aminokapronsyre-etylendiamin-harpiks, hvor X = Glu, Pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Met, Arg, Trp. Disse 14 aminosyrene ble valgt slik at både valin og serin ble utelatt, og alle sidekjedefunksjonelle grupper var fortsatt til stede, dvs. (i) Asn ble valgt men ikke Gin; (ii) Glu ble valgt men ikke Asp; (iii) Thr ble valgt men ikke Ser; (iv) Leu ble valgt men ikke Ile eller Val; og (v) Met ble valgt men ikke Cys. Siden 14 aminosyre ble valgt ved hver av de fem tilfeldige koblingstrinnene, var det teoretiske antallet peptider 10^, eller 537,824 individuelle peptider.
Hybridomcellelinjen som produserer anti-v-mos monoklonalt antistoff ble oppnådd fra Microbiological Asociates Inc., Maryland (Hybridoma nr. 165-28E7, SCRF 354, Lot nr. 165-119).
Peptidligandaffiniteten for anti-v-mos mAb ble målt ved
oppløsningsfasebindingsstudier ved anvendelse av [<3>H]acetyl v-mos peptid ([<3>H]Ac-v-mos) som radioligand. Radiolfganden ble dannet ved N-terminalacetylering av v-mos peptid, før avspaltning av sidekjedene med en ekvimolar mengde [<3>H]natriumacetat (spesifikk aktivitet = 2,52 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). [<3>H]Ac-v-mos produktet, som ble separert fra ureagert v-mos peptid med revers fase HPLC, hadde en spesifikk aktivitet på 2,50 Ci/mmol. Bindingsaffiniteten til [<3>H]Ac-v-mos for anti-v-mos MAb (=10 pg/ml) ble målt i 1,0 ml PBS-gelatinbuffer (0,05% gelatin i PBS) ved 23-24°C etter 3 timers inkubasjon. Spesifikk binding ble definert som forskjellen mellom [<3>H]Ac-v-mos binding i nærvær (uspesifikk) og fravær (totalt) 100 pM umerket v-mos peptid for hver [<3>H]Ac-v-mos konsentrasjon. Bundet radioligand ble separert ved sentrifugering ved anvendelse av et 10-ganger overskudd (bindingsaktivitet relativt til immunoglobulin anvendt) av protein-G Sepharose (Pharmacia) for åpresipitere antistoffet. Metningsbindingsanalyse fra fem bestemmelser over et konsentrasjonsområdet på 125-5000 nM viste at [<3>H]Ac-v-mos var bundet til anti-v-mos mAb med en Kd-verdi på 850 ±160 nM. Bindingsaffinitetene til peptidligandene ble bestemt med studier av bindingsinhibisjon ved anvendelse av syv peptidligandkonsentrasjoner i konkurranse med 10 pg/ml anti-v-mos MAb med 20 nM [<3>H]Ac-v-mos med betingelsene som beskrevet ovenfor. Over 50% av den totale bindingen var spesifikk i inhibisjonsstudiene. Metning og inhibisjonsbindingskonstanter ble bestemt fra enkeltsetebinding ved ulineær regressjonsanalyse som tidligere beskrevet (Knapp og Yamamura, 1990, Life Sei. 46:1457-1463).
11.2. Resultater
Omtrent 230000 kuler ble screenet med et anti-v-mos alkalisk fosfatasekonjugat. Derfor ble mindre enn 43% permutasjoner undersøkt. Etter inkubasjon med substratet, ble omtrent 50 av kulene farvet kraftig blå. 24 av disse kulene ble fysisk valgt ut og aminosyresekvensen til 11 av disse bie bestemt. I tillegg ble 17 farveløse kuler tilfeldig plugget ut for sekvensering.
Resultater av anti-v-mos ligandsekvensering er vist i tabell 3. Siden både valin og serin med hensikt ikke ble innbefattet i dette peptidbiblioteket er det ikke overraskende å oppdage at ingen av de elve peptidligandsekvensene ligner den native epitopen (FGSVY). Til tross for at det ikke var noen gjentagelser i elve ligandene var deres sekvenser ikke-tilfeldige. Både arginin og tyrosin oppstår ofte i disse sekvensene. Minst en og noen ganger to argininer er videre ti Istede i den andre og/eiler tredje posisjonen til hver av disse peptidligandene. De negative kulene valgt tilfeldig, viste derimot ikke noe felles aminosyresekvensmønster. Til tross for at prøvestørrelsen er begrenset, var "chi-square goodness of fir statistisk for sekvensene fra de negative kulene ikke signifikant (x^ = 18,27, df ~ 13, P = 0,15) som indikerer at det ikke er noe bevis for en ikke-jevn distribusjon av aminosyrer for ufargede tilfeldige peptidkuler.
Noen av de positive ligandene ble syntetisert og deres affinitet for anti-v-mos MAb ble bestemt med oppløsningsfasebindingsstudier (seksjon 11.1., ovenfor). Resultatet av disse studier er oppsummert i tabell 4.
Tabell 4A oppsummerer bindingsaffinitetene til v-mos epitopen (bestemt ved epitopekartlegging) for anti-v-mos monoklonalt antistoff. Virkning av endring av karboksylterminusen er også vist. Tabell 4B oppsummerer bindingsaffinitetene til mimotoper identifisert fra et peptidbibliotek som mangler flere av aminosyrene i v-mos epitopen. li-alaninamidet ble inkludert i noen av ligandene testet for å simulere strukturen til den identifiserte liganden hvor antistoffet bindes på kulen.
Affiniteten til best anti-v-mos mimotope i tabell 4 er omtrent 2,5 ganger mindre enn den til det native peptidet. Til tross for at ingen av peptidligandene testet har en Ki-verdi som er så lav som den native v-mos liganden, demonstrerer resultatene klart at ved å anvende et tilfeldig bibliotek som mangler noen av aminosyrene tilstede i den native epitopen, kan en serie strukturelt forskjellige mimotoper med affinitet for akseptormolekylet, dvs. anti-v-mos MAb, bli identifisert.
11.3. Diskusjon
Anti-v-mos MAb i denne studien hadde en relativ affinitet overfor v-mos peptidet (immunogenet). Serin og valin var til stede i v-mos lineære epitopen (FGSVY), men ble med hensikt utelatt fra det anvendte screeningsbiblioteket. Til tross for dette muliggjøre fremgangsmåten definisjonen av en lineær mimotope med totalt forskjellig sekvens og aminosyresammensetning, men med sammenlignbar affinitet for antistoffet. Dette illustrerer klart kompleksiteten samt det mangfoldige ved makromolekylær-peptidinteraksjoner.
12. Eksempel: En selektivt s<p>altbar linker: ONb
Et sett på fire peptider som inkorporerer UV-spaltbar linker ONb (se seksjon 5.4., ovenfor) ble preparert og testet.
12.1. Materialer og metoder
Følgende fire peptider bie preparert på to harpikser ved anvendelse av standard fast fasesynteseteknikker (f.eks. seksjonene 6 og 7, ovenfor):
i) Fmoc-Trp-Ty^OBu<t>j-Phe-ONb-liAla-ACA-EDA-PepSyn K
ii) TRP-Tyr-Phe-ONb-ftAla-ACA-EDA-PepSyn K
iii) Fmoc-Typ-TyrfOBu^-Phe-ONb-BAIa-ACA^-MBHA
iv) Trp-Tyr-Phe-ONb-ifAla-ACA-4-MBHA
Hvert peptid ble bestrålt i 1 og 3 timer med ultrafiolett (UV) og synlig (VIS) lys i 0,3 ml vann eller 3/7 blanding av kloretanohdiklormetanl. Totalt 16 + 16 eksperimenter ble kjørt og analysert.
Etter eksponering ble supernatanten filtrert ut, lyofilisert og på ny løst opp til like volum MeOH (0,3 ml). Produktene ble analysert på HPLC.
12.2. Resultater
Analyse ved HPLC viste klart ingen tripeptidfrigivelse ved VIS bestråling i vann, og nesten fullstendig frigivelse av tripeptid ved UV bestråling i 1 time.
Peptid i i vann ble spaltet til et enkelt produkt. I noen tilfeller ble to produkter observert å eluere fra HPLC. Ved lengre eksponeringstider (UV), ble omdanning mellom de to produktene observert i minst noen få tilfeller.
12.3. Diskusjon
Den UV-sensitive linkeren frigjør klart peptidet i vandig oppløsning. Eksponeringstidene 1 time vil være egnet for ågi ufullstendig frigjøring av peptid. Resultatene viser også at polyamidharpiksen er stabil overfor og kompatibel med vandige systemer.
13. Eksempel: Identifikasjon av en enzvmetterliqnina
13.1. Materialer og metoder
Et tilfeldig bibliotek av pentapeptider omfattende 19 av de 20 vanlige aminosyrene (inkludert cystein) ble preparert ifølge foreliggende oppfinnelse (se seksjon 10.1., ovenfor).
Peptidbiblioteket ble utsatt for det kromogene substratet nitråblå tetrazolium (NBT) klorid i fravær av eksogent enzym under betingelser mottagelige for produktdannelse og positivt reagerende kuler ble identifisert. Disse kulene ble valgt og sekvensert.
13.2. Resultater
Sekvensene til fem kuler som så ut til å katalysere reduksjonen av NTB til det mørkeblå diformazanproduktet er vist i tabell 5.
Tabell 5. Sekvensen til peptid- kuler som ser ut til åvirke som enz<y>mer
13.3. Diskusjon
De foregående resultatene foreslår at peptidet PNNNH-kulen kan redusere MBT til et mørkeblått diformazanpigment enten kjemisk eller enzymatisk. Peptidet eller peptid-kulen demonstrerer derfor aktivitet som et "kunstig enzym" eller en enzymetterligning. 14. Eksempel: Screening for en anti- cancer peptidsekvens Et begrenset bibliotek omfattende pentapeptider med sammensetningen tyrosin etterfulgt av en tilfeldig sekvens omfattende 5 aminosyrer valgt fra gruppen aminosyrer bestående av glutaminsyre, serin, valin, glycin, arginin og asparagin inneholder peptidsekvenser med anti-cancer (dvs. anti-tumor) ceilelinjeaktivitet.
14.1. Materialer oa metoder
Et tilfeldig peptidbibliotek ifølge denne oppfinnelsen ble syntetisert med en hydrolyserbar diketopiperazinlinker. 96-brønnskåler ble anvendt i screeningen for anti-cancer (anti-tumorcelle) medikamenter.
Etter avspaltning av den sidekjedebeskyttende gruppen og N_-Fmoc gruppe, ble peptidkulebiblioteket nøytralisert med DIEA (diisopropyletylamin) og omfattende vasket med DMF for åfjerne gjenværende potensielt toksiske kjemikalier. Biblioteket ble deretter gradvis skiftet til 0,01 M HCI (tilstand hvor linkeren er stabil) og til slutt vasket med 0,001 M HCI. Omtrent 10 bibliotekkuler ble deretter overført til hver brønn i en plate. 50 pl RPMI medium (med 25 mM HEPES buffer) ble deretter tilsatt til hver brønn for ånøytralisere oppløsnings-pH. Ved nøytral eller delvis alkalisk pH vil peptidene bli frigjort (f.eks. etter 16 eller 24 timer).
