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ES2346832T3 - Compuestos y metodos para el tratamiento y el diagnostico de una infeccion clamidial. - Google Patents

Compuestos y metodos para el tratamiento y el diagnostico de una infeccion clamidial. Download PDF

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ES2346832T3
ES2346832T3 ES99963037T ES99963037T ES2346832T3 ES 2346832 T3 ES2346832 T3 ES 2346832T3 ES 99963037 T ES99963037 T ES 99963037T ES 99963037 T ES99963037 T ES 99963037T ES 2346832 T3 ES2346832 T3 ES 2346832T3
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ES
Spain
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seq
baselineskip
trachomatis
polypeptide
clone
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ES99963037T
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Inventor
Peter Probst
Ajay Bhatia
Yasir A. W. Skeiky
Steven P. Fling
Shyian Jen
Erica Jean Stromberg
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Corixa Corp
Original Assignee
Corixa Corp
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y (a) un polipéptido aislado que comprende: (i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o (ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o (b) un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido aislado que comprende: (i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o (ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o (c) una proteína de fusión que comprende un polipéptido aislado que comprende: (i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o (ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.

Description

Compuestos y métodos para el tratamiento y el diagnóstico de una infección clamidial.
Campo técnico
La presente invención se refiere de modo general a la detección y al tratamiento de una infección clamidial. En particular, la invención se refiere a polipéptidos que comprenden un antígeno de Chlamydia y al uso de dichos polipéptidos para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección clamidial.
Antecedentes de la invención
Las clamidias son patógenos bacterianos intracelulares que son responsables de una amplia variedad de importantes infecciones humanas y animales. Chlamydia trachomatis es una de las causas más habituales de enfermedades de transmisión sexual y puede conducir a la enfermedad inflamatoria pélvica ("pelvic inflammatory disease", PID), que produce obstrucción de los tubos e infertilidad. Chlamydia trachomatis también puede desempeñar un papel en la infertilidad masculina. En 1990, se calculó que el coste de tratar la PID en EEUU fue de 4 billones de dólares. El tracoma, debido a una infección ocular por Chlamydia trachomatis, es la principal causa de ceguera evitable en el mundo. Chlamydia pneumoniae es una causa importante de infecciones del tracto respiratorio agudas en seres humanos y también se cree que desempeña un papel en la patogénesis de la aterosclerosis y, en particular, de la enfermedad cardíaca coronaria. Se ha demostrado que los individuos con una alta valoración de anticuerpos contra Chlamydia pneumoniae tienen una probabilidad al menos doble de sufrir una enfermedad cardíaca coronaria que los individuos seronegativos. Las infecciones clamidiales, por tanto, constituyen un problema sanitario importante en EEUU y en el mundo.
La infección clamidial a menudo es asintomática. Por ejemplo, cuando una mujer busca atención médica por una PID, ya se ha podido producir una lesión irreversible que produzca infertilidad. Por tanto, en la técnica siguen siendo necesarias vacunas y composiciones farmacéuticas mejoradas para la prevención y el tratamiento de infecciones por Chlamydia. La presente invención satisface esta necesidad y además proporciona otras ventajas relacionadas.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas para su uso en la terapia de una infección por Chlamydia. En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden polipéptidos, en las que los polipéptidos comprenden una porción inmunogénica de un antígeno de Chlamydia, o un variante de dicho antígeno. Ciertas porciones y otros variantes son inmunogénicos, de forma que la capacidad de un variante para reaccionar con antisueros específicos de antígeno no se reduce sustancialmente. Dentro de ciertas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:5 o su variante que tiene al menos 90% de coincidencia con ella. En otras realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:5, 6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tiene al menos 90% de coincidencia con ella.
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden polinucleótidos que codifican un polipéptido como se describió anteriormente, o una porción de éstos (como una porción que codifique al menos 15 restos aminoácidos de una proteína clamidial).
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden proteínas de fusión que comprenden un polipéptido, como se describió anteriormente. Las composiciones farmacéuticas comprenden un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas comprenden un inmunoestimulante.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para fabricar un medicamento para inducir una inmunidad protectora en un paciente, en los que el medicamento puede administrarse a un paciente con una cantidad eficaz de una o más de las anteriores composiciones farmacéuticas o vacunas.
Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras hacer referencia a la siguiente descripción detallada.
Identificadores de las secuencias
La SEQ ID NO:1 es la secuencia de ADN determinada para el clon 1-B1-66 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:2 es la secuencia de ADN determinada para el clon 4-D7-28 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:3 es la secuencia de ADN determinada para el clon 3-G3-10 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:4 es la secuencia de ADN determinada para el clon 10-C10-31 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoácidos predicha para 1-B1-66.
La SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos predicha para 4-D7-28.
La SEQ ID NO:7 es una primera secuencia de aminoácidos predicha para 3-G3-10.
La SEQ ID NO:8 es una segunda secuencia de aminoácidos predicha para 3-G3-10.
La SEQ ID NO:9 es una tercera secuencia de aminoácidos predicha para 3-G3-10.
La SEQ ID NO:10 es una cuarta secuencia de aminoácidos predicha para 3-G3-10.
La SEQ ID NO:11 es una quinta secuencia de aminoácidos predicha para 3-G3-10.
La SEQ ID NO:12 es la secuencia de aminoácidos predicha para 10-C10-31.
La SEQ ID NO:13 es la secuencia de aminoácidos del péptido sintético 1-B1-66/48-67.
La SEQ ID NO:14 es la secuencia de aminoácidos del péptido sintético 1-B1-66/58-77.
La SEQ ID NO:15 es la secuencia de ADN determinada para el clon 2C7-8 de C. trachomatis de serovar LGV II.
La SEQ ID NO:16 es la secuencia de ADN determinada para un primer marco de lectura abierto putativo de C. trachomatis de serovar D.
La SEQ ID NO:17 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por el primer marco de lectura abierto putativo de C. trachomatis de serovar D.
La SEQ ID NO:18 es la secuencia de aminoácidos del péptido sintético CtC7.8-12.
La SEQ ID NO:19 es la secuencia de aminoácidos del péptido sintético CtC7.8-13.
La SEQ ID NO:20 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por un segundo marco de lectura abierto putativo de C. trachomatis de serovar D.
La SEQ ID NO:21 es la secuencia de ADN determinada para el clon 4C9-18 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:22 es la secuencia de ADN determinada homóloga a la lipoamida deshidrogenasa de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:23 es la secuencia de ADN determinada homóloga a la proteína hipotética de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:24 es la secuencia de ADN determinada homóloga a la ubiquinona metiltransferasa de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:25 es la secuencia de ADN determinada para el clon 4C9-18#2 BL21 pLysS de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:26 es la secuencia de aminoácidos predicha para 4C9-18#2 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:27 es la secuencia de ADN determinada para Cp-SWIB de la cepa TWAR de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:28 es la secuencia de aminoácidos predicha para Cp-SWIB de la cepa TWAR de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:29 es la secuencia de ADN determinada para Cp-S 13 de la cepa TWAR de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:30 es la secuencia de aminoácidos predicha para Cp-S 13 de la cepa TWAR de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:31 es la secuencia de aminoácidos para un péptido consenso 10-mero de CtC7.8-12 y CtC7.8-13.
La SEQ ID NO:32 es la secuencia de aminoácidos predicha para el clon 2C7-8 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:33 es la secuencia de ADN determinada de un clon de C. trachomatis de serovar D que muestra homología con el clon 2C7-8.
La SEQ ID NO:34 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia de SEQ ID NO:33.
La SEQ ID NO:35 es la secuencia de ADN para C.p. SWIB Nde (cebador 5') de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:36 es la secuencia de ADN para C.p. SWIB EcoRI (cebador 3') de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:37 es la secuencia de ADN para C.p. S 13 Nde (cebador 5') de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:38 es la secuencia de ADN para C.p. S 13 EcoRI (cebador 3') de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:39 es la secuencia de aminoácidos del péptido CtSwib 52-67 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:40 es la secuencia de aminoácidos del péptido CtSwib 53-68 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:41 es la secuencia de aminoácidos del péptido HuSwib 288-302 del dominio SWI humano.
La SEQ ID NO:42 es la secuencia de aminoácidos del péptido CtSWI-T 822-837 de la fusión de topoisomerasa-SWIB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:43 es la secuencia de aminoácidos del péptido CpSWI-T 828-842 de la fusión de topoisomerasa-SWIB de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:44 es una primera secuencia de ADN determinada para el clon 19783.3,jen.seq(1>509)CTL2#11-3' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 3'.
La SEQ ID NO:45 es una segunda secuencia de ADN determinada para el clon 19783.4,jen.seq(1>481)CTL2#11-5' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:46 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19784CTL2-12consensus.seq(1>427)
CTL2#12 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:47 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19785.4,jen.seq(1>600)CTL2#16-5' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:48 es una primera secuencia de ADN determinada para el clon 19786.3,jen.seq(1>600)CTL2#18-3' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 3'.
La SEQ ID NO:49 es una segunda secuencia de ADN determinada para el clon 19786.4,jen.seq(1>600)CTL2#18-5' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:50 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19788CTL2_21consensus.seq(1>406)
CTL2#21 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:51 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19790CTL2_23consensus.seq(1>602)
CTL2#23 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:52 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19791CTL2 24consensus.seq(1>145)
CTL2#24 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:53 es la secuencia de ADN determinada para el clon CTL2#4 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:54 es la secuencia de ADN determinada para el clon CTL2#8b de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:55 es la secuencia de ADN determinada para el clon 15-G1-89 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen de la lipoamida deshidrogenasa CT557.
La SEQ ID NO:56 es la secuencia de ADN determinada para el clon 14-H1-4 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen del antioxidante específico de tiol CT603.
La SEQ ID NO:57 es la secuencia de ADN determinada para el clon 12-G3-83 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con la proteína hipotética CT622.
La SEQ ID NO:58 es la secuencia de ADN determinada para el clon 12-B3-95 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen de la lipoamida deshidrogenasa CT557.
La SEQ ID NO:59 es la secuencia de ADN determinada para el clon 11-H4-28 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen de adnK CT396.
La SEQ ID NO:60 es la secuencia de ADN determinada para el clon 11-H3-68 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con la proteína de la virulencia PGP6-D y con el gen ribosómico L1 CT318.
\newpage
La SEQ ID NO:61 es la secuencia de ADN determinada para el clon 11-G1-34 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con el gen de la malato deshidrogenasa CT376 y con el gen de la glucógeno hidrolasa CT042.
La SEQ ID NO:62 es la secuencia de ADN determinada para el clon 11-G10-46 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con la proteína hipotética CT610.
La SEQ ID NO:63 es la secuencia de ADN determinada para el clon 11-C12-91 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen de OMP2 CT443.
La SEQ ID NO:64 es la secuencia de ADN determinada para el clon 11-A3-93 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen de la superfamilia HAD CT103.
La SEQ ID NO:65 es la secuencia de aminoácidos determinada para el clon 14-H1-4 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen del antioxidante específico de tiol CT603.
La SEQ ID NO:66 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2#9 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:67 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2#7 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:68 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2#6 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:69 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2#5 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:70 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2#2 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:71 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2#1 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:72 es una primera secuencia de ADN determinada para el clon 23509.2CtL2#3-5' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:73 es una segunda secuencia de ADN determinada para el clon 23509.1CtL2#3-3' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 3'.
La SEQ ID NO:74 es una primera secuencia de ADN determinada para el clon 22121.2CtL2#10-5' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:75 es una segunda secuencia de ADN determinada para el clon 22121.1CtL2#10-3' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 3'.
La SEQ ID NO:76 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19787.6CtL2#19-5' de C. trachomatis LGV II, que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:77 es la secuencia de ADN determinada para el clon CpS 13-His de C. pneumoniae LGV II.
La SEQ ID NO:78 es la secuencia de ADN determinada para el clon Cp_SWIB-His de C. pneumoniae LGV II.
La SEQ ID NO:79 es la secuencia de ADN determinada para el clon 23-G7-68 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con la proteína ribosómica L11, L10 y L1.
La SEQ ID NO:80 es la secuencia de ADN determinada para el clon 22-F8-91 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen pmpC.
La SEQ ID NO:81 es la secuencia de ADN determinada para el clon 21-E8-95 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con los genes CT610-CT613.
La SEQ ID NO:82 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19-F12-57 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con los genes CT858 y recA.
La SEQ ID NO:83 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19-F12-53 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen CT445 que codifica la glutamil ARNt sintetasa.
La SEQ ID NO:84 es la secuencia de ADN determinada para el clon 19-A5-54 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen del plásmido críptico.
La SEQ ID NO:85 es la secuencia de ADN determinada para el clon 17-E11-72 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con los genes OppC_2 y pmpD.
La SEQ ID NO:86 es la secuencia de ADN determinada para el clon 17-C1-77 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con los marcos de lectura abiertos CT857 y CT858.
La SEQ ID NO:87 es la secuencia de ADN determinada para el clon 15-H2-76 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con los genes pmpD y SycE, y con el ORF de CT089.
La SEQ ID NO:88 es la secuencia de ADN determinada para el clon 15-A3-26 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el ORF de CT858.
La SEQ ID NO:89 es la secuencia de aminoácidos determinada para el clon Cp_SWIB-His de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:90 es la secuencia de aminoácidos determinada para el clon CtL2_LPDA_FL de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:91 es la secuencia de aminoácidos determinada para el clon CpS 13-His de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:92 es la secuencia de aminoácidos determinada para el clon CtL2_TSA_FL de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:93 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-Swib 43-61 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:94 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-Swib 48-67 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:95 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-Swib 52-71 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:96 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-Swib 58-77 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:97 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-Swib 63-82 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:98 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-Swib 51-66 de C. trachomatis LGV II.
La SEQ ID NO:99 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Cp-Swib 52-67 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:100 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Cp-Swib 37-51 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:101 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Cp-Swib 32-51 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:102 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Cp-Swib 37-56 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:103 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-Swib 36-50 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:104 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-S 13 46-65 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:105 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-S 13 60-80 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:106 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-S 13 1-20 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:107 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-S 13 46-65 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:108 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Ct-S 13 56-75 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:109 es la secuencia de aminoácidos para el péptido Cp-S 13 56-75 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:110 es la secuencia de ADN determinada para el clon 21-G12-60 de C. trachomatis LGV II, que contiene marcos de lectura abiertos parciales para las proteínas hipotéticas CT875, CT229 y CT228.
La SEQ ID NO:111 es la secuencia de ADN determinada para el clon 22-B3-53 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el ORF de CT110 de GroEL.
La SEQ ID NO:112 es la secuencia de ADN determinada para el clon 22-A1-49 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con los ORF de CT660 y CT659.
La SEQ ID NO:113 es la secuencia de ADN determinada para el clon 17-E2-9 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con los ORF de CT661 y CT610.
La SEQ ID NO:114 es la secuencia de ADN determinada para el clon 17-C10-31 de C. trachomatis LGV II, que comparte una homología parcial con el ORF de CT858.
La SEQ ID NO:115 es la secuencia de ADN determinada para el clon 21-C7-66 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el gen similar a adnK.
La SEQ ID NO:116 es la secuencia de ADN determinada para el clon 20-G3-45 de C. trachomatis LGV II, que contiene parte del gen pmpB de CT413.
La SEQ ID NO:117 es la secuencia de ADN determinada para el clon 18-C5-2 de C. trachomatis LGV II, que comparte homología con el ORF de la proteína ribosómica S1.
La SEQ ID NO:118 es la secuencia de ADN determinada para el clon 17-C5-19 de C. trachomatis LGV II, que contiene parte de los ORF de CT431 y CT430.
La SEQ ID NO:119 es la secuencia de ADN determinada para el clon 16-D4-22 de C. trachomatis LGV II, que contiene secuencias parciales del ORF3 y ORF4 del plásmido para el crecimiento dentro de células de mamífero.
La SEQ ID NO:120 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap CT529 de C. trachomatis de serovar LGV II.
La SEQ ID NO:121 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar LGV II.
La SEQ ID NO:122 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar E.
La SEQ ID NO:123 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar E.
La SEQ ID NO:124 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar 1A.
La SEQ ID NO:125 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar 1A.
La SEQ ID NO:126 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar G.
La SEQ ID NO:127 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar G.
La SEQ ID NO:128 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar F1 NII.
La SEQ ID NO:129 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar F1 NII.
La SEQ ID NO:130 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L1.
La SEQ ID NO:131 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L1.
La SEQ ID NO:132 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L3.
La SEQ ID NO:133 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L3.
La SEQ ID NO:134 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar Ba.
La SEQ ID NO:135 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar Ba.
La SEQ ID NO:136 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar MOPN.
La SEQ ID NO:137 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar MOPN.
La SEQ ID NO:138 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #124-139 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:139 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #132-147 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:140 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #138-155 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:141 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #146-163 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:142 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #154-171 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:143 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #162-178 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:144 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #138-147 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:145 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #139-147 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:146 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #140-147 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:147 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #138-146 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:148 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #138-145 del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:149 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #F140->I del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:150 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido # #S139>Ga del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:151 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido # #S139>Gb del ORF de Cap 1 CT529 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:152 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #2 C7.8-6 del ORF de 216 aa de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:153 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #2 C7.8-7 del ORF de 216 aa de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:154 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #2 C7.8-8 del ORF de 216 aa de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:155 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #2 C7.8-9 del ORF de 216 aa de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:156 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido #2 C7.8-10 del ORF de 216 aa de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:157 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido de 53 restos aminoácidos del ORF de 216 aa dentro del clon 2C7.8 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:158 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido de 52 restos aminoácidos del ORF de CT529 dentro del clon 2C7.8 de C. trachomatis de serovar L2.
La SEQ ID NO:159 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (directo) para clonar el CT529 de longitud completa del serovar L2.
La SEQ ID NO:160 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (inverso) para clonar el CT529 de longitud completa del serovar L2.
La SEQ ID NO:161 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (directo) para clonar el CT529 de longitud completa para serovares distintos de L2 y MOPN.
La SEQ ID NO:162 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (inverso) para clonar el CT529 de longitud completa para serovares distintos de L2 y MOPN.
La SEQ ID NO:163 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (directo) para clonar el CT529 de longitud completa del serovar MOPN.
La SEQ ID NO:164 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (inverso) para clonar el CT529 de longitud completa del serovar MOPN.
La SEQ ID NO:165 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (directo) para pBIB-KS.
La SEQ ID NO:166 es la secuencia de ADN determinada para el cebador 5' (inverso) para pBIB-KS.
La SEQ ID NO:167 es la secuencia de aminoácidos determinada para el epitopo 9-mero del péptido Cap1#139-147 del serovar L2.
La SEQ ID NO:168 es la secuencia de aminoácidos determinada para el epitopo 9-mero del péptido Cap1#139-147 del serovar D.
La SEQ ID NO:169 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen pmpI de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:170 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen pmpG de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:171 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen pmpE de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:172 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen pmpD de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:173 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen pmpC de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:174 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen pmpB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:175 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen pmpI de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:176 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen pmpG de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:177 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen pmpE de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:178 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen pmpD de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:179 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen pmpC de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:180 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el gen pmpB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:181 es la secuencia de ADN determinada menos la secuencia señal para el gen pmpI de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:182 es una secuencia de ADN de longitud completa posteriormente determinada para el gen pmpG de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:183 es la secuencia de ADN determinada menos la secuencia señal para el gen pmpE de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:184 es una primera secuencia de ADN determinada que representa el extremo carboxi terminal para el gen pmpD de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:185 es una segunda secuencia de ADN determinada que representa el extremo amino terminal menos la secuencia señal para el gen pmpD de C. trachomatis.
\newpage
La SEQ ID NO:186 es una primera secuencia de ADN determinada que representa el extremo carboxi terminal para el gen pmpC de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:187 es una segunda secuencia de ADN determinada que representa el extremo amino terminal menos la secuencia señal para el gen pmpC de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:188 es la secuencia de ADN determinada que representa el gen pmp de C. pneumoniae de serovar MOMPS en una molécula de fusión con Ra12.
La SEQ ID NO:189 es la secuencia de aminoácidos predicha menos la secuencia señal para el gen pmpI de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:190 es una secuencia de aminoácidos posteriormente predicha para el gen pmpG de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:191 es la secuencia de aminoácidos predicha menos la secuencia señal para el gen pmpE de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:192 es una primera secuencia de aminoácidos predicha que representa el extremo carboxi terminal para el gen pmpD de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:193 es una segunda secuencia de aminoácidos predicha que representa el extremo amino terminal menos la secuencia señal para el gen pmpD de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:194 es una primera secuencia de aminoácidos predicha que representa el extremo carboxi terminal para el gen pmpC de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:195 es una segunda secuencia de aminoácidos predicha que representa el extremo amino terminal para el gen pmpC de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:196 es una primera secuencia de aminoácidos predicha que representa el gen pmp de C. pneumoniae de serovar MOMPS en una molécula de fusión con Ra12.
La SEQ ID NO:197 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar el gen pmpC de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:198 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar el gen pmpC de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:199 es la secuencia de ADN determinada para la secuencia de inserción para clonar el gen pmpC de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:200 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar el gen pmpD de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:201 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar el gen pmpD de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:202 es la secuencia de ADN determinada para la secuencia de inserción para clonar el gen pmpD de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:203 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar el gen pmpE de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:204 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar el gen pmpE de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:205 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar el gen pmpG de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:206 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar el gen pmpG de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
La SEQ ID NO:207 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar la porción amino terminal del gen pmpC de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:208 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar la porción amino terminal del gen pmpC de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:209 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar la porción carboxi terminal del gen pmpC de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:210 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar la porción carboxi terminal del gen pmpC de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:211 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar la porción amino terminal del gen pmpD de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:212 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar la porción amino terminal del gen pmpD de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:213 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar la porción carboxi terminal del gen pmpD de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:214 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar la porción carboxi terminal del gen pmpD de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:215 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar el gen pmpE de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:216 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar el gen pmpE de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:217 es la secuencia de ADN determinada para la secuencia de inserción para clonar el gen pmpE de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:218 es la secuencia de aminoácidos para la secuencia de inserción para clonar el gen pmpE de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:219 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar el gen pmpG de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:220 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar el gen pmpG de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:221 es la secuencia de aminoácidos para la secuencia de inserción para clonar el gen pmpG de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:222 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 5' para clonar el gen pmpI de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:223 es la secuencia de ADN determinada para el cebador oligonucleotídico 3' para clonar el gen pmpI de C. trachomatis en el vector pET17b.
La SEQ ID NO:224 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 1-20 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:225 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 6-25 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:226 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 12-31 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:227 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 17-36 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:228 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 22-41 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:229 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 27-46 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:230 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 42-61 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:231 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 46-65 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:232 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 51-70 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:233 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 56-75 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:234 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 61-80 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:235 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 66-87 Swib de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:236 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 103-122 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:237 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 108-127 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:238 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 113-132 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:239 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 118-137 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:240 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 123-143 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:241 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 128-147 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:242 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 133-152 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:243 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 137-156 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:244 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 142-161 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:245 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 147-166 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:246 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 152-171 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:247 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 157-176 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:248 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 162-181 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:249 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 167-186 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:250 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 171-190 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:251 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 171-186 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:252 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 175-186 OMCB de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:253 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 185-198 OMCB de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:254 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 98-115 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:255 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 101-120 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:256 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 106-125 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:257 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 111-130 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:258 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 116-135 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:259 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 121-140 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:260 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 126-145 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:261 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 131-150 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:262 es la secuencia de aminoácidos determinada para el péptido 136-155 TSA de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:263 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen CT529/Cap 1 de C. trachomatis de serovar I.
La SEQ ID NO:264 es la secuencia de aminoácidos predicha determinada para el gen CT529/Cap 1 de C. trachomatis de serovar I.
La SEQ ID NO:265 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el gen CT529/Cap 1 de C. trachomatis de serovar K.
La SEQ ID NO:266 es la secuencia de aminoácidos predicha determinada para el gen CT529/Cap 1 de C. trachomatis de serovar K.
\newpage
La SEQ ID NO:267 es la secuencia de ADN determinada para el clon 17-G4-36 de C. trachomatis que comparte homología con parte del ORF de la subunidad beta de la ARN polimerasa dirigida a ADN-CT315 en serD.
La SEQ ID NO:268 es la secuencia de ADN determinada para la secuencia parcial del gen CT016 de C. trachomatis en el clon 2E10.
La SEQ ID NO:269 es la secuencia de ADN determinada para la secuencia parcial del gen de la ARNt sintasa de C. trachomatis en el clon 2E10.
La SEQ ID NO:270 es la secuencia de ADN determinada para la secuencia parcial del gen clpX de C. trachomatis en el clon 2E10.
La SEQ ID NO:271 es una primera secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-30 de C. trachomatis que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:272 es una segunda secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-30 de C. trachomatis que representa el extremo 3'.
