RU2615450C2 - Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биохимии. Описаны антисмысловые олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию ядерного респираторного фактора 1 (NRF1), в частности, путем нацеленного взаимодействия с природными антисмысловыми полинуклеотидами ядерного респираторного фактора 1 (NRF1). При этом антисмысловой олигонуклеотид представляет собой олигонуклеотид длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который специфически гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом NRF1 и имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный олигонуклеотид необязательно содержит одну или более модификаций, выбранных из: по меньшей мере одного модифицированного фрагмента сахара; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида; и их комбинаций. Изобретение также относится к их применению для лечения заболеваний и расстройств, связанных с экспрессией NRF1. Изобретение позволяет повышать экспрессию гена ядерного респираторного фактора 1. 6 н. и 24 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/290549, поданной 29 декабря 2009, включенной в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

[0002] Варианты реализации настоящего изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию NRF1 и связанных с ним молекул.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] ДНК-РНК и РНК-РНК гибридизации играют важную роль во многих аспектах функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию, транскрипцию и трансляцию ДНК. Гибридизация также играет ключевую роль в различных методиках для обнаружения конкретной нуклеиновой кислоты или изменения ее экспрессии. Антисмысловые нуклеотиды, например, нарушают экспрессию гена, гибридизуясь с целевой РНК, тем самым вмешиваясь в сплайсинг, транскрипцию, трансляцию и репликацию РНК. Антисмысловая ДНК обладает дополнительным свойством: ДНК-РНК-гибриды служат субстратом для расщепления рибонуклеазой Н, активности, присутствующей в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как в случае с олигодезоксинуклеотидами (ОДН), или же они могут экспрессироваться эндогенными генами в виде молекул РНК. Управление США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) недавно одобрило антисмысловое лекарственное средство, VITRAVENE™ (для лечения цитомегаловирусного ретинита), признав возможность применения антисмысловых соединений в терапевтических целях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее описание представляет собой краткое изложение настоящего изобретения, предназначенное для того, чтобы в сжатой форме охарактеризовать предмет и сущность изобретения. Необходимо понимать, что краткое описание изобретения не должно быть использовано для истолкования или ограничения объема или смысла формулы настоящего изобретения.

[0005] Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта с применением антисмыслового(ых) олигонуклеотида(ов), нацеленного(ых) па любой участок природного антисмыслового транскрипта, приводящим к позитивной регуляции соответствующего смыслового гена. Согласно настоящему изобретению также предполагается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто с помощью миРНК, рибозимов и малых молекул, которые включены 15 объем настоящего изобретения.

[0006] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NRF1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 5 до 30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности, обратно комплементарной полинуклеотиду, содержащему от 5 до 30 последовательных нуклеотидов, выбранных в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида NRF1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0007] Согласно одному из вариантов реализации действие олигонуклеотида нацелено на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов NRF1, например, нуклеотидов, представленных в последовательности SEQ ID NO: 2, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены последовательностями SEQ ID NO: 3-5.

[0008] В другом варианте реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NRF1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 5 до 30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности, обратно комплементарной антисмысловой последовательности указанного полинуклеотида NRF1; с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида NRF1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0009] В другом варианте реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NRR в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий включающий контактирование указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом, составляющим в длину от 5 до 30 нуклеотидов, где указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную антисмысловому олигонуклеотиду к антисмысловому полинуклеотиду NRF1; с модулированием, таким образом, функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида NRF1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.

[0010] Согласно одному из вариантов реализации композиция содержит один или несколько антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами NRF1.

[0011] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды содержат один или более модифицированный или замещенный нуклеотид.

[0012] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированную связь.

[0013] Согласно еще одному варианту реализации указанные модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, содержащие фосфотиоат, метилфосфонат, пептидные нуклеиновые кислоты, 2'-О-метил-, фтор- или углерод, метиленовые или другие молекулы закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК). Предпочтительно, указанные модифицированные нуклеотиды представляют собой молекулы закрытой нуклеиновой кислоты, включая α-L-ЗНК.

[0014] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.

[0015] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды вводятся в составе фармацевтической композиции. Схема лечения предполагает введение указанных антисмысловых соединений пациенту по меньшей мере однократно; однако эта схема может быть изменена таким образом, что будет включать введение нескольких доз в течение определенного периода времени. Указанное лечение может сочетаться с одним или несколькими другими видами терапии.

[0016] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды заключают в липосомы или присоединяют к молекуле-носителю (например, холестерину или ТАТ-пептиду).

[0017] Другие аспекты описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0018] Фиг.1 представляет собой график результатов ПЦР в режиме реальном времени, показывающий кратность изменения+стандартное отклонение иРНК NRF1 после обработки клеток HEPG2 фосфотиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК NRF1 в клетках FIEPG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигомеров, сконструированных как антисмысловые kNRF1. Столбцы, помеченные как CUR-0526, CUR-0528, CUR-0530 соответствуют образцам, обработанным SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно.

[0019] Описание перечня последовательностей - SEQ ID NO: 1: ядерный респираторный фактор 1 (NRF1) человека, вариант транскрипта 1, иРНК (номер доступа в базе данных NCBI: NM_005011); SEQ ID NO: 2: Природная антисмысловая последовательность NRF1 Hs.292860; SEQ ID NO: 3-5: Антисмысловые олигонуклеотиды. * означает фосфотиоатную связь; SEQ ID NO: 6-8: Последовательности, обратно комплементарные указанным антисмысловым олигонуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 3-5, соответственно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0020] Ниже описаны некоторые аспекты изобретения со ссылками на примеры применения для наглядности. Следует понимать, что многочисленные конкретные особенности, взаимосвязи и способы изложены с целью обеспечить полное понимание изобретения. Однако для специалиста в соответствующей области техники будет очевидно, что настоящее изобретение может быть осуществлено без одной или более конкретных особенностей или с применением других способов. Настоящее изобретение не ограничивается указанным порядком действий или процессов, так как некоторые действия могут осуществляться в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или процессами. Кроме того, не все приведенные в качестве примеров действия или процессы необходимы для реализации методики согласно настоящему изобретению.

[0021] Все гены, названия генов и генные продукты, описанные в настоящей заявке, соответствуют гомологам из любых видов, для которых могут быть применены композиции и способы, описанные в настоящей заявке. Таким образом, указанные термины включают, не ограничиваясь перечисленными, гены и генные продукты человека и мыши. Следует понимать, что описание гена или генного продукта конкретного вида предназначено исключительно для наглядности и не должно быть истолковано как ограничение, если контекст, в котором оно приведено, четко не указывает на это. Таким образом, например, описанные в настоящей заявке гены, которые согласно некоторым вариантам реализации родственны последовательностям нуклеиновых кислот и аминокислот млекопитающих, включают гомологичные и/или ортологичные гены и генные продукты, полученные от других животных, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, других млекопитающих, рыб, амфибий, рептилий и птиц. Согласно одному из вариантов реализации указанные гены или последовательности нуклеиновых кислот представляют собой гены и последовательности нуклеиновых кислот человека.

Определения

[0022] Терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации, а не для ограничения настоящего изобретения. В контексте настоящей заявки термины, используемые в единственном числе, включают также и множественное число, если из контекста ясно не следует обратное. Кроме того, в тех случаях, когда термины «включая», «включает», «имеющий», «имеет», «имеет в составе» или их варианты используются в подробном описании и/или в формуле изобретения, предполагается, что такие термины носят охватывающий характер, сходный с термином «содержащий».

[0023] Термин «приблизительно» или «примерно» означает значение в допустимых пределах ошибки для конкретной величины, как очевидно для специалиста в данной области техники, которая частично зависит от того, как измеряется или определяется значение, т.е. от ограничений системы измерений. Например, «приблизительно» может означать величину в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, в соответствии с принятой в данной области техники практикой. Как вариант, «приблизительно» может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5%, и еще более предпочтительно до 1% от заданного значения. Как вариант, особенно в отношении биологических систем или процессов, термин может означать порядок возрастания величин, предпочтительно в пределах 5-кратного возрастания, и более предпочтительно в пределах 2-кратного возрастания. При указании в настоящей заявке или формуле изобретения конкретных значений, если не указано иное, следует считать, что термин «приблизительно» охватывает величины внутри допустимого для конкретного значения интервала ошибок.

[0024] Используемый в настоящей заявке термин «иРНК» означает известный (е) на сегодняшний день иРНК транскрипт(ы) гена-мишени и любые транскрипты, которые могут быть обнаружены в дальнейшем.

[0025] Под «антисмысловыми олигонуклеотидами» или «антисмысловым соединением» подразумевается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (целевой РНК, ДНК). Например, если она представляет собой олигонуклеотид РНК, она связывается с другой целевой РНК посредством РНК-РНК взаимодействий и изменяет активность целевой РНК. Антисмысловой олигонуклеотид может повышающе или понижающе регулировать экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Указанное определение включает любые молекулы чужеродной РНК или ДНК, подходящие для целей терапии, диагностики или с любой другой точки зрения. Такие молекулы включают, например, антисмысловые молекулы РНК или ДНК, интерферирующие РНК (РНКи), микроРНК, молекулы РНК-ловушек, миРНК, ферментативные РНК, терапевтические редактирующие РНК, РНК-агонисты и антагонисты, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), формы альтернативного сплайсинга, праймеры, зонды, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, такие соединения могут быть представлены в форме одноцепочечных, двуцепочечных, частично одноцепочечных, или кольцевых олигомериых соединений.

[0026] В контексте настоящего изобретения термин «олигонуклеотид» относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин «олигонуклеотид» также включает линейные или кольцевые олигомеры, состоящие из природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК), фосфотиоатные, метилфосфонатные и т.п. Олигонуклеотиды способны специфически связываться с целевым полинуклеотидом посредством стандартных мономер-мономерных взаимодействий, таких как спаривание оснований по Уотсону-Крику, Хугстиновское или обратное Хугстиновское спаривание оснований или т.п.

[0027] Указанный олигонуклеотид может быть «химерным», то есть состоять из разнородных участков. В контексте настоящего изобретения «химерные» соединения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химических участка, например, участок(ки) ДНК, участок(ки) РЫК, участок(ки) ПНК и т.д. Каждый химический участок состоит из по меньшей мере одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где указанный олигонуклеотид модифицирован с целью приобретения одного или более необходимого свойства. Необходимые свойства указанного олигонуклеотида включают, например, но не ограничиваясь перечисленными: повышенную устойчивость к разложению нуклеазами, повышенное поглощение клетками и/или повышенную связывающую способность в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Различные участки указанного олигонуклеотида могут, таким образом, обладать различными свойствами. Указанные химерные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов согласно приведенным выше описаниям.

[0028] Указанный олигонуклеотид может состоять из участков, которые могут быть связаны по «порядку», то есть мономеры связаны последовательно, как в нативной ДНК; или связаны через спейсеры. Спейсеры предназначены для формирования ковалентного «мостика» между указанными участками и в предпочтительных случаях имеют длину не более чем приблизительно 100 атомов углерода. Указанные спейсеры могут обладать различными функциональными свойствами, например, нести положительный или отрицательный заряд, иметь специфические для связывания нуклеиновых кислот особенности (интеркаляторы, связыватели бороздки, токсины, флуорофоры и т.д.), быть липофильными, включать особые вторичные структуры, например, аланин-содержащие белки, включающие альфа-спирали.

[0029] Используемые в настоящей заявке термины "NRF1" и "ядерный респираторный фактор 1" включают все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.

[0030] Используемые в настоящей заявке выражения ядерный респираторный фактор 1, Nrf1, NRF1, ядерный респираторный фактор 1 альфа-пал, ALPHA-PAL, NRF-1/alpha-PAL, alpha-PAL/NRF-1, ядерный респираторный фактор-1/ альфа-палиндром-связывающий белок, Альфа-палиндром-связывающий белок, LWG и NRF-1 рассматриваются как синонимы в литературе и являются взаимозаменяемыми в контексте настоящей заявки.

[0031] Используемый в настоящей заявке термин «олигонуклеотид, специфичный для» или «олигонуклеотид, нацеленный на» относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную формирован, стабильный комплекс с фрагментом гена-мишени или (ii) способную формировать стабильный дуплекс с фрагментом и РНК транскрипта гена-мишени. Стабильность указанных комплексов и дуплексов может быть определена посредством теоретических расчетов и/или in vitro анализов. Типовые способы анализа для определения стабильности гибридизации комплексов и дуплексов описаны в Примерах ниже.

[0032] Используемый в настоящей заявке термин «целевая нуклеиновая кислота» включает ДНК, РНК (включая пре-мРНК и и РНК), транскрибированные с таких ДНК, а также кДНК, полученные с помощью таких РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с его целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование указанной нуклеиновой кислоты. Такая модуляция функции целевой нуклеиновой кислоты посредством соединений, которые специфически гибридизуются с ней, обычно называется «антисмысловой». Изменяемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Изменяемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК в сайт трансляции белка, трансляция белка из указанной РНК, сплайсинг указанной РНК с получением одного или более вида иРНК. и каталитическая активность, с которой может быть связана указанная РНК, либо которой она может способствовать. Общим эффектом от такого изменения функции целевой нуклеиновой кислоты является модуляция экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.

[0033] РНК-интерференция «РНКи» опосредована молекулами двуцепочечной РНК (дцРНК), которые обладают сиквенс-специфичной гомологией с «целевыми» последовательностями нуклеиновых кислот. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанные посредники представляют собой дуплексы 5-25-нуклеотидных «малых интерферирующих» РНК (миРНК). Указанные миРНК синтезируются при процессинге дцРНК ферментом-РНКазой, известным как дайсер. Дуплексные продукты миРНК входят в состав мульти-белкового миРНК-содержащего комплекса, называемого RISC (РНК-индуцируемый комплекс сайлеисинга). Без связи с какой-либо конкретной теорией, предполагается, что RISC переносится к целевой нуклеиновой кислоте (подходит иРНК), где указанный миРНК-дуплекс взаимодействует с ней сиквенс-специфичным образом, опосредуя каталитическое расщепление. Малые интерферирующие РНК, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и использованы в соответствии с известными в данной области техники методиками, знакомыми специалистам в данной области техники. Для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, подходят малые интерферирующие 14 IK, включающие от приблизительно 1 до приблизительно 50 нуклеотидов (нт). Согласно неограничивающим примерам реализации миРНК могут содержать от приблизительно 5 до приблизительно 40 нт, от приблизительно 5 до приблизительно 30 нт, от приблизительно 10 до приблизительно 30 нт, от приблизительно 15 до приблизительно 25 нт, или приблизительно 20-25 нуклеотидов.

[0034] Отбор подходящих олигонуклеотидов выполняют с применением компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и определяют участки идентичности или гомологии. Такие программы применяют для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, из баз данных, таких как GcnBank, или секвенированием продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот различных видов позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, которым свойственна необходимая степень межвидовой идентичности. Для генов, которые не были секвенированы, выполняют саузерн-блоттинг, что позволяет провести определение степени идентичности генов у целевого вида и у других видов. Проводя саузерн-блоттинг в условиях различной степени жесткости, согласно известным в данной области техники методикам, возможно с достаточной точностью определить степень идентичности. Такие процедуры позволяют провести отбор олигонуклеотидов, проявляющих значительную степень комплементарности целевым последовательностям нуклеиновых кислот регулируемого объекта, и более низкую степень комплементарности соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот из других видов. Специалисту в данной области техники будет ясно, что существует значительная свобода выбора подходящих участков генов для применения в настоящем изобретении.

[0035] Под «ферментативной РНК» подразумевается молекула РНК с ферментативной активностью (Cech, (1988)./. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) сначала связываются с целевой РНК. Такое связывание происходит посредством мишень-связывающего фрагмента ферментативной нуклеиновой кислоты, который располагается в непосредственной близости к ферментативному фрагменту указанной молекулы, расщепляющему целевую РНК. Таким образом, указанная ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает, а потом связывается с целевой РНК посредством спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком ферментативно расщепляет целевую РНК.

[0036] Под «РНК-ловушкой» подразумевается молекула РНК, имитирующая природный лиганд-связывающий домен. Указанная РНК-ловушка, таким образом, конкурирует с природной мишенью связывания специфического лиганда. Например, показано, что сверхэкспрессия РНК трансактивируемого регуляторного элемента (TAR) ВИЧ может функционировать в качестве «ловушки» и эффективно связывает tat белок ВИЧ, предотвращая таким образом его связывание с TAR-последовательностями, кодируемыми ВИЧ-РНК. Такой пример является частным. Специалистам в данной области техники будет попятно, что это всего лишь пример, и другие варианты реализации легко могут быть осуществлены с применением общеизвестных в данной области техники методик.

[0037] Используемый в настоящей заявке термин «мономеры» обычно означает мономеры, связанные фосфодиэфирными связями или их аналогами с образованием олигонуклеотидов, варьирующих в размерах от нескольких мономерных единиц, например, приблизительно 3-4, до приблизительно нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги фосфодиэфирных связей включают: фосфотиоат, фосфородитиоат, метилфосфорнаты, фосфороселеноат, фосфорамидат и т.п., более подробно описанные ниже.

