NO20101293L - Vaksinesammensetning og vaksine samt anvendelse av polypeptid og polynukletid - Google Patents

Abstract

Forbindelser og fremgangsmåter for diagnose og behandling av Clamydiainfeksjon blir beskrevet. Forbindelsene som er frembrakt, inkluderer polypeptider som inneholder minst en antigen del av ett Clamydia-antigen og DNA-sekvenser som koder for slike polypeptider. Farmasøytiske blandinger og vaksiner som omfatter slike polypeptider eller DNA sekvenser, blir også frembrakt, sammen med antistoff rettet mot slike polypeptider. Diagnostiske reagenssett som inneholder slike polypeptider eller DNA sekvenser og et passende påvisningsreagens, kan benyttes for påvisning av Clamydia-infeksjon i pasienter og i biologiske prøver.

Description

FORBINDELSER OG FREMGANGSMÅTER FOR BEHANDLING

OG DIAGNOSE AV CHLAMYDIA-\NFEKSJON

TEKNISK OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelse dreier seg generelt om påvisning og behandling av infeksjon med Chlamydia. Spesielt er oppfinnelsen relatert til polypeptider som omfatter et antigen fra Chlamydia-, og bruk av slike polypeptider for serumdiagnostikk og behandling av C/7/amyc//a-infeksjon.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Chlamydiae er intracellulære bakterielle patogener som er ansvarlige for en lang rekke viktige humane og dyreinfeksjoner. Chlamydia trachomatis er en av de mest vanlige årsaker til seksuelt overførte sykdommer, og kan føre til inflammatorisk bekkensykdom (PID), som fører til egglederobstruksjon og infertilitet. Chlamydia trachomatis kan også spille en rolle i infertilitet hos menn. I 1990 ble omkostningene ved å behandle PID i USA anslått til å være 4 milliarder dollar. Trakom, som er forårsaket av høyinfeksjon med Chlamydia trachomatis, er den viktigste årsak til blindhet som kan forebygges, i verden. Chlamydia pneumonia er en viktig årsak til akutt luftveisinfeksjon hos mennesker, og blir også antatt å spille en rolle i patogenese av arteriosklerose, spesielt i koronar hjertesykdom. Personer med et høyt titer av antistoff mot Chlamydia pneumonia er blitt funnet å ha minst dobbelt så stor sjanse for å lide av koronar hjertesykdom som serumnegative individer. C/7/amyc//a-infeksjoner utgjør således et betydelig helseproblem, både i USA og i hele verden.

Ctøamyc//a-infeksjon er ofte asymptomatisk. For eksempel kan ved det tidspunkt som en kvinne søker medisinsk hjelp for PID, allerede irreversibel skade forekomme og føre til infertilitet. Det gjenstår derfor i faget et ønske om forbedrete vaksiner og farmasøytiske blandinger som kan forebygge og behandle CWamyc//a-infeksjoner. Den foreliggende oppfinnelse oppfyller dette behov og gir videre andre, relaterte fordeler.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse frembringer blandinger og fremgangsmåter for behandling og terapi av C/7/amyc//'a-infeksjoner. I ett aspekt frembringer den foreliggende oppfinnelse polypeptider som omfatter en immunogen del av et antigen fra Chlamydia, eller en variant av et slikt antigen. Visse deler og andre varianter er immunogene, slik at enden som varianten har i å reagere med antigenspesifikk antisera, ikke er særlig senket. I visse utførelser omfatter polypeptidet en aminosyresekvens som koder for en polynukleotidsekvens som er utvalgt fra gruppen som består av (a) en sekvens av SEQ ID NO: 1,15, 21-25, 44-64, 66-76, 79-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 133, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-290, (b) komplimentene av de nevnte sekvenser, og (c) sekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (a) eller (b) under moderat stringente betingelser. I spesielle utførelser omfatter den foreliggende oppfinnelse polypeptider minst en del av et Chlamydia protein som inkluderer en aminosyresekvens utvalgt fra gruppen som består av sekvenser som er beskrevet i SEQ ID NO: 5-14, 17-20, 26, 28, 30-32, 34, 39-43, 65, 89-109, 138-158, 167, 168, 224-262, 246, 247, 254-256, 292, og varianter av disse.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer videre polynukleotider som koder for et polypeptid som er beskrevet over, eller en del av et slikt (slik som en del som koder for minst 15 aminosyrerester i et Cft/amycZ/a-protein), ekspresjonsvektorer som omfatter slike polynukleotider og vertsceller som er transformert eller transfektert med slike ekspresjonsvektorer.

I et relatert aspekt blir også polynukleotidsekvenser som koder for de ovenfor nevnte polypeptider, rekombinante ekspresjonsvektorer som omfatter en eller flere av disse polynukleotidsekvenser som er vertsceller som er transformert eller transfektert med slike ekspresjonsvektorer, frembrakt.

I et annet aspekt frembringer den foreliggende oppfinnelse fusjonsproteiner som omfatter et oppfunnet polypeptid, eller alternativt et oppfunnet polypeptid og et kjent C/?/amyc//'a-antigen, sammen med polynukleotider som koder for slike fusjonsproteiner, i kombinasjon med en fysiologisk akseptabel bærer eller immunstimulant til bruk som en farmasøytisk blanding og vaksiner av disse.

Den foreliggende oppfinnelsen frembringer videre farmasøytiske blandinger som omfatter: (a) et antistoff, både poliklonalt og monoklonalt, eller antigenbindende fragment fra dette som spesifikt binder til et C/7/amyc//'a-protein, og (b) en fysiologisk akseptabel bærer. I andre aspekter frembringer den foreliggende oppfinnelse farmasøytiske blandinger som omfatter ett eller flere C/7/amyc//'a-polypetider som er beskrevet her, eller et polynukleotidmolekyl som koder for et slikt polypeptid, og en fysiologisk akseptabel bærer. Oppfinnelsen frembringer også vaksiner til profylaktiske og terapeutiske formål som omfatter ett eller flere av de beskrevne polypeptider, og en immunostimulant, som definert her, sammen med vaksiner som omfatter en eller flere polynukleotidsekvenser som koder for slike polypeptider, og en immunostimulant.

I ytterligere et annet aspekt blir fremgangsmåter frembrakt for å indusere beskyttende immunitet hos en pasient, som omfatter tilførsel til en pasient av en effektiv mengde av en eller flere av de ovenfor beskrevne farmasøytiske blandinger eller vaksiner.

I ytterligere et annet aspekt blir fremgangsmåter for behandling av Chlamydia-infeksjon hos en pasient frembrakt, der fremgangsmåtene omfatter å frembringe perifere blodmononukleærceller (PBMC) fra pasienten, inkubering av PBMC med et polypeptid fra den foreliggende oppfinnelse (eller et polynukleotid som koder for et slikt polypeptid) for å frembringe inkuberte T celler og tilføre de inkuberte T cellene tilbake til pasienten. Den foreliggende oppfinnelse frembringer i tillegg fremgangsmåter for behandling av Cfr/amyd/a-infeksjoner som omfatter inkubering av antigenpresenterende celler med et polypeptid fra den foreliggende oppfinnelse (eller et polynukleotid som koder for et slikt polypeptid) for å frembringe inkuberte antigenpresenterende celler og tilføre de inkuberte antigenpresenterende celler til pasienten. Prolifererte celler kan, men behøver ikke, å være klonet før de blir tilført pasienten. I visse utførelser blir de antigenpresenterende celler utvalgt fra gruppen som består av dendritiske celler, makrofager, monocyter, B-celler og fibroblaster. Blandinger for behandlng av Ctøamyd/a-infeksjoner som omfatter T-celler, eller antigenpresenterende celler som er blitt inkubert med et polypeptid eller polynukleotid fra den foreliggende oppfinnelse, blir også frembrakt. I relaterte aspekter blir vaksiner frembrakt som omfatter: (a) en antigenpresenterende celle som uttrykker et polypeptid som beskrevet over og (b) en immunostimulant.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer videre i andre aspekter fremgangsmåter for å fjerne CWamyc//'a-infiserte celler fra en biologisk prøve, som omfatter at den biologiske prøve blir brakt i kontakt med T-celler som spesifikt reagerer med et C/?/amyc//'a-protein, der trinnet der kontakt blir gjort, utførelser under betingelser og i et tidsrom som er tilstrekkelig for å tillate fjerning av celler som uttrykker proteinet fra prøven.

I relaterte aspekter blir fremgangsmåter frembrakt for å hemme utvikling av C/7/amyc//'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter at en pasient blir tilført en biologisk prøve som er behandlet som beskrevet over. I videre aspekter av oppfinnelsen blir fremgangsmåter og diagnostiske reagenssett frembrakt for å påvise Chlamydia-infeksjon hos en pasient. I én utførelse omfatter fremgangsmåten: (a) tilsetting av en biologisk prøve til minst ett av polypeptidene eller fusjonsproteinene som er beskrevet her, og (b) påvising i prøven nærvær av bindingsmidler som binder til polypeptidet eller fusjonsproteinet, og derved påvise Ctøamyc//'a-infeksjon i den biologiske prøve. Passende biologiske prøver inkluderer hellblod, spytt, serum, plasma, oppspytt, cerebrospinalvæske og urin. I én utførelse omfatter de diagnostiske reagenssett ett eller flere av polypeptidene eller fusjonsproteinet som er beskrevet her, i kombinasjon med et påvisningsmiddel. I ytterligere en annen utførelse omfatter de diagnostiske sett enten et monoklonalt antistoff eller et polyklonalt antistoff som binder til et polypeptid fra den foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer også fremgangsmåter for å påvise Ctøamyd/a-infeksjon som omfatter: (a) fremskaffing av en biologisk prøve fra pasienten, (b) tilsetting til prøven minst to oligonukleotidprimere i en polymerasekjedereaksjon, der minst én av polynukloetidprimerne er spesifikk for en polynukleotid sekvens som blir beskrevet her, og (c) påvising i prøven av en polynukleotidsekvens som amplifiseres i nærvær av oligonukleotidprimerne. I en utførelse omfattet oiligonukleotidprimeren minst omtrent 10 sammenhengende nukleotider fra en polynukleotidsekvens for et peptid som er beskrevet her, eller av en sekvens som hybridiserer til denne.

I et videre aspekt frembringer den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å påvise C/7/amyc//a-infeksjon hos en pasient som omfatter: (a) fremskaffing av en biologisk prøve fra pasientene, (b) tilsetting til prøven av en oligonukleotidprobe som er spesifikk for en polynukleotidsekvens som er beskrevet her, og (c) påvising i prøven av en polynukleotidsekvens som hybridiserer til oligonukletidproben. I en utførelse omfatter oligonukleotidproben minst omtrent 15 sammenhengende nukleotider fra en polynukleotidsekvens som er beskrevet her, eller en sekvens som hybridiserer til denne.

Disse og andre aspekter av den foreliggende oppfinnelsen vil bli klare under henvisning til den følgende detaljerte beskrivelse. Alle referanser som beskrives her, blir herved inkorporert som referanse i deres helhet, som om hver ble inkludert hver for seg.

SEKVENSIDENTIFISERERE

SEQ ID NO: 1 er den bestemte DNA sekvens for C. trachomatis klonen 1-B1-66. SEQ ID NO: 2 er den bestemte DNA sekvens for C. trachomatis klonen 4-D7-28. SEQ ID NO: 3 er den bestemte DNA sekvens for C. trachomatis klonen 3-G3-10. SEQ ID NO: 4 er den bestemte DNA sekvens for C. trachomatis klonen 10-C10-31.

SEQ ID NO: 5 er den forutsagte aminosyresekvens til 1-B1-66.

SEQ ID NO: 6 er den forutsagte aminosyresekvens til 4-D7-28.

SEQ ID NO: 7 er en første forutsagt aminosyresekvens for 3-G3-10. SEQ ID NO: 8 er en annen forutsagt aminosyresekvens for 3-G3-10. SEQ ID NO: 9 er en tredje forutsagt aminosyresekvens for 3-G3-10. SEQ ID NO: 10 er en fjerde forutsagt aminosyresekvens for 3-G3-10. SEQ ID NO: 11 er en femte forutsagt aminosyresekvens for 3-G3-10. SEQ ID NO: 12 er den forutsagte aminosyresekvens for 10-C10-31. SEQ ID NO: 13 er aminosyresekvensen for det syntetiske peptid 1-B1-66/48-67. SEQ ID NO: 14 er aminosyresekvensen til det syntetiske peptid 1-B1-66/58-77. SEQ ID NO: 15 er den bestemte DNA sekvens for C. trachomatis serovariant LGV II klone 2C7-8.

SEQ ID NO: 16 er den bestemte DNA sekvens for den første mulige åpne leseramme fra C. trachomatis serovar D

SEQ ID NO: 17 er den forutsagte aminosyresekvens som kodes av en første mulige åpne leseramme fra C. trachomatis serovar D

SEQ ID NO: 18 er aminosyresekvensen til det syntetiske peptid CtC7,8-12 SEQ ID NO: 19 er aminosyresekvensen til det syntetiske peptid CtC7,8-13

SEQ ID NO: 20 er den forutsagte aminosyresekvens som kodes for av en annen mulig åpen leseramme fra C. trachomatis serovar D

SEQ ID NO: 21 er den bestemte DNA sekvens for klone 4C9-18 fra C.

trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 22 er den bestemte DNA sekvens som er homolog med Lipoamide Dehydrogenase fra C. trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 23 er den bestemt DNA sekvens som er homolog med hypotetisk protein fra C. trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 24 er den bestemte DNA sekvens som er homolog til Ubiquinone Mehtyltransferase fra C. trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 25 er den bestemte DNA sekvens for klone 4C9-18#2 BL21 pLysS fra C. trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 26 er den forutsagte aminosyresekvens for 4C9-18#1 BL21 pLysS fra C. trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 27 er den bestemte DNA sekvens for Cp-SWIB fra C. pneumonia stamme TWAR

SEQ ID NO: 28 er den forutsagte amiosyresekvens for Cp-SWIB fra C.

pneumonia stamme TWAR

SEQ ID NO: 29 er den bestemte DNA sekvens for Cp-S13 fra C. pneumonia stamme TWAR

SEQ ID NO: 30 er den forutsagte aminosyresekvens for Cp-S13 fra C.

pneumonia stamme TWAR

SEQ ID NO: 31 er aminosyresekvensen til et dekamer konsensus peptid fra CtC7,8-12og CtC7,8-13

SEQ ID NO: 32 er den forutsagte aminosyreskevens for klone 2C7-8 fra C.

trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 33 er den bestemte DNA sekvens til en klone fra C. trachomatis serovar D, som viser homologi med klone 2C7-8

SEQ ID NO: 34 er den forutsagte aminosyresekvens som blir kodet for av sekvensen i SEQ ID NO: 33

SEQ ID NO: 35 er DNA sekvensen til Cp. SWIB Nde (5' primer) fra C.

pneumonia

SEQ ID NO: 36 er DNA sekvensen til Cp. SWIB EcoRI (3' primer) fra C.

pneumonia

SEQ ID NO: 37 er DNA sekvensen til Cp. S13 Nde (5' primer) fra C. pneumonia

SEQ ID NO: 38 er DNA sekvensen til Cp. S13 EcoRI (3' primer) fra C.

pneumonia

SEQ ID NO: 39 er aminosyresekvensen til CtSwib 52-67 peptidet fra C.

trachomatis LGV II

SEQ ID NO: 40 er aminosyresekensen til CpSwib 53-68 peptidet fra C. pneumonia

SEQ ID NO: 41 er aminosyreskvensen til HusSwib 288-302 peptidet fra humant SWI domenet

SEQ ID NO: 42 er aminosyresekvensen til CtSWI-T 822-837 peptid fra topoisomerase-SWIB fusjonen til C. trachomatis

SEQ ID NO: 43 er aminosyresekvensen til CpSWI-T 828-242 peptid fra topoisomerase-SWIB fusjonen til C. penumonia

SEQ ID NO: 44 er en første bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19783.3,ien.seq(1 >509)CTL2#11 -3'. som repesenterer den 3' ende.

SEQ ID NO: 45 er en annen bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19783.4,ien.seqd >481 )CTL2#11 -5', som representenrer den 5' ende.

SEQ ID NO: 46 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19784CTL2J 2konsensus.seq(1 >427)CTL2#12.

SEQ ID NO: 47 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19785.4,jen.seq(1>600)CTL2#16-5', som representenrer den 5' ende.

SEQ ID NO: 48 er en første bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19786.3,ien.seq(1 >600)CTL2#18-3'. som representenrer den 3' ende.

SEQ ID NO: 49 er en annen bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19786.4,ien.seqd >600)CTL2#18-5', som representenrer den 5' ende.

SEQ ID NO: 50 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19788CTL2_21 konsesus.seq(1 >406)CTL2#21.

SEQ ID NO: 51 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 19790CTL2_23konsesus.seq(1 >602)CTL2#23.

SEQ ID NO: 52 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19791CTL2_24konsesus.seq(1>145)CTL2#24.

SEQ ID NO: 53 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen CTL2#4.

SEQ ID NO: 54 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen CTL22#8b.

SEQ ID NO: 55 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 15-G1-89, som deler homologi med lipoamiddehydrogenasegenet CT557.

SEQ ID NO: 56 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 14-H1-4, som deler homologi med det tiolspesifikke antioksidantgenet CT603.

SEQ ID NO: 57 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 12-G3-83, som deler homologi med det hypotetiske protein CT662.

SEQ ID NO: 58 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 12-B3-95, som deler homologi med lipoamiddehydrogenasegenet CT557.

SEQ ID NO: 59 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 11-H4-28, som deler homologi med dnaK genet CT396.

SEQ ID NO: 60 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 11-H3-68, som deler en delvis homologi med PGP6-D virulensproteinet og L1 ribosomal gen CT318.

SEQ ID NO: 61 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 11-G1-34, som deler delvis homologi med malatdehydrogenasegenet CT376 og med glykogenhydrolasegenet CT042.

SEQ ID NO: 62 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 11-G1-46, som deler homologi med det hypotetiske proteinet CT610.

SEQ ID NO: 63 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 11-C12-91, som deler homologi med OMP2 genet CT443.

SEQ ID NO: 64 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 11-A3-93, som deler homologi med HAD superfamiliegenet CT103.

SEQ ID NO: 65 er den bestemte aminosyresekvens til C . trachomatis LGV II klonen 14-H1-4, som deler homologi med det tiolspesifikke antioksidantgenet CT603.

SEQ ID NO: 66 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen CtL2#9.

SEQ ID NO: 67 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen CtL2#7.

SEQ ID NO: 68 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen CtL2#6.

SEQ ID NO: 69 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen CtL2#5.

SEQ ID NO: 70 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen CtL2#2.

SEQ ID NO: 71 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen CtL2#1.

SEQ ID NO: 72 er en første bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 23509.2CtL2#3-5', som representerer den 5' ende.

SEQ ID NO: 73 er en annen bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 23509.1 CtL2#3-3', som representerer den 3' ende.

SEQ ID NO: 74 er en første bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 22121.2CtL2#10-5', som representerer den 5' ende.

SEQ ID NO: 75 er en annen bestemt DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 22121.1CtL2#10-3\ som representerer den 3' ende.

SEQ ID NO: 76 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19787.6CtL2#19-5', som representerer den 5' ende.

SEQ ID NO: 77 er den bestemte DNA sekvens for C . pneummoniae LGV II klonen CpS13-His.

SEQ ID NO: 79 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 23-G7-68, som deler delvis homologi med L11, L10 og L1 ribosomalt protein.

SEQ ID NO: 80 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 22-F7-91, som deler homologi med pmpC genet.

SEQ ID NO: 81 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 21-E8-95, som deler homologi med CT610-CT613 genene.

SEQ ID NO: 82 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19-F12-57, som deler homologi med CT858 og recA genene.

SEQ ID NO: 83 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19-F12-53, som deler homologi med CT445 genet som koder for glutamyl tRNA syntetase.

SEQ ID NO: 84 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 19-A5-54, som deler homologi med det kryptiske plasmidgen.

SEQ ID NO: 85 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 17-E11-72, som deler delvis homologi med OppC_2 og pmpD genene.

SEQ ID NO: 86 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 17-C1-77, som deler en delvis homologi med CT857 og CT858 åpne leserrammer.

SEQ ID NO: 87 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 15-H2-76, som deler en delvis homologi med pmpD og SycE genene, og med CT089 åpen leseramme.

SEQ ID NO: 88 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 15-A3-26, som deler homologi med CT858 åpen leseramme.

SEQ ID NO: 89 er den bestemte aminosyresekvens for C . pnuemoniae klonen Cp_SWIB-His.

SEQ ID NO: 90 er den bestemte aminosyresekvens for C . trachomatis LGV II klonen CtL2_LPDA_FL.

SEQ ID NO: 91 er den bestemte aminosyresekvens for C . pnuemoniae klonen CpS13-His.

SEQ ID NO: 92 er den bestemte aminosyresekvens til C . trachomatis LGV II klonen CtL2_TSA_FL.

SEQ ID NO: 93 er aminosyresekvensen til Ct-Swib 43-61 peptidet fra C. trachomatis LGV II.

SEQ ID NO: 94 er aminosyresekvensen til Ct-Swib 48-67 peptidet fra C. trachomatis LGV II.

SEQ ID NO: 95 er aminosyresekvensen til Ct-Swib 52-71 peptidet fra C. trachomatis LGV II.

SEQ ID NO: 96 er aminosyresekvensen til Ct-Swib 58-77 peptidet fra C. trachomatis LGV II.

SEQ ID NO: 97 er aminosyresekvensen til Ct-Swib 63-82 peptidet fra C. trachomatis LGV II.

SEQ ID NO: 98 er aminosyresekvensen til Ct-Swib 51-66 peptidet fra C. trachomatis LGV II.

SEQ ID NO: 99 er aminosyresekvensen til Cp-Swib 52-67 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 100 er aminosyresekvensen til Cp-Swib 37-51 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 101 er aminosyresekvensen til Cp-Swib 32-51 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 102 er aminosyresekvensen til Cp-Swib 37-56 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 103 er aminosyresekvensen for Ct-Swib 36-50 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 104 er aminosyresekvensen til Ct-S13 46-65 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 105 er aminosyresekvensen for Ct-S13 60-80 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 106 er aminosyresekvensen til Ct-S13 1-20 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 107 er aminosyresekvensen til Ct-S13 46-65 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 108 er aminosyresekvensen til Ct-S13 56-75 peptidet fra C. trachomatis.

SEQ ID NO: 109 er aminosyresekvensen for Cp-S13 56-75 peptidet fra C. pneumoniae.

SEQ ID NO: 110 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 21- G12-60, som inneholder delvis åpne leserammer for de hypotetiske proteiner CT875, CT229 og CT228.

SEQ ID NO: 111 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 22- B3-53, som deler homologi med den åpne leseramme til CT110 til GroEL.

SEQ ID NO: 112 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 22-A1-49, som deler en delvis homologi med de åpne leserammer for CT660 og CT659.

SEQ ID NO: 113 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 17-E2-9, som deler en delvis homologi med de åpne leserammer for CT611 og CT610.

SEQ ID NO: 114 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 17- C10-31, som deler en delvis homologi med den åpne leserammer for CT858.

SEQ ID NO: 115 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 21-C7-66, som deler homologi med det dnaK-lignende gen.

SEQ ID NO: 116 er den bestemte DNA sekvens til C . trachomatis LGV II klonen 20-G3-45, som inneholder del av pmB genet CT413.

SEQ ID NO: 117 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 18- C5-2, som deler homologi med den åpne leseramme for S1 ribosomalt protein.

SEQ ID NO: 118 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 17-C5-19, som inneholder deler av de åpne leserammer for CT431 og CT430.

SEQ ID NO: 119 er den bestemte DNA sekvens for C . trachomatis LGV II klonen 16-D4-22, som inneholder delvise sekvenser til de åpne leserammer 3 og 4 til plasmidet for vekst i pattedyrceller.

SEQ ID NO: 120 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C . trachomatis serovar LGV II Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 121 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar LGV II Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 122 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C . trachomatis serovar E Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 123 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar LGV II Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 124 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C . trachomatis serovar IA Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 125 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar IA Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 126 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C . trachomatis serovar G Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 127 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar G Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 128 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C . trachomatis serovar F1 NM Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 129 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar F1 NM Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 130 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C . trachomatis serovar L1 Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 131 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar L1 Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 132 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C . trachomatis serovar L3 Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 133 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar L3 Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 134 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C . trachomatis serovar Ba Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 135 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar Ba Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 136 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C . trachomatis serovar MOPN Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 137 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C trachomatis serovar MOPN Cap1 genet CT529.

SEQ ID NO: 138 er den bestemte aminosyresekvens til Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #124-139 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 139 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #132-147 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 140 er den bestemte aminosyresekvens til Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #138-155 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 141 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT429 åpen leseramme peptid #146-163 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 142 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #154-171 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 143 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #162-178 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 144 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #138-147 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 145 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #139-147 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 146 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #140-147 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 147 er den bestemte aminosyresekvens til Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #138-146 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 148 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #138-145 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 149 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid #F140->1 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 150 er den bestemte aminosyresekvens for Cap1 CT529 åpen leseramme peptid ##S139>Ga fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 152 er den bestemte aminosyresekvens for peptidet #2C7,8-6 fra den 216 aminosyre åpne leseramme til C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 153 er den bestemte aminosyresekvens til peptidet #2C7,8-7 fra den 216 aminosyre åpne leseramme til C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 154 er den bestemte aminosyresekvens for peptidet #2C7,8-8 til den 216 aminosyre åpne leseramme til C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 155 er den bestemte aminosyresekvens til peptidet #2C7,8-9 til den 216 aminosyre åpne leseramme fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 156 er den bestemte aminosyresekvens for peptidet #2C7,8-10 til den 216 aminosyre åpne leseramme fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 157 er den bestemte aminosyresekvens for det 53 aminosyre restpeptid til den 216 aminosyre åpne leseramme innen klone 2C7.8-6 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 158 er den bestemte aminosyresekvens for det 52 aminosyre restpeptid til CT529 åpen leseramme innen klonen 2C7,8 fra C. trachomatis serovar L2.

SEQ ID NO: 159 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (fremover) primeren til kloning av full-lengde CT529 serovar L2.

SEQ ID NO: 160 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (reverserte) primeren til kloning av full-lengde CT529 serovar L2.

SEQ ID NO: 161 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (fremover) primeren til kloning av full-lengde CT529 fra serovarianter som er ulike L2 og MOPN.

SEQ ID NO: 162 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (revers) primeren til kloning av full-lengde CT529 serovarianter som er andre enn L2 og MOPN.

SEQ ID NO: 163 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (fremover) primeren til kloning av full-lengde CT529 serovar MOPN.

SEQ ID NO: 164 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (revers) primeren til kloning av full-lengde CT529 serovar MOPN.

SEQ ID NO: 165 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (fremover) primer til pBIB-KS.

SEQ ID NO: 166 er den bestemte DNA sekvens for den 5' (revers) primer til pBIB-KS.

SEQ ID NO: 167 er den bestemte aminosyresekvens til nonamer epitoppeptidet Cap1 #139-147 fra serovar L2.

SEQ ID NO: 168 er den bestemte aminosyresekvens til nonamer epitoppeptidet Cap1#139-147 fra serovar D.

SEQ ID NO: 169 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C. trachomatis pmpl genet.

SEQ ID NO: 170 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C. trachomatis pmpG genet.

SEQ ID NO: 171 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C. trachomatis pmpE genet.

SEQ ID NO: 172 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C. trachomatis pmpD genet.

SEQ ID NO: 173 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C. trachomatis pmpC genet.

SEQ ID NO: 174 er den bestemte full-lengde DNA sekvens for C. trachomatis pmpB genet.

SEQ ID NO: 175 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens for C. trachomatis pmpIG genet.

SEQ ID NO: 176 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens for C. trachomatis pmpG genet.

SEQ ID NO: 177 er den forutsagte full-lengde aminosyre sekvens til C. trachomatis pmpE genet.

SEQ ID NO: 178 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens for C. trachomatis pmpDG genet.

SEQ ID NO: 179 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens for C. trachomatis pmpC genet.

SEQ ID NO: 180 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens for C. trachomatis pmpB genet.

SEQ ID NO: 181 er den bestemte DNA sekvens minus signalsekvensen for C. trachomatis pmpl genet.

SEQ ID NO: 182 er en dretter bestemt full-lengde DNA sekvens for C. trachomatis pmpG genet.

SEQ ID NO: 183 er den bestemte DNA sekvens minus signalsekvensen for C. trachomatis pmpE genet.

SEQ ID NO: 184 er den først bestemte DNA sekvens som representerer karboksyterminalen for C. trachomatis pmpD genet.

SEQ ID NO: 185 er en annen bestemt DNA sekvens som representerer aminoterminalen minus signalsekvensen for C. trachomatis pmpD genet.

SEQ ID NO: 186 er en først bestemt DNA sekvens som representerer karboksyterminalen for C. trachomatis pmpC genet.

SEQ ID NO: 187 er en annen bestemt DNA sekvens som representerer aminoterminalen minus signalsekvensen for C. trachomatis pmpC genet.

SEQ ID NO: 188 er den bestemte DNA sekvens som representerer C. pneumoniae serovar MOMPS pmp genet i et fusjonsmolekyl med Ra12.

SEQ ID NO: 189 er den forutsagte aminosyresekvens minus signalsekvensen for for C. trachomatis pmpl genet.

SEQ ID NO: 190 er deretter forutsagt aminosyresekvens for C. trachomatis pmpG genet.

SEQ ID NO: 191 er den forutsagte aminosyresekvens minus signalsekvensen for C. trachomatis pmpE genet.

SEQ ID NO: 192 er en først forutsagt aminosyresekvens som representerer karboksyterminalen av C. trachomatis pmpD genet.

SEQ ID NO: 193 er en annen forutsagt aminosyresekvens som representerer aminoterminalen minus signalsekvensen fra C. trachomatis pmpD genet.

SEQ ID NO: 194 er en først forutsagt aminosyresekvens som representerer karboksyterminalen fra C. trachomatis pmpC genet.

SEQ ID NO: 195 er en annen forutsagt aminosyresekvens som representerer aminoterminalen fra C. trachomatis pmpC genet.

SEQ ID NO: 196 er den forutsagte aminosyresekvens som representerer C. pneumoniae serovar MOMPS pmp genet i et fusjonsmolekyl med Ra12.

SEQ ID NO: 197 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpCG genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 198 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpC genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 199 er den bestemte DNA sekvens for insersjonssekvensen for kloning av C. trachomatis pmpC genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 200 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpD genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 201 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpD genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 202 er den bestemte DNA sekvens for insersjonssekvensen til kloning av C. trachomatis pmpD genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 203 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpE genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 204 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpE genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 205 er den bestemte DNA sekvens til 5' oligo primeren for å klone av C. trachomatis pmpG genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 206 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpG genet i SKB vaksinevektoren.