La SEQ ID NO:273 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-28 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:274 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-27 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:275 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-26 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:276 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-24 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:277 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-23 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:278 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-21 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:279 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-18 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:280 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-17 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:281 es una primera secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-15 de C. trachomatis que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:282 es una segunda secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-15 de C. trachomatis que representa el extremo 3'.
La SEQ ID NO:283 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-13 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:284 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-10 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:285 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-8 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:286 es una primera secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-6 de C. trachomatis que representa el extremo 5'.
La SEQ ID NO:287 es una segunda secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-6 de C. trachomatis que representa el extremo 3'.
La SEQ ID NO:288 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-5 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:289 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-2 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:290 es la secuencia de ADN determinada para el clon CtL2gam-1 de C. trachomatis.
La SEQ ID NO:291 es la secuencia de ADN de longitud completa determinada para el homólogo del gen CT529 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:292 es la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha para el homólogo del gen CT529 de C. pneumoniae.
La SEQ ID NO:293 es la secuencia de ADN determinada para la secuencia de inserción para clonar el gen pmpG de C. trachomatis en el vector de vacuna SKB.
Descripción de las figuras
La figura 1 ilustra la inducción de IFN-\gamma a partir de un línea de células T específicas de Chlamydia por células diana que expresan el clon 4C9-18#2.
La figura 2 ilustra los vectores retrovíricos pBIB-KS 1, 2, 3, modificados para que contengan un sitio de inicio de la traducción Kosak y codones de fin.
La figura 3 muestra la lisis específica en un ensayo de liberación de cromo de células P815 pulsadas con los péptidos de Chlamydia CtC7.8-12 (SEQ ID NO:18) y CtC7.8-13 (SEQ ID NO:19).
La figura 4 muestra las valoraciones de isotipo de anticuerpos en ratones C57B/6 inmunizados con la proteína SWIB de C. trachomatis.
La figura 5 muestra las respuestas proliferativas de células T específicas de Chlamydia en esplenocitos de ratones C3H inmunizados con la proteína SWIB de C. trachomatis.
La figura 6 ilustra las secuencias de los cebadores 5' y 3' diseñados a partir de C. pneumoniae que se emplean para aislar los genes SWIB y S 13 de C. pneumoniae.
Las figuras 7A y 7B muestran la inducción de IFN-\gamma a partir de una línea de células T anti-Chlamydia (TCL-8) capaz de tener reacción cruzada con C. trachomatis y C. pneumoniae tras su activación por células dendríticas derivadas de monocitos que expresan proteínas clamidiales.
La figura 8 muestra la identificación de epitopos de células T en la proteína S 13 ribosómica clamidial con la línea de células T TCL 8 EB/DC.
La figura 9 ilustra la respuesta proliferativa de células T CP-21 generada contra células dendríticas infectadas con C. pneumoniae frente a la proteína SWIB de C. pneumoniae recombinante, pero no frente a la proteína SWIB de C. trachomatis.
La figura 10 muestra las respuestas proliferativas frente a SWIB específicas de C. trachomatis de una línea de células T primaria (TCT-10 EB) procedentes de un donante asintomático.
La figura 11 ilustra la identificación del epitopo de células T en SWIB de C. trachomatis con una línea de células T específicas de antígeno (TCL-10 EB).
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Descripción detallada de la invención
Como se indicó anteriormente, la presente invención se dirige, en general, a composición farmacéuticas y a métodos de vacunas para el diagnóstico y el tratamiento de una infección clamidial. En un aspecto, las composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de un antígeno de Chlamydia, o su variante.
En realizaciones específicas, la presente invención describe polipéptidos que comprenden una porción inmunogénica de un antígeno de Chlamydia, en los que el antígeno de Chlamydia comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:5 o su variante que tiene al menos 90% de coincidencia con ella. En otras realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:5, 6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tiene al menos 90% de coincidencia con ella.
Tal como se emplea en la presente, el término "polipéptido" incluye cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en las que los restos aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes. Por tanto, un polipéptido que comprenda una porción inmunogénica de uno de los antígenos de la invención puede consistir totalmente en la porción inmunogénica o puede contener más secuencias. Estas otras secuencias pueden derivarse del antígeno nativo de Chlamydia o pueden ser heterólogas, y estas secuencias pueden ser inmunogénicas (pero no es necesario).
Los términos "polinucleótido" y "polinucleótidos", tal como se emplean en la presente, significan un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas, e incluyen moléculas de ADN y las correspondientes moléculas de ARN, incluyendo moléculas de ARNHn y ARNm, tanto la hebra sentido como la antisentido, e incluyen ADNc, ADN genómico y ADN recombinante, así como polinucleótidos total o parcialmente sintetizados. Una molécula de ARNHn contiene intrones y se corresponde con una molécula de ADN de una manera en general de una a una. Una molécula de ARNm se corresponde con una molécula de ARNHn y ADN de la cual se han retirado los intrones. Un polinucleótido puede consistir en un gen completo o en cualquiera de sus porciones. Los polinucleótidos antisentido operables pueden comprender un fragmento del correspondiente polinucleótido y, por tanto, la definición de "polinucleótido" incluye todos estos fragmentos antisentido operables.
Una "porción inmunogénica" de un antígeno es una porción que es capaz de reaccionar con suero obtenido a partir de un individuo infectado con Chlamydia (es decir, genera una lectura de absorbancia con suero de individuos infectados que está al menos tres desviaciones estándar por encima de la absorbancia obtenida con suero de individuos no infectados, en un ensayo ELISA representativo descrito en la presente). Estas porciones inmunogénicas en general comprenden al menos aproximadamente 5 restos aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 20 restos aminoácidos. Los métodos para preparar e identificar porciones inmunogénicas de antígenos con secuencia conocida son muy conocidos en la técnica e incluyen los resumidos en Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., Raven Press, 1993, pp. 243-247, y las referencias citadas aquí. Estas técnicas incluyen seleccionar polipéptidos para su capacidad para reaccionar con anticuerpos específicos de antígeno, antisuero y/o líneas de células T o clones. Tal como se emplea en la presente, los antisueros y los anticuerpos son "específicos de antígeno" si se unen de modo específico a un antígeno (es decir, reaccionan con una proteína en un ensayo ELISA o en otro inmunoensayo, y no reaccionan de manera detectable con proteínas no relacionadas). Estos antisueros y anticuerpos pueden prepararse como se describe en la presente y utilizando técnicas muy conocidas. Una porción inmunogénica de una proteína nativa de Chlamydia es una porción que reacciona con dicho antisuero y/o células T a un nivel que no es sustancialmente menor que la reactividad del polipéptido de longitud completa (por ejemplo, en un ensayo ELISA y/o de reactividad de células T). Estas porciones inmunogénicas pueden reaccionar dentro de estos ensayos a un nivel que es similar o mayor que la reactividad del polipéptido de longitud completa. Estas selecciones pueden realizarse, en general, utilizando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica, como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, un polipéptido puede inmovilizarse sobre un soporte sólido y ponerse en contacto con suero de pacientes para permitir la unión de anticuerpos dentro del suero con el polipéptido inmovilizado. El suero no unido puede entonces retirarse y los anticuerpos unidos pueden detectarse utilizando, por ejemplo, proteína A marcada con ^{125}I.
Los ejemplos de porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente incluyen, por ejemplo, los epitopos estimulantes de células T proporcionados en SEQ ID NO:9, 10, 18, 19, 31, 39, 93-96, 98, 100-102, 106, 108, 138-140, 158, 167, 168, 246, 247 y 254-256. Los polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de uno o más antígenos de Chlamydia, como se describen en la presente, pueden utilizarse en general, solos o en combinación, para detectar una infección clamidial en un paciente.
Las composiciones y las vacunas de la presente invención también incluyen variantes de los anteriores polipéptidos y moléculas polinucleotídicas. Estos variantes incluyen, pero no se limitan a variantes alélicos naturales de las secuencias de la invención. En particular, los variantes incluyen otros serovares de Chlamydia, como los serovares D, E y F, así como varios serovares LGV que comparten homología con los polipéptidos y moléculas polinucleotídicas de la invención descritos en la presente. Preferiblemente, los homólogos de serovar muestran una homología de 95-99% con la correspondiente secuencia o secuencias del polipéptido descritas en la presente.
Un "variante" de polipéptido, tal como se emplea en la presente, es un polipéptido que se diferencia del polipéptido mencionado sólo en sustituciones y/o modificaciones conservadoras, de forma que se conservan las propiedades antigénicas del polipéptido. En una realización preferida, los polipéptidos variantes se diferencian de una secuencia identificada por una sustitución, una deleción o una adición de cinco o menos aminoácidos. Estos variantes en general pueden identificarse modificando una de las anteriores secuencias de polipéptidos, y evaluando las propiedades antigénicas del polipéptido modificado utilizando, por ejemplo, los procedimientos representativos descritos en la presente. En otras palabras, la capacidad de un variante para reaccionar con antisueros específicos de antígeno puede potenciarse o no cambiarse, con relación a la proteína nativa, o puede disminuirse en menos de 50%, y preferiblemente menos de 20%, con relación a la proteína nativa. Estos variantes pueden identificarse, en general, modificando una de las anteriores secuencias de polipéptidos y evaluando la reactividad del polipéptido modificado con antisuero o anticuerpos específicos de antígeno como se describe en la presente. Los variantes preferidos incluyen aquellos en los que se ha eliminado una o más de sus porciones, como la secuencia conductora N-terminal o un dominio transmembrana. Otros variantes preferidos incluyen variantes en que una porción pequeña (por ejemplo, 1-30 aminoácidos, preferiblemente 5-15 aminoácidos) se ha eliminado del extremo N- y/o C-terminal de la proteína madura. Los variantes de polipéptidos preferiblemente muestran al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de coincidencia (determinada como se describe a continuación) con los polipéptidos identificados.
Tal como se emplea en la presente, una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tenga propiedades similares, de una manera que los expertos en la técnica de la química de péptidos esperarían que no cambiase sustancialmente la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, en general, basándose en la similitud en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen la lisina y la arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen unos valores de hidrofilicidad similares incluyen la leucina, la isoleucina y la valina; la glicina y la alanina; la asparagina y la glutamina; y la serina, la treonina, la fenilalanina y la tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Un variante también puede contener, o como alternativa puede contener cambios no conservadores. En una realización preferida, los polipéptidos variantes se diferencian de una secuencia nativa mediante la sustitución, la deleción o la adición de cinco o menos aminoácidos. Los variantes también (o como alternativa) pueden estar modificados mediante, por ejemplo, la deleción o la adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Los variantes también pueden contener, o como alternativa pueden contener otras modificaciones, incluyendo la deleción o la adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre las propiedades antigénicas, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una secuencia señal (o conductora) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige, de modo cotraduccional o postraduccional, la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede conjugarse con un conector u otras secuencias para facilitar la síntesis, la purificación o la identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una región Fc de inmunoglobulina.
Un "variante" de polinucleótido es una secuencia que se diferencia de la secuencia de nucleótidos mencionada en que tiene una o más deleciones, sustituciones o adiciones de nucleótidos, de forma que no disminuye la inmunogenicidad del polipéptido codificado con relación a la proteína nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede evaluarse de modo general como se describe en la presente. Estas modificaciones pueden introducirse con facilidad utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, como la mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos como se indica, por ejemplo, en Adelman et al. (DNA, 2:183, 1983). Los variantes de nucleótidos pueden ser variantes alélicos naturales como se analiza a continuación, o variantes no naturales. Las secuencias de nucleótidos de los variantes preferiblemente muestran al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de coincidencia (determinada como se indica a continuación) con la secuencia mencionada.
Los polipéptidos proporcionados para su uso en la presente invención incluyen variantes que son codificados por secuencias polinucleotídicas que son sustancialmente homólogas con una o más de las secuencias polinucleotídicas mencionadas de modo específico en la presente. Una "homología sustancial", tal como se emplea en la presente, se refiere a secuencias polinucleotídicas que son capaces de hibridarse bajo condiciones moderadamente rigurosas. Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen el prelavado en una disolución de 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridar a 50ºC-65ºC, 5X SSC, durante la noche o, en el caso de homología cruzada entre especies, a 45ºC con 0,5X SSC; seguido de lavar dos veces a 65ºC durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene SDS al 0,1%. Estas secuencias polinucleótídicas hibridantes también se encuentran dentro del alcance de esta descripción, al igual que las secuencias de nucleótidos que, debido a la degeneración del código, codifican un polipéptido que es el mismo que un polipéptido descrito en la presente.
Se dice que dos secuencias de nucleótidos o de polipéptidos son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o de restos aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para la correspondencia máxima como se describen a continuación. Las comparaciones entre dos secuencias se realizan, de forma típica, comparando las secuencias a través de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se emplea en la presente, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de alinear de manera óptima ambas secuencias.
El alineamiento óptimo de secuencias para su comparación puede realizarse utilizando el programa Megalign en la serie de programas bioinformáticos Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando los parámetros por defecto. Este programa incluye varios esquemas de alineamiento descritos en las siguientes referencias bibliográficas: Dayhoff, M.O. (ed.), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Resarch Foundation, Washington DC, vol. 5, supl. 3, pp. 345-358; Hein, J. (1990), Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645, Methods in Enzymology, vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989), Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, CABIOS, 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W. (1988), Optimal alignments in linear space, CABIOS, 4:11-17; Robinson, E.D. (1971), Comb. Theor., 11:105; Santou, N., Nes, M. (1987), The neighbor joining method. A new method for reconstructing phylogenetic trees, Mol. Biol. Evol., 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R. (1973), Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983), Rapid similarity searches of nucleic acid and protein data banks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730.
Preferiblemente, el "porcentaje de coincidencia de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de modo óptimo a través de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de 20% o menos, normalmente de 5% a 15%, o de 10% a 12%, comparado con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que las bases de ácidos nucleicos o los restos aminoácidos idénticos aparecen en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para producir el porcentaje de coincidencia de secuencia.
En la presente también se describen alelos de los genes que codifican las secuencias de nucleótidos mencionadas en la presente. Tal como se emplea en la presente, un "alelo" o una "secuencia alélica" es una forma alternativa del gen que puede ser el resultado de al menos una mutación en la secuencia del ácido nucleico. Los alelos pueden producir ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen concreto puede no tener o tener una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales habituales que producen alelos son atribuibles a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse de modo individual o en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia concreta. En la presente se describen polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de un antígeno de Chlamydia (o un variante de dicho antígeno), que comprende una o más de las secuencias de aminoácidos codificadas por (a) una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1-4, 15, 21-21, 44-64, 66-76 y 79-88; (b) los complementos de dichas secuencias de ADN; o (c) secuencias de ADN sustancialmente homólogas con una secuencia en (a) o (b). Tal como se analiza en los ejemplos que aparecen a continuación, varios de los antígenos de Chlamydia descritos en la presente reconocen una línea de células T que reconoce a células dendríticas derivadas de monocitos infectadas por Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae, indicando que pueden representar un epitopo inmunorreactivo compartido por Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae. Los antígenos, por tanto, puede emplearse en una vacuna para infecciones del tracto genital de C. trachomatis y para infecciones por C. pneumoniae. En el ejemplo 6 se proporciona una mayor caracterización de estos antígenos de Chlamydia de Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae para determinar el grado de reactividad cruzada. Además, el ejemplo 4 describe fragmentos de ADNc (SEQ ID NO:15, 16 y 33) aislados a partir de C. trachomatis que codifican proteínas (SEQ ID NO:17-19 y 32) capaces de estimular una línea de células T CD8+ específica de Chlamydia.
En general, los antígenos de Chlamydia y las secuencias polinucleótídicas que codifican dichos antígenos pueden prepararse utilizando cualquiera de una diversidad de procedimientos. Por ejemplo, pueden aislarse moléculas polinucleotídicas que codifican antígenos de Chlamydia a partir de un banco genómico o de expresión de ADNc de Chlamydia seleccionando con una línea de células T específica de Chlamydia como se describe a continuación, y secuenciarse utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Además, un polinucleótido puede identificarse, como se describe con más detalle a continuación, seleccionando una micromatriz de ADNc para la expresión asociada a Chlamydia (es decir, una expresión que sea al menos dos veces mayor en células infectadas por Chlamydia que en los controles, según se determina utilizando un ensayo representativo proporcionado en la presente). Estas selecciones pueden realizarse utilizando una micromatriz Synteni (Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante (y fundamentalmente como se describe en Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10614-10619, 1996, y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2150-2155, 1997). Como alternativa, los polipéptidos pueden amplificarse a partir de ADNc preparado a partir de células que expresan las proteínas descritas en la presente. Estos polinucleótidos pueden amplificarse mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Para esta estrategia pueden diseñarse cebadores específicos de secuencia basándose en las secuencias proporcionadas en la presente, o pueden comprarse o sintetizarse.
Los antígenos pueden producirse de modo recombinante, como se describe a continuación, insertando una secuencia polinucleotídica que codifique el antígeno en un vector de expresión, y expresando el antígeno en un hospedante apropiado. Los antígenos pueden evaluarse para una propiedad deseada, como la capacidad para reaccionar con suero obtenido a partir de un individuo infectado por Chlamydia como se describe en la presente, y pueden secuenciarse utilizando, por ejemplo, la química de Edman tradicional. Véase Edman y Berg, Eur. J. Biochem., 80:116-132, 1967.
Las secuencias polinucleotídicas que codifican antígenos también pueden obtenerse seleccionando un banco de ADNc o de ADN genómico de Chlamydia apropiado para buscar secuencias polinucleotícas que se hibriden con oligonucleótidos degenerados derivados de secuencias de aminoácidos parciales de los antígenos aislados. Las secuencias de oligonucleótidos degeneradas para su uso en esta selección pueden diseñarse y sintetizarse, y la selección puede realizarse como se describe (por ejemplo) en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (y las referencias citadas en ello). También puede emplearse una reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando los anteriores oligonucleótidos en métodos muy conocidos en la técnica, para aislar una sonda de ácido nucleico a partir de un banco genómico de ADNc. La selección del banco puede entonces realizarse utilizando la sonda aislada.
Puede utilizarse una porción amplificada para aislar un gen de longitud completa a partir de un banco adecuado (por ejemplo, un banco de ADNc de Chlamydia) utilizando técnicas muy conocidas. Dentro de dichas técnicas, un banco (de ADNc o genómico) se selecciona utilizando uno o más cebadores o sondas polinucleotídicas adecuados para la amplificación. Preferiblemente, un banco se selecciona según el tamaño de sus componentes para incluir moléculas más grandes. También pueden preferirse los bancos cebados de modo aleatorio para identificar regiones de genes 5' y cadena arriba. Se prefieren los bancos genómicos para obtener intrones y extender secuencias 5'.
Para la técnicas de hibridación, una secuencia parcial puede marcarse (por ejemplo, mediante desplazamiento de mella o marcaje terminal con ^{32}P) utilizando técnicas muy conocidas. Entonces un banco bacteriano o de bacteriófagos se selecciona mediante filtros hibridantes que contengan colonias bacterianas desnaturalizadas (o céspedes que contengan placas de fagos) con la sonda marcada (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las colonias o placas hibridantes se seleccionan y se expanden, y el ADN se aisla para su posterior análisis. Los clones de ADNc pueden analizarse para determinar la cantidad de secuencia adicional, por ejemplo mediante PCR utilizando un cebador procedente de la secuencia parcial y un cebador procedente del vector. Pueden generarse mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones solapantes. Entonces puede determinarse la secuencia completa utilizando técnicas convencionales, que pueden implicar generar una serie de clones de deleción. Las secuencias solapantes resultantes entonces se ensamblan en una única secuencia contigua. Puede generarse una molécula de ADNc de longitud completa acoplando fragmentos adecuados, utilizando técnicas muy conocidas.
Como alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia codificadora de longitud completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. Dentro de dichas técnicas, la amplificación se realiza en general mediante PCR. Puede utilizarse cualquiera de una diversidad de kits disponibles en el mercado para realizar la etapa de amplificación. Los cebadores pueden diseñarse utilizando técnicas muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989), y también pueden emplearse programas informáticos muy conocidos en la técnica. Los cebadores preferiblemente tienen una longitud de 22-30 nucleótidos, tienen un contenido de GC de al menos 50%, y se reasocian con la secuencia diana a unas temperaturas de aproximadamente 68ºC a 72ºC. La región amplificada puede secuenciarse como se describió anteriormente, y las secuencias solapantes pueden ensamblarse en una secuencia
contigua.
Una de estas técnicas de amplificación es la PCR inversa (véase Triglia et al., Nucl. Acids Res., 16:8186, 1988), que emplea enzimas de restricción para generar un fragmento en la región conocida del gen. El fragmento entonces se circulariza mediante acoplamiento intramolecular y se emplea como molde para una PCR con cebadores divergentes derivados de la región conocida. Dentro de una estrategia alternativa, las secuencias adyacentes a una secuencia parcial pueden recuperarse para la amplificación con un cebador para una secuencia conectora y un cebador específico para una región conocida. Las secuencias amplificadas se someten, de forma típica, a una segunda ronda de amplificación con el mismo cebador conector y un segundo cebador específico para la región conocida. Una variación de este procedimiento, que emplea dos cebadores que inician la extensión en direcciones opuestas desde la secuencia conocida, se describe en el documento WO 96/38591. Otras técnicas incluyen la PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic., 1:111-119, 1991) y la PCR de paseo (Parker et al., Nucl. Acids. Res., 19:3055-3060, 1991). La amplificación mediada por la transcripción, o TMA, es otro método que puede utilizarse para la amplificación de ADN, ARNr o ARNm, como se describe en la patente nº PCT/US91/03184. El método no basado en PCR autocatalítico e isotermo utilizada dos cebadores y dos enzimas: la ARN polimerasa y la transcriptasa inversa. Un cebador contiene una secuencia promotora para la ARN polimerasa. En la primera amplificación, el promotor-cebador se hibrida con el ARNr diana en un sitio definido. La transcriptasa inversa crea una copia de ADN del ARNr diana mediante extensión desde el extremo 3' del promotor-cebador. El ARN en el complejo resultante se degrada, y un segundo cebador se une a la copia de ADN. Una nueva hebra de ADN es sintetizada a partir del extremo del cebador por la transcriptasa inversa, creando un ADN bicatenario. La ARN polimerasa reconoce la secuencia promotora en el molde de ADN e inicia la transcripción. Cada uno de amplicones de ARN recién sintetizados se reintroduce en el proceso de TMA y actúa como molde para una nueva ronda de replicación que conduce a la expansión exponencial del amplicón de ARN. También pueden utilizarse otros métodos que emplean la amplificación para obtener una secuencia de ADNc de longitud completa.
En ciertos casos, es posible obtener una secuencia de ADNc de longitud completa mediante el análisis de secuencias proporcionadas en una base de datos de marcadores de secuencia expresados (EST), como la disponible en GenBank. Las búsquedas de EST solapantes pueden realizarse de modo general utilizando programas muy conocidos (por ejemplo, las búsquedas NCBI BLAST), y estos EST pueden utilizarse para generar una secuencia de longitud completa contigua. También pueden obtenerse secuencias de ADNc de longitud completa mediante el análisis de fragmentos genómicos.
Los variantes de polinucleótidos pueden prepararse de modo general mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la síntesis química, por ejemplo mediante una síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Las modificaciones en una secuencia polinucleotídica también pueden introducirse utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, como la mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos (véase Adelman et al., DNA, 2:183, 1983). Como alternativa, pueden generarse moléculas de ARN mediante la transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican una proteína clamidial, o su porción, con la condición de que el ADN se incorpore en un vector con un promotor de la ARN polimerasa adecuado (como T7 o SP6). Ciertas porciones pueden utilizarse para preparar un polipéptido codificado, como se describe en la presente. Además, o como alternativa, una porción puede administrarse a un paciente de forma que el polipéptido codificado se genere in vivo (por ejemplo, transfectando células de presentación de antígenos, como células dendríticas, con una construcción de ADNc que codifique un polipéptido clamidial, y administrando las células transfectadas al paciente).
También puede utilizarse una porción de una secuencia complementaria con una secuencia codificadora (es decir, un polinucleótido antisentido) como sonda o para modular la expresión génica. Las construcciones de ADNc que pueden transcribirse en ARN antisentido también pueden introducirse en células de tejidos para facilitar la producción de ARN antisentido. Un polinucleótido antisentido puede utilizarse, como se describe en la presente, para inhibir la expresión de una proteína clamidial. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión génica a través de la formación de una triple hélice, que compromete la capacidad de la doble hélice para abrirse lo suficiente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras (véase Gee et al., en Huber y Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY, 1994)). Como alternativa, una molécula antisentido puede diseñarse para que se hibride con una región control de un gen (por ejemplo, un promotor, un potenciador o un sitio de inicio de la transcripción) y bloquear la transcripción del gen; o para bloquear la traducción mediante la inhibición de la unión de un transcrito a ribosomas.
