[go: up one dir, main page]

CZ289365B6 - Banka oligomerů, způsob její přípravy a způsob stanovení sekvence bio-oligomeru - Google Patents

Banka oligomerů, způsob její přípravy a způsob stanovení sekvence bio-oligomeru Download PDF

Info

Publication number
CZ289365B6
CZ289365B6 CS19924073A CS407392A CZ289365B6 CZ 289365 B6 CZ289365 B6 CZ 289365B6 CS 19924073 A CS19924073 A CS 19924073A CS 407392 A CS407392 A CS 407392A CZ 289365 B6 CZ289365 B6 CZ 289365B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bio
oligomer
peptide
solid support
peptides
Prior art date
Application number
CS19924073A
Other languages
English (en)
Inventor
Kit Sang Lam
Original Assignee
The Arizona Board Of Regents
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Arizona Board Of Regents filed Critical The Arizona Board Of Regents
Publication of CZ407392A3 publication Critical patent/CZ407392A3/cs
Publication of CZ289365B6 publication Critical patent/CZ289365B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/70—Enkephalins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00592—Split-and-pool, mix-and-divide processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/817—Entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

Banka oligomer , je tvo°ena °adou biologicky · inn²ch bio-oligomer , zbaven²ch ochrann²ch skupin, v n ka d² bio-oligomer m jinou sekvenci podjednotek, °adou pevn²ch nosi , vz jemn m siteln²ch a vhodn²ch pro reak n podm nky p°i chemick synt ze bio-oligomer , p°i em jeden typ bio-oligomeru s ur itou sekvenc je v z n na pevn² nosi za vzniku kombinace pevn ho nosi e a bio-oligomeru, p°i em biologicky · inn²mi bio-oligomery jsou peptidy, zbaven ochrann²ch skupin. Sou st °e en tvo° tak zp sob p° pravy takov banky a zp sob stanoven sekvence bio-oligomer p°i pou it banky oligomer .\