SEQ ID NO: 207 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren til kloning av den aminoterminale del av C. trachomatis pmpC genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 208 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til å klone den aminoterminale del av C. trachomatis pmpC genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 209 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren for å klone den karboksyterminale del av C. trachomatis pmpC genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 210 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til kloning av den karboksyterminale del av C. trachomatis pmpC genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 211 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren til å klone den aminoterminale del av C. trachomatis pmpD genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 212 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren for å klone den aminoterminale del av C. trachomatis pmpD genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 213 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren for å klone den karboksyterminale del av C. trachomatis pmpD genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 214 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til å klone den karboksyterminale del av C. trachomatis pmpD genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 215 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpE genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 216 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til kloning av C. trachomatis pmpE genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 217 er den bestemte DNA sekvens for insersjonssekvensen til kloning av C. trachomatis pmpEC genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 218 er aminosyresekvensen til insersjonssekvensen for å klone C. trachomatis pmpE genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 219 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren for å klone C. trachomatis pmpG genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 220 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren for å klone C. trachomatis pmpG genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 221 er aminosyresekvensen for insersjonssekvensen til å klone C. trachomatis pmpG genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 222 er den bestemte DNA sekvens for 5' oligo primeren til å klone C. trachomatis pmpl genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 223 er den bestemte DNA sekvens for 3' oligo primeren til å klone C. trachomatis pmpl genet i pET17b vektoren.

SEQ ID NO: 224 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 1-20.

SEQ ID NO: 225 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 6-25.

SEQ ID NO: 226 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 12-13.

SEQ ID NO: 227 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 17-36.

SEQ ID NO: 228 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 22-41.

SEQ ID NO: 229 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 27-46.

SEQ ID NO: 230 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 42-61.

SEQ ID NO: 231 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 46-65.

SEQ ID NO: 232 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 51-70.

SEQ ID NO: 233 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 56-75.

SEQ ID NO: 234 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 61-80.

SEQ ID NO: 235 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea Swib peptidet 66-87.

SEQ ID NO: 236 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 103-122.

SEQ ID NO: 237 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 108-127.

SEQ ID NO: 238 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 113-132.

SEQ ID NO: 239 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 118-137.

SEQ ID NO: 240 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 123-143.

SEQ ID NO: 241 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 128-147.

SEQ ID NO: 242 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 133-152.

SEQ ID NO: 243 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 137-156.

SEQ ID NO: 244 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 142-161.

SEQ ID NO: 245 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 147-166.

SEQ ID NO: 246 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 152-171.

SEQ ID NO: 247 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB peptidet 157-176.

SEQ ID NO: 248 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB

peptidet 162-181.

SEQ ID NO: 249 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB

peptidet 167-186.

SEQ ID NO: 250 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB

peptidet 171-190.

SEQ ID NO: 251 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB

peptidet 171-186.

SEQ ID NO: 252 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis OMCB

peptidet 175-186.

SEQ ID NO: 253 er den bestemte aminosyresekvens for C. pneumoniea OMCB peptidet 185-198.

SEQ ID NO: 254 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis TSA peptidet 96-115.

SEQ ID NO: 255 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis TSA peptidet 191-120.

SEQ ID NO: 256 er den bestemte aminosyresekvens for C. trachomatis TSA peptidet 106-125.

SEQ ID NO: 257 er den bestemte aminosyresekvens til C. trachomatis TSA peptidet 111-130.

SEQ ID NO: 258 er den bestemte aminosyresekvens til C. trachomatis TSA peptidet 116-135.

SEQ ID NO: 259 er den bestemte aminosyresekvens til C. trachomatis ISA peptidet 121-140.

SEQ ID NO: 260 er den bestemte aminosyresekvens til C. trachomatis TSA peptidet 126-145.

SEQ ID NO: 261 er den bestemte aminosyresekvens til C. trachomatis TSA peptidet 131-150.

SEQ ID NO: 262 er den bestemte aminosyresekvens til C. trachomatis TSA peptidet 136-155.

SEQ ID NO: 263 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C. trachomatis C529/Cap 1 genet serovar I.

SEQ ID NO: 264 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C. trachomatis C529/Cap 1 genet serovar I.

SEQ ID NO: 265 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C. trachomatis C529/Cap 1 genet serovar K.

SEQ ID NO: 266 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C. trachomatis C529/Cap 1 genet serovar K.

SEQ ID NO: 267 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen 17-G4-36 som deler homologi med del av den åpne leseramme til DNA rettet RNA polymerasebentasubenhet-CT315 i serD.

SEQ ID NO: 268 er den bestemte DNA sekvens til den delvise sekvens av C. trachomatis CT016 genet i klone 2E10.

SEQ ID NO: 269 er den bestemte DNA sekvens for den delvise sekvens til C. trachomatis Trna syntasegenet i klone 2E10.

SEQ ID NO: 270 er den bestemte DNA sekvens for den delvise sekvens til C. trachomatis clpX genet i klone 2E10.

SEQ ID NO: 271 er en først bestemt DNA sekvens til C. trachomatis klone Ctl_2gam-30 som representerer den 5' ende.

SEQ ID NO: 272 er en annen bestemt DNA sekvens til C. trachomatis klone Ctl_2gam-30 som representerer den 3' ende.

SEQ ID NO: 273 er den bestemte DNA sekvens for C. trachomatis klonen CtL2gam-28.

SEQ ID NO: 274 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-27.

SEQ ID NO: 275 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-26.

SEQ ID NO: 276 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-24.

SEQ ID NO: 277 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-23.

SEQ ID NO: 278 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-21.

SEQ ID NO: 279 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-18.

SEQ ID NO: 280 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-17.

SEQ ID NO: 281 er en først bestemt DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-15 som representerer den 5' ende.

SEQ ID NO: 282 er en annen bestemt DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-15 som representerer den 3' ende.

SEQ ID NO: 283 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-13.

SEQ ID NO: 284 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-10.

SEQ ID NO: 285 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-8.

SEQ ID NO: 286 er en først bestemt DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-6 som representerer den 5' ende.

SEQ ID NO: 287 er en annen bestemt DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-6 som representerer den 3' ende.

SEQ ID NO: 288 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen Ctl_2gam-5.

SEQ ID NO: 289 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-2.

SEQ ID NO: 290 er den bestemte DNA sekvens til C. trachomatis klonen CtL2gam-1.

SEQ ID NO: 291 er den bestemte full-lengde DNA sekvens til C. pneumoniae homologen til CT529 genet.

SEQ ID NO: 292 er den forutsagte full-lengde aminosyresekvens til C. prenumoniae homologen til CT529 genet.

SEQ ID NO: 293 er den bestemte DNA sekvens for insersjonssekvensen for å klone C. trachomatis pmpG genet i SKB vaksinevektoren.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. 1 illustrerer induksjon av INF-y fra en Ctøamyc//a-spesifikk T cellelinje aktivert av målceller som uttrykker klone 4C9-18#2. Fig. 2 illustrerer retrovirusvektorer pBIB-KS1,2,3 som er endret for å inneholde et Kosak translasjonsbegynnersete og stoppdokoner. Fig. 3 viser spesefikk lysis i en analyse av krom frisetting i P815 celler som fikk pulser med Chlamydia peptider CtC7,8-12 (SEQ ID NO: 18) og CtC7,8-13 (SEQ ID NO: 19). Fig. 4 viser antistoff isotyptitere i C57BI/6 muse var blitt immunisert med C. trachomatis SWIB protein. Fig. 5 viser C/?/amyc//'a-spesifikk T-celle proliferasjonsresponser i miltceller fra C3H mus som var blitt immunisert med C. trachomatis SWIB protein. Fig. 6 illustrerer 5' og 3' primersekvensene fra C. pneumoniae som ble benyttet for å isolere SWIB og S13 genene fra C. pneumonia. Fig. 7A og 7B viser induksjon av IFN-y fra en human ant\- Chlamydia T-cellelinje (TCL-8) som har evne til å kryssreagere med C. trachomatis og C. penumonia etter aktivering av monocytavledet dendritiske celler som uttrykker Cfr/amyd/a-proteiner. Fig. 8 viser identifikasjon av T-celleepitoper i C/7/amyc//a-ribosomalt S13 protein med T-cellelinje TCL 8 EB/DC. Fig. 9 illustrerer den proliferative respons til CP-21 T-celler som ble ladet mot C. penumon/a-infiserte dendritiske celler fremkalt av rekombinant C. pneumonia- S\ N\ B protein, men ikke C. trachomatis SWIB protein. Fig. 10 viser den C. fracftomaf/s-spesefikke SWIB proliferative responsen til en primær T-cellelinje (TCT-10 EB)fra en asymptomatisk donor. Fig. 11 viser identifikasjon av T-celleepitop i C. tranchomatis SWIB med en antigenspesifikk T-cellelinje (TCL-10 EB).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Som beskrevet over, er den foreliggende oppfinnelse generelt rettet mot forbindelser og fremgangsmåter for diagnose og behandling av CWamycZ/a-infeksjon. I ett aspekt av oppfinnelsen inkluderer oppfinnelsens blandinger polypeptider som omfatter minst én immunogen del av et CWamyc/Za-antigen, eller en variant av dette.

I spesifikke utførelser beskriver oppfinnelsen polypeptider som omfatter en immunogen del av et CWamycZ/a-antigen, der det Ctøamyd/a-antigene omfatter en aminosyresekvens som blir kodet for av et polynukleotidmolekyl som inkluderer en sekvens som velges ut fra gruppen som består av (a) nukleotidsekvensene beskrevet i SEQ ID NO: 1, 15, 21-25, 44-64, 66-76, 79-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-29, (b) komplementene til de nevnte nukleotidsekvenser, og (c) varianter av slike sekvenser.

Som benyttet her, omfatter ordet "polypeptid" aminosyrekjeder av alle lengder, deriblant full-lengde proteiner (dvs. antigener), der aminosyrerestene er koblet sammen med kovalente peptidbindinger. Et polypeptid som omfatter en immunogen del fra et av oppfinnelsens antigener, kan således totalt utgjøres av den immunogene del, eller kan inneholde ytterligere sekvenser. De ytterligere sekvenser kan avledes fra det native C/?/amyc//'a-antigen eller kan være heterologt, og slike sekvenser (men behøver ikke å være) være immunogene.

Ordet "polynukleotid(er)", som benyttet her, betyr en enkelt- eller dobbelttrådet polymer av deoksyribonukleotid eller ribonukleotidbaser, og inkluderer DNA og tilsvarende RNA molekyler, deriblant HnRNA og mRNA molekyler, både sens- og anti-senstråder, og omfatter cDNA, genomisk DNA og rekombinant DNA, samt også delvis eller helt syntetiserte polynukleotider. Et HnRNA molekyl inneholder introner og tilsvarer et DNA molekyl i en en-til-en relasjon. Et mRNA molekyl tilsvarer et HnRNA og DNA molekyl som er blitt fratatt sine introner. Et polynukleotid kan bestå av et helt gen, eller enhver del av et gen. Operable antisens polynukleotider kan omfatte et fragment av det tilsvarnede polynukleotid, og definisjonen av "polynukleotid" inkluderer derfor alle slike operable antisens fragmenter.

En "immunogen del" av et antigen er en del som har evne til å reagere med sera som er fremskaffet fra C/?/amyc//'a-infiserte individer (dvs. produseres en absorbans avlesning med sera fra infiserte individer som er minst tre standard avvik over absorbansen som fremskaffes med sera fra ikke-infiserte individer, i et standard ELISA eksperiment som beskrevet her). Slike immunogene deler omfatter vanligvis minst 5 aminosyrerester, mer fordelaktig minst omtrent 10, og mest fordelaktig minst omtrent 20 aminosyrerester. Fremgangsmåter for å fremstille og identifisere immunogene deler av antigener med kjent sekvens er vel kjent i faget og inkluderer de som er beskrevet i Paul, Fundamental Immunology, 3. utgave, Raven Press, 1993, s. 243-247, og referanser som er sitert der. Slike fremgangsmåter inkluderer analyse av polypeptider med henblikk på evne til å reagere med antigen-spesifikke antistoff, antisera og/eller T-cellelinjer eller kloner. Som benyttet her, er antisera og antistoff "antigen-spesifikke" dersom de spesifikt binder til ett antigen (dvs. de reagerer med proteinet i ett ELISA eller et annet immunoessay, og reagerer ikke påvisbart med ikke-relaterte proteiner). Slike antisera og antistoff kan fremstilles som beskrevet her, og ved bruk av velkjente fremgangsmåter. En immunogen del av et nativt Ctøamyc//a-protein er en del som reagerer med slike antisera og/eller T-celler på et nivå som ikke er i hovedsak mindre enn reaktiviteten til full-lengde polypeptidet (f.eks. i et ELISA og/eller T-celle reaktivitetseksperiment). Slike immunogene deler kan reagere i slike eksperimenter på et nivå som er likt eller større enn reaktiviteten til full-lengde polypeptidet. Slike undersøkelser kan generelt bli utført ved å bruke fremgangsmåter som er vel kjent med de som har normal trening i faget, slik som de som er beskrevet i Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. For eksempel kan et polypeptid bli immobilisert på en fast støttefase, og pasientsera kan tilsettes for å tillate binding av antistoff som er disse seraene til det immobiliserte polypeptid. Ikke-bundet serum kan deretter blir fjernet, og bundet antistoff kan for eksempel bli påvist ved hjelp av12<5>l-merket protein A.

Eksempler på immunogene deler av antigen som er vurdert i den foreliggende oppfinnelse, inkluderer for eksempel de T-cellestimulerende epitoper som er fremvist i SEQ ID NO: 9, 10, 18, 19, 31, 39, 93-96, 98, 100-102, 106, 108, 138-140, 158, 167, 168, 246, 247 og 254-256. Polypeptidet som omfatter minst en immunogen del fra et eller flere c/?/amyc//'-ntigener som beskrevet her, kan generelt blir benyttet, alene eller sammen, for å vise CWamycZ/a-infeksjon hos en pasient.

Forbindelsene og fremgangsmåtene fra den foreliggende oppfinnelsen omfatter også varianter av de ovenfor nevnte polypeptider og polynukleotide molekyler, slike varianter inkluderer, men er ikke begrenset til, naturlig forekommende allelle-varianter til oppfinnelsens sekvenser. Spesielt inkluderer varianter andre CWam<y>cZ/a-serovarianter, slik som serovar D, E og F, samt også de ulike LGV serovarianter som deler homologi med oppfinnelsens polypeptid og polynukleotid molekyler som er beskrevet her. Fortrinnsvis viser serovar homologene 95-99% homologi med de tilsvarende polypeptidsekvens(er) som beskives her.

En polypeptid "variant", som benyttet her, er et polypeptid som skiller seg fra det beskrevne polypeptid utelukkende i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner, slik at de antigene egenskaper til polypeptidet er bevart, I en foretrukket utførelse skiller variante polypeptider seg fra en identifisert sekvens ved substitusjon, delesjon eller addisjon av fem aminosyrer eller færre. Slike varianter kan vanligvis identifiseres ved å modifisere en av de ovenfor beskrevne polypeptidsekvenser, og evaluering av de antigene egenskaper til det modifiserte polypeptid ved å bruke for eksempel de representative fremgangsmåter som er beskrevet her. Med andre ord kan evnen til en variant til å reagere med antigen antisera være forsterket eller uendret, sammenlignet med det native protein, eller kan være senket med mindre enn 50% og fortrinnsvis mindre enn 20%, relativt til det native protein. Slike varianter kan generelt identifiseres ved å modifisere en av de ovenfor beskrevne polypeptidsekvenser og evaluering av reaktiviteten av det modifiserte polypeptid med antigen spesifikke antistoff eller antisera som beskrevet her. Foretrukne varianter inkluderer de der en eller flere deler, slik som en N-terminal ledersekvens eller et transmembrandomene, er blitt fjernet. Andre foretrukne varianter inkluderer varianter der en liten del (f.eks. 1-30 aminosyrer, fortrinnsvis 5-15 aminosyrer) er blitt fjernet fra N- og/eller C-terminalene i det modne protein. Polypeptidvarianter fremviser fortrinnsvis minst omtrent 70%, mer fordelaktig minst 90% og mest fordelaktig minst 95% identitet (bestemt som beskrevet under) med de identifiserte polypeptid.

Som benyttet her, er en "konservativ substitusjon" en der en aminosyre er substituert for an annen aminosyre som har lignende egenskaper, slik at en som er øvet i faget peptidkjemi, ville forvente at sekundær struktur og den hydropatiske egenskap til polypeptidet ville forbli uventet i all hovedsak. Aminosyresubstitusjoner som kan generelt gjøres på basis av likheter av polaritet, ladning, løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller amfipatiske egenskaper av sidekjedene. For eksempel kan negativt ladet aminosyre inkludere asparaginsyre og glutaminsyre, positivt ladete aminosyrer inkluderer lysin og arginin, aminosyrer med uladete polare hodegrupper som har like hydrofilisitetsverdier, inkluderer leusin, isoleusin og valin, glysin og alanin, asparagin og glutamin, og serin, treonin, fenylalanin og tyrosin. Andre grupper aminosyrer som kan representere konservative endringer, inkluderer: (a) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr, (s) cys, ser, tyr, thr, (3) val, ile, leu, met, ala, phe, (4) lys, arg, his, og (5) phe, tyr, trp, his. En variant kan også, eller som alternativ, inneholde ikke konservative endringer. I en foretrukket utførelse skiller variante polypeptider seg fra native sekvenser ved substitusjon, delesjon eller tilsetning av fem aminosyrer eller færre. Varianter kan også (eller som alternativ) bli modifisert ved for eksempel delesjon eller tilføring av aminosyrer som har minimal påvirkning på immunogenisiteten, den sekundære strukturen og den hydropatiske egenskap til polypeptidet. Varianter kan også, eller som alternativ, inneholde andre modifikasjoner, deriblant delesjon eller tilsetning av aminosyrer som har minimal påvirkning på de antigene egenskaper, sekundære struktur og den hydropatiske egenskap til polypeptidet. For eksempel kan et polypeptid bli konjugert til en signal (eller leder) sekvens ved den N-terminale proteinende, som co-translasjonelt eller post-translasjonelt dirigerer trafikkering av proteinet. Polypeptider kan også bli konjugert til en linker eller annen sekvens for lettere å kunne syntetiseres, renses eller identifiseres (f.eks. poly-His), eller for å forsterke binding av polypeptidet til en fast fase. For eksempel kan et polypeptid konjugeres til en immunglobulin Fc region.

En polynukleotid "variant" er en sekvens som skiller seg fra den beskrevne nukleotidsekvens i at det er en eller flere nukleotiddelesjoner, -substitusjoner eller -addisjoner slik at immunogenisiteten til det kodete polypeptid ikke blir senket, sammenlignet med det native protein. Effekten på immunogenisiteten av det kodete polypeptid kan vanligvis bli vurdert som beskrevet her. Slike modifikasjoner kan lett bli introdusert ved å bruke standard mutagenesemetoder, slik som oligonukleotid-rettet setespesifikk mutagenese, som for eksempel beskrevet av Adelman et al., ( DNA, 2:183, 1983). Nukleotidvarianter kan være naturlig forekommende allelevarianter som diskutert nedenfor, eller ikke-naturlig forekommende varianter. Variantnukleotidsekvenser fremviser fortrinnsvis minst omtrent 70%, mer fordelaktig omtrent minst 80% og mest fordelaktig minst omtrent 90% identitet (bestemt som beskrevet nedenfor) med den beskrevne sekvens.

Polypeptidene som frembringes av den foreliggende oppfinnelsle, inkluderer varianter som blir kodet for av polynekleotidsekvenser som er i hovedsak homologe til en eller flere av de polynykleotidsekvenser som spesifikt blir beskrevet her. "Substansiell homologi", henspeiler på polynukleotidsekvenser som har evne til å hybridisere under moderat stringente betingelser. Passende moderat stringente betingelser inkluderer forvask i en løsning på 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA

(pH 8,0), hybridisering ved 50°C-65°C, 5X SSC, over natt, eller dersom det er en homologi mellom arter, ved 45°C med 0,5X SSC, etterfulgt av to vasker ved 65°C i 20 minutter med henholdsvis 2X, 0,5X og 0,2X SSC som inneholder 0,1% SDS. Slike hybridiserende polynukleotidsekvenser er også innenfor oppfinnelsens område, som også nukleotidsekvenser er, som på grunn av den degenererte genetiske kode, koder for polypeptid som er det samme som polypeptidet fra den foreliggende oppfinnelse.

To nukleotid- eller polypepitdsekvenser blir sagt å være "identiske" dersom nukleotidsekvensen eller aminosyresekvensen i de to sekvensene er de samme når de blir stilt opp ved siden av hverandre med henblikk på maksimum overensstemmelse, som beskrevet nedenfor. Sammenligninger mellom to sekvenser blir typisk utført ved å sammenligne sekvensene i et sammenligningsvindu for å identifisere og sammenligne lokale områder med henblikk på sekvenslikheter. Et "sammenligningsvindu" som benyttet her, dreier seg om et segment på minst omtrent 20 etter hverandre følgende posisjoner, vanligvis 30 til omtrent 75, 40 til omtrent 50, der en sekvens kan sammenlignes til en referansesekvens med det samme antall etterfølgende posisjoner etter at de to sekvenser blir stilt opp optimalt.

Optimal oppstilling av sekvenser med henblikk på sammenligning kan utføres ved å bruke Megalign programmet i Lasergenes bioinformatikk software (DNASTAR,

Inc., Madison, Wl), ved å bruke standard parametere. Dette program omfatter en rekke oppstillingsskjemaer som er beskrevet i de følgende referanser: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrics for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Seqeunce and Structure, National Biomedical Resarch Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl, 3, s. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes s. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) Fast and sensitive multiple sequence alignments on at microcomputer CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) Optimal alignments in linear space CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) The Neighbor joining method. A new method for reconstructing phulogenetic trees Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1972) Numehcal Taxonomy- the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Fransisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks Proe. Nati. Acad., Sei. USA 80:726-730.

Fortrinnsvis blir "prosent sekvensidentitet" bestemt ved å sammenligne to optimalt tilpassete sekvenser i et sammenligningsvindu på minst 20 posisjoner, der delen av polynukleotidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner eller delesjoner (dvs. gap) på 20 prosent eller mindre, vanligvis 5 til 15%, eller 10 til 12%, sammenlignet med referansesekvensene (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) med henblikk på optimal tilpassing av de to sekvenser. Prosentdelen blir kalkulert ved å bestemme antall posisjoner der de identiske nukleinsyrebaser eller laminosyrerester forekommer i begge sekvenser, for å fremskaffe antall posisjoner som passer, og dele antall av identiske posisjoner på antall totale posisjoner i referansesekvensen (dvs. størrelsen på vinduet) og multiplisere den resulterende fraksjon med 100 for å fremskaffe prosentvis sekvensidentitiet.

Også inkludert i den foreliggende oppfinnelses område er alleler av genene som koder for nukleotidsekvensene som er beskrevet her. Som benyttet her, er et "allel" eller "allelsekvens" alternativ form av genet som kan resultere fra en mutasjon i nukleinsyresekvensen. Alleler kan føre til endrete mRNA molekyler eller polypeptider som har struktur eller funksjon som kan eller ikke kan være endret. Alle deler kan ha ingen, en eller mange allelformer. Vanlige mutasjonsendringer som fører til dannelse av alleler, blir vanligvis forårsaket av naturlige delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av nukleotider. Hver av disse endringstypene kan forekomme alene eller sammen med de andre, en eller flere ganger i en definert sekvens. I spesielle utførelser beskriver denne oppfinnelse polypeptider som omfatter minst en immunogen del av et Chlamydia-antigen (eller en variant av et slikt antigen) som omfatter en eller flere av aminosyresekvensene som kodes for, av (a) en polynukleotidsekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 1-4, 15, 21-25, 44-64, 66-76 og 79-88, (b) komplementene til slike DNA sekvenser eller (c) DNA sekvenser som i hovedsak er homologe med en sekvens i (a) eller (b). Som beskrevet i eksemplene nedenfor, gjenkjenner en rekke av C/7/amyc//'a-antigenene som er beskrevet her, en T-cellelinje som gjenkjenner både Chlamydia trachomatis og Chlamydia pneumoniae infiserte monocyt-avledete dendritiske celler, noe som identikerer at de kan representere en immunreaktiv epitop som deles av Chlamydia trachomatis og Chlamydia pneumoniae. Antigenene kan således benyttes i en vaksine mot både C. fracftomaf/s-infeksjon av kjønnsorganer og infeksjoner med C. pneumoniae. Videre karakterisering av disse C/?/amyc//'a-antigener fra Chlamydia trachomatis og Chlamydia pneumoniae for å bestemme grad av kryss-reaktivitet, blir frembrakt i eksempel 6.1 tillegg beskriver eksempel 4 cDNA fragmenter (SEQ ID NO: 15, 16 og 33) som er isolert fra C. trachomatis som koder for proteiner (SEQ ID NO: 17-19 og 32) som har evne til å stimulere en CWamyc//'a-spesifikk mus CD8+ T-cellelinje.

Generelt kan Cft/amyd/a-antigener og polynukleotidsekvenser som koder for slike antigener, fremstilles ved hjelp av en rekke fremgangsmåter. For eksempel kan nukleotidmolekylet som koder for Ctøamyc//'a-antigenet bli isolert fra et Chlamydia genomisk eller cDNA ekspresjonsbibliotek ved å skrine med en CWamyc//'a-spesifikk T-cellelinje som beskrevet nedenfor, og sekvensert med fremgangsmåter som er velkjente for de som har øvelse i faget. I tillegg kan et polynukleotid identifiseres, som beskrevet i større detalj nedenfor, ved å skrine med mikromatriser med cDNA med henblikk på Chlamydia- assosiert ekspresjon (dvs. ekspresjon som er minst to ganger større i C/7/amyc//'a-infiserte celler enn i kontroller, bestemt ved å bruke en representativ analyse som blir frembrakt her). Slike undersøkelser kan utføres ved å bruke et Synteni mikromatrisesystem (Palo Alto, CA) ifølge produsentens protokoller (og i hovedsak som bskrevet av Schena et al., Proe. Nati., Acad. Sei. USA 93:10614-10619, 1996 og Heller et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94: 2150-2155, 1997). Alternativt kan polypeptidene bli forsterket ved cDNA fremstilt fra celler som uttrykker proteinene som er beskrevet her. Slike polynukleotider kan amplifiseres ved polymerasekjedereaksjon (PCR). For å benytte denne tilnærming, kan sekvens-spesifikke primere bli lavet spesielt på sekvensene som er gitt her, og de kan bli kjøpt eller syntetisert.

Antigenene kan bli produsert rekombinant som beskrevet nedenfor, ved å innføre en polynukleotidsekvens som koder for antigenet, inn i en ekspresjonsvektor og uttrykke antigenet i en passende vertscelle. Antigener kan evalueres med henblikk på en ønsket egenskap, slik som evne til å reagere med sera fremskaffet fra et individet som er infisert med Chlamydia, som beskrevet her, og kan sekvenseres ved å bruke for eksempel tradisjonell Edmans sekviseringskjemi. Se Edman and Berg, Eur. Biochem. 80:116-132, 1967.

Polynukleotidsekvenser som koder for antigener, kan også fremskaffes ved å analysere et passende Chlamydia cDNA eller genomisk DNA bibliotek med henblikk på polynukleotidsekvenser som hybridiserer til degenererte oligonukleotider som er avledet fra delvise aminosyresekvenneser fra isolerte antigener. Degenererte oligonukleotidsekvenser for bruk i en slik analyse kan bli bygget opp og syntetisert, og analysen bli utført som beskrevet (for eksempel) i Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Maunual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (og referanser som er sitert der). Polymerasekjedereaksjon (PCR) kan også bli benyttet, der man bruker de ovenfor nevnte nukleotidene i fremgangsmåter som er vel kjent i faget, for å isolere en nukleinsyreprobe fra en cDNA eller genomisk bibliotek. Bibliotek-analysen kan deretter utføres ved hjelp av den isolerte probe.

En amplifisert del kan brukes for å isolere et full-lengde gen fra et passende bibliotek (f.eks. et Chlamydia cDNA bibliotek) ved å bruke vel kjente fremgangsmåter. Med slike fremgangsmåter blir et bibliotek (cDNA eller genomisk) undersøkt ved å bruke en eller flere polynukleotidprober eller primere som er passende for å amplifiseres. Fortrinnsvis blir biblioteket valgt ut med henblikk på størrelse for å inkludere større molekyler. Tilfeldig primete biblioteker kan også bli foretrukket for å kunne identifisere 5' og oppstrømsregioner av gener. Genomiske biblioteker blir foretrukket når man vil fremskaffe introner og for å forlenge 5' sekvenser.

For å utføre hybridiseringsfremgangsmåter, kan en delvis sekvens bli merket (f.eks. med nikktranslasjon eller endemerking med<32>P) ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. Et bakterie- eller bakteriofagbibliotek blir deretter undersøkt ved å hybridisere filtrene som inneholder denaturt bakterielle kolonier (eller heldekkende bakteriekultur som inneholder fagflekker) med den merkete probe (se Sambrook et al., Molecular Clning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Hybridiserende kolonier eller flekker blir utvalgt og ekspandert, og DNA blir isolert med henblikk på videre analyse. cDNA kloner kan analyseres for å bestemme mengde av ytterligere sekvens ved for eksempel bruk av PCR, med en primer fra den delvise sekvens og en primer fra vektoren. Restriksjonskart og delvise sekvenser kan fremskaffes for å identifisere en eller flere overlappende kloner. Den komplette sekvens kan deretter bli bestemt ved å bruke standard fremgangsmåter, som kan dreie seg om å produsere en serie med delesjonskloner. De resulterende overlappende sekvenser blir deretter samlet inn i en enkel samt kontinuerlig sekvens. Et full-lengde cDNA molekyl kan fremskaffes ved å koble sammen passende fragmenter, ved å bruke velkjente fremgangsmåter.

Alternativt er den en rekke amplifikasjonsteknikker tilgjengelig for å fremskaffe en full-lengdekodende sekvens fra en delvis cDNA sekvens. Innenfor disse fremgangsmåter blir amplifikasjon vanligvis utført ved hjelp av PCR. En rekke kommersielt tilgjengelige reagenssett kan benyttes for å utføre amplifikasjonstrinnet. Primere kan produseres ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente i faget (se for eksempel Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987, Erlich ed., PCR Techology, Stockton Press, NY, 1989), og dataprogrammer som er velkjente i faget, kan også bli benyttet. Primere er fortrinnsvis 22-30 nukleotider lange, har minst 50% GC innhold, og binder til målesekvensen ved temperaturer på omtrent 68°C til 72°C. Den amplifiserte regionen kan sekvenseres som beskrevet ovenfor, og overlappende sekvenser kan samles sammen i en kontinuerlig sekvens.

