CN101500592A - 控制组织因子信号转导特异性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于在哺乳动物对象中治疗依赖于组织因子/VIIa因子信号转导的疾病的组合物和方法。该方法包括向哺乳动物对象给用组织因子信号转导抑制剂。该抑制剂可有效减少哺乳动物对象中的疾病发生率。本发明还提供了组织因子/VIIa因子信号转导调节剂的筛选方法。

Description

控制组织因子信号转导特异性的组合物和方法

与相关申请的交叉引用

[0001]本主题专利申请主张美国临时专利申请60/734,149(2005年11月7日提交)的优先权。该优先权申请的完整披露在此以各种目的全文引用作为参考。

政府资助声明

[0002]本发明在国家心肺血液研究所的政府资助下进行，资助号：HL60472，HL31950以及HL16411。政府对本发明具有一定的权利。

技术领域

[0003]本发明一般涉及在哺乳动物对象中治疗依赖于组织因子/VIIa因子(TF/VIIa)信号转导的疾病的组合物和方法。该方法包括向哺乳动物对象给用组织因子信号转导抑制剂。该抑制剂可用于降低或消除疾病的发生率或预防其发生或复发，且不干扰哺乳动物对象的止血。

背景技术

[0004]细胞表面受体组织因子(TF)的酶复合物与丝氨酸蛋白酶因子VIIa激活生理止血和凝血并同时在炎症，肿瘤进展和血管生成中引发蛋白酶激活的受体信号转导。Mackman，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.24：1015-1022，2004；Riewald及Ruf，Crit.Care7：123-129，2003；Belting等人，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.25：1545-1550，2005。上游TF-VIIa信号转导如何决定病理而不被下游大量生成的凝血蛋白酶所取代仍是血管生物学中的基础的，尚未解决的问题。Kawabata等人.，Br J Pharmacol，144：212-219，2005；Namkung，等人，.Gastroenterology，126：1844-1859，2004；Fiorucci，等人.，Proc Natl Acad Sci USA，98：13936-13941，2001；Cocks等人.，Nature，398：156-160，1999。

[0005]TF结合并变构激活VIIa因子并且协助能释放生成凝血酶的产物Xa的三元TF-VIIa-X凝血起动复合物的组装。Norledge等人.，Proteins53：640-648，2003。该TF-VIIa复合物还能直接裂解蛋白酶激活受体(PAR)2。Camerer等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5255-5260，2000；Riewald及Ruf，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：7742-7747，2001。尽管在止血和炎症中通过PARs进行的凝血酶信号转导已充分明确，在体内通过替代蛋白酶进行的PARs激活尚不清楚。Coughlin，J.Thromb.Haemost.3：1800-1814，2005。由于TF细胞质区磷酸化是PAR2信号转导的下游而TF细胞质区缺失的小鼠显示了增强的PAR2依赖性血管生成，TF和PAR2紧密连接。Ahamed及Ruf，J Biol.Chem.279：23038-23044，2004；Belting等人，NatureMed.10：502-509，2004。然而，TF-VIIa信号转导如何被调节以及如何通过其它下游凝血蛋白酶产生独立于信号转导的生理作用尚未完全被理解。目前尚未有经FDA批准的用于治疗血管生成相关疾病的血管生成抑制剂。本领域中对调节或抑制与血管生成，肿瘤细胞生长，肿瘤转移或炎症相关的TF信号转导，同时允许止血途径正常进行存在着需求。

发明综述

[0006]本发明一般涉及用于在哺乳动物对象中治疗疾病(例如，血管生成相关疾病，炎症或新生物疾病)的组合物和方法。该组合物是一种不干扰哺乳动物对象中的止血的组织因子信号转导抑制剂。该方法包括向哺乳动物对象给用组织因子信号转导抑制剂。该抑制剂可降低血管生成相关疾病，炎症或新生物疾病的发生率，且不增加在哺乳动物对象中减少凝血或增加出血的风险。

[0007]本发明提供了一种用于在哺乳动物中治疗依赖于组织因子/VIIa因子信号转导的疾病的方法，其包括向该哺乳动物对象给用数量足以减少或消除该疾病或能预防其发生或复发的组织因子信号转导抑制剂，其中该抑制剂不干扰哺乳动物对象中的止血。该疾病包括，但不限于，血管生成相关疾病，新生物疾病，或炎症。新生物疾病或炎症包含在血管生成相关疾病中。一方面，该抑制剂是一种抗体或小化学实体。在一个具体的方面，该抑制剂是由ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体10H10(MAb 10H10)。

[0008]本发明提供了一种在细胞中调节组织因子信号转导的化合物的鉴定方法，其包括将测试化合物与包含了表达能进行信号转导的组织因子的细胞的基于细胞的测定系统相接触，其中组织因子依赖性信号转导受到蛋白二硫键异构酶的调节，向所述测定系统提供其数量可供激活组织因子依赖性信号转导的VIIa因子，并检测所述测试化合物在所述测定系统中对组织因子依赖性信号转导的作用，所述测试化合物在所述测定中的作用可作为所述调节的指示。一方面，该方法进一步包括检测测试化合物对组织因子信号转导的抑制作用。另一方面，该方法进一步包括检测测试化合物对组织因子介导的止血的无作用。该细胞包括，但不限于，角化细胞，黑素瘤，或内皮细胞。在另一方面，该基于细胞的测定系统通过蛋白酶激活受体2进行信号响应。在另一方面，该测试化合物为抗体或小化学实体。在一个具体的方面，该化合物抑制MAb 10H10与组织因子的结合。在一个更具体的方面，该化合物不抑制ATCC编号为HB9382的杂交瘤所产生的单克隆抗体5G9(MAb 5G9)与组织因子的结合。

[0009]本发明提供了一种用于治疗哺乳动物对象中血管生成的方法，其包括给用治疗有效量的通过组织因子-VIIa因子途径调节细胞中的信号转导的化合物，其中所述的化合物为在基于细胞的测定系统中组织因子-VIIa因子信号转导的拮抗剂，且所述的化合物可在哺乳动物对象中减少或消除血管生成或预防其发生或复发。在另一方面，该化合物不干扰哺乳动物对象中的止血。一方面，组织因子-VIIa因子信号转导依赖于蛋白二硫键异构酶。在另一方面，组织因子-VIIa因子信号转导通过蛋白酶激活受体2发生。在另一方面，测试化合物为抗体或小化学实体。在一个具体的方面，该化合物抑制MAb 10H10与组织因子的结合。在一个更具体的方面，该化合物不抑制MAb 5G9与组织因子的结合。

[0010]本发明提供了一种用于治疗哺乳动物对象中新生物疾病的方法，其包括给用治疗有效量的通过组织因子-VIIa因子途径调节细胞中的信号转导的化合物，其中所述的化合物为在基于细胞的测定系统中组织因子-VIIa因子信号转导的拮抗剂，且所述的化合物可在哺乳动物对象中减少或消除新生物疾病或预防其发生或复发。在另一方面，该化合物不干扰哺乳动物对象中的止血。一方面，组织因子-VIIa因子信号转导依赖于蛋白二硫键异构酶。在另一方面，组织因子-VIIa因子信号转导通过蛋白酶激活受体2发生。在另一方面，测试化合物为抗体或小化学实体。在一个具体的方面，该化合物抑制MAb 10H10与组织因子的结合。在一个更具体的方面，该化合物不抑制MAb 5G9与组织因子的结合。

[0011]本发明提供了一种用于治疗哺乳动物对象中炎症的方法，其包括给用治疗有效量的通过组织因子-VIIa因子途径调节细胞中的信号转导的化合物，其中所述的化合物为在基于细胞的测定系统中组织因子-VIIa因子信号转导的拮抗剂，且所述的化合物可在哺乳动物对象中减少或消除炎症或预防其发生或复发。在另一方面，该化合物不干扰哺乳动物对象中的止血。一方面，组织因子-VIIa因子信号转导依赖于蛋白二硫键异构酶。在另一方面，组织因子-VIIa因子信号转导通过蛋白酶激活受体2发生。在另一方面，测试化合物为抗体或小化学实体。在一个具体的方面，该化合物抑制MAb 10H10与组织因子的结合。在一个更具体的方面，该化合物不抑制MAb 5G9与组织因子的结合。

[0012]本发明提供了一种用于检测哺乳动物对象中血管生成相关疾病的存在或易患病体质的方法，其包括提供来自该哺乳动物对象的样本；导入能在样本中免疫特异性结合组织因子的抗体，并测定样本中与组织因子结合的抗体的存在或数量，其中与组织因子结合的抗体的存在表示哺乳动物对象中血管生成相关疾病的存在或易患病体质，其中该抗体抑制组织因子信号转导但不干扰该哺乳动物对象中的止血。在本发明的另一方面，与组织因子结合的抗体的上升水平显示了血管生成相关疾病的存在或易患病体质。在一个具体的方面，该抗体为Mab 10H10。在一个进一步的具体方面，该血管生成相关疾病为新生物疾病或炎症。

[0013]本发明提供了一种用于检测哺乳动物对象中新生物疾病的存在或易患病体质的方法，其包括提供来自该哺乳动物对象的样本，导入能在样本中免疫特异性结合组织因子的抗体，并测定样本中与组织因子结合的抗体的存在或数量，其中与组织因子结合的抗体的存在表示哺乳动物对象中新生物疾病的存在或易患病体质，其中该抗体抑制组织因子信号转导但不干扰该哺乳动物对象中的止血。在本方法的其它方面中，与组织因子结合的抗体的上升水平显示了新生物疾病的存在或易患病体质在一个具体的方面，该抗体为Mab 10H10。在一个具体的方面，该新生物疾病为实体肿瘤，良性或恶性乳腺癌，黑素瘤，神经胶质瘤，星细胞瘤，血液系统恶性肿瘤，白血病，肺癌，结肠直肠癌，子宫癌，子宫平滑肌瘤，卵巢癌，子宫内膜癌，多囊卵巢综合症，子宫内膜息肉，前列腺癌，前列腺肥大，垂体癌，子宫腺肌病，腺癌，脑脊膜瘤，骨癌，多发性骨髓瘤，或CNS癌。

[0014]本发明提供了一种用于检测哺乳动物对象中炎症疾病的存在或易患病体质的方法，其包括提供来自该哺乳动物对象的样本；导入能在样本中免疫特异性结合组织因子的抗体，并测定样本中与组织因子结合的抗体的存在或数量，其中与组织因子结合的抗体的存在表示哺乳动物对象中炎症疾病的存在或易患病体质，其中该抗体抑制组织因子信号转导但不干扰该哺乳动物对象中的止血。在本发明的另一方面，与组织因子结合的抗体的上升水平显示了炎症疾病的存在或易患病体质。在一个具体的方面，该抗体为Mab 10H10。

附图说明

[0015]图1显示了信号转导组织因子的特异性抑制。

[0016]图2显示了信号转导组织因子受蛋白二硫键异构酶所调节。

[0017]图3显示了减少的组织因子的信号转导。

[0018]图4显示TF-VIIa信号转导促进肿瘤生长。

[0019]图5显示给MAb-10H10的表位分配。

[0020]图6显示了TF凝血活性的灭活取决于氧化氮。

[0021]图7显示了TF-VIIa信号转导需要TF-PAR2复合物的形成。

发明详述

[0022]一方面，本发明提供了治疗异常组织因子/VIIa因子(TF/VIIa)信号转导活性(例如，在具有过量TF/VIIa信号转导的对象中)的方法以及患有依赖于TF/VIIa信号转导、由TF/VIIa信号转导介导或与TF/VIIa信号转导相关联的疾病或症状的对象的治疗方法。异常TF/VIIa信号转导指与健康对象相比组织因子/VIIa因子(TF/VIIa)信号转导途径活性的过量或不足量。由TF/VIIa信号转导决定的疾病包括任何其发生或发展由TF/VIIa途径的异常信号转导活性介导或与之关联的紊乱或症状。该种疾病的范例包括炎症，新生物疾病，以及血管生成依赖性疾病。血管生成依赖性疾病包括具有过量血管生成(例如，癌症，糖尿病性失明，年龄相关性黄斑变性，风湿性关节炎，以及牛皮癣)或不足量血管生成(例如，冠心病，中风，以及伤口愈合延迟)的疾病或紊乱。本发明的组合物通常包括不干扰TF介导的止血(例如，凝血)途径的TF/VIIa信号转导途径抑制剂。本发明的方法包括向需要治疗的哺乳动物对象给用有效量的该种抑制剂。该抑制剂可用于减少炎症或新生物疾病的发生率，且不增加该对象出血的风险。

[0023]细胞表面受体组织因子(TF)的酶复合物与丝氨酸蛋白酶因子VIIa激活生理止血和凝血并同时在炎症，肿瘤进展和血管生成中引发蛋白酶激活的受体信号转导。Mackman，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.24：1015-1022，2004；Riewald及Ruf，Crit.Care 7：123-129，2003；Belting等人，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.25：1545-1550，2005。直接的上游TF-VIIa信号转导如何决定病理而不被下游大量生成的凝血蛋白酶所超越仍是血管生物学中的基础的，尚未解决的问题。如下列实施例所将具体描述，本发明证明了胞外蛋白二硫键异构酶(PDI)联合TF调节凝血，同时保留细胞信号转导。胞外TF Cys¹⁸⁶-Cys²⁰⁹二硫键的破坏表型模拟了PDI调节的信号转导TF的功能属性。因此，二硫键取代途径可作为受体功能特异性的胞外开关。单克隆抗体可靶向信号转导TF抑制的细胞应答天然构型和体内肿瘤(例如，乳腺瘤或黑素瘤)生长。在不损害有益的TF诱导的止血的同时，对病理生理TF信号转导的干扰为功能性二硫键开关在治疗方面的开发提供了范例。

[0024]应当理解本发明不限于特定的方法，试剂，化合物，组合物或生物系统，它们应当是可变的。还应当理解此处所用的术语仅供描述特定实施例之用，且并非意在限制。除非另行明确指明，本说明书和权利要求书所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包含了复数对象。因此，如一个细胞包括了两个或多个细胞的组合或类似物。

[0025]此处所用的术语“约”指一个如数量，时间期限等可测量的值，可包含对特定数值±20％或±10％，更优选±5％，更优选±1％，更优选±0.1％的变量，该变量适于实施所披露的方法。

[0026]除非另行说明，此处所用的技术和科学术语的含义等同于本发明所属领域普通技术人员的普遍理解。尽管其它与此处所述类似或等同的方法和材料也可用于对本发明进行测试，但优选的材料和方法已在此处描述。下列术语可用于描述和主张本发明。

[0027]“止血”指阻止受伤的血管出血，它要求经调节机制平衡的血管，血小板以及血浆因子的组合活性以限制血小板和血纤维蛋白在损伤区域的积聚。止血异常可导致血栓症或过量出血。

[0028]“血管生成”指在健康或处于疾病中的哺乳动物对象的新血管生长。血管生成在伤口愈合期间发生且可以在损伤或创伤后恢复向组织的血流。对于女性，血管生成还发生在每月生殖周期(以复原子宫内膜，在排卵中使卵子成熟)和怀孕(构建胎盘，母体和胎儿之间的循环)过程中。当血管生成生长因子的生成超过血管生成抑制剂时，可发生血管生长。当存在的抑制剂超过刺激剂时，血管生成停止。

[0029]产生过量血管生成的疾病包括，但不限于，癌症，炎症，糖尿病性失明，年龄相关性黄斑变性，风湿性关节炎，或牛皮癣。在这些症状中，心血管将供养患病组织，破坏正常组织，并且在癌症中支持肿瘤转移。产生不充分血管生成的疾病包括，但不限于，冠心病，中风，以及伤口愈合延迟。在这些症状中，血管生长不充分，且循环未被完全恢复，从而导致组织死亡的风险。

新生物疾病的治疗

[0030]新生物疾病指由异常或失控的细胞分裂引起的癌症或任何恶性生长或肿瘤；它可通过淋巴系统或血液系统扩散至身体的其他部位。“实体肿瘤”包括，但不限于，肉瘤，黑素瘤，癌瘤或其他实体肿瘤癌。

[0031]“肉瘤”指由类似于胚性结缔组织的物质构成且通常由包埋在纤维状或均一物质中的紧密填充的细胞组成的肿瘤肉瘤包括，但不限于，软骨肉瘤，纤维肉瘤，淋巴肉瘤，黑素肉瘤，粘液肉瘤，骨肉瘤，Abemethy肉瘤，脂肉瘤，脂肪肉瘤，腺泡状软组织肉瘤，成釉细胞肉瘤，葡萄状肉瘤，绿色瘤，绒毛膜癌瘤，胚胎性癌肉瘤，Wilms肿瘤肉瘤，子宫内膜肉瘤，间质肉瘤，Ewing肉瘤，筋膜肉瘤，成纤维细胞肉瘤，巨细胞肉瘤，绿色肉瘤，Hodgkin肉瘤，原发性多色素出血性肉瘤，B细胞免疫母细胞肉瘤，淋巴瘤，T细胞免疫母细胞肉瘤，Jensen肉瘤，Kaposi肉瘤，Kupffer细胞肉瘤，血管肉瘤，白血病性肉瘤，恶性间充质瘤，骨膜外肉瘤，网状细胞肉瘤，Rous肉瘤，浆液囊性肉瘤，滑膜肉瘤，以及毛细血管扩张性肉瘤。

[0032]“黑素瘤”指在皮肤和其他器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。黑素瘤包括，例如，肢端雀斑样痣黑色素瘤，无黑色素性恶性黑素瘤，良性幼年型黑素瘤，Cloudman黑素瘤，S91黑素瘤，Harding-Passey黑素瘤，幼年型黑素瘤，恶性雀斑黑素瘤，恶性黑素瘤，结节性黑色素瘤，指甲下黑素瘤，以及浅表扩展性黑素瘤。

[0033]“癌瘤”指由易于渗透周边组织并形成转移的上皮细胞构成的恶性新生长。示范性癌瘤包括，例如，腺泡癌，腺泡癌，囊性腺样癌，腺样囊性癌，腺癌，肾上腺皮质癌，蜂窝状癌，肺泡细胞癌，基底细胞癌，基底细胞癌，类基底细胞癌，基底鳞状细胞癌，细支气管肺泡癌，细支气管癌，支气管癌，髓样癌，胆管细胞癌，绒毛膜癌，胶样癌，粉刺状癌，粉刺状癌，囊性腺样癌，胸廓癌，皮肤癌，柱状癌，柱状细胞癌，导管癌，硬癌，胚胎性癌，髓样癌，表皮样癌，腺样上皮细胞癌，外植癌，溃疡性癌，硬癌，粘液癌，胶样癌，巨细胞癌，巨细胞癌，腺癌，粒层细胞癌，发母质癌，多血癌，肝细胞癌，Hurthle细胞癌，粘液癌，肾细胞癌，幼稚型胚胎性癌，原位癌，表皮内癌，上皮内癌，Krompecher癌，Kulchitzky细胞癌，大细胞癌，豆状癌，豆状癌，脂瘤样癌，淋巴上皮癌，髓样癌，髓样癌，黑色素癌，软癌，粘蛋白性腺癌，carcinoma muciparurn，粘液细胞癌，mucoepidernoidcarcinoma，粘液癌，粘液癌，粘液瘤样癌，鼻咽癌，燕麦细胞癌，骨化性癌，骨化性癌，乳头状癌，门脉周癌，原位癌，棘细胞癌，粉刺癌，肾细胞癌，贮备细胞癌，肉瘤样癌，schneiderian癌，硬癌，阴囊癌，印指环细胞癌，单纯癌，小细胞癌，硬癌，球状细胞癌，梭形细胞癌，髓样癌，鳞状细胞癌，扁平细胞癌，绳捆癌，血管扩张性癌，血管扩张性癌，移行细胞癌，结节性皮癌，结节性皮癌，疣状癌，以及carcinoma viflosum。

[0034]“白血病”指血液生成器官的渐进性，恶性疾病，并通常以白细胞及其前体在血液和骨髓中的畸形扩增和发展为特征。临床上白血病通常基于以下几点进行分类(1)疾病的期限和特征-急性或慢性；(2)所涉及细胞的类型；骨髓(骨髓性)，淋巴(淋巴性)或单核细胞；以及(3)血液中异常细胞的增长或不增长-白血型或非白血病(亚白血病)。白血病包括，例如，急性非淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病，急性粒细胞性白血病，慢性粒细胞性白血病，急性前髓细胞白血病，成人T细胞白血病，非白血性白血病，白细胞不增多性白血病，嗜碱性细胞性白血病，胚细胞白血病，牛白血病，慢性粒细胞性白血病，皮肤白血病，胚细胞性白血病，嗜酸细胞性白血病，Gross白血病，毛细胞性白血病，成血细胞性白血病，成血细胞性白血病，组织细胞性白血病，干细胞性白血病，急性单核细胞性白血病，白细胞减少性白血病，淋巴细胞性白血病，成淋巴细胞白血病，淋巴细胞性白血病，淋巴原白血病，淋巴系白血病，淋巴肉瘤细胞性白血病，肥大细胞白血病，巨核细胞型白血病，小原粒型白血病，单核细胞性白血病，成髓细胞白血病，髓细胞性白血病，髓细胞性白血病，粒单白血病，Naegeli白血病，浆细胞性白血病，浆细胞性白血病，前髓细胞性白血病，Rieder细胞性白血病，Schilling白血病，干细胞性白血病，亚白血性白血病，以及未分化细胞性白血病。

[0035]其它的癌症包括，例如，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，成神经细胞瘤，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，横纹肌肉瘤，原发性血小板增多症，原发性巨球蛋白血症，小细胞肺肿瘤，原发性脑肿瘤，胃癌，结肠癌，恶性胰岛素瘤，恶性类癌瘤，膀胱癌，恶化前皮肤病损，睾丸癌，淋巴瘤，甲状腺癌，成神经细胞瘤，食管癌，生殖泌尿道癌，恶性高钙血症，子宫颈癌，子宫内膜癌，肾上腺皮质癌，以及前列腺癌。

