CN1964740A - 治疗和预防与αVβ5整联蛋白有关的疾病的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过阻断与αvβ5整联蛋白的结合治疗和预防与αvβ5整联蛋白有关的疾病的组合物和方 法。

Description

治疗和预防与αVβ5整联蛋白有关的疾病的方法和组合物

交叉参考相关申请

本申请要求2004年4月2日申请的美国临时专利申请号60/559,175的权益，其中公开的内容完全引入作为参考。

有关发明权利的声明由联邦发起研究和开发本发明是由国家卫生研究院(the National Institutes of Health)资助的HL53949号基金在政府支持下进行的。政府拥有本发明的一些权利。

背景技术

肺水肿(“PE”)每年影响数百万的人，引起大量的发病率和死亡率。在PE患者中，具有来自肺毛细血管液体的肺泡流体妨碍氧向系统循环的转运(Hall等，in Current Therapy in Respiratory Medicine(R.Cherniack，Ed.，1986)，pp.222-227)。如果未采取正确的措施，这一系列事件将导致低血氧、高碳酸血症和死亡。

破坏肺部流体动态平衡的所有情况或药物可导致PE，广义上PE可分成心源性的和非心源性的PE(参见，例如，Kakouros和Kakouros，Hellenic J.Cardiol.44：385-391(2003)。例如，急性肺损伤/成人(急性)呼吸窘迫症或“ARDS”(其可由例如肺炎、感染性休克、创伤、呕吐吸引术、或吸入化学物质产生的肺损伤导致)经常与非心源性PE同时出现。非心源性PE的特点是肺组织血管通透性增加，导致肺中流体水平增加。心源性PE通常由左心衰竭导致，也可以是心梗发作、心瓣膜泄漏或狭窄(二尖瓣或主动脉瓣)、或导致心肌虚弱和/或僵硬(心肌病)的任何心脏疾病的并发症。病态的心脏将其增加的压力传递给肺静脉。当肺静脉压力增加时，流体挤入气体空间(肺泡)。然后这些液体成为正常氧交换的障碍，导致呼吸急促。心源性PE的特点是毛细管流体静水压增加，导致肺中流体水平增加。

PE是由下列疾病导致的：例如毛细血管通透性改变、感染、吸入的或循环毒素、血管活性物质(例如组胺、激肽)、弥散性血管内凝血、免疫反应、放射相关的肺炎、尿毒症、近乎溺死(near drowning)、吸烟和急性呼吸窘迫症、左心室衰竭、二尖瓣狭窄、细菌性心内膜炎、肺静脉纤维化、肺静脉起点先天性狭窄、肺静脉占位性疾病(pulmonary venoocclusive disease)、流体过度灌注、血白蛋白减少(如肾、肝脏、营养或蛋白丢失性肠病导致)、高高度(high-altitude)、药物过量、CNS创伤、蛛网膜下出血、肺栓塞、肺实质性疾病、惊厥、麻醉、和心肺分流手术。

PE症状可包括，例如，呼吸短促、呼吸急促和/或用力呼吸、心悸、高血压、胸闷、伴有或不伴有发绀的四肢发冷、咳嗽伴有发泡或粉红色痰、附属呼吸肌广泛参与呼吸、伴有或不伴有哮喘的湿罗音、及其组合。PE诊断的检测包括血液测试如全血计数(CBC)、血液尿素氮(BUN)、肌酐和血清蛋白质。尿液分析、动脉血气分析(ABGs)、胸部X-射线、心电图(ECG)和所有用于帮助医生缩小PE诊断范围的检测方法。

心源性PE治疗的代表性方法包括将患者置于100％的氧气中、使用吗啡减轻焦虑和提供某些有益的心脏作用，速尿利尿，血管扩张剂用于减少相对于心肌必须泵出的量的工作量、影响肌收缩力的药物如doputamine以增加心肌收缩性。其他使用过的方法是在四肢中的三个上使用旋转止血带，可以减少500ml血容积。

不幸的是，还没有特异的或疗效令人满意的PE治疗方法。因此，所属领域中仍需要更有效和特异性的PE治疗方式。本申请是针对此问题及其他一些问题的。

发明概述

本发明提供了用于治疗和预防与αvβ5整联蛋白有关的疾病如PE的组合物和方法。

本发明的一个实施方案提供治疗或预防哺乳动物对象(subject)(例如灵长类动物如人、猴子、或黑猩猩；犬科动物；或猫)的PE的方法。给药所述对象治疗量或预防量的αvβ5整联蛋白拮抗剂。所述拮抗剂可以是，例如，小于1kDa、小于0.5Da、或小于0.25KDa的药物。所述拮抗剂可以是抗体或抗体片段、包括人源化抗体，scFv，Fab，或(Fab’)2。所述抗体可以是ALULA、人源化ALULA、或与ALULA竞争特异性与αvβ5整联蛋白结合的抗体。给药可以是但不限于：静脉内、鼻腔内、或气管内。本发明的方法可用于治疗患有PE或处于发生PE危险的个体。可以给所述对象第二种用于治疗或预防急性肺损伤和/或ARDs和或PE的治疗药物，所述治疗药物包括但不限于，例如TGFβ途径抑制剂、活化的蛋白C、类固醇、GM-CSF、利尿剂、支气管扩张剂、血小板抑制剂、与αvβ5整联蛋白结合的抗体，与β5结合的抗体、第二种αvβ5整联蛋白拮抗剂、αvβ6整联蛋白的拮抗剂、β2激动剂，或表面活性剂。

本发明的另一个实施方案提供了特异性与ALULA竞争与αvβ5整联蛋白结合的抗体。本实施方案的抗体可以是ALULA本身、人源化ALULA、ALULA片段包括，例如ALULA的scFv、Fab和(Fab’)2，或其他与ALULA竞争与αvβ5整联蛋白结合的抗体。本发明同时提供了含所述抗体和可药用赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可进一步含有第二种治疗或预防PE的治疗剂(如TGFβ途径抑制剂、活化的蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、利尿剂、支气管扩张剂、与αvβ5整联蛋白结合的抗体，与β5结合的抗体、第二种αvβ5整联蛋白拮抗剂、αvβ6整联蛋白的拮抗剂)。或者，所述药物组合物可以含有治疗中风、心肌梗死、和癌症(如血管生成)的药物。

本发明的另一个实施方案提供鉴定治疗PE药物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括，将多种药物(agents)与αvβ5整联蛋白接触，选择与αvβ5整联蛋白配体竞争结合的药物，然后测定所选择的药物对PE的效果。对PE有作用的药物可鉴定为治疗PE的药物。所述多种药物可以是多种抗体或可在1KDa以下。所述配体可以是抗体，包括，例如ALULA，或者可以是玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白c和腺病毒五邻体基(adenoviruspenton base)。

本发明的另一个实施方案提供了治疗或预防PE的试剂盒。所述试剂盒含αvβ5整联蛋白的拮抗剂(如包括ALULA的单克隆抗体、与ALULA竞争与αvβ5整联蛋白结合的抗体)和第二种治疗肺水肿的药物(如TGFβ途径抑制剂、活化蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、利尿剂、支气管扩张剂、与αvβ5整联蛋白结合的抗体，与β5结合的抗体、第二种αvβ5整联蛋白拮抗剂、αvβ6整联蛋白拮抗剂、β2激动剂，或表面活性剂)。

本发明的这些和其他实施方案进一步在下列详述部分阐明。

附图的简要说明

图1显示了体内试验结果，证明可保护β5^-/-小鼠免受PE诱导的肺损伤。

图2显示了体内试验结果，证明与β5特异性结合的抗体(即ALULA)可减轻PE诱导的缺血再灌注损伤的严重程度。

图3显示体内试验结果，证明与β5特异性结合的抗体(即ALULA)可减轻高潮气量换气肺损伤诱导的严重程度。

图4显示体外试验结果，证明与β5特异性结合的抗体(即ALULA)可阻断表达αvβ5整联蛋白的细胞与包被有多种浓度αvβ5整联蛋白配体玻连蛋白的培养皿的粘附。

发明内容

I.前言

本发明部分基于用结合αvβ5整联蛋白的药物治疗动物可减轻PE症状的令人惊奇的发现。具体而言，阻断配体与αvβ5整联蛋白的结合可减轻PE的严重程度。发明人已经证实与一种与αvβ5整联蛋白结合的抗体可阻断玻连蛋白与αvβ5整联蛋白的结合，玻连蛋白是αvβ5整联蛋白的配体。发明人进一步证实给药与αvβ5整联蛋白的结合抗体可减轻PE的严重程度。因此，本发明提供了通过给药所述对象治疗有效量的αvβ5拮抗剂治疗或预防对象PE的方法。

本发明也提供了与指定为“ALULA”的公开抗体竞争的抗体以及含所述抗体的药物组合物。正如下面实施例中的更详细的描述，ALULA与αvβ5整联蛋白结合，向哺乳动物对象给药ALULA可减轻所述对象中PE的严重程度。

通过鉴定与αvβ5整联蛋白相互作用的药物并测试其治疗PE的能力，本发明也提供了鉴定治疗PE的新药物的方法。

II.定义

“αvβ5拮抗剂”指所有与αvβ5配体竞争αvβ5整联蛋白上可配体结合位点的药物。αvβ5拮抗剂包括特异性与αvβ5、β5结合的药物、以及与αvβ5或β5结合并至少与一种其他整联蛋白如αvβ3或αvβ6结合的药物。

αvβ5整联蛋白是含非共价结合的α/β异二聚体，尤其是介导细胞-细胞相互作用、细胞-细胞外基质相互作用、和细胞-病原体相互作用的粘附分子家族中的一员。αvβ5是唯一含β5亚单位的整联蛋白。αvβ5整联蛋白识别RGD肽序列并与玻连蛋白结合(参见，例如Hynes，Cell 69：11-25(1992)，其参与多种疾病如中风、心肌梗塞、癌症(如血管生成)、和眼新血管生成疾病(参见，例如，Friedlander等，Science 270(5241)：1500-2(1995)；Friedlander等，PNAS USA93(18)：9764-9(1996)；Elicieri等，J.Cell Biol.157(10：149-159(2002)；Heba等，J.Vasc.Res.38(3)：288-300(2001)；Soeki等，Cardiology 93(3)：168-74(2000)；和Li等，Am.J.Physiol.270(5Pt2)：H1803-11(1996)。αv和β5都已经测序并表征(分别参见，例如，Hynes，1992supra和美国专利5,527,679)。

αvβ5整联蛋白拮抗剂的“治疗剂量”或“治疗有效量”或“有效量”是指所述拮抗剂预防、缓解、缓和、或减轻患者与αvβ5整联蛋白有关的疾病症状的严重程度的量，有关的疾病包括，例如中风、心肌梗塞、癌症(如血管生成)、眼新血管生成疾病、和PE(如肺中流体积聚、肺毛细血管静水压增加、或呼吸急促)。

术语“抗体”指编码免疫球蛋白基因的多肽或其特异性结合和识别抗原的功能性片段。所述识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、σ、和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为μγ、α、δ、或σ，其反过来限定了免疫球蛋白的类型，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)组成。每条链的N-末端有约100至110或更多氨基酸形成的可变区，主要负责抗原识别。因此，术语“重链可变区”、“V_H”、或“VH”代表免疫球蛋白重链的可变区。包括Fv、scFv、dsFv或Fab；而术语“轻链可变区”、“VL”或“VL”代表免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。