En slik amplifikasjonsfremgangsmåte er invers PCT (se Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), som benytter restriksjonsenzymer for å generere et fragment i den kjente regionen av genet. Fragmentet blir deretter sirkularisert ved intramolekylær legering, og benyttes som et templat for PCR med divergerende primere avledet fra den kjente region. I en alternativ tilnærming kan sekvenser som er like ved siden av en delvis sekvens, bli gjenvunnet ved hjelp av amplikasjon med en primer til en koblingssekvens og en primer som er spesifikk for en kjent region. De amplifiserte sekvenser blir da vanligvis utsatt for en ny runde amplifikasjon med den samme koblingsprimer, men med en ny primer som er spesifikk for den kjente region. En variasjon av denne prosedyre, som benytter to primere som initierer ekstensjon i motsatte retninger fra den kjente sekvens, er beskrevet i WO 96/38591. Ytterligere fremgangsmåter inkluderer innfangings-PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991)og vandrende PCR (Parker et al., Nucl. Acids., Res. 19:3055-60, 1991). Transkripsjonsmediert amplifikasjon, eller TMA, er en annen fremgangsmåte som kan benyttes for amplifikasjon av DNA, rRNA eller mRNA som beskrevet i patent nr. PCT/US91/03184. Denne autokatalytiske og isotermiske ikke-PCR fremgangsmåte benytter to primere og to enzymer: RNA polymerase og reverstranskriptase. En primer inneholder en promotersekvens for RNA polymerase. I den første amplifikasjon hybridiserer promoter-primeren til mål rRNA i et definert område. Reverstranskriptase skaper en DNA kopi av mål rRNA ved hjelp av ekstensjon fra 3' enden av promoter-primeren. RNA i det resulterende kompleks blir degradert og en ny primer binder til DNA kopien. En ny tråd DNA blir syntetisert fra enden av primeren ved hjelp av reverstranskriptase som produserer dobbelttrådet DNA. RNA polymerase gjenkjenner promotersekvensen i DNA templaten og initierer transkripsjon. Hvert av de nysyntetiserte RNA amplikonene går på nytt inn i TMA prosessen og fungerer som en templat for en ny runde med replikasjon som fører til eksponensiell ekspansjon av RNA amplikonet. Andre fremgangsmåter som benytter amplifikasjon, kan også benyttes for å fremskaffe en full-lengde cDNA sekvens.

I visse tilfeller er det mulig å fremskaffe en full-lengde cDNA sekvens ved å analysere sekvenser som finnes i en expressed sequence tag (EST) database, slik som den som er tilgjengelig fra GenBank. Leting etter overlappende EST kan vanligvis bli utført ved å benytte velkjente programmer (f.eks. NCBI BLAST søk), og slike EST kan benyttes for å produsere en kontinuerlig full-lengde sekvens. Full-lengde cDNA sekvenser kan også fremskaffes ved å analysere genomiske fragmenter.

Polynukleotidvarianter kan generelt bli fremstilt ved enhver fremgangsmåte som er kjent i faget, deriblant kjemisk syntese ved for eksempel fastfasefosforamidkjemisk syntese. Modifikasjoner i en polynukleotidsekvens kan også introduseres ved å bruke standard mutageneseteknikker, slik som oligonukleotid-rettet setespesifikk mutagenese (se Adelman et al., DNA 2:183, 1983). Alternativt kan RNA molekyler genereres in vitro eller in vivo med transkripsjon av DNA sekvenser som koder for et C/7/amyc//'a-protein, eller deler av dette, så lenge DNA er inkorporert i en vektor med en passende RNA polymerasepromoter (slik som 17 eller SP6). Visse deler kan benyttes for å fremstille rettkodet polypeptid, som beskrevet her. I tillegg, eller alternativt, kan en del tilføres til en pasient slik at det kodete polypeptid blir produsert in vivo (f.eks. ved å transfektere antigen-presenterende celler, slik som dendritiske celler, med et cDNA konstrukt som koder for et C/7/amyc//'a-polypeptid, og tilføre de transfeterte celler til pasienten).

En del av en sekvens som er komplementær til en kodende sekvens (dvs. en at antisenspolynukleotid) kan også ben tytes som en probe eller for å modulere genekspresjon. cDNA konstrukter som kan transkriberes til antisens RNA, kan også introdueres i celler eller vev for å fasilitere produksjon av antisens RNA. Et antisenspolynukleotid kan benyttes, som beskrevet her, for å hemme ekspresjon av et C/?/amyc//'a-protein. Antisens teknologi kan benyttes for å kontrollere genekspresjon gjennom trippel-heliks-dannelse som hindrer evnen som den dobbelte heliks har i å åpne seg tilstrekkelig for å kunne binde polymerase, transkripsjonsfaktorer eller regulatoriske molekyler (se Gee et al., In Huber and Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)). Alternativt kan et anisens-molekyl bygges opp for å hybridisere med en kontrollregion i et gen (f.eks. promoter, enhanser eller transkripsjonsinitiserinngssete), og hindre transkripsjon av genet, eller å hindre translasjon ved å hemme binding av et transkript til ribosomer.

En del av en kodende sekvens, eller av en komplementær sekvens, kan også bli bygget opp som en probe eller primer for å påvise genekspresjon. Prober kan merkes med en rekke reportergrupper, slik som radioaktive nukliderog enzymer, og er fortrinnsvis minst 10 nukleotider lange, mer fordelaktig minst 20 nukleotider lange og enda mer fordelaktig minst 30 nukleotider lange. Primere, som beskrevet over, er fortrinnsvis 22-30 nukleotider lange.

Ethvert polynukleotid kan videre modifiseres for å øke stabiliteten in vivo. Mulige modifikasjoner inkluderer, men de er ikke begrenset til, tilførsel av flankesekvenser i 5' og/ellr 3' endene, bruk av fosfortioat eller 2' O-metyl istedenfor fosfodiesterasekoblinger i den kjemiske struktur, og/eller inklusjon av utradisjonelle baser slik som inosin, queosin og wybutosin, samt acetyl-, metyl-, tio- og andre modifiserte former av adenin, cytidin, guanin, tymin og uridin.

Nukleotidsekvensene som beskrevet her, kan kobles til en rekke andre nukleotidsekvenser ved å bruke etablerte rekombinant DNA fremgangsmåter. For eksempel kan et polynukleotid bli klonet inn i en rekke kloningsvektorer, deriblant plasmider, fagmider, lambdafagderivater og kosmider. Vektorer som er spesielt interessante, inkluderer ekspresjosnvektorer, replikasjonsvektorer, probedannelses-vektorer og sekveseringsvektorer. Generelt vil en vektor inneholde et replikasjons-startsete som fungerer i minst en organisme, passende restriksjonsendonukleaseseter og en eller flere selekterbare markører. Andre elementer vil avhenge av den ønskete bruk, og vil være klart for de som har vanlig kunnskap i faget.

Syntetiske polypeptider med mindre enn omtrent 100 aminosyrer, og generelt under mindre enn omtrent 50 aminosyrer, kan produseres med fremgangsmåter som er vel kjent i faget. For eksempel kan slike polypeptider syntetiseres ved hjelp av enhver av de kommersielt tilgjengelige fastfaseteknikkene, slik som Merrifields fastfase-syntesefremgangsmåte, der aminosyrer sekvensielt blir tilsatt en voksende aminosyrekjede. Se Merrifield, J. Am. Chem. Sol. 85:2149-2146, 1963. Utstyr for automatisert syntese av polypeptider er kommersielt tilgjengelig fra produsenter slik som Perkin Eimer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, og kan benyttes ifølge produsentenes instruksjoner.

Som beskrevet over, kan immunogene deler av Ctøamyd/a-antigener bli fremstilt og identifisert med velkjente fremgangsmåter, slik som de som er beskrevet i Paul, Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, s. 243-247, og referanser som er sitert der. Slike teknikker inkluderer analyse av polypeptiddeler av det native antigen med henblikk på immnunogene egenskaper. De representative ELISA analyser som er beskrevet her, kan generelt bli benyttet i disse analyser. En immunogen del av et polypeptid er en del som, med bruk av slike representative eksperimenter, produserer et signal i slike analyser som er i hovedsak likt det som blir produsert av full-lengde antigenet. Med andre ord produserer en immunogen del av et Ctøamyc//a-antigen minst omttent 20%, og fortrinnsvis omtrent 100%, av det signalet som induseres av full-lengde antigenet i en modell av ELISA analysen som beskrevet her.

Deler og andre varianter av Ctøamyc//a-antigener kan produsere ved hjelp av syntetiske eller rekombinante fremgangsmåter. Varianter av et nativt antigen kan generelt fremstilles ved å bruke standard mutageneseteknikker, slik som oligonukleotid- rettet setespesifikk mutagenese. Deler av polynukleotidsekvenser) kan også fjernes ved å bruke standard fremgangsmåter for å tillate fremstilling av forkortete polypeptider.

Rekombinante polypeptid som innehodler deler og/eller varianter av et nativt antigen, kan lett fremstilles fra en polynukleotidsekvens som koder for polypeptidet ved å bruke en rekke fremgangmsåter som er vel kjent for de med normal kompentanse i faget. For eksempel kan supernatanter fra passende verts-/vektorsystemer som frisetter det kombinante protein inn i kulturmediet, først bli konsentrert ved å bruke et kommersielt tilgjengelig filter. Etter konsentrasjon kan konsentratet bli tilsatt en passende rensningsmatriks slik som en affinitetsmatriks eller et ionebytteresin. Til slutt kan et eller flere reversfase HPLC trinn bli benyttet for videre å rense et rekombinant protein.

Enhver av en rekke ekspresjonsvektorer som er kjent av de med vanlig kunnskap i faget, kan benyttes for å uttrykke rekombinante polypeptider som beskrevet her. Ekspresjon kan oppnås i enhver passende vertscelle som er blitt transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholder et polynukleotidmolekyl som koder for et rekombinant polypeptid. Passende vertsceller inkluderer prokaryoter, gjær og høyere eukaryoteceller. Fortrinnsvis er vertscellene som blir benyttet, E. coli, gjærceller eller en pattedyrcellelinje, som COS eller CHO. DNA sekvensene som uttrykkes på denne måte, kan kode for naturlig forekommende antigener, deler av naturlig forekommende antigener eller av andre varianter av dette.

Generelt blir, uansett fremgangsmåte for fremstilling, polypeptidene som er beskrevet her, fremstilt i en isolert og i hovedsak ren form. Fortrinnsvis er polypeptidene minst omtrent 80% rene, mer fordelaktig omtrent 90% rene og mest fordelaktig minst omtrent 99% rene.

Innen visse spesifikke utførelser kan et popypeptid være et fusjonsprotein som omfatter multiple polypeptider som beskrevet her, eller som omfatter minst et polypeptid som beskrevet her og en ikke-relatert sekvens, slik som et kjent C/7/amyc//'a-protein. En fusjonspartner kan for eksempel hjelpe i å frembringe T hjelperepitoper (en immunologisk funsjonspartner), fortrinnsvis T hjelperepitoper som gjenkjennes av mennesker, eller kan hjelpe i ekspresjon av proteinet (en ekspresjonsforsterker) med et høyere utbytte enn det native rekombinante protein. Visse foretrukne fusjonspartnere er både immunologiske og ekspresjonsforsterkende fusjonspartnere. Andre fusjonspartnere kan utvelges for å øke løseligheten av proteinet eller å tillate proteinet å bli målrettet mot ønskete intracellulære områder. Ytterligere andre fusjonspartnere inkluderer affinitetstilheng, som forenkler rensning av proteinet. En DNA sekvens som koder for et fusjonsprotein fra den foreliggende oppfinnelse, kan konstrueres ved å bruke kjente rekombinante DNA fremgangsmåter for å sette sammen separate DNA sekvenser som koder for eksempel for de første og andre polypeptidene inn i en passende ekspresjonsvektor. Den 3' ende av en DNA sekvens som koder for det første polypeptid, blir ligert, med eller uten en peptidkobler, til 5' ende av en DNA sekvens som koder for det andre polypeptid slik at leserammen av disse to sekvenser er i fase slik at det tillater mRNA translasjon av de to DNA sekvenser inn i et enkelt fusjonsprotein som bevarer den biologiske aktivitet av både det første og det andre polypeptid.

En peptid koblingssekvens kan benyttes for å separere det første og det andre polypeptid med en avstand som er tilstrekkelig for å sikre at hvert polypeptid folder seg inn i sine korrekte sekundære og tertiære strukturer. Slik en peptid koblingssekvens er inkorporert i fusjonsproteinet ved å bruke standard fremgangsmåter som er vel kjente i faget. Passende peptidkoblingssekvenser kan velges basert på de følgende faktorer: (1) deres evne til å adoptere en fleksibel og utstrakt konformasjon, (2) deres manglende evne til å inngå en sekundær struktur som kunne interagere med funksjonelle epitoper på det første eller det andre polypeptid, og (3) mangel på hydrofobe eller ladete rester som kan reagere med de funksjonelle epitoper på polypeptidene. Foretrukne peptidkoblingssekvenser inneholder Gly, Asn og Ser rester. Andre nesten nøytrale aminosyrer, slik som Thr og Ala kan også benyttes i koblingssekvensen. Aminosyresekvenser som hensiktsmessig benyttes som koblere, inkluderer de som er beskrevet i Marat et al., Gene 40:39-46, 1985, Murphy et al., Proe, Nati. Acad. Sei. USA 83:8258-8562, 1986, US patent nr. 4,935,233 og US patent nr. 4,751,180. Koblingssekvensen kan være fra omtrent 1 til omtrent 50 aminosyrelengder. Som alternativ til bruk av en peptidkoblingssekvens (når det er ønsket) kan man benytte ikke-essensielle N-terminale aminosyreregioner (når de er til stede) på de første og andre polypeptidene for å separere de funksjonelle domener og å hindre rommelige hinder.

De ligerte DNA sekvenser blir operativt koblet til passende transkripsjonene eller translasjonene regulatoriske elementer. De regulatoriske elementene som er ansvarlig for ekspresjon av DNA, er lokalisert bare på den 5' side av DNA sekvensen som koder for det første polypeptid. På samme måte er stoppkodoner som kreves for å avslutte translasjon og transkripssjonstermineringssignaler, bare til stede 3' forden DNA sekvens som koder for det andre polypeptid.

Fusjonsproteiner kan også fremskaffes som omfatter et polypeptid fra den foreliggende oppfinnelsen sammen med et ikke-relatert immunogent protein. Fortrinnsvis har det immunogene protein evne til å fremkalle en gjenkjennelsesrespons. Eksempler på slike proteiner inkluderer tetanus, tuberkulose og hepatitt proteiner (se for eksempel Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).

Innenfor foretrukne utførelser blir en immunologisk fusjonspartner avledet fra protein D, et overflateprotein fra den gram-negative bakterie Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Fortrinnsvis omfatter et protein D derivat omtrent den første tredjedel av proteinet (for eksempel de første N-terminale 100-110 aminosyrer), og et protein D derivat kan bli likvidert. I visse foretrukne utførelser blir de første 109 rester av et lipoprotein D fusjonspartner inkludert på N-terminalen for å gi polypeptidet ytterligere eksogene T-celleepitoper og for å øke ekspresjonsnivåer i E. coli (og således funksjonere som en ekspresjonsforsterker). Lipidhalen sikrer optimal presentasjon av antigen for de antigenpresenterende celler. Andre fusjonspartnere inkluderer det ikke-strukturelle protein fra influensavirus, NS1 (hemaglutinin). Vanligvis blir de N-terminale 81 aminsoyrer benyttet, selv om ulike fragmenter som inkluderer T-hjelperepitoper kan benyttes.

I et annen utførelse er den immunologiske fusjonspartner proteinet som er kjent som LYTA, eller en del av dette (fortrinnsvis en C-terminal del). LYTA er avledet fra streptococcus pneumoniae, som syntetiserer en N-acetyl-L-alaninamidase som er kjent som amidase LYTA (som kodes for av LytA genet, Gene 43:265-292, 1986). LYTA er et autolysin som spesifikt nedbryter visse bindinger i peptidoglykanstrukturen. Den C-terminale del av LYTA proteinet er ansvarlig for affiniteten til cholin eller til noen cholinanaloger slike som DEAE. Denne egenskap er blitt benyttet for utvikling av E. coli C-LYTA uttrykkende plasmider som er hensiktsmessige for å utvikle fusjonsproteiner. Rensning av hybridproteinet som inneholder C-LYTA fragmentet ved aminoterminalen, er blitt beskrevet (se Biotechnology 70:795-798, 1992). Innenfor en foretrukken utførelse kan en gjentatt del av LYTA inkorporeres inn i et fusjonsprotein. En gjentatt del er funnet i den C-terminale regionen og begynner på rest 178. En spesielt foretrukket gjentatt del inkorporerer restene 188-305.1 tillegg kan fusjonsproteinet Ra12 bli koblet til oppfinnelsens polynukleotider for å hjelpe til med proteinekspresjon.

I et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelse beskrives fremgangsmåter for å benytte ett eller flere av de ovenfor beskrevne polypeptider eller fusjonsproteiner (eller polynukleotider som koder for slike polypeptider eller fusjonsproteiner) for å indusere beskyttende immunitet mot C/?/amyc//'a-infeksjoner hos en pasient. Som benyttet her, beskriver "pasient" ethvert varmblodig dyr, fortrinnsvis et menneske. En pasient kan være utsatt for en sykdom, eller kan være fri for påvisbar sykdom og/eller infeksjon. Med andre ord kan beskyttende immunitet bli indusert både for å forhindre og behandle C/7/amyc//'a-infeksjon.

Innen dette aspekt av oppfinnelsen vil polypeptidet, fusjonsproteinet eller polynukleotidmolekylet vanligvis være til stede i en farmasøytisk blanding eller en vaksine. Farmasøytiske blandinger kan omfatte et eller flere polypeptider, der hvert kan inneholde en eller flere av de ovenfor beskrevne sekvenser (eller varianter av disse), og en fysiologisk akseptabel bærer. Vaksiner kan omfatte ett eller flere av de ovenfor nevnte polypeptider og en immunstimulant, slik som et adjuvans eller et liposom (der polypeptidet er blitt inkorporert i liposomet). Slike farmasøytiske blandinger og vaksiner kan også inneholde Ctøamyd/a-antigener, enten inkorporert i et kombinasjonspolypeptid eller til stede i ett separat polypeptid.

Alternativt kan en vaksine inneholde polynukleotider som koder for et eller flere polypeptider eller fusjonsproteiner som beskrevet over, slik at polypeptidet blir fremstilt in situ. I slike vaksiner kan polynukleotidene være til stede i en rekke av leveringssystemer som er kjente av de med vanlig kunnskap i faget, deriblant nukleinsyre-ekspresjonssystemer, bakterielle og virale ekspresjonssystemer. Passende nukleoid-ekspresjonssystemer inneholder de nødvendige polynukleotidsekvenser for ekspresjon i pasienten (slik som en passende promoter og et termineringssignal). Bakterielle leveringssystemer inkluderer tilførsel av et bakterium (slik som Bacillus- Calmette-Guerrin) som uttrykker en immunogen del av polypeptidet på dets celleoverflate. I en foretrukken utførelse kan polynukleotidene bli introdusert ved å bruke et virus-ekspresjonssystem (for eksempel vaksinia eller andre koppevirus, retrovirus eller adenovirus), som kan benytte seg av et ikke-patogent (defektivt) virus. Fremgangsmåter for å inkorporere polynukleotider inn i slike ekspresjonssystemer er vel kjent til de med vanlig kunnskap i faget. Polynukleotidene kan også tilføres som "nakne" plasmidvektorer, som beskrevet av f.eks. Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993, og beskrevet av Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Fremgangsmåter for å inkorporere DNA inn i slike vektorer er vel kjent for de med vanlig øvelse i faget. En retrovirusvektor kan i tillegg overføre eller inkorporere et gen som koder for en selekterbar markør (for å hjelpe i å identifisere eller selektere de transduserte celler) og/eller en lokaliseringsdel, slik som et gen som koder for en ligand for en reseptor på en spesifikk målcelle, for å gjøre vektoren målspesifikk. Målretting kan også bli oppnådd ved å bruke et antistoff, med fremgangsmåter som er kjent for de som har normal kunnskap i faget.

Andre formuleringer for terapeutiske formål inkluderer kolloidale fordelings-systemer, slik som makromolekylkomplekser, nanokapsler, mikrosfærer, kuler og lipid-baserte systemer som inkluderer olje-i-vann emulsjoner miceller, blandete miceller og liposomer. Et foretrukket kolloidalt system til bruk som leveringsmedium in vitro og in vivo er et liposom (dvs. en kunstig membranblære). Opptak av nakne polynukleotider kan bli øket ved å inkorporere polynukleotidene inn i og/eller på biodegradbare kuler, som effektivt blir transportert inn i cellene. Fremstilling og bruk av slike systemer er vel kjent i faget.

I et relatert aspekt kan en polynukleotid vaksine som beskrevet ovenfor, bli tilført samtidig med eller etter enten polypeptid fra den foreliggende oppfinnelse eller et kjent Ctøamyd/a-antigen. For eksempel kan tilførsel av polynukleotidet som koder for et polypeptid fra den foreliggende oppfinnelsen, enten "nakent" eller i et leveringssystem som beskrevet ovenfor, bli etterfulgt av et antigen for å forsterke den beskyttende immuneffekt av vaksinen.

Polypeptider og polynukleotider som beskrevet her, kan også benyttes i adoptiv immunterapi for å behandle Ctøamyc//a-infeksjon. Adoptiv immunterapi kan bli bredt klassifisert i enten aktiv eller passiv immunterapi. I aktiv immunterapi avhenger behandling av in vivo stimulering av det endogene vertsimmunsystem med tilførsel av immun responsmodifiserende midler (for eksempel vaksiner, bakterielle adjuvants og/eller cytokiner).

I passiv immunterapi dreier behandlingen seg om levering av biologiske reagenser som har etablert immunreaktivitet (slik som effektorceller eller antistoff) som direkte eller indirekte kan mediere anti-C/7/amyc//'avirkninger og ikke har behov for å avhenge av et intakt vertsimmunsystem. Eksempler på effektorceller inkluderer T lymfocyter (for eksempel CD8+ cytotoksiske T-lymfocyt, CD4+ T-hjelper), drepeceller (silke som naturlige drepeceller, lymfokinaktiverte drepeceller), B celler, eller antigen-presenterende celler (slik som dendritiske celler og makrofager) som uttrykker de beskrevne antigener. Polypeptidene som er beskrevet her, kan også benyttes for å produsere antistoff eller anti-idiotypiske antistoff (som i US patent nr. 4,918,164) med henblikk på passiv immunterapi.

Den viktigste fremgangsmåte for å produsere adekvate antall T-celler for adoptiv immunterapi er å dyrke immun T-celler in vitro. Dyrkningsbetingelser som tillater ekspansjon av enkelte antigen-spesifikke T-celler til flere milliarder med retensjon av antigen gjenkjennelse in vivo, er vel kjent i faget. Disse in vivo dyrkningsbetingelser benytter vanligvis intermitterende stimulering med antigen, ofte i nærvær av cytokiner slik som IL-2, og ikke-delende føderceller. Som notert ovenfor, kan de immunreaktive polypeptider som er beskrevet her, benyttes for raskt å ekspandere antigen-spesifikke T- cellekulturer for å produsere tilstrekkelige mengder av celler til immunterapi. Spesielt kan antigen-presenterende celler, slik som dendritiske, makrofag, monocyt, fibroblat eller B-celler, bli tilsatt pulser med immunreaktive polypeptider, eller polynukleotidsekvenser) kan introduseres i antigenpresenterende celler ved å bruke en rekke ulike standard fremgangsmåter som er vel kjent i faget. For eksempel kan antigen-presenterende celler bli transfektert eller transdusert med en polynukleotidsekvens, der nevnte sekvens inneholder en promoterregion som er passende for å øke ekspresjon, og kan uttrykkes som del av et rekombinant virus eller et annet ekspresjonssystem. Flere virusvektorer kan benyttes for å transdusere en antigenpresenterende celle, deriblant koppevirus, vaksinevirus og adenovirus, antigen-presenterende celler kan også presenteres med polynukleotidsekvenser beskrevet her ved hjelp av en rekke metoder, deriblant gengeværteknologi, lipidmediert levering, elektroporering, osmotisk sjokk og partikulære leveringsmekanismer, noe som resulterer i en effektiv og akseptabel ekspresjon på nivåer som kan bestemmes av en med vanlig øvelse i faget. For at dyrkete T-celler skal være effektive terapeutiske, må de dyrkete T-celler ha evne til å vokse og fordele seg utover og å overleve over lang tid in vivo. Studier har vist at dyrkete T-celler kan induseres til å vokse in vivo og å overleve i lang tid i betydelige mengder ved hjelp av gjentatte stimuleringer med antigen forsterket med IL-2 (se for eksempel Cheever, M., et al., "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited," Immunological Reviews, 157:177, 1997).

Polypeptidene som er beskrevet her, kan også benyttes for å produsere og/eller isolere Chlamydia- xeaYXwe T-celler, som deretter kan bli tilført pasienten. I en fremgangsmåte kan antigen-spesifikke T-cellelinjer bli produsert ved in vivo immunisering med korte peptider som korresponderer med immunogene deler av de beskrevne polypeptider. De resulterende antigen-spesifikke CD8+ eller CD4+ T-cellekloner kan isoleres fra pasienten, bli ekspandert under standard celledyrkings-betingelser, og bli returnert til pasientene.

Alternativt kan peptider som tilsvarer immunogene deler av polypeptidene, bli benyttet for å frembringe Chlamydia reaktive T-cellesubgrupper ved selektiv in vitro stimulering og ekspansjon av autologe T-celler for å frembringe antigen-spesifikke T-celler som deretter kan overføres til pasienten som beskrevet, for eksempel av Chang et al, ( Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22(3), 213, 1996). Celler fra immunsystemet, slik som T-celler, kan isoleres fra pasientens perifere blod ved å bruke en kommersielt tilgjengelig celleseparator, slik som Isolex™ system, tilgjengelig fra Nexell Therapeutics, Inc. Irvine, CA. De separerte celler blir stimulert med et eller flere av de immunreaktive polypeptider i et leveringsmedium, slik som en mikrosfære, for å frembringe antigen-spesifikke T-celler. Populasjonen av antigen-spesifikke T-celler blir deretter ekspandert ved å bruke standard fremgangsmåter, og cellene blir ført tilbake til pasienten.

I andre utførelser kan T-celle og/eller antistoffreseptorer som er spesifikke for polypeptidene som er beskrevet her, bli klonet, ekspandert og overført i andre vektorer eller effektorceller til bruk i adoptiv immunterapi. Spesielt kan T-celler blir transfektert med de passende gener for å uttrykke de variable domener fra C/?/amyc//'a-spesifikke monoklonale antistoff som de ekstracellulære gjenkjennelseselementer og kobles til T-cellereseptorsignalkjedene, noe som resulterer i T-celleaktivering, spesifikk lys og frigjøring av cytokin. Dette tillater T-cellen å dirigere dets spesifisitet på en MHC-uavhengig måte. Se for eksempel Eshhar, Z., Cancer Immunol Immunother, 45(3-4): 131-6, 1997, og Hwu, P., et al, Cancer Res. 55(15):3369-73, 1995. En annen utførelse kan inkludere transfeksjon av Cft/amyc//'a-antigen-spesifikke alfa og beta T-cellereseptorkjeder inn i alternerende T-celler, som beskrevet i Cole, DJ, et al, Cancer Res, 55(4):748-52, 1995.

I en videre utførelse kan syngene eller autologe dendritiske celler bli tilsatt pulser med peptider som tilsvarer minst en immunogen del av et polypeptid som er beskrevet her. De resulterende antigen-spesifikke dendritiske celler kan enten bli overført til en pasient, eller benyttet for å stimulere T-celler for å frembringe antigen-spesifikke T-celler som igjen kan bli tilført en pasient. Bruk av peptid-pulsete dendritiske celler for å produsere antigen-spesifikke T-celler og den etterfølgende bruk av slike antigen-spesifikk T-celler for å utvide sykdom i en musemodell er blitt demonstrert av Cheever et al, Immunological Reviews, 757:177, 1997). I tillegg kan vektorer som uttrykker de beskrevne polynukleotider bli introdusert i stamceller hentet fra pasienten og bli klonalt videre ført in vitro for å bli transplantert autologt tilbake i den samme pasient.

Innen visse apsekter kan polypeptider, polynukleotider, T-celler og/eller bindingsmidler som er beskrevet her, bli inkorporert i farmasøytiske forbindelser eller immunogene forbindelser (dvs. vaksiner). Farmasøytiske forbindelser omfatter en eller flere slike forbindelser og en fysiologisk akseptabel bærer. Vaksiner kan omfatte en eller flere slike forbindelser og en immunstimulant. En immunstimulant kan være enhver substans som forsterker eller potensierer en immunrespons mot et ekogent antigen. Eksempler på immunstimulanter inkluderer adjuvanser, biodegradbare mikrokuler (f.eks. polylaktikgalaktid) og liposomer (som forbindelsen er introdusert inn i, se f.eks. Fullerton, US patent nr. 4,235,877). Vaksinefremstilling blir generelt beskrevet for eksempel i M.F. Powell og M.J. Newman, ed., "Vaccine Design (the subunit an adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Farmasøytiske forbindelser og vaksiner innenfor den foreliggende oppfinnelses område kan også inneholde andre forbindelser, som kan være biologisk aktive eller inaktive. For eksempel kan en eller flere immunogene deler av andre CWamycZ/a-antigener være til stede, enten inkorporert i et fusjonspolypeptid eller som en separat forbindelse, som en del av forbindelsen eller vaksinen.

En farmasøytisk forbindelse eller vaksine kan inneholde DNA som koder for et eller flere av polypeptidene som er beskrevet over, slik at polypeptidet blir produsert in situ. Som beskrevet over, kan DNA være til stede i ethvert av en rekke leveringssystemer som er kjent hos de med vanlig kunnskap i faget, deriblant nukleinsyre-ekspresjonssystemer, bakterier og virusekspresjonssystemer. En rekke genleverings-teknikker er vel kjent i faget, slik som de beskrevet av Rolland, Crit, Rev. Therao. Drug Carrier Systems 75:143-198, 1998, og referanser i dette. Passende nukleinsyre-ekspresjonssystmer inneholder de nødvendige DNA sekvenser for ekspresjon i pasienten (slik som den passende promoter og avslutningssignal). Bakterielle leveringssystemer inkluderer tilførsel av en bakteri (slik som Bacillus- Calmette- Guerrin) som uttrykker en immunogen del av polypeptidet på dets celleoverflate eller skiller ut en slik epitop. I en foretrukket utførelse kan DNA introduseres ved hjelp av et virus-ekspresjonssystem (f.eks. vaksinia eller andre koppevirus, retrovirus eller adenovirus), som kan inkludere bruk av en ikke-patogen (defektiv), replikasjonskompentent virustype. Passende systemer er beskrevet for eksempel i Fisher-Hoch et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 86:317-321, 1989, Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. 569:86-103, 1989, Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990, US patent nr. 4,603,112, 4,769,330 og 5,017,487, WO 89/01973, US patent nr. 4,777,127, GB 2,200,651, EP 9,345,242, WO 91/02805, Berkner, Biotechiques 6:616-627, 1988, Rosenfield et al., Science 252AZ\- 434, 1991, Kolls et al., Proe, Nati. Acad. Sei. USA 97:215-219, 1994, Kass-Eisler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:11498-11592, 1993, Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993, og Guzman et all, Cir. Res. 73:1202-1207, 1993. Fremgangsmåter for å inkorporere DNA i slike ekspresjonssystemer er vel kjent for de med vanlig kunnskap i faget. DNA kan også være "nakent", som beskrevet for eksempel i Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993, og vurdert og av Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Opptak av nakent DNA kan økes ved å legge DNA på overflaten av biodegraderbare kuler, som blir effektivt transportert inn i cellene.

Mens enhver passende bærer som er kjent for de som har vanlig kunnskap i faget kan benyttes i oppfinnelsens farmasøytiske forbindelser, kan bærertypen variere avhengig av tilførselsmåten. Den foreliggende oppfinnelses forbindelser kan bli formulert for enhver passende tilførselsmåte, for eksempel lokal, oral, nasal, intravenøs, intrakranial, intraperitoneal, subkutan eller intramuskulær tilførsel. Til parenteral tilførsel, slik som subkutan injeksjon, vil bærerer fortrinnsvis omfatte vann, saltvann, alkohol, et fett, en voks eller en buffer. For oral tilførsel kan enhver av de ovenfor nevnte bærere eller en fast bærer, slik som mannitol, laktose, stivelse, mangnesiumstearat, natriumsakkarin, talk, cellulose, glukose, sukrose og magnesiumkarbonat, bli benyttet. Biodegraderbare mikrosfærer (f.eks. polylaktat, polyglykolat) kan også bli benyttet som bærere for denne oppfinnelses farmasøytiske forbindelser. Passende biodegraderbare mikrosfærer blir for eksempel beskrevet i US patent nr. 4,897,268 og 5,075,109.

Slike forbindelser kan også omfatte buffere (f.eks. nøytralt bufret saltvann eller fosfatbufret saltvann), karbohydrater (f.eks. glukose, mannose, sukrose eller dekstraner), mannitol, proteiner, polypetider eller aminosyrer slik som glycin, antioksidanter, chelaterende midler slik som EDTA eller glutation, adjuvanser (f.eks. aluminiumhydroksid) og/eller konserveringsmidler. Alternativt kan den foreliggende oppfinnelses forbindelser bli formulert som et frysetørket produkt. Forbindelser kan også bli innkapslet i liposomer ved å bruke vel kjent fremgangsmåte.

Enhver av en serie immunostimulanter kan bli benyttet i denne oppfinnelses vaksiner. For eksempel kan et adjuvans bli inkludert. De fleste adjuvans inneholder en substans som er beregnet på å beskytte antigenet fra rask nedbrytning, slik som aluminiuimhydroksid eller mineralolje, og en stimulator av immunresponser, slik som lipid A, eller proteiner avledet fra Bortadella pertussis eller Mycobacterium tuberculosis. Passende adjuvansia er kommersielt tilgjengelige som for eksempel Freunds inkomplette adjuvans og komplette adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Ml), Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), aluminiumsalter slik som aluminiumhydroksidgel (alum) eller aluminiumfosfat, kalsiumsalter, jernsalter eller zinksalter, en uløselig suspensjon av acylert tyrosin, acylerte sukkere, kationisk eller anionisk deriverte poylsakkarider, polyfosfazener, biodegraderbare mikrokuler, monofosforyllipid A og quil A. Cytokiner, slik som GM-CSF eller interleukin-2, -7 eller-12, kan også benyttes som adjuvans.

Innenfor de vaksiner som blir frembrakt her, kan under utvalgte omstendigheter adjuvanssammensetningen bli planlagt å indusere en immunrespons hovedsakelig av Th1-typen eller Th2-typen. Høyt nivå av Th1-type cytokiner (f.eks. IFN-y, TNF-a, IL-2 og IL-12) tenderer i retning av å indusere cellemedierte immunresponser mot et tilført antigen. I motsetning vil høye nivåer av Th2-type cytokiner (f.eks. IL-4-, IL-5, IL-6 og IL-10) fortrinnsvis føre til induksjon av humorale immunresponser. Etter applikasjon av en vaksine som frembrakt her, vil en pasient ha en immunrespons som inkluderer både Th1- og Th2-type responser. Innen en foretrukken utførelse, der en respons er i hovedsak Th 1-type, vil cytokiner av Th 1-type øke mer enn nivået av Th2-type cytokiner. Nivået av disse cytokiner kan lett bli målt ved å bruke standard fremgangsmåter. For en oversikt om cytokinfamilien, se Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immuno. 7:145-173, 1989.

Foretrukne adjuvans til bruk i å fremkalle en i hovedsak Th 1-type respons inkluderer for eksempel en kombinasjon av monofosforyllipid !, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyllipid A (3D-MPL), sammen med et aluminiumsalt. MPL adjuvans er tilgjengelig fra Ribi ImmunoChem Research Inc. (Hamiliton, MT) ( se US patent nr. 4,436, 727, 4,877,611, 4,866,034 og 4,912,094). CpG-inneholdende nukleotider (der CpG dinukleotidet ikke er metylert) induserer også en i hovedsak Th1 respons. Slike oligonukleotider er vel kjent og er beskrevet for eksempel i WO 96/02555. Et annet foretrukket adjuvans er et saponin, fortrinnsvis QS21, som kan benyttes alene eller i kombinasjon med andre adjuvanser. For eksempel vil et forsterket system inkludere kombinasjonen av et monofosforyllipid A og saponinderivat, slik som kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller en mindre reaktogen sammensetning der QS21 blir bundet opp med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739. Andre foretrukne formuleringer omfatter en olje-i-vann emulsjon og tokoferol. En spesielt potent adjuvans formulering inkluderer QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje-i-vann emulsjon og er beskrevet i WO 95/17210. Enhver vaksine som blir fremvist her, kan fremstilles ved å bruke velkjente fremgangsmåter som resulterer i en kombinasjon av antigen, immunresponsforsterker og en passende bærer eller bindemiddel.

Forbindelsene som beskrives her, kan tilføres som del av en langsom frigjørings-formulering (dvs. en formulering slik som en kapsel, en svamp eller en gele (for eksempel sammensatt av polysakkarider) som fører til en langsom frisetting av forbindelse etter tilførsel). Slike formuleringer kan vanligvis bli fremstilt ved å bruke velkjente fremgangsmåter og tilført for eksempel ved oral, rektal eller subkutan implantering, eller ved implantering nær det ønskete målsetet. Vedvarende frisettingsformuleringer kan inneholde et polypeptid, polynukleotid eller antistoff fordelt i en bærermatriks og/eller inneholdt inne i et reservoar som er omgitt av en membran som er hastighetsbegrensende. Bærere til bruk i slike formuleringer er biokompatible, og kan også være biodegraderbare, fortrinnsvis frembringer denne formuleringen et relativt konstant nivå av frisetting av aktive komponenter. Mengde aktiv forbindelse som er i en slik langsom frisettingsformulering, avhenger av implantasjonssete, hastighet og den forventete varighet av frisetting og type tilstand som skal bli behandlet eller forebygget.

Ethvert av en rekke leveringsmedier kan bli benyttet i farmasøytiske forbindelser og vaksiner for å forenkle produksjon av en antigen-spesifikk immunrespons som retter seg mot CWamycZ/a-infiserte celler. Leveringsmedier inkluderer antigenpresenterende celler (APC), slik som dendritiske celler, makrofager, B-celler, monocyter og andre celler som kan bli modifisert slik at de er effektive APC. Slike celler kan, men behøver ikke, være modifisert genetisk for å øke evnen til å presentere antigenet, for å forbedre aktivering og/eller vedlikehold av T-celleresponsen, for å ha anti-Ctøamyc//a-effeter i seg selv og/eller å være immunologisk kompatibel med mottakeren (dvs. tilpasset HLA haplotype). APC kan generelt bli isolert fra enhver av en rekke biologiske væsker og organer, og kan være autologe, allogene, syngene eller zenogene celler.

Visse foretrukne utførelser av den foreliggende oppfinnelsen benytter dendritiske celler eller forløpere av disse som antigen-presenterende celler. Dendritiske celler her meget potente APC (Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998) og har blitt vist å være effektive som en fysiologisk adjuvans for å utløse pofylaktisk eller terapeutisk immunitet (se Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). Generelt kan dendritiske celler bli identifisert basert på deres typiske form { in situ, stjerneformet, med markert cytoplasmiske utløpere (dendriter) som er synlige in vitro), deres evne til å ta opp, prosessere og presentere antigen med høy effektivitet, og deres evne til å aktivere naiv T-celle respons. Dendritiske celler kan selvfølgelig bli modifisert for å uttrykke spesifikke celleoverflatereseptorer eller ligander som vanligvis ikke er å finne på dendritiske celler in vivo eller ex vivo, og slike modifiserte dendritiske celler blir vurdert i den foreliggende oppfinnelse. Som et alternativ til dendritiske celler kan frigjorte vesikler antigen-merkete dendritiske celelr (kalt eksosomer) bli benyttet i en vaksine (se Zitvogel et al., Nature Med. 4:495-600, 1998).

Dendritiske celler og forløpere kan fremskaffes fra perifert blod, fra benmarg, lymfeknuter, milt, hud, navlestreng blod eller ethvert annet passende vev eller kroppsvæske. For eksempel kan dendritiske celler bli differensiert ex vivo ved å tilsette en kombinasjon av cytokiner slik som GM-CSF, IL-4, IL-13 og/eller TNFa til kulturer av monocyter som er høstet fra perifert blod. Alternativt kan CD34 positive celler som er høstet fra perifert blod, navlestrengblod eller benmarg, bli differensiert til dendritiske celler ved å tilfelle kombinasjoner av GM-CSF, IL-3, TNFa, CD40 ligand, LPS, flt3 ligand og/eller andre forbindelser som induserer differensiering, modning og proliferasjon av dendritiske celler til dyrkningsmediet.

Dendritiske celler er enkelt kategorisert som "umodne" og "modne" celler, som tillater en enkel måte å diskrimere mellom to velkarakteriserte fenotyper. Imidlertid bør denne nomeklatur ikke konstrueres for å ekskludere alle mulige intermediære differensieringsstadier. Umodne dendritiske celler karakteriseres som ABC med en høy evne til antigen opptak og prosessering, som korrulerer med høy ekspresjon av Fcy reseptor og mannosereseptor. Den modne fenotype blir typiskkarakterisertav en lavere ekspresjon av disse markører, men en høy ekspresjon av celleoverflatemolekylet som er ansvarlig for T-celleaktivering slik som klasse I og klasse II MHC, adhesjons-molekyler (f.eks. CD54 og CD11) og kostimulatoriske molekyler (f.eks. CD40, CD80, CD86 og 4-1BB).

APC kan generelt bli transfektert med et polynukleotid som koder for et C/?/amyc//'a-protein (eller en del eller annen variant av dette) slik at det Chlamydiale polypeptid, eller en immunogen del av dette, blir uttrykket på celleoverflaten. Slilk transfeksjon kan foregå ex vivo, og en forbindelse eller vaksine som omfatter slike transfekterte celler, kan deretter bli benyttet for terapeutiske formål, som beskrevet her. Alternativt kan et genleveringssystem som er rettet mot dendritisk eller annen type antigenpresenterende celle, bli tilført til en pasient, noe som fører til transfeksjon som foregår in vivo. In vivo og ex vivo transfeksjon av dendritiske celler kan for eksempel generelt bli utført ved å bruke enhver fremgangsmåte som er kjent i faget, slik som de som er beskrevet i WO 97/24447, eller gengeværtilnærmingene beskrevet av Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997. Antigenoppfylling av dendritiske celler kan oppnås ved å inkubere dendritiske celler eller forløperceller med det Chlamydiale polypeptid, DNA (nakent eller i en plasmidvektor) eller RNA, eller med antigen-uttrykkende rekombinante bakterier eller virus (v.eks. vaksinia, fuglekopper, adenovirus eller lentivirusvektorer). Før oppfylling kan polypeptidet blir kovalent konjugert til en immunoloigsk partner som gir T-cellehjelp (f.eks. et bærermolekyl). Alternativt kan en dendritcelle bli pulset med en ikke-konjugert immunologisk partner, separat eller i nærvær av polypeptidet.

Tilførselsveier og hyppighet for de farmasøytiske forbindelser og vaksiner, samt også doser, vil variere fra individ til individ. Generelt kan de farmasøytiske forbindelser og vaksiner tilføres ved injeksjon (f.eks. intrakutant, intramuskuklært, intravenøst eller subkutant), intranasalt (f.eks. ved innånding) eller oralt. Mellom 1 og 3 doser kan tilføres i løpet av en 1-36 ukers periode. Fortrinnsvis blir 3 doser tilført, i intervaller på 3-4 måneder, og forsterkingsvaksineringer kan bli gitt i perioder etter dette. Alternative protokoller kan være passende for spesielle pasienter. En passende dose er en mengde polypeptid eller DNA som når det blir tilført som beskrevet over, har evne til å fremkalle en immunrespons hos en immunisert pasient som er tilstrekkelig til å beskytte pasienten mot C/7/amyc//'a-infeksjon for minst 1-2 år. Generelt varierer mengden av polypeptid som er til stede i en dose (eller produsert in situ av DNA tilstede i dosen), fra omtrent 1 ng til omtrent 100 mg pr. kg vert, typisk fra omtrent 10 ng til omtrent 1 mg, og fortrinnsvis fra omtrent 100 ng til omtrent 1^g. Egnet dosestørrelse vil variere med pasientens størrelse, men vil vanligvis variere fra omtrent 0,1 ml til omtrent 5 ml.

Mens enhver passende bærer som er kjent for de med vanlig kunnskap i faget kan bli benyttet i denne oppfinnelses farmasøytiske forbindelser, vil typen bærer variere avhengig av tilførselsmåten. For parenteral tilførsel, slik som subkutan injeksjon, vil bæreren fortrinnsvis inneholde vann, saltvann, alkohol, en fett-type, en voks eller en buffer. Til oral tilførsel kan enhver av ovenfor nevnte bærere eller en fast bærer, slik som mannitol, laktose, stivelse magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, cellulose, glukose, sukrose og magnesiumkarbonat bli benyttet. Biodegraderbare mikrokuler (f.eks. polylaktisk galaktid) kan også benyttes som bærere for denne oppfinnelses farmasøytiske forbindelser. Passende biodegraderbare mikrokuler er for eksempel beskrevet i US patent nr. 4,897,268 og 5,075,109.

Generelt vil en passende dose og et passende behandlingsopplegg gi de aktive forbindelser i en mengde som er tilstrekkelig til å frembringe terapeutiske og/eller profilaktiske fordeler. En slik respons kan følges ved å påvise et forbedret klinisk resultat hos behandlete pasienter sammenlignet med ikke behandlete pasienter. Økning i tidligere eksisterende immunresponser mot et Ctøamyd/a-protein korrererer generelt med en forbedret klinisk situasjon. Slike immunresponser kan vanligvis evalueres ved å bruke standard proliferering, cytotoksisitet eller cytokinanalyser, som kan utføres ved å bruke prøver hentet fra en pasient før og etter behandling.

I et annet aspekt frembringer den foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for å bruke polypeptidene beskrevet overfor å diagnostisere Ctøamyc//a-infeksjon. I dette aspekt blir fremgangsmåter frembrakt for å påvise CWamyd/a-infeksjon i en biologisk prøve, ved å bruke ett eller flere av de ovenfor nevnte polypeptider, enten alene eller i kombinasjon. For klarhets skyld vil ordet "polypeptid" bli benyttet når spesifikke utførelser av de oppfunnete diagnostiske fremgangsmåter blir beskrevet. Det vil imidlertid være klart for en med øvelse i faget at den foreliggende oppfinnelses fusjonsproteiner også kan benyttes i slike fremgangsmåter.

Som benyttet her, er en "biologisk prøve" ethvert antistoffinneholdende prøvemateriale fremskaffet fra en pasient. Fortrinnsvis er prøven helblod, oppspytt, serum, plasma, spyttsekret, serebrospinalvæske eller urin. Mer fordelaktig er prøven en blod-, serum- eller plasmaprøve som er fremskaffet fra en pasient. Polypeptidene blir benyttet i en analyse, som beskrevet under, for å bestemme nærvær eller fravær av antistoff rettet mot polypeptidene i prøven, relativt til en på forhånd bestemt kontrollverdi. Nærvær av slike antistoff indikerer tidligere sensitisering til Chlamydia-antigener som kan indikere CWamycZ/a-infeksjon.

I utførelser der mer enn ett polypeptid blir benyttet, bli polypeptidene fortrinnsvis benyttet komplementært, (dvs. ett komponentpolypeptid vil tendere til å påvise infeksjon i prøver der infeksjon ikke ville bli påvist med et annet komponentpolypeptid). Komplementære polypeptider kan generelt identifiseres ved å bruke hvert polypeptid individuelt ved å evaluere serumprøver fremskaffet fra en pasientrekke som er kjent å være infisert med Chlamydia. Etter bestemmelse av hvilke prøver som er positive (som beskrevet nedenfor) med hvert polypeptid, kan kombinasjoner av to eller flere polypeptider bli formulert som har evne til å påvise infeksjon i de fleste eller alle av prøvene som blir testet.

En rekke analyseformater er kjent til de som har vanlig kjennskap i faget, for å benytte ett eller flere polypeptid for å påvise antistoff i en prøve. Se f.eks. Harlow and Lane, Antibodes: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, som herved inkorporeres som referanse. I en foretrukket utførelse vil analysen benytte polypeptid immobilisert på et fast medium for å binde til og fjerne antistoffet fra prøven. Det bundete antistoff kan deretter bli påvist ved å bruke et påvisningsreagens som inneholder en reportergruppe. Passende påvisningsreagenser inkluderer antistoff som binder antistoff til antistoff-/polypeptidkomplekset og fritt polypeptid merket med en reportergruppe (f.eks. i et semi-kompetitivt analysesystem). Alternativt kan et kompetitivt analysesystem bli benyttet, der et antistoff som binder til polypeptidet blir merket med en reportergruppe og tillatt å binde til det immobiliserte antigen etter inkubering av antigen med prøven. Graden som prøvekomponenter kan hemme binding av det merkete antistoff til polypeptidet, indikerer at prøven har reagert med det immobiliserte polypeptid.

Den faste støttefase kan være ethvert fast materiale som er kjent av de som har vanlig kunnskap i faget, som kan binde antigener. For eksempel kan den faste fase være en brønn i en mikrotiterplate, eller en mikrocellulose eller andre passende membraner. Alternativt kan støttefasen være en kule eller en plate, slik som glass, fiberlgass, lateks eller plastikkmateriale slik som polystyren eller polyvinylklorid. Støttefasen kan også være en magnetisk partikkel eller en fiberoptisk sensor, slik som for eksempel beskrevet i US patent nr. 5,359,681.

Polypeptidene kan være bundet til den faste støttefase ved å bruke en rekke fremgangsmåter som er kjent for de som har vanlig kunnskap i faget. I sammenheng med den foreliggende oppfinnelse dreier ordet "bundet" både til ikke kovalent assosiasjon, slik som adsorpsjon, og kovalent binding (som kan være en direkte kobling mellom antigenet og funksjonelle grupper på støttefasen eller kan være en kobling ved hjelp av et krysskoblende middel). Binding ved adsorpsjon til en brønn i en mikrotiterplate eller til en membran blir foretrukket. I slike tilfeller kan adsorpsjon oppnås ved å blande polypeptidet, i en passende buffer, med den faste støttefase i et passende tidsrom. Kontakttiden varierer med temperatur, men er vanligvis mellom omtrent 1 time og 1 dag. Generelt er brønntilsetting til en mikrotiterplate av plastikk (slik som polystyren eller polyvinylklorid) med en mengde polypeptid som varierer fra omtrent 10 ng til omtrent 1^g, og fortrinnsvis omtrent 100 ng, tilstrekkelig til å binde en adekvat mengde med antigen.

Kovalent binding av polypeptid til en fast støttefase kan generelt oppnås ved å først tilsette støttefasen et bifunksjonelt reagens som vil reagere med både støtten og en funksjonell gruppe slik som en hydroksyl eller aminogruppe, på polypeptidet. For eksempel kan polypeptidet være bundet til støttefaser som har en passende polymer dekking ved å bruke benzokinon eller ved å kondensere en aldehydgruppe på støttefasen med et amin og et aktivt hydrogen på polypeptidet (se f.eks. Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12-A13).

I visse utførelser er analysemetoden et enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA). Denne analyse kan utføres ved først å la et polypeptidantigen, som har blitt immobilisert på en fast støttefase, vanligvis brønnen i en mikrotiterplate, komme i kontakt med prøven, slik at antistoff mot polypeptidet i prøven blir tillatt å binde til det immobiliserte polypeptid. Ikke bundet prøve blir deretter fjernet fra det immobiliserte polypeptid, og et deteksjonsreagens som har evne til å binde til det immobiliserte antistoff-polypeptidkompleks, blir tilsatt. Mengde av deteksjonsreagens som blir bundet til den faste fase, blir deretter bestemt ved å bruke en fremgangsmåte som er passende for det spesifikke deteksjonsreagens.

Mer spesifikt vil, så fort polypeptidet blir immobilisert på den faste fase som beskrevet over, de gjenværende proteinbindingssetene på den faste fase bli blokket. Ethvert passende blokkerende middel, kjent for de som har vanlig kunnskap i faget, slik som bovint serumalbumin (BSA) eller Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Loius, MO) kan benyttes. Det immobiliserte polypeptid blir deretter inkubert med prøven, og antistoff blir tillatt å binde til antigenet. Prøven kan fortynnes med et passende fortynningsmiddel, slik som fosfatbufret saltvann (PBS) før inkubering. Generelt er en passende inkuberingstid den periode som er tilstrekkelig fort å påvise nærvær av antistoff i en HGE-infisert prøve. Fortrinnsvis er kontakttiden tilstrekkelig til å oppnå en binding som minst 95% av den som oppnås ved et ekvilibrium mellom bundet og ikke bundet antistoff. De med vanlig øvelse i faget vil forstå at tiden som er nødvendig for å oppnå et ekvilibrium kan lett bli bestemt ved å analysere bindingsnivået som oppnås i løpet av en tidsperiode. Ved romtemperatur er vanligvis en inkuberingstid på 30 minutter tilstrekkelig.

Ikke bundet prøve kan deretter fjernes ved å vaske det faste støttemedium med en passende buffer, slik som PBS med 0,1% Twwen 20™. Deteksjonsreagens kan deretter bli tilsatt støttemediet. Et passende deteksjonsreagens er enhver forbindelse som binder til det immobiliserte antistoff-polypeptidkompleks, og som kan bli påvist ved en hvilken som helst av en rekke fremgangsmåter som er kjent til de i faget. Fortrinnsvis inneholder deteksjonsreagenset et bindingsmiddel (som for eksempel protein A, protein G, immunglobulin, lektin eller fritt antigen) som er konjugert til en reportergruppe. Foretrukne reportergrupper inkluderer enzymer (slike som pepperrot peroksidase), substrakter, kofaktorer, inhibitorer, farvestoff, radionuklider, lumiscenser, fluorescerende grupper og biotin. Konjugering av bindingsmiddel til reportergruppe kan oppnås ved å bruke standard fremgangsmåter som er kjent for de som har vanlig øvelse i faget. Vanlige bindingsmidler kan også bli kjøpt, konjugert til en rekke reportergrupper fra mange kommersielle kilder (f.eks. Zymed Laboratories, Sand Francisco, CA, og Pierce, Rockford, IL).

Detekskjonsreagenset blir deretter inkubert med det immobiliserte antistoff-polypeptidkompleks i en tidsperiode som er tilstrekkelig til å påvise det bundete antistoff. En passende tidsperiode kan generelt bli bestemt ved hjelp av produsentens instruksjoner eller ved å analysere bindingsnivå som oppnås i løpet av en tidsperiode. Ubundet deteksjonsreagens blir deretter fjernet, og bundet deteksjonsreagens blir påvist ved å bruke reportergruppen. Fremgangsmåten som benyttes for å påvise reportergruppen avhengig av hva slags reportergruppe som benyttes. For radioaktive grupper må scintillasjonstelling eller radiografiske fremgangsmåter vanligvis benyttes. Spektroskopiske fremgangsmåter kan benyttes for å påvise farver, luminescensgrupper og fluorescerende grupper. Biotin kan bli påvist ved å bruke avidin, koblet til en ulik reportergruppe (vanligvis en radioaktiv eller fluorescerende gruppe, eller et enzym). Enzymreportergrupper kan vanligvis påvises ved tilsetting av et substrat (vanligvis i en spesifikk tidsperiode) etterfulgt av spektroskopisk eller annen analyse av reaksjonens produkter.

For å bestemme fravær eller nærvær av anti-Ctøamyd/a-antistoff i prøven, blir signalet som påvises fra reportergruppen som forblir bundet til det faste støttemedium, vanligvis sammenlignet med et signal som tilsvarer et på forhånd bestemt minimumsnivå. I én foretrukket utførelse er dette minimumsnivået det gjennomsnittlige signal som oppnås når det mobiliserte antigen blir inkubert med prøver med ikke infisert pasient. Generelt blir en prøve som produserer et signal som er tre standard avvik over det på forhånd bestemte minimumsnivå, vurdert som positivt med henblikk på Ctøamyd/a-infeksjon. I en alternativ foretrukket utførelse blir minimumsnivået bestemt ved å bruke en Receiver Operator Curve, ifølge fremgangsmåten til Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicin, Little Brown and Co., 1985, s, 106-107. I denne utførelse blir i korthet minimumsnivået bestemt fra et plot av par med ekte positive hastigheter (dvs. sensivitet) og falske positive hastigheter (100% spesifisitet) som tilsvarer hvert mulig minimumsnivå for det diagnostiske testresultat. Minimumsnivået på plotet som er nærmest det øvre venstre hjørne (dvs. verdien som omfatter det største areal), er det mest nøyaktige minimumsnivå, og en prøve som produserer et signal som er høyere enn minimumsnivået bestemt ved denne fremgangsmåte, kan bli vurdert som positiv. Alternativ kan minimumsnivået bli skiftet til venstre langs plotet, for å minimalisere den falske positive hastighet, eller mot høyre for å minimalisere den falske negative hastighet. Generelt vil en prøve som produserer et signal som er høyere enn minimusnivået bestemt ved denne fremgangsmåte, bli vurdert som positiv med henblikk på CWamyd/a-infeksjon.

I en relatert utførelse blir analysen utført i et raskt gjennomstrømnings- eller stripetestformat, der antigenet blir immobilisert på en membran, slik som nitrocellulose.

I gjennomstrømningstesten vil antistoff i prøven binde seg til det immobiliserte polypeptid mens prøven passerer gjennom membranen. Et påvisningsreagens (f.eks. protein A-kolloidal gull) binder deretter til antistoff-polypeptidkomplekset mens løsningen som inneholder deteksjonsreagenset strømmer gjennom membranen. Påvisning av bundet deteksjonsreagens kan deretter gjøres som beskrevet over. I stripetestformatet blir en ende av membranen som har bundet polypeptidet, senket ned i en løsning som inneholder prøven. Prøven vandrer langs membranen gjennom en region som inneholder et deteksjonsreagens, og til området med det immobiliserte polypeptid. Konsenstrasjon av deteksjonsreagens ved polypeptidet indikerer nærvær av anti-CWamyc//'a-antistoff i prøven. Vanligvis vil konsentrasjonen av deteksjonsreagens på dette området fremkalle et mønster, slik som en linje, som kan avleses visuelt. Fravær av slikt mønster indikerer et negativt resultat. Generelt blir mengde polypeptid immobilisert på membranen utvalgt for å produsere et visuelt klart mønster når den biologiske prøve inneholder et antistoffnivå som ville være tilstrekkelig til å produsere et positivt signal i en ELISA, som beskrevet over. Fortrinnsvis vil mengde polypeptid som er immobilisert på membranen, variere fra 25 ng til omtrent 1^g, og mer fordelaktig fra omtrent 50 ng til omtrent 500 ng. Slike tester kan typisk utføres med en meget liten mengde (f.eks. en dråpe) av pasientens serum eller blod.

Selvfølgelig kan en rekke andre analyseprotokoller som eksisterer, bli benyttet til bruk sammen med polypeptidene fra den foreliggende oppfinnelse. De ovenfor beskrivelser er kun ønsket å representere eksempler. Et eksempel på en alternativ analysemetode som kan være hensiktsmessig å benytte i slike fremgangsmåter, er et Western blot, der proteinet som er til stede i en bilogisk prøve, blir separert på en gel, før det blir eksponert for et bindingsmiddel. Slike fremgangsmåter er vel kjent for de med øvelse i faget.

Den foreligglende oppfinnelse frembringer videre midler, slik som antistoff og antigenbindende fragmenter av disse, som spesifikt kan binde til et CtøamycZ/a-protein. Som benyttet her, vil et antistoff, eller et antigenbindende fragment av dette, bli sagt å "binde spesifikt" til et C/7/amyc//'a-protein dersom det reagerer i et påvisbart nivå (i for eksempel et ELISA) med et C/7/amyc//'a-protein, og ikke reagerer på påvisbar måte med ikke relaterte proteiner under lignende betingelser. Som brukt her, dreier "binding" seg om en ikke kovalent assosiasjon mellom to separate molekyler slik at et kompleks blir dannet. Evne til å binde kan evalueres for eksempel ved å bestemme en bindings-konstant for danning av komplekset. Bindingskonstanten er den verdi som oppnås når konsentrasjonen av komplekset blir delt på produktet av komponentkonsentrasjonene. Generelt vil to komponenter være sagt å "binde", i denne oppfinnelses sammenheng når bindingskonstanten for kompleksdannelse overstiger omtrent 10<3>L/mol. Bindingskonstanten kan bestemmes ved fremgangsmåter som er vel kjent i faget.