炎症的治疗

[0036]“炎症”或“炎性疾病”同时指急性应答(即，激活了炎症过程的应答)和慢性应答(即，以进展缓慢和新结缔组织为标志的应答)。急性和慢性炎症可通过所涉及的细胞类型进行区分。急性炎症通常涉及多形核中性粒细胞；而慢性炎症通常以淋巴细胞组织细胞和/或肉芽肿性应答为特征。炎症包括特异性和非特异性防御系统的反应。特异性防御系统反应是应答抗原(可能包括自身抗原)的特异性免疫系统反应。非特异性防御系统反应是由不能进行免疫记忆的白细胞介导的炎症应答。该种细胞包括粒细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞以及嗜曙红细胞。特定类型的炎症范例为弥漫性炎症，灶性炎症，格鲁布性炎，间质性炎症，阻塞性炎症，实质性炎症，特异性炎症，毒性炎症以及创伤性炎症。

[0037]保护动物免患包括炎症在内的疾病指减少对炎性剂(即，能够引起炎症应答的药剂，例如，乙酰甲胆碱，组胺，一种过敏原，一种白三烯，盐，换气过度，锻炼，二氧化硫，腺苷，普萘洛尔，冷空气，抗原及缓激肽)进行炎症应答(即，包括炎症的应答)的潜在可能性。优选降低进行炎症应答的潜在可能性，最理想能达到使该动物不再遭受不适和/或由于暴露至炎性剂导致的功能病变。例如，保护动物可以指一种化合物在给用至该动物时预防疾病发生和/或治愈或减轻疾病症状，征兆或病因的能力。保护动物特别指调节炎症应答以抑制(例如，减少，抑制或阻断)过于活跃或有害的炎症应答。保护动物还特别指调节细胞介导的免疫和/或体液免疫(即，T细胞活性和/或IgE活性)。疾病指任何对动物正常健康状态的背离并包括已发生背离(例如，感染，基因突变，遗传缺陷等)但症状尚未显现的疾病症状和病症。

抗体治疗

[0038]在一些实施例中，本发明提供了在哺乳动物对象(例如，患有炎症或肿瘤的对象)中抑制或阻抑TF/VIIa信号转导的方法，其中需要减少或下调TF/VIIa信号转导活性。该方法需要向哺乳动物对象给用可抑制或阻抑TF/VIIa信号转导的有效量的TF/VIIa信号转导抑制剂。在一些相关实施例中，本发明提供了与哺乳动物对象中组织因子/VII因子信号转导关联或由其决定的疾病症状的治疗或改善方法。如上文指出，该种疾病包括，例如，血管生成相关疾病，新生物疾病或炎症。该方法包括向哺乳动物对象给用其数量能有效减少或消除血管生成相关疾病，新生物疾病，或炎症或者能预防其在哺乳动物对象中发生或复发的组织因子信号转导抑制剂。在一些实施例中，本发明采用了针对能在哺乳动物对象中抑制组织因子信号转导但不干扰止血(例如，凝血)的组织因子的抗体。

[0039]典型的抗体指包含了来自特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽。该识别的免疫球蛋白基因包括kappa，lambda，alpha，gamma，delta，epsilon和恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为kappa或lambda。重链可被分为gamma，mu，alpha，delta或epsilon，其依次分别定义免疫球蛋白类别IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。抗体的抗原结合区通常在结合的特异性和亲和性中最为关键。

[0040]抗体和抗体衍生抗原结合分子表示与给定表位(例如，MAb10H10识别的TF或特定TF肽表位)显示单价，二价或多价强烈结合的多肽链。除非另行指明，本发明的抗体或抗原结合分子可具有来自任何脊椎动物，骆驼类，鸟类或鱼类的序列。它们可通过任何适用技术(例如，杂交瘤技术，核糖体展示，噬菌体展示，基因改组库，半合成或全合成库或其组合)生成。如此处所述，本发明的抗体或抗原结合分子包括完整抗体，抗原结合多肽链和其它设计抗体(例如，参见Serafini，J NuclMed.34：533-6，1993)。

[0041]抗体或抗原结合分子还包括包含了保留结合同源抗原(例如，由MAb 10H10识别的TF或特定TF肽表位)能力的完整抗体的抗原结合部分的抗体片段。该种抗体片段的范例包括(i)Fab片段，一种由VL，VH，CL和CHI区域构成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，一种包含了在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1区域构成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂中的VL和VH区域组成的FV片段；(v)一种由VH区域构成的dAb片段(Ward等人.，Nature 341：544-546，1989)；(vi)分离的决定簇互补区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个区域VL和VH由单独的基因编码，它们可通过重组方法采用能使它们作为单独蛋白链(其中该VL和VH区配对形成单价分子)生产的合成接头进行连接(被称为单链Fv(scFv)；例如，参见Bird等人.，Science 242：423-426，1988；以及Huston等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。

[0042]本发明的抗体或抗原结合分子进一步包括一种或多种能通过化学方法结合至，或表达为与其它蛋白的融合蛋白的免疫球蛋白链。它还包括双特异性抗体。双特异性抗体或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。本发明的其它抗原结合片段或抗体部分包括二价scFv(diabody)，双特异性scFv抗体(其中该抗体分子识别两个不同的表位)，单独结合区(dAbs)，以及微抗体。

[0043]此处所述的各种抗体或抗原结合片段可通过对完整抗体的酶或化学修饰，或采用重组DNA方法从头合成(例如，单链Fv)，或通过噬菌体展示库识别(例如，参见McCafferty等人.，Nature 348：552-554，1990)进行生产。例如，微抗体可通过本领域所描述的方法生成，例如，Vaughan和Sollazzo，Comb Chem High Throughput Screen.4：417-302001。双特异性抗体可通过包括杂交瘤融合和Fab’片段连接等各种方法生产。例如，参见SongsiVIIai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人.，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。单链抗体可通过噬菌体展示库或核糖体展示库，基因改组库识别得到。该种库可从合成，半合成或初始和免疫活性源进行构建。

[0044]可在上述的治疗方法中实际应用的抗体的特定范例为名为10H10的鼠单克隆抗体。如下方实施例所证明，MAb 10H10是一种可作为组织因子信号转导抑制剂且不干扰止血的抗体。该抗体已在美国专利5,223,427和6,001,978中得到具体描述。分泌该抗体的杂交瘤已参照布达佩斯条约的规定在1987年3月27日保藏于美国菌种保藏中心(Manassas，VA)，其编号为HB9383。除了由该杂交瘤生产的10H10抗体外，任何具有与MAb 10H10相同的结合特异性以及相同或更好的结合亲和性的抗体均可用于本发明的治疗方法。此外，本发明的治疗方法还可采用任何来自MAb 10H10或具有与MAb 10H10相同结合特异性以及相同或更好的结合亲和性的抗体的抗原结合分子或片段。

[0045]本发明的一些治疗方法针对治疗人类对象。在这些方法中，优选人源化抗体，人源抗体，或包含人源序列(例如，在恒定区)的嵌合抗体。与分离自非人动物(例如，小鼠)的抗体相比，该种抗体在给用至人对象时将具有更少的抗原性或不具有抗原性。嵌合抗TF抗体(例如，具有与MAb 10H10相同结合特异性的抗体)可由来自于非人抗TF抗体的区域和人源抗体区域构成。例如，嵌合H链可包含与人重链恒定区至少一部分连接的此处所示的小鼠抗TF抗体重链可变区的抗原结合区。该嵌合重链可与嵌合L链结合从而包含与人轻链恒定区至少一部分连接的小鼠抗TF抗体轻链可变区的抗原结合区。

[0046]本发明的嵌合抗TF抗体可参照本领域已知方法进行生产。例如，参见，Robinson等人..，国际专利申请PCT/US86/02269；Akira，等人..，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人..，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人..，国际申请WO 86/01533；Cabilly等人.美国专利4,816,567；Cabilly等人.，欧洲专利申请125,023；Better等人.，Science 240：1041-1043，1988；Liu等人.，PNAS84：3439-3443，1987；Liu等人.，J.Immunol.139：3521-3526，1987；Sun等人.，PNAS 84：214-218，1987；Nishimura等人.，Cane.Res.47：999-1005，1987；Wood等人.，Nature 314：446-449，1985；Shaw等人.，J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559，1988。

[0047]具有非人源抗体的完整可变区的嵌合抗体可进一步人源化以减少该抗体在人体内的抗原性。这通常可通过将该Fv可变区的特定序列或氨基酸(框架区或非CDR区)替换为人Fv可变区的等价序列或氨基酸序列得以实现。这些附加替换序列或氨基酸残基通常不直接包括在抗原结合中。非人源抗体更通常可通过仅将非人源抗体(例如，此处所示的小鼠抗TF抗体)的CDRs替换为人源抗体的CDRs进行人源化。在一些情况下，随后可将人框架区的一些附加残基替换为非人供体抗体的相应残基。通常需要进行该种附加嫁接以提高对抗原的结合。这是由于仅具有来自非人源抗体的CDRs的人源化抗体与非人供体抗体相比具有较低的完全结合活性。因此，除了CDRs外，本发明的人源化抗hTF抗体(例如，具有与MAb10H10相同结合特异性的抗体)通常可将人框架区的一些氨基酸残基替换为来自非人供体抗体(例如，此处所示的小鼠抗体)的响应残基。通过CDR替换生成人源化抗体的方法，包括选择进行替换的框架残基的标准已在本领域公知。例如，参见，Winter等人.，英国专利申请GB2188638A(1987)，美国专利5,225,539；Jones等人.，Nature 321：552-525，1986；Verhoeyan等人.，Science 239：1534，1988；Beidler等人.，J.Immunol.141：4053-4060，1988；以及WO 94/10332。

[0048]除了嵌合或人源化抗hPAR1抗体外，治疗人对象的治疗方法还可采用显示具有与MAb 10H10等小鼠抗体相同结合特异性以及相当或更高结合特异性的全人源抗体。该人抗TF抗体可采用任何本领域公知的方法生成，例如，采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示法。例如，参见，Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol 13：65-93(1995)，美国专利4,444,887和4,716,111；以及PCT公布WO 98/46645，WO 98/50433，WO98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741。

[0049]具有与MAb 10H10相同结合特异性以及相同或更好结合亲和性的衍生抗体或抗原结合分子可通过本领域公知的并在此处示范的方法获取。例如，可通过筛选与MAb 10H10竞争结合组织因子多肽或肽的能力得到针对组织因子抗原的候选抗体或免疫球蛋白。人组织因子的多肽和多聚核苷酸序列均为已知(例如，参见Scarpati等人.，Biochemistry26：5234-5238，1987；and Fisher等人.，Thromb.Res.48：89-99，1987)。适合筛选的组织因子多肽或肽可采用本领域公知且在此处描述的方法生成。此外，一组来自于人组织因子的特定抗原肽已在本领域得到描述，例如，美国专利5,223,427和6,001,978。这些专利还披露了MAb 10H10与组织因子肽组结合的能力。例如，据显示MAb 10H10特异性结合序列为SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV(SEQ ID NO：1)或ECDLTDEIVKDVKQTY(SEQ ID NO：2)的组织因子肽，但不结合来自于人组织因子的多种其它的抗原肽。后述的肽包括，例如，TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY(SEQ ID NO：3)或LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC(SEQ ID NO：4)。因此，可通过阻断MAb 10H10与具有序列SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽结合的能力筛选候选抗体(例如，针对人组织因子多肽的抗体)。还可通过与MAb 10H10结合美国专利5,223,427中描述的人组织因子肽组的相同或基本相同的结合能力进行筛选。进行该种筛选的方法已为本领域公知(例如，参见，美国专利5,223,427和6,001,978)。

[0050]除了体外筛选测定，还可使用体内方法鉴定适用于实施本发明方法的抗TF抗体。例如，美国专利申请10/778,726(公开号20050008625)披露了一种在抗体中将非人源抗体可变区替换为人可变区，同时保留相同的或提供更佳的结合特性的体内方法。为生成具有与小鼠MAb 10H10相同结合活性以及相同或更好的结合亲和性的人源抗体，本方法通过表位引导非人源抗体的可变区替换为全人源抗体。所得的人源抗体通常与参考非人源抗体结构上不相关，但与参考抗体结合相同抗原上的相同表位。

[0051]对特定表位具有与起始的非人源抗体(例如，小鼠MAb 10H10)相同或更好亲和性的人源抗体还可通过从生产人抗体的公司获取。例如，为生成所需的人源抗体，KaloBios，Inc.(Mountian View，CA)采用了人“接受者(acceptor)”抗体库。随后生成与非人源抗体结合相同表位(尽管亲和性不同)的人源抗体的定向或表位聚焦库。然后在表位聚焦库中选择具有与起始的非人源抗体类似或更高亲和性的抗体。然后进一步分析鉴定人源抗体的亲和性和序列一致性。

[0052]除了MAb 10H10以及从其衍生的抗体或抗原结合分子，其它具有所需性能以实现本发明的治疗性方法的抗TF抗体也可通过本领域常规的技术和方法进行生产。如本领域所普遍理解，双特异性捕捉剂包括在转移细胞或炎症细胞等细胞上结合组织因子的抗体，抗体结合片段(例如，单链抗体，Fab′片段，F(ab)′2片段，以及scFv蛋白和亲和体(Affibody，Teknikringen 30，floor 6，Box 700 04，Stockholm SE-10044，瑞典；参见美国专利，在此以各种目的全文引用作为参考))。根据其目标用途，它们还可包括特异性结合其它生物分子的受体和其它蛋白。

[0053]杂交抗体和杂交抗体片段包括具有全长重和轻链的完整抗体分子，或其任何片段，例如，Fab，Fab′，F(ab′)₂，Fd，scFv，抗体轻链和抗体重链。具有此处所述的可变区以及来自不同种类的恒定区的嵌合抗体同样适用。例如，参见，美国申请20030022244。

[0054]首先，选择可产生抗体的预定目标物。用于生成针对目标物的单克隆抗体的技术已为本领域技术人员公知。该种技术的范例包括，但不限于，包括展示库，异种或humab小鼠，杂交瘤等的技术。目标物包括任何能显示抗原性的物质并通常为蛋白或蛋白多糖。范例包括受体，酶，激素，生长因子，肽等。应当理解不仅天然存在抗体适用于本披露，针对预定对象的工程改造抗体及抗体片段同样适用。

[0055]可用于此处提出的技术的抗体(Abs)包括单克隆和多克隆Abs，以及抗体片段如Fab，Fab′，F(ab′)₂，Fd，scFv，双价抗体，抗体轻链，抗体重链和/或来自噬菌体或噬菌体展示技术的抗体片段。首先，从起源物种获取起始抗体。更具体地，采用对目标抗原具有特异性的起源物种抗体的轻链，重链或两者的核酸或氨基酸序列。起源物种是任何用于生成抗体或抗体库的物种，例如，大鼠，小鼠，兔子，鸡，猴，人等。生成和克隆单克隆抗体的技术已为本领域技术人员公知。在获得所需抗体后，使用任何可能的CDRs定义(例如，单独Kabat，单独Chothia，Kabat和Chothia组合，以及本领域技术人员已知的任何其它定义)将可变区(VH和VL)分离为组成部分(即，框架(FRs)和CDRs)。一旦获取组成部分后，有必要选择适当的目标物种框架。一个实施例包括比对来自起源物种抗体序列的各独立框架区和来自目标物种的可变氨基酸序列或基因序列。用于比对搜索的程序已为本领域所熟知，例如，BLAST等。例如，如果目标物种为人，可从任何适当的参考数据库，例如Genbank，NCBI蛋白数据库(http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，VBASE，人源抗体基因数据库(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc)，以及Kabat免疫球蛋白数据库(http://www.immuno.bme.nwu.edu)，及其翻译产物得到该氨基酸序列或基因序列(胚系或重排抗体序列)源。如果基于该核苷序列完成比对，则应对选定基因进行分析以确定该子集中何种基因与起源物种抗体具有最接近的氨基酸同源性。可预期与数据库中其它序列相比获得更高同源性程度的氨基酸序列或基因序列可参照此处描述的方法进行使用和操作。此外，同源性更低的氨基酸序列或基因在参照此处所述的方法操作和选择时可编码对预定目标抗原具有特异性的产物。在特定实施例中，可接受的同源性范围大于约50％。应当理解目标物种可以不是人类。

[0056]“治疗”指在癌症或炎症的治疗或改善或预防中任何成功指标，包括任何客观或主观的参数，如消除；免除；症状减弱或使患者对疾病更具耐受性；减缓退化或衰退的速率；或使最终退化时衰弱更少。症状的治疗或改善可基于主观或客观参数；包括医生检查的结果。相应地，术语“治疗”包括给用本发明的化合物或药剂以预防或减缓，减轻，或者阻止或抑制与眼部疾病关联的症状的发展。术语“治疗效果”指减少，消除，或预防对象的疾病，疾病的症状，或疾病的副作用。

[0057]在特定实施例中，“联合”，“组合疗法”和“组合产物”指向患者同时给用第一治疗剂以及此处所用的化合物。当联合给用时，各成分可同时给用或在不同时间点以任意顺序先后给用。因此，各成分可单独给用，但在时间上充分接近以提供所需的治疗效果。

[0058]采用本发明的方法对癌症，转移癌症或炎症的“治疗”或“处理”包括在具有罹患癌症或炎症风险但仍未发生或显示感染症状的对象中预防症状的发作，抑制癌症或炎症的症状(减缓或阻止其发展)，对癌症或炎症的症状或副作用进行缓解(包括姑息疗法)，以及消除癌症或炎症的症状(引起衰退)。“治疗”指在癌症或炎症的治疗或改善或预防中任何成功指标，包括任何客观或主观的参数，如消除；免除；症状减弱或使患者对疾病更具耐受性；减缓退化或衰退的速率；或使最终退化时衰弱更少。症状的治疗或改善可基于主观或客观参数；包括医生检查的结果。相应地，术语“治疗”包括给用本发明的化合物或药剂以预防或减缓，减轻，或者阻止或抑制与眼部疾病关联的症状的发展。术语“治疗效果”指减少，消除，或预防对象的疾病，疾病的症状，或疾病的副作用。

[0059]“剂量单位”指可作为待治疗特定个体的单一剂量的物理分散单位。各单位可包含结合了所需的药学载体的经计算产生所需疗效的预定量活性化合物。剂量单位形式的规范可由(a)活性化合物的独特性质以及待达到的特定治疗效果，(b)组合该种活性化合物的领域的固有限制所决定。

[0060]上下文中两个或多个核酸或多肽序列的“一致性”或“一致性”百分比指两个或多个序列或子序列经采用下述默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比较算法或通过人工比对和视觉观察(例如，参见MCBI网站)的检测，彼此相同或具有一定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即在比较窗口或指定区域中进行最大对应的比较和比对时，在特定区域中具有60％一致性，优选65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％或更高的一致性(例如，编码此处所述的组织因子或针对组织因子的抗体的核苷酸序列或者此处所述的组织因子或针对组织因子的抗体的氨基酸序列))。于是该序列可认为“基本一致”。该术语还可以指，或可用于，测试序列的配合。该术语还包括具有缺失和/或添加，以及具有替换的序列。如下文所述，优选算法还可以计算差距等。一致性优选针对长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域，或更优选针对长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域。

[0061]在序列比较中，通常将一种序列作为参考序列，将测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，并在需要时指定序列算法程序参数。优选采用默认程序参数，或另行指定参数。随后序列比较算法将根据程序参数计算测试序列相对参考序列的序列相似度百分数。

[0062]此处所用的“比较窗口”指包括了对选自下述小组中任一邻近位点数的片段的范围，该小组由20至600组成，通常为约50至约200，更常见为约100至约150，在该范围内一种序列能够与相同邻近位点数量的参考序列在两者最佳比对后进行比较。通过序列比对以进行比较的方法已为本领域公知。通过序列的最佳比对进行比较可通过下述方法实现，例如，通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，J.MoI.Biol.48：443，1970的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988的相似性搜索法，通过这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，以及TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，以及通过人工比对和视觉观察(例如，参见，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1995增刊)。

[0063]适于检测序列一致性和序列相似性百分比的算法的优选范例为BLAST和BLAST2.0算法，其描述分别参见Altschul等人，Nuc.Acids Res，25：3389-3402，1977以及Altschul等人.，J.MoI.Biol，215：403-410，1990。BLAST和BLAST2.0可采用此处所述的参数检测本发明的核酸和蛋白的序列一致性百分比。可进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首选通过鉴定待测序列中长度为W的短字鉴定高得分序列对(HSPs)，其中该短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某些正数值界限得分T。T指邻近字得分界限(上文Altschul等人)。这些初始邻近字命中(word hit)可作为种子启动对包含它们的更长HSPs的搜索。该字命中在每个序列的两个方向同时伸展，直至累计比对得分得到增加。对核苷酸序列的累计分数采用参数M(对一对匹配残基的奖赏分数；总是>0)和N(对不匹配残基的惩罚分数；总是<0)进行计算。对于氨基酸序列，可使用得分矩阵来计算累计分数。以下情况下字命中向各方向的伸展被停止：累计比对分数较其最大实现值小数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累计分数降至0或以下；或者达到了任一序列的末端。BLAST算法的参数W，T和X测定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认wordlength(w)为11，expectation(E)为5，M＝5，N＝-4，并同时对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认wordlength(w)为3，expectation(E)为10，以及该得分BLOSUM62矩阵(参见Henikoff &Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915，1989)的alignments(B)为50，expectation(E)为10，M＝5，N＝-4，并同时对两条链进行比较。

[0064]“多肽”，“肽”和“蛋白”在此可相互替换使用，并指氨基酸残基的聚合物。该术语可用于包含一种或多种与天然存在氨基酸对应的人工化学模仿的氨基酸残基的聚合物，以及天然存在氨基酸聚合物和非天然存在氨基酸聚合物。