[0038] Термин «нуклеотид» охватывает нуклеотиды природного происхождения, а также нуклеотиды, не встречающиеся в природе. Для специалиста в данной области очевидно, что различные нуклеотиды, ранее считавшиеся «не встречающимися в природе» впоследствии были найдены в природе. Таким образом, термин «нуклеотиды» включает не только известные молекулы, содержащие пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративные примеры других типов нуклеотидов представлены молекулами, содержащими аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диамипопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этанцитозин, N6,N6-этано-2,6-диаминопурин, 5-метилцитозип, 5-(С3-С6)-алкипилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолопиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и «не встречающиеся в природе» нуклеотиды, описанные в патенте СШЛ 5432272. Benner et al. Под термином «нуклеотид» подразумеваются все и каждый из приведенных примеров, а также их аналоги и таутомеры. Особенный интерес представляют нуклеотиды, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые считаются нуклеотидами природного происхождения, в отношении терапевтического и диагностического применения у человека. Нуклеотиды включают природные 2'-дезокси и 2'-гидроксил-сахара, например, согласно описанию в Romberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), а также их аналоги.

[0039] Термин «аналоги» в отношении нуклеотидов включает синтетические нуклеотиды, содержащие фрагменты с модифицированными основаниями и/или модифицированные фрагменты сахара (см., например, общее описание в Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nitcl. Acid. Res., 25(22), 4429- 4443, Toulmé, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Ada 1489:117-139; Freicr S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlinan, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisen.se & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-С-связанные[3.2.0] бициклоарабинонуклеозиды. Такие аналоги включают синтетические нуклеотиды, сконструированные с целью увеличения связывающих способностей, например, стабильности дуплексов или триплексов, специфичности или т.п.

[0040] В контексте настоящей заявки «гибридизация» означает спаривание в значительной степени комплементарных цепей олигомерных соединений. В одном из механизмов спаривания задействованы водородные связи, которые могут представлять собой водородные связи по Уотсону-Крику, Хугстиновские или обратные Хугстиновские водородные связи, между комплементарными нуклеозидными или нуклеотидными основаниями (нуклеотидами) цепей олигомерных соединений. Например, аденил и тимин представляют собой комплементарные нуклеотиды, спаривающиеся при помощи водородных связей. Гибридизация может происходить при различных условиях.

[0041] Антисмысловое соединение является «специфически гибридизуемым», если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.

[0042] В контексте настоящей заявки выражение «гибридизация в жестких условиях» или «жесткие условия» относится к условиям, при которых соединение, предложенное в настоящем изобретении, будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью и минимальным числом других последовательностей. Жесткие условия зависят от последовательностей и различаются в зависимости от обстоятельств; в контексте настоящего изобретения, «жесткие условия», при которых олигомерные соединения гибридизуются с целевой последовательностью, определяются природой и составом олигомерных соединений и методиками анализа, применяемыми для их исследования. Как правило, при гибридизации в жестких условиях используются низкие концентрации (<0,15М) солей с неорганическими катионами, такими как Na++ или K++ - (т.е. с низкой ионной силой), температуры выше 20°С-25°С, но ниже температуры плавления комплекса указанного олигомерного соединения с целевой последовательностью, и присутствие денатурантов, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид, или детергента додецилсульфата натрия (SDS). Например, скорость гибридизации снижается на 1,1% па каждый 1% формамида. Примером жестких условий гибридизации является 0.1 X цитратно-солевой буфер (SSC)/0,1% (вес/объем) SDS при 60°С в течение 30 минут.

[0043] Используемый в настоящей заявке термин «комплементарный» относится к способности к точному спариванию двух нуклеотидов на одной или двух олигомерных цепях. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородные связи с нуклеиновым основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, и при этом указанная целевая нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, РНК или олигонуклеотидную молекулу, тогда это положение водородной связи между указанным олигонуклеотидом и указанной целевой нуклеиновой кислотой считается комплементарным положением. Указанное олигомерное соединение и другая ДНК, РНК или олигонуклеотидная молекула комплементарных друг другу, если достаточное количество комплементарных положений в каждой молекуле заняты нуклеотидами, способными образовывать водородные связи друг с другом. Таким образом, термины «специфически гибридизуемый) и «комплементарный» используются для обозначения достаточной степени точности спаривания или комплементарности достаточного количества нуклеотидов обеспечивающих стабильное; специфическое связывание указанного олигомерного соединения и целевой нуклеиновой кислоты.

[0044] Специалистам и данной области техники будет понятно, что последовательность олигомерного соединения необязательно должна быть на 100% комплементарна последовательности ее целевой нуклеиновой кислоты, чтобы быть специфически гибридизуемой. Кроме того, олигонуклеотид может гибридизоваться с одним или более сегментом таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в гибридизации (например, петлеобразные структуры, некомплементарные или шпилькообразные структуры). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению содержат последовательности, по меньшей мере приблизительно на 70%, или по меньшей мере приблизительно на 75%. или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно па 90%, или по меньшей мере приблизительно на 95%, или по меньшей мере приблизительно на 99% комплементарные целевому участку в составе целевой последовательности нуклеиновой кислоты, на которую они нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов указанного антисмыслового соединения комплементарны целевому участку, и которое, таким образом, будет специфически гибридизоваться, комплементарно на 90%. В данном примере остающиеся некомплементарные нуклеотиды могут быть объединены или рассеяны между комплементарными нуклеотидами и не обязательно соседствуют друг с другом или с комплементарными нуклеотидами. Соответственно, антисмысловое соединение, составляющее в длину 18 нуклеотидов, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, фланкированное двумя участками с полной комплементарностью целевой нуклеиновой кислоте, будет обладать 77.8% общей комплементарности целевой нуклеиновой кислоте и, таким образом, будет входить в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с участком целевой нуклеиновой кислоты может быть определен по стандартной методике с применением программ BLAST (средств поиска основного локального выравнивания) и PowerBLAST, известных в данной области техники. Процент гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности может быть определен, например, при помощи программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park. Madison Wis.), с применением параметров по умолчанию, использующей алгоритм Смита-Ватсрмана (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).

[0045] Используемый в настоящей заявке термин «температура плавления / точка плавления» относится к температуре, при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных целевой последовательности, равновесно гибридизуются с целевой последовательностью. Как правило, жесткими условиями являются такие условия, при которых концентрация солей составляет по меньшей мере приблизительно 0,01-1,0 М ионов Na (или других солей) при рН 7,0-8,3 и температуре по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких олигонуклеотидов (например, из 10-50 нуклеотидов)- Жесткие условия могут также достигаться посредством добавления дестабилизирующих агентов, таких как формам ид. J0046] В контексте настоящей заявки «модулирование» означает либо повышение (стимуляцию), либо снижение (ингибирование) экспрессии гена.

[0047] Термин «вариант», при использовании в отношении полинуклеотидной последовательности, может охватывать полинуклеотидные последовательности, родственные генам дикого типа. Это определение может также включать, например, «аллельные,» «сплайс-» «видовые» или «полиморфные» варианты. Сплайс-вариант может обладать значительной степенью идентичности с шаблонной молекулой, по, как правило, состоит из большего или меньшего числа полинуклеотидов в результате альтернативного сплайсинга экзонов при процессинге и РНК. Соответствующий полипептид может включать дополнительные функциональные домены или какие-то домены могут отсутствовать. Видовые варианты представляют собой полинуклеотидные последовательности, отличающиеся у разных видов. Особенно подходят для применения в настоящем изобретении варианты продуктов гена дикого типа. Варианты могут быть получены в результате по меньшей мере одной мутации в последовательности нуклеиновой кислоты и могут приводить к изменениям в иРНК или полипептидов, структура которых может быть изменена или не изменена. Любой природный или рекомбинантный ген может иметь пи одной, иметь одну или множество аллельных форм. Стандартные мутационные изменения, которые приводят к возникновению вариантов, как правило, происходят в результате природных делений, добавлений или замен нуклеотидов. Каждое из таких изменений может происходить отдельно или в комбинации с другими, однократно или многократно в определенной последовательности.

[0048] Получаемые полипептиды, как правило, обладают значительной степенью идентичности аминокислотного состава. Полиморфный вариант представляет собой вариацию полинуклеотидной последовательности конкретного гена у индивидуумов определенного вида. Полиморфные варианты также могут включать «однонуклеотидные полиморфы» (спины) или мутации одиночных оснований, в которых указанная полинуклеотидная последовательность отличается одним основанием. Присутствие спилов может свидетельствовать, например, о конкретной популяции с определенной склонностью к болезни, то есть предрасположенностью относительно сопротивляемости.

[0049] Производные пол и нуклеотиды включают нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, с заменой водорода па алкильную, ацильную или аминогруппу. Производные, например, производные олигонуклеотидов, могут содержать не встречающиеся в природе фрагменты, такие как видоизмененные фрагменты сахара или внутрисвязанные сахара. Типовыми являются фосфотиоат и другие серосодержащие виды, известные в данной области техники. Производные нуклеиновых кислот могут также содержать метки, включая радионуклеотиды, ферменты, флуоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные агенты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы, и т.п.

[0050] «Производное» полипептида или пептида представляет собой полипептид или пептид, модифицированный, например, гликозилированием, пегилированием, фосфорилированием, сульфатированием, восстановлением/алкилированием, ацилированием, реакцией сочетания или мягкой обработкой формалином. Производное может гаже быть модифицировано таким образом, чтобы содержать детектируемую метку, прямо или непрямо, включая, но не ограничиваясь перечисленными, радиоизотопные, флуоресцентные и ферментные метки.

[0051] Используемый в настоящей заявке термин «животное» или «пациент» включает, например, человека, овцу, вапити, оленя, чернохвостого оленя, норок, млекопитающих, обезьян, лошадь, рогатый скот, свинью, коз, собаку, кошку, крысу, мышей, птиц, кур, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.

[0052] Под «млекопитающими» понимаются теплокровные животные, как правило, получающие медицинскую помощь (например, люди и одомашненные животные). Примерь: включают кошку, собаку, лошадь, крупный рогатый скот и человека, а также только человека.

[0053] «Лечение» относится к лечению болезненного состояния у млекопитающего, и включает: (а) предотвращение наступления болезненного состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к болезни, но еще не имеет соответствующего диагноза; (b) подавление болезненного состояния, например, остановку его развития; и/или (с) облегчение болезненного состояния, например, регрессия болезненного состояния до достижения нужной стадии. Лечение также включает смягчение симптомов заболевания (например, уменьшение боли или дискомфорта), причем такое смягчение может оказывать или не оказывать влияние на течение болезни (например, причину, передачу, проявления, и т.д.).

[0054] Используемый в настоящей заявке термин «рак» относится ко всем типам раковых заболеваний, новообразований или злокачественных опухолей млекопитающих, включая, но не ограничиваясь перечисленными: лейкемию, лимфому, меланому, карциному и саркому. Указанный рак проявляется в виде «опухоли» или ткани, содержащей злокачественные клетки указанного рака. Примеры опухолей включают саркомы и карциномы, в том числе, по не ограничиваясь перечисленными: фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак груди, рак яичников, рак простаты, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальной железы, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Нильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карциному легких, мелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, кралиофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемунгиобластому, нейрому слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому и ретинобластому. Дополнительные виды рака, при лечении которых может быть применена композиция согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленными, например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому. множественную миелому, нейробластому, рак груди, рак яичников, рак легких, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, мелкоклеточные опухоли легких, первичные опухоли мозга, рак желудка, рак прямой кишки, злокачественную инсулиному поджелудочной железы, злокачественную карциноидную опухоль, рак мочевого пузыря, рак ЖКТ, предраковые повреждения кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, эзофагеальный рак, рак урогенитального тракта, злокачественную гиперкальциемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак простаты.

[0055] «Неврологическое заболевание или расстройство» относится к любому заболеванию или расстройству нервной системы и/или зрительной системы. «Неврологические заболевания или расстройства» включают заболевания или расстройства, которые связаны с центральной нервной системой (головным мозгом, стволом мозга и мозжечком), периферической нерпой системой (включая черепно-мозговые нервы), и автономной нервной системой (части которой расположены как в центральной, так и в периферической нервной системах). Примеры неврологических расстройств включают, не ограничиваясь перечисленными: головные боли, ступор и кому, слабоумие, судорожные припадки, нарушения сна, травмы, инфекции, новообразования, нейроофтальмологию, двигательные расстройства, демиелинизирующие заболевания, заболевания спинного мозга и заболевания периферических нервов, мышц и нервномышечных соединений. Мании и психические болезни, включающие в качестве неограничивающих примеров биполярное расстройство и шизофрению, также включены в определение неврологического расстройства. Ниже приведен список некоторых неврологических расстройств, симптомов, признаков и синдромов, лечение которых может проводиться с применением композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении: приобретенная эпилептиформная афазия; острый рассеянный энцефаломиелит; адренолейкодистрофия; возрастная макулярная дегенерация; агенез мозолистого тела; агнозия; синдром Экарди; болезнь Александера; болезнь Альперса; альтернирующая гемиплегия; сосудистая деменция; амиотрофический латеральный склероз; анэнцефалия; синдром Энгельмана; ангиоматоз; аноксия; афазия; апраксия; арахноидальные кисты; арахноидит; синдром Арнольда-Киари; артериовенозная мальформация; синдром Аспергера; телеангиоэктатическая атаксия; синдром нарушения внимания с гиперактивностью; аутизм; вегетативная дисфункция; позвоночная боль: болезнь Баттена; Болезнь Бехчета; паралич Белла: доброкачественный эссенциальный блефароспазм; доброкачественный фокус; амиотрофия; доброкачественная внутричерепная гипертензия: болезнь Бинсвангера; блефароспазм; синдром Блоха-Сульцбергера; повреждение плечевого сплетения; абсцесс головного мозга: черепно-мозговые травмы; опухоли мозга (включая мультиформную глиобластому); опухоль позвоночника; синдром Броун-Секара; болезнь Канавана; синдром запястного канала; каузалгия; таламический синдром; центральный понтинный миелиполиз; пороки развития центральной нервной системы; мозговая аневризма; церебральный артериосклероз; церебральная атрофии: церебральный гигантизм; церебральный паралич; болезнь Шарко-Мари-Тута; индуцированная химиотерапией невропатия и нейропатическая боль; мальформация Киари; хорея; хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия; хроническая боль; хронический региональный болевой синдром; синдром Коффина-Лоури; кома, включая стойкое вегетативное состояние; врожденная лицевая диплегия; кортико-базальная дегенерация; височный артериит; краниосиностоз; болезнь Крейтцфельда-Якоба; расстройства в результате хронической травматизации; синдром Кушинга; инклюзионная цитомегалия; цигомегаловирусная инфекция; синдром «танцующих глаз»; синдром Денди-Уокера; болезнь Доусона; синдром де Морсье; паралич Дежерни-Клюмикс; слабоумие; дерматомиозит; диабетическая нейропатия; диффузный склероз; вегетативная дистопия; дисграфия; дислексия; дистопии; эпилептическая энцефалопатия раннего детского возраста; синдром пустого турецкого седла; энцефалит; энцефалоцеле; энцефалотригеминальный ангиоматоз; эпилепсия; паралич Эрба; эссенциальный тремор; болезнь Фабри; синдром Фара; обмороки; семейный спастический паралич; фебрильные судороги; синдром Фишера; атаксия Фридрейха; лобно-височная деменция и другие «таупатии»; болезнь Гоши; синдром Герстманна; гигантоклеточный артериит; гигантоклеточная инклюзионная болезнь; глобоидно-клеточная лейкодистрофия; синдром Гийена-Барре; миелопатия, ассоциированная с вирусом Т-клеточного лейкоза человека: болезнь Галлервордена-Шпатца; травма головы; головная боль; гемифациальный спазм; наследственная спастическая параплегия; наследственная полиневропатическая атаксия; синдром Рамсея-Ханта; опоясывающий лишай; синдром Хираямы; ВИЧ-ассоциированные слабоумие и нейропатия (и неврологические проявления СПИДа); аринэнцефадия; болезнь Хантингтона и другое болезни полиглутаминовых повторов; гидроанэнцефалия; гидроцефалия; гиперсекреция кортизола: гипоксия; иммуноопосредованный энцефаломиелит; миозит с включенными тельцами; синдром недержания пигмента; инфантильная форма болезни накопления фитановой кислоты; инфантильная форма болезни Рефсума; инфантильные спазмы; воспалительная миопатия; внутричерепные кисты; внутричерепная гипертензия; синдром Жубера; синдром Кирнса-Сейра: болезнь Кеннеди синдром Кинсбурна; синдром Клиппеля-Фейля; болезнь Краббе; болезнь Кугельберга-Веландера; куру; болезнь Лафора; миастенический синдром Ламберта-Итона; синдром Ландау-Клеффнера; боковой мозговой синдром (синдром Валленберга); необучаемость; болезнь Лея: синдром Леннокса-Гасто; синдром Леша-Найхана; лейкодистрофия; деменция с тельцами Лети; лиссэнцефалия; синдром «запертого человека»; болезнь Лу Герига (т.е. болезнь моторных нейронов или амиотрофический латеральный склероз); болезнь поясничного диска; болезнь Лайма-неврологические последствия; болезнь Мачадо-Джозефа; макроэнцефалия; макроцефалия; синдром Мелькерссона-Розенталя; болезнь Меньера; менингит; болезнь Менкеса; метахроматическая лейкодистрофия; микроцефалия; мигрень; синдром Миллера-Фишера; мини-инсульты; митохондриальные миопатии; синдром Мебиуса; мономелическая амиотрофия; болезнь моторных нейронов; болезнь Моямоя; мукополисахаридозы; мультиинфарктная деменция; многофокальная могорная нейропатия; рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания; множественная системная атрофия с постуральной гипотензией; р мышечная дистрофия; миастения; димиелинизирующий диффузный склероз; миоклоническая энцефалопатия раннего детского возраста; миоклония; миопатия; врожденная миотония; нарколепсия; нейрофиброматоз; злокачественный нейролептический синдром; неврологические проявления СПИДа; неврологические осложнения волчанки; нейромиотония; неврональный цероидный липофусциноз; нарушения миграции нейронов; болезнь Ниманна-Пика; синдром О'Салливана-МакЛеода; затылочная невралгия; скрытая дизрафия спинного мозга; синдром Охтахара; оливопонтоцеребеллярная атрофия; опсоклонус-миоклонус; неврит зрительного нерва; ортостатическая гипотензия; синдром перенапряжения; парестезия; нейродегенеративные заболевания или расстройства (болезнь Паркинсона, болезнь Хатинггона, синдром Альцгеймера, амиотрофический боковой склероз(АБС), dementia, рассеянный склероз и другие заболевания и расстройства, связанные с гибелью нервных клеток); врожденная парамиотония; паранеопластические синдромы; пароксизмальные атаки; синдром Парри-Ромберга; болезнь Пелицеуса-Мерцбахера; периодические параличи; периферическая нейропатия; болезненная нейропатия и нейропатическая боль; стойкое вегетативное состояние; первазивные расстройства развития; световой чихательный рефлекс; болезнь накоплепия фитановой кислоты; болезнь Пика; защемление нерва; опухоли гипофиза; полимиознт; порэнцсфалия; постполиосиндром; постгерпетическая невралгия; постинфекционный энцефаломиелит; постуральная гипотензия; синдром Прадера-Вилли; первичный латеральный склероз: прионные болезни; прогрессирующая гемифациальная атрофия; прогрессивная мультифокалышя лейкоэнцсфалонатия; прогрессирующая склерозирующая полиодистрофия; прогрессирующий надъядерный паралич; доброкачественная внутричерепная гипертензия; синдром Рамсея-Ханта (типы I и II); энцефалит Расмуссена; синдром рефлекторной симпатической дистрофии; болезнь Рефсума; нарушения в результате повторяющихся движений; нарушения в результате длительного напряжения; синдром беспокойных ног; миелопатия, вызываемая ретровирусами; синдром Ретта; синдром Рейс; пляска святого Витта; болезнь Сандгоффа; болезнь Шильдера; шизэнцсфалия; септо-оптическая дисплазия; синдром детского сотрясения; опоясывающий герпес; синдром Шая-Дрейджера; синдром Шёгреиа; апноэ во время сна; синдром Сотоса; спастичность; расщепление позвоночника; повреждение спинного мозга; опухоли спинного мозга; спинальная мышечная атрофия; синдром мышечной скованности; инсульт; синдром Стерджа-Вебера; подострый склерозирующий нанэннефалит; субкортикальная артериосклеротическая энцефалопатия; хорея Сидешама; обмороки; сирингомиелия; поздняя дискинезия; болезнь Тея-Сакса; височный артериит; скрытая дизрафия спинного мозга; болезнь Томсена; компрессионный синдром верхней апертуры грудной клетки; невралгия тройничного нерва; паралич Тодда; синдром Туретта; транзиторная ишемическая атака; передающиеся губчатые энцефалопатии; поперечный миелит; травматическое повреждение головного мозга; tremor; тригеминальная невралгия; тропический спастический парапарез; туберозный склероз; сосудистая деменция (мультиинфарктная деменция); васкулит, включая височный артериит; болезнь фон Гиппеля-Линдау; синдром Валленберга; болезнь Верднига-Хоффмана; синдром Веста; хлыстовая травма; синдром Вильямса; болезнь Вильсона; и синдром Цельвегера.