Description

Oblast techniky
Vynález se týká banky oligomerů na pevném nosiči, v níž je každý pevný nosič spojen s jediným typem bio-oligomeru a v bance jsou uloženy všechny existující kombinace monomemích podjednotek. Bio-oligomerem podle vynálezu může být peptid.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby takové banky. Předmětem vynálezu je rovněž způsob použití bio-oligomerů v bance k identifikaci a charakterizaci ligandů, schopných vázat molekuly akceptoru nebo zprostředkovat požadovanou biologickou účinnost. Bio-oligomery banky mohou rovněž katalyzovat chemické reakce:
Dosavadní stav techniky
Rozpoznávání a vazba ligandů řídí téměř všechny biologické pochody, například rozpínání imunologického popudu, buněčné signály a komunikace, intracelulámí signál a katalýzu, tj. enzymatické reakce. V oboru dlouho přetrvává zájem identifikace molekuly, působící jako látky, schopné agonistické reakce nebo antagonismu účinnosti ligandů, například hormonů, růstových faktorů a nervových přenašečů, může také jít o látky, indukující B-buňky (zprostředkování protilátkou), nebo T-buňky (buněčná cesta) při imunologické odpovědi, dále o látky, katalyzující chemické reakce nebo řídicí expresi genu na úrovni transkripce nebo translace.
Zvláště zajímavé jsou ligandy typu bílkovin nebo peptidů. Jde o většinu hormonů, růstových faktorů, neoroaktivních molekul a imunologických epitopů. Mimoto, jak bude dále podrobněji diskutováno, většina snah vytvořit agonisty nebo antagonisty biologické účinnosti, zprostředkované receptory, se soustředila na peptidy. Vývoj farmaceutických prostředků, které by byly klíčovými látkami pro místa vazby na receptorech, však byl do značné míry brzděn obtížemi při stanovení řetězce peptidových ligandů. Nesmírný počet těchto peptidových řetězců způsobil, že tento cíl je nedosažitelný jakýmkoliv jiným způsobem než pracnou izolací, specifického komplexu, identifikací uložení epitopu a analýzou jeho řetězce. Problém je dále komplikován tím, že epitopy jsou tvořeny řetězcem aminokyselin, který se v primárním řetězci nepřenáší.
Někteří výzkumní pracovníci v oboru se pokoušeli obejít tento pracný pochod stanovením řetězce aminokyselin v proteinu na základě odpovídajícího oligonukleotidového řetězce. Proteiny jsou velké peptidy, sestávající z aminokyselin. Každá aminokyselina je kódována jedním nebo větším počtem kodonů, které jsou tvořeny vždy třemi zbytky nukleových kyselin. Například peptid A, obsahující aminokyselinu glutamin, bude kódován kodonem tří nukleových kyselin: cytosin, adenin a guanin. Komplementem pro tento kodon by byl guanin, který se váže na cytosin, thymin, který se váže na adenin a cytosin, tento kodon by byl kódem pro peptid B. Na základě teorie komplementarity by se peptid B vázal na peptid A. V publikaci Bost a Blalock, 1989, Methods in Enzymology, 168: 16-28 se uvádí, že pravděpodobně jakýkoliv peptid se bude vázat na jiný peptid, který je kódován komplementárním řetězcem zbytků nukleových kyselin. Na základě této informace bylo možno předpovědět řetězec aminokyselin komplementárního peptidu. Autoři použili uvedený řetězec k syntéze peptidu ke zkouškám jeho schopnosti vazby.
Tento postup však nevyřešil svrchu uvedený problém, protože afinita vazby mezi komplementárními peptidy byla obecně velmi nízká a bylo zapotřebí komplementárních peptidů delších než 15 zbytků. Mimoto tento přístup vyžaduje znalost buď řetězce aminokyselin nebo řetězce nukleových kyselin příslušné bílkoviny nebo jejího vazného partnera. Mimoto není tento
-1 CZ 289365 B6 postup použitelný pro epitopy, tvořené zbytky aminokyselin, které se nepřenášejí v primárním řetězci.
V poslední době se objevilo několik zpráv o přípravě bank peptidů a jejich použití při identifikaci peptidových ligandů, které se mohou vázat na akceptory. Při jednom z těchto postupů bylo použito rekombinantního bakteriofágu pro získání velkých bank. Při použití „fágové“ metody (Scott a Smith, 1990, Science 249:386-390, Cwirla a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, Devlin a další, 1990, Science 249: 404-406) je možno získat velké banky (106—108 jedinců v chemickém smyslu), avšak genetický kód a biologický systém tyto systémy podstatně omezují, pokud jde o jejich využití. Při dalším přístupu byly užity především chemické metody, jako příklad je možno uvést Geysenovu metodu (Geysen a další, 1986, Molecular Immunology 23:709-715, Geysen a další, 1987, J. Immunologic Method 102:259-274) a v nejnovější době metodu Fodora a dalších (1991), Science 251, 767-773). Při použití metody Geysena a dalších je možno syntetizovat omezené množství peptidů (103 - 104) na polyethylenovém nosiči v průběhu několika dnů. Při postupu podle Fodora a dalších se využívá „světlem směrované prostorově cílené paralelní chemické syntézy“. Tento postup je rovněž omezen relativní nevyvinutostí fotochemické syntézy peptidů.
Byla také vyvinuta paralelní syntéza peptidů ve velkém měřítku. Houghton podává zprávu o syntéze stovek analogických peptidů současně na polypropylenové síti (metoda čajových sáčků), postup byl popsán v Houghton, 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135. Berg a další (1989, J. Amer. Chem. Soc. 111: 8024-8026) podali zprávu o novém nosiči na bázi polyethylenového filmu s naroubovaným polystyrenem, který je vhodný k provádění paralelní syntézy peptidů. Při provádění obou postupů bylo užito standardní pryskyřice sBocaminokyselinou a běžného postupu, spočívajícího v odstranění ochranné skupiny, neutralizaci, vazbě apromývání pevné fáze způsobem podle publikace Marrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149— 2154, 1963.
Furka a další (1988, 14ft Intemational Congress of Biochemistry, Sv. 4, Abstrakt FR:013) popsali postup pro výrobu směsi peptidů oddělených navázáním každé ze tří různých aminokyselin s následným smísením pryskyřice. Uvedený postup neposkytuje uspokojivou metodu pro izolaci požadovaného peptidů z velkého množství získaných peptidů.
Přestože běží o použitelný postup, dovolují postupy podle Geysena, Fodora, Houghtona, Berga a Furky se spolupracovníky syntézu a provádění zkoušek pouze v případě několika set až několika tisíc peptidů současně. Jde tedy o velmi omezené postupy vzhledem k milionům možných peptidových řetězců, z nichž alespoň jeden by mohl odpovídat vazným místům pro zkoumané látky. Vzhledem k existenci 20 známých běžných aminokyselin je v řetězci pěti aminokyselin 205 nebo přibližně 3,2 x 106 možných kombinací aminokyselin. Žádný ze svrchu uvedených postupů neumožňuje syntézu tak velkého množství peptidů současně. K dalšímu zmnožení možných peptidů dochází, bere-li se v úvahu možnost různé délky řetězce. Je tedy zřejmé, že běžná syntéza peptidů, tak jak byla shrnuta v publikaci Stewart a Young, 1984, Solid Phase Synthesis, 2. Vydání, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) není metodou, jíž by bylo možno současně získat tisíce až miliony peptidů současně.
Mimoto žádná z dosud známých metod pro syntézu peptidů neumožňuje syntézu banky peptidů, vázané na pevnou podložku ve skutečně nahodilém uspořádání. Peptidová banka se skutečně nahodilým uspořádáním musí mít dobrou statistickou distribuci všech typů přítomných molekul tak, aby banka obsahovala všechny typy přítomných peptidových řetězců v přibližně ekvimolámím množství.
Syntézu skutečně nahodilých peptidů obvykle není možno uskutečnit za současného přidání různých aminokyselin do jediné reakční nádoby vzhledem ktomu, že se rychlost vazby jednotlivých aminokyselin od sebe nesmírně liší při syntéze peptidů v pevné fázi SPPS
-2CZ 289365 B6 (Ragnarson a další, Acta Chem. Scand. 25:1487, 1489, Ragnarson a další, 1974, J. Org. Chem. 39:3837-3842). Například rychlost vazby Fmoc-glycinu na tvořící se peptid je daleko větší než rychlost vazby Fmoc-valinu, pravděpodobně v důsledku sterické zábrany, která je způsobena velkým postranním řetězcem valinu. V případě smísení všech 20 aktivovaných eukaryotických L-aminokyselin s pryskyřicí v průběhu každého cyklu vazby by došlo k přednostnímu zařazení nejrychleji reagujících aminokyselin do peptidu a nebylo by možno získat ekvimolámí množství každého typu peptidu. Mimoto by měl každý z možných nukleofilů odlišnou reaktivitu.
Mimoto také žádný z postupů, dosud známých pro syntézu peptidů nemůže poskytnout banku o více než 105 peptidech tak, aby vždy jeden typ peptidu byl vázán najeden typ pevné fáze. V případě, že by toho bylo možno dosáhnout, bylo by také možno daleko snáze od sebe izolovat jednotlivé peptidy.
Je tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí získat banku peptidových řetězců se skutečně nahodilým rozdělením a banku oligonukleotidových řetězců, tj. bio-oligomerů, z níž je možno snadno a rychle izolovat jeden z řetězců od řetězců ostatních. Bylo by rovněž zapotřebí navrhnout postup, jímž by bylo možno rychle a levně syntetizovat tisíce až miliony těchto skutečně náhodně distribuovaných řetězců bio-oligomerů.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří banka oligomerů, která je tvořena řadou biologicky účinných bio-oligomerů, zbavených ochranných skupin, v níž každý bio-oligomer má jinou sekvenci podjednotek, řadou pevných nosičů, vzájemně mísitelných a vhodných pro reakční podmínky při chemické syntéze biooligomerů, přičemž jeden typ bio-oligomeru s určitou sekvencí je vázán na pevný nosič za vzniku kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru, přičemž biologicky účinnými bio-oligomery jsou peptidy, zbavené ochranných skupin.
Vynález spočívá také ve způsobu přípravy banky svrchu uvedeného typu, který spočívá v tom, že se
a) připraví alespoň tolik podílů pevného nosiče, kolik je různých druhů podjednotek bio-oligomerů, které mají být přidány, avšak alespoň dva tyto podíly, pro tvorbu bio-oligomerů,
b) odděleně se přivádějí skupiny podjednotek k podílům pevného nosiče tak, že se ke každému podílu přivádí jedna podjednotka,
c) podjednotky se úplně váží na v podstatě všechna místa, která jsou k dispozici na pevném nosiči za vzniku kombinace částice a nosiče nové podjednotky,
d) stanoví se úplnost vazby a popřípadě se reakce přivede až k dovršení,
e) důkladně se promísí podíly kombinací částic pevného nosiče a nových podjednotek, a stupně a) až e) se opakují v požadovaném počtu opakování, po posledním požadovaném stupni se v posledním stupni e) odstraní ochranné skupiny, přičemž bio-oligomer zůstává vázán na pevný nosič. V jednom z provedení postupu může být podjednotkou
-3CZ 289365 B6 aminokyselina a bio-oligomerem může být peptid. V dalším provedení může být podjednotkou aminokyselina a bio-oligomerem může být peptid.
Podstatu vynálezu tvoří také způsob stanovení řetězce bio-oligomemího ligandu pro akceptorovou molekulu, který spočívá vtom, že se vytvoří banka oligomerů snahodilým uspořádáním, vázaná na pevné fáze, přičemž každý typ pevné fáze je vázán na jediný typ biooligomeru a banka obsahuje všechny možné kombinace monomemích podjednotek, z nichž je oligomer vytvořen. K této bance s nahodilým uspořádáním biooligomerů se přidá molekula zkoumaného akceptoru nebo substrátu, takže tato molekula akceptoru rozpozná a bude se vázat na jeden nebo větší počet typů pevné fáze s bio-oligomerem v bance nebo se uvedená molekula substrátu účastní chemické reakce, katalyzované jedním nebo větším počtem typů bio-oligomerů na pevné fázi v bance, izoluje se kombinace pevné fáze a bio-oligomeru, která má požadované vlastnosti a analyzuje se řetězec bio-oligomeru v izolované kombinaci pevné fáze a biooligomeru. V jiném provedení se postupuje tak, že se část bio-oligomeru uvolní z kombinace pevné fáze a oligomerů un šitu a in šitu se také stanoví biologická účinnost.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněno schéma syntézy peptidů s nahodilým rozložením s použitím syntézy, probíhající po jednotlivých stupních, syntetizuje se tripeptid s navázaným terminálním zbytkem tryptofanu: X-X-X-W (kde X znamená S, A nebo V), celkové množství možností je 33, tj. 27.
Na obr. 2 je schematicky znázorněna řada cyklických peptidů: n=0, 1, 2, 3... a m = 1, 2, 3,..., přičemž n a m mohou být stejné, avšak nemusí. Plné čáry označují vazby lineárního peptidů, přerušené označují příčné vazby. Páry specifických podjednotek, mezi nimiž mohou vznikat příčné vazby jsou označeny A a B. Nesítění může vznikat pouze mezi dvěma jednotkami A nebo pouze mezi dvěma jednotkami B. Na obr. 2a) je znázorněn tak zvaný „košíkový“ motiv, na obr. 2b motiv „žebříku“ a na obr. 2c motiv „lasa“.
Na obr. 3 jsou znázorněny chromatogramy (Ci8, reverzní fáze HPLC, Vydac) pro nahodilé tetrapeptidy (X-X-X-W, kde X = S, A nebo V), syntetizované A) novým postupem a B) obvyklou syntézou peptidů na pevné fázi. Chromatogram byl získán elucí sloupce při použití lineárního gradientu acetonitrilu. Rozpouštědlo A: 0,1% kyselina trifluoroctová a 5% acetonitril, rozpouštědlo B: 0,1% kyselina trifluoroctová a 100% acetonitril.
Na obr. 4 je znázorněna fotografie peptidů na částicích nosiče (dlouhé v-mos), značených protilátkou antimos a sekundární protilátkou.
Na obr. 5 je znázorněna fotografie směsi částic nosiče (dlouhé v-mos a krátké v-mos) po značení protilátkou anti-v-mos a sekundární protilátkou.
Na obr. 6 je znázorněna obdobná směs jako na obr. 5, značená protilátkou proti v-mos a sekundární protilátkou.
Na obr. 7 je znázorněna mikrofotografie typického peptidového ligandu v bance, v níž je možno pozitivní nosič (zbarvený temné modře) snadno odlišit od pozadí, obsahujícího mnoho tisíc negativních (bezbarvých) částic nosiče.
Na obr. 8 je znázorněna mikrofotografie, znázorňující na koncentraci závislý inhibiční účinek biotinu na barvení částic pryskyřice LHPQF kombinací streptavidinu a alkalické fosfatázy. A: 100 mM, B: 10 nM, C: 1 nM, d: 0,1 nM biotinu. Prázdné částice (pryskyřice + kyselina β-Ala
-4CZ 289365 B6 amonokapronová) byla smísena 1:1 s pryskyřicí LHPQFD před inkubací s kombinací streptavidinu a alkalické fosfarázy jako vnitřní kontrola.
Podrobný popis jednotlivých provedení
V dalších odstavcích budou podrobněji objasněna jednotlivá výhodná provedení vynálezu.
Tak jak je zde používán, pojem „banka“ znamená sestavu v podstatě nahodilých bio-oligomerů. Pod pojmem „bio-oligomer“ se rozumí polymer směně než 100podjednotkami. Může jít o peptid, tvořený podjednotkami aminokyselin.
1. Způsob tvorby banky nahodilých bio-oligomerů
Jak již bylo uvedeno, vynález se týká způsobu vytvoření banky bio-oligomerů tak, že se tyto oligomery syntetizují z nahodilých řetězců monomemích podjednotek. Pod tímto pojmem se rozumí řetězce, v nichž může kterákoliv monomemí podjednotka následovat za jakoukoliv jinou monomemí podjednotkou nebojí může předcházet.
V jednom z možných provedení může být monomemí podjednotkou aminokyselina, její analog nebo molekula, podobná peptidu, čímž se rozumí molekula, která strukturně a chemicky peptid napodobuje a je složena ze dvou nebo většího počtu zbytků aminokyselin.
Banka s obsahem peptidů, jak bylo svrchu uvedeno, může být získána tak, že se opakuje následující stupně:
a) připraví se alespoň dva podíly pevného nosiče pro nahodilé řetězce podjednotek,
b) odděleně se přivedou skupiny podjednotek k podílům pevného nosiče,
c) tyto podjednotky se úplně váží na v podstatě všechny vazná místa pevného nosiče za vzniku nové kombinace pevného nosiče a nové podjednotky,
d) prokáže se úplnost vazby a v případě potřeby se zajistí dovršení reakce,
e) důkladně se promísí podíly kombinací pevného nosiče a nové podjednotky, a pak se opakují stupně a) až e) v požadovaném počtu opakování, v konečném stupni se pak odstraní ochranné skupiny, přičemž bio-oligomer zůstává vázán na pevný nosič.
V dalším provedení je možno banku nahodilých biooligomerů připravit tak, že se v alespoň jednom stupni váže tatáž podjednotka na všechny typy pevného nosiče a v alespoň jednom dalším stupni se na tento pevný nosič váží alespoň dvě podjednotky. Banka bio-oligomerů může být připravena jedním opakováním stupňů a) až e) svrchu, v jiném provedení více než jedním opakováním stupňů a) až e). Pevný nosič je možno připravit sjiž navázanou jednou jednotkou nebo větším počtem jednotek.
Banka oligomerů může být tvořena předem stanoveným omezeným počtem podjednotek.
V jiném provedení může být tvořena všemi dostupnými podjednotkami.
V dalším provedení je možno identifikovat bio-oligomer tak, že se nejprve připraví banka a identifikuje se řetězec bio-oligomeru, který má požadované vlastnosti. Připraví se pevný nosič s takto identifikovaným bío-oligomerem. K identifikovanému řetězci se přidá nový segment monomemí podjednotky a identifikuje se nový řetězec, obsahující známý řetězec a nahodilý
-5CZ 289365 B6 řetězec, tento výsledný řetězec má rovněž požadované vlastnosti. Tímto způsobem je možno rychle identifikovat požadovaný bio-oligomer.
Bio-oligomery, které banka obsahuje, v ní mohou, ale nemusí být obsaženy v ekvimolámím množství. Jak je všeobecně známo, molámí množství je koncentrace, v níž se molekulová hmotnost, vyjádřená v gramech určité látky, rozpustí v rozpouštědle tak, že vznikne 1 litr roztoku. Pod pojmem „ekvimolámí“ se rozumí, že podjednotky jsou přítomny v přibližně stejné molámí koncentraci. To znamená, že v případě, že v bance s obsahem 150 000 bio-oligomerů je bio-oligomer A přítomen v množství 200pmol/l, měly by být také všechny ostatní biooligomery přítomny v koncentraci přibližně 200 pmol v 1 litru. Tento pojem však zahrnuje v sobě také heterogenitu pevný nosičů. Tato heterogenita poněkud mění skutečné množství biooligomeru a záleží také na tom, jaké množství oligomeru může být vázáno na určitý nosič.
Při provádění způsobu podle vynálezu se připravují alespoň dva podíly pevného nosiče, přičemž počet těchto pevných nosičů s výhodou alespoň odpovídá počtu bio-oligomerů, které mají být syntetizovány. To dovoluje přípravu banky, v níž každý z pevných nosičů váže pouze jeden typ biooligomeru. Pod pojmem „podíl“ se rozumí určitá frakce celého množství pevných nosičů.
2. Banky nahodilých peptidů
Ve zvláštním provedení může banka nahodilých biooligomerů obsahovat peptidy. Pod pojmem „peptid“ se rozumí v nejširším slova smyslu sloučenina, obsahující dvě nebo větší počet aminokyselin, analogů aminokyselin nebo látek, peptidům podobných. Podjednotky mohou být vázány peptidovými vazbami. V jiném provedení však mohou být vázány také jinými vazbami, jako esterovými, éterovými a jinými vazbami. Pod pojmem „aminokyselina“ se rozumí přírodní nebo nepřírodní, například syntetická aminokyselina včetně glycinu a D i L-izomerů, analogů aminokyselin a látek, podobných peptidům. Peptid o třech a větším počtu aminokyselin je obvykle označován jako oligopeptid v případě, že je peptidový řetězec krátký. V případě, že je řetězec dlouhý, užívá se obvykle názvu polypeptid nebo bílkovina.
Vynález je založen na syntetické chemii peptidů a nezávisí na žádném živém systému, pokud jde o amplifikaci nebo analýzu. Peptidová banka může obsahovat nepřírodní aminokyseliny. Peptidy podle vynálezu mohou tedy obsahovat D-aminokyseliny, kombinace D- a L-aminokyselin a různé „značkové“ aminokyseliny (například beta-methylaminokyseliny, C-alfamethylaminokyselina a N-alfa-methylaminokyseliny apod.) tak, aby peptidy v bance měly specifické vlastnosti. Mimoto je možno při použití specifických aminokyselin v určitých vazných stupních připravit peptidové banky s alfa-šroubovnicí, beta-závitem, gamma-závitem a také cyklické peptidy.
Banka peptidů podle vynálezu obsahuje všechny možné kombinace aminokyselin, jimiž jsou peptidy tvořeny. Například v případě dipeptidu při použití aminokyselin glycinu a prolinu existují čtyři možnosti: glycin-glycin, glycin-prolin, prolin-glycin a prolin-prolin, banka nahodilých peptidů bude obsahovat všechny tyto kombinace.
Do každého podílu pevného nosiče se nejprve odděleně přivedou první aminokyseliny. Obvykle jsou aminokyselinami, užitými pro syntézu peptidů v bazickém prostředí labilní na alfa-aminoskupině chráněné 9-fluorenylmethoxykarbonyl (Fmoc) aminokyseliny, poprvé popsané v publikaci Carpino a Han, 1972, J. Org. Chem. 37: 3403-3409. Při provádění způsobu podle vynálezu je rovněž možno použít Boc-aminokyseliny (N-alfa-chráněné terc.-butyloxykarbonylovou skupinou). Jak aminoskupiny, chráněné na alfa-aminoskupině skupinou Fmoc, tak ty, které jsou v téže poloze chráněny skupinou Boc je možno získat od Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, nebo Paninsula Labs nebo i od jiných firem, zabývajících se tímto oborem. Mimoto je při provádění způsobu podle vynálezu možno použít i aminokyselin, chráněných na Nalfa i jinak, jak je v oboru všeobecně známo.
-6CZ 289365 B6
V případě svrchu popsaného příkladu dipeptidu by tedy první skupina zaváděných aminokyselin obsahovala glycin a prolin, každý podíl pevného nosiče by byl uveden do styku buď sN^1Fmoc-glycin nebo s NalfaFmoc-prolinem.
Tyto první aminokyseliny se pak váží na pevný nosič tak, aby došlo k vazbě na v podstatě všechna vazná místa na pevném nosiči. To znamená, že je zapotřebí dovést vaznou reakci až do konce bez ohledu na rozdíly v rychlosti vazby pro jednotlivé aminokyseliny. Mimoto se aminokyseliny bází na v podstatě všechna vazná místa na pevném nosiči tak, že každý pevný nosič bude obsahovat v podstatě pouze jeden typ peptidu. Úplnou vazbou vznikne kombinace pevného nosiče a první aminokyseliny. V případě svrchu uvedeného dipeptidu půjde o kombinace nosičglycin a nosič-prolin, nebo také částice nosiče-glycin a částice nosiče-prolin.
Vazbu aminokyselin je možno uskutečnit obvyklým způsobem, tak jak bylo uvedeno například v publikaci Stewart a Young, 1984, Solid Phase Synthesis, 2. Vydání, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Jak je odborníkům známo, zahrnuje způsob syntézy peptidů na pevném nosiči postupné budování peptidu od karboxylového nebo C-terminálního zakončení, na němž je C-terminální aminokyselina se svou alfa-aminoskupinou připojena na pevný polymemí nosič. Alfa-aminoskupina je chráněna a po ukončení syntézy je odštěpena, načež se následující aminokyselina, rovněž chráněná, naváže peptidovou vazbou na alfa-aminoskupinu aminokyseliny, vázané na pevný nosič. Pak se opakuje cyklus deprotekce předchozí aminokyseliny a navázání další aminokyselina až do úplné dostavby peptidu. Jakékoliv reaktivní postranní řetězce na aminokyselině se chrání chemickými skupinami, které snesou vazbu a odstranění ochranné skupiny Nalfa, avšak je možno je odstranit na konci syntézy.
Aby bylo možno navázat aminokyselinu na rostoucí řetězec při syntéze, je nutno karboxylovou skupinu chráněné aminokyseliny aktivovat. Při provádění způsobu podle vynálezu je možno užít řadu aktivačních postupů včetně například vytvoření symetrického anhydridu (PSA), vytvoření směsného anhydridu (PMA), chloridu kyseliny, aktivního esteru a aktivace karboxylové kyseliny in sítu, jak bylo popsáno v publikaci Fields and Noble, 1990, „Solid Phase Peptide Synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids“, Int. J. Pept. Protein a Res. 35:1601-214.
Použití Fmoc-aminokyselin je pouze jedním ze způsobů syntézy peptidů. Je možno použít také Boc-aminokyseliny, chráněné terc.butyloxykarbonylovou skupinou pro přípravu banky peptidů, vázaných na pevný nosič (např. Geysen a další, 1987, J. Immunol. Methods 102:259-274).
Je nutno prokázat úplnost vazby. Obecně je známá řada testů, používaných k průkazu úplnosti reakce. Jde například o ninhydrinový (Kaiserův) test, test s použitím kyseliny pikrové, 2,4,6-trinitrobenzensulfonové (TNBS), fluorescaminu a chloraminu, tyto testy jsou založeny na reakci reakčního činidla s volnou aminokyselinou za vzniku chromofomí sloučeniny. V případě, že se použijí aminokyseliny, například Pro a Hyp, je výhodné použití isatinu podle svrchu uvedené publikace Fields a Noble. Kvantifikaci úplnosti reakce je možno sledovat v jejím průběhu, například podle PCT zveřejněné patentové přihlášky WO91/03485, Salisbury a další.
Při syntéze Fmoc je výhodný Kaiserům test. Při jeho provádění je možno vzorek z každé zkumavky zkoušet nínhydrinovým reakčním činidlem (Pierce Chemical) podle publikace Sarin a další, 1981, Anal. Biochem. 117: 147-157. V
V případě, že vazná reakce není zcela dovršena, je možno ji dovršit několika možnými známými způsoby, například
a) druhou vazbou, při níž se použije až pětinásobného přebytku chráněné aminokyseliny,
b) další vazbou při použití odlišných nebo přídavných rozpouštědel (např. trifluorethanu) a
-7CZ 289365 B6
c) přidáním chaotropické soli, například NaC104 nebo LiBr (Klis a Stewart, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshall eds., ESCOM Publ., str. 904-906.
Po dovršení vazné reakce se důkladně promísí podíly kombinací pevného nosiče a první aminokyseliny. Tohoto důkladného promísení je možno dosáhnout například míšením v jediné reakční nádobě pomocí protřepávání nebo míchadlem nebo jakýmkoliv běžným automatickým zařízením nebo také probubláváním inertního plynu, například dusíku nebo argonu.
Výsledná směs se rozdělí alespoň do dvou podílů, které by v případě, že míšení bylo skutečně účinné, měly obsahovat v podstatě stejná množství kombinace pevného nosiče a první aminokyseliny. Například v případě svrchu uvedeného dipeptidu by každý podíl obsahoval v podstatě stejné množství kombinace částice nosiče-glycin a částice nosiče-prolin.
Ke každému podílu se pak odděleně přidá druhá skupina aminokyselin. Tato druhá skupina může být tvořena
a) týmiž aminokyselinami jako v prvním případě, tj. glycinem nebo prolinem,
b) odlišnými aminokyselinami, například tryptofanem nebo leucinem,
c) pouze jedním typem aminokyseliny, například izoleucinem.
Stejně jako v případě první skupiny aminokyselin se druhá skupina aminokyselin jednotlivě váže na kombinaci pevného nosiče a první aminokyseliny v každém z podílů za vzniku peptidů, obsahujících první aminokyselinu a druhou aminokyselinu. Stejně jako v první vazbě je možno vazby dosáhnout jakýmkoliv známým způsobem. Na příkladu svrchu uvedeného dipeptidu může jít o následující případy:
a) v případě přidání týchž aminokyselin je výsledným peptidem buď glycin-glycin, glycinprolin, prolin-glycin nebo prolin-prolin,
b) při přidání odlišných aminokyselin je výsledným peptidem Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Trp nebo Pro-Leu a
c) při přidání jednoho typu aminokyseliny je výsledným peptidem Gly-Ile nebo Pro-Ile.
Tento postup je možno opakovat mnohokrát, pokud jsou k dispozici aminokyseliny, které je možno přidávat. V případě, že má být získán tetrapeptid X-X-X-Trp, kde X znamená valin, serin, nebo alanin, je například postup možno opakovat třikrát za vzniku tetrapeotidu X-X-XTrp, kde X znamená valin, serin, nebo alanin, je například postup možno opakovat třikrát za vzniku tetrapeptidu X-X-X-Trp. Při prvním, druhém a třetím přidání aminokyselin je možno k podílu nosiče přidat buď Nalfa-Fmoc valin, NalfaFmoc serin (O-Bu); nebo NaIfa-Fmoc alanin za vzniku 27 různých peptidů v přibližně ekvimolámích množstvích (Obr. 1). V případě, že je požadován hexapeptid, opakuje se postup šestkrát. V případě, že hexapeptid má být tvořen pěti aminokyselinami, je možno postup provést s pěti podíly, z nichž každý obsahuje různou aminokyselinu v každém vazném stupni. Avšak v případě, že hexapeptid má být vytvořen z jakýchkoliv ze základních dvaceti aminokyselin, bylo by možno postup provádět při použití dvaceti podílů v každém vazném stupni.
Způsob syntézy peptidů podle vynálezu je možno provést při použití nosiče, k němuž aminokyselina již je nebo ještě není vázána. Mimoto je možno použít vazný řetězec-linker, který již byl navázán na nosič. Jedním z běžných nosičů, na němž již je aminokyseliny vázána je beta
-8CZ 289365 B6 alanin-PAM-pryskyřice (Bachem Biochemical). Tyto pryskyřice jsou dodávány z mnoha komerčních zdrojů nebo se vyrábějí v laboratoři.
V případě, že se jako počáteční materiál použije kombinace nosiče a aminokyseliny nebo kombinace nosiče a vazné látky, rozdělí se tento materiál na dva podíly nebo alespoň dva podíly, z nichž ke každému se přidá aminokyselina z první skupiny aminokyselin. Jak již bylo uvedeno, je zapotřebí vázat tuto aminokyselinu na všechna vazná místa na kombinaci pevného nosiče a aminokyseliny nebo pevného nosiče a vazné látky a podíly, obsahující tuto nově přidanou aminokyselinu se důkladně promísí. Jak již bylo svrchu popsáno, směs se rozdělí na alespoň dva podíly, z nichž se ke každému přidá aminokyselina ze druhé skupiny a vazná reakce se opakuje, čímž vzniká rostoucí peptid. Jak již bylo svrchu uvedeno, postup je možno opakovat tolikrát, kolikrát je požadováno pro vznik požadovaného peptidu.
Uvedený postup je možno použít pro syntézu nahodilých peptidů stejně jako pro syntézu peptidové banky, obsahující předem stanovené řetězce. Syntéza předem stanovených řetězců v sobě zahrnuje použití specifických Nalfa-Boc, Nalfa-Fmoc nebo jiných příslušně chráněných aminokyselin. Je například možno volit ve specifických stupních vazby aminokyseliny tak, aby výsledný peptid měl určitou pravděpodobnost nebo aby přednostně vznikla určitá sekundární struktura, například beta-řetězec, alfa-helix, beta-závit apod. Například alfa-helix se jako přednostní struktura vyvine v případě, že se jako aminokyseliny přednostně použijí Glu, Ala, Leu, His, Trp. Beta-řetězce vznikají při převážném použití aminokyselin Val, lle Tyr a Met.
V případě, že se užijí převážně aminokyseliny Gly, Asn, Ser, Pro a Asp, vzniká velká pravděpodobnost beta-závitu. Je možno uvést ještě další příklady, například aminokyseliny kyselé povahy v blízkosti N-terminálního zakončení a bazické aminokyseliny v blízkosti Cterminálního zakončení a bazické aminokyseliny v blízkosti C-terminálního zakončení stabilizují alfa-helix. D-aminokyseliny mohou stabilizovat některé závity, mimoto je možno včlenit ještě řadu dalších strukturních prvků, jak bude dále uvedeno v odstavcích 2.1 a 2.2. Může být dokonce připravena i banka cyklických peptidů s disulfidovými, laktamovými, laktonovými skupinami nebo jinými skupinami, uzavírajícími kruh, jak bude dále uvedeno v odstavci 2.1.
Je nutno zdůraznit, že způsobem podle vynálezu je možno získat peptidy tak, že každý nosič, například částice pryskyřice, bude obsahovat pouze jeden typ peptidu. Způsob zajistí, že každá jednotlivá částice pryskyřice se dostane do styku pouze s jednou Fmoc-aminokyselinou v průběhu každého stupně vazby a tato reakce bude dovedena do konce. Tímto způsobem vzrůstá možnost oddělit s vysokou citlivostí a účinností peptid, který je specifický pro určitou látku, na niž se váže.
Způsob podle vynálezu dovoluje syntézu banky nahodilých peptidů, obsahující 105 až 107 různých druhů peptidů.
V jednom z možných provedení mohou peptidy určité banky například obsahovat na C-terminálním zakončení zvláštní aminokyseliny, která v postranním řetězci obsahuje CO2H nebo COHN2, takže simuluje volný glycin nebo glycinamidovou skupinu. Další cestou ke vzniku tohoto zvláštního zbytku je použití analogu D- nebo L-aminokyseliny s postranním řetězcem, tvořícím vazbu k částici pryskyřice. V jednom z možných provedení může mít zdánlivě volný Cterminální zbytek optickou konfiguraci D nebo L. V jiném možném provedení je možno použít racemickou směs D- a L-izomerů.
V dalším možném provedení je možno jako N-terminální zbytek peptidů banky použít pyroglutamát. Přestože pyroglutamát není možno prokázat při analýze Edmanovou degradací, což omezuje substituci na 50 % peptidů na daném nosič N-terminálním pyroglutamátem, zbývá ještě dostatečné množství peptidů bez pyroglutamátu pro analýzu řetězce. Je zřejmé, že tuto techniku by bylo možno použít pro analýzu jakéhokoliv peptidu s obsahem zbytku, odolného při Edmanově degradaci na N-terminálním zakončení. Další postupy pro stanovení vlastností
-9CZ 289365 B6 jednotlivých peptidů s požadovaným účinkem budou dále podrobněji uvedeny. Specifická účinnost peptidu, obsahujícího chráněnou N-terminální skupinu, například pyroglutamát, v 50 % peptidů by se ihned prokázala srovnáním účinnosti peptidu, blokovaného na 100% s neblokovaným (0 %) peptidem.
V dalším možném provedení je možno volit podjednotky peptidů, které jsou příčinou vzniku užitečných chemických nebo strukturních vlastností. Například peptidy, obsahující D-aminokyseliny budou in vivo odolné proti působení proteáz, specifických pro L-aminokyseliny. Mimoto poskytuje způsob podle vynálezu možnost přípravy bank peptidů s lépe definovanými strukturními vlastnostmi a při použití látek, podobných peptidům a jejich vazeb, například esterových vazeb, je možno připravit banky s novými vlastnostmi. V dalším možném provedení je možno vytvořit banku peptidů, obsahující redukovanou peptidovou vazbu, tj. R1-CH2-NH-R2, kde R] a R2 jsou zbytky nebo řetězce aminokyselin. Redukovanou peptidovou vazbu je možno zavést jako dipeptidovou podjednotku. Taková molekula pak bude odolná proti hydrolýze peptidové vazby, například proti působení proteáz. Banky tohoto typu by poskytovaly vazné látky sjedinečnou funkcí a účinkem, například s prodlouženým biologickým poločasem vzhledem k odolnosti proti metabolickému odbourávání nebo s odolností proti působení proteáz. Mimoto je známo, že v určitých systémech mají peptidy podobného typu vyšší účinnost (Hrubý, 1982, Life science 31:189-199, Hrubý a další, 1990, Biochem. J., 268:249-262). Vynález poskytuje způsob jak získat peptidy s uvedenou vazbou, obsahující ve všech ostatních polohách zcela nahodilé řetězce.
2.1 Usměrněné a cyklické peptidy
Usměrněné, cyklické nebo rigidizované peptidy je svrchu uvedeným způsobem rovněž možno připravit za předpokladu, že v alespoň dvou polohách řetězce ve všech peptidech banky bude včleněna aminokyselina nebo analog aminokyseliny, poskytující chemickou funkční skupinu, schopnou zesítění pro usměrnění, cyklizaci nebo rigidizaci peptidu po zpracování ke vzniku zesítění. Cyklizace bude upřednostněna v případě zařazení aminokyseliny, indukující vznik závitu, příkladem aminokyselin, schopných způsobit zesítění peptidu mohou být cystein (za vzniku disulfídových můstků), kyselina asparagová (za vzniku laktamu nebo laktonu) a chelatační sloučeniny, například kyselina gama-karboxylglutamová (Gla) (Bachem) pro chelataci přechodného kovu s tvorbou zesítění. Chráněnou kyselinu gama-karboxylglutamovou je možno připravit tak, že se modifikuje syntéza, popsaná v publikaci Zee-Cheng a další, 1980, Biophys. Biochem. Res. Commun. 94:1128-1132. Peptidovou knihovnu, v níž peptid obsahuje v řetězci alespoň dvě aminokyseliny, schopné zesítění je možno zpracovávat například oxidací cysteinových zbytků za vzniku disulfidu nebo adicí kovového iontu za vzniku chelatátu za současného zesítění peptidu a vzniku usměrněného, cyklického nebo rigidizovaného peptidu.
Vynález poskytuje soubor obecně rigidních motivů pro použití při přípravě bank podle vynálezu.
V jednom z provedení, které je znázorněno na obr. 2a, dávají dva páry zbytků, schopných zesítění vznik „košíku“. Tento motiv „košíku“ může mít své zvláštní použití jako katalytické místo mimo vazné vlastnosti, které jsou důsledkem této usměrněné konfigurace. V dalším možném provedení vytvářejí dva zbytky, schopné zesítění „žebřík“, tak jak je znázorněno na obr. 2b. V případě, že se v motivu „žebříku“ střídají D- a L- aminokyseliny, je možno připravit peptid, v němž všechny postranní řetězce aminokyselin budou orientovány směrem k jednomu povrchu, tak jak tomu je například u beta-konfigurace gramicidinu. Takový povrch může potenciálně tvořit jedinečné katalytické místo. V ještě dalším provedení je možno vytvořit jednoduchý motiv „lasa“, v němž dva zbytky vytvářejí příčnou vazbu, tak jak je zřejmé z obr. 2c. Kromě tvorby peptidové smyčky je možno dosáhnout také motivy kratšího „lasa“ u usměrněného lineárního peptidu, čímž dojde ke stabilizaci sekundární struktury, například alfa-helixu.
Je dále pravděpodobně možno vytvořit také mezipeptidové příčné vazby, což vede k vytvoření rigidní peptidové matrice.
-10CZ 289365 B6
Vynález poskytuje strategii k systemické přípravě zesítění. Například v případě, že se do peptidového řetězce zařadí čtyři cysteinové zbytky, je možno použít různé ochranné skupiny (Hiskey, 1981 v The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Gross and Meienhofer eds., Academie Press, New York, str. 137-167, Ponsanti a další, 1990, Tetrahedron 46: 8255-8266). První pár cysteinových zbytků je možno zbavit ochranných skupin a oxidovat, pak je možno odstranit ochranné skupiny ze druhé dvojice zbytků a rovněž je oxidovat. Tímto způsobem je možno vytvořit definovaný soubor disulfidových příčných vazeb. Je také do řetězce možno zařadit dvojici cysteinových zbytků a dvojice chelačních analogů aminokyselin, takže příčné vazby pak budou mít odlišnou chemickou povahu.
2.2 Neklasické aminokyseliny, které indukují usměrnění struktury
Do banky nahodilých peptidů je možno zařadit také následující neklasické aminokyseliny k zavedení zvláštních tvarových motivů: l,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3-karboxylát (Kazmierski a další, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283), (2S,3S)-Methylfenylalanin, (2S,3R)-methylfenylalanin, (2R,3S)-methylfenylalanin a (2R,3R)-methylfenylalanin (Kazmierski a Hrubý, 1991, Tetrahedron Letters, kyselinu 2-aminotetrahydronaftalen-2karboxylovou (Landis, 1989, Ph.D. Thesis, University of Arizona), hydroxy-1,2,3,4tetrahydroizochinolin-3-karboxylát (Miyake a další, 1989, J. Takeda Res. Labs. 43:53-76), beta-karbolin (D a L), (Kazmierski, 1988, Ph. D. Thesis, University of Arizona), HIC (kyselina histidinizochinolinkarboxylová) (Zechel a další, 1991, Int. J. Pep. Protein Res. 43) a HIC (histidin—cyklická močovina) (Dharanipragada).