Bindingsmidler kan videre ha evne til å differensiere mellom pasienter med og uten en CtøamycZ/a-infeksjon ved å bruke de representative analysemetoder som er frembrakt her. Med andre ord kan antistoff eller andre bindingsmidler som binder til et C/?/amyc//'a-protein generere et signal som indikerer nærvær av en C/7/amyc//'a-infeksjon

i minst omtrent 20% av pasientene med sykdommen, og vil gi et negativt signal som indikerer fravær av sykdommen hos minst omtrent 90% av individer uten infeksjon. For å bestemme om et bindingsmiddel tilfredsstiller dette krav, kan biologiske prøver (f.eks. blod, sera, oppspytt, urin og/eller vevsbiopsier) fra pasienter med og uten Chlamydia-infeksjon (som bestemt ved å bruke standard kliniske tester) bli analysert som beskrevet her med henblikk på nærvær av polypeptider som binder til bindingsmidlet.

Det vil være klart at et statistisk signifikant antall prøver med og uten sykdommen må bli analysert. Hvert bindingsmiddel bør tilfredsstille de ovenfor nevnte kriterier, imidlertid vil de med vanlig øvelse i faget lett forstå at bindingsmidler kan benyttes i kombinasjon for å øke sensitivitet.

Ethvert middel som tilfredsstiller de ovenfor nevnte krav, kan være et bindingsmiddel. For eksempel kan et bindingsmiddel være et ribosom, med eller uten en peptidkomponent, et RNA molekyl eller et polypeptid. I en foretrukket utførelse er et bindingsmiddel et antistoff eller et antigenbindende fragment fra dette. Antistoff kan fremstilles ved hjelp av en rekke fremgangsmåter kjent til de med vanlig øvelse i faget. Se f.eks. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Generelt kan antistoff produseres ved hjelp av cellekulturteknikker, deriblant generering av monoklonale antistoff som beskrevet her, eller via transfeksjon av antistoffgener inn i passende bakterielle eller pattedyrvertsceller, for å tillate produksjon av rekombinante antistoff. I en fremgangsmåte blir et immunogen som omfatter polypeptidet, først injisert i en av en rekke pattedyr (f.eks. mus, rotter, kaniner, sauer eller geiter). I dette trinn kan polypeptider fra denne oppfinnelse fungere som immunogen uten modifikasjon. Alternativt kan, spesielt for relativt korte polypeptider, en forbedret immunrespons bli fremkalt dersom polypeptidet blir koblet til et bærerprotein, slik som bovint serumalbumin eller hemocyanin fra albueskjell. Immunogenet blir injistert inn i dyre verten, fortrinnsvis ifølge en på forhånd bestemt tidsplan som inkluderer en eller flere forsterkningsimmuniseringer, og dyrene blir deretter tappet for blod regelmessig. Polyklonale antistoff som er spesifikke for polypeptidet kan deretter bli renset fra slike antistoff ved for eksempel å benytte affinitetskromatografi der polypeptidet er koblet til et passende fast medium.

Monokonale antistoff som er spesifikke for et antigenpolypeptid av interesse, kan for eksempel fremstilles ved å bruke fremgangsmåten til Kohler and Milstein, Eur. J. Immuno. 6:511-519, 1976, og forbedringer av denne metode. I korthet dreier disse fremgangsmåter seg om preparering av udødelig cellelinje som har evne til å produsere antistoff med den ønskete spesifisitet (dvs. reaktivitet med det interessante polypeptid). Slike cellelinjer kan for eksempel produseres fra miltceller fremskaffet fra et dyr som immunisert som beskrevet over. Miltcellene blir deretter immortalisert ved for eksempel fusjon med myelomceller som fusjonspartner, fortrinnsvis en som er syngent med det immuniserte dyr. En rekke fusjonsfremgangsmåter kan benyttes. For eksempel kan miltcellene og myelomcellene bli kombinert med et ikke-ionisk detergens i et par minutter og deretter platet ut med lav tetthet på et selektivt medium som tillater vekst av hybridceller, men ikke myelomceller alene. En foretrukket seleksjonsfremgangsmåte benytter HAT (hypoksantin, aminopterin, tymidin) seleksjon. Etter en passende tid, vanligvis 1 til 2 uker, blir kolonier av disse hybrider observert. Enkle kolonier blir selektert og deres kultursupernatanter testet med hensyn på bindingsaktivitet mot polypeptidet. Hybridomer med høy reaktivitet og spesifisitet blir foretrukket.

Monoklonale antistoff kan isolerels fra supernatanten til voksende hybridom-kolonier. I tillegg kan like teknikker benyttes for å for øke utbyttet, slik som injekson av hybridomcellelinje inn i bukhulen til en passende virveldyrsvert, slik som mus. Monoklonale antistoff kan deretter høstes fra bukhulevæske eller blod. Forurensninger kan fjernes fra antistoffene ved hjelp av standard fremgangsmåter, slik som kromatografi, gelfiltrering, presipitering og ekstraksjon. Polypeptidene fra denne oppfinnelsen kan benyttes i rensningsprosessen for eksempel i et affinitets-kromatografitrinn.

I visse utførelser kan bruk av antigen-bindende fragmenter fra antistoffene bli foretrukket. Slike fragmenter inkluderer Fab fragmenter, som kan fremstilles ved hjelp av standard fremgangsmåter. I korthet har immunglobelinet bli renset fra kaninserum ved affinitetskromatografi på protein A resinsøyler (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Laboratory, 1988) og fordøyet med papain for å frembringe Fab og Fc fragmenter. Fab og Fc fragmentene kan separeres med affinitetskromatografi på protein A søyler.

Monoklonale antistoff fra den foreliggende oppfinnelse kan kobles til et eller flere terapeutiske midler. Passende midler i denne sammenheng inkluderer radioaktive nukleider, differenseringsindusere, medikamenter, toksiner og derivater av disse. Foretrukne radionuklider inkluderer<50>Y,<123>l,<125>l,<131>l,<186>Re,<188>Re, 211At og<212>Bi. Foretrukne medikamenter inkluderer metotreksat og pyrimidin og purinanaloger. Foretrukne differensieringsindusere inkluderer forbolestere og smørsyre, Foretrukne toksiner inkluderer risin, abrin, difteritoksin, koleratoksin, gelonin, pseudonomas eksotoksin, shigella toksin og antivirusprotein fra lommeugress.

Et terapeutisk middel kan kobles (dvs. kovalent bindes) til et passende monoklonalt antistoff enten direkte eller indirekte (f.eks. via en koblergruppe). En direkte reaksjon mellom et antigen og et antistoff er mulig når hver har en substituent som har evne til å reagere med den andre. For eksempel en nukleofilgruppe, slik som amino eller sulfydryl gruppe, på en kan ha evne til å reagere med en karbonyl-inneholdende gruppe, slik som et anhydrid eller et surt halid, eller med en alkylgruppe som inneholderl en god avleverende gruppe (f.eks. et halid) på den andre.

Alternativt kan det være ønskelig å koble et terapeutisk middel og et antistoff via en koblingsgruppe. En koblergruppe kan funksjonere som en romoppfyller for å fjerne et antistoff fra et middel for å unngå interferens med bindingsevnene. En koblingsgruppe kan også føre til å øke den kjemiske reaktivitet til en substituent på et middel eller et antistoff, og derved å øke koblingseffektiviteten. En økning i kjemisk reaktivitet kan også forbedre bruk av midler, eller funksjonelle grupper på midler, som ellers ikke ville være mulig.

Det vil være klart for de som er øvet i faget, at en rekke bifunksjonelle eller polyfunksjonelle reagenser, både homo- og retrofunksjonelle (slik som de som er beskrevet i katalogen til Pierce Chemical Co., Rockford, IL), kan benyttes som koblergruppe. Kobling kan utføres for eksempel via aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper eller oksiderte karbohydratrester. Det er en rekke referanser som beskriver slike fremgangsmåter, f.eks. US patent nr. 4,671,948, til Rodwell et al.

Der et terapeutisk middel er mer potent når det er uten antistoffdelen fra immunokonjugatene i den foreliggende oppfinnelse, kan det være ønskelig å bruke en koblergurppe som lar seg kløve av under eller etter internalisering inn i cellen. En rekke ulike kløvbare koblingsgrupper er blitt beskrevet. Mekaniskmene ansvarlig for intracellulær frisetting av et middel fra disse koblergrupper inkluderer kløving ved reduksjon av en disulfidbro (f.eks. US patent nr. 4,489,710, til Spitler), ved bestråling av en fotolabil binding (f.eks. US patent nr. 4,625,014, til Senter et al), ved hjelp av hydrolyse av derivatiserte aminosyresidekjeder (f.eks. US patent nr. 4,638,045, til Kohn et al.), ved serumkomplemnt-mediert dialyse (f.eks. US patent nr. 4,671,958 til Rodwell et al.), og syrekatalysert hydrolyse (f.eks. US patent nr. 4,569,789 til Blattler et al.).

Det kan være ønskelig å koble mer enn ett middel til et antistoff. I en utførelse blir multiple molekyler av et middel koblet til ett antistoffmolekyl. I en annen utførelse vil mer enn en type middel koble til et antistoff. Uansett den spesielle utførelse, kan immunkonjugater med mere enn ett middel fremstilles på ulike måter. For eksempel kan mer enn ett middel bli koblet direkte til et antistoff, eller koblingsmolekyler kan benyttes som tillater mulltiple bindingsseter. Alternativt kan en bærer bli benyttet.

En bærer kan bære midlene på en rekke måter, deriblant kovalentbinding enten direkte eller via en koblingsgruppe. Passende bærere inkluderer proteiner slik som albuminer (f.eks. US patent nr. 4,507,234, til Kato et al.), peptider og polysakkarider som aminodekstran (f.eks. US patent 4,699,784, til Shih et al.). En bærer kan også bære et middel ved ikke-kovalent binding eller ved kapsylering, slik som inne i en liposomblære (f.eks. US patent nr. 4,429,008 og 4,873,088). Bærere som er spesifikke for radioaktive midler, inkluderer radiohalogenerte små molekyler og bindings- forbindelser. For eksempel beskriver US patent nr. 4,735,792 representaive radiohalogenerte små molekyler og deres syntese. Et radionuklidchelat kan dannes fra chelaterende forbindelser som inkluderer de som inneholder nitrogen og svovelatomer som donoratomene for å binde metall, eller metalloksid, radionukleid. For eksempel beskriver US patent nr. 4,673, 562, til Davison et al., representative chelaterende forbindelser og deres syntese.

En rekke tilførelsesruter for antistoffene og immunkonjugatene kan benyttes. Vanligvis vil tilførselen være intravenøs, intramuskulær, subkutan eller i område-spesifikke regioner ved passende fremgangsmåter. Det vil være klart at den nøyaktige dose av antistoff/immunkonjugat vil variere avhengig av hvilket antistoff som brukes, antigentettheten, og hvor raskt antistoffet fjernes.

Antistoff kan benyttes i diagnostiske tester for å påvise nærvær av Chlamydia-antigen ved å bruke analyser som er lignende de som er beskrevet over i detalj, og andre fremgangsmåter som er vel kjent til de med øvelse i faget, som derved frembringer en fremgangsmåte for å påvise Ctøamyc//'a-infeksjon hos en pasient.

Diagnostiske reagenser fra foreliggende oppfinnelse kan også omfatte DNA sekvenser som koder for et eller flere av de ovenfor nevnte polypeptider, eller en eller flere deler av disse. For eksempel kan minst to oligonukleotidprimere bli benyttet i analyse basert på en polymerasekjedereaksjon (PCR) for å amplifisere Chlamydia-spesifikt cDNA avledet fra en biologisk prøve, der minst en av oligonukleotidprimerne er spesifikk for et DNA molekyl som koder for et polypeptid fra den foreliggende oppfinnelse. Nærvær av det amplifiserte cDNA blir deretter påvist ved å bruke fremgangsmåter som er vel kjent i faget, slik som gelelktroforese. På samme måte kan oligonukleotidprober som er spesifikt for et DNA molekyl som koder fra et polypeptid fra den foreliggende oppfinnelse, bli benyttet i et hybridiseringseksperiment for å påvise nærvær av et polypeptid fra oppfinnelsen i en biologisk prøve.

Som benyttet her, betyr begrepet "oligonukleotidprimer/probe spesifikt for et DNA molekyl" en oligonukleotidsekvens som har minst omtrent 80%, fortrinnsvis minst om 90% og mer fortrinnsvis minst omtrent 95% identitet med det relevante DNA molekyl. Oligonukleotidprimere og/prober som kan hensiktsmessig bli benyttet i oppfinnelsens diagnostiske fremgangsmåter, har fortrinnsvis minst omtrent 10-40 nukleotider. I en foretrukket utførelse omfatter oligonukleotidprimerne minst omtrent 10 etterfølgende nukleotider fra et DNA molekyl som koder for et av peptidene beskrevet her. Fortrinnsvis omfatter oligonukleotidprober i bruk i oppfinnelsens diagnostiske fremgangsmåter minst omtrent 15 sammenhengde oligonukleotider fra et DNA molekyl som koder for et av polypeptidene som er beskrevet her. Fremgangsmåter for både PCR baserte analyser og hybridiseringsanalyser er vel kjente i faget (se for eksempel Mullis et al. Ibid; Ehrlich, Ibid). Primere eller prober kan således bli benyttet for å påvise C/?/amyc//'aspesifikke sekvenser i biologiske prøver. DNA prober og primere som omfatter oligonukleotidsekvenser beskrevet over, kan benyttes alene eller i kombinasjon med hverandre.

De følgende eksempler blir tilbudt som illustrasjoner og ikke som begrensninger.

EKSEMPEL 1

ISOLERING AV DNA SEKVENSER SOM KODER FOR CHMMYDM-ANTIGENER

CWamycZ/a-antigener fra den foreliggende oppfinnelse ble isolert ved ekspresjonskloning av et genomisk DNA bibliotek fra Chlamydia trachomatis LGV II i hovedsak som beskrevet av Sanderson et al. (J. Exp. Med., 1995, 782:1751-1757), og ble funnet å indusere proliferasjon av PBMC og IFN-y i en immunreaktiv T-cellelinje.

En C/7/amyc//'a-spesifikk T-cellelinje ble fremstilt ved å stimulere PBMC fra en normal donor uten historie av Ctøamyc//a-infeksjon av genitaltraktur med elementærkropper fra chalmydia trachomatis LGV II. Denne T-cellelinje som hevises til TCL-8, ble funnet å gjenkjenne både monocyteavledete dendritiske celler infisert med både Chlamydia trachomatis og Chlamydia pneumonia.

Et tilfeldig kuttet genomisk bibliotek fra Chlamydia trachomatis LGV II ble konstruert i Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA), og det amplifiserte bibliotek ble platet ut i en 96 brønns mikrotiterplate med en tetthet på 30 kloner/brønn. Bakteria ble indusert til å uttrykke rekombinant protein i nærvær av 2 mM IPTG i 3 t., deretter sentrifugert og resuspendert i 200^l RPMI 10% FBS. 10^l av den induserte bakterielle suspensjon ble overført til 96 brønns plater som inneholdt autologe monocylavledete dendritiske celler. Etter en 21. inkubering ble dendritiske celler vasket for å fjerne fri E. coli, og Cft/amyd/a-spesifikke T-celler ble tilsatt. Positive E. coli grupper ble identifisert ved å bestemme IFN-y produksjon og proliferasjon av T-cellene i respons til bakteriene.

Fire positive grupper ble identifisert, som ble nedbrutt for å gi fire rene kloner (som blir henvist til som 1-B1-66, 4-D7-28, 3-G3-10 og 10-C10-31), som har størrelser på sesjonene på henholdsvis 481 bp, 183 bp, 110 bp og 1400 bp. De bestemte DNA sekvenser for 1-B1-66, 4-D7-28, 3-G3-10 og 10-C10-31 blir fremvist i henholdsvis SEQ ID NO: 1-4. Klone 1-B 1-66 er omtrent i regionen 536690 til genomet til c. trachomatis (NCBI c. tranchomatisdatabase). I klone 1-B1-66 haren åpen leseramme (ORF) blitt identifisert (nukleotider 115 - 375) som koder for et tidligere identifisert 9 kDa protein (Stephens, et al. Genbank Accession nr. AE001320), sekvensen til dette blir fremvist i SEQ ID NO: 5). Klone 4-D7-28 er en mindre region fra den samme leseramme (aminosyrene 22-82 til 1-B1-66). Klone 3-3G-10 er omtrent i region 74559 i genomet til c. trachomatis. Insertet er klonet i antisensretning med henblikk på dets orientering i genomet. Klonen 10-C10-31 inneholder en åpen leseramme som tilsvarer en tidligere publisert sekvens for S13 ribosomproteinet fra Chlamydia trachomatis (Gu, L. et al. J. Bacteriology, 777:2594-2601, 1995). De forutsagte proteinsekvenser til 4-D7-28 og 10-C10-31 blir fremvist i henholdsvis SEQ ID NO: 6 og 12. Forutsagte proteinsekvenser for 3-G3-10 blir fremvist i SEQ ID NO: 7-11.

I en relatert serie med skriningstuider ble en ytterligere T-cellelnje benyttet for å skrine det genomiske DNA bibliotek til Chlamydia trachomatis LGV II som er beskrevet over. En CWamyc//'a-spesifikk T-cellelinje (TCT-1) ble avledet fra en pasient med en C/?/amyc//'a-genital traktinfeksjon ved å stimuelre pasientens PBMC med autologe monocytavledete celler infisert med elementære legemer fra Chlamydia trachomatis LGV II. En klone, 4C-9-18 (SEQ ID NO: 21), som inneholdt et 1257 bp insert, frembrakte en spesifikk immunrespons, som målt ved hjelp av et standard prolifereringseksperiment, fra den Ctøamyd/a-spesifikke T-cellelinje TCT-1. Følgende analyse viste at denne klone inneholdt tre kjente sekvenser: lipoamiddehydrogenase (GenBak Accession No. AE001326), beskrevet i SEQ ID NO: 22, et hypotetisk protein CT429 (GenBank Accession nr. AE001316), beskrevet i SEQ ID NO: 23, og del av en åpen leseramme til ubikvinonmetyltransferase CT428 (GenBank Accession nr. AE001316), beskrevet i SEQ ID NO: 24.

I de videre studier som involerte klonen 4C9-18 (SE ID NO: 21), ble den full-lengde aminosyresekvens til lipoamiddehydrogenase (SEQ ID NO: 22) fra c. trachomatis (LGV II) uttrykket i klone CtL2-LPDA-FL, som beskrevet i SEQ ID NO: 90.

For videre å karakterisere den åpne leseramme som inneholdt T-cellestimulerende epitop(er), ble et cDNA fragment som inneholdt nukleotidene 1-695 fra klone 4C9-18 med en cDNA sekvens som kodet for en 6X-histidinmerking på aminoterminalen, subklonet inn i Ndel/EcoRI setet i pET17b vektor (Novagen, Madison, Wl), henvist til som klone 4C9-18#2 BL21 pLysS (SEQ ID NO: 25), med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 26) og transformert inn i E. coli. Selektiv induksjon av de transformerte E. coli med 2 mM IPTG i tre timer resulterte i ekspresjon av et 26 kDa protein fra klone 4C9-18#2 BL21 pLysS, som vist ved standard Coomassie-farvet SDS-PAGE. For å bestemme immunogenisiteten til proteinet som var kodet for av klone 4C90-18#2 BL 21 pLysS, ble E. coli som uttrykket 26 kDa proteinet titert på 1 x 10<4>monocyt-avledete dendritceller og inkubert i 2 timer. Dendritcellekulturene ble vasket og 2,5 x 10<4>T-celler (TCT-1) ble tilsatt og tillatt å inkubere i ytterligere 72 timer, da nivået på IFN-y i kultursupernatanten ble bestemt ved hjelp av ELISA. Som vist i fig. 1, ble T-cellelinjen TCT-1 funnet å respondere på induserte kulturer, målt ved IFN-g, noe som indiserte en C/7/amyc//'a-spesifikk T-celle respons mot lipoamiddehydrogenase-sekvensen. På samme måte ble proteinet kodet for av klone 4C9-18#2 BL21 pLysS vist å stimulere TCT-1 T-cellelinjen analysert med standard proliferasjonsanalyser.

Etterfølgende studier for å identifisere ytterligere Chlamydia trachomatisantigener ved å bruke den ovenfor beskrevne CD4- T-celleekspresjonskloningsfremgangsmåten, ga ytterligere kloner. De TCT-1 og TCL-8 C/?/amyc//'a-spesifikke T-cellelinjer, samt også den TCP-21 T-cellelinje ble benyttet for å skrine det genomiske bibliotek fra Chlamydia trachomatis LGV II. TCP-21 T-cellelinjen ble avledet fra en pasient som hadde en humoral immunrespons mot Chlamydia penumonia. TCT-1 cellelinjen identifiserte 37 positive grupper, TCT-3 cellelinjen identifiserte 41 positive grupper og TCP-21 cellelinjen identifiserte 2 positive grupper. De følgende kloner ble avledet fra 10 av disse positive grupper. Klone 11-A3-93 (SEQ ID NO: 64), identifisert av TCP-21 cellelinjen, er et 1339 bp genomisk fragment som deler homologi med HAD superfamilien (CT103). Det andre insert i den samme klone deler homologi med fab I genet (CT104) som er til stede på den komplementære tråd. Klone 11-C12-91 (SEQ ID NO: 63), identifsert ved å bruke TCP-21 cellelinjen, håret 269 bp insert som er del av OMP2 genet (CT443) og deler homologi med det 60 kDa cysteinrike ytre membranprotein til c. pneumoniae.

Klone 11-G10-46, (SEQ ID NO: 62), identifisert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, inneholder et 688 bp insert som deler homologi med det hypotetiske protein CT610. Klone 11-G1-34, (SEQ ID NO: 61), identifisert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, har to delvis åpne leserammer (ORF) med en insertstørrelse på 1215 bp. En ORF deler homologi med malathydrogenasegenet (CT376), og den andre ORF deler homologi med glykogenhydrolasegenet (CT042). Klone 11-H3-68, (SEQ ID NO: 60), idenfisert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, har to ORF med en total insertstørrelse på 1180 bp. En delvis ORF koder for det plasmid-kodete PGP6-D virulensproteinet, mens den andre ORF er en komplett ORF for L1 ribosomalt gen (CT318). Klone 11-H4-28, (SEQ ID NO: 59), identifisert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, har en insertstørrelse på 552 bp og er del av ORF for genet for dnaK (CT396). Klone 12-B3-95 (SEQ ID NO: 58) identifisert ved å bruke TCT-1 cellelinjen, har en insertstørrelse på 463 bp og er en del av ORF for lipoamiddehydrogenasegenet (CT557). Klonene 15-G1-89 og 12-B3-95 er identiske, (henholdsvis SEQ ID NO: 55 og 58), identifisert ved å bruke TCT-1 cellelinjen, de har en insertstørelse på 463 bp og er del av ORF for lipoamiddehydrogenasegenet (CT557). Klone 12-G3-83, (SEQ ID NO: 57) identifisert ved å bruke TCT-1 cellelinjen, har en insertstørrelse på 1537 bp og har del av ORF for det hypotetiske protein CT622.

Klone 23-G7-68, (SEQ ID NO: 79) identifisert ved bruk av TCT-3 cellelinjen, inneholder et 950 bp insert og inneholder en liten del av L11 ribosomal leseramme, hele ORF for L1 ribosomalt protein og en del av ORF for L10 ribosomalt protein. Klone 22-F8-91, (SEQ ID NO: 80), identifsert ved bruk av TCT-1 cellelinjen, inneholder et 395 bp insert som inneholder del av pmpC ORF på den komplementære tråd til klonen. Klone 21-E8-95, (SEQ ID NO: 81), identifisert ved bruk av TCT-3 cellelinjen, inneholder et 2,085 bp insert som inneholder del av ORF for CT613, den komplette ORF for CT612, den komplette ORF for CT611 og del av ORF for CT610. Klone 19-F12-57, (SEQ ID NO: 82), identifsert ved bruk av TCT-3 cellelinjen, inneholder et 405 bp insert som inneholder del av ORF for CT858, og en liten del av ORF for recA. Klone 19-F12-53, (SEQ ID NO: 83), identfisert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, inneholder et 379 bp insert som er del av ORF for CT455 som koder for glutamyl tRNA syntetase. Klone 19-A5-54, (SEQ ID NO: 84), identifsert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, inneholder et 715 bp insert som er del av ORF3 (den komplementære tråd av klonen) til det kryptiske plasmid. Klone 17-E11-72 (SEQ ID NO: 85), identifisert ved å bruke TCT-1 cellelinjen, inneholder et 476 bp insert som er del av ORF til Opp_2 og pmpD. pmpD regionen til denne klone er dekket av pmpD regionen til klone 15-H2-76. Klone 17-C1-77, (SEQ ID NO: 86) identfisert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, inneholder et 1551 bp insert som er del av ORF for CT857, samt også del ORF for CT858. Klone 15-H2-76, (SEQ ID NO: 87), identifisert ved å bruke TCT-1 cellelinjen, inneholder et 3,031 bp insert som inneholder en stor del av ORF for pmpD, del av ORF for CT089, samt også en del av ORF for SycE. Klone 15-A3-26, (SEQ ID NO: 88), inneholder et 976 bp insert som inneholder del av ORF for CT858. Klone 17-G4-36 (SEQ ID NO: 267), identifisert ved å bruke TCT-10 cellelinjen, inneholder et 680 bp insert som er i ramme med beta-gal i plasmidet og deler homologi med del av ORF for DNA-rettet RNA polymerasebetasubenhet (CT315 i SerD).

Flere av klonene beskrevet over deler homologi med ulike polymorfe membranproteiner. Den genomiske sekvens til Chlamydia trachomatis inneholder en familie med ni polymore membranproteingener, som beskrives som pmp. Disse gener blir benevnt pmpA, pmpB, pmpC, pmpD, pmpE, pmpF, pmpG, pmpH og pmpl. Proteiner som uttrykkes fra disse gener, antas å være av biologisk relevanse i å danne en beskyttende immunrespons mot en Ctøamyc//a-infeksjon. Spesielt inneholder pmpC, pmpD, pmpE og pmpl forutsigbare signalpeptider, noe som antyder at de er ytre membranproteiner og derfor mulige immunologiske mål.

Basert på sekvensen Chlamydia trachomatis LGV II servoar ble primerpar lavet for å PCR amplifisere full-lengde fragmentene til pmpC, pmpD, pmpE, pmpG, pmpH og pmpl. De resulterende fragmenter ble subklonet inn i DNA vaksinevektoren JA4304 eller JAL, som er JA4304 med en modifisert kobler (SmithKline Beecham, London, England). Spesifikt ble pmpC subklonet inn i JAL vektoren ved å bruke den 5' oligo

GAT AGG CGC GCC GCA ATC ATG AAA TTT ATG TCA GCT ACT GCT G og den 3'

oligo CAG AAC GCG TTT AGA ATG TCA TAC GAG CAC CGC A, som fremvist i SEQ ID NO: henholdsvis 197 og 198. PCR amplifikasjon av genet under betingelser som er velkjent i faget, oligering inn i de 5' merket ASCI/3' Mlul setene til JAL vektoren ble fullført etter innføring av den korte nukleotidsekvens GCAATC (SEQ ID NO: 199) oppstrøms til ATG for å produsere en Kozak-lignende sekvens. Den resulterende ekspresjonsvektor inneholdt full-lengde pmpC genet som omfattet 5325 nukleotider (SEQ ID NO: 173) som inneholdt den hypotetiske signalsekvens, som koder for et 187 kD protein (SEQ ID NO: 179). pmpD genet ble subklonet inn i JA4304 vaksinevektoren etter PCR amplifikasjon av genet ved å bruke de følgende oligos: 5' oligo- TGC AAT CAT GAG TTC GCA GAA AGA TAT AAA AAG C (SEQ ID No: 200) og 3' oligo- CAG

AGC TAG CTT AAA AGA TCA ATC OCA ATC CAG TAT TC (SEQ ID NO: 201). Genet

ble ligert inn i et 5' sløvet HIII/3' Mlul sete til JA4304 vaksinevektoren ved å bruke standard fremgangsmåter som er vel kjent i faget. CAATC (SEQ ID NO: 202) ble satt inn oppstrøms for ATG for å lage et Kozak-lignende sekvens. Denne klone er unik i at det siste treonin i Hindlll setet mangler på grunn av sløvingsprosedyren, slik også det siste glycin i den Kozak-lignende sekvens er. Insertet, et 4593 nukleotidfragment (SEQ ID NO: 172) er full-lengde genet for pmpD som inneholder den hypotetiske

signalsekvens, som koder for et 161 kD protein (SEQ ID NO: 178). pmpE ble subklonet inn i JA4304 vektoren ved å bruke den 5' oligo TGC AAT CAT GAA AAA AGC GTT TTT CTT TTT C (SEQ ID NO: 203), og den 3' oligo- CAG AAC GCG TCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C (SEQ ID NO: 204). Etter PCR amplifikasjon ble genet ligert inn i det 5- sløvete HIM/3' Mlul setet til JA4304. For å fasilitere dette, ble en kort nekleotidsekvens, TGCAATC (SEQ ID NO: 293), tilsatt oppstrøms for initieringskodonet for å produsere en Kozak-lignende sekvens og rekonstituere setet for Hindlll. Insertet er det full-lengde pmpE genet (SEQ ID NO: 171), som inneholder den hypotetiske

signalsekvens. pmpE genet koder for et 105 kD protein (SEQ ID NO: 177). pmpG genet ble PCR amplifisert ved å bruke den 5' oligo-GTG CAA TCA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG (SEQ ID NO: 205), og det 3' oligo- CAG AAC GCG TTT AGA ACC GGA CTT TAC TTC C (SEQ ID NO: 206) og subklonet inn i JA4304 vektoren. Lignende kloningsstrategier ble fulgt for pmpl og pmpK genene. I tillegg ble primerpar lavet for å PCR amplifisere de full-lengde eller overlappende fragmenter av pmp genene, som deretter ble subklonet for ekspresjon av protein i pET17b vektoren (Novagen, Madison, Wl) og transfektert inn i E. coli BL21 pLysS for ekspresjon og følgende rensning ved å bruke histidin-nikkel kromatogråfisk metologi som er levert av Novagen. Flere av genene som koder for de rekombinante proteinene, som beskrevet nedenfor, mangler den native signalsekvens som hjelper på ekspresjon av proteinet. Full-lengde proteinekspresjon av pmpC ble oppnådd gjennom ekspresjon av to overlappende fragmenter, som representerer amino og karboksy terminalene. Subkloning av pmpC-amino terminale delen, som mangler signalersekvensen (SEQ ID NO: 187, med den tilsvarende aminosyresekvens fremvist i SEQ ID NO: 195) benyttet den 5' oligo- CAG

ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGA GGC GAG CTC GAT CCA AGA TC

(SEQ ID NO: 207), og den 3' oligo-CAG AGG TAC CTC AGA TAG CAC TCT CTC CTA TTA AAG TAG G (SEQ ID NO: 208) inn i det 5' Ndcl/3' KPN kloningssetet til vektoren. Den karboksyterminale del av genet, pmpC-karboksyterminalt fragment (SEQ ID NO: 186, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 194), ble subklonet inn i det 5' Nhel/3' KPN kloningssete til ekspresjonsvektoren ved å bruke de følgende primere: 5' oligo- CAG AGC TAG CAT GCA TCA CCA Tea CCA TCA CGT TAA GAT TGA GAA CTT CTC TGG C (SEQ ID NO: 209), og 3' oligo- CAG AGG TAC CTT AGA ATG TCA TAC GAG CAC CGC AG (SEQ ID NO: 210). pmpD ble også uttrykket som to overlappende proteiner. pmpD-aminoterminale del, som mangler signalsekvensen, (SEQ ID NO: 185, med den korresponderende aminosyresekvens fremvist i SEQ ID

NO: 193), inneholder initieringskodonet til pET17b, og blir uttrykket som et 80 kD protein. Med henblikk på proteinekspresjon og rensning er et seks-histidinmerke lagt etter initieringskodonet og er fusjonert med den 28<nde>aminosyre (nukleotid 84) i genet. De følgende primere ble benyttet, 5' oligo, CAG ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG GTT AGC (SEQ ID NO: 211), og den 3' oligo- CAG AGG TAC CTC AGC TCC TCC AGC ACA CTC TCT TC (SEQ ID NO: 212), for å spleise inn i det 5' Ndel/3' KPN kloningssete til vektoren. Den pmpD-karboksyterminale del (SEQ ID NO: 184) ble uttrykket som et 93 kD protein (SEQ ID NO: 192). For ekspresjon og etterfølgende rensning ble en ytterligelre metionin, alanin og serin inkludert, som representerer initieringskodonet og de første to aminosyrene fra pET17b vektoren. Et seks-histidinmerke nedstrøms fra metionin, alanin og serin blir fusjonert ved den 691ste aminosyren (nukleotid 2073) i genet. Den 5' oligo- CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG TGC TAT TTC TTG CTT ACG TGG (SEQ ID NO: 213) og den 3' oligo-CAG AGG TAC TTn AAA AGA TCA ATC GCA ATC CAG TAT TCG (SEQ ID NO: 214)

ble benyttet for å subklone insertet inn i det 5' Nhel/3' KPN kloningssete i

ekspresjonsvektoren. pmpE ble uttrykket som et 106kD protein (SEQ ID NO: 183, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 191). pmpE insertet mangler også den native signalsekvens. PCR amplifikasjon av genet under betingelser som er vel kjent i faget, ble utført ved å bruke følgende oligoprimere: 5' oligo- CAG AGG ATC CAC

ATC ACC ATC ACC ATC ACG GAC TAG CTA GAG AGG TTC (SEQ ID NO: 215), og

den 3' oligo- CAG AGA ATT CCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C (SEQ ID NO: 216), og det amplilfiserte insert ble ligert inn i et 5' BamHI/E' EcoRI sete i JA43404. Den korte nukleotidsekvens, som fremvist i SEQ ID NO: 217, ble satt inn oppstrøms for initieringskodonet for å danne den Kozak-lignende sekvens og rekonstituere Hindi 11 setet. Det uttrykkete protein inneholder initieringskodonet og de 21 nedstrøms aminosyrene fra pET17b ekspresjonsvektoren, det vil si

MASMTGGQQMGRDSSLVPSSDP (SEQ ID NO: 218). I tillegg er seks histidiner inkludert oppstrøms for sekvensen som er beskrevet over, og er fusjonert med den 28<nde>aminosyre (nukleotid 84) fra genet, som eliminerer det hypotetiske signalpeptid. Sekvensene fremvist i SEQ ID NO: 183 med den tilsvarende aminosyresekvens i SEQ ID NO: 191 inkluderer ikke disse ytterligere sekvenser. pmpG genet (SEQ ID NO: 182, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 190) ble PCR amplifisert under betingelser som er vel kjent i faget, ved å bruke de følgende oligoprimere: 5' olio-CAG AGG TAC CGC ATC ACC ATC ACC ATC ACA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG (SEQ ID NO: 219), og den 3' oligo- CAG AGC GGC CGC TTA GAA CCG GAC TTT ACT TCC (SEQ ID NO: 220), og ligert inn i det 5' KPN/3' Noti kloningssete i ekspresjonsvektoren. Det uttrykkete protein inneholder en ytterligere aminosyresekvens i aminoenden, nemlig MASMTGGQQNGRDSSLVPHHHHHH (SEQ ID NO: 221), som omfatter initierintskodonet og ytterligere sekvens fra pET17b ekspresjonsvektoren, pmpl genet (SEQ ID NO: 181, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 189), ble PCR amplifisert under betingelser som er vel kjent i faget ved å bruke de følgende oligoprimere: 5' oligo- CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CCT CTT TGG CCA GGA TCC C (SEQ ID NO: 222), og den 3' oligo- CAG AAC TAG TCT AGA ACC TGT AAG TGG TCC (SEQ ID NO: 223), og ligert inn i ekspresjonsvektoren ved 5' Nhel/3' Spel kloningssetet. Det 95 kD uttrykket protein inneholder initieringskodonet pluss en ytterligere alanin og serin fra pET17b vektoren i den aminoterminale ende av proteinet. I tillegg er seks histidiner fusjonert ved den 21<nde>aminosyre av genet, som eliminerer det hypotetiske signalpeptid.

Klone 14H1-4 (SEQ ID NO: 56), identifisert ved å bruke TCT-3 cellelinjen, inneholder en komplett ORF for genet for TSA, tiol spesifikk antioksidant - CT603 (ORF for CT603 er en homolog av CPn0778 fra c. pneumoniae). Den åpne leseramme for TSA i klone 14-H1-4 ble amplifisert slik at det uttrykkete protein har en ytterligere melonin og en 6x histidinstreker (i aminoterminale ende). Dette forsterkete insert ble subklonet inn i Nde/EcoRI setene i pET17b vektoren. Etter induksjon av denne klone med IPTG ble et 22,6 kDa protein renset ved hjelp av Ni-NTA agaroseaffinitetskromatografi. Den bestemte aminosyresekvens for de 195 aminosyrene ORF til klone 14-H1-4 som koder for TSA genet, er fremvist i SEQ ID NO: 65. Videre analyse ga en full-lengde klone for TSA genet, henvist til som CTL2-TSA-FL, med full-lengde aminosyresekvensen fremvist i SEQ ID NO: 92.

Videre studier ga 10 ytterligere kloner identifisert med TCT-1 og TCT-3 T-cellelinjene, som beskrevet over. Klonene identifisert av TCT-1 linjen er: 16-D4-22, 17-C5-19, 18-C5-2, 20-G3-45 og 21-C7-66, kloner identifisert av TCT-3 cellelinjen er: 17-C10-31, 17-E2-9, 22-A1-49 og 22-B3-53. Klone 21 -G12-60 ble gjenkjent av både TCT-1 og TCT-3 T-cellelinjene. Klone 16-D4-22 (SE ID NO: 119), identifisert ved å bruke TCT-1 cellelinjen, inneholder av 953 bp insert som inneholder to gener, deler av åpen leseramme 3 (ORF3) og ORF4 fra c. trachomatis plasmidet for vekst i pattedyrceller. Klone 17-C5-19 (SEQ ID NO: 118), inneholder et 951 bp insert som inneholder del av ORF for DT531, som koder for clpP_1 protease og del av ORF for CT430

(diaminopimelatepimerase). Klone 18-C5-2 (SEQ ID NO: 117) er del av ORF for S1 ribosomalt protein med et 446 bp insert som blir identifisert ved å bruke TCT-1 cellelinjen. Klone 20-G3-45 (SEQ ID NO: 116), identifisert med TCT-1 cellelinjen, inneholder et 437 bp insert som er del av pmpB genet (CT413). Klone 21-C7-66 (SEQ ID NO: 115), identifisert ved hjelp av TCT-1 cellelinjen, inneholder et 995 bp insert som koder for del av dnaK lignende protein. Insertet i denne klone overlapper ikke med insertet til TCT-3 klone 11-H4-28 (SEQ ID NO: 59), som ble vist å være del av dnaK genet CT396. Klone 17-C10-31 (SEQ ID NO: 114), identifisert av TCT-3 cellelinjen, inneholder et 976 bp insert. Denne klone inneholder deler av ORF for CT858, en protease som inneholder IRBP og DHR domener. Klone 17-E2-9 (SEQ ID NO: 113) inneholder del av ORF for to gener, CT611 og CT610, som spenner over et 1142 bp insert. Klone 22-A1-49 (SEQ ID NO: 112), identifisert med bruk av TCT-3 cellelinjen, inneholder også to gener i et 698 bp insert. Del av ORF for CT660 (DNA gyrase{gyrA-_2}) er til stede på topptråden, mens den komplette ORF for et hypotetisk protein for CT650 er til stede på den komplementære tråd. Klone 22-B3-53 (SEQ ID NO: 111), identifisert med TCT-1 linjen, har et 267 bp insert som koder for del av ORF for GroEL (CT110). Klone 21 -G12-60 (SEQ ID NO: 110), identifisert av både TCT-1 og TCT-3 cellelinjene, inneholder et 1461 bp insert som inneholder delvise ORF for hypotetiske proteiner CT875, CT229 og CT228.

Ytterligere Ctøamyd/a-antigener ble fremskaffet ved å skrine et genomisk ekspresjonsbibliotek fra Chlamydia trachomatis (LGV II serovar) i Lambda Screen-1 vektoren (Novagen, Madison, Wl) med sera som er slått sammen fra flere C/?/amyc//'ainfiserte individer ved å bruke fremgangsmåter som er vel kjent i faget. De følgende immunreaktive kloner ble identifisert, og insertene som inneholdt Ctøamyd/agener, ble sekvensert: CTL2#1 (SEQ ID NO: 71), CTL2#2 (SEQ ID NO: 70, CTL2#3-5' (SEQ ID NO: 72, en første bestemt genomisk sekvens som representerer den 5' ende), CTL2#3-3' (SEQ ID NO: 73, en annen bestemt genomisk sekvens som representerer den 3' ende), CTL2#4 (Seq ID NO: 53), CTL2#5 (SEQ ID NO: 69), CTL2#6 (SEQ ID NO: 68), CTL2#7 (SEQ ID NO: 67), CTL2#8b (SEQ ID NO: 54), CTL2#9 (SEQ ID NO: 66), CTL2#10-5' (SEQ ID NO: 74, en første betemt genomisk sekvens som representerer den 5' ende), CTL2#10-3' (SEQ ID NO: 75, en annen bestemt genomisk sekvens som representerer den 3' ende), CTL2#11-5' (SEQ ID NO: 45, en første bestemt genomisk sekvens som representerer den 5' enden), CTL2#11-3'

(SEQ ID NO: 44, en annen bestemt genomisk sekvens som representerer den 3' ende),

CTL2#12 (SEQ ID NO: 46), CTL2#16-5' (SEQ ID NO: 47), CTL2#18-5' (SEQ ID NO: 49, en første bestemt genomisk sekvens som representerer den 5' ende), CTL#18-3'

(SEQ ID NO: 48, en annen bestemt genomisk sekvens som representerer den 3' ende), CTL2#19-5' (SEQ ID NO: 76, den bestemte genomiske sekvens representerer den 5-ende), CTL2#21 (SEQ ID NO: 50), CTL2#23 (SEQ ID NO: 51) og CTL2#24 (SEQ ID NO: 52).

Ytterligere Chlamydia trachomatisantigener blir identifisert med serologisk ekspresjonskloning. Disse studier benyttet sera som var slått sammen fra flere individer med C/?/amyc//'a-infeksjon som beskrevet over, men IgA og IgM antistoff ble benyttet i tillegg til IgG som et sekundært antistoff. Kloner som ble skrinet med denne fremgangsmåte, forsterker påvisning av antigener som gjenkjennes av en rask immunrespons til en C/7/amyc//'a-infeksjon, det vil si en slimhinnehumoral immunrespons. De følgende immunreaktive kloner blekarakterisert, og insertene som inneholdt Chlamydiagener ble sekvensert: CTL2gam-1 (SEQ ID NO: 290), CTL2gam-2 (SEQ ID NO: 289), CTL2gam-5-(SEQ ID NO: 288), CTL2gam-6-3' (SEQ ID NO: 287, en annen bestemt genomisk sekvens som representerer den 3' ende), CTL2gam-6-5'

(SEQ ID NO: 186, en første bestemt genomisk sekvens som representerer den 5' ende), CTL2gam-8 (SEQ ID NO: 285), CTL2gam-10 (SEQ ID NO: 284), CTL2gam-13 (SEQ ID NO: 283), CTL2gam-15-3' (SEQ ID NO: 282, en annen bestemt genomisk sekvens som representerer den 3' ende), CTL2gam-15-5' (SEQ ID NO: 281, en første bestemt genomisk sekvens som representerer den 5' ende), CTL2gam-17 (SEQ ID NO: 280), CTL2gam-18 (SEQ ID NO: 279), CTL2gam-21 (SEQ ID NO: 278), CTL2gam-23 (SEQ ID NO: 277), CTL2gam-24 (SEQ ID NO: 276), CTL2gam-26 (SEQ ID NO: 275), CTL2gam-27 (SEQ ID NO: 274), CTL2gam-28 (SEQ ID NO: 273), CTL2gam-30-3'

(SEQ ID NO: 272, en annen bestemt genomisk sekvens som representerer den 3' ende) og CTL2gam-30-5' (SEQ ID NO: 271, en første bestemt genomisk sekvens som representerer den 5-merkete ende).

EKSEMPEL 2

INDUKSJON AV T-CELLEPROLIFERASJON OG INTERFERON-y PRODUKSJON AV CHLAMYDIA TRACHOMATIS ANTIGENER

Evne som rekombinante Chlamydia trachomatisantlgener har i å indusere T-celleproliferasjon og interferon-y produksjon, blir bestemt som følger.

Proteiner blir indusert med IPTG og renset ved hjelp av Ni-NTA agaroseaffinitetskromatografi (Webb et al., J. Immunology 757:5034-5041, 1996). De rensete polypeptider blir deretter undersøkt med henblikk på evne til å indusere T-celleproliferasjon i PBMC preparater. PBMC fra c. fracftomaf/spasienter samt også fra normale donorer som har T-celler som er kjent for å proliferere som respons til C/7/amyc//'a-antigener, blir dyrket i medium som omfatter RPM11640 supplementert med 10% sammenslått humant serum og 50 \ ig/ m\ gentamicin. Rensete polypeptider blir tilsatt i duplikat i konsentrasjoner på 0,5 til 10^Ig/mL. Etter seks dagers dyrking i 96 brønns rundbundsplater i et volum på 200 jai, blir 50 jai medium fjernet fra hver brønn for å bestemme IFN-y nivåer, som beskrevet nedenfor. Platene blir deretter tilsatt pulser med 1 nCi/well av tritiummerket tymidin i videre 18 timer, deretter høstet og tritiumopptak blir bestemt ved å bruke en gass scintillasjonsteller. Fraksjoner som fører til proliferasjon i begge replikater som er tre ganger større enn proliferasjonen observert i celler dyrket i medium alene, vurderes som positive.

IFN-y blir målt ved å bruke et enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA). ELISA plater blir dekket med et musmonoklonalt antistoff rettet mot humant IFN-y (PharMingen, San Diego, CA) i PBS i fire timer ved romtemperatur. Brønner blir deretter blokket med PBS som inneholder 5% (vekt/volum) fettfri tørrmelk i 1 time ved romtemperatur. Platene blir vasket seks ganger i PBS/0,2% TWEEN-20, og prøver fortynnet 1:2 i dyrkningsmedium i ELISA platene blir inkubert over natten ved romtemperatur. Platene blir vasket igjen, og et polyklonalt kaninantihumant IFN-y serum fortynnet 1:3000 i PBS/10% normalt geiteserum blir tilsatt hver brønn. Platene blir deretter inkubert i 2 timer ved romtemperatur, vasket og pepperrotperoksidasekoblet antikanin IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) blir tilsatt ved en 1:2000 fortynning i PBS/5% fettfri tørrmelk. Etter videre to timers inkubering ved romtemperatur blir platene vasket og TMB substrat blir tilsatt. Reaksjonen blir stoppet etter 20 minutter med en normal 1 N svovelsyre. Optisk tetthet blir bestemt ved 450 nm, ved bruk av 570 nm som referansebølgelengde. Fraksjoner som fører til resultater i begge replikater som gir en OD som er to ganger større enn gjennomsnitts OD fra cellene som er dyrket i medium alene, pluss 3 standard avvik, blir vurdert som positive.

Ved å bruke den ovenfor beskrevne fremgangsmåte ble rekombinant 1B1-66 protein (SEQ ID NO:5) samt to syntetiske peptider som tilsvarer aminosyrene 48-67 (SEQ ID NO: 13, henvist til som 1-B1-66/48-67) og 48-77 (SEQ ID NO: 14, benevnt 1B1-66/58-77), henholdsvis fra SEQ ID NO: 5, ble funnet å indusere en proliferasjon s-respons og IFN-y produksjon i en Ctøamyc//a-spesifikk T-cellelinje som ble benyttet for å skrine et genomisk bibliotek fra c. trachomatis LGV II.

Videre studier har identifisert en c. fracftomaf/sspesifikk T-celleepitop i det ribosomale S13 protein. Ved å benytte standard epitop kartleggingsteknikker som er vel kjent i faget, blir to T-celleepitoper i det ribosomale S13 proteinet (rS13) identifisert med en Ctøamyc//a-spesifikk T-cellelinje fra donor CL-8 (T-cellelinje TCL-8 EB/DC). Fig. 8 illustrerer at det første peptid, rS13, 1-20 (SEQ ID NO: 106), er 100% identisk med den tilsvarende c. pneumon/aesekvensen, som forklarer kryssreaktiviteten av T-cellelinjen overfor rekombinante c. trachomatis- og c- pneumoniae rS13. Responsen til det andre peptid rS13 56-75 (SEQ ID NO: 108) er spesifikk for c. trachomatis, antydende at rS13 responsen i denne friske og asymptomatiske donor ble frembrakt ved eksponering til c. trachomatis og ikke til c. pneumoniae, eller noen annen mikrobeinfeksjon.

Som beskrevet i eksempel 1, har klone 11-C12-91 (SEQ ID NO: 63), identifisert ved bruk av TCP-21 cellelinjen, et 269 bp insert som er del av OMP2 genet (CT443) og deler homolgi med det 60 kDa cysteinrike ytre membranprotein til c. penumoniae, benevnt som OMCB. For videre å definere de reaktive epitop(er), ble epitopkartlegging utført ved å bruke en serie med overlappende peptider, og immunoanalysen som tidligere er beskrevet. I korthet ble proliferative responser bestemt ved å stimulere 2,5 x 10<4>TCP-21 T-celler i nærvær av 1 x 10<4>monocyavledete dendritceller med enten ikke-infeksiøse elementærlegemer avledet fra c. trachomatis og c. pneumonia, eller peptider avledet fra proteinsekvensen til c. trachomatis eller c. pneumoniae OMCB protein (0,1 ug/ml). PCT-21 T-cellene responderte til epitopene CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190, CT-OMCB #171-186 og til en mindre grad overfor CT-OMCB #175-186 (SEC ID NO: 249-252). Interessant ga TCP-21 T-cellelinjen også en proliferativ respons til det homologe c. penumoniaepepWd CP-OMCB #171-186 (SEQ ID NO: 253), som var lik med eller større enn responsen til c. fracfromaf/speptidene. Aminosyresubstitusjoner i posisjon to (dvs. asparaginsyre istedenfor glutaminsyre) og posisjon 4 (dvs. cystein istedenfor serin) endret ikke den proliferative responsen til T-cellene og demonstrerer derfor at denne epitop er en kryssreaktiv epitop mellom c. trachomatis og c. penumoniae.

For videre å definere epitopen som er beskrevet over, ble en ytterligere T-cellelinje, TCT-3, benyttet i epitopkartleggingseksperimenter. Immunoanalysene ble utført som beskrevet over, med unntak av at kun peptider fra c. trachomatis ble testet. T-cellene ga en proliferativ respons på to peptider, CT-OMCB #152-171 og CT-OMCB #157-176 (henholdsvis SEQ ID NO: 246 og 247), og definerte derved en ytterligere immunogen epitop i den cysteinrike ytre membranprotein til c. trachomatis.

Klone 14H1-4 (SEQ ID NO: 56, med den tilsvarende full-lengde aminosyresekvens fremvist i SEQ ID NO: 92) ble identifisert ved bruk av TCT-3 cellelinjen i CD4 T-celleekspresjonskloningssystemet som tidligere er beskrevet, og ble vist å inneholde en komplett ORF for det tiolspesifikke antioksidantgen (CT603), benevnt som TSA. Epitopkartleggingsimmunoanalyser ble utført øsom beskrevet over, for videre å definere epitopen T-cellelinjen fremviste en sterk proliferasjonsrespons overfor de overlappende peptider CT-TSA #96-115, CT-TSA #101-120 og CT-TSA #106-125 (henholdsvis SEQ ID NO: 254-256), noe som demonstrerte en immunreaktiv epitop i det tiolspesifikke antioksidantgen til c. trachomatis serovar LGVII.

EKSEMPEL 3

FREMSTILLING AV SYNTETISKE POLYPEPTIDER

Polypeptier kan syntetiseres på en Millipore 9050 peptidsyntesemaskin ved å bruke FMOC kjemi med GPTU (0-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametyluronium-heksafluorfosfat) aktivering. En Gly-Cys-Gly sekvens kan kobles til aminoterminalen til peptidet for å frembringe en fremgangsmåte for å konjugere eller merke peptidet. Kløving av peptidene fra den faste støttefase kan utføres ved å bruke den følgende kløvingsblanding: trifluoreddiksyre:etanditiol:tioanisol:vann:fenol (40:1:2:2:3). Etter kløving i 2 timer kan peptidene presipiteres i kald metyl-t-butyl-eter. Peptidbunnfallene kan deretter løses opp i vann som inneholder 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) og frysetørret før rensning med C18 reversfase HPLC. En gradient på 0-60% acetonitril (med 0,1% TFA) i vann (som inneholder 0,1% TFA) kan benyttes for å eluere peptidene. Etter frysetørking av de rene fraksjoner, kan peptidene karakteriseres ved bruk av elektrostråling massespektrometri og ved aminosyreanalyse.

EKSEMPEL 4

ISOLERING OG KARAKTERISERING AV DNA SEKVENSER

SOM KODER FOR CHLAMYDIA- AHJ\ GENER VED Å BRUKE

RETROVIRUSEKSPRESJONSVEKTORSYSTEMER OG

ETTERFØLGENDE IMMUNOLOGISK ANALYSE

Et genomisk bibliotek fra Chlamydia trachomatis LGV II ble konstruert ved begrensete fordøyelser ved bruk av BamHI, Bglll, BstYi og Mbol restriksjonsenzymer. Restriksjonsfragmentene ble deretter ligert inn i BamHI setet til de retrovirale vektorer pBIB-KS1,2,3. Dette vektorsett ble modifisert for å inneholde et Kosak translasjons-initieringssete og stoppekodoner for å tillate ekspresjon av proteiner fra korte DNA genomiske fragmenter, som vist i fig. 2. DNA grupper på 80 kloner ble fremstilt og transfektert inn i den retroviruse pakkelinje Phoenix-Ampho, som beskrevet i Pear, W.S., Scott, M.L and Nolan, G.P., Generation of High Titre, Helper-free Retroviruses by Transient Transfection. Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, s. 41-57. CtøamycZ/abiblioteket i retrovirusform ble deretter trasduert inn i H2-Ld uttrykkende P815 celler, som deretter ble benyttet som målceller for å stimulere en antigenspesifikk T-cellelinje.

En Cfr/amyd/aspesifikk mus H2<d>begrenset CD8+ T-cellelinje ble ekspandert i kultur ved gjentatte runder med stimulering med bestrålet c. trachomatismfiserte J774 celler og bestrålete syngene miltceller, som beskrevet av Starnbach, M., i J. Immunol, 753:5183, 1994. Denne C/7/amyc//'a-spesifikke T-cellelinje ble benyttet for å skrine det ovenfor nevnte Chlamydia genomiske bibliotek uttrykket av de retrovirus-transduserte P815 celler. Positive DNA grupper ble identifisert ved dektsjon av IFN-y produksjon ved å bruke Elispot analyse (se Lalvani et al., J. Experimental Medicine 786:859-865, 1997).

To positive grupper, benevnt 2C7 og 2E10, ble identifisert ved hjelp av IFN-y Elispot analyser. Stabile transduktanter av P815 celler fra gruppe 2C7 ble klonet ved begrensende fortynning, og individuelle kloner ble utvalgt basert på deres evne til å fremskaffe IFN-y produksjon fra den C/?/amyc//'a-spesifikke CTL cellelinje. Fra denne skrining ble fire positive kloner utvalgt, benevnte 2C7-8, 2C7-9, 2C7-19 og 2C7-21. På samme måte ble den postive gruppe 2E10 videre analysert, som førte til en ytterligere positiv klone, som inneholder tre inserter. De tre inserter er fragmenter av CT016, tRNA syntase og clpX genene (henholdsvis SEQ ID NO: 268-270).

Transgent DNA fra disse fire positive 2C7.8 kloner ble amplifisert med PCR ved bruk av pBIB-KS spesifikke primere for selektrivt å amplifisere Chlamydia DNA insertet. Amplifiserte inserter ble renset med gelektroferese og sekvensert. En immunreaktiv klone, 2C7-8 (SEQ ID NO: 15, med den forutsagte aminsoyresekvens gitt i SEQ ID NO: 32) er et 160 bp fragment med homologi til nukletoidene 597304-597145 i Chlamydia trachomatis, serovar D (NCBI, BLASTN search; SEQ ID NO: 33, med den forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 34). Sekvensen til klone 2C7-8 kartlegges innen to mulige åpne leserammer fra regionen med høy homologi som er beskrevet like ovenfor, og spesielt en av disse mulige åpne leserammer, som består av et 298 aminosyrefragment SEQ ID NO: 16, med den forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 17), ble vist å fremvise immunologisk aktivitet.

Full-lengde kloning av det 298 aminosyrefragment (benevnt som CT529 og/eller Cap1 genet) fra serovar L2 ble fremskaffet ved hjelp av PCR amplifikasjon ved å bruke 5-ttttgaagcaggtaggtgaatatg (fremover) (SEQ ID NO: 159) og 5'-ttaagaaatttaaaaaatccctta (revers) (SEQ ID NO: 160) primere, ved bruk av renset c. trachomatis L2 genomisk DNA som templat. Dette PCR produkt ble renset med gelelektroferese, klonet inn i pCRBIunt (Invitrogen Carlsbad, CA) for sekvensering, og deretter subklonet inn i EcoRI setet til pBIB-KMS, et derivat av pBIB-KS til ekspresjon. Chlamydia pneumoniae homologen til CT529 er vist i SEQ ID NO: 291, med den tilsvarende aminosyresekvens fremvist i SEQ ID NO: 292.

Full-lengde DNA som koder for ulike CT529 serovarianter, ble amplifisert med PCR fra bakterielle lysater som inneholdt 10<5>IFU, i hovedsak som beskrevet (Denamur, E., C. Sayada, A. Souriau, J. Orfila, A. Rodolakis og J. Elion, 1991, J. Gen. Microbiol. 137:2525). De følgende serovarianter ble amplifisert som beskrevet: Ba (SEQ ID NO: 134, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 134), E (BOUR) og E (MTW447) (SEQ ID NO: 122, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 123, F (NI1) (SEQ ID NO: 128, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 129), G (SEQ ID NO: 126, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 127), la (SEQ ID NO: 124, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO. 125), L1 (SEQ ID NO: 130, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 131), L3 (SEQ ID NO: 132, med den tilsvarende forutsagte aminosyreskvens gitt i SEQ ID NO: 133), I (SEQ ID NO: 263, med tilsvarende forutsagt aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 264), K (SEQ ID NO: 264, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 166), og MoPn (SEQ ID NO: 136, med den tilsvarende forutsagte aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 137). PCR reaksjoner ble utført med Advantage Genomic PCR Kit (Clontech, Palo Alto, CA) ved å bruke primere som er spesifikke for serovar L2 DNA (eks ernt for ORF). Primersekvenser var 5'-ggtataatatctctctaaattttg (fremover-SEQ ID NO: 161) og 5'-agataaaaaaggctgtttc' (revers- SEQ ID NO: 162) med unntak av MoPn som krevde 5-ttttgaagcaggtcaggtgaatatg (fremover-SEQ ID NO: 163) og 5-tttacaataagaaaagctaagcactttgt (revers-SEQ ID NO: 164). PCR amplifisert DNA ble renset med QIAquick PCR rensningskit (Qiagen, Valencia, CA) og klonet i pCR2,1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) for å sekvenseres.

Sekvensering av DNA avledet fra PCR amplifiserte inserter av de immunreaktive kloner ble gjort på en automatisert sekvenseringsmaksin (ABI 377) ved bruk både av pBIB-KS spesifikkfremoverprimer 5-ccttacacagtcctgctgac (SEQ ID NO: 165) og en reversprimer 3'-gtttccgggccctcacattg (SEQ ID NO: 166). PCRBIunt klonet DNA som koder for CT529 serovar L2 og pCR2,1 klonet DNA som koder for CT529 serovar Ba, E (BOUR), E (MTW447), F (NM), G, la, K, L1, L3 og MoPn ble sekvenser ved å bruke 17 promotorprimer og universale M13 forover og M13 reversprimere.

For å bestemme om disse to mulige åpne leserammer (SEQ ID NO: 16 og 20) kodet for et protein som hadde en assosiert immunologisk funksjon, ble overlappende peptider (17-20 aminosyre lengder) som dekket lengden til de to åpne leserammer syntetisert, som beskrevet i eksempel 3. Et standard kromfrisettingsassay ble benyttet for å bestemme prosent spesifikk lyse av peptidstimulert H2<d>begrensete målceller. I dette assay ble P815 celler (H2<d>) merket ved 37°C i en time med 100^Ci med 51 Cr i nærvær eller fravær av 1fag/ml av de indirekte peptider. Etter den inkubering ble merkete P815 celler vasket for å fjerne overskudd av<51>Cr og peptid, og deretter platet i duplikat inn i mikrokulturplater med en konsentrasjon på 1,000 celler/brønn. Effektor CTL (Ctøamyc//'a-spesifikke CD8 T-celler) ble tilsatt i de angitte effektor:målratioer. Etter 4 timers inkubering ble supernatanter høstet og målt ved hjelp av gammamåling for å kvantifisere frisetting av<51>Cr i supernatanten. To overlappende peptider fra den 298 aminosyre åpne leseramme ført spesifikt til stimulering av CTL linjen. Peptiden som er representert i SEQ ID NO: 138-156, ble syntetisert, over representerertranslasjon av L2 homologen til serovar D åpen leserammen til CT529 (Cap1 genet) og 216 aminosyre åpen leseramme. Som vist i fig. 3, hadde peptidene CtC7,8-12 (SEQ ID NO: 18, også henvist til som Cap1#132-147, SEQ ID NO: 139) og CtC7,8-13 (SEQ ID NO: 19, også benevnt som Cap1#138-155, SEQ ID NO: 140) evne til å fremkalle henholdsvis 38 ti 52% spesifikk lyse, med en effektor til målratio på 10:1. Interessant inneholdt overlappingen mellom disse to peptider et forutsagt H2<d>(Kd og L<d>) bindingspeptid. Et 10 minosyrepeptid var syntetisert for å tilsvare denne overlappende sekvens (SEQ ID NO: 31) og ble funnet å frembringe en sterk immunrespons fra anW- Chlamydia CTL linjen målt ved elispotanalyse. Søking av de mest ferske GenBank databaser viste intet protein som tidligere er blitt beskrevet med henblikk på dette genet. Derfor definerer den mulige åpne leseramme som koder for klone 2C7-8 (SEQ ID NO: 15) et gen som omfatter et antigen fra Chlamydia som har evne til å stimulere antigenspesifikke CD8+ T-celler på en MHC-1 begrenset måte, som viser at dette antigen kunne benyttes for å utvikle en vaksine mot Chlamydia.

For å bekrefte disse resultater og videre kartlegge epitopen, ble forkortete peptider (SEQ ID NO: 137-156) lavet og testet med henblikk på gjenkjennelse av T-cellene i et IFN-g ELISPOT assay. Forkortelse av enten Ser139 (Cap1#140-17, SEQ ID NO: 146) eller Leu147 (Cap1#138-146, SEQ ID NO: 147) opphever gjenkjennelse avT-celler. Disse resultater indikerer at nonamerpeptidet Cap1#139-147 (SFIGGITYL, SEQ ID NO: 145) er den minimale epitop som gjenkjennes av de Ctøamyc//a-spesifikke T-celler.

Sekvenstilpasning av Cap1 (CT529) fra utvalgte serovarianter av c. trachomatis (SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 og 139) viseren av

aminosyreforskjellene funnet i posisjon 2 i den foreslåtte epitop. Det homologe serovar D peptid er SIIGGITYL (SEQ ID NO: 168). Evnen som SFIGGITYL og SIIGGITYL har i å målreltte celler for gjenkjennelse de C/7/amyc//a-spesifikke T-celler, ble sammenlignet. Seriefortynninger av hvert peptid ble inkubert med P815 celler og testet med henblikk på gjenkjennelse av T-cellene i et 51Cr frisettingsassay, som beskrevet over. De Ctøamyd/a-spesifikke T-celler gjenkjente serovar L2 peptidet ved en minimal konsentrasjon på 1 nM og serovar D peptidet ved en minimal konsentrasjon på 10 nM.

Videre studier har vist at en Cap1#139-147-spesifikk T-celleklone gjenkjenner c. fracftomaf/sinfiserte celler. For å bekrefte at Cap1139-147er presentert på overflaten av C/?/amyc//a-infiserte celler, ble Balb-3T3 (H-2<d>) celler infisert med c. trachomatis serovar L2 serovar og testet for å bestemme om disse celler blir gjenkjent av en CD8+ T-celleklone som er spesifikk for Cap1#139-147 epitop (SEQ ID NO: 145). T-celleklonen spesifikk for Cap1#139-147 epitopen ble frembrakt ved begrensende fortynning av linje 69 T-cellene. T-celleklonen gjenkjente spesifikt de CWamycZ/a-infiserte celler. I disse eksperiment var målcellene infisert med c. trachomatis (positive kontroller) eller ikke-identifiserte Balb/3T3 celler, som viste 45%, 36% og 30% spesifikk lysis ved henholdsvis 30:1, 10:1 og 3:1 effektor til målratio, eller Cap1#139-147 epitop (SEQ ID NO: 145) dekket, eller ubehandlete P815 celler, som viste 83%, 75% og 58% spesifikk lysis ved henholdsvis 30:1, 10:1 og 3:1 effektor til målratioer (negative kontroller har mindre enn 5% lysis i alle tilfeller). Disse resultater antyder at epitopen er presentert under infeksjon.

In vivo studier viser at Cap1#139-147 epitopspesifikke T-celler blir forberedt under museinfeksjon med c. trachomatis. For å bestemme om infeksjon med c. trachomatis forbereder en Cap1 #139-147 epitopspesifikk T-cellerespons, ble mus infisert i.p. med 108 IFU med c. trachomatis serovar L2. To uker etter infeksjon ble musene avlivet og miltceller ble stimulert på bestrålete syngene miltceller som var pulset med Cap1#139-147 eptioppeptid. Etter 5 dags stimulering ble kulturene benyttet i et standard<51>Cr frisettingsassay for å bestemme om det var Cap1#139-147 epitopspesifikke T-celler til stede i kulturen. Spesifikt ga miltceller fra en mus immunisert med c. trachomatis serovar L2 eller en kontrollmus injisert med PBS etter en 5 dags dyrking med Cap1#139-147 peptiddekket syngene miltceller og CD8+ T-celler som har evne til spesifikt å gjenkjenne Cap1#139-147 epitop henholdsvis 73%, 60% og 32% spesifikk lyse ved 30:1, 10:1 og 3:1 effektor til målratioer. Kontrollmusen hadde prosent lysis på omtrent 10% ved en 30:1 effektor til målratio, og dette sank jevnt med mindre effektor til mål fra ratio. Målceller var Cap1 #139-147 peptiddyrkete eller ubehandlete P815 celler. Disse resultater antyder at Cap1 #139-147 peptidspesifikke T-celler blir forberedt under museinfeksjon med c. trachomatis.

EKSEMPEL 5

DANNELSE AV ANTISTOFF OG T-CELLERESPONSER HOS MUS

SOM ER IMMUNISERT MED CHL>WDYMANTIGENER

Immunogenisitetsstudier ble utført for å bestemme antistoff og CD4+ T-celleresponsen hos mus immunisert med enten renset SWIB eller S13 proteiner formulert med Montanide adjuvans, eller DNA-baserte immuniseringer med pcDNA-3 ekspresjonsvektorer som inneholder DNA sekvensene for SWIB eller S13. SWIB blir også benevnt som klone 1-B1-66 (SEQ ID NO: 1, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 5), og S13 ribosomalt protein ble også benevnt klone 10-C10-31 (SEQ ID NO: 4, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 12). I det første eksperiment ble grupper på tre C57BL/6 mus immunisert to ganger og fulgt med henblikk på antistoff og CF4+ T-celleresponser. DNA immuniseringer ble gjort intradermalt ved basis av hale, og polypeptidimmuniseringene ble tilført subkutant. Resultatene fra standard 3H-inkorporeringsanalyser av miltceller fra immuniserte mus viste en sterk proliferasjonsrespons fra gruppen som ble immunisert med renset rekombinant SWIB polypeptid (SEQ ID NO: 5). Videre analyse av cytokininduksjons-responser, som tidligere beskrevet, viste at gruppen som var immunisert med SWIB polypeptid, produserte en målbar IFN-y og IL-4 respons. Følgende ELISA-baserte analyser for å bestemme den dominerende antistoffisotyperespons i den eksperimentelle gruppe som var immunisert med SWIB polypeptid, ble utført. Fig. 4 viser at den SWIB-immuniserte gruppe ga en humoral respons som i hovedsak var lgG1.

I et annet eksperiment ble C3H mus immunisert tre ganger med 10^g renset SWIB protein (også benevnt som klone 1-B1-66, SEQ ID NO: 5) formulert i enten PBS eller Montanide med tre ukers intervaller og høstet to uker etter den tredje immunisering. Antistofftitere rettet mot SWIB proteinet ble bestemt ved hjelp av standard ELISA-baserte fremgangmåter som er vel kjent i faget, og viste at SWIB proteinet formulert med Montanide adjuvans førte til en sterkt humoral immunrespons. T-celleproliferative responser ble bestemt med et XTT-basert assay (Scudiero, et al, Cancer Research, 1988, 48:4827). Som vist i fig. 5, frembrakte miltceller fra mus immunisert med SWIB polypeptidet pluss Montanide en antigenspesifikk proliferativ respons. I tillegg ble evnen til splenocyter fra immuniserte dyr i å frisette IFN-y som respons til løselig rekombinant SWIB polypeptid bestemt ved å bruke cytokininduksjonsanalysen som er tidligere beskrevet. Splenocytene fra alle dyrene i gruppen som immunisert med SWIB polypeptid formulert med montanide adjuvans, frisatte IFN-y som respons til eksponering overfor SWIB C/7/amyc//a-antigenet, noe som demonstrerte en CWam<y>cZ/a-spesifikk immunrespons.

I et videre eksperiment ble C3H mus immunisert ved tre separate tidspunkter ved halebasis med 10^g renset SWIB eller S13 protein (c. trachomatis, SWIB protein, klone 1-B1-66, SEQ ID NO: 5, og S13 protein, klone 10-C10-31, SEQ ID NO: 4) formulert med SBAS2 adjuvans (SmithKline Beechham, London, England). Antigenspesifikk antistofftiter ble målt ved hjelp av ELISA, og viste at begge polypeptider induserte en sterkt IgG respons, som varierte i titer fra 1x10-<4>til 1 x 10"<5>. lgG1 og lgG2a komponentene av denne respons var til stede i omtrent like mengder. Antigenspesifikke T-celleproliferasjonsresponser, bestemt ved standard 3H-inkorporeringsanalyser på miltceller isolert fra immuniserte mus, var meget sterkt for SWIB (50,000 cpm over den negative kontroll) og ytterligere sterkere for S13 (100,000 cpm over den negative kontroll). IFNy produksjonen ble analysert med standard ELISA fremgangsmåter fra supernatant fra den prolifererende kultur. In vitro restimulering av kulturen med S13 protein induserte høye nivåer av IFNy produksjon, omtrent 25 ng/ml mot 2 ng/ml fra den negative kontroll. Restimulering med SWIB protein induserte også IFNy, men i en mindre grad.

I et relatert eksperiment ble C3H mus immunisert ved tre forskjellige tidspunkter med 10^g renset SWIB eller S13 protein (c. trachomatis, SWIB protein, klone-1-B1-66 SEQ ID NO: 5, og S13 protein, klone 10-C10-31, SEQ ID NO: 4) blandet opp med 10 \ ig koleratoksin. Slimhinneimmunisering ble utført med intranasal inokulering. Antigenspesifikke antistoffresponser ble bestemt med standard ELISA fremgangsmåter. Antigenspesifikke IgG antistoff var til stede i blodet til SWIB-immuniserte mus, med titere som varierte fra 1 x 10"<3>til 1 x 10-<4>, men ikke påvisbare i dyr immunisert med S13. Antigenspesiefikke T-celleresponser fra isolerte miltceller, som målt med IFNy produksjon, ga lignende resultater med de som er beskrevet umiddelbart over etter systemisk immunisering.

En dyrestudie ble utført for å bestemme immunogenisiteten til CT529 serovar LGVII CTL epitopen, definert av det CT529 dekamer konsensus peptid (CSFIGGITYL - SEQ ID NO: 31), som ble identifisert som en H2-Kd begrenset CTL epitop. BALB/c mus (3 mus pr. gruppe) ble immunisert tre ganger med 25^g peptid kombinert med ulike adjuvanser. Peptidet ble tilført systemisk ved halebasen i enten SKB adjuvanssystem SBAS-2", SBAS-7 (SmithKline Beecham, London, England) eller Montanide. Peptidet ble også tilført intranasalt blandet opp med 10^g koleratoksin (CT). Native mus ble benyttet som kontroll. Fire uker etter den tredje immunisering ble miltceller restimulert med lipopolysakkarid (LPS)-støt og pulset med 10^g/ml CT529 dekamer konsensus-peptid ved tre ulike effektorer til LPS-støt ratioer: 6, 1,5 og 0,4 ved 1 x 10<6>celler/ml. Etter 2 restimuleringer ble effektorceller testet med henblikk på deres evne til å oppløse peptidpulsete P815 celler ved bruk av et standard kromfrisettingsassay. Et ikke relevant peptid fra kyllingeggovalbumin ble benyttet som en negativ kontroll. Resultatene demonstrerer at en signifikant immunrespons var frembrakt mot CT529 dekamer konsensuspeptidet og at antigenspesifikke T-celler som har evne til å løse opp peptistimulerte målceller, ble fremskaffet som respons til immunisering med peptid. Spesifikt ble antigenspesifikke oppløsningsaktiviteter funnet i de SBAS-7 og CT tilsatte grupper, mens Montanide og SBAS-2" ikke støttet opp om CTL epitopimmuniseringen.

EKSEMPEL 6

EKSPRESJON OG KARAKTERISERING AV

CHLAMYDIA PNEUMONIAEGENER

Den humane T-cellelinje, TCL-8, beskrevet i eksempel 1, gjenkjenner Chlamydia trachomatis samt også Chlamydia pneumoniamfiserte monocytavledete dendritceller, noe som antyder at Chlamydia trachomatis og pneumonia kan kode for kryssreaktive T-celleepitoper. For å isolere de Chlamydia pneumoniagener som er homologe til Chlamydia trachomatis LGV II klone 1B1-66, også benevnt som SWIB (SEQ ID NO: 1) og klone 19C19-31, også benevnte som S13 ribosomalt protein (SEQ ID NO: 4) ble HeLa 229 celler infisert med c. pneumoniastamme TWAR (CDC/CWL-029). Etter tre dagers inkubering ble de c. pneumoniamfiserte HeLa celler høstet, vasket og resuspendert i 200fal vann og varmet opp i et kokende vannbad i 20 minutter. Ti mikroliter av den oppbrutte cellesuspensjon ble benyttet som PCR templat. C. pneumon/aspesifikke primere ble lavet for klonene 1B1-66 og 10C10-31 slik at den 5' ende hadde en 6X-histidinserie og et Nde I sete satt inn, og den 3' ende hadde stoppkodon og et BamHI sete inkludert (fig. 6). PCR produktene ble amplifisert og sekvensert med standard teknikker som er vel kjente i faget. De c. pneumonia-spesifikke PCT produktene ble klonet i ekspresjonsvektoren pET17B (Novagen, Madison, Wl), og transfektert inn i E. coli BL21 pLysS for ekspresjon og deretter følgende rensning ved å bruke histidin-nikkel kromatografimetoden gitt av Novagen. To proteiner fra c. pneumonia ble således produsert, et 10-11 kDa protein benevnt som CpSWIB (SEQ ID NO: 27, og SEQ ID NO: 78 med en 6 histidinserie, med de korresponderende aminosyresekvenser gitt i henholdsvis SEQ ID NO: 28), et 15 kDa protein benevnt som CpS13 (SEQ ID NO: 29, og SEQ ID NO: 77, med en 6 histidinserie, med den tilsvarende aminosyreskevens gitt i henholdsvis SEQ ID NO: 30 og 91).

EKSEMPEL 7

INDUKSJON AV T-CELLEPROLIFERASJON OG INTERFERON-y

PRODUKSJON AV CHLAMYDIA PNEUMONIAEAHT\ GENER

Evne som rekombinante Chlamydia pneumoniaeantlgener har i å indusere T-celleproliferasjon og interferon-y produksjon blir bestemt som følger.

Proteiner blir indusert av IPTG og renset ved hjelp av Ni-NTA agaroseaffinitetskromatografi (Webb et al., J. Immunology 757:5034-5041, 1996). De rensete polypeptider blir deretter undersøkt med henblikk på evnen til å indusere T-celleproliferasjon i PBMC preparater. PBMC fra c. pnewmon/aepasienter samt også fra normale donorer hvis T-celler er kjent å proliferere som respons til Chlamydia-antigener, blir dyrket i medium som omfatter RPMI 1640 supplementert med 10% sammenslått humant serum og 50fag/ml gentamicin. Rensete polypeptider blir tilsatt i duplikat i konsentrasjoner på 0,5 til 10 ng/ml. Etter seks dagers dyrking av kulturen i 96 brønns rundbunnete plater i et volum på 200fal, blir 50fal medium fjernet fra hver brønn for å bestemme IFN-y nivåer, som beskrevet nedenfor. Platene blir deretter tilsatt pulser med 1 jaCi/brønn av tritiert tymidin i videre 18 timer, høstet, og tritiumopptak blir bestemt ved bruk av en gass-scintillasjonsteller. Fraksjoner som fører til polyferering i begge replikater som er større enn tre ganger polyfereringen observert i celler dyrket i medium alene, blir vurdert som positive.

IFN-y ble målt ved å bruke et enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA). ELISA platene blir dekket med et musemonoklonalt antistoff rettet mot humant IFN-y (PharMingen, San Diego, CA) i PBS i fire timer ved romtemperatur. Brønner blir deretter blokket med PBs som inneholder 5% (vekt/volum) fettfri tørrmelk i 1 time ved romtemperatur. Platene blir vasket seks ganger i PBS/0,2% TWEEN-20, og prøvene blir fortynnet 1:2 i dyrkingsmeidum i ELISA platene blir inkubert over natten ved romtemperatur. Platene blir vasket igjen, og et polyklonalt kanin antihumant IFN-y serum fortynnet 1:3000 i PBS/10% normalt geiteserum blir tilsatt hver brønn. Platene blir deretter inkubert i to timer ved romtemperatur, vasket, og pepperrot peroksidase-koblet antikanin IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) blir satt ved en fortynning på 1:2000 i PBS/5% fettfri tørrmelk. Etter en videre to timers inkubering ved romtemperatur blir platene vasket, og TMB substrat blir tilsatt. Reaksjonen stoppes etter 20 min. med 1 N svovelsyre. Optisk tetthet blir bestemt ved 450 nm, og bruk av 570 nm som referanse bølgelengde. Fraksjoner som fører til i begge replikater at en OD oppstår som er to ganger større enn gjennomsnitt OD fra celler dyrket i medium alene, pluss 3 standard avvik, blir vurdert som positive.

En human anW- Chlamydia T-celleline (TCL-8) som har evne til å kryssreagere med c. trachomatis og c. pneumonia ble benyttet for å bestemme om de uttrykkete proteiner som beskrevet i eksemplet over (dvs. CpSWIB, Seq ID NO: 27, og SEQ ID NO: 78, med en 6X histidinsekvens, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i henholdsvis SEQ ID NO: 28, og det 15 kDa proteinet benevnt som CpS13 SEQ ID NO: 29, og SEQ ID NO: 77, med en 6X histidinrekke, med de tilsvarende aminosyresekvenser gitt i henholdsvis SEQ ID NO: 30 og 91), hadde T-celleepitoper som var felles for både c. trachomatis og c. pneumonia. I korthet ble E. coli som uttrykket C/?/amyc//'a-proteiner, titrert på 1 x 10<4>monocytavledete dendritiske celler. Etter to timer ble dendritcellekulturene vasket og 2,5 x 10<4>T-celler (TCL-8) tilsatt og tillatt å inkubere i ytterligere 72 timer. Mengde av INF-y i kultursupernatanten ble deretter bestemt med ELISA. Som vist i fig. 7A og 7B, gjenkjente TCL-8 T-cellelinjen spesifikt det S13 ribosomale protein fra både c. trachomatis og c. pneumonia som demonstrert med antigen-spesifikk induksjon av IFN-y, mens bare SWIB proteinet fra c. trachomatis ble gjenkjent av T-cellelinjen. For å bekrefte disse resultater, ble T-celleeptiopen til c. trachomatis identifisert med epitopkartlegging ved å bruke målceller som var blitt stimulert med en serie med overlappende peptider og T-cellelinjen TCL-8.<3>H-tymidin inkorporeringsanalyser viste at peptidet, benevnt som C.t.SWIB 52-67, fra SEQ ID NO: 39 ga den sterkeste proliferasjon av TCL-8 linjen. De homologe peptidene som korresponderte til SWIB fra c. pneumon/aesekvensen (SEQ ID NO: 40), topoisomerase-SWIB-fusjonen til c. pneumoniae- SW\ B fusjonen til c. pneumoniae (SEQ ID NO: 43) og c. trachomatis (SEQ ID NO: 42) samt også det humane SWI domenet (SEQ ID NO: 41) ble syntetisert og undersøkt i de ovenfor beskrevne assays. T-cellelinjen TCL-8 gjenkjente bare c. fracftomaf/speptidet til SEQ ID NO: 39, og ikke det tilsvarende c. pneumon/aepeptidet (SEQ ID NO: 40), eller de andre tilsvarende peptider beskrevet over (SEQ ID NO: 41-43).

Ctøamyc//a-spesifikke T-cellelinjer ble fremstilt fra donor CP-21 med en positiv serumtiter mot c. pneumoniae ved å stimulere donor PBMC med enten c. trachomatis eller c. pneumoniaemfiserte monocytavledete dendritiske celler. T-celler produsert mot c. pneumoniae responderte på rekombinanten c. penumoniae- S\ N\ B, men ikke c. trachomatis- S\ N\ B, mens T-cellelinjen produsert mot c. trachomatis ikke responderte mot verken c. trachomatis- eller c. pneumoniae- S\ N\ B (se fig. 9). Den c. pneumoniae-SWIB spesifikke immunrespondstil donor CP-21 bekrefter c. pneumon/aeinfeksjonen og indikerer frembringing av c. pneumoniae- S\ N\ B spesifikke T-celler under in vivo c. penumoniaemfekspn.

Epitopkartlegging av T-celleresponsen til c. pneumoniae- S\ N\ B har vist at Cp-SWIB-spesifikke T-celler responderte på de overlappende peptidene Cp-SWIB 32-51 (SEQ ID NO: 101) og Cp-SWIB 37-56 (SEQ ID NO: 102), noe som indikerer en c. pne<y>mon/ae-SWIB-spesifikkT-celleepitop Cp-SWIB 37-51 (SEQ ID NO: 100).

I ytterligere eksperimenter ble T-cellelinjer produsert fra donor CP1 også en c. pneumoniae seropositiv donor, ved å stimulere PBMC med ikke-infeksiøse elementær-partikler fra henholdsvis c. trachomatis og c. pneumoniae. Spesifikt ble poroliferative responser bestemt ved å stimulere 2,5 x 10<4>T-celler i nærvær av 1 x 10<4>monocytavledete dendritiske celler og ikke-infeksiøse elementærlegemer avledet fra c. trachomatis og c. penumoniae, eller enten rekombinant c. tranchomatis eller c. pfenumoniae SWIB protein. T-celleresponsen mot SWIB lignet på resultatene fremskaffet med T-cellelinjer fra CP-21 i c. penumoniae- SW\ B, men ikke c. trachomatis-SWIB fremkalte en respons av c. pneumoniae T-cellelinjen. I tillegg ga ikke c. trachomatis T-cellelinjen noen proliferasjon som respons på enten c. trachomatis eller c. pneumoniae SWIB, selv om den prolifererte i respons til både CT og CP elementærlegemer. Som beskrevet i eksempel 1, har klone 11-C12-91 (SEQ ID NO: 63), identifisert ved bruk av TCP-21 cellelinjen, et 260 bp insert som er del av OMP2 genet (CT443) og deler homologi med det 60 kDa cysteinrike ytre membranprotein til c. pneumoniae benevnt som OMCB. For videre å definere den eller de reaktive epitoper, ble epitopkartleggingen utført med en serie med overlappende peptider og immunoanalysen som er beskrevet tidligere. I korthet ble proliferende responser bestemt ved å stimulere 2,5 x 10<4>TCP-21 T-celler i nærvær av 1 x 10<4>monocytavledete dendritiske celler med enten ikke-infeksiøse elementærlegemer avledet fra c. trachomatis og c. pneumoniae, eller peptider avledet fra proteinsekvensen til c. trachomatis eller c. pneumoniae OMCB proteinet (0,1 \ ig/ m\). TCT-21 T-cellene responderte på epitopene CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190, CT-OMCB #171-186, og til en mindre grad til CT-OMCB #176-186 (henholdsvis SEQ ID NO: 249-252). Av interesse er at TCP-21 T-cellelinjen også ga en proliferasjonsrespons til det homologe c. pneumoniaepept\ d CT-OMCB # 171-186 (SEQ ID NO: 253), som var lik eller større enn responsen overfor peptidene fra c. trachomatis. Aminosyresubstisjoner i posisjon to (dv.s asparaginsyre for glutaminsyre) og i posisjon fire (dvs. cystein for serin) endret ikke den proliferative respons til T-cellene og demonstrerer derfor at denne epitop kan være en kryssreaktivepitop med c. trachomatis og c. penumoniae.

EKSEMPEL 8

IMMUNRESPONSER I HUMANE PBMC OG T-CELLELINJER MOT

CHMMYDM-ANTIGENER

De eksemplene som er gitt her, antyder at det er en populasjon med friske donorer i den generelle populasjon som er blitt infisert med c. trachomatis og frembrakt en beskyttende immunrespons som kontrollerer c. fracftomaf/sinfeksjonen. Disse donorer forble klinisk asymptomatiske og seronegative med henblikk på c. trachomatis. For å karakterisere immunresponsen til vanlige donorer mot Ctøamyc//a-antigener som hadde blitt identifisert ved hjelp av CD4 ekspresjonskloning, ble PBMC fremskaffet fra 12 friske donorer testet mot et panel med rekombinante cfta/ym/c/aantigener som inkluderte c. tranchomatis-, c. pneumoniae- S\ N\ B og c. trachomatis-, c. penumoniae-S13. Resultatene er sammenfattet i tabell I nedenfor. Alle donorer var seronegative med henblikk på c. trachomatis, mens seks av tolv hadde en positiv titer for c. pneumoniae. Ved å bruke en stimuleringsindeks på >4 som en positiv respons, responderte 11 av 12 av individene på c. fracftomaf/selementærlegemer og 12 av 12 responderte på c. pneumon/aeelementærlegemer. En donor, AD104, responderte på rekombinant c. pneumoniae- SW protein, men ikke på rekombinant c. trachomatis- SIZ proteinet, som indirekte en c. pem/mon/ae-spesifikk respons. Tre av tolv donorer hadde en c. trachomatis- S\ N\ B, men ikke en c. penumoniae- S\ N\ B spesifikk respons, som bekreftet en c. fracftomaf/sinfeksjon. C. trachomatis og c. penumoniae- S~\ Z fremkalte en respons i 8 av 12 donorer, som antydet en CWamycZ/a-infeksjon. Disse resultater viser evnen til SWIB og S13 i å fremkalle en T-cellerespons hos PBMC hos normale studieobjektiver.

CT = Chlamydia trachomatis, CP = Chlamydia penumoniae, EB = Chlamydia-elementærlegemer, Swib = rekombinany Chlamydia Swib protein, S13 = rekombinant Chlamydia S13 protein, IpdA = rekombinant Chlamydia IdpA protein, TSA = rekombinant Chlamydia TSA protein. Verdiene representerer resultater fra standard proliferasjonsanalyser. Proliferative responser ble bestemt ved å stimulere 3 x 10<5>PBMC med 1 x 10<4>monocyt-avledete dendritceller som var pre-inkubert med de respektive rekombinante antigen eller elementærlegemer (EB). Analyser ble høstet etter 6 dager med en<3>H-tymidinpuls i de siste 18 t.

Sl: Stimuleringsindeks

+/-: Sl - 4

+: Sl > 4

++: Sl 10-30

+++: Sl> 30

I en første serie med eksperimenter ble T-cellelinjer fremstilt fra en frisk kvinne (CT-10) som hadde en sykehistorie med genital eksponering for c. trachomatis ved å stimuelre T-celler med c. trachomatis LGV II elementærlegemer som tidligere beskrevet. Selv om studieobjektet var eksponert for c. trachomatis, gjennomgikk hun ikke noen servokonvertering og utviklet ikke kliniske symptomer, noe som antydet at donor CT-10 kan ha utviklet en beskyttende immunrespons mot c. trachomatis. Som vist i fig. 10, responderte en primær C/?/amyc//'a-spesifikk T-cellelinje avledet fra donor CT-10 på c- trachomatis- SW\ B, men ikke c. penumoniae- SW\ B rekombinante proteiner, noe som bekreftet eksponering som CT-10 hadde hatt overfor c. trachomatis. Epitopkartlegging av T-celleresponsen til c. trachomatis- S\ N\ B, viste at denne donor responderte på den samme epitop Ct-SWIB 52-67 (SEQ ID NO: 39) som T-cellelinjen TCL-8, som vist i fig. 11.

Ytterligere T-cellelinjer ble produsert som beskrevet over, fra ulike c. fracftomaf/spasienter. En sammenfatning av pasientenes kliniske profil og proliferasjonsresponser overfor ulike c. trachomatis og c. pneumoniae elementærlegemer og rekombinante proteiner er vist i tabell II.

NGU = ikke-gonokokk uretritt, BV = bakteriell vaginose, CT = Chlamydia trachomatis, CP = Chlamydia penumoniea, EB = Chlamydia elementærlegemer, Swib = rekombinant Chlamydia Swib protein, S13 = rekombinant Chlamydia S13 protein, IpdA = rekombinant Chlamydia IpdA protein, TSA = rekombinant Chlamydia TSA protein. Verdier representerer resultater fra standard proliferasjonsanalyser. Proliferative responser ble bestemt ved å stimulere 3 x 105 PBMC med 1 x IO<4>monocyt-avledete dendritiske celler pre-inkubert med de henholdsvis rekombinante antigener eller elementærlegemer (EB). Analyser ble høstet etter 6 dager med en<3>H-tymidinpuls under de siste 18 timer.

Sl: Stimuleringsindeks

+/-: Sl ~ 4

+: Sl > 4

++: Sl 10-30

+++: Sl > 30

Ved å bruke panelet med asymptomatiske (som definert over) studiobjekter og c. fracftomaf/spasienter, som sammenfattet i tabellene I og II, ble en komplett studie av immunresponsene til PBMC avledet fra de to grupper som var oppført. I korthet ble PBMC fra c. pneumon/apasienter samt også fra normale donorer dyrket i medium som inneholdt RPMI 1640 supplementert med 10% sammenslått humant serum og 50 ng/ml gentamicin. Rensete polypeptider, et panel med rekombinante c/7/aym/c/aantigener deriblant c. trachomatis-, c. pneumoniae- SW\ B og S13, samt også c. trachomatis IpdA og TSA ble tilsatt i duplikat ved konsentrasjoner på 0,5 til 10 ng/ml. Etter seks dagers dykring i 96-brønns rundbunnplater i et volum på 200 \ i\ ble 50 \ i\ fjernet fra hver brønn for å bestemme IFN-y nivåer, som beskrevet nedenfor. Platene ble deretter tilsatt pulser med 1^Cr/brønn med tritiert tymidin i videre 18 timer, høstet, og tritiumopptak ble bestemt ved å bruke en gass-scinitillasjonsteller. Fraksjoner som førte til proliferasjon i begge replikater som var tre ganger større enn proliferasjonen observert i celler dyrket i medium alene, blir vurdert som positive.