Композиции и молекулы полинуклеотидов и олигонуклеотидов

[0056] Мишени (целевые последовательности): Согласно одному из вариантов реализации мишени включают последовательности нуклеиновых кислот ядерного респираторного фактора 1 (NRF1), включая, но не ограничиваясь указанными, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с NRF1.

[0057] Ядерный респираторный фактор 1 (является представителем семейства транскрипционных факторов с доменом CNC с основной лейциновой молнией (CNC-bZIP). Факторы CNC bZIP, наряду с малыми Maf белками, связываются как гетеродимеры с элементом NF-E2/AP-1. Транскрипционный фактор NRF1 воздействует на ядерные гены, кодирующие респираторные субъединицы и компоненты системы митохондриальной транскрипции и репликации.

[0058] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые олигонуклеотиды применяют для предотвращения или лечения заболеваний или расстройств, связанных с представителями семейства NRF1. Типовые опосредованные ядерным респираторным фактором 1 (NRF1) заболевания и расстройства, лечение которых может проводиться с помощью клеток/тканей, регенерированных из стволовых клеток, полученных с применением указанных антисмысловых соединений, включают: заболевание или расстройство, связанное с анормальной функцией и/или экспрессией NRF1, неврологическое заболевание или расстройство (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз и т.п.) заболевание или расстройство, связанное с инсулинорезистентностью, диабет, опухоль печени, немелкоклеточный бронхолегочный рак, иммунологическое заболевание или расстройство, оксидативный стресс, заболевание или расстройство, связанное с нарушением митохондриальной, функции, заболевание или расстройство, связанное с нарушением митохондриального биогенеза, заболевание или расстройство, связанное с митохондриальным заболеванием в результате нарушения ядерного контроля митохондриальной функции, возрастными изменениями и старением.

[0059] Согласно одному из вариантов реализации модулирование NRF1 одним или более антисмысловым олигонуклеотидом обеспечивается нуждающемуся и этом пациенту для увеличения атлетической результативности и наращивания мускулатуры.

[0060] Согласно одному из вариантов реализации модулирование NRF1 одним или более антисмысловым олигонуклеотидом обеспечивается нуждающемуся в этом пациенту для предотвращения или лечения любого заболевания или расстройства, связанного с анормальной экспрессией, функцией, активностью NRF1 по сравнению с контролем.

[0061] Согласно одному из вариантов реализации угнанные олигонуклеотиды специфичны для полинуклеотидов NRF1, включая без ограничений некодирующие области. NRF1-мишени включают варианты NRF1; мутанты NRF1, включая SNP; некодирующие последовательности NRF1; аллели, фрагменты и т.п. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой молекулу антисмысловой РНК.

[0062) Согласно вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула нуклеиновой кислоты не ограничивается собственно поли нуклеотидам и NRF1 и может быть представлена любыми изоформами, рецепторами, гомологами, некодирующими участками и т.п., NRF1.

[0063] Согласно одному из вариантов реализации олеонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность (природную антисмысловую последовательность для кодирующих и некодирующих областей) целевых NRI-1, включая в качестве неограничивающих примеров их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой молекулу антисмысловой РНК или ДНК.

[0064] Согласно одному из вариантов реализации олигомерные соединения, предложенные в настоящем изобретении, также включают варианты, в которых в одном или нескольких положениях нуклеотидов указанного соединения присутствуют различающиеся основания. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденин, могут быть получены варианты, которые содержат тимидин, гуанозин, цитидин или другие природные или синтетические нуклеотиды в этом положении. Такие варианты могут быть получены в любом положении антисмыслового соединения. Такие соединения затем анализируют с применением способов, описанных в настоящей заявке, для определения их способности ингибировать экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.

[0065] Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между указанным антисмысловым соединением и мишенью составляет от приблизительно 50% до приблизительно 60%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 60%) до приблизительно 70%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 70%) до приблизительно 80%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 80% до приблизительно 90%. Согласно некоторым вариантам реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляют приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%) или приблизительно 100%.

[0066] Антисмысловое соединение является специфически гибридизуемым, если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, вызывая потерю активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание. Такие условия включают, например, физиологические условия в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и условия, при которых проводится анализ в случае исследований in vitro.

[0067] Антисмысловое соединение, ДНК, РНК, химерное, замещенное и т.н., является специфически гибридизуемым, когда связывание указанного соединения с целевой ДНК или РНК нарушает нормальное функционирование указанной целевой ДНК или РНК, вызывая в результате утрату функций, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, г.с., в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и, в случае исследований in vitro, в условиях, при которых проводится исследование.

[0068] Согласно одному из вариантов реализации нацеленное воздействие на NRF1, включая в качестве неограничивающих примеров антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскладываемые с применением, например, ПНР, гибридизации и т.д., одной или более последовательностей, представленных в SEQ IDNO: 2. и г.н., модулирует экспрессию или функцию NRJ1. Согласно одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются повышающее по сравнению с контролем. Согласно одному и; вариантов реализации экспрессия или функция регулируются понижающее по сравнению с контролем.

[0069] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотиды включают последовательности нуклеиновых кислот, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 3-5, включая антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскладываемые с применением, например, ГИДР, гибридизации и т.д. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфотиоат, фосфородитиоат или т.п. Согласно одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды содержат фосфорное производное. Указанное фосфорсодержащее производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к фрагменту сахара или аналога сахара в модифицированных олигонуклеотидах, предложенных в настоящем изобретении, может представляет собой монофосфат, дифосфат, грифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфотиоат и т.п. Способы получения вышеупомянутых фосфатных аналогов и их встраивания в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, по сути, также известны, и нет необходимости описывать их в настоящей заявке.

[0070] Специфичность и чувствительность антисмысловых последовательностей также используются специалистами в данной области техники в терапевтических целях. Антисмысловые олигонуклеотиды применялись в качестве терапевтических фрагментов при лечении болезненных состояний у животных и человека. Антисмысловые олигонуклеотиды безопасно и эффективно вводились людям, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания. Таким образом, установлено, что олигонуклеотиды могут представлять собой подходящие терапевтические механизмы воздействия, которые могут быть подогнаны под схемы лечения клеток, тканей и животных, в особенности, человека.

[0071] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения олигомерные антисмысловые соединения, в частности, олигонуклеотиды, связываются с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты и модулируют экспрессию и/или функцию молекул, кодируемых геном-мишенью. Изменяемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Изменяемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК в сайт трансляции белка, трансляция белка из указанной PI IK, сплайсинг указанной РНК с получением одного или более вида иРНК, и каталитическая активность, с которой может быть связана указанная РНК, либо которой она может способствовать. Функция может стимулироваться или подавляться в зависимости от желаемого результата.

[0072] Антисмысловые соединения включают антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), формы альтернативного сплайсинга, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, такие соединения могут быть представлены в форме одноцепочечных, двуцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений

[0073] Нацеленное воздействие посредством антисмыслового соединения на конкретную молекулу нуклеиновой кислоты в контексте настоящего изобретения может представлять собой многоступенчатый процесс. Указанный процесс, как правило, начинается с идентификации целевой нуклеиновой кислоты, функцию которой необходимо модулировать. Такая целевая нуклеиновая кислота может представлять собой, например, клеточный ген (или иРНК, транскрибированную с этого гена), экспрессия которого связана с определенным заболеванием или болезненным состоянием, или молекулу нуклеиновой кислоты из инфекционного агента. Согласно настоящему изобретению указанная целевая нуклеиновая кислота кодирует ядерный респираторный фактор 1 (NRF1).

[0074] Процесс нацеленного воздействия, как правило, также включает определение по меньшей мере одного целевого участка, сегмента или сайга в целевой нуклеиновой кислоте для достижения антисмыслового взаимодействия в форме нужного эффекта, например, модулирования экспрессии. В контексте настоящего изобретения термин «участок» определяемся как фрагмент целевой нуклеиновой кислоты, обладающий по меньшей мере одной идентифицируемой структурой, функцией или характеристикой. В состав участков целевых нуклеиновых кислот входят сегменты. «Сегменты» определяются как более короткие участки или субфрагменты участков в целевой нуклеиновой кислоте. «Сайты» в контексте настоящей заявки определены как положения в целевой нуклеиновой кислоте.

[0075] Согласно одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми последовательностями ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) и модулируют экспрессию и/или функцию NRF1 (SEQ ID NO: 1). Примеры антисмысловых последовательностей включают последовательности SRQ ID NO: 2-5.

[0076] Согласно одному из вариантов реализации укачанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с одним или более сегментом полинуклеотидов ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) и модулируют экспрессию и/или функцию NRF1. Указанные сегменты содержат по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов смысловых или антисмысловых полинуклеотидов NRF1.

[0077] Согласно одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды являются специфическими для природных антисмысловых последовательностей NRF1, причем связывание указанных олигонуклеотидов с природными антисмысловыми последовательностями NRF1 модулирует экспрессию и/или функцию NRF1.

[0078] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотидные соединения содержат последовательности, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 3-5, антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскладываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.п. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфотиоат, фосфородитиоат или т.п. Согласно одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды содержат фосфорное производное. Указанное фосфорсодержащее производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к фрагменту сахара или аналога сахара в модифицированных олигонуклеотидах, предложенных в настоящем изобретении, может представляй, собой монофосфат, дифосфат, трифосфач, алкилфосфат, алканфосфат, фосфотиоат и т.п. Способы получения вышеупомянутых фосфатных аналогов и их встраивания в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, по сути, также известны, и нет необходимости описывать их в настоящей заявке.

[0079] Поскольку, как известно специалистам в данной области техники, кодон инициации трансляции обычно представляет собой 5'-AUG (в транскрибируемых молекулах иРНК; 5'-ATG в соответствующей молекуле ДНК), указанный кодон инициации трансляции также называют «AUG-кодон», «стартовый кодон» или «стартовый кодон AUG». У небольшого числа генов кодон инициации трансляции имеет последовательность РНК 5'-GUG, 5'-UUG или 5'-CUG; показано, что 5'-AUA, 5'-ACG и 5'-CUG функционируют in vivo. Таким образом, термины «кодон инициации трансляции» и «стартовый кодон» могут включать различные последовательности кодонов, даже не смотря на то, что инициирующая аминокислота во всех случаях представляет собой, как правило, метионин (у эукариот) или формилметионин (у прокариот). Эукариотические и прокариотические цены могут иметь два или более альтернативных стартовых кодона, каждый из которых может преимущественно использоваться для инициации трансляции в том или ином типе клеток или тканей, или при наличии определенного ряда условий. В контексте настоящего изобретения «стартовый кодон» и «кодон инициации трансляции» относятся к кодону или кодонам, которые используются in vivo для инициации трансляции иРНК, транскрибируемой с гена, кодирующего ядерный респераторный (фактор 1 (NRF1), независимо от того, какую(ие) последовательность(и) имеют такие кодоны. Кодон терминации трансляции (или «стоп-кодон») гена может быть представлен одной из трех последовательностей, а именно, 5'-UAA, 5'-UAG и 5'-UGA (соответствующих ДНК последовательностям 5'-ТАЛ, 5'-'TAG и 5'-TGA, соответственно).

[0080] Термины «область стартового кодона» и «область кодона инициации трансляции» относятся к фрагменту такой иРНК или гена, который включает приблизительно 25-50 последовательных нуклеотидов в каждом направлении (т.е., 5' или 3') от кодона инициации трансляции. Сходным образом, термины «область стоп-кодона» и «область кодона терминации трансляции» относятся к фрагменту такой иРНК или гена, который содержит приблизительно 25-50 последовательных нуклеотидов в каждом направлении (т.е. 5' или 3') or кодона терминации трансляции. Соответственно, указанная «область стартового кодона» (или «область кодона инициации трансляции») и указанная «область стоп-кодона» (или «область кодона терминации трансляции») представляют собой участки, которые могут быть эффективными мишенями антисмысловых соединений, предложенных в настоящем изобретении.

[0081] Открытая рамка считывания (ORF), или «Кодирующая область», известная в данной области техники как участок между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции, также представляет собой участок, который может быть эффективной мишенью. В контексте настоящего изобретения целевой участок (мишень) представляет собой внутригенный участок, охватывающий кодон инициации трансляции или кодом терминации открытой рамки считывания (ORF) гена.

[0082] Другой целевой участок включает 5' нетранслируемый участок (5'UTR), известный в данной области техники как фрагмент иРНК в 5' направлении от кодона инициации трансляции, и, таким образом, включающий нуклеотиды между 5'кэп-сайтом и кодоном инициации трансляции иРНК (или соответствующими нуклеотидами на указанном гене). Другой целевой участок включает 3' нетранслируемый участок (3'UTR), известный в данной области техники как фрагмент иРНК в 3' направлении от кодона терминации трансляции, и, таким образом, включая нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3' концом иРНК (или соответствующими нуклеотидами на указанном гене). 5'кэп-сайт иРНК содержит N7-метилированный гуанозиновый остаток, присоединенный к крайнему 5' остатку иРНК через 5'-5'-трифосфатную связь. 5'кэпучасток иРНК» предположительно включает включает саму 5'-кэп-структуру, а также первые 50 нуклеотидов, смежные с этим кэп-сайтом. Другой целевой участок согласно настоящему изобретению представлен 5' кэп-участком.

[0083] Хотя некоторые эукариотические иРНК-транслируются транслируются непосредственно, многие содержат один или несколько участков, известных как «интроны», которые вырезаются из 1раскрипта до трансляции. Остающиеся (и, следовательно, транслирующиеся) участки известны как «экзоны» и сплайсируются с образованием непрерывной последовательности иРНК. Согласно одному из вариантов реализации целенаправленное воздействие на участки сплайсинга, т.е., участки соединения интрон-экзон или участки соединения экзон-интрон, особенно подходит для тех случаев, когда в заболевание вовлечены аберрантный сплайсинг или сверхсинтез конкретного генного продукта. Согласно другому варианту реализации пеленой участок представляет собой сайт аберрантного слияния, возникший в результате перестановки или делении, иРНК транскрипты, полученные в результате сплайсинга двух (или более) иРНК из различных источников генов, известны как «слитые транскрипты». Интроны могут быть эффективными мишенями антисмысловых соединений с нацеленным действием, например, на ДНК или пре-иРНК.