抗体功能性片段的例子包括但不限于，完整的抗体分子、抗体片段如Fv、单链Fv(scFv)，互补识别区(CDRs)，VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2′和这些片段的所有组合或其他任何能与目标抗原结合的免疫球蛋白的功能部分(参见，例如，Fundamental Immunology(Paul ed.，4th ed.2001)。所属领域技术人员应当意识到，不同的抗体片段可通过不同的方法获得，例如，用酶如胰酶消化完整的抗体；或从头合成。抗体片段经常使用化学或重组DNA方法进行从头合成。因此，这里使用的术语抗体包括对整个抗体进行修饰的、或那些采用重组DNA技术(如单链Fv)从头合成的抗体片段或那些用噬菌体表达文库(phage display libraries)鉴定的(参见，例如McCafferty等(1990)Nature 348：552)。术语“抗体”还包括二价或双特性分子、二联体(diabodies)、三联体(triabodies)、和四联体(tetrabodies)。二价和双特性分子如下列文献所述：Kostelny等(1992)J.Immunol.148：1547，Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 31：1579，Hollinger等(1993)，PNAS.USA90：6444，Gruber等，(1994)J Immunol.：5368，Zhu等(1997)Protein Sci.6：781，Hu等(1996)Cancer Res.56：3055，Adams等(1993)Cancer Res.53：4026，和McCartney等(1995)Protein Eng.8：301。

“人源化”抗体是指保留非人抗体的反应性而对人的免疫原性较小。例如这可以通过保留非人CDR区而用人的相对应的部分替换所述抗体剩余的部分。参见，例如，Morrison等，PNAS USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)。

“单链Fv(scFv)或“单链抗体”是指一种蛋白质，其中scFv抗体的V_H和V_L区含单链，该链折叠后形成类似双链抗体的抗原结合位点。制备scFv抗体的方法在例如Ward等，Exp Hematol.(5)：660-4(1993)；以及Vaughan等，Nat Biotechnol.14(3)：309-14(1996)中有详细描述。单链Fv(scFv)任选含有长度不超过50个氨基酸的肽接头，一般不超过40个氨基酸，优选不超过30个氨基酸，更优选不超过20个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头是一种Gly-Gly-Gly-Gly-Ser连环体，例如2、3、4、5或6个这样的序列。但应当意识到接头中的某些氨基酸可以被替代。例如，缬氨酸可以被替代为甘氨酸。其他肽接头及其用途是所属领域所熟知的。参见，例如Huston等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 8：5879(1988)；Bird等，Science 242：4236(1988)；Glockshuber等，Biochemistry 29：1362(1990)；美国专利4,946,778，美国专利5,132,405和Stemmer等，Biotechniques 14：256-265(1993)。

当短语“特异性(或选择性)与抗体结合”指蛋白质或肽时，是指存在异种蛋白质和其他生物制剂时所述蛋白质的结合反应是限速反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定抗体与特定的蛋白结合(如αvβ5整联蛋白、β5、或其部分片段)，并且与样品中存在的其他蛋白质的结合量很小。在此条件下与抗体特异性结合要求选择的抗体对某一特定蛋白具有特异性。例如，可以选择针对αvβ5或β5多肽的抗体得到除多态性变异体(例如，与感兴趣的序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列)外仅与该蛋白而不与其他蛋白发生特异性免疫反应的抗体。可采用多种免疫测定方法选择与与特定蛋白质特异性反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定、Western blots、或免疫组化是常规用于选择与特定蛋白特异性反应的单克隆抗体的方法。用于检测特异性免疫反应的免疫测定方法和条件的详细描述参见Harlow和Lane Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，NY(1988)。典型的，特异性或选择性反应至少是背景信号或噪声的两倍，更典型的大于背景10到100倍。

“特异性竞争”结合药物减少抗体对多肽的特异性结合。采用所属领域已知的竞争结合试验方法，当第一抗体存在时，如果第二抗体对抗原的结合减少了至少30％，通常至少约40％、50％、60％或75％，并经常至少约90％，则认为第一抗体竞争性的抑制第二抗体的结合(参见，例如，Harlow和Lane，supra)。

这里的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物时，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟，以及天然存在的氨基酸多聚体和非天然存在的氨基酸多聚体。这里使用的该术语包含任何长度的氨基酸，包括全长蛋白质(如抗原)，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物(mimetics)。天然存在的氨基酸是那些由基因编码的，以及那些后来经修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然氨基酸有相同基本化学结构的化合物，例如α碳与氢结合、羧基、氨基，和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸甲砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指化合物的结构与一般氨基酸的化学结构不同，但其功能与天然存在的氨基酸相似。

这里的氨基酸可以用它们通常已知的三个字母标记或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一个字母标记表示。同样地，核苷酸可以用其通常接受的单字母代码表示。

术语“肽模拟物”和“模拟物”是指合成的化合物，基本上具有与本发明的αvβ5拮抗剂相同的结构和功能特性。肽类似物通常用于制药工业，作为非肽药物，具有类似模板肽的性质。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“肽模拟物(peptidomimetics)”(参见，例如，Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger TINS  p.392(1985)；和Evans等J.Med.Chem.30：1229(1987))。肽模拟物结构类似可用于治疗的肽，可以产生等效或增强的治疗或预防效果。通常，肽模拟物结构类似典型的多肽(即具有生物学或药理学活性的多肽)，例如天然存在的αvβ5配体，但其中一个或多个肽键任选被选自例如CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CH2SO-键代替。所述模拟物可以完全由合成的、非天然的氨基酸类似物组成，或是部分天然肽氨基酸的嵌合分子和部分非天然氨基酸类似物。所述模拟物也可以结合有任意含量的天然氨基酸保守基团，只要所述基团基本上不改变所述模拟物的结构和/或活性。

这里使用的术语“核苷酸”和“多核苷酸”可以互相替代。使用的术语“多核苷酸”包括寡核苷酸(即短多核苷酸)。该术语也指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和天然存在的变异体，同时也指合成的和/或非天然存在的核苷酸(即包含核苷酸类似物或主链残基或键被修饰的核苷酸)，如，例如但非限制性的，磷硫酰(phosphorothioates)、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)等。除非另有说明，特定核苷酸序列也暗示包含其适当修饰的变异体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。特别地，将序列的一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位点用混和碱基和/或脱氧肌苷残基取代可以得到简并密码子取代(参见，例如，Batzer等，核酸Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等(1992)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

“siRNA”或“RNAi”是指形成双链RNA的核苷酸，当所述siRNA与基因或靶标基因在同一细胞中表达时，所述双链RNA能减少或抑制所述基因或靶标基因的表达(参见，例如，Bass，Nature，411，428-429(2001)；Elbashir等，Nature，411，494-498(2001)；WO00/44895；WO01/36646；WO99/32619；WO00/01846；WO01/29058；WO99/07409；和WO00/44914)。因此“siRNA”指由互补链形成的双链RNA。所述siRNA互补部分杂交形成的双链分子通常具有基本上或完全的同一性。在一个实施方案中，siRNA指与靶标基因有实质的或完全的同一性，并形成双链siRNA。siRNA序列可与全长的靶标基因或其序列相应。典型的，所述siRNA至少长约15-50个核苷酸（例如双链siRNA的每个互补序列长15-50个核苷酸、且所述双链siRNA长约15-50个碱基对，优选约20-30个碱基核苷酸，优选长约20-25个核苷酸，如，长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

“沉默”或“下调”是指靶标序列可检测的转录和/或翻译减少，即，RNAi靶定的序列，或在无干扰RNA或其他核酸序列存在时靶标序列或蛋白质与正常水平相比数量或活性降低。可检测的降低可以小至5％或10％，或高达80％、90％或100％。更典型的，可检测的降低范围为20％、30％、40％、50％、60％或70％。

III.αvβ5的抑制

通过抑制配体与αvβ5整联蛋白的结合，本发明提供了治疗或预防涉及αvβ5整联蛋白的疾病如，举例来说：PE、中风、心肌梗塞、癌症(例如通过阻断αvβ5整联蛋白有关的血管生成)和眼新生血管疾病(例如通过阻断αvβ5整联蛋白有关的血管生成)。按照本发明的方法，所有抑制αvβ5整联蛋白表达或配体与αvβ5整联蛋白结合的方法可用于治疗涉及αvβ5整联蛋白的疾病。例如，与αvβ5整联蛋白特异性结合的抗体、与β5亚单位特异性结合的抗体、αvβ5整联蛋白的配体和肽、非肽、和所述配体的肽模拟物类似物可用于抑制与αvβ5整联蛋白的结合，因而可治疗或预防涉及αvβ5的疾病。此外，抑制β5表达的多核苷酸(例如siRNA分子、反义序列等)可用于治疗或预防涉及αvβ5整联蛋白的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是PE(例如包括心源性和非心源性PE)。在一些实施方案中，治疗PE的同时也治疗或预防了下游的疾病如，例如肺纤维化。

A.抗体

按照本发明的一个方面，特异性与αvβ5整联蛋白或αvβ5整联蛋白β5亚单位结合的抗体被用于治疗或预防涉及αvβ5整联蛋白的疾病，包括，例如PE、中风、心肌梗塞、癌症(即血管生成)，和眼新生血管疾病(即血管生成)。所述抗体也可以与其他配体竞争与αvβ5整联蛋白或αvβ5整联蛋白β5亚单位的结合。适宜的抗体包括，例如，单克隆抗体、人源化抗体和抗体片段(即Fv、Fab、(Fab’)₂，或scFv)。

在一些实施方案中，与αvβ5整联蛋白的β5亚单位结合的单克隆抗体ALULA(ATCC保藏号PTA-5817，2004年2月13日保藏在ATCC，10801University Blvd.Manassas，VA20110-2209)被用来治疗和预防涉及αvβ5整联蛋白的疾病，包括，例如PE、中风、心肌梗塞、癌症(如血管生成)，和眼新生血管疾病(如血管生成)。不受理论的限制，我们认为ALULA是通过阻断αvβ5整联蛋白介导的肺血管通透性变化而产生作用的。在一些实施方案中，人源化的ALULA、ALULA片段、或与ALULA竞争结合至αvβ5整联蛋白或αvβ5整联蛋白的β5亚单位的单克隆抗体用于治疗PE。

可使用所属领域熟知的各种技术获取单克隆抗体。简言之，来自期望抗原免疫的动物的脾细胞被永生化，一般是用骨髓瘤细胞融合(参见，例如，Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976))。其他使细胞永生的方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因、或逆转录病毒，或其他现有技术熟知的方法转化。筛选单个永生化细胞形成的克隆用于产生对所述抗原具有期望的特异性和亲和力的抗体，同时可以通过多种技术增加这些细胞产生的单克隆抗体的产量，包括注射到脊椎动物宿主的腹腔中。或者，也可以按照Huse等，Science 246：1275-1281(1989)提出的常规方法通过筛选来源于人B细胞的DNA库分离编码单克隆抗体的DNA序列或其结合片段。

收集单克隆抗体，并在免疫试验中对免疫原进行滴定，例如，在固相支持物上用固定的免疫原进行固相免疫试验。单克隆抗体一般以K_d至少约0.1mM结合，更常见至少约1μM，优选至少约0.1μM或更低、和最优选0.01μM或更低。

在一个示范性的实施方案中，动物如兔或小鼠用αvβ5多肽或构建的编码该多肽的核酸免疫。可采用标准的方法分离免疫后产生的抗体。本发明的免疫球蛋白(包括其结合片段和其他衍生物)可以很容易地通过多种重组DNA技术生产，包括在转染细胞中(如永生化的真核细胞，如骨髓瘤或杂交瘤细胞)或在小鼠、大鼠、兔或其他能通过已熟知的方法产生抗体的脊椎动物中表达。适宜的DNA序列的来源细胞和用于免疫球蛋白表达和分泌的宿主细胞可来自多种途径，例如美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)(细胞系和杂交瘤目录，第五版(1985)Rockville，Md。

在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体，即抗体保留非人抗体的反应性而对人的免疫原性较低。例如这可以通过保留非人CDR区而用其人源的相应部分置换剩余的部分。例如参见Morrison等，PNAS USA，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Vcrhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994)。人源化抗体的技术是所属领域所熟知的，例如在美国专利4,816,567；5,530,101；5,859,205；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,777,085；6,180,370；6,210,671；和6,329,511；WO87/02671；EP专利申请0173494；Jones等(1986)Nature321：522；和Verhoyen等(1988)Science239：1534有详细描述。另外在Winter和Milstein(1991)Nature349：293中也详细描述了人源化抗体。例如可以合成包含编码人源化免疫球蛋白框架区第一序列和编码期望的免疫球蛋白互补决定区的第二序列的多核苷酸或将适当的cDNA和基因组DNA片段结合起来。可按照已知方法从多种人细胞中分离人恒定区DNA序列。类似的，用于生产本发明免疫球蛋白的CDRs可以来源于特异性与αvβ5整联蛋白结合的单克隆抗体(如ALULA或可与ALULA竞争结合至αvβ5整联蛋白特异性的抗体)。