Una porción de una secuencia codificadora, o de una secuencia complementaria, también puede diseñarse como una sonda o un cebador para que detecte la expresión génica. Las sondas pueden marcarse con una diversidad de grupos indicadores, como radionúclidos y enzimas, y preferiblemente tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente una longitud de al menos 20 nucleótidos, y aún más preferiblemente una longitud de al menos 30 nucleótidos. Los cebadores, como se indicó anteriormente, tienen preferiblemente una longitud de 22-30 nucleótidos.
Cualquier polinucleótido puede modificarse posteriormente para aumentar la estabilidad in vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de enlaces fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa en el esqueleto; y/o la inclusión de bases no tradicionales como inosina, queosina y wibutosina, así como formas modificadas con acetilo, metilo, tio y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.
Las secuencias de nucleótidos como se describen en la presente pueden unirse a una diversidad de otras secuencias de nucleótidos utilizando técnicas de ADN recombinante establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido puede clonarse en cualquiera de una diversidad de vectores de clonación, incluyendo plásmidos, fágmidos, derivados del fago lambda y cósmidos. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación. En general, un vector contendrá un origen de la replicación funcional en al menos un organismo, sitios de endonucleasas de restricción convenientes, y uno o más marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado y serán evidentes para los expertos en la técnica.
Pueden generarse polipéptidos sintéticos que tengan menos de aproximadamente 100 aminoácidos y, en general, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, estos polipéptidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden de modo secuencial a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automática de polipéptidos está disponible en el mercado en suministradores como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, y puede manejarse según las instrucciones del fabricante.
Como se indicó anteriormente, las porciones inmunogénicas de los antígenos de Chlamydia pueden prepararse e identificarse utilizando técnicas muy conocidas, como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., Raven Press, 1993, pp. 243-247, y las referencias citadas aquí. Estas técnicas incluyen seleccionar porciones polipeptídicas del antígeno nativo para propiedades inmunogénicas. Los ELISA representativos descritos en la presente pueden emplearse en general en estas selecciones. Una porción inmunogénica de un polipéptido es una porción que, dentro de dichos ensayos representativos, genera una señal en dichos señales que es sustancialmente similar a la generada por el antígeno de longitud completa. En otras palabras, una porción inmunogénica de un antígeno de Chlamydia genera al menos aproximadamente 20%, y preferiblemente aproximadamente 100% de la señal inducida por el antígeno de longitud completa en un ELISA modelo, como se describe en la presente.
Pueden generarse porciones y otros variantes de antígenos de Chlamydia por medios sintéticos o recombinantes. Los variantes de un antígeno nativo pueden prepararse en general utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, como la mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos. También pueden retirarse secciones secciones de la secuencia polinucleotídica utilizarse técnicas convencionales para permitir la preparación de polipéptidos truncados.
Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un antígeno nativo pueden prepararse con facilidad a partir de una secuencia polinucleotídica que codifique el polipéptido, utilizando una diversidad de técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, en primer lugar pueden concentrarse sobrenadantes procedentes de sistemas de hospedante/vector adecuados que segreguen la proteína recombinante hacia el medio de cultivo, utilizando un filtro disponible en el mercado. Tras la concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada, como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Por último, pueden emplearse una o más etapas de HPLC en fase inversa para purificar aún más una proteína recombinante.
Puede emplearse cualquiera de una diversidad de vectores de expresión conocidos por los expertos en la técnica para expresar los polipéptidos recombinantes como se describe en la presente. La expresión puede lograrse en una célula hospedante apropiada que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión que contenga una molécula polinucleotídica que codifique un polipéptido recombinante. Las células hospedantes adecuadas incluyen procariotas, levaduras y células de eucariotas superiores. Preferiblemente, las células hospedantes empleadas son E. coli, levaduras o una línea celular de mamífero, como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar antígenos naturales, porciones de antígenos naturales u otros variantes de éstos.
En general, independientemente del método de preparación, los polipéptidos descritos en la presente se preparan en una forma aislada sustancialmente pura. Preferiblemente, los polipéptidos son al menos aproximadamente 80% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% puros, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puros.
Dentro de ciertas realizaciones específicas, un polipéptido puede ser una proteína de fusión que comprenda múltiples polipéptidos como se describe en la presente, o que comprenda al menos un polipéptido como se describe en la presente y una secuencia no relacionada, como una proteína clamidial conocida. Una pareja de fusión puede ayudar, por ejemplo, a proporcionar epitopos de células T auxiliares (una pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epitopos de células T auxiliares reconocidos por el ser humano, o puede ayudar a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) con mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Ciertas parejas de fusión preferidas son parejas de fusión inmunológicas y potenciadoras de la expresión. Pueden seleccionarse otras parejas de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a compartimentos intracelulares deseados. Otras parejas de fusión incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína. Puede construirse una secuencia de ADN que codifique una proteína de fusión de la presente invención utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas para ensamblar diferentes secuencias de ADN que codifiquen, por ejemplo, el primer y el segundo polipéptido, en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de una secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido se acopla, con o sin un conector peptídico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido de forma que los marcos de lectura de las secuencias están en fase para permitir la traducción del ARNm de las dos secuencias de ADN en una única proteína de fusión que conserve la actividad biológica del primer y del segundo polipéptido.
Puede emplearse una secuencia conectora peptídica para separar el primer y el segundo polipéptido una distancia suficiente para asegurarse de que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Esta secuencia conectora peptídica se incorpora en la proteína de fusión utilizando técnicas convencionales muy conocidas en la técnica. Las secuencias conectoras peptídicas adecuadas pueden elegirse basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interaccionar con epitopos funcionales sobre el primer y el segundo polipéptido; y (2) la inexistencia de restos hidrófobos o cargados que puedan reaccionar con los epitopos funcionales del polipéptido. Las secuencias conectoras peptídicas preferidas contienen restos Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, como Thr y Ala, también pueden utilizarse en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de modo útil como conectores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene, 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8258-8562, 1986; patente de EEUU nº 4.935.233 y patente de EEUU nº 4.751.180. La secuencia conectora puede tener una longitud de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. Como alternativa al uso de una secuencia conectora peptídica (cuando se desee), se pueden utilizar regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales (cuando estén presentes) en el primer y el segundo polipéptido para separar los dominios funcionales y evitar el impedimento estérico.
Las secuencias de ADN acopladas están unidas de modo operable a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN están localizados sólo 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido. De manera similar, los codones de fin necesarios para terminar la traducción y las señales de fin de la transcripción sólo están presentes 3' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.
También se proporcionan proteínas de fusión que comprenden un polipéptido descrito en la presente junto con una proteína inmunogénica no relacionada. Preferiblemente, la proteína inmunogénica es capaz de provocar una respuesta de memoria. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen las proteínas del tétanos, la tuberculosis y la hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).
Dentro de las realizaciones preferidas, una pareja de fusión inmunólogica se deriva de la proteína D, una proteína de la superficie de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenza B (documento WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de la proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales), y un derivado de la proteína D puedes estar lipidado. Dentro de ciertas realizaciones preferidas, se incluyen los primeros 109 restos de una pareja de fusión de la lipoproteína D en el extremo N-terminal para proporcionar al polipéptido otros epitopos de células T exógenos y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (actuando con ello como un potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura la presentación óptima del antígeno a las células de presentación de antígenos. Otras parejas de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). De forma típica se emplean los 81 aminoácidos N-terminales aunque pueden utilizarse fragmentos diferentes que incluyan epitopos de células T auxiliares.
En otra realización, la pareja de fusión inmunológica es la proteína conocida como LYTA o su porción (preferiblemente una porción C-terminal). La LYTA se deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene, 43:265-292, 1986). La LYTA es una autolisina que degrada de modo específico ciertos enlaces en el esqueleto de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad con la colina o con algunos análogos de colina, como DEAE. Esta propiedad se ha aprovechado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. coli, útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino terminal (véase Biotechnology, 10:795-798, 1992). Dentro de una realización preferida, una porción repetida de LYTA puede incorporarse en una proteína de fusión. Una porción repetida se encuentra en la región C-terminal que comienza en el resto 178. Una porción repetida particularmente preferida incorpora los restos 188-305. Además, la proteína de fusión Ra12 puede conectarse a los polinucleótidos descritos en la presente para facilitar la expresión de las proteínas.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para fabricar un medicamento que emplea uno o más de los anteriores polipéptidos o proteínas de fusión (o polinucleótidos que codifiquen dichos polipéptidos o proteínas de fusión) para inducir una inmunidad protectora contra una infección clamidial en un paciente. Tal como se emplea en la presente, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede sufrir una enfermedad o puede estar exento de una enfermedad y/o infección detectable. En otras palabras, puede inducirse una inmunidad protectora para evitar o tratar una infección clamidial.
En este aspecto, el polipéptido, la proteína de fusión o la molécula polinucleotídica está presente dentro de una composición farmacéutica o de una vacuna. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales puede contener una o más de las anteriores secuencias (o sus variantes), y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más de los anteriores polipéptidos y un inmunoestimulante, como un adyuvante o un liposoma (en el que se incorpora el polipéptido). Estas composiciones farmacéuticas y vacunas también pueden contener otros antígenos de Chlamydia, incorporados en un polipéptido de combinación o presentes dentro de otros polipéptido distinto.
Como alternativa, una vacuna puede contener polinucleótidos que codifiquen uno o más polipéptidos o proteínas de fusión como se describió anteriormente, de forma que el polipéptido se genera in situ. En estas vacunas, los polinucleótidos pueden estar presentes dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de transporte conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y víricos. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias polinucleotídicas necesarias para la expresión en el paciente (como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de transporte bacterianos implican la administración de una bacteria (como Bacillus-Calmette-Guerrin) que exprese una porción inmunogénica del polipéptido sobre su superficie celular. En una realización preferida, los polinucleótidos pueden introducirse utilizando un sistema de expresión vírico (por ejemplo, vaccinia u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus no patógeno (defectuoso). Las técnicas para incorporar polinucleótidos en estos sistemas de expresión son muy conocidas por los expertos en la técnica. Los polinucleótidos también pueden administrarse como vectores plasmídicos "desnudos" como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science, 259:1745-1749, 1993, y analizado por Cohen, Science, 259:1691-1692, 1993. Las técnicas para incorporar ADN en estos vectores son muy conocidas por los expertos en la técnica. Un vector retrovírico además puede transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable (para ayudar a la identificación o la selección de células transducidas) y/o un resto de transporte dirigido, como un gen que codifique un ligando para un receptor sobre una célula diana específica, para hacer que el vector sea específico para la diana. El transporte dirigido también puede realizarse utilizando un anticuerpo, mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Otras formulaciones para fines terapéuticos incluyen sistemas de dispersión coloidales, como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esferas y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para su uso como vehículo de transporte in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La captación de los polinucleótidos desnudos puede aumentarse incorporando los polinucleótidos en el interior de esferas biodegradables y/o sobre éstas, que son transportadas de modo eficaz hacia el interior de las células. La preparación y el uso de estos sistemas es muy conocido en la técnica.
En un aspecto relacionado, una vacuna de polinucleótidos como se describió anteriormente puede administrarse de modo simultáneo o secuencial con un polipéptido descrito en la presente o con un antígeno de Chlamydia conocido. Por ejemplo, la administración de polinucleótidos que codifican un polipéptido descrito en la presente, "desnudo" o en un sistema de transporte como se describió anteriormente, puede ser seguida de la administración de un antígeno para potenciar el efecto inmunológico protector de la vacuna.
Los polipéptidos y los polinucleótidos descritos en la presente también pueden emplearse en una inmunoterapia adoptiva para el tratamiento de una infección clamidial. La inmunoterapia adoptiva puede clasificarse de modo amplio como una inmunoterapia activa o pasiva. En la inmunoterapia activa, el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunológico de hospedante endógeno, con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunológica (por ejemplo, vacunas, adyuvantes bacterianos y/o citoquinas).
En la administración pasiva, el tratamiento implica la administración de reactivos biológicos con una reactividad inmunológica establecida (como células efectoras o anticuerpos) que pueden mediar de modo directo o indirecto en los efectos anti-Chlamydia, y no depende necesariamente del sistema inmunológico intacto del hospedante. Los ejemplos de células efectoras incluyen linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos CD8+, células T auxiliares CD4+), células asesinas (como las células asesinas naturales, las células asesinas activadas por linfoquinas), células B, o células presentadoras de antígenos (como células dendríticas y macrófagos) que expresen los antígenos descritos. Los polipéptidos descritos en la presente también pueden utilizarse para generar anticuerpos o anticuerpos anti-idiotípicos (como en la patente de EEUU nº 4.918.164) para una inmunoterapia pasiva.
El método predominante para procurar unos números adecuados de células T para la inmunoterapia adoptiva consiste en cultivar células T inmunológicas in vitro. Las condiciones de cultivo para expandir células T específicas de un único antígeno hasta un número de varios billones con la conservación del reconocimiento del antígeno in vivo son muy conocidas en la técnica. Estas condiciones de cultivo in vitro utilizan, de forma típica, la estimulación intermitente con el antígeno, a menudo en presencia de citoquinas, como IL-2, y de células de soporte que no están en división. Como se indicó anteriormente, los polipéptidos inmunorreactivos descritos en la presente pueden utilizarse para expandir con rapidez cultivos de células T específicas de antígeno para generar un número suficiente de células para la inmunoterapia. En particular, las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos o células B, pueden pulsarse con polipéptidos inmunorreactivos, o puede introducirse una secuencia o secuencias polinucleotídicas en las células presentadoras de antígenos, utilizando una amplia variedad de técnicas convencionales muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos pueden transfectarse o transducirse con una secuencia polinucleotídica, en la que dicha secuencia contiene una región promotora apropiada para aumentar la expresión, y puede expresarse como parte de un virus recombinante u otro sistema de expresión. Pueden utilizarse varios vectores víricos para transducir una célula presentadora de antígenos, incluyendo poxvirus, virus de vaccinia y adenovirus; también las células presentadoras de antígenos pueden transfectarse con secuencias polinucleotídicas descritas en la presente mediante una diversidad de medios, incluyendo la tecnología de la pistola de genes, el transporte mediado por lípidos, la electroporación, el choque osmótico, y los mecanismos de administración de partículas, dando como resultado unos niveles de expresión eficaces y aceptables, según pueden determinar los expertos en la técnica. Para que las células T cultivadas sean eficaces en terapia, las células T cultivadas deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente y sobrevivir durante largo tiempo in vivo. Los estudios han demostrado que las células T cultivadas pueden ser inducidas a crecer in vivo y pueden sobrevivir durante largo tiempo en números sustanciales mediante una estimulación repetida con antígeno suplementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever, M., et al, "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited", Immunological Reviews, 157:177, 1997).
Los polipéptidos descritos en la presente también pueden emplearse para generar y/o aislar células T reactivas a Chlamydia, que entonces pueden administrarse a un paciente. En una técnica, las líneas de células T específicas de antígeno pueden generarse mediante la inmunización in vivo con péptidos cortos que se corresponden con porciones inmunogénicas de los polipéptidos descritos. Los clones de células T CD8+ o CD4+ específicos de antígeno resultantes pueden aislarse a partir del paciente, expandirse utilizando técnicas de cultivo de tejidos convencionales, y volverse a introducir en el paciente.
Como alternativa, los péptidos que se corresponden con las porciones inmunogénicas de los polipéptidos pueden emplearse para generar subconjuntos de células T reactivas a Chlamydia mediante la estimulación y la expansión selectivas in vitro de células T autólogas para proporcionar células T específicas de antígeno que después pueden transferirse al paciente como se describe, por ejemplo, en Chang et al. (Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22(3), 213, 1996). Las células del sistema inmunológico, como células T, pueden aislarse a partir de la sangre periférica de un paciente utilizando un sistema de separación de células disponible en el mercado, como el sistema Isolex^{TM}, disponible en Nexell Therapeutics, Inc., Irvine, CA. Las células separadas se estimulan con uno o más de los polipéptidos inmunorreactivos contenidos dentro de un vehículo de transporte, como una microesfera, para proporcionar células T específicas de antígeno. La población de células T específicas de antígeno entonces se expande utilizando técnicas convencionales, y las células se vuelven a administrar al paciente.
Los receptores de células T y/o de anticuerpos específicos para los polipéptidos descritos en la presente pueden clonarse, expandirse y transferirse a otros vectores o células efectoras para su uso en una inmunoterapia adoptiva. En particular, las células T pueden transfectarse con los genes apropiados para expresar los dominios variables de anticuerpos monoclonales específicos de Chlamydia en forma de elementos de reconocimiento extracelulares, y unirse a las cadenas de señalización del receptor de células T, dando como resultado la activación de las células T, la lisis específica y la liberación de citoquinas. Esto permite que las células T redirijan su especificidad de una manera independiente de MHC. Véase, por ejemplo, Eshhar, Z., Cancer Immunol Immunother, 45(3-4):131-136, 1997, y Hwu, P., et al, Cancer Res., 55(15):3369-3373, 1995. Otra realización puede incluir la transfección de cadenas del receptor de células T alfa y beta específico de antígenos de Chlamydia hacia células T alternativas, como en Cole, D.J., et al., Cancer Res., 55(4):748-752, 1995.
Pueden pulsarse células dendríticas singeneicas o autólogas con los péptidos que se corresponden con al menos una porción inmunogénica de un polipéptido descrito en la presente. Las células dendríticas específicas de antígeno resultantes pueden transferirse a un paciente, o pueden emplearse para estimular células T para proporcionar células T específicas de antígeno que, a su vez, pueden administrarse a un paciente. El uso de células dendríticas pulsadas con péptidos para generar células T específicas de antígeno y el posterior uso de dichas células T específicas de antígeno para erradicar una enfermedad en un modelo murino ha sido demostrado por Cheever et al., Immunological Reviews, 157:177, 1997). Además, los vectores que expresan los polinucleótidos descritos pueden introducirse en células pluripotenciales extraídas del paciente y propargarse clónicamente in vitro para su transplante autólogo de nuevo al mismo paciente.
Los polipéptidos, los polinucleótidos, las células T y/o los agentes de unión descritos en la presente pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas o composiciones inmunogénicas (es decir, vacunas). Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de dichos compuestos y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más de dichos compuestos y un inmunoestimulante. Un inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que aumente o potencie una respuesta inmunológica frente a un antígeno exógeno. Los ejemplos de inmunoestimulantes incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, galactida poliláctica) y liposomas (en los que se incorpora el compuesto, véase, por ejemplo, Fullerton, patente de EEUU nº 4.235.877). La preparación de vacunas se describe en general, por ejemplo, en M.F. Powell y M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Las composiciones farmacéuticas y las vacunas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros compuestos, que pueden biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, pueden estar presentes una o más porciones inmunogénicas de otros antígenos de Chlamydia, incorporados a un polipéptido de fusión o como un compuesto separado, dentro de la composición o de la vacuna.
Una composición farmacéutica o una vacuna puede contener ADN que codifique uno o más de los polipéptidos como se describió anteriormente, de forma que el polipéptido se genera in situ. Como se indicó anteriormente, el ADN puede estar presente dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de transporte conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y víricos. En la técnica se conocen numerosas técnicas de transporte de genes, como los descritos en Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 15:143-198, 1998, y en las referencias citadas aquí. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (como un promotor y una señal de terminación adecuados). Los sistemas de transporte bacterianos implican la administración de una bacteria (como Bacillus-Calmette-Guerrin) que exprese una porción inmunogénica del polipéptido sobre su superficie celular o que segrege dicho epitopo. En una realización preferida, el ADN puede introducirse utilizando un sistema de expresión vírico (por ejemplo, vaccinia u otro poxvirus, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus competente para la replicación no patógeno (defectuoso). Los sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine, 8:17-21, 1990; patentes de EEUU nº 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; documento WO 89/01973; patente de EEUU nº 4.777.127; documento GB 2.200.651; documento EP 0345242; documento WO 91/02805; Berkner, Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science, 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502, 1993; Guzmán et al., Circulation, 88:2838-2848, 1993; y Guzmán et al., Cir. Res., 73:1202-1207, 1993. Las técnicas para incorporar ADN en dichos sistemas de expresión son muy conocidas por los expertos en la técnica. El ADN también puede estar "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science, 259:1745-1749, 1993, y analizado por Cohen, Science, 259:1691-1692, 1993. La captación del ADN desnudo puede aumentarse revistiendo el ADN sobre esferas biodegradables, que son transportadas con eficacia hacia el interior de las células.
Aunque cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica puede emplearse en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo de la vía de administración. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para cualquier manera de administración apropiada incluyendo, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, como mediante una inyección subcutánea, el vehículo comprende preferiblemente agua, disolución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, puede emplearse cualquiera de los anteriores vehículos o un vehículos sólido, como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato poliglicolato) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Se describen microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las patentes de EEUU nº 4.897.268 y 5.075.109.
Estas composiciones también pueden comprender tampones (por ejemplo, disolución salina tamponada neutra o disolución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como glicina, antioxidantes, agentes quelantes como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado. Los compuestos también pueden encapsularse dentro de liposomas utilizando tecnologías muy conocidas.
Puede emplearse cualquiera de una diversidad de inmunoestimulantes en las vacunas de esta invención. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno de un catabolismo rápido, como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante de las respuestas inmunológicas, como lípido A, proteínas derivadas de Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvante adecuados están disponibles en el mercado, por ejemplo, como adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); sales de aluminio, como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos catiónica o aniónicamente derivatizados; polifosfazenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y Quil A. También pueden utilizarse citoquinas, como GM-CSF o interleuquina-2, -7 o -12, como adyuvantes.
En las vacunas proporcionadas en la presente, bajo circunstancias seleccionadas, la composición de adyuvante puede diseñarse para inducir una respuesta inmunológica predominantemente de tipo Th1 o de tipo Th2. Unos niveles altos de citoquinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-\gamma, TNF\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunológicas mediadas por células contra un antígeno administrado. Por contraste, unos niveles altos de citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunológicas humorales. Tras la aplicación de una vacuna como se proporciona en la presente, un paciente sostendrá una respuesta inmunológica que incluya respuestas de tipo Th1 y Th2. Dentro de una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 aumentará hasta un grado mayor que el nivel de las citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas pueden evaluarse con facilidad utilizando ensayos convencionales. Para un análisis de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol., 7:145-173, 1989.
Los adyuvantes preferidos para su uso para provocar una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monosfororil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes de MPL están disponibles en Ribi ImmunoChem Research Inc. (Hamilton, MT) (véanse las patentes de EEUU nº 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Estos oligonucleótidos son muy conocidos y se describen, por ejemplo, en el documento WO 96/02555. Otro adyuvante preferido es la saponina, preferiblemente QS21, que puede utilizarse sola o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, como la combinación de QS21 y 3D-MPL, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que el QS21 está extinguido con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación de adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210. Cualquier vacuna proporcionada en la presente puede prepararse utilizando métodos muy conocidos que den como resultado una combinación del antígeno, el potenciador de la respuesta inmunológica y un vehículo o excipiente adecuado.
Las composiciones descritas en la presente pueden administrarse como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación como una cápsula, una esponja o un gel (compuestos de polisacáridos, por ejemplo) que logre una liberación lenta del compuesto tras la administración). Estas formulaciones pueden prepararse, en general, utilizando tecnologías muy conocidas y pueden administrarse, por ejemplo, mediante implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo dispersados en una matriz vehículo y/o pueden estar contenidos dentro de un depósito rodeado por una membrana de control de la velocidad. Los vehículos para su uso en estas formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. La cantidad del compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de la implantación, de la velocidad y de la duración esperada de la liberación, y de la naturaleza del trastorno que se va a tratar o a prevenir.
Puede emplearse cualquiera de una diversidad de vehículos de transporte en las composiciones farmacéuticas y las vacunas para facilitar la producción de una respuesta inmunológica específica de antígeno que se dirija a células infectadas por Chlamydia. Los vehículos de transporte incluyen células presentadoras de antígenos (APC), como células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que pueden modificarse para que sean APC eficaces. Estas células pueden estar genéticamente modificadas (pero puede que no sea necesario) para aumentar la capacidad de presentación del antígeno, para mejorar la activación y/o el mantenimiento de la respuesta de células T, para que tengan efectos anti-Chlamydia per se y/o para que sean inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, un haplotipo HLA apareado). Las APC pueden aislarse en general a partir de cualquiera de una diversidad de fluidos biológicos y órganos, y pueden ser células autólogas, alogeneicas, singeneicas o xenogeneicas.