Enten (1) en del av hele mengden av mediet blir overført til en separat plate med en spesifikk cancercellelinje, eller (2) cancercellelinjen ble tilsatt direkte i brønnen med kulene. Omtrent 2500 lungecancerceller/brønn ble anvendt. Skålene ble deretter inkubert ved 37°C i 7 dager og en MTT analyse ble utført for å kvantifisere den relative cytotoksisiteten til frigjorte peptider i hver brønn.
Forskjellige etablerte humane carcinomer, lymfomer, myelomer, samt leukemicellelinjer kan bli anvendt for screeningen. Eksempler er MCI paneltumorene: L1210 lymfoidleukemi; B16 melanom; Lewis lungecarcinom; M5076 sarkom; tarm 38 carcinom og MX-1 human brystcarcinom. Andre eksempler er: MCF-7 brystcancer; 8226 myelomcellelinje; P388 (mus) leukemicellelinje og Hawkins ikke-lille cellelungecancerlinjen.
14.2. Resultater
Et bibliotek bestående av omtrent 8000 peptider med sekvensen YXXXXX-[kule], hvor Y er Tyr og X er Glu, Ser, Val, Gly, Arg, eller Asn, ble screenet. I to eksperimenter demonstrerte 3-4 supernatanter inneholdende frigjort peptid ut i fra noen få tusen vekstinhibisjon av Hawkins ikke-lille cellelungecancerlinjen. Idet hver brønn inneholdt omtrent 10 kuler, ble vesentlig alle 8000 mulige sekvenser testet og så mange som 3 aktive peptid kuler ble identifisert. Samme resultattype fremkom med begge direkte inkubasjoner av kuler med celler og
med overføring av den frigjorte peptidsupenratanten.
14.3. Diskusjon
Disse resultatene indikerer at et begrenset bibliotek av peptider kan innbefatte noen peptidsekvenser med cytotoksisk aktivitet. I det foregående eksemplet, omtrent 0,05% av de mulige sekvensene demonstrerte anti-cancercelleaktivitet. Ved analysering av supernatanter inneholder frigjort peptid i flere analyser kan toksisitet overfor andre cancerceller og overfor normale vevceller bli bestemt.
På denne måten kan peptidsekvenser med bred toksisitet for tumorceller eller med toksisitet for en spesifikk tumorcellelinje bli identifisert. Sekvenser med lav toksisitet for normale celler vil bli foretrukket som terapeutiske midler. Denne fremgangsmåten kan bli anvendt for screening av antimikrobielle, antiparasittiske og vekstfaktorantagonister.
En lignende screeningsmetode for en vekstfaktoragonist anvender en vekstfaktor avhengig cellelinje. I en slike analyse vil peptidsekvenser med vekstfaktoragonistaktivitet stimulere veksten av celler dyrket i fravær av den essensielle vekstfaktoren.
Forskjellige publikasjoner er sitert heri og beskrivelsene er inkorporert som referanse.

Claims (45)

1. Bibliotek av bio-oligomerer, karakterisert ved at det består av en multiplisitet av arter av biologiske-aktive avbeskyttede biooligomerer og en multiplisitet av fast fase bærere som er grundig blandbare og egnede for reaksjonsbetingelsene ved bio-oligomer kjemisk syntese; hvor en enkelt avbeskyttet bio-oligomerart er koblet til hver fast fase bærer for å danne en fast fase bærer/bio-oligomer kombinasjon, og hvorfor hver art i biblioteket er identiteten til en subenhet av biooligomeren til stede i en hvilke som helst gitt ikke-unrform posisjon av bio-oligomerarten statistisk uavhengig av identiteten til subenhetene ved andre posisjoner av bio-oligomerarten.
2. Bibliotek ifølge krav 1, karakterisert ved at bio-oligomerene er avbeskyttede peptider.
3. Bibliotek ifølge krav 2, karakterisert ved at subenhetene blir valgt fra gruppen bestående av glycin, L-aminosyrer, D-aminosyrer, ikke-klassiske aminosyrer og peptidetterlignere.
4. Bibliotek ifølge krav 2, karakterisert ved at peptidene omfatter minst to aminosyrer med evne til kryssbinding.
5. Bibliotek ifølge krav 4, karakterisert ved at peptidene er blitt behandlet for å kryss-binde peptidene og danne tvungede, cykliserte eller rigidiserte peptider.
6. Bibliotek ifølge krav 1,karakterisert ved at fast fase bæreren omfatter en linker.
7. Bibliotek ifølge krav 1,karakterisert ved at bio-oligomerene er avspaltede oligonukleotider.
8. Bibliotek ifølge krav 7, karakterisert ved at subenhetene blir valgt fra gruppen bestående av ribonukleosider, deoksyribonukleosider og nukleosidderivater.
9. Fremgangsmåte for å danne et bibliotek av biologiske aktive bio-oligomerer, karakterisert ved at den omfatter: (a) tilveiebringing av minst så mange alikvoter av en fast fase bærer som antall forskjellige arter av bio-oligomersubenheter som blir tilsatt, men minst to, for å danne bio-oligomerene; (b) separat introdusere et sett subenheter til alikvotene av fast fase bæreren slik at en subenhet er introdusert til hver alikvot; (c) fullstendig kobling av subenhetene til vesentlig alle setene av fast fase bæreren for å danne en fast fase bærer/nysu ben hets kombi nasjon; (d) vurdering av fullført kobling, og om nødvendig, tvinge reaksjonen til fullførelse (e) grundig blanding av alikvotene til fast fase bærer/ny subenhet kombinasjon; og, etter gjentagelse av trinnene (a)-(e) ønsket antall ganger, et endelig trinn omfattende: fjerning av beskyttelsesgruppene slik at hver biologisk aktiv bio-oligomer forblir koblet til fast fase bæreren.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert ved at fast fase bæreren er polydimetylakrylamid.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at fast fase bæreren velges fra gruppen bestående av polystyrenharpiks, polyhipeharpiks, polyamidharpiks, polystyrenharpiks podet med polyetylenglykol og polydimetylakrylamidharpiks.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert ved at fast fase bæreren er silika.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at fast fase bæreren omfatter en linker.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at linkeren omfatter en linker valgt fra gruppen bestående av aminosmørsyre, aminokaproisk syre, 7-aminoheptanoisk syre, etylengiykol og 8-aminokaprylsyre.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at linkeren omfatter aminokapron syre.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at bio-oligomerbiblioteket blir fremstilt slik at i minst et trinn blir den samme subenheten koblet til alle fast fase bærerene, og i minst et annet trinn blir minst to forskjellige subenheter separat koblet til minst to alikvoter av fast fase bæreren.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at trinnene (a)-(e) blir utført en gang.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at trinnene (a)-(e) biir utført mer enn en gang.
19. Fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en bio-oligomerligand for et akseptormolekyl, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) innføring, til bibliotek ifølge krav 1, et akseptormolekyl av interesse slik at nevnte akseptormolekyl vil gjenkjenne og bli bundet til en eller flere fast fase bærer/bio-oligomerart innenfor biblioteket (b) isolere en fast fase bærer/bio-oligomerart som utviser binding til akseptormolekylet; og (c) bestemmelse av sekvensen til bio-oligomeren av fast fase bærer/bio-oligomeren isolert i trinn (b).
20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at akseptormolekylet velges fra gruppen bestående av antistoffer, reseptorer, viruser, bakterier, proteiner, karbohydrater, nukleinsyrer, lipider, medikamenter, metaller og små molekyler.
21. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at akseptormolekylet er et antistoff.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at akseptormolekylet er en reseptor.
23. Fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en biologisk aktiv bio-oligomer ligand, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) frigjøring, in situ, en del av bio-oligomerene til bio-oligomer biblioteket ifølge krav 1; (b) detektering, in situ, den biologiske aktiviteten av interesse til frigjort bio-oligomer; (c) isolering av en fast fase bærer/bio-oligomer, hvor det er koblet dertil, arter av bio-oligomeren som utviser den biologiske aktiviteten av interesse; og (d) bestemme sekvensen til bio-oligomerartene som er igjen på fast fase bæreren isolert i trinn (c).
24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den faste bæreren er syre-sensitiv, base-sensitiv, nukleofil-sensitiv, fotosensitiv, elektrofil-sensitiv, oksidasjon-sensitiv eller reduksjon-sensitiv.
25. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den faste bæreren omfatter en linker som er syre-sensitivi, base-sensitiv, nukleofil-sensitiv, elektrofil-sensitiv, foto-sensitiv, oksidasjonssensitiv eller reduksjonssensitiv.
26. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at in situ frigjøringen ifølge trinn (a) blir oppnådd ved enzymatisk spaltning, kjemisk spaltning eller en fotokjemisk spaltning.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den biologiske aktiviteten detektert i trinn (b) velges fra gruppen bestående av cytotoksisitet, anti-tumor aktivitet, anti-bakteriell aktivitet, anti-viral aktivitet, anti-sopp aktivitet, anti-parasitt aktivitet, vekstfaktor aktivitet, vekstinhibitorisk aktivitet, hormon aktivitet, neurotransmitter aktivitet, immunmodulator aktivitet og regulatorisk aktivitet.
28. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den biologiske aktiviteten detektert i trinn (b) er en inhibisjon av et enzym.
29. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden er et terapeutisk middel.
30. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden er et diagnostisk middel.
31. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en cytotoksisk aktivitet.
32. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en anti-tumor aktivitet.
33. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en antimikrobiell aktivitet.
34. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en vekstfaktor agonist aktivitet.
35. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en vekstfaktor antagonist aktivitet.
36. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en hormon agonist aktivitet.
37. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en hormon antagonist aktivitet.
38. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens som har en erytropoietin agonist aktivitet.
39. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en oligonukleotidsekvens som har en cytotoksisk aktivitet.
40. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en oligonukleotidsekvens som har en antitumor aktivitet.
41. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en oligonukleotidsekvens som har en antimikrobiell aktivitet.
42. Fremgangsmåte ifølge krav 19 eller 23, karakterisert ved at bio-oligomer liganden består av en peptidsekvens innbefattet i en vaksine.
43. Fremgangsmåte for å bestemme sekvensen til en bio-oligomer som katalyserer en reaksjon, karakterisert ved at den omfatter: (a) tilsetning, til biblioteket av bio-oligomerer ifølge krav 1, et substrat slik at et reaksjonsprodukt er detekterbart; (b) isolering av en fast fase bærer som har en bio-oligomer art som utviser aktiviteten av interesse; og (c) bestemme sekvensen av bio-oligomeren koblet til bæreren isolert i trinn (b).
44. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at bio-oligomer liganden som har en enzym inhibitorisk aktivitet er et oligonukleotid.
45. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at bio-oligomer liganden som har en enzyminhibitorisk aktivitet er et peptid som består av aminosyrer valgt fra gruppen bestående av glycin, unaturlige aminosyrer, D-isomerer av naturlige aminosyrer, aminosyreanaloger og peptidomimetikker.