Následující analogy aminokyselin je možno zařadit do vybraných bank k indukci nebo upřednostnění určitých specifických sekundárních struktur: LL-ACP (kyselina LL-3-amino-2propendon-6-karboxylová), dipeptidový analog, indukující beta-závit (Kemp a další, 1985, J. Org. Chem. 50:5834-5838), analogy, indukující beta-strukturu (Kemp a další, 1988, Tetrahedron lett 29:5081-5082), analogy aminokyselin, indukující vznik beta-závitu (Kemp a další, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 5057-5060) analogy, indukující vznik alfa-helixu (Kemp a další, 1988, Tetrahedron lett. 29: 4935-4938), analogy, indukující gama-závit (Kemp a další, 1989, J. Org. Chem. 54:109-115) a analogy, které byly popsány v následujících publikacích: Nagai a Sáto, 1985, Tetrahedron Lett. 26:647-650, DiMaio a další, 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans, str. 1687: také analog Gly-Ala (Kahn a další, 1989, Tetrahedron Lett. 30:3217), izoester amidové vazby (Jones a další, 1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856), tetrazol (Zbrocki a další, 1988, J. Am. Chem. Soc. 110: 5875-5880), DTC (Samanen a další, 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509) a analogy, které byly popsány v publikacích Olson a další, 1990, J. Org. Chem. 56:436.
Přestože svrchu uvedené neklasické peptidy a látky peptidům podobné nemusí být přístupné klasické analýze řetězce Edmanovou degradací, je možno použít kombinace počáteční Edmanovy degradace s následnou analýzou aminokyselin zbývajícího řetězce ke stanovení struktury peptidu s požadovanou účinností. Je také možno k analýze použít spektrální analýzu.
2.3 Derivatizované a modifikované peptidy
Vynález dále poskytuje možnost modifikace a derivatizace peptidů v bance. Modifikace peptidů jsou v oboru známy, jde například o fosforylaci, karboxymethylaci a acylaci. Modifikace je možno provést chemickým nebo také enzymatickým způsobem.
Je možno připravit i glykosylované peptidy nebo peptidy, acylované alifatickými kyselinami. Příprava těchto peptidových derivátů je v oboru známa a byla popsána například v následujících publikacích:
-11 CZ 289365 B6
1. Garg a Jeanloz. 1985, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, sv. 43, Academie Press,
2. Kunz. 1987, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308,
3. Horvát a další, 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 31: 499-507,
4. Bardaji a další, 1990, Ang. Chem. Int. Ed. English 23:231,
5. Toth a další, 1990, Peptides, Chemistry, Structure and Biology, Rivies a Marshall eds., ESCOM Publ., Leiden, str. 1078-1079.
6. Torres a další, 1989, Experientia 45:574-576,
7. Torres a další, 1989, EMBO J., 8:2925-2932,
8. Hordever a Musiol, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Tamtéž, str. 811— 812,
9. Zee-Cheng a Olson, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 94: 1128-1132,
10. Marki a další, 1977, Helv. Chem. Acta 60: 807,
11. Fuju a další, 1987, J. Chem. Soc. Chem. Commun., str. 163-164,
12. Ponsati a další, 1990, Peptides 1990, Giralt a Andreu eds., ESCOM Publ. str. 238-240,
13. Fuji a další, 1987, 1988, Peptides, Chemistry and Biology, Marshall ed., ESCOM Publ., Leiden str. 217-219.
Existují rovněž dvě hlavní skupiny vazeb mezi peptidy a uhlohydráty. První z nich, éterová vazba, spojuje serin nebo threonin hydroxylovou skupinou na hydroxylovou skupinu cukru. Druhá, amidová vazba váže karboxylovou skupinu glutamátu nebo aspartátu na aminoskupinu cukru. Zejména ve svrchu uvedených citacích 1 a 2 se uvádějí postupy pro přípravu peptid-uhlohydrátových éterů a amidů. Uhlohydrát může být vázán na peptid také acetylovými a ketalovými vazbami.
Je možno připravit také alifatické acylpeptidové deriváty. Je například možno acylovat volnou aminoskupinu (N-terminální nebo lysyl), například kyselinou myristovou. V dalším možném provedení je možno zařadit do peptidu banky aminokyselinu, obsahující alifatický postranní řetězec se strukturou (CH2)nCH3. Tyto a další konjugáty peptidu a alifatické kyseliny, vhodné pro použití při provádění způsobu podle vynálezu byly popsány v britském patentovém spisu č. 8809162.4, v PCT/AU 89/00166 a v publikaci 5 svrchu.
3. Pevné nosiče a linkery pro použití v bance nahodilých bio-oligomerů
Pevný nosič pro použití podle vynálezu bude za reakčních podmínek inertní vzhledem k syntéze bio-oligomeru, například syntéze peptidů.
Pevný nosič pro použití podle vynálezu musí mít reaktivní skupinu pro vazbu monomemí podjednotky nebo pro vazbu linkeru nebo jakékoliv skupiny, která může sloužit jako počáteční vazné místo pro monomemí podjednotku. V jednom z možných provedení může být pevný nosič vhodný pro použití in vivo, to znamená, že může sloužit jako nosič pro přímou aplikaci banky bio-oligomerů (např. TentaGel, Repp Polymere, Tubingen, SRN, dále v odstavci 7). Ve
-12CZ 289365 B6 zvláštním provedení může být pevný nosič perorálně poživatelný. V jiném provedení může být jako pevný nosič použit chromatografický materiál.
Pevný nosič není omezen na použití specifického typu nosiče. Dostupná je velká řada typů 5 těchto nosičů, jak je všeobecně známo. Jde například o různé typy silikagelů, pryskyřic, derivatizovaných plastických filmů, kuliček z plastických hmot a gelů oxidu hlinitého. Vhodný pevný nosič je možno volit vzhledem ke konečnému použití a jeho vhodnosti pro různé předpokládané postupy v průběhu syntézy. Například při syntéze peptidů je možno jako pevný nosič použít například pryskyřice, jako polystyren (např. pryskyřici PAM, Bachem lne., 10 Peninsula Laboratories apod.), pryskyřici typu POLYHIPE (Aminotech, Kanada), polyamidovou pryskyřici (Peninsula Laboratories), polystyrénovou pryskyřici, roubovanou polyethylenglykolem (TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, SRN) nebo polydimethylakrylamidovou pryskyřici (Milligen/Biosearch, Califomia). Ve výhodném provedení pro syntézu peptidů se jako pevný nosič použije polydimethylakrylamidová pryskyřice.
Pevný nosič podle vynálezu může rovněž obsahovat linker. Pod tímto pojmem se v průběhu přihlášky rozumí jakákoliv molekula, která zajišťuje prostorovou vzdálenost mezi pevným nosičem a syntetizovaným peptidem. Linkery mohou být kovalentně vázány na pevný nosič před vazbou Nalfa-Boc- nebo Nalfa-Fmoc- nebo jakkoliv jinak chráněných aminokyselin. Ke spojení 20 oligomeru a pevného nosiče je možno použít různé linkery. Příkladem linkerů mohou být kyselina aminomáselná, aminokapronová, 7-aminoheptanová a 8-aminokaprylová. Kyselina Fmoc-aminokapronová se běžně dodává (Bachem Biochem) a je velmi vhodná. V dalším možném provedení mohou linkery ještě obsahovat jednu nebo větší počet molekul beta-alaninu jako látky, zvyšující vzdálenost. Mimoto je možno modifikovat pevný nosič tak, aby splnil 25 požadavky, specifické pro určitý účel biologické zkoušky nebo detekce. Modifikaci pevného nosiče je možno uskutečnit zařazením specifického linkeru. Modifikovaný pevný nosič je například možno učinit citlivým na působení kyselin, bází, nukleofilních látek, elektrofilních látek, světla, oxidačních nebo redukčních podmínek.
Kromě svrchu uvedených linkerů je možno použít zejména selektivně odštěpitelné linkery. Například v dále uvedeném odstavci 12 bude vysvětleno použití linkeru, citlivého na působení ultrafialového světla (Barany a Albericio, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942). Další odštěpitelné linkery mohou ke svému odštěpení vyžadovat hydrogenolýzu nebo fotolýzu. Příkladem fotosenzitivních (světlem odštěpítelných) linkerů jsou řetězce, které byly popsány 35 v publikacích Wnag, 1976, J. org. Chem. 41:32-58, Hammer a další, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45 a Kreib-Cordonier a další, 1990 v Peptides-Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshall eds., str. 895-897. Lander (1977, Methods Enzym. 47:145-149) užil vodnou kyselinu mravenčí k odštěpení vazby Asp-Pro a tento přístup byl použit k charakterizaci determinant
T-buněk ve spojení s Geysenovou metodou syntézy (Van der zee a další, 1989, Eur. J. Immunol. 191:43-47). Další potenciální linkery, odštěpitelné za bazických podmínek zahrnují ty řetězce, které jsou založeny na kyselině p-(hydroxymethyl)benzoové (Atherton a další, 1981, J. Chem. Soc. Perkin 1:538-546) a kyselině hydroxyoctové (Baleaux a další, 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28: 22-28). Geysen a další (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33) popsali štěpení peptidů 45 diketopiperazinovým mechanismem. Enzym může specificky odštěpit linker, který obsahuje řetězec, který je citlivý na působení enzymu nebo substrát pro působení enzymu, jde například o štěpení peptidů působením proteázy.
V některých případech je možno derivatizovat 10 až 50% pryskyřice substitucí odštěpeným 50 linkerem a zbývajících 50 až 90 % substituovat neodštěpitelným linkerem, aby bylo možno zajistit, že bude k dispozici dostatečné množství peptidů po odštěpení linkeru pro následnou analýzu řetězce. Je možno použít také kombinace odštěpitelných linkerů, aby bylo možno postupné odštěpení z jediné částice nosiče.
-13CZ 289365 B6
Pevný nosič pro použití vynálezu může dále obsahovat příslušný bio-oligomer, k němuž je možno přidat řetězec nahodilých podjednotek. Tento bio-oligomer je možno vlit na základě popsaných postupů nebo může obsahovat řetězec, který má požadované vlastnosti.
4. Způsob detekce a identifikace bio-oligomerů
Kromě přípravy banky skutečně nahodilých bio-oligomerů a způsobů jejich syntézy tvoří podstatu vynálezu rovněž způsob analýzy banky bio-oligomerů k identifikaci těch oligomerů v bance, které mají určitý typ biologické účinnosti, jako je vazba, stimulace, inhibice, toxicita, chuť apod. Jiné banky bio-oligomerů je možno analyzovat dále uvedenými způsoby na přítomnost enzymatické účinnosti, inhibiční účinnosti na enzymy a chemické a fyzikální vlastnosti určitého typu.
Bio-oligomery s určitými vlastnostmi, které jsou nalezeny při počáteční analýzy nemusí být konečnými ligandy. Ve skutečnosti je výhodné syntetizovat druhou banku na základě společných řetězců ligandů, vybraných při první analýze. Tímto způsobem je možno identifikovat ligandy s nejvyšší účinností za předpokladu, že druhá analýza je prováděna za ještě vymezenějších podmínek.
4.1 Vazné zkoušky
Vynález dovoluje identifikaci ligandů typu bio-oligomerů, které váží molekuly akceptoru. Pod pojmem „molekula akceptoru“ se rozumí jakákoliv látka, která se váže na biooligomer. Akceptorovou molekulou může být biologická makromolekula, například protilátka, receptor nebo virus. Mimoto může být akceptorovou molekulou chemická sloučenina, například bílkovina, uhlohydrát, nukleová kyselina, lipid, léčivo, kov nebo menší molekula.
Banka bio-oligomerů podle vynálezu může vstupovat do interakce s mnoha různými molekulami akceptoru. Identifikací určitého typu bio-oligomeru, na nějž se váže specifická molekula akceptoru, je pak možno fyzikálně izolovat tento typ bio-oligomeru.
Vzhledem k tomu, že pouze malé množství nosiče bude v každém analytickém nebo detekčním stupni odstraněno, zůstává ve směsi stále ještě převážná většina nosičů s navázanými oligomery. Z tohoto důvodu je možno banku nahodilých biooligomerů použít mnohokrát. V případě, že se užije různá barva nebo jiné identifikační zbarvení pro různé molekuly akceptoru (například fluorescenčním barvením jako použitím fluoresceinu- zelená, texasové červeni-červená a DAPImodrá i po spojení s akceptorem) a při použití vhodných excitačních filtrů ve fluorescenčním mikroskopu nebo detektoru fluorescence je možno přidat různé akceptory například k peptidové bance a současně provést rychlé vyhodnocení na specifické typy ligandů. Tento postup nejen snižuje náklady, nýbrž také zvyšuje množství akceptorových molekul, které je možno tímto způsobem nalézt.
Při provádění způsobu podle vynálezu se přidá molekula akceptoru do banky bio-oligomerů, jde bude rozpoznána a bude se vázat na jeden nebo větší počet typů bio-oligomerů v bance. Každý typ bio-oligomeru, na nějž se molekula akceptoru váže, bude sám vázán na jediném typu pevného nosiče, takže je možno nosič a s ním i bio-oligomer snadno identifikovat a izolovat.
Bio-oligomer je možno izolovat jakýmkoliv běžným způsobem, známým v oboru a vynález proto není omezen na určité způsoby izolace. Je například možno fyzikálním způsobem izolovat kombinaci pevného nosiče a bio-oligomeru s nejsilnější fyzikálně-chemickou interakcí se specifickou molekulou akceptoru. V jednom provedení, které je založeno na fyzikálně-chemické interakci, se přidá roztok se specifickou molekulou akceptoru k bance nahodilých peptidů, ekvivalentní přibližně 105 až 107 typů pevného nosiče. Molekula akceptoru se inkubuje s pryskyřicí na dobu, dostatečnou k dosažení vazby mezi například peptidem a protilátkou, např.
-14CZ 289365 B6 hodinu při teplotě 22 °C. Pak se molekula akceptoru, povlečená kombinací bio-oligomeru a pevné fáze izoluje. Jednotlivá specifická provedení budou uvedena dále při popisu jednotlivých modifikací, které popisují například použití monoklonální protilátky jako rozpustné molekuly akceptoru. Je zřejmé, že tyto metody je možno snadno upravit k detekci vazby jakékoliv molekuly akceptoru.
i) Monoklonální protilátka se nejprve označí fluorescenční skupinou způsobem, který se v oboru běžně provádí a je obecně znám. Pak se protilátka v koncentraci 1 pg/ml přidá k bance peptidů a po opatrném promíchání při teplotě 22 °C jednu hodinu se pevná fáze promyje a identifikuje se fluorescenční kombinace pevného nosiče a peptidu a tento podíl se izoluje s použitím automatického zařízení, oddělujícího fluorescenční molekuly. Je také možno fluorescenční kombinaci pevného nosiče a peptidu identifikovat a fyzikálně oddělit pod mikroskopem s fluorescenčními doplňky při použití mikromanipulátoru. Relativní intenzita fluorescence je obvykle úměrná afinitě peptidového ligandu k monoklonální protilátce.
ii) Monoklonální protilátka se nejprve konjuguje s feromagnetickými částicemi obvyklým způsobem. Pak se konjugovaná protilátka v koncentraci 1 pg/ml inkubuje s bankou 1 hodinu při teplotě 22 °C. Magnetické částice vytvoří kolem odpovídajícího peptidu na nosiči rozety, které je pak možno od směsi oddělit silným magnetem.
iii) Monoklonální protilátka se nejprve konjuguje s enzymem, například s alkalickou fosfatázou způsobem, který se v oboru běžně užívá. Získaný konjugát protilátky a enzymu se pak inkubuje s bankou nahodilých peptidů 30 minut až jednu hodinu při teplotě 22 °C. Po promytí se celá banka vlije do Petriho misky, která obsahuje substrát pro alkalickou fosfatázu, například 5-borm-4-chlor-3-indolylfosfát (BCIP) a nitrotetrazoliovou modř (NBT). Po inkubaci několik dalších minut změní kombinace protilátky, nosiče a peptidu barvu (zmodrá) a vzhledem kvysrážení přeměněného substrátu na pevném nosiči a tuto kombinaci je pak možno snadno identifikovat a fyzikálně oddělit pod mikroskopem při použití mikromanipulátoru. Relativní intenzita barevné reakce je obecně proporcionální afinitě peptidu vzhledem k příslušné monoklonální protilátce.
iv) Monoklonální protilátka se nejprve konjuguje s enzymem, například s perioxidázou z křenu obvyklým způsobem. Tento konjugát protilátky a enzymu se pak inkubuje 30 minut až jednu hodinu s bankou nahodilých peptidů při teplotě 22 °C. Po promytí se celá banka vlije do Petriho misky, která obsahuje substrát pro peroxidázu, například 3,3',4,4'-diaminobenzidin (DAB), 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) nebo 5-chlor-l-naftol (4CN). Po inkubaci několik minut změní kombinace protilátky, pevného nosiče a peptidu barvu a je možno ji identifikovat a snadno fyzikálně izolovat pod mikroskopem při použití mikromanipulátoru. Relativní intenzita barevné reakce je obvykle přímo úměrná afinitě peptidu pro použitou monoklonální protilátku.
v) Monoklonální protilátka se nejprve označí biotinem (biotinyluje se) způsobem, který je v oboru běžně prováděn a pak se inkubuje s bankou nahodilých peptidů 30 minut až jednu hodinu při teplotě 22 °C. Po promytí banky se přidá směs streptavidinu a alkalické fosfatázy nebo komplex strepavidinu a peroxidázy z křenu a pak se směs inkubuje 30 minut. Pak se nosič promyje a barva se vyvine obdobným způsobem jako v předchozím odstavci iii) při použití enzymatické metody. Kombinace pevného nosiče a peptidu je pak možno izolovat fyzikálním způsobem stejně jako svrchu.
Kromě použití rozpustných molekul akceptoru je také podle jiného provedení možno provádět detekci bio-oligomerů, schopných se vázat na receptory na povrchu buněk při použití neporušených buněk. Použití neporušených buněk je výhodné v případě receptorů, které jsou
-15CZ 289365 B6 tvořeny větším počtem podjednotek nebo jsou labilní nebo v případě receptorů, které vyžadují pro svou funkci přítomnost lipidové oblasti buněčné membrány. Buňky, použité při tomto provedení mohou být buňky živé nebo fixované. Tyto buňky se inkubují s bankou nahodilých peptidu a budou se vázat na určité peptidy, což se projeví tvorbou „rosety“ mezi cílovou buňkou 5 a příslušnou kombinací peptidu a pevného nosiče. Vytvořené rozety je pak možno izolovat diferenciálním odstředěním nebo oddělit fyzikálně při použití mikroskopu.
Při dalším možném provedení je možno banku analyzovat také propíráním při použití buněčných linií, například
i) linie, v níž receptor na povrchu buněk není přítomen a ii) linie, která byla od předchozí buněčné linie odvozena její transfekcí genem, který je kódem pro příslušný receptor.
Pak je možno analyzovat banku následujícím způsobem:
i) Nejprve se banka zbaví nespecifických částic nosiče, které by se vázaly na buňky bez receptorů tak, že se užije souvislá vrstva původní buněčné linie bez receptorů, na niž se uvedené částice naváží, ii) nenavázané částice, které jsou směsí částic, specifických pro receptor a irelevantních částic se uvedou do styku se souvislou vrstvou buněčné linie, pozitivní vzhledem k receptorů, na niž se bude vázat kombinace pevného nosiče a látky, specifické pro receptor, iii) odstraní se zbývající irelevantní kombinace jemným promytím a slitím a iv) specifická kombinace receptorů, peptidu a pevného nosiče se oddělí pomocí mikromanipulátoru.
Jako alternativa k použití celých buněk při výzkumu receptorů, vázaných na membránu nebo receptorů, vyžadujících ke své funkci lipidovou oblast membrány je možno rekonstituovat molekuly receptorů do liposomů, kde je možno navázat odpovídající skupinu nebo enzym.
Přestože svrchu uvedené příklady byly uvedeny pro ligandy typů peptidů, je možno použít při praktickém provedení těchto zkoušek všechny bio-oligomery, které byly uvedeny svrchu v odstavcích 1 a 2. Znamená to, že se molekula akceptoru může vázat na neklasickou, cirkularizovanou, konformačně pozměněnou nebo strukturně usměrněnou molekulu peptidu.
V jednom z možných provedení je možno přímo označit molekulu akceptoru. V dalším možném povedení je možno užít značenou sekundární reakční složku k detekci vazby molekuly akceptoru na pevný nosič, obsahující hledaný bio-oligomer. Vazbu je možno prokázat in šitu tvorbou chromoforu pomocí enzymatického značení. Vhodným enzymem pro toto použití je například alkalická fosfatáza nebo peroxidáza z křenu. V dalším možném provedení je možno použít dvou 45 barev při použití dvou chromogenních substrátů a dvojího enzymatického značení na různých hledaných akceptorových molekulách. Tímto způsobem lze identifikovat také přímo a zkříženě reagující ligandy.
Další označení, jehož je možno použít při provádění vynálezu jsou latexové barevné částice, 50 magnetické částice, fluorescenční značení, například fluoresceinizothiokyanátem FITC, phycoerythrinem PE, texasovou červení TR, rhodeminem, volnými nebo chelatovanými lanthanidy, zejména Eu+++, dále je možno užít chemiluminiscenční molekuly, radioizotopy, nebo označení v magnetické rezonanci. Dvě barevné zkoušky je možno uskutečnit při použití dvou nebo většího počtu barevných latexových částic nebo fluorescenčních látek, emitujících při
-16CZ 289365 B6 různých vlnočtech. Značené částice je možno izolovat manuálně nebo mechanickými prostředky. Mechanickými prostředky jsou například postupy, při nichž k dělení dochází pomocí fluorescenční aktivace, tj. analogicky jako při FACS a také mikromanipulátory.
Ve specifických příkladech, které budou dále uvedeny bylo užito značení pomocí enzymuchromogenu a fluorescenčního značení FITC.
Reaktivní částice je možno izolovat na základě intenzity značení, například intenzity zbarvení, fluorescence, magnetizmu nebo radioaktivity, uvedena byla pouze některá kritéria. 10 Nej intenzivněji značené částice je možno oddělit a řetězec materiálu analyzovat nebo materiál jinak charakterizovat, například hmotovým spektrem. V jiném provedení je možno provést selekci částic s intenzitou značení nad určitou úroveň a materiál, na tyto částice vázaný, analyzovat. Potenciálně je také možno užít moderní metody zobrazování pod mikroskopem pro kvantitativní určení intenzity zbarvení a tím i definovat relativní afinitu ligandu k molekule 15 receptoru před analýzou řetězce materiálu, vázaného na částice. Podobně je možno užít také kvantitativní analýzy ve fluorescenčním mikroskopu v případě akceptoru s fluorescenčním značením. V ještě dalším provedení je možno oddělit částice s určitou intenzitou značení pro analýzu složení na ně vázaného materiálu, například může jít o složení aminokyselin. Je také možno připravit banku, obsahující vymezenou skupinu monomemích podjednotek, které byly 20 identifikovány jako důležité a tuto banku pak podrobit analýze.
V dalším provedení je možno identifikovat bio-oligomery s největší vaznou aktivitou, tj. vaznou konstantou tak, že se postupně ředí příslušná molekula akceptoru tak dlouho, až k vazbě dochází pouze na několika částicích pevného nosiče v bance. Je také možno postupovat tak, že se užije 25 omezujících podmínek v roztoku, v němž k vazbě dochází. Omezení vazby nebo hybridizace je možno dosáhnout
i) zvýšením iontové síly roztoku, ii) zvýšením koncentrace denaturačních látek, jako močoviny, iii) zvýšením nebo snížením pH od neutrální hodnoty 7.
Je možno použít také jiných změn podmínek v roztoku, tak jak je to v oboru běžně známo. 35 Vysoké ředění nebo vazba akceptorové molekuly za vysoce vymezených podmínek na komplex pevného nosiče a bio-oligomeru může být použita k detekci příslušného ligandu v bance nahodilých látek, obsahující všechny nebo téměř všechny možné monomemí podjednotky nebo v bance vymezené skupiny sloučenin.
V dalším provedení mohou být středem zájmu bio-oligomery, které mají nízkou afinitu vazby. Tyto látky je možno izolovat tak, že se nejprve odstraní všechny bio-oligomery s vysokou afinitou vazby a pak se provede detekce vazby za málo vymezených podmínek nebo v méně zředěném prostředí.
Ve výhodném provedení je možno použít postupu s dvojím značením. První označení je možno použít k detekci nespecifické vazby molekuly akceptoru na nosič v přítomnosti rozpustného ligandu. Pak se označené částice od banky oddělí a odstraní se rovněž rozpustný ligand. Pak se zjistí specifická vazba molekuly akceptoru na zbývající částice. Je možno očekávat, že bio-oligomery na částicích budou vázat molekulu akceptoru na tomtéž vazném místě jako příslušný ligand 50 a budou jen tedy určitým způsobem napodobovat. Zkouška s dvojitým značením má tu výhodu, že příslušnou molekulu akceptoru není nutno čistit, protože první stupeň zkoušky dovoluje odstranění nespecificky reagujících částic nosiče.
- 17CZ 289365 B6
4.2 Zkoušky na biologickou účinnost
Podle vynálezu je možno provést zkoušky na biologickou účinnost bio-oligomeru z banky po odstranění jakýchkoliv toxických molekul, zbývajících po syntéze, například neutralizací a důkladným promytím pomocí rozpouštědla, sterilní vody a živného prostředí. Biologická účinnost, kterou je možno prokázat zahrnuje toxicitu až do zničení cílového objektu, stimulaci a podporu růstu a fyziologické změny.
Ve výhodném provedení je možno bio-oligomery banky selektivně odštěpit od pevného nosiče nebo jeho částice. V jednom z možných provedení se částice nosiče připraví tak, že pouze frakci bio-oligomeru je možno selektivně odštěpit. Selektivně odštěpitelné bio-oligomery, linkery a částice nosiče byly popsány svrchu v odstavci 3. Na banku se působí štěpným činidlem, čímž dojde k odštěpení frakce bio-oligomerů. Příkladem štěpných činidel může být UV-světlo, kyselina, báze, enzym nebo katalyzátor. V jednom provedení se tímto způsobem z banky uvolní 10 až 90% bio-oligomerů. Ve výhodném provedení se uvolní 25 až 50% bio-oligomerů. V případě, že jsou odštěpitelné všechny bio-oligomery, je možno uskutečnit nekvantitativní štěpení omezením množství štěpného činidla. Je například možno omezit dobu expozice a intenzitu ultrafialového světla. V jiném provedení je možno snížit koncentraci reakčního činidla. Po provedeném štěpení je možno banku dále zpracovávat například neutralizací k dosažení biologické kompatibility, pokud jde o požadovanou zkoušku. Odborník snadno stanoví podmínky při štěpení pro částečné štěpení v případě, že všechny bio-oligomery banky jsou vázány na částice nosiče štěpitelnými linkery nebo vazbami. Je dále obecně známo, že relativní koncentraci uvolněného bio-oligomeru je možno ovlivnit změnami podmínek při štěpení.
Vzhledem k tomu, že částice nosiče v bance jsou imobilizovány, vytvoří se koncentrační gradient určitého biooligomeru. Vysokou koncentraci bio-oligomeru bude možno prokázat v blízkosti částice, z níž byl uvolněn. To znamená, že průkaz hledané biologické účinnosti v blízkosti částice dovolí identifikaci a izolaci částice a stanovení řetězce nebo jiné vlastnosti biooligomeru. Identifikace bio-oligomeru je možná z toho důvodu, že po částečném odštěpení bude na částici k dispozici ještě dostatečné množství pro analýzu řetězce nebo stanovení některé vlastnosti bio-oligomeru. V dalším možném provedení je možno částice dělit do vyhloubení mikrotitrační plotny (např. 10 částic/vyhloubení) a určitý podíl bio-oligomeru uvolnit a podrobit zkouškám na biologickou účinnost, čímž je možno vyloučit potenciální problém difúze. Jak bude dále popsáno, je možno na pevný nosič vázat různé frakce bio-oligomeru různými odštěpitelnými vaznými řetězci pro následující analýzu řetězce. V dalších příkladech znamená „částice“ částici pevného nosiče.
Dále budou uvedeny příklady, jak je možno provést biologické zkoušky, aniž by měl být vynález na tyto příklady provedení omezen.
i) Populace buněk ve formě suspenze jednotlivých buněk se navrství na kapalné prostředí nebo polotuhou matrici, obsahující banku nahodilých bio-oligomerů. V jednom provedení se tento postup provádí v mikrotitrační plotně pro tkáňové kultury s 96 vyhloubeními s jednou nebo větším počtem částic v každém vyhloubení, každé vyhloubení rovněž obsahuje suspenzi buněk. V dalším provedení se k suspenzi buněk přidá bariérová matrice a částice banky. Podíl peptidu na každé částici se váže na vodou odštěpitelný (např. diketopiperazin) nebo světlem odštěpitelný linker. Je možno odštěpit dostatečné množství peptidu pro biologický účinek, přičemž zůstává ještě dostatečné množství peptidu, vázaného na částice, pro analýzu řetězce. Suspenze buněk může být v roztoku nebo v polotuhé matrici. Po vhodné době inkubace se populace buněk zkoumá na růst nebo proliferaci např. identifikací kolonií. V dalším provedení je možno přidat tetrazoliovou sůl MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-difenyltetrazoliumbromid) podle publikace Mosman, 1983, J. Immunol. Methods 130:140-151). Sukcinátdehydrogenáza, kterou je možno prokázat v mitochondriích životaschopných buněk převádí MTT na formazanovou
-18CZ 289365 B6 modř. To znamená, že koncentrace modrého zbarvení bude znamenat přítomnost metabolicky aktivních buněk. V dalším možném provedení je možno stanovit včlenění radioaktivního značení, např. triciovaného thymidinu jako ukazatel proliferace buněk. Podobně je možno prokázat syntézu bílkovin zařazením 35S-methioninu. Částice, které uvolní peptid, který stimuluje nebo působí inhibici růstu buněk se pak izolují a analyzuje se řetězec materiálu, identifikovaný řetězec peptidu se pak znovu podrobí zkouškám v roztoku proti indikátorovému typu buněk.
ii) V dalším provedení postupu i) se částice banky rozdělí do vyhloubení mikrotitrační plotny tak, že každé vyhloubení obsahuje přibližně 10 částic. Částice se uvedou do suspenze v kapalné fázi. Z každé částice se uvolní dostateční množství peptidu k vyvolání biologického účinku, zatímco na částici zůstává dostatečné množství peptidu pro analýzu jeho řetězce. Supematant, obsahující uvolněný peptid je možno přenést na replikační plotnu nebo ponechat ve vyhloubení společně s částicemi. Stanoví se biologická účinnost, např. růst nebo proliferace buněčné linie. Částice z vyhloubení s biologickou účinností se analyzují a každý analyzovaný řetězec se připraví a testuje, aby bylo možno prokázat, který z řetězců má biologickou účinnost.
iii) V dalším provedení postupu ii) se bio-oligomery váží na částice tak, že přibližně 1/3 bio-oligomerů je možno uvolnit v prvním stupni, další 1/2 ve druhém stupni a zbývající 1/3 zůstane na částici. K postupnému volnění může dojít při použití dvou odlišných odštěpitelných linkerů nebo použitím omezeného množství štěpného činidla, které může v každém stupni odštěpit jen určitý podíl bio-oligomeru. V tomto případě je výhodné použití řízeného ozáření linkeru, citlivého na světlo, přestože i při použití pečlivě volené doby působení chemického nebo enzymatického činidla je možno dosáhnout částečného odštěpení. Banka postupně odštěpitelných bio-oligomerů se připraví a rozdělí do vyhloubení mikrotitrační plotny tak, že každé vyhloubení obsahuje více než 50, s výhodou 50 až 250 částic. Částice se zpracují tak, aby došlo k odštěpení přibližně 1/3 bio-oligomerů. Supematant se sleduje na biologickou účinnost v opakovaných zkouškách. Částice z vyhloubení s biologickou účinností se pak uvedou do suspenze a rozdělí do vyhloubení mikrotitrační plotny tak, že každá plotna obsahuje 1 až 10 částic. Na částice se působí tak, že se uvolní další 1/3 bio-oligomeru a supematant se opět zkouší na biologickou účinnost. Částice z vyhloubení s biologickou účinností se izolují a navázaný bio-oligomer se analyzuje k určení řetězce. V případě, že účinná je více než jedna částice, připraví se všechny identifikované řetězce a jednotlivě se zkouší na biologickou účinnost. Tato dvoustupňová biologická zkouška se jeví jako velmi účinný způsob k vyšetření velké banky na biooligomery se specifickým biologickým účinkem.
iv) Stimulaci uvolnění cytokinu je možno sledovat tak, že se suspenze jednotlivých buněk přidá ve formě, imobilizované na polotuhé matrici, např. na agarozovém gelu. V případě, že bio-oligomer podle vynálezu působí uvolnění cytokinu, např. lymphokinu, růstového faktoru, hormonu apod., je možno přítomnost cytokinu prokázat aktivitou indikátorové buněčné linie. Specifické testy s použitím indikátorové buněčné linie je možno provést způsobem podle odstavce i) svrchu. V jiném provedení je možno cytokin, uvolněný stimulovanými buňkami prokázat blotem na membránu, např. z nitrocelulózy a pak cytokin prokázat imunologicky nebo průkazem vazby na receptor.
v) V dalším možném provedení je možno sledovat toxicitu bio-oligomeru. Zóny nebo plaky bez růstu, např. v případě transformované nebo nádorová buněčné linie, převrstvené na banku bio-olimerů v tomto případě jsou indikátorem biologické účinnosti. Ve zvláštním provedení je možno navrstvit na polotuhou matrici dvě populace buněk jednu na druhou. Tímto způsobem je možno identifikovat cytotoxický bio-oligomer, specifický pro cílovou buňku, avšak netoxický pro jiné buňky. Touto zkouškou je možno rychle identifikovat bio
-19CZ 289365 B6 oligomeiy, vhodné pro použití jako chemoterapeutika. Cytotoxické bio-oligomery zahrnují toxické peptidy.
vi) Pozorovat je možno také fyziologické změny. V jednom z možných provedení se na banku navrství suspenze myokardiálních buněk. Pak je možno pozorovat změny fyziologie buněk, stimulované bio-oligomerem. V jiném provedení je možno sledovat řízení určitého enzymu tak, že se sleduje vzestup účinnosti určitého enzymu v případě, že je k dispozici příslušný substrát, například chromogen (např. MTT, jak bylo uvedeno svrchu v odstavci i), fluorofuru nebo chmiluminiscenční látky. Řízení enzymu je možno sledovat také imunologicky. V ještě dalším možném provedení je možno pomocí histologické techniky prokázat fyziologické nebo morfoogické změny, vyvolané bio-oligomerem z knihovny.
vii) Vynález poskytuje postu k průkazu účinnosti biooligomeru v bance na polarizované buňky, například na buňky s basolaterální a luminální plochou. Polární buňky a kultury těchto buněk je možno připravit na semipermeabilní membráně, podle velikosti otvorů. Banka se přidá na polotuhé matrici k basolaterální ploše nebo k luminální ploše. Pak je možno prokázat různé účinky bio-oligomeru podle vynálezu, například polární transport, proliferaci, intercelulámí komunikaci apod. Zvláště je možno značením biooligomeru, např. radioaktivně nebo pomocí fluoroforu identifikovat transportovatelné bio-oligomery. V oboru existuje také dlouhodobá potřeba specificky absorbovatelných molekul. Tyto molekuly by byly zvláště vhodné pro podání farmaceutických látek perorálně a do nosu tam, kde je žádoucí transport z povrchu sliznice na opačnou stranu epitelu.
Je také možno uskutečnit biologické zkoušky při použití neodštěpených bio-oligomerů. Pak je možno sériově sledovat biologickou účinnost celých částic svázaným bio-oligomerem. V jednom zmožných provedení je možno aplikovat celou banku živočichovi a částice pak izolovat ze specifických tkání. Je možno izolovat částice, které byly vstřebány po perorálním, nosním nebo kožním podání. Ve výhodném provedení se užijí magnetické částice nebo částice, které mají jinou identifikovatelnou vlastnost a tak je možno je snadno ze tkání izolovat.
Je zřejmé, že všechny svrchu uvedené biologické zkoušky se týkají bio-oligomerů, zahrnujících peptidy. Peptidy jako analogy peptidů jsou dobře známé jako látky podporující růst, inhibitory růstu a regulátorové molekuly. Peptidy mohou působit jako regulátory genů tak, že se váží na řídicí řetězce genu a například agonizují nebo antagonizují účinky promotorů, zesilovačů transkripce a řídicích bílkovin.
Všechny banky, které byly popsány v odstavcích 1 a 2 je možno zkoumat na takovou biologickou účinnost.
Je dále zřejmé, že je možno použít k biologickému sledování jakoukoliv buňku, kterou je možno udržovat ve tkáňové kultuře po kratší nebo po delší časové období. Pod pojmem „buňka“ se rozumí prokaryotická (např. bakteriální) a eukaryotická buňka, kvasinky, plísně a houby. Je možno užít primární buňky nebo buněčné linie, udržované v kultuře. Mimoto bude pravděpodobně možné provádět i pokusy sviry tak, že se buňky infikují nebo transformují virem. Bylo by například možno sledovat schopnost bio-oligomeru způsobit inhibici lysogenní účinnosti bakteriofágu lambda identifikaci kolonií E. coli po transfekci, které by v případě infekce nevytvářely zřetelné plaky.
Postupy pro zkoušky na účinnost bio-oligomeru v bance nahodilých bio-oligomeru není možno omezit na svrchu uvedené příklady. Je totiž možno modifikovat jakýkoliv systém zařazením vynálezu, takže rovněž bude spadat do jeho rozsahu.
-20CZ 289365 B6
4.2.1 Biologická zkouška na antagonisty erythropoetinu
Ve zvláštním provedení se vynález týká zkoušky na bio-oligomer, který je agonistou erythropoetinu. Je však zřejmé, že postup, který bude k tomuto účelu popsán může být využit k identifikaci jakéhokoliv agonisty, např. agonisty růstových faktorů, hormonů, cytokinů, lymfokinů a jiných intercelulámích mediátorů, jak byly svrchu popsány v odstavci 4.2.
V tomto provedení může být banka bio-oligomerů tvořena peptapeptidy, připravenými z 19 běžných aminokyselin s výjimkou cystinu. Teoretické množství možných vzniklých peptidů je 2 476 099. Banku je možno získat v 19 stupních k usnadnění analýzy banky. Postupuje se tak, že se v každém stupni pro C-terminální zakončení volí jediná aminokyselina, takže pouze další čtyři jsou voleny nahodile. Vzniklý peptid má tedy obecný vzorec XXXXY, kde Y je aminokyselina, zvolená pro uvedený stupeň a X znamená nahodile navázanou aminokyselinu. Tímto způsobem je možno snížit počet potenciálních peptidů v každém stupni na 130 321. Při rozdělení materiálu po 10 částicích (peptidů) do každého vyhloubení plotny s 96 vyhloubeními je počet potřebných plotech 136, další plotny je zapotřebí pro biologické zkoušky (standardy a kontroly), takže celkový počet potřebných ploten je 137. Způsob dovoluje distribuci celého stupně tvorby banky v celém počtu ploten v průběhu jediného pracovního dne.
Hlavní podíl 50 až 80 % peptidu, syntetizovaného na částicích nosiče je možno odštěpit k provedení biologických zkoušek tak, že se z každé částice nosiče uvolní alespoň 50 pmol peptidu. Jako odštěpitelný linker je vhodná zejména diketopiperazinová vazba, přestože je možno použít také linker, odštěpitelný působením světla.
Vazba je dostatečná stálá v mírně kyselém prostředí, např. 0,1 až 1,0 mM HC1 pro distribuci částic nosiče v průběhu 6 až 8 hodin. Odštěpení je možno vyvolat přidáním 20 μΐ 1,0 až 10 mM Hepes o pH 8,5 do každého vyhloubení. Štěpení probíhá přes noc (12-18 hodin) při udržování konečného objemu vyhloubení na stálé hodnotě. Odpařování je možno zabránit uložením ploten ve vlhké komoře.
Roztok peptidu, získaný štěpením banky by měl být aseptický nebo spíše sterilní. Aseptické podmínky jsou nutné vzhledem k tomu, že roztok bude tvořit 25 % konečného objemu kultuiy a kultivace bude trvat alespoň 24 hodin. Aseptických podmínek je možno dosáhnout tak, že se
1) hydratují částice po syntéze ve sterilní vodě,
2) počáteční suspenze částic se ředí okyselenou sterilní vodou,
3) užije se sterilní techniky pro rozdělování částic do jednotlivých vyhloubení mikrotitračních ploten.
Konečná suspenze částic může obsahovat méně než přibližně 20% MSO k usnadnění solubilizace hydrofobních peptidů. DMSO by měl být přidán v případě potřeby v časném stadiu společně s vodou k usnadnění rozpuštění. Konečná suspenze částic by měla obsahovat 10 částic/50 μΐ. Udržení částic v suspenzi v průběhu pipetování je možno dosáhnout přidáním přibližně 0,8 až 3,3 % methylcelulózy. Použití methylcelulózy může umožnit snížení množství DMSO, použitého pro zvýšení rozpustnosti. Konečná koncentrace methylcelulózy v kultuře má být udržována pod 0,8 %, tak aby nedocházelo k interferenci s biologickými zkouškami.