在某些情况下，将CDR转移到人的框架上可导致人源化抗体的特异性丧失。在这些情况下，可以在所述抗体人源部分的框架区进行回复突变。进行回复突变的方法是现有技术中熟知的，在例如Co等，PNAS USA88；2269-2273(1991)和WO90/07861中有详细描述。

在一些实施方案中，所述抗体是抗体片段如Fab、F(ab’)₂、Fv或scFv。所述抗体片段可以采用现有技术中任何已知的方法制备，包括化学消化(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)和重组方法。分离和制备重组核酸的方法是所属领域技术人员已知的(参见，Sambrook等，Molecular Cloning.A LaboratoryManual(2d ed.1989)，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995))。所述抗体可以在多种宿主细胞中表达，包括E.coli、其他细菌宿主、酵母、和多种高等真核细胞如COS、CHO，和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系。

本发明的一个实施方案提供了鉴定与ALULA竞争与αvβ5整联蛋白特异性结合的抗体的方法。

可采用竞争性结合试验鉴定与ALULA竞争与αvβ5整联蛋白特异性结合的抗体。可采用现有技术中已知的多种竞争结合试验中的任一种来测定两种抗体对同一抗原的竞争结合。简言之，是检测不同抗体抑制另一抗体的结合能力。例如，可以采用三明治ELISA试验通过其结合的抗原表位区分抗体。这是通过在孔的表面包被捕获抗体进行的。然后在捕获表面加上不完全饱和浓度的标记抗原。该蛋白质通过特异性的抗体：抗原表位相互作用与所述抗体结合。洗涤后，在ELISA中加入与可检测部分共价结合的二抗(如HRP和定义为检测抗体的标记抗体)。如果此抗体与所述捕获抗体识别相同的抗原表位，则其不能结合在靶蛋白质上，因为该特定的抗原表位已不能再结合了。但如果此二抗识别所述靶标蛋白质上不同的抗原表位，则它可以结合，并且这种结合可通过相应的底物定量活性水平(和抗体结合)而进行检测。用单个抗体如捕获抗体或检测抗体定义背景，而最大信号可以通过抗原特异性抗体捕获并用抗体检测抗原上的标记测定。用背景和最大信号作为参照，可用配对(pair-wise)方式评估抗体以确定特异的抗原表位。

采用上述任何试验方法，当一抗存在时，如果二抗与抗原的结合降低至少30％、一般至少约40％、50％、60％或75％，经常至少约90％，则认为一抗竞争性地抑制二抗的结合。

B.αvβ5小分子拮抗剂

按照本发明的方法，所有αvβ5的小分子拮抗剂都可用于治疗或预防PE。一般所述小分子质量小于1000道尔顿，经常小于500道尔顿。

典型地，αvβ5小分子拮抗剂包括，例如美国公开专利申请2000/40019206、2004/0019037、2004/0019035、2004/0018192、2004/0010023、2003/0181440、2003/0171271、2003/0139398、2002/0037889、2002/0077321、2002/0072500，美国专利6,683,051和Goodman等，J.Med Chem.45(5)：1045-51(2002)中描述的那些。

例如，可以使用美国专利公开号20040019206 A1中公开的式I化合物，包括其不同的同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物：

或其可药用的盐，其中

X是

Y选自N--R¹、O、和S；y和z各自独立地选自0、1、2和3的整数；A是N或C；R¹选自H、烷基、芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、链烯基、炔基、酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳基氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳基硫代羰基、酰氧基甲氧基羰基，任选被一个或多个选自低级烷基、卤素、羟基、卤代烷基、氰基、硝基、羧基、氨基、烷氧基、芳基，或芳基(任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、氰基、烷基磺酰基、烷基硫代、硝基、羧基、氨基、羟基、磺酸基、磺酰胺基、芳基、稠和芳基、单环杂环，或稠和的单环杂环取代)的取代基取代的烷基，任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、羟基、低级烷基、烷氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、氰基、硝基、烷基硫代、烷基磺酰基、磺酸基、磺酰胺基、羧基衍生物、氨基、芳基、稠和芳基、单环杂环和稠和单环杂环取代的芳基、单环杂环，和任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、氨基、硝基、羟基、羧基衍生物、氰基、烷基硫代、烷基磺酰基、磺酸基、磺酰胺基、芳基或稠和芳基的取代基取代的单环杂环；或

R¹与R⁸一起形成4-12元二氮杂环，任选被一个或多个选自低级烷基、羟基、酮、烷氧基、卤素、苯基、氨基、羧基或羧基酯，和稠和苯基的取代基取代；或

R¹与R⁸一起形成5元杂芳环，任选被一个或多个选自低级烷基、苯基和羟基的取代基取代；或R¹与R⁸一起形成与苯基稠和的5元杂芳环；

R⁸(当不与R¹一同成环时)和R⁹独立地选自H、烷基、链烯基、炔基、芳烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基、芳基氨基、酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳基氧基、芳基氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳硫基羰基、酰基氧基甲氧基羰基、环烷基、二环烷基、芳基、酰基、苯甲酰基、任选被一个或多个选自低级烷基、卤素、羟基、卤代烷基、氰基、硝基、羧基衍生物、氨基、烷氧基、硫代、烷基硫代、磺酰基、芳基、芳烷基、芳基(任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、烷基硫代、卤代烷基硫代、硫代、羟基、氰基、硝基、羧基衍生物、芳氧基、酰氨基(amido)、酰胺基(acylamino)、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟烷氧基、三氟甲基、磺酰基、烷基磺酰基、卤代烷基磺酰基，磺酸基、磺酰胺基、芳基、稠和芳基、单环杂环、稠和单环杂环的取代基取代)的取代基取代的烷基，任选被一个或多个选自卤素、卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、烷基硫代、卤代烷基硫代、硫代、羟基、氰基、硝基、羧基衍生物、芳氧基、酰氨基、酰胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟烷氧基、三氟甲基磺酰基、烷基磺酰基、磺酸、磺酰胺基、芳基、稠和芳基、单环杂环，或稠和单环杂环的取代基取代的芳基，单环杂环，任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、硝基、羟基、羧基衍生物、氰基、烷基硫基、烷基磺酰基、芳基、稠和芳基的取代基取代的单环杂环，单环和二环杂环烷基、--SO₂R¹⁰，其中R¹⁰选自烷基、芳基和单环杂环，全部任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰胺基、三氟烷基、酰氨基、烷基氨基磺酰基，烷基磺酰基，烷基磺酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟甲硫基、三氟烷氧基、三氟甲基磺酰基、芳基、芳氧基、硫代、烷基硫代和单环杂环的取代基取代；和

其中

R¹⁰如上定义；或

NR⁸和R⁹一起形成一个4-12元单氧单环或二环，所述环任选被一个或多个选自低级烷基、羧基衍生物、芳基或羟基的取代基取代，并且其中所述环任选含选自O、N和S的杂原子；

或

X是

X是

其中

Y′选自烷基、环烷基、二环烷基、芳基、单环杂环、任选被芳基取代的烷基，其中芳基还可以任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、烷基、硝基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳基，或稠和芳基，任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳基、稠和芳基、硝基、亚甲二氧基，亚乙二氧基或烷基、炔基、链烯基、--S--R¹¹和--OR¹¹的取代基取代的芳基所取代，其中R¹¹选自H、烷基、芳烷基、芳基、链烯基和炔基，或R¹¹与R⁸共同形成一个4-12元单氮和单硫或单氧杂环，所述环任选被低级烷基、羟基、酮、苯基、羧基或羧基酯和稠和苯基取代，或R¹¹与R⁸共同形成噻唑、噁唑、苯并噁唑或苯并噻唑；R⁸如上定义；或

Y¹(当Y¹是碳)与R⁸共同形成一个4-12元单氧或二氮杂环，所述环任选被烷基、芳基、酮或羟基取代；或

X是

其中

R¹和R⁸共同形成一个5-8元二氮杂环，所述环任选被一个或多个选自低级烷基、羟基、酮、苯基或羧基衍生物的取代基所取代；和R⁹选自烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳硫基羰基或酰氧基甲氧基羰基；或

X是

其中

R¹和R⁸共同形成一个5-8元二氮杂环，所述环任选被羟基、酮、苯基、或烷基取代；和R⁹选自烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳硫基羰基和酰氧基甲氧基羰基；

R²、R³和R⁴独立的选自一个或多个选自H、烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、硝基、氨基、烷基氨基、酰胺基、二烷基氨基、氰基，烷硫基、烷基磺酰基、羧基衍生物、三卤乙酰胺基、乙酰胺基、芳基、稠和芳基、环烷基、硫代、单环杂环、稠和单环杂环，和X的取代基，其中X定义如上；

R⁵、R⁶和R⁷独立的选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、羧基衍生物、卤代烷基、环烷基、单环杂环，任选被烷基、卤素、卤代烷基、氰基、羟基、芳基、稠和芳基、硝基、烷氧基、芳氧基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺酰胺基、硫代、烷硫基、羧基衍生物、氨基、酰氨基取代的单环杂环，任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代、烷基硫代、炔基、链烯基、烷基、芳硫基、烷基亚砜、烷基磺酰基、芳基亚砜、芳基磺酰基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺酰胺基、芳基磺酰胺基、酰胺、羧基衍生物、磺酰胺基、磺酸基、膦酸衍生物、次膦酸衍生物、芳基、芳硫基、芳基亚砜，或芳基砜取代的烷基，全部任选在芳基环上被卤素、烷基、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、羧基衍生物、烷氧基、芳氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、芳基、稠和芳基、单环杂环和稠和单环杂环，单环杂环硫代、单环杂环亚砜、和单环杂环砜取代，其可任选被卤素、卤代烷基、硝基、羟基、烷氧基、稠和芳基取代，或烷基、烷基羰基、卤代烷基羰基和芳基羰基，任选在一个或多个位点被卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、芳氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、烷基硫代、卤代烷基硫代、硫代、羟基、氰基、硝基、酰氧基、羧基衍生物、羧基烷氧基、酰氨基、酰胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟烷氧基、三氟甲基磺酰基、烷基磺酰基、磺酸基、磺酰胺基、芳基、稠和芳基、单环杂环和稠和单环杂环取代的芳基所取代。

也可以使用关国专利公开号20040019037 A1中公开的式II化合物，包括其各种的同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物：