El uso de células dendríticas o sus progenitoras como células presentadoras de antígenos se describe en la presente. Las células dendríticas son APC muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature, 392:245-251, 1998) y se ha demostrado que son eficaces como adyuvantes fisiológicos para provocar una inmunidad profiláctica o terapéutica (véase Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med., 50:507-529, 1999). En general, las células dendríticas pueden identificarse basándose en su forma típica (estrelladas in situ, con marcados procesos citoplásmicos (dendritas) visibles in vitro), su capacidad para captar, procesar y presentar antígenos con alta eficacia, y su capacidad para activar respuestas de células T indiferenciadas. Las células dendríticas, por supuesto, pueden modificarse para que expresen ligandos o receptores de la superficie celular específicos que no se encuentran habitualmente en células dendríticas in vivo o ex vivo, y en la presente se contemplan estas células dendríticas modificadas. Como alternativa a las células dendríticas pueden utilizarse vesículas segregadas de células dendríticas cargadas de antígenos (denominadas exosomas) en una vacuna (véase Zitvogel et al., Nature Med., 4:594-600, 1998).
Las células dendríticas y las progenitoras pueden obtenerse a partir de sangre periférica, médula ósea, nódulos linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuados. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo añadiendo una combinación de citoquinas, como GM-CSF, IL-4, IL-12 y/o TNFa a cultivos de monocitos recolectados a partir de sangre periférica. Como alternativa, células CD34 positivas recolectadas a partir de sangre periférica, sangre del cordón umbilical o médula ósea, pueden diferenciarse en células dendríticas añadiendo al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF\alpha, ligando de CD40, LPS, ligado de flt3 y/u otro compuesto o compuestos que induzcan la diferenciación, la maduración y la proliferación de las células dendríticas.
Las células dendríticas se clasifican de modo conveniente como células "inmaduras" y "maduras", lo cual permite una manera más sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe considerarse que esta nomenclatura excluya todas las posibles etapas intermedias de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como APC con una alta capacidad para la captación y el procesamiento de antígenos, lo cual se correlaciona con la alta expresión del receptor Fc\gamma y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza, de forma típica, por una menor expresión de estos marcadores, pero presenta una alta expresión de moléculas de la superficie celular responsables de la activación de células T, como MHC de clase I y de clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1BB).
Las APC en general pueden transfectarse con un polinucleótido que codifique una proteína clamidial (o su porción o variante), de forma que el polipéptido clamidial, o su porción inmunológica, se exprese sobre la superficie de la célula. Esta transfección puede realizarse ex vivo, y una composición o una vacuna que comprenda estas células transfectadas puede entonces utilizarse para fines terapéuticos, como se describe en la presente. Como alternativa, un vehículo de transporte de genes que se dirija a una célula dendrítica o a otra célula presentadora de antígenos puede administrarse a un paciente, dando como resultado una transfección que se realiza in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, puede realizarse en general utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo los descritos en el documento WO 97/24447, o con la estrategia de la pistola de genes descrita por Mahvi et al., Immunology and Cell Biology, 75:456-460, 1997. La carga con antígenos de las células dendríticas puede lograrse incubando las células dendríticas o las células progenitoras con polipéptido clamidial, ADN (desnudo o dentro de un vector plasmídico) o ARN; o con virus o bacterias recombinantes que expresen el antígeno (por ejemplo, vectores de vaccinia, viruela aviar, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido puede conjugarse covalentemente a una pareja inmunológica que proporcione la ayuda de las células T (por ejemplo, una molécula vehículo). Como alternativa, una célula dendrítica puede pulsarse con una pareja inmunológica no conjugada, por separado o en presencia del polipéptido.
Las vías y la frecuencia de la administración de las composiciones farmacéuticas y de las vacunas, así como la dosificación, variarán de un individuo a otro. En general, las composiciones farmacéuticas y las vacunas pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, por vía intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, mediante aspiración) o por vía oral. Pueden administrarse entre 1 y 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Preferiblemente se administran 3 dosis a intervalos de 3-4 meses, y después pueden administrarse vacunaciones de refuerzo periódicamente. Otros protocolos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad del polipéptido o ADN que, cuando se administra como se describió anteriormente, es capaz de provocar una respuesta inmunológica en un paciente inmunizado para proteger al paciente de una infección clamidial durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producido in situ por el ADN en una dosis) varía de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 mg por kg del hospedante, de forma típica de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg, y preferiblemente de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1 \mug. Los tamaños de las dosis adecuados variarán según el tamaño del paciente, pero de forma típica estarán en un intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.
Aunque en las composiciones farmacéuticas de esta invención puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica, el tipo de vehículo variará dependiendo de la vía de administración. Para la administración parenteral, como una inyección subcutánea, el vehículo comprenderá preferiblemente agua, disolución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, puede emplearse cualquiera de los anteriores vehículos o un vehículo sólido, como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato poliglicolato) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Se describen microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las patentes de EEUU nº 4.897.268 y 5.075.109.
En general, una dosificación y un régimen de tratamiento adecuados proporcionan el compuesto o compuestos activos en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Esta respuesta puede controlarse estableciendo un resultado clínico mejorado en pacientes tratados, comparado con paciente no tratados. Un aumento en las respuestas inmunológicas preexistentes frente a una proteína clamidial en general se correlaciona con una respuesta clínica mejorada. Estas respuestas inmunológicas pueden evaluarse en general utilizando ensayos de proliferación, de citotoxicidad o de citoquinas convencionales, que pueden realizarse utilizando muestras obtenidas a partir de un paciente antes y después del tratamiento.
En la presente se describen métodos para utilizar los polipéptidos descritos en la presente para diagnosticar una infección clamidial. En este aspecto, se proporcionan métodos para detectar una infección clamidial en una muestra biológica, utilizando uno o más de los anteriores polipéptidos, por sí solos o en combinación. Para que sea más claro, el término "polipéptido" se utilizará cuando se describan las realizaciones específicas de los métodos de diagnóstico. Sin embargo, para los expertos en la técnica será evidente que las proteínas de fusión de la presente invención también pueden emplearse en dichos métodos.
Tal como se emplea en la presente, una "muestra biológica" es una muestra que contiene anticuerpos obtenida de un paciente. Preferiblemente, la muestra es sangre completa, esputo, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal u orina. Más preferiblemente, la muestra es una muestra de sangre, suero o plasma obtenida de un paciente. Los polipéptidos se emplean en un ensayo, como se describe a continuación, para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos contra el polipéptido o los polipéptidos en la muestra, con relación a un valor de corte predeterminado. La presencia de dichos anticuerpos indica una sensibilización previa a antígenos de Chlamydia que puede ser indicativa de una infección por Chlamydia.
Cuando se emplea más de un polipéptido, los polipéptidos utilizados son preferiblemente complementarios (es decir, un componente polipeptídico tenderá a detectar una infección en las muestras cuando la infección no pueda ser detectada por otro componente polipeptídico). Los polipéptidos complementarios en general pueden identificarse utilizando cada polipéptido de modo individual para evaluar muestras de suero obtenidas a partir de una serie de pacientes que se sabe que están infectados con Chlamydia. Después de determinar cuáles muestras son positivas (como se describe a continuación) con cada polipéptido, pueden formularse combinaciones de dos o más polipéptidos que sean capaces de detectar una infección en la mayoría o en todas las muestras ensayadas.
Los expertos en la técnica conocen una diversidad de formatos de ensayo para utilizar uno o más polipéptidos para detectar anticuerpos en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, que se incorpora como referencia en la presente. En una realización preferida, el ensayo implica el uso de un polipéptido inmovilizado sobre un soporte sólido que se une y retira al anticuerpo de la muestra. El anticuerpo unido entonces puede detectarse utilizando un reactivo de detección que contenga un grupo indicador. Los reactivos de detección adecuados incluyen anticuerpos que se unen al complejo de anticuerpo/polipéptido y liberan al polipéptido marcado con un grupo indicador (por ejemplo, en un ensayo semicompetitivo). Como alternativa, puede utilizarse un ensayo competitivo en el que un anticuerpo que se une al polipéptido se marca con un grupo indicador y se deja unir al antígeno inmovilizado después de la incubación del antígeno con la muestra. El grado en que los componentes de la muestra inhiben la unión del anticuerpo marcado con el polipéptido es indicativo de la reactividad de la muestra con el polipéptido inmovilizado.
El soporte sólido puede ser cualquier material sólido conocido por los expertos en la técnica al cual pueda unirse el antígeno. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microvaloración, o una membrana de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Como alternativa, el soporte puede ser una esfera o un disco, como de vidrio, fibra de vidrio, látex o de material de plástico como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, como los descritos, por ejemplo, en la patente de EEUU nº 5.359.681.
Los polipéptidos pueden unirse al soporte sólido utilizando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. En el contexto de la presente solicitud, el término "unido" se refiere a una asociación no covalente, como adsorción, y a una unión covalente (que puede ser un enlace directo entre el antígeno y los grupos funcionales sobre el soporte, o puede ser una unión a través de un agente reticulante). Se prefiere la unión mediante adsorción a un pocillo en una placa de microvaloración o a una membrana. En estos casos, la adsorción puede lograrse poniendo en contacto el polipéptido, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una cantidad adecuada de tiempo. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero de forma típica es de entre aproximadamente 1 hora y 1 día. En general, poner en contacto un pocillo de una placa de microvaloración de plástico (como de poliestireno o de poli(cloruro de vinilo)) con una cantidad de polipéptido que varíe de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 \mug, y preferiblemente de aproximadamente 100 ng, es suficiente para se que se una una cantidad adecuada de antígeno.
La unión covalente del polipéptido a un soporte sólido puede lograrse, en general, haciendo reaccionar al soporte, en primer lugar, con un reactivo bifuncional que reaccione con el soporte y con un grupo funcional, como un grupo hidroxilo o amino, sobre el polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a soportes que tengan un revestimiento polimérico apropiado utilizando benzoquinona o mediante la condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo sobre el polipéptido (véase, por ejemplo, el catálogo y el manual de Pierce Immunotechnology, 1991, en A12-A13).
El ensayo puede ser un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA). Este ensayo puede realizarse poniendo en contacto, en primer lugar, un antígeno polipeptídico que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido, normalmente el pocillo de una placa de microvaloración, con la muestra, de forma que los anticuerpos contra el polipéptido dentro de la muestra puedan unirse al polipéptido inmovilizado. Entonces se retira la muestra no unida del polipéptido inmovilizado y se añade un reactivo de detección capaz de unirse al complejo de anticuerpo-polipéptido inmovilizado. Entonces se determina la cantidad de reactivo de detección que permanece unido al soporte sólido utilizando un método apropiado para el reactivo de detección específico.
De manera más específica, cuando el polipéptido se ha inmovilizado sobre el soporte sólido como se describió anteriormente, el resto de los sitios de unión de proteínas sobre el soporte se bloquea, de forma típica. Puede emplearse cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por los expertos en la técnica, como albúmina de suero bovina (BSA) o Tween 20^{TM} (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). El polipéptido inmovilizado entonces se incuba con la muestra y se deja que el anticuerpo se una al antígeno. La muestra puede diluirse con un diluyente adecuado, como disolución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, un tiempo de incubación) es el periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia del anticuerpo en una muestra infectada por HGE. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para lograr un nivel de unión que sea al menos 95% del logrado en el equilibrio entre el anticuerpo unido y no unido. Los expertos en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para lograr el equilibrio puede determinarse con facilidad ensayando el nivel de unión que se produce a lo largo de un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos es en general suficiente.
La muestra no unida entonces puede retirarse lavando el soporte sólido con un tampón apropiado, como PBS que contiene Tween 20^{TM} al 0,1%. Entonces puede añadirse un reactivo de detección al soporte sólido. Un reactivo de detección apropiado es cualquier compuesto que se una al complejo de anticuerpo-polipéptido inmovilizado y que pueda detectarse mediante cualquiera de una diversidad de medios conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el reactivo de detección contiene un agente de unión (como por ejemplo proteína A, proteína G, inmunoglobulina, lectina o antígeno libre) conjugado con un grupo indicador. Los grupos indicadores preferidos incluyen enzimas (como peroxidasa de rábano), sustratos, cofactores, inhibidores, tintes, radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación del agente de unión al grupo indicador puede lograrse utilizando métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los agentes de unión habituales también pueden adquirirse conjugados con una diversidad de grupos indicadores a partir de muchas fuentes comerciales (por ejemplo, Zymed Laboratories, San Franciscco, CA, y Pierce, Rockford, IL).
El reactivo de detección entonces se incuba con el complejo de anticuerpo-polipéptido inmovilizado durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo unido. Una cantidad de tiempo apropiada puede determinarse, en general, a partir de las instrucciones del fabricante o ensayando el nivel de unión que se produce a lo largo de un periodo de tiempo. Entonces se retira el reactivo de detección no unido y se detecta el reactivo de detección unido utilizando el grupo indicador. El método empleado para detectar el grupo indicador dependerá de la naturaleza del grupo indicador. Para los grupos radiactivos en general son apropiados los métodos de recuento de centelleo o autorradiográficos. Pueden utilizarse métodos espectroscópicos para detectar tintes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse utilizando avidina, acoplada con un grupo indicador diferente (habitualmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos pueden detectarse en general mediante la adición del sustrato (en general durante un periodo de tiempo específico), seguido del análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de la reacción.
Para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-Chlamydia en la muestra, la señal detectada a partir de un grupo indicador que permanezca unido al soporte sólido en general se compara con una señal que se corresponde con un valor de corte predeterminado. En una realización preferida, el valor de corte es el promedio de la señal media obtenida cuando el antígeno inmovilizado se incuba con muestras de un paciente sin infectar. En general, una muestra que genere una señal que esté tres desviaciones estándar por encima del valor de corte predeterminado se considera positiva para una infección por Chlamydia. En una realización preferida alternativa, el valor de corte se determina utilizando una curva de receptor operador, según el método de Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107. Brevemente, en esta realización el valor de corte puede determinarse a partir de una gráfica de parejas de proporciones de positivos verdaderos (es decir, sensibilidad) y proporciones de positivos falsos (100%-especificidad) que se corresponden con cada valor de corte posible para el resultado del ensayo de diagnóstico. El valor de corte en la gráfica que esté más cercano a la esquina superior izquierda (es decir, el valor que encierra el área más grande) es el valor de corte más preciso, y una muestra que genere una señal que sea mayor que el valor de corte determinado mediante este método puede considerarse positiva. Como alternativa, el valor de corte puede desplazarse hacia la izquierda a través de la gráfica para minimizar la proporción de positivos falsos, o hacia la derecha para minimizar la proporción de negativos falsos. En general, una muestra que genere una señal que sea mayor que el valor de corte determinado mediante este método se considera positiva para una infección por Chlamydia.
El ensayo también puede realizarse en un formato de flujo rápido o de ensayo con tiras, en el que el antígeno se inmoviliza sobre una membrana, por ejemplo de nitrocelulosa. En el ensayo de flujo, los anticuerpos en la muestra se unen al polipéptido inmovilizado a medida que la muestra pasa a través de la membrana. Entonces un reactivo de detección (por ejemplo, proteína A-oro coloidal) se une al complejo de anticuerpo-polipéptido a medida que la disolución que contiene el reactivo de detección fluye a través de la membrana. La detección del reactivo de detección unido puede realizarse entonces como se describió anteriormente. En el formato de ensayo con tiras, un extremo de la membrana a la que está unido el polipéptido se sumerge en una disolución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene el reactivo de detección y hacia el área del polipéptido inmovilizado. La concentración del reactivo de detección en el polipéptido indica la presencia de anticuerpos anti-Chlamydia en la muestra. De forma típica, la concentración del reactivo de detección en ese sitio genera un patrón, como una línea, que se puede leer de modo visual. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana se selecciona para que se genere un patrón visualmente discernible cuando la muestra biológica contenga un nivel de anticuerpos que sea suficiente para generar una señal positiva en un ELISA, como se analizó anteriormente. Preferiblemente, la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana varía de aproximadamente 25 ng a aproximadamente 1 \mug, y más preferiblemente de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Estos ensayos pueden realizarse de modo típico con una cantidad muy pequeña (por ejemplo, una gota) del suero o de la sangre del paciente.
Por supuesto, existen numerosos protocolos de ensayo diferentes que son adecuados para su uso con los polipéptidos descritos en la presente. Las anteriores descripciones pretenden ser sólo un ejemplo. Un ejemplo de un protocolo de ensayo alternativo que puede emplearse de modo útil en estos métodos es un análisis de la transferencia Western, en el que las proteínas presentes en una muestra biológica se separan sobre un gel, antes de la exposición a un agente de unión. Estas técnicas son muy conocidas por los expertos en la técnica.
En la presente también se describen agentes, como anticuerpos y sus fragmentos de unión al antígeno, que se unen de modo específico a una proteína clamidial. Tal como se emplea en la presente, se dice que un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se "une de modo específico" a una proteína clamidial si reacciona a un nivel detectable (dentro, por ejemplo, de un ELISA) con una proteína clamidial, y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas bajo condiciones similares. Tal como se emplea en la presente, la "unión" se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas distintas, de modo que se forme un complejo. La capacidad de unirse puede evaluarse determinando, por ejemplo, una constante de unión para la formación del complejo. La constante de unión es el valor obtenido cuando la concentración del complejo se divide entre el producto de las concentraciones de los componentes. En general, se dice que dos compuestos se "unen", en el contexto de la presente descripción, cuando la constante de unión para la formación del complejo es mayor que aproximadamente 10^{3} l/mol. La constante de unión puede determinarse utilizando métodos muy conocidos en la técnica.
Los agentes de unión además pueden ser capaces de diferenciar entre pacientes con y sin una infección por Chlamydia utilizando los ensayos representativos proporcionados en la presente. En otras palabras, los anticuerpos u otros agentes de unión que se unen a una proteína clamidial generarán una señal que indica la presencia de una infección clamidial en al menos aproximadamente 20% de los pacientes con la enfermedad, y generarán una señal negativa que indica la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente 90% de los individuos sin infección. Para determinar si un agente de unión cumple este requisito, pueden ensayarse muestras biológicas (por ejemplo, sangre, suero, esputo, orina y/o biopsias de tejidos) procedentes de pacientes con y sin infección clamidial (según se determina utilizando ensayos clínicos convencionales) según se describe en la presente para detectar la presencia de polipéptidos que se unan al agente de unión. Será evidente que deberá ensayarse un número número estadísticamente significativo de muestras con y sin enfermedad. Cada agente de unión debe cumplir el anterior criterio; sin embargo, los expertos en la técnica conocerán agentes de unión que puedan utilizarse en combinación para aumentar la sensibilidad.
Cualquier agente que cumpla los anteriores requisitos puede ser un agente de unión. Por ejemplo, un agente de unión puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una molécula de ARN o un polipéptido. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo u su fragmento de unión al antígeno. Los anticuerpos pueden prepararse mediante cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpo monoclonales como se describe en la presente, o mediante la transfección de genes de anticuerpos en hospedantes bacterianos o de células de mamífero adecuados, para permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprende el polipéptido en primer lugar se inyecta en uno de una amplia variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos descritos en la presente puede actuar como el inmunógeno sin modificaciones. Como alternativa, en particular para polipéptidos relativamente cortos, puede provocarse una respuesta inmunológica superior si el polipéptido se une a una proteína vehículo, como albúmina de suero bovina o hemocianina de lapa de agujero. El inmunógeno se inyecta en el animal hospedante, preferiblemente según un programa predeterminado que incorpore una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales se sangran periódicamente. Entonces pueden purificarse anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido a partir de estos antisueros, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad utilizando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido antigénico de interés utilizando, por ejemplo, la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976, y sus mejoras. Brevemente, estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos con la especificidad deseada (es decir, que tengan reactividad con el polipéptido de interés). Estas líneas celulares puede producirse, por ejemplo, a partir de células esplénicas obtenidas a partir de un animal inmunizado como se describió anteriormente. Las células esplénicas entonces se inmortalizan, por ejemplo, mediante su fusión con una pareja de fusión de células de mieloma, preferiblemente una que sea singeneica con el animal inmunizado. Puede emplearse una diversidad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células esplénicas y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y después cultivarse en placa a baja densidad sobre un medio selectivo que soporte el crecimiento de células híbridas, pero no de células de mieloma. Una técnica de selección preferida emplea una selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, normalmente de aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan las colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y sus sobrenadantes de cultivo se ensayan para detectar actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren los hibridomas que tengan alta reactividad y especificidad.
Pueden aislarse anticuerpos monoclonales a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridomas en crecimiento. Además, pueden emplearse diversas técnicas para potenciar el rendimiento, como la inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado adecuado, como un ratón. Los anticuerpos monoclonales entonces pueden recolectarse del fluido de ascitis o de la sangre. Los contaminantes pueden eliminarse de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Los polipéptidos descritos en la presente pueden utilizarse en el proceso de purificación, por ejemplo en una etapa de cromatografía de afinidad.
Puede preferirse el uso de fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos. Estos fragmentos incluyen fragmentos Fab, que pueden prepararse utilizando técnicas convencionales. Brevemente, pueden purificarse inmunoglobulinas a partir de suero de conejo mediante cromatografía de afinidad en columnas de esferas de proteína A (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y digerirse con papaína para producir fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc pueden separarse mediante cromatografía de afinidad en columnas de esferas de proteína A.
Los anticuerpos monoclonales pueden acoplarse a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados a este respecto incluyen radionúclidos, inductores de la diferenciación, fármacos, toxinas y sus derivados. Los radionúclidos preferidos incluyen ^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{211}At y ^{212}Bi. Los fármacos preferidos incluyen metotrexato, y análogos de pirimidina y purina. Los inductores de la diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricino, abrina, toxina de la difteria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella y proteína antivírica de la hierba carmín.
Un agente terapéutico puede acoplarse (por ejemplo, unirse de modo covalente) a un anticuerpo monoclonal adecuado de modo directo o indirecto (por ejemplo, a través de un grupo conector). Una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo, como un grupo amino o sulfhidrilo, sobre uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) sobre el otro.
Como alternativa, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo a través de un grupo conector. Un grupo conector puede actuar como un espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente para evitar la interferencia con las capacidades de unión. Un grupo conector también pueden actuar para aumentar la reactividad química de un sustituyente sobre un agente o un anticuerpo y, por tanto, aumentar la eficacia del acoplamiento. Un aumento en la reactividad química también puede facilitar el uso de agentes, o de grupos funcionales sobre los agentes, que de otra forma no sería posible.
Será evidente para los expertos en la técnica que puede emplearse una diversidad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, homo- y heterofuncionales (como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL) como grupo conector. El acoplamiento puede realizarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o restos carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias bibliográficas que describen esta metodología, por ejemplo la patente de EEUU nº 4.671.958, de Rodwell et al.
Cuando el agente terapéutico es más potente cuando está exento de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados descritos en la presente, puede resultar deseable utilizar un grupo conector escindible durante o tras su internalización en una célula. Se ha descrito una serie de diferentes grupos conectores escindibles. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente desde estos grupos conectores incluyen la escisión mediante la reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.489.710, de Spitler), mediante irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.625.014, de Senter et al.), mediante la hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizadas (por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.638.045, de Kohn et al.), mediante una hidrólisis mediada por el complemente sérico (por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.671.958, de Rodwell et al.), y mediante hidrólisis catalizada por ácidos (por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.569.789, de Blattler et al.).
Puede resultar deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. Pueden acoplarse múltiples moléculas de un agente a una molécula de anticuerpo. Como alternativa, puede acoplarse más de un tipo de agente a un anticuerpo. Independientemente de la realización concreta, los inmunoconjugados con más de un agente pueden prepararse mediante una diversidad de formas. Por ejemplo, puede acoplarse directamente más de un agente a una molécula de anticuerpo, o pueden emplearse conectores que proporcionen múltiples sitios de unión. Como alternativa, puede utilizarse un vehículo.
Un vehículo puede portar los agentes de una diversidad de maneras, incluyendo la unión covalente directamente o a través de un grupo conector. Los vehículos adecuados incluyen proteínas, como albúminas (por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.507.234, de Kato et al.), péptidos y polisacáridos, como aminodextrano (por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.699.784, de Shih et al.). Un vehículo también puede portar un agente mediante un enlace no covalente o mediante encapsulación, como dentro de una vesícula liposómica (por ejemplo, las patentes de EEUU nº 4.429.008 y 4.873.088). Los vehículos específicos para agentes de radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.735.792 describe moléculas pequeñas radiohalogenadas representativas y su síntesis. Un quelado de radionúclido puede formarse quelando compuestos que incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y de azufre como átomos donadores para la unión del radionúclido metálico o de óxido metálico. Por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.673.562, de Davison et al. describe compuestos quelantes representativos y su síntesis.
Puede utilizarse una diversidad de vías de administración para los anticuerpos y los inmunoconjugados. De forma típica, la administración se realizará por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea o en regiones específicas de sitio mediante los métodos apropiados. Será evidente que la dosis precisa del anticuerpo/inmunoconjugado variará dependiendo del anticuerpo utilizado, de la densidad del antígeno y de la velocidad de eliminación del anticuerpo.
Los anticuerpos pueden utilizarse en ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de antígenos de Chlamydia utilizando ensayos similares a los detallados anteriormente y otras técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica, proporcionando con ello un método para detectar una infección clamidial en un paciente.