Uvolněné peptidy je možno přenést na plotny pro biologické pokusy ve formě vzorků s objemem 50 μΐ, přičemž je nutno dbát toho, aby si odpovídaly plotny pro vzorky a pro pěstování. Je také nutno při přenosu zachovat sterilní podmínky. Do určitých vyhloubení ploten je možno přidat lidský rekombinantní EPO jako pozitivní kontrolu (na každé plotně) a pro konstrukce
-21 CZ 289365 B6 standardních křivek (první a poslední plotna). Do kontrolních vyhloubení je možno vložit 0,1IU EPO a standardní křivky je možno získat ze šesti zkoušek vždy s dvěma vyhloubeními při použití 1,0 až 100 jednotek EPO (D‘Andrea a další, 1991, Mol. Cell Biol. 11:1980-1987).
Biologickou zkoušku je možno provést při použití rekombinantní buněčné linie Ba/F3-T, u níž dochází k expresi receptoru pro erythropoetin (EPO-R). Tyto buňky jsou závislé buď na přítomnosti interleukinu-3 (IL-3) nebo EPO. Pěstování uvedených buněk v přítomnosti IL-3 (ve formě 10% roztoku) v upraveném živném roztoku WEHI může zabránit možné interferenci EPO v prostředí s biologickou zkouškou. Základním růstovým prostředím pro buňky Ba/F3-T je prostředí RPMl 1640 s obsahem 2,0 g/1 hydrogenuhličitanu sodného, 10% fetálního telecího séra, 1 x penicillin-streptomycin, 5 μΐ beta-merkaptoethanolu/1 a 10 mM Hepes (konečná koncentrace), pH se upraví na 7,40. Toto prostředí je nutno doplnit 10 % upraveného prostředí WHEI, který se dodá IL-3. Upravené prostředí WHEI se připraví tak, že se pěstují buňky WHEI v tomtéž základním prostředí až do vytvoření souvislé vrstvy buněk. Pak se prostředí odstředí k odstranění buněk, nechá se projít filtrem s průměrem otvorů 0,22 pm a skladuje ve zmrazeném stavu. Buňky Ba/F3-T se pěstují až do koncentrace 1,31 x 107 buněk, tyto buňky se pak rozdělí po 1 x 103 buněk/vyhloubení v objemu 150 μΐ podle publikace Yoshimura a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:4139-4143.
Pak se buňky Ba/F3-T přenesou z malých lahví do sterilních lahví do odstředivek s objemem 250 ml. Pak se buňky odstředí při 500 g celkem 5 minut. Pak se buňky uvedou do suspenze ve 200 ml čerstvého základního prostředí bez IL-3 pro počítání buněk. Konečný objem se pak upraví tak, aby bylo dosaženo 6,67 x 103 buněk/ml (1 x 103buněk/150 μΐ) přidáním dalšího živného prostředí. Obvykle je zapotřebí rozdělit výslednou suspenzi buněk na 4 až 8 podílů a jednotlivé podíly skladovat v inkubátoru v průběhu dlouhého postupu dělení. Počet buněk a jejich živnost by měla být stanoveny na vzorcích, odebraných na konci a na začátku dělení, aby bylo ověřeno, že na první i na poslední plotně se nachází přibližně stejný počet životaschopných buněk. Buňky se rozdělují do ploten s obsahem supematantů s uvolněným peptidem. Pak se plotny inkubují tři dny (Yoshimura a další, svrchu).
Konečným stupněm biologické zkoušky je zjištění počtu živých buněk v každém vyhloubení plotny. Tento počet je možno stanovit zkouškou MTT podle publikace Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63 v modifikaci podle publikace Niks a Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151. Modifikovaná zkouška dovoluje stanovení počtu živých buněk bez odstranění živného prostředí.
MTT, tj. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid se připraví ve formě roztoku v PBS, který obsahuje 5 mg MTT/ml, zapotřebí je přibližně 270 ml roztoku. Do každého vyhloubení plotny se uloží 20 μΐ tohoto roztoku a plotna se inkubuje 4 hodiny při teplotě 37 °C. Po této době se do každého vyhloubení přidá 100 μΐ extrakčního roztoku a plotna se uloží do lázně s ultrazvukem na 120 sekund. Extrakční roztok obsahuje 50% objemových dimethylformamidu v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) s koncentrací 20 % hmotnostních, upravené na pH 4,7 přidáním směsi kyseliny octové a chlorovodíkové způsobem podle publikace Hansen a další, 1989, J. Immunol. Methods 119:203. Tímto postupem dochází k solubilizaci formazanového produktu metabolismu MTT pro měření optické hustoty při 570 nm zařízením pro odečítání přímo z mikrotitračních ploten.
Údaje optické hustoty, získané při biologických zkouškách se užijí k vypočítání průměru ze všech vyhloubení, obsahujících vzorky ke stanovení 95% mezí spolehlivosti pro průměrnou hodnotu. Pro hodnoty optické hustoty ve vyhloubeních vně uvedeného intervalu se pro stanovení statistické významnosti užije Studentovo t. Statisticky významné hodnoty se srovnávají se standardní křivkou EPO, čímž se získá údaj pro účinnost v IU relativně k EPO. Standardní křivka se stanoví nelineární analýzou regresů při použití logistické rovnice. Údaje z obou standardních
-22CZ 289365 B6 křivek se analyzují společně i odděleně za účelem zjištění, zda existuje statisticky významný rozdíl v odpovědi, měřené na obou koncích biologické zkoušky (test na poměr F). Srovnáním kontrolních hodnot, měřených pro každou plotnu v průběhu celé zkoušky je možno určit ke zjištění, zda existuje stálá změna v odpovědi při biologické zkoušce.
Je důležité si uvědomit, že existují na buňkách Ba/F3-T dva receptory pro růstové faktory (IL3R a EPO-R) a že aktivita kteréhokoliv z nich vyvolá pozitivní biologickou odpověď. To znamená, že svrchu uvedenou biologickou zkouškou je možno oddělit agonisty receptorů IL-3 i EPO. Existuje dvojí řešení tohoto problému. Jedním z nich je použití jiné buněčné linie nebo slezinných buněk z myší po podání fenylhydrazinu (Krystal, 1983, Exp. Hematol. 11:649-660). Druhým je zkouška syntetických peptidů na účinnost EPO i IL-3 ve druhé biologické zkoušce nebo pomocí radioaktivně značených vazných látek.
4.3 Látky, spolupůsobící s enzymy a inhibitory enzymů
Vynález se týká také bio-oligomerů, které katalyzují určité reakce, například banky enzymů, které mohou sloužit jako koenzymy nebo způsobit inhibici enzymatických reakcí. Vynález tedy také poskytuje metody pro zkoumání účinnosti enzymů nebo koenzymů a také pro sledování inhibice enzymatické účinnosti.
Enzymatickou účinnost je možno sledovat na základě tvorby zjistitelného reakčního produktu. Ve zvláštním provedení katalyzuje bio-oligomer z banky enzymatickou reakcí, jejímž substrátem je substrát pro alkalickou fosfatázu, tj. 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfát (BCIP), čímž dojde k modrému, nerozpustnému reakčnímu produktu na pevném nosiči, jak bude dále popsáno v příkladu 8.
V dalším provedení se může tvořit oblast pozorovatelného produktu, například zabarvení nebo fluorescence na polotuhé matrici. V tomto případě se banka navrství na polotuhou matrici, například na agarózový gel a přidá se chromogenní nebo jiný indikátorový substrát. V případě, že kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru má požadovanou enzymatickou účinnost, vytvoří se zóna produktu. Například je možno biooligomer, který je analogem peroxidázy z křenu identifikovat tak, že se přidá roztok aminoantipyrenu (0,25 mg/ml, Kodak), fenolu (8 mg/ml) aH2O2 (0,005%) v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,0. Částice s enzymatickou účinností budou tvořit purpurovou zónu. V dalším provedení je možno identifikovat částice nosiče s bio-oligomerem s účinností proteázy přidáním známých kolorimetrických substrát pro proteázu.
Koenzymatickou účinnost je možno pozorovat tak, že se sleduje enzymatická účinnost příznivě ovlivněná koenzymem tam, kde není přítomen přírodní nebo obvyklý koenzym.
Inhibiční účinek se enzymatickou reakci je možno prokázat při použití částečně uvolněného bio-oligomeru. Uvolňování bio-oligomerů bylo již popsáno svrchu v odstavcích 3 a 4.2.
V jednom zmožných provedení se banka bio-oligomerů navrství na polotuho matrici, která obsahuje enzym.
Z banky se pak částečně uvolní bio-oligomer. V případě, že bio-oligomer působí inhibici enzymatické účinnosti, je možno identifikovat oblast bez produktu. V jednom z provedení je substrát enzymu chromogenní a vytváří se barevný produkt. To znamená, že přítomnost inhibitoru enzymu se projeví přítomností oblasti bez zbarvení. V dalším možném provedení je možno prokázat inhibici proteolýzy hemoglobinu nebo indikátorového enzymu jako alkalické fosfatázy přítomností opaktní zóny v polotuhé matrici. K tomuto jevu dochází proto, že přítomný inhibitor proteolýzy brání degradaci hemoglobinu nebo indikátorového enzymu.
Je dobře známo, že bio-oligomerem s enzymatickou účinností, účinností koenzymu nebo schopností působit inhibici enzymatické účinnosti může být peptid. Zvláštní význam mají
-23 CZ 289365 B6 usměrněné nebo cyklické peptidy, které mohou dát vznik katalytickým místům nebo zónám, jak již bylo svrchu popsáno v odstavci 2.1.
Mimoto je možno předpokládat, že bio-oligomer, vázaný na nosič může mít enzymatickou účinnost nebo účinnost koenzymu, kdežto volný bio-oligomer může být neúčinný. To může být způsobeno také tím, že molekuly bio-oligomeru jsou přítomností nosiče, na němž jsou vázány, vlastně zhuštěny. Bio-oligomer také může způsobit inhibici účinnosti enzymu nebo koenzymu po uvolnění z částice nosiče. Bylo by také možno chemicky zabudovat známé enzymy (kofaktory) do usměrněného bio-oligomeru k simulaci jednoduchého nebo komplexního enzymu včetně, například, řetězce pro transport elektronů.
5. Způsoby charakterizace bio-oligomeru
Jakmile je identifikována částice nosiče s hledanými vlastnostmi některou z metod podle svrchu uvedeného odstavce 4, je možno stanovit strukturu a celý řetězec identifikovaného biooligomeru.
V případě, že bio-oligomerem je peptid, je vhodnou metodou analýzy řetězce Edmanova degradace. Zvláště výhodné je automatické analyzování řetězce, například při použití Applied Biosystems 477A Protein Sequencer. Je také možno určit řetězec aminokyselin v peptidu buď bombardováním rychlými atomy v hmotové spektroskopii (FAB-MS) nebo dalšími analytickými postupy.
Řetězec peptidů je možno analyzovat buď na nosiči nebo po odštěpení zpěvného nosiče. K odštěpení peptidů se na oddělené částice nosiče speptidem působí obvyklými činidly pro odštěpení polymerů od pevného nosiče. Volba činidla pro toto odštěpení závisí na použitém pevném nosiči, například k odštěpení peptidů z pryskyřice Wang je výhodné použití 50% kyseliny trifluoroctové (TFA) v dichlormethanu.
Je také možno postupovat tak, že se izoluje jediná pevná fáze nosiče, například jeho částice s navázáním biooligomerem a tato částice se přidá do analyzátoru, aniž by byl bio-oligomer předem od částice odštěpen. Například v případě, že bio-oligomerem je peptid, obsahuje jediná částice pryskyřice s průměrem 100 μπι se substitucí pryskyřice 0,5 mekv/g přibližně 200pmol peptidu. Jediná částice piyskyřice obsahuje přibližně 3 125 pmol peptidu. V případě současných automatických analyzátorů řetězce je pro spolehlivou analýzu zapotřebí pouze 5 až 10 pmol peptidu. Je tedy zřejmé, že jediná částice pryskyřice PAM s průměrem 100 gm obsahuje více než dostatečné množství peptidu pro analýzu řetězce.
V případě, že peptidy obsahují aminokyseliny nebo látky, podobné peptidům, které nejsou přístupné Edmanově degradaci, je možno částice připravit tak, aby 10 až 50% peptidů neobsahovalo zbytek, který uvedené metodě odolává. Zbývající řetězce je pak možno stanovit a řetězce s nestanovitelným zbytkem odvodit extrapolací.
Dalším způsobem, který je možno použít pro zbytky, které nelze běžným způsobem analyzovat je dočasná ochrana části peptidu před vazbou uvedeného zbytku v průběhu syntézy banky.
V průběhu následné identifikace struktury se užije Edmanova degradace až k uvedenému zbytku, pak se odstraní ochranná skupina a analyzuje se druhá polovina (C-terminální část) řetězce až k uvedenému zbytku.
Při spektrofotometru s bombardováním rychlými atomy je patrně možno analýzu uskutečnit nejúčinněji. Detekcí fragmentů i typu bio-oligomeru je možno rekonstruovat celý řetězec. Při provedení hmotové spektrometri (Finnigan MAT) je možno současně získat údaje o struktuře i analýzu řetězce.
-24CZ 289365 B6
Jakmile je stanoven řetězec bio-oligomeru, je možno syntetizovat jeho velké množství chemicky automatickým zařízením nebo jinými biologickými nebo chemickými postupy. Je v něm také možno měnit některé části ke zvýšení jeho specifické biologické účinnosti.
6. Látky pro léčebné a diagnostické účely z bank nahodilých bio-oligomerů.
Jakmile byl určen řetězec příslušného bio-oligomeru, je podle vynálezu možno získat molekuly, které obsahují řetězec bio-oligomeru pro použití k léčebným nebo diagnostickým účelům. Řetězec bio-oligomeru může sám o sobě být diagnostickou nebo léčebnou látkou nebo jej je možno zabudovat do větší molekuly. Molekulu, obsahující řetězec bio-oligomeru s biologickou nebo vaznou účinností je možno označit jako „efektorovou molekulu“. Vynález dále poskytuje banky pro použití k různým účelům. „Efektorová“ funkce uvedené efektorové molekuly může být kterákoliv z funkcí, které byly svrchu popsány nebo které jsou v oboru známy.
Popsaný postup je nejen novým nástrojem pro vyhledávání specifických ligandů diagnostické nebo léčebné hodnoty, nýbrž poskytuje také důležitou informaci o celé řadě ligandů nebo potenciálně velmi se lišících primárních řetězců nebo chemických sloučenin, které mohou být přesto schopné interakce s toutéž molekulou akceptoru. Po integraci takové informace s molekulovým modelováním a moderní počítačovou technikou bude patrně možno získat hlubší porozumění interakcí ligandů a receptorů.
Léčiva zahrnují molekuly efektoru, který se váže na biologicky aktivní polohy cytokinů, růstových faktorů nebo hormonálních látek a tím podporuje nebo neutralizuje jejich užitek a může blokovat nebo podporovat také transkripci a/nebo translaci.
Léčiva zahrnují také efektorové molekuly, které se mohou vázat na receptor, farmakologicky zajímavý, například na receptor růstového faktoru, nervového přenašeče nebo hormonu. Tyto molekuly je možno použít jako agonisty nebo antagonisty působení přírodních ligandů.
Dalším využitím efektorové molekuly, schopné se vázat na receptory, je její použití k vazbě za účelem blokování vazby virů nebo mikroorganismů, které si získávají přístup do buňky vazbou na normální buněčné receptory. Příkladem tohoto jevu může být virus lidské imunodeficience na receptor CD4 a vazba viru herpes simplex na receptor růstového faktoru fibroblastů. Efektorové molekuly, které „obsadí“ receptor je možno použít jako farmakologicky účinné látky, které blokují virovou infekci na cílových buňkách. Podobným způsobem by bylo možno dosáhnout inhibice invaze parazitů do buňky po identifikaci vhodných efektorových molekul způsobem podle vynálezu.
V dalším provedení je možno použít efektorovou molekulu, obsahující řetězec bio-oligomeru, který se váže na molekulu akceptoru jako cíl pro toxin nebo jinou látku. Ve výhodném provedení je akceptorovou molekulou receptor nebo antigen na povrchu nádorové buňky, živočišného parazita nebo mikroorganismu, například bakterie, viru, jednobuněčného parazita, jednobuněčného patogenního mikroorganismu, houby nebo plísně.
Mimoto je možné, že několik bio-oligomerů z mnoha milionů, přítomných v baňce bude mít řetězce s biologickou účinností. Je zásadně možno izolovat bio-oligomery, které mají protinádorovou, antiparazitámí nebo antimikrobiální, například protihoubovou, antibakteriální, antiparazitámí nebo protivirovou účinnost. Mimoto mohou být některé z těchto bio-oligomerů agonisty nebo antagonisty růstových faktorů, jako erytropoetinu, epidermálního růstového faktoru, růstového faktoru nádorů, růstového faktoru fibroblastů a také hormonů, nerovových přenášečů, imunomodulátorů nebo jiných řídicích molekul. V jednom zmožných provedení jsou bio-oligomerem peptidy.
-25CZ 289365 B6
Léčiva podle vynálezu také zahrnují efektorové molekuly, obsahující řetězce bio-oligomeru s vysokou afinitou pro léčiva, například pro digoxin, benzodiazepam, heroin, kokain nebo theofylin. Takové peptidy je možno použít jako antidota při předávkování takových léčiv. Podobně je možno efektorové molekuly s obsahem léčiv vázat na malé molekuly, nebo také na kovové ionty včetně iontů těžkých kovů. Řetězce bio-oligomerů s vysokou afinitou k bilirubinu by mohly být užitečné při léčení hyperbilirubinemie novorozenců.
Obecně je možno uvést, že vynález poskytuje možnost identifikace řetězce bio-oligomerů pro léčebné účely při léčení nemocí a chorobných stavů, tak jak jsou uvedeny například vProduct Category Index of the Physicians Desk Reference PDR, 1991, 45. vydání, Medicinal Economics Data: Oradall, NJ, str. 201-202. Je například možno identifikovat efektorovou molekulu s účinkem antiparazitámím, antikoagulačním, antagonistickým proti antikoagulantním, antidiabetickým, protikřečovým, antidepresivním, protiprůjmovým, antidotálním, antigonadotropinovým, antihistaminovým, antihypertenzivním, protizánětlivým, protizvracivým, protimigrenózním, antiparkinsonickým, proti shlukování destiček, protisvědivým, antipsychorickým, antipyretickým, antitoxinovým (například protijedovým), bronchodilatačním, vasodilatačním, chelatačním, kontraceptivním, relaxačním na svalovou tkáň, antigluakomatózním nebo sedativním.
Léčivé prostředky podle vynálezu mohou také obsahovat příslušné, z farmaceutického hlediska přijatelné nosiče, ředidla a pomocné látky. Farmaceutické nosiče mohou být sterilní kapaliny, například voda a oleje včetně ropy, z tuků živočišného, rostlinného nebo syntetického původu, jako jsou podzemnicový olej, sójový olej, minerální oleje, sezamový olej a podobně. Voda je výhodným nosičem v případě, že se farmaceutický prostředek podává nitrožilně. Jako kapalné nosiče je možno použít také roztoky chloridu sodného, zejména fyziologický roztok a roztoky dextrózy aglycerolu ve vodě, zvláště pro injekční roztoky. Vhodnými farmaceutickými pomocnými látkami jsou škrob, glukóza, laktóza, sacharóza, želatina, slad, rýžová mouka, křída, silikagel, uhličitan hořečnatý, stearan hořečnatý, stearan sodný, glycerolmonostearát, mastek, chlorid sodný, sušené odstředěné mléko, glycerol, propylenglykol, voda, ethanol a další. Farmaceutické prostředky mohou mít formu roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, prášků, lékových forem se zpomaleným uvolňováním účinných látek apod. Vhodné farmaceutické nosiče byly popsány v publikaci Remingtonů Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin. Obvyklé farmaceutické prostředky obsahují účinné množství léčiva spolu s vhodným množstvím nosiče tak, aby vznikla léková forma, vhodná pro podání nemocnému. Nitrožilní injekce je sice velmi účinnou formou podání, je však možno použít i další formy, například injekční podání jinou cestou, perorální, nosní nebo jiné parenterální podání.
Molekula, obsahující řetězec bio-oligomeru, určený způsobem podle vynálezu, může být užita také pro výrobu diagnostického prostředku. Diagnostický prostředek může obsahovat jeden nebo větší počet řetězců bio-oligomerů podle vynálezu, například více než jeden peptidový řetězec. Mimoto může diagnostický prostředek obsahovat kterýkoliv z nosičů, které byly popsány svrchu pro farmaceutické léčebné prostředky.
Pod pojmem „diagnostický prostředek“ se rozumí prostředek, který je možno použít pro detekci určitého stavu nebo jevu, jako například nádoru, jako lymfomu zT nebo B-buněk nebo infekčního onemocnění, jak již bylo svrchu uvedeno. Pojem detekce se užívá v nejširším smyslu tak, aby zahrnoval průkaz existence stavu, místa nebo části těla, účastnící se stavu, nebo aby bylo možno rozpoznat závažnost stavu. Například je možno komplex imunoperoxidáza z křenu a peptid nebo podobnou imunochemicky účinnou látku použít k detekci a kvantifikaci specifického receptoru nebo molekuly protilátky ve tkáni, séru nebo jiné tělesné tekutině. Diagnostické prostředky je možné použít in vivo i in vitru. Vynález poskytuje zejména použitelné a užitečné diagnostické prostředky pro použití v imunologických zkouškách, hybridizaci Southem nebo Northem blot a pro zkoušky in šitu.
-26CZ 289365 B6
Mimoto může diagnostické činidlo obsahovat jednu nebo větší počet značících prostředků, například radioizotopy, fluorescenční látky, paramagnetické látky nebo jiné látky, usnadňující zobrazení. Odborník zná škálu těchto látek a způsoby jejich zařízení do diagnostických prostředků.
Farmaceutické prostředky, určené pro léčení a diagnostické prostředky podle vynálezu je možno použít pro léčení a pro diagnózu u živočichů, s výhodou savců včetně člověka, avšak také psů, koček, koní, krav, vepřů, morčat, myší a krys. Léčebné a diagnostické prostředky je možno použít také k léčení a/nebo diagnostice chorob rostlin.
Onemocnění a stavu, přístupné pro léčení nebo diagnózu pomocí bio-oligomerů podle vynálezu jsou velmi různé, stejně jako permutace struktury banky nahodilých bio-oligomerů. K osvětlení některých provedení, nikoliv však k omezení rozsahu vynálezu budou dále uvedeny některé specifické příklady použití vynálezu.
6.1 Cytotoxické prostředky
Molekula, tvořená řetězcem bio-oligomeru může sama o sobě mít specifickou cytotoxickou účinnost. Bio-oligomer, který se váže na příslušný akceptor může také být modifikován postupy, které jsou v oboru běžně známé, například konjugací s cytotoxickou sloučeninou, jako drogou nebo radionuklidem, čímž vznikne cytotoxická molekula. Bio-oligomer, například peptid, může „zaměřit“ účinek cytotoxické sloučeniny a specificky zprostředkovat zničení buněk, na něž jsou vázány určité akceptorové molekuly. Je například možno konjugovat cytotoxickou látku tak, aby došlo k odstranění nežádoucích populací B-buněk, například v případě lymfomu zB-buněk, populace T-buněk nebo lymfomy zT-buněk u nemocného. Potenciální klinická aplikace zahrnuje léčbu autoimunních chorob lymfomů a specifickou imunosupresivní léčbu v případě transplantací orgánů. Tímto způsobem by bylo pravděpodobně možno léčit také ty formy nádorů, při nichž nádorové buňky produkují ligand schopný vazby na receptor, jako tomu je v případě karcinomu mléčné žlázy a vaječníků, kde hraje svou úlohu pravděpodobně receptor epidermálního růstového faktoru EFG.
Cytotoxické látky, specifické pro cílovou buňku, například buňky zhoubného nádoru nebo buňku, napadenou virem, avšak nejedovaté pro okolní zdravé buňky, tkáně nebo orgány by rovněž mělo být možné tímto způsobem získat. Bude možno nejen cíleně odstranit nežádoucí buňky, jako nádorové buňky, nýbrž využít některých toxinů také jako účinných antimikrobiálních látek. Zejména jde v tomto případě o bakteriostatika, bakteriocidní látky, protivirové látky, antiparazitámí látky nebo fungicidní sloučeniny. Podobně je možno identifikovat i toxiny s insekticidním nebo herbicidním účinkem.
V jednom z možných provedení může být bio-oligomerem peptid. Tento peptid může být látkou, napomáhající zasáhnout cíl, k němu je připojen toxin. V jiném možném provedení může peptid splnit obě úlohy a účinkovat jako látka, zasahující cíl i jako toxin.
6.2 Modifikátory imunity
Podle vynálezu je možno získat molekuly a prostředky pro použití k modifikaci imunologické odpovědi. Pod tímto pojmem se rozumí molekuly nebo sloučeniny, schopné způsobit změny v imunologickém systému. Zvláště mohou modifikátory imunity stimulovat nebo způsobit inhibici odpovědi T-buněk, B-buněk a také nespecifické imunologické odpovědi, tak jak jsou zprostředkovány činností makrofágů, neutrofilů, polymorfonukleámích fagocytámích buněk, granulocytů a jiných buněk myeloidní linie. Efektorové molekuly je možno použít k ovlivnění následujících imunologických stavů:
-27CZ 289365 B6
a) různá autoimunologická onemocnění jako myasthenia gravis, roztroušená skleróza, Graveho onemocnění, revmatoidní arthritis, systemický lupus erythematosus (SLE), pemphigus vulgaris, autoimunologická hemolytická anemie a trombocytopenie,
b) lymfom j iného než Hodgkinova typu a další zhoubná onemocnění,
c) alergie
d) komplex imunologických chorob,
e) odmítnutí transplantovaných orgánů,
f) infekční onemocnění a
g) diabetes mellitus.
Modifikátory imunologické odpovědi mohou stimulovat imunologickou aktivitu tak, že napodobují účinnost lymfokinu jako interleukinu IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, faktoru, stimulujícího tvorbu kolonií granulocytů CSF nebo makrofágů a granulocytů/makrofágů a podobně. Ke 20 stimulaci může dojít účinností peptidu, který se váže na vazný řetězec receptoru lymfokinu nebo oligonukleotidem zprostředkovanou aktivaci buněčného ústrojí pro transkripci. Modifikátor imunologické odpovědi může působit vazbou na leukocyt nebo lymfocyt, jako F-receptor, LAF1, LAF-2 apod., indukcí účinnosti, například fagocytózy nebo uvolnění cytotoxinů. Efektorová molekula podle vynálezu může působit také jako chemotaxin.
Ve zvláštním provedením může molekula, obsahující bio-oligomer napodobovat antigen. Pak může být bio-oligomer vhodnou vakcínou k vyvolání aktivity T-buněk nebo B-buněk, specifické pro určitý patogen. Antigen (epitop) je možno použít také k zesílení specifické imunologické odpovědi.
Je zřejmé, že efektorové molekuly podle vynálezu budou účinné v uvolněné formě. Avšak určitý bio-oligomer může mít vyšší účinek v případě, že zůstane vázán na pevný nosič. Zejména vysoká hustota napodobeného epitopu může daleko účinněji stimulovat odpověď B-buněk svou vazbou na imunoglobulin membrány nebo zprostředkovat jinou odpověď přes příslušný receptor.
Bude patrně možno použít také omezené banky podle vynálezu jako vakcíny v případě patogenů, které mají různé epitopy. Je například známo, že primární struktura (řetězce) v průběhu infekce s časem. Změnou epitopu VSG unikne tiypanosoma imunologickému rozpoznání. Podobně parazit, vyvolávající malárii má tu vlastnost, že u něj dochází k expresi různých antigenních 40 epitopů v různých jeho druzích v různých fázích životního cyklu. Znamená to, že pomocí banky s omezenou diverzitou by bylo možno dosáhnout imunizace proti variabilním antigenům, produkovaným parazity, vyvolávajícími malárii a proti trypanosomám. Omezená banka může mít své použití jako vakcína v jakémkoliv případě, kdy je požadována imunita proti celé skupině antigenů.
Je pravděpodobné, že efektorové molekuly mohou také způsobit inhibici imunologické odpovědi tak, že
i) blokují specifickou imunologickou odpověď na úrovni protilátky nebo receptoru antigenů v T-buňce, ii) blokování receptoru F nebo jiného receptoru, iii) vazbou na lymfokiny a cytokiny s následnou inhibici účinnosti těchto látek a
-28CZ 289365 B6 iv) negativními zpětnými signály, přiváděnými k buňkám, které zprostředkují imunologickou odpověď.
Efektorové molekuly je možno použít k dosažení tolerance imunologického systému například pro autoimunní antigeny. Například tolerance imunologického systému k DNA by bylo možno dosáhnout pomocí oligonukleotidu nebo banky oligonukleotidů, tento postup by mohl být úspěšný při léčbě SLE. Mimoto by mohlo být dosaženo inhibice imunního systému způsobem, popsaným svrchu v odstavci 6.1.
Mimoto mohou farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahovat vybrané syntetické peptidy santigenním účinkem, jimiž by bylo možno dosáhnout tolerance imunologického systému k určitému antigenu a tak potlačit nebo i vyléčit odpovídající autoimunologické onemocnění. Podobně by bylo možno při použití specifických syntetických antigenních peptidů způsobit inhibici tvorby vícesložkových imunologických komplexů a tím i zabránit vzniku složitých imunologických onemocnění.
Peptidy, schopné vazby na monoklonální protilátky, specifické pro nádory je možno izolovat, analyzovat jejich řetězec a syntetizovat pro použití jako imunogeny k indukci aktivní imunity proti nádoru.
Specifické peptidy s vysokou afinitou vzhledem k receptorům FC by mohly být použity jako léčiva k blokování receptorů FC retikuloendotheliálního systému, což by bylo příznivé pro nemocné s autoimunologickými chorobami, jako jsou idiopatická trombocytopenie nebo autoimunologická hemolytická anemie.
Možnosti pro použití peptidů k léčebným účelům by mohly být ještě širší. Peptidy, napodobující epitopy invadujících organismů by mohly být použity k zastavení infekce organismu. Například současné výsledky studií sAIDS prokázaly, že infekce virem AIDS začíná rozpoznáním a vazbou mezi specifickým glykoproteinem (gpl20) na obalu viru AIDS a povrchovým receptorem CD4 buňky. V případě podání peptidu, napodobujícího gpl20 je možno dostatečným způsobem blokovat receptor CD4, takže virus AIDS se na tento receptor nebude moci vázat a nebude tedy ani schopen infikovat buňku. Podobně by bylo možno dosáhnout inhibice invaze parazitů a infekcí.
6.3 Neuroaktivní agonisté a antagonisté
Je pravděpodobné, že efektorové molekuly podle vynálezu budou agonizovat (nebo napodobovat účinek) nebo antagonizovat (působit inhibic) účinků hormonů, nervových přenášečů, analgetik, anestetik, antipsychotik, antidepresivních látek nebo narkotik. Takové efektorové molekuly by mohly být užitečné pro získání regulátorů chuti kjídlu, psychiatrických léčiv, modulátorů schopnosti se soustředit a zapamatovat si apod. Vynález je možno také využít k modifikaci vnímání určitých podnětů, bylo by například možno navodit pocity „sladké“ nebo „slané“ chuti apod.
7. Omezené banky
Je dále možno předpokládat, že omezené banky podle vynálezu by mohly být zdrojem komplexních chutí, například typů různých koření při nižší ceně a bez případných alergických reakcí. Bylo by tak možno nahradit nákladná koření, například šafrán nebo vytvořit nové kombinace chutí.
V dalším provedení může být omezena banka zcela zvláštním chromatografíckým materiálem. Je možno předpokládat, že banka bio-oligomerů, například peptidů s některými společnými
-29CZ 289365 B6 chemickými vlastnostmi, avšak s řadou různých řetězců bude vhodnějším chromatografickým materiálem než současně dostupné materiály. Tyto materiály například budou selektivnější než iontoměničové materiály nebo materiály v reverzní fázi. Čištěnou molekulu by také bylo možno z nosiče vymývat snadno a za šetrnějších podmínek, než jaké je možno použít například při provádění imunoafinitní chromatografie, čímž současně bude méně pravděpodobná denaturace čištěné látky. V jednom z možných provedení je možno připravit nosič na základě složení nebo struktuiy bio-oligomeru, tak aby došlo k požadovanému stupni afinity nebo k vazbě na specifické molekuly akceptoru ve vysoké koncentraci. Mimoto by bylo možno rychle identifikovat vysoce selektivní nosič bez použití čištěného materiálu, jak bylo také svrchu popsáno v odstavci 4.1.
V dalším možném provedení je možno připravit částice nosiče s nízkou afinitou a omezenou banku připravit s použitím určitých částic nosiče. V ještě dalším možném provedení je k chromatografickým účelům možno použít částice nosiče s nízkou nebo vysokou afinitou, nesoucí jeden nebo několik řetězců bio-oligomeru, identifikovaných z milionů řetězců podle vynálezu.
Vynález bude dále osvětlen následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu na popsaná provedení.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Syntéza tetrapeptidové banky
Způsob podle vynálezu byl použit pro přípravu tetrapeptidové banky s peptidy vzorce X-X-XTrp, kde X může znamenat valin, serin nebo alanin a první aminokyselinou je vždy tryptofan. Tryptofan byl zvolen pro karboxy-terminální zakončení k usnadnění spektrofotometrického sledování při OD28o.
Nalfa-Fmoc-tryptofan-alkoxymethylpolystyrenová pryskyřice, popsaná v publikaci Wang, 1973, J. Amer. Chem. 95: 1328-1333 (Bachem lne., Torrence, Ca.) byla vložena do nádoby pro běžné provádění syntézy peptidů na pevném nosiči. Pro přidání byly užity rovněž Fmoc-aminokyseliny (Bachem lne.). Další reakční složky byly voleny z běžných složek, obvykle užívaných při syntéze na pevném nosiči, tak jak jsou popsány například v Austen, 1988, „Peptide Synthesis“, Methods in Molecular Biology, sv. 3. str. 311-331.
Pro vazné reakce byla použita nádoba s víkem, povlečeným teflonem a k míšení jednotlivých podílů nosiče po provedené reakci byla rovněž použita standardní nádoba pro provádění syntézy na pevném nosiči.
Přibližně 0,5 g Fmoc-Trp-alkoxymethylové pryskyřice bylo nabobtnáno ve 20 ml dichlormethanu (DCM). Pak byla pryskyřice dvakrát promyta DCM, jednou směsí DCM a dimethylformamidu 1:1 a třikrát dimethylformamidem (DMF). Pak byla pryskyřice zbavena ochranných skupin působením 20% piperidinu v DMF (objemová %). Po důkladném promytí pryskyřice, zbavené ochranných skupin 3 x DMF, 3 x DCM a 2 x směsí DCM a DMF 1:1 byla pryskyřice znovu uvedena do suspenze v přibližně 7,5 ml DMF a rozdělena na tři podíly o přibližně 2,5 ml a pak rozdělena do tří očíslovaných zkumavek pro uskutečnění další vazby.
Na pryskyřici již je navázán tryptofan, k materiálu se nyní přidá množství chráněné aminokyseliny, odpovídající množství vázaného tryptofanu. Pro každou aminokyselinu, která má být navázána se užije pětinásobného molámího přebytku aminokyseliny, který se přidá do nádoby, v níž se již nachází podíl promyté pryskyřice. Do každé nádoby se přidá pětinásobný
-30CZ 289365 B6 molámí přebytek jiné aminokyseliny. Pak se každá nádoba dvě minuty protřepává, načež se přidá pětinásobný molámí přebytek diizopropylkarbodiimidu (DIC) ve 3 ml DCM, načež se směs ještě 1 hodinu protřepává.
Aby bylo možno kontrolovat úplnost vazby, byl vzorek z každé zkumavky zkoušen ninhydrinovým reakčním činidlem (Pierce Chemical) způsobem, popsaným v Sarin a další, 1981, Anal. Biochem. 117: 147-157. V případě, že vazná reakce není zcela dovršena, jak je možno tímto testem prokázat, pokračuje se v reakci až do jejího dovršení, čehož je možno dosáhnout několika známými způsoby, například
a) druhou vazbou při použití jedno- až pětinásobného přebytku chráněné aminokyseliny,
b) další vazbou při použití odlišných nebo přídatných rozpouštědel, například trifluorethanolu, nebo
c) přidáním chaotropických solí, například NaC104 nebo LiBr (Klis a Stewart, 1990, „Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier a Marshall eds, ESCOM Publ., str. 904-906.
Po dovršení vazby se pryskyřice ze tří zkumavek, v nichž byla vazba provedena pečlivě přenesou a smísí v jediné mísící nádobě. Pak se pryskyřice dvakrát promyje DCM/DMF (1:1), 3 x DCM, 3 x DMF a pak se odstraní ochranné skupiny působením 20% piperidinu v DMF (% objemová). Po důkladném promytí DCM a DMF svrchu uvedeným způsobem se směs opět rozdělí na tři podíly a tyto podíly se přenesou do tří oddělených reakčních nádob. Pak se přidá druhá skupina aminokyselin. Po ukončení vazby se opět nejprve odstraní ochranné skupiny působením 20% piperidinu, pak se pryskyřice důkladně promyje DCM a DMF ta, jak bylo svrchu popsáno. Pak se stejným způsobem uskuteční vazba třetí aminokyseliny.
K odštěpení peptidů z pevného nosiče se k částicím pryskyřice přidá 30 ml 50% (% objemová) kyseliny trifluoroctové TFA, 5 % anisolu a 0,9 % (objemových) ethandithiolu v DCM: Pak se směs čtyři hodiny protřepává a supematant s obsahem peptidů se oddělí. Pak se supematant odpaří na rotačním odpařovači a peptidy se vysráží etherem. Po důkladném promytí se sraženina peptidů suší a je připravena pro další analýzu. Lyofilizovaný peptid (ve formě prášku) se skladuje ve zmrazeném stavu.
Příklad 2: Srovnání způsobu podle vynálezu s běžnou metodou syntézy peptidů
Materiály a metody
Banka nahodilých tetrapeptidů byla připravena svrchu popsaným způsobem (příklad 1). Mimoto byla připravena banka tetrapeptidů při použití syntézy běžného typu na pevném nosiči (dále SPPS), tak jak byla popsána ve svrchu uvedené publikaci Austenově. Jako kombinace pevného nosiče a aminokyseliny byla užita Nalfa-Fmoc-tryptofa-alkoxymethylová pryskyřice (Bachem, lne.). V průběhu každého stupně vazby bylo do reakční nádoby přidáno pětinásobné molámí množství N^-Fmoc-valinu, Na,fa-Fmoc-serinu (O-Bu) a N^-Fmoc-alaninu. Po třech po sobě následujících stupních vazby bylo tetrapeptidy odštěpeny působením 50% TFA, 5% anisolu a 0,9% ethandithiolu (jde vždy o % objemová) v DCM způsobem podle svrchu uvedené Austenovy publikace.
Výsledky
Obě peptidové banky byly analyzovány na HPLC chromatografickém sloupci C-18 v reverzní fázi (Vydac), aby bylo možno prokázat počet různých peptidů v bance (počet vrcholů), relativní
-31 CZ 289365 B6 koncentraci těchto peptidů (plocha vrcholů) a relativní hydrofilní povahu peptidů (časná nebo pozdní eluce ze sloupce). Výsledky jsou znázorněny na obr. 1. Chromatogram v horní části (obr. 1A) byl získán při použití banky peptidů podle vynálezu, který chromatogram ve spodní části (obr. 1B) byl získán při použití SPPS.
V obou částech je možno odlišit 21 vrcholů, což ukazuje na přítomnost alespoň 21 odlišných peptidů v každé bance. Avšak v chromatogramu, získaném při použití SPPS jsou podstatně větší vrcholy 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 7, což znamená, že banka obsahovala větší koncentraci peptidů 1 až 7 než peptidů 8 až 21. Zvýšené množství peptidů 1 až 7 prokazuje, že tyto peptidy byly přednostně syntetizovány na úkor peptidů 8 až 21. Mimoto docházelo u těchto vrcholů k časné eluci ze sloupce, to znamená, že uvedené peptidy měly kratší dobu retence ve sloupci a měly tedy hydrofilnější povahu než ostatní peptidy 8 až 21.
Tento výsledek nebyl při použití systému SPPS neočekávaný. Je známo, že valin je hydrofobní a má podstatně pomalejší rychlost vazby (patrně vlivem sterické zábrany) než je rychlost vazby alaninu nebo šeřinu. To znamená, že při běžné nahodilé vazbě svrchu uvedeným způsobem, při níž se valin dostává do „kompetice“ při vazbě společně s alaninem a serinem musí dojít k tomu, že syntetizované peptidy jsou na valin chudé a že tedy v získané bance není distribuce nahodilých peptidů ekvimolámí.
Na druhé straně je z chromatogramu banky nahodilých peptidů, získané způsobem podle vynálezu, zřejmá ekvimolámí distribuce peptidů v bance. Přestože plocha vrcholů 3, 6, 12, 13 a 18 je přibližně dvojnásobná než plocha vrcholů ostatních, což ukazuje na přítomnost dvou peptidů v tomto místě, většina ze zbývajících 16 vrcholů má téměř totožnou plochu. Mimoto všech 21 vrcholů je rovnoměrně rozloženo po celkové době retence, což rovněž prokazuje ekvimolámí distribuci jednotlivých peptidů.
U vybraných vrcholů byl analyzován řetězec. Analýza řetězce byla provedena u menších vrcholů 8, 9 a 21 a u velkého vrcholu 6. K analýze bylo použito automatického zařízení (Apllied Biosystems 477A) s následujícím výsledkem:
vrchol 8: Val-Ala-Ser-Trp, vrchol 9: Val-Ser-Ala-Trp, vrchol 21:Val-Val-Val-Trp, vrchol 6: (Ser-Val)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)-Trp.