NO19930011A 1990-07-02 1993-01-04 Bibliotek av bio-oligomerer og fremgangsmåte for fremstilling av dette, samt for å bestemme sekvensen til en bio-oligomerligand for etakseptormolekyl, enbiologisk aktiv bio-oligomerligand eller en bio-oligomer somkatalyserer en reaksjon NO315002B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54684590A 1990-07-02 1990-07-02
US07/717,454 US5650489A (en) 1990-07-02 1991-06-19 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
PCT/US1991/004666 WO1992000091A1 (en) 1990-07-02 1991-07-01 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO930011D0 NO930011D0 (no) 1993-01-04
NO930011L NO930011L (no) 1993-02-22
NO315002B1 true NO315002B1 (no) 2003-06-23

Family

ID=27068387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19930011A NO315002B1 (no) 1990-07-02 1993-01-04 Bibliotek av bio-oligomerer og fremgangsmåte for fremstilling av dette, samt for å bestemme sekvensen til en bio-oligomerligand for etakseptormolekyl, enbiologisk aktiv bio-oligomerligand eller en bio-oligomer somkatalyserer en reaksjon

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5650489A (no)
EP (1) EP0542770B1 (no)
JP (1) JP3552718B2 (no)
KR (2) KR100222146B1 (no)
AT (1) ATE176330T1 (no)
AU (3) AU659091B2 (no)
CA (1) CA2086672C (no)
CZ (1) CZ289365B6 (no)
DE (1) DE69130828T2 (no)
DK (1) DK0542770T3 (no)
ES (1) ES2126572T3 (no)
FI (1) FI107995B (no)
GR (1) GR3029443T3 (no)
HU (1) HU218007B (no)
IE (1) IE912299A1 (no)
IL (1) IL98682A (no)
MX (1) MX9100052A (no)
NO (1) NO315002B1 (no)
NZ (1) NZ238805A (no)
PL (2) PL168354B1 (no)
RO (1) RO112336B1 (no)
SK (1) SK281490B6 (no)
WO (1) WO1992000091A1 (no)

Families Citing this family (626)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5747334A (en) * 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
US5639595A (en) * 1990-05-01 1997-06-17 Isis Phamaceuticals, Inc. Identification of novel drugs and reagents
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US6197529B1 (en) * 1990-11-21 2001-03-06 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Linear substituted oligoalkyleneimine libraries
US20050209121A1 (en) * 1990-12-05 2005-09-22 Novozymes A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
US5646001A (en) * 1991-03-25 1997-07-08 Immunivest Corporation Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
WO1993004204A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthetic unrandomization of oligomer fragments
AU2580892A (en) * 1991-09-05 1993-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents
DK0604552T3 (da) * 1991-09-18 1997-08-04 Affymax Tech Nv Fremgangsmåde til syntese af forskellige samlinger af oligomerer
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US6117974A (en) * 1991-10-02 2000-09-12 Peptor Limited Libraries of backbone-cyclized peptidomimetics
US20010021513A1 (en) * 1991-11-21 2001-09-13 Puijk Wouter Cornelis Test device comprising a plate containing a multiplicity of wells with an associated metering device, as well as a kit which comprises these devices and use of the devices
US5573905A (en) * 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
DE69330027T3 (de) * 1992-04-15 2008-09-25 The Johns Hopkins University Synthese von verschiedenen und nützlichen oligonukleotidsammlungen
US5541061A (en) * 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
AU4779493A (en) * 1992-07-21 1994-02-14 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
PT665897E (pt) * 1992-10-01 2003-11-28 Trustees Of Columbia U In The Bibliotecas quimicas combinatorias complexas codificadas com etiquetas
US6503759B1 (en) 1992-10-01 2003-01-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5721099A (en) * 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5565324A (en) * 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5807683A (en) * 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
DE4243770A1 (de) * 1992-12-23 1994-06-30 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
AU6281594A (en) * 1993-03-12 1994-09-26 Jerini Bio Chemicals Gmbh Process for synthesizing and selecting sequences of covalently bound components
US6864048B2 (en) 1993-04-28 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Factorial chemical libraries
ATE366741T1 (de) * 1993-05-27 2007-08-15 Aventis Pharma Inc Topologisch getrennte, kodierende festphasen- bibliotheken
US5840485A (en) * 1993-05-27 1998-11-24 Selectide Corporation Topologically segregated, encoded solid phase libraries
WO1994028424A1 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Chiron Corporation Method for selection of biologically active peptide sequences
US5846731A (en) * 1993-06-17 1998-12-08 Torry Pines Institute For Molecular Studies Peralkylated oligopeptide mixtures
US5480971A (en) * 1993-06-17 1996-01-02 Houghten Pharmaceuticals, Inc. Peralkylated oligopeptide mixtures
ATE210993T1 (de) * 1993-06-21 2002-01-15 Selectide Corp Selektiv spaltbare verbindungen, die auf iminodiessigsäure-ester-bindungen basieren
WO1995001800A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation Cyclic semi-random peptide libraries
AU7193494A (en) * 1993-07-21 1995-02-20 Oxford Glycosystems Ltd Saccharides, their synthesis and use
US6001982A (en) * 1993-07-29 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
CA2169456A1 (en) * 1993-08-13 1995-02-23 J. Wesley Fox Biocatalytic methods for synthesizing and identifying biologically active compounds
CN1525171A (zh) * 1993-10-01 2004-09-01 ŦԼ�и��ױ��Ǵ�ѧ���� 用标示物编码的多元组合化学库
US5922545A (en) * 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US6165778A (en) * 1993-11-02 2000-12-26 Affymax Technologies N.V. Reaction vessel agitation apparatus
US5503805A (en) * 1993-11-02 1996-04-02 Affymax Technologies N.V. Apparatus and method for parallel coupling reactions
US6287787B1 (en) 1993-11-24 2001-09-11 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Dimeric oligopeptide mixture sets
AU1068295A (en) * 1993-12-09 1995-06-27 Novartis Ag Process for the production of combinatorial compound libraries
WO1995016918A1 (en) * 1993-12-15 1995-06-22 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
US5587471A (en) * 1994-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of making oligonucleotide libraries
JPH09511486A (ja) * 1994-01-13 1997-11-18 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 合成レセプター、ライブラリー及びこれらの使用
US5593853A (en) * 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5541085A (en) * 1994-02-14 1996-07-30 Zymogenetics, Inc. Method for preparing orphan receptor ligands
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
AU690656B2 (en) * 1994-03-11 1998-04-30 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
US6015880A (en) * 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US6936477B2 (en) 1994-04-13 2005-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5856083A (en) * 1994-05-06 1999-01-05 Pharmacopeia, Inc. Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules
US5846841A (en) * 1994-05-20 1998-12-08 Selectide Corporation Motif Libraries
IL109943A (en) * 1994-06-08 2006-08-01 Develogen Israel Ltd Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
US6407059B1 (en) 1994-06-08 2002-06-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
WO1995034813A1 (en) * 1994-06-14 1995-12-21 Smithkline Beecham Corporation Resins for solid state synthesis
US5663046A (en) * 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5817751A (en) * 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
AU2871195A (en) * 1994-06-23 1996-01-19 Affymax Technologies N.V. Methods for the synthesis of diketopiperazines
US5939268A (en) * 1994-07-26 1999-08-17 The Scripps Research Institute Combinatorial libraries of molecules and methods for producing same
MX9700725A (es) * 1994-07-26 1997-05-31 Scripps Research Inst Coleccion combinatoria soluble.
US5948693A (en) * 1994-09-01 1999-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
US5463564A (en) * 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US6558633B1 (en) 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
US5846719A (en) * 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US5604097A (en) * 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
AU3599895A (en) * 1994-10-14 1996-05-06 Chiron Mimotopes Pty Ltd Method and apparatus for efficient mimotope discovery
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US5688696A (en) * 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
DE4444260A1 (de) * 1994-12-13 1996-06-20 Hoechst Ag Cyclohexapeptide und deren Mischungen, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung
WO1996022067A2 (en) * 1994-12-27 1996-07-25 United Biomedical, Inc. Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics
US5712171A (en) 1995-01-20 1998-01-27 Arqule, Inc. Method of generating a plurality of chemical compounds in a spatially arranged array
GB9502225D0 (en) * 1995-02-04 1995-03-22 Zeneca Ltd Method
AU5487496A (en) * 1995-05-03 1996-11-21 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5759865A (en) * 1995-05-03 1998-06-02 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5834318A (en) * 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5750674A (en) * 1995-05-23 1998-05-12 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced
AU5871196A (en) * 1995-05-23 1996-12-24 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the synthesis of oligonucleotides and the oligonucleotides thereby produced
US20010053523A1 (en) * 1995-06-02 2001-12-20 M&E Biotech A/S. Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
US6051554A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5770687A (en) * 1995-06-07 1998-06-23 Peptor Limited Comformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
CA2225313A1 (en) * 1995-06-21 1997-01-09 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
SE9502286D0 (sv) * 1995-06-22 1995-06-22 Pharmacia Ab Process for detection, quantification and/or identification of a peptide
US6579848B1 (en) * 1995-06-23 2003-06-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Depigmenting activity of agouti signal protein and peptides thereof
GB9515070D0 (en) * 1995-07-22 1995-09-20 Zeneca Ltd Label
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
AU693723B2 (en) * 1995-09-11 1998-07-02 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
AU728668B2 (en) * 1995-09-11 2001-01-18 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
US6743892B1 (en) 1995-09-11 2004-06-01 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ in vivo
US7026114B1 (en) * 1995-09-13 2006-04-11 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for monitoring polymer array synthesis
US6841533B1 (en) 1995-12-07 2005-01-11 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized interleukin-6 antagonists
US6147205A (en) * 1995-12-15 2000-11-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups and methods for their use
US20110028350A1 (en) * 1995-12-15 2011-02-03 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
CA2238995A1 (en) * 1995-12-18 1997-06-26 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Methods for identifying compounds that bind to a target
AU1582197A (en) * 1996-01-22 1997-08-11 Eli Lilly And Company Combinatorial process for preparing substituted indane libraries
US6455247B1 (en) 1996-01-23 2002-09-24 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
US6365344B1 (en) * 1996-01-23 2002-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
US6277583B1 (en) * 1996-02-07 2001-08-21 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries and applications thereof
US6080719A (en) * 1996-02-23 2000-06-27 Hoechst Aktiengesellschaft Cyclohexapeptides and their mixtures, a process for preparing them, and their use
WO1997033000A1 (en) * 1996-03-04 1997-09-12 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
DE19610103A1 (de) 1996-03-15 1997-09-18 Basf Ag Cycloalkylderivate und ihre Synthese an fester Phase
EP0954601A4 (en) * 1996-03-20 2004-08-18 Genzyme Corp METHOD FOR DETECTING CYTOTOXIC T-CELL EPITOPES
EP0901629A4 (en) * 1996-03-21 2000-02-02 Univ Princeton CARBOHYDRATE LIBRARY, ASSAY AND METHOD
US5866341A (en) * 1996-04-03 1999-02-02 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for screening drug libraries
US7144119B2 (en) 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US6387707B1 (en) 1996-04-25 2002-05-14 Bioarray Solutions Array Cytometry