Los reactivos de diagnóstico también pueden comprender secuencias de ADN que codifiquen uno o más de los anteriores polipéptidos, o una o más porciones de éstos. Por ejemplo, pueden emplearse al menos dos cebadores oligonucleotídicos en un ensayo basado en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar ADNc específico de Chlamydia derivado de una muestra biológica, en el que al menos uno de los cebadores oligonucleotídicos es específico para una molécula de ADN que codifica un polipéptido descrito en la presente. Entonces se detecta la presencia del ADNc amplificado utilizando técnicas muy conocidas en la técnica, como una electroforesis en gel. De forma similar, las sondas oligonucleotídicas específicas para una molécula de ADN que codifica un polipéptido descrito en la presente pueden utilizarse en un ensayo de hibridación para detectar la presencia de un polipéptido en una muestra biológica.
Tal como se emplea en la presente, la expresión "sonda/cebador oligonucleotídico específico para una molécula de ADN" significa una secuencia oligonucleotídica que tiene al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 90% y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de coincidencia con la molécula de ADN en cuestión. Los cebadores y/o las sondas oligonucleotídicas que pueden emplearse de forma útil en los métodos de diagnóstico preferiblemente tienen al menos aproximadamente 10-40 nucleótidos. Los cebadores oligonucleotídicos pueden comprender al menos aproximadamente 10 nucleótidos contiguos de una molécula de ADN que codifica uno de los polipéptidos descritos en la presente. Preferiblemente, las sondas oligonucleotídicas para su uso en los métodos de diagnóstico comprenden al menos aproximadamente 15 oligonucleótidos contiguos de una molécula de ADN que codifica uno de los polipéptidos descritos en la presente. Las técnicas para los ensayos basados en PCR y los ensayos de hibridación son muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis et al., ibid.; Ehrlich, ibid.). Por tanto, los cebadores o las sondas pueden utilizarse para detectar secuencias específicas de Chlamydia en muestras biológicas. Las sondas o los cebadores de ADN que comprenden las secuencias oligonucleotídicas descritas anteriormente pueden utilizarse por sí solos o en combinación entre sí.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación. Cualquier ejemplo que pueda quedar fuera del alcance de la presente invención se proporciona sólo para ayudar a los expertos en la técnica en su comprensión del campo técnico de la invención.
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Ejemplo 1
Aislamiento de secuencias de ADN que codifican antígenos de Chlamydia
Se aislaron antígenos de Chlamydia de la presente invención mediante la clonación de expresión de un banco de ADN genómico de Chlamydia trachomatis LGV II fundamentalmente como se describe en Sanderson et al. (J. Exp. Med., 1995, 182:1751-1757), y se demostró que inducían la proliferación de PBMC e IFN-\gamma en una línea de células T inmunorreactiva.
Se generó una línea de células T específica de Chlamydia estimulando PBMC procedentes de un donante normal sin historia de infección clamidial en el tracto genital, con cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis LGV II. Se descubrió que esta línea de células T, denominada TCL-8, reconoce a células dendríticas derivadas de monocitos infectadas por Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae.
Se construyó un banco genómico con rupturas aleatorias de Chlamydia trachomatis LGV II en Lambda ZAP (Stratagene, La Joll, CA) y el banco amplificado se cultivó en placas de microvaloración de 96 pocillos a una densidad de 30 clones/pocillos. Se indujeron bacterias para que expresaran la proteína recombinante en presencia de IPTG 2 mM durante 3 h, después se sedimentaron y se resuspendieron en 200 \mul de RMPI con FBS al 10%. Se trasladaron 10 \mul de la suspensión bacteriana inducida a placas de 96 pocillos que contenían células dendríticas derivadas de monocitos autólogas. Después de 2 h de incubación, las células dendríticas se lavaron para eliminar E. coli libre y se añadieron células T específicas de Chlamydia. Se identificaron las agrupaciones de E. coli positivas determinando la producción de IFN-\gamma y la proliferación de células T en respuesta a las agrupaciones.
Se identificaron cuatro agrupaciones positivas, que se descompusieron para proporcionar cuatro clones puros (denominados 1-B1-66, 4-D7-28, 3-G3-10 y 10-C10-31), con unos tamaños del inserto de 481 pb, 183 pb, 110 pb y 1400 pb, respectivamente. El clon 1-B1-66 está aproximadamente en la región 536690 del genoma de C. trachomatis (base de datos NCBI de C. trachomatis). Dentro del clon 1-B1-66 se ha identificado un marco de lectura abierto (ORF) (nucleótidos 115-375) que codifica una proteína de 9 kDa previamente identificada (Stephens, et al., GenBank nº de registro AE001320), cuya secuencia se proporciona en SEQ ID NO:5. El clon 4-D7-28 es una región más pequeña del mismo ORF (aminoácidos 22-82 de 1-B1-66). El clon 3-G3-10 está aproximadamente en la región 74559 del genoma de C. trachomatis. El inserto se clona en la orientación antisentido con respecto a su orientación en el genoma. El clon 10-C10-31 contiene un marco de lectura abierto que se corresponde con una secuencia previamente publicada para la proteína ribosómica S 13 de Chlamydia trachomatis (Gu, L. et al., J. Bacteriology, 177:2594-2601, 1995). Las secuencias de la proteína predichas para 4-D7-28 y 10-C10-31 se proporcionan en SEQ ID NO:6 y 12, respectivamente. Las secuencias de la proteína predichas para 3-G3-10 se proporcionan en SEQ ID NO:7-11.
En una serie relacionada de estudios de selección, se empleó otra línea de células T para seleccionar el banco de ADN genómico de Chlamydia trachomatis LGV II descrito anteriormente. Se derivó una línea de células T específica de Chlamydia (TCT-1) a partir de un paciente con una infección clamidial del tracto genital estimulando las PBMC del paciente con células dendríticas derivadas de monocitos autólogas infectadas con cuerpos elementales de Chlamydia trachomatis LGV II. Un clon, 4C9-18 (SEQ ID NO:21), que contenía un inserto de 1256 pb, provocó una respuesta inmunológica específica, según se midió mediante ensayos de proliferación convencionales, a partir de la línea de células T específica de Chlamydia TCT-1. Posteriores análisis revelaron que este clon contenía tres secuencias conocidas: lipoamida deshidrogenasa (GenBank nº de registro AE001326), descrita en SEQ ID NO:22; una proteína hipotética CT429 (GenBank nº de registro AE001316), descrita en SEQ ID NO:23; y parte de un marco de lectura abierto de la ubiquinona metiltransferasa CT428 (GenBank nº de registro AE001316), descrito en SEQ ID NO:24.
En otro estudios que implicaron al clon 4C9-18 (SEQ ID NO:21), se expresó la secuencia de aminoácidos de longitud completa para la lipoamida deshidrogenasa (SEQ ID NO:22) a partir de C. trachomatis (LGV II) en el clon CtL2-LPDA-FL, según se describe en SEQ ID NO:90.
Para caracterizar más a fondo el marco de lectura abierto que contiene el epitopo o epitopos estimulantes de células T se subclonó un fragmento de ADNc que contenía los nucleótidos 1-695 del clon 4C9-18 con una secuencia de ADNc que codificaba un marcador de 6X-histidina en el extremo amino-terminal, en el sitio NdeI/EcoRI del vector pET17b (Novagen, Madison, WI), denominado clon 4C9-18#2 BL21 pLysS (SEQ ID NO:25, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:26) y se transformó en E. coli. Una inducción selectiva de E. coli transformado con IPTG 2 mM durante tres horas produjo la expresión de una proteína de 26 kDa a partir del clon 4C9-18#2 BL21 pLysS, según se evidencia mediante un SDS-PAGE teñido con Coomassie convencional. Para determinar la inmunogenicidad de la proteína codificada por el clon 4C9-18#2 BL21 pLysS, se valoraron E. coli que expresaban la proteína de 26 kDa en 1 x 10^{4} células dendríticas derivadas de monocitos y se incubaron durante 2 horas. Los cultivos de células dendríticas se lavaron y se añadieron 2,5 x 10^{4} células T (TCT-1) y se dejaron en incubación durante 72 horas más, tras lo cual se determinó el nivel de IFN-\gamma en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Como se muestra en la figura 1, la línea de células T TCT-1 respondía a los cultivos inducidos, según se mide mediante IFN-\gamma, lo cual indica una respuesta de células T específica de Chlamydia contra la secuencia de lipoamida deshidrogenasa. De manera similar, se demostró que la proteína codificada por el clon 4C9-18#2 BL21 pLysS estimulaba la línea de células T TCT-1 mediante ensayos de proliferación convencionales.
Posteriores estudios para identificar otros antígenos de Chlamydia trachomatis utilizando la técnica de clonación de expresión de células T CD4+ descrita anteriormente produjeron más clones. Las líneas de células T específicas de Chlamydia TCT-1 y TCL-9, así como la línea de células T TCP-21, se utilizaron para seleccionar el banco genómico de Chlamydia trachomatis LGV II. La línea de células T TCP-21 se derivó de un paciente que presentaba una respuesta inmunológica humoral a Chlamydia pneumoniae. La línea celular TCT-1 identificó 37 agrupaciones positivas, la línea celular TCT-3 identificó 41 agrupaciones positivas, y la línea celular TCP-21 identificó 2 agrupaciones positivas. Los siguientes clones se derivaron de 10 de estas agrupaciones positivas. El clon 11-A3-93 (SEQ ID NO:64), identificado por la línea celular TCP-21, es un fragmento genómico de 1339 pb que comparte homología con la superfamilia HAD (CT103). El segundo inserto en el mismo clon comparte homología con el gen fab I (CT104) presente sobre la hebra complementaria. El clon 11-C12-91 (SEQ ID NO:63), identificado utilizando la línea celular TCP-21, tiene un inserto de 269 pb que es parte del gen OMP2 (CT443), y comparte homología con la proteína de la membrana externa rica en cisteína de 60 kDa de C. pneumoniae.
El clon 11-G10-46 (SEQ ID NO:62), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un inserto de 688 pb que comparte homología con la proteína hipotética CT610. El clon 11-G1-34 (SEQ ID NO:61), identificado utilizando la línea celular TCT-3, tiene dos marcos de lectura abiertos (ORF) parciales con un tamaño del inserto de 1215 pb. Un ORF comparte homología con el gen de la malato deshidrogenasa (CT376), y el otro ORF comparte homología con el gen de la glucógeno hidrolasa (CT042). El clon 11-H3-68 (SEQ ID NO:60), identificado utilizando la línea celular TCT-3, tiene dos ORF con un tamaño total del inserto de 1180 pb. Un ORF parcial codifica la proteína de la virulencia PGP6-D codificada por el plásmido, mientras que el segundo ORF es un ORF completo para el gen ribosómico L1 (CT318). El clon 11-H4-28 (SEQ ID NO:59), identificado utilizando la línea celular TCT-3, tiene un tamaño del inserto de 552 pb y es parte del ORF para el gen de adnK (CT396). El clon 12-B3-95 (SEQ ID NO:58), identificado utilizando la línea celular TCT-1, tiene un tamaño del inserto de 463 pb y es parte del ORF para el gen de la lipoamida deshidrogenasa (CT557). Los clones 15-G1-89 y 12-B3-95 son idénticos (SEQ ID NO:55 y 58, respectivamente), se identificaron utilizando la línea celular TCT-1, tienen un tamaño del inserto de 463 pb y son parte del ORF para el gen de la lipoamida deshidrogenasa (CT557). El clon 12-G3-83 (SEQ ID NO:57), identificado utilizando la línea celular TCT-1, tiene un tamaño del inserto de 1537 pb, y tiene parte del ORF para la proteína hipotética CT622.
El clon 23-G7-68 (SEQ ID NO:79), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un inserto de 950 pb y contiene una pequeña parte del ORF ribosómico L11, el ORF completo para la proteína ribosómica L1 y una parte del ORF para la proteína ribosómica L10. El clon 22-F8-91 (SEQ ID NO:80), identificado utilizando la línea celular TCT-1, contiene un inserto de 395 pb que contiene una parte del ORF de pmpC sobre la hebra complementaria del clon. El clon 21-E8-95 (SEQ ID NO:81), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un inserto de 2.085 pb que contiene parte del ORF de CT613, el ORF completo para CT612, el ORF completo para CT611 y parte del ORF para CT610. El clon 19-F12-57 (SEQ ID NO:82), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un inserto de 405 pb que contiene parte del ORF de CT858 y una pequeña parte del ORF de recA. El clon 19-F12-53 (SEQ ID NO:83), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un inserto de 379 pb que es parte del ORF para CT455 que codifica la glutamil ARNt sintetasa. El clon 19-A5-54 (SEQ ID NO:84), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un inserto de 715 pb que es parte del ORF3 (hebra complementaria del clon) del plásmido críptico. El clon 17-E11-72 (SEQ ID NO:85), identificado utilizando la línea celular TCT-1, contiene un inserto de 476 pb que es parte del ORF para Opp_2 y pmpD. La región de pmpD de este clon está cubierta por la región de pmpD del clon 15-H2-76. El clon 17-C1-77 (SEQ ID NO:86), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un inserto de 1551 pb que es parte del ORF de CT857, así como parte del ORF de CT858. El clon 15-H2-76 (SEQ ID NO:87), identificado utilizando la línea celular TCT-1, contiene un inserto de 3.031 pb que contiene una gran parte del ORF de pmpD, parte del ORF de CT089, así como parte del ORF para SycE. El clon 15-A3-26 (SEQ ID NO:88), contiene un inserto de 976 pb que contiene parte del ORF para CT858. El clon 17-G4-36 (SEQ ID NO:267), identificado utilizando la línea celular TCT-10, contiene un inserto de 680 pb que está en marco con beta-gal en el plásmido y comparte homología con parte del ORF para la subunidad beta de la ARN polimerasa dirigida a ARN (CT315 en SerD).
Varios de los clones descritos anteriormente comparten homología con diversas proteínas de la membrana polimórficas. La secuencia genómica de Chlamydia trachomatis contiene una familia de nueve genes de la proteína de la membrana polimórfica, denominados pmp. Estos genes se denominan pmpA, pmpB, pmpC, pmpD, pmpE, pmpF, pmpG, pmpH y pmpI. Se cree que las proteínas expresadas a partir de estos genes tienen importancia biológica para generar una respuesta inmunológica protectora frente a una infección clamidial. En particular, pmpC, pmpD, pmpE y pmpI contienen péptidos señal predecibles, lo cual sugiere que son proteínas de la membrana externa y, por tanto, son dianas inmunológicas potenciales
Basándose en la secuencia de Chlamydia trachomatis de serovar LGVII, se diseñaron parejas de cebadores para amplificar mediante PCR los fragmentos de longitud completa de pmpC, pmpD, pmpE, pmpG, pmpH y pmpI. Los fragmentos resultantes se subclonaron en el vactor de vacuna de ADN JA4304 o JAL, que es JA4304 con un conector modificado (SmithKline Beecham, Londres, Reino Unido). De forma específica, pmpC se subclonó en el vector JAL utilizando el oligo 5'-GAT AGG CGC GCC GCA ATC ATG AAA TTT ATG TCA GCT ACT GCT G y el oligo 3'-CAG AAC GCG TTT AGA ATG TCA TAC GAG CAC CGC A, según se proporcionan en SEQ ID NO:197 y 198, respectivamente. La amplificación mediante PCR del gen bajo condiciones muy conocidas en la técnica y el acoplamiento en los sitios 5' ASCI/3' MluI del vector JAL se completó después de insertar la secuencia de nucleótidos corta GCAATC (SEQ ID NO:199) cadena arriba del ATG para crear una secuencia de tipo Kozak. El vector de expresión resultante contenía el gen pmpC de longitud competa que comprende 5325 nucleótidos (SEQ ID NO:173) que contiene la secuencia señal hipotética, que codifica una proteína de 187 kD (SEQ ID NO:179). El gen pmpD se subclonó en el vector de vacuna JA4304 tras la amplificación mediante PCR del gen utilizando los siguientes oligos: 5'-TGC AAT CAT GAG TTC GCA GAA AGA TAT AAA AAG C (SEQ ID NO:200) y 3'-CAG AGC TAG CTT AAA AGA TCA ATC GCA ATC CAG TAT TC (SEQ ID NO:201). El gen se acopló en el sitio 5' HIII con extremo romo/3' MluI del vector de vacuna JA4304 utilizando técnicas convencionales muy conocidas en la técnica. Se insertó la secuencia CAATC (SEQ ID NO:202) cadena arriba de ATG para crear una secuencia de tipo Kozak. Este clon es exclusivo porque falta la última treonina del sitio HindIII debido al procedimiento de formación de extremos romos, al igual que la última glicina en la secuencia de tipo Kozak. El inserto, un fragmento de 4593 nucleótidos (SEQ ID NO:172), es un gen de longitud completa para pmpD que contiene la secuencia señal hipotética, que codifica una proteína de 161 kD (SEQ ID NO:178). El pmpE se subclonó en el vector JA4304 utilizando el oligo 5'-TGC AAT CAT GAA AAA AGC GTT TTT CTT TTT C (SEQ ID NO:203), y el oligo 3'-CAG AAC GCG TCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C (SEQ ID NO:204). Tras la amplificación mediante PCR, el gen se acopló en el sitio 5' HIII con extremo romo/3' MluI de JA4304. Para facilitar esto se añadió una secuencia de nucleótidos corta, TGCAATC (SEQ ID NO:293), cadena arriba del codón de inicio para crear una secuencia de tipo Kozak y reconstruir el sitio HindIII. El inserto es el gen pmpE de longitud completa (SEQ ID NO:171) que contiene la secuencia señal hipotética. El gen pmpE codifica una proteína de 105 kD (SEQ ID NO:177). El gen pmpG se amplificó mediante PCR utilizando el oligo 5'-GTG CAA TCA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG (SEQ ID NO:205), y el oligo 3'-CAG AAC GCG TTT AGA ACC GGA CTT TAC TTC C (SEQ ID NO:206) y se subclonó en el vector JA4304. Se siguieron estrategias de clonación similares para los genes pmpI y pmpK. Además se diseñaron parejas de cebadores para amplificar mediante PCR los fragmentos de longitud completa o solapantes de los genes pmp, que entonces se subclonaron para la expresión de proteínas en el vector pET17b (Novagen, Madison, WI) y se transfectaron en E. coli BL21 pLysS para la expresión y la posterior purificación utilizando la metodología cromatográfica de histidina-níquel proporcionada por Novagen. Varios de los genes que codifican las proteínas recombinantes, como se describe a continuación, carecen de la secuencia señal nativa para para facilitar la expresión de la proteína. La expresión de la proteína de longitud completa de pmpC se logró mediante la expresión de dos fragmentos solapantes, que representan los extremos amino y carboxi terminales. La subclonación de la porción amino terminal de pmpC, que carece de la secuencia señal (SEQ ID NO:187, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:195), empleó el oligo 5'-CAG ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGA GGC GAG CTC GAT CCA AGA TC (SEQ ID NO:207), y el oligo 3'-CAG AGG TAC CTC AGA TAG CAC TCT CTC CTA TTA AAG TAG G (SEQ ID NO:208) en el sitio de clonación 5' NdeI/3' KPN del vector. La porción carboxi terminal del gen, el fragmento carboxi terminal de pmpC (SEQ ID NO:186, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:194), se subclonó en el sitio de clonación 5' NheI/3' KPN del vector de expresión utilizando los siguientes cebadores: oligo 5'-CAG AGC TAG CAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGT TAA GAT TGA GAA CTT CTC TGG C (SEQ ID NO:209), y oligo 3'-CAG AGG TAC CTT AGA ATG TCA TAC GAG CAC CGC AG (SEQ ID NO:210). El pmpD también se expresó como dos proteínas solapantes. La porción amino terminal de pmpD, que carece de la secuencia señal (SEQ ID NO:185, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:193), contiene el codón de inicio de pET17b y se expresa como una proteína de 80 kD. Para fines de expresión y purificación de proteínas, un marcador de seis histidinas sigue al codón de inicio y se acopla en el aminoácido 28º (nucleótido 84) del gen. Se emplearon los siguientes cebadores, el oligo 5'-CAG ACA TAT GCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG GTT AGC (SEQ ID NO:211), y el oligo 3'-CAG AGG TAC CTC AGC TCC TCC AGC ACA CTC TCT TC (SEQ ID NO:212), para romper el sitio de clonación 5' NdeI/3' KPN del vector. La porción carboxi terminal de pmpD (SEQ ID NO:184) se expresó como una proteína de 92 kD (SEQ ID NO:192). Para la expresión y la posterior purificación, se incluyeron una metionina, una alanina y una serina más, que representan el codón de inicio y los primeros dos aminoácidos del vector pET17b. Se condensa un marcador de seis histidinas cadena debajo de la metionina, la alanina y la serina en el aminoácido 69151 (nucleótido 2073) del gen. Se empleó el oligo 5'-CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CGG TGC TAT TTC TTG CTT ACG TGG (SEQ ID NO:213) y el oligo 3'-CAG AGG TAC TTn AAA AGA TCA ATC GCA ATC CAG TAT TCG (SEQ ID NO:214) para subclonar el inserto en el sitio de clonación 5' NheI/3' KPN del vector de expresión. El pmpE se expresó como una proteína de 106 kD (SEQ ID NO:183, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:191). El inserto de pmpE también carece de la secuencia señal nativa. La amplificación mediante PCR del gen bajo condiciones muy conocidas en la técnica se realizó utilizando los siguientes oligocebadores: 5'-CAG AGG ATC CAC ATC ACC ATC ACC ATC ACG GAC TAG CTA GAG AGG TTC (SEQ ID NO:215), y 3'-CAG AGA ATT CCT AGA ATC GCA GAG CAA TTT C (SEQ ID NO:216), y el inserto amplificado se acopló en un sitio 5' BamHI/3' EcoRI de JA4304. La secuencia de nucleótidos corta proporcionada en SEQ ID NO:217 se insertó cadena arriba del codón de inicio para crear una secuencia de tipo Kozak y reconstituir el sitio HindIII. La proteína expresada contenía el codón de inicio y los 21 aminoácidos cadena abajo del vector de expresión pET17b, es decir, MASMTGGQQMGRDSSLVPSSDP (SEQ ID NO:218). Además se incluye un marcador de seis histidinas cadena arriba de la secuencia descrita anteriormente y se condensa en el aminoácido 28º (nucleótido 84) del gen, lo cual elimina el péptido señal hipotético. Las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO:183, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:191, no incluyen estas secuencias adicionales. El gen pmpG (SEQ ID NO:182, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:190) se amplificó mediante PCR bajo condiciones muy conocidas en la técnica utilizando los siguientes oligocebadores: 5'-CAG AGG TAC CGC ATC ACC ATC ACC ATC ACA TGA TTC CTC AAG GAA TTT ACG (SEQ ID NO:219), y 3'-CAG AGC GGC CGC TTA GAA CCG GAC TTT ACT TCC (SEQ ID NO:220), y se acopló en el sitio de clonación 5' KPN/3' NotI del vector de expresión. La proteína expresada contiene una secuencia de aminoácidos adicional en el extremo amino terminal, a saber, MASMTGGQQNGRDSSLVPHHHHHH (SEQ ID NO:221), que comprende el codón de inicio y una secuencia adicional del vector de expresión pET17b. El gen pmpI (SEQ ID NO:181, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:189) se amplificó mediante PCR bajo condiciones muy conocidas en la técnica utilizando los siguientes oligocebadores: 5'-CAG AGC TAG CCA TCA CCA TCA CCA TCA CCT CTT TGG CCA GGA TCC C (SEQ ID NO:222), y 3'-CAG AAC TAG TCT AGA ACC TGT AAG TGG TCC (SEQ ID NO:223), y se acopló en el vector de expresión en el sitio de clonación 5' NheI/3' SpeI. La proteína expresada de 95 kD contenía el codón de inicio más una alanina y una serina adicionales del vector pET17b en el extremo amino terminal de la proteína. Ademas se condensa un marcador de seis histidinas en el aminoácido 21º del gen, que elimina el péptido señal hipotético.
El clon 14H1-4 (SEQ ID NO:56), identificado utilizando la línea celular TCT-3, contiene un ORF completo para el gen TSA (antioxidante específico de tiol), CT603 (el ORF de CT603 es un homólogo de CPn0778 de C. pneumoniae). El marco de lectura abierto de TSA en el clon 14-H1-4 se amplificó de forma que la proteína expresada poseía una metionina adicional y un marcador de 6X-histidina (extremo amino terminal). Este inserto amplificad se subclonó en los sitios Nde/EcoRI del vector pET17b. Tras la inducción de este clon con IPTG se purificó una proteína de 22,6 kDa mediante cromatografía de afinidad en agarosa Ni-NTA. La secuencia de aminoácidos determinada para el ORF de 195 aminoácidos del clon 14-H1-4 que codifica el gen TSA se proporciona en SEQ ID NO:65. Un posterior análisis produjo un clon de longitud completa para el gen TSA, denominado CTL2-TSA-FL, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos de longitud completa en SEQ ID NO:92.
Posteriores estudios produjeron 10 clones más identificados por las líneas de células T TCT-1 y TCT-3, como se describió anteriormente. Los clones identificados por la línea TCT-1 fueron: 16-D4-22, 17-C5-19, 18-C5-2, 20-G3-45 y 21-C7-66; los clones identificados por la línea TCT-3 fueron: 17-C10-31, 17-E2-9, 22-A1-49 y 22-B3-53. El clon 21-G12-60 fue reconocido por ambas líneas de células T TCT-1 y TCT-3. El 16-D4-22 (SEQ ID NO:119), identificado utilizando la línea celular TCT-1, contiene un inserto de 953 pb que contiene dos genes, partes del marco de lectura abierto 3 (ORF3) y ORF4 del plásmido de C. trachomatis para el crecimiento dentro de células de mamífero. El clon 17-C5-19 (SEQ ID NO:118) contiene un inserto de 951 pb que contiene parte del ORF para DT431, que codifica la clpP_1 proteasa y parte del ORF para CT430 (diaminopimelato epimerasa). El clon 18-C5-2 (SEQ ID NO:117) es parte del ORF para la proteína ribosómica S1, con un inserto de 446 pb que se identificó utilizando la línea celular TCT-1. El clon 20-G3-45 (SEQ ID NO:116), identificado por la línea celular TCT-1, contiene un inserto de 437 pb que es parte del gen pmpB (CT413). El clon 21-C7-66 (SEQ ID NO:115), identificado por la línea TCT-1, contiene un inserto de 995 pb que codifica parte de la proteína de tipo adnK. El inserto de este clon no se solapa con el inserto del clon de TCT-3 11-H4-28 (SEQ ID NO:59), que se demostró que formaba parte del gen CT396 de adnK del clon 17-C10-31 (SEQ ID NO:114), identificado por la línea celular TCT-3, que contiene un inserto de 976 pb. Este clon contiene parte del ORF para CT858, un IRBP que contiene proteasa, y dominios DHR. El clon 17-E2-9 (SEQ ID NO:113) contiene parte de los ORF para dos genes, CT611 y CT610, que abarcan un inserto de 1142 pb. El clon 22-A1-49 (SEQ ID NO:112), identificado utilizando la línea TCT-3, también contiene dos genes en un inserto de 698 pb. Parte del ORF para CT660 (ADN girasa{gyrA_2}) está presente en la hebra superior, mientras que el ORF completo para una proteína hipotética CT659 está presente en la hebra complementaria. El clon 22-B3-53 (SEQ ID NO:111), identificado por la línea TCT-1, tiene un inserto de 267 pb que codifica parte del ORF para GroEL (CT110). El clon 21-012-60 (SEQ ID NO:110), identificado por ambas líneas celulares TCT-1 y TCT-3, contiene un inserto de 1461 pb que contiene ORF parciales para las proteínas hipotéticas CT875, CT229 y
CT228.
Se obtuvieron más antígenos de Chlamydia seleccionando un banco de expresión genómico de Chlamydia trachomatis (serovar LGV II) en el vector Lambda Screen-1 (Novagen, Madison, WI) con suero reunido procedente de varios individuos infectado por Chlamydia, utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. Se identificaron los siguientes clones inmunorreactivos y se secuenciaron los insertos que contenían genes de Chlamydia: CTL2#1 (SEQ ID NO:71); CTL2#2 (SEQ ID NO:70); CTL2#3-5' (SEQ ID NO:72, una primera secuencia genómica determinada que representa el extremo 5'); CTL2#3-3' (SEQ ID NO:73, una segunda secuencia genómica determinada que representa el extremo 3'); CTL2#4 (SEQ ID NO:53); CTL2#5 (SEQ ID NO:69); CTL2#6 (SEQ ID NO:68); CTL2#7 (SEQ ID NO:67); CTL2#8b (SEQ ID NO:54); CTL2#9 (SEQ ID NO:66); CTL2#10-5' (SEQ ID NO:74, una primera secuencia genómica determinada que representa el extremo 5'); CTL2#10-3' (SEQ ID NO:75, una segunda secuencia genómica determinada que representa el extremo 3'); CT2#11-5' (SEQ ID NO:45, una primera secuencia genómica determinada que representa el extremo 5'); CTL2#11-3' (SEQ ID NO:44, una segunda secuencia genómica determinada que representa el extremo 3'); CTL2#12 (SEQ ID NO:46); CTL2#16-5' (SEQ ID NO:47); CTL2#18-5' (SEQ ID NO:49, una primera secuencia genómica determinada que representa el extremo 5'); CTL2#18-3' (SEQ ID NO:48, una segunda secuencia genómica determinada que representa el extremo 3'); CTL2#19-5' (SEQ ID NO:76, la secuencia genómica determinada que representa el extremo 5'); CTL2#21 (SEQ ID NO:50); CTL2#23 (SEQ ID NO:51); y CTL2#24 (SEQ ID NO:52).
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Se identificaron más antígenos de Chlamydia trachomatis mediante la clonación de expresión serológica. Estos estudios emplearon suero reunido procedente de varios individuos infectados por Chlamydia, como se describió anteriormente, pero se emplearon anticuerpos IgA e IgM además de IgG como anticuerpos secundarios. Los clones seleccionados mediante este método potencian la detección de antígenos reconocidos por una respuesta inmunológica temprana frente a una infección clamidial, que es una respuesta inmunológica humoral mucósica. Se caracterizaron los siguientes clones inmunorreactivos y se secuenciaron los insertos que contenían genes de Chlamydia: CTL2gam-1 (SEQ ID NO:290), CTL2gam-2 (SEQ ID NO:289), CTL2gam-5 (SEQ ID NO:288), CTL2gam-6-3' (SEQ ID NO:287, una segunda secuencia genómica determinada que representa el extremo 3'), CTL2gam-6-5' (SEQ ID NO:286, una primera secuencia genómica determinada que representa el extremo 5'), CTL2gam-8 (SEQ ID NO:285), CTL2gam-10 (SEQ ID NO:284), CTL2gam-13 (SEQ ID NO:283), CTL2gam-15-3' (SEQ ID NO:282, una segunda secuencia genómica determinada que representa el extremo 3'), CTL2gam-15-5' (SEQ ID NO:281, una primera secuencia genómica determinada que representa el extremo 5'), CTL2gam-17 (SEQ ID NO:280), CTL2gam-18 (SEQ ID NO:279), CTL2gam-21 (SEQ ID NO:278), CTL2gam-23 (SEQ ID NO:277), CTL2gam-24 (SEQ ID NO:276), CTL2gam-26 (SEQ ID NO:275), CTL2gam-27 (SEQ ID NO:274), CTL2gam-28 (SEQ ID NO:273), CTL2gam-30-3' (SEQ ID NO:272, una segunda secuencia genómica determinada que representa el extremo 3'), y CTL2gam-30-5' (SEQ ID NO:271, una primera secuencia genómica determinada que representa el extremo 5').
Ejemplo 2
Inducción de la proliferación de células T y de la producción de interferón-\gamma por antígenos DE Chlamydia trachomatis
Se determinó la capacidad de antígenos de Chlamydia trachomatis recombinantes para inducir la proliferación de células T y la producción de interferón-\gamma como sigue.
Las proteínas se inducen mediante IPTG y se purifican mediante una cromatografía de afinidad en agarosa Ni-NTA (Webb et al., J. Immunology, 157:5034-5041, 1996). Los polipéptidos purificados entonces se seleccionan para la capacidad para inducir la proliferación de células T en preparaciones de PBMC. Las PBMC procedentes de pacientes con C. trachomatis, así como procedentes de donantes normales cuyas células T se sabe que proliferan en respuesta a antígenos de Chlamydia, se cultivan en un medio que comprende RPMI 1640 suplementado con suero humano reunido al 10% y gentamicina 50 \mug/ml. Los polipéptidos purificados se añaden por duplicado a concentraciones de 0,5 a 10 \mug/ml. Después de seis días de cultivo en placas de fondo donde de 96 pocillos en un volumen de 200 \mul, se retiran 50 \mul del medio de cada pocillo para la determinación de los niveles de IFN-\gamma, como se describe a continuación. Las placas entonces se pulsan con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada durante 18 horas más, se recolectan y se determina la captación de tritio utilizando un contador de centelleo de gases. Las fracciones que producen una proliferación en ambas replicaciones que era tres veces mayor que la proliferación observada en las células cultivadas sólo con medio se consideran positivas.
Se mide el IFN-\gamma utilizando un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA). Las placas de ELISA se revisten con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido al IFN-\gamma humano (PharMingen, San Diego, CA) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. Los pocillos después se bloquean con PBS que contiene leche desnatada en polvo al 5% (en p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan seis veces en PBS/TWEEN-20 al 0,2% y las muestras se diluyen 1:2 en medio de cultivo. Las placas de ELISA se incuban durante la noche a temperatura ambiente. Las placas de nuevo se lavan y se añade a cada pocillo un suero anti-IFN-\gamma humano de conejo policlonal diluido 1:3000 en PBS/suero de cabra normal al 10%. Las placas entonces se incuban durante dos horas a temperatura ambiente, se lavan y se añade anti-IgG de conejo acoplado con peroxidasa de rábano (Sigma Chemical So., St. Louis, MO) a una dilución de 1:2000 en PBS/leche desnatada en polvo al 5%. Después de dos horas más de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavan y se añade un sustrato de TMB. La reacción se detiene después de 20 min con ácido sulfúrico 1 N. Se determina la densidad óptica a 450 nm utilizando 570 nm como longitud de onda de referencia. Las fracciones cuyo resultado en ambas replicaciones es una DO dos veces mayor que la DO media de células cultivadas sólo con medio, más 3 desviaciones estándar, se consideran positivas.
Utilizando la anterior metodología, se descubrió que la proteína 1B1-66 recombinante (SEQ ID NO:5), así como dos péptidos sintéticos que se corresponden con los restos aminoácidos 48-67 (SEQ ID NO:13, denominado 1-B1-66/48-67) y 58-77 (SEQ ID NO:14, denominado 1B1-66/58-77), respectivamente, de SEQ ID NO:5, inducían una respuesta proliferativa y la producción de IFN-\gamma en una línea de células T específica de Chlamydia utilizada para seleccionar un banco genómico de C. trachomatis LGV II.
Otros estudios han identificado un epitopo de células T específico de C. trachomatis en la proteína S 13 ribosómica. Empleando técnicas de cartografiado de epitopos convencionales muy conocidas en la técnica se identificaron dos epitopos de células T en la proteína S 13 ribosómica (rS13) con una línea de células T específica de Chlamydia procedente del donante CL-8 (línea de células T TCL-8 EB/DC). La figura 8 indica que el primer péptido rS13 1-20 (SEQ ID NO:106), es 100% idéntico a la correspondiente secuencia de C. pneumoniae, lo cual explica la reactividad cruzada de la línea de células T con rS13 de C. pneumoniae y rS13 de C. trachomatis recombinantes. La respuesta al segundo péptido, rS13 56-75 (SEQ ID NO:108), es específica de C. trachomatis, lo cual indica que la respuesta de rS13 en este donante asintomático sano es provocada por la exposición a C. trachomatis y no a C. pneumoniae, ni a cualquier otra infección microbiana.
Como se describe en el ejemplo 1, el clon 11-C12-91 (SEQ ID NO:63), identificado utilizando la línea celular TCP-21, tiene un inserto de 269 pb que es parte del gen OMP2 (CT443) y comparte homología con la proteína de la membrana externa rica en cisteína de 60 kDa de C. pneumoniae, denominada OMCB. Para definir aún más el epitopo o epitopos reactivos se realizó un cartografiado de epitopos utilizando una serie de péptidos solapantes y el inmunoensayo previamente descrito. Brevemente, se determinaron las respuestas proliferativas estimulando 2,5 x 10^{4} células T TCP-21 en presencia de 1 x 10^{4} células dendríticas derivadas de monocitos, con cuerpos elementales no infecciosos derivados de C. trachomatis y C. pneumoniae, o péptidos derivados de la secuencia de la proteína OMCB de C. trachomatis o C. pneumoniae (0,1 \mug/ml). Las células T TCP-21 respondieron a los epitopos CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190, CT-OMCB #171-186, y en menor grado a CT-OMCB #175-186 (SEQ ID NO:249-252, respectivamente). De manera notable, la línea de células T TCP-21 también produjo una respuesta proliferativa al péptido homólogo CP-OMCB #171-186 de C. pneumoniae (SEQ ID NO:253), que era igual o mayor que la respuesta a los péptidos de C. trachomatis. Las sustituciones de aminoácidos en la posición dos (es decir, Asp por Glu) y en la posición cuatro (es decir, Cys por Ser) no alteraron las respuestas proliferativas de las células T y, por tanto, se demuestra que este epitopo es un epitopo de reactividad cruzada entre C. trachomatis y C. pneumoniae.
Para definir aún más el epitopo descrito anteriormente, se empleó otra línea de células T, TCT-3, en los experimentos de cartografiado de epitopos. Se realizaron inmunoensayos como se describió anteriormente, excepto que sólo se ensayaron péptidos de C. trachomatis. Las células T produjeron respuestas proliferativas frente a dos péptidos, CT-OMCB #152-171 y CT-OMCB #157-176 (SEQ ID NO:246 y 247, respectivamente), definiendo con ello otro epitopo inmunogénico en la proteína de la membrana externa rica en cisteína de C. trachomatis.
El clon 14H1-4 (SEQ ID NO:56, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos de longitud completa en SEQ ID NO:92) se identificó utilizando la línea celular TCT-3 en el sistema de clonación de expresión de células T CD4 previamente descrito, y se demostró que contenía un ORF completo para el gen del antioxidante específico de tiol (CT603), denominado TSA. Se realizaron los inmunoensayos de cartografiado de epitopos, como se describió anteriormente, para definir aún más el epitopo. La línea de células T TCT-3 muestra una fuerte respuesta proliferativa a los péptidos solapantes CT-TSA #96-115, CT-TSA #101-120 y CT-TSA #106-125 (SEQ ID NO:254-256, respectivamente), lo cual demuestra que existe un epitopo inmunorreactivo en el gen del antioxidante específico de tiol de C. trachomatis de serovar LGV II.
Ejemplo 3
Preparación de polipéptidos sintéticos
Pueden sintetizarse polipéptidos en un sintetizador de péptido Millipore 9050 utilizando la química de FMOC con activación con HPTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio). Una secuencia Gly-Cys-Gly puede unirse al extremo amino terminal del péptido para proporcionar un método para conjugar o marcar el péptido. La escisión de los péptidos del soporte sólido puede realizarse utilizando la siguiente mezcla de escisión: ácido trifluoracético:etanditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Después de realizar la escisión durante 2 horas, los péptidos puede precipitarse en metil t-butil éter frío. Los precipitados peptídicos entonces pueden disolverse en agua que contiene ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y liofilizarse antes de una purificación mediante una HPLC en fase inversa C18. Puede utilizarse un gradiente de acetonitrilo del 0-60% (que contiene TFA al 0,1%) en agua (que contiene TFA al 0,1%) para eluir los péptidos. Tras la liofilización de las fracciones puras, los péptidos pueden caracterizarse utilizando una espectrometría de masas con electronebulización y mediante un análisis de aminoácidos.
Ejemplo 4
Aislamiento y caracterización de secuencias de ADN que codifican antígenos de Chlamydia utilizando sistemas de vectores de expresión retrovíricos y el posterior análisis inmunológico
Se construyó un banco genómico de Chlamydia trachomatis LGV II mediante digestiones limitadas utilizando las enzimas de restricción BamHI, BgIII, BstYi y MboI. Los fragmentos de la digestión de restricción posteriormente se acoplaron en el sitio BamHI de los vectores retrovíricos pBIB-KS1, 2, 3. Este conjunto de vectores se modificó para que contuviese un sitio de inicio de la traducción Kosak y codones de fin para permitir la expresión de proteínas a partir de fragmentos genómicos de ADN cortos, como se muestra en la figura 2. Se prepararon agrupaciones de ADN de 80 clones y se transfectaron en la línea de encapsulación retrovírica Pheonix-Ampho, como se describe en Pear, W.S., Scott, M.L. y Nolan, G.P., Generation of High Titre, Helper-free Retroviruses by Transient Transfection. Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp. 41-57. El banco de Chlamydia en forma retrovírica entonces se transdujo en células P815 que expresan H2-Ld, que entonces se emplearon como células diana para estimular una línea de células T específica de antígeno.
Una línea de células T CD8+ H2^{d} restringida murina, específica de Chlamydia, se expandió en cultivo mediante rondas repetidas de estimulación con células J774 infectadas con C. trachomatis irradiadas y células esplénicas singeneicas irradiadas, como se describe en Starnbach, M., J. Immunol., 153:5183, 1994. Esta línea de células T específica de Chlamydia se empleó para seleccionar el anterior banco genómico de Chlamydia expresado por las células P815 retrovíricamente transducidas. Se identificaron las agrupaciones de ADN positivas mediante la detección de la producción de IFN-\gamma utilizando una análisis Elispot (véase Lalvani et al., J. Experimental Medicine, 186:859-865, 1997).
Se identificaron dos agrupaciones positivas, denominadas 2C7 y 3E10, mediante los análisis Elispot de IFN-\gamma. Se clonaron los transductantes estables de las células P815 a partir de la agrupación 2C7 mediante dilución limitante y se seleccionaron clones individuales basándose en su capacidad para provocar la producción de IFN-\gamma en la línea CTL específica de Chlamydia. Como resultado de este proceso de selección se seleccionaron cuatro clones positivos, denominados 2C7-8, 2C7-9, 2C7-19 y 2C7-21. De manera similar, la agrupación positiva 2E10 se seleccionó posteriormente, dando como resultado otro clon positivo, que contiene tres insertos. Los tres insertos son fragmentos de los genes CT016, ARNt sintasa, y clpX (SEQ ID NO:268-270, respectivamente).
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Se amplificó ADN transgénico procedente de estos cuatro clones 2C7.8 positivos mediante PCR utilizando cebadores específicos de pBIB-KS para amplificar de modo selectivo el inserto de ADN de Chlamydia. Los insertos amplificados se purificaron en gel y se secuenciaron. Un clon inmunorreactivo, 2C7-8 (SEQ ID NO:15, proporcionándose la secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:32), es un fragmento de 160 pb con homología con los nucleótidos 597304-597145 de Chlamydia trachomatis de serovar D (NCBI, búsqueda BLASTN; SEQ ID NO:33, proporcionándose la secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:34). La secuencia del clon 2C7-8 se cartografía dentro de dos marcos de lectura abierta putativos de la región de alta homología descrita justo anteriormente y, en particular, se demostró que uno de estos marcos de lectura abiertos putativos, que consiste en un fragmento de 298 aminoácidos (SEQ ID NO:16, proporcionándose la secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:17), mostraba actividad inmunológica.
Se obtuvo la clonación de longitud completa del fragmento de 298 aminoácidos (denominado CT529 y/o el gen Cap1) del serovar L2 mediante una amplificación con PCR utilizando los cebadores 5'-ttttgaagcaggtaggtgaatatg (directo) (SEQ ID NO:159) y 5'-ttaagaaatttaaaaaatccctta (inverso) (SEQ ID NO:160), utilizando ADN genómico de C. trachomatis L2 como molde. Este producto de la PCR se purificó en gel, se clonó en pCRBlunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la secuenciación, y después se subclonó en el sitio EcoRI de pBIB-KMS, un derivado de pBIB-KS para la expresión. El homólogo de CT529 de Chlamydia pneumoniae se proporciona en SEQ ID NO:291, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:292.
El ADN de longitud completa que codificar diversos CT529 de serovares se amplificó mediante PCR a partir de lisados bacterianos que contenían 10^{5} IFU, fundamentalmente como se ha sido descrito (Denamur, E., C. Sayada, A. Souriau, J. Orfila, A. Rodolakis y J. Elion, 1991, J. Gen. Microbiol., 137:2525). Los siguientes serovares se amplificaron como se describió: Ba (SEQ ID NO:134, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:135); E (BOUR) y E (MTW447) (SEQ ID NO:122, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:123); F (NI1) (SEQ ID NO:128, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:129); G (SEQ ID NO:126, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:127); Ia (SEQ ID NO:124, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:125); L1 (SEQ ID NO:130, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:131); L3 (SEQ ID NO:132, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:133); I (SEQ ID NO:263, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:264); K (SEQ ID NO:265, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:266); y MoPn (SEQ ID NO:136, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en SEQ ID NO:137). La reacciones de PCR se realizaron con el kit de PCR Advantage Genomic (Clontech, Palo Alto, CA) utilizando cebadores específicos para el ADN del serovar L2 (externos al ORF). Las secuencias de los cebadores fueron 5'-ggtataatatctctctaaattttg (directo - SEQ ID NO:161) y 5'-agataaaaaaggctgtttc' (inverso - SEQ ID NO:162) excepto para MoPn que requirió 5'-ttttgaagcaggtaggtgaatatg (directo - SEQ ID NO:163) y 5'-tttacaataagaaaagctaagcactttgt (inverso - SEQ ID NO:164). El ADN amplificado mediante PCR se purificó con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Valencia, CA) y se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la secuenciación.
La secuenciación del ADN derivado de los insertos amplificados mediante PCR de los clones inmunorreativos se realizó en un secuenciador automático (ABI 377) utilizando un cebador directo específico de pBIB-KS, 5'-ccttacacagtcctgctgac (SEQ ID NO:165), y un cebador inverso, 3'-gtttccgggccctcacattg (SEQ ID NO:166). Se secuenció el ADN clonado con PCRBlunt que codifica CT529 del serovar L2, y ADN clonado con pCR2.1 que codifica CT529 del serovar Ba, E (BOUR), E (MTW447), F (NI1), G, Ia, K, L1, L3 y MoPn, utilizando un cebador del promotor de T7 y cebadores universales directos de M 13 e inversos de M 13.
Para determinar si estos marcos de lectura abiertos putativos (SEQ ID NO:16 y 20) codifican una proteína con una función inmunológica asociada, se sintetizaron péptidos solapantes (con una longitud de 17-20 aminoácidos) que abarcan las longitudes de los dos marcos de lectura abiertos, como se describe en el ejemplo 3. Se utilizó un ensayo de liberación de cromo convencional para determinar el porcentaje de lisis específica de células diana H2^{d} restringidas pulsadas con péptidos. En este ensayo, se marcaron partes alícuotas de células P815 (H2^{d}) a 37ºC durante una hora con 100 \muCi de ^{51}Cr en presencia o en ausencia de 1 \mug/ml de los péptidos indicados. Tras esta incubación, las células P815 marcadas se lavaron para eliminar el exceso de ^{51}Cr y péptido, y después se cultivaron en placas de microcultivo por duplicado a una concentración de 1.000 células/pocillo. Se añadieron CTL efectoras (células T CD8 específicas de Chlamydia) a las proporciones de efectora:diana indicadas. Tras una incubación de 4 horas, los sobrenadantes se recogieron y se midieron con un contador gamma para determinar la liberación de ^{51}Cr hacia el sobrenadante. Dos péptidos solapantes de los 298 aminoácidos del marco de lectura abierto estimularon de modo específico la línea CTL. Se sintetizaron los péptidos representados en SEQ ID NO:138-156, que representan la traducción del homólogo de L2 del marco de lectura abierto del serovar D para CT529 (gen Cap1) y el marco de lectura abierto de 216 aminoácidos. Como se muestra en la figura 3, los péptidos CtC7.8-12 (SEQ ID NO:18, también denominado Cap1#132-147, SEQ ID NO:139) y CtC7.8-13 (SEQ ID NO:19, también denominado Cap1#138-155, SEQ ID NO:140) fueron capaces de provocar una lisis específica del 38% al 52%, respectivamente, con una proporción de efectoras a diana de 10:1. De manera notable, el solapamiento entre estos dos péptidos contenía un péptido de unión a H2^{d} (K^{d} y L^{d}) predicho. Se sintetizó un péptido de 10 aminoácidos para que se correspondiese con esta secuencia solapante (SEQ ID NO:31), y se descubrió que generaba una fuerte respuesta inmunológica en la línea CTL anti-Chlamydia mediante el ensayo Elispot. De manera significativa, una búsqueda en la base de datos de GenBank más reciente no reveló proteínas que previamente se hubieran descrito para este gen. Por tanto, el marco de lectura abierto putativo que codifica el clon 2C7-8 (SEQ ID NO:15) define un gen que incluye un antígeno de Chlamydia capaz de estimular células T CD8+ específicas de antígeno de una manera MHC I-restringida, lo cual demuestra que este antígeno puede utilizarse para desarrollar una vacuna contra Chlamydia.
Para confirmar estos resultados y para cartografiar más a fondo el epitopo se fabricaron péptidos truncados (SEQ ID NO:138-156) y se ensayaron para su reconocimiento por células T en un ensayo ELISPOT de IFN-\gamma. Los truncamientos de Ser139 (Cap1#140-147, SEQ ID NO:146) o Leu147 (Cap1#138-146, SEQ ID NO:147) abrogan el reconocimiento por las células T. Estos resultados indican que el péptido 9-mero Cap1#139-147 (SFIGGITYL, SEQ ID NO:145) es el epitopo mínimo reconocido por células T específicas de Chlamydia.
Los alineamientos de las secuencias de Cap1 (CT529) de serovares seleccionados de C. trachomatis (SEQ ID NO:121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137 y 139) demuestran que una de las diferencias en los aminoácidos se encuentra en la posición 2 del epitopo propuesto. El péptido homólogo del serovar D es SIIGGITYL (SEQ ID NO:168). Se comparó la capacidad de SFIGGITYL y SIIGGITYL para dirigirse a células para el reconocimiento por las células T específicas de Chlamydia. Diluciones en serie de cada péptido se incubaron con células P815 y se ensayaron para el reconocimiento por las células T en un ensayo de liberación de ^{51}Cr, como se describió anteriormente. Las células T específicas de Chlamydia reconocieron el péptido del serovar L2 a una concentración mínima de 1 nM y el péptido del serovar D a una concentración mínima de 10 nM.
Otros estudios han demostrado que el clon de células T específico de Cap1#139-147 reconoce a células infectadas por C. trachomatis. Para confirmar que Cap1_{139-147} se presenta sobre la superficie de células infectadas por Chlamydia se infectaron células Balb-3T3 (H-2^{d}) con C. trachomatis de serovar L2 y se ensayaron para determinar si estas células son reconocidas por un clon de células T CD8+ específico para el epitopo de Cap1#139-147 (SEQ ID NO:145). El clon de células T específico para el epitopo de Cap1#139-147 se obtuvo mediante una dilución limitante de la línea de células T 69. El clon de células T reconoció de modo específico las células infectadas por Chlamydia. En estos experimentos, las células diana fueron células Balb/3T3 infectadas con C. trachomatis (control positivo) o no infectadas, que muestran una lisis específica de 45%, 36% y 30% a 30:1, 10:1 y 3:1 de proporción entre efectoras a diana, respectivamente; o el epitopo de Cap1#139-147 (SEQ ID NO:145) revestido, o células P185 no tratadas, que muestran una lisis específica de 83%, 75% y 58% a 30:1, 10:1 y 3:1 de proporción entre efectoras a diana, respectivamente (los controles negativos tienen menos de 5% de lisis en todos los casos). Estos datos sugieren que el epitopo está presente durante la infección.
Los estudios in vivo demuestran que las células T específicas del epitopo de Cap1#139-147 son cebadas durante una infección murina con C. trachomatis. Para determinar si la infección con C. trachomatis ceba una respuesta de células T específica del epitopo de Cap1#139-147, los ratones fueron infectados por vía intraperitoneal con 10^{8} IFU de C. trachomatis de serovar L2. Dos semanas después de la infección, los ratones fueron sacrificados y las células esplénicas se estimularon sobre células esplénicas singeneicas irradiadas pulsadas con el péptido del epitopo de Cap1#139-147. Después de 5 días de estimulación, los cultivos se utilizaron en un ensayo de liberación de ^{51}Cr convencional para determinar si había células T específicas del epitopo de Cap1#139-147 en el cultivo. De modo específico, células esplénicas de un ratón inmunizado con C. trachomatis de serovar D o de un ratón control inyectadas con PBS después de 5 días de cultivo con células esplénicas singeneicas revestidas con el péptido Cap1#139-147 y células T CD8+ capaces de reconocer de modo específico el epitopo de Cap1#139-147 produjeron una lisis específica de 73%, 60% y 32% a una proporción entre efectoras a diana de 30:1, 10:1 y 3:1, respectivamente. Los ratones control presentaban un porcentaje de lisis de aproximadamente 10% a una proporción entre efectoras a diana de 30:1 y ésta disminuyó de manera constante con unas proporciones de E:D cada vez menores. Las células diana eran células P815 revestidas con el péptido Cap1#139-147 o sin tratar. Estos datos sugieren que las células T específicas del péptido Cap1#139-147 son cebadas durante una infección murina con C. trachomatis.
Ejemplo 5
Generación de respuestas de anticuerpos y de células T en ratones inmunizados con antígenos de Chlamydia
Se realizaron estudios de inmunogenicidad para determinar las respuestas de anticuerpos y de células T CD4+ en ratones inmunizados con proteínas SWIB o S 13 purificadas formuladas con adyuvante de Montanide, o inmunizaciones basadas en ADN con vectores de expresión pADNc-3 que contenía las secuencias de ADN para SWIB o S 13. El SWIB también se denomina clon 1-B1-66 (SEQ ID NO:1, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:5), y la proteína ribosómica S 13 también se denomina clon 10-C10-31 (SEQ ID NO:4, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:12). En el primer experimento, grupos de tres ratones C57BL/6 se inmunizaron dos veces y se controlaron para las respuestas de anticuerpos y de células T CD4+. Las inmunizaciones con ADN fueron intradérmicas en la base de la cola, y las inmunizaciones con polipéptidos se administraron por vía subcutánea. Los resultados de los ensayos de incorporación de ^{3}H convencionales de células esplénicas en ratones inmunizados muestran una fuerte respuesta proliferativa en el grupo inmunizado con el polipéptido SWIB recombinante purificado (SEQ ID NO:5). Otros análisis mediante ensayos de inducción de citoquinas, como se describió previamente, demuestran que el grupo inmunizado con el polipéptido SWIB produjo una respuesta mensurable de IFN-\gamma e IL-4. Se realizaron posteriores ensayos basados en ELISA para determinar la respuesta isotípica de anticuerpos predominante en el grupo experimental inmunizado con el polipéptido SWIB. La figura 4 indica que el grupo inmunizado con SWIB produjo una respuesta humoral que era predominantemente de IgG1.
En un segundo experimento, ratones C3H se inmunizaron tres veces con 10 \mug de proteína SWIB purificada (también denominada clon 1-B1-66, SEQ ID NO:5) formulada en PBS o en Montanide en intervalos de tres semanas y se realizó la recolección dos semanas después de la tercera inmunización. Se determinaron las valoraciones de anticuerpos dirigidos contra la proteína SWIB mediante técnicas basadas en ELISA muy conocidas en la técnica, que demostraron que la proteína SWIB formulada con el adyuvante de Montanide indujo una fuerte respuesta inmunológica humoral. Se determinaron las respuestas proliferativas de células T mediante un ensayo basado en XTT (Scudiero et al., Cancer Research, 1988, 48:4827). Como se muestra en la figura 5, los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con el polipéptido SWIB más Montanide provocaron una respuesta proliferativa específica de antígeno. Además, se determinó la capacidad de los esplenocitos procedentes de animales inmunizados para segregar IFN-\gamma en respuesta al polipéptido SWIB recombinante soluble utilizando el ensayo de inducción de citoquinas previamente descrito. Los esplenocitos de todos los animales en el grupo inmunizado con el polipéptido SWIB formulado con adyuvante de Montanide segregaron IFN-\gamma en respuesta a la exposición al antígeno de Chlamydia SWIB, lo cual demuestra una respuesta inmunológica específica de Chlamydia.
En otro experimento, se inmunizaron ratones C3H en tres momentos del tiempo distintos en la base de la cola con 10 \mug de proteína SWIB o S 13 purificada (C. trachomatis, proteína SWIB, clon 1-B1-66, SEQ ID NO:5, y proteína S 13, clon 10-C10-31, SEQ ID NO:4) formuladas con el adyuvante SBAS2 (SmithKline Beecham, Londres, Reino Unido). Las valoraciones de anticuerpos específicos de antígeno se midieron mediante ELISA, demostrando que ambos polipéptidos inducían una fuerte respuesta de IgG, que varía en valoraciones de 1 x 10^{-4} a 1 x 10^{-5}. Los componentes de IgG1 e IgG2 de esta respuesta estaban presentes en cantidades bastante iguales. Las respuestas proliferativas de células T específicas de antígeno, determinadas mediante ensayos de incorporación de ^{3}H convencionales en células esplénicas aisladas a partir de ratones inmunizados, fueron bastante fuertes para SWIB (50.000 cpm por encima del control negativo) y aún más fuertes para S 13 (100.000 cpm por encima del control negativo). La producción de IFN-\gamma se ensayó mediante técnicas de ELISA convencionales del sobrenadante del cultivo en proliferación. La reestimulación in vitro del cultivo con la proteína S 13 indujo unos niveles altos de producción de IFN-\gamma, aproximadamente 25 ng/ml frente a 2 ng/ml para el control negativo. La reestimulación con la proteína SWIB también indujo IFN-\gamma, aunque en un grado menor.
En un experimento relacionado, ratones C3H fueron inmunizados en tres momentos del tiempo distintos con 10 \mug de proteína SWIB o S 13 purificada (C. trachomatis, proteína SWIB, clon 1-B1-66, SEQ ID NO:5, y proteína S 13, clon 10-C10-31, SEQ ID NO:4) mezcladas con 10 \mug de toxina del cólera. La inmunización mucósica se realizó mediante inoculación intranasal. Las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno se determinaron mediante técnicas ELISA convencionales. Anticuerpos IgG específicos de antígenos estuvieron presentes en la sangre de ratones inmunizados con SWIB, con unas valoraciones que varían de 1 x 10^{-3} a 1 x 10^{-4}, pero no fueron detectables en los animales inmunizados con S 13. Las respuestas de células T específicas de antígeno de esplenocitos aislados, según se midió mediante la producción de IFN-\gamma, produjeron un resultados similares a los descritos justo anteriormente para la inmunización sistémica.
Se realizó un estudio animal para determinar la inmunogenicidad del epitopo de CTL de CT529 del serovar LGV II, definido por el péptido consenso 10-mero de CT529 (CSFIGGITYL - SEQ ID NO:31), que se identificó como un epitopo de CTL H2-Kd restringido. Se inmunizaron ratones BABL/c (3 ratones por grupo) tres veces con 25 \mug de péptido combinado con diversos adyuvantes. El péptido se administró por vía sistémica en la base de la cola en el sistema adyuvante de SKB SBAS-2", SBAS-7 (SmithKline Beecham, Londres, Reino Unido) o Montanide. El péptido también se administró por vía intranasal mezclado con 10 ug de toxina del cólera (CT). Se utilizaron ratones sin estimular como control. Cuatro semanas después de la 3ª inmunización, las células esplénicas se reestimularon con blastos-LPS pulsados con péptido consenso 10-mero de CT529 10 ug/ml a tres proporciones diferentes de efectoras a blastos-LPS: 6, 1,5 y 0,4 a 1 x 10^{6} células/ml. Después de 2 reestimulaciones, las células efectoras se ensayaron para su capacidad para lisar células P815 pulsadas con péptidos utilizando un ensayo de liberación de cromo convencional. Se empleó un péptido no relevante de ovoalbúmina de huevo de pollo como control negativo. Los resultados demuestran que se produjo una respuesta inmunológica significativa hacia el péptido consenso 10-mero de CT529 y que, en respuesta a la inmunización con el péptido, fueron suscitadas células T específicas de antígeno capaces de lisar las dianas pulsadas con péptidos. De modo específico, se descubrieron actividades líticas específicas de antígeno en el grupo con adyuvante de SBAS-7 y CT, mientras que Montanide y SBAS-2" no pudieron adyuvar a la inmunización de epitopo de CTL.
Ejemplo 6
Expresión y caracterización de genes de Chlamydia pneumoniae
La línea de células T humana TCL-8, descrita en el ejemplo 1, reconoce a células dendríticas derivadas de monocitos infectadas con Chlamydia trachomatis así como con Chlamydia pneumoniae, lo cual sugiere que Chlamydia trachomatis y C. pneumoniae podrían codificar epitopos de células T de reactividad cruzada. Para aislar los genes de Chlamydia pneumoniae homólogos al clon 1B1-66 de Chlamydia trachomatis LGV II, también denominado SWIB (SEQ ID NO:1), y al clon 10C10-31, también denominado proteína ribosómica S 13 (SEQ ID NO:4), se infectaron células HeLa con la cepa TWAR de C. pneumoniae (CDC/CWL-029). Después de tres días de incubación se recolectaron las células HeLa infectadas con C. pneumoniae, se lavaron y se resuspendieron en 200 \mul de agua y se calentaron en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos. Se emplearon 10 microlitros de la suspensión de células rotas como molde de la PCR.
Se diseñaron cebadores específicos de C. pneumoniae para los clones 1B1-66 y 10C10-31, de forma que el extremo 5' tenía un marcador de 6X-histidina y un sitio Nde I inserto, y el extremo 3' tenía un codón de fin y un sitio BamHI incluido (figura 6). Los productos de la PCR se amplificaron y se secuenciaron mediante técnicas convencionales muy conocidas en la técnica. Los productos de la PCR específicos de C. pneumoniae se clonaron en el vector de expresión pET17B (Novagen, Madison, WI) y se transfectaron en E. coli BL21 pLysS para la expresión y la posterior purificación utilizando la metodología cromatográfica de níquel-histidina proporcionada por Novagen. De esta forma se generaron dos proteínas de C. pneumoniae, una proteína de 10-11 kDa denominada CpSWIB (SEQ ID NO:27, y SEQ ID NO:78 que tiene un marcador de 6X-his, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:28, respectivamente), una proteína de 15 kDa denominada CpS 13 (SEQ ID NO:29, y SEQ ID NO:77 que tiene un marcador 6X-his, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:30 y 91, respectivamente).
Ejemplo 7
Inducción de la proliferación de células t y de la producción de interferón-\gamma por antígenos de Chlamydia pneumoniae
Se determinó la capacidad de antígenos de Chlamydia pneumoniae recombinantes para inducir la proliferación de células T y la producción de interferón-\gamma.
Las proteínas se indujeron mediante IPTG y se purificaron mediante una cromatografía de afinidad en agarosa Ni-NTA (Webb et al., J. Immunology, 157:5034-5041, 1996). Los polipéptidos purificados entonces se seleccionaron para la capacidad de inducir la proliferación de células T en preparaciones de PBMC. Se cultivan PBMC procedentes de pacientes con C. pneumoniae, así como de donantes normales cuyas células T se sabe que proliferan en respuesta a antígenos de Chlamydia, en medio que comprende RPMI 1640 suplementado con suero humano reunido al 10% y gentamicina 50 \mug/ml. Se añaden los polipéptidos purificados por duplicado a concentraciones de 0,5 a 10 \mug/ml. Después de seis días de cultivo en placas de fondo redondo de 96 pocillos en un volumen de 200 \mul se retiran 50 \mul de medio de cada pocillo para la determinación de los niveles de IFN-\gamma, como se describe a continuación. Las placas entonces se pulsan con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada durante 18 horas más, se recolectan y se determina la captación de tritio utilizando un contador de centelleo de gases. Las fracciones que producen una proliferación en ambas replicaciones tres veces mayor que la proliferación observada en células cultivadas sólo con medio se consideran positivas.
Se midió el IFN-\gamma utilizando un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA). Se revisten placas de ELISA con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a IFN-\gamma humano (PharMingen, San Diego, CA) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. Los pocillos después se bloquean con PBS que contiene leche desnatada en polvo al 5% (en p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan seis veces en PBS/TWEEN-20 al 0,2% y las muestras se diluyen 1:2 en medio de cultivo. Las placas de ELISA se incuban durante la noche a temperatura ambiente. Las placas de nuevo se lavan y se añade a cada pocillo un suero anti-IFN-\gamma humano de conejo policlonal diluido 1:3000 en PBS/suero de cabra normal al 10%. Las placas entonces se incuban durante dos horas a temperatura ambiente, se lavan y se añade anti-IgG de conejo acoplado con peroxidasa de rábano (Sigma Chemical So., St. Louis, MO) a una dilución de 1:2000 en PBS/leche desnatada en polvo al 5%. Después de dos horas más de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavan y se añade un sustrato de TMB. La reacción se detiene después de 20 min con ácido sulfúrico 1 N. Se determina la densidad óptica a 450 nm utilizando 570 nm como longitud de onda de referencia. Las fracciones cuyo resultado en ambas replicaciones es una DO dos veces mayor que la DO media de células cultivadas sólo con medio, más 3 desviaciones estándar, se consideran positivas.
Se empleó una línea de células T anti-Chlamydia humana (TCL-8) capaz de tener reactividad cruzada con C. trachomatis y C. pneumoniae para determinar si las proteínas expresadas descritas en el anterior ejemplo (es decir, CpSWIB, SEQ ID NO:27, y SEQ ID NO:78 que tiene un marcador de 6X-his, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:28, respectivamente, y la proteína de 15 kDa denominada CpS 13, SEQ ID NO:29, y SEQ ID NO:77 que tiene un marcador 6X-his, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:30 y 91, respectivamente), poseen epitopos de células T comunes a C. trachomatis y C. pneumoniae. Brevemente, se valoraron E. coli que expresaban proteínas clamidiales en 1 x 10^{4} células dendríticas derivadas de monocitos. Después de dos horas, los cultivos de células dendríticas se lavaron y se añadieron 2,5 x 10^{4} células T (TCL-8) y se dejó en incubación durante 72 horas más. Entonces se determinó la cantidad de IFN-\gamma en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Como se muestra en las figuras 7A y 7B, la línea de células T TCL-8 reconoce de modo específico la proteína ribosómica S 13 en C. trachomatis y C. pneumoniae, según se demuestra mediante la inducción específica de antígeno de IFN-\gamma, mientras que sólo la proteína SWIB de C. trachomatis fue reconocida por la línea de células T. Para validar estos resultados se identificó el epitopo de células T de SWIB de C. trachomatis mediante cartografiado de epitopos utilizando células diana pulsadas con una serie de péptidos solapantes y la línea de células T TCL-8. Los ensayos de incorporación de ^{3}H-timidina demostraron que el péptido, denominado C.t.SWIB 52-67, SEQ ID NO:39, produjo la mayor proliferación de la línea TCL-8. Los péptidos homólogos correspondientes a SWIB de secuencia de C. pneumoniae (SEQ ID NO:40), la fusión de topoisomerasa-SWIB de C. pneumoniae (SEQ ID NO:43) y de C. trachomatis (SEQ ID NO:42), así como el dominio SWI humano (SEQ ID NO:41) se sintetizaron y se ensayaron en el anterior ensayo. La línea de células T TCL-8 sólo reconoció el péptido de C. trachomatis de SEQ ID NO:39 y no el correspondiente péptido de C. pneumoniae (SEQ ID NO:40) ni los otros péptidos correspondientes descritos anteriormente (SEQ ID NO:41-43).
Se generaron líneas de células T específicas de Chlamydia a partir del donante CP-21 con una valoración sérica positiva contra C. pneumoniae estimulando PBMC donantes con células dendríticas derivadas de monocitos infectadas con C. trachomatis o C. pneumoniae, respectivamente. Las células T generadas contra C. pneumoniae respondían a SWIB de C. pneumoniae recombinante pero no a SWIB de C. trachomatis, mientras que la línea de células T generada contra C. trachomatis no respondió a SWIB de C. trachomatis ni de C. pneumoniae (véase la figura 9). La respuesta inmunológica específica de SWIB de C. pneumoniae del donante CP-21 confirma la infección por C. pneumoniae e indica la producción de células T específicas de SWIB de C. pneumoniae durante una infección in vivo de C. pneumoniae.
El cartografiado de epitopos de la respuesta de células T a SWIB de C. pneumoniae ha demostrado que las células T específicas de Cp-SWIB respondían a los péptidos solapantes Cp-SWIB 32-51 (SEQ ID NO:101) y Cp-SWIB 37-56 (SEQ ID NO:102), lo cual indica un epitopo de células T específico de SWIB de C. pneumoniae Cp-SWIB 37-51 (SEQ ID NO:100).
En otros experimentos se generaron líneas de células T a partir del donante CP1, que también es un donante seropositivo a C. pneumoniae, estimulando PBMC con cuerpos elementales no infecciones de C. trachomatis y C. pneumoniae, respectivamente. En particular, se determinaron las respuestas proliferativas estimulando 2,5 x 10^{4} células T en presencia de 1 x 10^{4} células dendríticas derivadas de monocitos y cuerpos elementales no infecciosos derivados de C. trachomatis y C. pneumoniae, o la proteína SWIB recombinante de C. trachomatis o C. pneumoniae. La respuesta de células T contra SWIB se parece a los datos obtenidos con las líneas de células T de CP-21 en que fue SWIB de C. pneumoniae, pero no SWIB de C. trachomatis, la que provocó una respuesta en la línea de células T de C. pneunomiae. Además, la línea de células T de C. trachomatis no proliferó en respuesta a SWIB de C. trachomatis ni de C. pneumoniae, aunque sí proliferó en respuesta a los cuerpos elementales de CT y CP. Como se describe en el ejemplo 1, el clon 11-C12-91 (SEQ ID NO:63), identificado utilizando la línea celular TCP-21, tiene un inserto de 269 pb que es parte del gen OMP2 (CT443) y comparte homología con la proteína de la membrana externa rica en cisteína de 60 kDa de C. pneumoniae, denominada OMCB. Para definir aún más el epitopo o epitopos reactivos se realizó un cartografiado de epitopos utilizando una serie de péptidos solapantes y el inmunoensayo previamente descrito. Brevemente, se determinaron las respuestas proliferativas estimulando 2,5 x 10^{4} células T TCP-21 en presencia de 1 x 10^{4} células dendríticas derivadas de monocitos, con cuerpos elementales no infecciosos derivados de C. trachomatis y C. pneumoniae, o péptidos derivados de la secuencia de la proteína OMCB de C. trachomatis o C. pneumoniae (0,1 \mug/ml). Las células T TCP-21 respondieron a los epitopos CT-OMCB #167-186, CT-OMCB #171-190, CT-OMCB #171-186, y en un menor grado a CT-OMCB #175-186 (SEQ ID NO:249-252, respectivamente). De manera notable, la línea de células T TCP-21 también produjo una respuesta proliferativa al péptido homólogo de C. pneumoniae CP-OMCB #171-186 (SEQ ID NO:253), que fue igual o mayor que la respuesta a los péptidos de C. trachomatis. Las sustituciones de aminoácidos en la posición dos (es decir, Asp por Glu) y en la posición cuatro (es decir, Cys por Ser) no alteraron las respuestas proliferativas de las células T y, por tanto, se demuestra que este epitopo es un epitopo de reactividad cruzada entre C. trachomatis y C. pneumoniae.
Ejemplo 8
Respuestas inmunológicas de PMBC humanas y líneas de células T frente a antígenos de Chlamydia
Los ejemplos proporcionados en la presente sugieren que existe una población de donantes sanos entre la población general que han sido infectados por C. trachomatis y que han generado una respuesta inmunológica protectora que controla la infección de C. trachomatis. Estos donantes permanecen clínicamente asintomáticos y seronegativos para C. trachomatis. Para caracterizar las respuestas inmunológicas de los donantes normales frente a antígenos clamidials que se han identificado mediante clonación de expresión de CD4, se ensayaron PBMC obtenidas de 12 donantes sanos frente a un panel de antígenos clamidials recombinantes que incluyen SWIB de C. trachomatis y C. pneumoniae, y S 13 de C. trachomatis y C. pneumoniae. Los datos se resumen en la tabla I que aparece a continuación. Todos los donantes eran seronegativos para C. trachomatis, mientras que 6/12 presentaban una valoración positiva de C. pneumoniae. Utilizando un índice de estimulación de >4 como respuesta positiva, 11/12 de los sujetos respondieron a los cuerpos elementales de C. trachomatis, y 12/12 respondieron a los cuerpos elementales de C. pneumoniae. Un donante, AD104, respondió a la proteína S 13 de C. pneumoniae recombinante pero no a la proteína S 13 de C. trachomatis recombinante, lo cual indica una respuesta específica de C. pneumoniae. Tres de 12 donantes presentaron una respuesta específica a SWIB de C. trachomatis pero no a SWIB de C. pneumoniae, lo cual confirma una infección por C. trachomatis. La S 13 de C. trachomatis y de C. pneumoniae produjeron una respuesta en 8/12 donantes, lo cual sugiere una infección clamidial. Estos datos demuestran la capacidad de SWIB y S 13 para provocar una respuesta de células T en PBMC de sujetos de estudio normales.