[0084] Согласно одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с кодирующими и/или не-кодирующими участками целевого полинуклеотида и модулируют экспрессию и/или функцию целевой молекулы.

[0085] Согласно одному из вариантов реализации указанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию целевой молекулы.

[0086] Согласно одному из вариантов реализации укачанные антисмысловые олигонуклеотиды связываются со смысловыми нуклеотидами и модулирую г экспрессию и/или функцию целевой молекулы.

[0087] Альтернативные РНК-транскрипты могут быть получены с одного и того же геномного участка ДНК. Такие альтерантивные транскрипты обычно называют «вариантами». В частности, «пре-иРНК варианты» представляют собой транскриты, полученные из той же геномной ДНК, отличающиеся от других транскриптов, полученных из той же геномной ДНК, положениями старта или окончания, и содержащие как интронную, так и экзонную последовательности.

[0088] При вырезании одного или более экзонного или ингронного участка или их фрагментов в процессе сплайсинга пре-варианты иРНК образую более короткие «иРНК варианты». Соответственно, варианты иРНК представляют собой процессированные пре-варианты иРНК, и каждый уникальный вариант пре-иРНК в обязательном порядке всегда производит уникальный вариант иРНК в результате сплайсинга. Такие варианты иРНК также известны как «варианты альтернативного сплайсинга». Если сплайсинга варианта пре-иРНК не происходит, тогда вариант пре-иРНК идентичен иРНК-варианту.

[0089] Варианты могут быть получены с применением альтерантивных сигналов начала и конца транскрипции. Пре-иРНК и иРНК могут, содержать несколько стартовых кодонов и стоп-кодонов. Варианты, получаемые из пре-иРНК или иРНК и использующие альтернативные стартовые кодоны, известны как «варианты с альтернативной инициацией» указанных пре-иРНК или иРНК.

Транскрипты, использующие альтернативный стоп-кодоп, известны как «варианты с альтернативной терминацией» указанных пре-иРНК или иРНК. Одним из конкретных вариантов с альтернативной терминацией является «полиА вариант», в котором многочисленные транскрипты синтезируются в результате альтернативною выбора одного из «полиА-стоп-сигналов» транскрипционным механизмом, в результате чего возникают транскрипты заканчивающиеся уникальными полиА-сайтами. В контексте настоящего изобретения виды вариантов, описанные в настоящей заявке, также представляют собой варианты реализации целевых нуклеиновых кислот.

[0090] Положения на целевой нуклеиновой кислоте, с которыми гибридизуются указанные антисмысловые соединения, определены как по меньшей мере 5-нуклеотидные фрагменты участка-мишени, на который нацелено действие активного антисмыслового соединения.

[0091] Хотя в настоящей заявке и представлены конкретные последовательности некоторых типовых целевых сегментов, для специалиста в данной области будет очевидно, что они приведены для наглядности и описания конкретных вариантов реализации, входящих в объем настоящего изобретения. Дополнительные целевые сегменты могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области на основании настоящего описания.

[0092] Целевые сегменты, составляющие в длину 5-100 нуклеотидов, содержащие участок, составленный по меньшей мере пятью (5) последовательными нуклеотидами, выбранными из иллюстративных предпочтительных целевых сегментов, также считаются подходящими для нацеленного воздействия.

[0093] Целевые сегменты могут включать ДНК или РНК последовательности, которые содержат по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов из 3'-конца одного из иллюстративных предпочтительных целевых сегментов (остальные нуклеотиды представляют собой последовательный участок той же ДНК или РНК, начинающийся непосредственно над 5'-концом указанного целевою сегмента и продолжающийся, пока указанная ДНК или РНК не достигнет приблизительно 5-100 нуклеотидов). Сходные предпочтительные целевые сегменты представлены ДНК или РНК последовательностями, которые содержат но меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов из 3'-конца одного из иллюстративных предпочтительных целевых сегментов (остальные нуклеотиды представляют собой последовательный участок той же ДНК или РНК, начинающийся непосредственно за 5'-концом и продолжающийся, пока указанная ДНК или РНК не достигнет приблизительно 5-100 нуклеотидов). Специалист в данной области техники, располагая целевыми сегментами, примеры которых приведены и настоящей заявке, сможет, не прибегая к значительным объемам экспериментов, идентифицировать другие предпочтительные целевые сегменты.

[0094] После того как один или более целевой участок, сегмент или сайт идентифицированы, отбирают антисмысловые соединения, обладающие значительной степенью комплементарности указанной мишени, т.е. достаточно хорошо и специфически гибридизующиеся с ней с получением необходимого эффекта.

[0095] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения указанные олигонуклеотиды связываются с антисмысловой цепью конкретной мишени. Длина указанных олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 5 нуклеотидов и они могут быть синтезированы таким образом, что каждый олигонуклеотид будет нацелен на перекрывающиеся последовательности, т.о. полученные олигоиуклеотиды будут покрывать целевой полинуклеотид по всей длине. Мишени также включают кодирующие и некодирующие области.

[0096] Согласно одному из вариантов реализации предпочтительно нацеленное воздействие на специфические нуклеиновые кислоты посредством антисмысловых олигонуклеотидов. Нацеленное воздействие посредством антисмыслового соединения на конкретную нуклеиновую кислоту представляет собой многоступенчатый процесс. Указанный процесс, как правило, начинается с идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, функцию которой необходимо модулировать. Она может представлять собой, например, клеточный ген (или иРНК, транскрибированную с этого гена), экспрессия которого связана с определенным заболеванием или болезненным состоянием, или некодирующий полинуклеотид, такой как, например, некодирующая РНК (нкРНК).

[0097] РНК могут быть классифицированы на (1) информационные РНК (иРНК), транслируемые с образованием белков, и (2) не кодирующие белки РНК (нкРНК). нкРНК включают микроРНК, антисмысловые транскрипты и другие транскрипционные единицы (TE, содержащие большое количество стоп-кодонов и не включающие сколько-нибудь обширную «открытую рамку считывания». Многие нкРНК начинаются с сайтов инициации транскрипции в 3' нетранслируемых участках (3'UTR) кодирующих белки локусов. НкРНК часто довольно малочисленны, и по меньшей мере половина нкРНК, секвенированных консорциумом FANTOM, по-видимому, не полиаденилированы. Большинство исследователей по попятным причинам уделяют основное внимание полиаденилированным иРНК, которые подвергаются процессингу и экспортируются в цитоплазму. Недавно было показано, что пул неполиаденилированных ядерных РНК может быть очень обширен, и что многие из таких транскриптов происходят из так называемых межгенных участков. Механизм, посредством которого hkPHK могут регулировать генную экспрессию, заключается в спаривании оснований с целевыми траскриптами. РНК, функционирующие за счет спаривания оснований, могут быть разделены на следующие группы: (1) цис-кодируемые РНК, кодируемые генным участком в том же расположении, по па противоположной цепи относительно РНК, с которыми они взаимодействуют и, таким образом, демонстрирующие безупречную комплементарность своей мишени, и (2) транс-кодируемые РНК, кодируемые хромосомным участком, отличным от кодирующего РНК, с которыми они взаимодействуют и, как правило, не обладающие безупречным потенциалом для спаривания оснований со своими мишенями.

[0098] Без связи с какой-либо конкретной теорией, модификация антисмыслового полинуклеотида антисмысловыми олигонуклеотидами, описанными в настоящей заявке, может влиять на экспрессию соответствующих смысловых информационных РНК. При этом такая регуляция может быть как дискордантной (антисмысловой нокдаун приводит к повышению уровней информационной РНК), так и конкордатной (антисмысловой нокдаун приводит к сопутствующему понижению уровней информационной PHK). В таких случаях антисмысловые олигонуклеотиды могут быть нацелены на перекрывающиеся или неперекрывающиеся части указанного антисмыслового транскрипта, что приводит к нокдауну или изоляции. Нацеленное действие как па кодирующие, так и на некодирующие антисмысловые последовательности может осуществляться одинаковым образом и любая из этих категорий способна к регуляции соответствующих смысловых транскриптов - либо конкордатным, либо дискордантным образом. Стратегии, применяемые для идентификации новых олигонуклеотидов для взаимодействия с мишенями, могут быть основаны на нокдауне антисмысловых РНК-трапскриптов антисмысловыми олигонуклеотидами или любыми другими способами модулирования требуемой мишени.

[0099] Стратегия 1: В случае дискордантной регуляции, нокдаун антисмыслового транскрипта повышает экспрессию обычного (смыслового) гена. В том случае, если этот последний ген кодирует мишень известного или предполагаемого лекарственного средства, то нокдаун его антисмыслового эквивалента может предположительно имитировать действие агониста рецептора или ферментного стимулятора.

[00100] Стратегия 2: В случае конкордантной регуляции возможно одновременно осуществить нокдаун и антисмыслового и смыслового транскриптов и чем самым добиться синергистического снижения обычной (смысловой) генной экспрессии. Если, например, антисмысловой олигонуклеотид используют для нокдауна, тогда эта стратегия может применяться для нацеленного воздействия одним антисмысловым олигонуклеотидом па смысловой транскрипт и другим антисмысловым олигонуклеотидом на соответствующий антисмысловой транскрипт, или одним энергетически симметричным антисмысловым олигонуклеотидом, одновременно нацеленно действующим на перекрывающиеся смысловые и аптисмысловые транскрипты.

[00101] Согласно настоящему изобретению антисмысловыс соединения включают антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), миРНК соединения, одно- или двуцепочечные РНК-интерферирующие (РНКи) соединения, такие как миРНК соединения, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты и модулируют ее функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут представлять собой миметики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двуцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, но они могут быть объединены или получены иным способом для получения кольцевых или и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, формирующих полностью или частично двуцепочечное соединение или одиночную цепь с достаточной самокомплементарностью для гибридизации и формирования полностью или частично двуцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3' или 5' концы, или могут связываться с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец на 5' либо на 3' конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двуцепочечные соединения в некоторых случаях могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Как вариант, указанные две цепи могут быть связаны посредством не-нуклеинового фрагмента или линкерной группы. Сформированная одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплсмептарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двуцепочечными. Специфическая модуляция генной экспрессии может быть достигнута стабильной экспрессией дцРНК-шпилек в трансгенных клеточных линиях, при этом согласно некоторым вариантам реализации указанные генная экспрессия или функция регулируются повышающе. При формировании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с формированием дуплекса, указанные две цепи (или формирующие дуплекс участки одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются по Уотсону-Крику.

[00102] При введении в систему соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут приводить к активации одного или более фермента или структурного белка, влияя на расщепление или иные модификации целевой нуклеиновой кислоты, либо могут действовать через механизмы «заполнения». Как правило, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть названы «ДНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2'-дезокси-сахар и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания) или «РНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2'- гидроксил или 2’- модифицированные сахара и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего A- и B- формами. Предполагают, что, как правило, олигонуклеотиды, имеющие структуру типа В-формы, «ДНК-подобны», а имеющие структуру типа А-формы, «РНК-подобны». Согласно некоторым вариантам реализации (с химерами) антисмысловое соединение может содержать участки как А-, так и В-формы.

[00103] Согласно одному из вариантов реализации требуемые олигонуклеотиды или антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одно из перечисленных: антисмысловая РНК, антисмысловая ДНК, химерные аптисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие модифицированные связи, интерферирующая РНК (РНКи), малая интерферирующая РНК (миРНК); микроинтерферирующая РНК (микроРНК); малые временные РНК (siPHK, мвРНК); или малые образующие шпильки РНК (shPHK); малые активирующие РНК (аРНК); короткие активирующие РНК (каРНК) или их комбинации.

[00104] дцРНК также может активировать генную экспрессию посредством механизма, названного «активация генов малыми (короткими) РНК» или аРНК. дцРНК, нацеленные на промоторы генов, индуцируют мощную активацию транскрипции связанных с ними генов. Наличие аРНК в клетках человека было продемонстрировано с применением синтетических дцРНК, называемых «короткие активирующие РНК» (каРНК). На настоящий момент неизвестно, присутствует ли аРНК в других организмах.

[00105] Обнаружено, что малые двуцепочечные РНК (дцРНК), такие как малые интерферирующие РНК (миРНК) и микроРНК (микроРНК), являются триггерами эволюционно консервативного механизма, известного как РНК-интерференция (РНКи). РНКи неизбежно ведет к сайленсингу генов посредством реконструкции хроматина и, тем самым, к подавлению транскрипции, разрушению комплементарной иРЫК или блокированию трансляции белка. Тем не менее, в случаях, подробно описанных в нижеследующем разделе «Примеры», олигонуклеотиды, как показано, увеличивают экспрессию и/или функцию полинуклеотидов ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) и кодируемых ими продуктов. дцРНК могут также работать как короткие активирующие РНК (каРНК). Без связи с какой-либо конкретной теорией, посредством нацеленного взаимодействия с промоторами генов каРНК индуцируют экспрессию гена-мишени в результате явления, называемого дцРНК-ипдуцировапной активацией транскрипции (aPHK).

[00106] Согласно другому варианту реализации «предпочтительные целевые сегменты», определенные в настоящей заявке, могут быть использованы для отбора дополнительных соединений, которые модулируют экспрессию полинуклеотидов ядерного респираторного фактора 1 (NRF1). «Модуляторы» представляют собой соединения, понижающие или повышающие экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей NRA1, и содержащие но меньшей мере 5-нуклеотидный участок, комплементарный предпочтительному целевому сегменту. Способ отбора включает этапы контактирования предпочтительного целевого сегмента молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей смысловые или природные антисмысловые полинуклеотиды NRF1, с одним или несколькими потенциальными модуляторами, и отбор одного или более потенциального модулятора, понижающего или повышающего экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды NRF1, например, SKQ ID NO: 3-5. После того, как подтверждена способность потенциального(ых) модулятора(ов) к модулированию (например, понижению или повышению) экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды NRF1, указанный модулятор может быть использован для дальнейших исследований функций полинуклеотидов NRF1, или для применения в качестве агента для исследований, диагностики или лечения согласно настоящему изобретению.

[00107] Нацеленное воздействие при помощи природной антисмысловой последовательности предпочтительно модулирует функцию гена-мишени. Например, гена NRF1 (в частности, под номером доступа NM_005011). Согласно одному из вариантов реализации мишень представляет собой антисмысловой полинуклеотид гена NRF1. Согласно одному из вариантов реализации действие антисмыслового олигонуклеотида нацелено на смысловые и/или природные антисмысловые последовательности полинуклеотидов NRF1 (в частности, под номером доступа NM 005011), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу, и указанные мишени включают кодирующие и некодирующие участки антисмысловых и/или смысловых полинуклеотидов NRF1.

[00108] Предпочтительные целевые сегменты согласно настоящему изобретению могут также быть скомбинированы с соответствующими комплементарными антисмысловыми соединениями, предложенными в настоящем изобретении, с формированием стабилизированных двуцепочечных (дуплексных) олигонуклеотидов.

[00109] В данной области техники показано, что такие двуцепочечные олигонуклеотидные фрагменты модулируют экспрессию мишеней и регулируют трансляцию, а также процессинг РНК, посредством антисмыслового механизма. Кроме того, указанные двуцепочечные фрагменты могут подвергаться химическим модификациям. Например, показано, что такие двуцепочечные фрагменты ингибируют мишень посредством классической гибридизации антисмысловой цепи указанного дуплекса с мишенью, запуская тем самым ферментное расщепление мишени.

[00110] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловой олигонуклеотид нацелен на полинуклеотиды ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) (в частности, под номером доступа NM_005011), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.

[00111] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула нуклеиновой кислоты не ограничивается собственно NRF1 и может быть представлена любыми изоформами, рецепторами, гомологами и т.п. молекулами NRF1.

[00112] Согласно одному из вариантов реализации действие олигонуклеотида нацелено на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов NRF1, например, полинуклеотидов, представленных в последовательности SEQ II) NO: 2, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены последовательностями SRQ ID NO: 3-5.

[00113] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны пли связываются с антисмысловыми последовательностями нуклеиновых кислот NRF1, включая в качестве неограничивающих примеров некодирующие смысловые и/или антисмысловые последовательности, связанные с полинуклеотидами NRF1, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул NRF1.

[00114] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны природным антисмысловым последовательностям нуклеиновых кислот NRF1, представленным в последовательностях SEQ ID NO: 2, или связываются с ними, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул NRFI.

[00115] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотиды содержат последовательности, состоящие по меньшей мере из 5 последовательных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NO: 3-5, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул NRFI.

[00116] Указанные полинуклеотидные мишени включают NRF1, в том числе представителей этого семейства, варианты NRF1; мутанты NRF1, в том числе SNP; некодирующие последовательности NRF1; аллели NRF1; видовые варианты, фрагменты и т.п. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.

[00117] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотид, нацеленный на полинуклеотиды NRF1, включает: антисмысловую РНК, интерферирующую РНК (РНКи), малую интерферирующую РНК (миРНК); микроинтерферирующую РНК (микроРНК); малые временные РНК (stPHK, мвРНК); или малые образующие шпильки РНК (shPHK); малые активирующие РНК (аРНК); или короткие активирующие РНК (каРНК).

[00118] Согласно одному из вариантов реализации направленное воздействие на полинуклеотиды ядерного респираторного фактора 1 (NRF1), например, SKQ II) NO: 2, модулирует экспрессию или функцию таких мишеней. Согласно одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются повышающие по сравнению с контролем. Согласно одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются понижающе по сравнению с контролем.

[00119] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые соединения содержат последовательности, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 3-5. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п.

[00120] Согласно одному из вариантов реализации последовательности SEQ ID NO: 3-5 содержат один или более ЗНК-нуклеотид.

[00121] Модуляция нужной целевой нуклеиновой кислоты может быть осуществлена несколькими известными в данной области техники способами. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК и т.д. Молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты (например, рибозимы) представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, способные катализировать одну или несколько разнообразных реакций, включая способность многократно расщеплять другие отдельные молекулы нуклеиновой кислоты чувствительным к последовательности нуклеиновых оснований сиквенс-специфичным образом. Такие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты могут применяться, например, для нацеленного действия на практически любой РНК-транскрипт.

[00122] Из-за сиквенс-специфичности транс-расщепляющие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты являются многообещающими потенциальным и терапевтическими агентами для лечения заболеваний человека (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Chrisloffersen and Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы таким образом, чтобы расщеплять специфические целевые РНК из совокупности клеточных РНК. Такое расщепление переводит указанную иРНК в нефункциональное состояние и подавляет экспрессию белка с этой РНК. Таким образом, синтез белка, связанный с болезненным состоянием, может быть селективно ингибирован.

[00123] Как правило, ферментативные нуклеиновые кислоты с РНК-расщепляющей активностью сначала связываются с целевой РНК. Такое связывание происходит посредством мишень-связывающего фрагмента ферментативной нуклеиновой кислоты, который располагается в непосредственной близости к ферментативному фрагменту указанной молекулы, расщепляющему целевую РНК. Таким образом, указанная ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает целевую РНК, а потом связывается с ней посредством комплементарного спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком ферментативно расщепляет целевую РНК. Стратегическое расщепление такой целевой РНК уничтожит ее способность к прямому синтезу кодируемого белка. После того, как ферментативная нуклеиновая кислота связала и расщепила целевую РНК, она отсоединяется от этой РНК, освобождался для другой мишени и может повторно связывать и расщеплять новые мишени.

[00124] Ряд подходов, таких как in vitro стратегии отбора (извлечения) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, В 205, 435), был использован для получения новых нуклеиновых катализаторов, способных катализировать различные реакции, такие как расщепление и лигировапие фосфодиэфирных связей и амидных связей.

[00125] Получение рибозимов, обладающих оптимальной каталитической активностью, внесет существенный вклад в любую стратегию, включающую применение РНК-расщепляющих рибозимов для регулирования генной экспрессии. Рибозим типа «головка молотка», например, функционирует со скоростью каталитической реакции (kcat) приблизительно 1 мип-1 в присутствии насыщающих (К) мМ) концентраций кофактора Mg2+. Показано, что синтетический «РНК-лигазный» рибозим катализирует соответствующую реакцию самоизменения со скоростью приблизительно 100 мин-1. Кроме того, известно, что определенные модифицированные рибозимы типа «головка молота», имеющие субстрат-связывающие ДНК-«ручки», катализируют расщепление РНК со скоростями оборотов, достигающими 100 мин-1. Наконец, замещение специфического остатка каталитического ядра «головки молота» определенными нуклеотидными аналогами дает модифицированные рибозимы, демонстрирующие повышение скорости каталитической реакции вплоть до 10-кратного. Эти результаты показывают, что рибозимы могут обеспечивать химические преобразования с каталитическими скоростями, значительно превышающими таковые, демонстрируемые in vitro большинством природных саморасщепляющих рибозимов. Далее, возможно, что структуры определенных саморасщепляющих рибозимов могут быть оптимизированы для получения максимальной каталитической активности, или что могут быть получены совершенно новые РНК мотивы, демонстрирующие значительно увеличенные скорости фосфодиэфирного расщепления PHK.

[00126] Внутримолекулярное расщепление РНК-субстрата РНК катализатором, соответствующим модели «головка молота», впервые было показано в 1987 (Uhlenbeck, О. С. (1987) Nature, 328: 596-600). Указанный РНК катализатор был выделен и вступал в реакцию с различными РНК-молекулами, подтверждая, что он действительно является катализатором.

[00127] Каталитические РНК. сконструированные на основе мотива «головка молота», применялись для расщепления специфических целевых последовательностей осуществлением подходящего спаривания оснований в каталитической РНК для обеспечения необходимого спаривания оснований с целевыми последовательностями. Это позволило применить указанную каталитическую РНК для расщепления специфических целевых последовательностей и показать, что каталитические РНК, сконструированные согласно модели «головка молота», предположительно способны расщеплять специфические субстратные РНК in vivo.

[00128] РНК-интерференция (РНКи) стала мощным инструментом модулирования генной экспрессии у млекопитающих и в клетках млекопитающих. Этот подход предполагает получение малых интерферирующих РНК (миРНК) в виде самой РНК или в виде ДНК, с применением экспрессионной плазмиды или вируса и кодирующей последовательности малых шпилькообразующих РНК, в результате процессинга дающих: миРНК. Эта система обеспечивает эффективный транспорт пре-миРНК в цитоплазму, где они проявляют активность, и позволяет применение регулируемых и тканеспецифичных промоторов генной экспрессии.

[00129] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотид или антисмысловое соединение содержит олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметик, химеру, аналог или гомолог. Этот термин включает олигонуклеотиды, состоящие из встречающихся в природе нуклеотидов, Сахаров и ковалентных межнуклеозидных (скелетных) связей, а также олигонуклеотиды, содержащие не встречающиеся в природе фрагменты, функционирующие сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительнее нативных форм, так как они обладают необходимыми свойствами, такими как, например, увеличенное поглощение клетками, увеличенная связывающая способность в отношении целевой нуклеиновой кислоты и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

[00130] Согласно настоящему изобретению указанные олигонуклеотиды или «антисмысловые соединения» включают антисмысловые олигонуклеотиды (например, РНК, ДНК, их миметики, химеры, аналоги или гомологи), рибозимы, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), миРНК соединения, одно- или двуцепочечные РНК-интерферирующие (PНКи) соединения, такие как миРНК соединения, каРМК, аРНК, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты и модулируют ее (функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДИК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут представлять собой мимстики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двуцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, по они могут быть объединены или получены иным способом для получения кольцевых или и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, формирующих полностью или частично двуцепочечное соединение, или одиночная цепь с достаточной самокомплементарностью для гибридизации и формирования полностью или частично двуцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3' или 5' концы, или могут связываться с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец на 5' или на 3' конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двуцепочечные соединения в некоторых случаях могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Как вариант, указанные две цепи могут быть связаны посредством не-нуклеинового фрагмента или линкерной группы. Сформированная одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двуцепочечными. Специфическое модулирование генной экспрессии может быть достигнуто стабильной экспрессией дцРНК-шпилек в трансгенных клеточных линиях. При формировании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с формированием дуплекса, указанные две цепи (или формирующие дуплекс участки одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются по Уотсону-Крику.

(00131] При введении в систему соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут приводить к активации одного или более ферментов или структурных белков, влияя на расщепление или иные модификации целевой нуклеиновой кислоты, либо могут действовать через механизмы «заполнения». Как правило, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть названы «ДНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2'-дезокси-сахар и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания) или «РНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2'- гидроксил или 2’-модифицированные сахара и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего А- и В-формами, Предполагают, что, как правило, олигонуклеотиды, имеющие структуру типа В-формы, «ДНК-подобны», а имеющие структуру типа А-формы, «РНК-подобны». Согласно некоторым вариантам реализации (с химерами) антисмысловое соединение может содержать участки как А-, так и В-формы.

[00132] Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению могут содержать антисмысловой фрагмент приблизительно от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов (т.е. приблизительно от 5 до приблизительно 80 связанных нуклеозидов) длиной. Это относится к длине указанной антисмысловой цепи или части указанного антисмыслового соединения. Иными словами, одноцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, содержит от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов, а двуцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, (такие как, например, дцРНК) содержит смысловой и антисмысловая цепь или фрагменты от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что под этим понимаются антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52. 53, 54, 55. 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.

[00133] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, содержат антисмысловые фрагменты 10-50 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены олигонуклеотиды, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38. 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, или 50 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного. Согласно некоторым вариантам реализации длина указанных олигонуклеотидов составляет 15 нуклеотидов.

[00134] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые или олигонуклеотидные соединения, предложенные в настоящем изобретении, издержат антисмысловые фрагменты, составляющие от 12 или 13 до 30 нуклеотидов в длину. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены антисмысловые соединения, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.

[00135] Согласно одному из вариантов реализации олигомерные соединения, предложенные в настоящем изобретении, также включают варианты, в которых в одном или нескольких положениях нуклеотидов указанного соединения присутствуют различающиеся основания. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденозин, могут быть получены варианты, которые содержат тимидин, гуанозин или цитидин в этом положении. Это может быть осуществлено в любом положении указанного антисмыслового или дцРНК-соединения. Такие соединения затем тестируют с применением способов, описанных в настоящей заявке, для определения их способности ингибировать экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.

[00136] Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между указанным антисмысловым соединением и мишенью составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 60% до приблизительно 70%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 70% до приблизительно 80%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 80% до приблизительно 90%. Согласно некоторым вариантам реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарности составляют приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.

[00137] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые олигонуклеотиды, такие как, например, молекулы нуклеиновой кислоты, представленные и SEQ ID NO: 2-5 включают одну или более чем одну замену или модификацию. Согласно одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды заменены закрытыми нуклеиновыми кислотами (31IK).

[00138] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды нацеленно взаимодействуют с одним или более участком молекул нуклеиновой кислоты смысловых и/или антисмысловых кодирующих и/или некодирующих последовательностей, связанных с NRFI и последовательностей, представленных в последовательностях SFQ ID NO: 1 и 2. Мишенями указанных олигонуклеотидов также являются перекрывающиеся области SRQ ID NO: 1 и 2.

[00139] Некоторые предпочтительные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, представляют собой химерные олигонуклеотиды. «Химерные олигонуклеотиды» или «химеры» в контексте настоящего изобретения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химически отличных участка, каждый из которых состоит по меньшей мере из одного нуклеотида. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок модифицированных нуклеотидов, обеспечивающий одно или более полезное свойство (такое как, например, увеличенная устойчивость к нуклеазам, увеличенное поглощение клетками, повышенная связывающая способность по отношению к мишени) и участок, который представляет собой субстрат для ферментов, способных к расщеплению РНК:ДНК или РНК:РПК гибридов. Как пример, РПКаза II представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет РНК-цепь РНК:ДНК дуплекса. Активация РНКазы FI, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК. тем самым значительно повышая эффективность антисмысловую модулирования генной экспрессии. Соответственно, сопоставимые результаты часто могут быть получены с более короткими олигонуклеотидами при использовании химерных олигонуклеотидов, по сравнению с фосфотиоатными дезоксиолигонуклеотидами, гибридизующимися с чем же целевым участком. Расщепление целевой РНК может быть определено стандартным способом посредством гель-электрофореза и, при необходимости, сопутствующих методик гибридизации нуклеиновых кислот, известных в данной области техники. Согласно одному из вариантов реализации химерный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один участок, модифицированный для увеличения способности связываться с мишенью, и, как привило, участок, функционирующий как субстрат РНКазы Н. Связывающая способность олигонуклеогида по отношению к мишени (в данном случае, нуклеиновой кислоте, кодирующей ras) определяется стандартным способом измерением температуры плавления пары олигонуклеотид/мишень, представляющим собой температуру, при которой олигонуклеотид и мишень диссоциируют; диссоциацию определяют спектрофотометрически. Чем выше температура плавления, тем больше связывающая способность указанного олигонуклеотида по отношению к мишени.

[00140] Химерные антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде составных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или миметиков олигонуклеотидов согласно приведенным выше описаниям. Такие соединения также известны в данной области техники как гибриды или гапмеры. Примеры патентов США, в которых описано получение таких гибридных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; и 5700922, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00141] Согласно одному из вариантов реализации модифицируемый участок указанного олигонуклеотида содержит по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный по 2' положению сахара, наиболее предпочтительно 2'-O-алкил, 2'-O-алкил-O-алкил или 2'-фтор-модифицированный нуклеотид. Согласно другому варианту реализации РНК модификации включают 2'-фтор, 2'-амино и 2'-O-метильные модификации рибозы пиримидинов, лишенные азотистого основания остатки или обратное основание на 3'-конце указанной РНК. Такие модификации олигонуклеотидов осуществляют стандартными способами; показано, что такие олигонуклеотиды имеют более высокую температуре плавления (т.е. большую способность связываться с мишенью), чем 2'-дезоксиолигонуклеотиды, относительно определенной мишени. 13 результате такой повышенной связывающей способности значительно усиливается ингибирование генной экспрессии РНКи-олигонуклеотидом. РНКаза II представляет собой клеточную эндонуклеазу, расщепляющую РНК цепь РНК:ДНК дуплексов; активация этого фермента, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК, и, следовательно, может значительно увеличивать эффективность РНКи игибирования. Расщепление целевой РНК может быть подтверждено обычным способом посредством гель-электрофореза. Согласно одному из вариантов реализации указанный химерный олигонуклеотид также модифицирован для увеличения устойчивости к нуклеазе. Клетки содержат множество экзо- и энонуклеаз, способных разлагать нуклеиновые кислоты. Показано, что некоторые нуклеотидные и нуклеозидные модификации придают олигонуклеотиду, в состав которого они входят, большую устойчивость к нуклеазному расщеплению по сравнению с нативным олигодезоксинуклеотидом. Устойчивость к нуклеазам измеряют обычным способом, инкубируя олигонуклеотиды с клеточными экстрактами или растворами с выделенными нуклеазами и измеряя содержание интактных олигонуклеотидов спустя определенное время, как правило, посредством гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, модифицированные для увеличения устойчивости к нуклеазам, остаются интактными на протяжении более длительного времени по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами. Показано, что ряд модификаций олигонуклеотидов усиливают или придают им устойчивость к нуклеазам. Олигонуклеотиды, которые содержат по меньшей мере одну фосфотиоатную модификацию, на настоящий момент более предпочтительны. В некоторых случаях модификации олигонуклеотидов, усиливающие способность связываться с мишенью также, независимым образом, способны повышать устойчивость к нуклеазам.

[00142] Специфические примеры некоторых предпочтительных олигонуклеотидов, предусмотренных настоящим изобретением, включают содержащие модифицированные остовы, например, фосфотиоаты, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, алкильные с короткой цепью или циклоалкильные связи между сахарами или гетероатомные с короткой цепью или гетероциклические связи между сахарами. Наиболее предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфотиоатными остовами и с гетероатомными остовами, в частности. CH2--NH--O--CH2, CH,— N(СН3)-O--CH2 [известный как метилен(метилимино) или MMI остов], CH2—O--N (CH3)—CH2, CH2--N (СН3)--СН2, и O—N (CH3)—CH2—CH2 остовы, где нативный фосфодиэфирный остов представлен в виде О-P-О--CH,). Амидные остовы, описанные в De Mcsmacker et al. (1995) Acс. Chem. Res. 28:366-374, также являются предпочтительными. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы (Suinmeilon and Weller, патент США 5034506). Согласно другому варианту реализации, такому как остов на основе пептидной нуклеиновой кислоты (ПИК), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида заменен полиамидным остовом, нуклеотиды связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп полиамидного остова. Олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей в положении 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 ОСН3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 или O(CH2)n СН3, где n принимает значения от 1 до приблизительно 10; С1-С10 низшие алкилы, алкоксиалкокси, замещенные низшие алкилы, алкарил или аралкил; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; О--, S--, или N-алкил; О--, S-, или N-алкенил; SOCH3; SO2 СН3; ONO2; NO2: N3; NH2; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенные силилы; РНК расщепляющую группу; репортерную группу; интеркалятор; группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида; или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метоксиэтокси [2'-O-CH2 СН2 OCH3, также известный как 2'-O-(2-метоксиэтил)]. Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси (2'-O—СН3), 2'-пропокси (2'-ОСН2 СН2СН3) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, по 3' положению сахара 3' концевого нуклеотида и 5' положению 5' концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики сахаров, такие как циклобутилы, вместо пентофуранозильной группы.

[00143] Олигонуклеотиды могут также содержать, дополнительно или альтернативно, модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области техники просто «основанием»). Используемые в настоящей заявке термины «немодифицированные» или «природные» нуклеотиды включают аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают нуклеотиды, обнаруживаемые в природных нуклеиновых кислотах редко или временно, например, гипоксантин, 6-метиладенин, 5-Ме пиримидины, в частности, 5-метилцитозин (также называемый 5-метил-2' дезоксицитозин и часто упоминаемый в данной области техники как 5-Ме-С), 5- гидроксиметилцитозин (ГМЦ), гликозил ГМЦ и гентобиозил ГМЦ, а также синтетические нуклеотиды, например, 2-амипоадепин, 2-(метиламино)аденин, 2-(имидазолилалкил)аденин, 2-(аминоалкиламино)аденин или другие гетерозамещенные алкиладенины, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 5-бромурацил, 5-гидроксиметилурацил, 8-азагуанин, 7-деазагуанин, N6 (6-аминогексил)аденин и 2,6-диаминопурин. «Универсальное» основание из известных в данной области техники, например, инозин, может также быть включено. Показано, что 5-Ме-С замещения увеличивают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С и на настоящий момент являются предпочтительными замещениями оснований.

[00144] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, увеличивающих активность или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, фрагмент холестерила, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту. Олигонуклеотиды, содержащие липофильные фрагменты, и способы получения таких олигонуклеотидов известны в данной области техники, см., например, патенты США 5138045, 5218105 и 5459255.

[00145] Необязательно, чтобы все положения конкретного нуклеотида были модифицированы единообразно, и на самом деле в одном олигонуклеотиде, или даже в одном нуклеозиде в составе олигонуклеотида может содержаться более одной из упомянутых выше модификаций. Настоящее изобретение также включает олигонуклеотиды, которые представляют собой химерные олигонуклеотиды согласно данному выше определению.

[00146] Согласно другому варианту реализации молекула нуклеиновой кислоты, предложенная в настоящем изобретении, конъюгирована с другим фрагментом, включая, но не ограничиваясь перечисленными, лишенные оснований нуклеотиды, полиэфиры, полиамины, полиамиды, пептиды, углеводороды, липиды или полиуглеводородные соединения. Специалистам в данной области техники будет ясно, что такие молекулы могут быть связаны с любым одним или более чем одним нуклеотидом, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, и нескольких положениях на сахаре, основании или фосфатной группе.

[00147] Олигонуклеотиды, применяемые согласно настоящему изобретению, могут быть удобно и просто получены с применением общеизвестной техники твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза коммерчески доступно от ряда поставщиков, включая Applied Biosystems. Могут также быть использованы любые другие способы такого синтеза; фактический синтез указанного олигонуклеотида не представляет трудностей для среднего специалиста в данной области техники. Также общеизвестна возможность использования сходных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфотиоатные и алкилатные производные. Также общеизвестна возможность использования сходных техник и коммерчески доступных модифицированных амидитов и продуктов на основе стекла с контролируемым размером пор (CPG), таких как биотип-, флуоресцеин-, акридин- или псорален-модифицированные амидиты и/или CPG (доступные у Glen Research, Sterling VA) для синтеза флуоресцентно меченых, биотинилированных или других модифицированных олигонуклеотидов, таких как холестерин-модифицированные олигонуклеотиды.

[00148] В соответствии с настоящим изобретением подразумевается применение модификаций, например, применение мономеров ЗНК для усиления силы, специфичности и продолжительности действия и расширение диапазона путей введения олигонуклеотидов. состоящих из конкретных компонентов, таких как МОЭ, АНК, ФАНК, ФТ и т.д. Это может быть достигнуто замещением некоторых мономеров в конкретных олигонуклеотидах ЗНК-мономерами. ЗНК-модифицированный олигонуклеотид может иметь размер, соответствующий исходному соединению, или может быть больше, либо, предпочтительно, меньше. Предпочтительно, чтобы такие ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды содержали менее чем приблизительно 70%, более, предпочтительно менее чем приблизительно 60%, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно. 50% мономеров ЗНК, и чтобы их размеры составляли приблизительно от 5 до 25 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 12 до 20 нуклеотидов,

[00149] Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы включают, не ограничиваясь перечисленными: фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-амино фосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, и боранофосфаты, включающие нормальные 3'-5' связи, 2'-5' связанные аналоги, и имеющие обращенную полярность, где соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Различные соли, смешанные соли и свободные кислоты также включены.

[00150] Примеры патентов США, раскрывающих получение вышеприведенных фосфорсодержащих связей, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821: 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; и 5625050. каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00151] Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы, не включающие атомы фосфора, образованы алкильными с короткой цепью пли циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или более гетероатомными с короткой цепью или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (образованными частично сахаром нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, содержащие смешанные N, О, S и СН2-компоненты.

[00152] Примеры патентов США, содержащие указание по получению описанных выше олигонуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00153] В других предпочтительных миметиках олигонуклеотидов и сахара, и межнуклеозидная связь, т.е. остов, нуклеотидных единиц, заменены новыми группами. Основания сохраняют для гибридизации с подходящим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно из таких олигомерных соединений, олигонуклеотидный миметик, продемонстрировавший прекрасную способность к гибридизации, называют пептидной нуклеиновой кислотой (ПНК). В ПНК-соединениях сахарный остов олигонуклеотида заменен амидсодержащим остовом, например, аминоэтилглициновым остовом. Основания нуклеиновых кислот сохранены и связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп амидной части остова. Примеры патентов США, в которых описано получение ПНК-соединений, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5539082; 5714331; и 5719262, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Дальнейшее описание ПНК-соединений можно найти у Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500.

[00154] Согласно варианту реализации изобретения олигонуклеотиды с фосфотиоатными остовами и олигонуклеозиды с гетероатомными остовами, и в частности- CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N (СН3)-О-CH2-, известным как метилен (метилимино) или MMI остов, - CH2-O-N (CH3)-CH2-, -CH2N(СН3)-N(CH3)СН2- и -O-N(CH3)-CH2-CH2-, где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -О-Р-O-СН2- согласно упомянутому выше патенту США 5489677, и амидные остовы согласно упомянутому выше патенту США 5602240. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы согласно вышеупомянутому патенту США 5034506.

[00155] Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей но положению 2': ОН; F; О-, S-, или N-алкил: О-, S-, или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил; или О алкил-О-алкил, где указанные алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный С→СО алкил или С2→СО алкенил и алкинил. В частности, предпочтительными являются О(СН2)n OnCH3, O(СН2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2nON(CH2)nCH3)2, где n и m могут принимать значения от 1 до приблизительно 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей по положению 2': С→СО, (низшие алкилы, замещенные низшие алкилы, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенные силилы, РНК расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида, или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-мегокси:жжси (2'-O-CH2CH2OCH3, также известную как 2'-O-(2-метоксиэтил) или 2-МОЭ), т.е. алкоксиалкокси группу. Еще одна предпочтительная модификация включает 2'-диметиламипооксиэтокси, т.е., O(CH2)2ON(CH3)2 группу, также известную как 2'-ДМАОЭ, согласно описанию в приведенных ниже в настоящей заявке примерах, и 2'- диметиламиноэтоксиэтокси (также известной в данной области техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-ДМАЭОЭ), т.е. 2'-O-СН2-O-CH2-N (CH2)2.

[00156] Другие предпочтительные модификации включают 2-метокси (2'-O СН3), 2'-аминопропокси (2'-O CH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, но 3' положению сахара 3' концевого нуклеотида пли в 2'-5'связанных олигонуклеотидах и 5' положению 5' концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики сахаров, например, циклобутильные фрагменты вместо пентофурамозильного сахара. Примеры патентов США, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576-127; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053: 5639873: 5646265; 5658873; 5670633; и 5700920, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00157] Олигонуклеотиды могут также содержать модифицированные или замещенные нуклеиновые основания (часто называемое в данной области техники просто «основания»). В контексте настоящей заявки «немодифицированные» или «природные» нуклеотиды включают пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают другие синтетические и природные нуклеотиды, такие как 5-метилцитозин (5-me-С), 5-гидроксиметил цитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пронинил урацил и цитозин, 6-азо урацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдо-урацил), 4-гиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенил, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазаадепин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.

[00158] Далее, нуклеотиды включают описанные в патенте США 3687808, описанные в 'The Concise encyclopedia of Polymer Science And Engineering', стр. 858-859, Kroschwilz, .1.1., ed. John Wiley & Sons, 1990, описанные у Englisch et al., 'Angewandle Chcmie, International Edition', 1991, 30, стр. 613, и описанные у Sanghvi, Y.S., Chapter 15, 'Antisense Research and Applications' , стр. 289-302, Crooke, S.T. и Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидов подходят, в частности, для увеличения связывающей способности олигомерных соединений, предложенных в настоящем изобретении. Такие включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и 0-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. 5-метилилцитозиновые замещения, как было показано, повышают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. и Lebleu, В., eds, 'Antisense Research and Applications' , CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и па настоящий момент являются предпочтительными замещениями оснований, в частности, в комбинации с 2'-O-метоксиэтиловыми модификациями сахаров.

[00159] Примеры патентов США, в которых описано получение вышеупомянутых модифицированных нуклеотидов, а также других модифицированных нуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808, а также 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 518490о; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5596091; 5614617; 5750692 и 5681941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00160] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, подразумевает химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагмента или конъюгата, стимулирующего активность, распределение в клетках или поглощение клетками указанного олигонуклеотида.

[00161] Такие фрагменты содержат, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-8-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфонат, цепь полиамина или полиэлтилегликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, или октадециламиновый или гексиламино-карбонил-t оксихолестериновый фрагмент.

[00162] Примеры патентов США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных коньюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552 538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486 603; 5512439; 5578718: 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762 779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013: 5082 830: 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810: 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599 928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00163] Поиск новых лекарственных средств: Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут также применяться для поиска новых лекарств и валидации мишеней. Настоящее изобретение включает применение описанных в настоящей заявке соединений и предпочтительных целевых сегментов при поиске новых лекарственных средств для выяснения взаимосвязей, существующих между полинуклеотидами ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) и болезнью, фенотипом или состоянием. Такие способы включают определение или модуляцию полинуклеотидов NRF1, включая контактирование образца, ткани, клетки или организма с соединениями, предложенными в настоящем изобретении, измерение уровня нуклеиновой кислоты или белка полинуклеотидов NRF1 и / или оценка соответствующего фенотипического или химического конечного состояния через некоторое время после лечения, и, в некоторых случаях, сравнение измеряемой величины с необработанными образцами или образцами, обработанными другими предложенными в настоящем изобретении соединениями. Эти способы могут применяться параллельно или в комбинации с другими экспериментами по определению функций неизвестных генов в процессе валидации мишеней или для определения обоснованности применения конкретного генного продукта в качестве мишени для лечения или предотвращения конкретного заболевания, состояния или фенотипа

Оценка положительности регуляции или ингибирования генной экспрессии:

[00164] Перенос экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или в организм-хозяина может быть оценен прямым определением присутствия указанной нуклеиновой кислоты в указанных клетке или организме. Такое определение может быть проведено несколькими известными специалистам в данной области техники способами. Например, присутствие экзогенной нуклеиновой кислоты может быть определено посредством саузерн-блоттинга или полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением праймеров, специфически амплифицирующих нуклеотидные последовательности, связанные с указанной нуклеиновой кислотой. Экспрессия указанных экзогенных нуклеиновых кислот также может быть измерена с применением общепринятых способов, в том числе анализа генной экспрессии. Например, иРНК, полученная из экзогенной нуклеиновой кислоты, может быть обнаружена и количественно определена с применением позерн-блоттинга и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

[00165] Экспрессия РНК с указанной экзогенной нуклеиновой кислоты может также быть определена измерением ферментативной активности или активности репортерного белка. Например, антисмысловая модулирующая активность может быть непрямо измерена через понижение или повышение экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в качестве показателя тот, что экзогенная нуклеиновая кислота производит эффекторную РНК. Используя консервативность последовательностей, возможно сконструировать праймеры и использовать для амплификации кодирующих участков указанных генов-мишеней. Сначала может быть использована наиболее активно экспрессируемая кодирующая область каждого гена для построения модели контрольного гена, хотя может быть использована любая кодирующая или некодирующая область. Каждый контрольный ген получен встраиванием каждой кодирующей области между кодирующей репортер областью и ее поли(А)-сигналом. Эти плазмиды производят иРНК с репортерным геном в вышележащей части гена и потенциальной мишенью РНК и в 3' некодирующей области. Эффективность индивидуальных антисмысловых олигонуклеотидов может быть проанализирована по модулированию репортерного гена. Репортерные гены подходящие для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, включают гены синтазы ацетогидроксикислот (АГКС), щелочной фосфатазы (ЩФ), бетагалактозидазы (LacZ), бета глюкоронидазы (GUS), хлорамфеникол ацетилтрансферазы (ХАТ), зеленого флуоресцентного белка (GFP), красного флуоресцентного белка (RFP), желтого флуоресцентного белка (YFP), голубого флуоресцентного белка (CFP), пероксидазы хрена (ПОХ), люциферазы (Luc), нопалин синтезы (NOS), октонин синтазы (OCS) и их производных. Доступны различные селективные маркеры, придающие устойчивость к ампициллину, блеомицину, хлорамфениколу, гентамицину, гиромицину, канамицину, линкомицину, метотрексату, фосфинотрицину, пуромицину и тетрациклину. Способы определения модулирования репортерного гена хорошо известны в данной области техники, и включают, не ограничиваясь перечисленными: флуорометрические способы (например, флуоресцентная спектроскопия, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), флуоресцентная микроскопия), определение устойчивости к антибиотику.

[00166] Экспрессия белка и иРНК NRF1 может быть проанализирована с применением известных специалистам в данной области техники способов, описанных в любом из разделов настоящей заявки. Например, для измерения уровней белка могут применяться методы иммуноанализа, такие как FLISA. Наборы FLISA для анализа NRF1 коммерчески доступны, например, от R&D Systems (Minneapolis, MN).

[00167] Согласно вариантам реализации экспрессия NRFI (например, иРНК или белка) в образце (например, клетки или ткани in vivo или in vitro), обработанном с применением антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, оценивается посредством сравнения с экспрессией NRF1 в контрольном образце. Например, экспрессия белка или нуклеиновой кислоты может сравниваться с применением известных специалистам в данной области техники способов с таковой в плацебо-образце или в необработанном образце. Как вариант, может быть проведено сравнение с образцом, обработанным контрольным антисмысловым олигонуклеотидом (например, имеющим измененную или иную последовательность), в зависимости от того, какую информацию необходимо получить. Согласно другому варианту реализации различие в экспрессии белка или нуклеиновой кислоты NRF1 между необработанным и обработанным образцами может сравниваться с различием в экспрессии различных нуклеиновых кислот включая любые стандартные, признанные исследователем подходящими, например, конститутивный ген) в обработанном и необработанном образцах.

[00168] Наблюдаемые различия могут быть выражены в удобной форме, например, в виде пропорции или доли, для сравнения с контролем. Согласно вариантам реализации уровень иРНК или белка NRF1 в образце, обработанном антисмысловым олигонуклеотидом, предложенным в настоящем изобретении, повышается или снижается приблизительно 1,25-кратно-10-кратно или более относительно необработанного образца или образца, обработанного контрольной нуклеиновой кислотой. Согласно вариантам реализации уровень и РНК или белка NRF1 повышается или снижается по меньшей мере приблизительно 1,25-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,3-кратпо, по меньшей мере приблизительно 1,4-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,6-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,7-кратно, но меньшей мере приблизительно 1,8-кратно, по меньшей мере приблизительно 2-кратно, но меньшей мере приблизительно 2,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 3,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей мере приблизительно 4,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 5-кратно, но меньшей мере приблизительно 5.5-кратпо, по меньшей мере приблизительно 6-кратпо, по меньшей мере приблизительно 6,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 7.5-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей мере приблизительно 8,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 9,5-кратно, или но меньшей мере приблизительно 10-кратно или более. Наборы, реагенты для исследований, диагностики и терапии

[00169] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть использованы для диагностики, лечения и профилактики, а также в качестве реагентов для исследований и компонентов наборов. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, способные ингибировать генную экспрессию с высокой специфичностью, часто используются специалистами в данной области техники для выяснения функций отдельных генов или распознавания функций различных компонентов биологических путей.

[00170] Для применения в наборах и для диагностики, и в различных биологических системах, соединения, предложенные в настоящем изобретении, по отдельности или в комбинации с другими соединеними или терапевтическими средствами подходят в качестве инструмента дифференциального и/или комбинаторного анализа для определения паттернов экспрессии части или всего набора генов, экспрессируемых в клетках и тканях.

[00171] Используемый в настоящей заявке термин «биологическая система» или «система» определен как любой организм, клетка, клеточная культура или ткань, экспрессирующая, или с приобретенной способностью экспрессировать, продукты генов ядерного респираторного фактора 1 (NRF1). Они включают, не ограничиваясь перечисленными: человека, трансгенных животных, клетки, культуры клеток, ткани, ксенотрансплантаты, трансплантаты и их комбинации.

[00172] Согласно одному из неограничивающих примеров паттерны экспрессии в клетках или тканях, обработанных одним или несколькими антисмысловыми соединениями, сравнивают с контрольными клетками или тканями, не обработанными антисмысловыми соединениями, и исходя из полученных паттернов анализируют дифференциальные уровни генной экспрессии, так как они связаны, например, с болезнью, сигнальными путями, локализацией в клетках, уровнями экспрессии, размером, структурой или функцией изучаемых генов, Эти исследования могут быть выполнены на стимулированных пли нестимулированных клетках в присутствии или в отсутствие других соединений, которые влияют на паттерны экспрессии.

[00173] Примеры способов анализа генной экспрессии, известных в данной области техники, включают анализ на ДНК-чипах или на микрочипах, SAGE (серийный анализ экспрессии генов), READS (рестриктазная амплификация расщепляемых кДНК). TOGA (полный анализ генной экспрессии), белковые чипы и протеомику, секвенирование меток экспрессируемой последовательности (FST), вычитающий РНК фингерпринтинг (SuRF), вычитающее клонирование, дифференциальный дисплей (DD), сравнительная геномная гибридизация, FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) и масс-спектрометрические методы.

[00174] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, подходят для исследований и диагностики, поскольку такие соединения гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими ядерный респираторный фактор 1 (NRF1). Например, олигонуклеотиды, гибридизующиеся с эффективностью и в условиях, (писанных в настоящей заявке, являясь эффективными модуляторами NRF1, представляют собой эффективные праймеры или зонды в условиях, благоприятных для амплификации или определения гена, соответственно. Такие праймеры и зонды подходят для способов, требующих специфического определения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих NRF1, и для амплификации указанных молекул нуклеиновой кислоты для определения или для применения в дальнейших исследованиях NRF1. Гибридизация указанных антисмысловых олигонуклеотидов, в частности, праймеров и зондов, предложенных в настоящем изобретении, с нуклеиновой кислотой, кодирующей NRF1, может быть определена при помощи известных в данной области техники способов. Такие способы могут включать конъюгирование фермента с указанным олигонуклеотидом, радиоактивное мечение указанного олигонуклеотида и любые другие подходящие способы детекции. Могут также быть подготовлены наборы для определения уровней NRF1 в образце при помощи таких способов определения.

[00175] Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений также используются специалистами в данной области техники для терапевтических целей. Антисмысловые соединения применялись в качестве терапевтических компонентов при лечении болезненных состояний у животных, в том числе человека. Лекарственные средства на основе антисмысловых олигонуклеотидов. безопасно и эффективно вводили людям, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания. Таким образом, установлено, что антисмысловые соединения могут применяться в качестве терапевтических средств, которые, могут быть модифицированы, под терапевтические схемы для лечения клеток, тканей и животных, в особенности, человека.

[00176] В случае терапевтических средств животное, предпочтительно человек, у которого, предположительно, имеется заболевание или расстройство, лечение которого может проводиться модуляцией экспрессии пол и нуклеотидов NRF1, получает лечение в виде введения антисмысловых соединений в соответствии с настоящим изобретением. Например, согласно одному из неограничивающих вариантов, реализации указанные способы включают этап введения животному, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества модулятора NRF1. Модуляторы NRF1. предложенные в настоящем изобретении, эффективно модулируют активность NRF1 или модулируют экспрессию белка NRF1. Согласно одному из вариантов реализации указанные активность или экспрессия NRF1 у животного подавлены приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия NRF1 у животного подавлены приблизительно на 30%. Более предпочтительно указанные активность или экспрессия NRF1 Таким образом, указанные олигомерные соединения модулируют экспрессию иРНК ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере па 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере па 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.

[00177] Согласно одному из вариантов реализации указанные активность и/или экспрессия ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) у животного повышены приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия NRF1 у животного повышены приблизительно на 30%. Более предпочтительно, указанные активность или экспрессия NRF1 у животного повышены на 50% или более. Таким образом, указанные олигомерные соединения изменяют экспрессию иРНК NRF1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере па 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере па 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере па 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.

[00178] Например, снижение экспрессии ядерного респираторного фактора I (NRF1) может быть определено в сыворотке, крови, жировой ткани, печени или любой другой жидкости организма, ткани или органе указанного животного. Предпочтительно, кленки, содержащиеся в указанных анализируемых жидкостях, тканях или органах, содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептиды NRF1 и/или собственно белок NRF1.

[00179] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть использованы для фармацевтических композиций посредством добавления эффективного количества соединения к подходящему фармацевтически приемлемому разбавителю или носителю. Применение соединений и способов, предложенных в настоящем изобретении, может также подходить для профилактики.

Конъюгаты

[00180] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, усиливают клеточное распределение или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты или конъюгаты могут включать конъюгированные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгированные группы, предложенные в настоящем изобретении, включают интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, нолиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, улучшающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, улучшающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типовые конъюгированные группы включают холестерины, липиды, фосфолипиды, биотип, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Группы, усиливающие фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, повышающие сопротивление разрушению и/или усиливающие сиквенс-специфичную гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой. Группы, улучшающие фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, распределение, метаболизм или выведение соединений, предложенных в настоящем изобретении. Типовые конъюгированные группы описаны в международной заявке на патент PCT/US 92/09196, поданной 23 октября 1992, и патенте США 6287860, включенных в настоящую заявку посредством ссылки. Конъюгированные фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными: липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевую кислоту, тиоэфир, например, гексил-5-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-rac-глицеро-3-Нфосфонат, цепь полиамида или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый (фрагмент, октадециламин или фрагмент гексиламино-карбонил-оксихолестерина. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть также коньюгированы с активными лекарственными веществами, например, аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофемом, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом, хлортиазидом, диазепином, индометицином, барбитуратом, цефалоспорином, сульфамидным препаратом, антидиабетическим средством, антибактериальным веществом или антибиотиком.

[00181] Примеры патентов CUIA, в которых описан.) получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 1762779: 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4901582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 525850,',; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241. 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.

Составы

[00182] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, также могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединении, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Примеры патентов США, в которых описано получение таких способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции составов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 5108921; 5354844; 5416016: 5459127; 5521291: 5543165; 5547932; 558302;); 5591721; 1426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; 5595756, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.

[00183] Хотя указанные антисмысловые олигонуклеотиды не обязательно должны вводиться при помощи вектора, чтобы модулировать экспрессию и/или функцию мишени, варианты реализации настоящего изобретения включают векторные конструкции для экспрессии антисмысловых олигонуклеотидов, включая промоторы, последовательности генов составных промоторов и обладающие выраженной конститутивной промоторной активностью, или промоторной активностью, которая может быть индуцирована при необходимости.

[00184] Согласно одному из вариантов реализации осуществление изобретения включает введение по меньшей мере одного из вышеуказанных антисмысловых олигонуклеотидов при помощи подходящей системы доставки на основе нуклеиновой кислоты. Согласно одному из вариантов реализации такая система включает невирусный вектор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом. Примеры таких невирусных векторов включают еооственно олигонуклеотид (например, любая(ые) из SEQ ID NO: 3-5) или комбинацию е подходящим белковым, полисахаридным или липидным составом.

[00185] Дополнительно, подходящие системы доставки нуклеиновой кислоты включают вирусные векторы, как правило, на основе последовательности одного или нескольких аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV), хелпер-зависимого аденовируса, ретровируса, или липосомального комплекса с японским гемагглютинирующим вирусом (HVJ). Предпочтительно, указанный вирусный вектор содержит сильный эукариотический промотор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом, например, промотор цитомегаловируса (ЦМВ).

[00186] Дополнительные предпочтительные векторы включают вирусные векторы, белки слияния и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают вирусы мышиного лейкоза Молони и ВИЧ-вирусы. Один из предпочтительных ВИЧ-вирусных векторов содержит по меньшей мере два вектора, где гены gag и pol происходят из генома ВИЧ, а ген env - из другого вируса. Предпочтительными являются ДНК-вирусные векторы. Такие векторы включают pox-векторы, такие как ортопокс- или авипокс-векторы, герпесвирусные векторы, такие как векторы па основе вируса простого герпеса (HSV) I, аденовирусные векторы и векторы на основе аденоассоциированного вируса.

[00187] Антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое при введении животному, включая человека, способно обеспечить получение (прямо или непрямо) биологически активного метаболита или его компонента.

[00188] Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений, предложенных в настоящем изобретении: т.е. солям, сохраняющим необходимую биологическую активность исходного соединения и, кроме того, не дающих нежелательных токсических эффектов. Предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.

[00189] Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, содержащие антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении. Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут вводиться различными способами в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение, и от тою, на какую область необходимо воздействовать. Введение может быть местным (в том числе через глаза и через слизистые оболочки, включая вагинальное и ректальное введение), через легкие, например, посредством вдыхания или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи небулайзера; интратрахеально, интраназально, эпидермально и трансдермально), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или интравентрикулярное, введение.

[00190] При лечении тканей центральной нервной системы введение может осуществляться, например, инъекцией или инфузией в спинномозговую жидкость. Введение антисмысловой РНК в спинномозговую жидкость описано, например, в заявке на патент США, опубликованной под номером 2007/01 17772, "Methods for slowing familial ALS disease progrc.ssi.on» («Способы замедления развития наследственного заболевания БАС»), включенной в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.

[00191] Если предполагается введение антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, в клетки центральной нервной системы, введение может осуществляться совместно с одним или несколькими агентами, способными обеспечить проникновение указанного антисмыслового олигонуклеотида через гематоэнцефалический барьер. Инъекция может быть сделана, например, в энторинальную область коры или гиппокамп. Доставка нейротрофических факторов введением аденовирусного вектора в двигательные нейроны мышечной ткани описана, например, в патенте США 6632427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons» («Переное генов в двигательные нейроны мозга, опосредованный аденовирусным вектором»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Доставка векторов непосредственно в мозг, например, в стриатум, таламус, гиппокамп или черную субстанцию известна в данной области техники и описана, например, в патенте США 6756523, ((Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain» («Аденовирусные векторы для переноса чужеродных генов л клетки центральной нервной системы, в частности, клетки мозга»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Введение может быть быстрым в случае инъекции или осуществляться в течение некоторого промежутка времени в случае медленной инфузии или введения составов с замедленным высвобождением.

[00192] Рассматриваемые антисмысловые олигонуклеотиды могут быть связаны или конъюгированы с агентами, обеспечивающими необходимые фармацевтические или фармакокинетические свойства. Например, указанный антисмысловой олигонуклеотид может сочетаться с любым веществом, которое, как известно в данной области техники, способствует проникновению или транспорту через гематоэнцефалический барьер, таким как антитело к рецептору трансферрина, и вводимому путем внутривенной инъекции. Указанное антисмысловое соединение может быть связано с вирусным вектором, например, придающим указанному антисмысловому соединению большую эффективность и/или усиливающим транспорт указанного антисмыслового соединения через гематоэнцефалический барьер. Осмотическое преодоление гематоэнцефалического барьера может также быть, достигнуто, например, инфузией сахаров, включая, но не ограничиваясь перечисленными, мезоэритрит, ксилит, D(+) галактозу, В(+) лактозу, D(+) ксилозу, дульцит, миоинозитол, L(-)фруктозу, D(-)маннит, D(+)глюкозу, D(-)арабинозу, D(-)арабинозу, целлобиоза, D(+)мальтозу, D(+)раффинозу, L(+)рамноза, D(+)мелибиоза. D(-)рибозу, адонит, D(+)арабит, L(-)арабит, D(+)фукозу, L(-)фукозу, D(-)ликсоза, L(+)ликсоза, и L(-)ликсоза, или аминокислот, включая, но не ограничиваясь перечисленными, глутамин, лизин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, тирозин, валин и таурин. Способы и материалы для повышения проникновения через гематоэнцефалический барьер описаны, например, в патенте США 4866042, «Method for the delivery of genetic material across the blood brain barricr» («Способы доставки генетического материала через гематоэнцефалический барьер»), патенте CILIA 6294520, «Matcrial for passage through the blood-brain barrier)) («Материал для прохождения через гематоэнцефалический барьер») и патенте США 6936589, «Parenteral delivery systems)) («Парентеральные системы доставки»), включенных в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.

[00193] Рассматриваемые антисмысловые соединения могуч быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Например, катионные липиды могут также быть включены в указанный состав для облегчения поглощения олигонуклеотидов. Одной из таких композиций, как покачано, способствующей поглощению, является LIPOFECTIN (доступный у GIBCO-BRL, Bethesda, MD).

[00194] Олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну 2'-О-метоксиэтильную модификацию, предположительно подходят; в частности, для перорального введения. Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыры, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармакологические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимы или желательны. Подходящее применение включает также покрытия для презервативов, перчаток и т.п.

[00195] Фармацевтические составы, предложенные в настоящем изобретении, которые могут быть представлены в виде удобной единичной дозированной формы, могут быть получены согласно общепринятым методикам, хорошо известным в области фармацевтической индустрии. Такие техники включают этап соединения активных ингредиентов с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами. Как правило, указанные составы получают равномерным глубоким соединением активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкомолотыми твердыми носителями, или с ними обоими, и затем, при необходимости, придают продукту форму.

[00196] Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде любой из многих возможных лекарственных форм, включая, но не ограничиваясь перечисленными, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также быть получены в виде суспензий па основе водных, неводных или смешанных сред. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Указанная суспензия может также содержать стабилизаторы.

[00197] Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленными: растворы, эмульсин, пены и содержащие липосомы составы. Фармацевтические композиции и составы, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать один или более усилители проникновения, носители, вспомогательные вещества или другие активные или неактивные ингредиенты.

[00198] Эмульсии представляют собой, как правило, гетерогенные системы, где одна жидкость распределена в другой в виде капель, как правило, более 0,1 мкм в диаметре. Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты помимо дисперсных фаз, и активное лекарственное вещество может присутствовать в растворе в водной фазе, масляной фазе или быть представлено отдельной фазой. Микроэмульсии также относятся к вариантам реализации настоящего изобретения. Эмульсии и их применение хорошо известны в данной области техники и подробнее описаны в патенте США 6287860.

[00199] Составы, предложенные в настоящем изобретении, включают липосомальные составы. В контексте настоящего изобретения термин «липосома» означает пузырьки, состоящие из амфифильных липидов, образующих один или более чем один сферический бислой. Липосомы представляют собой однослойные или многослойные пузырьки с мембраной, образованной липофильными веществами и водной внутренней фазой, где содержится композиция, которую необходимо доставить. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые предположительно взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. рН-чувствительных или отрицательно заряженные липосомы, предположительно, скорее захватывают ДНК, чем образуют с ней комплексы. Как катионные, так и некатионные липосомы применялись для доставки ДНК в клетки.

[00200] Липосомы также включают «стерически стабилизированные» липосомы, что при использовании в настоящей заявке относится к липосомам, содержащим один или более специализированный липид. После включения в липосомы эти специализированные липиды образуют липосомы с увеличенной продолжительностью существования по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примеры стерически стабилизированных липосом являются такие, в которых часть образующего пузырек липидного компонента липосомы содержит один или более гликолипид или дериватизирован одним или несколькими гидрофильными полимерами, таких как фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Липосомы и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.

[00201] Фармацевтические составы и композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также включать поверхностно-активные вещества. Применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, составах и эмульсиях хороню известно в данной области техники.

Поверхностно-активные вещества и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.

[00202] Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение включает различные усилители проникновения, способствующие эффективной доставке нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов. Кроме способствования диффузии нелипофильных препаратов через клеточные мембраны, усилители проникновения повышают проникающую способность липофильных препаратов. Усилители проникновения могут быть разделены, на пять больших категорий, а именно, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие агенты, и не-хелатирующие не-ПАВ-вещества. Усилители проникновения и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860. включенном в настоящую заявку посредством ссылки.

[00203] Специалисту в данной области техники будет понятно, что составы получают согласно стандартным методикам в соответствии с их назначением, т.е. способом введения.

[00204] Предпочтительные составы для место го применения включают такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, смешаны с агентами для местного введения, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные, например диолеилфосфатидил DOPE этаноламин, димиристоилфосфатидил холин DMPC, дистеаролфосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидил глицерина DMPG), и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеилфосфатидил этаноламин DOTMA).

[00205] Для местного или другого применения олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомы или входить в состав липосомальных комплексов, в частности, с катионными липосомами. Как вариант, олигонуклеотиды могут входить в состав липидных комплексов, в частности с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и сложные эфиры, их фармацевтически приемлемые соли, и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.

[00206] Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, содержащие микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, порционные упаковки, таблетки или минитаблетки. Присутствие загустителей, вкусоароматических агентов, разбавителей, эмульгаторов, диспергирующих агентов или связующих веществ может быть желательным. Предпочтительными составами для перорального приема являются такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, вводятся совместно с одним или несколькими усилителями проникновения, поверхностно-активными веществами и хелатирующими веществами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или сложные эфиры или их соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли и жирные кислоты и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860. включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Также предпочтительными являются комбинации усилителей проникновения, например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. В частности, предпочтительной является комбинация натриевой соли лауриновой кислоты, каприновой кислоты и УДХК. Другие усилители проникновения включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть введены перорально, в гранулированной форме, включая высушенные распылением частицы, или в составе комплексов микро- или наночастиц. Комлексообразующие агенты для олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.

[00207] Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержат], буферы, разбавители и другие подходящие добавки, включая, по не ограничиваясь перечисленными, усилители проникновения, переносчики и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.

[00208] Определенные варианты реализации настоящего изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие одно или более олигомерное соединение и один или более другой химиотерапевтический агент, действующий с помощью не-антисмыслового механизма. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленными, химиотерапевтические лекарственные средства для лечения рака, такие как даунорубицин, дауномицин, дактипомицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицнн, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфаммд, цитозина арабинозид, бис-хлорэтил- нитрозомочевина, бусульфан, митомицин С, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевина, мустарген, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурил, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевина, дезоксикоформицин, 4-гидроксипсроксицикло-фосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексату (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид(VP-16), триметрсксат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстильбэстрол(DES). При применении c соединениями, предложенными в настоящем изобретении, такие химиотерапевтические агенты могут применяться индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид, в течение некоторого времени, затем МТХ и олигонуклеотид), или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, МТХ и олигонуклеотид, или 5-FU, лучевая терапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь перечисленными, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, и противовирусные лекарственные средства, включая, по не ограничиваясь перечисленными, рибавирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, могут также быть скомбинированы в композициях, предложенных в настоящем изобретении. Комбинации антисмысловых соединений и других не-антисмысловых лекарственных средств также входят в объем настоящею изобретения. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.

[00209] Согласно другому сходному варианту осуществления композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, нацеленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту. Например, первой мишенью может быть конкретная антисмысловая последовательность ядерного респираторного фактора 1 (NRF1), а второй мишенью может быть участок другой нуклеотидной последовательности. Как вариант, композиции, предложенных в настоящем изобретении, могут содержать два антисмысловых соединения или более нацеленных на разные участки одной и той же целевой нуклеиновой кислоты ядерного респираторного фактора I (NRFI). Многочисленные примеры антисмысловых соединений приведены в настоящей заявке, другие могут быть выбраны из подходящих соединений, известных в данной области техники. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.

Дозировки:

[00210] Получение фармацевтических композиций и их последующее введение (дозирование) должны быть знакомы специалистам в данной облает техники. Дозы зависят от тяжести и чувствительности к лечению болезненного состояния-мишени терапии, курс лечения может длиться от нескольких дней до нескольких месяцев, или до излечения, или до облегчения болезненного состояния. Оптимальный режим дозирования может быть рассчитан на основании измерений накопления препарата в организме пациента. Специалист без труда определит оптимальные дозировки, методологию дозировок и частоту повторения. Оптимальные дозы могут варьировать в зависимости от относительной эффективности конкретных олигонуклеотидов, и, как правило, могут быть рассчитаны исходя из ЕС50, эффективных для животных моделей in vitro и in vivo. Как правило, доза составляет от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, и может вводиться однократно или чаще ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже каждые 2-20 дет. Специалист без труда может рассчитать частоту введения доз, основанную на времени удержания и концентрациях лекарства в жидкостях или тканях организма. После проведения эффективного лечения может быть желательно применение поддерживающей терапии у пациента для предотвращения рецидива заболевания, при этом указанный олигонуклеотид вводится в поддерживающих дозах, варьирующих от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, от однократного или более частого ежедневного приема до однократного приема один раз в 20 лет.

[00211] Согласно вариантам реализации пациент получает дозу лекарственного средства, составляющую по меньшей мере приблизительно I, по меньшей мере приблизительно 2, по меньшей мере приблизительно 3, по меньшей мере приблизительно 4, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 6, по меньшей мере приблизительно 7, по меньшей мере приблизительно 8, по меньшей мере приблизительно 9, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 30. по меньшей мере приблизительно 35, но меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50. по меньшей мере приблизительно 60. по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 90, или по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг массы тела. Некоторые вводимые дозировки антисмысловых олигонуклеотидов описаны, например, в патенте США 7563884. "Antisense modulation of РТР 1 В expression)) («Антисмысловое модулирование экспрессии РТР1 В»), включенном is настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.

[00212] Хотя выше и были описаны различные варианты реализации настоящего изобретения, следует понимать, что они представлены только в качестве примеров, а не для ограничения. Многочисленные модификации раскрытых вариантов реализации могут быть осуществлены согласно описаниям в настоящей заявке, не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, объем и сущность настоящею изобретения не ограничены какими-либо из приведенных выше вариантов реализации.

[00213] Все упоминаемые здесь документы включены в настоящую заявку посредством ссылок. Все публикации и патентные документы, упомянутые в настоящей заявке, включены посредством ссылок в том же объеме, как если бы каждая публикация или каждый патентный документ были упомянуты в индивидуальном порядке. Цитируя различные источники в данном документе, заявители не признают, что какой-либо из источников представляет «предшествующий уровень техники» относительно настоящего изобретения. Варианты реализации предложенных в изобретении композиций и способов проиллюстрированы приведенными ниже примерами.

ПРИМЕРЫ

[00214] Следующие неограничивающие примеры предназначены для иллюстрации некоторых вариантов реализации настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что вариации содержания и вариантов элементов описанных компонентов очевидны специалистам в данной области и входят в объем настоящего изобретения.

Пример 1: Конструирование антисмысловых олигонуклеотидов, специфических для ант и смысловой молекулы нуклеиновой кислоты к ядерному респираторному фактору 1 (NRF1) и/или к смысловой нет/ полинуклеотида NRF1

[00215] Как указано выше, термин «олигонуклеотид, специфичный для» или «олигонуклеотид с нацеленным действием» относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную формирован, стабильный комплекс с фрагментом гена-мишени или (ii) способную формировать стабильный дуплекс с фрагментом иРНК транскрипта гена-мишени.

[00216] Отбор подходящих олигонуклеотидов выполняют с применением компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и определяют участки идентичности или гомологии. Такие программы применяют для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, из баз данных, таких как GenBank, или секвенированием продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот различных видов позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, которым свойственна необходимая степень межвидовой идентичности. Для генов, которые не были секвенированы, выполняют саузерн-блоттинг, что позволяет провести определение степени идентичности генов у целевого вида и у других видов. Проводя саузерн-блоттинг в условиях различной степени жесткости, согласно известным в данной области техники методикам, возможно с достаточной точностью определить степень идентичности. Такие процедуры позволяют провести отбор олигонуклеотидов. проявляющих значительную степень комплементарности целевым последовательностям нуклеиновых кислот объекта, подлежащего управлению, и более низкую степень комплементарности соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот из других видов. Специалисту в данной области техники будет ясно, что существует значительная свобода выбора подходящих участков генов для применения согласно настоящему изобретению.

[00217] Антисмысловое соединение является «специфически гибридизуемым», если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.

[00218| Характеристики гибридизации олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть определены с применением одного или более in vitro способа анализа из известных специалистам в данной области техники. Например, указанные характеристики олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть получены нулем определения силы связывания целевых природных антисмысловых последовательностей и молекул потенциального лекарственного средства с применением анализа кривых плавления.

[00219] Сила связывания нелепых природных антисмысловых последовательностей и молекулы потенциального лекарственного средства (далее - Молекулы) может быть оценена с применением любых стандартных способов измерения силы межмолекулярных взаимодействий, например, анализа кривых плавления.

[00220) Анализ кривых плавления определяет температуру, при которой происходит быстрый переход от двуцепочечной к одноцепочечной конформации комплекса природной антисмысловой последовательности/Молекулы. Эта температура широко используется как надежная мера силы взаимодействия между двумя молекулами.

[00221] Анализ кривых плавления может быть выполнен с применением кДНК-копии актуальной природной антисмысловой молекулы РНК или синтетического нуклеотида ДНК или РНК, соответствующего связывающему сайту Молекулы. Доступны многочисленные наборы, включающие все необходимые реагенты для проведения анализа (например, набор MellDoclor от Applied Biosyslems Inc.). Такие наборы содержат подходящий буферный раствор, содержащий один из связывающих двуцепочечную ДНК (дцДНК) красителей (таких как красители ITRM от АВ1, SYBR Green. SYTO и т.д.). Свойства дцДНК красителей таковы, что они практически не флуоресцируют в свободной форме, но очень выраженно флуоресцируют при связывании с дцДНК.

[00222] Для проведения анализа указанную кДНК или соответствующий олигонуклеотид смешивают с Молекулой в концентрациях, определенных согласно протоколам конкретных производителей. Смесь подогревают до 95°С для диссоциации преформированных комплексов дцДНК, затем медленно охлаждают до комнатной температуры или другой более низкой температуры, указанной производителем набора, для ренатурации молекул ДНК. Вновь сформировавшиеся комплексы затем медленно нагревают до 95°С, одновременно непрерывно измеряя интенсивность - флуоресценции в результате реакции. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна количеству присутствующих в реакции дцДНК. Информация может быть получена с применением инструмента на основе НЦР в реальном времени, совместимого с набором (например, StepOne Plus Real Time PCR System от А BI или инструмент lightTyper от Roche Diagnostics, Lewes, UK).

[00223] Пики плавления получают построением графика зависимости отрицательной производной флуоресценции по температуре (-d(Флуоресценция)/dT) по оси y) от температуры (ось х) с применением подходящего программного обеспечения (например, lightTyper (Roche) или SDS Dissociation Curve, ABI). Информацию анализируют с целью определить температуру быстрого перехода комплекса дцДНК и одноцепочечные молекулы. Эту температуру называют температурой плавления и она прямо пропорциональна силе взаимодействия между двумя молекулами. Как правило, температура плавления превышает 40°С.

Пример 2: Модуляция полинуклеотидов NRF 1

Обработка клеток HEPG2 антисмысловыми олигонуклеотидами

[00224) Клетки HepG2 от ЛТСС (cat# НВ-8065) выращивали на культуральной среде (MEM/BBSS (Hyclone cat#SH30024, или Mediatech cat#MT-10-010-CV)-10% ЭБС (Mediatech cat#MT35-011-CV)+ пенициллин/стрептомицин (Mediatech cat// MT30-002-CI)) при 37°С и 5% CO₂. В день эксперимента среду в 6-луночных планшетах меняли на свежую культуральную среду. Все антисмысловые олигонуклеотиды разводили до концентрации 20 мкМ. Два мкл этого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco cat/731985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen cat// 1166, 8019) при комнатной температуре в течение 20 мин и добавляли в каждую лунку 6-лупочных планшетов с клетками HEPG2. Сходную смесь, содержащую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для имитации трансфекции контроля. После 3-18 ч инкубации при 37°С и 5% СО₂ среду заменяли на свежую культуральную среду. Через 48 ч после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду удаляли и РНК выделяли из клеток с применением SV Total RNA Isolation System от Promega (cat#Z3105) или набора RNeasy Total RNA Isolation от Qiagcn (cat#74181), следуя инструкциям производителя. 600 нг РНК добавляли к реакции обратной транскрипции, проводимой с применением кДНК-набора Verso от Thermo Scientific (cat#AB1453B) или High Capacity cl)NA Reverse Transcription Kit (cat#4368813) согласно описанию в протоколе производителя. кДНК, полученные в результате реакции обратной транскрипции, использовали для мониторинга генной экспрессии при помощи ПЦР в реальном времени с применением ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) и праймеров/зондов, сконструированных ABI (Applied Biosystcms Taqman Gene Expression Assay: Hs00192316_m1 от Applied Biosystcms Inc., Foster City CA). Использовали следующий цикл ПЦР: 50°С в течение 2 мни. 95°С в течение 10 мин, 40 циклов при (95°С в течение 15 секунд, 60°С в течение 1 мин) с применением термоциклера М×4000 (Stratagene). Изменение кратности генной экспрессии после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S. между обработанными и ложно-трансфектированными образцами.

[00225] Результаты: Результаты ГЩР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК NRF1 is клетках HepG2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним олигонуклеотидом, антисмысловым к природной антисмысловой последовательности NRF1 Hs.292860 (Фиг.1).

[00226] Хотя настоящее изобретение было иллюстрировано и описано посредством ссылок на один пли несколько вариантов реализации, эквивалентные изменения и модификации будут очевидны для специалистов после прочтения и понимания настоящего описания и прилагаемых чертежей. Кроме того, хотя конкретные свойства согласно настоящему изобретению могут раскрываться только в одном из нескольких вариантов реализации, такие свойства могут быть скомбинированы с одним или несколькими другими свойствами других вариантов реализации, что может быть необходимо и полезно для любого или частного случая применения.

[00227] Реферат настоящего изобретения позволит читателю быстро понять техническую суть изобретения. Подразумевается, что он не будет использован для целей толкования или ограничения сути и объема приведенной ниже формулы изобретения.

Claims (35)

1. Способ повышения экспрессии гена ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий:

приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который специфически гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом NRF1 и имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный олигонуклеотид необязательно содержит одну или более модификаций, выбранных из: по меньшей мере одного модифицированного фрагмента сахара; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида; и их комбинаций.

2. Способ по п. 1, в котором указанный олигонуклеотид имеет последовательность, на 100% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку природного антисмыслового полинуклеотида гена ядерного респираторного фактора 1 (NRF1).

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что олигонуклеотид не имеет модификаций.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экспрессию гена ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) повышают in vivo или in vitro относительно контроля.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность SEQ ID NO: 2.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит одну или более модификаций, выбранных из следующих: по меньшей мере один модифицированный фрагмент сахара, по меньшей мере одна модифицированная межнуклеотидная связь, по меньшей мере один модифицированный нуклеотид и их комбинации.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере один модифицированный фрагмент сахара, выбранный из следующих: фрагмент 2'-О-метоксиэтил модифицированного сахара, фрагмент 2'-метокси модифицированного сахара, фрагмент 2'-O-алкил модифицированного сахара, фрагмент бициклического сахара и их комбинации.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь, выбранную из: фосфотиоата, 2'-О-метоксиэтила (МОЭ), 2'-фтора, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, фосфата триэфира, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.

9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из: пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК), арабино-нуклеиновой кислоты (ФАНК), их аналога, производного и комбинаций.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну олигонуклеотидную последовательность, представленную в последовательностях SEQ ID NO: 3-5.

11. Способ повышения экспрессии гена ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro, включающий:

приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом малой интерферирующей РНК (миРНК) длиной 19-30 нуклеотидов, причем указанный по меньшей мере один миРНК олигонуклеотид специфически гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом NRF1 и имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1.

12. Способ повышения экспрессии гена ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro, включающий:

приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом длиной 19-30 нуклеотидов, специфичным для природного антисмыслового полинуклеотида NRF1, причем указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1, и указанный олигонуклеотид необязательно содержит одну или более модификаций, выбранных из: по меньшей мере одного модифицированного фрагмента сахара; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида; и их комбинаций.

13. Синтетический олигонуклеотид длиной от 19 до 30 нуклеотидов, повышающий экспрессию гена ядерного респираторного фактора 1 (NRF1), содержащий по меньшей мере одну модификацию, выбранную из: по меньшей мере одного модифицированного фрагмента сахара; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида; и их комбинаций; причем указанный олигонуклеотид специфически гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом NRF1 и имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1.

14. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна модификация включает межнуклеотидную связь, выбранную из группы, состоящей из: фосфотиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, фосфата триэфира, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.

15. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную межнуклеотидную связь.

16. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит остов из фосфотиоатных межнуклеотидных связей.

17. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, причем указанный модифицированный нуклеотид выбран из: пептидной нуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК), их аналога, производного и комбинации.

18. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит множество модификаций, причем указанные модификации включают модифицированные нуклеотиды, выбранные из: фосфотиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, фосфата триэфира, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинации.

19. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит множество модификаций, причем указанные модификации включают модифицированные нуклеотиды, выбранные из: пептидных нуклеиновых кислот, закрытых нуклеиновых кислот (ЗНК), их аналогов, производных и комбинаций.

20. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный фрагмент сахара, выбранный из: фрагмента 2'-O-метоксиэтил-модифицированного сахара, фрагмента 2'-метокси-модифицированного сахара, фрагмента 2'-О-алкил-модифицированного сахара, фрагмента бициклического сахара и их комбинации.

21. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит множество модификаций, причем указанные модификации включают модифицированные фрагменты сахара, выбранные из: фрагмента 2'-O-метоксиэтил модифицированного сахара, фрагмента 2'-метокси модифицированного сахара, фрагмента 2'-O-алкил модифицированного сахара, фрагмента бициклического сахара и их комбинации.

22. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид повышает экспрессию гена ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) in vivo или in vitro по сравнению с контролем.

23. Олигонуклеотид по п. 13, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит последовательности, представленные в последовательностях SEQ ID NO: 3-5.

24. Композиция для предотвращения или лечения заболевания, связанного с геном ядерного респираторного фактора 1 (NRF1), содержащая терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного олигонуклеотида по любому из пп. 13-23 или по меньшей мере одного олигонуклеотида, длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который специфически гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом NRF1 и имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1,

и один или более фармацевтических носителей и вспомогательных веществ.

25. Композиция по п. 24, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 40% идентичную любой последовательности, представленной в последовательностях SEQ ID NO: 3-5.

26. Композиция по п. 24, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит последовательность, представленную в последовательностях SEQ ID NO: 3-5.

27. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что олигонуклеотид, содержащий последовательность, представленную в последовательностях SEQ ID NO: 3-5, содержит одну или более модификацию или замену.

28. Композиция по п. 27, отличающаяся тем, что указанная одна или более модификация выбрана из: фосфотиоата, метилфосфоната, пептидной нуклеиновой кислоты, молекул закрытой нуклеиновой кислоты (ЗНК) и их комбинаций.

29. Способ предотвращения или лечения заболевания, связанного с геном ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) и/или по меньшей мере одним кодируемым указанным геном продуктом, включающий:

введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного олигонуклеотида по любому из пп. 13-23 или по меньшей мере одного олигонуклеотида, длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который специфически гибридизуется с природным антисмысловым полинуклеотидом NRF1 и имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, обратно комплементарной участку в рамках от 1 до 810 нуклеотида последовательности SEQ ID NO: 2, или имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную участку последовательности SEQ ID NO: 1; обеспечивая, таким образом, предотвращение или лечение заболевания, связанного с указанным по меньшей мере одним полинуклеотидом ядерного респираторного фактора 1 (NRF1) и/или с по меньшей мере одним кодируемым указанным полинуклеотидом продуктом.

30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанное заболевание выбрано из: заболевания или расстройства, связанного с анормальной экспрессией NRF1, неврологического заболевания или расстройства (например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, амиотрофического латерального склероза и т.п.), заболевания или расстройства, связанного с инсулинорезистентностью, диабета, опухоли печени, немелкоклеточного бронхолегочного рака, иммунологического заболевания или расстройства, оксидативного стресса, заболевания или расстройства, связанного с нарушением митохондриальной функции, заболевания или расстройства, связанного с нарушением митохондриального биогенеза, заболевания или расстройства, связанного с митохондриальным заболеванием в результате нарушений ядерного контроля митохондриальной функции, возрастными изменениями и старением.

Images