ATE366418T1 (de) 1996-04-25 2007-07-15 Bioarray Solutions Ltd Licht-regulierte, elektrokinetische zusammensetzung von partikeln an oberflächen
US5958342A (en) * 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
DE19621177A1 (de) 1996-05-24 1997-11-27 Basf Ag Kohlenhydratderivate und ihre Synthese an fester Phase
US6696251B1 (en) 1996-05-31 2004-02-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6203978B1 (en) * 1996-05-31 2001-03-20 Du Vergier Ltd. Capture of single stranded nucleic acids
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
JP3734040B2 (ja) 1996-06-14 2006-01-11 明治乳業株式会社 Ｔ細胞エピトープペプチド
WO1997049430A1 (en) * 1996-06-26 1997-12-31 Antigen Express, Inc. Immunotherapy by modulation of antigen presentation
DE19626762A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Basf Ag Enzymatisch spaltbare Linker für Festphasensynthesen
US6355613B1 (en) 1996-07-31 2002-03-12 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5922872A (en) * 1996-08-01 1999-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Meta-benzylic and alpha-amido compositions and methods for preparing same
US5817489A (en) * 1996-08-01 1998-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Di-nitrogen heterocycle compositions
US6576239B1 (en) 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
WO1998011437A1 (en) 1996-09-16 1998-03-19 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries with tagged leaving groups
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5798035A (en) 1996-10-03 1998-08-25 Pharmacopeia, Inc. High throughput solid phase chemical synthesis utilizing thin cylindrical reaction vessels useable for biological assay
US20020022227A1 (en) * 1996-10-17 2002-02-21 Short Jay M. Morphatides: novel shape and structure libraries
US6838238B1 (en) * 1996-10-17 2005-01-04 Invitrogen Corporation Morphatides: novel shape and structure libraries
US6149869A (en) * 1996-10-23 2000-11-21 Glaxo Wellcome Inc. Chemical synthesizers
US6042789A (en) * 1996-10-23 2000-03-28 Glaxo Group Limited System for parallel synthesis of organic compounds
US6025371A (en) * 1996-10-28 2000-02-15 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6413724B1 (en) 1996-10-28 2002-07-02 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6571227B1 (en) 1996-11-04 2003-05-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system and computer program product for non-linear mapping of multi-dimensional data
US6453246B1 (en) 1996-11-04 2002-09-17 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing proximity data in a multi-dimensional space
CA2270527A1 (en) 1996-11-04 1998-05-14 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for the visualization and interactive processing and analysis of chemical data
EP1164203B1 (en) 1996-11-06 2007-10-10 Sequenom, Inc. DNA Diagnostics based on mass spectrometry
US6054325A (en) * 1996-12-02 2000-04-25 Glaxo Wellcom Inc. Method and apparatus for transferring and combining distinct chemical compositions with reagents
US6083761A (en) * 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
AU7624298A (en) * 1996-12-03 1998-06-29 Graybill, Todd L. Aminobenzenedicarboxylic acid-based combinatorial libraries
AU5794498A (en) 1996-12-10 1998-07-03 Genetrace Systems, Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
CA2283474A1 (en) * 1997-03-04 1998-09-11 Bio-Technology General Corp. Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs
US6045755A (en) * 1997-03-10 2000-04-04 Trega Biosciences,, Inc. Apparatus and method for combinatorial chemistry synthesis
US6177464B1 (en) 1997-03-14 2001-01-23 Sepracor, Inc. Ring opening metathesis of alkenes
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
JPH10260223A (ja) * 1997-03-19 1998-09-29 Fujitsu Ltd 半導体検査装置及びこれを用いた検査方法
JP2002506423A (ja) * 1997-04-11 2002-02-26 イーライ・リリー・アンド・カンパニー ペプチド模倣型大員環のコンビナトリアルライブラリーとそのための方法
US6004823A (en) * 1997-05-07 1999-12-21 Smithkline Beecham Corporation Compounds
US5908960A (en) * 1997-05-07 1999-06-01 Smithkline Beecham Corporation Compounds
GB9710582D0 (en) 1997-05-22 1997-07-16 Oxford Glycosciences Uk Ltd A method for de novo peptide sequence determination
AU756945B2 (en) * 1997-05-23 2003-01-30 Bioarray Solutions Ltd Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
WO1998058256A1 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill PEPTIDO OLIGONUCLEOTIDES (PONs) AND THEIR COMBINATORIAL LIBRARIES
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
EP1387390B1 (en) 1997-06-20 2009-02-18 Bio - Rad Laboratories, Inc. Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine
US5874589A (en) * 1997-07-18 1999-02-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for synthesizing diverse collections of tetramic acids and derivatives thereof
US6410342B1 (en) * 1997-08-19 2002-06-25 Pharmacopeia, Inc. Method and apparatus for controlled photoelution
US6960457B1 (en) 1997-09-04 2005-11-01 Stanford University Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface
US7252950B1 (en) 1997-09-04 2007-08-07 The Regents Of The University Of California Assays for detecting modulators of cytoskeletal function
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
ATE218892T1 (de) 1997-11-07 2002-06-15 Conjuchem Inc Affinitätsmarkierer für menschliches serum albumin
US6228579B1 (en) * 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
US6083682A (en) * 1997-12-19 2000-07-04 Glaxo Group Limited System and method for solid-phase parallel synthesis of a combinatorial collection of compounds
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US6497820B1 (en) 1998-02-03 2002-12-24 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
US5968361A (en) * 1998-02-24 1999-10-19 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
AU2795399A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Hplc fractionation of complex chemical mixtures
US6232287B1 (en) 1998-03-13 2001-05-15 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
EP1062508A1 (en) 1998-03-20 2000-12-27 The Rockefeller University Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof
AU767185B2 (en) 1998-03-23 2003-11-06 President And Fellows Of Harvard College Synthesis of compounds and libraries of compounds
AU3457199A (en) * 1998-03-30 1999-10-18 Arch Development Corporation Methods and compounds for modulating nuclear receptor activity
US6316616B1 (en) 1998-04-02 2001-11-13 President And Fellows Of Harvard College Parallel combinatorial approach to the discovery and optimization of catalysts and uses thereof
US6872537B1 (en) 1998-04-14 2005-03-29 Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
WO1999053295A1 (en) 1998-04-14 1999-10-21 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
US6699969B1 (en) 1998-04-14 2004-03-02 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
DE19819889A1 (de) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren
CA2330790A1 (en) 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Method and device for isolating nucleic acids
US6541211B1 (en) 1998-05-20 2003-04-01 Selectide Corporation Apparatus and method for synthesizing combinational libraries
US6872535B2 (en) 1998-05-20 2005-03-29 Aventis Pharmaceuticals Inc. Three-dimensional array of supports for solid-phase parallel synthesis and method of use
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US7387779B2 (en) * 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US7402400B2 (en) 2001-07-03 2008-07-22 Regents Of The University Of California Mammalian sweet taste receptors
AU757955B2 (en) 1998-08-17 2003-03-13 Bristol-Myers Squibb Company Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules
US6633543B1 (en) * 1998-08-27 2003-10-14 Intel Corporation Multicast flow control
US6423493B1 (en) * 1998-10-26 2002-07-23 Board Of Regents The University Of Texas System Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US20040242521A1 (en) * 1999-10-25 2004-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Thio-siRNA aptamers
AU1818400A (en) * 1998-11-12 2000-05-29 Eli Lilly And Company Aryloxime linkers in the solid-phase synthesis of 3-aminobenzisoxazoles
US20030027214A1 (en) * 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
EP1185871A4 (en) 1999-06-01 2003-01-15 Caliper Techn Corp MICRO-SCALE ASSAYS AND MICROFLUIDIC DEVICES FOR THE CONTROL OF TRANSPORTER, INDUCED GRADIENT AND BINDING ACTIVITIES
JP2003502304A (ja) 1999-06-14 2003-01-21 ジェネンテック・インコーポレーテッド ターンライブラリをファージ上に表示するための構造化ペプチド骨格
SE9902479D0 (sv) * 1999-06-30 1999-06-30 Amersham Pharm Biotech Ab Particle classification as marker
US7742877B1 (en) * 1999-07-22 2010-06-22 Becton, Dickinson & Company Methods, apparatus and computer program products for formulating culture media
EP1218545B1 (en) * 1999-08-18 2012-01-25 Illumina, Inc. Methods for preparing oligonucleotide solutions
DE60044904D1 (de) 1999-09-03 2010-10-14 Brigham & Womens Hospital Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von entzündungskrankheiten unter verwendung von cadherin-11-modulierenden agenzien
US6503713B1 (en) * 1999-10-04 2003-01-07 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods for identifying RNA binding compounds
US6569685B1 (en) 1999-10-05 2003-05-27 The Molecular Sciences Institute, Inc. Protein fingerprint system and related methods
KR100378252B1 (ko) * 1999-11-12 2003-03-29 학교법인 포항공과대학교 니트로술포닐에톡시카르보닐-아미노산을 이용한 합성테트라펩티드 라이브러리의 제조방법
US6458538B1 (en) * 1999-12-14 2002-10-01 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay
US7452664B2 (en) 1999-12-15 2008-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation
US8642284B1 (en) 1999-12-15 2014-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents that alter NAD-dependent deacetylation activity of a SIR2 protein
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
JP2003520050A (ja) 2000-01-24 2003-07-02 フィロス インク． タンパク質分析のための高感度多重化診断アッセイ法
JP2003523504A (ja) 2000-02-03 2003-08-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 認知に影響する因子の検出のためのアッセイ
US7416524B1 (en) 2000-02-18 2008-08-26 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. System, method and computer program product for fast and efficient searching of large chemical libraries
US6671627B2 (en) 2000-02-29 2003-12-30 3-D Pharmaceuticals, Inc. Method and computer program product for designing combinatorial arrays
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
AU2001247627A1 (en) 2000-03-22 2001-10-03 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
US20050037430A1 (en) * 2000-03-29 2005-02-17 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
USRE43279E1 (en) 2000-03-29 2012-03-27 Biotemp B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
AU2001249805A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
AU2001268468A1 (en) 2000-06-13 2001-12-24 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
CA2413978C (en) 2000-06-21 2008-12-16 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
US6759510B1 (en) * 2000-06-30 2004-07-06 Becton, Dickinson And Company Peptides for use in culture media
US20020019010A1 (en) * 2000-07-07 2002-02-14 Stockwell Brent R. Methods for identifying combinations of entities as therapeutics
US20020051991A1 (en) * 2000-07-11 2002-05-02 Zhi Hong Rapid generation of diverse nucleoside and nucleotide libraries
WO2002014867A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Agilix Corporation Ultra-sensitive detection systems
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US7452964B2 (en) 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US6963807B2 (en) 2000-09-08 2005-11-08 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Automated identification of peptides
US7420030B2 (en) 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
AU2001292142A1 (en) * 2000-09-11 2002-03-22 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
WO2002023202A2 (en) * 2000-09-18 2002-03-21 Genzyme Corporation Method to identify antibody targets based on mass spectrometry (maldi-tof)
AU2001294654A1 (en) 2000-09-25 2002-04-08 The Regents Of The University Of California Model for neurodegenerative diseases involving amyloid accumulation
US20030045005A1 (en) * 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US7045283B2 (en) 2000-10-18 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies
WO2002046400A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mutated class ii major histocompatibility proteins
US7572575B2 (en) 2000-12-13 2009-08-11 Massachusetts Institute Of Technology SIR2 activity