Tyto valin obsahující řetězce potvrzují, že způsob podle vynálezu umožňuje uskutečnění skutečně nahodilé syntézy peptidů i v případě použití aminokyselin, o nichž je známo, že jejich rychlost vazby je nízká.
Řetězec pro vrchol 6 není vyčerpávajícím způsobem uveden vzhledem k tomu, že ve vrcholu se nacházelo pravděpodobně větší množství peptidů. Řetězce dvou hlavních peptidů však patrně jsou Ser-Ala-Ala-Trp a Val-Ser-Ser-Trp.
Závěry
Výsledky ukazují, že způsobem syntézy nahodilých peptidů podle vynálezu je možno získat banku nahodilých peptidů s v podstatě ekvimolámím množstvím jednotlivých peptidů na rozdíl od standardního postupu SPPS, při němž převažuje v bance ten peptid, který obsahuje zbytky aminokyselin s vyšší rychlostí vazby.
-32CZ 289365 B6
Příklad 3: Izolace peptidu jako ligandu, který se váže na molekulu receptoru
Aby bylo možno prokázat použitelnost způsobu podle vynálezu pro izolaci určitého peptidu, byl syntetizován peptid, obsahující 12 aminokyselin s předem stanoveným řetězcem produktu genu V-mos. V-mos je onkogen, izolovaný z myšího sarkomu a je příbuzný viru Moloneyova sarkomu u myší. Je známo, že produkt genu V-mos má aktivitu serin/threoninkinázy.
Materiály a metody
Řetězec Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala byl syntetizován na polyakrylamidové části o průměru přibližně 300 pm při použití Nalfa-Fmoc-aminokyselin a reakčních činidel a postupů, užívaných při běžné syntéza peptidů na pevném nosiči. Ochranné skupiny na postranním řetězci byly odstraněny 50% TFA, peptid zůstal kovalentně vázán na polyakrylamidovou pryskyřici přes linker, ethylendiamin-kyseliny aminokapronové, čímž byla získána konečná struktura Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala-aminokapronová kyselina-ethylendiaminová pryskyřice (dále bude tento materiál uváděn jako dlouhá v-mosčástice). Tento řetězec peptidu odpovídá zbytkům 100 až 111 v produktu genu v-mos.
Při použití téže metody byl syntetizován kratší peptid ze zbytků 106 až 111 produktu genu v-mos s řetězcem Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala, rovněž na polyakrylamidové částici při použití téhož linkeru (krátká v-mos-částice). Tento peptid byl užit jako negativní kontrola.
Buněčná linie hybridomu, produkující myší monoklonální protilátku, specifickou pro dlouhý v-mos-peptid, známou jako anti-v-mos (hybridom č. 165-2847, SCRF 354, šarže č. 165-119) byla získána od Microbiological Associates lne., Maryland. Při zkoušce Elisa detekuje tato protilátka homologní řetězec produktů genu v-mos, a to MOS, neu/HER-1 a HER-2. Je známo, že uvedená protilátka má jen zanedbatelnou afinitu pro krátký peptid v-mos. Sekundární kozí protilátka proti IgG myši(specifická pro lehký a těžký řetězec), značená alkalickou fosfatázou, byla získána od Sigma.
Při použití běžné techniky pro získání monoklonálních protilátek podle publikace Methods in Enzymology, sv. 121 (186) byly získány monoklonální protilátky ve formě ascitu a byly pak čištěny na sloupci G pro bílkoviny (Pharmacia).
Výsledky
Dlouhé v-mos-částice byly smíseny s tisícinásobným přebytkem krátkých v-mos-částic. 2 ml čištěné monoklonální protilátky anti-v-mos (1 pg/ml) v PBS s 0,1% Tween 20 bylo přidáno ke směsi krátkých a dlouhých částic v-mos a směs byla inkubována při teplotě místnosti 1 hodinu za šetrného míchání. Pak byla částice promyty na malém polypropylenovém sloupci pro jedno použití (Isolab), v němž byly částice zachyceny fritou. Pak byly částice smíseny s 2 ml sekundární protilátky na 1 hodinu při ředění 1 : 2 000. Po promytí byly částice uloženy do polystyrénové Petriho misky a po usazení byl supematant odstraněn a jako substrát byl opatrně přidán roztok 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu a tetrazoliumnitromodři.
Po inkubaci směsi 15 minut při teplotě místnosti se dlouhé v-mos-částici zabarvily purpurově na rozdíl od krátkých částic, které zůstaly bezbarvé. Tímto způsobem bylo možno okamžitě zjistit jedinou tmavou částici mezi tisíci bezbarvých částic. Možnost odlišení je zřetelně znázorněna na obr. 2 až 4, jde o fotografie ve zvětšení 40x. Na obr. 2 jsou znázorněny skupiny dlouhých vmos-částic, značené monoklonální protilátkou, na obr. 3 je znázorněna směs dlouhých a krátkých v-mos-částic, značených monoklonální protilátkou anti-v-mos a na obr. 4 je znázorněna rychlá
-33CZ 289365 B6 detekce jediné modré částice ve velké skupině bezbarvých částic. Částice, které obsahovaly hledaný řetězec peptidů byly tedy ihned odlišeny a izolovány od dalších částic v bance.
Po izolaci byl použit automatický analyzátor Applied Biosystems 477A ke stanovení N-terminálního řetězce aminokyselin z jediné dlouho v-mos-částice.
Závěry
Uvedený příklad prokazuje, že způsobem podle vynálezu je skutečně možno vyhledat částici, obsahující bio-oligomerový ligand v tomto případě peptidový řetězec, v tisícinásobném přebytku jiných odlišných částic. Mimoto je z uvedeného příkladu zřejmé, že je možno tuto částici izolovat a analyzovat řetězec navázaného peptidů.
Příklad 4: Izolace kratšího peptidového ligandu, který se váže na molekulu receptoru
Aby bylo možno dále prokázat použití způsobu podle vynálezu pro izolaci určitého peptidů, byl syntetizován hexapeptid Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr na standardní piyskyřici PAM o velikosti částic 100 pm při použití Nalfa-Fmoc-aminokyselin a dalších reakčních činidel, běžně užívaných při syntéze na pevném nosiči.
Materiály a metody
Vazné reakce byly prováděny způsobem, který byl uveden svrchu v odstavci materiály a metody Příkladu 3. Ochranné skupiny na alfa-aminoskupině byly odstraněny působením 20% piperidinu, ochranné skupiny na postranním řetězci byly odštěpeny 50% TFA a peptid zůstal kovalentně vázán na polystyrénovou pryskyřici přes linker kyselina aminokapronová-beta-alanin, čímž byla získána struktura Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr-kyselina aminokapronová-beta-alaninpryskyřice. Tento peptidový řetězec odpovídá zbytkům 104 až 109 produktu genu v-mos, tak jak bylo svrchu popsáno v příkladu 3.
Stejně jako v příkladu 3 byly získány protilátky anti-v-mos z buněčné linie hybridomu, produkující myši monoklonální protilátky, specifické proti peptidů v-mos. Značená sekundární kozí protilátka proti myšímu IgG, značená alkalickou fosfatázou, byla získána od Sigma.
Výsledky
Přibližně 0,1 mg peptidů v-mos, vázaného na pryskyřici PAM bylo smíseno se stonásobným přebytkem částic Nalfa-Fmoc-alanin-PAM (Bachem lne.). 2 ml čištěné monoklonální protilátky (1 pg/ml) vPBS s 0,1 % Tween 20 bylo přidáno ke směsi peptidů na nosiči a inkubováno 45 minut při teplotě místnosti ze šetrného míchání.
Pak byly částice promyty na malém polypropylenovém sloupci pro jedno použití (Isolab), v němž byly částice zachyceny na fritě. Pak byla částice smíseny s 2 ml sekundární, alkalickou fosfatázou značené protilátky (ředění 1:100) na 1 hodinu. Po promytí byly částice rozloženy na skleněný filtr a namočeny do 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiozolinsulfonové kyseliny)ABTS jako substrátu spolu s H2O2. Po inkubaci 15 minut při teplotě místnosti na komplex piyskyřice PAM a v-mos-peptidu zbarvil tmavě zeleně. Na skleněném filtru se vytvořil malý světleji zelený lem. Většina pevného nosiče, neobsahujícího v-mos-peptid nereagovala s monoklonální protilátkou a nedošlo tedy ke změně barvy. Částice nosiče s v-mos-peptidem bylo proto možno snadno identifikovat.
-34CZ 289365 B6
Závěry
Tento příklad prokazuje, že hledaná molekula akceptoru nereaguje nespecificky s pevným nosičem, nýbrž reaguje specificky pro kombinaci pevného nosiče a peptidu. Stejně jako svrchu v příkladu 3 je možno izolovat pozitivně reagující částice nosiče a analyzovat řetězec peptidu.
Příklad 5: Stanovení ligandů pro streptavidin a monoklonální protilátku proti β-endorfinu
V tomto příkladu je dále ilustrován specifický přístup vynálezu k identifikaci peptidového ligandu.
Místo využívání biologického systému, například filamentózního fágu se pro tvorbu banky využívá chemické syntézy velkých peptidových bank, v nichž je každý peptid vázán na jednotlivou částici nosiče. Jednotlivé částice nosiče, specificky vázané na peptid se pak fyzikálně izolují a analyzuje se řetězec navázaného peptidu.
Přístup závisí na schopnosti chemicky syntetizovat velkou banku nahodilých peptidů a spojit ji s příslušnou izolací pro detekce a se systémem pro analýzu struktury.
Prostředkem, který vynález používá k vyřešení tohoto problému je rozdělení částic nosiče na skupiny jednotlivých podílů v průběhu každého vazného cyklu, přičemž každý podíl nosiče se nechá reagovat s jedinou aktivovanou aminokyselinou. Po dovršení vazby se různé podíly pryskyřice důkladně promísí, promyjí, odstraní se ochranné skupiny a po dalším promytí se pryskyřice znovu rozdělí na podíly pro nový cyklus vazby. Znamená to, že v jednom cyklu není žádná částice podrobena působení více než jedné aminokyseliny a na konci několika takových stupňů bude každá částice obsahovat jen jediný peptidový řetězec. Peptidová banka, vytvořená uvedeným způsobem bude teoreticky tvořena skutečně nahodilými peptidy. Mimoto bude obsahovat ekvimolámí množství všech peptidů. Celkové množství permutací a tím i výsledné množství peptidů bude záviset na počtu podílů a aminkyselin, zvolených pro každý vazný stupeň a na celkovém množství vazných stupňů při syntéze (délka peptidu).
Nový přístup pro současnou syntézu velkého množství peptidů současně nejen poskytuje možnost získat banku skutečně nahodilých peptidů v ekvimolámím množství, nýbrž vede také k získání banky peptidů na částicích pevného nosiče, kde každá částice nese pouze jediný řetězec peptidu. Tato poslední vlastnost je zcela zjištěna tím, že se při každé vazné reakci dostává částice do styku s jedinou aminokyselinou, přičemž reakce je vždy dovolena do konce. Toto pojetí reakce má zásadní význam pro úspěch nového postupu.
Pomocí nového syntetického způsobu podle vynálezu je možno syntetizovat prakticky jakoukoliv peptidovou banku s přesně definovaným složením. Je například možno použít až všech 20 přírodních L-amionokyselin v každém vazném stupni, každou pro jiný podíl částic, nebo je možno v každém stupni použít jen několik aminokyselin.
-35CZ 289365 B6
Materiály a metody
A) Syntéza peptidové banky
Byla syntetizována velká banka se strukturou Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-β-Ala-kyselina aminokapronováethylendiamin-pryskyřice (X = 19 ze 20 běžných aminokyselin s výjimkou cysteinu v každém vazném stupni). Částice pevného nosiče, zvoleného pro syntézu peptidů byly částice polydimethylakrylamidu, tj. PDA (Milligen lne., USA).
Syntéza peptidů při použití této piyskyřice byla prováděna způsobem podle publikace Atherton a Sheppard, 1988, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, IRL Press. Postup byl prováděn tak, že vždy 3 g pryskyřice (přibližně 2 miliony částic) byly šetrně míšeny přes noc s ethylendiaminem. Po důkladném promytí byla na pryskyřici navázána kyselina aminokapronová a pak β-alanin při použití Fmoc ochranných skupin, avšak bez odštěpitelného linkeru. V pěti následujících stupních byla syntéza provedena nahodile a odděleně bylo v každém vazném stupni použito všech 19 Fmoc-aminokyselin-OPfp s výjimkou cysteinu. Po ukončení pěti vazných stupňů byla ochranná skupina Fmoc odstraněna 20% roztokem piperidinu (% objemová) v DMF. Ochranné skupiny na postranním řetězci byly odstraněny směsí 90 % TFA, 1 % anisolu a 0,9% ethandietholu (% objemová). Pryskyřice byla neutralizována 10% diizopropylethylaminem v DMF a uložena v DMF při teplotě 4 °C.
Spojovník β-alanin-kyseliny aminokapronová-ethylendiamin je tvořen celkem 11 atomy uhlíku a 4 atomy dusíku a jeho největší délka je 17,6 x 10‘10 m. Vzhledem k tomu, že v každém vazném stupni bylo užito 19 různých aminokyselin, je teoretické množství získaných peptidů při pěti vazných stupních 195, tj. 2 476 099 peptidů v bance.
Jak již bylo drive uvedeno, obecně postup spočívá vtom, že se vytvoří velká banka nahodilých peptidů na jednotlivých částicích pevného nosiče tak, že každá částice obsahuje pouze jeden typ peptidů. Pak je možno snadno identifikovat částici, reagující s molekulou akceptoru, fyzikálně ji izolovat a analyzovat řetězec aminokyselin v peptidů pomocí Edmanovy degradace. Pro úspěch postupuje tedy nutná přesná identifikace peptidového řetězce na jediné částici nosiče. Při použití automatického analyzátoru bílkovin (Model 477A-01 Pulsed Liquid Automatic Protein/Peptide Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, Califomia) bylo běžně izolováno 50 až 500 pmol peptidů z každé částice nosiče. Mimoto bylo předběžnou analýzou (DiMarch a další, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology“ Proceedings of the Elevanth Američan Peptide Symposium, 9.-14. července 1988, La Jolla, Ca., ESCOM, Leiden, str. 229-230) prokázáno, že účinnost vazby peptidů na pevný nosič při syntéze byla vyšší než 98 %.
B) Specifická identifikace a selekce peptidových ligandů z banky
Identifikace a selekci specifických peptidových ligandů z banky nahodilých peptidů je možno snadno uskutečnit imunologickými postupy, například zkouškou ELISA, imunofluorescencí nebo při použití imunomagnetických částic. Při popsaných pokusech bylo při detekci použito imunohistochemických metod. Specificky se vážícími molekulami akceptoru, které byly při těchto zkouškách použity, byly
i) streptavidin, tj. bílkovina, která váže biotin, a ii) monoklonální protilátka proti endorfinu MAB.
Při použití bank s epitopy z filamentózních fágů (Cwirla a další, Delvin a další, oddíl 2 svrchu) bylo možno peptidové ligandy snadno identifikovat.
-36CZ 289365 B6
Při detekci částic, na něž se váže streptavidin bylo užito imunohistochemických postupů. Banka nahodilých peptidů byla šetrně promísena s postupně se zvyšujícím množstvím bidestilované vody k rozředění MDF. Pak byly částice důkladně promyty PBS a k blokování jakékoliv nespecifické vazby byla užita želatina v koncentraci 0,1 % hmotnostní. Pak byl k částicím za hodinového šetrného míchání přidán konjugát streptavidinu a alkalické fosfatázy (Pierce, Rockford, Illinois). Pak byly částice důkladně promyty a byl přidán standardní substrát, 5-brom4-chlor-3-indolylfosfát/tetrazoliová nitromodř (BCIP/NBT). Pak byly částice spolu s roztokem substrátu přeneseny do polystyrénových Petriho misek (15 misek s rozměry 100 x20mm) a reakce se nechala probíhat 2 hodiny. Částice nosiče s navázaným konjugátem streptavidinu a alkalické fosfatázy změnily barvu na temně modrou, kdežto většina částic banky zůstala bezbarvá.
C) Stanovení afinity peptidového ligandu
Afinita peptidového ligandu pro monoklonální protilátku proti β-endorfmu byla stanovena v roztoku v kapalné fázi. Při této zkoušce byla měřena inhibice vazby 5,0 nM 3H(Leu)enkefalinu (specifická aktivita 39,0 Ci/mmol), New England Nuclear, Boston, Ma) na 125— 200ng/ml Mab proti β-endorfinu působením peptidového ligandu v 1,0 ml 40 mM tris - HC1, 150 mM NaCl, pH 7,4 s obsahem 1,0 mg/ml albuminu ze séra skotu, 0,1 % objemových Tween 20 a 0,05 % hmotnostních azidu sodíku. Specifická vazba byla definována jako rozdíl mezi vazbou, naměřenou v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 1,0 μΜ neznačeného (Leu)enkeralinu. Navázaný radioaktivní ligand byl vysrážen přidáním 10-násobného přebytku Protein-GSepharosy (Pharmacia) a následnou inkubací přes noc při teplotě 23-24 °C. Protein-GSepharosa byla oddělena odstředěním (13 000xg na 5 minut), usazenina byla uvedena do suspenze ve 250 μΐ 5% (obj. %) kyseliny octové před přenesením do lahviček pro kapalinovou scintilaci. Hodnota IQ (n=3) byly stanoveny analýzou nasycení při použití pěti koncentrací radioaktivního vazného řetězce (1,87-30 nM) pro 3H(Leu)enkefalin, všechny zkoušky byly provedeny dvakrát při současném provedení nespecifické vazby jako kontroly. Průměrná hodnota IQ byla 9,79 ± 4,63 nM. Křivky pro inhibici peptidového ligandu byly získány pro 8 koncentrací peptidu. Údaje, získané při zkouškách na nasycení a inhibici byly analyzovány váženou nelineární regresí při použití příslušných modelů podle publikace Knapp a další, 1990, J. Pharmacol. Exp. Ther. 255:1278-1282. Hodnoty Ki pro inhibiční vazné konstanty byly vypočítány postupem podle Cheng a Prusoff, 1973, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3102. Každá hodnota Ki byla vypočítána ze tří až čtyř nezávislých stanovení.
Výsledky
Byla analyzována banka nahodilých syntetických peptidů vzorce X-X-X-X-X-pryskyřice, v níž X = všech 19 běžných aminokyselin (nebyl použit cystein), celkem šlo o možný počet 195 - 2 476 099 permutací. V podílu banky, na němž byla analýza provedena, se nacházelo přibližně 2 000 000 částic nosiče. V prvním stupni, v němž byl použit konjugát sterptavidinu a alkalické fosfatázy (odstavec B) příkladu 5 svrchu) došlo ke zabarvení přibližně 75 částic s různou intenzitou zbarvení a tyto částice byly fyzikálně odděleny pod mikroskopem pomocí mikromanipulátoru. Každá částice byla promyta v 8M guanidinhydrochloridu k odstranění vázaného straptavidinového konjugátu s enzymem. Pak byla každá částice jednotlivě uložena na skleněný filtr analyzátoru Applied Biosystem protein Sequencer (ABI). Řetězce 28 ze 75 částic jsou uvedeny v následující tabulce 1. Všechny částice měly buď společný řetězec HPQ nebo HPM. Z mikrofotografie na obr. 7 je zřejmé, že tmavou částici lze snadno identifikovat na pozadí mnoha tisíc bezbarvých částic v průběhu analýzy.
-37CZ 289365 B6
Tabulka 1
Peptidové řetězce jednotlivých částic nosiče, reagujících se streptavidinema)
HPQFV (b0,8 Ί120) GHPQG (0,44 250) PLHPQ(2,5 48)
HPWGP(0,35 60) MYNPQ AIHPQ
HPQAG(1,5 53) REHPQ(0,56 112) AAHPQ(0,9 476)
LHPQF (0,47 286) IQHPQ(1,8 192) dTPHPQ (0 158)
FHPQG(0,23 72) GNHPQ(0 222) WNHPM (2,5 59)
GHPWN (0,5 44) TVHPW (0 96) WTHPM(1,4 202)
THPQN (0,5 44) IGHPQ VHPMA(0,6 21)
WHPWG (2,3 60) WMHPQ(2,7 257) dMHPMA(0,31 140)
IHPQG(2,1 57) GAHPQ
a) tyto ligandy byly identifikovány v bance peptidů, obsahující 195, tj. 2 476 099 peptidů,
b) první číslo v závorkách udává předpověď pro Edmanovu degradaci ve stupni 5 (tj. množství zbytku 5 cyklu 4/množství zbytku 5 v cyklu 5),
c) druhé číslo v závorkách znamená množství peptidu v pmol, izolovaného v průběhu analýzy řetězce,
d) byly identifikovány dva řetězce TPHPQ a dva řetězce MHPMA, nebylo možno prokázat žádná další opakování.
Aby bylo možno prokázat, že všechny řetězce, v nichž se opakuje HPW se skutečně váží na místo pro vazbu biotinu ve streptavidinu, byl syntetizován řetězec LHPQF-beta-Ala-kyselina aminokapronová-ethylendiamin-piyskyřice (LHPQF-pryskyřice). Tento materiál byl pak smísen skonjugátem straptavidinu a alkalické fosfatázy za přítomnosti různých koncentrací biotinu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 8. Biotin v koncentraci lOOnM úplně blokoval zabarvení LHPQF-pryskyřice. V koncentraci 10 a 1,0 nM biotin způsobil částečnou inhibici zbarvení a při koncentraci 0,1 nM neměl na zabarvení žádný účinek. Tento pokud jasně prokazuje vazbu řetězce HPLW na místo pro vazbu biotinu v molekule Streptavidinu.
Před použitím téže banky nahodilých peptidů k průkazu vazy na protilátku anti-beta-endorfinMAb, byly z banky odstraněny všechny modré částice, zabarvené v předchozí zkoušce s konjugátem streptavidinu a alkalické fosfatázy. Zbývající částice nosiče pak byly zpracovány působením 8M guanidihydrochloridu k odstranění jakékoliv vázané bílkoviny. Pak byla banka smísena s biotinylovanou anti-beta-endorfin-MAb (anti-beta-endorfin, klon 3-E7 byl získán od Boehringe Mannheim, Indianopolis, Indiana) na 16 hodin. Po důkladném promytí bylo použito sekundárního stupně s konjugátem streptavidinu a alkalické fosfatázy ke zjištění barevné reakce. Tímto způsobem bylo identifikováno šest peptidů s řetězcem, příbuzným nativnímu ligandů Leu-enkefalinu YGGFL, a to: YGGMV, YGGLQ, YGGLS, YGGFA, YGGFT a YGGTQ. Byly syntetizovány peptidové analogy těchto ligandů s různým karboxy-terminálním zakončením a byla stanovena jejich afinita (Ki) při použití 3HLeu-enkefalinu (New England Nuclea, Boston, Massachusetts) jako značeného ligandů a neznačených peptidů v kompetici s tímto řetězcem (jak bylo popsáno svrchu v odstavci 10.1.2) B) Příkladu 5. Výsledky těchto studií jsou shrnuty v následující tabulce 2.
-38CZ 289365 B6
Tabulka 2
Afinita peptidových ligandů k monoklonální protilátce proti beta-endorfinu
Peptid Ki v nM, karboxyterminální zakončení
-OH -nh2 -βΑ-ΟΗ -βΑ-ΝΗ,
XGGFLa) 17,5±3,2 27,9±2,3 17,1±1,8 13,7±1,7
YGGFA 32,0±2,0 72,0±16,4 82,3±8,8 93,6±34,7
YGGFT 36,9±7,7 65,2±16,8 50,6±8,9 43,3±2,3
YGGFQ 15,0+1,7 40,1+6,0 39,4±2,3 45,4+11,6
YGGLS 726±134 991+52 916±182 1150±247
YGGLW 1980+303 2910±695 1470±120 1910±504
YGGMV 8780+1500 14000±l110 5140±885 7160±101
a) YGGL je (Leu)enkefalin, přírodní vazná látka pro anti-|3-endorfm MAb. Diskuse
Možnost syntetizovat určité peptidy pouze na jednotlivých částicích nosiče spolu s citlivou a specifickou detekcí je podstatou úspěšnosti způsobu podle vynálezu. Jde o postup, při němž je možno selektivně izolovat jedinou částici nosiče z banky a po působení 8M guanidinchloridu k odstranění vázaných bílkovin ji účinně čistit, přičemž peptid zůstává kovalentně vázán na pryskyřici a je připraven pro analýzu řetězce. Současně automatické analyzátory peptidů jsou schopné provést analýzu peptidu v koncentracích pouze 5 až lOpmol. Mimoto modrá barva, která se ireverzibilně váže na částici nosiče, neinterferuje s analýzou řetězce peptidu. V průběhu každého cyklu nahodilé vazby byly vyvinuty veškeré snahy pro optimalizaci způsobu syntézy včetně použití velkých přebytků Nalfa-Fmoc-aminokyselin. Podle dosažených výsledků je zcela zřejmé, že účinnost syntetické reakce v jednotlivých stupních nahodilé vazby byla vyšší než 98 %.
Vzhledem k tomu, že zbarvené částice nosiče je možno snadno zpozorovat na bezbarvém pozadí (např. na obr. 7), je velmi snadné vizuálně zkontrolovat 2 miliony částic v mikroskopu v sérii 10 až 15 Petriho misek a oddělit reaktivní částice pro analýzu řetězce. Mimoto je možno stanovit relativní afinitu různých ligandů tak, že se sleduje relativní intenzita zbarvení každé pozitivní částice. Tato vlastnost umožní izolovat částice se specifickým zabarvením pro analýzu řetězce.
Devlin a další (1990, Science 259: 404-406, oddíl 2, svrchu) popsali důležitost řetězců HPQ, HPM a HPN ve 20 vazných řetězcích pro streptavidin, které izolovali pomocí fágů. Z 20 izolovaných řetězců jich 15 obsahovalo HPQ, 4 obsahovaly HPM a jeden HPN. Bylo zajímavé, že analýzou banky bylo získáno 28 různých peptidů, z nichž 23 obsahovalo řetězec HPQ a 5 řetězec HPM (tabulka 1). Je také zřejmé, že poloha HPQ/HPM v pentapeptidu nebyla pro vazbu streptavidinu důležitá. Ze všech identifikovaných pentapeptidových řetězců s obsahem HPW nebo HPM se pouze dva opakovaly (TPHW a MHPMA). Tato skutečnost je v ostrém kontrastu s údaji Delvina a dalších, v jejichž materiálu se řada řetězců opakovala ve 20 izolátech, problém spočívá patrně v tom, že biosyntetický postup nebyl skutečně nahodilý, takže docházelo k selekci aminokyselin.
V anti-[3-endorfinovém systému má 6 peptidů velmi podobný řetězec s řetězcem přírodního YGGFL (Tabulka . 2). Tyto výsledky jsou podobné těm, které byly získány pomocí filamentosních fágů při použití téže monoklonální protilátky (klon 3-E7) podle Cwirla a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 svrchu). Přestože analýzou peptidové banky byl získán menší počet řetězců než podle uvedené publikace, 50 % získaných řetězců mělo k protilátce daleko větší afinitu než kterýkoliv z řetězců, získaných pomocí fágu.
-39CZ 289365 B6
Příklad 6: Omezená peptidová banka
V další sérii pokusů bylo užito odlišného typu protilátky, v němž epitop byl uložen uprostřed peptidového řetězce místo na jeho N-terminálním zakončení (jako v případě betaendorfinu). Použitou protilátkou byla monoklonální protilátka anti-v-mos MAb. Tato protilátka byla získána imunizací myší peptidem, obsahujícím 12 aminokyselin, LGSGGSVYKA, který odpovídá zbytkům 100 až 111 onkogenu v-mos. Peptid byl konjugován s nosnou bílkovinou před imunizací. Při zkoušce ELISA je možno použít anti-v-mos MAb k detekci homologních řetězců v-mos, MOS, neu/HER-1 a HER-2 genu.
Materiály a metody
Při použití komerčně dodaného systému (Geysen a další, 1986, Mol. Immunol. 23: 709-715) pro mapování epitopů (Cambridge Research Biochemical, Boston) při syntéze překrývajících se peptidů (skupiny tetrapeptidů, pentapeptidů a hexapeptidů) byl mapován epitop v rozsahu 12 aminokyselin v-mos, rozpoznávaný protilátkou anti-v-mos-MAb ve srovnání spentapeptidovým řetězcem FGSVY (tj. zbytku 6 až 10 v dodekapeptidu v-mos).
Pokusy byly prováděny s omezenou bankou nahodilých peptidů, v níž byly aminokyseliny valin a serin, přítomné ve v-mos peptidu, úmyslně vypuštěny. Tato banka nahodilých peptidů měla následující složení: G-X-X-X-X-X-p-Ala-aminokapronová kyselina-ethylendiaminpryskyřice, kde X = Glu, Pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Met, Arg, Trp. Těchto 14 aminokyselin bylo zvoleno tak, že valin a serin byly vynechány a všechny funkční skupiny postranního řetězce byly zachovány, to znamená, že
i) byl použit Asn, avšak nikoliv Gin, ii) Byl použit Glu, avšak nikoliv Asp, iii) Byl použit Thr, avšak nikoliv Ser, iv) Byl použit Leu, avšak nikoliv Ile nebo Val a
v) Byl použit Met, avšak nikoliv Cys.
Vzhledem k tomu, že bylo v každém z pěti nahodilých vazných stupňů použito 14 aminokyselin, bylo teoretické množství peptidů 145, to znamená 537 824.
Buněčná linie hybridomu, produkující monoklonální protilátku anti-v-mos byla získána od Microbiological Associates lne., Maryland (Hybridom No. 165-2847, SCRF 354, šarže č. 165-119).
Afinita peptidového ligandu pro anti-v-mos-MAb byla měřena vaznými zkouškami v kapalné fázi při použití 3H-acetyl-v-mos-peptidu (3H-Ac-v-mos) jako radioaktivního vazného řetězce. Tato radioaktivní látka byla připravena N-terminální acetylací v-mos před odstraněním ochranných skupin z postranního řetězce, při použití ekvimolámího množství 3H-octanu sodného (specifická aktivita = 252 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). Produkt 3H-Ac-vmos, který byl oddělen od nezreagovaného v-mos-peptidu pomocí HPLC v reverzní fázi měl specifickou aktivitu 2,50 Ci/mmol. Afinita vazby 3H-Ac-v-mos na Anti-v-mos-MAb (10 pg/ml) byla měřena v 1,0 ml PBS-pufru s želatinou (0,05% želatina v PBS) při teplotě 2324 °C po inkubaci tři hodiny. Specifická vazba byla definována jako rozdíl mezi vazbou 3H-Acv-mos v přítomnosti (nespecifická vazba) a v nepřítomnosti (celková vazba) 100 μΜ
-40CZ 289365 B6 neznačeného peptidů v-mos pro každou koncentraci 3H-Ac-v-mos. Vázaný radioaktivní ligand byl oddělen odstředěním při použití lOnásobného přebytku (kapacita vazby relativně k použitému imunoglobulinu) bílkovina-G-Sepharosa (Pharmacia), kvysrážení protilátky. Analýza vazby do nasycení z pěti stanovení v rozsahu koncentrace 125-5000 nM ukázala, že se 3H-Ac-v-mos váže na anti-v-mos-MAb s hodnotou Kd 850 ± 160 nM. Afinita vazby peptidového ligandů byla stanovena studiemi na inhibici této vazby při použití sedmi peptidových řetězců v kompetici o 10 pg/ml anti-v-mos-MAb s 20 nM 3H-Ac-v-mos za svrchu uvedených podmínek. Těmito studiemi bylo prokázáno, že ve více než 50 % celkové vazby šlo o vazbu specifickou. Konstanty pro nasycení vazby a pro inhibici byly měřeny pro jediné místo vazby pomocí nelineární regresní analýzy, jak bylo svrchu popsáno (Knapp a Yamamura, 1990, Lie Sci. 46:1457-1463).
Výsledky
Bylo analyzováno přibližně 230 000 částic pomocí konjugátu anti-v-mos a alkalické fosfatázy. Bylo tedy analyzováno méně než 43 % permutací. Po inkubaci se substrátem se přibližně 50 částic zbarvilo intenzivně modře. 24 těchto částic bylo fyzikálně odděleno a byly analyzovány řetězce aminokyselin na 11 těchto částicích. Mimoto bylo náhodně odebráno 17 bezbarvých částic pro analýzu řetězce.
Výsledky analýzy řetězce pro částice s ligandem anti-v-mos jsou shrnuty v tabulce 3. Vzhledem k tomu, že úmyslně nebyly použity aminokyseliny valin a serin v bance, není překvapující, že ani jeden z řetězců neodpovídá nativnímu epitopu z 11 analyzovaných řetězců (nativní řetězec odpovídá řetězci FGSVY). Přestože v uvedených 11 řetězcích nedošlo k žádnému opakování, jejich řetězce nebyly nahodilé. Vyskytuje se v nich velmi často arginin a tyrosin. Mimoto je alespoň jeden a někdy dva argininové zbytky jsou přítomny v poloze 2 a/nebo 3 těchto řetězců. Na druhé straně nahodile zvolené nezbarvené částice nemají žádnou vlastnost, společnou pro řetězce aminokyselin. Přestože je rozsah vzorku omezen, hodnota chi2 nebyla ve srovnání s řetězci z negativních částic nosiče statisticky významná (ch2 = 18,27, df = 13, P = 0,15), což prokazuje, že není k dispozici žádný průkaz nerovnoměrné distribuce aminokyselin pro nahodile vytvořené řetězce na nezbarvených částicích.
Tabulka 3
Peptidové řetězce na jednotlivých částicích nosiče, které reagovaly s monoklonální protilátkou anti-v-mos-Mab
A. Řetězce z reaktivních částic
GRRGME GRRPYG GRRAYE GREEGP
GRYAKH GRKTYY
GRYMPK GFRHMA GFRYHN GHRYFH GWREKE
-41 CZ 289365 B6
B. Řetězce z nereaktivních částic
GKELAG GPYLMW GTKMNF GEEKMEF GYEEPK GKKPNP GEYAPP GGFMEF GPKFMA
GFEKHP GWGAYP GAARPP GLEFGME GRLNTL GMTHAY GPYGMA GHYNNL
Některé z pozitivních ligandů byly syntetizovány a byla stanovena jejich afinita pro anti-v-mosMAb vazbou v kapalné fázi, jak bylo popsáno svrchu v odstavci Materiál a metody Příkladu 6. Výsledky těchto zkoušek jsou shrnuty v tabulce 4.
V tabulce 4 jsou shrnuty afinity v-mos-epitopů pro monoklonální protilátku anti-v-mos-MAb podle výsledků mapování epitopů. Je také uveden vliv změny karboxyterminálního zakončení.
V tabulce 4B shrnuje afinitu mimotopů, identifikovaných z peptidové banky, v níž chybí několik aminokyselin ve v-mos-epitopu. Některé zkoumané ligandy obsahovaly beta-alaninamid k napodobení struktury identifikovaného ligandu, k němuž se protilátka váže na částici nosiče.
Afinita nej lepšího anti-v-mos-mimotopu v tabulce 4 je přibližně 2,5krát menší než afinita nativního peptidů. Přestože žádný ze zkoumaných peptidových ligandů neměl hodnotu Ki tak nízkou, jako nativní ligand v-mos, výsledky zřetelně prokazují, že při použití banky nahodilých peptidů, v níž chybějí některé aminokyseliny, nacházejí se v nativním epitopu je možno identifikovat celou řadu strukturně odlišných mimotopů, které mají určitou afinitu k molekule akceptoru, tj. monoklonální protilátce anti-v-mos.
Tabulka 4
Afinita vazby peptidového ligandu pro anti-v-mos-Mab
Peptid Ki, μΜ
A. LGSGGFGSVYKA (v-mos-peptid) 3,2 ± 0,4
GFGSVY-NH2 (v-mos-epitop 246-337
GFGSVY-OH 1000
gfgsvy-pa-nh2 409-442
GFGSVY-pA-OH 529-770
B. GRRAYE-OH 6,79 ±2,31
GRRAYE-NH2 24,70 ± 7,00
GRRAYE-pA-OH 15,10 ±0,50
GRRAYE-pA-NH2 9,02-20,40
GRRGME-OH 100
GRRGME-pA-NH2 24,00 ± 8,40
GRREPG-pA-NH2 26,90 ± 6,20
GRRPYG-OH 1000
GRRPYG-pA-NH2 20,50 ±4,50
-42CZ 289365 B6
Diskuse
Anti-v-mos-MAb, užité v této studii měly poměrně nízkou afinitu k immunogenu, tj. v-mospeptidu. Ve v-mos lineárním epitopu byl přítomen serin a valin (FGSVY), avšak tyto aminokyseliny byly úmyslně vynechány z použité banky. I tak však bylo možno tímto způsobem definovat lineární mimotop s úplně odlišným řetězcem a složením aminokyselin, avšak se srovnatelnou afinotou pro protilátku. Tím byla zcela jasně prokázána jak složitost, tak využitelnost interakcí mezi makromolekulámími peptidy.
Příklad 7: Selektivně odštěpitelný linker: Onb
Byla připravena skupina čtyř peptidů, obsahujících linke ONb, kteiý je možno odštěpit působením UV-světla (odstavec 3 svrchu) a tyto peptidy byly užity k testům.
Materiály a metody
Na dvou pryskyřicích byly připraveny následující čtyři peptidy při použití standardní syntézy na pevném nosiči (např. Příklad 1 a 2 svrchu):
i) Fmoc-Trp-Tyr(Obu')-Phe-ONb-betaAla-ACA-EDA-PepSyn K, ii) TRP-Tyr-Phe-ONb-betaAla-ACA-EDA-PepSyn K, iii) Fmoc-Trp-Tyr(Obu'>-Phe-ONb-betaAla-ACA-4-MBHA, iv) TRP-Tyr-Phe-ONb-betaAla-ACA-4-MBHA.
Každý z peptidů byl ozařován 1 a 3 hodiny UV-zářením a viditelným (VIS) světlem v 0,3 ml vody nebo směsi chlorethanolu a dichlormethanu 3:7. Celkem bylo provedeno a vyhodnoceno 16 + 16 pokusů.
Po expozici byly supematanty odfiltrovány, lyofilizovány a pak znovu rozpuštěny v 0,3 ml methanolu. Produkty pak byly analyzovány pomocí HPLC.
Výsledky
Analýza HPLC jasně prokázala, že po ozáření VIS ve vodě nedošlo k žádnému uvolnění tripeptidů za 1 hodinu, kdežto po ozáření UV-světlem došlo po této době k téměř úplnému uvolnění tripeptidů.
Zvláště peptid i) byl ve vodě rozštěpen na jediný produkt. V některých případech bylo možno pozorovat vymývání dvou produktů za sloupce HPLC. Při delší době expozice UV-záření bylo možno v alespoň několika případech pozorovat vzájemnou přeměnu mezi dvěma produkty.
Diskuse
Je zřejmé, že při použití linkeru citlivého na UV-světlo dochází ve vodném roztoku k uvolnění peptidu. Doba expozice 1 hodina je dostatečná k neúplnému uvolnění peptidu. Výsledky také ukazují, že polyamidová pryskyřice je kompatibilní s vodným systémem a je v něm stálá.
-43CZ 289365 B6
Příklad 8: Identifikace látky, podobné en2ymu
Materiály a metody
Způsob podle vynálezu byla připravena banka nahodilých pentapeptidů (odstavec Materiál a metody Příkladu 5 svrchu), použito bylo 19 aminokyselin ze známých běžných 20 (byl vynechán cystein).
Peptidová banka byla vystavena působení chromogenního substrátu NBT (chlorid tetrazoliové nitromodři) v nepřítomnosti exogenního enzymu za podmínek, vedoucích ke tvorbě produktu a identifikují se pozitivně reagující částice. Tyto částice se oddělí a řetězce produktů se analyzují.
Výsledky
V následující tabulce 5 jsou uvedeny řetězce z pěti částic nosiče, které zjevně katalyzovaly redukci NTB za vzniku tmavě modrého diformazanového produktu.
Tabulka 5
Řetězce peptidů z částic, napodobujících působení enzymu
PNNNH WNNNM
PNNNG MNNNR
QNNNR
Diskuse
Uvedené výsledky prokazují, že spojení PNNNH-částice může redukovat NBT na temně modrý diformazanový pigment chemicky nebo enzymaticky. Peptid nebo spojení peptidu a částice má tedy účinnost „arteficiálního“ enzymu nebo účinnost enzymu podobnou.
Příklad 9: Vyhledávání peptidových řetězců s protirakovinným účinkem
Omezená peptidová banka, obsahující pentapeptidy, v nichž první aminokyselinou je tyrosin, za nímž následuje řetězec nahodilých zbytků ze skupiny kyselina glutamová, serin, valin, glycin, asparagin a arginin byla vyšetřena na přítomnost řetězců s protinádorovou účinností při použití různých buněčných linií nádorových buněk.
Materiály a metody
Banka nahodilých peptidů podle vynálezu byla syntetizována při použití hydrolyzovatelného diketopiperazinového linkeru. Při stanovení proti-nádorové účinnosti byly použity plotny s 96 vyhloubeními.
Po odstranění ochranné skupiny z postranního řetězce a Naifa-Fmoc-skupiny byla peptidová banka neutralizována působením diizopropylethylaminu DIEA a důkladně promyta DMF k odstranění jakýchkoliv zbývajících potenciálně toxických látek. Pak byla postupně banka uvedena do suspenze v 0,01 M HC1 (podmínky, v nichž je linker stálý) a nakonec promyta 0,001 M HC1. Pak bylo do každého vyhloubení přeneseno přibližně 0 částic nosiče z banky. Pak bylo do každého vyhloubení přidáno 50 μΐ prostředí RPMI (s 25 mM pufru Hepes k neutralizaci pH
-44CZ 289365 B6 roztoku. Při neutrálním nebo slabě alkalickém pH docházelo k uvolnění peptidů například v průběhu 16 až 24 hodin.
Pak bylo postupováno tak, že 1) buď byla část prostředí přenesena na oddělenou plotnu se specifickou buněčnou linií nádorových buněk, nebo 2) tyto buňky byly přidány přímo do vyhloubení, obsahujících částice. Bylo užito přibližně 2500 buněk plicního nádoru/ml. Pak byly plotny inkubovány 7 dnů při teplotě 37 °C, načež byla provedena zkouška MTT ke kvantitativnímu vyhodnocení cytotoxicity uvolněných peptidů v každém vyhloubení.
K této zkoušce je možno použít různé stabilizované buněčné linie lidského karcinomu, lymfomu, myelomu a také leukemie. Příkladem mohou být nádorové buňky NCI: lymfoidní leukemie L1210, melanom B16, Lewisův karcinom plic, sarkom M5076, karcinom tlustého střeva 38 a karcinom mléčné žlázy člověka MX-1. Dalšími příklady mohou být karcinom mléčné žlázy MCF-7, buněčná linie myelomu 8226, buněčná linie leukemie myší P388 a buněčná linie Hawkinsova karcinomu plic (z buněk, odlišných od karcinomu z malých buněk).
Výsledky
Byla analyzována banka, obsahující přibližně 8000 peptidů s řetězcem Y-XXXXX-částice nosiče, kde Y znamená Tyr, X znamená Glu, Ser, Val, Gly, Arg nebo ASN. Ve dvou pokusech bylo možno prokázat pro 3 až 4 supematanty s obsahem uvolněného peptidů inhibici buněčné linie Hawkinsonova karcinomu plic. Vzhledem ktomu, že každé vyhloubení obsahovalo přibližně 10 částic, bylo podrobeno zkoušce v podstatě všech 8 000 možných řetězců a byly identifikovány 3 účinné řetězce peptidů. Téhož výsledku bylo možno dosáhnout při přímé inkubaci částic s buňkami a při přenosu supematantu s uvolněným peptidem.
Diskuse
Uvedené výsledky ukazují, že omezená banka peptidů může obsahovat některé peptidové řetězce s cytotoxickým účinkem. V předchozím příkladu mělo přibližně 0,05 % všech řetězců protinádorovou účinnost. Zkouškami se supematanty, obsahujícími uvolněné peptidy je možno v sériových zkouškách zjistit toxicitu i proti jiným nádorovým buňkám a také proti buňkám normálních tkání.
Tímto způsobem je možno identifikovat peptidové řetězce se širokou toxicitou proti nádorovým buňkám nebo s toxicitou proti specifickým liniím nádorových buněk. Ty řetězce, které mají nízkou toxicitu pro normální buňky by bylo možné použít jako léčebné látky. Stejný postup je možno použít také pro antimikrobiální a antiparazitámí látky a pro antagonisty růstových faktorů.
Podobný postup pro zjištění agonistů růstového faktoru by mohl využít buněčných linií, závislých na přítomnosti růstového faktoru. Peptidy s agonistickým účinkem by v tomto případě stimulovaly růst těchto buněčných linií v nepřítomnosti růstového faktoru.
Vynález byl popsán v souvislosti s jednotlivými výhodnými provedeními, je však zcela zřejmé, že jej není možno na tato provedení omezit. Je totiž možno provést ještě řadu modifikací, odborníkům zcela zřejmých, které by rovněž spadaly do rozsahu vynálezu.