或其可药用盐，其中

X选自：

Y-Z是--CH₂CH₂-或--CONR³--；A是O或NR¹；m是O或1；R¹是氢或C₁-3烷基；各非芳族环碳原子是未取代的或独立的被一个或两个R²取代基取代，并且各个芳香族环碳原子是未取代的或独立的被一个R²取代基取代，所述R²选自下列：C_1-8烷基、C_3-8环烷基、C_3-8环杂烷基、C_3-8环烷基-C_1-6烷基、C_3-8环杂烷基-C_1-6烷基、芳基、芳基-C_1-6烷基、氨基、氨基-C_1-6烷基、C_1-3酰胺基、C_1-3酰胺基-C_1-6烷基、(C_1-6烷基)_1-2氨基、C_3-6环烷基-C_0-2氨基、(C_1-6烷基)_1-2氨基-C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-4烷氧基-C_1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基-C_1-6烷基、C_1-3烷氧基羰基、C_1-3烷氧基羰基-C_1-6烷基、羟基、羟基-C_1-6烷基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、三氟乙氧基，C_1-8烷基-S(O)_0-2、(C_1-8烷基)_0-2氨基羰基、C_1-8烷氧基羰基氨基、(C_1-8烷基)_1-2氨基羰基氧基、(芳基C_1-3烷基)_1-2氨基、(芳基)_1-2氨基、芳基-C_1-3烷基磺酰基氨基，和C_1-8烷基磺酰基氨基；或两个R²取代基，当在同一个非芳族碳原子上时，与其相连的碳原子共同形成羰基；或两个R²取代基，与其相连的碳原子连接形成3-至6-元饱和螺碳环；R³是氢或C_1-4烷基；R⁴是芳基，其中芳基基团选自下列：苯、萘基、吡啶、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、二氢苯并呋喃基，苯并(1，3)二氧戊环、苯并(1，4)二噁烷，和喹喔啉基；和一、二和三取代的芳基，其中芳基定义如上，所述取代基独立的为氢、羟基、羟基-C_1-6烷基、卤素、C_1-8烷基、C_3-8环烷基、芳基、芳基C_1-3烷基、氨基、氨基C_1-6烷基、C_1-3酰胺基、C_1-3酰胺基-C_1-6烷基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6)烷基氨基、C_1-6烷基氨基-C_1-6烷基、二(C_1-6)烷基氨基-C_1-6烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4烷基硫代、C_1-4烷基亚磺酰基、C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷氧基-C_1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基-C_1-6烷基、C_1-5烷氧基羰基、C_1-3烷氧基羰基-C_1-6烷基、C_1-5烷基羰基氧基、氰基、三氟甲基、1，1，1-三氟乙基、三氟甲氧基、三氟乙氧基或硝基；或两个邻近的取代基与其连接的碳原子共同形成五-或六-元饱和或不饱和环，其中含1个或2个选自N、O、和S的杂原子，其环碳原子可以被氧或C_1-3烷基取代；并且R⁵是氢或C_1-3烷基。

美国专利公开号20040019035A1中公开的式III化合物，包括其各种同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可以用于本发明的方法中：

美国专利公开号20040010023 A1公开的式IV化合物，包括其各种同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可以用于本发明的方法中：

其中R¹是OR或N(R)₂，R是H、A、环烷基、Ar、芳基烷基或Pol，R²和R³在各种情况下各自独立的为H、A、Hal、NO₂、OR、N(R)₂、CN、CO--R、SO₃R、SO₂R、NH--C(O)A或SR，R⁴是单环或二环含1到4个N原子的芳香族杂环，其可以被Hal、R、OR、CN、N(R⁵)₂或NO₂单取代或二取代，但不包括吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、1，3，5-、1，2，4-和1，2，3-三嗪和四嗪，R⁵是H或A，R⁶是Hal或NO₂，A是含1到8个碳原子的烷基，其中所述烷基可以被R⁶单或多取代和/或其烷基碳链可以被--O--中断，Ar是芳基，可以是未取代的或是单、二或三取代的，环烷基是含3到15个C原子的环烷基，Hal是F、Cl、Br或I，Pol是无末端官能基团的固相，n、m在各种情况下各自独立的是1、2、3、4、5或6，o是1、2、3或4，并且p是1、2、3、4或5。

美国专利公开号20030181440 A1中公开的式V化合物，包括其各种同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可用于本发明的方法中：

其中M选自C₁-C₄亚烷基(碳链任选被一个选自C₁-C₄烷基，C₂-C₄链烯基，环烷基(其中环碳原子形成所述碳链的结合点)或芳基(任选被卤素取代)的取代基取代并且末端碳原子被选自A的一个取代基取代)，C₂-C₄亚链烯基(alkenylene)(被选自A的一个取代基取代)，亚杂环基(heterocyclylene)(任选被选自A的一个取代基取代)，亚杂环烯基(heterocyclenylene)(被选自A的一个取代基取代)，亚芳基(被选自A的一个取代基取代)，(C₁-C₄亚烷基)芳基(在C₁-C₄亚烷基上被选自A的一个取代基取代)或亚芳基(C₁-C₄)烷基(在亚芳基上被选自A的一个取代基取代)；

A任选存在并选自杂芳基、杂环基、R₃HN--、(杂芳基)氨基、(杂环基)氨基、R₃HNC(＝NH)--、R₃HNC(＝NH)NH--、R₃HNC(＝O)NH--、R₃C(＝NH)NH--、(杂环基)氨基氧基、(杂芳基)氨基氧基、R₃HNC(＝NH)NHO--、R₃C(＝NH)NHO--、R₃HNC(＝NH)NHC＝O)--或R₃C(＝NH)NHC(＝O)--；其中杂芳基和杂环基任选被一至五个独立选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、杂芳基(任选被C₁-C₄烷基取代)、卤素、羟基、硝基、氰基、三卤代(C₁-C₄)烷基、C₁-C₄烷基羰基、C₁-C₄烷氧基羰基、芳基(C₁-C₄)烷氧基羰基、R₃HN--、氨基(C₁-C₄)烷基、C₁-C₄烷基氨基(C₁-C₄)烷基或二(C₁-C₄烷基)氨基(C₁-C₄)烷基的取代基取代；

条件是：如果A是H₂NC(＝NH)NH--，则独立地，当Q是--CH₂--时W不是氢；

L选自--C(＝O)--、--SO₂--、--OC(＝O)-或--HNC(＝O)--；R₁选自氢、C₁-C₈烷基或环烷基；R₂选自氢或C₁-C₈烷基；R₃选自氢、C₁-C₈烷基、芳基、芳基(C₁-C₈)烷基、环烷基、羟基、氰基或硝基；Q选自--CH₂--、--CH(C₁-C₈烷基)-、--CH(C₂-C₈链烯基)-、--CH(C₂-C₈炔基)-、--CH(芳基)-(其中芳基任选被1至5个独立的选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、--O--(C₁-C₃烷基)-O--、卤素、羟基、三卤代(C₁-C₃)烷基或三卤代(C₁-C₃)烷氧基的取代基取代)、--CH(杂芳基)-(其中杂芳基任选被选自卤素、羟基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、--O--(C₁-C₃烷基)-O--、氨基、C₁-C₄烷基氨基或二(C₁-C₄)烷基氨基)或--CH(芳基(C₁-C₈)烷基)-的取代基取代；W选自氢或N(R₄)T；r是选自0或1的整数；R₄选自氢、C₁-C₈烷基或C₂-C₆酰基；T选自R₅C(＝O)--、R₅OC(＝O)—或R₅C(＝N--CN)--；R₅选自C₁-C₈烷基、芳基、芳基(C₁-C₈)烷基或氨基(其中氨基任选被1到2个独立的选自C₁-C₈烷基取代)；R₆选自氢、C₁-C₈烷基、芳基(C₁-C₈)烷基、(R₇)N(C₁-C₈)烷基、(R₈)(R₇)N(C₁-C₈)烷基或(R₈)(R₇)NC(＝O)-(C₁-C₈)烷基；并且，R₇和R₈独立的选自氢、C₁-C₈烷基或环烷基；和其可药用盐。

美国专利公开号20030139398 A1公开的式VI化合物，包括其各种同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可用于本发明的方法中：

其中A选自羰基、氨基、氨甲酰基、乙酰氨基，乙酰亚氨基、脒基、亚氨基甲基氨基、酰脲、缩二脲基(biureto)、联脲基、硫脲基、胍基、缩二胍基(biguanido)、双胍基(biguanidino)、脒腙基、1，2亚肼基，咔唑基、脲氨基、环亚烷基、亚杂环基、亚芳基和亚杂芳基；其中亚芳基和杂亚芳基任选被1到2个独立的选自C₁-C₈烷基、C₁-C₈烷氧基、卤素、(卤素)_1-3(C₁-C₈)烷基和(卤素)_1-3(C₁-C₈)烷氧基的其他取代基取代；(B)任选存在并选自NH、O和C(O)；M选自C₁-C₆亚烷基、C₂-C₆亚链烯基、C₂-C₆亚炔基和亚芳基；其中亚芳基任选被1至4个独立的选自C₁-C₈烷基、C₁-C₈烷氧基、卤素、(卤素)_1-3(C₁-C₈)烷基和(卤素)_1-3(C₁-C₈)烷氧基的其他取代基取代；R₃是1至2个独立的选自氢、C₁-C₈烷基、环烷基、杂环基、芳基、芳基(C₁-C₈)烷基、杂芳基、杂芳基(C₁-C₈)烷基、氨基、C₁-C₈烷基氨基、二(C₁-C₈)烷基氨基，亚氨基、亚氨基甲基、脒基、C₁-C₈烷基脒基、二(C₁-C₈)烷基脒基、环烷基脒基、卤素和羟基的取代基；其中环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、以及芳基烷基和杂芳基烷基的芳基和杂芳基部分任选被1至2个独立的选自C₁-C₈烷基、C₁-C₈烷氧基、芳基和卤素的取代基取代；并且，其中杂环基任选被选自氧的取代基取代；(L)任选存在并选自NH、O、S和C(O)；Y选自通过单键连接在环上的两个取代基和通过双键连接到环上的一个取代基；其中所述通过单键连接到环上的两个取代基独立的选自氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈烷氧基、卤素、(卤素)_1-3(C₁-C₄)烷基和(卤素)_1-3(C₁-C₄)烷氧基；或者，所述两个取代基共同形成选自环烷基和--O--(CH₂)_1-4-O--的基团；并且，其中所述通过双键连接到环上的一个取代基选自S、O、C₁-C₈亚烷基、亚氨基、(C₁-C₄)烷基亚氨基、(卤素)_1-2亚甲基和(卤素)_1-3(C₂-C₄)亚烷基；X选自N、NH、O和S；R₁任选存在并选自氢、C₁-C₈烷基、环烷基、环烷基(C₁-C₆)烷基、芳基、芳基(C₁-C₆)烷基、杂芳基、杂芳基(C₁-C₆)烷基、芳基氨基和杂芳基氨基；其中芳基、杂芳基以及芳基烷基和杂芳基烷基的芳基和杂芳基部分任选被1至5个独立的选自C₁-C₈烷基、C₁-C₈烷氧基、芳基、芳基(C₁-C₈)烷基、杂芳基、氨基、C₁-C₈烷基氨基、二(C₁-C₈烷基)氨基、杂芳基氨基、亚氨基、亚氨基甲基、磺酰基、卤素、羟基、硝基、氰基、(卤代)_1-3(C₁-C₄)烷基和(卤代)_1-3(C₁-C₄)烷氧基的取代基取代；E是被W和W′取代的C₁-C₄烷基；F是被U和U′取代的C₁-C₄烷基；W、W′、U和U′独立的选自氢、C₁-C₈烷基、C₂-C₈链烯基、C₂-C₈炔基、环烷基、环烷基(C₁-C₄)烷基、杂环基、杂环基(C₁-C₄)烷基、芳基、芳基(C₁-C₄)烷基、二芳基、杂芳基、杂芳基(C₁-C₄)烷基、--N[(R₄)，T(R₅)]和卤素；其中杂环基、芳基、联芳基、杂芳基以及杂环烷基、芳基烷基和杂芳基烷基的杂环基、芳基和杂芳基部分任选被1至5个独立的选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、氨基、C₁-C₄烷基氨基、二(C₁-C₄烷基)氨基、卤素、羟基、硝基和氰基的取代基取代；并且，或者芳基、杂芳基以及芳基烷基和杂芳基烷基的芳基和杂芳基部分上的两个任选的取代基共同形成选自环烷基、杂环基和--O--(CH₂)_1-4---O--的基团；条件是，如果W、W′、U和U′中的一个选自--N[(R₄)，T(R₅)]，则剩余的W、W′、U和U′不选自--N(R₄)，T(R₅)]；R₄选自氢和C₁-C₈烷基；T选自亚芳基、羰基、羧基、磺酰基和--C(O)NH--；其中亚芳基任选被1至2个独立的选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基和卤素的其他取代基取代；R₅选自氢、C₁-C₈烷基、C₂-C₈链烯基、环烷基、杂环基、芳基、芳基(C₁-C₄)烷基、芳基(C₂-C₄)链烯基、联芳基、联芳基(C₁-C₄)烷基、杂芳基、杂芳基(C₁-C₄)烷基和氨基；其中杂环基、芳基、杂芳基以及芳基烷基、芳基链烯基、联芳基、联芳基烷基和杂芳基烷基的芳基和杂芳基部分任选被1至5个独立的选自C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、杂环基、芳基、芳基(C₁-C₄)烷基、芳基磺酰基、杂芳基、氨基、C₁-C₄烷基氨基、二(C₁-C₄烷基)氨基、卤素、羟基、(卤素)_1-3(C₁--C₄)烷基和(卤素)_1-3(C₁-C₄)烷氧基的取代基取代；和，或者芳基、杂芳基以及芳基烷基、芳基链烯基和杂芳基烷基的芳基和杂芳基部分上的两个任选取代基共同形成选自环烷基、杂环基和--O--(CH₂)_1-4--O--的基团；R6选自氢、C₁-C₈烷基和(CH₂)_1-8CON(R₇)₂；并且，R₇选自氢、C₁-C₈烷基和环烷基；及其可药用的消旋体、对映体、非对映异构体和盐。