EP1404867B1 (en) 2000-12-23 2008-02-27 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Oligonucleotide transfection screening method
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
US7054757B2 (en) 2001-01-29 2006-05-30 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. Method, system, and computer program product for analyzing combinatorial libraries
DE10106339A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-22 Hans-Joachim Mueller Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
US20060228730A1 (en) * 2001-04-11 2006-10-12 Rando Robert F Methods for identifying small molecules that bind specific RNA structural motifs
US20050142545A1 (en) * 2001-04-11 2005-06-30 Conn Michael M. Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs
CA2381627C (en) * 2001-04-13 2010-06-22 Michael J. Mitrovich Solid lubricant and composition
US6914123B2 (en) 2001-04-17 2005-07-05 Genentech, Inc. Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
CZ20033143A3 (en) 2001-05-21 2004-04-14 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
US20030148380A1 (en) * 2001-06-05 2003-08-07 Belcher Angela M. Molecular recognition of materials
US20030113714A1 (en) * 2001-09-28 2003-06-19 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticles
US20050164515A9 (en) * 2001-06-05 2005-07-28 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticle nucleation, shape and crystal phase
JP4342934B2 (ja) 2001-06-11 2009-10-14 キセノポート インコーポレーティッド Ｐｅｐｔ−２輸送体を介した薬剤の投与
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
EP2327985B2 (en) 2001-06-26 2019-08-21 Senomyx, Inc. T1R Hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
AU2002312566A1 (en) 2001-07-09 2003-01-29 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
US6800449B1 (en) * 2001-07-13 2004-10-05 Syngenta Participations Ag High throughput functional proteomics
US7413870B2 (en) 2001-08-01 2008-08-19 Rigel Pharmaceuticals, Incorporated SAK: modulation of cellular proliferation for treatment of cancer
US6767731B2 (en) * 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
TW573125B (en) * 2001-08-29 2004-01-21 Combinatorx Inc A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof
US20030073104A1 (en) * 2001-10-02 2003-04-17 Belcher Angela M. Nanoscaling ordering of hybrid materials using genetically engineered mesoscale virus
CA2497740C (en) 2001-10-15 2011-06-21 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
WO2003035679A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Medical Research Council Molecules
US7262269B2 (en) 2001-10-26 2007-08-28 The Regents Of University Of California Method for screening combinational bead library; ligands for cancer cells
US6670142B2 (en) 2001-10-26 2003-12-30 The Regents Of The University Of California Method for screening combinatorial bead library, capturing cells from body fluids, and ligands for cancer cells
US20030124595A1 (en) * 2001-11-06 2003-07-03 Lizardi Paul M. Sensitive coded detection systems
JP2005518442A (ja) * 2001-11-20 2005-06-23 デューク・ユニバーシティー 界面バイオマテリアル
US7871619B2 (en) 2001-11-30 2011-01-18 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
WO2003052053A2 (en) * 2001-12-17 2003-06-26 Ribapharm Inc. Nucleoside libraries and compounds by mcc combinatorial strategies on solid support
US7291456B2 (en) 2002-01-24 2007-11-06 The Regents Of The University Of California Method for determining differences in molecular interactions and for screening a combinatorial library
JP2005516336A (ja) * 2002-01-28 2005-06-02 バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド 論理的なトリガのための方法および装置
CA2471017A1 (en) 2002-01-31 2003-08-07 Burstein Technologies, Inc. Method for triggering through disc grooves and related optical analysis discs and system
WO2003066829A2 (en) * 2002-02-07 2003-08-14 Discovery Genomics, Inc. Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation and methods of use thereof
WO2003076572A2 (en) 2002-03-04 2003-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Novel nucleic acid molecules and polypeptides encoding baboon tafi
IL163822A0 (en) 2002-03-15 2005-12-18 Nuevolution As An improved method for synthesising templated molecules
US7544767B2 (en) 2002-04-05 2009-06-09 Burnham Institute For Medical Research HMGN2 peptides and related molecules that selectively home to tumor blood vessels and tumor cells
WO2003089922A1 (en) 2002-04-15 2003-10-30 American National Red Cross Method for detecting ligands and targets in a mixture
US20060275753A1 (en) * 2002-04-15 2006-12-07 Hammond David J Recovery of analytes using combinatorial libraries
EP1578781A4 (en) * 2002-05-17 2007-05-30 Alfred E Slanetz METHOD FOR DETERMINING THE TARGET FUNCTION AND IDENTIFICATION OF MEDICAL DEVICE STRUCTURES
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
US7291461B2 (en) * 2002-06-21 2007-11-06 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mRNA decay
US20100168037A1 (en) * 2002-07-03 2010-07-01 Bio Science International, Inc. Peptides comprising aromatic d-amino acids and methods of use
ATE464392T1 (de) * 2002-07-11 2010-04-15 American Nat Red Cross Verfahren zur identifizierung einzelner aktiver einheiten aus komplexen gemischen
US7301006B2 (en) * 2002-07-16 2007-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and materials for the synthesis of modified peptides
EP1543157A4 (en) * 2002-07-24 2006-11-15 Ptc Therapeutics Inc METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLECULES MODULATING PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND DEGRADATION OF INDUCED MRNA BY NON-SENSE MUTATION
EP1539980B1 (en) 2002-08-01 2016-02-17 Nuevolution A/S Library of complexes comprising small non-peptide molecules and double-stranded oligonucleotides identifying the molecules
US20040081653A1 (en) 2002-08-16 2004-04-29 Raitano Arthur B. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer
CN104383554B (zh) 2002-09-06 2018-06-08 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的以环糊精为基础的聚合物
US7157228B2 (en) * 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US20050064508A1 (en) 2003-09-22 2005-03-24 Semzyme Peptide mediated synthesis of metallic and magnetic materials
CA2749227A1 (en) * 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
AU2003272169A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-13 Biacore Ab Assay with co-immobilized ligands
DK3299463T3 (da) 2002-10-30 2020-12-07 Nuevolution As Enzymatisk kodning
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
US7863411B2 (en) 2002-12-03 2011-01-04 Pathogen Removal and Diagnostics Technologies Inc. Prion protein ligands and methods of use
US20040185473A1 (en) * 2002-12-17 2004-09-23 Affymetrix, Inc. Releasable polymer arrays
DE60330406D1 (de) 2002-12-19 2010-01-14 Nuevolution As Durch quasizufallsstrukturen und funktionen geführte synthesemethode
US7736909B2 (en) * 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
AT413945B (de) * 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
JP2006518997A (ja) 2003-01-21 2006-08-24 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 新規アシルコエンザイムａ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−３（ｍｇａｔ３）をコードするポリヌクレオチドおよびその用途
WO2004074429A2 (en) 2003-02-21 2004-09-02 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
GB0305448D0 (en) * 2003-03-10 2003-04-16 Tcp Innovations Ltd Immunoassay
US20040185499A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Jolley Michael E. Method of epitope scanning using fluorescence polarization
WO2004085049A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 The Regents Of The University Of California Preparation and application of encoded bead aggregates in combinatorial chemistry
US20040235054A1 (en) * 2003-03-28 2004-11-25 The Regents Of The University Of California Novel encoding method for "one-bead one-compound" combinatorial libraries
US20060078893A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0307428D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
WO2004087865A2 (en) * 2003-03-31 2004-10-14 The Regents Of The University Of California The preparation and application of ligand-biopolymer conjugates
PL1615992T3 (pl) 2003-04-04 2014-03-31 Pathogen Removal And Diagnostic Tech Inc Materiały wiążące białko prionowe i sposoby ich zastosowania
US7510848B2 (en) 2003-04-04 2009-03-31 North Carolina State University Prion protein binding materials and methods of use
US20040210036A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-21 Nanogen, Inc. Peptide substrate libraries
EP1641555B1 (en) 2003-04-30 2020-12-02 Nexus Biosystems, Inc. Multi-well plate providing a high-density storage and assay platform
US7910523B2 (en) * 2003-05-23 2011-03-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting AP-1 transcription factors
US20060121489A1 (en) * 2003-05-23 2006-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System High throughput screening of aptamer libraries for specific binding to proteins on viruses and other pathogens
KR101291787B1 (ko) 2003-05-30 2013-08-07 어젠시스 인코포레이티드 전립선 줄기 세포 항원 (ｐｓｃａ) 변이체 및 그의서브서열
JP2007526438A (ja) * 2003-06-06 2007-09-13 コンビナトルックス インコーポレイテッド 組成物の組み合わせの多次元評価システムおよび方法
US7672791B2 (en) * 2003-06-13 2010-03-02 International Business Machines Corporation Method of performing three-dimensional molecular superposition and similarity searches in databases of flexible molecules
WO2005010016A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-03 Board Of Regents Thioaptamers enable discovery of physiological pathways and new therapeutic strategies
US7619059B2 (en) 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
CA2445420A1 (en) 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
WO2005015158A2 (en) 2003-08-06 2005-02-17 Senomyx Inc. T1r hetero-oligomeric taste receptors, cell lines that express said receptors, and taste compounds
US7927796B2 (en) 2003-09-18 2011-04-19 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
DK1670939T3 (da) 2003-09-18 2010-03-01 Nuevolution As Fremgangsmåde til opnåelse af strukturel information om et kodet molekyle og fremgangsmåde til udvælgelse af forbindelser
EP1664722B1 (en) 2003-09-22 2011-11-02 Bioarray Solutions Ltd Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
WO2005035552A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-21 Genzyme Corporation Transducing combinatorial peptide library
CA2544041C (en) 2003-10-28 2015-12-08 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
WO2005045060A2 (en) 2003-10-29 2005-05-19 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna
EP2369348A1 (en) 2003-11-07 2011-09-28 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for Alzheimer's disease
WO2005060739A1 (en) 2003-12-24 2005-07-07 G2 Inflammation Pty Ltd Transgenic non-human mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized c5ar
US20050164167A1 (en) * 2004-01-28 2005-07-28 Buscher Benjamin A. Method of discovery and development of broad-spectrum antiviral drugs
US20050221339A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
CN1964740A (zh) 2004-04-02 2007-05-16 加利福尼亚大学董事会 治疗和预防与αVβ5整联蛋白有关的疾病的方法和组合物
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
US8900856B2 (en) 2004-04-08 2014-12-02 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20050239134A1 (en) * 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
WO2005116643A2 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Carlsberg A/S Identification of compounds modifying a cellular response
RU2381234C2 (ru) 2004-05-28 2010-02-10 Эдженсис, Инк. Антитела и родственные молекулы, связывающиеся с белками psca
DK2453024T3 (en) 2004-06-21 2018-02-12 Univ Leland Stanford Junior Genes and conduits that are differentially expressed in bipolar disorder and / or major depressive disorder
JP4507080B2 (ja) * 2004-07-30 2010-07-21 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
AU2005277648B2 (en) 2004-08-20 2011-12-22 Buck Institute For Age Research Small molecules that replace or agonize p53 function
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
US8338093B2 (en) * 2004-12-31 2012-12-25 Affymetrix, Inc. Primer array synthesis and validation
US7547775B2 (en) * 2004-12-31 2009-06-16 Affymetrix, Inc. Parallel preparation of high fidelity probes in an array format
JP2008529035A (ja) * 2005-02-03 2008-07-31 パーキンエルマー エルエーエス，インク． 多次元シグナルを用いる超高感度検出システム
US20100196509A1 (en) 2005-02-28 2010-08-05 Jonathan Braun Methods for Diagnosis and Treatment of Endometrial Cancer
US20100240770A1 (en) * 2005-03-11 2010-09-23 Jifa Qi Synthesis and use of colloidal III-V nanoparticles