TABLA I 
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1 
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En una primera serie de experimentos se generaron líneas de células T a partir de una mujer sana (CT-10) con una historia de exposición genital a C. trachomatis, estimulando células T con cuerpos elementales de C. trachomatis LGV II como se ha descrito previamente. Aunque el sujeto de estudio se expuso a C. trachomatis no se seroconvirtió y no desarrolló síntomas clínicos, lo cual sugiere que el donante CT-10 puede haber desarrollado una respuesta inmunológica protectora frente a C. trachomatis. Como se muestra en la figura 10, una línea de células T específica de Chlamydia primaria derivada del donante CT-10 respondió a proteínas recombinantes de SWIB de C. trachomatis pero no a SWIB de C. pneumoniae, lo cual confirma la exposición de CT-10 a C. trachomatis. El cartografiado de epitopos de la respuesta de células T a SWIB de C. trachomatis demostró que este donante respondía al mismo epitopo Ct-SWIB 52-67 (SEQ ID NO:39) que la línea de células T TCL-8, como se muestra en la figura 11.
Se generaron otras líneas de células T como se describió anteriormente para diversos pacientes con C. trachomatis. En la tabla II se resume el perfil clínico de los pacientes y las respuestas proliferativas a diversas proteínas recombinantes y cuerpos elementales de C. trachomatis y C. pneumoniae.
TABLA II
3
5
Utilizando el panel de sujetos de estudio asintomáticos (como se definió anteriormente) y pacientes con C. trachomatis, como se resumen en las tablas I y II, se realizó un estudio exhaustivo de las respuestas inmunológicas de PBMC derivadas de los dos grupos. Brevemente, PBMC procedentes de pacientes con C. pneumoniae, así como de donantes normales, se cultivaron en medio que comprendía RPMI 1640 suplementado con suero humano reunido al 10% y gentamicina 50 \mug/ml. Se añaden los polipéptido purificados, un panel de antígenos clamidials recombinantes que incluye SWIB y S 13 de C. trachomatis y C. pneumoniae, así como IpdA y TSA de C. trachomatis, por duplicado a concentraciones de 0,5 a 10 \mug/ml. Después de seis días de cultivo en placas de fondo redondo de 96 pocillos en un volumen de 200 \mul, se retiran 50 \mul de medio de cada pocillo para la determinación de los niveles de IFN-\gamma, como se describe a continuación. Las placas entonces se pulsan con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada durante 18 horas más, se recolectan y se determina la captación de tritio utilizando un contador de centelleo de gases. Las fracciones que producen una proliferación en ambas replicaciones tres veces mayor que la proliferación observada en células cultivadas sólo con medio se consideran positivas.
Las respuestas proliferativas a antígenos de Chlamydia recombinantes demuestran que la mayoría de los donantes asintomáticos y de los pacientes con C. trachomatis reconocían el antígeno S 13 de C. trachomatis (8/12), y la mayoría de los pacientes con C. trachomatis reconocía el antígeno S 13 de C. pneumoniae (8/12), y 4/12 donantes asintomáticas también reconocieron el antígeno S 13 de C. pneumoniae. Además, seis de los doce pacientes con C. trachomatis y cuatro de los doce donantes asintomáticos produjeron respuestas proliferativas al antígeno IpdA de C. trachomatis. Estos resultados demuestran que el antígeno S 13 de C. trachomatis y C. pneumoniae, el antígeno SWIB de C. trachomatis, y el antígeno IpdA de C. trachomatis, fueron reconocidos por los donantes asintomáticos, lo cual indica que estos antígenos fueron reconocidos durante la exposición a Chlamydia y se produjo una respuesta inmunológica contra ellos. Esto implica que estos antígenos pueden desempeñar un papel para conferir una inmunidad protectora en un hospedante humano. Además, el antígeno S 13 de C. trachomatis y C. pneumoniae es reconocido igualmente bien entre los pacientes con C. trachomatis, indicando con ello que puede haber epitopos compartidos entre C. trachomatis y C. pneumoniae en la proteína S 13. La tabla III resume los resultados de estos estudios.
TABLA III
6
Se inició una serie de estudios para determinar la respuesta inmunológica celular a líneas de células T a corto plazo generadas a partir de donantes asintomáticos y pacientes con C. trachomatis. Las respuestas inmunológicas celulares se midieron mediante ensayos de proliferación convencionales e IFN-\gamma, como se describe en el ejemplo 7. De modo específico, la mayoría de los antígenos estaban en forma de clones de E. coli individuales que expresan antígenos clamidials, aunque también se utilizaron algunas proteínas recombinantes en los ensayos. Los clones de E. coli individuales se valoraron sobre 1 x 10^{4} células dendríticas derivadas de monocitos, y después de dos horas el cultivo se lavó y se añadieron 2,5 x 10^{4} células T. El ensayo que emplea las proteínas recombinantes se realizó como se describió previamente. La proliferación se determinó después de cuatro días con un pulso de ^{3}H-timidina convencional durante las últimas 18 horas. Se determinó la inducción de IFN-\gamma a partir de los sobrenadantes del cultivo recolectados después de cuatro días utilizando ensayos ELISA convencionales, como se describió anteriormente. Los resultados demuestran que todos los antígenos de C. trachomatis ensayados, excepto C.t. SWIB, produjeron respuestas proliferativas de una o más líneas de células T diferentes derivadas de pacientes con C. trachomatis. Además, se obtuvieron respuestas proliferativas en los pacientes con C. trachomatis y en donantes asintomáticos para los siguientes genes de Chlamydia, CT622, groEL, pmpD, CT610 y rS13.
El clon 12G3-83 también contiene secuencias de CT734 y CT764, además de CT622, y por tanto estas secuencias génicas también pueden tener epitopos inmunorreactivos. De manera similar, el clon 21G12-60 contiene secuencias de los genes de proteína hipotética CT229 y CT228, además de CT875; y 15H2-76 también contiene secuencias de CT812 y CT088, además de compartir homología con el gen sycE. El clon 11H3-61 también contiene secuencias que comparten homología con la proteína de la virulencia PGP6-D.
TABLA IV
7
Ejemplo 9
Estudios de protección utilizando antígenos de Chlamydia
Se realizaron estudios de protección en ratones para determinar si una inmunización con antígenos clamidials puede afectar a la enfermedad del tracto genital resultante de una inoculación clamidial. Se utilizaron dos modelos: un modelo de inoculación intravaginal que emplea un aislado humano que contiene una cepa de Chlamydia psittaci (MTW447), y un modelo de inoculación intrauterina que implica un aislado humano identificado como Chlamydia trachomatis de serovar F (cep NI1). Ambas cepas inducen la inflamación de tracto genital superior, que se parece a la endometritis y a la salpingitis provocadas por Chlamydia trachomatis en mujeres. En el primer experimento, ratones C3H (4 ratones por grupo) se inmunizaron tres veces con 100 \mug del vector de expresión pADNc-3 que contiene el ADN de SWIB de C. trachomatis (SEQ ID NO:1, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:5). Las inoculaciones se realizaron en la base de la cola para una inmunización sistémica. Dos semanas después de la última inmunización, los animales se trataron con progesterona y se infectaron, a través de la vagina o mediante una inyección del inóculo en el útero. Dos semanas después de la infección, los ratones fueron sacrificados y se cortaron los tractos genitales, se tiñeron y se estudiaron para la histopatología. Se puntuaron los niveles de inflamación (de + para muy suave, a +++++ para muy grave). Se sumaron las puntuaciones atribuidas a cada oviducto/ovario individual y se dividieron entre el número de órganos estudiados para obtener una puntuación media de inflamación para el grupo. En el modelo de inoculación uterina, los animales inmunizados de control negativo que recibieron el vector vacío mostraron una inflamación coherente con una puntuación de inflamación media del ovario/oviducto de 6,12, por contraste con 2,62 para el grupo inmunizado con ADN. En el modelo de inoculación vaginal e infección ascendente, los ratones inmunizados de control negativo tenían una puntuación de inflamación media del ovario/oviducto de 8,37, frente a 5,00 para el grupo inmunizado con ADN. Además, en este último modelo los ratones vacunados no mostraron señales de oclusión tubal, mientras que los grupos vacunados de control negativo presentaban células inflamatorias en el lumen del oviducto.
En un segundo experimento, ratones C3H (4 ratones por grupo) se inmunizaron tres veces con 50 \mug del vector de expresión pADNc-3 que contiene el ADN de SWIB de C. trachomatis (SEQ ID NO:1, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:5) encapsulado en microesferas de polilactida-co-glicólido (PLG). Las inmunizaciones se realizaron por vía intraperitoneal. Dos semanas después de la última inmunización, los animales se trataron con progesterona y se infectaron mediante la inoculación de C. pisttaci en la vagina. Dos semanas después de la infección, los ratones fueron sacrificados y se cortaron los tractos genitales, se tiñeron y se estudiaron para la histopatología. Se puntuaron los niveles de inflamación como se describió previamente. Se sumaron las puntuaciones atribuidas a cada oviducto/ovario individual y se dividieron entre el número de órganos estudiados para obtener una puntuación media de inflamación para el grupo. Los animales inmunizados de control negativo que recibieron el vector vacío encapsulado en PLG mostraron una inflamación coherente con una puntuación de inflamación media del ovario/oviducto de 7,28, frente a 5,71 para el grupo inmunizado con ADN encapsulado en PLG. La inflamación en el peritoneo fue de 1,75 para el grupo vacunado frente a 3,75 para el control.
En un tercer experimento, ratones C3H (4 ratones por grupo) se inmunizaron tres veces con 10 \mug de proteína recombinante purificada, que era SWIB (SEQ ID NO:1, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:5), o S 13 (SEQ ID NO:4, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO:12), mezclada con la toxina del cólera (CT). La preparación se administró por vía intranasal tras una anestesia, en un volumen de 20 ul. Dos semanas después de la última inmunización, los animales se trataron con progesterona y se infectaron mediante la inoculación vaginal de C. pisttaci o mediante una inyección de C. trachomatis de serovar F en el útero. Dos semanas después de la infección, los ratones fueron sacrificados y se cortaron los tractos genitales, se tiñeron y se estudiaron para la histopatología. Se puntuó el grado de inflamación como se describió previamente. Se sumaron las puntuaciones atribuidas a cada oviducto/ovario individual y se dividieron entre el número de órganos estudiados para obtener una puntuación media de inflamación para el grupo. En el modelo de inoculación uterina, los animales inmunizados de control negativo que recibieron sólo la toxina del cólera mostraron una puntuación de inflamación media del ovario/oviducto de 4,25 (sólo se analizaron 2 ratones; los otros 2 murieron), frente a 5,00 para el grupo inmunizado con S 13 más la toxina del cólera, y 1,00 para el grupo inmunizado con SWIB más la toxina del cólera. Los animales infectados no tratados presentaron una puntuación de inflamación media del ovario/oviducto de 7. En el modelo de inoculación vaginal e infección ascendente, los ratones inmunizados de control negativo tenían una puntuación de inflamación media del ovario/oviducto de 7,37, frente a 6,75 para el grupo inmunizado con S 13 más la toxina del cólera, y 5,37 para el grupo inmunizado con SWIB más la toxina del cólera. Los animales infectados no tratados presentaron una puntuación de inflamación media del ovario/oviducto de 8.
Los tres experimentos descritos anteriormente sugieren que puede obtenerse una protección específica de SWIB. Este efecto protector es más marcado en el modelo de la infección homóloga, pero sigue estando presente en una infección de exposición heteróloga con C. psittaci.
Aunque la presente invención se ha descrito con algún detalle como ilustración y ejemplo para aclarar su comprensión, pueden realizarse cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, que se pretende sea limitada sólo por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
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<110> Corixa Corporation
\hskip1cm
Probst, Peter 
\hskip1cm
Bhatia, Ajay 
\hskip1cm
Skeiky, Yasir 
\hskip1cm
Fling, Steve 
\hskip1cm
Maisonneuve, Jeff 
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO Y EL DIAGNÓSTICO DE UNA INFECCIÓN CLAMIDIAL
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<130> 210121.469PC
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<140> PCT
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<141> 08-12-1399
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<160> 303
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0/4.0
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<210> 1
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<211> 481
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 1
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8 
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<210> 2
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<211> 183
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 2
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9 
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<210> 3
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<211> 110
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 3
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10 
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 4
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11 
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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12 
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<213> Chlamydia trachomatis 
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14 
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<213> Chlamydia trachomatis 
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15 
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<210> 9
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 9
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16 
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<210> 10
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 10
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17 
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<210> 11
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<211> 36
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\hskip1cm
18 
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<210> 12
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 12
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19 
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 13
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\hskip1cm
20 
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<210> 14
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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21 
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<211> 161
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 15
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\hskip1cm
22 
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<210> 16
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<211> 897
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 16
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\hskip1cm
23 
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<210> 17
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<211> 298
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 17
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24 
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 18
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25 
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<211> 18
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\hskip1cm
26 
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<210> 20
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<211> 216
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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27 
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<210> 21
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<211> 1256
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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28 
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<210> 22
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<211> 601
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<212> ADN
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29 
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<211> 270
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 23
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\hskip1cm
30 
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<210> 24
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<211> 363
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 24
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\hskip1cm
31 
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<210> 25
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<211> 696
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\hskip1cm
32 
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<210> 26
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<211> 231
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 26
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\hskip1cm
33 
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<210> 27
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<211> 264
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<212> ADN
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<213> Chlamydia pneumoniae 
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<400> 27
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\hskip1cm
34 
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
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<212> PRT
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<213> Chlamydia pneumoniae 
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<400> 28
\hskip1cm
35 
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
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<212> ADN
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<213> Chlamydia pneumoniae 
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<400> 29
\hskip1cm
36 
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 122
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<212> PRT
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<213> Chlamydia pneumoniae 
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<400> 30
\hskip1cm
37 
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en el laboratorio
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 32
\hskip1cm
39 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
40 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
41 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
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<211> 55
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<212> ADN
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<213> Chlamydia pneumoniae 
\newpage
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<400> 35
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\hskip-.1em\dddseqskip
gatatacata tgcatcacca tcaccatcac atgagtcaaa aaaaataaaa actct 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Chlamydia pneumoniae 
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<400> 36
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgaggaat tcttatttta caatatgttt gga 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatatacata tgcatcacca tcaccatcac atgccacgca tcattggaat gat 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgaggaat tcttatttct tcttacctgc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en el laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en el laboratorio
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en el laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en el laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en el laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 481
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
48 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (522)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
50 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
51 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
52 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 602
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 450
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 716
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 463
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 829
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1537
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 463
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
61 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
62 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1180
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm
63 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 688
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
68 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 520
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
69 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
70 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
71 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 715
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
72 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
73 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 715
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
74 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 641
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (550)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (559)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (575)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (583)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (634)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (638)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
75 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 584
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (460)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (523)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (541)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (546)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
76 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 545
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
78 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 797
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (788)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\vskip0.400000\baselineskip
<221> inseguro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (789)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=A,T,C o G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
79 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 950
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2085
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm
84 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm
85 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 715
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 476
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1551
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
89 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3031
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\hskip1cm
90 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 976
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\hskip1cm
93 
\hskip1cm
94 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
96 
\hskip1cm
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
98 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\hskip1cm
99 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\hskip1cm
100 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\hskip1cm
101 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\hskip1cm
102 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\hskip1cm
103 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\hskip1cm
104 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\hskip1cm
105 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\hskip1cm
106 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\hskip1cm
107 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\hskip1cm
108 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\hskip1cm
109 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\hskip1cm
110 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\hskip1cm
111 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\hskip1cm
112 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\hskip1cm
113 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\hskip1cm
114 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1461
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
115 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
116 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 698
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
117 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
118 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 976
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 995
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
120 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\hskip1cm
121 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 446
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\hskip1cm
122 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 951
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\hskip1cm
123 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 953
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
124 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\hskip1cm
126 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 897
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\hskip1cm
127 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\hskip1cm
129 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\hskip1cm
130 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 897
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
131 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
132 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
133 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
134 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 897
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
135 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
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<212> PRT
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<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
136 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\hskip1cm
137 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
138 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 897
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
139 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
140 
\hskip1cm
141 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\hskip1cm
143 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\hskip1cm
144 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\hskip1cm
145 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\hskip1cm
146 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\hskip1cm
147 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\hskip1cm
148 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\hskip1cm
149 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\hskip1cm
150 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\hskip1cm
151 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\hskip1cm
152 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\hskip1cm
153 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\hskip1cm
154 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\hskip1cm
155 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\hskip1cm
156 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\hskip1cm
157 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\hskip1cm
158 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\hskip1cm
159 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\hskip1cm
160 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\hskip1cm
161 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\hskip1cm
162 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\hskip1cm
163 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\hskip1cm
164 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttgaagca ggtaggtgaa tatg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaagaaatt taaaaaatcc ctta 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtataatat ctctctaaat tttg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agataaaaaa ggctgtttc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
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<400> 163
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttgaagca ggtaggtgaa tatg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Chlamydia 
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<400> 164
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttacaataa gaaaagctaa gcactttgt 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Chlamydia 
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<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttacacag tcctgctgac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtttccgggc cctcacattg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
165 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
166 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
167 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2949
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
168 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2895
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
169 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4593
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
170 
\hskip1cm
171 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
172 
\hskip1cm
173 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5265
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
174 
\hskip1cm
175 
\hskip1cm
176 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 880
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(880)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\hskip1cm
177 
\hskip1cm
178 
\hskip1cm
179 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 982
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(982)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\hskip1cm
180 
\hskip1cm
181 
\hskip1cm
182 
\hskip1cm
183 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 964
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\hskip1cm
184 
\hskip1cm
185 
\hskip1cm
186 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\hskip1cm
187 
\hskip1cm
188 
\hskip1cm
189 
\hskip1cm
190 
\hskip1cm
191 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1776
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\hskip1cm
192 
\hskip1cm
193 
\hskip1cm
194 
\hskip1cm
195 
\hskip1cm
196 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1752
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\hskip1cm
197 
\hskip1cm
198 
\hskip1cm
199 
\hskip1cm
200 
\hskip1cm
201 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2601
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\hskip1cm
202 
\hskip1cm
203 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3021
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\hskip1cm
204 
\hskip1cm
205 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2934
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\hskip1cm
206 
\hskip1cm
207 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\hskip1cm
208 
\hskip1cm
209 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2337
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\hskip1cm
210 
\hskip1cm
211 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2847
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\hskip1cm
212 
\hskip1cm
213 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2466
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\hskip1cm
214 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\hskip1cm
215 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 866
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(866)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\hskip1cm
216 
\hskip1cm
217 
\hskip1cm
218 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1006
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\hskip1cm
219 
\hskip1cm
220 
\hskip1cm
221 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 977
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\hskip1cm
222 
\hskip1cm
223 
\hskip1cm
224 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 848
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\hskip1cm
225 
\hskip1cm
226 
\hskip1cm
227 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 778
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\hskip1cm
228 
\hskip1cm
229 
\hskip1cm
230 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 948
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\hskip1cm
231 
\hskip1cm
232 
\hskip1cm
233 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\hskip1cm
234 
\hskip1cm
235 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 525
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\hskip1cm
236 
\hskip1cm
237 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gataggcgcg ccgcaatcat gaaatttatg tcagctactg ctg 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaacgcgt ttagaatgtc atacgagcac cgca 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaatc 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcaatcatg agttcgcaga aagatataaa aagc 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagctagc ttaaaagatc aatcgcaatc cagtattc 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caatc 
\hfill
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcaatcatg aaaaaagcgt ttttcttttt c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaacgcgt ctagaatcgc agagcaattt c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgcaatcat gattcctcaa ggaatttacg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaacgcgt ttagaaccgg actttacttc c 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Chlamydia 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagacatatg catcaccatc accatcacga ggcgagctcg atccaagatc 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaggtacc tcagatagca ctctctccta ttaaagtagg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagctagc atgcatcacc atcaccatca cgttaagatt gagaacttct ctggc 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaggtacc ttagaatgtc atacgagcac cgcag 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagacatatg catcaccatc accatcacgg gttagc 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaggtacc tcagctcctc cagcacactc tcttc 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagctagc catcaccatc accatcacgg tgctatttct tgcttacgtg g 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaggtact taaaagatca atcgcaatcc agtattcg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaggatcc acatcaccat caccatcacg gactagctag agaggttc 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagaattc ctagaatcgc agagcaattt c 
\hfill
31 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcaatc 
\hfill
7 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\hskip1cm
238 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaggtacc gcatcaccat caccatcaca tgattcctca aggaatttac g 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagcggcc gcttagaacc ggactttact tcc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\hskip1cm
239 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagctagc catcaccatc accatcacct ctttggccag gatccc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaactagt ctagaacctg taagtggtcc 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
\hskip1cm
240 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\hskip1cm
241 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\hskip1cm
242 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\hskip1cm
243 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\hskip1cm
244 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 229
\hskip1cm
245 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\hskip1cm
246 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\hskip1cm
247 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\hskip1cm
248 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\hskip1cm
249 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\hskip1cm
250 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\hskip1cm
251 
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<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\hskip1cm
252 
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<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\hskip1cm
253 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\hskip1cm
254 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 239
\hskip1cm
255 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 240
\hskip1cm
256 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 241
\hskip1cm
257 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 242
\hskip1cm
258 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 243
\hskip1cm
259 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 244
\hskip1cm
260 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 245
\hskip1cm
261 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 246
\hskip1cm
262 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 247
\hskip1cm
263 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 248
\hskip1cm
264 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 249
\hskip1cm
265 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 250
\hskip1cm
266 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 251
\hskip1cm
267 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 252
\hskip1cm
268 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 253
\hskip1cm
269 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 254
\hskip1cm
270 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 255
\hskip1cm
271 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 256
\hskip1cm
272 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 257
\hskip1cm
273 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 258
\hskip1cm
274 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 259
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 259
\hskip1cm
275 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 260
\hskip1cm
276 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 261
\hskip1cm
277 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 262
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hecho en un laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 262
\hskip1cm
278 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 897
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(897)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 263
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
279 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(298)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 264
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
280 
\hskip1cm
281 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 265
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 897
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(897)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 265
\hskip1cm
282 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 266
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(298)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 266
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
283 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 680
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 267
\hskip1cm
284 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 268
\hskip1cm
285 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 269
\hskip1cm
286 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 270
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 270
\hskip1cm
287 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(511)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 271
\hskip1cm
288 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 272
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 598
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 272
\hskip1cm
289 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 273
\hskip1cm
290 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 274
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 264
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 274
\hskip1cm
291 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 275
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 275
\hskip1cm
292 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 276
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 276
\hskip1cm
293 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 505
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 277
\hskip1cm
294 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 278
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 278
\hskip1cm
295 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 279
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
296 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 280
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 280
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
297 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 281
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 577
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 281
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
298 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 607
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 282
\hskip1cm
299 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 283
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1077
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 283
\hskip1cm
300 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 284
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 284
\hskip1cm
301 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 802
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 285
\hskip1cm
302 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 286
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 286
\hskip1cm
303 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 287
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(489)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 287
\hskip1cm
304 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 288
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
305 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 515
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 289
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
306 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 290
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 290
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
307 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 291
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1002
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 291
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
308 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 292
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 292
\hskip1cm
309 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 293
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcaatc 
\hfill
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 294
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
310 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 295
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
311 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 296
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 296
\hskip1cm
312 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 488
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 297
\hskip1cm
313 
\hskip1cm
314 
\hskip1cm
315 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 298
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
316 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 299
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 299
\hskip1cm
317 
\hskip1cm
318 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 300
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 300
\hskip1cm
319 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 301
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
320 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 302
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
321 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 303
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 303
\hskip1cm
322

Claims (19)

1. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y
(a) un polipéptido aislado que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(b) un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido aislado que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(c) una proteína de fusión que comprende un polipéptido aislado que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polipéptido aislado que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polipéptido aislado que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polipéptido aislado que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO:5.
5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polipéptido aislado que consiste en la secuencia indicada en SEQ ID NO:5.
6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polipéptido aislado que comprende una secuencia indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polipéptido aislado que comprende una secuencia indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98.
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
9. Una composición farmacéutica según la reivindicación 8, que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polinucleótido aislado que comprende la secuencia indicada por los nucleótidos 115 a 375 de SEQ ID NO:1.
10. Una vacuna que comprende un inmunoestimulante, y
(a) un polipéptido aislado que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(b) un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido aislado que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
11. Una vacuna según la reivindicación 10, que comprende un inmunoestimulante y un polipéptido aislado que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
12. Una vacuna según la reivindicación 13, en la que el polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:5.
13. Una vacuna según la reivindicación 13, en la que el polipéptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98.
14. Una vacuna según la reivindicación 10, que comprende un inmunoestimulante y un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta.
15. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en la que el inmunoestimulante es un adyuvante.
16. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en la inducción de una inmunidad protectora en un paciente.
17. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, para su uso en la inducción de una inmunidad protectora en un paciente.
18. El uso de un polipéptido que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta;
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección por Chlamydia trachomatis.
19. El uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende:
(i) la secuencia de polipéptido indicada en SEQ ID NO:5, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta; o
\newpage
(ii) una secuencia de polipéptido indicada en una cualquiera de SEQ ID NO:6, 39, 94, 95, 96 ó 98, o su variante que tenga al menos 90% de coincidencia con ésta;
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección por Chlamydia trachomatis.
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