美国专利公开号20020037889 A1中公开的式VII化合物，包括其各种的同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可用于本发明的方法中：

X选自下列

和

各个R¹独立的为氢或C_1-3烷基，和各个非芳族环碳原子是未取代的或独立的被1或2个R²取代基取代，和各个芳香族环碳原子是未取代的或独立的被1个R²取代基取代，所述R²取代基选自下列：C_1-8烷基、C_3-8环烷基、C_3-8环杂烷基、C_3-8环烷基-C_1-6烷基、C_3-8环杂烷基-C_1-6烷基、芳基、芳基-C_1-6烷基、氨基-C_1-6烷基、C_1-3酰胺基、C_1-3酰胺基-C_1-6烷基、氨基、(C_1-6烷基)_1-2氨基、C_3-6环烷基-C_0-2氨基、(C_1-6烷基)_1-2氨基-C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-4烷氧基-C_1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基-C_1-6烷基、C_1-3烷氧基羰基、C_1-3烷氧基羰基-C_1-6烷基、羟基、羟基-C_1-6烷基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、C_1-8烷基-S(O)_0-2、(C_1-8烷基)_0-2氨基羰基、C_1-8烷基氧基羰基氨基、(C_1-8烷基)_1-2氨基羰基氧基、(芳基)_1-2氨基、芳基-C_1-3烷基磺酰基氨基和C_1-8烷基磺酰基氨基，或当两个取代基R²在同一非芳族碳原子上时，与其连接的碳原子共同形成羰基；或两个R²取代基与其相连的碳原子共同形成3-到6-元饱和螺碳环；R⁴是芳基，其中所述芳基基团选自下列：苯基、萘基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、二氢苯并呋喃基，苯并(1，3)二氧戊环、苯并(1，4)二噁烷；和一、二和三取代的芳基，其中所述取代基独立的为氢、羟基、羟基-C_1-6烷基、卤素、C_1-8烷基、C_3-8环烷基、芳基、芳基C_1-3烷基、氨基、氨基C_1-6烷基、C_1-3酰胺基、C_1-3酰胺基-C_1-6烷基、C_1-6烷基氨基、二(C_1-6)烷基氨基、C_1-6烷基氨基-C_1-6烷基、二(C_1-6)烷基氨基-C_1-6烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4烷基硫代、C_1-4烷基亚磺酰基、C_1-4烷基磺酰基、C_1-4烷氧基-C_1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基-C₁₆烷基、C_1-5烷氧基羰基、C_1-3烷氧基羰基-C_1-6烷基、C_1-5烷基羰基氧基、氰基、三氟甲基、1，1，1-三氟乙基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、或硝基；或两个邻近的取代基与其相连的碳原子共同形成5-或6-元饱和或不饱和含1或2个选自N、O和S的杂原子，其环碳原子可以被氧或C_1-3烷基取代；并且R³是氢或C_1-3烷基。

美国专利公开号20020077321A1中公开的式VIII化合物，包括其各种同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可用于本发明的方法中：

其中

是一个4-8元单环或一个7-12元二环，所述环任选是饱和或不饱和的；所述环任选被一个或多个选自烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、卤素、烷氧基烷基、氨基烷基、羟基、硝基、烷氧基、羟基烷基、硫代烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰胺基、酰基、酰胺基、烷基砜、磺酰胺基、烯丙基、链烯基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、炔基、甲酰胺基、氰基和--(CH₂)_nCOR的取代基取代，其中n是0-2且R是羟基、烷氧基、烷基或氨基；

A¹是下式的5-9元单环或7-12元二环杂环

含至少一个氮原子和任选1至4个选自O、N、S、SO₂和CO的杂原子，；任选是饱和或不饱和的；任选被一个或多个R^k取代，R^k选自羟基、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、硫代烷基、氰基、氨基、烷基氨基、卤代烷基、卤素、酰氨基、磺酰胺基和--COR，其中R是羟基、烷氧基、烷基或氨基；

或A¹是

其中Y¹选自N--R²、O和S；R²选自H、烷基、芳基、羟基、烷氧基、氰基、酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳基硫代羰基、酰氧基甲氧基羰基；R²与R⁷共同形成一个4-12元二氮杂环，所述杂环任选被一个或多个选自低级烷基、硫代烷基、烷基氨基、羟基、酮、烷氧基、卤素、苯基、氨基、羧基或羧基酯的取代基取代；或R²与R⁷共同形成一个4-12元杂环，含一个或多个选自O、N和S的杂原子，任选是不饱和的；或R²与R⁷共同形成一个与芳基或杂芳基环稠和的5元杂芳香族环；R⁷(不与R²成环时)和R⁸独立的选自H；烷基；芳烷基；氨基；烷基氨基；羟基；烷氧基；芳基氨基；酰氨基；烷基羰基；芳基羰基；烷氧基羰基；芳氧基；芳氧基羰基；卤代烷基羰基；卤代烷氧基羰基；烷基硫代羰基；芳基硫代羰基；酰氧基甲氧基羰基；环烷基；双环烷基；芳基；酰基；苯甲酰基；或NR⁷和R⁸共同形成4-12元含单氧单环或双环，所述环任选被一个或多个选自低级烷基、羧基衍生物、芳基或羟基的取代基取代，并且其中所述环任选含选自O、N和S的杂原子；R⁵选自H和烷基；

或A是

其中Y选自烷基；环烷基；双环烷基；芳基；单环杂环；Z₁选自CH₂、CH₂O、O、NH、NR_k、CO、S、SO、CH(OH)和SO₂，其中R_k选自H或低级烷基；Z₂是1-5碳连接体，其任选含一个或多个选自O、S和N的杂原子；或者Z₁-Z₂还含甲酰胺、砜、肟、磺酰胺、链烯基、炔基或酰基基团；其中所述Z₁-Z₂的碳和氮任选被烷基、烷氧基、硫代烷基、烷基砜、  芳基、烷氧基烷基、羟基、烷基氨基、杂芳基、链烯基、炔基、羧基烷基、卤素、卤代烷基或酰胺基取代；

其中Z₂-Z₁连接在

相对于X₁取代基的对位或间位；n是0、1或2的整数；R^c选自氢、烷基、卤素、羟基、硝基、烷氧基、氨基、卤代烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、氨基烷基、羟基烷基、硫代烷基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰基氨基、酰基、酰胺基、磺酰基、磺酰胺、烯丙基、链烯基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、炔基、炔基烷基、羧基、烷氧基羰基、甲酰氨基(carboxamido)、氰基和--(CH₂)_n--COR，其中n是0-2，和R选自羟基、烷氧基、烷基和氨基；X1选自--O--CO、SO₂、NR^m和(CHR^p)_q，其中R^m是H或烷基；R^p是H、烷基、烷氧基或羟基并且q是0或1；X₂选自--CHR^e--、CO、SO₂、O、NR^f和S；R^e选自H、烷基、羟基和烷氧基；R^f是H或烷基；或Y独立的选自--CR^g—或--N--其中R^g选自H、烷基、卤代烷基、氟、烷氧基烷基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、烷基砜、杂芳烷基、羟基、烷氧基、羟基烷基和羧基烷基；基团X--X₂--Y任选含选自酰基、烷基、氨基、醚、硫醚、砜和烯烃；

形成3-8元单环系统或8-11元双环系统；任选饱和或不饱和的；所述单环系统任选含1-2个选自N、O和S杂原子；所述双环系统任选含1-4个选自N、O、S的杂原子或任选含基团如SO₂或CO)；并且任选被一个或多个选自烷基、卤素、氰基、烷氧羰基、卤代烷基、烷氧基烷基、烷基砜、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基或烷氧基的取代基取代；R^b是X₃-R^h，其中X₃选自O、S和NR^j，其中R^h和R^j独立的选自H、烷基、酰基、芳基、芳烷基和烷氧基烷基；并且n是0、1或2。

此外，美国专利公开号20020072500中公开的式IX或式X化合物，包括其各种同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可用于本发明的方法中：

其中

X是

Y选自N--R¹、O和S；A是N或C；R¹选自H、烷基、芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、链烯基、炔基、酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳基硫代羰基、酰氧基甲氧基羰基，任选被一个或多个选自低级烷基、卤素、羟基、卤代烷基、氰基、硝基、羧基、氨基、烷氧基、芳基，或芳基(任选被一个或多个卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、氰基、烷基磺酰基、烷基硫代、硝基、羧基、氨基、羟基、磺酸、磺酰胺、芳基、稠和芳基、单环杂环或稠和单环杂环的取代基取代)的取代基取代的烷基，任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、羟基、低级烷基、烷氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、氰基、硝基、烷基硫代、烷基磺酰基、磺酸、磺酰胺、羧基衍生物、氨基、芳基、稠和芳基、单环杂环和稠和单环杂环的取代基取代的芳基，单环杂环，和任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、氨基、硝基、羟基、羧基衍生物、氰基、烷基硫代、烷基磺酰基、磺酸、磺酰胺、芳基或稠和芳基的取代基取代的单环杂环；或R¹与R⁸共同形成4-12元二氮杂环，所述杂环任选被一个或多个选自低级烷基、羟基、酮、烷氧基、卤素、苯基、氨基、羧基或羧基酯，和稠和苯基的取代基取代；或R¹与R⁸共同形成5元杂芳香族环，所述环任选被一个或多个选自低级烷基、苯基和羟基的取代基取代；或R¹与R⁸共同形成与苯基稠和的5元杂芳香族环；R⁸(不与R¹成环时)和R⁹独立的选自H、烷基、链烯基、炔基、芳烷基、氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基、芳基氨基、酰氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基、芳氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基-羰基、烷基硫代羰基、芳基硫代羰基、酰氧基甲氧基羰基、环烷基、双环烷基、芳基、酰基、苯甲酰基、任选被一个或多个选自低级烷基、卤素、羟基、卤代烷基、氰基、硝基、羧基衍生物、氨基、烷氧基、硫代、烷基硫代、磺酰基、芳基、芳烷基、芳基(任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、烷基硫代、卤代烷基硫代、硫代、羟基、氰基、硝基、羧基衍生物、芳氧基、酰氨基、酰胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟烷氧基、三氟甲基、磺酰基、烷基磺酰基、卤代烷基磺酰基、磺酸、磺酰胺、芳基、稠和芳基、单环杂环、稠和单环杂环取代的取代)的取代基取代的烷基，任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、低级烷基、烷氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、烷基硫代、卤代烷基硫代、硫代、羟基、氰基、硝基、羧基衍生物、芳氧基、酰氨基、酰胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟烷氧基、三氟甲基磺酰基、烷基磺酰基、磺酸、磺酰胺、芳基、稠和芳基、单环杂环或稠和单环杂环的取代基取代的芳基，单环杂环，任选被一个或多个选自卤素，卤代烷基、低级烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、硝基、羟基、羧基衍生物、氰基、烷基硫代、烷基磺酰基、芳基、稠和芳基、单环和双环杂环烷基、--SO₂R¹⁰的取代基取代的单环杂环，其中R¹⁰选自烷基、芳基和单环杂环，全部任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、氰基、硝基、氨基、酰氨基、三氟烷基、酰氨基、烷基氨基磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟甲基硫代、三氟烷氧基、三氟甲基磺酰基、芳基、芳氧基、硫代、烷基硫代和单环杂环的取代基取代；和