JP2008532559A (ja) 2005-03-19 2008-08-21 メディカル リサーチ カウンシル ウイルス感染の治療及び予防又は治療及び予防の改善
WO2006101187A1 (en) 2005-03-22 2006-09-28 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides that increase collagen or hyaluronic acid production
CN101495645B (zh) 2005-03-23 2012-08-22 生物-拉德实验室公司 蛋白纯化方法
WO2006105488A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
US8318906B2 (en) 2005-04-15 2012-11-27 The Regents Of The University Of California EMP2 antibodies and their therapeutic uses
US20070099830A1 (en) 2005-04-21 2007-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Sirt4 activities
US20070003954A1 (en) * 2005-05-12 2007-01-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20070021433A1 (en) 2005-06-03 2007-01-25 Jian-Qiang Fan Pharmacological chaperones for treating obesity
NZ598031A (en) 2005-07-19 2013-11-29 Stemgen S P A Inhibition of the tumorigenic potential of tumor stem cells by lif and bmps
WO2007022530A2 (en) * 2005-08-16 2007-02-22 The Children's Mercy Hospital Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof
US7943134B2 (en) 2005-08-31 2011-05-17 Academia Sinica Compositions and methods for identifying response targets and treating flavivirus infection responses
US7781209B2 (en) 2005-09-25 2010-08-24 Multispan, Inc. GPCR-expressing cell lines
CA2952660C (en) 2005-10-20 2018-09-11 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
US8119572B2 (en) * 2005-10-24 2012-02-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries
AU2006311827A1 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Redpoint Bio Corporation High throughput screening assay for the TRPM5 ion channel
NZ568762A (en) 2005-11-07 2011-11-25 Scripps Research Inst Use of an inhibitor of tissue factor signaling in the manufacture of a medcament for inhibiting or suppressing tissue factor/tissue factor VIIa signaling involving protease activated receptor 2 in a mammal
EP2564864B8 (en) 2005-11-12 2015-05-13 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University FGF2-related methods for diagnosing and treating depression
US7576037B2 (en) 2005-11-18 2009-08-18 Mei Technologies, Inc. Process and apparatus for combinatorial synthesis
LT3305900T (lt) 2005-12-01 2021-11-10 Nuevolution A/S Fermentiniai kodavimo būdai didelių bibliotekų efektyviai sintezei
GB2433505A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Capture agents for binding a ligand
GB2433506A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk A method of producing a multimeric capture agent
GB2433591A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Method for functionalising a hydrophobic substrate
EP1976567B1 (en) 2005-12-28 2020-05-13 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
WO2007081387A1 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices, methods of use, and kits for performing diagnostics
WO2007079755A1 (en) * 2006-01-12 2007-07-19 Janus Beierholm Holding Aps Reimmunization and antibody design
WO2007092777A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
US20100278821A1 (en) 2006-03-21 2010-11-04 The Regents Of The University Of California N-cadherin: target for cancer diagnosis and therapy
WO2007109347A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Regents Of The University Of California N-cadherin and ly6 e: targets for cancer diagnosis and therapy
CN101472947A (zh) * 2006-04-21 2009-07-01 惠氏公司 用于高通量筛选细胞系的方法
TWI674069B (zh) 2006-04-21 2019-10-11 美商賽諾米克斯公司 包含高度鮮味風味劑之可食用組合物及其製造方法
PL2027158T3 (pl) * 2006-05-02 2013-02-28 Carviar Aps Sposób immunizacji gatunków ptaków
EP2011882B1 (en) 2006-05-02 2012-03-28 Teikyo University Method for screening of substance capable of increasing glutathione
WO2008063227A2 (en) * 2006-05-11 2008-05-29 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US7862812B2 (en) 2006-05-31 2011-01-04 Lpath, Inc. Methods for decreasing immune response and treating immune conditions
EP1865316B1 (en) 2006-06-07 2010-02-24 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients GmbH Screening methods for compounds that modulate the activity of G-protein coupled receptors
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008013861A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of trpa1 activation by a lower alkyl phenol
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
EP2423333A1 (en) 2006-08-25 2012-02-29 Oncotherapy Science, Inc. Prognostic markers and therapeutic targets for lung cancer
EP2679998A1 (en) 2006-09-06 2014-01-01 The Regents of the University of California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma
US20090252745A1 (en) * 2006-09-15 2009-10-08 Duke University Amino acids in the HCV core polypeptide domain 3 and correlation with steatosis
WO2008063933A2 (en) 2006-11-10 2008-05-29 Massachusetts Institute Of Technology Pak modulators
WO2008067196A2 (en) 2006-11-16 2008-06-05 The Regents Of The University Of California Methods for identifying inhibitors of solute transporters
AU2007341981A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 The Salk Institute For Biological Studies Methods for enhancing exercise performance
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
US8772046B2 (en) * 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20080269065A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Syntrix Biosystems, Inc. Conformationally Constrained Analytical Probes
KR101440153B1 (ko) * 2007-05-09 2014-09-15 재단법인서울대학교산학협력재단 펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의기질특이성 분석 방법
WO2009023059A2 (en) 2007-06-01 2009-02-19 The Trustees Of Princeton University Treatment of viral infections by modulation of host cell metabolic pathways
US9364432B2 (en) 2007-06-11 2016-06-14 Edge Therapeutics, Inc. Intraventricular drug delivery system for improving outcome after a brain injury affecting cerebral blood flow
CN105055300A (zh) * 2007-06-11 2015-11-18 R·骆克·麦克唐纳 用于预防脑血管痉挛的药物递送系统
US10092524B2 (en) 2008-06-11 2018-10-09 Edge Therapeutics, Inc. Compositions and their use to treat complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage
US8334239B2 (en) * 2007-07-10 2012-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High affinity VEGF-receptor antagonists
US8163874B2 (en) * 2007-08-06 2012-04-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Beta helical peptide structures stable in aqueous and non-aqueous media and methods for preparing same
US8703161B2 (en) * 2007-08-13 2014-04-22 Elc Management, Llc Skin repair compositions comprising circadian gene activators and a synergistic combination of Sirt1 gene activators
ES2477292T3 (es) 2007-08-13 2014-07-16 Baxter International Inc. Modulación por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson
WO2009025793A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Senomyx, Inc. Human t2r bitterness receptors and uses thereof
WO2009045377A2 (en) 2007-10-01 2009-04-09 Redpoint Bio Corporation A non-desensitizing mutant of the transient receptor potential trpm5 ion channel
KR101662622B1 (ko) 2007-10-04 2016-10-05 지모제넥틱스, 인코포레이티드 Ｂ7 패밀리 구성원 ｚＢ7Ｈ6 및 관련된 조성물 및 방법
CA2703165A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 The Regents Of The University Of California Biomarkers for prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus
JP2011514881A (ja) 2007-11-09 2011-05-12 ザ ソルク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 免疫増強剤としてのｔａｍ受容体阻害剤の使用および免疫抑制剤としてのｔａｍ活性化剤の使用
WO2009079373A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 The Regents Of The University Of California Inhibitors of calcium-activated chloride channels
EP2077272A1 (en) 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
US9187535B2 (en) 2007-12-19 2015-11-17 Affibody Ab Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
NZ587750A (en) 2008-03-05 2012-10-26 Univ California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma
EP2955222B1 (en) 2008-03-17 2018-09-12 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009131957A2 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising oxadiazole derivatives
CA2721980C (en) 2008-04-21 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Selective high-affinity poly dentate ligands and methods of making such
JP2010043063A (ja) 2008-05-09 2010-02-25 Agency For Science Technology & Research 川崎病の診断及び治療
ES2845203T3 (es) 2008-07-01 2021-07-26 Genocea Biosciences Inc Sistema de análisis de antígenos
EP2315629B1 (en) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet libraries
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
WO2010017248A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 University Of Miami Sting (stimulator of interferon genes), a regulator of innate immune responses
WO2010022249A2 (en) 2008-08-20 2010-02-25 Ensemble Discovery Corporation Macrocyclic compounds for inhibition of tumor necrosis factor alpha
CN102224254A (zh) 2008-09-23 2011-10-19 哈佛大学校长及研究员协会 Sirt4及其用途
US20130074214A1 (en) 2008-09-25 2013-03-21 University Of Guelph Nitrogen Responsive Early Nodulin Gene
KR101151805B1 (ko) 2008-10-20 2012-06-01 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더
JP5798037B2 (ja) 2008-11-06 2015-10-21 ユニバーシティ オブ マイアミ 蛋白尿腎疾患の病因における可溶性ｕＰＡＲの役割
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
WO2010060599A1 (en) 2008-11-27 2010-06-03 Roche Diagnostics Gmbh Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers
EP2370445B1 (en) 2008-12-03 2014-07-23 The Scripps Research Institute Stem cell cultures
RU2618688C2 (ru) 2008-12-04 2017-05-10 КьюРНА,Инк.,US Лечение связанных с геном-супрессором опухолей заболеваний посредством ингибирования природного транскрипта в антисмысловой ориентации относительно этого гена
CA2745329C (en) 2008-12-04 2022-07-12 Opko Curna, Llc Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo
EP2370581B1 (en) 2008-12-04 2016-08-03 CuRNA, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf
EP2370175A2 (en) 2008-12-16 2011-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods of inhibiting quiescent tumor proliferation
ES2645869T3 (es) 2008-12-17 2017-12-11 The Scripps Research Institute Generación y mantenimiento de células madre
US20120165650A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 General Electric Company Her2 binders
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
EP2396038B1 (en) 2009-02-12 2015-10-21 CuRNA, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
ES2656290T3 (es) 2009-03-16 2018-02-26 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor nuclear (derivado de eritroide 2) similar al 2 (NRF2) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a NRF2
CA2755404C (en) 2009-03-17 2020-03-24 Joseph Collard Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
EP3415235A1 (en) 2009-03-23 2018-12-19 Raindance Technologies Inc. Manipulation of microfluidic droplets
KR20110140128A (ko) 2009-03-27 2011-12-30 고조 인더스트리즈, 인크 포자-표면 상호작용을 길항하는 화합물을 스크리닝 및 사용하기 위한 조성물 및 방법
US8343976B2 (en) 2009-04-20 2013-01-01 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising pyrazole derivatives
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
EP2427553A4 (en) 2009-05-06 2012-11-07 Opko Curna Llc TREATMENT OF LIPID TRANSPORT AND METABOLISM-RELATED DISEASES BY INHIBITING THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST A LIPID TRANSPORT AND METABOLIC TREATMENT
JP5931720B2 (ja) 2009-05-08 2016-06-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｄｍｄファミリーに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるジストロフィンファミリー関連疾患の治療
JP5922017B2 (ja) 2009-05-18 2016-05-24 クルナ・インコーポレーテッド リプログラミング因子に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるリプログラミング因子関連疾患の治療
US8895527B2 (en) 2009-05-22 2014-11-25 Curna, Inc. Treatment of transcription factor E3 (TFE3) and insulin receptor substrate 2(IRS2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TFE3
US8791085B2 (en) 2009-05-28 2014-07-29 Curna, Inc. Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
CA2765509C (en) 2009-06-16 2021-08-17 Joseph Collard Treatment of paraoxonase 1 (pon1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pon1
CN102695797B (zh) 2009-06-16 2018-05-25 库尔纳公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
CN102597238B (zh) 2009-06-24 2016-06-29 库尔纳公司 通过抑制针对肿瘤坏死因子受体2(tnfr2)的天然反义转录物来治疗tnfr2相关的疾病
EP2446037B1 (en) 2009-06-26 2016-04-20 CuRNA, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
CN102498123A (zh) * 2009-07-15 2012-06-13 新加坡科技研究局 改进的生物聚合物筛选
US20120122711A1 (en) * 2009-07-15 2012-05-17 Heath James R Screening of biopolymers