Proliferative responser til de rekombinante C/?/amyc//'a-antigener demonstrerte at de fleste av de asymptomatiske donorer og c. fracftomaf/skpasienter gjenkjente c. trachomatis S13 antigenet (8/12), og et flertall av c. fracfromaf/spasientene gjenkjente c. pneumoniae S13 antigenet (8(12), med 4/12 asymptomatiske donorer som også gjenkjente c. pneumoniae S13 antigenet. Seks av tolv av c. fracftomaf/spaisentene og fire av tolv av de asymptomatiske donorer ga også en proliferasjonsrespons på IpdA antigenet til c. trachomatis. Disse resultater demonstrerer at c. trachomatis og c. pneumonia S13 antigenet, c. trachomatis SWIB antigenet og c. trachomatis IpdA antigenet blir gjenkjent av de asymptomatiske donorer, som indikerer at disse antigener ble gjenkjent under eksponering overfor Chlamydia, og en immunrespons ble produsert mot dem. Dette impliserer at disse antigener kan spille en rolle i å gi beskyttende immunitet hos en human vert. I tillegg blir c. trachomatis og c. pneumonia S13 antigenet gjenkjent like bra blant c. fracfromaf/spasientene, noe som indikerer at det kan være eptioper som er delt mellom c. trachomatis og c. penumonia i S13 proteinet. Tabell III sammenfatter resultatene fra disse studier.

En serie med studier ble påbegynt for å bestemme den cellulære immunrespons til korttids T-cellelinjer fremstilt fra asymptomatiske donorer og c. fracftomaf/spasienter. Cellulære immunresponser ble målt med standard proliferasjonsanalyser og IFN-y, som beskrevet i eksempel 7. Spesifikt var de fleste antigener i form av enkelte E. coli kloner som uttrykket C/?/amyc//'a-antigener, selv om noen rekombinante proteiner også ble benyttet i analysene. De enkle E. coli kloner ble titrert på 1 x 10<4>monocytavledete dendritiske celler, og kulturen ble vasket etter to timer, og 2,5 x 10<4>T-celler ble tilsatt. Analysen som brukte de rekombinante proteiner, ble utført som beskrevet tidligere. Proliferasjon ble bestemt etter fire dager med en standard 3H-tymidinpulstilsetting i de siste 18 timer. Induksjon av IFN-y nivå ble bestemt fra kultursupernatanter som ble høstet etter fire dager ved å bruke standard ELISA analyser, som beskrevet over. Resultatene viser at alle c. fracftomaf/santigene testet, med unntak av CT. Swib, fremkalte en proliferasjonsrespons fra en eller flere av de ulike T-cellelinjer fremstilt fra c. fracfromaf/spasienter. I tillegg ble proliferasjonsresponser fremkalt både fra c. fracftomaf/spasientene og asymptomatiske donorer med de følgende Chlamydiagener, CT622, groEL, pmpD, CT610 og rS13.

12G3-83 klonen inneholder også sekvenser til CT734 og CT764 i tillegg til CT622, og disse gensekvenser kan derfor også ha immunoreaktive epitoper. På samme måte inneholder klone 21G12-60 sekvenser til de hypotetiske proteingenene CT229 og CT228 i tillegg til CT875, og 15H2-76 inneholder også sekvenser fra CT812

og CT088, i tillegg til å dele homologi med sycE genet. Klone 11H3-61 inneholder også sekvenser som deler homologi med PGP6-D virulensproteinet.

EKSEMPEL 9

BESKYTTELSESSTUDIER SOM BENYTTER

CHMMYDM-ANTIGENER

Beskyttelsesstudier ble utført hos mus for å bestemme om immunisering med Ctøamyd/a-anitgener kan ha betydning på kjønnssykdommer som resulterer fra C/?/amyc//'a-inokulering. To modeller ble benyttet, en modell med intravaginal inokulering som benytter et humant isolat som inneholder en stamme med Chlamydia psittaci (MTW447), og en modell med intrauterin inokulering som benytter et humant isolat identifisert som Chlamydia trachomatis, servoar F (stamme NM). Begge stammer induserer inflammasjon i den øvre genitaltraktus, som ligner endometritt og salpingitt fremkalt av Chlamydia trachomatis hos kvinner. I det første eksperiment ble C3H mus

(4 mus pr. gruppe) immunisert tre ganger med 100 ng pcDNA-3 ekspresjonsvektor som inneholder c. trachomatis SWIB DNA (SEQ ID NO:1, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 5). Inokuleringer ble gjort ved halebasis for å få systemisk immunisering. To uker etter den siste immunisering ble dyrene behandlet med progesteron og infisert, enten gjennom vagina eller ved injeksjon av inokulet i livmoren. To uker etter infeksjon ble musene avlivet og genitaltraktur ble snittet, farvet og studert histopatologisk. Betennelselsnivå ble vurdert (fra + for meget mild til +++++ for meget alvorlig). Vurderinger som ble gitt for hver enkelt eggleder/eggstokk ble lagt sammen og delt på antall organer som ble studert, for å få en gjennomsnittsvurdering av inflammasjon i gruppen. I modellen for livmorsinokulering viste negativ kontroll immuniserte dyr som fikk bare en tom vektor, konsistent en betennelse med en eggstokk/eggleder gjennomsnittsinflammasjonsgradering på 6,12, i motsatt til 2,62 for gruppen som var immunisert med DNA. I modellen med vaginal inokulering og oppstigende infeksjon hadde negativ kontrollimmuniserte mus en eggstokk/eggleder gjennomsnittbetennelsesvurdering på 8,37, mot 5,00 for den DNA-immuniserte gruppe. I den senere modellen viste de vaksinerte mus også ingen tegn på gjenlukking av eggleder, mens negativ kontrollvaksinerte grupper hadde betennelsesceller i egglederens hulrom.

I et nytt eksperiment ble C3H mus (4 mus pr. gruppe) immunisert tre ganger med 50 ng pcDNA-3 ekspresjonsvektor som inneholder c. trachomatis SWIB DNA (SEQ ID NO: 1, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 5) innkapslet i Poly Lactid co-Glycolid mikrokuler (PLG), immuniseringene ble gjort intraperitonealt. To uker etter den siste immunisering ble dyrene behandlet med progesteron og infisert med inokulering med c. psittaci i vagina. To uker etter infeksjon ble musene avlivet, og genitaltraktur ble snittet, farvet og histopatologisk undersøkt. Inflammasjonsnivået ble vurdert som tidligere beskrevet. Score som var gitt til hver enkelt eggleder/eggstokk, ble lagt sammen og fordelt på antall organer som var studert for å få et gjennomsnitt av betennelse for hele gruppen. Negative kontrollimmuniserte dyr som mottok PLG-innkapslet tom vektor, viste konsistent betennelse med en eggstokk/eggleder gjennomsnittsbetennelsesscore på 7,28 mot 5,71 forden PLG-inkapslete DNA immuniserte gruppe. Betennelse i bukhinnen var 1,75 for den vaksinerte gruppe sammenlignet med 3,75 for kontrollen.

I et tredje eksperiment ble C3H mus (4 pr. gruppe) immunisert tre ganger med 10 ng renset rekombinant protein, enten SWIB (SEQ ID NO: 1, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 5, eller S13 (SEQ ID NO: 4, med den tilsvarende aminosyresekvens gitt i SEQ ID NO: 12) blandet med koleratoksin (CT), preparatet ble tilført intranasalt etter anestesi i et volum på 20fal. To uker etter den siste immunisering ble dyrene behandlet med progesteron og infisert, enten ved vaginal inokulering av c. psittaci eller ved injekson av c. trachomatis serovar F i livmoren. To uker etter infeksjon ble musene avlivet og genitaltraktur ble snittet, farvet og histopatologisk undersøkt. Inflammasjonsgrad ble vurdert som beskrevet. Score som ble gitt til hver enkelt eggleder/eggstokk, ble lagt sammen og del på antall undersøkte organer for å få en gjennomsnittsscure for betennelse for gruppen. I modellen for inokulering i livmoren viste de negativkontrollimmuniserte dyr som fikk bare koleratoksin, en gjennomsnitts-eggstokk/eggleder-betennelsescore på 4,25 (bare 2 mus biel analysert, 2 andre døde) sammenlignet med 5,00 for gruppen S13 pluss koleratoksinimmunisering, og 1,00 for SWIB pluss koleratoksin. Ubehandlete infiserte dyr hadde en gjennomsnittseggstokk-/egglederinflammasjonsscore på 7.1 modellen med inokulering i vagina og oppad-stigende infeksjon hadde negativkontrollimmuniserte mus en eggstokk/eggleder-gjennomsnittsbetennelsesscore på 7,37 mot6,75forden S13 pluss koleratoksinimmuniserte gruppen og 5,37 for den SWIB pluss koleratoksinimmuniserte gruppe. Ubehandlete infiserte dyr hadde en eggstokk/leggledergjennomsnittsbetennelsesscore på 8.

De tre eksperimenter over antyder at SWIB-spesifikk proteksjon kan oppnås. Denne beskyttende effekt er mer markert i modellen med homolog infeksjon, men er fremdeles til stede i en heterolog påvirkningsstimulering med c. psittaci.

Selv om den foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet i betydelig detalj som illustrasjon og eksempel for det formål å gi forståelse, kan endringer og modifikasjoner utføres uten at man fjerner seg fra oppfinnelsens område, som ønskes å bli begrenset utelukkende ved området til de vedlagte patentkrav.

Claims (85)

1. Isolert polypeptid som omfatter en immunogen del av et Chlamydia-antigen, der nevnte antigen omfatter en aminosyresekvens som kodes for av en polynukleotidsekvens utvalgt fra gruppen som består av: (a) sekvenser gitt i SEQ ID NO: 1, 15,21-25,44-64, 66-76, 79-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-290, (b) sekvenser som er komplementære til en sekvens i (a), og (c) polynukleotidsekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (a) eller (b) under moderat stringente betingelser.

2. Polypeptid ifølge krav 1 der polypeptidet omfatter en sekvens utvalgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 5, 26, 32, 65, 90, 92-98,103-108, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 175-180, 189-196, 264 og 266.

3. Isolert polynukleotidmolekyl som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 og 2.

4. Rekombinant ekspresjonsvektor som omfatter et polynukleotidmolekyl ifølge krav 3.

5. Vertscelle transformert med en ekspresjosnvektor ifølge krav 4.

6. Vertscelle ifølge krav 5 der vertscellen blir utvalgt fra gruppen som består av E. coli, gjær og pattedyrceller.

7. Fusjonsprotein som omfatter et polypeptid ifølge ethvert av kravene 1 og 2.

8. Fusjonsprotein ifølge krav 7, der fusjonsproteinet omfatter en ekspresjonsforsterker som øker ekspresjon av fusjonsproteinet i en vertscelle transfektert med et polynukleotid som koder for fusjonsproteinet.

9. Fusjonsprotein ifølge krav 7, der fusjonsproteinet omfatter en T-hjelperepitop som ikke er tilstede i polypeptidet ifølge krav 1.

10. Fusjonsprotein ifølge krav 7, der fusjonsproteinet omfatter et affinitetstilheng.

11. Isolert polynukleotid som koder for et fusjonsprotein ifølge krav 7.

12. Isolert monoklonalt antistoff, eller antigenbindingsfragment fra dette, som spesifikt binder til et CWamycZ/a-protein som omfatter en aminosyresekvens som blir kodet for av en polynukleotidsekvens ifølge krav 1, eller et komplement til noen av de foregående polynukleotidsekvenser.

13. Farmasøytisk forbindelse som omfatter et polypeptid ifølge krav 1, og en fysiologisk akseptabel bærer.

14. Farmasøytisk forbindelse som omfatter et polynukleotidmolekyl ifølge krav 3 og en fysiologisk akseptabel bærer.

15. Farmasøytisk forbindelse som omfatter polypeptid og en fysiologisk akseptabel bærer, der polypeptidet blir kodet for av polynukleotidmolekyl utvalgt fra gruppen som består av: (a) sekvenser beskrevet i SEQ ID NO: 1-4,15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (b) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (a), og (c) sekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (a) eller (b) under moderat stringente betingelser.

16. Farmasøytisk forbindelse som omfatter et polynukleotidmolekyl og en fysiologisk akseptabel bærer der polynukleotidmolekylet omfatter en sekvens utvalgt fra gruppen som består av: (a) sekvenser beskrevet i SEQ ID nO: 1-4, 15, 16,21-25, 27, 29, 33,44-64, 66-88, 110-119, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (b) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (a), og (c) sekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (a) eller (b) under moderat stringente betingelser.

17. En farmasøytisk forbindelse som omfatter en fysiologisk akseptabel bærer og minst én komponent utvalgt fra gruppen som bstår av: (a) et fusjonsprotein ifølge krav 7, (b) et polynukleotid ifølge krav 11, og (c) et antistoff ifølge krav 12.

18. Vaksine som omfatter et polypeptid ifølge krav 1, og en immunstimulant.

19. Vaksine som omfatter et polynukleotidmolekyl ifølge krav 3 og en immunstimulant.

20. Vaksine som omfatter et polypeptid og en immunstimulant, der polypeptidet blir kodet for av en sekvens utvalgt fra gruppen som består av: (a) sekvenser beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15,16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (b) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (a), og (c) sekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (a) eller (b) under moderat stringente betingelser.

21. Vaksine som omfatter et DNA molekyl og en immunstimulant, der DNA molekylet omfatter en sekvens utvalgt fra gruppen som består av: (a) sekvenser beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15,16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (b) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (a), og (c) sekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (a) eller (b) under moderat stringente betingelser.

22. Vaksine som omfatter en immunstimulant og minst én komponent utvalgt fra gruppen som består av: (a) fusjonsprotein ifølge krav 7, (b) polynukleotid ifølge krav 11, og (c) antistoff ifølge krav 12.

23. Vaksine ifølge ethvert av kravene 18-22 der immunstimulanten er et adjuvans.

24. Fremgangsmåte for å indusere beskyttende immunitet hos en pasient, som omfatter tilførsel til en pasient av en farmasøytisk forbindelse ifølge ethvert av kravene 13-17.

25. Fremgangsmåte for å indusere beskyttende immunitet hos en pasient, som omfatter tilførsel til en pasient av en vaksine ifølge ethvert av kravene 18-22.

26. Isolert polyklonalt antistoff, eller antigenbindende fragment fra dette, som spesifikt binder til et Ctøamyd/ a-protein som omfatter en aminosyresekvens som er kodet for av en polynukleotidsekvens ifølge krav 1, eller et komplement av enhver av de foregående polynukleotidsekvenser.

27. Fremgangsmåte for å påvise C/7/amyc//'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter: (a) fremskaffing av en biologisk prøve fra pasienten, (b) tilsetting til prøven et polypeptid som omfatter en immunogen del av CWamyc// 'a-antigen, der nevnte antigen omfatter en aminosyresekvens som kodes for av en polynukleotidsekvens utvlagt fra gruppen som består av: (i) en sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (i), og (iii) polynukleotidsekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betingelser, og (c) påvising av nærvær av antistoff som binder til polypeptidet.

28. Fremgangsmåte for påvising av C/7/amyc//'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter: (a) framskaffing av en biologisk prøve fra pasienten, (b) sammenføring av prøven med et fusjonsprotein som omfatter et polypeptid, der polypeptidet omfatter en immunogen del av et C/7 /amyc// 'a-antigen, der nevnte antigen omfatter en aminosyresekvens som det kodes for av en nukleotidsekvens utvalgt fra gruppen som består av (i) en sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (i), og (iii) polynukleotidsekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betignelser, og (c) påvising nærvær av antistoff som binder til fusjonsproteinet.

29. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 27 og 28 der den biologiske prøve er utvalgt fra gruppen som består av helblod, serum, plasma, spytt, cerebrospinalvæske og urin.

30. Fremgangsmåte for å påvise cft/amyd/ lnfeksjon i en biologisk prøve, som omfatter: (a) blanding av prøven med minst to oligonukleotidprimere i en polymerasekjedereaksjon, der minst en av oligonukleotidprimerne er spesifikk for et polynukleotidmolekyl som omfatter en sekvens fra SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181- 188, 263, 265 og 267-291, og (b) påvising i prøven av en polynukleotidsekvens som amplifiserer i nærvær av oligonukleotidprimerne, derved å påvise C/7 /amyc// 'a-infeksjon.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, der minst én av oligonukleotidprimerne omfatter minst omtrent 10 sammenhengende nukleotider fra en polynukleotidsekvens fra SEQ ID NO: 1-4, 15,16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291.

32. Fremgangsmåte for å påvise C/7/amyc//a-infeksjon i en biologisk prøve, som omfatter: (a) tilsetting til prøven av en eller flere oligonukleotidprober som er spesifikke for et polynukleotidmolekyl som omfatter en sekvens på SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, og (b) påvising i prøven av en polynukleotidsekvens som hybridiserer til oligonukleotidproben, for derved å påvise C/7 /amyc//a-infeksjon.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32 der proben omfatter minst omtrent 15 sammenhengende nukleotider fra en polynukleotidsekvens fra SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291.

34. Fremgangsmåte for påvisning av Ctøamyc//a-infeksjon i en biologisk prøve, som omfatter: (a) blanding av den biologiske prøve med et bindingsmiddel som har evne til å binde til et polypeptid som omfatter en immunogen del av et Chlamydia-antigen, der nevnte antigen omfatter en aminosyresekvens som kodes for av en polynukleotidsekvens utvalgt fra gruppen som består av: (i) sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser som er komplementære til en sekvens av (i), og (iii) polynucleotidskevenser som hybridiserer til en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betingelser, og (b) påvising i prøven av et polypeptid som binder til bindingsmidlet, for derved å påvise Ctøamyd/a-infeksjon i den biologiske prøve.

35. Fremgangsmåte for å påvise C/7 /amyc//a-infeksjon i en biologisk prøve, som omfatter: (a) blanding av den biologiske prøve med et bindingsmiddel som har evne til å binde seg til et fusjonsprotein som omfatter et polypeptid, der polypeptidet omfatter en immunogen del av et C/7 /amyc// a-antigen, der nevnte antigen omfatter en aminosyresekvens som koder for av en polynukleotidsekvens utvalgt fra gruppen som består av: (i) sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4,15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (i), og (iii) polynukleotidsekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betingelser, og (b) påvising i prøven av et polypeptid som binder til bindingsmidlet, og derved påvise Ctøamyc//a-infeksjon i den biologiske prøve.

36. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 34 og 35 der bindingsmidlet er et monoklonalt antistoff.

37. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 34 og 35 der bindingsmidlet er et polyklonalt antistoff.

38. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 34 og 35 der den biologiske prøve er utvalgt fra gruppen som består av helblod, oppspytt, serum, plasma, spytt, cerebrospinalvæske og urin.

39. Et diagnostisk reagenssett som omfatter: (a) polypeptid som omfatter en immunogen del av et CWamyc/Z-antigen, der nevnte antigen omfatter en aminosyresekvens kodet for at en polynukleotidsekvens som er utvalgt fra gruppen som består av: (i) sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser som er komplementære til en sekvens av (i), og (c) polynukleotidsekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betingelser, og (b) påvisningsreagens.

40. Diagnostisk reagenssett som omfatter: (a) fusjonsprotein som omfatter et polypeptid, der polypeptidet omfatter en immunogen del av et CWam <y> c/Za-antigen, der nevnte antigen omfatter en aminosyresekvens som kodes for av en polynukleotidsekvens som er utvalgt fra gruppen som består av: (i) sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4,15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser som er komplementære til en sekvens fra (i), og (iii) polynukleotidsekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betingelser, og (b) deteksjonsreagens.

41. Reagenssettet ifølge kravene 39 eller 40 der polypeptidet er immobilisert på et fast underlag.

42. Reagenssettet ifølge kravene 39 eller 40 der deteksjonsreagenset omfatter en reportergruppe som er bundet til et bindingsmiddel.

43. Reagenssettet ifølge krav 42 der bindingsmidlet blir utvalgt fra gruppen som består av anti-immunoglobulinet, protein G, protein A og lektiner.

44. Reagenssettet ifølge krav 42 der reportergruppen er utvalgt fra gruppen som består av radioaktive isotoper, fluorescerende grupper, luminiscerende grupper, enzymer, biotin og farvepartikler.

45. Diagnostisk reagenssett som omfatter minst to oligonukleotidprimere, der minst én av oligonukleotidprimerne er spesifikke for et polynukleotidmolekyl som omfatteren polynukleotidsekvens fra SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33,44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291.

46. Diagnostisk reagenssett ifølge krav 43, der minst én av oligonukleotidprimerne omfatter minst omtrent 10 sammenhengende nukleotider fra en sekvens fra SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33,44-64, 66-88, 110- 119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291.

47. Diagnostisk reagenssett som omfatter minst én oligonukleotidprobe der oligonukleotidproben er spesifikk for et polynukleotidmolekyl som omfatter en sekvens fra SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291.

48. Reagenssett ifølge krav 47, der oligonukleotidproben omfatter minst omtrent 15 sammenhengende nukleotider fra en polynukleotidsekvens fra SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33,44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291.

49. Diagnostisk reagenssett som omfatter: (a) minst ett antistoff, eller et antigenbindende fragment av dette, ifølge krav 22, og (b) deteksjonsreagens.

50. Fremgangsmåte for å behandle CWamyc// 'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter trinnene: (a) fremskaffe perifere blodceller fra pasienten, (b) inkubere cellen i nærvær av minst ett polypeptid der polypeptidet omfatter en immunogen del av et Cft/amyd/ a-antigen, der nevnte antigenomfatter en aminosyresekvens som kodes for av en polynukleotidsekvens utvalgt fra gruppen som består av: (i) sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser komplentære til en sekvens fra (i), og (iii) polynukleotidsekvenser som hybridiserer til en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betingelser, slik at T-celler proliferer, og (c) tilførsel til pasienten av de prolifererte T-celler.

51. Fremgangsmåte for å behandle CWamyc//'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter trinnene: (a) fremskaffing av perifere blodceller fra pasienten, (b) inkubering av cellene i nærvær av minst ett polynukleotid, som omfatter en polynukleotidsekvens utvalgt fra gruppen som består av: (i) en sekvens beskrevet i SEQ ID NO: 1-4, 15, 16, 21-25, 27, 29, 33, 44-64, 66-88, 110-119, 120, 122, 124, 126, 128 130, 132, 134, 136, 169-174, 181-188, 263, 265 og 267-291, (ii) sekvenser komplementære til en sekvens fra (i), og (iii) polynukleotidsevkenser som hybridiserer med en sekvens fra (i) eller (ii) under moderat stringente betingelser slik at T-celler prolifererer, og (c) tilførsel til pasienten av de prolifererte T-celler.

52. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 50 og 51 der trinnet med å inkubere T-cellene blir gjentatt en eller flere ganger.

53. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 50 og 51 der trinn (a) videre omfatter separering av T-celler fra de perifere blodceller, og der cellene inkubert i trinn (b) er T-cellene.

54. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 50 og 51 der trinn (a) videre omfatter separering av CD4+ eller eller CD8+ T-celler fra de perifere blodceller, og der cellene proliferert i trinn (b) er CD4+ eller CD8+ T-celler.

55. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 50 og 51 der trinn (a) videre omfatter separering av gamma/delta T-lymfocyter fra de perifere blodceller, og cellene som prolifererte i trinn (b) er gamma/delta T-lymfocyter.

56. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 50 og 51 der trinn (b) videre omfatter kloning av en eller flere T-celler som prolifererte i nærvær av polypeptidet.

57. Farmasøytisk forbindelse for behandling av C/7 /amyc// 'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter T-celler proliferert i nærvær av et polypeptid ifølge krav 1, i kombinasjon med en fysiologisk akseptabel bærer.

58. Farmasøytisk forbindelse for behandling av C/7/amyc//'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter T-celler proliferert i nærvær av et polynukleotid ifølge krav 3, i kombinasjon med en fysiologisk akseptabel bærer.

59. Fremgangsmåte for å behandle CWamyc//a-infeksjon hos en pasient som omfatter trinnene: (a) inkubering av antigenpresenterende celler i nærvær av minst ett polypeptid ifølge krav 1, (b) tilførsel til pasienten av de inkuberte antigenpresenterende celler.

60. Fremgangsmåte for å behandle CWamyc//'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter trinnene: (a) introduksjon av minst ett polynukleotid ifølge krav 3 inn i antigen-presenterende celler, (b) tilførsel til pasienten av de antigenpresenterende celler.

61. Fremgangsmåte ifølge krav 59 eller 60 der de antigenpresenterende celler blir utvalgt fra gruppen som består av dendritiske celler, makrofagceller, B-celler, fibroblastceller, monocytceller og stamceller.

62. Farmasøytisk forbindelse for behandling av Cft/amyd/ a-infeksjon hos en pasient, som omfatter antigenpresenterende celler inkubert i nærvær av et polypeptid ifølge krav 1, i kombinasjon med en fysiologisk akspetabel bærer.

63. Farmasøytisk forbindelse til behandling av C/7 /amyc// 'a-infeksjon hos en pasient, som omfatter antigenpresenterende celler inkubert i nærvær av et polynukleotid ifølge krav 3, i kombinasjon med en fysiologisk akseptabel bærer.

64. Polypeptid som omfatter en immunogen del av et C/? /amyc// 'a-antigen, der nevnte immunogene del omfatter en sekvens fra SEQ ID NO: 18, 19, 31, 39, 93-96, 98, 100-102, 106, 108, 138-140, 158, 167, 168, 246, 247 og 254-256.

65. Immunogen eptiop fra et C/7 /amyc// 'a-antigen, som omfatter en sekvens fra SEQ ID NO: 31, 98, 106, 108, 138-140, 158,167, 168, 246, 247 eller 254-256.

66. Isolert polypeptid som omfatter en sekvens beskrevedt i enhver av SEQ ID NO: 5-14, 17-20, 26, 28, 30-32, 34, 39-43, 65, 89-109, 138-158, 167, 168, 224-262, 246, 247, 254-256 og 292.

67. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et isolert polypeptid omfattende: (i) en aminosyresekvens med minst 90% identitet med sekvensen som kodes for av SEQ ID NO:76, 87 eller 280; (ii) et immunogent fragment av aminosyresekvensen som kodes for av SEQ IDNO:76, 87 eller 208; (iii) aminosyresekvensen i SEQ ID NO:290 eller en variant derav som har minst 90% identitet derav; eller (iv) et immunogent fragment av aminosyresekvensen i SEQ ID NO:290.

68. Sammensetning ifølge krav 67, karakterisert ved at den omfatter et isolert polypeptid som omfatter polypeptidsekvensen angitt i SEQ ID NO:290 eller en variant derav som har minst 90% identitet dertil.

69. Sammensetning ifølge krav 68, karakterisert ved at det isolerte polypeptidet består av en aminosyresekvens angitt i SEQ ID NO:290.

70. Sammensetning ifølge krav 68, karakterisert ved at det isolerte polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som har minst 90% identitet med sekvensen som kodes for av SEQ ID NO:76, 87 eller 280.

71. Sammensetning ifølge krav 70, karakterisert ved at det isolerte polypeptidet består av en aminosyresekvens som kodes for av SEQ ID NO:76, 87 eller 280.

72. Sammensetning, karakterisert ved a t den omfatter et isolert polynukleotid, karakterisert ved at det nevnte isolerte polynukleotid omfatter: (i) en polynukleotidsekvens som koder for polypeptidsekvensen angitt i SEQ ID NO:290 eller en variant derav som har minst 90% identitet dertil; eller (ii) nukleotidsekvensen i SEQ ID NO:76, 87 eller 280, eller en variant derav som har minst 90% identititet dertil.

73. Sammensetning ifølge krav 72, karakterisert ved at det isolerte polynukleotidet koder for et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO:290 eller en variant derav som har minst 90% identitet dertil.

74. Sammensetning ifølge krav 73, karakterisert ved at det isolerte polynukleotidet koder for et polypeptid som består av aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO:290.

75. Sammensetning ifølge krav 72, karakterisert ved at det isolerte polynukletotidet omfatter polynukleotidsekvensen i SEQ ID NO:76, 87 eller 280, eller en variant derav som har minst 90% identitet dertil.

76. Sammensetning ifølge krav 75, karakterisert ved a t det isolerte polynukleotidet består av polynukleotidsekvensen i SEQ ID NO:76, 87 eller 280.

77. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et fusjonsprotein, idet nevnte fusjonsprotein omfatter et polypeptid som definert i hvilke som helst av kravene 67-71.

78. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 67-77, karakterisert ved at sammensetningen er en farmasøytisk sammensetning som omfatter en fysiologisk akseptabel bærer.

79. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 67-77, karakterisert ved at sammensetningen er en vaksinesammensetning som omfatter en immunostimulant.

80. Vaksinesammensetning ifølge krav 79, karakterisert ved at immunostimulanten er en adjuvant.

81. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 78 for anvendelse ved indusering av beskyttende immunitet i en pasient.

82. Vaksine ifølge krav 79 eller 80, karakterisert ved at den er for anvendelse for indusering av beskyttende immunitet i en pasient.

83. Polypeptid, karakterisert ved at det omfatter: (i) en aminosyresekvens som har minst 90% identitet med sekvensen som kodes for av SEQ ID NO:76, 87 eller 280; (ii) et immunogent fragment av aminosyresekvensen som kodes for av SEQ IDNO:76, 87 eller 280; (iii) aminosyresekvens i SEQ ID NO:290 eller en variant derav som har minst 90% identitet dertil; eller (iv) et immunogent fragment av aminosyresekvensen i SEQ ID NO:290, for behandling eller forebygging av Chlamydia trachomatis infeksjon.

84. Polynukleotid, karakterisert ved at det koder for et polypeptide som omfatter: (i) en aminosyresekvens som har minst 90% identitiet med sekvensen som kodes for av SEQ ID NO:76, 87 eller 280; (ii) et immunogent fragment av aminosyresekvensen som kodes for av SEQ IDNO:76, 87 eller 280; (iii) aminosyresekvens i SEQ ID NO:290 eller en variant derav som har minst 90% identitet dertil; eller (iv) et immunogent fragment av aminosyresekvensen i SEQ ID NO:290, for behandling eller forebygging av Chlamydia trachomatis infeksjon.

85. Fusjonsprotein, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid som definert i et hvilket som helst av kravene 67-71 for behandling eller forebygging av Chlamydia trachomatis infeksjon.