其中R¹⁰定义如上；NR⁸和R⁹共同形成4-12元单氧单环或双环，所述环任选被一个或多个选自低级烷基、羧基衍生物、芳基或羟基的取代基取代，并且其中所述环任选含选自O、N和S的杂原子；

或X是

其中Y¹选自烷基、环烷基、双环烷基、芳基、单环杂环、任选被芳基取代的烷基(其中芳基可任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、烷基、硝基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳基或稠和芳基取代)，任选被一个或多个选自卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳基、稠和芳基、硝基、亚甲二氧基、亚乙二氧基，或烷基、炔基、链烯基、--S--R¹¹和--OR¹¹取代的芳基，其中R¹¹选自H、烷基、芳烷基、芳基、链烯基和炔基，或R¹¹与R⁸共同形成4-12元单氧和单硫或单氧杂环，所述环任选被低级烷基、羟基、酮、苯基、羧基或羧基酯、和稠和苯基取代，或R¹¹与R⁸共同形成噻唑、噁唑、苯并噁唑或苯并噻唑；R⁸定义如上；或Y¹(当Y¹是碳)与R⁸共同形成4-12元含单氧或二氮环，所述环任选被烷基、芳基、酮或羟基取代；或

X是

其中R¹和R⁸共同形成5-8元含二氮杂环，所述环任选被一个或多个选自低级烷基、羟基、酮、苯基或羧基衍生物的取代基取代；并且R⁹选自烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基-羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳基硫代羰基或酰氧基甲氧基羰基；或

X是

其中R¹和R⁸共同形成5-8元二氮杂环，所述环任选被羟基、酮、苯基或烷基取代；并且R⁹都选自烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基羰基、卤代烷氧基羰基、烷基硫代羰基、芳基硫代羰基和酰氧基甲氧基羰基；R²、R³和R⁴独立的选自一个或多个选自H、烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、硝基、氨基、烷基氨基、酰胺基、二烷基氨基、氰基、烷基硫代、烷基磺酰基、羧基衍生物、三卤代乙酰氨基、乙酰胺、芳基、稠和芳基、环烷基、硫代、单环杂环、稠和单环杂环和X的取代基，其中X定义如上；R⁵、R⁶和R⁷独立的选自氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、羧基衍生物、卤代烷基、环烷基、单环杂环，任选被烷基、卤素、卤代烷基、氰基、羟基、芳基、稠和芳基、硝基、烷氧基、芳氧基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、磺酰胺、硫代、烷基硫代、羧基衍生物、氨基、酰氨基取代的单环杂环，任选被一个或多个卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、硫代、烷基硫代、炔基、链烯基、烷基、芳基硫代、烷基亚砜、烷基磺酰基、芳基亚砜、芳基磺酰基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺酰胺基、芳基磺酰胺基、酰胺、羧基衍生物、磺酰胺基、磺酸基、膦酸衍生物、次膦酸衍生物、芳基、芳基硫代、芳基亚砜或芳基砜取代的烷基，全部任选在芳环上被卤素、烷基、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、羧基衍生物、烷氧基、芳氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氨基、芳基、稠和芳基、单环杂环、和稠和单环杂环、单环杂环硫代、单环杂环亚砜、和单环杂环砜取代，其可以任选被卤素、卤代烷基、硝基、羟基、烷氧基、稠和芳基、或烷基、烷基羰基、卤代烷基羰基、和芳基羰基取代，任选在一个或多个位点被卤素、卤代烷基、烷基、烷氧基、芳氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、烷基硫代、卤代烷基硫代、硫代、羟基、氰基、硝基、酰氧基、羧基衍生物、羧基烷氧基、酰氨基、酰胺基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟烷氧基、三氟甲基磺酰基、烷基磺酰基、磺酸基、磺酰胺基、芳基、稠和芳基、单环杂环和稠和单环杂环取代的芳基。

其中R₁和R₂选自氢、羟基烷基卤代烷基和卤素。

Goodman等，J.Med Chem.45(5)：1045-51(2002)中公开的式XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX和XX化合物，包括其各种同分异构体、对映体、互变异构体、消旋体和多晶形物，或其可药用盐或酯可用于本发明的方法中：

在某些情况下，本发明的αvβ5拮抗剂含三肽序列RGD。设计这样的分子作为整联蛋白配体的示例可见，例如Pierschbacher等，J.Cell.Biochem.56：150-154(1994))；Ruoslahti，Ann.Rev.Cell.Dev.Bio.12：697-715(1996)；Chorev等，Biopolymers 37：367-375(1995))；Pasqualini等，J.Cell.Biol.130：1189-l196(1995))；Smith等，J.Biol.Chem.269：32788-32795(1994)；和美国专利号5,780,426和6,683,051。

C.抑制αvβ5整联蛋白的表达

如上所述，本发明是基于阻断配体与αvβ5整联蛋白的结合可减轻PE的严重程度的出人意料的发现。例如，如下面的实施例3中描述的，本申请发明人证明β5^-/-小鼠不产生与肺损伤有关的PE。因此，在转录或翻译水平干扰αvβ5整联蛋白基因特异性表达的核苷酸序列可用于治疗或预防PE。例如这可以利用siRNA和/或反义寡核苷酸来阻断特定突变mRNA的转录或翻译，或者通过siRNA诱导mRNA的降解，或者通过反义核酸屏蔽所述mRNA。

1.siRNA

与β基因相应的双链siRNA可以通过诱导β5mRNA转录子降解，使αvβ5整联蛋白的转录和/或翻译沉默，，因此通过阻止αvβ5整联蛋白的表达治疗或预防PE。所述siRNA典型的长约5到约100个核苷酸，更典型的长约10到约50个核苷酸，最典型的长约15到约30个核苷酸。siRNA分子及其制备方法详见，例如Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；WO00/44895；WO01/36646；WO99/32619；WO00/01846；WO01/29058；WO99/07409和WO00/44914。转录dsRNA或siRNA(例如，作为发夹二倍体)的DNA分子也可以产生RNAi。转录dsRNA的DNA分子如美国专利号6,573,099和美国专利申请公开号2002/0160393和2003/0027783，以及Tuschl和Borkhardt，Molecular Interventions，2：158(2002)中公开的。例如，Genbank接收号：AK054968、BF588784、BE208820、BE207859或BE206567中公开的与核酸序列特异性杂交的dsRNA寡核苷酸可以用于本发明的方法中。可以比较PE症状严重程度的降低和无干扰RNA时的症状来衡量siRNA的有效性。

siRNA可采用现有技术中已知的手段给予对象，包括注射、吸入或口服摄入所述siRNA。另一种合适的siRNA递送体系是胶体分散系统如，例如大分子复合物、微囊、微球、小球(beads)和包括水包油乳剂、微团、混和微团和脂质体的基于脂质的体系。本发明优选的胶体体系是脂质体。脂质体是人造膜囊泡，可在体内和体外用作递送载体。核酸，包括RNA和DNA在脂质体内，并以生物活性形式递送到细胞中(Fraley等，Trends Biochem.Sci.，6：77，1981)。可以采用现有技术中已知的任何手段将脂质体靶定在特定的细胞类型或组织上。

2.反义寡核苷酸

与编码β5多肽的核酸序列特异性杂交的反义寡核苷酸也能使αvβ5整联蛋白的转录和/或翻译沉默，因此可治疗或预防PE。例如，Genbank接收号：BF588784；BE208820；BE207859；BE206567；NM_002213；BC006541；NM_174679；AF468059；AY434090；NM_010580；BC058246；XM_147237；AF022111；AF022110；AF043257；AF043256和S58644中公开的与所述核酸序列特异性杂交的反义寡核苷酸可以用于本发明的方法中。可以比较PE症状严重程度的降低和无反义核酸时的症状来衡量反义核酸的有效性。

反义核酸是与特定的mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(参见，例如，Weintraub，Scientific American，262：40(1990))。典型的，合成的反义寡核苷酸一般长度在15到25个碱基之间。反义核酸可以含天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸如，例如磷硫酰、甲基膦酸酯和-端基异构-糖-磷酸盐，主链修饰的核苷酸。

在细胞中，所述反义核酸与相应的mRNA杂交形成双链分子。所述反义核酸可干扰所述mRNA的翻译，因为细胞不翻译双链的mRNA。优选约15个核苷酸的反义寡聚体，因为它们较易合成，而且相比更大的分子在引入到产生核苷酸突变的目标细胞时较少出现问题。使用反义方法抑制体外基因翻译是现有技术所熟知的(Marcus-Sakura，Anal.Biochem.，172：289，(1988))。较少见的，可以使用直接与DNA结合的反义分子。

可以采用现有技术中已知的任何方法递送αvβ5整联蛋白基因特异性的反义多核苷酸，包括，例如，直接注射、吸入或摄食所述多核苷酸。此外，可以使用重组表达载体(例如，基于腺病毒、疱疹病毒、痘病毒或逆转录病毒的病毒载体)或上述胶体分散体系(如脂质体)递送反义多核苷酸。如这里教导的，可以利用不同的病毒载体进行基因治疗，包括

IV.鉴定其他的αvβ5拮抗剂

其他的αvβ5拮抗剂可很容易的按照本领域普通技术人员熟知的方法鉴定。一种简便的筛选拮抗剂的方法包括测定潜在的拮抗剂与已知整联蛋白配体竞争结合的能力。例如，玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白c和腺病毒五邻体基是已知的αvβ5整联蛋白配体，可以用在鉴定潜在αvβ5整联蛋白的竞争试验中。其他含RGD氨基酸序列的多肽也可用于竞争性试验中。此外，与αvβ5整联蛋白结合的单克隆抗体及其片段可用于筛选其他的αvβ5整联蛋白拮抗剂。在一些实施方案中，ALULA和与ALULA竞争结合至αvβ5的抗体被用于筛选其他αvβ5整联蛋白的拮抗剂。

竞争性试验是现有技术中熟知的。典型的，标记αvβ5整联蛋白的配体或与配体竞争结合至αvβ5整联蛋白的抗体(如ALULA)，这样可以检测与αvβ5整联蛋白结合的差异(例如当潜在的αvβ5整联蛋白竞争性配体数量增加时)。所述配体可以是天然存在的配体和合成的配体。竞争性试验可显示潜在竞争性拮抗剂的亲和力。

可利用多种不同的筛选方案来识别调节细胞中αvβ5整联蛋白特定拓扑学活性或功能水平的药物，例如，在哺乳动物细胞特别是人细胞中。大体上，所述筛选方法包括筛选很多药物以识别与αvβ5相互作用的药物，例如通过与αvβ5整联蛋白结合或通过阻断αvβ5整联蛋白特异性抗体(例如ALULA)或配体(例如玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白c和腺病毒五邻体基)与αvβ5整联蛋白的结合。

可通过筛选能与αvβ5整联蛋白结合的药物进行初步筛选，因为至少某些药物可能成为αvβ5整联蛋白拮抗剂。结合试验一般包括将αvβ5整联蛋白与一个或多个待测药物接触足够长的时间使αvβ5整联蛋白与待测药物形成结合复合物。可采用多种已确定的分析技术检测任何形成的结合复合物。蛋白结合试验包括但不限于免疫组化结合试验、流式细胞分析或其他试验。这些试验中使用的αvβ5整联蛋白可以是天然表达的、克隆的或合成的。

本发明的筛选方法可以在体外或在细胞水平进行。细胞水平的试验可在任何表达αvβ5整联蛋白的细胞中进行。为了筛选结合或调节αvβ5整联蛋白活性的药物，细胞水平试验可以使用整个细胞或含αvβ5整联蛋白的细胞部分。所属领域技术人员能够意识到αvβ5整联蛋白可在不含内源性αvβ5整联蛋白的细胞中表达。合适的细胞水平试验详见，例如DePaola等，Annals ofBiomedical Engineering 29：1-9(2001)。