[0065]“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸以类似的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指由遗传码所编码的氨基酸，以及随后进行修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即，一个与氢连接的α碳，一个羧基基团，一个氨基基团，以及一个R基团，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基锍。该种类似物具有修饰后的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰后的肽骨架，但保留了与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸一般化学结构的结构，但与天然存在的氨基酸以类似的方式作用的化合物。

[0066]在此氨基酸既可以用通常了解的三个字母的符号表示，也可通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样的，核苷酸也可用其普遍接受的单字母代码表示。

[0067]“保守性修饰变体”可同时用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守性修饰变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或当该核酸不编码氨基酸序列时指基本相同的序列。由于遗传码的兼并，大量功能相同的核酸可编码任何给定蛋白。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定丙氨酸的各位点，该密码子可改变为所述的任意相应密码子而不改变编码的多肽。该核酸突变体为“沉默突变体”，它是保守性修饰变体的一种。此处的每个编码多肽的核酸序列还包括了该核酸可能的沉默变体。技术人员将理解可对核酸中的各密码子进行修饰(除了AUG，它通常是蛋氨酸的唯一密码子，以及TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)以获得功能相同的分子。相应地，编码多肽的核酸的各沉默突变体包含在所述有关表达产物，但与实际探针序列无关的各序列中。

[0068]对于氨基酸序列，技术人员将理解当一种更改导致以化学类似的氨基酸替换氨基酸时，在编码序列中改变，增加或去除了单个氨基酸或一定比例氨基酸的核酸，肽，多肽或蛋白序列的单独替换，去除或增加为一种“保守性修饰变体”。保守性替代表提供了本领域公知的功能类似的氨基酸。该种保守性修饰的变体不排除本发明的多形态变体，种间同源物，以及等位基因。

[0069]下列八组分别包含了可相互保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(例如，参见Creighton，Proteins(1984))。[0070]多肽结构等大分子结构可通过不同的构造水平进行描述。对于该构造的一般讨论参见，例如，Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，3rd ed.，1994)and Cantor and Schimmel，Biophysical Chemistry Part I：TheConformation of Biological Macromolecules，1980。“一级结构”指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”指在多肽内局部有序的三维结构。这些结构通常称为功能区，例如，酶区，胞外区，跨膜区，孔区以及细胞质尾区。功能区是多肽中形成多肽致密单元且通常长度为15至350个氨基酸的部分。功能区通常由低级构造如β-折叠和α-螺旋伸展等部分组成。“三级结构”指多肽单体完整的三维结构。“四级结构”指由独立三级单元通过非共价连接形成的三维结构。各向异性项也称为能量项。

[0071]特定的核酸序列还包含了“剪接变体”。类似的，由核酸编码的特定蛋白包含了该核酸的剪接变体所编码的任意蛋白。如字面含义所示，“剪接变体”为基因替代剪接的产物。转录后，可对初始核酸转录物进行剪切从而使不同的(替代)核酸剪切产物编码不同的多肽。生产剪切变体的机制不尽相同，但包括外显子的替代剪切。由相同核酸通过转录通读得到的替代多肽同样包含在本定义之内。剪切反应的任意产物，包括剪切产物的重组形式均包括在本定义之内。

[0072]细胞，或核酸，蛋白，或载体等的“重组”指该细胞，核酸，蛋白或载体曾通过引入外源核酸或蛋白或通过天然核酸或蛋白的替换进行修饰，或该细胞来自于经过该修饰的细胞。因此，例如重组细胞可表达细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或者可表达其它情况下异常表达，表达下调或者根本不表达的天然基因。

[0073]“严格杂交条件”指通常在核酸的复杂混合物中探针与其目标子序列杂交而不与其它序列杂交的条件。严格条件与序列相关且随环境的不同而变化。更长序列特别会在更高的温度下杂交。对核酸杂交的广泛指导可参见Tijssen，＂Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes，＂Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays，1993。一般而言，严格条件可选定为较特定离子强度pH下的热熔点(T_m)低大约5-10℃。T_m为(在给定离子强度，pH和核酸浓度下)平衡时50％的针对目标的互补探针与目标序列进行杂交时的温度(由于目标序列为过量存在，因此在平衡时50％的探针被占用)。严格条件还可通过添加甲酰胺等去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的两倍，优选为背景杂交的10倍。示范性的严格杂交条件如下：50％甲酰胺，5x SSC，以及1％SDS，在42℃下孵育，或者5x SSC，1％SDS，在65℃下孵育，并在65℃下以0.2x SSC，以及0.1％ SDS洗涤。

[0074]在严格条件下不进行彼此杂交的核酸在其编码的多肽基本一致时仍然基本一致。例如，该情况可发生在核酸的拷贝由遗传码所允许的最大密码子兼并所创建时。在该种情况下，该核酸通常在温和的严格杂交条件下杂交。示范性的“温和严格杂交条件”包括在40％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS的缓冲液在37℃下杂交，并以1 x SSC在45℃下洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。普通技术人员可轻易的理解可通过替代性的杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件。确定杂交参数的附加指导方针可参见多篇参考文献，例如，上文Ausubel等人。

[0075]对于PCR，尽管退火温度可根据引物长度在约32℃和48℃之间变化，低严格性扩增的典型温度为约36℃。尽管高严格退火温度可根据引物长度和特异性在约50℃至约65℃之间变化，高严格性PCR扩增的典型温度为约62℃。高和低严格性扩增的典型循环条件包括30秒-2分钟的90℃-95℃的变性期，以及持续约30秒-2分钟的退火期，1-2分钟的72℃的延长期。低和高严格性扩增的方案和方针参见，例如，Innis等人，PCRProtocols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.，1990。

[0076]“药学可接受的赋形剂”指可用于制备总体安全，无毒，良好的药物组合物的赋形剂，并包括可进行兽用和人体药物用途的赋形剂。该种赋形剂可以是固体，液体，半固体，或者对于气雾剂时可以是气体。

[0077]“药学可接受盐和酯”指药学可接受并具有所需药理功能的盐和酯。该种盐包括化合物中的酸性质子能够与无机或有机碱基反应的盐。适用的无机盐包括可通过碱金属(例如，钠和钾，镁，钙，和铝)形成的盐。适用的有机盐包括通过有机碱基如胺碱(例如，乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N甲基葡萄糖胺等)形成的盐。该种盐还包括由无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸，柠檬酸，马来酸以及如甲烷磺酸和苯磺酸等烷烃和芳烃磺酸)形成的酸性加成盐。药学可接受的酯包括通过化合物中的羧基，磺酰氧，以及膦羧基等基团形成的酯，例如，C_1-6烷基酯。当存在两种酸性基团时，药学可接受的盐或酯可以是一种单酸单盐或酯或者一种双盐或酯，类似地，当存在超过两种酸性基团时，这些基团可以部分或全部被盐化或酯化。本发明中指定的化合物可以未盐化或未酯化的形式，或者以盐化和/或酯化的形式存在，且对该化合物的指定意在包含其初始(未盐化和未酯化)化合物及其药学可接受的盐和酯。此外，本发明中指定的化合物可以多种立体异构形式存在，且对该种化合物的指定意在包含所有的单独立体异构体及所有该种立体异构体的混合物(不管是否为外消旋)。

[0078]“药学可接受”，“生理学耐受”及其语法变体在针对组合物，载体，稀释剂和试剂时可相互替换并代表该材料能够向人体施用而不产生可阻止该组合物的给用的有害生理学作用。

[0079]“治疗有效量”指在向对象给用以治疗疾病时，其数量足以引起对该疾病的疗效。

[0080]除非另行说明，术语“患者”，“对象”可相互替换并指哺乳动物，如人类患者或非人类的灵长类动物，以及兔子，大鼠，小鼠及其它实验动物。相应地，此处所用的术语“对象”或“患者”指任何可给用本发明组合物的哺乳动物患者或对象。在本发明的一些实施例中，该患者患有对疾病抵抗力降低的疾病，例如HIV。在本发明的一个示范性实施例中，为鉴别可根据本发明的方法采用包含一种或多种凝集素和/或表面活性蛋白的药物组合物进行治疗的对象患者，可采用可接受的筛选方法以确定对象中现有疾病或症状的状态或者目标或怀疑疾病或症状的危险因素。这些筛选方法包括，例如，确定对象是否患有眼部疾病的眼部检查。这些常规方法可使临床医生能够选择需要治疗的对象。在本发明的特定实施例中，用于储存，清洁，再润湿和/或消毒隐形眼镜的眼科组合物，以及人工泪液组合物和/或隐形眼镜将包含一种或多种凝集素和/或表面活性蛋白，从而抑制隐形眼镜佩戴者中眼部疾病的形成。

[0081]对已知癌症治疗药物或炎症治疗药物与本发明药物组合物的“同步给药”指将该药物和作为组织因子抑制剂(例如，抗体或小化学实体)的组合物在特定时间给药从而使已知药物和本发明的组合物均产生疗效。该同步给药可包括与本发明化合物的给用同时(即，在同一时间)，在先，或随后给用该抗菌药物。本领域的普通技术人员将可简单确定特定药物和本发明的组合物给用的正确时间，顺序和剂量。

[0082]从相同家族和/或相同家族成员选择合适的框架区候选物后，重和轻链可变区均可通过将来自于起源物种的CDRs嫁接至杂交框架区生成。针对上述任意方面的具有杂交可变链区的杂交抗体或杂交抗体片段的可采用本领域常规方法组装。例如，编码此处所述的杂交可变区(即，基于目标物种的框架和来自于起源物种的CDRs)的DNA序列可通过寡聚核苷酸合成和/或PCR生成。编码CDR区的核酸还可从起源物种抗体采用适当的限制性内切酶分离并通过适当的连接酶连接至目标物种的框架。另外，起源物种抗体可变链的框架区还可通过定点突变进行改变。

[0083]由于杂交体可从多种对应各框架区的候选物中选择构建，参照此处所述的原理进行构建可产生多种序列组合。相应地，可构建具有单独框架区不同组合的成员的杂交体库。该库可以是序列集合的电子数据库或是杂交体的物理集合。

[0084]物理抗体或抗体片段库的组建优选通过合成多聚核苷酸实现。在一个实施例中，在寡聚核苷酸中设计了重叠区从而使其可退火并通过聚合酶(例如通过聚合酶链式反应(PCR))填补。可进行多步重叠延长从而生成VL和VH基因插入物。这些片段中设计了人恒定区的重叠区从而使其可通过重叠延长融合并生成全长轻链和Fd重链片段。轻和重Fd链区可通过重叠延长连接在一起以生成可克隆进入展示载体的单独Fab库插入物。也可采用组装人源化库基因的替代性方法。例如，该库可采用连接酶链式反应(LCR)方法通过重叠多聚核苷酸进行组装。Chalmers等人，Biotechniques，30-2：249-252，2001。

[0085]可生成各种形式的抗体并克隆进入适当的载体以创建杂交抗体库或杂交抗体片段库。例如，可将可变基因克隆进入同框包含必要恒定区的剩余部分的载体。可被克隆的附加片段的范例包括全轻链，重链的Fd部分，或包含轻链和重链Fd编码序列的片段。此外，用于人源化的抗体片段可以是单链抗体(scFv)。

[0086]任何选择性展示系统可结合本披露的库进行使用。用于分离大库的目标成员的选择方案已为本领域所知，其代表为噬菌体展示技术。这种在丝状噬菌体表面展示多种肽序列的系统经证明可用于创建可对结合目标抗原的特定抗体片段进行体外选择和扩增的抗体片段(以及编码它们的核苷酸序列)库。Scott等人，Science，249：386，1990。该编码VH和VL区的核苷酸序列被连接至编码前导信号的基因片段并导入大肠杆菌的周质空间，从而使所得抗体片段在噬菌体表面(通常作为与噬菌体外壳蛋白如pIII或pVIII的融合物)展示。另外，抗体片段还可在lambda噬菌体或T7衣壳(phagebodies)的外表展示。基于噬菌体的展示系统的一项优势在于，由于它们为生物系统，选定的库成员可通过在细菌细胞中含选定库成员的噬菌体的生长进行简单的扩增。此外，由于编码该多肽库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体中，测序，表达和后续基因操作均相对简单。用于构建噬菌体抗体展示库和lambda噬菌体展示库的方法已为本领域公知。McCafferty等人，Nature，348：552，1990；Kang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363，1991。

[0087]本发明进一步涉及特异性结合本发明的多肽的抗体和T细胞抗原受体(TCR)。本发明的抗体包括IgG(包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)，IgA(包括IgA1和IgA2)，IgD，IgE或IgM，以及IgY。此处所用的术语“抗体”(Ab)意在包括全抗体，包括单链全抗体，及其抗原结合片段。该抗体优选为本发明的人抗原结合抗体片段并包括，但不限于，Fab，Fab′和F(ab′)₂，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接Fvs(sdFv)以及包含V_L或V_H区的片段。该抗体可来自包括鸟类和哺乳动物的任意动物来源。该抗体优选人，鼠，兔，山羊，豚鼠，骆驼，马或鸡抗体。

[0088]包括单链抗体在内的抗原结合分子或片段可以仅单独包含可变区，或是结合下列区域的全部或部分：CH1，CH2和CH3区。本发明还包括了可变区和铰链区，CH1，CH2和CH3区的任意组合。本发明进一步包括特异性结合本发明的多肽的单克隆，多克隆，嵌合，人源化，以及人单克隆和人多克隆抗体。本发明进一步包括本发明抗体的抗独特性抗体。

[0089]如上文指出，适用于本发明的抗体可以具有单特异性，双特异性，三特异性或更大的多特异性。多特异性抗体可对本发明的多肽不同表位具有特异性，或可能对本发明多肽和外源组合物(如外源多肽或固相支持材料)具有特异性。例如，参见，WO 93/17715；WO 92/08802；WO91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69，1991；美国专利5,573,920；4,474,893；5,601,819；4,714,681；4,925,648，均以各种目的全文引用作为参考；Kostelny等人，J.Immunol.74S：1547-1553，1992。

[0090]适用于本发明的抗体可通过该抗体识别或特异性结合的本发明的表位或多肽部分进行描述或说明。该表位或多肽部分可按照此处所述进行说明，例如，通过N末端和C末端位置，通过连续氨基酸残基大小进行说明。也可排除特异性结合本发明的任意表位或多肽的抗体。因此，本发明包括了特异性结合本发明多肽的抗体，同时允许排除该种抗体。

[0091]本发明的抗体还可根据其交叉反应性进行描述或说明。不与本发明的多肽的任何其它类似物，直系同源物，或同源物结合的抗体同样包括在内。与本发明的多肽的一致性少于95％，少于90％，少于85％，少于80％，少于75％，少于70％，少于65％，少于60％，少于55％，或少于50％(通过本领域已知并在此处描述的方法计算)的多肽不结合的抗体同样包括在本发明之内。本发明进一步包含了仅与根据本发明的多聚核苷酸在“严格杂交条件”(如此处所述)下杂交的多聚核苷酸编码的多肽结合的抗体。本发明的抗体还可根据其结合亲和性进行描述或说明。优选结合亲和性包括解离常数或K_d小于5 X 10^-6M，10^-6M，5 X 10^-7M，10^-7M，5 X 10^-8M，10^-8M，5 X 10^-9M，10^-9M，5 X 10^-10M，10^-10M，5 X 10^-11M，10^-11M，5 X 10^-12M，10^-12M，5 X 10^-13M，10^-13M，5 X 10^-14M，10^-14M，5 X 10^-15M以及10^-15M的亲和性。

[0092]抑制组织因子信号转导的抗体的用途包括，但不限于，本领域已知的纯化，检测，以及靶向本发明多肽的方法，包括体外和体内诊断和治疗方法。例如，该抗体可用于在生物样本中定性和定量检测本发明的多肽水平的免疫测定。例如，参见，上文Harlow和Lane，在此以各种目的全文引用作为参考。

[0093]本发明的抗体可以单独使用或与其它组合物联合使用。该抗体可进一步在N-或C-末端重组融合至外源多肽或化学结合(包括共价或非共价结合)至多肽或其它组合物。例如，本发明的抗体可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或外源多肽，药物，或毒素等效应分子。例如，参见WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利5,314,995和EP 396,387，其全文在此以各种目的引用作为参考。

[0094]本发明的抗体可通过本领域任何适用方法进行制备。例如，可向动物给用本发明的多肽或其抗原性片段以引导含有多克隆抗体的血清的生产。术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指由单个克隆(包括真核，原核或噬菌体克隆)得到的抗体，而非它的生产方法。单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括杂交瘤，重组和噬菌体展示技术的应用。

[0095]杂交瘤技术包括本领域已知的以及在上文Harlow和Lane；Hammerling等人.，Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas，563-681，1981中所讲解的技术，所述参考文献在此全文引用作为参考。可采用木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)₂片段)等酶通过蛋白水解裂解获得Fab和F(ab′)₂片段。

[0096]另外，抑制组织因子信号转导的抗体可通过重组DNA和噬菌体展示技术或通过合成化学采用本领域已知的方法进行生产。例如，本发明的抗体可采用本领域已知的各种噬菌体展示方法制备。在噬菌体展示方法中，功能性抗体区域被展示在携带了编码它们的多聚核苷酸的噬菌体粒表面上。具有目标结合属性的噬菌体可通过直接选择抗原，通常选择结合至或捕获至固体表面或珠从抗原抗体库或结合抗体库(例如，人或鼠)进行选择。这些方法中常用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括带有重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的Fab，Fv或二硫键稳定的Fv抗体区域的fd和M13。可用于制备该本发明抗体的噬菌体展示方法的范例可参见Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50，1995；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186，1995；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958，1994；Persic等人，Gene 187：9-18，1997；Burton等人，Advancesin Immunology 57：191-280，1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO95/20401；以及美国专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727和5,733,743，其全文以各种目的分别在此引用作为参考。

[0097]如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可从该噬菌体分离该抗体编码区并用于生成包括人源抗体或任何其它目标抗原结合片段的完整抗体，并在包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌的目标宿主中表达。例如，用于重组生产Fab，Fab′和F(ab′)₂片段的技术也可采用本领域已知的技术，例如参见WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869，1992；以及Sawai等人，AJRI 34：26-34，1995；和Better等人，Science 240：10411043，1988。

[0098]可用于生产单链Fvs和抗体的技术范例可参见美国专利4,946,778和5,258,498，其全文以各种目的分别在此引用作为参考。Huston等人，Methods in Enzymology，203：46-88，1991；Shu，L.等人，PNAS 90：7995-7999，1993；以及Skerra等人，Science 240：1038-1040，1988。对于某些应用，包括抗体在人体内的体内应用以及体外检测分析中，优选采用嵌合，人源化或人源抗体。生产嵌合抗体的方法已为本领域所知。例如，参见Morrison，Science 229：1202，1985；Oi等人，Biotechniques 4：214，1986；Gillies等人.，J.Immunol.Methods，125：191-202，1989；以及美国专利5,807,715。抗体可通过多种技术进行人源化，包括CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；以及美国专利5,530,101和5,585,089)，镶饰或重塑(EP0592106；EP 0 519 596；Padlan E.A.，Molecular Immunology，28：489-498，1991；Studnicka等人，Protein Engineering 7：805-814，1994；Roguska等人.，PNAS91：969-973，1994)，以及链替换(美国专利5,565,332)。人源抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述的噬菌体展示技术。还可参见美国专利4,444,887；4,716,111；5,545,806；和5,814,318；以及WO98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和WO 91/10741，分别以各种目的在此全文引用作为参考。

[0099]本发明进一步包括重组融合或化学结合(包括共价和非共价结合)至本发明多肽的抗体。该抗体可对本发明多肽以外的抗原具有特异性。例如，可通过将本发明的多肽融合或结合至特异针对特定细胞表面受体的抗体，以使抗体可以将本发明多肽靶向体外或体内的特定细胞类型。融合或结合至本发明多肽的抗体还可通过本领域已知的方法用于体外免疫测定和纯化方法。例如，参见上文的Harbor等人，以及WO 93/21232；EP 0 439 095；Naramura等人.，Immunol.Lett.39：91-99，1994；美国专利5,474,981，以各种目的在此全文引用作为参考；Gillies等人，PNAS 89：1428-1432，1992；Fell等人，J.Immunol.146：2446-2452，1991。

[0100]本发明进一步包括了组合物，其包含了融合或结合至抗体中可变区以外区域的本发明多肽。例如，本发明的多肽可融合或结合至抗体Fc区，或其部分。融合至本发明多肽的抗体部分可包括铰链区，CH₁区，CH₂区，以及CH₃区或完整区域的任意组合或其部分。本发明的多肽可融合或结合至上述抗体部分以提高该多肽的体内半衰期或用于采用本领域已知方法的免疫测定。该多肽还可用于融合或结合至上述抗体部分以形成多聚体。例如，融合至本发明多肽的Fc部分可通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。可通过将多肽融合至IgA和IgM部分形成更高的多聚体。用于将本发明的多肽融合或结合至抗体部分的方法已为本领所知。例如，参见美国专利5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851；5,112,946；EP 0 307 434，EP 0 367 166；WO 96/04388；以及WO 91/06570，分别以各种目的在此全文引用作为参考；Ashkenazi等人，PNAS，88：10535-10539，1991；Zheng等人.，J.Immunol，154：5590-5600，1995；以及Vil等人.，PNAS，89：11337-11341，1992。