US9863956B2 (en) 2009-07-22 2018-01-09 Agency For Science, Technology And Research Differentiation of isobaric amino acids and other species
CA2767409C (en) 2009-07-24 2018-10-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with .alpha.v.beta.5 integrin
JP2013500017A (ja) 2009-07-24 2013-01-07 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド サ−チュイン（ｓｉｒｔ）への天然アンチセンス転写物の阻止によるサ−チュイン（ｓｉｒｔ）関連疾患の治療
KR101802536B1 (ko) 2009-08-05 2017-11-28 큐알엔에이, 인크. 인슐린 유전자 (ｉｎｓ)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인슐린 유전자 (ｉｎｓ) 관련된 질환의 치료
KR101827015B1 (ko) 2009-08-11 2018-02-07 큐알엔에이, 인크. 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ) 관련된 질환의 치료
CA2771102C (en) 2009-08-14 2019-10-15 The Regents Of The University Of California Methods of diagnosing and treating autism
EP2467398B1 (en) 2009-08-20 2019-10-09 Poseida Therapeutics, Inc. Trpc4 inhibitors and uses thereof
EP2467482A4 (en) 2009-08-21 2013-12-11 Curna Inc TREATMENT OF DISEASES RELATED TO "CIP PROTEIN CHIP EXTREME (PROTEIN INTERACTING WITH HSP70)" BY INHIBITION OF CHIP NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT
EP2470566A1 (en) 2009-08-24 2012-07-04 St. Jude Children's Research Hospital Compositions and methods for potentiating interleukin-35
US9023822B2 (en) 2009-08-25 2015-05-05 Curna, Inc. Treatment of 'IQ motif containing GTPase activating protein' (IQGAP) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IQGAP
CN102791861B (zh) 2009-09-25 2018-08-07 库尔纳公司 通过调节聚丝蛋白(flg)的表达和活性而治疗flg相关疾病
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
CA2781290A1 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Lynn K. Gordon Epithelial membrane protein-2 (emp2) and proliferative vitreoretinopathy (pvr)
BR112012012210B8 (pt) * 2009-11-23 2021-05-25 Cerulean Pharma Inc conjugado de (cdp)-taxano de polímero contendo ciclodextrina, composição, composição farmacêutica, forma de dosagem, kit e uso de um conjugado de cdp-taxano
CA2782366A1 (en) 2009-12-16 2011-07-14 Opko Curna, Llc Treatment of membrane bound transcription factor peptidase, site 1 (mbtps1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to mbtps1
EP2516648B1 (en) 2009-12-23 2017-11-08 CuRNA, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf
EP2515947B1 (en) 2009-12-23 2021-10-06 CuRNA, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US8962585B2 (en) 2009-12-29 2015-02-24 Curna, Inc. Treatment of tumor protein 63 (p63) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to p63
RU2615450C2 (ru) 2009-12-29 2017-04-04 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
WO2011082281A2 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Curna, Inc. Treatment of insulin receptor substrate 2 (irs2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irs2 and transcription factor e3 (tfe3)
JP5886757B2 (ja) 2010-01-04 2016-03-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド インターフェロン調節因子８（ｉｒｆ８）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるインターフェロン調節因子８（ｉｒｆ８）関連疾患の治療
EP2521785B1 (en) 2010-01-06 2022-03-09 CuRNA, Inc. Inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene for use in a treatment of pancreatic developmental gene related diseases
CA2786535C (en) 2010-01-11 2019-03-26 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
CN202823394U (zh) 2010-01-19 2013-03-27 伊鲁米那股份有限公司 用于处理化学反应的设备和系统
WO2011091435A2 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Mount Sinai School Of Medicine Methods of treating liver disease
US8946182B2 (en) 2010-01-25 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of RNASE H1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to RNASE H1
WO2011094759A2 (en) 2010-02-01 2011-08-04 The Regents Of The University Of California Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US8535889B2 (en) 2010-02-12 2013-09-17 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5976548B2 (ja) 2010-02-22 2016-08-23 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｐｙｃｒ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ１（ｐｙｃｒ１）関連疾患の治療
US8980856B2 (en) 2010-04-02 2015-03-17 Curna, Inc. Treatment of colony-stimulating factor 3 (CSF3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CSF3
US9044494B2 (en) 2010-04-09 2015-06-02 Curna, Inc. Treatment of fibroblast growth factor 21 (FGF21) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to FGF21
WO2011127933A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
EP2957636B1 (en) 2010-05-03 2020-04-01 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 3 (sirt3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt3
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
WO2011150005A2 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Opko Curna Llc Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
CA2799596C (en) 2010-05-26 2020-09-22 Curna, Inc. Treatment of methionine sulfoxide reductase a (msra) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to msra
EP2400304A1 (en) 2010-06-22 2011-12-28 Centro de Investigación Cooperativa En Biomateriales ( CIC biomaGUNE) Method for the characterization of intermolecular interactions
DK2585596T3 (da) 2010-06-23 2021-04-06 Curna Inc Behandling af spændingsreguleret natriumkanal-alpha-underenhed (scna)-relaterede sygdomme ved inhibering af naturligt antisense-transkript til scna
NO2593547T3 (no) 2010-07-14 2018-04-14
EP2598661B1 (en) 2010-07-26 2017-09-27 Biomatrica, INC. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
CA2806670A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US20130267423A1 (en) * 2010-08-27 2013-10-10 Su Seong Lee Peptide libraries for screening and other applications
EP3447155A1 (en) 2010-09-30 2019-02-27 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2625274B1 (en) 2010-10-06 2017-07-19 CuRNA, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
WO2012052391A1 (en) 2010-10-19 2012-04-26 Glaxo Group Limited Polypeptide with jmjd3 catalytic activity
KR101865433B1 (ko) 2010-10-22 2018-07-13 큐알엔에이, 인크. 알파-l 이두로니다아제 (idua)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 idua 관련된 질환의 치료
US10000752B2 (en) 2010-11-18 2018-06-19 Curna, Inc. Antagonat compositions and methods of use
WO2012074855A2 (en) 2010-11-22 2012-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying a cellular nascent rna transcript
CA2818824A1 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Joseph Collard Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog
KR102482184B1 (ko) 2010-12-22 2022-12-28 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 단세포 분류 및 iPSC의 증강된 재프로그래밍을 위한 세포 배양 플랫폼
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
US9364803B2 (en) 2011-02-11 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP2675893B1 (en) 2011-02-18 2019-01-09 The Scripps Research Institute Directed differentiation of oligodendrocyte precursor cells to a myelinating cell fate
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012119989A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Oryzon Genomics, S.A. Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer
WO2012122025A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
US20120301904A1 (en) 2011-04-26 2012-11-29 Prosetta Antiviral, Inc Multiprotein assemblies
JP6040227B2 (ja) 2011-05-19 2016-12-07 アジーナ バイオサイエンス， インコーポレイテッド マルチプレックス核酸同定のための製品およびプロセス
US9556470B2 (en) 2011-06-02 2017-01-31 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
WO2012170742A2 (en) 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with hmgb1 antagonists
US9244074B2 (en) 2011-06-07 2016-01-26 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
WO2012170771A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Curna, Inc. Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9725490B2 (en) 2011-07-29 2017-08-08 Tokushima University ERAP1-derived peptide and use thereof
JP6342805B2 (ja) 2011-09-02 2018-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよびその用途
CN103874486A (zh) 2011-09-06 2014-06-18 库尔纳公司 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
US20140323907A1 (en) 2011-10-28 2014-10-30 Jason Frazier Methods for drug delivery
RS57919B1 (sr) 2011-12-16 2019-01-31 Poseida Therapeutics Inc Trpc4 modulatori za primenu u lečenju ili prevenciji bola
EP2812344A4 (en) * 2012-02-07 2015-10-28 Vibrant Holdings Llc SUBSTRATES, PEPTIDE NETWORKS AND METHODS
JP6253596B2 (ja) 2012-02-16 2017-12-27 ザ ペン ステイト リサーチ ファンデーション アシル補酵素ａ：リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素１（ａｌｃａｔ１）の発現、機能または活性の阻害物質を同定する方法
US10105351B2 (en) 2012-03-14 2018-10-23 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Neurofibromatoses therapeutic agents and screening for same
JP2015511494A (ja) 2012-03-15 2015-04-20 キュアナ，インク． 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置
WO2013155223A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating cancer
JP2015516400A (ja) 2012-04-24 2015-06-11 ユニバーシティー オブ マイアミＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉａｍｉ 侵襲的かつ多剤耐性の病原体に対するパーフォリン２の防御
US9399019B2 (en) 2012-05-09 2016-07-26 Evonik Corporation Polymorph compositions, methods of making, and uses thereof
WO2013184645A2 (en) 2012-06-04 2013-12-12 The Scripps Research Institute Novel phenyl glyoxal probes
CA2879542A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Salk Institute For Biological Studies Regulating the interaction between tam ligands and lipid membranes with exposed phosphatidylserine
CA2922849A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Ixchel Pharma, Llc Agents useful for treating obesity, diabetes and related disorders
EP2900673A4 (en) 2012-09-26 2016-10-19 Univ California IRE1 MODULATION
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
AU2013204200B2 (en) 2012-10-11 2016-10-20 Brandeis University Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US20140120116A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The Chinese University Of Hong Kong Treatment of cancer using smad3 inhibitor
EP2912194B1 (en) 2012-10-26 2019-05-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Androgen receptor variants and methods for making and using
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
EP2928913A1 (en) * 2012-12-10 2015-10-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Lipocalin fusion partners
EP2934572A4 (en) 2012-12-20 2016-11-23 Biomatrica Inc FORMULATIONS AND METHODS FOR STABILIZING PCR REAGENTS
EP2954323B1 (en) 2013-02-07 2020-04-15 The Regents of The University of California Use of translational profiling to identify target molecules for therapeutic treatment
JP5981667B2 (ja) 2013-02-15 2016-08-31 ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー 増幅された電気化学発光検出のための方法および組成物
US9227978B2 (en) 2013-03-15 2016-01-05 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of Kras G12C
WO2014144844A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA DERIVED SMALL RNAs (tsRNAs) INVOLVED IN CELL VIABILITY
WO2014172661A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 The Regent Of The University Of California Lone star virus
US10626178B2 (en) 2013-08-21 2020-04-21 Raz Yirmiya Treatment of mood and stress related disorders
WO2015025323A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Treatment of mood and stress related disorders
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
JO3805B1 (ar) 2013-10-10 2021-01-31 Araxes Pharma Llc مثبطات كراس جي12سي
US9644037B2 (en) 2013-10-18 2017-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that specifically bind ataxia telangiectasia-mutated and RAD3-related kinase phosphorylated at position 1989 and their use
CN105979780A (zh) 2013-12-11 2016-09-28 斯隆-凯特林癌症研究院 治疗前列腺癌的糖皮质激素抑制剂
EP3444251B1 (en) 2013-12-11 2023-06-07 Biogen MA Inc. Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
CA2941004A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Peter Flynn Improved reprogramming methods and cell culture platforms
WO2015136509A2 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Genesis Theranostix Korlatolt Felelossegu Tarsasag Diagnostic and therapeutic targets for preeclampsia and closely related complications of pregnancy
EP3154338B1 (en) 2014-06-10 2020-01-29 Biomatrica, INC. Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
ES2826443T3 (es) 2014-09-25 2021-05-18 Araxes Pharma Llc Inhibidores de proteínas mutantes KRAS G12C
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
MX2017012979A (es) 2015-04-10 2017-11-28 Araxes Pharma Llc Compuestos de quinazolina sustituidos y metodos de uso de los mismos.