最初检测与αvβ5整联蛋白相互作用的药物可进一步试验以验证其表观活性。优选这样的研究在适当的细胞或PE动物模型上进行，如下面实施例1中所描述的。这些方法的基本模式包括给药作为模型的动物一种在先期筛选中挑选的先导化合物，然后确定实际上PE是否得到改善。在验证试验中使用的动物模型一般是各种哺乳动物。适宜动物的特定例子包括但不限于灵长类(例如黑猩猩、猴等等)和啮齿类(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等等)动物。

检测作为潜在αvβ5整联蛋白的拮抗剂的药物可以是任何小的化合物或生物物质如多肽、糖、核酸或脂类。或者，调节剂可以是αvβ5或αvβ5整联蛋白配体的遗传变异体。尽管绝大多数时候使用化合物的水或有机溶液(特别是基于DMSO的溶液)，基本上任何化合物可用作本发明试验中潜在的调节剂或配体。通过试验步骤自动化和从任何方便的途径提供用于试验的化合物来设计筛选大化合物库的试验，其通常是采用平行方式进行的(例如在机器人试验中在微孔板上以微量滴定的形式进行)。

在一些实施方案中，所述药物的分子量小于1,500道尔顿，在某些情况下小于1,000、800、600、500或400道尔顿。期望所述药物相对较小，因为小分子药物相比大分子量物质更可能具有与良好的药代动力学特性相一致的生理化学性质，包括口服吸收。例如，Lipinski等证明，根据渗透性和溶解度，下列药物不太可能成功作为药物：具有超过5个H-键供体(表示为OHs和NHs的总数)，分子量超过500，LogP超过5(或MLogP超过4.15)，和/或具有超过10个H-键受体(表示为Ns和Os的总数)。参见，例如，Lipinski等，Adv Drug Delivery Res 23：3-25(1997)。是生物转运载体底物的化合物类型是所述规则的例外。

在一个实施方案中，高通量筛选方法包括提供含很多潜在治疗化合物(潜在调节剂或配体化合物)的组合化学或肽库。然后在一个或多个如上所述的试验中筛选这样的“组合化学库”或“配体库”，以筛选出那些显示出期望活性的库中成员(特定的化合物种类或亚类)。所述化合物可以作为传统的“先导化合物”或作为潜在的或实际的治疗剂。

组合化学库是不同化合物的集合，通过化学或生物合成将多种化学“积木”如试剂组合起来。例如，线性组合化学库如多肽库是以给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数目)的所有可能方式组合的一组化学积木(氨基酸)形成的。可以通过化学积木的这种组合混和合成数以百万计的化合物。

制备和筛选组合化学库是所属领域技术人员熟知的。这样的组合化学库包括但不限于：肽库(参见，例如，美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493(1991)和Houghton等，Nature354：84-88(1991))。也可以使用产生多样化学库的其他化学方法。这样的化学方法包括但不限于：拟肽(如PCT公开号WO 91/19735)，编码肽(如PCT公开号WO 93/20242)，随机生物寡聚体(bio-oligomers)(例如PCT公开号WO 92/00091)，苯二氮卓类(如美国专利号5,288,514)，diversomers如乙内酰脲类，苯二氮类和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913(1993))，vinylogous多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.114：6568(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽肽模拟物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218(1992))，类似有机合成的小化合物库(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))，oligocarbamates(Cho等，Science 261：1303(1993))，和/或膦酸肽(peptidylphosphonates)(Campbell等，J.Org.Chem.59：658(1994))，核酸库(参见Ausubel，Berger和Sambrook，都在前面)，肽核酸库(参见，例如，美国专利5,539,083)，抗体库(参见，例如，Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)：309-314(1996)和PCT/US96/10287)，糖类库(参见，例如，Liang等，Science，274：1520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，小有机分子库(参见，例如，苯并二氮类，Baum C&EN，Jan18，第33页(1993)；类异戊二烯，美国专利5,569,588，噻唑酮类和间噻嗪酮类，美国专利5,549,974；吡咯烷类，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮类5,288,514，等)。

制备组合库的设备可以购买(参见，例如，ECIS TM，Applied BioPhysicsInc.，Troy，NY，MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，许多组合库也可以购买到(参见，例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等)。

V.治疗

如上所述，本发明也提供了含αvβ5整联蛋白拮抗剂的组合物。本发明的组合物可用于治疗或预防涉及αvβ5整联蛋白的疾病，包括，例如PE、中风、心肌梗塞和癌症(即血管生成)。

在一个实施方案中，本发明的组合物(例如含ALULA、人源化ALULA或ALULA片段的组合物)可用于治疗或预防患PE或处于患PE风险的对象的PE。例如，已经暴露于毒性吸入物的对象可能在暴露后接受治疗，而处于PE风险的患者可以进行预防性和/或治疗性的治疗。处于PE风险患者的例子包括急性误吸患者，出现细菌性脓毒症症状的患者，血液培养物为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌阳性的患者，胰腺炎患者或出血性休克患者。

本发明的组合物可以在规则的基础(例如每日)上给药一段时间(例如2、3、4、5、6或1-3周或更久)。

本发明的组合物可采用现有技术中已知的任何途径直接给药哺乳动物对象以阻断αvβ5结合，例如，通过注射(例如静脉内、腹腔内、皮下、肌内或真皮内)，吸入，经皮给药，直肠给药或口服给药。

本发明的药用组合物可含有可药用的载体。可药用的载体部分由具体的给药组合物决定，部分由采用的给药所述组合物的具体方法决定。因此，本发明药用组合物适宜的制剂种类很多(参见，例如Remington PharmaceuticalSciences，第17版，1989)。

本发明的组合物可单独或与其他适宜的组分组合制成气雾剂(即，它们可以被“雾化”)以通过吸入给药。气雾剂可以放置在可加压的压推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。

适合给药的制剂包括水和非水溶液，其中可含有抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂以及保持制剂等渗的溶质的等渗无菌溶液，和水和非水无菌混悬液，其中可含有助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实践中，组合物可以通过例如，口服、鼻腔、局部、静脉内、腹腔内或鞘内给药。化合物制剂可置于单位剂量或多剂量密封的容器中，例如安瓿和瓶子。可以用无菌粉末、颗粒和之前所述类型的片剂制备溶液和混悬液。所述调节剂也可作为调配食品或药物的一部分给药。

适于口服给药的制剂包括：(a)液体溶液，例如有效量的包装的核酸混悬在稀释剂中，例如水、盐水或PEG400；(b)胶囊、囊剂或片剂，其中含预定量的活性成分，如液体、固体、颗粒或凝胶；(c)在适当的液体中的混悬液；和(d)适宜的乳剂。片剂可含有一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和可药用载体的。锭剂(Lozenge)可包括活性成分，包含在调味剂例如蔗糖中，以及锭剂(pastilles)于惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、凝胶中含活性成分，以及类似制剂，除活性成分外，还含有现有技术中已知的载体。

在本发明中给药患者的剂量应当随时间足以产生有益的反应，例如，肺毛细血管静水压降低、肺中流体减少，肺中积聚流体的速度降低，或其组合。任何患者的最佳剂量水平依赖于多种因素，包括采用的特定调节剂的效力、年龄、体重、体力活动、患者的饮食、与其他药物可能的组合，以及PE的严重程度。剂量的大小同时也由具体对象给药具体化合物或载体时任何不良副作用的出现、性质和程度决定。

在确定αvβ5整联蛋白拮抗剂的给药的有效量时，医生可以评估拮抗剂的循环血浆水平和拮抗剂毒性。通常，对于典型的对象拮抗剂的剂量当量从约1ng/kg到10mg/kg。

通过用于大量和整体健康受试者时拮抗剂的LD₅₀和不同浓度时所述拮抗剂的副作用确定αvβ5整联蛋白拮抗剂的给药速率。给药可以通过单次或分剂量给药。

VI.组合治疗

在一些实施方案中，αvβ5整联蛋白拮抗剂是与第二种治疗剂合用于治疗或预防与αvβ5整联蛋白有关的疾病或异常(例如中风、心肌梗塞和癌症(例如血管生成)。例如，αvβ5整联蛋白拮抗剂可与第二种治疗或预防急性肺损伤和/或ARDS或PE的治疗剂共同给药。例如，αvβ5整联蛋白拮抗剂(例如ALULA、人源化ALULA或ALULA片段)可与所有PE的标准治疗共同给药，包括例如，利尿剂、支气管舒张药、麻醉药、氧和选择性应用止血带。此外，αvβ5整联蛋白拮抗剂可与靶标涉及急性肺损伤和/或ARDS或PE代谢途径的药物共同给药。例如，αvβ5整联蛋白拮抗剂可与TGFβ途径抑制剂、活化蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、β-2激动剂、表面活性剂、特异性结合αvβ5整联蛋白或β5的抗体、第二种αvβ5整联蛋白拮抗剂、特异性结合αvβ6整联蛋白的抗体、αvβ6整联蛋白拮抗剂、凝血酶受体拮抗剂、抗凝血酶药、rho激酶抑制剂和抑制αvβ5整联蛋白表达的核酸，包括例如上述反义寡核苷酸和siRNA。适合的TGFβ途径抑制剂包括例如TGF-β抗体(包括那些特异性阻断TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3或其组合的)如描述于，例如Ling等，J.Amer.Soc.Nephrol.14：377-388(2003)，McCormick等，J.Immunol.163：5693-5699(1999)，和Cordeiro，Curr.Opin.Mol.Ther.5(2)：199-203(2003)；TGF-β受体II型抑制剂或TGF-β受体I型激酶抑制剂，如描述于，例如DaCosta Bayfield，Mol.Pharmacol.65(3)：744-52(2004)，Laping，Curr.Opin.Pharmacol.3(2)：204-8(2003)，Laping，Mol.Pharmacol.62(1)：58-64(2002)；可溶的TGF-β受体II型，如描述于，例如Pittet，J.Clin.Invest.107：1537-1544(2001)；Wang等，Exp Lung Res.28(6)：405-17(2002)和Wang，Thorax54(9)：805-12(1999)；可溶的潜在的可交联肽(soluble latency associatedpeptides)，如描述于，例如Zhang，J.Invest.Dermatol.121(4)：713-9(2003)；凝血酶敏感素I抑制剂，如描述于，例如Crawford等，Cell 93：1159-1170(1998)，Riberiro等，J.Biol.Chem.274：13586-13593(1999)，and Schultz-Cherry等，J.Biol.Chem.269：26775-26782(1994)。适宜的β-2激动剂包括，例如，沙丁胺醇、比托特罗、福莫特罗、异丙肾上腺素、左沙丁胺醇、奥西那林、吡布特罗、沙美特罗和特布他林。合适的表面活性剂包括，例如，棕榈胆磷冻干粉，infasurf，KL-4，pumactant，survanta，venticute和表面活性剂TA，如Taeusch等，Acta Pharmacol Sin23 Supplement：11-15(2002)中描述的。合适的抗凝血酶药包括，例如，水蛭素，二价水蛭素(Biogen)、阿加曲班(Texas Biotechnology)和依非加群(Lilly)以及美国专利号6,518,244中描述的化合物。适合的凝血酶受体拮抗剂描述于，例如，美国专利号6,544,982、6,515,023、6,403,612、6,399,581和5,446,131中。适合的rho激酶抑制剂包括，例如描述于，例如Tasaka等，Am J Respir Cell Mol Biol.2005 Mar 18；[Epub预备出版]中的Y-27632，例如Nishikimi等，J Hypertens.22(9)：1787-96(2004)中描述的法舒地尔，例如Sasaki等，Pharmacol Ther.93(2-3)：225-32(2002)中描述的1-(5-异异喹啉磺酰基)-高哌嗪(HA-1077)，(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉)磺酰基]-高哌嗪(H-1152P)，以及如美国专利号6,451,825和6,218,410以及美国专利公开号20050014783和20030134775中描述的其他rho激酶抑制剂。

此外，αvβ5整联蛋白拮抗剂可与如美国专利公开号20020192186中的表达ATP酶的腺病毒、与美国专利公开号20020004042中的β2肾上腺素受体、与美国专利号6,284,751中的VEGFβ拮抗剂、与美国专利号5,231,114中的脂质过氧化抑制剂、和与如美国公开专利申请号2000/40019206、2004/0019037、2004/0019035、2004/0018192、2004/0010023、2003/0181440、2003/0171271、2003/0139398、2002/0037889、2002/0077321、2002/0072500、美国专利号6,683,051和Goodman等，J.Med Chem.45(5)：1045-51(2002)中描述的αvβ6、αvβ5和αvβ3整联蛋白的小分子抑制剂组合给药。

αvβ5整联蛋白拮抗剂(如ALULA、人源化ALULA或ALULA片段)和所述第二种治疗剂可以同时或顺序给药。例如，αvβ5整联蛋白拮抗剂可以先给药，然后给第二种治疗剂。或者，所述第二种治疗剂可以先给药，然后给αvβ5整联蛋白拮抗剂。在某些情况下，αvβ5整联蛋白和所述第二种治疗剂可在同一制剂中给药。在其他情况下所述αvβ5整联蛋白拮抗剂和所述第二种治疗剂在不同的制剂中给药。当αvβ5整联蛋白拮抗剂和所述第二种治疗剂在不同的制剂中给药时，它们可同时或顺序给药。

给药时，可以通过应用于大量和整体健康受试者时所述拮抗剂和第二种治疗剂的LD₅₀，以及不同浓度下所述拮抗剂和第二种治疗剂的副作用组合确定所述αvβ5整联蛋白拮抗剂和第二种治疗剂的给药速率给药。在某些情况下，所述αvβ5整联蛋白的拮抗剂和第二种治疗剂各以亚治疗剂量或治疗剂量给药。

VII.试剂盒

本发明也提供了治疗或预防涉及αvβ5整联蛋白的疾病的试剂盒，所述疾病包括，例如，PE、中风、心肌梗塞和癌症(即血管生成)。所述试剂盒含αvβ5整联蛋白拮抗剂(如与αvβ5整联蛋白结合的抗体，包括，例如，ALULA、人源化ALULA或ALULA片段)和与β5结合的抗体(如ALULA、人源化ALULA或ALULA片段)和第二种治疗包括PE的涉及αvβ5整联蛋白疾病的治疗剂。适宜的第二种治疗剂包括，例如，TGFβ途径抑制剂、活化蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、利尿剂、支气管舒张剂、与αvβ5整联蛋白或β5特异性结合的抗体、第二种αvβ5整联蛋白拮抗剂、与αvβ6整联蛋白特异性结合的抗体、αvβ6整联蛋白拮抗剂、β-2激动剂和表面活性剂。所述试剂盒还包含使用试剂盒的书面说明(如手册)。

实施例

实施例1：材料和方法

啮齿类单肺缺血再灌注肺损伤PE模型：小鼠或大鼠进行肺移植，心肺分流术，肺血栓动脉内膜切除术或严重休克。然后分别诱导三十分钟和三小时的缺血和再灌注。进行左胸廓切开术，通过阻断左肺门(如用脐带)30分钟诱导缺血。用潮气容积12ml/kg的空气使肺再膨胀，然后重新开始正常换气以诱导再灌注。3小时后处死动物，评估每个肺的渗透性，例如，通过测定外渗到肺中标记的白蛋白，表示为血管外肺等效量(extravascular pulmonaryequivalents)(EVPE)。

啮齿类动物呼吸机诱导的肺损伤PE模型：小鼠或大鼠以正常(6ml每kg)或高潮气量(20ml每kg)通气。4小时后注射¹²⁵I-标记的白蛋白，然后采集肺并确定EVPE。

血管外血浆等效量(Extravascular Plasma Equivalents)(EVPE)的测定：例如按Frank等，J.Biol.Chem.，278(45)：43939-43950(2003))的方法测定EVPE。简言之，在采集肺前两小时将血管示踪剂(如¹²⁵I白蛋白)腹腔注射到大鼠中。收集血液并切下肺。测定肺和血浆的放射活性。测定肺匀浆和血液中血红蛋白的浓度。用肺中的血液容积乘以血浆放射活性计数计算肺血管外放射活性。

抗体：ALULA按下述方法制备。W6/32，一种特异性结合HLA A、B和C的小鼠单克隆抗体W6/32来自ATCC。CD-1WT，一种结合CD-1的单克隆抗体来自ATCC。

实施例2：与αvβ5整联蛋白特异性结合的小鼠单克隆抗体-ALULA的制备

用表达包含αvβ5整联蛋白序列的多肽的细胞免疫αvβ5基因敲除小鼠。采用现有技术中已知的方法鉴定特异性结合αvβ5整联蛋白的单克隆抗体。更具体而言，鉴定与β5特异性结合的ALULA。ALULA于2004年2月13日保藏于ATCC，保藏号为：PTA-5817。

实施例3：β5^-/-小鼠不产生与PE有关的肺损伤

β5^-/-小鼠和野生型小鼠按上面实施例1中所述的进行换气以诱导肺损伤有关的PE并测定EVPE。与野生型小鼠不同，β5^-/-小鼠在换气后不产生PE。这些结果说明αvβ5参与了PE。所述结果如图1所示。

实施例4：与β5特异性结合的单克隆抗体降低与缺血再灌注有关的肺水肿的严重程度

为了确定β5在缺血-再灌注有关PE中的作用，对大鼠进行下列治疗并测定EVPE：

1.无治疗。

2.腹腔注射(i.p.)4μg/克W6/32。

3.I.p.4μg/克(i.p.)ALULA。

4.如上实施例1所述的诱导缺血再灌注。

5.诱导缺血再灌注并腹腔注射4μg/克W6/32。

6.诱导缺血再灌注并腹腔注射4μg/克ALULA。

在这些试验中，在诱导缺血-再灌注前注射抗体。

ALULA治疗大鼠与对照大鼠相比出现EVPE降低(即肺细胞渗透性降低)，说明与β5特异性结合的单克隆抗体能降低PE的严重程度。

所述结果如图2所示。

实施例5：与β5特异性结合的单克隆抗体降低与肺损伤有关的肺水肿的严重程度

为确定β5在与肺损伤有关的PE中的作用，对小鼠进行下列治疗并测定EVPE：

1.正常潮气量并i.p.注射4μg/克CD-1WT。

2.高潮气量并i.p.注射4μg/克CD-1WT。

3.正常潮气量并i.p.注射4μg/克ALULA。

4.高潮气量并i.p.注射4μg/克ALULA。

在这些试验中，抗体在潮气量处理前注射。

M ALULA治疗小鼠相比对照小鼠出现EVPE降低，说明与β5特异性结合的单克隆抗体能减轻PE的严重程度。

因此，ALULA是第一个被证明在体内整体哺乳动物具有阻断活性的αvβ5特异性单克隆抗体，并且是第一次在急性肺损伤模型(即PE)中显示阻断血管通透性增加和肺泡流体产生。

所述结果如图3所示。

实施例6：抗体ALULA阻断αvβ5整联蛋白配体玻连蛋白与表达αvβ5整联蛋白的细胞的结合

表达αvβ5整联蛋白的SW-480细胞在0μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml和10μg/ml ALULA存在下与0μg/ml、0.1μg/ml、0.3μg/ml和1μg/ml的玻连蛋白接触。用α9β1整联蛋白特异性单克隆抗体(即Y9A2)作为阴性对照。ALULA阻断αvβ5整联蛋白配体玻连蛋白与细胞的结合。结果如图4所示。

上述实施例是用于阐述本发明，而不是限制其范围。本发明的其他改变对所属领域普通技术人员是显而易见的，并包含在附加的权利要求中。这里引用的所有出版物、数据库、专利、专利申请和登记号全部引入作为参考。

Claims (34)

1.一种治疗或预防哺乳动物对象肺水肿的方法，所述方法包括给药所述对象治疗量的αvβ5整联蛋白拮抗剂。

2.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂是1kDa以下的药物。

3.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂是抗体。

4.权利要求3的方法，其中所述抗体是人源化抗体。

5.权利要求3的方法，其中所述抗体选自scFv、Fab和(Fab’)₂。

6.权利要求3的方法，其中所述抗体与ALULA(ATCC保藏号PTA-5817)竞争与αvβ5整联蛋白的特异性结合。

7.权利要求6的方法，其中所述抗体是ALULA。

8.权利要求6的方法，其中所述抗体是人源化ALULA。

9.权利要求1的方法，其中给药选自静脉内给药、鼻腔内给药和支气管内给药。

10.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。

11.权利要求10的方法，其中所述人患有肺水肿。

12.权利要求10的方法，其中所述人处于患肺水肿的风险中。

13.权利要求1的方法，还包括给药所述对象第二种治疗剂用于治疗或预防急性肺损伤。

14.权利要求13的方法，其中所述第二种治疗剂选自：TGFβ途径抑制剂、活化蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、利尿剂、支气管舒张剂、与αvβ5整联蛋白结合的抗体、与β5结合的抗体、αvβ5整联蛋白第二种拮抗剂、αvβ6整联蛋白拮抗剂、β-2激动剂和表面活性剂。

15.与ALULA(ATCC保藏号PTA-5817)特异性竞争与αvβ5结合的抗体。

16.权利要求15的抗体，其中所述抗体是ALULA。

17.权利要求15的抗体，其中所述抗体是人源化ALULA。

18.权利要求15的抗体，其中所述抗体选自：scFv、Fab和(Fab’)₂。

19.药物组合物，含有可药用的赋形剂和与ALULA(ATCC保藏号PTA-5817)竞争与αvβ5特异性结合的抗体。

20.权利要求19的药物组合物，其中所述抗体是ALULA。

21.权利要求19的药物组合物，其中所述抗体是人源化ALULA。

22.权利要求19的药物组合物，还含有第二种用于治疗或预防急性肺损伤的治疗剂。

23.权利要求22所述的药物组合物，其中所述第二种治疗剂选自：TGFβ途径抑制剂、活化蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、利尿剂、支气管舒张剂、与αvβ5整联蛋白结合的抗体、与β5结合的抗体、αvβ5整联蛋白第二种拮抗剂、αvβ6整联蛋白拮抗剂、β-2激动剂和表面活性剂。

24.鉴定治疗肺水肿药物的方法，所述方法包括，

将多种药物与αvβ5接触；

选择与αvβ5整联蛋白配体竞争与αvβ5整联蛋白结合的药物；和确定所选择的药物对肺水肿是否有效，从而鉴定治疗肺水肿的药物。

25.权利要求24的方法，其中所述多种药物是多种抗体。

26.权利要求24所述的方法，其中所述多种药物各在1KDa以下。

27.权利要求24所述的方法，其中所述配体是抗体。

28.权利要求27所述的方法，其中所述抗体是ALULA。

29.权利要求24所述的方法，其中所述配体选自玻连蛋白、纤连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白c和腺病毒五邻体基。

30.治疗或预防肺水肿的试剂盒，所述试剂盒包括：

αvβ5整联蛋白拮抗剂；和

第二种治疗或预防急性肺损伤的治疗剂。

31.权利要求30所述的试剂盒，其中所述αvβ5整联蛋白拮抗剂是单克隆抗体。

32.权利要求31所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体是ALULA。

33.权利要求31所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体是人源化ALULA。

34.权利要求30所述的试剂盒，其中第二种治疗剂选自：TGFβ途径抑制剂、活化蛋白C、类固醇、GM-CSF、血小板抑制剂、利尿剂、支气管舒张剂、与αvβ5整联蛋白结合的抗体、与β5结合的抗体、αvβ5整联蛋白第二种拮抗剂、αvβ6整联蛋白拮抗剂、β-2激动剂和表面活性剂。

Images