[0101]本发明进一步涉及作为本发明组织因子信号转导拮抗剂的抗体。例如，本发明包括了通过本发明多肽的独特构象部分或全部破坏受体/配体相互作用的抗体。包含了受体特异性抗体和配体特异性抗体。本发明包括了不防止配体结合但防止受体信号转导的受体特异性抗体。受体信号转导可通过此处所述或本领域已知的技术进行测定。本发明还包括了同时防止配体结合和受体信号转导的受体特异性抗体。同样地，本发明包括了与配体结合并防止配体与受体结合的中和抗体，以及结合配体，从而防止受体信号转导，但不防止配体与受体结合的抗体。本发明进一步包括了激活该受体的抗体。这些抗体可作为由配体介导的受体信号转导影响的全部或部分生物活性的拮抗剂。该抗体可被指定为包括此处披露特定活性的生物活性的拮抗剂。上述抗体拮抗剂可通过本领域已知的方法制备。例如，参见WO 96/40281；美国专利5,811,097，分别以各种目的在此全文引用作为参考；Deng等人，Blood 92：1981-1988，1998；Chen，等人，Cancer Res.，58：3668-3678，1998；Harrop等人，J.Immunol 161：1786-1794，1998；Zhu等人，Cancer Res.，58：3209-3214，1998；Yoon，等人，J.Immunol，160：3170-3179，1998；Prat等人，J.Cell.Sci.，111：237-247，1998；Pitard等人，J.Immunol Methods，205：177-190，1997；Liautard等人.，Cytokinde，9：233-241，1997；Carlson等人.，J.Biol.Chem.，272：11295-11301，1997；Taryman等人，Neuron，14：755-762，1995；Muller等人，Structure，6：1153-1167，1998；Bartunek等人，Cytokinem，8：14-20，1996。如上文讨论，在肿瘤性细胞或炎症细胞中抑制组织因子信号转导的抗体可通过本领域技术人员熟知的技术依次用于生成“模仿”本发明多肽的抗独特性抗体。(例如，参见，Greenspan等人，FASEB J.7：437-444，1989以及Nissinoff，J.Immunol.147：2429-2438，1991)。例如，结合和竞争性抑制多肽多聚化和/或与本发明多肽与配体的结合的抗体可用于生成“模仿”多肽多聚化和/或结合区，从而结合和中和多肽和/或其配体的抗独特型。该中和性抗独特型或该抗独特型的Fab片段可用于在治疗领域中和多肽配体。例如，该抗独特型抗体可用于结合本发明的多肽和/或结合其配体/受体，从而阻断其生物活性。

[0102]新生物细胞或炎症细胞中组织因子信号转导的“抑制剂”，“激活剂”和“调节剂”分别指可通过组织因子结合或信号转导的体外和体内测定进行鉴定的抑制，激活或调节分子，如配体，激动剂，拮抗剂以及它们的同源物和类似物。

[0103]“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂指结合，部分或完全阻断刺激，减少，防止，延缓激活，灭活，脱敏或下调信号转导组织因子活性的药剂，如拮抗剂。激活剂指结合，刺激，增加，打开，激活，促进，强化激活，致敏或上调信号转导组织因子活性的药剂，如激动剂。调节剂可包括能够改变信号转导组织因子与下列对象相互作用的试剂：能够与激活剂或抑制剂结合的蛋白，受体，包括蛋白，肽，脂质，碳水化合物，多糖，或以上的组合，如脂蛋白，糖蛋白及类似物。调节剂包括天然存在的信号转导组织因子配体经基因修饰(如改变了活性)的产物，以及天然存在和合成的配体，拮抗剂，激动剂，小化学分子及类似物。对抑制剂的该种测定包括，例如，对表达信号转导组织因子的细胞采用公认的调节剂化合物，然后如本处所述检测对组织因子信号转导的功能作用。将包含了以潜在激活剂，抑制剂或调节剂处理的组织因子的测定样本与未经抑制剂，激活剂或调节剂处理的对照样本进行比较以测定抑制程度。对照样本(未经抑制剂处理)可指定其相对组织因子信号转导值为100％。当组织因子信号转导活性值相对对照约为80％，可选50％或25-0％时形成抑制。

[0104]一种分子结合信号转导组织因子的能力可通过公认配体与细胞上的信号转导组织因子集结合的能力进行测定。结合的特异性可通过与仅具有凝血组织因子的细胞结合的比较进行测定。

[0105]在一个实施例中，结合至信号转导组织因子的抗体可以通过固定配体或受体进行分析。例如，该分析可包括将融合到His标签的经适当修饰模仿信号转导构型的组织因子固定化至Ni激活NTA树脂珠。抗体可添加于适当的缓冲液中，随后将珠子在给定温度下培养一段时间。经过洗涤去除未结合材料后，结合的蛋白可通过SDS，高pH缓冲液及类似物等释放并进行分析。

融合蛋白

[0106]针对信号转导组织因子的抗体可用于生成融合蛋白。例如，本发明的抗体在与第二蛋白融合时可用作抗体纯化中的抗原性标签，或当该抗体作为信号转导组织因子抑制剂进行治疗时提高其稳定性。

[0107]可融合至多肽的区域范例不仅包括外源信号序列，还包括其它外源功能性区域。该融合并非必须直接进行，也可通过接头序列实现。

[0108]此外，融合蛋白还可经工程改造以提高该多肽的特性。例如，可向该多肽的N-末端添加附加氨基酸区域，部分带电氨基酸以提高从宿主细胞纯化或者后续处理和贮存时的稳定性和持续性。此外，可向该多肽添加肽部分以促进纯化。该区域可在该多肽的最终制备前去除。添加肽部分以促进多肽处理仅需要本领域熟悉和常规的技术。

[0109]此外，抑制组织因子信号转导的抗体组合物和组合物(包括片段和特异性表位)可与免疫球蛋白(IgG)恒定区的部分相结合以得到嵌合多肽。这些融合蛋白可促进纯化并在体内显示更长的半衰期。一项报道描述了由人CD4-多肽的两个区和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链恒定区的不同区域组成的嵌合蛋白。EPA394,827；Traunecker等人，Nature，331：84-86，1988。具有二硫键连接的二聚体结构(属于IgG)的融合蛋白在结合和中和其它分子时也可比单独的单体分泌的多肽或蛋白片段更具效率。Fountoulakis等人，J.Biochem.270：3958-3964，1995。

[0110]类似地，EP-A-O 464 533(加拿大对应2045869)披露了包含免疫球蛋白分子恒定区各部分和其它人源蛋白或其部分的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分可用于治疗和诊断，并因此可以改善药代动力学属性。(EP-A 0 232 262.)备选地，需要在融合蛋白表达，检测和纯化后去除Fc部分。例如，当融合蛋白用作免疫抗原时该Fc可能妨碍治疗和诊断。例如，在药物开发中，人源蛋白如hIL-5被融合至Fc部分以进行鉴定hIL5拮抗剂的高通量筛选测定。Bennett等人.，J.MolecularRecognition 8：52-58，1995；K.Johanson等人.，J.Biol.Chem.，270：9459-9471 1995。

[0111]此外，该多肽可融合至标记序列，例如促进融合多肽纯化的肽。在优选实施例中，该标记氨基酸序列为一种六组氨酸肽，例如pQE载体所提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，其中多数已上市销售。如Gentz等人.，Proc.Natl.Acad.Sci USA86：821821，1989所述，例如，用于融和蛋白快速纯化的六组氨酸。另一可用于纯化的标签，“HA”标签，对应来自于流感血凝素蛋白的表位。Wilson等人.，Cell 37：767，1984。

[0112]因此，可采用本发明的多聚核苷酸或多肽进行任何上述融合。

SCFV噬菌体库

[0113]在哺乳动物对象中抑制组织因子信号转导且不干扰哺乳动物对象止血的scFv抗体库可用于治疗血管生成，新生物疾病或炎症疾病。使用噬菌体展示库鉴定特异性结合并抑制信号转导组织因子但不增加出血风险的抗体组合物的方法之一为采用scFv噬菌体库(例如，参见Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，85：5879-5883，1988；Chaudhary等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070，1990)。各种在噬菌体外壳蛋白上展示scFv库的实施例已得到描述。同样已知改善的噬菌体展示方法，例如参见WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)以及WO97/08320(Morphosys)，在此引用作为参考。同样已知Fab库的展示，例如参见WO92/01047(CAT/MRC)和WO91/17271(Affymax)。

[0114]由于抗体或抗体片段将展示在噬菌体或噬菌粒表面上，可选择克隆进展示载体中的能通过抑制组织因子信号转导治疗新生物疾病或炎症疾病的杂交抗体或杂交抗体片段以鉴定保留了良好结合活性的变体。例如，参见，Barbas III，等人，Phage Display，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001，其内容在此引用作为参考。例如，对于Fab片段，轻链和重链Fd产物受lac启动子控制，且各链均带有与之融合的前导信号以导入细菌宿主的周质空间。在该空间中该抗体片段能够正确组装。该重链片段与噬菌体外壳蛋白区融合表达，从而使该组装的抗体片段整合进入新生成的噬菌体或噬菌粒外壳中。新噬菌粒的生成要求添加包含了所有必需噬菌体基因的辅助噬菌体。当抗体片段库展示在噬菌体或噬菌粒表面后，可进行名为淘选的过程。在该方法中i)该展示在噬菌体或噬菌粒表面的抗体与目标抗原结合，ii)未结合的抗体被洗去，iii)结合颗粒从抗原洗脱，并且iv)洗脱颗粒被暴露至新鲜培养基宿主以扩增富集物以进行另一轮选择。通常在筛选能特异性结合的抗体克隆之前需要进行三到四轮淘选。噬菌体/噬菌粒从而可支持结合表型(抗体)与基因型(DNA)的连接，使得抗体展示技术的应用非常成功。然而，还可采用其它的载体形式进行人源化过程，例如将该抗体片段库克隆进入溶解噬菌体载体(修饰后T7或Lambda Zap系统)以进行选择和/或筛选。

[0115]选择目标杂交抗体和/或杂交抗体片段之后，可通过本领域技术人员已知的任何技术(例如，原核或真核细胞表达等)进行大量生产。例如，杂交抗体或片段可通过常规技术进行生产以构建表达载体，其构建的表达载体编码一种抗体重链(其中保留起源物种抗体结合特异性所需的CDRs以及必要时的可变区框架的最小部分(参照此处所述的技术进行工程改造)均来自于起源物种抗体)，而抗体的剩余部分来自于目标物种免疫球蛋白(可按照此处描述进行操作)，从而生成了表达杂交抗体重链的载体。

[0116]在一个具体的实施方式中，单链Fv(scFv)抗体库可从患有各种癌症疾病的5，10，15或20位或者更多位患者的外周血淋巴细胞进行制备。然后可用合成的sialyl Lewis^x和Lewis^x BSA结合物选择完整的人源高亲和性scFv抗体。在一项研究中，这些人源scFv抗体对sialyl Lewis^x和Lewis^x具有特异性，这可通过ELISA，BIAcore以及流式细胞仪与胰腺癌细胞的细胞表面的结合得到证明。核苷酸序列显示得到了至少四个独特的scFv基因。在1.1至6.2 x 10^-7M的K_d值与来自二次免疫应答的mAbs的亲和性相当。这些抗体可作为探测糖抗原的结构和功能以及在人肿瘤疾病治疗中的有用试剂。Mao，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：6953-6958，1999。

[0117]在一个更具体的实施方式中，噬菌体展示联合抗体库可用于生成和选择各种针对适当抗原的抗体，例如，可用于治疗新生物疾病或炎症疾病的抑制组织因子信号转导的抗体。噬菌体外壳蛋白pVII和pIX可用于展示抗体Fv区的异源二聚体结构。该技术曾被延伸至构建具有4.5 x10⁹个展示在丝状噬菌体pIX上的成员的大型人源单链Fv(scFv)库。此外，该库的多样性，品质和实用性可通过选择针对六种不同蛋白抗原的scFv得到证明。特别地，超过90％的选定克隆仅在三轮淘选之后便显示出对其相应抗原的阳性结合。经分析还发现scFvs具有高亲和性。例如，动力学分析(BIAcore)揭示针对葡萄球菌肠毒素B和霍乱毒素B亚基的scFvs分别具有纳摩尔级和次纳摩尔级的解离常数，提供了与从免疫获得的mAbs相当或更高的亲和性。高亲和性不仅可在截然不同的蛋白之间取得，也可在更紧密相关的蛋白(例如，蓖麻(“蓖麻毒素”)凝集素(RCA₆₀和RCA₁₂₀))中获得，尽管两者的序列同源性>80％。这些结果暗示pIX-展示库的性能可以潜在超越pIII-展示形式并使其适于淘选多种目标抗原。Gao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：12612-12616，2001。

[0118]抗体或其它结合剂和抗原之间的特异性结合指至少为10^-6M的结合亲和性。优选的结合剂以至少约10^-7M，并优选以10^-8M至10^-9M，10^-10M，10^-11M或10^-12M的亲和性相结合。术语表位指能够特异性结合抗体的抗原决定簇。表位通常由氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成并通常具有特定的三维结构特性，以及特定的带电特性。构型和非构型表位的区别在于与前者的结合在变形溶剂的存在下将缺失，而后者不会。

检测组织因子信号转导及其调节剂的免疫结合测定

[0119]本发明提供了检测组织因子信号转导以及鉴定组织因子信号转导调节剂的方法。如下文更为具体的描述，一些方法涉及在基于细胞的测定系统中鉴定组织因子信号转导的调节剂。一些其它方法涉及在无细胞系统中鉴定组织因子信号转导的调节剂。在一些实施方式中，可对测试化合物进行筛选以鉴定抑制或阻抑TF/VIIa介导的信号转导活性但不干扰体内止血的组织因子调节剂。该种调节剂(例如，小分子有机化合物调节剂)可通过采用具有所需属性(例如，MAb 10H10)的已知化合物，通过此处所述的竞争性测定形式进行鉴定。因此，本发明的一些筛选方法涉及抑制TF/VIIa信号转导但不阻断凝血的化合物鉴定。这些方法要求在测试化合物存在或缺失的情况下检测(i)具有MAb 10H10的结合特异性的抗体或抗原结合分子和(ii)组织因子多肽之间的结合，然后检测当测试化合物存在时相对测试化合物缺失时对结合的抑制。一些方法采用了由ATCC编号HB9383的杂交瘤生产的鼠MAb 10H10。一些筛选方法采用的化合物优选小分子有机化合物，例如，分子量不超过约5000，更优选不超过约2500，1000或500的化合物。

[0120]此处所述的任意技术和测定形式可用于实践该种方法。除了检测它们与MAb 10H10竞争结合组织因子的能力之外，还可进一步检测调节组织因子信号转导的活性(例如，抑制TF/VIIa信号转导活性同时不影响止血)。可对该化合物在此处所述的TF/VIIa介导的任意信号转导活性(例如，MAP激酶磷酸化或复合物形成以及通过蛋白酶激活受体2进行的信号转导)的抑制活性进行测试。检测TF/VIIa介导的信号转导活性的测定已为本领域熟知。如下文实施例8所示范，TF/VIIa介导的信号转导活性可通过MAP激酶磷酸化测定(例如，在以VIIa和X因子刺激的HUVEC细胞或CHO细胞中一种MAP激酶(例如，ERK激酶)的磷酸化水平的western印迹分析)进行定量检测。这些测定可用于此处所述的鉴定新型TF信号转导调节化合物(例如，抑制剂)的筛选方法。它们还可以用于在本发明的治疗方法中监测所用TF信号转导抑制剂的作用。当一种化合物可以相对该化合物缺失时的TF信号转导抑制至少50％，至少75％，至少90％，或至少95％的TF信号转导时，该化合物可被认为是TF信号转导抑制剂。该种定量抑制可通过本领域公知(例如，Blood105：2384-91，2005)或此处所述(例如，在下文实施例8所述的条件下在6日的周期内于HUVEC细胞中ERK磷酸化水平的下降)的任意TF信号转导测定进行检测。

[0121]通过本领域已知或在此处所述的任意测定，该来自于筛选方法的鉴定化合物(或本发明的治疗方法中所用的抑制剂)可通过进一步检测以确定它们对组织因子介导的止血活性(例如，凝血)没有明显的影响。例如，如下文实施例所证明，TF介导的凝血活性可通过对HaCaT细胞中的Xa因子生成的定量进行检测。这些测定可用于检查本发明的筛选方法中所用的测试化合物或是本发明的治疗方法中所用的抑制剂化合物。当一种化合物的存在相比该化合物缺失的情况不会导致超过5％，超过10％，超过15％，或超过25％的止血活性(例如，通过下文描述的条件下的Xa生成测定所检测到的凝血活性)下降，则该化合物不干扰或防止(即，不明显影响)TF介导的止血(例如，凝血)。在一些实施方式中，化合物对凝血的潜在阻断活性可通过测定该化合物对组织因子与已知阻断组织因子介导的凝血的抗体之间结合的作用测定进行检测。该种抗体之一是ATCC编号为HB9382的杂交瘤生产的单克隆抗体5G9。该抗体对凝血的抑制活性以及相应测定详细披露于美国专利5,223,427。化合物对MAb5G5与组织因子的结合没有明显作用(例如，下降至少20％，30％，40％，50％，75％或更多)表明该化合物可能不阻断组织因子介导的凝血。

[0122]组织因子信号转导还可通过一系列被广泛接受的免疫结合测定中的任何一种进行检测和/或定量(例如，参见美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288以及4,837,168)。可用于免疫结合测定的抗体可作为不干扰哺乳动物对象中的止血的组织因子信号转导抑制剂。免疫结合测定采用依赖于在哺乳动物对象中改变组织因子/VIIa因子信号转导的疾病诊断或治疗中的抗体。例如，MAb 10H10是一种可作为不干扰哺乳动物对象中的止血的组织因子信号转导抑制剂的抗体并可用于本发明的实施例中的免疫结合测定。关于常规免疫测定的综述，还可参见Methods inCell Biology：Antibodies in Cell Biology，volume 37(Asai，ed.1993)；Basicand Clinical Immunology(Stites & Terr，eds.，7th ed.1991)。免疫学结合测定(或免疫测定)通常采用一种能专一地与目标蛋白或抗原(在本发明中为组织因子或其抗原性子序列)结合的抗体。该抗体(例如，抗组织因子)可采用如上所述的本领域技术人员所熟知的一系列方法中的任意一种进行制备。

[0123]免疫测定中经常采用一种标记试剂特异性结合并标记抗体和抗原形成的复合物。标记试剂本身可以是组成抗体/抗原复合物的一部分。因此，该标记试剂可以是标记的组织因子。另外，该标记试剂可以是一种与该抗体/组织因子复合物特异性结合的第三部分，例如二级抗体(二级抗体通常对获得该第一抗体的物种的抗体具有特异性)。其它能够专一性地结合免疫球蛋白恒定区的蛋白，如蛋白A或蛋白G也可以用作标记试剂。这些蛋白显示了对来自各种物种的免疫球蛋白恒定区的强烈非免疫原性反应性(例如，参见，Kronval等人.，J.Immunol.111：1401-1406，1973；Akerstrom等人，J.Immunol.135：2589-2542，1985)。标记试剂可使用一种可检测成分(如生物素)进行修饰，该基团可被链霉亲和素等分子特异性结合。各种可检测成分已为本领域技术人员所熟知。

[0124]在整个测定过程中，每一次试剂合并后均可能要求采取孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可持续5秒钟到几小时不等，可选择约5分钟至约24小时。然而，孵育的时间将取决于测定的形式，抗原，溶液体积，浓度等因素。尽管测定可在一定温度范围下进行(如10℃至40℃)，其通常在室温下进行。

[0125]非竞争性测定形式：检测样本中的组织因子信号转导的免疫测定可以为竞争性或非竞争性。非竞争性免疫测定是一种直接检测抗原数量的测定。例如，如果人们选择“三明治”测定，抗组织因子抗体可直接结合至固相底物上进行固定化。然后这些固定化抗体可以捕捉测试样本中存在的组织因子。然后将由此固定化的组织因子与标记试剂(例如针对组织因子的带标记的二级抗体)结合。此外，二级抗体可缺失标记，但可被标记的三级抗体结合，该三级抗体是特异性地针对可衍生得到二级抗体的物种的抗体。该二级或三级抗体通常可使用一种可检测部分(如生物素)进行修饰，该成分可被链霉亲和素等分子特异性结合以提供可检测部分。

[0126]竞争性测定形式：在竞争性测定中，样本中组织因子信号转导的数量可通过检测抗组织因子抗体上被样本中未知组织因子替换(竞争走)的已知的，添加的(外源性)组织因子数量进行间接检测。在一个竞争性测定中，已知数量的组织因子被添加入样本，然后该样本与特异性结合组织因子的抗体进行接触。与该抗体结合的外源性组织因子数量与样本中存在的组织因子的浓度成反比。在一个特定优选实施方式中，该抗体被固定在固相底物上。与该抗体结合的组织因子的数量可通过测定组织因子/抗体复合物的数量，或通过测定残留的未复合蛋白的数量进行检测。组织因子的数量可通过提供标记的组织因子分子进行检测。

[0127]半抗原抑制测定是另一种优选的竞争性测定。在该测定中已知组织因子被固定在固相底物上。将已知数量的抗组织因子抗体添加入样本，然后将样本与固定化组织因子接触。与已知固定化组织因子结合的抗组织因子抗体数量与样本中存在的组织因子数量成反比。此外，固定化抗体的数量还可通过检测抗体的固定化部分或是其残留在溶液中的部分进行测定。该检测可在抗体被标记时直接进行，也可按上文所述通过后续添加能与抗体特异性结合的标记成分间接进行。

[0128]交叉反应性测定：竞争性结合形式的免疫测定也可用于交叉反应性测定。例如，可将组织因子固定至固相底物。将与抗血清竞争结合固定化抗原的蛋白(例如，组织因子及类似物)添加至测定。添加的蛋白与抗血清竞争结合固定化抗原的蛋白能力被用来与组织因子与其自身的竞争能力进行比较。采用标准算法计算上述蛋白的交叉反应性百分比。选择并汇集对上述列举的每一种添加蛋白的交叉反应性小于10％的抗血清。使用添加的经考虑的蛋白(如远缘同源物)进行免疫吸附，选择性地从汇集的抗血清中去除交叉反应抗体。

[0129]将该免疫吸附并汇集的抗血清用于如上所述的竞争性结合免疫测定中，从而将被认为可能是组织因子的等位基因或多形态变体的第二蛋白与免疫原蛋白进行比较。为了进行该比较，两种蛋白在测定中均采用了较大的浓度范围，并对各蛋白抑制抗血清和固定化蛋白50％的结合时所需的浓度进行了测定。如果抑制50％的结合所需的第二蛋白数量小于抑制50％的结合所需的组织因子数量的10倍，则该认为该第二蛋白与组织因子免疫原的多克隆抗体特异性结合。

[0130]其它测定形式：Western印迹(免疫印迹)分析可用于对样本中存在的组织因子进行检测和定量。该技术通常包括通过凝胶电泳根据分子量分离样本蛋白，将分离蛋白转入合适的固相支持物(如硝化纤维过滤器，尼龙过滤器或衍生尼龙过滤器)，然后将样本与能够特异性结合组织因子的抗体进行孵育。抗组织因子抗体在固相支持物上特异性结合组织因子。这些抗体可进行直接标记，或采用能够特异性结合抗组织因子抗体的标记抗体(例如标记羊抗小鼠抗体)进行后续检测。

[0131]其它测试形式包括脂质体免疫测定(LIA)，该测试采用设计的脂质体与特定分子(如抗体)结合并释放被封装的试剂或标记。然后参照标准技术测定释放的化合物(参见Monroe等人，Amer.Clin.Prod.Rev.5：34-41，1986)。

[0132]非特异性结合的减少：本领域的技术人员均可理解在免疫测定中经常需要使非特异性结合最小化。特别当测定包含了固定在固相底物上的抗原或抗体时，需要最小化对底物的非特异性结合的数量。减少该种非特异性结合的方法已为本领域技术人员所熟知。通常该技术包括采用类似蛋白质的组合物对底物进行包覆。蛋白组合物如牛血清白蛋白(BSA)，脱脂奶粉以及白明胶得到了特别广泛的应用，其中特别优选奶粉。

[0133]标记：只要不通过与本测定中所用的抗体特异性结合形成明显的干扰，本测定所用的特定标记或可检测基团不构成本发明的重要方面。可检测基团可以是任何具有可检测物理或化学属性的材料。这类可检测标记在免疫测定领域已得到了很好的发展，并且一般来说大部分可在该方法中使用的标记都可用于本发明。因此，标记是指任何可通过分光的，光化学的，生物化学的，免疫化学的，电子的，光学的或是化学的手段进行测定的组成。可用于本发明的标记包括磁珠(如DYNABEADS^TM)，荧光染料(如异硫氰酸萤光素，德州红，若丹明等)，放射性标记(例如³H，¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C或³²P)，酶(例如辣根过氧化酶，碱性磷酸酶以及其它ELISA中常用的酶)，化学发光标记，以及比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯，聚丙烯，乳胶等)。

[0134]该标记可参照本领域所熟知的方法直接或间接地偶合至测定中所需的成分。如上文所示，可供采用的标记种类繁多，而标记的选择取决于所需的灵敏度，与化合物结合的容易程度，所需的稳定性，现有的仪器以及处理的规定。

[0135]非放射性的标记常通过间接的方法进行附着。通常配体分子(如生物素)与该分子间为共价结合。然后将配体结合至另一分子(如链霉亲和素分子)，该分子既可以是天然可检测的，也可以共价结合至一个信号系统，例如一种可检测的酶，荧光化合物或化学发光化合物。该配体及其靶标可用于与能够识别组织因子的抗体，或是能够识别抗组织因子的第二抗体进行适当的组合。

[0136]该分子也可与信号生成化合物直接结合，例如与酶或荧光团进行结合。作为标记的目标酶主要为水解酶，特别是磷酸酶，酯酶和糖苷酶，或是氧化酶，特别是过氧化酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮等。化学发光化合物包括虫荧光素以及2，3-二氢酞嗪二酮，例如发光氨。对各种可供采用的标记或信号生成系统的综述参见U.S.Patent No.4,391,904。

[0137]检测标记的方法已为本领域技术人员所熟知。因此，例如当该标记为一种放射性标记时，检测的方法包括闪烁计数器或自动射线摄影的摄影软片。当该标记是一种荧光标记时，可通过适当波长的光激发荧光团并检测所得荧光以完成检测。该荧光可通过使用电荷耦合器件(CCDs)等电子检测器或是光电倍增器等类似仪器进行直观检测。类似地，酶标记的检测可通过提供合适的该酶的底物后检测所得的反应产物。最后简单的比色标记可以简单地通过观察与标记关联的色彩进行检测。因此，在各种试纸测定中，共轭金常显粉红色，而各种共轭珠则显示珠子的颜色。

[0138]一些测定形式不要求使用标记的成分。例如，凝集测定可用于检测目标抗体的存在。在该测定中，包覆了抗原的颗粒被包含了目标抗体的样本所凝集。在该形式中，所有的成分均无需标记，目标抗体的存在可通过简单的视觉观察进行检测。

小分子化学组合物

[0139]“小分子”或“小化学实体”包括任何可作用于生物过程的化学或其它部分，其中该小化学实体可作为不干扰哺乳动物对象止血的组织因子信号转导抑制剂，其可用于在哺乳动物对象中治疗或诊断疾病。小分子可包括任何数量的目前已知并已使用的治疗剂，或者可以是为筛选生物功能在该类分子库中合成的小分子。小分子与大分子的区别在于大小。本发明的小分子的分子量通常小于约5000道尔顿(Da)，优选小于约2500Da，更优选小于1000Da，最优选小于约500Da。在本项用于治疗依赖于组织因子/VIIa因子信号转导的疾病的方法中，该小分子有机化合物，肽类似物，或抗体类似物可以是抗体抑制剂MAb 10H10的类似物。

[0140]小分子包括但不限于有机化合物，肽类似物，抗体类似物，及其合成物。此处所用的术语“有机化合物”或“小化学实体”指除大分子以外的任何基于碳的化合物如核酸和多肽。除碳外，有机化合物可包含钙，氯，氟，铜，氢，铁，钾，氮，氧，硫以及其它元素。有机化合物可以呈芳香族或脂肪族形式。有机化合物的非限制性范例包括丙酮，醇，苯胺，糖，单糖，寡糖，多糖，氨基酸，核苷，核苷酸，脂质，维甲酸，类固醇，蛋白聚糖，酮，醛，饱和，不饱和以及多饱和脂肪，油及蜡，烯烃，酯，醚，硫醇，硫化物，环状化合物，杂环化合物，咪唑和苯酚。此处所用的有机化合物还包括硝化有机化合物和卤化(例如，氯化)有机化合物。制备肽类似物的方法如下所述。小分子集合，以及参照本发明鉴定的小分子可通过加速器质谱(AMS；参见Turteltaub等人，Curr Pharm Des6(10)：991-1007，2000，Bioanalytical applications of accelerator massspectrometry for pharmaceutical research；and Enjalbal等人，Mass SpectromRev19(3)：139-61，2000，Mass spectrometry in combinatorial chemistry)等技术加以表征。

[0141]优选可通过更简便和低价的方式生产，配制或以其它方式制备的小分子或小化学实体。优选在各种贮存条件下保持稳定的小分子。优选可与大分子紧密联合形成具有活性并具有改善的药物性能的分子的小分子。改善的药物性能包括在循环时间，分布，代谢，修饰，排泄，分泌，消除和稳定性上的变化有利于目标生物活性。改善的药物性能包括化学实体在毒理学和疗效特征上的变化。

对组织因子信号转导调节剂的高通量测定

[0142]如上所述，本发明提供了不干扰止血的组织因子信号转导调节剂(例如，抑制剂或激活剂)的鉴定方法(例如，在哺乳动物对象中)。用于该方法的测试化合物可以是任意的小有机分子，或生物实体，如蛋白(例如抗体或肽)，糖，小化学分子，核酸(例如反义寡核苷酸，RNAi)或核酶，或脂质。另外，调节剂可以是基因修饰后的组织因子。测试化合物通常是小有机分子，肽，抗体，脂质或脂质类似物。

[0143]尽管多数情况下会使用能够溶解于水溶液或有机(特别是基于DMSO的)溶液的化合物，本质上任何化学化合物都可用作本发明的测定中的潜在调节剂或配体。该测定可通过使测定步骤自动化并从将任何来源方便的化合物提供至测定以筛选大型化学库，该测定通常平行进行(例如，在机器人测定中的微量滴定板上通过微量滴定形式)。应当意识到化合物的供应商为数众多，其中包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，Fluka Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs Switzerland)等等。

[0144]在一个优选实施方式中，高通量筛选法包括提供一种包含了大量潜在治疗性化合物(潜在调节剂或配体化合物)的小有机分子或肽库。然后参照此处所述在一个或多个测定中筛选该“组合化学库”或“配体库”以鉴别显示所需特征活性的库成员(特别是化学物种或亚类)。由此鉴定的化合物可用作传统的“先导化合物”或其自身可用作潜在或实际的治疗剂。

[0145]组合化学库是通过合并一定量的“化学砌块”如试剂所获取的通过化学合成或是生物合成得到的各类化合物的集合。例如，一个线性组合化学库如多肽库可通过以各种可能的途径在给定的化合物长度(即在一个多肽化合物中氨基酸的数量)下组合一批化合物砌块(氨基酸)形成。通过该种化学砌块的组合混合可以合成得到成千上万的化合物。

[0146]组合化学文库的制备和筛选已为本领域技术人员所熟知。该组合化学文库包括，但不限于，肽文库(例如，参见美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-493，1991以及Houghton等人，Nature 354：84-88，1991)。也可采用其它能够产生化学多样库的化学物质。该种化学物质包括，但不限于，类肽(例如PCT公布WO 91/19735)，编码肽类(例如PCT公布WO 93/20242)，任意生物低聚体(例如PCT公布WO92/00091)，苯并二氮类(例如美国专利5,288,514)，乙内酰脲类，苯并二氮类以及二肽类等diversomers(Hobbs等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA90：6909-6913，1993)，vinylogous多肽(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.114：6568，1992)，带有葡萄糖支架的非肽类肽类似物(Hirschmann等人.，J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218，1992)，小化合物库的有机合成类似物(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.116：2661，1994)，低聚氨基甲酸酯(Cho等人，Sciencs 261：1303，1993)，和/或肽基磷酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.59：658，1994)，核酸库(均参见上文Ausubel，Berger和Sambrook)，肽核酸库(例如，参见美国专利5,539,083)，抗体库(例如，参见Vaughn等人，Nature Biotechnology，14：309-314，1996以及PCT/US96/10287)，糖库(例如，参见Liang等人，Science 274：1520-1522，1996以及美国专利5,593,853)，小有机分子库(例如，参见苯(并)二氮类Baum C&EN，Jan 18，page 33(1993)；异戊烯类，美国专利5,569,588；噻唑啉酮类及间噻嗪酮类，美国专利5,549,974；吡咯烷类美国专利5,525,735以及5,519,134；吗啉化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮类5,288,514等等)。

[0147]用于制备组合库的仪器已在市场上销售(例如，参见357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，许多组合库本身也已经进入市场(例如，参见ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，MartekBiosciences，Columbia，MD等)。

[0148]候选化合物可用作治疗新生物疾病或炎症疾病的药物的鉴定策略的一部分，其中该化合物抑制组织因子信号转导且不提高出血的风险。与信号转导组织因子结合的测试化合物被认为是候选化合物。

[0149]本发明中还包括了鉴定能与组织因子结合，或能调节组织因子蛋白或多肽或其生物活性部分的活性的候选或测试化合物的筛选测定。测试化合物的获取可采用本领域已知多种组合库方法中的任意一种，其包括但不限于，生物库；空间可寻址并行固相或液相库；要求重叠合法的合成库法；“一珠一化合物”库法；以及采用亲和层析选择的合成库法。生物库法可用于肽库等，而其它四种方法适用于化合物的肽，非肽低聚物或小分子库(Lam，Anticancer Drug Des.12：145，1997)。合成分子库的方法范例可在本领域发现，例如：De Witt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909，1993；Erb等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 91：11422，1994；Zuckermann等人，J.Med.Chem.37：2678，1994；Cho等人.，Science 261：1303，1993；Carrell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059，1994；Carell等人.，Angew.Chem.Int.Ed Engl.33：2061，1994；以及Gallop等人.，J.Med.Chem.37：1233，1994。在一些实施方式中，该测试化合物为组织因子的激活变体。

[0150]化合物库可存在于溶液中(例如Houghten，Bio/Techniques 13：412-421，1992)，或是在珠上(Lam，Nature 354：82-84，1991)，芯片上(Fodor，Nature 364：555-556，1993)，细菌中(美国专利5,223,409)，孢子中(美国专利5,571,698，5,403,484，以及5,223,409)，质粒中(Cull等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869，1992)或在噬菌体上(Scott等人，Science 249：386-390，1990；Devlin，Science 249：404-406，1990；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382，1990；以及Felici，J.Mol Biol.222：301-310，1991)。

[0151]测试化合物抑制组织因子或其生物活性部分信号转导活性的能力可进行测定，例如，可通过监测在测试化合物存在时在凝血活性缺失时对组织因子信号转导的抑制。组织因子或其生物活性部分活性的调节可通过测定凝血活性缺失时的组织因子信号转导进行检测。测试化合物调节组织因子信号转导，或其生物活性部分的能力还可通过监测组织因子与蛋白二硫键异构酶的结合能力进行检测。该结合测定可以基于细胞或在无细胞状态下进行。

[0152]化合物通过抑制组织因子信号转导治疗新生物疾病或炎症疾病同时不提高出血风险的能力可通过此处所述或本领域已知的检测直接结合的方法之一进行检测。在一个实施方式中，化合物在不提高出血风险的情况下抑制组织因子信号转导的能力可通过监测角化细胞或内皮细胞中的组织因子信号转导进行测定。组织因子信号转导的检测可包括对同时编码FLAG序列或荧光素酶等可检测标记的重组组织因子的表达的检测。该测定可附加于直接结合的测定。一般而言，该种测定可用于检测测试化合物抑制组织因子信号转导的能力。

[0153]一般而言，测试化合物结合组织因子，干扰组织因子信号转导的能力可与该测试化合物缺失时检测结合的对照相比较。在一些情况下会采用预定参考值。该参考值可相对对照进行确定，其中一种与参考不同的测试样本将表明化合物结合目标分子(例如，组织因子)或调节蛋白二硫键异构酶存在下组织因子依赖性PAR2信号转导。参考值还能反应通过标准观察到的结合数量(例如，抗体对信号转导组织因子的亲和性)。在这一情况下，测试化合物与参考类似(例如，等于或少于)时将显示该化合物是一种候选化合物(例如，与信号转导组织因子结合的程度等于或大于参考抗体)。

[0154]本发明进一步涉及通过上述筛选测定鉴别得到的新型试剂及其在此处所述的治疗中的用途。

[0155]本发明的一个实施方式提供了采用天然存在或重组的组织因子，或表达组织因子的细胞或组织进行的可溶性测定。在另一实施方式中，本发明提供了高通量形式的基于固相的体外测定，其中组织因子，具有模拟细胞信号转导汇集物的适当修饰构型的组织因子或其配体通过共价或非共价相互作用连接至固相底物。此处所述的任一种测定均可用于高通量筛选。

[0156]在本发明的高通量测定中，不管是可溶性还是固相测定均有可能在一天内筛选数千种不同的调节剂或配体。该方法可用于体外的组织因子蛋白测定，或包含组织因子基因产物或组织因子蛋白的基于细胞或基于膜的测定。特别地，微量滴定板上的每一个孔均可用于对所选潜在调节剂进行一次独立的测定，或在对浓度或孵育时间作用进行观察时，每5-10个孔可测试一个单独的调节剂。因此，一个单独的标准微量滴定板可以测定约100(例如96)个调节剂。如果采用一块1536孔板，则一块单独的板便可简单测定约100至约1500个不同的化合物。一天内可进行多块板的测定；采用本发明的集成系统每天可以进行约6,000，20,000，50,000或超过100,000个不同化合物的测定筛选。

[0157]在固相反应中，目标蛋白或其片段(例如胞外区)，或包含了作为融和蛋白一部分的目标蛋白或其片段的细胞或膜可直接或间接地通过共价或非共价连接(例如，通过标签)结合至固相组分。该标签可以是任意种类的组分。总体而言，先将一种可与标签结合的分子(标签结合剂)固定至固相支持物，然后将带标签的目标分子通过标签与标签结合剂的相互作用附着在固相支持物上。

[0158]根据文献中对已知分子间反应的详细描述，有多种标签和标签结合剂可供使用。例如，当一种标签具有天然的结合剂(如生物素，蛋白A或蛋白G)时，它可被用于与适当的标签结合剂(抗生物素蛋白，链霉亲和素，中和亲和素，免疫球蛋白的Fc区等)进行结合。对带有自然结合剂(如生物素)的分子的抗体也广泛存在并且是适当的标签结合剂(参见SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA，St.Louis MO)。

[0159]类似的，任何半抗原或是抗原的化合物均可用于与适当的抗体结合形成标签/标签结合剂对。目前市场上已经有数千种特异性抗体，在文献中还描述了许多其它的抗体。例如，在一个常规构型中，标签为一级抗体而标签结合剂是识别一级抗体的二级抗体。除了抗体抗原反应外，受体配体反应也可作为适当的标签和标签结合剂对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如，细胞受体-配体反应如toll样受体，铁传递蛋白，c-kit，病毒受体配体，细胞因子受体，趋化因子受体，白介素受体，免疫球蛋白受体以及抗体，钙粘附素家族，整合素家族，选择素家族等等；例如，参见Pigott和Power，The Adhesion Molecule Facts Book I，1993。类似地，毒素和毒液，病毒表位，激素(如阿片类药物，类固醇等)，胞内受体(例如可介导各类小配体作用的受体，包括类固醇，甲状腺激素，维甲酸以及维生素D；肽)，药物，外源凝集素，糖，核酸(线性和环状聚合物构型)，低聚糖，蛋白，磷酯以及抗体均可与各种细胞受体相互作用。)

[0160]合成聚合物，如聚氨酯，聚酯，聚碳酸酯，聚脲，聚酰胺，聚乙烯亚胺，聚芳硫醚，聚硅醚，聚酰亚胺以及聚乙酸酯均能够形成适当的标签和标签结合剂。如本领域技术人员在阅读本披露的基础上所能理解，许多其它的标签/标签结合剂对也可用于此处所述的测定系统。

[0161]常见的接头如肽，聚醚等也可用作标签，其中还包括多肽序列，如5至200氨基酸之间的聚甘氨酸序列。该种柔性接头已为本领域技术人员所公知。例如，聚乙二醇接头可从Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama获得。这些接头可选择具有酰胺键合，巯基键合和异功能键合。

[0162]标签结合剂可通过各种现有方法中的任意一种固定至固相底物。固相底物通常可通过将全部或部分底物暴露至一种化学试剂进行衍生化或功能化，其中该试剂将能够与标签结合剂中一部分产生反应的化学基团固定至表面。例如，适于连接更长链部分的基团包括胺，羟基，硫醇以及羧基基团。氨基烷基硅烷和羟基烷基硅烷可被用于对多种表面(如玻璃表面)进行功能化。该种固相生物聚合物阵列已在文献中得到具体描述。例如，参见Merrifield，J Am.Chem.Soc.85：2149-2154，1963(描述肽等固相合成)；Geysen等人，J.Immun.Meth.102：259-274，1987(描述在针上的固相成分合成)；Frank和Doring，Tetrahedron 44：6031-6040，1988(描述在纤维素板上各种肽序列的合成)；Fodor等人，Science 251：767-777，1991；Sheldon等人，Clinical Chemistry 39：718-719，1993；以及Kozal等人，Nature Medicine 2：753-759，1996(均描述固定至固相底物的生物聚合物的阵列)。将标签结合剂固定至底物的非化学方法包括其它常用的方法，如加热，通过UV辐射交联等。

作为组织因子信号转导调节剂的双特异性化合物

[0163]一方面，本发明提供了一种鉴定候选物或测试双特异性化合物的方法，通过该方法可降低一种物质在非人类动物体内的血清和/或循环中的浓度。采用该快速方法选择或优化的化合物可被用于治疗能通过给服该种化合物受益的对象，例如人类对象。

[0164]可在本发明中该方法的实施方式中进行测试的候选化合物为双特异性化合物。如此处所用，术语“双特异性化合物”包括了具有两种不同的结合特异性的化合物。示范性的双特异性化合物包括，例如，双特异性抗体，杂聚物以及基于抗原的杂聚物。

[0165]可在本发明的实施方式中进行测试的双特异性分子优选包含对组织因子，蛋白二硫键异构酶，或PAR2，优选人组织因子，蛋白二硫键异构酶，或PAR2特异的结合部分，其交联至对目标药剂(例如一种独特的抗体或抗原)具有特异性的第二结合部分。对组织因子具有特异性的结合部分的范例包括，但不限于，组织因子配体，例如，在优选的实施方式中，针对组织因子信号转导的抗体。该抗体可以是哺乳动物对象中的组织因子信号转导抑制剂，其中该抑制剂不干扰哺乳动物对象中的止血。

[0166]在另一实施方式中，新型组织因子结合分子可通过其结合组织因子并抑制组织因子信号转导的能力进行鉴定。例如，化合物或小分子库可通过无细胞结合测定进行测试。任意数量的测试化合物(例如，肽类似物，小分子或其它药物)均可用于进行测试且测试化合物的获取可采用本领域已知多种组合库方法中的任意一种，其包括：生物库；空间可寻址并行固相或液相库；要求重叠合法的合成库法；“一珠一化合物”库法；以及采用亲和层析选择的合成库法。生物库法局限于肽库，而其它四种方法适用于化合物的肽，非肽低聚物或小分子库化合物(Lam，AnticancerDrug Des.12：145，1997)。

[0167]在许多对调节剂和天然提取物库进行测试的药物筛选程序中均要求使用高通量测定，从而使给定时间范围内所考察的调节剂数量达到最大化。在无细胞系统中进行的测定(如通过纯化或半纯化蛋白)常被选为初级筛选，通过该筛选可对由测试调节剂介导的目标分子的改变进行快速开发和相对简便的检测。此外，测试调节剂在体外系统中的细胞毒性和/或生物相容性的作用通常可被忽略，从而使测定可以主要聚焦于药物对分子目标的作用，如上游或下游原件对结合亲和性的改变所显示。

[0168]在另一实施方式中，本领域公知的噬菌体展示技术可被用于鉴定新型组织因子结合分子。在一个实施方式中，本发明提供了筛选能够结合组织因子或其生物活性部分的候选物或测试化合物的测定。可鉴定能够结合组织因子的分子的基于细胞的测定可被用于鉴定作为本发明中双特异性化合物的其它试剂。例如，表达组织因子的细胞可在筛选测定中采用。例如，可以鉴定能够对组织因子的结合产生统计性显著差异的化合物。

[0169]在一个实施方式中，该测定是一种无细胞测定，其中组织因子结合分子的鉴定基于其在体外结合组织因子的能力。该组织因子蛋白结合分子可被提供，且该蛋白对信号转导组织因子蛋白的结合能力可采用本领域认可的测定直接结合的方法进行测试。该蛋白对目标分子的结合能力的检测可通过实时生物分子相互作用分析(BIA)等技术实现。Sjolander等人，Anal.Chem.63：2338-2345，1991，以及Szabo等人，Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705，1995。此处所述的“BIA”是一种无需标记任何相互作用物，实时研究生物特异性相互作用的技术(如BIAcore)。表面等离子共振(SPR)中光学现象的变化可用作生物分子间实时反应的指示。

[0170]本发明中的无细胞测定可适于使用可溶和/或膜结合形式的蛋白。在使用膜结合型蛋白进行无细胞测定的情况下，需要采用助溶剂使该膜结合型蛋白保持在溶液中。该类助溶剂的范例包括非离子型洗涤剂如正辛基葡萄糖苷，正十二烷基葡萄糖苷，辛酰基-N-甲基葡糖胺，癸酰基-N-甲基葡糖胺，Triton

 X-100，Triton

 X-114，Thesit

，异十三烷基聚乙二醇醚，3-[3-(胆酰氨丙基)二甲铵基]丙磺酸内盐(CHAPS)，3-[3-(胆酰氨丙基)二甲铵基]-2羟基-丙磺酸内盐(CHAPSO)或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-铵基-丙磺酸内盐。

[0171]可检测蛋白-蛋白相互作用的适当测定已为本领域所公知(如免疫沉淀反应，双杂交测定等)。在测试化合物存在或缺失的情况下进行的该测试可用于鉴定能够调节(例如，抑制或增强)本发明的蛋白与目标分子相互作用的化合物。

[0172]该蛋白与目标分子结合或相互作用的能力的检测可通过直接结合等方法实现。在直接结合测定中，将该蛋白与放射性同位素或酶标记偶合，从而可通过测定复合物中的标记蛋白检测该蛋白与目标分子的结合。例如，蛋白可直接或间接地采用¹²⁵I，³⁵S，¹⁴C或³H进行标记，然后可通过直接放射性计数或闪烁计数进行检测。此外，还可以采用酶标记来标记分子，例如，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，或荧光素酶，然后可通过测定适当底物向产物的转化来检测酶标记。

[0173]通常需要将本发明的蛋白或其结合蛋白固定化以帮助复合物从一种或全部两种蛋白的未复合形式进行分离，并适应自动化测定。在候选试剂存在或缺失的情况下与上游或下游结合原件的结合可在任何适于容纳反应物的容器内完成。其范例包括微量滴定板，试管以及微量离心管。在一个实施方式中提供了一种补充了可使蛋白与基质结合的区域的融和蛋白。例如，谷胱甘肽s-转移酶/组织因子融合蛋白可被谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽微量滴定板所吸附，然后将后者之一与细胞溶解物(例如³⁵S标记)和测试调节剂合并，将混合物在有利于复合物形成的条件下进行孵育(例如在生理盐度和pH下，也可采用略为苛刻的条件)。在孵育后，洗涤珠子去除未结合标记，固定化基质并直接检测放射性标记(例如将珠子置于闪烁体中)，或当复合物后续解离后在上清液中检测。另外，可将复合物从基质中解离，并用SDS-PAGE分离，然后使用标准电泳技术从凝胶中测定珠子部分组织因子结合蛋白的水平。

[0174]其它在基质上固定蛋白的技术也可用于该对象测定。例如，可采用本领域熟知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，I11.)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化分子，然后固定在链霉亲和素涂布的96孔板的孔上(Pierce Chemical)。

[0175]在不对任一相互作用物进行标记的情况下对化合物调节组织因子和蛋白二硫键异构酶或组织因子和PAR2之间相互作用的能力的测定同样在本发明的范围之内。例如，可采用微生理计在不标记本发明蛋白或目标分子的情况下检测两者之间的相互作用。McConnell等人，Science257：1906-1912，1992。如此处所述，微生理计(例如细胞传感仪)是一种使用光寻址电位传感器(LAPS)检测细胞酸化其环境时的比率的分析仪器。酸化率的变化可以作为化合物和受体之间相互作用的指示。

[0176]本发明中可被测试的基于抗原的杂聚物优先包括对组织因子(优选人组织因子)具有特异性的结合部分，并交联至可被自体抗体识别的抗原。可被自体抗体识别的抗原的范例包括，但不限于，以下的任一一种：VIII因子(与通过替换重组VIII因子治疗血友病有关的抗体)；肌肉乙酰胆碱受体(与疾病重症肌无力相关的抗体)；双磷脂酰甘油(与疾病狼疮相关)；血小板相关蛋白(与疾病特发性血小板减少性紫癜相关)；与干燥综合症相关的多抗原；组织移植自身免疫反应涉及的抗原；心肌上发现的抗原(与疾病自身免疫性心肌炎相关)；与免疫复合物介导的肾病相关的抗原；dsDNA和ssDNA抗原(与狼疮性肾炎相关)；桥粒糖蛋白和桥粒斑蛋白(与天疱疮和类天疱疮相关)；或任何其它明确的与疾病发病机理相关的抗原。

[0177]在本发明中进行测试的示范性杂聚物以及基于抗原的杂聚物及其制备方法已为本领域公知。例如，示范性杂聚物可参考WO 03007971A1；U.S.20020103343A1；美国专利5,879,679；美国专利5,487,890；美国专利5,470,570；WO 9522977A1；WO/02075275A3，WO/0246208A2或A3，WO/0180883A1，WO/0145669A1，WO 9205801A1，Lindorfer等人，J.Immunol.Methods.248：125，2001；Hahn等人.，J.Immnol.166：1057，2001；Nardin等人，J.Immunol.Methods.211：21，1998；Kuhn等人，J.Immunol.160：5088，1998；Taylor等人.，Cancer Immunol.Immunother.45：152，1997；Taylor等人.，J.Immunol.159：4035，1997；以及Taylor等人.，J.Immunol.148：2462，1992。此外，还可制备这些杂聚物的变体。例如，在一个实施方式中可采用以不同连接化学物质制备的双特异性分子形式。可被用于交联双特异性分子成分的示范性试剂包括：聚乙二醇，SATA，SMCC以及其它本领域已知的，可从Pierce Biotechnology等获取的试剂。可被测试的双特异性分子的示范形式可见2002年9月16日提交的U.S.Ser.No.60/411,731，其内容在此引用作为参考。

[0178]在其它的实施方式中可制备双特异性分子的不同多聚体形式(例如，二聚物，三聚物，四聚物，五聚物，或更高的多聚物形式)。在其它实施方式中可对双特异性分子的纯化形式进行测试，例如可见2002年5月13日提交的U.S.Ser.No.60/380,211，其内容在此引用作为参考。

[0179]在另一实施方式中，当杂聚物的结合部分之一为抗体时，可采用抗体的各种同型(例如IgA，IgD，IgE，IgG1，IgG₂(例如IgG₂a)，IgG₃，IgG₄，或IgM)。在另一实施方式中，抗体分子中的一部分(例如Fab片段)可被用作结合部分之一。在一个优选实施方式中，至少一个结合部分是包含Fc区域的抗体。在一个实施方式中，该抗体为小鼠抗体。

[0180]在另一实施方式中可对抗体修饰的作用进行检测，例如可对抗体的去免疫作用进行检测(如2003年3月28日提交的U.S.Ser.No.60/458,869)。

[0181]在本发明所提供的方法中，在非人类动物的血清，循环和/或组织中的试剂(例如病原体)可至少减少约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，或约100％。

[0182]在另一实施方式中，在对象的血清，循环和/或组织中的试剂浓度可直接检测。例如，可对血清和/或循环中该物质的存在引起的病理进行检测，如对动物的组织样本进行检测。另一种对非人类动物的血清，循环和/或组织中的物质浓度的间接检测为对该物质在非人类动物中引起感染的能力的检测。例如，可以检测该双特异性化合物对临床表现和感染症状的作用。也可对该双特异性化合物抑制感染扩散(例如，从一个器官系统扩散至另一个器官系统，或从一个个体扩散至另一个个体)的作用进行测试。

[0183]在另一个实施方式中检测了双特异性化合物在非人类动物中结合带有组织因子的细胞的能力。例如，在一个实施方式中，该双特异性化合物对组织因子目标分子的结合能力的检测可通过实时生物分子相互作用分析(BIA)等技术实现(Sjolander等人，Anal.Chem.63：2338-2345，1991，以及Szabo等人，Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705，1995)。此处所述的“BIA”是一种无需标记任何相互作用物，实时研究生物专一性相互作用的技术(例如，BIAcore)。表面等离子共振(SPR)中光学现象的变化可用作生物分子间实时反应的指示。

[0184]在另一实施方式中检测了非人类动物中细胞对该物质的破坏(例如被巨噬细胞灭活)。

[0185]对能够减少非人类动物的血清，循环和/或组织中该物质浓度(与未接受双特异性化合物的非人类动物体内所观察到的浓度比较)的化合物进行选择。

[0186]在该测定中所测试的化合物可以选自受试的众多化合物。在另一实施方式中，在快速测定中测试的双特异性化合物可能已经被鉴别为能够结合组织因子(例如在体外测定中)并可通过快速测定进一步评估或优化。此时，一种双特异性化合物降低血清和/或循环中一种物质浓度的能力可与另一种双特异性化合物或同一化合物的非优化产物进行比较以测定其在血清和/或循环中降低该物质浓度的能力。

[0187]在优选的实施方式中，本发明的双特异性化合物可在约1μg化合物/kg体重至约100μg化合物/kg体重的浓度范围内给用。如此处定义，双特异性化合物治疗有效量(即有效剂量)的范围为约0.01至5000μg/kg体重，优选约0.1至500μg/kg体重，更优选约2至80μg/kg体重，甚至更优选约5至70μg/kg体重，10至60μg/kg体重，，20至50μg/kg体重，24至41μg/kg体重，25至40μg/kg体重，26至39μg/kg体重，27至38μg/kg体重，28至37μg/kg体重，29至36μg/kg体重，30至35μg/kg体重，31至34μg/kg体重或32至33μg/kg体重。技术人员可以理解某些因素可以影响有效治疗一种对象所需的剂量，其包括但不限于疾病或紊乱的严重性，在先的治疗，对象的总体健康和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，采用治疗有效量的蛋白，多肽或抗体对对象的治疗可以包括单次治疗，也可包括优选的多次治疗。

[0188]在一个优选的范例中，在静脉(iv)注射一种物质后以约1至500μg/kg体重范围内的双特异性化合物对该动物进行处理。应当理解用于处理的双特异性化合物的有效剂量可以在特定处理后上升或下降。如此处所述的诊断测定的结果可能会明显引起剂量的改变。

[0189]测试化合物和/或物质的给药途径可以选择由静脉(iv)注射至动物的循环中。其它的给药途径包括，但不限于，局部，非肠道，皮下或吸入给药。术语“胃肠外”包括通过皮下，静脉或肌肉等途径注射，还包括局部给药，例如在疾病或受伤处。通过灌输方式持续释放化合物的方法也已为本领域公知。相关领域的技术人员可以认识到合适的剂量会由于待处理的紊乱的性质，患者的体重，年龄以及总体情况以及给药的途径等因素而发生变化。初步剂量可参照动物试验指定，人用剂量的调整可参照被本领域接受的实践来进行。

[0190]候选化合物和物质可在一定剂量范围下给动物施用。当该物质也向动物施用时，候选化合物的施用可在该物质施用之前，同时或之后。

[0191]本发明中表达组织因子的转基因动物(如小鼠)可用于筛选或评估能够治疗与对象的血清和/循环中有害物质(例如自体抗体，传染病原或毒素)的出现有关的人类紊乱或疾病的候选化合物

[0192]能够被本发明的双特异性化合物结合的示范性目标物质包括血源物质，其包括但不限于以下的任意一种：病毒，肿瘤细胞，炎症细胞，多聚核苷酸，抗体(如与自体免疫失调有关的自体抗体)。

[0193]在一个实施方式中，在实施本发明的测定的过程中，该药剂可在双特异性化合物给药前，给药时或给药后对转基因动物给用。

[0194]可以对本发明的双特异性化合物或其任意部分进行修饰以提高其半衰期。医药行业中常将肽类似物用作具有与模板肽具有相似性质的非肽药物。这些非肽化合物被称为“肽类似物”(Fauchere，Adv.Drug Res.15：29，1986；Veber等人，TINS p.392，1985；以及Evans等人，J.Med.Chem30：1229，1987，在此引用作为参考)并通常用计算机辅助分子模拟进行协助开发。与有疗效的肽结构类似的肽类似物能够产生相当的治疗或预防效果。一般而言，肽类似物的结构类似于范例多肽(即一种具有生物或药理活性的多肽)，例如抗原多肽，但其中一个或多个肽键可被-CH₂NH-，-CH₂S-，-CH₂-CH₂-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-COCH₂-，-CH(OH)CH₂--，以及-CH₂SO-替代，该替代通过本领域已知方法进行，并在下列参考文献中得到进一步描述：Spatola，A.F.in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins Weinstein，B.，ed.，Marcel Dekker，New York，p.267，1983；Spatola，A.F.，Vega Data，Vol.1，Issue 3，＂Peptide BackboneModifications，＂1983；Morley，TrendsPharm Sci pp.463-468，1980；Hudson等人.，Int.J Pept.Prot.Res.14：177-185，1979(-CH₂NH-，CH₂CH₂-)；Spatola等人，Life Sci.38：1243-1249，1986(-CH₂-S)；Hann，J.Chem.Soc.PerkinTrans 1：307-314，1982(-CH-CH-，顺式和反式)；Almquist等人，J MedChem 23：1392-1398，1980(-COCH₂-)；Jennings-White等人，TetrahedronLett 23：2533，1982(-COCH₂-)；Szelke等人，欧洲专利申请EP 45665 CA：97：39405，1982(-CH(OH)CH₂-)；Holladay等人，Tetrahedron Lett 24：4401-4404，1983(-C(OH)CH₂-)；以及Hruby，Life Sci.31：189-199，1982(-CH₂-S-)；分别在此引作参考。一种特别优选的非肽键为-CH₂NH-。该种肽类似物相对多肽实例具有显著的有点，例如包括：制备更经济，化学稳定性更高，药理属性(半衰期，吸收，效力，功效等)更强，专一性的改变(例如一种广谱的生物活性)，抗原性降低，以及其它。对肽类似物的标记通常包括将一个或多个标记直接或通过间隔基(例如酰胺基团)与通过定量结构-活性数据和/或分子模拟所预测的肽类似物的非干扰位点进行共价结合。该非干扰位点通常是不直接接触(通过与肽类似物结合产生治疗作用的)大分子的位点。肽类似物的衍生化(例如标记)不应实质影响该肽类似物的目标生物或药理活性。

[0195]以同类型的D氨基酸对氨基酸序列中的一个或多个氨基酸进行系统替换(例如D-赖氨酸替换L-赖氨酸)可用于得到更稳定的肽。此外，可通过本领域公知的方法生成限定性肽(Rizo等人，Annu.Rev.Biochem.61：387，1992，在此引用作为参考)；例如，通过加入能够形成分子内二硫键的内部半胱氨酸残基将肽环化。

[0196]该种修饰的多肽可通过原核或真核宿主细胞生成。此外，该种肽还可以通过化学方法合成。在重组宿主内表达外源多肽，化学合成多肽以及体外翻译的方法已为本领域熟知，并在以下文献中得到进一步描述：Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989；Berger等人，Methods in Enzymology，Volume152，Guide to Molecular Cloning Techniques，1987，Academic Press，Inc，SanDiego，Calif.；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.91：501，1969；Chaiken，CRC Crit.Rev.Biochem.11：255，1981；Kaiser等人，Science 243：187，1989；Merrifield，Science 232：342，1986；Kent，Annu.Rev.Biochem.57：957，1988；以及Offord，Semisynthetic Proteins，Wiley Publishing，1980，在此引用作为参考。

[0197]多肽通常可通过直接化学合成进行制备，并用作杂聚物的结合部分。肽可被制备为修饰肽，其中非肽部分通过共价键连接至N末端和/或C末端。在一些优选实施方式中对羧基末端或氨基末端两者之一或全部进行了化学修饰。对末端氨基和羧基基团最常见的修饰分别为乙酰化和酰胺化。氨基末端的修饰如酰化(例如乙酰化)或烷化(例如甲基化)和羧基末端的修饰如酰胺化，以及其它末端修饰，包括环化，可被用于各种测试化合物的实施方式。某些氨基末端和/或羧基末端修饰和/或核心序列的肽延伸可提供物理，化学，生物化学以及药理属性上的优势，例如：稳定性提高，效力和/或功效的增强，对血清蛋白酶的耐药性，所需的药代动力学属性等等。

可测标记

[0198]本测定中的特定标记或可测基团可通过分光的，光化学的，生物化学的，免疫化学的，电子的，光学的或是化学的方法进行测定。只要不影响本测定所用的抗体(例如，Mab 10H10)与信号转导组织因子的特异性结合，特定类型的标记不构成本发明的重要方面。可测基团可以是任何具有可测物理或化学属性的材料。这类可测标记在测定或免疫测定领域已经相当成熟，并且一般来说大部分可在该方法中使用的标记都可用于本发明。因此，标记是指任何可通过分光的，光化学的，生物化学的，免疫化学的，电子的，光学的或是化学的手段进行测定的物质。可用于本发明的标记包括磁珠(如Dynabeads^TM)，荧光染料(如异硫氰酸萤光素，德州红，若丹明等)，放射性标记(例如³H，¹⁴C，³⁵S，¹²⁵I，¹²¹I，¹¹²In，^99mTc，)，其它成像剂如微气泡(供超声成像)，¹⁸F，¹¹C，¹⁵O(供正电子发射断层显像)，^99mTC，¹¹¹In(供单光子发射断层显像)，酶(例如辣根过氧化酶，碱性磷酸酶以及其它ELISA中常用的酶)，以及比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯，聚丙烯，乳胶等)。描述该种标记用途的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；以及4,366,241，分别以各种目的在此全文引用作为参考。还可参见Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(6^th Ed.，Molecular Probes，Inc.，Eugene OR.)。

[0199]该标记可参照本领域所熟知的方法直接或间接地偶合至测定中所需的成分。如上文所示，可供采用的标记种类繁多，而标记的选择取决于所需的灵敏度，与化合物结合的容易程度，所需的稳定性，现有的仪器以及处理的规定。

[0200]非放射性的标记常通过间接的方法进行附着。通常配体分子(如生物素)与该分子间为共价结合。然后将配体结合至一种抗配体分子(如链霉亲和素分子)，该分子既可以是天然可测的，也可以共价结合至一个信号系统，例如一种可测的酶，荧光化合物或化学发光化合物。多种配体和抗配体可供使用。当一种配体具有天然抗配体(例如，生物素，甲状腺素以及皮质甾醇等)，它可与该种标记的，天然存在的抗配体结合使用。另外，任何半抗原或抗原化合物均可与抗体联合使用。

[0201]该分子也可与信号生成化合物直接结合，例如与酶或荧光团进行结合。作为标记的目标酶主要为水解酶，特别是磷酸酶，酯酶和糖苷酶，或是氧化还原酶，特别是过氧化酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹磺酰，伞形酮等。化学发光化合物包括虫荧光素以及2，3-二氢酞嗪二酮，例如发光氨。对各种可供采用的标记或信号生成系统的综述参见美国专利4,391,904，在此以各种目的全文引用作为参考。

[0202]检测标记的方法已为本领域技术人员所熟知。因此，例如当该标记为一种放射性标记时，检测的方法包括闪烁计数器或自动射线摄影的摄影软片。当该标记为一种荧光标记时，它可以通过以合适波长的光激发荧光染料并测定所得的荧光进行检测。该荧光可通过使用电荷耦合器件(CCDs)等电子检测器或是光电倍增器等类似仪器通过摄影软片进行直观检测。类似地，酶标记的检测可通过提供合适的该酶的底物后检测所得的反应产物。最后简单的比色标记可以简单地通过观察与标记关联的色彩进行检测。因此，在各种试纸测定中，共轭金常显粉红色，而各种共轭珠则显示珠子的颜色。

[0203]一些测定形式不要求使用标记的成分。例如，凝集测定可用于检测目标抗体的存在。在该测定中，包覆了抗原的颗粒被包含了目标抗体的样本所凝集。在该形式中，所有的成分均无需标记，目标抗体的存在可通过简单的视觉观察进行检测。

[0204]细胞标记和针对该细胞标记的抗体常通过共价或非共价连接一种提供可测信号的物质进行标记。

试剂盒

[0205]本发明还包括了包含本发明的组合物(例如，单克隆抗体，人源序列抗体，人源抗体，多特异性和双特异性分子，小化学分子，核酸组合物，例如，反义寡核苷酸，双链RNA寡核苷酸(RNAi，shRNA，siRNA)，或DNA寡核苷酸或包含编码转录shRNA分子的核苷酸序列的载体)以及使用说明的试剂盒。该试剂盒可进一步包括本发明的至少一种附加试剂，或者一种或多种附加人源抗体(例如，与第一人源抗体结合不同抗原表位的具有互补活性的人源抗体)。试剂盒通常包括指示该试剂盒内含物目标用途的标签。术语标签包括任何在试剂盒上或试剂盒中提供的，或以其它方式与该试剂盒随附的书写或记录的材料。

药物组合物

[0206]治疗剂组合物(例如，单克隆抗体，人源序列抗体，人源抗体，多特异性和双特异性分子，小化学分子，核酸组合物，例如，反义寡核苷酸，双链RNA寡核苷酸(RNAi，shRNA，siRNA)，或DNA寡核苷酸或包含编码转录shRNA分子的核苷酸序列的载体)可用于本发明的组合物和方法，并以立体异构体，前药，药学可接受的盐，水合物，溶剂化物，酸盐水合物，N氧化物或其同构晶体形式，或以将该治疗有效量(例如，针对癌症或转移癌症)的化合物与适当的载体或赋形剂混合所得的药物组合物的形式向人患者本身给用。

[0207]药学可接受载体可由将要给用的特定组合物，以及给用该组合物的特定方法所部分决定。相应地存在各种各样的药物组合物的适用制剂以联合给用治疗性抗体与肿瘤细胞靶标或小分子或配体组合(例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA18^th ed.，1990，在此引用作为参考)。该药物组合物通常包含以适于向患者给用的形式的差异表达的蛋白，激动剂或拮抗剂。该药物组合物通常被无菌，基本等渗制备并完全遵守美国食品药品管理局的所有良好操作规范(GMP)的规定。

处理方案

[0208]本发明提供了一种或多种组合物(例如，单克隆抗体，人源序列抗体，人源抗体，多特异性和双特异性分子，小分子，配体模拟物及其衍生物和类似物，核酸组合物，例如，反义寡核苷酸，双链RNA寡核苷酸(RNAi，shRNA，siRNA)，或DNA寡核苷酸或包含在新生物肿瘤细胞或炎症细胞特异性结合信号转导组织因子的编码shRNA分子转录的核苷酸序列的载体)，并结合了药学可接受的载体的药物组合物。一些组合物包括多种(两种或两种以上)抗体或小分子治疗剂的组合。

[0209]在预防应用中，可向易患疾病或症状(即，免疫疾病)，或者具有患病风险的患者给用药物组合物或药剂，其给用量足以消除或减少该风险，减轻严重性，或延缓疾病的发作，包括疾病生化，组织学和/或行为学症状，其在疾病发展过程中的并发症和中间病理表型。在治疗应用中，可向易患，或已患该种疾病的患者给用组合物或药剂，其给用量足以治愈，或至少部分抑制疾病的症状(生化，组织学和/或行为学)，包括其在疾病发展过程中的并发症和中间病理表型。足以实现治疗性或预防性治疗的量被定义为治疗或预防有效剂量。在预防和治疗方案中，通常以多重剂量给用药剂直至实现足够的免疫应答。通常对免疫应答进行检测并在免疫应答开始下降时给用重复剂量。

有效剂量

[0210]此处所述的抑制组织因子信号转导的药物组合物(例如，单克隆抗体，人源序列抗体，人源抗体，多特异性和双特异性分子，小化学分子，核酸组合物，例如，反义寡核苷酸，双链RNA寡核苷酸(RNAi，shRNA，siRNA)，或DNA寡核苷酸或包含编码shRNA分子转录的核苷酸序列的载体)，或其它组织因子抑制剂(例如，小分子抑制剂)治疗新生物疾病或炎症疾病的有效剂量取决于多种不同的因素，包括给药方法，靶标位点，患者的生理状态，该患者是人或动物，给药的其它药剂，以及用于治疗还是预防。该患者通常为人，但也可治疗包括转基因动物在内的非人类哺乳动物。治疗剂量需要进行测定以优化其安全性和有效性。

[0211]对于治疗性抗体或小分子组合物的给用，该剂量范围为宿主体重的约0.0001至100mg/kg，通常为0.01至5mg/kg。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重的范围内。在一个示范性治疗方案中每两周或每月或每3至6月给用一次。在一些方法中可同时给用两种或多种具有不同结合靶点特异性的治疗性抗体或小分子组合物，其中各治疗性抗体或小分子组合物的给用剂量均在指示的范围之内。治疗性抗体或小分子组合物通常可在多种时间给用。单独剂量之间的间隔可以为数周，数月或数年。根据对患者体内治疗性抗体或小分子组合物血液水平的测量所示，该间隔也可是不规律的。在一些方法中可对剂量进行调整以使血浆抗体或小分子组合物浓度在1-1000μg/ml，在一些方法中该浓度为25-300μg/ml。另外，抗体或小分子组合物可作为缓释制剂给药，此时可减少给药频率。剂量和频率的变化取决于治疗性抗体或小分子组合物在患者体内的半衰期。剂量和给用频率可依据该治疗为预防性或治疗性而发生变化。在预防性应用中，可以相对低的剂量在较长的一段时间内以相对较低的频率给药。一些患者将接受终身治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对高的剂量在相对短的间隔内给药直至疾病的进展被减缓或终止，并优选直至该患者显示部分或完全改善疾病症状。此后，该患者可以预防方案进行给用。

[0212]治疗性抗体或小分子组合物的剂量范围为每个患者约10ng至1g，100ng至100mg，1μg至10mg，或30-300μg。

给药途径

[0213]用于治疗新生物疾病，或炎症疾病的治疗性组合物(例如，单克隆抗体，人源序列抗体，人源抗体，多特异性和双特异性分子，小化学分子，核酸组合物，例如，反义寡核苷酸，双链RNA寡核苷酸(RNAi，shRNA，siRNA)，或DNA寡核苷酸或包含编码shRNA分子转录的核苷酸序列的载体)可通过肠胃外，局部，静脉内，口服，皮下，动脉内，颅内，腹膜内，鼻内或肌肉内的方式给用以进行预防性(作为靶向新生物疾病或治疗性疾病的治疗性抗体或小分子制剂的吸入剂)和/或治疗性治疗。最常规的给用途径为皮下给用免疫原剂，尽管其它途径可能达到同样效果。仅次于它的常规途径是肌肉内注射。该种注射类型最普遍在手臂或腿的肌肉上进行。在一些方法中，可将药剂直接注射进入发现肿瘤的特定组织，例如颅内注射或对流增强型输送。优选通过肌肉注射或静脉输注给用抗体或小分子组合物。在一些方法中，特定治疗性抗体或小分子组合物被直接传输进入颅内。在一些方法中，抗体或小分子组合物作为缓释组合物或仪器(例如Medipad^TM仪)进行给药。

[0214]本发明的药剂可视情况联合在治疗各种疾病(包括各种免疫相关疾病)至少部分有效的其它药剂进行给药。对于脑中的原发和转移的肿瘤，治疗性组合物还可与促进本发明药剂穿越血脑屏障(BBB)的其它药剂联合给用。例如，治疗性抗体或小分子组合物的鼻内传递还可包括细胞膜穿透促进剂。

制剂

[0215]用于治疗新生物疾病，或炎症疾病的组合物(例如，单克隆抗体，人源序列抗体，人源抗体，多特异性和双特异性分子，小化学分子，核酸组合物，例如，反义寡核苷酸，双链RNA寡核苷酸(RNAi，shRNA，siRNA)，或DNA寡核苷酸或包含编码shRNA分子转录的核苷酸序列的载体)通常作为包含活性治疗剂(例如，化疗剂或抗炎剂)和多种其它药学可接受的成分的药物组合物给用。参见Remington′s PharmaceuticalScience(15^th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1980)。优选形式取决于目标给药模式和治疗应用。根据制剂需要，该组合物还可包括药学可接受的，无毒载体或稀释剂，它们通常定义为向动物或人给用的药物组合物制剂常用的溶媒。所选的稀释剂应当不影响该组合的生物活性。该种稀释剂的范例为蒸馏水，生理磷酸缓冲盐水，Ringer溶液，右旋糖溶液，以及Hank溶液。此外，该药物组合物或制剂还可包括其它载体，佐剂，或无毒，无治疗性，无免疫原性稳定剂等。

[0216]药物组合物还可包括大型的，代谢缓慢的大分子如蛋白，多糖(例如壳聚糖)，聚乳酸，聚乙醇酸和共聚物(例如功能化乳胶Sepharose^TM，琼脂糖，纤维素等)，聚合氨基酸，氨基酸共聚物，以及脂质聚集物(例如油滴或脂质体)。此外，这些载体可作为免疫刺激剂(即，佐剂)。

[0217]对于肠胃外给用，治疗性抗体或小分子组合物可作为在无菌液体如水油，盐水，甘油或乙醇等药物载体和生理可接受稀释剂中的该物质的溶液或悬浮液的可注射剂型给用。此外，组合物中还可包括润湿剂或乳化剂，表面活性剂，pH缓冲物质等辅助物质。药物组合物的其它成分为动物，植物或合成来源的油，例如，花生油，大豆油以及矿物油。通常而言，特别对于可注射溶液，丙二醇或聚乙二醇等乙二醇为优选的液体载体。治疗性抗体或小分子组合物可通过贮存注射液或输注制剂等方式给用，该种形式的制剂可使活性成分持续释放。示范性组合物包括5mg/mL的治疗性抗体或小分子组合物，并在由50mM L-组氨酸，150mMNaCl组成，且用HCl调节至pH6.0的水缓冲液配置。

[0218]组合物通常制备成为可注射的液体溶液或悬浮液；也可制成适于在注射前溶于或悬浮于液体载体的固体形式。如上所述，该制剂还可在脂质体或微粒(例如聚交酯，聚乙交酯或共聚物)乳化或封装以增强佐剂作用。Langer，Science 249：1527，1990and Hanes，Advanced DrugDelivery Reviews 28：97-119，1997。本发明的药剂可以贮存注射液或输注制剂给用，该种形式的制剂可使活性成分持续或脉冲释放。

[0219]适于其它给药模式的其它制剂包括口服、鼻内和肺部制剂，栓剂，以及透皮应用。

[0220]对于栓剂，结合剂和载体包括，例如，聚烷撑二醇或甘油三酸酯；该种栓剂可通过含量在0.5％至10％，优选1％至2％范围内的活性成分制备。口服制剂含有赋形剂，例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁。这种组合物可采用溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，缓释制剂或粉末等形式并包含10％-95％，优选25％-70％的活性成分。

[0221]局部应用可形成透皮或皮内传递。局部给用可通过联合给用具有霍乱毒素或其脱毒衍生物或亚基或者其它类似细菌毒素的药剂得到促进。Glenn等人，Nature 391：851，1998。该联合给用可通过采用混合物或通过化学交联或作为融合蛋白表达获得的连接分子的形式实现。

[0222]另外，可采用皮肤斑贴或穿透体实现透皮传递。Paul等人，Eur.J.Immunol.25：3521-24，1995；Cevc等人.，Biochem.Biophys.Acta 1368：201-15，1998。

[0223]该药物组合物通常被无菌，充分等渗制备并完全遵守美国食品药品管理局的所有良好操作规范(GMP)的规定。

毒性

[0224]优选地，此处所述的治疗有效剂量的组合物(例如，单克隆抗体，人源序列抗体，人源抗体，多特异性和双特异性分子，小化学分子，核酸组合物，例如，反义寡核苷酸，双链RNA寡核苷酸(RNAi，shRNA，siRNA)，或DNA寡核苷酸或包含编码shRNA分子转录的核苷酸序列的载体)可提供治疗性受益且不引起实质毒性。

[0225]此处所述的蛋白的毒性可在细胞培养或试验动物中通过标准的药物程序进行测定，例如测定LD₅₀(引起50％的群死亡的剂量)和LD₁₀₀(引起100％的群死亡的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比例即治疗指数。从细胞培养测定和动物试验获得的数据可用于制定在人体内无毒使用的剂量范围。此处所述的蛋白的剂量优选处于包含了毒性很小或没有毒性的有效剂量的循环浓度范围内。该剂量可根据采用的剂型和给药途径在该范围内变化。确切的剂型，给用途径和剂量可由医生个人根据患者的状况选择。(例如，参见Fingl等人，1975，In：The PharmacologicalBasis of Therapeutics，Ch.1.)。

[0226]以下提供的对于开展本发明的特定实施方式的范例仅作阐述之用，无意以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

[0227]如下文的实施例所示，本发明发现TF-VIIa介导的凝血和细胞信号转导涉及TF的不同细胞池。据发现三元TF-VIIa-Xa复合物中的Xa进行凝血激活和凝血启动期信号转导需要TF的表面可接近的，胞外Cys¹⁸⁶-Cys²⁰⁹二硫键，而通过二元TF-VIIa复合物进行的直接PAR2裂解则无此要求。该二硫键的突变破坏再现了的功能特性，该TF-VIIa信号转导池对构成型表达TF的细胞上的VIIa具有较低亲和性。

[0228]此外，据观察蛋白二硫键异构酶(PDI)可通过靶向该二硫键阻滞凝血。TF凝血活性可被胞外PDI和TF的联合所抑制，且TF-PAR2复合物形成以及TF-VIIa信号转导需要二硫键/硫醇交换途径。在包括乳腺癌细胞等多种细胞类型中TF-PDI联合和TF-VIIa信号转导之间密切相关。一种独特的单克隆抗体(MAb-10H10)仅识别TF的非凝血，隐性构象。该抗体抑制TF-PAR2复合物的形成和TF-VIIa信号转导，但不阻止凝血激活。通过MAb-10H10在这些细胞中阻断TF-VIIa信号转导优于通过MAb-5G9阻断凝血以抑制肿瘤生长(例如，乳腺肿瘤或黑素瘤)，这突出了与体内TF-VIIa信号转导途径的关联。重要的是，MAb-10H10对凝血激活仅有极小的作用，显示TF-VIIa信号转导的抑制并不损害止血。

[0229]此外还发现PDI在氧化氮(NO)依赖性途径中抑制TF凝血活性。动脉粥样硬化，糖尿病或炎症中的血管保护性NO合成常出现紊乱，且氧化氮合成的解偶联可将细胞表面TF活性转化为凝血。因此TF凝血活性的NO依赖性抑制以意想不到的方式关联了凝血活性的调节和心血管疾病和炎症中的氧化应激。

实施例1

信号转导TF的特异性抑制

[0230]细胞表面表达的TF可以不同的亲和性结合VIIa且TF凝血激活通常在比细胞信号转导更低的VIIa浓度下饱和。Le等人，J.Biol.Chem267：15447-15454，1992；Hjortoe等人，Blood 103：3029-3037，2004。目前尚不清楚不同的VIIa结合是TF构象的固有属性或是源自于其它已知的影响TF凝血活性的因素，包括脂质环境，伴侣蛋白或钙动员。Sevinsky等人，J.Cell Biol.133：293-304，1996；Carson等人.，Blood 84：526-534，1994；Bhattacharjee等人，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.25：1737-1743，2005；Bach和Moldow，Blood 89：3270-3276，1997。我们发现TF的凝血活性在人角化细胞生长停滞过程中TF表达水平渐进下调至<5％(通过恒定肌动蛋白水平记录)时仍保持不变(图1a)。相反地，TF-VIIa信号转导随TF水平同步下调(图1b)，尽管PAR响应并未缺失(图1e)。

[0231]对非渗透细胞的染色证实了细胞表面TF表达的下降(图1c)，但出人意料的是我们发现与TF羧基末端结合但不抑制VIIa结合的MAb-10H10的表位缺失。Ruf等人，Biochem.J.278：729-733，1991。抑制凝血和基底结合的MAb-5G9的反应性得到保留，显示MAb-10H10缺失了与促进凝血的TF残留池的反应性。Huang等人.，J.Mol.Biol.275：873-894，1998。采用纯化的，磷脂重构的TF或TF表达细胞的细胞溶解产物进行的免疫耗竭实验证实仅MAb 5G9，而非MAb 10H10可有效结合凝血TF(图1d)。因此，抗原性不同的TF池相对通过PAR2进行的TF-VIIa细胞信号转导造成凝血(图1e)。

[0232]由于Xa生成速率在1nM VIIa时饱和至～99％，因此凝血TF对VIIa具有高亲和性且与培养时间无关。在TF-VIIa-X凝血起动复合物中，新生产物Xa而非TF-VIIa可激活PARs。Riewald和Ruf，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：7742-7747，2001。低(1nM)VIIa浓度仅当底物X存在和TF-VIIa-Xa的信号转导受Xa抑制剂NAP5抑制时才产生可感知的信号转导(图1f)。10nM VIIa下的TF-VIIa信号转导不受NAP5抑制且当底物X与10nM VIIa同时添加时NAP5对信号转导仅具有极小的作用。这显示TF-VIIa信号转导池不受底物存在的影响。凝血起动复合物的凝血和Xa依赖性信号转导受MAb-5G9抑制，但不受MAb-10H10抑制。重要的是，对凝血TF具有很差反应性的MAb-10H10阻断TF-VIIa信号转导(图1c，d)。因此，我们鉴定了针对信号转导TF但不干扰凝血起动或三元TF-VIIa-Xa复合物信号转导的特异性抑制抗体。

[0233]图1显示了信号转导TF的特异性抑制。生长停滞的HaCaT细胞中的a凝血活性，TF表达以及b TF-VIIa信号转导，平均±sd(n＝3)。插图：细胞溶解产物中的肌动蛋白或TF。c通过结合了FITC的MAb-9C3和结合了德州红的MAb-5G9或10H10进行的细胞表面TF检测。d通过固定化MAb-5G9或10H10免疫耗竭的磷脂-重构TF的Xa生成(相对于对照)。e HaCaT TF-VIIa信号转导的PAR2依赖性。f根据对VIIa的不同亲和性将TF分为介导TF-VIIa或Xa依赖性三元TF-VIIa-Xa复合物信号转导。MAb-10H10特异性抑制TF-VIIa信号转导；平均±sd(n>3)。

实施例2

信号转导TF受蛋白二硫键异构酶调节

[0234]为进一步在该模型中说明TF功能的调节，可将细胞重新接种于可防止细胞间接触的Ca²⁺缺失培养基48小时。备选地，可在后24小时向培养基添加诱导独特上皮形态而不影响TF表达或VIIa结合水平的2mM Ca²⁺(高Ca²⁺)。采用在生物素化后不结合TF的MAb-5G9进行表面生物素化和免疫沉淀反应以证实TF的同等和突出细胞表面表达。然而，在这两种情况下，TF显示显著的功能性差异(图2b)且低Ca²⁺细胞中的凝血活性高出～3-4倍。尽管通过激动剂肽进行直接PAR2激活与之相当，但TF-VIIa信号转导仅在高Ca²⁺细胞而非低Ca²⁺细胞中突出。因此，向高Ca²⁺转变表现为以凝血TF为代价诱导信号转导TF。与此相一致，在Ca²⁺添加时以环己酰亚胺(CHX)阻断蛋白合成可同时防止TF-VIIa信号转导和阻断更高糖基化的细胞表面TF的出现(图2c)。

[0235]由于蛋白二硫键异构酶(PDI)可在接触抑制中诱导，我们推断TF的凝血活性受到靶向凝血所需的溶剂暴露的TF Cys¹⁸⁶-Cys²⁰⁹二硫键的PDI途径所抑制。Rehemtulla等人.，J.Biol.Chem.266：10294-10299，1991。该种交叉链二硫键由于其拉紧的几何结构而容易被还原。Hogg，Trends Biochem.Sci.28：210-214，2003；Wouters等人，BioEssays 26：73-79，2004。通过以不透过膜的硫醇反应性3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-生物胞素(MPB)进行标记发现细胞表面PDI与TF相伴随。约56和64kDa的MPB标记条带与TF共沉淀，特别是来自高Ca²⁺细胞的TF共沉淀(图2d)，但通过氧化苯胂(PAO)阻断临近硫醇去除了标记。约为TF分子量的暗淡、可变标记条带仍被保留，这可能显示了TF的瞬时还原。与TF共沉淀的主MPB标记条带与免疫沉淀的PDI对齐，但不与近源同系物ERP57对齐，且抗PDI阻断MBP标记(图2e)。siRNA敲除PDI或ERP57进一步证实PDI与TF共沉淀(图2f)。

[0236]NHS表面生物素化PDI在64kDa的共免疫沉淀可通过Western印迹得到证实(图2g)。一种PDI抑制剂-杆菌肽可防止PDI与TF的共沉淀。Mandel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A90：4112-4116，1993。杆菌肽抑制TF-VIIa信号转导，但不引导PAR2激动剂或凝血酶应答(图2h)。洗脱杆菌肽恢复TF-VIIa信号转导和表面PDI的MBP标记显示在该实验的时间范围内伴随了PDI与TF的快速再结合。因此，在高Ca²⁺细胞上的信号转导TF是与PDI的杆菌肽敏感性复合物。

[0237]尽管杆菌肽的存在略微提高了TF的凝血功能(图2j)，低Ca²⁺细胞相对高Ca²⁺细胞的活性仍然显著不同。我们推断添加杆菌肽对TF活性的部分作用是由于PDI相对标记条件的低效率解离(图2g，i)。对HgCl₂的短时暴露可充分提高高Ca²⁺细胞中的TF凝血活性，显示TF可通过还原途径进行负向调节。由于氧化提高的凝血可影响TF，因为HgCl₂对低Ca²⁺细胞作用极小，不在杆菌肽的存在下提高凝血以及无需从细胞表面替换PDI而特异性破坏PDI与TF的结合(图2k)。此外，杆菌肽是一种HgCl₂激活的可逆抑制剂(图2j)，但不在细胞上阻断HgCl₂的非特异性，毒性作用。因此，信号转导TF通过氧化还原机制损失凝血活性。通过表面氧化可减少MAb-10H10而非其它抗体反应性，这进一步证明了信号转导TF的氧化还原敏感性构象。

[0238]图2显示了信号转导TF受PDI调节。a通过NHS表面生物素化证实，可防止MAb-5G9免疫沉淀的TF经高Ca²⁺转换具有类似的细胞表面表达。b在高Ca²⁺细胞中的TF的低凝血活性与MAb-10H10可抑制的TF-VIIa信号转导相关；与高Ca²⁺对照不同，p<0.01，t检验，平均±sd(n>4)，c环己酰亚胺(CHX)TF合成阻断防止TF-VIIa信号转导，d与TF共沉淀的蛋白的MPB标记受2μM PAO抑制。E在TF和PDI免疫沉淀中MBP标记条带的共迁移。抗PDI SPA-890阻断MPB标记。f siRNA敲除PDI而非ERP57在TF免疫沉淀中防止MPB标记条带。g PDI抑制剂杆菌肽(3mM)在NHS表面生物素化细胞的MAb-9C3免疫沉淀中从TF中解离PDI，h杆菌肽可逆阻断TF-VIIa信号转导。洗出：在以10nM VIIa刺激前对采用杆菌肽预培养10分钟的细胞进行洗涤；^*相对对照p<0.01，t检验，平均±sd(n>4)。i洗出杆菌肽可促进PDI-TF再聚集；在洗涤后标记10分钟。j杆菌肽对TF凝血活性的作用。在功能测定前以100μMHgCl₂氧化细胞表面2分钟。k以HgCl₂氧化可将PDI从TF解离而不从细胞表面替换MPB或NHS生物素化PDI。

实施例3

对TF二硫键的突变破坏使其对VIIa的亲和性降低(信号转导TF的特征)

[0239]我们测试了破坏的TF Cys¹⁸⁶-Cys²⁰⁹二硫键是否再现PDI调节的TF信号转导功能。通过腺病毒转导在TF阴性脐静脉内皮细胞(HUVECs)引入对二硫键的单个丙氨酸替代突变以获得类似的表面表达。各突变体显示TF-VIIa介导的Xa生成减少>95％，但TF-VIIa信号转导在表达C209A而非C186A TF的PAR2-激动剂应答细胞中得到保留(图3a)。通过间接免疫荧光显示，VIIa与C209A TF的结合与野生型TF相当。表达野生型TF的细胞中的TF-VIIa信号转导需要>1nM VIIa，而三元TF凝血起动复合物信号转导在<1nM VIIa时发生(图3b)。在导入了C209A TF的细胞中，TF-VIIa信号转导所要求的VIIa浓度略低于野生型TF表达细胞。重要的是，当底物X与VIIa同时添加时，C209A TF介导的信号转导不会改变。因此，为生成不仅促进凝血，还能促进三元TF-VIIa-Xa复合物信号转导的高亲和性TF需要Cys¹⁸⁶-Cys²⁰⁹二硫键的形成。

[0240]我们证实了还原性C209A TF变构诱导了蛋白水解细胞信号转导必需的VIIa的催化活性。重组可溶性单体C209A TF刺激的VIIa活性在饱和时达到最大值。然而，还原型C209A TF相对可溶性，氧化型野生型TF具有更低的亲和性来增强VIIa的催化活性。因此，对TF二硫键的突变破坏使其对VIIa的亲和性降低(信号转导TF的特征)。除了抑制VIIa特异性结合信号转导TF外，MAb-10H10不阻断C209A TF-VIIa的催化活性。因此MAb 10H10可能通过空间位阻防止TF-VIIa介导的PAR2裂解。

[0241]图3显示了还原型TF的信号转导。a突变体C209A TF-VIIa信号转导，但在表达类似水平的野生型、C186A或C209A TF的HUVECs中丧失了对PAR2的凝血活性。b在表达C209A或野生型TF的HUVECs中具有和不具有100nM X时的VIIa信号转导剂量响应，平均±sd(n>4)。c重组可溶性C209A TF相对野生型TF以降低的亲和性激活VIIa(40nM)；平均±sd(n＝3)。插图单体可溶性TF的均匀制备物的凝胶；该表达标签未从获得更高分子量的C209A TF中裂解。下图：Mab-10H10对TF-VIIa酰胺化活性没有作用。

实施例4

凝血TF和信号转导TF在肿瘤进展中的作用

[0242]针对凝血(MAb-5G9)和信号转导(MAb-10H10)TF的特异性抗体为说明这些活性分别在肿瘤进展的作用提供了机会。在异种移植MDA-MB231乳腺癌模型中可实现对肿瘤细胞TF的特异性靶向。抗体MAb-5G9显示了预期的抑制凝血的特异性，而抗体MAb-10H10可抑制信号转导，包括促血管新生白介素8和TR3(一种典型的PAR信号转导下游的早期应答基因)的诱导(图4a，b)。以MAb-10H10而非MAb-5G9灌输的肿瘤细胞显示的最终肿瘤大小和肿瘤重量明显小于同型匹配的对照IgG1(图4c)。在组织培养中经抗体处理的细胞生长与对照并无太大区别，这与以前的TF表达对体外增殖没有作用的结果相一致。Yu等人.，Blood105：1734-1741，2005；Zhang等人，J.Clin.Invest.94：1320-1327，1994。MAb-5G9略微减少肿瘤体积，这与MAb-5G9对体外TF-VIIa信号转导的部分抑制作用相一致。

[0243]由于MAb-5G9而非MAb-10H10可抑制黑素瘤M24met转移，所以TF可通过凝血酶途径支持实验性黑素瘤转移的早期阻止期。Mueller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11832-11836，1992。由于前述试验中的抗体给用方案不足以评价转移的肿瘤生长，我们再次考察了TF信号转导在该黑素瘤模型的肿瘤扩增中的作用。MAb-5G9可延缓黑素瘤初期肿瘤生长，但MAb10H10能更有效减少肿瘤体积和肿瘤重量(图4d)。与凝血驱动的血行转移不同，靶向TF-VIIa信号转导可有效抑制两种独立的体内肿瘤模型的原发生长。

[0244]图4显示TF-VIIa信号转导促进肿瘤生长。a，b MDA-MB231乳腺癌细胞中的TF-VIIa信号转导受MAb10H10阻断，但不被MAb5G9阻断(*p<0.01，t检验，平均±sd(n>4)。插图：典型试验。c在通过共同注射以实现局部高抗体浓度的1mg对照IgG1(TIB115)，MAb-5G9或MAb-10H10存在时MDA-MB231原发肿瘤生长。处死动物时的肿瘤重量(n＝6，双侧ANOVA，Kruskall Wallis **p<0.001)。d以1mgMAb-5G9或MAb-10H10灌输或未以之灌输的M24met黑素瘤细胞的肿瘤生长(n＝8，双侧ANOVA，Kruskall Wallis **p<0.001，*p<0.01)。

[0245]这些试验确定了TF由凝血级联系统的起动辅因子转化为推动病理学的非凝血性信号转导辅助受体的分子机制。由于信号转导TF-VIIa不有效结合底物，因此它可逃避Xa依赖性TF途径抑制剂(TFPI)的快速反馈抑制。Huang等人，Blood 90：944-951，1997。因此病理生理上调TF-VIIa信号转导可脱离凝血激活后的典型抑制回路进行。靶向信号转导TF抑制肿瘤生长，为TF-VIIa介导的PAR2激活是促使病理独立于体内凝血酶信号转导的中枢信号转导途径提供了直接证据。TF的范例显示二硫键转变途径具有在一种单独受体的两种截然不同的生物功能之间进行转换的灵活性且该种可调节的转换可经开发获取潜在的治疗性得益。本研究将鼓励对其它病理生理相关的细胞表面受体的类似靶向。

实施例5

对信号转导组织因子具有特异性的抗体的表位分配

[0246]图5显示了一种对信号转导组织因子具有结合特异性的单克隆抗体-MAb-10H10的表位分配。该图显示了野生型或突变可溶性TF1-218与所示抗体的免疫沉淀后通过Western印迹的检测。MAb-10H10不能有效免疫沉淀在残基149和150(A149，A150)处突变的TF，显示在TF羧基末端区的表位定位临近或直接涉及这些残基侧链。

实施例6

PDI对TF凝血活性的氧化氮(NO)依赖性抑制

[0247]如上文指出，突变分析显示断裂Cys¹⁸⁶-Cys²⁰⁹二硫键可导致TF凝血失活，但MPB标记未在高Ca²⁺细胞中显示出明显的游离硫醇。细胞表面PDI催化反式亚硝基化和去亚硝基化反应且PDI可在邻近硫醇被S亚硝基化。增强TF凝血活性需要50-100μM Hg²⁺，该浓度是从PDI释放氧化氮(NO)的典型浓度(Sliskovic等人.J.Biol.Chem.280，8733-8741，2005)，这从而提出了Hg²⁺的激活作用与PDI的去亚硝基化有关的可能性。为证实这一可能性，可采用生物素开关法以检测S亚硝基化。通过N-乙基马来酰亚胺(NEM)阻断细胞游离硫醇后，在抗坏血酸存在或缺失的情况下对细胞进行MPB标记以释放NO。类似地，在以1mM碘乙酰胺阻断游离硫醇后，检测抗坏血酸存在时TF免疫沉淀的MPB标记。

[0248]如图6所示，通过这些研究的结果显示PDI以氧化氮依赖性途径抑制TF凝血活性，关联了TF凝血活性的调节和脉管系统的氧化应激。图6a显示了在以1mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)阻断硫醇后，在抗坏血酸(AA)释放NO的情况下，尤其在高Ca²⁺细胞的PDI免疫沉淀中用生物素开关法检测到升高的PDI标记。对高Ca²⁺细胞具有特异性的免疫沉淀PDI在抗坏血酸存在下显示了上升的MPB标记。与TF分子量相当的MPB标记条带也在PDI免疫沉淀变为可见。图6b显示了在以1mM碘乙酰胺阻断硫醇后，并在存在或不存在AA时的MPB标记前，生物素开关法对TF的S亚硝基化的检测。以1mM碘乙酰胺阻断游离硫醇后，TF免疫沉淀的MPB标记在抗坏血酸的存在下显著提升。

[0249]可进一步对Hg²⁺诱导的TF激活是否可逆进行测试。洗出氧化剂后，TF的凝血活性仍保持在较高水平。图6c所示的结果证实了TF凝血活性的Hg²⁺诱导激活可通过NO依赖性PDI途径逆转。在该试验中，将经过100μM Hg²⁺短时暴露并洗涤后的细胞在Xa生成测定前于1.5mMCa²⁺并含有1mM硝普钠(SNP)，1mM还原型谷胱甘肽(GSH)，或1mM S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)，且含有或不含有10μM PAO的HEPES缓冲液中培养10分钟。数据显示单独添加还原型谷胱甘肽(GSH)或NO供体硝普钠(SNP)对TF活性没有作用，但组合使用时TF凝血活性被抑制(图6c；*不同对照(p<0.05，t检验；平均±sd；n＝3))。邻近硫醇阻断剂PAO防止了TF的失活，显示PDI与TF二硫键破坏有关。NO与GSH反应产生S-亚硝基谷胱甘肽且S-亚硝基谷胱甘肽的添加足以抑制TF凝血活性。

实施例7

TF-VIIa信号转导需要TF.PAR2复合物形成

[0250]另外的如图7所示的研究显示TF-VIIa信号转导需要TF.PAR2复合物形成。图7a显示MAb-5G9对高Ca²⁺细胞的PAR2的免疫沉淀可通过Hg²⁺预处理破坏。图7b显示MAb-10H10而非MAb-5G9可干扰TF-PAR2复合物。以所示抗体在无血清培养基中预处理HaCaT细胞15分钟并在PAR2免疫沉淀中检测TF。因为没有来自不同物种的PAR2适用抗体可供进行Western印迹，由于背景而无法进行加样对照。图7c显示MAb-10H10不免疫沉淀来自HaCaT细胞的PAR2。图7d显示了MAb-10H10不免疫沉淀含PDI的复合物。MPB标记细胞可以MAb-9C3或MAb-10H10进行免疫沉淀并通过MPB探测PDI，TF或硫醇-生物素化。

[0251]如图7所示，MAb-5G9对TF-VIIa信号转导没有作用，但对TF的凝血和非凝血池显示出强烈的反应性。该抗体可免疫沉淀TF与来自HaCaT细胞的PAR2复合物(图7a)。Hg²⁺处理从TF释放表面PDI可破坏PAR2与MAb-5G9免疫沉淀中的TF的复合物形成。以MAb-5G9预处理细胞对逆转TF与PAR2免疫沉淀的结合没有作用，但信号转导阻断Mab-10H10显著降低TF-PAR2结合(图7b)。因此，抗体阻断TF-VIIa信号转导与减少的TF-PAR2共免疫沉淀有关。与MAb-5G9不同，MAb-10H10不免疫沉淀PAR2(图7c)或PDI(图7d)，显示该抗体可防止包含TF，PAR2和PDI的复合物的形成。综上所述，在图7和图2中描述的在细胞模型中的TF和PAR2的生理水平的数据显示PDI可作为直接TF-VIIa细胞信号转导和凝血激活之间的调节开关。

实施例8

材料与方法

[0252]试剂。凝血因子，抑制剂，以及抗体可从前述来源或由以下供应商获得：抗PDI RL90(Alexis)，SPA-890(Stressgen)，抗ERP57(Upstate)，N′-(3-马来酰亚胺丙酰)生物胞素(MPB)(Molecular Probes)，杆菌肽，氧化苯胂(Sigma)。Riewald和Ruf，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：7742-7747，2001；Ahamed和Ruf，J.BiolChem.279：23038-23044，2004；Sevinsky等人，J.Cell Biol.133：293-304，1996；Ruf等人，Biochem.J.278：729-733，1991；Morrissey等人，Thromb.Res.52：247-61，1988；Dorfleutner等人，Mol.Biol.Cell 15：4416-4425，2004；以及Dorfleutner和Ruf，Blood 102：3998-4005，2003。杆菌肽可通过凝胶过滤再次纯化并对PDI降解的缺失进行测试。兔抗PAR2可针对KLH偶联肽TIQGTNRSSKGRSLIGKVDGTSHVTGCG(SEQ ID NO：5)获得。如Stone等人，Biochem.J.310：605-614，1995所述，可溶性TF突变体可在大肠杆菌中表达。

[0253]除了上述科技文献中的披露，5G9和10H10抗体还在美国专利5,223,427和6,001,978中得到了详尽描述。生产这两种抗体的杂交瘤已参照布达佩斯条约的规定在1987年3月27日保藏于美国菌种保藏中心，其编号分别为HB9382和HB9383。

[0254]细胞培养。HUVECs可参照描述进行保存和转导。Ahamed和Ruf，J.Biol.Chem.279：23038-23044，2004。人HaCaT角化细胞标准培养为DMEM，含10％FBS，2mM谷氨酸。对于低Ca²⁺培养，将细胞分入含10％脱钙FBS的角化细胞-SFM(Invitrogen)培养48小时，并在环己酰亚胺(50μM)存在或缺失时通过添加2mM Ca²⁺转换培养24小时。对于siRNA敲除，每日通过2μl Lipofectamin 2000(Gibco)用100nM siRNA(Santa Cruz Biotechnology)对40％汇合的HaCaT细胞进行转染。

[0255]功能性和信号转导测定。对于信号转导试验，可在无血清条件下于含有2mM谷氨酰胺，10mM HEPES，1.5mM Ca²⁺的M199中平衡细胞(HUVECs)5小时或24小时(MDA-MB231)或在含2mM谷氨酰胺，10mM HEPES的DMEM中平衡10-20分钟(HaCaT)。在刺激前10分钟添加抑制剂：抗TF(50μg/ml)，兔抗PAR2(100μg/ml)，抗TF(ATAP2，20μg/ml，WEDE 15，40μg/ml)，杆菌肽(3mM)。常规添加水蛭素(200nM)以排除凝血酶信号转导。在激动剂刺激后10分钟进行的MAP激酶磷酸化以及在90分钟后进行的基因诱导可通过Western印迹或实时PCR进行定量。Ahamed等人，Blood 105：2384-2391，2005。

[0256]细胞表面标记，免疫沉淀，共焦成像。在含1.5mM氯化钙的HEPES缓冲液中以100μM MPB或0.5mg/ml NHS生物素于4℃下对细胞进行洗涤和标记20分钟。在终止(对MPB使用1mM还原型谷胱甘肽，对NHS使用Tris)后，由50mM n-辛基-β-D-葡萄糖苷溶解产物所得的免疫沉淀通过Mabs直接结合至Dynabeads以进行与羊抗TF，抗PDI RL90的Western印迹，或通过链霉亲和素结合的辣根过氧化酶进行生物素检测。采用NIH Image Scion对印迹进行数字化以检测密度。将细胞在冰上用直接结合的抗体进行染色以通过Nikon TE2000-U显微镜进行共焦成像。使用Adobe Photoshop合并各荧光团的光学切片。

[0257]肿瘤生长试验。在100μl PBS中将2 x 10⁶MDA-MB231mfp细胞或0.5 x 10⁶M24met细胞与1mg MAb-10H10，MAb-5G9或同型匹配的IgG1(TIB115)相混合并皮下注射至6周大，雌性C.B-17SCID小鼠(Taconic)。Jessani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101：13756-13761，2004；Mueller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11832-11836，1992。以测径规测量肿瘤体积并在处死动物时测定肿瘤重量。采用ANOVA建立组间差异并通过非参数Kruskal-Wallis检验测定显著水平。

[0258]此处所用的针对物理属性(如分子量)或化学属性(如化学式)的范围意在包含该范围的所有组合和亚组合以及具体实施方式。

[0259]本说明书中所引用的所有出版物，序列，专利和专利申请均以各种目的全文引用作为参考，如同将每一个单独的公开和专利申请均为特定的单独的以各种目的引用作为参考。

[0260]尽管前述发明已通过阐释目的的图示和范例进行详细描述，本领域的普通技术人员根据本发明的教导应当能够轻易理解可在不脱离附加权利要求的精神和范围的情况下对其进行一定的更改和调整。

Claims (25)

1.一种在哺乳动物对象中抑制或阻抑组织因子/VIIa因子(TF/VIIa)信号转导的方法，该方法包括向哺乳动物对象给用组织因子信号转导抑制剂，其中该抑制剂不干扰哺乳动物对象的止血。

2.如权利要求1所述的方法，其中该对象患有血管生成相关疾病，新生物疾病，或炎症。

3.如权利要求1所述的方法，其中该抑制剂不阻止凝血激活。

4.如权利要求1所述的方法，其中TF/VIIa信号转导依赖于蛋白二硫键异构酶(PDI)。

5.如权利要求1所述的方法，其中TF/VIIa信号转导通过蛋白酶激活受体2(PAR2)实现。

6.如权利要求1所述的方法，其中该抑制剂是一种抗体或小化学实体。

7.如权利要求6所述的方法，其中该抑制剂是具有ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体10H10的结合特异性的抗体或抗原结合分子。

8.如权利要求6所述的方法，其中该抑制剂为ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体10H10。

9.如权利要求1所述的方法，其中该抑制剂通过ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体10H10抑制与组织因子的结合。

10.如权利要求1所述的方法，其中该抑制剂不通过ATCC编号为HB9382的杂交瘤所产生的单克隆抗体5G9抑制与组织因子的结合。

11.一种在哺乳动物对象中治疗或改善依赖于组织因子-VIIa因子(TF/VIIa)信号转导的疾病症状的方法，其包括向对象给用治疗有效量的能抑制TF/VIIa信号转导但不干扰组织因子介导的止血活性的化合物。

12.如权利要求11所述的方法，其中该疾病是新生物疾病，血管生成相关疾病，或炎症。

13.如权利要求11所述的方法，其中该疾病是乳腺肿瘤或黑素瘤。

14.如权利要求11所述的方法，其中该止血活性为TF介导的凝血。

15.如权利要求11所述的方法，其中TF/VIIa信号转导依赖于蛋白二硫键异构酶。

16.如权利要求11所述的方法，其中TF/VIIa信号转导通过蛋白酶激活受体2(PAR2)实现。

17.如权利要求11所述的方法，其中该化合物是一种抗体或小化学实体。

18.如权利要求17所述的方法，其中该化合物是具有ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体10H10的结合特异性的抗体或抗原结合分子。

19.如权利要求17所述的方法，其中该化合物为ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体10H10。

20.一种抑制TF/VIIa信号转导但不阻断凝血的药剂的鉴定方法，该方法包括在测试化合物存在或缺失的情况下测定(i)具有ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体10H10的结合特异性的抗体或抗原结合分子，和(ii)组织因子多肽之间的结合；并检测当测试化合物存在时相对于测试化合物缺失时对所述结合的抑制，从而鉴定抑制TF/VIIa信号转导但不阻断凝血的药剂。

21.如权利要求20所述的方法，其中该抗体或抗原结合分子为ATCC编号为HB9383的杂交瘤所产生的单克隆抗体。

22.如权利要求20所述的方法，其中该测试化合物为小分子有机化合物。

23.如权利要求20所述的方法，进一步包括对经鉴定的药剂对组织因子信号转导的抑制作用进行检测。

24.如权利要求20所述的方法，进一步包括对经鉴定的药剂对组织因子介导的凝血的无作用进行检测。

25.如权利要求20所述的方法，进一步包括(i)在经鉴定药剂存在或缺失的情况下，将组织因子多肽与ATCC编号为HB9382的杂交瘤所产生的单克隆抗体5G9相接触，以及(ii)检测经鉴定药剂对ATCC编号为HB9382的杂交瘤所产生的单克隆抗体5G9与组织因子的结合的无抑制。

Images