Claims (38)

1. Banka oligomerů, vyznačující se tím, že je tvořena řadou biologicky účinných bio-oligomerů, zbavených ochranných skupin, v níž každý bio-oligomer má jinou sekvenci podjednotek, řadou pevných nosičů, vzájemně mísitelných a vhodných pro reakční podmínky při chemické syntéze bio-oligomerů, přičemž jeden typ bio-oligomeru s určitou sekvencí je vázán na pevný nosič za vzniku kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru, přičemž biologicky účinnými bio-oligomery jsou peptidy, zbavené ochranných skupin.
2. Banka podle nároku 1,vyznačující se tím, že se v ní podjednotky volí ze skupiny glycin, L-aminokyseliny, D-aminokyseliny, l,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3-karboxylát, (2S,3S)-methylfenylalanin, (2R,3S)-methylfenylalanin, kyselina 2-aminotetrahydronaftalen-2karboxylová, hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3-karboxylová, beta-karbolin (D a L), kyselina histidinizochinolinkarboxylová, histidin, cyklická močovina a látky podobné peptidům, obsahující nejméně dva zbytky aminokyselin.
3. Banka podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že její peptidové řetězce obsahují alespoň dvě aminokyseliny, schopné zesítění.
4. Banka podle nároku 3, v y z n a č u j í c í se tím, že peptidy jsou zesítěny a vytvářejí vymezené, cyklizované nebo rigidizované peptidy.
5. Banka podle nároku 1,vyznačující se tím, že pevný nosič obsahuje linker.
6. Způsob přípravy banky nahodilých bio-oligomerů podle nároku 1, vyznačující se tím, že se
a) připraví alespoň tolik podílů pevného nosiče, kolik je různých druhů podjednotek bio-oligomerů, které mají být přidány, avšak alespoň dva tyto podíly, pro tvorbu bio-oligomerů,
b) odděleně se přivádějí skupiny podjednotek k podílům pevného nosiče tak, že se ke každému podílu přivádí jedna podjednotka,
c) podjednotky se úplně váží na v podstatě všechna místa, která jsou k dispozici na pevném nosiči za vzniku kombinace částice a nosiče nové podjednotky,
d) stanoví se úplnost vazby a popřípadě se reakce přivede až k dovršení,
e) důkladně se promísí podíly kombinací částic pevného nosiče a nových podjednotek, a stupně a) až e) se opakují v požadovaném počtu opakování, po posledním požadovaném stupni se v podlesním stupni e) odstraní ochranné skupiny, přičemž bio-oligomer zůstává vázán na pevný nosič.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se jako pevný nosič užije polydimethylakrylamid.
8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se pevný nosič volí ze skupiny polystyrénová pryskyřice, pryskyřice typu polyhipe, polyamidová pryskyřice, polystyrénová pryskyřice, naroubovaná polyethylenglykolem a polydimethylakrylamidová pryskyřice.
-46CZ 289365 B6
9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se jako pevný nosič použije oxid křemičitý.
10. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pevný nosič obsahuje linker.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se linker volí ze skupiny kyselina aminomáselná, kyselina aminokapronová, kyselina 7-aminoheptanová, ethylenglykol a kyselina beta-aminokaprylová.
12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že linker je kyselina aminokapronová.
13. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se při přípravě banky biooligomerů v alespoň jednom stupni váže tatáž podjednotka na všechny pevné nosiče a v alespoň jednom dalším stupni se alespoň dvě podjednotky odděleně váží na alespoň dva podíly pevného nosiče.
14. Způsob podle nároku 6, vy zn ač u j í c í se tí m, že se stupně a) až e) opakují pouze jednou.
15. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se stupně a) až e) opakují více než jednou.
16. Způsob stanovení sekvence bio-oligomeru jako ligandů k molekule akceptoru, vyznačující se tím, že se
a) do banky podle vynálezu 1 přivede molekula příslušného akceptoru, která rozpozná a bude se vázat na jednu nebo větší počet kombinací nosiče a bio-oligomeru v bance,
b) izoluje se kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru, která vykazuje vazbu na molekulu akceptoru a
c) analyzuje se řetězec bio-oligomeru z kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru, izolovaná ze stupně b).
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se molekula akceptoru volí ze skupiny protilátek, receptorů, virů, bakterií, bílkovin, uhlohydrátů, nukleových kyselin, lipidů, léčiv a kovů.
18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se jako molekula akceptoru užije protilátka.
19. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se jako molekula akceptoru užije receptor.
20. Způsob stanovení sekvence bio-oligomeru jako ligandů, vyznačující se tím, že se
a) část bio-oligomeru z banky bio-oligomeru podle nároku 1 uvolní in sítu,
b) in šitu se provede detekce biologické účinnosti uvolněného biooligomeru,
-47CZ 289365 B6
c) izoluje se kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru podle nároku 1 s navázaným biooligomerem s hledaným specifickým biologickým účinkem, prokázaným, ve stupni b) a
d) stanoví se řetězec bio-oligomeru, zbývající na kombinaci pevného nosiče a bio-oligomeru, izolované ve stupni c).
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se jako pevné nosiče užijí nosiče, citlivé na působení kyselin, bází, nukleofilních látek, citlivé na světlo, na efektofílní látky, na oxidaci nebo na redukce.
22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že pevný nosič obsahuje linker, citlivý na působení kyseliny nebo báze, na nukleofílní nebo elektrofílní látky, na světlo a na oxidaci nebo redukci.
23. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se uvolnění in šitu ve stupni a) provádí enzymatickým štěpením, chemickým štěpením nebo fotochemickým štěpením.
24. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se detekce ve stupni b) týká biologické účinnosti ze skupiny cytotoxicita, protinádorová účinnost, antibakteriální účinnost, protivirový účinek, účinek proti houbám, proti parazitům, účinnost růstového faktoru, inhibice růstu, hormonální účinek, přenos nerovového vzduchu, imunomodulační účinnost a regulační účinek.
25. Způsob podle nároku 20, v y z n a č u j í c í se tím, že biologickou účinností, jejíž detekce se provádí ve stupni b) je inhibice enzymu.
26. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující ligandem je peptidový řetězec s léčebným účinkem.
se tí m, že bio-oligomemím
27. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující ligandem je peptidový řetězec pro diagnostické účely.
se že bio-oligomemím
28. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující ligandem je peptidový řetězec s cytotoxickým účinkem.
že bio-oligomemím
29. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující ligandem je peptidový řetězec s protinádorovým účinkem.
se tím, že bio-oligomemím
30. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující ligandem je peptidový řetězec s antimikrobiálním účinkem.
se tím, že bio-oligomemím
31. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující ligandem je peptidový řetězec s účinkem růstového faktoru.
tím, že bio-oligomemím se tím,
32. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující ligandem je peptidový řetězec s antagonistickým účinkem proti růstovému faktoru.
že bio-oligomemím
33. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující se tím, že bio-oligomemím ligandem je peptidový řetězec s účinkem hormonu.
34. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující se tím, že bio-oligomemím ligandem je peptidový řetězec s antagonistickým účinkem proti hormonu.
-48CZ 289365 B6
35. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyzn ač u j í cí se tím, že bio-oligomemím ligandem je peptidový řetězec s účinkem erythropoetinu.
36. Způsob podle nároku 16 nebo 20, vyznačující se tím, že bio-oligomemím ligandem je peptidový řetězec s imunogenním účinkem.
37. Způsob stanovení sekvence bio-oligomeru, katalyzujícího enzymatickou reakci, v y z n a č u j í c í s e t í m, že se
a) přidá banka oligomerů podle nároku 1 k takovému substrátu, z nějž vzniká enzymatickou reakcí detekovatelný produkt,
b) izoluje se kombinace pevného nosiče a bio-oligomeru, která má sledovanou účinnost a
c) stanoví se řetězec bio-oligomeru, vázaný na pevný nosič, izolovaný ve stupni b).
38. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že biooligomemím vazným řetězcem s inhibičním účinkem na enzym je peptid, tvořený aminokyselinami ze skupiny glycin, nepřírodní aminokyseliny, D-izomeiy přírodních aminokyselin, analogy aminokyselin a látky, podobné peptidům.
CS19924073A 1990-07-02 1992-12-31 Banka oligomerů, způsob její přípravy a způsob stanovení sekvence bio-oligomeru CZ289365B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54684590A 1990-07-02 1990-07-02
US07/717,454 US5650489A (en) 1990-07-02 1991-06-19 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
PCT/US1991/004666 WO1992000091A1 (en) 1990-07-02 1991-07-01 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ407392A3 CZ407392A3 (en) 1993-10-13
CZ289365B6 true CZ289365B6 (cs) 2002-01-16