EP3283462B1 (en) 2015-04-15 2020-12-02 Araxes Pharma LLC Fused-tricyclic inhibitors of kras and methods of use thereof
EP3286327B1 (en) 2015-04-24 2021-11-10 Agena Bioscience, Inc. Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
AU2016250849A1 (en) 2015-04-24 2017-11-02 Agena Bioscience, Inc. Multiplex methods for detection and quantification of minor variants
US10196701B2 (en) 2015-06-01 2019-02-05 The Penn State Research Foundation Hepatitis B virus capsid assembly
US20160370380A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Pharmaseq, Inc. Combinatorial antibody diagnostic
US10851423B2 (en) 2015-06-22 2020-12-01 Proteovista Llc SNP arrays
EP3314260B1 (en) 2015-06-24 2021-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for detecting protein-protein interactions
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
EP3356353A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10875842B2 (en) 2015-09-28 2020-12-29 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356351A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058792A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058805A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10975071B2 (en) 2015-09-28 2021-04-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356339A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
SG10202111851YA (en) 2015-10-16 2021-12-30 Fate Therapeutics Inc Platform for the Induction & Maintenance of Ground State Pluripotency
JP2018533939A (ja) 2015-10-19 2018-11-22 アラクセス ファーマ エルエルシー Ｒａｓの阻害剤をスクリーニングするための方法
EP3377481A1 (en) 2015-11-16 2018-09-26 Araxes Pharma LLC 2-substituted quinazoline compounds comprising a substituted heterocyclic group and methods of use thereof
WO2017100212A1 (en) 2015-12-08 2017-06-15 Biomatrica, Inc. Reduction of erythrocyte sedimentation rate
WO2017100546A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
CA3013829A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Alexander Krantz Site-selective functionalization of proteins using traceless affinity labels
WO2017172979A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
WO2018036503A1 (en) 2016-08-25 2018-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Fecal bacterial markers for colorectal cancer
EP3519402A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10726944B2 (en) 2016-10-04 2020-07-28 International Business Machines Corporation Recommending novel reactants to synthesize chemical products
EP3523289A1 (en) 2016-10-07 2019-08-14 Araxes Pharma LLC Heterocyclic compounds as inhibitors of ras and methods of use thereof
AU2017378487B2 (en) 2016-12-15 2022-03-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating cancer
US11274093B2 (en) 2017-01-26 2022-03-15 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
US11136308B2 (en) 2017-01-26 2021-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline and quinazolinone compounds and methods of use thereof
EP3573971A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c modulators for treating cancer
EP3573964A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
WO2018140600A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Fused hetero-hetero bicyclic compounds and methods of use thereof
WO2018170464A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 The Johns Hopkins University Targeted epigenetic therapy against distal regulatory element of tgfb2 expression
EP3601326A4 (en) 2017-03-20 2020-12-16 The Broad Institute, Inc. COMPOUNDS AND METHODS OF REGULATING INSULIN SECRETION
SG11201908530QA (en) 2017-03-20 2019-10-30 Genocea Biosciences Inc Treatment methods
JP7239181B2 (ja) 2017-04-04 2023-03-14 ロマ リンダ ユニヴァーシティ 癌治療のための生物製剤
US11639346B2 (en) 2017-05-25 2023-05-02 Araxes Pharma Llc Quinazoline derivatives as modulators of mutant KRAS, HRAS or NRAS
CN110869357A (zh) 2017-05-25 2020-03-06 亚瑞克西斯制药公司 化合物及其用于治疗癌症的使用方法
MX2019013954A (es) 2017-05-25 2020-08-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras.
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
WO2019046791A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 The Johns Hopkins University TARGETED EPIGENETIC THERAPY FOR AERIAL CONDITION OF AERTICAL HERITATION
EP3692073A4 (en) 2017-10-03 2021-05-26 Cedars-Sinai Medical Center METHOD OF TARGETING THE IMMUNE CHECK POINT PD1 SIGNAL PATH FOR TREATMENT OF LUNG FIBROSIS
WO2019090242A1 (en) 2017-11-04 2019-05-09 Advanced Proteome Therapeutics Inc. Composition and method for modifying polypeptides
MX2021000887A (es) 2018-08-01 2021-03-31 Araxes Pharma Llc Compuestos espiroheterociclicos y metodos de uso de los mismos para el tratamiento de cancer.
JP2022512897A (ja) 2018-10-29 2022-02-07 ジェノセア バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療方法
EP3873488B1 (en) 2018-10-31 2025-03-19 The University of Sydney Pharmaceutical compositions for use in treating an hbv or hdv infection
WO2020097261A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services New compositions and methods for treating beta-globinopathies
CN113365661A (zh) 2019-01-31 2021-09-07 新加坡科技研究局 用于治疗或预防癌症的cnx/erp57抑制剂
US20220249559A1 (en) 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
RU2699563C1 (ru) * 2019-05-29 2019-09-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт-ПИЯФ) Модифицированный синтетический аналог природного опиоидного пептида энкефалина
DE102020202529A1 (de) * 2020-02-27 2021-09-02 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren zur Identifikation einer Wirkstoffkombination
US11965162B2 (en) 2020-04-16 2024-04-23 The Johns Hopkins University MicroRNA and inhibitors thereof and methods of treatment
WO2023081167A2 (en) 2021-11-02 2023-05-11 The Regents Of The University Of California P-selectin mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2023086969A2 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Ichor Medical Systems Inc. Treatment methods
WO2023146807A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 The Regents Of The University Of California Vegf mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2024197185A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for dissecting organelle physiology

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4392997A (en) * 1981-07-06 1983-07-12 Northwestern University Antigenic peptide compounds
US4618598A (en) * 1982-04-12 1986-10-21 Duke University Method of regulating hormone function or release
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4555101A (en) * 1984-03-13 1985-11-26 Stobb, Inc. Method and apparatus for separating signatures from a stack
US4590003A (en) * 1984-03-23 1986-05-20 Oncogen Platelet related growth regulator
US4569792A (en) * 1984-06-14 1986-02-11 Eli Lilly And Company Anti-diabetic compounds
US4625014A (en) * 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
JPH07119760B2 (ja) * 1984-07-24 1995-12-20 コモンウエルス・セ−ラム・ラボラトリ−ズ・コミッション ミモトープを検出または決定する方法
US4798787A (en) * 1984-09-19 1989-01-17 Cetus Corporation Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products
US4705777A (en) * 1985-02-25 1987-11-10 The Regents Of The University Of California Cationic oligopeptides having microbicidal activity
US4863857A (en) * 1985-03-01 1989-09-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Polypeptide complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known
US4631211A (en) * 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
NZ215865A (en) * 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
WO1986006487A1 (en) * 1985-04-22 1986-11-06 Commonwealth Serum Laboratories Commission Method for determining mimotopes
US4710489A (en) * 1985-04-22 1987-12-01 Cornell Research Foundation, Inc. Glutathione delivery system
CS256960B1 (en) * 1985-11-16 1988-04-15 Viktor Krchnak Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
US4780421A (en) * 1986-04-03 1988-10-25 Sclavo Inc. Cleavable labels for use in binding assays
US4837304A (en) * 1987-05-22 1989-06-06 Merck & Co., Inc. Inhibitor of ribonucleotide reductase
DE3855890T2 (de) * 1987-10-13 1998-02-12 Terrapin Tech Inc Verfahren zur herstellung von imunodiagnose-mitteln
NZ228482A (en) * 1988-03-24 1991-03-26 Terrapin Tech Inc Chromatography substrate containing a peptide paralog (active site mimicer) peptide
US5010175A (en) * 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
WO1989011211A2 (en) * 1988-05-24 1989-11-30 Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh ( Oligonucleotide bank and process for dna sequencing
US4988625A (en) * 1988-11-09 1991-01-29 Merck & Co., Inc. Method for determining the functionalization of a solid support
CA2009996A1 (en) * 1989-02-17 1990-08-17 Kathleen S. Cook Process for making genes encoding random polymers of amino acids
US5182366A (en) * 1990-05-15 1993-01-26 Huebner Verena D Controlled synthesis of peptide mixtures using mixed resins
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
NO930011D0 (no) 1993-01-04
AU2845495A (en) 1996-05-16
AU2836995A (en) 1995-12-07
AU8238591A (en) 1992-01-23
WO1992000091A1 (en) 1992-01-09
EP0542770A4 (en) 1993-09-15
MX9100052A (es) 1992-02-28
HU9204179D0 (en) 1993-04-28
IL98682A0 (en) 1992-07-15
ATE176330T1 (de) 1999-02-15
NO930011L (no) 1993-02-22
RO112336B1 (ro) 1997-08-29
AU659091B2 (en) 1995-05-11
PL168354B1 (pl) 1996-02-29
US5650489A (en) 1997-07-22
CZ289365B6 (cs) 2002-01-16
ES2126572T3 (es) 1999-04-01
FI925986A0 (fi) 1992-12-31
CZ407392A3 (en) 1993-10-13
HU218007B (hu) 2000-05-28
EP0542770A1 (en) 1993-05-26
GR3029443T3 (en) 1999-05-28
NZ238805A (en) 1994-07-26
JPH06500308A (ja) 1994-01-13
DE69130828T2 (de) 1999-06-17
HUT63576A (en) 1993-09-28
KR100245767B1 (ko) 2000-03-15
CA2086672A1 (en) 1992-01-03
FI107995B (fi) 2001-11-15
DE69130828D1 (de) 1999-03-11
SK407392A3 (en) 1994-08-10
US5510240A (en) 1996-04-23
JP3552718B2 (ja) 2004-08-11
EP0542770B1 (en) 1999-01-27
KR100222146B1 (en) 1999-10-01
IE912299A1 (en) 1992-01-15
DK0542770T3 (da) 1999-09-13
AU683762B2 (en) 1997-11-20
IL98682A (en) 1997-02-18
SK281490B6 (sk) 2001-04-09
FI925986L (fi) 1992-12-31
US5858670A (en) 1999-01-12
PL169616B1 (pl) 1996-08-30
CA2086672C (en) 2005-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0542770B1 (en) Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US6090912A (en) Topologically segregated, encoded solid phase libraries comprising linkers having an enzymatically susceptible bond
US5840485A (en) Topologically segregated, encoded solid phase libraries
CA2090860C (en) Synthesis of equimolar multiple oligomer mixtures, especially of oligopeptide mixtures
DE69409312T2 (de) Herstellung und Durchmusterung von hochgradig diversen Peptidbanken hinschtlich Bindungsaktivität
Lam et al. A one-bead one-peptide combinatorial library method for B-cell epitope mapping
JP2003327597A (ja) イミノジ酢酸エステル結合に基づく選択的に開裂可能なリンカー
WO1994013623A1 (en) Synthesis of encoded polymers
WO1994018345A1 (en) Receptor-binding antiproliferative peptides
RU2145233C1 (ru) Неупорядоченная библиотека пептидов, способ ее получения и способ идентификации пептида, синтезированного твердофазным синтезом
Joo Synthesis and screening of support-bound combinatorial cyclic peptide and free C-terminal peptide libraries
Sepetov et al. A One-Bead One-Peptide Combinatorial Library Method for B-Cell Epitope Mapping
Swistowski Development of a new platform technology for the recognition and validation of peptide-protein interactions

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired