DE69409312T2

DE69409312T2 - Herstellung und Durchmusterung von hochgradig diversen Peptidbanken hinschtlich Bindungsaktivität

Info

Publication number: DE69409312T2
Application number: DE69409312T
Authority: DE
Inventors: Eran Hadas; Vered Hornik
Original assignee: Interpharm Laboratories Ltd
Current assignee: Interpharm Laboratories Ltd
Priority date: 1993-06-22
Filing date: 1994-06-21
Publication date: 1998-10-01
Anticipated expiration: 2014-06-22
Also published as: DK0639584T3; ATE164591T1; EP0639584A1; JPH07194382A; AU678460B2; AU6487394A; CA2126359A1; DE69409312D1; EP0639584B1; IL106106A0; ZA944474B; ES2114633T3

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptidbanken (oder anderen Polymerbanken) mit hoher Dichte und zur Durchmusterung solcher Banken hinsichtlich eines Peptids mit der Fähigkeit, ausgewählte Zielmoleküle zu erkennen.
Von vielen biologischen Phänomenen ist bekannt, daß sie die Wechselwirkung von Peptiden mit einem makromolekularen Zielmolekül, wie einem Protein, einschließen. Solche Peptide umfassen das vasoaktive Intestinalpeptid, die Angiotensine und die Endotheline.
Damit eine solche Wechselwirkung eintritt, muß das Peptid durch Faltung eine Konformation einnehmen, in der es eine Oberfläche präsentiert, die zu einem entscheidenden Bereich, z.B. einer katalytischen Spalte, des Zielmoleküls komplementär ist. Obwohl kurze Peptide, die mit Proteinen oder anderen Biomolekülen in Wechselwirkung treten, in der Forschung und bei der klinischen Therapie verwendet werden (Magazine, 1991; Bischoff, 1992; Baumbach, 1992), ist die rationale Entwicklung von Peptiden schwierig, die neue Zielmoleküle binden oder deren Bindung an ein bekanntes Zielmolekül verstärkt oder spezifischer gemacht wird.
Bei Peptiden wird die Gesamtzahl der chemischen Strukturen durch die Anzahl der verschiedenen verwendeten Aminosäuren und durch die Peptidlänge bestimmt, z.B. ist es möglich, aus 20 Aminosäuren 20&sup9; verschiedene Peptide mit einer Länge von 9 Aminosäuren zu synthetisieren.
Falls man nicht rational die Peptide vorhersagen kann, die die gewünschten Bindungsaktivitäten aufweisen, ist es wünschenswert, gleichzeitig eine große Anzahl von Peptiden unterschiedlicher Sequenzen durchmustern zu können, die in einer Weise hergestellt und präsentiert werden, die die Identifizierung der Bindungspeptide erleichtert. Eine solche Auswahl von Peptiden wird als "Peptidbank" bezeichnet (Birbaum, 1992; Amato, 1992).
Ein Verfahren zur Herstellung einer Peptidbank ist die DNA-Rekombinationstechnik (Scott, 1990; Cwirla, 1990; Devun, 1990). Die Peptide werden als Teil eines Oberflächenproteins auf dem pIII-Protein der äußeren Oberfläche eines filamentösen Phagens exprimiert. Phagen, die spezifisch mit einem ausgewählten Zielmolekül reagieren, werden durch ein Panning-Verfahren selektiert und vermehrt. Dann wird die relevante DNA-Sequenz der selektierten Phagen bestimmt. Die identifizierten Peptidsequenzen werden von den identifizierten DNA-Sequenzen abgeleitet. Die Vorteile dieses Ansatzes für eine Peptidbank sind Schnelligkeit und Einfachheit. Der Hauptnachteil ist, daß die Peptidbank nur lineare (unverzweigte) Peptide enthält, die aus den 20 nativen L-Aminosäuren zusammengesetzt sind.
Ein anderer Ansatz zur Herstellung einer Peptidbank ist die chemische Synthese. Der Hauptvorteil des chemischen Ansatzes ist die Möglichkeit zur Herstellung von Peptiden, deren Zusammensetzung nicht auf die zwanzig genetisch codierten Aminosäuren begrenzt ist. Die Verwendung einer großen Anzahl von verschiedenen Aminosäuren erhöht den Grad der Diversität, die von kurzen Peptidsequenzen erhalten werden kann. Der chemische Ansatz erleichtert auch die Synthese cyclischer und verzweigter Peptide. Die Verwendung von nichtnativen Aminosäuren erlaubt neben der Erhöhung der Diversität der Bank eine bessere Steuerung der Peptideigenschafien: z.B. kann die Lipidlöslichkeit der Peptide durch die Verwendung von Sulfoxidderivaten von Methionin in einem hohen Maße gesteigert werden.
Der von Affimax (Fodor, 1991) durchgeführte Ansatz der "ansprechbaren Bank" ("addressable library approach") umfaßt die folgenden Schritte: Die Peptide werden in Quadraten so klein wie 10 x 10 um auf einem Stück Glas synthetisiert. Die in jedem Quadrat erzeugte Peptidsequenz ist auf Grund ihrer Position bekannt. Es ist möglich, eine Oberfläche von etwa 1 cm² mit 100 x 100 = 10 000 verschiedenen Peptiden zu besetzen. Die Peptide werden mit einem fluoreszierenden Liganden umgesetzt, und die gefärbten Quadrate werden unter dem Mikroskop identifiziert. Auf diese Weise ist es möglich, Peptide unmittelbar zu identifizieren, die an einen spezifischen Liganden binden. Der Hauptnachteil dieses Ansatzes ist die verhältnismäßig geringe Anzahl der Peptide, die durchmustert werden kann.
Gemäß der von Houghten (1991) vorgestellten Variante wurden Hexapeptidgemische aus 18 L-nativen Aminosäuren synthetisiert. Die Position 6 entspricht dem C-Terminus und die Position 1 entspricht dem N-Terminus. Ein vollständiges Gemisch aller 18 Aminosäuren wurde in eine jede der Positionen 3-6 eingeführt. Das Peptidgemisch wurde dann in 18 x 18 = 324 verschiedene Röhrchen aufgeteilt, und in jedem Röhrchen wurde in den Positionen 1-2 ein spezifisches Dipeptid eingeführt. Die 324 Peptidpopulationen wurden hinsichtlich Aktivität durchmustert (z.B. Inhibierung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung) und das aktivste Peptidgemisch wurde identifiziert. Anschließend wurden 18 neue Peptidgemische synthetisiert. Alle der 18 neuen Peptidgemische enthielten in den Positionen 1 und 2 das im vorhergehenden Schritt identifizierte Dipeptid. Die dritte Position eines jeden der Gemische wies eine einzelne Aminosäure auf. Die Positionen 4-6 umfaßten ein Gemisch aller 18 Aminosäuren. Die 18 Peptidgemische wurden hinsichtlich Aktivität durchmustert, und das am besten reagierende Gemisch wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Das Verfahren wurde wiederholt, bis alle 6 Positionen in dem Peptid identifiziert waren.
Vor kurzem schlug Houghten (Oral Presentation and Abstract, European Peptide Society (EPS), Symposium 92, Interlaken, Schweiz) einen anderen Ansatz vor. Ausgehend von 18 Aminosäuren wurden insgesamt 18 x 6 = 108 Peptidgemische synthetisiert. In 18 Gemischen umfaßte die Position 6 eine einzigartige Aminosäure und die Positionen 1-5 umfaßten ein Gemisch aller Aminosäuren. In weiteren 18 Gemischen umfaßte die Position 5 eine einzigartige Aminosäure und alle anderen Positionen umfaßten ein Gemisch aller 18 Aminosäuren, etc. Nach der Synthese wurden alle der 108 Peptidgemische gleichzeitig getestet, und das aktivste Gemisch von einem jeden der jede Position repräsentierenden 18 Gemische wurde identifiziert. Die gewiinschte Sequenz wurde auf diese Weise an einem einzigen Tag identifiziert.
Der Hauptnachteil der beiden Houghten-Ansätze ist die begrenzte Möglichkeit zur Einführung einer große Anzahl von verschiedenen Aminosäuren. Falls die Anzahl der verschiedenen Aminosäuren erhöht wird, wird die relative Menge jedes einzigartigen Peptids in dem Gemisch verringert, und es wird folglich schwieriger, seine Auswirkungen nachzuweisen. Houghten gleicht dies aus, indem er seine Peptidgemische bei einer Konzentration von 5 mg/ml hinsichtlich einer Aktivität testet. Es ist jedoch schwer vorstellbar Banken zu testen, die aus mehr als ungefähr 40 verschiedenen Aminosäuren hergestellt sind.
Die vorliegende Erfindung kompensiert die vorstehend erwähnten Mängel des Standes der Technik. Insbesondere erlaubt sie die Durehmusterung viel größerer Peptidbanken.
Wenn eine Peptidbank auf Kügelchen synthetisiert wird, weisen üblicherweise alle Peptidmoleküle auf einem bestimmten Kügelchen die gleiche Sequenz auf Folglich, wie vorstehend erläutert, wird die Diversität der Peptidbänk durch die Gesamtzahl der verwendeten Kügelchen begrenzt, die wiederum durch menschliche Faktoren begrenzt wird. Die hier genannten Anmelder schätzten, daß diese Grenze in der Größenordnung von 10&sup8; verschiedenen Kügelchen und daher 10&sup8; verschiedenen Peptidsequenzen liegt. Es wird angenommen, daß die Bereitstellung von Peptidsequenzen durch die Bank mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens um sieben Größenordnungen, d.h. 10¹&sup5; verschiedene Peptidsequenzen, gesteigert werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung trägt jedes Kügelchen nicht eine einzelne Peptidsequenz, sondern eine einzelne Familie von verwandten Peptidsequenzen (üblicherweise ist das Familienmerkmal ein gemeinsamer (oder gering degenerierter) aminoterminaler Teil aus einer oder mehreren Aminosäuren). Die Peptidbank wiederum umfaßt viele verschiedene Familien von Peptiden, wobei jede Familie auf einem oder mehreren Kügelchen vorkommt. Da die Peptidbank so angeordnet ist, daß das Peptidkomplement eines jeden Kügelchens eingeschränkt ist, ist die Bank "strukturiert". Diese strukturierte Bank wird dann einer Durchmusterungsrunde unterworfen.
Falls ein Kügelchen durch ein Affinitätsreagens markiert wird, zeigt es, daß ein oder mehrere Peptide in seiner Familie durch das Affinitätsreagens gebunden werden. Das Peptidgemisch auf dem Kügelchen wird dann sequenziert, um den gemeinsamen (oder gering degenerierten) aminoterminalen Teil, den familienspezifischen "Marker", zu bestimmen.
Bei der nächsten Durchmusterungsrunde wird eine Unterbank der Bank der vorherigen Runde hergestellt, in der alle Peptide den familienspezifischen Marker der erfolgreichen Familie in der letzten Bank besitzen. Jedes Kügelchen dieser neuen Bank trägt nur Peptide, die zu einer Unterfamilie der vorstehend erwähnten Familie gehören. Wenn diese Unterbank mit einem Affinitätsreagens durchmustert wird, handelt es bei den gebundenen Kügelchen um diejenigen, deren Unterfamilien ein bindendes Peptid umfassen. Das Verfahren wird dann wiederholt, wobei jede erfolgreiche Familie der Bank eines Durchmusterungszyklus in der nächsten Runde zu einer neuen Bank wird, die wiederum in Familien aufgeteilt ist. Schließlich ist die gesamte Sequenz des Bindungspeptids bekannt.
Obwohl sich die Beschreibung der Einfachheit halber auf die Synthese, Durchmusterung und Sequenzierung von Peptidbanken bezieht, kann sie mutatis mutandis auf Banken angewendet werden, die andere Heteropolymere präsentieren, deren Fähigkeit, spezifisch an ein Zielmolekül zu binden, mit ihrer spezifischen Sequenz der monomeren Einheiten in Beziehung steht. Solche Polymere umfassen Peptoide, Nucleinsäuren und Kohlenhydrate. Es sollte ferner angemerkt werden, daß der Begriff "Polymer" "Oligomere" einschließen soll.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Herstellung einer Peptidbank (oder einer anderen Polymerbank), in der eine hochgradig diverse Auswahl von Peptiden durch Festphasen-Peptidsyntheseverfahren auf Kügelchen synthetisiert und dann potentiellen Zielmolekülen präsentiert wird. Die Bank ist strukturiert, so daß jedes Kügelchen selbst eine nachweisbare Anzahl von Molekülen von im wesentlichen jeder Familie von verschiedenen, dennoch verwandten Peptiden bietet. Infolge dieses Familienverhältnisses können, nachdem ein "Kügelchen" mittels Affinitäts-Durchmusterung als "positiv" identifiziert wird, eine oder mehrere Aminosäuren des Teils der Sequenz, die alle Peptidsequenzen "gemeinsam" haben, die diesem Kügelchen entstammen, identifiziert werden. Dann wird eine neue Bank hergestellt, deren Elemente der "positiven Familie" der vorherigen Bank entsprechen. Diese Tochterbank ist wiederum in Familien strukturiert und zwar eine Familie pro Kügelchen, so daß die Durchmusterung und Sequenzierung zur Identifizierung weiterer Reste des tatsächlich gebundenen Peptids bzw. der gebundenen Peptide führt. Das Verfahren wird fortgesetzt, bis die gebundenen Peptide vollständig sequenziert wurden.
Die Anzahl der verschiedenen Peptide der Länge k, die möglicherweise aus N verschiedenen Aminosäuren synthetisiert werden, ist N . Die Anzahl der Kügelchen, die pro einzelner Bank verwendet werden kann, wird praktisch durch die Menge der Peptide begrenzt, die die Anmelder synthetisieren wollen, und von ihrer Möglichkeit zur Durchmusterung der Bank. Jeder Milliliter der beladenen Kügelchen enthält mehrere Hunderttausend bis mehrere Millionen Kügelchen. Manuell können die Anmelder eine Bank von etwa 100 ml Kügelchen durchmustern, die etwa 10&sup7; - 10&sup9; Kügelchen enthält. Falls, wie es üblich ist, jedes Kügelchen ein einzelnes Peptid tragen würde, wäre die Anzahl der Kügelchen in der Bank zur Durchmusterung hinsichtlich aller Hexapeptide ausreichend, die aus bis zu 30 verschiedenen Aminosäuren (720 x 10&sup6;) synthetisiert werden könnten. Die Durchmusterung aller Hexapeptide, die möglicherweise aus einer großen Anzahl von Aminosäuren synthetisiert werden, ist technisch schwierig oder unmöglich.
Die auf einem einzelnen Kügelchen von etwa 100 um Durchmesser vorkommende Peptidmenge kann etwa 100 pMol oder etwa 6 x 10¹³ Moleküle betragen. Diese Anzahl von Peptidmolekülen ist viel größer als die Anzahl der Moleküle, die zum Nachweis der Ligandenbindung an die Kügelchen erforderlich ist. Unter Anwendung von Enzym- oder Fluoreszenznachweisverfahren ist es möglich, die Bindung von Antikörpern mit Bindungskonstanten von etwa KA = 10&sup9; an so wenig wie 1000 Rezeptormoleküle zu überwachen, die auf der Zellmembran von Säugerzellen mit einem Durchmesser von etwa 10 um vorkommen. Der Durchmesser der zur Synthese des Peptids verwendeten Kügelchen beträgt etwa 100 um und damit ist ihr Volumen etwa (100/10) = 1000mal größer als das von Säugerzellen. Die Anmelder folgern deshalb, daß sie unter Anwendung von Enzym- oder Fluoreszenznachweisverfahren in der Lage sein sollten, die Bindung von Liganden mit KA = 10&sup9; an Kügelchen zu überwachen, die mindestens 1000 x 1000 = 10&sup6; Zielmoleküle enthalten. Da die Kügelchen etwa 6 x 10¹³ Peptidmoleküle enthalten, folgerten die Anmelder, daß sie jedes Kügelchen mit vielen Peptiden beladen können. Tatsächlich könnten sie theoretisch 6 x 10¹³/10 = 6 x 10&sup7; verschiedene Peptidmoleküle auf ein Kügelchen laden und wären noch in der Lage, die Bindung eines Liganden an einen einzelnen Peptidtyp nachzuweisen.
Sobald ein bestimmtes Kügelchen identifiziert wird, daß es ein Peptid von Interesse enthält, muß die Peptidstruktur bestimmt werden. Dies wird mittels N-terminaler Sequenzierung erreicht (Edman-Abbau). Das Verfahren wird routinemäßig mit einer automatischen Vorrichtung durchgeführt. Nach dem Abbau wird die so erhaltene PTH-Aminosaure mittels Umkehrphasen-Chromatographie analysiert. Vorrichtungen gemäß dem Stand der Technik können die Sequenz von etwa 10 pMol Peptid analysieren. Folglich sind die auf jedem Kügelchen nachgewiesenen 100 pMol Peptid eine zur Sequenzierung ausreichende Menge. Im Vergleich zum immunologischen Färbeverfahren ist der Sequenzierungsschritt jedoch verhältnismäßig unempfindlich. Folglich, selbst wenn die Anmelder auf jedem Kügelchen über 10&sup7; verschiedene Peptide synthetisieren könnten und noch in der Lage wären, Kügelchen basierend auf der Wechselwirkung des Liganden mit den Peptiden auf den Kügelchen unter Verwendung gegenwärtiger Vorrichtungen auszuwählen, wären sie nicht in der Lage, die Sequenzinformation abzufragen. Tatsächlich, auch wenn die Anmelder nur 20 verschiedene Peptide auf einem einzelnen Kügelchen synthetisierten, würde die durch jeden Edman-Abbauschritt erhaltene Menge an Aminosäure nur 100/20 = 5 pMol betragen, was zu gering ist, um die genau Analyse der Sequenz zu erlauben.
Die hier genannten Anmelder schlagen vor, daß es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich ist, das Problem der Aufklärung der Struktur eines aktiven Peptids in einer Bank, die viele Peptide pro Kügelchen ausprägt, in einer iterativen Weise anzugehen. Gemäß der Strategie der Anmelder ist jeder Wiederholungsschritt derart ausgestaltet, daß er die Identifizierung des gewünschten Kügelchens mittels der Wechselwirkung mit einem oder mehreren der auf dem Kügelchen offenbarten Peptide erlaubt und gleichzeitig zumindest die teilweise Bestimmung der Identität einer oder mehrerer Aminosäuren des Peptids ermöglicht. Mehrere Wiederholungen sind erforderlich, um die vollständige Aufklärung der gewünschten Struktur zu erlauben.

Zielmolekül

Der Zweck der Herstellung einer Peptidbank ist die Identifizierung von Peptiden, die an ein Zielmolekül von Interesse binden. Das Zielmolekül kann ein beliebiger Substanztyp sein. Es kann anorganisch oder organisch; kristallin oder amorph; mikromolekular oder makromolekular; natürlich vorkommend oder synthetisch sein. Übliche Zielmoleküle umfassen Proteine (einschließlich Enzyme, Hormone und Rezeptoren), Kohlenhydrate und Lipide. Geeignete Zielmoleküle umfassen den menschlichen Tumomekrosefaktor (oder seine p55- und p75-Rezeptoren) und Interleukin 6, seinen Zelloberflächenrezeptor, den IL-6- Rezeptor-Komplex und seinen Transducer gp130.
Die neuen Bindungsmoleküle, die aus Peptidbanken (oder anderen Polymerbanken) erhalten werden können, umfassen die folgenden (die in Kursivschrift angeführten Kategorien schließen sich nicht gegenseitig aus):
Moleküle, die die Zell-Zell- oder Zell-Substrat-Erkennung inhibieren. Mögliche Anwendungen können sein: die Inhibierung der Tumormetastasenbildung und die Inhibierung der Thrombocytenaggregation. Die Zelloberfläche enthält Gruppen von Molekülen, die die Bindung einer Zelle an eine andere oder von Zellen an extrazelluläre Matrixkomponenten vermitteln. Diese Moleküle sind z.B. Integrine. Vgl. Ferguson, T.A., Mizutani H. und Kupper T.S., "Two Integrin-Binding Peptides Abrogate T Cell-Mediated Immune Responses in Vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 8072-8076; Skubitz A.P.N., Letourneau P.D., Wayner E. und Furcht L.T., "Synthetic Peptides from the Carboxy-Terminal Globular Domain of the A Chain of Laminin: Their Ability to Promote Cell Adhesion and Neunte Outgrowth, and Interact With Heparin and the b1 Integrin Subunit", J. Cell Biol. 115 (1991), 1137-1148; Hynes R.O., "Integrines: Versatility, Modulation, and Signaling in Cell Adhesion", Cell 69 (1992), 11-25.
Peptide, die in der Lage sind, die durch Integrine vermittelten Zellaktivitäten zu inhibieren, könnten wie folgt nachgewiesen werden: Ein Integrin würde doniert. Das rekombinante Protein würde hergestellt und gereinigt. Die gereinigten Proteine würden mit Biotin markiert und zur Durchmusterung der Bank verwendet. Mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Avidin würde zum Färben der Kügelchen verwendet, die die biotinylierten Proteine binden. Nach der Identifizierung der Peptide, die an die Proteine binden, würden die Peptide in löslicher Form synthetisiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die gewünschte biologische Aktivität zu modifizieren, z.B. wie in den angeführten Veröffentlichungen beschrieben ist.
Inhibitoren der Virusanlagerung an Zelloberflächenrezeptoren, z.B. Moleküle, die die Aktivität des löslichen CD4 nachahmen. Die membrangebundene Form von CD4 dient als Rezeptor für HIV1. Der Nachweis von Peptiden, die in der Lage sind, die Bindung von Viren an Zellen zu inhibieren, könnte durch eines von zwei Verfahren durchgeführt werden. Bei einem Ansatz könnten die Anmelder vollständige Virione verwenden. Die Bindung der Virione an die Kügelchen könnte durch Verwendung von für den Virus spezifischen Antikörpern überwacht werden. Wenn die Struktur des Peptids, das an das Virus bindet, bekannt ist, könnte es in einer löslichen Form synthetisiert und in Virus-Hemmtests direkt getestet werden. Bei einem zweiten Ansatz könnten Virusproteine, von denen bekannt ist, daß sie die Bindung des Virus an die Zelle vermitteln, doniert, exprimiert und gereinigt und verwendet werden, wie vorstehend für Abschnitt 1 beschrieben ist.
Inhibitoren der virusspezzfischen Enzymaktivitäten.
- Inhibierung der viralen Proteaseaktivität.
- Bindung an die virale reverse Transkriptase und Inhibierung deren Aktivität.
Bakterizide oder bakteriostatische Moleküle:
- Moleküle, die in Bakterienmembranen ein Loch erzeugen.
- Moleküle, die die bakterielle Proteinsynthesemaschinerie durch Wechselwirkung mit den bakteriellen Ribosomen blockieren. Der Durchmusterungsansatz wäre die Untersuchung der Bindung der gereinigten bakteriellen Ribosomen (oder Polyribosomen) oder eines anderen Proteins, das bei der Synthese von Polypeptiden beteiligt ist (z.B. Enzyme), an die Kügelchen und später das Testen der Aktivität der synthetisierten löslichen Peptide hinsichtlich der Inhibierung der Ribosomenaktivität.
- Moleküle, die den bakteriellen Zellwandaufbau beeinträchtigen. In diesem Fall wurden die Anmelder hinsichtlich Kügelchen, enthaltend Peptide, die mindestens an eines der bei der Zellwandsynthese beteiligten Enzyme binden, durchmustern. Später würden die identifizierten Peptide in löslicher Form synthetisiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die Enzymaktivität und folglich die Zellwandsynthese zu inhibieren.
- Moleküle, die die Adsorption der Bakterien an spezifische Zielmoleküle inhibieren. In diesem Fall würden die Anmelder nach Kügelchen suchen, die Peptide enthalten, die ganze Bakterienzellen oder, stärker bevorzugt, donierte und gereinigte Bakterienzellen binden, von denen bekannt ist, daß sie bei der Erkennung von bakteriellen Zielmolekülen beteiligt sind. In einem zweiten Schritt würden die identifizierten Peptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die Bindung der Bakterien an das Zielmolekül zu inhibieren.
- Moleküle, die die bakterielle DNA-Synthese stören. Die Anmelder werden nach Peptiden suchen, die an ein doniertes und gereinigtes Enzym binden, das bei der DNA-Synthese oder bei der Produktion von DNA-Vorläufern beteiligt ist.
Inhibitoren von bakteriellen Exo- und Endotoxinen. Der Ansatz würde das Ausfindigmachen von Peptiden, die an das Toxin binden, und später das Testen der Fähigkeit des identifizierten Peptids, die toxische Aktivität zu inhibieren, einschließen.
Moleküle mit enzymatischer Aktivität. Die Anmelder könnten hinsichtlich solcher Peptide mit einem kolorimetrischen (farberzeugenden) Test für das Enzym durchmustem, bei dem das Endprodukt der Reaktion unlöslich wäre, wobei die Kügelchen gefärbt würden. Beispielsweise könnte die Reduktion von NAD zu NADH durch Bindung eines Enzyms das in der Lage ist, das reduzierte NADH zu verwenden, um ein Tetrazoliumsalz zu unlöslichem gefärbtem Formazan zu reduzieren, an die Kügelchen überwacht werden. Der Nachweis anderer Reaktionstypen kann die Kopplung mehrerer enzymatischer Reaktionen erforderlich machen, bis das gewünschte Farbprodukt erhalten wird. Vgl. Tawfik D.S., Green B.S., Cap R., Sela M. und Eshhar Z., "catELISA: A Facile General Route to Catalytic Antibodies", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 373-377.
Inhibitoren der enzymatischen Aktivität, z.B. von proteolytischen Enzymen. Die Anmelder werden zuerst nach Peptiden suchen, die in der Lage sind, an das Enzym der Wahl zu binden. Die Peptide würden dann in einer löslichen Form synthetisiert und ihre Fähigkeit bestimmt, die enzymatische Aktivität zu modifizieren.
Moleküle, die die eniymatische Aktivität in einer allosterischen Weisen inhibieren.
Moleküle, die DNA an spezifischen Sequenzen oder Stellen binden und die Transkription inhibieren. Zur Durchmusterung könnten die Kügelchen durch mit Biotin oder einem Enzym markierten spezifischen DNA-Segmenten gefärbt werden. In einem zweiten Schritt könnten lösliche Peptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet werden, die Transkription zu modifizieren. Die Bindung an einer spezifische Stelle kann die Bindung an Schleifen, Haarnadeln oder anderen Strukturen anzeigen.
Moleküle, die die Wechselwirkung von Proteinen mit Nucleinsäuren durch die Wechselwirkung mit den Proteinen stören. Die Durchmusterung hinsichtlich der Fähigkeit der Peptide, die Wechselwirkung des Proteins mit DNA oder RNA zu stören, könnte in einem zweiten Schritt durchgeführt werden, nachdem das Peptid identifiziert ist, das zur Bindung an das Protein in der Lage ist.
Moleküle, die als Adjuvanzien in Impfstoffen dienen. Solche Strukturen können allein oder als Teile von Konstrukten verwendet werden, die sowohl das Antigen als auch das Adjuvans in einem einzigen Molekül aufweisen.
Moleküle, die als Impfstoffe dienen, d.h. Moleküle, die antigene Epitope von natürlichen Antigenen nachahmen. Der gegenwärtige Ansatz zur Herstellung von Peptid-Impfstoffen umfaßt die Herstellung von Peptiden, die B- und T-Zell-Determinanten des antigenen Proteins enthalten. Die bevorzugte T-Zell-Determinante bzw. die bevorzugten T-Zell-Determinanten sind nicht festgelegt (mit vielen MHC-Isotypen reaktionsfähig), um die Erzeugung einer Immunantwort in einem so großen Anteil der Population wie möglich zuzulassen. Die Schwierigkeit besteht darin, daß die die antigenen Hauptdeterminanten darstellenden Peptide nicht notwendigerweise immunogen sind, wenn sie aus dem Protein entfernt werden. Die Anmelder würden gegen das Antigen gebildete Antikörper als Zielmoleküle verwenden, um Peptide zu identifizieren, die zur Bindung an die Antikörper in der Lage sind. Diese ausgewählten Proteine würden die immunogene Struktur des antigenen Proteins nachahmen. So erlaubt der Ansatz die Herstellung von Impfstoffen aus Teilen des Proteins, die immunogen sind, wenn das Protein intakt ist, jedoch nicht in isolierter Form. In einem zweiten Schritt würden die Anmelder die identifizierten Peptide an eine T-Zell-Determinante koppeln und ihre Fähigkeit, als Immunogene zu dienen, testen.
Moleküle, die mit dem T-Zell-Rezeptor in Wechselwirkung treten und zur Induktion der T-Zell-Suppression dienen. Peptide, die an den T-Zell-Rezeptor binden, könnten an die aktive Stelle (Erkennungsstelle) oder außerhalb davon an einen anderen Teil oder an andere Teile der Rezeptor-Polypeptidketten binden. Eine erste Durchmusterung könnte hinsichtlich Peptiden erfolgen, die an den gereinigten Rezeptor binden. Eine zweite Durchmusterung könnte überprüfen, ob das gebundene Peptid die Fähigkeit aufweist, einen spezifischen T-Clon zu aktivieren (Antigen-Nachahmung), viele T-Zelltypen zu aktivieren (Superantigen- Nachahmung) oder die Aktivierung der T-Zellen durch bekannte T-Zell-Determinanten zu inhibieren. Vgl. Drake D.G. und Kotzin B.L., "Superantigens: Biology, Immunology, and Potential Role in Disease", Journal of Clinical Immunology 12 (1992), 149-162; Esser U. und Parham P., "Superantigens: Playing Upon Both Sides", Nature 359 (1992), 19-20.
Moleküle, die die Antigen-Präsentation anderer Moleküle durch die Wechselwirkung mit Oberflächenrezeptoren auf den das Antigen präsentierenden Zellen (APCs) stören. Gegenwärtig wird angenommen, daß Proteinantigene einer Spaltung in kleinere Peptide in den APCs unterworfen sind. Diese prozessierten Peptide binden an MHC-Moleküle (Haupt- Histokompabilitätsantigenmoleküle) auf der Zelloberfläche und werden auf diese Weise von den T-Zellen präsentiert. Einige Typen der MHC-Moleküle binden das Peptid während ihrer eigenen Synthese und wandern mit den gebundenen Peptiden zur Zelloberfläche. Um mit diesem Mechanismus zu konkurrieren, würden die Anmelder ein inhibitorisches Peptid benötigen, das in die Zellen eindringt und zu der spezifische Stelle vordringt, wo die "Beladung" des MHC-Moleküls mit Peptiden erfolgt.
Andere Typen von MHC-Molekülen binden das Peptid extrazellulär. Die Bindung dieser Peptide könnte im Blutkreislauf durch Peptide kompetitiv gehemmt werden. Das gegenwärtige Dogma besagt, daß die Bindung des Peptids an das MHC-Molekül über zwei oder mehrere verankernde Reste (Stellen) des Peptids (z.B. der zweite Rest vom Amino- Terminus und dem freien Carboxy-Terminus) an spezifische Stellen in dem MHC-Molekül erfolgt. Theoretisch könnten die Anmelder stärker bindende Peptide konstruieren, die die Bindung der natürlichen Peptide verhindern würden. Diese Anwendung würde vorwiegend die Kontrolle von Autoimmunkrankheiten betreffen.
Moleküle, die die Immunogenität anderer Moleküle durch ein Hinleiten zu Antigenpräsentierenden Zellen steigern. Viele Peptidepitope sind keine guten Immunogene, da sie nicht an MHC-Moleküle binden können und folglich nicht "präsentierbar" sind. Es ist möglich daß, falls solche Peptide an Peptid-Mimetika gekoppelt würden, die an MHC-Moleküle binden würden, die Zielpeptide immunogener würden. Der Bank-Ansatz kann zum Nachweis von Peptiden verwendet werden, die an die verschiedenen MHC-Isotypen binden. Wie vorstehend angegeben, binden MHC-Moleküle Peptide über "verankernde" Reste/Stellen. Die Anmelder könnten Peptid-Mimetika nachweisen, die an das MHC-Molekül über nicht übliche Strukturen/Stellen binden, die im Vergleich zu reinen Peptiden wirksamer wären.
Moleküle, die die IgE-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp inhibieren. indem sie die Besetzung des Fc&epsi;-Rezeptors durch spezifische IgE-Antikörper verhindem. Während der Durchmusterung würden die Anmelder nach Peptiden suchen, die zur Bindung an den Fc&epsi;-Rezeptor in der Lage sind. Dieser Rezeptor ist für die Bindung des IgE verantwortlich. Wenn das IgE, das durch den Rezeptor gebunden ist, das Antigen blockiert, wird die den Rezeptor tragende Zelle aktiviert. Die Aktivierung einer solchen Zelle ist das Hauptelement bei der Überempfindlichkeit vom Soforttyp, die auch als allergische Reaktion bekannt ist. Wenn die Anmelder verhindern könnten, daß die Zellen das IgE binden, könnten sie die Aktivierung der Zellen durch das Antigen aufheben und auf diese Weise der allergischen Reaktion vorbeugen. In einem ersten Schritt könnten die Anmelder die Bank dazu verwenden, um nach an den Fc&epsi;-Rezeptor gebundenen Peptiden zu suchen. In einem zweiten Schritt würden die Anmelder die Fähigkeit der identifizierten Peptide testen, die Bindung des IgE an den Rezeptor zu blockieren. Die Hauptanwendung solcher Peptide wäre die Vorbeugung vor allergischen Reaktionen.
Moleküle, die die Bindung von Komplementkomponenten an Immunkomplexe inhibieren, wodurch die Komplementaktivierung inhibiert wird. Die Anmelder können die Bank hinsichtlich Peptiden durchmustern, die an ein Immunglobulin binden, das bei der Bildung der Immunkomplexe beteiligt ist. Der Fc-Anteil dieser Immunglobuline ist im Vergleich zum Fc-Rezeptor von freiem Immunglobulin in seiner Konformation modifiziert. Nur der Fc- Anteil von Immunglobulinen, die bei der Immunkomplexbildung beteiligt sind, ist zur Aktivierung des Komplements in der Lage. Die Anmelder könnten die Bank hinsichtlich Peptiden durchmustem, die an den Fc-Anteil von Immunglobulinen in einem Immunkomplex binden. In einem zweiten Schritt könnten die Anmelder die identifizierten Peptide in einer löslichen Form auf ihre Fähigkeit testen, die Komplementaktivierung zu inhibieren.
Moleküle, die an lösliche Immunkomplexe binden und ihre Anreicherung in der Niere verhindern. Immunkomplexe neigen dazu, sich in der Basalmembran der Niere anzureichem. Die unspezifische Aktivierung des Komplements an dieser Stelle kann eventuell Nierenversagen verursachen. Einige der Peptide, die an die Immunkomplexe binden (über den Fc-Anteil der beteiligten Immunglobuline), können die spezifische Bindung der Immunkomplexe an die Basalmembranen inhibieren. Alternativ können Peptide identifiziert werden, die die Aktivierung des Komplements durch den Immunkomplex verhindern, indem sie der Bindung der Komplementkomponente C3 an den Immunkomplex vorbeugen.
Moleküle, die als Zielantigene oder Pseudo-Antikörper in Immuntests dienen. Peptide können Antigene oder Antikörper ersetzen. Der Austausch antigener Reagenzien, die in Immunotests auf das Vorhandensein von verwandten Antikörpern im Serum verwendet werden (z.B. Bestimmung von Antikörpern gegen das AIDS-Virus), durch ein Peptid könnte die Spezifität verbessern. Gegenwartig neigen viele derartige Tests dazu, falsch positive Peptide zu erhalten, die weiter ausgewertet werden müssen, um sicherzustellen, daß sie wirklich positiv sind. Einige Leute versuchten, von dem Virus stammende Peptide zu verwenden. Dieser Ansatz führte zu spezifischeren Tests. Unter Verwendung bzw. Anwendung von Peptid- Mimetika und des Bank-Ansatzes wäre es möglich die Spezifität weiter einzuengen.
Die mit der Verwendung von Antikörpern in Immunotests verbundenen Schwierigkeiten sind zahlreich: (1) Instabilität des Antikörperproteins. (2) Veränderungen hinsichtlich der Spezifität der Antikörper von Charge zu Charge und nach Lagerung. (3) Schwierigkeiten bei der Markierung mit einem Tracer. (4) Hoher Preis. (5) Schwierigkeiten bei der Desinfektion, z.B. bei der Herstellung der Sonden. (6) Denaturierung nach wiederholter Elution des Analyten. (7) Schwierigkeiten bei der Immobilisierung an einen festen Träger. (8) Die Bivalenz der Antikörper ist zuweilen nachteilig.
Der Autausch der Antikörper gegen Peptide könnte einige der vorstehenden Schwierigkeiten überkommen. (1) Im Vergleich zu dem Antikörper weist das Peptid keine "Konformation" auf, die zerstört werden kann (was ein inaktives Protein zur Folge hat). (2) Die Kontinuität des Peptids von Charge zu Charge ist verglichen mit Antikörpern viel einfacher zu kontrollieren. (3) Der Tracer kann zusammen mit dem bindenden Teil des Peptids synthetisiert werden. (4) Der Preis synthetischer Peptide ist üblicherweise geringer als der von Antikörpern. (5) Die Peptide sind gegenüber einer hohen Konzentration von organischem Lösungsmittel stabil, das bei der Desinfektion verwendet werden kann. Dieses Lösungsmittel würde Antikörper zerstören. (6) Da die Peptide keine "festgelegte" Konformation aulweisen, würden sie bei längerem Gebrauch nicht zerstört. (7) Das Peptid muß nicht immobilisiert werden. Es kann an vielen Typen von Trägern in situ synthetisiert werden. (8) Das Peptid kann gegebenenfalls mono-, bi- oder polyvalent sein.
Inhibierung der Wanderung von Immunzellen durch Moleküle, die an die für die Chemotaris verantwortlichen Zelloberflächenrezeptoren binden oder sie blockieren. Einige der Moleküle, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, steuern die Fähigkeit der Zellen, auf Reize zu antworten. Diese Zelloberflächenrezeptoren steuern neben anderen Phänomenen auch die Chemotaxis. Diese Moleküle müssen identifiziert, cloniert und gereinigt werden. Nach der Reinigung könnten die Moleküle zur Selektion von Peptiden verwendet werden, die an sie binden würden. Einige der Peptide könnten die Fähigkeit aufweisen, spezifisch den Rezeptor zu blockieren und so die Fähigkeit der Zellen aufzuheben, auf spezifische Reize zu antworten. Solche Peptide könnten z.B. bei der Vorbeugung vor einer Entzündung oder der Vorbeugung vor einer Transplantatabstoßung verwendet werden.
Inhibierung der cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) -Funktion durch Moleküle, die die Bindung der CTLs an die Zielzelle stören. Der erste Schritt bei der Lyse der Zielzellen durch CTLs ist die Bindung des CTL-Rezeptors ah einen spezifischen Rezeptor auf den Zielzellen. Clonierte und gereinigte Polypeptidketten des CTL-Rezeptors könnten zur Durchmusterung einer Peptidbank hinsichtlich Peptiden, die an den Rezeptor binden, verwendet werden. Es wird erwartet, daß einige der ausgewählten Peptide in der Lage sind, die Fähigkeit der CTLs an ihre Zielmoleküle zu binden, zu inhibieren. Peptide, die an der Antigen-Bindungsstelle binden, würden die Aktivität spezifischer CTL-Clone inhibieren. Es können jedoch Peptide identifiziert werden, die außerhalb der aktiven Stelle binden, aber noch die Fähigkeit des Rezeptors inhibieren, an sein Zielmolekül zu binden. Solche Peptide könnten z.B. Inhibitoren von Autoimmunantworten sein.
Moleküle, die vorübergehend die Vermehrung von Stammzellen inhibieren. Diese Moleküle können verwendet werden, um die Schädigung der Stammzellen während einer Chemotherapie auf ein Minimum zu verringern.
Moleküle, die sowohl mit Tumorzellen als auch mit cytotoxischen T-Lymphocyten (CTLs) in Wechselwirkung treten, wobei die CTLs in Tumore geleitet werden und die Abtötung der Tumorzellen verbessert wird. Der erste Schritt beim Angriff der CTLs auf Tumorzellen ist die Bindung der CTLs an Tumorzellen. Die Bindung wird durch spezifische Zelloberflächenrezeptoren vermittelt, die auf den CTLs vorkommen. Der CTL-Rezeptor bindet an auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimierten Tumorantigenen. Jüngste Ergebnisse zeigten, daß es möglich ist, eine spezifische lytische Aktivität zu induzieren, auch wenn die CTLs an die Tumorzelle über ein Brückenmolekül binden, z.B. einen bifunktionellens Antikörper, der den CTL-Rezeptor und das Tumorantigen erkennt. Eine ähnliche Aktivität kann durch Peptide mit zwei Stellen vermittelt werden: eine Stelle, die an ein Tumorzellen-Oberflächenantigen binden würde, und eine andere, die an den CTL-Rezeptor binden würde. Die Durchmusterung einer Peptidbank nach Peptiden, die zur Bindung an jede der Strukturen in der Lage sind, könnte wie beschrieben durchgeführt werden. Nachdem solche Peptide identifiziert sind, würden sie in Form einer einzelnen Polypeptidkette synthetisiert oder anderweitig chemisch konjugiert und auf ihre Fähigkeit getestet, die spezifische Lyse der Tumorzielzellen zu induzieren.
Moleküle, die die Aktivität angiogener Faktoren oder ihrer Rezeptoren beeinflussen und inhibieren. Diese Moleküle werden zur Inhibierung der angiogenen Aktivität von Tumoren verwendet. Der Ansatz würde zu dem Nachweis von Peptiden ähnlich sein, die an andere Cytokine binden und sie inhibieren.
Moleküle, die die Vermehrung von Tumorzellen inhibieren. Es können Peptide entdeckt werden, die die Aktivität der Enzyme inhibieren, die bei der DNA-Synthese oder der Synthese von einem der Vorläufer beteiligt sind. Die Durchmusterung hinsichtlich solcher Peptide basiert auf der Durchmusterung hinsichtlich Peptiden, die an das gewünschte Enzym binden und seine Aktivität inhibieren. Die Spezifität gegenüber Tumorzellen kann durch ein anderes Peptid vermittelt werden, das an ein Zelloberflächenmolekül binden würde, das nach der Bindung der Peptide internalisiert wird, wobei auf diese Weise wird dem Enzym-Inhibitorpeptid ermöglicht würde, spezifisch in die Tumorzellen einzudringen. Ein solcher Ansatz wird gegenwärtig unter Verwendung von natürlichen toxischen Peptiden untersucht, die an Antikörperfragmente konjugiert sind. vgl. z.B. Better M., Bernhard S.L., Lei S.P., Fishwild D.M., Lane J.A., Carroll S.F. und Horwitz A.H., "Potent Anti-DC5 Ricin A Cain Immunoconjugates for Bacterially Produced Fab' and F(ab")&sub2;", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 457-461.
Moleküle, die die Passage durch die Zellmembran oder die Membran endosomaler Vesikel ermöglichen.
- Enzyminhibitoren;
- Antisense-Polynucleotide oder PNAs.
Moleküle, die die Passage durch die Blut-Hirn-Schranke ermöglichen.
Moleküle, die funktionelle Gruppen in Tumore durch die Bindung an Zellkomponenten leiten. Die funktionellen Gruppen können die folgenden einschließen:
- Toxine;
- Radionuklide: zur Abbildung und Therapie;
- Neutronen-Abfangmittel; und
- Enzyme: z.B. Glucoseoxidase.
Moleküle, die eine erhöhte Passage durch die Haut, die oberen Atemwege oder die Lungen erlauben.
Sortierung von Zellen nach ihrer Oberflächenmarkierung mittels Fluoreszenz oder magnetische Sortierung, z.B. Entfernung von Tumorzellen aus Knochenmarkzellen in vitro. Ähnlich wie Antikörper, können Peptide als spezifische Marker für Zellen verwendet werden. Die Verwendung von markierten Peptiden würde die Analyse und Sortierung der gewünschten Zellen erlauben.
Inhibitoren der Embryoempflanzung oder -entwicklung.
Moleküle, die sich zur Affinitötsreinigung anderer Moleküle verwenden lassen. Ein gebräuchliches Verfahren zur Reinigung von rekombinanten (und nativen) Proteinen ist die Affinitätschromatographie. Die Affinitätsliganden sind üblicherweise mimetische Farbstoffe und zuweilen auch monoclonale Antikörper. Es könnten Peptide ausgewählt werden, die spezifisch an ein Zielmolekül der Wahl binden und auf diese Weise seine Reinigung mittels Affinitätschromatographie erlauben. Sie könnten eine Kombination der Spezifität von Antikörpern, gekoppelt mit der Einfachheit der Verwendung mimetischer Farbstoffsäulen erlauben, z.B. die Depyrogenisierung mit 1 N NaOH.
Enzymatische Katalyse. Bei einigen Verfahren (z.B. Immunotest) ist es erforderlich, Proteine oder andere Moleküle an Oberflächen zu immobilisieren. Für eine solche Immobilisierung könnten Peptide verwendet werden, die den gewünschten Liganden binden. Die Immobilisierung von Zellen (Anhaftung von Zellen an peptidhaltige Oberflächen) ist ein spezifisches Beispiel, das bereits dargelegt wurde. Vgl. Fernandez M.C., Mullenix M.S., Christner R.B. und Mortensen R.F., "A Cell Attachment Peptide from Human C-Reactive Protein", J. Cell Biochem. 50 (1992), 83-92; Chen Y.-C.J., Danon T., Sastry L., Mubaraki M., Janda K.D. und Lerner R.A., "Catalytic Antibodies from Combinatorial Libraries", J. Amer. Chem. Soc. 115 (1993), 357-358; und Lesley S.A., Patten P.A. und Schultz P.G., "A Genetic Approach to the Generation of Antibodies with Enhanced Catalytic Activities", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 1160-1165.
Moleküle, die sich als Zusätze für die Säugergewebekultur verwenden lassen. Vor kurzem wurde festgestellt, daß einige Proteine verwendet werden können, um das Serum bei der Vermehrung von Säugerzellen in der Gewebekultur zu ersetzen. Unter den Proteinen sind Insulin und einige Wachstumsfaktoren. Wenn die Rezeptoren dieser Proteine bekannt sind, könnten Peptide aus der Bank ausgewählt werden, die an den Rezeptor binden würden, z.B. den Insulinrezeptor. Die Fähigkeit des Peptids, den Rezeptor zu aktivieren und auf diese Weise die Proteine zu ersetzen, könnte in einem zweiten Schritt getestet werden.
Die Vorteile für die Verwendung von Peptiden sind sowohl ökonomischer (die Peptide sind billiger als Proteine) als auch regulatorischer Art (es ist grundsätzlich sicherer, ein Peptid anstelle von Proteinen beliebiger Herkunft, sei sie natürlich oder rekombinant, zu verwenden).
Moleküle, die Antagonisten (teilweise oder vollständige) von Liganden (Hormone, Cytokine, Neurotransmitter, Toxine, etc.) sind (Anmerkung: Der Begriff "teilweiser Antagonist" bedeutet, daß nur einige der biologischen Aktivitäten des Liganden inhibiert werden, während andere Aktivitäten nicht beeinträchtigt werden). Die Aktivität wird durch die Wechselwirkung mit einem der folgenden Mgleküle vermittelt:
- Ligand (Hormon, Cytokin, Neurotransmitter, Steroid, Leukotriene, Releasing-Faktor, etc.): Verhinderung der Wechselwirkung des Liganden mit dem Rezeptor.
- Rezeptor: Bindung an den Rezeptor und dadurch Verhinderung der Wechselwirkung von Rezeptor mit dem Liganden oder mit signalumwandelnden Molekülen.
- Signalumwandelnde(s) Molekül bzw. Moleküle: Verhinderung der Aktivierung des Moleküls durch den Rezeptor oder Verhinderung der Signalumwandlung durch Verhinderung der Aktivierung des signalumwandelnden Moleküls.
Im Hinblick auf Agonisten (vollständige oder teilweise) oder Antagonisten (vollständige oder teilweise) natürlicher Peptide können die folgenden Peptide Zielmoleküle sein:
Angiotensin (Typ I und II), Biberotoxin; Endothelin; Sarafotoxin; Bombesin; Calcitonin; Calpain; Cholescystokinine; Cecropin; Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH); Defensin; Galanin; Gelsolin; Glucagon; GnRH - Gonadotropin-Releasing-Hormon; Leupeptin; MSH - α-Melanotropin; NPY - Neuropeptid Y; Peptid-Leukotriene; Somatostatin; Substanz P; Tachykinin; Vasopressin; VIP; und die Opiatfamilie. Natürliche Peptide sind für die Verwendung als Wirkstoffe nicht geeignet. Sie sind verhältnismäßig instabil, sind schwierig freizusetzen, neigen zu kurzen Halbwertszeiten im Blutkreislauf und weisen zuweilen nicht die gewünschte Spezifität auf. Es könnten Peptid-Mimetika ausgewählt werden, die an die Rezeptoren der natürlichen Peptide binden und ihre biologischen Aktivitäten nachanmen oder ihnen entgegenwirken. Da die Bank wahrscheinlich mehrere mögliche Leitstrukturen liefern würde, ist es möglich, daß einige von ihnen im Vergleich zu dem ursprünglichen nativen Peptid für die Verwendung als Wirkstoffe geeigneter sind.

Affinitätsreagens

Peptide, die an ein Zielmolekül von Interesse binden, werden durch ihre Bindung an ein Affinitätsreagens identifiziert. Ein Affinitätsreagens ist ein chemisches Teilchen, dessen Bindungseigenschaften zu denjenigen des Zielmoleküls von Interesse ähnlich sind, und dessen Bindung an ein Peptid (oder an ein anderes Reagens, das an das Peptid gebunden ist) eine nachweisbare physikalische oder chemische Veränderung hervorruft. Üblicheiweise ist das Affinitätsreagens ein Zielmolekül (oder ein Analogon hiervon), das an einen Marker konjugiert ist, wie ein Radioisotop, eine fluoreszierende Gruppe, ein Kolorophor, ein Enzym, ein Enzymsubstrat oder eine elektronendicbte Einheit. Der Marker kann direkt beobachtbar sein oder er kann nur auf Grund eines weiteren Verarbeitungsschrittes nachweisbar sein. Zum Beispiel kann ein biotinyliertes Zielmolekül an das Peptid gebunden werden, dann wird ein enzymmarkiertes Avidinmolekül an den Biotin-Marker gebunden und schließlich wird das Enzym mit einem Substrat beliefert, wobei das Enzymprodukt eine charakteristische Farbe aufweist. Die bevorzugten Reagenzien weisen Fluoreszenz- oder Enzymmarker auf. Falls der Marker fluoreszierend ist, handelt es sich vorzugsweise um Rhodamin. Falls der Marker ein Enzym ist, wird alkalische Phosphatase bevorzugt.

Aminosäuren und Peptide

Aminosäuren sind die Grundbausteine, aus denen Peptide und Proteine aufgebaut sind. Aminosäuren besitzen sowohl eine Aminogruppe (-NH&sub2;) als auch eine Carbonsäuregruppe (-COOH). Viele Aminosäuren, aber nicht alle, weisen die Struktur NH&sub2;-CHR-COOH auf, in der R ein Wasserstoffatom oder eine beliebige einer Vielzahl von funktionellen Gruppen ist.
Zwanzig Aminosäuren werden genetisch codiert: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin. Von diesen sind alle mit Ausnahme von Glycin optisch isomer, wobei jedoch nur die L-Form beim Menschen vorkommt. Trotzdem haben die D-Formen dieser Aminosäuren eine biologische Signifikanz, D-Phe ist zum Beispiel als Schmerzmittel bekannt.
Viele andere Aminosäuren sind ebenfalls bekannt, einschließlich: 2-Aminoadipinsäure, 3-Aminoadipinsäure, beta-Aminopropionsäure, 2-Aminobuttersäure, 4-Aminobuttersäure (Piperidinsäure), 6-Aminocapronsäure, 2-Aminoheptansäure, 2-Aminoisobuttersäure, 3-Aminoisobuttersäure, 2-Aminopimelinsäure, 2,4-Diaminobuttersäure, Desmosin, 2,2'-Diaminopimelinsäure, 2,3-Diaminopropionsäure, N-Ethylglycin, N-Ethylasparagin, Hydroxylysin, Allo-Hydroxylysin, 3-Hydroxyprolin, 4-Hydroxyprolin, Isodesmosin, Allo-Isoleucin, N-Methylglycin (Sarcosin), N-Methylisoleucin, N-Methylvalin, Norvalin, Norleucin und Omithin.
Es wurde festgestellt, daß es zur größeren Vereinfachung der Bezugnahme günstig ist, jeder der in den hier offenbarten Banken verwendeten Aminosäuren eine ID-Nummer zuzuweisen. Diese ID-Nummern erscheinen in Tabelle 101.
Die Peptide werden durch die Kondensation von Aminosäuren und/oder kleineren Peptiden hergestellt. Die Aminogruppe einer Aminosäure (oder eines zweiten Peptids) reagiert mit der Carbonsäuregruppe einer zweiten Aminosäure (oder eines Peptids), wobei unter Freisetzung eines Moleküls Wasser eine Peptidbindung (-NHCO-) erzeugt wird. Wenn daher eine Aminosäure in ein Peptid eingebaut wird, sollte sie vom technischen Standpunkt aus folglich als Aminosäurerest bezeichnet werden.

Peptidsynthese: Ein Überblick

Bei einer üblichen "Merrifield"-Synthese wird eine Seitenketten-geschützte Aminosäure über ihren Carboxyterminus an ein Trägermaterial, wie ein Harz, gebunden. Ein Seitenketten- und aminoterminal geschütztes Aminosäure-Reagens wird zugegeben, und sein Carboxyterminus reagiert mit dem ungeschützten Amino-Terminus der unlöslich gemachten Aminosäure, wobei eine Peptidbindung erzeugt wird. Vom Amino-Terminus des so erhaltenen Peptids wird die Schutzgruppe abgespalten und ein neues Aminosäure-Reagens zugegeben. Der Zyklus wird wiederholt, bis das gewünschte Peptid synthetisiert wurde. Für einen Überblick über die Verfahren vgl. Geisaw, Trends Biotechnol. 9 (1991), 294-295.
Bei der herkömmlichen Anwendung dieses Verfahrens wird das Aminosäure- Reagens so rein wie möglich hergestellt. Falls jedoch ein Gemisch von Peptiden gewünscht wird, kann das bei einem oder mehreren der Zyklen verwendete Aminosäure-Reagens ein Gemisch von Aminosäuren sein, und dieses Gemisch kann von Zyklus zu Zyklus gleich oder verschieden sein. Falls Ala an das Harz gekoppelt würde und ein Gemisch von Glu, Cys, His und Phe zugegeben würde, werden folglich die Dipeptide Ala-Glu, Ala-Cys, Ala-His und Ala-Phe hergestellt.
Wenn während eines Syntheseszyklus eine reine Aminosäure zugegeben wird, wird der so erhaltene Rest in den synthetisierten Peptidmolekülen als konstanter Rest bezeichnet. Falls ein Gemisch von Aminosäuren verwendet wird, wird der angehängte Rest als variabler Rest bezeichnet. Die Aminosäuren als Bestandteile des Gemisches, die die einzigen Aminosäuren sind, die die Position des variablen Restes einnehmen können, werden als "Satz" des variablen Restes bezeichnet. Der Satz für einen variablen Rest kann von dem des nächsten Restes verschieden sein. Wenn einer der während der Synthese eines Peptids angehängten Reste ein variabler Rest ist, so daß die Synthese bewußt ein Gemisch von Peptiden erzeugt, wird das Gemisch als Peptidbank bezeichnet wird. Die Unterschiede zwischen den Peptidmolekülen der Bank liegen im wesentlichen in und allein an der Position des vorherbestimmten variablen Restes.

Peptidbank

Eine Peptidbank kann im wesentlichen allein aus Peptiden der gleichen Länge bestehen oder sie kann Peptide unterschiedlicher Länge umfassen. Die Peptide der Bank können an jeder Position eines variablen Restes eine beliebige gewünschte Aminosäure umfassen. Mögliche Sätze umfassen, aber sind nicht darauf begrenzt: (a) alle der genetisch codierten Aminosäuren; (b) alle der genetisch codierten Aminosäuren, ausgenommen Cystein (wegen seiner Fähigkeit, Disulfidvernetzungen zu erzeugen); (c) alle der genetisch codierten Aminosäuren sowie ihre D-Formen; (d) alle natürlich vorkommenden Aminosäuren (einschließlich z.B. Hydroxyprolin); (e) alle hydrophile Aminosäuren; (f) alle hydrophoben Aminosäuren; (g) alle geladenen Aminosäuren; (h) alle ungeladenen Aminosäuren; etc. Die Peptidbank kann verzweigte und/oder zyklische Peptide umfassen.
Die "Größe" der Bank entspricht der geschätzten Anzahl der Peptidmoleküle in ihr. Vorzugsweise enthält die Bank mindestens 10¹&sup4; stärker bevorzugt mindestens 10¹&sup6;, noch stärker bevorzugt mindestens 10¹&sup8; und besonders bevorzugt mindestens 10²&sup0; Moleküle. Falls 6 x 10¹³ Peptide pro Kügelchen vorhanden sind, würden selbst 10&sup6; Kügelchen 6 x 10¹&sup9; Peptide bereitstellen, während 10&sup8; Kügelchen 6 x 10²¹ Peptide tragen würden.
Die "Diversität" ("Degeneration") der Bank entspricht der erwarteten Anzahl der einzigartigen Peptidsequenzen in der Bank. Das erfindungsgemäße Verfahren weist keine technisch vorgegebene untere Grenze hinsichtlich der Bank-Diversität auf. Es macht jedoch keinen Sinn, eine Bank mit einer Diversität von nur 2 herzustellen. Wünschenswerterweise sollte die Bank ausreichend divers sein, so daß es eher vorteilhaft ist, die Bank gleichzeitig zu synthetisieren und zu durchmustern, als jedes Peptid einzeln herzustellen und zu testen. Aus diesem Grund weist die Bank üblicherweise eine Diversität von mindestens 10³ auf. Ein weiterer Gesichtspunkt ist, ob die Bank eine Diversität aufweist, die mit der von gemäß dem Stand der Technik beschriebenen Banken vergleichbar oder größer ist. Vorzugsweise umfaßt die Diversität der Bank mindestens 10&sup8;, stärker bevorzugt mindestens 10¹&sup0;, noch stärker bevorzugt mindestens 10¹² und besonders bevorzugt mindestens 10¹&sup4; einzigartige Sequenzen. Eine Diversität von 10¹&sup4; würde mit 10&sup8; Kügelchen erzielt, die jeweils 10&sup6; Sequenzen tragen. Der "Sequenzsatz" der Bank ist der Satz der Sequenzen, die aufgrund der Wahl der konstanten und variablen Reste und der Sätze für jeden variablen Rest theoretisch in der Bank vorliegen können.
Die "durchschnittliche Anzahl der Moleküle mit identischer Sequenz ("average sampling level")" der Bank entspricht der Größe dividiert durch die Diversität, d.h. der durchschnittlichen Anzahl der Moleküle mit der gleichen Peptidsequenz. Vorzugsweise ist die durchschnittliche Anzahl der Moleküle mit identischer Sequenz zum Nachweis und mindestens zur teilweisen Sequenzierung ausreichend. Sie beträgt vorzugsweise mindestens 10&sup6; Moleküle pro Sequenz, stärker bevorzugt mindestens 10&sup7; und noch stärker bevorzugt mindestens 10&sup8;. Die durchschnittliche Anzahl der Moleküle mit identischer Sequenz sollte mindestens der Peptid-pro-Kügelchen-Nachweisgrenze (von der angenommen wird, daß sie zur Zeit 10 beträgt) und stärker bevorzugt dem Zehnfachen der Grenze entsprechen, um einen Sicherheitsspielraum vorzusehen.
Obwohl die Peptidbank Di-, Tri- und Tetrapeptide umfassen kann, beträgt die bevorzugte minimale Länge der Peptide 5 Aminosäuren. Es gibt keine bestimmte maximale Länge.

Strukturierte Peptidbank

Eine strukturierte Peptidbank ist eine Bank, in der die Peptidsynthese auf einer Ansammlung von Kügelchen (oder Äquivalenten) gesteuert wird, so daß das Repertoire der Sequenzvariation auf einem einzelnen Kügelchen auf einen vorbestimmten Untersatz der erlaubten Gesamtheit aller Sequenzvariationen für die gesamte Bank begrenzt ist.
Eine solche Bank wird durch schrittweise Synthese der Peptide auf den Kügelchen mittels eines Protokolls hergestellt, das einen oder mehrere "strukturierte zufällige" Additionszyklen umfaßt (gegebenenfalls können auch ein oder mehrere "unstrukturierte zufällige" oder "nicht zufällige" Zyklen verwendet werden).
Ein "strukturierter zufälliger" Zyklus ist ein Zyklus, bei dem ein variabler Rest angehängt wird, aber ein gewisser Grad der Kontrolle im Hinblick darauf ausgeübt wird, welche Kügelchen welche Aminosäuren des Satzes erhalten. Ein "nicht zufälliger" Zyklus ist ein Zyklus, bei dem alle wachsenden Peptide der Bank mit einem reinen Aminosäure-Additionsreagens umgesetzt werden. Ein "unstrukturierter zufälliger" Zyklus ist ein Zyklus, bei dem sie alle mit einem "gemischten Aminosäure-Additionsreagens" umgesetzt werden, wobei das Gemisch alle Aminosäuren umfaßt, die zu dem für diese Position des variablen Restes definierten Satz gehören.
Bei der einfachsten Form eines "strukturierten zufälligen" Zyklus werden die Kügelchen in N Aliquots aufgeteilt, wobei N die Anzahl der Aminosäuren in dem Satz des variablen Restes ist. Jedes Aliquot erhält eine unterschiedliche und nur eine von jenen N verschiedenen Aminosäuren. Als Ergebnis weisen alle Peptide auf einem Kügelchen in einem bestimmten Aliquot die identische Aminosäure an der in Frage kommenden Position des variablen Restes auf Dies wird als "voll strukturierter" Zyklus bezeichnet.
Es gibt jedoch Umstände, unter denen es geeignet ist, jedes Aliquot mit einem Gemisch eines einzigartigen Untersatzes der Aminosäuren in dem Satz des in Frage kommenden variablen Restes umzusetzen. Zum Beispiel kann der Satz für die Position des Restes unter Berücksichtigung der Bank als Einheit 100 Aminosäuren umfassen. Die Kügelchen können in die Aliquots A, B, C und D aufgeteilt werden, die mit Gemischen A' (Aminosäuren 1-25), B' (Aminosäuren 26-50), C' (Aminosäuren 51-75) bzw. D' (Aminosäuren 76- 100) umgesetzt werden. Dies ist ein Beispiel für einen "teilweise strukturierten" Zyklus.
Die Anzahl der verschiedenen Aliquots, zu der ein Kügelchen während eines bestimmten strukturierten Zyklus zugeordnet werden kann, ist der "Verteilungsfaktor" für diesen Zyklus. Die Anzahl der verschiedenen Permutationen von Aliquotzuordnungen, die ein einzelnes Kügelchen durchmachen kann, während die Bank synthetisiert wird, ist der "Bank-Verteilungsfaktor" das Produkt der Verteilungsfaktoren für die einzelnen Zyklen (der Verteilungsfaktor für einen unstrukturierten Zyklus ist eins). Die erwartete Anzahl der Kügelchen in der Bank, die einer bestimmten Reihenfolge von Aliquotzuordnungen bei den Verteilungsschritten (BL') unterworfen wurden, entspricht der Gesamtzahl der Kügelchen in der Bank (BL), dividiert durch den Bank-Verteilungsfaktor. BL' ist vorzugsweise mindestens 1, stärker bevorzugt mindestens 2 und noch stärker bevorzugt mindestens 10.
Falls 10&sup7; Kügelchen in der Bank (BL) vorhanden sind und drei strukturierte Zyklen mit jeweils einem Verteilungsfaktor von 100 durchgeführt werden, ist der Bank-Verteilungsfaktor 10&sup6; und BL' ist 10. Falls vier strukturierte Zyklen verwendet werden, wäre ein Verteilungsfaktor von 100 pro Zyklus zu groß; ein Faktor von etwa 90 wäre annehmbar (90&sup4; = 7,43 x 10&sup6;). Falls eine größere Anzahl von Kügelchen durchmustert werden könnte, könnte der Bank-Verteilungsfaktor erhöht werden.
Die erwartete Anzahl der identischen Peptidmoleküle auf einem einzelnen Kügelchen (MB') entspricht der erwarteten Anzahl der Peptidmoleküle auf dem Kügelchen (MB), dividiert durch die erwartete Diversität des Kügelchens (DB). Der Diversitätsfaktor (DB) für das Kügelchen ist das Produkt der Diversitätsfaktoren für dieses Kügelchen für jeden Rest des Peptids. Bei einem unstrukturierten zufälligen Zyklus ist der Diversitätsfaktor des Zyklus sowohl flir das Kügelchen als auch die Bank der gleiche, d.h. die Anzahl der verschiedenen Aminosäuren in dem entsprechenden Reagens. Bei einem strukturierten zufälligen Zyklus entspricht der Diversitätsfaktor des Zyklus für ein Kügelchen der Anzahl der verschiedenen Aminosäuren in dem Reagens, das zu diesem Zeitpunkt mit diesem Kügelchen umgesetzt wird (für einen voll strukturierten Zyklus ist er eins).
Die Anzahl der Peptidmoleküle, die von einem einzelnen Kügelchen getragen werden kann, ist eine Funktion der Oberfläche des Kügelchens und der Anzahl der potentiellen, gleichzeitig vorhandenen Peptidbindungsstellen auf der Oberfläche. Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert, daß diese Zahl (MB) mindestens 2 ist (das technisch nur durchführbar ist, wenn ein einzelnes Peptidmolekül nachgewiesen und sequenziert werden kann, und das nur zwei verschiedene Sequenzen pro Kügelchen zuläßt). Aus praktischen Gründen ist MB mindestens 10², vorzugsweise mindestens 10³, stärker bevorzugt mindestens 10&sup6;, noch stärker bevorzugt mindestens 10&sup9; und sogar noch stärker bevorzugt mindestens 10¹². Die Beispiele 1-4 setzen einen Wert von 6 x 10¹³ Molekülen/Kügelchen voraus.
Die Anzahl der Kügelchen in der Bank (BL) wird nur durch die Anzahl der Kügelchen begrenzt, die durchmustert werden können. Vorzugsweise werden mindestens 10&sup7; Kügelchen und stärker bevorzugt 10&sup8; oder 10&sup9; Kügelchen durchmustert. Es ist wahrscheinlich, daß ein technisches Hilfsmittel erforderlich ist, um eine große Anzahl von Kügelchen in einer einzigen Bank effektiv zu durchmustern.
Die Anzahl der Bindungspeptide, die von einem einzelnen Kügelchen für den Bindungstest getragen werden muß, um bestimmen zu können, ob diese Moleküle das Affinitätsreagens spezifisch binden, ist eine Funktion sowohl des Reagensgrads als auch der Empfindlichkeit des Tests. Vorzugsweise erfordert der Test nicht mehr als 10&sup7; bzw. nicht mehr als 10&sup6; Bindungsmoleküle pro Kügelchen zur Nachweis. Bevorzugt wird auch, daß nicht mehr als 10, stärker bevorzugt nicht mehr als 2 und noch stärker bevorzugt nicht mehr als ein solches Kügelchen für den Nachweis erforderlich ist.
Die maximale potentielle Diversität der Peptidbank ist eine Funktion:
(a) der Anzahl der Peptidmoleküle, die von einem einzelnen Kügelchen getragen werden können;
(b) der Anzahl der Kügelchen, die durchmustert werden können;
(c) der Anzahl der Bindungspeptidmoleküle, die von einem einzelnen Kügelchen für den Bindungstest getragen werden müssen, um bestimmen zu können, ob diese Moleküle das Affinitätsreagens spezifisch binden;
(d) der Anzahl der mindestens teilweise identischen Peptidmoleküle, die von einem einzelnen Kügelchen getragen werden müssen, damit der gemeinsame Teil ihrer Aminosäuresequenz sequenzierbar ist; und
(e) des erforderlichen Grades der statistischen Sicherheit, daß im wesentlichen alle theoretisch synthetisierten Peptide tatsächlich in nachweisbaren und sequenzierbaren Mengen vorliegen.
Es ist erkennbar, daß der Fachmann die Verbesserungen auf den Fachgebieten des Bindungstests, der Peptidsynthese und der Peptidsequenzierung ausnutzen wird, um einen höheren Diversitätsgrad in der Bank zu erzielen. Folglich, während für Berechnungszwecke, die die Durchführbarkeit der vorliegenden Erfindung zeigen, angenommen werden kann, daß 10&sup8; bis 10&sup9; Kügelchen manuell durchmustert werden können, daß 6 x 10¹³ Peptidmoleküle auf ein einzelnes Kügelchen geladen werden können, daß 10&sup6; Moleküle zum Nachweis der Bindung erforderlich sind und daß 10 pMol Peptid (etwa 1,5 x 10¹³ Hexapeptidmoleküle) zur Sequenzierung erforderlich sind, sollten diese Einschränkungen nicht den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung festlegen, falls sie technisch überholt sind.
Die erste Einschränkung hinsichtlich der Diversität der Bank ist die Anzahl der Peptidmoleküle in ihr. Diese entspricht der Anzahl der Kügelchen in der Bank, multipliziert mit der Anzahl der Moleküle pro Kügelchen. Folglich, wenn 10&sup7; Kügelchen und 6 x 10¹³ Peptide pro Kügelchen vorhanden sind, liegen 6 x 10²&sup0; Peptidmoleküle in der Bank vor.
Die zweite Einschränkung wird durch die Nachweistechnik auferlegt. Damit ein Nachweis erfolgt, muß es ein oder mehrere Kügelchen geben, von denen jedes eine Mindestanzahl der identischen Peptidmolekülen trägt, die die gewünschte Bindungseigenschaft aufweisen. Zum Beispiel, falls die Nachweistechnik ein positives Kügelchen und mindestens 10&sup6; Moleküle auf diesem Kügelchen erfordert, die die geeignete Sequenz aufweisen, dann umfaßt die maximale erlaubte Diversität der Bank (6 x 10²&sup0;/10&sup6; =) 6 x 10¹&sup4; verschiedene Peptidsequenzen. So kann eine solche Bank eine Pentapeptidbank mit 500 verschiedenen Aminosäuren in jeder Position (500&sup5; < 6 x 10¹³), eine Hexapeptidbank mit beinahe 200 verschiedenen Aminosäuren in jeder Position (200&sup6; = 6,4 x 10¹³) oder eine Octapeptidbank mit über 40 verschiedenen Aminosäuren in jeder Position (40&sup8; = 6,6 x 10¹²) sein.
Die Diversität eines einzelnen Kügelchens ist ebenfalls begrenzt. Falls 6 x 10¹³ Bindungsstellen vorhanden sind und 10&sup6; identische Peptidmoleküle zum Nachweis erforderlich sind, ist die maximale Diversität des Kügelchens 6 x 10&sup7;.
Jeder unstrukturierte zufällige Zyklus erhöht die Diversität eines einzelnen Kügelchens sowie der Bank durch seinen Diversitätsfaktor. Jeder voll strukturierte zufällige Zyklus erhöht die Diversität der Bank, aber nicht die Diversität des Kügelchens. Eine Kügelchen- Diversitätsgrenze von 6 x 10&sup7; würde man mit drei unstrukturierten Zyklen von jeweils etwas weniger als 400 Aminosäuren, vier unstrukturierten Zyklen von jeweils etwa 90 Aminosäuren und so weiter angehen.
In dem vorstehenden Beispiel bringt die Einstellung der relativen Anzahl der strukturierten und unstrukturierten Zyklen keinen Vorteil. Bei zwei strukturierten und vier unstrukturierten Zyklen von jeweils 100 Aminosäuren liegen nur (6 x 10¹³/100&sup4; =) 6 x 10&sup5; Moleküle jeder Peptidsequenz auf jedem Kügelchen vor, ein Wert, der unter der angenommenen Nachweisgrenze von 10 liegt. Bei vier strukturierten und zwei unstrukturierten Zyklen von jeweils 100 Aminosäuren gibt es 100&sup4; (= 10&sup8;) verschiedenen Permutationen der Kügelchen-Verteilungen, aber nur 10&sup7; Kügelchen, so daß die erwartete Anzahl der Kügelchen, die einer bestimmten Reihenfolge von vier Aliquotzuordnungen unterworfen werden, nur 0,1 und nicht mindestens 1,0 beträgt, wie wünschenswert ist.
Jedoch, falls die zugrundeliegenden Annahmen der Anmelder verändert werden, ändern sich auch die relativen Verdienste der strukturierten und unstrukturierten Zyklen. Falls zum Beispiel die Peptiddichte auf dem Kügelchen höher oder die Nachweisgrenze niedriger ist, könnte die Anzahl der unstrukturierten Zyklen erhöht werden. Falls die Anzahl der Kügelchen höher ist, könnten mehr strukturierte Zyklen durchgeführt werden. Und schließlich, falls weniger Aminosäuren in jedem Zyklus verwendet werden, könnten mehr Zyklen, strukturiert oder unstrukturiert, durchgeführt werden.
Die zur Sequenzierung mittels der derzeitigen Technik erforderliche Peptidmenge beträgt 10 pMol, was etwa 6 x 10¹² Molekülen (Hexapeptiden) entspricht. Falls die Diversität auf einem einzelnen Kügelchen auf die begrenzt ist, die zur Sequenzierung des gesamten Peptids auf einmal erforderlich ist, ist der Ansatz von geringffigigem Wert. Bei 6 x Molekülen pro Kügelchen wäre die Diversität auf (6 x 10¹³/6 x 10¹² =) 10 begrenzt. Das vorliegende Verfahren beabsichtigt jedoch&sub9; daß zuerst nur eine Teilsequenz bestimmt wird.
Folglich weisen die Peptide der ersten Bank einen ersten familienspezifischen Teil und einen zweiten individuellen Teil auf. Den ersten Teil, der üblicherweise 1 bis 5, vorzugsweise 3 Aminosäuren umfaßt, haben alle Peptiden auf einem bestimmten Kügelchen gemeinsam (oder er ist von einer begrenzten Variabilität bei allen Peptiden). Der Rest der Peptidsequenz ist der Teil, der sie vollständig oder hauptsächlich von den verschiedenen Peptidsequenzen unterscheidet, die von dem gleichen Kügelchen getragen werden.
In den folgenden Unterbanken kann jedes Peptid dadurch gekennzeichnet werden, daß es einen ersten Teil, der "universal" ist, d.h., daß ihn alle Peptide in der Unterbank besitzen, einen zweiten Teil, der für alle Peptide auf einem einzelnen Kügelchen der Unterbank familienspezifisch ist, und einen dritten individuellen Teil aufweist. Es ist nur erforderlich, daß jeder mögliche Rest der familienspezifischen Untersequenz auf dem aktiven Kügelchen in einer sequenzierbaren Menge vorliegt. Falls 100 pMol pro Kügelchen vorliegen und 10 pMol sequenzierbar sind, können bis zu zehn verschiedene Aminosäuren (jede in einer Menge von 10 pMol) an einer bestimmten Restposition bei den Peptiden auf einem einzelnen Kügelchen vorliegen. Falls die Reste der familienspezifischen Untersequenz variable Reste sind, werden mehrere sekundäre Banken untersucht, um zu bestimmen, welche der familienspezifischen Untersequenzen zu einem äktiven Peptid der primären Bank gehörte.
Während der Synthese des familienspezifischen Teils des Peptids werden bei jedem Zyklus, in dem ein variabler Rest angehängt werden soll, die Kügelchen in N Aliquots aufgeteilt, wobei N die Anzahl der Aminosäuren in dem Satz des variablen Restes ist, d.h. die Anzahl der verschiedenen Aminosäure-Reagenzien, die in diesem Zyklus verwendet werden, falls der Zyklus voll strukturiert ist. Jedes Aliquot der Kügelchen wird mit einem Aminosäure-Reagens umgesetzt, das eine und nur eine der Aminosäuren des Satzes bereitstellt. Dieser Schritt wird gunstigerweise in N verschiedenen Reaktionsgefaßen durchgeführt. Die Aliquots werden dann vereinigt. Noch üblicher ist, daß ein Codierungsfaktor von 2 verwendet wird, so daß jedes Aliquot mit einem Gemisch von zwei verschiedenen Aminosäure- Reagenzien umgesetzt wird.
Falls jedoch der variable Rest, der angehängt werden soll, innerhalb des individuellen Teil des Peptids liegt, wird ein Gemisch von allen Aminosäuren des Satzes zu allen Kügelchen zugegeben.
Eine Bank kann Peptide unterschiedlicher Längen umfassen. Eine solche Bank kann durch die Modifizierung von einem oder mehreren strukturierten Zyklen hergestellt werden, so daß eines der Aliquote nicht mit eitier Aminosäure umgesetzt wird. Alternativ kann das Reagens bei einem beliebigen zufälligen Zyklus ein Gemisch von Aminosäuren und Oligopeptiden umfassen. Auf beiden Wegen kann eine Bank mit Peptiden unterschiedlicher Längen, aber mit einem gemeinsamen familienspezifischen Teil hergestellt werden.

Kügelchen

Der Begriff "Kügelchen" soll nicht auf kugelförmige Teilchen begrenzt sein, sondem schließt alle beliebigen kleinen, abgrenzbaren, festen Elemente ein, auf denen eine strukturierte Peptidbank synthetisiert und durchmustert werden kann. Folglich müssen die "Kügelchen" aus einem Material hergestellt sein, an das Peptide konjugiert werden können und das im wesentlichen nicht von dem Affinitätsreagens gebunden wird. Zusätzlich müssen die Kügelchen in Aliquote aufgeteilt und wieder miteinander vereinigt werden können, wie vorstehend beschrieben, und während des Durchmusterungsverfahrens entsprechend der Fähigkeit ihrer konjugierten Peptide, an das Affinitätsreagens zu binden, später getrennt werden können.
Vorzugsweise sind die Kügelchen aus mit Divinylbenzol vernetztem aminomethyliertem Polystyrol hergestellt. Andere potentiell geeignete Materialien umfassen Tentagel (mit Polyethylenglykol modifiziertes Polystyrol, das mit Divinylbenzol vernetzt wurde). Das Geeignetsein anderer Trägermaterialien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann gemäß folgender Kriterien bewertet werden:
a) Möglichkeit zur Synthese von Peptiden auf den Kügelchen: Die Kügelchen sollten gegenüber allen bei der Peptidsynthese verwendeten Lösungsmitteln stabil sein.
b) Sie sollten eine freie Aminogruppe oder einen geeigneten stabilen, jedoch abspaltbaren Linker enthalten. Es sollte jedoch angemerkt werden, daß ein abspaltbarer Linker nicht erforderlich ist.
c) Die Kügelchen sollten während der Synthese, Durchmusterung und Behandlung mechanisch stabil sein.
d) Die Größe der Kügelchen sollte groß genug sein, um eine manuelle Behandlung oder ein alternatives Behandlungsverfahren, welches auch immer in Betracht gezogen wird, zuzulassen.
e) Die Peptid-Kapazität des Kügelchens sollte mindestens 10 pMol Peptid pro Kügelchen, oder welche untere Grenze auch immer durch Verbesserungen hinsichtlich der Sequenzierungstechnik durchführbar gemacht wird, betragen. Eine Kapazitit von etwa 100 pMol wird bevorzugt.
f) Die Kügelchen sollten einen geringen Grad an unspezifischer Adsorption der ausgewählten Liganden und von Proteinen im allgemeinen zeigen.
(Diese Kriterien sollten nicht 45 absolute Anforderungen angesehen werden.)
Kügelchen, die hinsichtlich des Geeignetseins getestet werden können umfassen:
- Aminomethyl-PERSEPTIVE-Kügelchen: (Perseptive, Cambridge, Massachusetts, USA).
- Kügelchen auf Polymer TSK-Gel-Basis (Tosohaas in Stuttgart, Deutschland).
- Matrix auf Fastflow Sepharose-Basis (Pharmacia Uppsala, Schweden).
Die Anzahl der Peptidmoleküle, die auf einem bestimmten Kügelchen untergebracht werden kann, ist eine Funktion der Oberfläche des Kügelchens und der Anzahl der reaktiven Stellen pro Oberflächeneinheit. Während es keine eindeutige untere Grenze in bezug auf die Tragfähigkeit gibt, ist die Anzahl der Peptidmoleküle pro Kügelchen einer der Faktoren, der die potentielle Diversität der Bank begrenzt, die zuverlässig durchmustert werden kann (d.h., so daß man mit ausreichender Sicherheit annehmen kann, daß alle der Peptide, von denen theoretisch erwarten wurde, daß sie produziert werden, tatsächlich in nachweisbaren Mengen produziert wurden, und daß man, falls die Durchmusterung negativ war, geltend machen kann, daß keines der erwarteten Peptide die gewünschte Affinität für das Zielmolekül aufwies). Noch gibt es eine eindeutige obere Grenze in bezug auf die Tragfähigkeit, jedoch, falls die reaktiven Stellen nicht weit genug voneinander entfernt sind, ist es möglich, daß eine sterische Hinderung der Bindung eintritt. Vorzugsweise weist das Kügelchen einen Durchmesser von 50 bis 500 Mikron (z.B. 100 Mikron) auf Das Kügelchen ist vorzugsweise in der Lage, mindestens 25 pMol Peptid, stärker bevorzugt mindestens 100 pMol Peptid zu tragen.
Da die Packungseffizienz (Kügelchen pro Volumeneinheit des Reaktionsgefäßes) mit zunehmenden Durchmesser des Kügelchens abnimmt, ist es wünschenswert, kleinere Kügelchen zu verwenden. Die Anzahl der Kügelchen pro Volumeneinheit des Reaktionsgefäßes ist, unter der Annahme, daß alle der in Frage kommenden Kügelchen kugelförmig sind, direkt abhängig vom Volumen jedes Kügelchens. Das Volumen eines jeden Kügelchens ist zur dritten Potenz des Durchmessers des Kügelchens proportional. Die Kügelchen sind porös, und es wird erwartet, daß die Peptide im gesamten Kügelchenvolumen synthetisiert werden. Es wird daher erwartet, daß die Kapazität der Kügelchen (die Peptidmenge auf dem Kügelchen) zuin Volumen des Kügelchens und somit zur dritten Potenz des Durchmessers direkt proportional ist. Falls der Durchmesser des Kügelchens von 100 auf 200 Mikron vergrößert wird, wird folglich erwartet, daß:
a) Die Anzahl der Kügelchen pro Volumeneinheit des Reaktionsgefäßes um das Achtfache geringer ist.
b) Die Peptid-Kapazität eines jeden Kügelchens um das Achtfache größer ist.
Die Peptid-Gesamtkapazität pro Volumen des Reaktionsgefäßes ist deshalb konstant.

Alternative Träger

Die erfindungsgemäßen strukturierten Oligomerbanken können an Banken angepaßt werden, in denen die Peptide auf anderen Trägern als Kügelchen präsentiert werden. Die Träger müssen jedoch individuell ansprechbar sein, so daß ein einzelnes Trägerelement eine bekannte Familie von Oligomeren mit einer im wesentlichen gleichen Untersequenz präsentiert, deren Sequenz bestimmbar ist, wenn das einzelne Trägerelement untersucht wird.
Ein Beispiel ist eine Adaption des lichtgesteuerten, räumlich ansprechbaren, parallelen, chemischen Syntheseverfahrens von Fodor et al., Science 251 (1991), 767. Bei dem Verfahren von Fodor erfolgt die Synthese auf einer festen Trägerschicht. Das Muster der Bestrahlung mit Licht (oder anderen Energieformen) durch eine Maske (oder einer anderen räumlich ansprechbaren Vorrichtung) bestimmt, welche Bereiche des Trägers für die chemische Kopplung aktiviert werden. Diese Aktivierung resultiert aus der Entfernung von photolabilen Schutzgruppen aus dem bestrahlten Bereich. Der Träger wird dem Additionsreagens ausgesetzt, das nur in dem Bereich reagiert, der unter dem Fenster der Maske liegt. Das Substrat wird dann durch eine zweite Maske mit einem anderen Fenster bestrahlt. Kombinatorische Maskierungsstrategien werden angewendet, um eine große Anzahl von Verbindungen in einer geringen Zahl von chemischen Schritten herzustellen. Zum Beispiel kann bei der ersten Runde die Trägeroberfläche in zwanzig vertikale Streifen aufgeteilt werden, wobei jeder von ihnen (in getrennten Bestrahlungs-Reaktions-Zyklen) eine der zwanzig genetisch codierten Aminosäuren aufnimmt. Die Oberfläche wird dann in zwanzig horizontale Streifen aufgeteilt, die beim zweiten Durchgang in ähnlicher Weise behandelt werden. Auf diese Weise werden alle 400 Dipeptide synthetisiert. Selbstverständlich können durch die Verwendung von 400 vertikalen Streifen und 400 horizontalen Streifen alle 160 000 Tetrapeptide synthetisiert werden. Von Fodor et al. wurde eine Auflösung von 50 Mikron erzielt (sein Nachweissystem soll eine Empfindlichkeitsgrenze von etwa 100 Fluoresceinmolekülen in einem Bereich von 10 Mikron² aufweisen).
Das Ergebnis der kombinatorischen Maskierungsstrategie ist die Herstellung einer großen Zahl von Verbindungen, die über den Träger verteilt sind. Jedoch überwiegt in einem beliebigen, bestimmten "Synthesebereich", d.h. einem gleich behandelten Bereich des Trägers, ein Produkt.
Gemäß der vorliegenden Modifikation des Fodor-Verfahrens wird der gesamte Träger einer oder mehreren Reaktionsrunden mit einem Gemisch von Aminosäuren unterworfen. Dann werden unter Anwendung des Fodor-Verfahrens eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren an jedes wachsende Peptid angehängt. Das Ergebnis ist, daß man innerhalb eines Synthesebereichs keine einzelne Peptidsequenz vorfindet, sondern eher eine Familie von verwandten Peptiden mit einem gemeinsamen Amino-Terminus und einem heterogenen Carboxy-Terminus.
Anders als bei der Ausführung in Form von "Kügelchen" besteht keine Notwendigkeit, diesen Amino-Terminus zu sequenzieren, da die Sequenz des Terminus aus den Koordinaten des im Test positiven Synthesebereichs ableitbar ist. Die aktiven Peptide in der bekannten Familie können durch Synthese einer sekundären Bank, die der Familie der primären Bank entspricht, und durch Analyse hinsichtlich einer Bindung bestimmt werden. Falls ein Träger in 50 Mikron² große Synthesebereiche aufgeteilt ist, wird erwartet, daß jeder Bereich 100 000 bis 1 000 000 Peptidmoleküle prasentiert. Falls 100 Moleküle pro 50 Mikron² Synthesebereich zum Nachweis erforderlich sind, kann jeder solche Synthesebereich 1000 bis 10 000 verschiedene Peptidsequenzen präsentieren. Folglich läßt die Adaptation des Verfahrens von Fodor et al. durch die Anmelder eine 1000- bis 10 000fach diversere Gesamtheit aller Peptide zu.

Durchmusterung

Die Peptidbank wird durchmustert, indem die Peptid-tragenden Kügelchen einem Affinitätsreagens ausgesetzt werden, wie vorstehend beschrieben. Das Reagens wird an die Kügelchen gebunden, die Peptide mit einer Affinität für das Reagenzes tragen. Überschüssiges Reagens wird entfernt und ein Signal wird erzeugt, z.B. eine Fluoreszenz oder eine Farbänderung, um die wechseiwirkenden Kügelchen von den passiven Kügelchen zu unterscheiden.
Die wechselwirkenden Kügelchen werden dann entfernt, entweder manuell oder durch andere Verfahren, die entweder die Gegenwart des Reagens oder die Erzeugung des Signals nachweisen. In einer Ausführungsform wird ein Sortierreagens verwendet, das magnetische Kügelchen umfaßt, die an Antikörper (oder andere bindende Moleküle) gekoppelt sind, die das Affinitätsreagens binden. Falls das Affinitätsreagens zum Beispiel ein polydonaler Kaninchen-Antikörper ist, könnten die magnetischen Kügelchen an Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper gekoppelt werden: Vorzugsweise weisen die magnetischen Kügelchen ein Gewicht auf das wesentlich geringer als das der Bank-Kügelchen ist, um ein Scherrisiko des Komplexes zu verringern. Jedoch, je schwerer das Kügelchen ist, desto größer ist das zur effizienten Trennung erforderliche Magnetfeld. Vorzugsweise weisen die Kügelchen ein Gewicht von etwa 10&supmin;¹¹ g bis 10&supmin;¹³ g auf. Der Durchmesser der magnetischen Kügelchen spielt ebenfalls eine Rolle. Große und leichte magnetische Kügelchen sind größeren Scherkräften ausgesetzt, verglichen mit kleinen und kompakten Kügelchen mit dem gleichen Gewicht. Dies ist auf die aus den Flüssigkeitsbewegungen resultierende größere hydrodynamische Widerstandskraft zurückzuführen, die die größeren Kügelchen beeinflußt. Die meisten der auf dem Markt erhältlichen magnetischen Kügelchen bestehen aus Derivaten von Polystyrol. Sie weisen keine ähnlichen Dichten aut, da sie hinsichtlich der Metallmenge in dem Kügelchen variieren. Der zur Verfügung stehende fortschrittlichste Magnetsortierer, der MACS von Beckton und Dickinson, verwendet magnetische Kügelchen von etwa 0,1 Mikron. B & D verwenden eine sehr leistungsfähigen Magneten. Schwächere Maschinen mit weniger leistungsfähigen Magneten verwenden größere Kügelchen. Die Anmelder glauben jedoch, daß Kügelchen von etwa 1 Mikron Durchmesser besonders geeignet sein könnten.
Eher als die Verwendung getrennter Sortier- und Affinitätsreagenzien ist die Verwendung eines Sortierreagens möglich, das das Zielmolekül von Interesse nachahmt und daher die Peptide direkt bindet. Das "Signal" entspricht dann der Abtrennung des Kügelchens durch das Sortierreagens.

Sequenzierung

"Positive" Kügelchen (diejenigen, die Bindungspeptide tragen) werden gewonnen und einzeln sequenziert. Obwohl eine Vielzahl von Sequenzierungsverfahren bekannt ist, umfassen alle: (a) die Abspaltung einer einzelnen Aminosäure von einem Ende des Peptids; (b) die Gewinnung und Identifizierung der freigesetzten Aminosäure; und (c) die Wiederholung der Schritte (a) und (b), bis das gesamte Peptid sequenziert wurde oder eine weitere Sequenzierung undurchführbar ist. Üblicherweise wird die Sequenzierung nur mit homogenen Peptidpräparationen durchgeführt. Obwohl ein einzelnes Kügelchen ein Gemisch von Peptiden trägt, weisen alle Peptide dieses Gemisches jedoch einen gemeinsamen terminalen Teil auf, den "familienspezifischen" Teil, der sequenzierbar ist.
Der "familienspezifische" Teil der Peptide der Bank kann der aminoterminale Teil sein, bei dem der aufeinanderfolgende Abbau am Amino-Terminus beginnen muß, oder er kann der carboxyterminale Teil sein, wobei in diesem Fall die Sequenzierung am Carboxylende des Peptids beginnt.
Die Primärsequenz der Aminosäuren in einem Peptid oder Protein wird im allgemeinen durch ein schrittweises chemisches Abbauverfahren bestimmt, bei dem eine Aminosäure nach der anderen von einem Ende des Peptids entfernt und identifiziert wird. Beim Edman-Abbau wird die N-terminale Aminosäure des Peptids an Phenylisothiocyanat gekoppelt, um das Phenylthiocarbamyl (PTC)-Derivat des Peptids zu erzeugen. Das PTC-Peptid wird dann mit einer starken Säure behandelt, die das PCT-Peptid an der ersten Peptidbindung zyklisiert und die N-terminale Aminosäure als Anilinothiozolinoe (ATZ)-Derivat freisetzt. Die ATZ-Aminosäure, die sehr instabil ist, wird extrahiert und in das stabilere Phenylthiohydantoin (PTH)-Derivat umgewandelt und mittels Chromatographie identifiziert. Das restliche Peptid wird dann einem weiteren schrittweisen Abbau unterworfen.
Für die carboxyterminale Sequenzierung (von synthetisierten Peptiden, die mit ihrem Amino-Terminus an einen Träger gekoppelt sind) kann das Spaitreagens eine Carboxypeptidase sein.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein bestimmtes Sequenzierungsverfahren begrenzt; jedoch muß das gewählte Verfahren vernünftigerweise in der Lage sein, die Sequenz des familienspezifischen Teils der Familie der Peptide auf einem einzelnen Kügelchen zu identifizieren.

Sequenzierung von verzweigten Peptiden

Das N-terminale Sequenzierungsverfahren ist Standard. Die Schwierigkeit liegt in der Identifizierung der richtigen Struktur. Falls bekannt ist, daß ein bestimmtes Peptid verzweigt ist, und der Verzweigungsgrad (zweifach verzweigt, dreifach verzweigt, etc.) und die Lage der Verzweigung im Vergleich zur Sequenz bekannt ist, wäre es möglich, die richtige Struktur auf Grundlage von Daten, die aus der N-terminalen Sequenzierung gewonnen wurden, und der Kenntnis des zweiten Syntheseansatzes abgeleitet werden. Jedoch, falls die Anmelder zulassen, daß eine Bank sowohl lineare als auch verzweigte Peptide enthält, oder falls die Anmelder in einer verzweigten Bank eine zufällige Verzweigung zulassen, wäre es sehr schwierig, die Struktur nur unter Zugrundelegung der Sequenzinformation in Verbindung mit einer begrenzten Anzahl von sekundären Banken abzuschätzen.
Das beste Verfahren wäre wahrscheinlich, unabhängige lineare oder verzweigte Banken herzustellen und jede verzweigte Bank mit einer einzigen Struktur herzustellen.
Die Ausschöpfung des vollen Potentials des Verzweigungsansatzes ist von der Verwendung von N-terminalen orthogonalen Schutzgruppen für jede Verzweigung unabhängig. Sonst würden viele mögliche Strukturen nicht in der Bank vorkommen.

Seguenzierung zyklischer Peptide

Die Sequenzierung zyklischer Peptide, die durch eine Cystinbildung innerhalb einer Kette gebildet werden, ist nach der Reduktion der Disulfidbrücken einfach. Bei einigen Formen der Zyklisierung ist die Bestimmung der N-terminalen Sequenz durch den Edman- Abbau nicht möglich und so muß der Zyklisierungsansatz mit einem Codierungsverfahren verbunden sein.

Codierung

Bestimmte Aminosäuren (z.B. Serin, Histidin) sind durch die Standardverfahren schwer zu identifizieren, entweder weil die As durch das Edman-Abbauverfahren zerstört werden, oder weil keine geeigneten Literaturstellen zur ihrer Identifizierung verfügbar sind. Dieses Problem kann durch ein beliebiges von mehreren Verfahren gelöst werden:
(a) Erhöhung des Anteils der schwierigen Aminosäuren in gemischten Aminosäure- Reagenzien, die im Verlauf der Peptidsynthese verwendet werden;
(b) Anwendung von mehr als einem Sequenzierungsverfahren; eine Aminosäure, die durch ein Verfahren schwierig zu analysieren ist, kann durch ein anderes einfacher nachgewiesen werden;
(c) Markierung der schwierigen Aminosäuren mit einem nachweisbaren, aber nicht störenden Marker vor deren Zugabe zu dem entstehenden Peptid während der Peptidsynthese; und/oder
(d) Partnerbildung zwischen jeder schwierig zu sequenzierenden Aminosäure und einer einfach sequenzierbaren Aminosäure ("Codierung") in dem Substitutionssatz für eine bestimmte Restposition in den Peptiden eines einzelnen Kügelchens.
Obwohl ihre Durchführung denkbar ist, würde die Alternative (a) ein Ungleichgewicht hinsichtlich der Struktur der bestimmten Bank erzeugen.
Die Alternative (b) erfordert die Aufteilung des Kügelchens in zwei Hälften und die Sequenzierung jeder Hälfte in einem unterschiedlichen Sequenzierungsverfahren, da diese Verfahren destruktiv sind.
Die Alternative (c) ist durchführbar, wenn der Marker nicht stört und durch das Synthese- oder Sequenzierungsverfahren nicht nachteilig modifiziert wird.
Die Alternative (d) wird bevorzugt und verdient eine weitere Erklärung. Man betrachte ein Kügelchen in einer Peptidbank, das Peptide mit der Sequenz
F&sub1;-F&sub2;-F&sub3;-I&sub4;-I&sub5;-I&sub6;
trägt, worin Fn "familienspezifische" Reste und In "individuelle" Reste sind. Bei normaler Verwendung sind die "F"-Reste für ein bestimmtes Kügelchen einzigartig. Man nehme an, daß einer oder mehrere der Fn-Reste schwierig zu sequenzierende Aminosäuren sind, wie Tryptophan. Falls dies der Fall ist, dann ergibt die Sequenzierung der Peptide auf diesem Kügelchen keine verwendbaren Ergebnisse, da die Aminosäure an der Position unbestimmt bleibt. Obwohl man alle der Möglichkeiten erschöpfend testen kann, gibt es eine Alternative.
Man nehme an, daß nur F&sub1; Tryptophan war. Man könnte stattdessen die Bank so strukturieren, daß auf diesem Kügelchen F&sub1; entweder Tryptophan oder eine einfach zu sequenzierende Aminosäure ist, wie Glycin. Falls für dieses Kügelchen festgestellt würde, daß es positiv ist, würde die aminoterminale Sequenzierung die Sequenz
Gly-F&sub2;-F&sub3;
für die ersten drei Aminosäuren der Peptide auf dem Kügelchen ergeben. Das tatsächlich bindende Peptid könnte Gly-F&sub2;-F&sub3; oder Trp-F&sub2;-F&sub3; sein. Die Antwort würde durch die Durchmusterung einer sekundären Bank bestimmt, die der Familie von Peptiden entspricht, die auf diesem positiven Kügelchen identifiziert wurde.
Ein typische Verwendung der "Codierung" ist bei der Durchmusterung von D-Aminosäuren, da eine herkömmliche Sequenzierung die D- und L-Formen der gleichen Aminosäure nicht unterscheidet. Unter Verwendung einer geeigneten Säule ist es technisch möglich, D- und L-Aminosäuren zu trennen oder in einer reinen chiralen Lösung ihre optische Beschaffenheit zu bestimmen. Jedoch erfordern alle der bekannten Verfahren viel größere Mengen an Material für die Analyse als bei der Sequenzierung eines einzelnen Kügelchens erhalten werden. Folglich ist es unpraktisch, die chirale Identität der sequenzierten Aminosäuren von einzelnen Bank-Kügelchen zu bestimmen. Eine andere Verwendung für die "Codierung" ist die Unterscheidung von Glu von Gln oder Asp von Asn.
So bauen die hier genannten Anmelder entsprechend ihrer Strategie an den "familienspezifischen" Positionen (z.B. 1-3 vom N-Terminus) der primären Bank zwei Aminosäuren ein. Die Aminosäurepaare sind so gewählt, daß jede "schwierige" Aminosäure mit einer "einfachen" gepaart wird. Bei der Durchführung der Sequenzierung zeigt das durch die "einfache" Aminosäure erzeugte Signal das Vorliegen der "schwierigen" Aminosäure an, selbst wenn sie nicht durch das Sequenzanalysegerät erfaßt wird.
Bei kurzen Peptiden könnte der N-Terminus die Aktivität des Peptids beeinflussen. Wenn z.B. das Peptid hauptsächlich aus hydrophoben Aminosäureresten besteht, kann das hydrophile primäre Amin des N-Terminus die Peptidaktivität zerstören. Es ist jedoch nicht möglich, N-terminal blockierte Peptide durch den Edman-Abbau zu sequenzieren.
Die Codierungsstrategie kann verwendet werden, um die Struktur von N-terminal modifizierten Peptiden zu analysieren. Im letzten Synthesezyklus verwenden die Anmelder ein Gemisch von Fmoc-geschützten (das α-Amin ist durch Fmoc blockiert) und blockierten (das α-Amin ist mit Essig- oder Benzoesäure blockiert) Aminosäuren. Nach der Sequenzierung zeigt das von der N-terminalen Aminosäure erhaltene Signal das Vorliegen der blockierten N-terminalen Aminosäure an, die gegenüber dem Edman-Abbau stabil ist.

Nichtpeptidbanken

Andere Polymere als Peptide können in den erfindungsgemäßen strukturierten Banken verwendet werden, mit der Maßgabe, daß sie (a) in einer Weise synthetisiert werden können, die eine "Strukturierung" erlaubt; (b) daß sie, wenn sie so präsentiert werden, durch ein Zielmaterial gebunden werden können; und (c) daß die Polymermoleküle auf einem einzelnen Kügelchen zumindest teilweise sequenziert werden können. Geeignete Polymere umfassen Peptoide, Nucleinsäuren und Kohlenhydrate.
Es sollte angemerkt werden, daß, falls ein bestimmter Polymertyp nicht ohne weiteres sequenziert werden kann, er indirekt durch eine "Codierungs"-Strategie untersucht werden kann, bei der die Kügelchen sowohl Peptide als auch das Nichtpeptidpolymer tragen. Vgl. Brenner und Lerner, "Encoded Combinatorial Chemistry", PNAS (USA) 89 (1992), 5381-5383, die die chemische Bindung eines genetischen Markers" (der mittels PCR amplifizierbar ist) an ein Polymer offenbaren, das nicht selbst genetisch codierbar ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muß das Peptid jedoch nicht chemisch an das Nichtpeptidpolymer gebunden sein. Zum Beispiel kann eine Bank so strukturiert sein, daß auf einem bestimmten Kügelchen eine einzelne Peptidsequenz und eine Familie von verwandten Nucleinsäuresequenzen vorliegen. Die Sequenzierung des Peptids identifiziert dann die Nucleinsäurefamilie.
Es kann wünschenswert sein, schwierig zu sequenzierende Polymerbanken durch die Adaptation des lichtgesteuerten, räumlich ansprechbaren, parallelen, chemischen Syntheseverfahrens von Fodor et al. durch die Anmelder zu präsentieren, da die familienspezifische Sequenz dann durch die räumliche Adresse angegeben wird.
Peptoide sind Peptidanaloge, in denen die Peptidbindung (-NHCO-) durch eine analoge Struktur, z.B. -NRCO-, ersetzt ist. Vgl. Simon et al., P.A., "Peptoids: A Modular Approach to Drug Discovery", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 9367-9371, und vgl. Gilon et al., "Backbone Cyclization: A New Method for Conferring Conformation Constraint on Peptides", Biopolymers 31(1991), 745-750. Wenn das Polymer ein Peptoid ist, kann es synthetisiert werden, wie im Referenzbeispiel beschrieben ist. Im allgemeinen sind diese Peptoide genauso wie Peptide sequenzierbar, obgleich die Empfindlichkeit oder Genauigkeit unterschiedlich sein kann.
Wenn das Polymer eine Nucleinsäure ist, können herkömmliche DNA- oder RNA- Synthese- und Sequenzierungsverfahren angewendet werden. Die üblichen Basen sind die Purine Adenin und Guanin und die Pyrimidine Thymidin (Uracil für RNA) und Cytosin. Ungewöhnliche Basen jedoch, wie die nachstehend aufgeführten. können bei der Synthese eingebaut oder durch eine sich der Synthese anschließenden Behandlung mit mutagenen Mitteln erzeugt werden.
4-Acetylcytidin;
5-(Carboxyhydroxylmethyl)uridin;
2'-O-Methylcytidin;
5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin;
5-Carboxymethylaminomethyluridin;
Dihydrouridin;
2'-O-Methylpseudouridin;
beta,D-Galactosylqueosin;
2'-O-Methylguanosin;
Inosin;
N&sup6;-Isopentyladenosin;
1-Methyladenosin;
1-Methylpseudouridin;
1-Methylguanosin;
1-Methylinosin;
2,2-Dimethylguanosin;
2-Methyladenosin;
2-Methylguanosin;
3-Methylcytidin;
5-Methylcytidin;
N&sup6;-Methyladenosin;
7-Methylguanosin;
5-Methylaminomethyluridin;
5-Methoxyaminomethyl-2-thiouridin;
beta,D-Mannosylqueosin;
5-Methoxycarbonylmethyluridin;
5-Methoxyuridin;
2-Methylthio-N&sup6;-isopentenyladenosin;
N-((9-beta-D-Ribofuranosyl-2-methylthiopurin-6-yl)carbamoyl)threonin;
N-((9-beta-D-Ribofuranosylpurin-6-yl)-N-methylcarbamoyl)threonin;
Uridin-5-oxyessigsäuremethylester;
Uridin-5-oxyessigsäure (v);
Wybutoxosin;
Pseudouridin;
Queosin;
2-Thiocytidin;
5-Methyl-2-thiouridin;
2-Thiouridin;
4-Thiouridin;
5-Methyluridin;
N-((9-beta-D-Ribofuranosylpurin-6-yl)carbamoyl)threonin; 2'-O-Methyl-5-methyluridin;
2'-O-Methyluridin;
Wybutosin; und
3-(3-Amino-3-carboxypropyl)uridin.
DNA kann durch die schrittweise Addition von Nucleotiden an eine entstehende Kette synthetisiert werden. Der erste Schritt der Synthese kann die Kopplung eines Nucleosids über eine Succinylbindung an einen geeigneten Träger wie Cellulose sein. Dieses Nucleosid stellt das 3'-Ende dar. Die Kettenverlängerung schreitet von 3' nach 5' voran; jeder Zyklus setzt sich (bei einem herkömmlichen Verfahren) aus den folgenden Schritten zusammen:

(1) Selektive Abspaltung der Schutzgruppe

Falls die 5'-Hydroxylgruppe durch eine Dimethoxytritylgruppe geschützt ist, wird sie zum Beispiel mit Säure entfernt.

(2) Kondensation

Ein geschütztes Nucleotid wird an das ungeschützte 5'-Ende gekoppelt. Die geschützten Nudeotide können 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup6;-(benzoyl)-2'-desoxyadenosin, 5'-Dimethoxytrityl-N&sup4;-(anisoyl)-2'-desoxycytidin, 5'-O-Dimethoxytrityl-N&sup6;-(N', N'-di-n-butylformadin)-2'-desoxyadenosin und 5'-O-Dimethoxytrityl-N²-(propionyl)-O&sup6;-(diphenylcarbamoyl)-2'-desoxyguanosin sein.

(3) Anheften einer Kappe

Die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen werden geschützt, z.B. durch Acylierung.
Das herkömmliche Verfahren zur DNA-Sequenzierung durch chemische Spaltung hängt von der parallelen Ausführung der vier basenspezifischen oder basenselektiven Modifizierungsprotokolle und der parallelen elektrophoretischen Auflösung der Hydrolysate in vier Bahnen ab. Es ist auch möglich DNA unter Zugrundelegung eines einzigen Basenmodifizierungsverfahrens zu analysieren, falls es bei allen Basen in der DNA einen gewissen Spaltungsgrad des Rückgrats erzeugt, aber die Spaltraten an den vier kanonischen Basen (A, T, G, C) deutlich verschieden sind. Vgl. Ambrose und Pless, Meth. Erizymol. 152 (1987), 522 (Modifizierung mit 0,5 M wäßrigem Piperidin, 0,3 M NaCl, 90ºC, pH) 12, 5 Stunden). Das Einzelreagensverfahren ist schneller, aber ungenauer.
Polysaccharide sind größere Polymere von Monosacchariden in einer verzweigten oder unverzweigten Kette. Oligosaccharide sind kürzere Polymere von Monosacchariden, wie Di-, Tri-, Tetra-, Penta- und Hexasaccharide. Der Einfachheit halber wird der Begriff "polymeres Kohlenhydrat" verwendet, um sowohl Poly- als auch Oligosaccharide einzuschließen.
Monosaccharide in einer polymeren Kohlenhydratbank können Aldosen, Ketosen oder Derivate sein. Sie können Tetrosen, Pentosen Hexosen oder komplexere Zucker sein. Sie können in der D- oder der L-Form vorliegen. Geeignete D-Zucker umfassen D-Glycerinaldehyd, D-Erythrose, D-Threose, D-Arabinose, D-Ribose, D-Lyxose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Altrose, D-Allose, D-Talose, D-Galactose, D-Idose, D-Gulose, D-Rhamnose und D-Fucose. Geeignete L-Zucker umfassen die L-Formen der vorstehend erwähnten D-Zucker.
Ein Zucker-Hemiacetal kann mit einer Hydroxylgruppe eines anderen Zuckers zur Erzeugung eines Disaccharids umgesetzt werden, und die Umsetzung kann wiederholt werden. Für Kohlenhydratsyntheseverfahren vgl. Kanie O. und Hindsgaul O., "Synthesis of Oligosaccharides, Glycolipids and Glycopeptides", Curr. Opin. Struc. Bio. 2 (1992), 674-681. Zur Sequenzierung vgl. Lee Y.C., "Review: High-Performance Anion-Exchange Chromatography for Carbohydrate Analysis", Anal. Biochem. 189 (1990), 151 - 162; Maley F., Trimble R.B., Tarentino A.L., Plummer T.H., "Review: Characterization of Glycoproteins and Their Associated Oligosaccharides Through the Use of Endoglycosidases", Anal. Biochem. 180 (1989), 195-204; und Spellman M.W., "Carbohydrate Characterization of Recombinant Glycoproteins of Pharmaceutical Interest", Anal. Chem. 62 (1990), 1714-1722.
Spezielle Konstrukte, die vor kurzem beschrieben wurden, umfassen:

Polypeptid/Nucleinsäure-Hybrid:

Bei diesem Typ eines Aminosäurederivats ist der Rest R des Cα-Atoms ein Nudeotidrest. Das Gerüst kann ein normales Polypeptid sein, und so nehmen die Anmelder an, daß es bei der Synthese und beim Edman-Abbau keine Schwierigkeiten geben sollte. Vgl. Meier C. und Engels J.W. Peptide Nucleic Acids (PNAs) - "Unusual Properties of Nonionic Oligonucleotide Analogs", Angew. Chem. (Engl.) 31 (1992), 1008-1010; Egholm M., Buchardt O., Nielsen P.E. und Berg R.H., "Peptide Nucleic Acids (PNA). Oligonucleotide Analogs With an Achiral Peptide Backbone", Journal of the American Chemical Society 114 (1992), 1895-1897.

"Gemischte" Polymere von Aminosäuren und anderen Monomeren:

Es kann eine Aminosäuren und andere Monomere (z.B. Nucleinsäuren) umfassende einzelne Kette hergestellt werden.

Beispiel 1

In diesem Beispiel beschreiben die Anmelder eine Hexapeptidbank, in der jeder Rest aus einem Satz von 25 Aminosäuren gewählt ist. Die Bank umfaßt eine maximale mögliche "Diversität" von 25&sup6; oder etwa 2,44 x 10&sup8; verschiedene Peptidsequenzen.
Betrachtet man die Bank als Ganzes, kann jede Restposition der Hexapeptide ein Rest der 25 Reste des Satzes sein, wobei die Bank strukturiert ist, so daß die Reste 1-3 (vom Amino-Terminus durchnumeriert) familienspezifische Reste sind und die Reste 4-6 individuelle Reste sind. Sofern nicht eine "Codierung" erforderlich ist, wie zuvor beschrieben, sind die ersten drei Reste für die Peptidfamilie auf einem einzelnen Kügelchen die gleichen, wobei die Diversität nur an den Resten 4-6 offensichtlich wird (natürlich variieren die Reste 1-3 von Kügelchen zu Kügelchen).
Diese Bank wird wie folgt hergestellt. Ein Gemisch wird aus 25 verschiedenen, Amino-geschützten Aminosäuren hergestellt. Für drei Aminosäure-Additionszyklen wird dieses Gemisch mit allen Kügelchen umgesetzt (d.h. ein unstrukturierter zufälliger Zyklus, in Tabelle 1 als "UR" abgekürzt). Als Ergebnis weist jedes Kügelchen eine Vielzahl von zufälligen Tripeptiden auf (Positionen 4-6 der gewünschten Hexapeptide). Folglich gibt es 25³ mögliche verschiedene Tripeptidsequenzen.
Die restlichen drei Zyklen sind strukturierte zufällige ("SR") Zyklen. Im vierten Zyklus werden die Kügelchen in 25 Aliquots aufgeteilt. Das erste Aliquot wird mit L-Ala umgesetzt, das zweite mit L-Arg, das dritte mit L-Asp und so weiter mit allen 25 Aliquots. Die Anmelder haben nun alle 25&sup4; möglichen verschiedenen Tetrapeptidsequenzen synthetisiert. Jedoch ist die aminoterminale Aminosäure aller Peptide auf den Kügelchen des ersten Aliquots L-Ala, während die aminoterminale Aminosäure aller Peptide des zweiten Aliquots L-Arg ist (diese Aminosäure entspricht dem Rest 3 des fertigen Hexapeptids). Alle Kügelchen werden nun zufällig miteinander gemischt. Im fünfien Zyklus werden die Kügelchen abermals in 25 Aliquots aufgeteilt, und jedes Aliquot wird mit einer bestimmten Aminosäure umgesetzt, wobei auf den Kügelchen Pentapeptide erhalten werden. Diese entspricht dem Rest 2 des fertigen Hexapeptids. Die Kügelchen werden vereinigt und "gemischt" und im sechsten und letzten Zyklus in 25 Aliquots aufgeteilt, um die letzte Aminosäure (Rest 1 des Hexapeptids) zu erhalten. Die Kügelchen der Bank tragen nun alle 25&sup6; möglichen Hexapeptide, jedoch war die Synthese strukturiert, so daß die Reste 1-3 (gezählt vom Amino- Terminus) der Peptide für die Peptide auf einem bestimmten Kügelchen identisch sind.
Der Syntheseplan ist in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt: Tabelle 1
Die Sequenzsatz-Statistik für diese Bank ist nachstehend angegeben: Molekule mit
Daran schließt sich die Sicherheitsfaktor-Analyse an:
Auf einem einzelnen Kügelchen liegen 4 x 10&sup9; identische Moleküle einer jeden unterschiedlichen Hexapeptidsequenz vor, dieser Wert liegt ausreichend über der angenommenen Bindungs-Nachweisgrenze von 10&sup7; Molekülen. Für die ersten drei Restpositionen sind 100 Picomol einer jeden Aminosäure vorhanden wodurch der Wert von 10 Picomolen reichlich überschritten wird, von dem angenommen wurde, daß er zur Sequenzierung erforderlich ist.
25³ (15 625) verschiedene Kügelchen sind erforderlich, um mindestens ein Kügelchen für jede der 25³ möglichen Permutationen der ersten drei Restpositionen zur Verfügung zu stellen. Falls 10³ Kügelchen verwendet werderi, liegen 10&sup7;/25³ oder etwa 640 Kügelchen in der Bank vor, die die identische familienspezifische Sequenz tragen.
Falls beim Testen der Bank für eines der Kügelchen nachgewiesen wurde, daß es "positiv" ist, werden die Peptidmoleküle auf ihm sequenziert. Alle von ihnen weisen die gleichen ersten drei Aminosäuren in Mengen von 100 pMol auf, die zur Sequenzierung ausreichend sind. Auf diese Weise könnten diese drei Aminosäurepositionen bestimmt werden. Jedoch ist noch nicht bekannt&sub9; welche der 25³ verschiedenen Peptidsequenzen auf diesem Kügelchen für die Bindungsaktivität verantwortlich war.
Um dies herauszufinden, wird eine sekundäre Bank hergestellt. Alle Peptide dieser Bank haben die Reste 1-3 gemeinsam. Alle Peptide auf einem bestimmten Kügelchen haben die Reste 4-6 gemeinsam. Falls der Test mit der sekundären Bank ein Kügelchen "markiert", haben alle der Peptide auf diesem Kügelchen die Reste 1-6 in Mengen von 100 pMol gemeinsam. Auf diese Weise ist eine Sequenzierung durchführbar und das aktive Peptid wird anschließend vollständig identifiziert.
Es sollte erkennbar sein, daß größere aktive Peptide durch weitere sich wiederholende Schritte bestimmt werden können.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird eine Bank aus 10&sup7; Kügelchen von allen der aus 100 verschiedenen Aminosäuren herstellbaren 100 Hexapeptiden hergestellt.
Man nehme an, daß die 10&sup7; Kügelchen drei unstrukturierten Zyklen, wobei in jedem die Kügelchen mit einem Gemisch von 100 verschiedenen Aminosäuren umgesetzt werden, und drei strukturierten Zyklen unterworfen werden, wobei in jedem die Kügelchen in 100 Aliquots aufgeteilt werden, jedes Aliquot mit einer einzelnen einzigartigen Aminosäure aus dem Satz der 100 Aminosäuren umgesetzt wird und die Aliquots nach jedem Zyklus wieder miteinander vereinigt werden.
Der Syntheseplan umfaßt diesmal: Tabelle 2
Dies ergibt die folgende Sequenzsatz-Statistik:
Die Beziehung der Sequenzsatz-Statistik zu den variierenden Nachweisgrenzen kann durch Berechnung der "Sicherheitsfaktoren" wie folgt ausgedrückt werden:
Die Herleitung dieser Zahlen wird nachstehend ausffihrlicher erläutert.
Die Diversität dieser Bank (DL) beträgt 100&sup6; (10¹²). Falls in der Bank 10&sup7; Kügelchen (BL) und 6 x 10¹³ Moleküle/Kügelchen (MB) vorhanden sind, gibt es 6 x 10²&sup0; Moleküle in der Bank (ML). Es ist deshalb möglich, (6 x 10²&sup0;/10¹² = 6 x 10&sup9;) identische Moleküle einer jeden einzigartigen Peptidsequenz zu haben.
Jedes Kügelchen hat eine Diversität von 100³ (10&sup6;). Bei 6 x 10¹³ Molekülen auf dem Kügelchen beträgt die erwartete Anzahl der identischen Moleküle pro Kügelchen (6 x 10¹³/10&sup6; = 6 x 10&sup7;), die ausreichend über dem Wert von 10&sup6; liegt, von dem angenommen wurde, daß er zum Nachweis erforderlich ist. Es gibt auch 100³ (10&sup6;) verschiedene Synthese-"wege", die die Kügelchen während der strukturierten Zyklen genommen haben, und deshalb beträgt die erwartete Anzahl der Kügelchen, die einen bestimmten Weg genommen haben, (10&sup7;/100³ = 10), wobei dieser Wert ausreichend über der gewünschten Mindestmenge von 1-2 liegt. Schließlich sind 6 x 10¹³ Hexapeptidmoleküle pro Kügelchen die äquivalente Menge von 100 pMol/Kügelchen. Da alle Moleküle auf einem einzelnen Kügelchen die gleichen ersten drei Aminosäuren aufweisen, liegt dieses erste Tripeptid in einer Konzentration von 100 pMol vor, während 25 zur Sequenzierung als wünschenswert erachtet wird.
Das Vorstehende zeigt folglich die Durchführbarkeit der Durchmusterung der Hexapeptidbank, wobei jeder Rest aus einem Satz von 100 verschiedenen Aminosäuren gewählt ist.

Beispiel 3

Ein anderer Weg zur Synthese einer Bank von allen möglichen Hexapeptiden, die aus 100 verschiedenen Aminosäuren hergestellt werden könnten, ist durch eine Kombination von sechs teilweise strukturierten zufälligen Zyklen.
In den Zyklen 1-3 werden die Reste 4-6 bereitgestellt. In jedem Zyklus werden die Kügelchen in die vier Aliquots A, B, C und D aufgeteilt. Aliquot A wird mit dem Aminosäuregemisch A' (Aminosäuren 1-25), Aliquot B mit Gemisch B' (Aminosauren 26-50), C mit C' (Aminosäuren 51-57) und D mit D' (Aminosäuren 76-100) umgesetzt. Am Ende eines jeden Zyklus werden die Aliquots wieder vereinigt.
In den Zyklen 4-6 werden die Reste 1-3 angehängt. In jedem Zyklus werden die Kügelchen in 50 verschiedene Aliquots aufgeteilt und jedes Aliquot wird mit einem einzigartigen Gemisch von zwei der 100 verschiedenen Aminosäuren umgesetzt. Wo möglich, wird eine schwierig zu sequenzierende Aminosäure mit einer einfach zu sequenzierenden Aminosäure gepaart.
Dieser Syntheseplan ist nachstehend zusammengefaßt: Tabelle 3
Die Sequenzsatz-Statistik und die Bank-Sicherheitsfaktoren sind wie folgt:
Falls jedes Kügelchen in einem bestimmten Zyklus 100 pMol der Aminosäure aufnimmt, sind die Reste 1-3 sequenzierbar, da jede der zwei möglichen Aminosäuren in einer Konzentration von (100/2=) 50 pMol vorliegt (um das Fünffache mehr als der Wert von 10 pMol, von dem angenommen wurde, daß er zur Sequenzierung erforderlich ist). Die Diversität pro Kügelchen beträgt 2³ x 25³ oder 125 000. Die erwartete Anzahl der identischen Moleküle einer jeden Sequenz beträgt (6 x 10¹³/125 000) oder 5 x 10&sup8;.
Der Verteilungsfaktor der Bank ist 50³ x 4³ oder 8 x 10&sup6;. Bei 10&sup7; Kügelchen in der Bank beträgt die erwartete Anzahl der Kügelchen, die jede mögliche Verteilungs-Permutation darstellen, (10&sup7;/8 x 10&sup6;) = 1,25.

Beispiel 3A: Durchmusterung der primären Bank hinsichtlich einer TNF-Bindung

Zur Veranschaulichung des Verfahrens wird die vorstehende Bank hinsichtlich Kügelchen, die THF spezifisch binden, wie folgt durchmustert: Die Kügelchen werden mit einer Lösung gemischt, die TNF (Tumomekrosefaktor) in einer Konzentration von 10 ug/ml in 5%igem fettarmen Milchpuffer enthält. Nach Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) werden die Kügelchen mit Kaninchen-Antikörpern inkubiert, die für TNF spezifisch sind, wie zuvor gewaschen und mit für Kaninchen-Immunglobulin spezifischen Antikörpern inkubiert, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert sind (Anti-Kaninchen-Ig-alkalische Phosphatase). Nach dem Waschen werden die Kügelchen dem Substrat BCIP (5-Brom- 4-chlor-3-indolylphosphat) ausgesetzt. Diejenigen Kügelchen, die den Liganden und/oder die Immunglobuline gebunden haben, werden blau gefärbt.
Die gefärbten Kügelchen werden mit einer Mikropipettiervorrichtung unter einem Mikroskop gewonnen und durch eine DMF-Behandlung entfärbt. Die gebundenen Proteine (TNF und Antikörper) werden durch Waschschritte mit 0,1 N HCl entfernt. Die entfärbten Kügelchen werden mit dem Anti-TNF- und Anti-Kaninchen-Ig-alkalische Phosphatase-Konjugat ohne Vorinkubation mit TNF umgesetzt. Einige der Kügelchen, die durch die Antikörper gefärbt wurden, werden entfernt. Die Peptide auf den Kügelchen, die bei diesem Schritt gefärbt wurden, binden offensichtlich an die Antikörper oder die alkalische Phosphatase und binden TNF nicht (natürlich könnte TNF durch ein anderes Zielmolekül ersetzt werden).

Beispiel 38: Durchmusterung der ausgewählten TNF-Bindungskügelchen, die TNF gebunden haben der primären Bank hinsichtlich der Bindung von TNF-TBP1-Komplexen

Die ungefärbten Kügelchen aus dem vorhergehenden Schritt werden wie vorstehend mit TNF und dann mit TBP1 (TNF-Bindungsprotein p55 oder löslicher TNF-Rezeptor vom Typ 1) umgesetzt. Die Kügelchen werden dann mit für TBP1 spezifischen Kaninchen- Antikörpern und, wie vorstehend, mit den an alkalische Phosphatase konjugierten Anti- Kaninchen-Ig-Antikörpern umgesetzt. Die Kügelchen werden dann durch Umsetzung mit BCIP gefärbt. Die blauen Kügelchen binden TNF offensichtlich in einer Orientierung, die zuläßt, daß das gebundene TNF an TBP1 bindet. Die ungefärbten Kügelchen binden offensichtlich TNF in einer Orientierung, die die aktive Stelle blockiert. Die Kügelchen, die ungefärbt waren, wenn sie TBP1 und seinen Antikörpern ausgesetzt wurden, werden dann wie vorstehend mit Antikörpern gegen TNF umgesetzt, um zu überprüfen, ob sie TNF noch binden. Die gefärbten Kügelchen werden dann einer N-terminalen Sequenzierung unterworfen. Die Peptide auf diesen Kügelchen hemmen die TNF-Aktivität durch Inhibierung seiner Bindung an den löslichen Rezeptor vom Typ 1, TBP1. Da der lösliche Rezeptor den extrazellulären Teil des Zelloberflächenrezeptors darstellt, sollte das Peptid durch die Bindung auch an den letzteren die Bindung von TNF an den Rezeptor inhibieren und auf diese Weise den schädlichen Einfluß von TNF verbessern.

Beispiel 3C: Sekundäre Bank

Die Sequenzierung eines jeden aus der primären Bank ausgewählten Kügelchens ergibt zwei Aminosäuren für jede der Positionen 1 -3. Bei dem vorliegenden Beispiel enthält jede Position 2 Aminosäuren. Folglich gibt es 8 verschiedene mögliche Tripeptide. Für jede Sequenz der drei Aminosäuren, die aus der Analyse der ausgewählten Kügelchen erhalten wurde, synthetisierten die Anmelder 8 verschiedene sekundäre Banken, wobei jede ein einzelnes Tripeptid der möglichen 8 repräsentiert. Die Positionen 4-6 einer jeden der 8 sekundären Banken enthalten zwei Aminosäuren pro Position, wie es für die Positionen 1-3 der ersten Bank durchgeführt wurde. Jede sekundäre Bank enthält 10&sup6; Kügelchen, um die vollständige Ausprägung aller möglichen Hexapeptide aus dem zur Herstellung der Bank verwendeten Satz von 100 verschiedenen Aminosäuren zu ermöglichen.
Die 8 sekundären Banken werden auf Grundlage der Ergebnisse der Sequenzierung der ersten 3 Positionen bei einem ausgewählten Kügelchen das aus der primären Bank erhalten wurde, gemäß der folgenden Tabelle synthetisiert: Tabelle 3c
Der Verteilungsfaktor für die Bank ist 50³ (125 000), für den 10&sup6; Kügelchen ausreichend sind. Die Diversität eines jeden Kügelchens beträgt nur 8 und die Reste 4-6 sind sequenzierbar (die Reste 1-3 sind in einer bestimmten sekundären Bank identisch). Die Diversität der sekundären Bank beträgt 100³.
Jede der auf diese Weise synthetisierten sekundären Banken wird mittels einer Sonde untersucht, wie vorstehend für die Durchsuchung der primären Bank beschrieben ist. Die Identität der am stärksten gelärbten Bank gibt die genaue Sequenz des Tripeptids an den Positionen 1-3 vom N-Terminus an.
Die am dunkelsten getärbten Kügelchen aus der Bank werden ausgewählt und einer N-terminalen Sequenzierung unterzogen. Die Sequenz der ersten 3 Positionen sollte aus der Synthese dieser Bank bekannt sein (eines der 8 möglichen Peptide), und die Sequenzinformation für die Positionen 4-6 (zwei mögliche Aminosäuren an jeder) ist die Grundlage für die tertiäre Bank, die nachstehend beschrieben wird.

Beispiel 3D: Tertiäre Bank

Da die Diversität eines jeden Kügelchens in der sekundären Bank nur 8 beträgt, ergibt die Sequenzierung der Peptide auf einem aktiven Kügelchen, daß eine oder mehrere der 8 möglichen Sequenzen eine aktive Sequenz ist. Die in diesem Beispiel beschriebene tertiäre Bank hat zwei Ziele: die Identifizierung der genauen Sequenz in bezug auf die Reste 4-6; und die Ermittlung derjenigen aus den gleichen 100 Aminosäuren erzeugten Nonapeptide, die mit der aktiven Hexapeptidsequenz beginnen.
Es gibt 8 tertiäre Banken, wobei jede eine der 8 möglichen Sequenzen an den Resten 4-6 für das aktive Kügelchen aus einer der sekundären Banken des letzten Beispiels darstellt. Für eine bestimmte tertiäre Bank ist der Syntheseplan wie folgt: Tabelle 3d
Dieser ergibt eine Kügelchen-Diversität von 8 und eine Bank-Diversität von Falls ein aktives Kügelchen vorhanden ist, sind die Reste 4-6 bekannt (auf Grund der Kenntnis, in welcher tertiären Bank sich das Kügelchen befand), und die Reste 7-9 sind auf eine der acht Möglichkeiten beschränkt (wie durch die Sequenzierung dieser Reste auf dem Kügelchen gezeigt wurde).
Es sollte offensichtlich sein, daß es möglich ist, die nächsten acht quaternären Dodecapeptidbanken zu synthetisieren, um die Reste 7-9 zu identifizieren, während die Möglichkeiten an den Positionen 9-12 untersucht werden, und so weiter, durch weitere Generationen von Banken hindurch.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird eine Octapeptidbank vorgestellt. Für dieses Beispiel nehmen die Anmelder an, daß 10&sup8; Kügelchen in der Bank und 6 x 10¹³ Peptide (100 pMol) pro Kügelchen vorliegen und es eine Nachweisgrenze eines aktiven Kügelchen mit 10&sup6; aktiven Molekülen darauf und eine Sequenzierungsgrenze von 10 pMol/Rest pro Kügelchen gibt. Die Bank wird wie folgt hergestellt:
Diese Bank weist daher die folgende Statistik auf:
Falls die Anzahl der Kügelchen in der Bank (BL) innerhalb von einer oder zwei Größenordnungen des Verhältnisses (MB/MB') liegt, wobei MB die Anzahl der Moleküle pro Kügelchen ist und MB' die Molekül-pro-Kügelchen-Nachweisgrenze ist, ist die beste Strategie im allgemeinen, eine gleiche Anzahl von strukturierten und unstrukturierten zufälligen Zyklen zu verwenden, z.B. 4 und 4 für eine Octapeptidbank.
Diese Annahme kann jedoch nicht immer gültig sein. Man nehme an, daß 10&sup9; Kügelchen in der Bank vorhanden sind, die Nachweisgrenze aber 10&sup8; Moleküle pro Kügelchen beträgt.
Eine vier-und-vier Strategie ergibt die folgende Statistik:
Es wäre sicherer, fünf strukturierte und drei unstrukturierte zufällige Zyklen zu verwenden.

Experimentelles Beispiel A

1. Synthese eines Modellpeptids: N-Ala-Leu-Pro (PLA) auf Eupergit C-Harz

Unter Anwendung der herkömmlichen Festphasensynthese mit Fmoc-geschützten Aminosäuren synthetisierten die Anmelder die PLA-Sequenz auf epoxy-aktiviertem Eupergit C (Rohm, Darmstadt, Deutschland; alternativ Spectra/Cryl, Spectrum, Houston, Texas, USA)-Harz (Kügelchendurchmesser 250u) nach Einführung von Cystamin als Linker und bestimmten die Peptidausbeute pro Kügelchen mittels Mikrosequenzierung der Aminosäuren. Auf diese Weise bestätigten die Anmelder ihr Syntheseverfahren und ihre Reagenzien und zeigten, daß sie die aminoterminale Sequenz eines Kügelchens bestimmen können (etwa 20- 40 pMol Aminosäure pro Kügelchen). Die Möglichkeit zur Sequenzierung eines Kügelchen ist für den Peptidbank-Ansatz essentiell. Die durchschnittliche Ausbeute pro Kügelchen von jeder Aminosäure aus den Sequenzen unter Zugrundelegung der Sequenzierung von 20-30 Kügelchen betrug:

2. Synthese einer Peptidbank auf den Eupergit C-Kügelchen

Die Bank wurde aus 37 verschiedenen Aminosäuren hergestellt (den genetisch codierten Aminosäuren, ausgenommen L-Cystein; ihren D-Formen, ausgenommen D-Isoleucin; plus L-Norleucin) und in sechs zufälligen Schritten (die gesamte Bank erhält ein Gemisch von allen Aminosäuren), gefolgt von drei strukturierten Schritten (je 1/37 der Bank erhält eine einzige Aminosäure), konstruiert. Diese Bank wurde zuerst dazu verwendet, die Einführung aller verschiedenen Aminosäuren, allein oder in einem Gemisch, durch Sequenzierung zu analysieren. Die Anmelder zeigten durch die Sequenzierung, daß alle Aminosauren in der Bank vertreten waren. Die folgende Tabelle gibt die durch Sequenzierung der Kügelchen erhaltenen durchschnittlichen Ausbeuten in pMol pro Kügelchen an.
Im strukturierten Bereich lagen die meisten der Aminosäuren in äquimolaren Mengen vor (einige wie Serin ergaben einen sehr schwachen Peak, was auf das Sequenzierungsproblem zurückzuführen ist), während die Verteilung im zufälligen Bereich nicht äquimolar war. Es gab eine Abweichung von der zufälligen Repräsentation von etwa einer Größenordnung von den besten zu den am wenigsten vertretenen Aminosäuren. Die bevorzugten Aminosäuren waren Alanin, Asparaginsäure, Phenylalanin, Methionin und Leucin. Die am wenigsten vertretenen Aminosäuren waren Serin Threonin, Isoleucin, Trypthophan und Valin. Für Isoleucin und Valin beobachteten die Anmelder daß sie in den ersten 3 Positionen, wo jede Aminosäure allein eingebaut wurde, stark vertreten waren, aber in den Positionen 4-6 weniger gut vertreten waren, wo sie aus einem Gemisch eingebaut wurden. Auf diese Weise konnten die Anmelder zwischen Schwierigkeiten hinsichtlich der relativen Kopplungseffizienz und Schwierigkeiten bei der Sequenzierung unterscheiden. Da der N-Terminus der Peptide, der den strukturierten Teil enthält, einzigartig ist und der wichtige Teil bei diesem Banktyp ist waren die Anmelder über die Unterschiede der Repräsentationsraten der Aminosäuren in dem zufälligen Teil nicht beunruhigt.

3. Durchmusterung der Eupergit C-Peptidbank mit Rhodamin-markiertem TBP1

Gereinigtes TBP1 (TNF-bindendes Protein; lösliche extrazelluläre Domäne des TNF-Rezeptors vom Typ 1, p55) (das rekombinante, menschliche, in CHO-Zellen produzierte, affinitätsgereinigte TBP1 wurde von Interpharm Laboratories, Ltd., erhalten) wurde mit Rhodamin markiert und auf die Peptidbank angewendet. Das Ergebnis war eine rosafarbene Hintergrundfärbung der Kügelchen, die wahrscheinlich aus der starken Hydrophobizität der Eupergit C-Matrix resultierte. Die Anmelder beobachteten auch die Zerbrechlichkeit der Kügelchen. Aus diesen zwei Gründen beschlossen die Anmelder, dieses Harz nicht weiter zu verwenden und ein "klassisches" Festphasen-Syntheseharz zu verwenden, nämlich mit Divinylbenzol vemetztes Polystyrol (PS-DVB).

4. Synthese des PLA-Modellpeptids auf aminomethyliertem Polystyrol-1% DVB-Harz

Das Tripeptid wurde auf dem DVB-Polystyrol-Harz (Kügelchendurchmesser 150u) wie in Absatz 1 mit ähnlichen Ergebnissen synthetisiert.

5. Oberflächenfärbung und ELISA-Modellexperimente mit TBP1-konjugierten Kügelchen

Gereinigtes TBP1 wurde an aminomethylierte Polystyrolkügeichen immobilisiert (1,5 ml beladenes Harz wurden mit 1,5 ml 10%igem Glutaraldehyd 30 Minuten umgesetzt, und 1 mg TBP1 wurde zugegeben und 1 Stunde konjugiert), und die Kügelchen wurden mit einem mit alkalischer Phosphatase markierten monoclonalen Antikörper (vgl. EP-Anmeldung 412,486) oder mit polydonalen Kaninchen-Antikörpern gegen TBP1, gefolgt von mit alkalischer Phosphatase markiertem Anti-Kaninchen-IgG, immunologisch gefärbt.
Zwei signalerzeugende Systeme wurden getestet, die beide durch alkalische Phosphatase vermittelt werden: die Oberflächenfärbung der Kügelchen mit dem unlöslichen Produkt, das durch das Substratsystem 5-Brom-4-chlor-indolylphosphat/Nitroblau-tetrazolium (BCIP/NBT) erzeugt wird, und der lösliche Farbstoff der von dem para-Nitrophenylphosphat (pNPP)-Substrat erzeugt wird.
Beim ersten System wurden die Kügelchen (etwa 50ul, beladen) bei der Färbung mit monoclonalen Antikörpern mit 5% FBS (fötales Rinderserum) in PBS inkubiert und dann mit dem mit alkalischer Phosphatase konjugierten monoclonalen Antikörper gegen TBP1 in einer Konzentration von 1 - 10 ug/ml (in FBS/PBS) 30 Minuten inkubiert. Nach Waschschritten mit 0,05 % Tween 20 enthaltendem PBS wurden pro Röhrchen 330 ul BCIP/NBT-Substrat (Bio Rad-Kit, Katalognummer 170-6432, 1:100/1:100 gemäß den Anweisungen des Herstellers in 0,1 M Tris, pH 9,5, verdünnt) zugegeben. Bei der Färbung mit polyclonalen Antiseren wurden die Kügelchen (etwa 50 ul, beladen) mit 5% FBS (fötales Rinderserum) in PBS inkubiert und anschließend mit 1:2000 (in FBS/PB S-Puffer) verdünntem polyclonalem Kaninchenserum gegen TBP1 30 Minuten inkubiert. Nach Waschschritten mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS wurde an Ziege-anti-Kaninchen-IgG konjugierte alkalische Phosphatase (Bio Makor, Katalognummer 3471), 1:1000 verdünnt (in FBS/PBS-Puffer), für eine 30minütige Inkubation zugegeben, die im Anschluß daran durchgeführten Waschschritte und die Substratzugabe erfolgten wie vorstehend beschrieben.
Beim zweiten System entsprach das Verfahren dem vorstehend für polyclonale Antiseren beschriebenen, aber das zugegebene Substrat war para-Nitrophenylphosphat (pNNP, Sigma 104 , 5 mg-Tablette in 10 ml 10 mM Diethanolamin, pH 9,5, mit 0,5 mM MgCl&sub2;) anstelle von BCIP/NBT und der lösliche Farbstoff wurde bei 37ºC gebildet. Die resultierenden OD-Werte einer jeden Probe wurden bei 405 nm in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten überwacht.
Die Ergebnisse zeigten eine stark spezifische, positive Oberflächenfärbung (mit BCIP/NBT) der TBP1-gekoppelten Kügelchen, verglichen mit der Färbung von Kontrollkügelchen oder der Färbung von TBP1-markierten Kügelchen mit Kontrollantikörpern. Bei der Oberflächenfärbung war im wesentlichen kein Hintergrund vorhanden. Die Anmelder konnten ein gefärbtes Kügelchen unter Tausenden von ungefärbten Kügelchen unter einem Durchstrahlungsmikroskop oder einem Reflexionsstereomikroskop (Präpariermikroskop) leicht identifizieren und entnehmen. Obwohl das Nachweissystem mit dem löslichen Substrat nicht empfindlich genug war, um den Nachweis eines einzelnen gefärbten Kügelchen zu ermöglichen, konnte es im Vergleich zur Kontrolle nur zehn positiv gefärbte Kügelchen in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte nachweisen.
Andere signalerzeugende Systeme, die getestet wurden, umfassen die Verwendung eines Chemolumineszenzsubstrats, die Färbung der Kügelchen mit mit kolloidalem Gold markierten zweiten Antikörpern oder die Verwendung von ¹²&sup5;I-markierten Sonden. Jedoch war keines dieser Systeme empfindlich genug, um den Nachweis eines Signals von einzelnen Kügelchen zu erlauben. Obwohl ein solches System für die vorliegende Erfindung nicht erforderlich ist, erlaubt es die Erhöhung der Diversität der Bank.

6. Synthese einer Peptidbank auf aminomethylierten Polystyrolkügelchen

Die Bank wurde unter Verwendung der 37 Aminosäuren synthetisiert und aus sechs "halb zufälligen" Schritten und drei strukturierten Schritten hergestellt, wobei die Struktur NH&sub2;-1-1-1-2-3-4-5-6-7-COO-NH-CH&sub2;-Kügelchen erhalten wurde (jede Nummer gibt die Anzahl der verschiedenen Aminosäuren an, die bei einem bestimmten Kopplungsschritt zu jedem Teil der Kügelchen zugegeben wurde). Diese Strategie wurde angewendet, um die Anzahl der vorliegenden Peptide zu erhöhen, ohne den Umfang der Bank (Volumen oder Anzahl der Kügelchen) zu vergrößern. Jedes Kügelchen ist deshalb in den 3 Positionen ausgehend vom Amino-Terminus einzigartig, enthält zwei verschiedene Aminosäuren in Position 4, drei in Position 5 und so weiter. Die Anmelder nehmen an, daß mindestens ein Pentapeptid erforderlich ist, um eine Bindungsaffinität zu erzielen, die zum Immunnachweis der Kügelchen ausreichend ist.
Die in den halb-zufälligen Schritten tatsächlich verwendeten Aminosäuren entsprachen den nachstehend angegebenen, wobei die "Position" vom Amino-Terminus aus bestimmt wurde. In den Untertiteln wie "9-3" ist die erste Zahl die Restposition und die zweite Zahl ist die Gruppennummer. Jede Gruppe ist ein Gemisch von Aminosäuren, mit dem ein Aliquot von Kügelchen umgesetzt wird. Die Anzahl der Gruppen entspricht dem Verteilungsfaktor. Gruppe 9-3 ist eine von fünf Gruppen und eine jede der Gruppen für die Position 9 setzt sich aus 7 oder 8 Aminosäuren zusammen. Position 9: Position 8: Position 7: Position 6: Position 5: Position 4:

7. Erste Durchmusterung der Polystyrol-Peptidbank mit TBP1

Ein Viertel (400 ul, beladen) der gesamten Anzahl der Kügelchen würde mit 5% FBS in PBS blockiert (1 ml für 45 Minuten), um eine unspezifische Bindung zu verhindern, und mit TBP1 inkubiert (1 ml in einer Konzentration von 10 ug/ml in FBS/PBS für 45 Minuten), gefolgt von polyclonalen Kaninchen-anti-TBP1-Antikörpern (1:500 in FBS/PBS, 1 ml für 1 Stunde) und mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG- Antikörpern (1:2000 in FBS/PBS, 1 ml für 40 Minuten). Das Signal wurde durch das BCIP/NBT-Substrat erzeugt (12 ml in einer 9 cm großen Petrischale, weitere Einzelheiten vgl. vorstehend Punkt 5). Mehr als 50 gefärbte Kügelchen wurden ausgewählt und drei von ihnen wurden einer Sequenzierung unterworfen. Zwei weitere Kügelchen, die durch die Durchmusterung eines zweiten Viertels der Bank mit 100 ng/ml TBP1 (das Signal wurde mit FAST-RED (4-Chlor-2-methylbenzvldiazoniumsalz, bereitgestellt von Sigma, St. Louis, Missouri, USA, das in Verbindung mit Naphthol-AS-MX, 3-Hydroxy-2-naphthoesäure-2,4- dimethylanilid, verwendet wurde)-Substrat erzeugt) ausgewählt wurden, wurden ebenfalls sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen der fünf Kügelchen sind:

8. Testen der Spezifität der ausgewählten Kügelchen

Die ausgewählten Kügelchen wurden infolge ihrer Fähigkeit gefärbt, entweder TBP1, die Antikörper gegen TBP1, die Ziegen-Antikörper gegen Kaninchen-IgG oder alkalische Phosphatase zu binden. Es war deshalb erforderlich, die Antikörper und alkalische Phosphatase bindenden Kügelchen von denjenigen zu unterscheiden, die TBP1 binden. Ein Weg zur Überprüfung der Spezifität der Kügelchen ist, die Kügelchen zu entfärben und mit allen Komponenten, jedoch ohne den Zielliganden TBP1, erneut zu färben. Die Kügelchen, die durch die Antikörper allein gefärbt wurden, wurden als unspezifisch bindende Kügelchen entfernt.

9. Entfärben und erneutes Färben

Das BCIP/NBT-Substrat, das die Anmelder zur Färbung der Kügelchen verwendeten, konnte durch keine Behandlung, die die Anmelder versuchten (organische Lösungsmittel, Harnstoff, SDS, NaOH, Kochen, Beschallen und Kombinationen aller vorstehenden), entlärbt werden, und sie beschlossen daher, ein anderes Substrat der alkalischen Phosphatase zu verwenden, das leicht entfärbt werden kann. Die Verwendung des Substrats FAST-RED ergab eine ausreichende Färbung, Entfärbung und erneute Färbung der Modellkügelchen (die mit alkalischer Phosphatase markiertes IgG adsorbierten). Aus unbekannten Gründen konnten die gefärbten Kügelchen der Bank nicht wieder gefärbt werden. Der Austausch von NBT durch MTT ergab die gewünschten Ergebnisse, und gefärbte Kügelchen konnten durch einen kurzen DMF-Waschschritt entfärbt werden.

10. Auswahlverfahren

Bei der Durchmusterung eines kleinen Volumens (< 5 ml, beladen) der Kügelchen- Bank, in dem die Anzahl der gefärbten Kügelchen verhältnismäßig gering ist, ist es möglich, die ausgewählten gefärbten Kügelchen mit einer Pinzette oder einer Mikropipettiervorrichtung zu entnehmen. Falls eine große Anzahl von gefärbten Kügelchen entnommen werden soll, kann die manuelle Handhabung zu viel Zeit in Anspruch nehmen. Die Anmelder testeten daher mehrere Verfahren zur schnelleren und einfacheren Sortierung. Den Anmeldern gelang die Trennung von positiven Modellkügeichen (TBP1 kovalent immobilisiert) von negativen Kügelchen durch ihre Umsetzung mit kleineren magnetischen Kügelchen, die an Anti-Kaninchen-Antikörper gekoppelt waren. Die Anti-Kaninchen-Antikörpern auf den magnetischen Kügelchen binden die TBP1 tragenden Kügelchen, die zuvor mit Kaninchen-anti-TBP1-Antikörpern umgesetzt wurden. Die magnetisch markierten Kügelchen wurden mit einem Magnet abgetrennt. Die Trennungsbedingungen waren wie folgt:
TBP1-Kügelchen: vgl. Punkt 5;
Kontrollkügelchen: nicht modifizierte Kügelchen aus aminomethyliertem Polystyrol;
Gemisch von 1% TBP1-Kügelchen in Kontrollkügelchen (insgesamt 50 ul Kügelchen);
Blockierung: 1 ml 5%ige fettarme Milch in PBS + 0,05% Tween 20;
Gereinigtes polyclonales Kaninchenserum gegen TBP1, 6 ug/ml in FBS/PBS, 1 ml für 30 Minuten;
Waschschritte mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS;
Schaf-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt an magnetische Kügelchen (Dynabeads M-280, Dynal, Katalognummer 112.03, 2,8 um Durchmesser), 1:100 in Blockierungspuffer verdünnt, 1 ml für 30 Minuten); und
Magnetische Sortierung + 2 Waschschritte unter Verwendung der "Magnetic Particle Concentrator" MPC -1-Vorrichtung (Dynal, Katalognummer 120.01).
Unter Verwendung eines solchen Systems zeigten die Anmelder, daß es möglich ist, alle der mit TBP1 bedeckten Kügelchen aus einem Überschuß an Kontrollkügelchen herauszuholen. 99,9% der Kügelchen in der gebundenen Fraktion waren TBP1-Kügelchen und nur 0,1% waren Kontrollkügelchen.

11. Bestätigung der Sequenz

Das Sequenzanalysegerät kann nicht zwischen L- und D-Aminosäuren unterscheiden. Folglich ist die Sequenzinformation nicht vollständig. Die Information über die ersten drei Aminosäuren läßt acht (2³) mögliche Sequenzen zu, und die Anmelder müssen herausfinden, welche die richtige ist. Von den ersten zwei Kügelchen, die sequenziert wurden, erhielten die Anmelder zwei sich teilweise überlappende Sequenzen: N-Ala-Cly-Met und N-Ala-Glu-Met. Die 12 möglichen Peptide die aus den Sequenzen der ersten zwei ausgewählten Kügelchen erhalten wurden, wurden auf Kügelchen synthetisiert, die eine zufällige Ansammlung aller Aminosäuren in den Positionen 1-6 vom C-Terminus enthalten. Die 12 Peptide (jedes wurde auf etwa 100 000 Kügelchen synthetisiert) wurden hinsichtlich einer TBP1-Bindung mittels des üblichen Verfahrens, aber mit dem löslichen Substrat getestet. Das Peptid N-DAla-DGlu-LMet ergab einen hohen OD-Wert (zehnmal höher als der Hintergrund) und die anderen 11 Peptide ergaben niedrigere Werte (zwischen Hintergrundswert und dem Dreifachen des Hintergrundwerts). Die Spezifität des Peptids gegenüber TBP1 wurde durch die ausbleibende Antwort mit den Antikörpern allein ebenfalls bestätigt. Der so erhaltene OD-Wert in Gegenwart von TBP1 war um das Vierfache höher als mit den Antikörpern allein.

12. Synthese der sekundären Banken

Die durch die Analyse des ersten Kügelchens identifizierte Sequenz wurde zur Synthese von 37 Peptiden auf Kügelchen (150 ul, beladen, etwa 200 000 Kügelchen) verwendet, wobei die Synthese mit 5 zufälligen Schritte begonnen wurde. An der vierten Stelle vom Amino-Terminus wurden die Kügelchen in 37 Gruppen aufgeteilt und jede Gruppe erhielt eine unterschiedliche Aminosäure. Die drei terminalen Aminosäuren waren N-Dala-Dglu- Lmet. Auf diese Weise erhielten die Anmelder 37 Peptide, die sich an der vierten Position unterschieden. Die Färbung der 37 Peptide (getrennt, unter Verwendung des löslichen Substrats) zeigte, daß L-Serin die bevorzugte Aminosäure an der vierten Position ist. Das Verfahren wurde wiederholt, um die Aminosäure an Position 5 vom N-Terminus zu identifizieren, zu diesem Zeitpunkt erkannten die Anmelder jedoch einige Probleme, die im nächsten Absatz beschrieben werden, so daß sie sich über die durch den Ansatz mit dem löslichen Substrat erhaltenen Ergebnisse nicht sicher waren.

13. Durchmusterung mit dem löslichen Substrat (ELISA)

Die ELISA-Tests wurden in aus Polypropylen-Spritzen hergestellten Minisäulen durchgeführt, die mit einer Polyethylen-Fritte als Trägersubstanz ausgestattet waren. Gleiche Mengen von Kügelchen einer jeden getesteten Gruppe wurden in jede Säule eingebracht. Die Reagenzien und das allgemeine Verfahren entsprachen jenen, die für die Modellkügelchen in Punkt 5 für das zweite System beschriebenen wurden; 200-500 ul Reagens wurden bei jedem Schritt zu jeder Säule zugegeben. Nach Zugabe des Substrats wurden die Säulen bei 37ºC etwa 60 Minuten inkubiert und dann wurden 200 ul Substrat einer jeden Säule (ohne die Kügelchen) in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte zur OD-Messung bei 405 nm überführt.
Die Verwendung eines löslichen Farbprodukts zur Überwachung von Unterschieden zwischen Peptiden scheint sehr nützlich zu sein, insbesondere da die Verwendung eines ELISA-Lesegeräts die Unterscheidung kleiner Unterschiede zwischen Färbungsintensitäten ermöglicht. Wenn die Anmelder es jedoch für sekundäre Banken verwendeten, zeigten die Ergebnisse, daß es nicht möglich ist unter Zugrundelegung des Beitrags von nur 3 spezifischen Aminosäuren eine positive Bindungsantwort zu erhalten (verglichen mit dem Beitrag von 5-6 Aminosäuren in der ursprünglichen Bank). Weitere Experimente zeigten das Vorliegen von Artefakten, die sich aus dem beobachteten starken Hintergrund ergaben, wenn das lösliche Substrat verwendet wurde. Der Hintergrund ist offensichtlich auf den Behälter und nicht auf die Kügelchen zurückzuführen. Die Anmelder nehmen an, daß das Problem aus der Absorption von Proteinen an die Polyethylen-Fritten der als Reaktionsgefäße verwendeten Säulen resultiert. Es kann möglich sein, diese Absorption zu blockieren und auf diese Weise die Ergebnisse zu verbessern.

14. Sekundäre Bank und Sequenzbestätigung für die Sequenz: N-Ser-Lys-Val

Acht sekundäre Banken, die auf der Sequenz basierten, die durch die Durchmusterung der Bank mit 100 ng/ml TBP1 (vgl. Punkt 7) erhalten wurde, wurden mit der allgemeinen Struktur: N-Ser-Lys-Val-1-1-1-R-R-R-Kügelchen synthetisiert, wobei R ein zufälliger Schritt bedeutet und 1 eine der bei jedem Schritt zu jedem Kügelchen zugegebenen 37 Aminosäuren ist und wobei jede der acht Banken an den drei N-Positionen eines der möglichen Peptide erhielt (Kombination der L- und D-Isomeren). Jede sekundäre Bank enthielt etwa 50 000 Kügelchen, die alle der möglichen Kombinationen der strukturierten drei Aminosäuren an den Positionen 4-6 vom N-Terminus umfassen sollten. Die acht Banken wurden mittels Oberflächenfärbung durchmustert. Die Ergebnisse zeigten, daß für die N-terminale Sequenz: N-DSer-DLys-LVal ein (Gruppe Nr. 4)-Kügelchen der stark gefärbten Kügelchen der Gruppe 4 bestimmt wurde und die erhaltene Sequenz N-Ser-Lys-Val-Lys-Lys war.

15. Spezifität des N-DSer-DLys-LVal-Peptids

Mehrere Färbeschritte wurden mit den Kügelchen der Bank durchgeführt, die die N-DSer-DLys-LVal-Sequenz enthielten, um ihre Spezifität zu überprüfen. Eine mit und ohne TBP1 durchgeführte Immunfiirbung ergab eine Spezifität für die Antikörper. Eine weitere Analyse ergab, daß die vorstehende Sequenz spezifisch die Kaninchen-Immunglobuline von sowohl Kaninchen-anti-TBP1-Antiserum als auch von normalem Kaninchenserum erkannte. Immunglobuline von anderen Tierarten und vom Menschen wurden nicht erkannt.

16. Empfindlichkeit der Oberflächenfärbung

Die Anmelder stießen bei dem Versuch, sehr gute, reproduzierbare Ergebnisse der Oberflächenfärbung zu erhalten, auf einige Schwierigkeiten. Es wurden nie falsch positive Ergebnisse beobachtet. Die Anmelder nehmen an, daß sich die Schwierigkeiten aus der Art des verwendeten Substrats ergaben. Sie versuchten die Konzentration der Reagenzien bis zu einer Menge zu erhöhen, von der sie annahmen, daß sie reproduzierbare Ergebnisse mit einem geringen Hintergrund sicherstellt. Kontrollkügelchen (ohne Peptide) wurden bei ansteigenden TBP1- und Antikörperkonzentrationen und mit verschiedenen Blockem getestet. Die Anmelder zeigten, daß die Hintergrundfärbung auch bei einer hohen Konzentration (z.B. über 10 mg/ml monoclonale Antikörper oder gereinigte polyclonale Antikörper, und Verdünnungen von unter 1:100 der rohen polyclonalen Antikörper) der Antikörper vernachlässigbar war, wenn anstelle von 5% FBS 5% fettarmes Milchpulver verwendet wurden oder wenn die TBP1-Konzentration 100 ug/ml betrug (bei der Verwendung von verdünnten Antikörpern, auch bei einem FBS-Blocker). Die Anmelder bevorzugen, die Durchmusterung unter Verwendung einer hohen Ligandenkonzentration (10-100 ug/ml) durchzuführen und verdünnte Antikörper zu verwenden, um so wenig wie möglich der Immunglobulin und alkalische Phosphatase bindenden Proteine zu selektieren.

17. Anwendung der Auswahlverfahren bei der Durchmusterung hinsichtlich TBP1- bindenden Peptiden

Die gegenwärtig veryügbare Peptidbank (in Absatz 6 beschrieben) wurde hinsichtlich TBP1 und Antikörpern gefärbt und gefärbte Kügelchen wurden wiedergewonnen. Die Kügelchen wurden entfärbt und mit den Antikörpern ohne TBP1 umgesetzt. Mit den Antikörpern gefärbte Kügelchen wurden entfernt. Die Kügelchen wurden dann mit TBP11 umgesetzt, gefolgt von der Umsetzung mit TNF und der Färbung mit Antikörpern gegen TNF. Diejenigen Kügelchen, die TNF gebunden haben, wurden als solche, die den TBP1-TNF- Komplex-Marker erkennen, beiseite gelassen. Solche Peptide könnten wahrscheinlich zur Untersuchung der TBP1-TNF-Komplexbildung verwendet werden. Die Kügelchen wurden dann wieder mit TBP1 und Anti-TBP1-Antikörpern gefärbt und die am stärksten gefärbten Kügelchen wurden ausgewählt. Dieses Färbeverfahren wurde ein zweites Mal wiederholt, um die Spezifität sicherzustellen. Insgesamt wurden etwa 15 Kügelchen gewonnen. Offensichtlich binden diese Kügelchen TBP1 an einer Stelle, die der TNF-Bindungsstelle nahe genug ist, um die Bindung von TNF zu inhibieren, oder anders, die Bindung des Peptids inhibiert die TNF-Bindung durch einen allosterischen Mechanismus. Diese Peptide sind Kandidaten für eine TBP1-Austauschtherapie. In der Diagnostik können sie in Immunotests zur alleinigen Bestimmung des freien TBP1 (eine Information, die sehr nützlich sein kann) und in der Produktion zur Affinitätsreinigung von TBP1 aus Produktionsflüssigkeiten verwendet werden.

Experimentelles Beispiel B

Modellfärbung der Peptidbank mit einem monoclonalen Antikörper gegen menschliches β-Endorphin

Diese Peptidbank ist eine Heptapeptidbank, in der die C-terminale Aminosäure konstant ist. Die anderen sechs Positionen wurden variiert.

Materialien

Kügelchen:

a. Kügelchen der Peptidbank #4 mit hoher Dichte, die entsprechend den folgenden Parametern hergestellt wurde:

- Harztyp: Polystyrol/Divinylbenzol
- Verwendete Aminosäuren = 73
- gesamte Diversität der Hexapeptide: 1,5 x 10¹¹
Struktur: N-2.28-2.28-2.28-5-24-73-L-L-L-Kügelchen; (L = Linker) (die Zahlen entsprechen der statistisch erwarteten durchschnittlichen Anzahl der verschiedenen Aminosäuren, die auf jedem Kügelchen an der angegebenen Position eingebaut wurden. Da die in einem bestimmten Zyklus eingebauten Gruppen unterschiedliche Größen haben können ist die durchschnittliche Anzahl nicht immer eine ganze Zahl. Beispielsweise ist 2,28 der gewichtete Mittelwert von 23 Gruppen mit 2.a.a./Gruppe und 9 Gruppen mit 3.a.a./Gruppe).
Alle Kügelchen wurden in einem Pool miteinander gemischt.
Peptide insgesamt pro Kügelchen = etwa 70 000
Bei diesem Experiment wurden nur etwa 0,2 Hexapeptidwiederholungen pro Sequenz verwendet, in vorherigen Versuchen wurden andere Teile verwendet.
In Bank 4 setzten sich die Gruppen wie folgt zusammen (wobei die Aminosauren durch die ID-Nummer ausgewiesen werden):

Position 6 (eine Gruppe)

Gruppe 1: 1-3, 5; 7-12, 14-23, 28, 29, 31-39, 42-48, 51-66, 68, 70-82, 85-89.

Position 5 (3 Gruppen

Gruppe 1: 3, 7, 8, 9, 14, 15, 18-23, 28, 29, 31-33, 36, 38, 39, 54, 73-76.
Gruppe 2: 1, 2, 5, 11, 16, 17, 52, 53, 55, 59, 60-62, 65, 71, 72, 77-80, 85-89.
Gruppe 3: 10, 12, 34, 35, 37, 42-48, 51, 56-58, 63, 64, 66, 68, 70, 81, 82.

Position 4 (15 Gruppen)

Gruppe 1: 9, 18, 19, 20, 21
Gruppe 2: 28, 29, 58, 73, 74
Gruppe 3: 3, 23, 33, 75, 76
Gruppe 4: 31, 32, 36, 39, 54
Gruppe 5: 7, 8, 14, 15, 36
Gruppe 6: 16, 17, 375 70, 89
Gruppe 7: 2, 5, 11, 79, 80
Gruppe 8: 1, 71, 72, 65
Gruppe 9: 52, 53, 55, 61, 62
Gruppe 10: 43, 85-88
Gruppe 11: 22, 59, 60, 77, 78
Gruppe 12: 63, 64, 66, 68
Gruppe 13: 34, 35, 42, 48, 51
Gruppe 14: 44-47, 82
Gruppe 15: 10, 12, 56, 57, 81

Positiorien 1-3 (32 Gruppen)

Gruppe 1: 11, 20, 21
Gruppe 2: 18, 19
Gruppe 3: 73, 74
Gruppe 4: 28, 29
Gruppe 5: 75, 76
Gruppe 6: 31, 32
Gruppe 7: 38, 39
Gruppe 8: 7, 8
Gruppe 9: 14, 15
Gruppe 10: 16, 17
Gruppe 11: 79, 80
Gruppe 12: 71, 72
Gruppe 13: 52, 53
Gruppe 14: 85, 86
Gruppe 15: 67, 88, 37
Gruppe 16: 59; 60
Gruppe 17: 77, 78
Gruppe 18: 61, 62
Gruppe 19: 63, 64
Gruppe 20: 48, 51, 43
Gruppe 21: 44, 45
Gruppe 22: 56, 57
Gruppe 23: 58, 42
Gruppe 24: 3, 33
Gruppe 25: 68, 66, 1
Gruppe 26: 22, 10, 12
Gruppe 27: 2, 65, 81
Gruppe 28: 46, 47, 23
Gruppe 29: 55, 82
Gruppe 30: 70, 5
Gruppe 31: 89, 34, 35
Gruppe 32: 36, 54

b. Kügelchen der Peptidbank #6 mit hoher Dichte, die entsprechend den Parametern der Bank #4 mit den folgenden Veränderungen hergestellt wurde:

Struktur: N-(1-2)-(2-3)-4-5-8-10-Asn-AcaE-Kügelchen
Peptide insgesamt pro Kügelchen = etwa 7.500
Die Kügelchen dieser Bank wurden nach dem letzten Synthesezyklus (Position 1 von N-Terminus) nicht vereinigt, sondern man ließ sie für die letzten Schritte der Abspaltung der Schutzgruppen und der Durchmusterung entsprechend ihrer Position 1, in Gruppen eingeteilt. In diesem Experiment wurden Gruppen überprüfi, die den N-terminalen Rest Tyr (Gruppe 11) und Pro (Gruppe 12) enthielten.
Die Bank kann weiterhin wie folgt charakterisiert werden:

Position 6 (7 Gruppe)

Gruppe 1: 5, 18-22, 28, 29, 31, 32
Gruppe 2: 1-3, 33, 38, 39, 73-76
Gruppe 3: 9-12, 77-82
Gruppe 4: 43, 56-60, 85-88
Gruppe 5: 23, 44-48, 51, 61-64
Gruppe 6: 34, 35, 52-55, 69, 66, 68, 71, 72
Gruppe 7: 7, 8, 14-17, 36, 37, 42, 70, 89

Position 5 (9 Gruppen)

Gruppe 1: 18, 19, 28, 29, 73-76
Gruppe 2: 7, 8, 14, 15, 20, 21, 31, 32
Gruppe 3: 63, 64, 66, 68, 71, 72, 77, 78
Gruppe 4: 44-47, 85-88
Gruppe 5: 16, 17, 38, 39, 52-55
Gruppe 6: 10, 12, 34, 35, 56, 57, 59, 60
Gruppe 7: 48, 51, 61, 62, 79-82
Gruppe 8: 22, 37, 42, 43, 58, 65, 70, 89
Gruppe 9: 1-3, 5, 9, 11, 23, 33, 36

Position 4 (15 Gruppen)

Gruppe 1: 20, 21, 18, 19, 9
Gruppe 2: 73, 74, 28, 29, 58
Gruppe 3: 75, 76, 23, 3, 33
Gruppe 4: 31, 32, 38, 39, 54
Gruppe 5: 7, 8, 36, 14, 15
Gruppe 6: 69, 16, 17, 70, 37
Gruppe 7: 11, 79, 80, 5, 2
Gruppe 8: 52, 53, 55, 61, 62
Gruppe 9: 43, 85-88
Gruppe 10: 22, 591 60, 77, 78
Gruppe 11: 34, 35, 42, 48, 51
Gruppe 12: 44-47, 82
Gruppe 13: 10, 12, 56, 57, 81
Gruppe 14: 1, 65, 71, 72
Gruppe 15: 63, 64, 66, 68

Position 3 (18 Gruppen)

Gruppe 1: 18, 19, 28, 29
Gruppe 2: 73-76
Gruppe 3: 20, 21, 31, 32
Gruppe 4: 7, 8, 14, 15
Gruppe 5: 71, 72, 77, 78
Gruppe 6: 63, 64, 66, 68
Gruppe 7: 44-47
Gruppe 8: 85-88
Gruppe 9: 52-55
Gruppe 10: 16, 17, 38, 39
Gruppe 11: 56, 57, 59, 60
Gruppe 12: 10, 12, 34, 35
Gruppe 13: 48, 51, 61, 62
Gruppe 14: 79-82
Gruppe 15: 22, 42, 43, 56, 57
Gruppe 16: 37, 65, 70, 89
Gruppe 17: 1, 5, 9, 11
Gruppe 18: 2, 3, 23, 33, 36

Position 2 (24 Gruppen)

Gruppe 1: 11, 20, 21
Gruppe 2: 18, 19, 54
Gruppe 3: 28, 29, 36
Gruppe 4: 5, 75, 76
Gruppe 5: 31, 32, 70
Gruppe 6: 38, 39, 42
Gruppe 7: 7, 6
Gruppe 6: 14, 15, 82
Gruppe 9: 9, 77, 78
Gruppe 10: 23, 46, 47
Gruppe 11: 63, 64, 81
Gruppe 12: 48, 51, 43
Gruppe 13: 44, 45, 65
Gruppe 14: 56, 57, 89
Gruppe 15: 66, 66, 22
Gruppe 16: 79, 80, 33
Gruppe 17: 52, 53, 1
Gruppe 18: 16, 17, 55
Gruppe 19: 71, 72, 3
Gruppe 20: 85, 86, 2
Gruppe 21: 67, 68, 37
Gruppe 22: 59, 60
Gruppe 23: 10, 12, 34, 35
Gruppe 24: 73, 74, 61, 62

Position 1 (40 Gruppen)

Gruppe 1: 20, 21
Gruppe 2: 18, 19
Gruppe 3: 73, 74
Gruppe 4: 28, 29
Gruppe 5: 75, 76
Gruppe 6: 31, 32
Gruppe 7: 38, 39
Gruppe 8: 7, 8
Gruppe 9: 14, 15
Gruppe 10: 16, 17
Gruppe 11: 79, 80
Gruppe 12: 71, 72
Gruppe 13: 52, 53
Gruppe 14: 65, 86
Gruppe 15: 87, 88
Gruppe 16: 59, 60
Gruppe 17: 77, 78
Gruppe 18: 61, 62
Gruppe 19: 63, 64
Gruppe 20: 48, 51
Gruppe 21: 44, 45
Gruppe 22: 561 57
Gruppe 23: 58, 42
Gruppe 24: 3, 33
Gruppe 25: 68, 66
Gruppe 26: 10, 12
Gruppe 27: 34, 35
Gruppe 28: 46, 47
Gruppe 29: 55, 82
Gruppe 30: 70, 5
Gruppe 31: 11, 23
Gruppe 32: 36, 54
Gruppe 33: 37, 81
Gruppe 34: 1
Gruppe 35: 9
Gruppe 36: 69
Gruppe 37: 65
Gruppe 38: 2
Gruppe 39: 43
Gruppe 40: 22

c. Modellkügelchen (TentaGel-Kügelchen, RAPP-Polymer Deutschland), die die Sequenzen n-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu und n-His-Pro-Tyr-Pro-Pro tragen.

Der monoclonale Antikörper gegen menschliches β-Endorphin (Boehringer Mannheim, Deutschland, Katalognr. 1089 170)¹ reagiert mit der N-terminalen Tyr-Gly-Gly-Phe- Sequenz von menschlichem β-Endorphin.
Polyclonale Kaninchen-Antikörper gegen mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Maus- IgG (Bio Makor, Israel, Katalognr. 3465).
Blockierungspuffer: 1% 1-Block (Tropix, MA, USA) in PBS, enthaltend 0,05% NaN&sub3;, 0,1% Tween 20, 0,133 g/l CaCl&sub2;.2H&sub2;O und 0,1 g/l MgCl&sub2;.6H&sub2;O.
Waschpuffer: PBS mit 0,05% NaN&sub3; und 0,1 Tween 20.
BCIP: 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (Sigma, Katalognr. B-0274), 25 mg, gelöst in 0,5 ml Dimethylformamid.

Verfahren

Die Peptidbanken wurden im wesentlichen synthetisiert, wie vorstehend beschrieben.
Die Färbung der Kügelchen wurde unter Verwendung der folgenden Schritte durchgeführt (alle Inkubationsschritte wurden unter kontinuierlichem Mischen der Kügelchen durchgeführt):
a) Waschen der Kügelchen mit Waschpuffer.
b) 45minütige Inkubation der Kügelchen mit Blockierungspuffer, um unspezifische Wechselwirkungen zu blockieren.
c) 40minütige Inkubation der Kügelchen mit dem monoclonalen Antikörper gegen menschliches (3-Endorphin, verdünnt auf 200 ng/ml in Blockierungspuffer.
d) Sechs Waschschritte mit Waschpuffer.
e) 40minütige Inkubation der Kügelchen mit den polyclonalen Kaninchen-Antikörpern gegen mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Maus-IgG, 1:1000 in Blockierungspuffer verdünnt.
f) Sechs Waschschritte mit Waschpuffer und ein Waschschritt mit Tris (25 mM), NaCl (125 mM) und Tween (0,1%).
g) 2stündige Inkubation der Kügelchen mit BCIP, verdünnt auf 500 ug/ml in 0,1 M Tris, pH 9.0.
h) Zwei Waschschritte mit H&sub2;O, Überführung der Kügelchen in Petrischalen und Kontrolle auf blau gefärbte Kügelchen (unter Verwendung eines Stereomikroskops).

Ergebnisse:

Die Ergebnisse der Färbung sind in Tabelle B-1 angegeben: Tabelle B-1 Färbung der Kügelchen mit Anti-Endorphin-McAb-Clon 3-E7
Einige der gefärbten Kügelchen wurden einer N-terminalen Sequenzierung unter Verwendung eines Gasphasen-Mikropeptidsequenzanalysegeräts (Modell 475A, Applied Biosystems) unterworfen; die Ergebnisse sind in Tabelle B-2 zusammengefaßt. Tabelle B-2 Sequenzergebnisse der blau gefärbten Kügelchen

Diskussion

Es ist erkennbar, daß die Sequenz nYGG, die Teil der Peptidsequenz ist, gegen die der Antikörper erzeugt wurde, durch Bank 6 (70.000 Hexapeptide pro Kügelchen) identifiziert wurde. Diese Ergebnisse beweisen die grundlegende Hypothese der Anmelder über die Möglichkeit, spezifische Sequenzen nachzuweisen, die auf Kügelchen synthetisiert wurden, die viele Hexapeptide pro Kügelchen tragen.
Über die anderen erhaltenen Sequenzen nYM und nQGY wurde in der Literatur nicht berichtet, aber sie könnten aufgrund der Tatsache richtig sein, daß diese Sequenzen einige ungewöhnliche Aminosäuren (die in früheren Berichten nicht verwendet wurden) an Positionen, die dem C-Terminus näher benachbart sind, und D-Isomere der YGGF-Aminosäuren an jeder beliebigen Position enthalten können, die die Bindung an das Antikörpereptiop beeinflussen können. Ferner waren die erkannten Aminosäuren Gln (Q) und Met (M) in einigen der Literaturberichte gleich, jedoch an anderen Positionen der Tetrapeptidsequenz. Die Sequenz nQGY scheint die Umkehrung von nYG zu enthalten und kann von dem Antikörper erkannt werden.

Literaturangaben

1. Gramsch C. et al., J. Neurochem. 40 (1983), 1220-1226.
2. Kassarjian A., Schellenberger V. und Turck C.W., Screening of Synthetic Peptide Libraries with Radiolabeled Acceptor Molecules, Peptide Res. 6 (1993), 129-133.
3. Lam K.S., Salmon S.E., Hersh E.M., Hruby V.J., Kazmierski W.M. und Knapp R.J., A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity, Nature 354 (1991), 82-84.
4. Lam I.S., Hruby V.J., Lebl M., Knapp R.J., Kazierski W.W., Hersh E.M. und Salmon S.E., The Chemical Synthesis of Large Random Peptide Libraries and Their Use for the Discovery of Ligands for Macromolecular Acceptors, Bioorganic and Medicinal Chemistry Lett. 3 (1993), 419-424.
5. Lam K.S., Lebl M., Krchnak V., Wade S., Abdul-Latif F., Ferguson R., Cuzzocrea C. und Wertman K., Discovery of D-Amino-Acid-Containing Ligands with Selectide Technology, Gene 137 (1993), 13-16.
6. Nikolaiev V., Stierandov A., Krchnak V., Seligmann B., Lam K.S., Salmon S.E. und Lebl M., Peptide-Encoding for Structure Determination of Nonsequenceable Polymers Within Libraries Synthesized and Tested on Solid-Phase Supports, Peptide Res. 6 (1993), 161-170.
7. Pinilla C., Appel J.R. und Houghten R.A., Synthetic Peptide Combinatorial Libraries (SPCLS): Identification of the Antigenic Determinant of (3-Endorphin Recognized by Monoclonal Antibody 3E7, Gene 128 (1993), 71-76.

Ausführungsbeispiel C

Dieser Abschnitt beschriebt die Synthese und Durchmusterung einer aus Glaskügelchen hergestellten Bank.
Die Glaskügelchen wurden von Potters-Balotini in Frankreich bezogen. Es wurden Kügelchen vom Typ 5000 verwendet. Der geforderte Durchmesser der Kügelchen beträgt 0- 30 Mikron. Die Kügelchen wurden mittels einer Fällung bei 1 g getrennt, und es wurde eine Subtraktion erzielt. Der durchschnittliche Durchmesser der abgetrennten Kügelchen beträgt etwa 7 Mikron.
Die Kapazität der Kügelchenbeträgt 1 uMol/ml, was etwa 300 000 Peptiden pro Kügelchen entspricht. Unter der Annahme, daß 1000 verschiedene Peptide pro Kügelchen vorliegen, wird folglich jedes von ihnen von 300 Peptiden repräsentiert.
Die Kügelchen wurden mit etwa 60%iger Salpetersäure 5 Stunden gewaschen. Die mit Säure gewaschenen Kügelchen wurden mit Aminopropyltriethoxysilan (2% in Ethanol, 1 Stunde bei 95ºC) aminiert. Die Kopplung der Aminosäuren wurde wie folgt durchgeführt:
Fmoc-geschützte Aminosäure, 25 mM in DMF;
PyBOP, 25 mM in DMF;
HObt, 25 mM in DMF; und
NMM, 42 mM.
Die Kopplung wurde 1 Stunde kontinuierlich durchgeführt.
Die Bank setzte sich aus den folgenden 74 α-Amin-Fmoc-geschützten Aminosäuren zusammen:
1-3, 5, 7-12, 14-23, 28, 29, 31-39, 42-48, 51-66, 68, 70- 82, 85-89, 120.
Die erste eingebaute Aminosäure (am C-Terminus) war β-Ala.
Für die zweite Aminosäure wurden die Aminosäuren in Gruppen eingeteilt, wie in Tabelle C-1 gezeigt: Tabelle C-1
Ein einzelnes Kügelchen in der Bank präsentiert ein Gemisch der Peptide, die an der zweiten Aminosäureposition nur Aminosäuren von einer einzigen Gruppe aufweisen. Verschiedene Kügelchen könnten Aminosäuren von unterschiedlichen Gruppen prasentleren. Die gleichen Gruppen wurden für die Syntheseschritte 2, 3, 4 und 5 verwendet.
Für Schritt 6 (Position 2 vom N-Terminus) wurden die Aminosäuren anfangs in Gruppen eingeteilt, wie in Tabelle C-2 gezeigt: Tabelle C-2
Der Einfachheit halber wurden die anfänglichen 37 Gruppen von Schritt 6 zu 12 größeren Gruppen vereinigt, die in Tabelle C-3 mit A-L markiert sind. So wurden die Gruppen 1-3 von Schritt 6 in Röhrchen A, die Gruppen 4-6 von Schritt 6 in Röhrchen B, etc. überführt. Tabelle C-3
In Tabelle C-4 stellen die in den Spaltenüberschriften angeführten Aminosäuren diejenigen dar, die an der zweiten Position vom N-Terminus eingeführt wurden. Man findet an dieser Position in den Peptiden auf einem bestimmten Kügelchen jede der zwei unterschiedlichen Aminosäuren. Da Röhrchen A Kügelchen aus drei verschiedenen Gruppen des Schritts 6 umfaßt, gibt es sechs Möglichkeiten für diese Position für die Kügelchen eines bestimmten Röhrchens A bis L.
Der Inhalt von Röhrchen A wurde dann auf 37 Mikroröhrchen zum Einbringen in die Spalte "A" einer Mikrotiterplatte verteilt. Der Inhalt eines jeden dieser 37 Röhrchen wurde mit dem entsprechenden Gemisch aus zwei Aminosäuren umgesetzt, das auf der linken Seite der Tabelle C-4 angegeben ist, so daß auf diese Weise die aminoterminale Aminosäure bereitgestellt wird. Der Inhalt von Röhrchen B wurde in die 37 Röhrchen der nächsten Spalte überführt, die in ähnlicher Weise umgesetzt wurden, und so weiter, für insgesamt 12 x 37 = 444 Röhrchen, wie in Tabelle C-4 gezeigt ist.
Die Bank wurde hinsichtlich der Bindung von IL-6 durchmustert, das mit dem Fluoreszenzmarker Cy3 markiert war. In keiner der Vertiefungen wurde eine Färbung beobachtet.
Die Bank wurde mit TBP1 gefärbt, das mit Tetramethylrhodamin markiert war. Eine Färbung wurde in den mit "1" in der nachstehenden Tabelle C-4 markierten Vertiefüngen beobachtet. Eine positive Färbung bedeutet, daß die Vertiefung mindestens 4 gefärbte Kügelchen enthielt. Tabelle C-4 von ihnen auf Basis von Polyacrylamid, Pfropfpolyethylen; Polyethylenglykol-modifiziertes Polystyrol/1% DVB, das im Handel als Tentagel von mehreren Firmen erhältlich ist; und modifiziertes Glas, entweder als Platten (wie von Affimax verwendet) oder als Kügelchen. Praktisch kann jedes Material als Träger verwendet werden, das gegenüber den bei der Peptidsynthese verwendeten Lösungsmitteln und Chemikalien stabil ist. Der bevorzugte Träger ist Tentagel.
Einige Literaturstellen für neue Träger sind nachstehend angeführt.
1. Mendre C., Sarrade V. und Calas B., Continuous Flow Synthesis of Peptides Using a Polyacrylamide Gel Resin (Expansin ), International Journal of Peptide and Protein Research 39 (1992), 278-284.
2. Kanda P., Kennedy R.C. und Sparrow J.T., Synthesis of Polyamide Supports for Use in Peptide Synthesis and as Peptide-Resin Conjugates for Antibody Production, Int. J. Pept. Protein Res. 38 (1991), 385-391.
3. Kiederowski G., Light-Directed Parallel Synthesis of up to 250,000 Different Oligopeptides and Oligonucleotides, Angew. Chem. Int. (engl. Ausgabe) 30 (1991), 822.
Anmerkung: Synthese auf modifiziertem Glas. Das ist die von Affimax angewendete Technik.
4. Valerio R.M., Benstead M., Bray A.M., Campell R.A. und Maeji N.J., Synthesis of Peptide Analogues Using the Multipin Synthesis Method, Anal. Biochem. 197 (1991), 168-177.
Anmerkung: Synthese auf Stäbchen aus Propfpolyethylen.
5. Calas B., Mery J., Parello J. und Cave A., Solid-Phase Synthesis Using a New Polyacrylic Resin, Tetrahedron 41 (1985), 5331-5339.
6. Englebresten D.R. und Harding D.R.K., Solid Phase Peptide Synthesis on Hydrophilic Supports, Part II: Studies Using Perloza Beaded Cellulose, Int. J. Pept. Protein Res. 40 (1992), 487-496.

Schutzgruppen

Die zwei häufigsten Schutzgruppen für die α-Aminogruppe sind die tert-Butyloxycarbonyl (Boc)- oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-gruppen. Die Boc-Schutzgruppe wird unter sauren Bedingungen entfernt, z.B. durch 100%ige TFA. Die Fmoc-Schutzgruppen werden unter basischen Bedingungen entfernt, z.B. durch 20%iges Piperidin in DMF. Die Anmelder bevorzugen die Anwendung der Fmoc-Strategie.
Die Seitenketten einiger der Aminosäuren müssen ebenfalls geschützt werden, um eine Beschädigung während der Synthese zu vermeiden oder um die Bildung verzweigter Peptide durch den Einbau von Aminosäuren an einer freien Aminogruppe, die in der Seitenkette von einigen wenigen Aminosäuren (z.B. Lysin, Ornithin) vorkommt, zu vermeiden. Übliche Schutzgruppen sind die folgenden:
für freie Aminogruppen: Boc, Fmoc und Benzyloxycarbonyl (CBZ);
für freie Carboxygruppen: tert-Butylester, Benzylester und Cyclohexylester;
für Arginin: eine Nitrogruppe (NO&sub2;), Mesitylensulfonsäure und Tosylgruppe;
für Asparagin: Xanthylgruppe und Methoxy-2,3,6-trimethylsulfon (Mtr);
für Cystein: Acetamidomethylgruppe, Benzylthiether, tert-Butylthiether, Methylbenzyl-, Methobenzyl- und 3-Nitro-2-pyridinsulfonyl (Npys)-Gruppe;
für Glutamin: Trityl- und Xanthyl (Xan)-Gruppe;
für Histidin: Tosyl- und Tritylgruppe;
für freie Hydroxylgruppen: Benzylether und tert-Butylether;
für Tryptophan: N-Formyl-, N-Brombenzoxycarbonyl- und Nitrophenylsulfonyl (Nps)- Gruppe; und
für Tyrosin O-Benzyl- und 0-2,6-Dichlorbenzylgruppe.
Die Anmelder bevorzugen die folgenden Schutzgruppen:
für freie Aminogruppen: Boc;
für freie Carboxylgruppen: tert-Butylester;
für Cystein: die zuvor verwendeten;
für Glutamin und Asparagin: keine;
für Histidin: Tritylgruppe;
für freie Hydroxylgruppen: tert-Butylether;
für Tryptophan: keine; und
für Arginin: Methoxy-2,3,6-trimethylsulfon (Mtr).

Kopplungsreagenzien:

Die Kopplung von Aminosäuren bei der Festphasen-Peptidsynthese wurde seit der Einführung der Technik im Jahr 1967 durch Merrifield untersucht. Heute kann die Synthese von kurzen Peptiden, die aus den 20 herkömmlichen L-Aminosäuren aufgebaut sind, durch ein beliebiges einer großen Auswahl von Verfahren durchgeführt werden. Jüngste Berichte auf dem Gebiet beschreiben neue Verfahren, die die den Zweck haben:
1. die Synthesedauer zu verkürzen;
2. die Racemisierung während der Synthese zu verringern;
3. die Synthese langer Peptide zu ermöglichen;
4. die Synthese "schwieriger" Sequenzen zu ermöglichen:
5. den Einbau unnatürlicher Aminosäuren zu ermöglichen, wie N-substituierte Aminosäuren oder am α-Kohlenstoffatom zweifach substituierte Aminosäuren, wobei das freie H-Atom durch eine andere Gruppe ersetzt ist;
6. die Automatisierung der Peptidsynthese zu verbessern;
7. die großtechnische Peptidsynthese zu verbessern;
8. Peptide mit unterschiedlichen Typen von Pseudopeptidbindungen herzustellen, wie
Carba Ψ (CH&sub2;);
Depsi Ψ (CO-O);
Hydroxyethylen Ψ (CHOH-CH&sub2;);
Ketomethylen Ψ (CO-CH&sub2;);
Methylenoxy CH&sub2;-O-;
reduzierte CH&sub2;-NH-Bindung;
retroinverse NH-CO-Bindung;
Thiomethylen CH&sub2;S-; und
Thiopeptid CS-NH; und
9. die Herstellung von Peptiden mit erzwungenen Konformationen, wie cyclischen Peptiden oder multiplen antigenischen Peptiden (MAPs), zu verbessern.
Mehrere jüngste Beispiele für Studien der Peptidsynthese sind nachstehend angeführt:
1. Schnolzer M., Alewood P., Jones A., Alewood D und Kent S.B.H., In Situ Neutralization in Boc-Chemistry Solid Phase Peptide Synthesis. Rapid, High Yield Assembly of Difficult Sequences, Int. J. Pept. Protein Res. 40 (1992), 180-193.
2. Chen S. und Xu J., A New Coupling Reagent for Peptide Synthesis. Benzotriazolyloxybis(pyrrolidino)-carbonium hexafluorophosphate (BBC), Tetrahedron Letters 33 (1992), 647-650.
3. Spencer J.R., Antonenki V.V., Delaet N.G.J. und Goodman M., Comparative Study of Methods to Couple Hindered Peptides, Int. J. Pept. Protein Res. 40 (1992), 282-293.
4. Kiso Y., Fujiwara Y., Kimura T., Nishitani A. und Akaji K., Efficient Solid Phase Peptide Synthesis. Use of Methanesulfonic Acid α-Amino Deprotecting Procedure and New Coupling Reagent, 2-(Benzotriazol-1-yl)-oxy-1,3-dimethylimidazolidinium hexafluorophosphate (BOI), Int. J. Pept. Protein Res. 40 (1992), 308-314.

Materialien

Lösungsmittel:

Die Anmelder bevorzugen die Verwendung von Dimethylformamid (DMF) während der Synthese. Sie geben zuweilen etwas Dichlormethan (DCM) zu, um eine einfachere Gewinnung der Kügelchen zu ermöglichen: die Dichte von DCM ist sehr hoch und die Kügelchen schwimmen in Gemischen von DMF und DCM.
Es ist selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung eines bestimmten Trägers, einer bestimmten Schutzgruppe oder eines bestimmten Lösungsmittels begrenzt ist.

Bevorzugter Synthesezyklus:

Ein Zyklus der Synthese umfaßt die folgenden Arbeitsschritte: Tabelle 100: Peptidsynthesezyklus

Abkürzungen:

DMF: N,N-Dimethylformamid;
Hobt: Hydroxybenzotriazol-1-hydrat;
NMM: 4-Methylmorpholin;
BOP: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat; und
Fmoc: Fluorenylmethoxycarbonyl.

Allgemeine Abspaltung der Schutzgruppen

Die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen wird am Ende der Synthese mittels zwei 40minütigen Inkubationen in 25% TFA in DCM + 5% Ahisol und 5% Thioanisol durchgeführt.

Ungewöhnliche Aminosäuren umfassende Peptide

Der gegenwärtige Trend bei der Peptidsynthese, insbesondere beim Ansatz des irrationalen Wirkstoffdesigns, macht den Einbau vieler verschiedener Arten von Bausteinen erforderlich. Viele der verwendeten neuen Bausteine sind Aminosäuren, die genetisch nicht codiert werden, z.B. glycosylierte Aminosäuren oder verschiedene unnatürliche Aminosäuren. Die nachstehend angeführten Literaturstellen weisen auf einige dieser jüngsten Anstrengungen hin:
1. Bielfeldt T., Peters S., Meldal M., Bock K. und Paulsen N.A., New Strategy for Solid- Phase Synthesis of O-Glycopeptides, Angew. Chem. (Engl.) 31 (1992), 857-859.
2. Gurjar M.K. und Saha U.K., Synthesis of the Glycopeptide-O-(3,4-di-O-methyl-2-O- [3,4-di-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl]-α-L-rhamnophyranosyl)-L-alanilol: An Unusual Part Structure in the Glycopeptidolipid of Mycobacterium fortuitum, Tetrahedron 48 (1992), 4039-4044.
3. Kessier H., Wittman V., Kock M. und Kottenhalin M., Synthesis of C-Glycopeptides via Free Radical Addition of Glycosyl Bromides to Dehydroalanine Derivatives, Angew. Chem. (Engl.) 31 (1992), 902-904.
4. Kraus J.L. und Attardo G., Synthesis and Biological Activities of New N-Formylated Methionyl Peptides Containing an α-Substituted Glycine Residue, European Journal of Medicinal Chemistry 27 (1992), 19-26.
5. Mhaskar S.Y., Synthesis of N-Lauroyl Dipeptides and Correlation of Their Structure with Surfactant and Antibacterial Properties, J. Am. Oil Chem. Soc. 69 (1992), 647- 652.
6. Moree W.J., Van der Marel G.A. und Liskamp R.M.J., Synthesis of Peptides Containing the α-Substituted Aminoethane Sulfinamide or Sulfonamide Transition-State Isostere Derived from Amino Acids, Tetrahedron Lett. 33 (1992), 6389-6392.
7. Paquet A., Further Studies on the Use of 2,2,2-Trichloroethyl Groups for Phosphate Protection in Phosphoserine Peptide Synthesis, International Journal of Peptide and Protein Research 39 (1992), 82-86.
8. Sewald N., Riede J., Bissinger P. und Burger K.A., A New Convenient Synthesis of 2-Trifluoromethyl Substituted Aspartic and its Isopeptides, Teil 11, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1 1992 (1992), 267-274.
9. Simon R.J., Kania R.S., Zuckermaun R.N., Huebner V.D., Jewell D.A., Banville S., Ng S., Wang L., Rosenberg S., Marlowe C.K., Spellmeyer D.C., Tan R., Frankel A.D., Santi D.V., Cohen F.E. und Bartlett P.A., Peptoids: A Modular Approach to Drug Discovery, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 9367-9371.
10. Tung C.-H., Zhu T., Lackland H. und Stein S., An Acridine Amino Acid Derivative for Use in Fmoc Peptide Synthesis, Peptide Research 5 (1992), 115-118.
11. Elofsson M., Building Blocks for Glycopeptide Synthesis: Glycosylation of 3-Mercaptopropionic Acid and Fmoc Amino Acids with Unprotected Carboxyl Groups, Tetrahedron Lett. 32 (1991), 7613-7616.
12. McMurray J.S., Solid Phase Synthesis of a Cyclic Peptide Using Fmoc Chemistry, Tetrahedron Letters 32 (1991), 7679-7682.
13. Nunami K.-I., Yamazaki T. und Goodman M., Cyclic Retroinverso Dipeptides with Two Aromatic Side Cains, I. Synthesis, Biopolymers 31 (1991), 1503-1512.
14. Rovero P., Synthesis of Cyclic Peptides on Solid Support, Tetrahedron Letters 32 (1991), 2639-2642.
15. Elofsson M., Walse B. und Kihlberg J., Building Blocks for Glycopeptide Synthesis: Glycosylation of 3-Mercaptopropionic Acid and Fmoc Amino Acids with Unprotected Carboxyl Groups, Tetrahedron Letters 32 (1991), 7613-7616.
16. Bielfeldt T., Peter S., Meldal M., Bock K. und Paulsen H., A New Strategy for Solid- Phase Synthesis of O-Glycopeptides, Angew. Chem. (Engl.) 31 (1992), 857-859.
17. Luning B., Norberg T. und Tejbrant J., Synthesis of Glycosylated Amino Acids for Use in Solid Phase (Glycopeptide Synthesis, Teil 2: N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)- 3-O-[2,4,6-tri-O-acetyl-α-D-sylopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-L-senne, J. Carbohydr. Chem. 11 (1992), 933-943.
18. Peters S., Bielfeldt T., Meldal M., Bock K. und Paulsen H., Solid Phase Peptide Synthesis of Mucin Glycopeptides, Tetrahedron Lett. 33 (1992), 6445-6448.
19. Urge L., Otvos Jr. L., Lang E., Wroblewski K., Laczko I. und Hollosi M., Fmoc- Protected, Glycosylated Asparagines Potentially Useful as Reagents in the Solid-Phase Synthesis of N-Glycopeptides, Carbohydr. Res. 235 (1992), 83-93.
20. Gerz M., Matter H. und Kessier H., S-Glycosylated Cyclic Peptides, Angew. Chem. (Engl.) 32 (1993), 269-271.

Verzweigte Peptide

Ein Vorteil des chemischen Ansatzes für Peptidbanken (gegenüber Banken, die durch biologische Verfahren, z.B. filamentöse Phagen, exprimiert werden) ist die Möglichkeit, verzweigte Peptide herzustellen und zu testen. Frühe Beispiele in der Literatur für solche Strukturen findet man bei der Verwendung von multiplen, antigenen Peptiden (MAP) als Immunogene, wobei in den MAPs Peptidhaptene an einen sich verzweigenden "Baum" von Lysinen gebunden sind.
1. Baleux F. und Dubois P., Novel Version of Multiple Antigenic Peptide Allowing Incorporation on a Cysteine Functionalized Lysine Tree, Int. J. Pept. Protein Res. 40 (1992), 7-12.
2. Munesinghe D.Y., Clavijo P. Calle M.C., Nussenzweig R.S. und Nardin E., Immunogenicity of Multiple Antigen Peptides (MAP) Containing T and B Cell Epitopes of the Repeat Region of the P. falciparum Circumsporozoite Protein, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 3015-3020.
Bei dem gegenwärtigen MAP-System werden identische Peptidsequenzen in der MAP-Struktur mehrmals wiederholt. Eine solche Anordnung stabilisiert offensichtlich die Peptidkonformation, was eine bessere Präsentation der Antigenstruktur und daher eine bessere Immunogenität ermöglicht. Die Anwendung von Ansätzen, die dem MAP-Verfahren ähnlich sind, könnte eine bessere biologische Aktivität der Peptide aufgrund der Stabilisierung der Konformation ermöglichen.
Die Wechselwirkung von kurzen linearen Peptiden mit ihren Zielmolekülen erfolgt über die ganze Länge des Peptids. Die Erzeugung verzweigter Peptide kann die Wechselwirkung des Peptids mit dem Zielmolekül über die ganze Oberfläche ermöglichen und auf diese Weise den Typ der Wechselwirkung einiger Antikörper mit ihren Zielantigenen nachahmen (beobachtet mittels Röntgenkristallographie und Analyse der Antikörper-Antigen-Komplexe). Diese Art der Wechselwirkung eröffnet neue Möglichkeiten für schwache Peptid- Ligand-Wechselwirkungen, die für linearen Peptide nicht existieren, die aber flir Protein- Ligand-Wechseiwirkungen existieren.

Zyklische Peptide

Viele natürlich vorkommende Peptide sind zyklisch. Die Zyklisierung ist ein üblicher Mechanismus zur Stabilisierung der Peptidkonformation, wodurch eine bessere Verknüpfüng des Peptids mit seinem Liganden und daher eine verbesserte biologische Aktivität erzielt wird. Eine Zyklisierung wird üblicherweise durch eine Cystinbildung innerhalb der Ketten, durch die Bildung einer Peptidbindung zwischen Seitenketten oder zwischen N- und C-terminalen Enden erreicht. Die Zyklisierung wurde bei Peptiden üblicherweise in Lösung erzielt aber vor kurzem erschienen mehrere Veröffentlichungen, die die Zyklisierung von Peptiden auf Kügelchen beschreiben (vgl. die nachstehenden Literaturstellen). Diese veröffentlichten Verfahren können direkt auf den Bank-Ansatz der hier genannten Anmelder angewendet werden.
1. Spatola A.F., Anwer M.K. und Rao M.N., Phase Transfer Catalysis in Solid Phase Peptide Synthesis. Preparation of Cycle [Xxx-Pro-Gly-Yyy-Pro-Gly] Model Peptides and Their Conformational Analysis, Int. J. Pept. Protein Res. 40 (1992), 322-332.
2. Tromelin A., Fulachier M.-H., Mourier G. und Menez A., Solid Phase Synthesis of a Cyclic Peptide Derived from a Curaremimetic Toxin, Tetrahedron Leif. 33 (1992), 5197-5200.
3. Trzeciak A., Synthesis of "Head-to.Tail" Cyclized Peptides on Solid Supports by Fmoc Chemistry, Tetrahedron Lett. 33 (1992), 4557-45560.
4. Wood S.J. und Wetzel R., Novel Cyclization Chemistry Especially Suited for Biologically Derived, Unprotected Peptides, Int. J. Pept. Protein Res. 39 (1992), 533-539.
5. Gilon C., Halle D., Chorev M., Selinger Z. und Byk G., Backbone Cyclization: A New Method for Conferring Conformational Constraint on Peptides, Biopolymers 31 (1991), 745-750.
6. McMurray J.S., Solid Phase Synthesis of a Cyclic Peptide Using Fmoc Chemistry, Tetrahedron Letters 32 (1991), 7679-7682.
7. Rovero P., Synthesis of Cyclic Peptides on Solid Support, Tetrahedron Letters 32 (1991), 2639-2642.
8. Yamjia X., Cyclization on the Bead via Following Cys Acm Deprotection, Tetrahedron 44 (1988), 805.

Peptoidsynthese

Die meisten, wenn nicht alle der Materialien, die mindestens 1 freie Aminogruppe und 1 freie Carboxylgruppe enthalten, können zur Synthese von Polypeptidpolymeren verwendet werden. Die meisten, wenn nicht alle der Substanzen mit nur einem einzigen Gruppentyp (d.h. freie Aminogruppe oder freie Carboxylgruppe) können an den C- bzw. N-terminalen Enden oder in geeignete Seitenketten eingebaut werden. Die meisten, wenn nicht alle Substanzen mit einer Gruppe, die mit freien Carboxyl- oder freien Amino-, freien Hydroxyl- oder freien Thiogruppen reaktionsfähig sind, können zur Modifikation des Terminus oder der Seitenkette geeigneter Aminosäuren verwendet werden. Bisher wurde nur eine kleine Anzahl solcher Verbindungen tatsächlich zur Synthese verwendet. Einige der beschriebenen Strukturen werden nachstehend beschrieben:
1. Modifizierung des R-Rests in einfach Cα-substituierten Aminosäuren. Modifizierte R- Reste, die beschrieben wurden, umfassen: glykosylierte, phosphorylierte oder sulfatierte Reste, Metallchelatoren, Nucleotidreste und viele andere.
2. Modifizierung der Peptidbindungen in Pseudopeptidbindungen. Die Pseudopeptidbindungen werden üblicherweise in Dipseudopeptide eingebaut, die dann in Peptide eingebaut werden. Es ist nicht möglich, solche Pseudopeptide zu sequenzieren, und so muß die Sequenzbestimmung auf die Codierung vertrauen. Nachstehend ist eine Liste der meisten Pseudopeptidbindungen angegeben, die in der Literatur beschrieben wurden.
Carba Ψ (CH&sub2;-CH&sub2;);
Depsi Ψ (CO-O);
Hydroxyethylen Ψ (CHOH-CH&sub2;);
Ketomethylen Ψ (CO-CH&sub2;);
Methylenoxy CH&sub2;-O-;
reduzierte CH&sub2;-NH-Bindung;
retroinverse NH-CO-Bindung;
Thiomethylen CH&sub2;-S-; und
Thiopeptid CS-NH.
3. Gerüstmodifizierungen: Verwendung von Nicht-α-Aminosäuren, z.B. β-Alanin.
4. α-Aminosäuren mit 2 R-Resten am Cα-Atom. Die R-Reste können gleich oder verschieden sein.
5. Dehydroaminosäuren (vgl. nachstehend)
6. N-Modifizierte Aminosäure der allgemeinen Struktur:

Literaturangaben:

1. Corringer P.J., Weng J.H., Ducos B., Durieux C., Boudeau P., Bohme A. und Roques B.P., CCK-B Agonist or Antagonist Activities of Structurally Hindered and Peptidase- Resistant Boc-CCK&sub4; Derivates, J. Med. Chem. 36 (1993), 166-172.
Beschriebene Aminosäuren: aromatisches Naphthylalaninimid (Nal-NH&sub2;) und N-Methylaminosäuren.
2. Beylin V.G., Chen H.G., Dunbar J., Goel O.P., Harter W., Marlatt M. und Topliss J.G., Cyclic Derivates of 3,3-Diphenylalanine (Dip) (II), Novel α-Amino Acids for Peptides of Biological Interest, Tetrahedron Lett. 34 (1993), 953-956.
3. Garbay-Jaureguiberry C., Ficheux D. und Roques B.P., Solid Phase Synthesis of Peptides Containing the Non-Hydrolysable Analog of (O)-Phosphotyrosine, p(CH&sub2;PO&sub3;H&sub2;)Phe. Application to the Synthesis of 344-357 Sequences of the β&sub2; Adrenergic Receptor, Int. J. Pept. Protein Res. 39 (1992), 523-527.
4. Lüning B., Norberg T. und Tejbrant J., Synthesis of Glycosylated Amino Acids for Use in Solid Phase Glycopeptide Synthesis, Teil 2: N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)3-O-[2,4,6-tri-O-acetyl-3-O-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-xylopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-L-serine, J. Carbohydr. Chem. 11 (1992), 933-943.
5. Tung C.H., Zhu T., Lackland H. und Stein S., An Acridine Amino Acid Derivative for Use in Fmoc Peptide Synthesis, Peptide Research 5 (1992), 115-118.
6. Frerot Eric, PyBOP and PyBroP: Two Reagents for the Difficult Coupling of the alpha, alpha-Dialkyl Amino Acid Aib, Tetrahedron 47 (1991), 259-270.
7. Moree W.J., Van der Marel G.A. und Liskamp R.M.J., Synthesis of Peptides Containing the α-Substituted Aminoethane Sulfinamide or Sulfonamide Transition-State Isostere Derived from Amino Acids, Tetrahedron Lett. 33 (1992), 6389-6392.
8. Rana T.M., Synthesis of a Metal-Binding Amino Acid Suitable for Solid Phase Assembly of Peptides, Tetrahedron Lett. 33 (1992), 4521-4524.
9. Urge L., Otvos Jr. L., Lang E., Wroblewski K., Laczko I. und Hollosi M., Fmoc- Protected Glycosylated Asparagines Potentially Useful as Reagents in the Solid-Phase Synthesis of N-Glycopeptides, Carbohydr. Res. 235 (1992), 83-93.
10. Pavone V., Diblasio B., Lombardi A., Maglio O., Isemia D., Pedone C., Benedette E., Altmann E. und Mutter M., Non Coded Cα,α-Disubstituted Amino Acids. X-Ray Diffraction Analysis of a Dipeptide Containing (S)-α-Methylserine, Int. J. Pept. Protein Res. 41 (1993), 15-20.
11. Nishino N., Mihara H., Kiyota H., Kobata K. und Fujimoto T., Aminoporphyrinic Acid as a New Template for Polypeptide Design, J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1993), 162-163, 1993.
12. Sosnovsky G., Prakash I. und Rao N.U.M., In the Search for New Anticancer Drugs. XXIV: Synthesis and Anticancer Activity of Amino Acids and Dipeptides Containing the 2-Chloroethyl- and [N'-Nitroso]-aminocarbonyl Groups, J. Pharm. Sci. 82 (1993), 1-10.
13. Berti F., Ebert C. und Gardossi L., One-Step Stereospecific Synthesis of α,β-Dehydroamino Acids and Dehydropeptides, Tetrahedron Lett. 33 (1992), 8145-8148. Tabelle 101

Allgemeine Literaturangaben:

Amato I., Speeding up a Chemical Game of Chance, Science 257 (1992), 330.
Baumbach G.A. und Hammond D.J., Protein Purification Using Affinity Ligands Deduced From Peptide Libraries, Biopharm (1992), Mai 1992, 24.
Bimbaum S. und Mosbach K., Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 49.
Bischoff S.C., Weck A.L. und Dahinden C.A., Peptide Analogous of Consensus Receptor Sequence Inhibit the Action of Cytokines on Human Basophus, Lymphokine and Cytokine Research 11 (1992), 33.
Cwirla S.E. et al., Peptides on Phage: A Vast Library of Peptides for Identifying Ligands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 6378.
Devlin J.J. et al., Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules, Science 249 (1990), 404.
Fodor P.A., Read J.L., Pirrung M.C., Stryer L., Lu A.T. und Solas D., Light-Directed Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis, Science 251 (1991), 767.
Furka A., Sebestyen F., Asgedon M. und Dibo G., Abst. 14th Int. Congr. Biochem., Prag, Tschechoslowakei, Bd. 5 (1988), 47.
Furka A., Sebestyen F., Asgedon M. und Dibo G., General Method for Rapid Synthesis of Multicomponent Peptide Mixtures, Int. J. Peptide Protein Res. 37 (1991), 487.
Houghten A.R., Pinilla C., Blondelle S.E., Appel J.R., Dooley C.T. und Cuervo J.H., Generation and Use of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries for Basic Research and Drug Discovery, Nature 354 (1991), 84.
Lam K.S., Salmon S.E., Hersh E.M., Hruby V.J., Kazmiesky W.M. und Knapp R.J., A New Type of Synthetic Peptide Library for Identifying Ligand-Binding Activity, Nature 354 (1991), 82.
Magazine H.I. und Johnson H.M., Characterization of a Synthetic Peptide Corresponding to a Receptor Binding Domain of a Mouse Interferon γ, Biochemistry 30 (1991), 5784.
Scott J.K. und Smith G.P., Searching for Peptide Ligands With an Epitope Library, Science 249 (1990), 386.

Claims

1. Bank von Polymermolekülen, die jeweils aus einer Vielzahl von Monomereinheiten bestehen, wobei die Bank eine Vielzahl verschiedener Familien von unterschiedlichen Sequenzen der Monomereinheiten umfaßt, und die Moleküle an Kügelchen immobilisiert sind, wobei jedes Kügelchen eine Vielzahl verschiedener Sequenzen trägt, die zu einer Sequenzfamilie der Polymermoleküle gehören, und die erwartete Menge einer jeden solchen Sequenz auf jedem Kügelchen für den Nachweis ausreichend ist, ob ein Molekül, das diese Sequenz besitzt, an ein Zielmolekül von Interesse bindet, wobei jede Sequenz einen familienspezifischen und einen individuellen Teil umfaßt, wobei der familienspezifische Teil einen geringeren Grad an Verschiedenartigkeit unter den Molekülen, die von einem einzelnen Kügelchen getragen werden, besitzt als unter den Molekülen der gesamten Bank, und ein solcher familienspezifischer Teil nach Wiedergewinnung der Moleküle, die von einem einzelnen Kügelchen getragen werden, dadurch sequenzierbar ist.

2. Verfahren zur Herstellung einer Bank von Polymermolekülen, die durch schrittweise Konjugation von monomeren oder oligomeren Reaktionspartnern synthetisiert werden können, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung einer Vielzahl von Kügelchen;

(b) schrittweise Konjugation in einer Vielzahl von Synthesezyklen, von denen mindestens einer nicht ein voll strukturierter Zyklus ist, eines monomeren oder oligomeren Reaktionspartners an die Kügelchen oder an ein darauf entstehendes Polymermolekül, wobei für einen oder mehrere "strukturierte zufällige" Synthesezyklen die folgenden Schritte durchgeführt werden:

(i) Aufteilung der Kügelchen in N Aliquots;

(ii) Umsetzung eines jeden Aliquots mit einem und nur einem Satz von N verschiedenen vorbestimmten monomeren oder oligomeren Reaktionspartnern, wobei der Wert von N und der Reaktionspartner dieses Satzes gleich oder unterschiedlich für jeden Zyklus sein kann; und

(iii) Vereinigung dieser umgesetzten Aliquots, wobei die Synthesezyklen durch die Verknüpfung eines Reaktionspartners eines Zyklus mit einem Reaktionspartner eines anderen Zyklus diese Moleküle schrittweise erzeugen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, das zusätzlich einen oder mehrere "strukturierte zufällige" Synthesezyklen umfaßt, in denen jeweils alle Kügelchen mit einem einzigen vorbestimmten Gemisch von monomeren oder oligomeren Reaktionspartnern umgesetzt werden, wobei das Gemisch in jedem solchen Zyklus gleich oder verschieden sein kann.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das zusätzlich einen oder mehrere "nicht- zufällige" Synthesezyklen umfaßt, in denen alle Kügelchen mit einem gereinigten Reaktionspartner umgesetzt werden, wodurch ein konstantes Element in das Molekül eingeführt wird.

5. Verfahren zur Identifizierung von Polymermolekülen, die an ein Zielmolekül von Interesse binden, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung einer ersten Polymermolekül-Bank nach Anspruch 1;

(b) Inkontaktbringen der ersten Bank mit dem Zielmolekül von Interesse unter Bedingungen, die den Nachweis der Bindung des Zielmoleküls an Polymermoleküle erlauben, die von einem Kügelchen der Banken getragen werden, und Auswählen von Kügelchen, die Polymermoleküle tragen, an die das Zielmolekül bindet;

(c) Bestimmung zumindest des familienspezifischen Teils der Sequenzen der Polymermoleküle, die von einem ausgewählten Kügelchen der ersten Bank getragen werden und an die das Zielmolekül bindet;

(d) Bereitstellung einer zweiten Polymermolekül-Bank nach Anspruch 1, wobei die zweite Bank derart beschaffen ist, daß im wesentlichen alle Sequenzen, die erwartungsgemäß von dem ausgewählten Kügelchen der ersten Bank getragen werden, in den Molekülen der zweiten Bank vorhanden sind, wobei die zweite Bank im wesentlichen die Sequenzen der ersten Bank nicht enthält, von denen nicht erwartet wurde, daß sie von dem ausgewählten Kügelchen getragen werden;

(e) Inkontaktbringen der zweiten Bank mit dem Zielmolekül von Interesse unter Bedingungen, die den Nachweis der Bindung des Zielmoleküls an Moleküle erlauben, die von einem Kügelchen der Banken getragen werden, und Auswählen der Kügelchen, die Peptide tragen, an die das Zielmolekül bindet;

(f) Bestimmung zumindest des familienspezifischen Teils der Sequenzen der Moleküle, die von einem ausgewählten Kügelchen der zweiten Bank getragen werden und an die das Zielmolekül bindet,

wobei eine Sequenz, die einem Molekül der ersten Bank entspricht, das das Zielmolekül bindet und von dem ersten ausgewählten Kügelchen getragen wurde, weiter bestimmt wird.

6. Bank nach Anspruch 1 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die Bank mindestens 10&sup7; Kügelchen umfaßt.

7. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei jedes Kügelchen mindestens 10³ Moleküle trägt.

8. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Test nicht mehr als 10&sup7;, stärker bevorzugt nicht mehr als 10&sup6; gebundene Moleküle pro Kügelchen für den Nachweis der Bindung an ein Zielmolekül benötigt, und die durchschnittliche Anzahl der Moleküle mit identischer Sequenz ("average sampling level") pro Kügelchen mindestens etwa der Peptid-pro-Kügelchen Nachweisgrenze entspricht.

9. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Test nicht mehr als zehn, stärker bevorzugt zwei, noch stärker bevorzugt ein Kügelchen benötigt, das für den Nachweis Moleküle trägt, die das Zielmolekül binden, und das Verhältnis der Anzahl von Kügelchen in der Bank zu dem Bank-Verteilungs-Faktor mindestens ungefähr der Kügelchen- pro-Bank-Nachweisgrenze entspricht.

10. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Bank mindestens 10&sup8;, stärker bevorzugt mindestens 10¹&sup0;, noch stärker bevorzugt mindestens 10¹² und am stärksten bevorzugt mindestens 10¹&sup4; Moleküle enthält.

11. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Mannigfaltigkeit der Bank mindestens 10&sup8;, stärker bevorzugt mindestens 10&sup9;, noch stärker bevorzugt mindestens 10¹&sup0; und am stärksten bevorzugt 10¹¹ einzigartige Sequenzen umfaßt.

12. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei während mindestens eines zufälligen Zyklus mindestens 40 verschiedene Einheiten an die entstehenden Moleküle der Bank gekoppelt werden.

13. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei während jedes zufälligen Zyklus mindestens 40 verschiedene Einheiten an die entstehenden Moleküles der Bank gekoppelt werden.

14. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Moleküle Peptide, Peptoide, Nucleinsäuren, oder Kohlenhydrate, vorzugsweise Peptide sind.

15. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Polymere eine Länge von mindestens fünf Einheiten haben.

16. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der familienspezifische Teil ein bis vier Einheiten lang ist.

17. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der familienspezifische Teil für alle Moleküle eines Kügelchens identisch ist.

18. Bank oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei, zumindest an einer Monomerposition in dem familienspezifischen Teil, eine Monomereinheit, die schwieriger zu sequenzieren ist, in einem ersten Molekül auf dem Kügelchen mit einer Monomereinheit, die weniger schwierig zu sequenzieren ist, an der entsprechenden Monomerposition in einem zweiten Molekül auf demselben Kügelchen gepaart wird.

19. Verfahren zur Konstruktion einer Bank von Polymermolekülen, die durch schrittweise Konjugation von monomeren oder oligomeren Reaktionspartnern synthetisiert werden können, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung eines Trägers, der eine Oberfläche hat, die in eine Vielzahl von individuell auswählbaren Bereichen unterteilbar ist,

(b) für eine oder mehrere Runden

(i) Umsetzung eines ersten ausgewählten Bereiches der Oberfläche des Trägers mit einem ersten ausgewählten monomeren oder oligomeren Reaktionspartner, so daß der Reaktionspartner im wesentlichen nur innerhalb des ersten ausgewählten Bereiches an den Träger oder an gebundene entstehende Polymermoleküle gekoppelt wird,

(ii) Umsetzung eines zweiten ausgewählten Bereiches der Oberfläche des Trägers mit einem zweiten ausgewählten monomeren oder oligomeren Reaktionspartner, so daß der Reaktionspartner im wesentlichen nur innerhalb des zweiten ausgewählten Bereiches an den Träger oder an gebundene entstehende Polymermoleküle gekoppelt wird, wobei der erste und zweite Bereich nicht überlappend sind, und der erste und zweite Reaktionspartner unterschiedlich sind; und

(c) Umsetzung der gesamten Trägeroberfläche mit einem Gemisch von zwei oder mehreren ausgewählten monomeren oder oligomeren Reaktionspartnern für eine oder mehrere Runden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei ein Bereich dadurch ausgewählt wird, daß die Oberfläche einer Strahlung durch eine Maske ausgesetzt wird, die eine Bestrahlung nur des ausgewählten Bereiches zuläßt, wodurch der Bereich durch Entfernung von photolabilen Schutzgruppen aus dem bestrahlten Bereich aktiviert wird.