Family

ID=27068387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS19924073A CZ289365B6 (cs) 1990-07-02 1992-12-31 Banka oligomerů, způsob její přípravy a způsob stanovení sekvence bio-oligomeru

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5650489A (cs)
EP (1) EP0542770B1 (cs)
JP (1) JP3552718B2 (cs)
KR (2) KR100222146B1 (cs)
AT (1) ATE176330T1 (cs)
AU (3) AU659091B2 (cs)
CA (1) CA2086672C (cs)
CZ (1) CZ289365B6 (cs)
DE (1) DE69130828T2 (cs)
DK (1) DK0542770T3 (cs)
ES (1) ES2126572T3 (cs)
FI (1) FI107995B (cs)
GR (1) GR3029443T3 (cs)
HU (1) HU218007B (cs)
IE (1) IE912299A1 (cs)
IL (1) IL98682A (cs)
MX (1) MX9100052A (cs)
NO (1) NO315002B1 (cs)
NZ (1) NZ238805A (cs)
PL (2) PL168354B1 (cs)
RO (1) RO112336B1 (cs)
SK (1) SK281490B6 (cs)
WO (1) WO1992000091A1 (cs)

Families Citing this family (626)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5747334A (en) * 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
US5639595A (en) * 1990-05-01 1997-06-17 Isis Phamaceuticals, Inc. Identification of novel drugs and reagents
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US6197529B1 (en) * 1990-11-21 2001-03-06 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Linear substituted oligoalkyleneimine libraries
US20050209121A1 (en) * 1990-12-05 2005-09-22 Novozymes A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
US5646001A (en) * 1991-03-25 1997-07-08 Immunivest Corporation Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
WO1993004204A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthetic unrandomization of oligomer fragments
AU2580892A (en) * 1991-09-05 1993-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents
DK0604552T3 (da) * 1991-09-18 1997-08-04 Affymax Tech Nv Fremgangsmåde til syntese af forskellige samlinger af oligomerer
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US6117974A (en) * 1991-10-02 2000-09-12 Peptor Limited Libraries of backbone-cyclized peptidomimetics
US20010021513A1 (en) * 1991-11-21 2001-09-13 Puijk Wouter Cornelis Test device comprising a plate containing a multiplicity of wells with an associated metering device, as well as a kit which comprises these devices and use of the devices
US5573905A (en) * 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
DE69330027T3 (de) * 1992-04-15 2008-09-25 The Johns Hopkins University Synthese von verschiedenen und nützlichen oligonukleotidsammlungen
US5541061A (en) * 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
AU4779493A (en) * 1992-07-21 1994-02-14 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
PT665897E (pt) * 1992-10-01 2003-11-28 Trustees Of Columbia U In The Bibliotecas quimicas combinatorias complexas codificadas com etiquetas
US6503759B1 (en) 1992-10-01 2003-01-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5721099A (en) * 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5565324A (en) * 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5807683A (en) * 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
DE4243770A1 (de) * 1992-12-23 1994-06-30 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
AU6281594A (en) * 1993-03-12 1994-09-26 Jerini Bio Chemicals Gmbh Process for synthesizing and selecting sequences of covalently bound components
US6864048B2 (en) 1993-04-28 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Factorial chemical libraries
ATE366741T1 (de) * 1993-05-27 2007-08-15 Aventis Pharma Inc Topologisch getrennte, kodierende festphasen- bibliotheken
US5840485A (en) * 1993-05-27 1998-11-24 Selectide Corporation Topologically segregated, encoded solid phase libraries
WO1994028424A1 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Chiron Corporation Method for selection of biologically active peptide sequences
US5846731A (en) * 1993-06-17 1998-12-08 Torry Pines Institute For Molecular Studies Peralkylated oligopeptide mixtures
US5480971A (en) * 1993-06-17 1996-01-02 Houghten Pharmaceuticals, Inc. Peralkylated oligopeptide mixtures
ATE210993T1 (de) * 1993-06-21 2002-01-15 Selectide Corp Selektiv spaltbare verbindungen, die auf iminodiessigsäure-ester-bindungen basieren
WO1995001800A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation Cyclic semi-random peptide libraries
AU7193494A (en) * 1993-07-21 1995-02-20 Oxford Glycosystems Ltd Saccharides, their synthesis and use
US6001982A (en) * 1993-07-29 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
CA2169456A1 (en) * 1993-08-13 1995-02-23 J. Wesley Fox Biocatalytic methods for synthesizing and identifying biologically active compounds
CN1525171A (zh) * 1993-10-01 2004-09-01 ŦԼ�и��ױ��Ǵ�ѧ���� 用标示物编码的多元组合化学库
US5922545A (en) * 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US6165778A (en) * 1993-11-02 2000-12-26 Affymax Technologies N.V. Reaction vessel agitation apparatus
US5503805A (en) * 1993-11-02 1996-04-02 Affymax Technologies N.V. Apparatus and method for parallel coupling reactions
US6287787B1 (en) 1993-11-24 2001-09-11 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Dimeric oligopeptide mixture sets
AU1068295A (en) * 1993-12-09 1995-06-27 Novartis Ag Process for the production of combinatorial compound libraries
WO1995016918A1 (en) * 1993-12-15 1995-06-22 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
US5587471A (en) * 1994-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of making oligonucleotide libraries
JPH09511486A (ja) * 1994-01-13 1997-11-18 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 合成レセプター、ライブラリー及びこれらの使用
US5593853A (en) * 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5541085A (en) * 1994-02-14 1996-07-30 Zymogenetics, Inc. Method for preparing orphan receptor ligands
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
AU690656B2 (en) * 1994-03-11 1998-04-30 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
US6015880A (en) * 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US6936477B2 (en) 1994-04-13 2005-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5856083A (en) * 1994-05-06 1999-01-05 Pharmacopeia, Inc. Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules
US5846841A (en) * 1994-05-20 1998-12-08 Selectide Corporation Motif Libraries
IL109943A (en) * 1994-06-08 2006-08-01 Develogen Israel Ltd Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
US6407059B1 (en) 1994-06-08 2002-06-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
WO1995034813A1 (en) * 1994-06-14 1995-12-21 Smithkline Beecham Corporation Resins for solid state synthesis
US5663046A (en) * 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5817751A (en) * 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
AU2871195A (en) * 1994-06-23 1996-01-19 Affymax Technologies N.V. Methods for the synthesis of diketopiperazines
US5939268A (en) * 1994-07-26 1999-08-17 The Scripps Research Institute Combinatorial libraries of molecules and methods for producing same
MX9700725A (es) * 1994-07-26 1997-05-31 Scripps Research Inst Coleccion combinatoria soluble.
US5948693A (en) * 1994-09-01 1999-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
US5463564A (en) * 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US6558633B1 (en) 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
US5846719A (en) * 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US5604097A (en) * 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
AU3599895A (en) * 1994-10-14 1996-05-06 Chiron Mimotopes Pty Ltd Method and apparatus for efficient mimotope discovery
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US5688696A (en) * 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
DE4444260A1 (de) * 1994-12-13 1996-06-20 Hoechst Ag Cyclohexapeptide und deren Mischungen, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung
WO1996022067A2 (en) * 1994-12-27 1996-07-25 United Biomedical, Inc. Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics
US5712171A (en) 1995-01-20 1998-01-27 Arqule, Inc. Method of generating a plurality of chemical compounds in a spatially arranged array
GB9502225D0 (en) * 1995-02-04 1995-03-22 Zeneca Ltd Method
AU5487496A (en) * 1995-05-03 1996-11-21 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5759865A (en) * 1995-05-03 1998-06-02 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5834318A (en) * 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5750674A (en) * 1995-05-23 1998-05-12 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced
AU5871196A (en) * 1995-05-23 1996-12-24 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the synthesis of oligonucleotides and the oligonucleotides thereby produced
US20010053523A1 (en) * 1995-06-02 2001-12-20 M&E Biotech A/S. Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
US6051554A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5770687A (en) * 1995-06-07 1998-06-23 Peptor Limited Comformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
CA2225313A1 (en) * 1995-06-21 1997-01-09 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
SE9502286D0 (sv) * 1995-06-22 1995-06-22 Pharmacia Ab Process for detection, quantification and/or identification of a peptide
US6579848B1 (en) * 1995-06-23 2003-06-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Depigmenting activity of agouti signal protein and peptides thereof
GB9515070D0 (en) * 1995-07-22 1995-09-20 Zeneca Ltd Label
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
AU693723B2 (en) * 1995-09-11 1998-07-02 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
AU728668B2 (en) * 1995-09-11 2001-01-18 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
US6743892B1 (en) 1995-09-11 2004-06-01 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ in vivo
US7026114B1 (en) * 1995-09-13 2006-04-11 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for monitoring polymer array synthesis
US6841533B1 (en) 1995-12-07 2005-01-11 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized interleukin-6 antagonists
US6147205A (en) * 1995-12-15 2000-11-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups and methods for their use
US20110028350A1 (en) * 1995-12-15 2011-02-03 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
CA2238995A1 (en) * 1995-12-18 1997-06-26 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Methods for identifying compounds that bind to a target
AU1582197A (en) * 1996-01-22 1997-08-11 Eli Lilly And Company Combinatorial process for preparing substituted indane libraries
US6455247B1 (en) 1996-01-23 2002-09-24 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
US6365344B1 (en) * 1996-01-23 2002-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
US6277583B1 (en) * 1996-02-07 2001-08-21 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries and applications thereof
US6080719A (en) * 1996-02-23 2000-06-27 Hoechst Aktiengesellschaft Cyclohexapeptides and their mixtures, a process for preparing them, and their use
WO1997033000A1 (en) * 1996-03-04 1997-09-12 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
DE19610103A1 (de) 1996-03-15 1997-09-18 Basf Ag Cycloalkylderivate und ihre Synthese an fester Phase
EP0954601A4 (en) * 1996-03-20 2004-08-18 Genzyme Corp METHOD FOR DETECTING CYTOTOXIC T-CELL EPITOPES
EP0901629A4 (en) * 1996-03-21 2000-02-02 Univ Princeton CARBOHYDRATE LIBRARY, ASSAY AND METHOD
US5866341A (en) * 1996-04-03 1999-02-02 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for screening drug libraries
US7144119B2 (en) 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US6387707B1 (en) 1996-04-25 2002-05-14 Bioarray Solutions Array Cytometry
ATE366418T1 (de) 1996-04-25 2007-07-15 Bioarray Solutions Ltd Licht-regulierte, elektrokinetische zusammensetzung von partikeln an oberflächen
US5958342A (en) * 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
DE19621177A1 (de) 1996-05-24 1997-11-27 Basf Ag Kohlenhydratderivate und ihre Synthese an fester Phase
US6696251B1 (en) 1996-05-31 2004-02-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6203978B1 (en) * 1996-05-31 2001-03-20 Du Vergier Ltd. Capture of single stranded nucleic acids
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
JP3734040B2 (ja) 1996-06-14 2006-01-11 明治乳業株式会社 Ｔ細胞エピトープペプチド
WO1997049430A1 (en) * 1996-06-26 1997-12-31 Antigen Express, Inc. Immunotherapy by modulation of antigen presentation
DE19626762A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Basf Ag Enzymatisch spaltbare Linker für Festphasensynthesen
US6355613B1 (en) 1996-07-31 2002-03-12 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5922872A (en) * 1996-08-01 1999-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Meta-benzylic and alpha-amido compositions and methods for preparing same
US5817489A (en) * 1996-08-01 1998-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Di-nitrogen heterocycle compositions
US6576239B1 (en) 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
WO1998011437A1 (en) 1996-09-16 1998-03-19 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries with tagged leaving groups
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5798035A (en) 1996-10-03 1998-08-25 Pharmacopeia, Inc. High throughput solid phase chemical synthesis utilizing thin cylindrical reaction vessels useable for biological assay
US20020022227A1 (en) * 1996-10-17 2002-02-21 Short Jay M. Morphatides: novel shape and structure libraries
US6838238B1 (en) * 1996-10-17 2005-01-04 Invitrogen Corporation Morphatides: novel shape and structure libraries
US6149869A (en) * 1996-10-23 2000-11-21 Glaxo Wellcome Inc. Chemical synthesizers
US6042789A (en) * 1996-10-23 2000-03-28 Glaxo Group Limited System for parallel synthesis of organic compounds
US6025371A (en) * 1996-10-28 2000-02-15 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6413724B1 (en) 1996-10-28 2002-07-02 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6571227B1 (en) 1996-11-04 2003-05-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system and computer program product for non-linear mapping of multi-dimensional data
US6453246B1 (en) 1996-11-04 2002-09-17 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing proximity data in a multi-dimensional space
CA2270527A1 (en) 1996-11-04 1998-05-14 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for the visualization and interactive processing and analysis of chemical data
EP1164203B1 (en) 1996-11-06 2007-10-10 Sequenom, Inc. DNA Diagnostics based on mass spectrometry
US6054325A (en) * 1996-12-02 2000-04-25 Glaxo Wellcom Inc. Method and apparatus for transferring and combining distinct chemical compositions with reagents
US6083761A (en) * 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
AU7624298A (en) * 1996-12-03 1998-06-29 Graybill, Todd L. Aminobenzenedicarboxylic acid-based combinatorial libraries
AU5794498A (en) 1996-12-10 1998-07-03 Genetrace Systems, Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
CA2283474A1 (en) * 1997-03-04 1998-09-11 Bio-Technology General Corp. Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs
US6045755A (en) * 1997-03-10 2000-04-04 Trega Biosciences,, Inc. Apparatus and method for combinatorial chemistry synthesis
US6177464B1 (en) 1997-03-14 2001-01-23 Sepracor, Inc. Ring opening metathesis of alkenes
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
JPH10260223A (ja) * 1997-03-19 1998-09-29 Fujitsu Ltd 半導体検査装置及びこれを用いた検査方法
JP2002506423A (ja) * 1997-04-11 2002-02-26 イーライ・リリー・アンド・カンパニー ペプチド模倣型大員環のコンビナトリアルライブラリーとそのための方法
US6004823A (en) * 1997-05-07 1999-12-21 Smithkline Beecham Corporation Compounds
US5908960A (en) * 1997-05-07 1999-06-01 Smithkline Beecham Corporation Compounds
GB9710582D0 (en) 1997-05-22 1997-07-16 Oxford Glycosciences Uk Ltd A method for de novo peptide sequence determination
AU756945B2 (en) * 1997-05-23 2003-01-30 Bioarray Solutions Ltd Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
WO1998058256A1 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill PEPTIDO OLIGONUCLEOTIDES (PONs) AND THEIR COMBINATORIAL LIBRARIES
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
EP1387390B1 (en) 1997-06-20 2009-02-18 Bio - Rad Laboratories, Inc. Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine
US5874589A (en) * 1997-07-18 1999-02-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for synthesizing diverse collections of tetramic acids and derivatives thereof
US6410342B1 (en) * 1997-08-19 2002-06-25 Pharmacopeia, Inc. Method and apparatus for controlled photoelution
US6960457B1 (en) 1997-09-04 2005-11-01 Stanford University Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface
US7252950B1 (en) 1997-09-04 2007-08-07 The Regents Of The University Of California Assays for detecting modulators of cytoskeletal function
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
ATE218892T1 (de) 1997-11-07 2002-06-15 Conjuchem Inc Affinitätsmarkierer für menschliches serum albumin
US6228579B1 (en) * 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
US6083682A (en) * 1997-12-19 2000-07-04 Glaxo Group Limited System and method for solid-phase parallel synthesis of a combinatorial collection of compounds
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US6497820B1 (en) 1998-02-03 2002-12-24 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
US5968361A (en) * 1998-02-24 1999-10-19 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
AU2795399A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Hplc fractionation of complex chemical mixtures
US6232287B1 (en) 1998-03-13 2001-05-15 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
EP1062508A1 (en) 1998-03-20 2000-12-27 The Rockefeller University Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof
AU767185B2 (en) 1998-03-23 2003-11-06 President And Fellows Of Harvard College Synthesis of compounds and libraries of compounds
AU3457199A (en) * 1998-03-30 1999-10-18 Arch Development Corporation Methods and compounds for modulating nuclear receptor activity
US6316616B1 (en) 1998-04-02 2001-11-13 President And Fellows Of Harvard College Parallel combinatorial approach to the discovery and optimization of catalysts and uses thereof
US6872537B1 (en) 1998-04-14 2005-03-29 Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
WO1999053295A1 (en) 1998-04-14 1999-10-21 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
US6699969B1 (en) 1998-04-14 2004-03-02 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
DE19819889A1 (de) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren
CA2330790A1 (en) 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Method and device for isolating nucleic acids
US6541211B1 (en) 1998-05-20 2003-04-01 Selectide Corporation Apparatus and method for synthesizing combinational libraries
US6872535B2 (en) 1998-05-20 2005-03-29 Aventis Pharmaceuticals Inc. Three-dimensional array of supports for solid-phase parallel synthesis and method of use
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US7387779B2 (en) * 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US7402400B2 (en) 2001-07-03 2008-07-22 Regents Of The University Of California Mammalian sweet taste receptors
AU757955B2 (en) 1998-08-17 2003-03-13 Bristol-Myers Squibb Company Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules
US6633543B1 (en) * 1998-08-27 2003-10-14 Intel Corporation Multicast flow control
US6423493B1 (en) * 1998-10-26 2002-07-23 Board Of Regents The University Of Texas System Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US20040242521A1 (en) * 1999-10-25 2004-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Thio-siRNA aptamers
AU1818400A (en) * 1998-11-12 2000-05-29 Eli Lilly And Company Aryloxime linkers in the solid-phase synthesis of 3-aminobenzisoxazoles
US20030027214A1 (en) * 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
EP1185871A4 (en) 1999-06-01 2003-01-15 Caliper Techn Corp MICRO-SCALE ASSAYS AND MICROFLUIDIC DEVICES FOR THE CONTROL OF TRANSPORTER, INDUCED GRADIENT AND BINDING ACTIVITIES
JP2003502304A (ja) 1999-06-14 2003-01-21 ジェネンテック・インコーポレーテッド ターンライブラリをファージ上に表示するための構造化ペプチド骨格
SE9902479D0 (sv) * 1999-06-30 1999-06-30 Amersham Pharm Biotech Ab Particle classification as marker
US7742877B1 (en) * 1999-07-22 2010-06-22 Becton, Dickinson & Company Methods, apparatus and computer program products for formulating culture media
EP1218545B1 (en) * 1999-08-18 2012-01-25 Illumina, Inc. Methods for preparing oligonucleotide solutions
DE60044904D1 (de) 1999-09-03 2010-10-14 Brigham & Womens Hospital Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von entzündungskrankheiten unter verwendung von cadherin-11-modulierenden agenzien
US6503713B1 (en) * 1999-10-04 2003-01-07 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Methods for identifying RNA binding compounds
US6569685B1 (en) 1999-10-05 2003-05-27 The Molecular Sciences Institute, Inc. Protein fingerprint system and related methods
KR100378252B1 (ko) * 1999-11-12 2003-03-29 학교법인 포항공과대학교 니트로술포닐에톡시카르보닐-아미노산을 이용한 합성테트라펩티드 라이브러리의 제조방법
US6458538B1 (en) * 1999-12-14 2002-10-01 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay
US7452664B2 (en) 1999-12-15 2008-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation
US8642284B1 (en) 1999-12-15 2014-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents that alter NAD-dependent deacetylation activity of a SIR2 protein
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
JP2003520050A (ja) 2000-01-24 2003-07-02 フィロス インク． タンパク質分析のための高感度多重化診断アッセイ法
JP2003523504A (ja) 2000-02-03 2003-08-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 認知に影響する因子の検出のためのアッセイ
US7416524B1 (en) 2000-02-18 2008-08-26 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. System, method and computer program product for fast and efficient searching of large chemical libraries
US6671627B2 (en) 2000-02-29 2003-12-30 3-D Pharmaceuticals, Inc. Method and computer program product for designing combinatorial arrays
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
AU2001247627A1 (en) 2000-03-22 2001-10-03 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
US20050037430A1 (en) * 2000-03-29 2005-02-17 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
USRE43279E1 (en) 2000-03-29 2012-03-27 Biotemp B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
AU2001249805A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
AU2001268468A1 (en) 2000-06-13 2001-12-24 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
CA2413978C (en) 2000-06-21 2008-12-16 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
US6759510B1 (en) * 2000-06-30 2004-07-06 Becton, Dickinson And Company Peptides for use in culture media
US20020019010A1 (en) * 2000-07-07 2002-02-14 Stockwell Brent R. Methods for identifying combinations of entities as therapeutics
US20020051991A1 (en) * 2000-07-11 2002-05-02 Zhi Hong Rapid generation of diverse nucleoside and nucleotide libraries
WO2002014867A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Agilix Corporation Ultra-sensitive detection systems
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US7452964B2 (en) 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US6963807B2 (en) 2000-09-08 2005-11-08 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Automated identification of peptides
US7420030B2 (en) 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
AU2001292142A1 (en) * 2000-09-11 2002-03-22 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
WO2002023202A2 (en) * 2000-09-18 2002-03-21 Genzyme Corporation Method to identify antibody targets based on mass spectrometry (maldi-tof)
AU2001294654A1 (en) 2000-09-25 2002-04-08 The Regents Of The University Of California Model for neurodegenerative diseases involving amyloid accumulation
US20030045005A1 (en) * 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US7045283B2 (en) 2000-10-18 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies
WO2002046400A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mutated class ii major histocompatibility proteins
US7572575B2 (en) 2000-12-13 2009-08-11 Massachusetts Institute Of Technology SIR2 activity
EP1404867B1 (en) 2000-12-23 2008-02-27 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Oligonucleotide transfection screening method
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
US7054757B2 (en) 2001-01-29 2006-05-30 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. Method, system, and computer program product for analyzing combinatorial libraries
DE10106339A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-22 Hans-Joachim Mueller Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
US20060228730A1 (en) * 2001-04-11 2006-10-12 Rando Robert F Methods for identifying small molecules that bind specific RNA structural motifs
US20050142545A1 (en) * 2001-04-11 2005-06-30 Conn Michael M. Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs
CA2381627C (en) * 2001-04-13 2010-06-22 Michael J. Mitrovich Solid lubricant and composition
US6914123B2 (en) 2001-04-17 2005-07-05 Genentech, Inc. Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
CZ20033143A3 (en) 2001-05-21 2004-04-14 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
US20030148380A1 (en) * 2001-06-05 2003-08-07 Belcher Angela M. Molecular recognition of materials
US20030113714A1 (en) * 2001-09-28 2003-06-19 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticles
US20050164515A9 (en) * 2001-06-05 2005-07-28 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticle nucleation, shape and crystal phase
JP4342934B2 (ja) 2001-06-11 2009-10-14 キセノポート インコーポレーティッド Ｐｅｐｔ−２輸送体を介した薬剤の投与
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
EP2327985B2 (en) 2001-06-26 2019-08-21 Senomyx, Inc. T1R Hetero-oligomeric taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of taste compounds
AU2002312566A1 (en) 2001-07-09 2003-01-29 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
US6800449B1 (en) * 2001-07-13 2004-10-05 Syngenta Participations Ag High throughput functional proteomics
US7413870B2 (en) 2001-08-01 2008-08-19 Rigel Pharmaceuticals, Incorporated SAK: modulation of cellular proliferation for treatment of cancer
US6767731B2 (en) * 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
TW573125B (en) * 2001-08-29 2004-01-21 Combinatorx Inc A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof
US20030073104A1 (en) * 2001-10-02 2003-04-17 Belcher Angela M. Nanoscaling ordering of hybrid materials using genetically engineered mesoscale virus
CA2497740C (en) 2001-10-15 2011-06-21 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
WO2003035679A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Medical Research Council Molecules
US7262269B2 (en) 2001-10-26 2007-08-28 The Regents Of University Of California Method for screening combinational bead library; ligands for cancer cells
US6670142B2 (en) 2001-10-26 2003-12-30 The Regents Of The University Of California Method for screening combinatorial bead library, capturing cells from body fluids, and ligands for cancer cells
US20030124595A1 (en) * 2001-11-06 2003-07-03 Lizardi Paul M. Sensitive coded detection systems
JP2005518442A (ja) * 2001-11-20 2005-06-23 デューク・ユニバーシティー 界面バイオマテリアル
US7871619B2 (en) 2001-11-30 2011-01-18 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
WO2003052053A2 (en) * 2001-12-17 2003-06-26 Ribapharm Inc. Nucleoside libraries and compounds by mcc combinatorial strategies on solid support
US7291456B2 (en) 2002-01-24 2007-11-06 The Regents Of The University Of California Method for determining differences in molecular interactions and for screening a combinatorial library
JP2005516336A (ja) * 2002-01-28 2005-06-02 バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド 論理的なトリガのための方法および装置
CA2471017A1 (en) 2002-01-31 2003-08-07 Burstein Technologies, Inc. Method for triggering through disc grooves and related optical analysis discs and system
WO2003066829A2 (en) * 2002-02-07 2003-08-14 Discovery Genomics, Inc. Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation and methods of use thereof
WO2003076572A2 (en) 2002-03-04 2003-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Novel nucleic acid molecules and polypeptides encoding baboon tafi
IL163822A0 (en) 2002-03-15 2005-12-18 Nuevolution As An improved method for synthesising templated molecules
US7544767B2 (en) 2002-04-05 2009-06-09 Burnham Institute For Medical Research HMGN2 peptides and related molecules that selectively home to tumor blood vessels and tumor cells
WO2003089922A1 (en) 2002-04-15 2003-10-30 American National Red Cross Method for detecting ligands and targets in a mixture
US20060275753A1 (en) * 2002-04-15 2006-12-07 Hammond David J Recovery of analytes using combinatorial libraries
EP1578781A4 (en) * 2002-05-17 2007-05-30 Alfred E Slanetz METHOD FOR DETERMINING THE TARGET FUNCTION AND IDENTIFICATION OF MEDICAL DEVICE STRUCTURES
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
US7291461B2 (en) * 2002-06-21 2007-11-06 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mRNA decay
US20100168037A1 (en) * 2002-07-03 2010-07-01 Bio Science International, Inc. Peptides comprising aromatic d-amino acids and methods of use
ATE464392T1 (de) * 2002-07-11 2010-04-15 American Nat Red Cross Verfahren zur identifizierung einzelner aktiver einheiten aus komplexen gemischen
US7301006B2 (en) * 2002-07-16 2007-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and materials for the synthesis of modified peptides
EP1543157A4 (en) * 2002-07-24 2006-11-15 Ptc Therapeutics Inc METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLECULES MODULATING PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND DEGRADATION OF INDUCED MRNA BY NON-SENSE MUTATION
EP1539980B1 (en) 2002-08-01 2016-02-17 Nuevolution A/S Library of complexes comprising small non-peptide molecules and double-stranded oligonucleotides identifying the molecules
US20040081653A1 (en) 2002-08-16 2004-04-29 Raitano Arthur B. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer
CN104383554B (zh) 2002-09-06 2018-06-08 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的以环糊精为基础的聚合物
US7157228B2 (en) * 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US20050064508A1 (en) 2003-09-22 2005-03-24 Semzyme Peptide mediated synthesis of metallic and magnetic materials
CA2749227A1 (en) * 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
AU2003272169A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-13 Biacore Ab Assay with co-immobilized ligands
DK3299463T3 (da) 2002-10-30 2020-12-07 Nuevolution As Enzymatisk kodning
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
US7863411B2 (en) 2002-12-03 2011-01-04 Pathogen Removal and Diagnostics Technologies Inc. Prion protein ligands and methods of use
US20040185473A1 (en) * 2002-12-17 2004-09-23 Affymetrix, Inc. Releasable polymer arrays
DE60330406D1 (de) 2002-12-19 2010-01-14 Nuevolution As Durch quasizufallsstrukturen und funktionen geführte synthesemethode
US7736909B2 (en) * 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
AT413945B (de) * 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
JP2006518997A (ja) 2003-01-21 2006-08-24 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 新規アシルコエンザイムａ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−３（ｍｇａｔ３）をコードするポリヌクレオチドおよびその用途
WO2004074429A2 (en) 2003-02-21 2004-09-02 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
GB0305448D0 (en) * 2003-03-10 2003-04-16 Tcp Innovations Ltd Immunoassay
US20040185499A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Jolley Michael E. Method of epitope scanning using fluorescence polarization
WO2004085049A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 The Regents Of The University Of California Preparation and application of encoded bead aggregates in combinatorial chemistry
US20040235054A1 (en) * 2003-03-28 2004-11-25 The Regents Of The University Of California Novel encoding method for "one-bead one-compound" combinatorial libraries
US20060078893A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0307428D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
WO2004087865A2 (en) * 2003-03-31 2004-10-14 The Regents Of The University Of California The preparation and application of ligand-biopolymer conjugates
PL1615992T3 (pl) 2003-04-04 2014-03-31 Pathogen Removal And Diagnostic Tech Inc Materiały wiążące białko prionowe i sposoby ich zastosowania
US7510848B2 (en) 2003-04-04 2009-03-31 North Carolina State University Prion protein binding materials and methods of use
US20040210036A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-21 Nanogen, Inc. Peptide substrate libraries
EP1641555B1 (en) 2003-04-30 2020-12-02 Nexus Biosystems, Inc. Multi-well plate providing a high-density storage and assay platform
US7910523B2 (en) * 2003-05-23 2011-03-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting AP-1 transcription factors
US20060121489A1 (en) * 2003-05-23 2006-06-08 Board Of Regents, The University Of Texas System High throughput screening of aptamer libraries for specific binding to proteins on viruses and other pathogens
KR101291787B1 (ko) 2003-05-30 2013-08-07 어젠시스 인코포레이티드 전립선 줄기 세포 항원 (ｐｓｃａ) 변이체 및 그의서브서열
JP2007526438A (ja) * 2003-06-06 2007-09-13 コンビナトルックス インコーポレイテッド 組成物の組み合わせの多次元評価システムおよび方法
US7672791B2 (en) * 2003-06-13 2010-03-02 International Business Machines Corporation Method of performing three-dimensional molecular superposition and similarity searches in databases of flexible molecules
WO2005010016A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-03 Board Of Regents Thioaptamers enable discovery of physiological pathways and new therapeutic strategies
US7619059B2 (en) 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
CA2445420A1 (en) 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
WO2005015158A2 (en) 2003-08-06 2005-02-17 Senomyx Inc. T1r hetero-oligomeric taste receptors, cell lines that express said receptors, and taste compounds
US7927796B2 (en) 2003-09-18 2011-04-19 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
DK1670939T3 (da) 2003-09-18 2010-03-01 Nuevolution As Fremgangsmåde til opnåelse af strukturel information om et kodet molekyle og fremgangsmåde til udvælgelse af forbindelser
EP1664722B1 (en) 2003-09-22 2011-11-02 Bioarray Solutions Ltd Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
WO2005035552A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-21 Genzyme Corporation Transducing combinatorial peptide library
CA2544041C (en) 2003-10-28 2015-12-08 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
WO2005045060A2 (en) 2003-10-29 2005-05-19 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna
EP2369348A1 (en) 2003-11-07 2011-09-28 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for Alzheimer's disease
WO2005060739A1 (en) 2003-12-24 2005-07-07 G2 Inflammation Pty Ltd Transgenic non-human mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized c5ar
US20050164167A1 (en) * 2004-01-28 2005-07-28 Buscher Benjamin A. Method of discovery and development of broad-spectrum antiviral drugs
US20050221339A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
CN1964740A (zh) 2004-04-02 2007-05-16 加利福尼亚大学董事会 治疗和预防与αVβ5整联蛋白有关的疾病的方法和组合物
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
US8900856B2 (en) 2004-04-08 2014-12-02 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20050239134A1 (en) * 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
WO2005116643A2 (en) 2004-05-25 2005-12-08 Carlsberg A/S Identification of compounds modifying a cellular response
RU2381234C2 (ru) 2004-05-28 2010-02-10 Эдженсис, Инк. Антитела и родственные молекулы, связывающиеся с белками psca
DK2453024T3 (en) 2004-06-21 2018-02-12 Univ Leland Stanford Junior Genes and conduits that are differentially expressed in bipolar disorder and / or major depressive disorder
JP4507080B2 (ja) * 2004-07-30 2010-07-21 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
AU2005277648B2 (en) 2004-08-20 2011-12-22 Buck Institute For Age Research Small molecules that replace or agonize p53 function
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
US8338093B2 (en) * 2004-12-31 2012-12-25 Affymetrix, Inc. Primer array synthesis and validation
US7547775B2 (en) * 2004-12-31 2009-06-16 Affymetrix, Inc. Parallel preparation of high fidelity probes in an array format
JP2008529035A (ja) * 2005-02-03 2008-07-31 パーキンエルマー エルエーエス，インク． 多次元シグナルを用いる超高感度検出システム
US20100196509A1 (en) 2005-02-28 2010-08-05 Jonathan Braun Methods for Diagnosis and Treatment of Endometrial Cancer
US20100240770A1 (en) * 2005-03-11 2010-09-23 Jifa Qi Synthesis and use of colloidal III-V nanoparticles
JP2008532559A (ja) 2005-03-19 2008-08-21 メディカル リサーチ カウンシル ウイルス感染の治療及び予防又は治療及び予防の改善
WO2006101187A1 (en) 2005-03-22 2006-09-28 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides that increase collagen or hyaluronic acid production
CN101495645B (zh) 2005-03-23 2012-08-22 生物-拉德实验室公司 蛋白纯化方法
WO2006105488A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
US8318906B2 (en) 2005-04-15 2012-11-27 The Regents Of The University Of California EMP2 antibodies and their therapeutic uses
US20070099830A1 (en) 2005-04-21 2007-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Sirt4 activities
US20070003954A1 (en) * 2005-05-12 2007-01-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20070021433A1 (en) 2005-06-03 2007-01-25 Jian-Qiang Fan Pharmacological chaperones for treating obesity
NZ598031A (en) 2005-07-19 2013-11-29 Stemgen S P A Inhibition of the tumorigenic potential of tumor stem cells by lif and bmps
WO2007022530A2 (en) * 2005-08-16 2007-02-22 The Children's Mercy Hospital Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof
US7943134B2 (en) 2005-08-31 2011-05-17 Academia Sinica Compositions and methods for identifying response targets and treating flavivirus infection responses
US7781209B2 (en) 2005-09-25 2010-08-24 Multispan, Inc. GPCR-expressing cell lines
CA2952660C (en) 2005-10-20 2018-09-11 Senomyx, Inc. Chimeric human sweet-umami and umami-sweet taste receptors
US8119572B2 (en) * 2005-10-24 2012-02-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries
AU2006311827A1 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Redpoint Bio Corporation High throughput screening assay for the TRPM5 ion channel
NZ568762A (en) 2005-11-07 2011-11-25 Scripps Research Inst Use of an inhibitor of tissue factor signaling in the manufacture of a medcament for inhibiting or suppressing tissue factor/tissue factor VIIa signaling involving protease activated receptor 2 in a mammal
EP2564864B8 (en) 2005-11-12 2015-05-13 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University FGF2-related methods for diagnosing and treating depression
US7576037B2 (en) 2005-11-18 2009-08-18 Mei Technologies, Inc. Process and apparatus for combinatorial synthesis
LT3305900T (lt) 2005-12-01 2021-11-10 Nuevolution A/S Fermentiniai kodavimo būdai didelių bibliotekų efektyviai sintezei
GB2433505A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Capture agents for binding a ligand
GB2433506A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk A method of producing a multimeric capture agent
GB2433591A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Method for functionalising a hydrophobic substrate
EP1976567B1 (en) 2005-12-28 2020-05-13 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
WO2007081387A1 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices, methods of use, and kits for performing diagnostics
WO2007079755A1 (en) * 2006-01-12 2007-07-19 Janus Beierholm Holding Aps Reimmunization and antibody design
WO2007092777A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
US20100278821A1 (en) 2006-03-21 2010-11-04 The Regents Of The University Of California N-cadherin: target for cancer diagnosis and therapy
WO2007109347A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Regents Of The University Of California N-cadherin and ly6 e: targets for cancer diagnosis and therapy
CN101472947A (zh) * 2006-04-21 2009-07-01 惠氏公司 用于高通量筛选细胞系的方法
TWI674069B (zh) 2006-04-21 2019-10-11 美商賽諾米克斯公司 包含高度鮮味風味劑之可食用組合物及其製造方法
PL2027158T3 (pl) * 2006-05-02 2013-02-28 Carviar Aps Sposób immunizacji gatunków ptaków
EP2011882B1 (en) 2006-05-02 2012-03-28 Teikyo University Method for screening of substance capable of increasing glutathione
WO2008063227A2 (en) * 2006-05-11 2008-05-29 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US7862812B2 (en) 2006-05-31 2011-01-04 Lpath, Inc. Methods for decreasing immune response and treating immune conditions
EP1865316B1 (en) 2006-06-07 2010-02-24 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients GmbH Screening methods for compounds that modulate the activity of G-protein coupled receptors
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008013861A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of trpa1 activation by a lower alkyl phenol
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
EP2423333A1 (en) 2006-08-25 2012-02-29 Oncotherapy Science, Inc. Prognostic markers and therapeutic targets for lung cancer
EP2679998A1 (en) 2006-09-06 2014-01-01 The Regents of the University of California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma
US20090252745A1 (en) * 2006-09-15 2009-10-08 Duke University Amino acids in the HCV core polypeptide domain 3 and correlation with steatosis
WO2008063933A2 (en) 2006-11-10 2008-05-29 Massachusetts Institute Of Technology Pak modulators
WO2008067196A2 (en) 2006-11-16 2008-06-05 The Regents Of The University Of California Methods for identifying inhibitors of solute transporters
AU2007341981A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 The Salk Institute For Biological Studies Methods for enhancing exercise performance
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
US8772046B2 (en) * 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20080269065A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Syntrix Biosystems, Inc. Conformationally Constrained Analytical Probes
KR101440153B1 (ko) * 2007-05-09 2014-09-15 재단법인서울대학교산학협력재단 펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의기질특이성 분석 방법
WO2009023059A2 (en) 2007-06-01 2009-02-19 The Trustees Of Princeton University Treatment of viral infections by modulation of host cell metabolic pathways
US9364432B2 (en) 2007-06-11 2016-06-14 Edge Therapeutics, Inc. Intraventricular drug delivery system for improving outcome after a brain injury affecting cerebral blood flow
CN105055300A (zh) * 2007-06-11 2015-11-18 R·骆克·麦克唐纳 用于预防脑血管痉挛的药物递送系统
US10092524B2 (en) 2008-06-11 2018-10-09 Edge Therapeutics, Inc. Compositions and their use to treat complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage
US8334239B2 (en) * 2007-07-10 2012-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High affinity VEGF-receptor antagonists
US8163874B2 (en) * 2007-08-06 2012-04-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Beta helical peptide structures stable in aqueous and non-aqueous media and methods for preparing same
US8703161B2 (en) * 2007-08-13 2014-04-22 Elc Management, Llc Skin repair compositions comprising circadian gene activators and a synergistic combination of Sirt1 gene activators
ES2477292T3 (es) 2007-08-13 2014-07-16 Baxter International Inc. Modulación por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson
WO2009025793A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Senomyx, Inc. Human t2r bitterness receptors and uses thereof
WO2009045377A2 (en) 2007-10-01 2009-04-09 Redpoint Bio Corporation A non-desensitizing mutant of the transient receptor potential trpm5 ion channel
KR101662622B1 (ko) 2007-10-04 2016-10-05 지모제넥틱스, 인코포레이티드 Ｂ7 패밀리 구성원 ｚＢ7Ｈ6 및 관련된 조성물 및 방법
CA2703165A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 The Regents Of The University Of California Biomarkers for prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus
JP2011514881A (ja) 2007-11-09 2011-05-12 ザ ソルク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 免疫増強剤としてのｔａｍ受容体阻害剤の使用および免疫抑制剤としてのｔａｍ活性化剤の使用
WO2009079373A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 The Regents Of The University Of California Inhibitors of calcium-activated chloride channels
EP2077272A1 (en) 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
US9187535B2 (en) 2007-12-19 2015-11-17 Affibody Ab Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
NZ587750A (en) 2008-03-05 2012-10-26 Univ California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma
EP2955222B1 (en) 2008-03-17 2018-09-12 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009131957A2 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising oxadiazole derivatives
CA2721980C (en) 2008-04-21 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Selective high-affinity poly dentate ligands and methods of making such
JP2010043063A (ja) 2008-05-09 2010-02-25 Agency For Science Technology & Research 川崎病の診断及び治療
ES2845203T3 (es) 2008-07-01 2021-07-26 Genocea Biosciences Inc Sistema de análisis de antígenos
EP2315629B1 (en) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet libraries
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
WO2010017248A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 University Of Miami Sting (stimulator of interferon genes), a regulator of innate immune responses
WO2010022249A2 (en) 2008-08-20 2010-02-25 Ensemble Discovery Corporation Macrocyclic compounds for inhibition of tumor necrosis factor alpha
CN102224254A (zh) 2008-09-23 2011-10-19 哈佛大学校长及研究员协会 Sirt4及其用途
US20130074214A1 (en) 2008-09-25 2013-03-21 University Of Guelph Nitrogen Responsive Early Nodulin Gene
KR101151805B1 (ko) 2008-10-20 2012-06-01 광주과학기술원 바이포달 펩타이드 바인더
JP5798037B2 (ja) 2008-11-06 2015-10-21 ユニバーシティ オブ マイアミ 蛋白尿腎疾患の病因における可溶性ｕＰＡＲの役割
EP2687609B1 (en) 2008-11-10 2017-01-04 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Method for treating solid tumor
WO2010060599A1 (en) 2008-11-27 2010-06-03 Roche Diagnostics Gmbh Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers
EP2370445B1 (en) 2008-12-03 2014-07-23 The Scripps Research Institute Stem cell cultures
RU2618688C2 (ru) 2008-12-04 2017-05-10 КьюРНА,Инк.,US Лечение связанных с геном-супрессором опухолей заболеваний посредством ингибирования природного транскрипта в антисмысловой ориентации относительно этого гена
CA2745329C (en) 2008-12-04 2022-07-12 Opko Curna, Llc Treatment of erythropoietin (epo) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to epo
EP2370581B1 (en) 2008-12-04 2016-08-03 CuRNA, Inc. Treatment of vascular endothelial growth factor (vegf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to vegf
EP2370175A2 (en) 2008-12-16 2011-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Methods of inhibiting quiescent tumor proliferation
ES2645869T3 (es) 2008-12-17 2017-12-11 The Scripps Research Institute Generación y mantenimiento de células madre
US20120165650A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 General Electric Company Her2 binders
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
EP2396038B1 (en) 2009-02-12 2015-10-21 CuRNA, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
ES2656290T3 (es) 2009-03-16 2018-02-26 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor nuclear (derivado de eritroide 2) similar al 2 (NRF2) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a NRF2
CA2755404C (en) 2009-03-17 2020-03-24 Joseph Collard Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
EP3415235A1 (en) 2009-03-23 2018-12-19 Raindance Technologies Inc. Manipulation of microfluidic droplets
KR20110140128A (ko) 2009-03-27 2011-12-30 고조 인더스트리즈, 인크 포자-표면 상호작용을 길항하는 화합물을 스크리닝 및 사용하기 위한 조성물 및 방법
US8343976B2 (en) 2009-04-20 2013-01-01 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising pyrazole derivatives
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
EP2427553A4 (en) 2009-05-06 2012-11-07 Opko Curna Llc TREATMENT OF LIPID TRANSPORT AND METABOLISM-RELATED DISEASES BY INHIBITING THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST A LIPID TRANSPORT AND METABOLIC TREATMENT
JP5931720B2 (ja) 2009-05-08 2016-06-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｄｍｄファミリーに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるジストロフィンファミリー関連疾患の治療
JP5922017B2 (ja) 2009-05-18 2016-05-24 クルナ・インコーポレーテッド リプログラミング因子に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるリプログラミング因子関連疾患の治療
US8895527B2 (en) 2009-05-22 2014-11-25 Curna, Inc. Treatment of transcription factor E3 (TFE3) and insulin receptor substrate 2(IRS2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TFE3
US8791085B2 (en) 2009-05-28 2014-07-29 Curna, Inc. Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
CA2765509C (en) 2009-06-16 2021-08-17 Joseph Collard Treatment of paraoxonase 1 (pon1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pon1
CN102695797B (zh) 2009-06-16 2018-05-25 库尔纳公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
CN102597238B (zh) 2009-06-24 2016-06-29 库尔纳公司 通过抑制针对肿瘤坏死因子受体2(tnfr2)的天然反义转录物来治疗tnfr2相关的疾病
EP2446037B1 (en) 2009-06-26 2016-04-20 CuRNA, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
CN102498123A (zh) * 2009-07-15 2012-06-13 新加坡科技研究局 改进的生物聚合物筛选
US20120122711A1 (en) * 2009-07-15 2012-05-17 Heath James R Screening of biopolymers
US9863956B2 (en) 2009-07-22 2018-01-09 Agency For Science, Technology And Research Differentiation of isobaric amino acids and other species
CA2767409C (en) 2009-07-24 2018-10-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with .alpha.v.beta.5 integrin
JP2013500017A (ja) 2009-07-24 2013-01-07 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド サ−チュイン（ｓｉｒｔ）への天然アンチセンス転写物の阻止によるサ−チュイン（ｓｉｒｔ）関連疾患の治療
KR101802536B1 (ko) 2009-08-05 2017-11-28 큐알엔에이, 인크. 인슐린 유전자 (ｉｎｓ)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 인슐린 유전자 (ｉｎｓ) 관련된 질환의 치료
KR101827015B1 (ko) 2009-08-11 2018-02-07 큐알엔에이, 인크. 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 아디포넥틴(ａｄｉｐｏｑ) 관련된 질환의 치료
CA2771102C (en) 2009-08-14 2019-10-15 The Regents Of The University Of California Methods of diagnosing and treating autism
EP2467398B1 (en) 2009-08-20 2019-10-09 Poseida Therapeutics, Inc. Trpc4 inhibitors and uses thereof
EP2467482A4 (en) 2009-08-21 2013-12-11 Curna Inc TREATMENT OF DISEASES RELATED TO "CIP PROTEIN CHIP EXTREME (PROTEIN INTERACTING WITH HSP70)" BY INHIBITION OF CHIP NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT
EP2470566A1 (en) 2009-08-24 2012-07-04 St. Jude Children's Research Hospital Compositions and methods for potentiating interleukin-35
US9023822B2 (en) 2009-08-25 2015-05-05 Curna, Inc. Treatment of 'IQ motif containing GTPase activating protein' (IQGAP) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IQGAP
CN102791861B (zh) 2009-09-25 2018-08-07 库尔纳公司 通过调节聚丝蛋白(flg)的表达和活性而治疗flg相关疾病
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
CA2781290A1 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Lynn K. Gordon Epithelial membrane protein-2 (emp2) and proliferative vitreoretinopathy (pvr)
BR112012012210B8 (pt) * 2009-11-23 2021-05-25 Cerulean Pharma Inc conjugado de (cdp)-taxano de polímero contendo ciclodextrina, composição, composição farmacêutica, forma de dosagem, kit e uso de um conjugado de cdp-taxano
CA2782366A1 (en) 2009-12-16 2011-07-14 Opko Curna, Llc Treatment of membrane bound transcription factor peptidase, site 1 (mbtps1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to mbtps1
EP2516648B1 (en) 2009-12-23 2017-11-08 CuRNA, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf
EP2515947B1 (en) 2009-12-23 2021-10-06 CuRNA, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US8962585B2 (en) 2009-12-29 2015-02-24 Curna, Inc. Treatment of tumor protein 63 (p63) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to p63
RU2615450C2 (ru) 2009-12-29 2017-04-04 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
WO2011082281A2 (en) 2009-12-31 2011-07-07 Curna, Inc. Treatment of insulin receptor substrate 2 (irs2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irs2 and transcription factor e3 (tfe3)
JP5886757B2 (ja) 2010-01-04 2016-03-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド インターフェロン調節因子８（ｉｒｆ８）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるインターフェロン調節因子８（ｉｒｆ８）関連疾患の治療
EP2521785B1 (en) 2010-01-06 2022-03-09 CuRNA, Inc. Inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene for use in a treatment of pancreatic developmental gene related diseases
CA2786535C (en) 2010-01-11 2019-03-26 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
CN202823394U (zh) 2010-01-19 2013-03-27 伊鲁米那股份有限公司 用于处理化学反应的设备和系统
WO2011091435A2 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Mount Sinai School Of Medicine Methods of treating liver disease
US8946182B2 (en) 2010-01-25 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of RNASE H1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to RNASE H1
WO2011094759A2 (en) 2010-02-01 2011-08-04 The Regents Of The University Of California Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US8535889B2 (en) 2010-02-12 2013-09-17 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5976548B2 (ja) 2010-02-22 2016-08-23 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｐｙｃｒ１に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるピロリン−５−カルボン酸レダクターゼ１（ｐｙｃｒ１）関連疾患の治療
US8980856B2 (en) 2010-04-02 2015-03-17 Curna, Inc. Treatment of colony-stimulating factor 3 (CSF3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to CSF3
US9044494B2 (en) 2010-04-09 2015-06-02 Curna, Inc. Treatment of fibroblast growth factor 21 (FGF21) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to FGF21
WO2011127933A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
EP2957636B1 (en) 2010-05-03 2020-04-01 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 3 (sirt3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt3
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
WO2011150005A2 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Opko Curna Llc Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
CA2799596C (en) 2010-05-26 2020-09-22 Curna, Inc. Treatment of methionine sulfoxide reductase a (msra) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to msra
EP2400304A1 (en) 2010-06-22 2011-12-28 Centro de Investigación Cooperativa En Biomateriales ( CIC biomaGUNE) Method for the characterization of intermolecular interactions
DK2585596T3 (da) 2010-06-23 2021-04-06 Curna Inc Behandling af spændingsreguleret natriumkanal-alpha-underenhed (scna)-relaterede sygdomme ved inhibering af naturligt antisense-transkript til scna
NO2593547T3 (cs) 2010-07-14 2018-04-14
EP2598661B1 (en) 2010-07-26 2017-09-27 Biomatrica, INC. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
CA2806670A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US20130267423A1 (en) * 2010-08-27 2013-10-10 Su Seong Lee Peptide libraries for screening and other applications
EP3447155A1 (en) 2010-09-30 2019-02-27 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2625274B1 (en) 2010-10-06 2017-07-19 CuRNA, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
WO2012052391A1 (en) 2010-10-19 2012-04-26 Glaxo Group Limited Polypeptide with jmjd3 catalytic activity
KR101865433B1 (ko) 2010-10-22 2018-07-13 큐알엔에이, 인크. 알파-l 이두로니다아제 (idua)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 idua 관련된 질환의 치료
US10000752B2 (en) 2010-11-18 2018-06-19 Curna, Inc. Antagonat compositions and methods of use
WO2012074855A2 (en) 2010-11-22 2012-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying a cellular nascent rna transcript
CA2818824A1 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Joseph Collard Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog
KR102482184B1 (ko) 2010-12-22 2022-12-28 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 단세포 분류 및 iPSC의 증강된 재프로그래밍을 위한 세포 배양 플랫폼
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
US9364803B2 (en) 2011-02-11 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP2675893B1 (en) 2011-02-18 2019-01-09 The Scripps Research Institute Directed differentiation of oligodendrocyte precursor cells to a myelinating cell fate
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012119989A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Oryzon Genomics, S.A. Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer
WO2012122025A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
US20120301904A1 (en) 2011-04-26 2012-11-29 Prosetta Antiviral, Inc Multiprotein assemblies
JP6040227B2 (ja) 2011-05-19 2016-12-07 アジーナ バイオサイエンス， インコーポレイテッド マルチプレックス核酸同定のための製品およびプロセス
US9556470B2 (en) 2011-06-02 2017-01-31 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
WO2012170742A2 (en) 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with hmgb1 antagonists
US9244074B2 (en) 2011-06-07 2016-01-26 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
WO2012170771A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Curna, Inc. Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9725490B2 (en) 2011-07-29 2017-08-08 Tokushima University ERAP1-derived peptide and use thereof
JP6342805B2 (ja) 2011-09-02 2018-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンおよびその用途
CN103874486A (zh) 2011-09-06 2014-06-18 库尔纳公司 用小分子治疗与电压门控钠通道的α亚基(SCNxA)相关的疾病
US20140323907A1 (en) 2011-10-28 2014-10-30 Jason Frazier Methods for drug delivery
RS57919B1 (sr) 2011-12-16 2019-01-31 Poseida Therapeutics Inc Trpc4 modulatori za primenu u lečenju ili prevenciji bola
EP2812344A4 (en) * 2012-02-07 2015-10-28 Vibrant Holdings Llc SUBSTRATES, PEPTIDE NETWORKS AND METHODS
JP6253596B2 (ja) 2012-02-16 2017-12-27 ザ ペン ステイト リサーチ ファンデーション アシル補酵素ａ：リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素１（ａｌｃａｔ１）の発現、機能または活性の阻害物質を同定する方法
US10105351B2 (en) 2012-03-14 2018-10-23 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Neurofibromatoses therapeutic agents and screening for same
JP2015511494A (ja) 2012-03-15 2015-04-20 キュアナ，インク． 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置
WO2013155223A1 (en) 2012-04-10 2013-10-17 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating cancer
JP2015516400A (ja) 2012-04-24 2015-06-11 ユニバーシティー オブ マイアミＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉａｍｉ 侵襲的かつ多剤耐性の病原体に対するパーフォリン２の防御
US9399019B2 (en) 2012-05-09 2016-07-26 Evonik Corporation Polymorph compositions, methods of making, and uses thereof
WO2013184645A2 (en) 2012-06-04 2013-12-12 The Scripps Research Institute Novel phenyl glyoxal probes
CA2879542A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Salk Institute For Biological Studies Regulating the interaction between tam ligands and lipid membranes with exposed phosphatidylserine
CA2922849A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Ixchel Pharma, Llc Agents useful for treating obesity, diabetes and related disorders
EP2900673A4 (en) 2012-09-26 2016-10-19 Univ California IRE1 MODULATION
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
AU2013204200B2 (en) 2012-10-11 2016-10-20 Brandeis University Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US20140120116A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The Chinese University Of Hong Kong Treatment of cancer using smad3 inhibitor
EP2912194B1 (en) 2012-10-26 2019-05-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Androgen receptor variants and methods for making and using
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
EP2928913A1 (en) * 2012-12-10 2015-10-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Lipocalin fusion partners
EP2934572A4 (en) 2012-12-20 2016-11-23 Biomatrica Inc FORMULATIONS AND METHODS FOR STABILIZING PCR REAGENTS
EP2954323B1 (en) 2013-02-07 2020-04-15 The Regents of The University of California Use of translational profiling to identify target molecules for therapeutic treatment
JP5981667B2 (ja) 2013-02-15 2016-08-31 ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー 増幅された電気化学発光検出のための方法および組成物
US9227978B2 (en) 2013-03-15 2016-01-05 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of Kras G12C
WO2014144844A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA DERIVED SMALL RNAs (tsRNAs) INVOLVED IN CELL VIABILITY
WO2014172661A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 The Regent Of The University Of California Lone star virus
US10626178B2 (en) 2013-08-21 2020-04-21 Raz Yirmiya Treatment of mood and stress related disorders
WO2015025323A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Treatment of mood and stress related disorders
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
JO3805B1 (ar) 2013-10-10 2021-01-31 Araxes Pharma Llc مثبطات كراس جي12سي
US9644037B2 (en) 2013-10-18 2017-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that specifically bind ataxia telangiectasia-mutated and RAD3-related kinase phosphorylated at position 1989 and their use
CN105979780A (zh) 2013-12-11 2016-09-28 斯隆-凯特林癌症研究院 治疗前列腺癌的糖皮质激素抑制剂
EP3444251B1 (en) 2013-12-11 2023-06-07 Biogen MA Inc. Biaryl compounds useful for the treatment of human diseases in oncology, neurology and immunology
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
CA2941004A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Peter Flynn Improved reprogramming methods and cell culture platforms
WO2015136509A2 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Genesis Theranostix Korlatolt Felelossegu Tarsasag Diagnostic and therapeutic targets for preeclampsia and closely related complications of pregnancy
EP3154338B1 (en) 2014-06-10 2020-01-29 Biomatrica, INC. Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
ES2826443T3 (es) 2014-09-25 2021-05-18 Araxes Pharma Llc Inhibidores de proteínas mutantes KRAS G12C
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
MX2017012979A (es) 2015-04-10 2017-11-28 Araxes Pharma Llc Compuestos de quinazolina sustituidos y metodos de uso de los mismos.
EP3283462B1 (en) 2015-04-15 2020-12-02 Araxes Pharma LLC Fused-tricyclic inhibitors of kras and methods of use thereof
EP3286327B1 (en) 2015-04-24 2021-11-10 Agena Bioscience, Inc. Multiplexed method for the identification and quantitation of minor alleles and polymorphisms
AU2016250849A1 (en) 2015-04-24 2017-11-02 Agena Bioscience, Inc. Multiplex methods for detection and quantification of minor variants
US10196701B2 (en) 2015-06-01 2019-02-05 The Penn State Research Foundation Hepatitis B virus capsid assembly
US20160370380A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Pharmaseq, Inc. Combinatorial antibody diagnostic
US10851423B2 (en) 2015-06-22 2020-12-01 Proteovista Llc SNP arrays
EP3314260B1 (en) 2015-06-24 2021-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for detecting protein-protein interactions
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
EP3356353A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10875842B2 (en) 2015-09-28 2020-12-29 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356351A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058792A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058805A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10975071B2 (en) 2015-09-28 2021-04-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356339A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
SG10202111851YA (en) 2015-10-16 2021-12-30 Fate Therapeutics Inc Platform for the Induction & Maintenance of Ground State Pluripotency
JP2018533939A (ja) 2015-10-19 2018-11-22 アラクセス ファーマ エルエルシー Ｒａｓの阻害剤をスクリーニングするための方法
EP3377481A1 (en) 2015-11-16 2018-09-26 Araxes Pharma LLC 2-substituted quinazoline compounds comprising a substituted heterocyclic group and methods of use thereof
WO2017100212A1 (en) 2015-12-08 2017-06-15 Biomatrica, Inc. Reduction of erythrocyte sedimentation rate
WO2017100546A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
CA3013829A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Alexander Krantz Site-selective functionalization of proteins using traceless affinity labels
WO2017172979A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
WO2018036503A1 (en) 2016-08-25 2018-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Fecal bacterial markers for colorectal cancer
EP3519402A1 (en) 2016-09-29 2019-08-07 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10726944B2 (en) 2016-10-04 2020-07-28 International Business Machines Corporation Recommending novel reactants to synthesize chemical products
EP3523289A1 (en) 2016-10-07 2019-08-14 Araxes Pharma LLC Heterocyclic compounds as inhibitors of ras and methods of use thereof
AU2017378487B2 (en) 2016-12-15 2022-03-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating cancer
US11274093B2 (en) 2017-01-26 2022-03-15 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
US11136308B2 (en) 2017-01-26 2021-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline and quinazolinone compounds and methods of use thereof
EP3573971A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c modulators for treating cancer
EP3573964A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
WO2018140600A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Fused hetero-hetero bicyclic compounds and methods of use thereof
WO2018170464A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 The Johns Hopkins University Targeted epigenetic therapy against distal regulatory element of tgfb2 expression
EP3601326A4 (en) 2017-03-20 2020-12-16 The Broad Institute, Inc. COMPOUNDS AND METHODS OF REGULATING INSULIN SECRETION
SG11201908530QA (en) 2017-03-20 2019-10-30 Genocea Biosciences Inc Treatment methods
JP7239181B2 (ja) 2017-04-04 2023-03-14 ロマ リンダ ユニヴァーシティ 癌治療のための生物製剤
US11639346B2 (en) 2017-05-25 2023-05-02 Araxes Pharma Llc Quinazoline derivatives as modulators of mutant KRAS, HRAS or NRAS
CN110869357A (zh) 2017-05-25 2020-03-06 亚瑞克西斯制药公司 化合物及其用于治疗癌症的使用方法
MX2019013954A (es) 2017-05-25 2020-08-31 Araxes Pharma Llc Inhibidores covalentes de kras.
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
WO2019046791A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 The Johns Hopkins University TARGETED EPIGENETIC THERAPY FOR AERIAL CONDITION OF AERTICAL HERITATION
EP3692073A4 (en) 2017-10-03 2021-05-26 Cedars-Sinai Medical Center METHOD OF TARGETING THE IMMUNE CHECK POINT PD1 SIGNAL PATH FOR TREATMENT OF LUNG FIBROSIS
WO2019090242A1 (en) 2017-11-04 2019-05-09 Advanced Proteome Therapeutics Inc. Composition and method for modifying polypeptides
MX2021000887A (es) 2018-08-01 2021-03-31 Araxes Pharma Llc Compuestos espiroheterociclicos y metodos de uso de los mismos para el tratamiento de cancer.
JP2022512897A (ja) 2018-10-29 2022-02-07 ジェノセア バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療方法
EP3873488B1 (en) 2018-10-31 2025-03-19 The University of Sydney Pharmaceutical compositions for use in treating an hbv or hdv infection
WO2020097261A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services New compositions and methods for treating beta-globinopathies
CN113365661A (zh) 2019-01-31 2021-09-07 新加坡科技研究局 用于治疗或预防癌症的cnx/erp57抑制剂
US20220249559A1 (en) 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
RU2699563C1 (ru) * 2019-05-29 2019-09-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт-ПИЯФ) Модифицированный синтетический аналог природного опиоидного пептида энкефалина
DE102020202529A1 (de) * 2020-02-27 2021-09-02 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren zur Identifikation einer Wirkstoffkombination
US11965162B2 (en) 2020-04-16 2024-04-23 The Johns Hopkins University MicroRNA and inhibitors thereof and methods of treatment
WO2023081167A2 (en) 2021-11-02 2023-05-11 The Regents Of The University Of California P-selectin mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2023086969A2 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Ichor Medical Systems Inc. Treatment methods
WO2023146807A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 The Regents Of The University Of California Vegf mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2024197185A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for dissecting organelle physiology

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4392997A (en) * 1981-07-06 1983-07-12 Northwestern University Antigenic peptide compounds
US4618598A (en) * 1982-04-12 1986-10-21 Duke University Method of regulating hormone function or release
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4555101A (en) * 1984-03-13 1985-11-26 Stobb, Inc. Method and apparatus for separating signatures from a stack
US4590003A (en) * 1984-03-23 1986-05-20 Oncogen Platelet related growth regulator
US4569792A (en) * 1984-06-14 1986-02-11 Eli Lilly And Company Anti-diabetic compounds
US4625014A (en) * 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
JPH07119760B2 (ja) * 1984-07-24 1995-12-20 コモンウエルス・セ−ラム・ラボラトリ−ズ・コミッション ミモトープを検出または決定する方法
US4798787A (en) * 1984-09-19 1989-01-17 Cetus Corporation Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products
US4705777A (en) * 1985-02-25 1987-11-10 The Regents Of The University Of California Cationic oligopeptides having microbicidal activity
US4863857A (en) * 1985-03-01 1989-09-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Polypeptide complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known
US4631211A (en) * 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
NZ215865A (en) * 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
WO1986006487A1 (en) * 1985-04-22 1986-11-06 Commonwealth Serum Laboratories Commission Method for determining mimotopes
US4710489A (en) * 1985-04-22 1987-12-01 Cornell Research Foundation, Inc. Glutathione delivery system
CS256960B1 (en) * 1985-11-16 1988-04-15 Viktor Krchnak Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
US4780421A (en) * 1986-04-03 1988-10-25 Sclavo Inc. Cleavable labels for use in binding assays
US4837304A (en) * 1987-05-22 1989-06-06 Merck & Co., Inc. Inhibitor of ribonucleotide reductase
DE3855890T2 (de) * 1987-10-13 1998-02-12 Terrapin Tech Inc Verfahren zur herstellung von imunodiagnose-mitteln
NZ228482A (en) * 1988-03-24 1991-03-26 Terrapin Tech Inc Chromatography substrate containing a peptide paralog (active site mimicer) peptide
US5010175A (en) * 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
WO1989011211A2 (en) * 1988-05-24 1989-11-30 Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh ( Oligonucleotide bank and process for dna sequencing
US4988625A (en) * 1988-11-09 1991-01-29 Merck & Co., Inc. Method for determining the functionalization of a solid support
CA2009996A1 (en) * 1989-02-17 1990-08-17 Kathleen S. Cook Process for making genes encoding random polymers of amino acids
US5182366A (en) * 1990-05-15 1993-01-26 Huebner Verena D Controlled synthesis of peptide mixtures using mixed resins
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
NO930011D0 (no) 1993-01-04
AU2845495A (en) 1996-05-16
AU2836995A (en) 1995-12-07
AU8238591A (en) 1992-01-23
WO1992000091A1 (en) 1992-01-09
EP0542770A4 (en) 1993-09-15
MX9100052A (es) 1992-02-28
HU9204179D0 (en) 1993-04-28
IL98682A0 (en) 1992-07-15
ATE176330T1 (de) 1999-02-15
NO930011L (no) 1993-02-22
RO112336B1 (ro) 1997-08-29
AU659091B2 (en) 1995-05-11
PL168354B1 (pl) 1996-02-29
US5650489A (en) 1997-07-22
ES2126572T3 (es) 1999-04-01
FI925986A0 (fi) 1992-12-31
CZ407392A3 (en) 1993-10-13
HU218007B (hu) 2000-05-28
EP0542770A1 (en) 1993-05-26
GR3029443T3 (en) 1999-05-28
NZ238805A (en) 1994-07-26
JPH06500308A (ja) 1994-01-13
DE69130828T2 (de) 1999-06-17
HUT63576A (en) 1993-09-28
KR100245767B1 (ko) 2000-03-15
CA2086672A1 (en) 1992-01-03
NO315002B1 (no) 2003-06-23
FI107995B (fi) 2001-11-15
DE69130828D1 (de) 1999-03-11
SK407392A3 (en) 1994-08-10
US5510240A (en) 1996-04-23
JP3552718B2 (ja) 2004-08-11
EP0542770B1 (en) 1999-01-27
KR100222146B1 (en) 1999-10-01
IE912299A1 (en) 1992-01-15
DK0542770T3 (da) 1999-09-13
AU683762B2 (en) 1997-11-20
IL98682A (en) 1997-02-18
SK281490B6 (sk) 2001-04-09
FI925986L (fi) 1992-12-31
US5858670A (en) 1999-01-12
PL169616B1 (pl) 1996-08-30
CA2086672C (en) 2005-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ289365B6 (cs) Banka oligomerů, způsob její přípravy a způsob stanovení sekvence bio-oligomeru
EP1310510B1 (en) Topologically segregated, encoded solid phase libraries
EP0705279B1 (en) Topologically segregated, encoded solid phase libraries
EP0639584B1 (en) Preparation and screening of highly diverse peptide libraries for binding activity
Lam et al. A one-bead one-peptide combinatorial library method for B-cell epitope mapping
US20080009068A1 (en) Protein-protein interactions and methods for identifying interacting proteins and the amino acid sequence at the site of interaction
US5948693A (en) Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
US5639852A (en) Immunostimulatory agents
WO1994018345A1 (en) Receptor-binding antiproliferative peptides
US6429286B1 (en) Immunoregulatory molecules for costimulatory signal transduction
RU2145233C1 (ru) Неупорядоченная библиотека пептидов, способ ее получения и способ идентификации пептида, синтезированного твердофазным синтезом
Weiner et al. Biological approaches to rational drug design
Hruby et al. Applications of synthetic peptides
EP0535804A1 (en) Peptide compounds
Stokes New methods for the synthesis of biologically active cyclosporins
Sepetov et al. A One-Bead One-Peptide Combinatorial Library Method for B-Cell Epitope Mapping
CN108218976A (zh) 衍生自lmp1的肿瘤抗原短肽

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20110701