MXPA05012806A

MXPA05012806A - Modulacion de los niveles de un precursor de saborizante de cafe en los granos verde de cafe.

Info

Publication number: MXPA05012806A
Application number: MXPA05012806A
Authority: MX
Inventors: Chenwei Lin
Original assignee: Nestec Sa
Priority date: 2003-06-20
Filing date: 2004-06-18
Publication date: 2006-06-27
Also published as: US8598329B2; RU2348693C2; WO2004113520A2; CA2530043A1; GT200400123AA; GT200400123A; JP2011004761A; US20110126314A1; RU2006101550A; WO2004113520A3; JP2009513102A; ZA200600546B; EP1639103A2; JP4755589B2; AU2004249879A1; US20070022489A1; JP5443304B2; BRPI0409205A

Abstract

La presente invencion se relaciona con las proteinasas de cisteina aisladas que codifican los polinucleotidos; inhibidores de la proteinasa de cisteina; y las endoproteinasas asparticas. La invencion tambien se relaciona con una celula huesped transformada, preferiblemente una celula de planta, en la cual la sobre o poca expresion de estos polinucleotidos resulta en la alteracion de los niveles de los precursores del sabor del cafe, especificamente, las moleculas que contienen el grupo amino, tal como los aminoacidos, peptidos y proteinas en los granos verdes de cafe.

Description

MODULACIÓN DE LOS NIVELES DE UN PRECURSOR DE SABORIZANTE DE CAFÉ EN LOS GRANOS VERDE DE CAFÉ Antecedentes de la Invención : El Café contiene una mezcla de alta complejidad de moléculas saborizantes . Hasta la fecha, la Investigación extensiva en la composición de las bebidas de café instantáneas o de granos frescos del mismo, han resultado en la identificación de mas de 850 compuestos, muchos de los cuales son moléculas activas de sabor (Flament, 1(2002) Química del Sabor de Café, John Wiley e Hijos, UK) . Sin embargo, unas pocas de las últimas moléculas de sabor del café encontradas en la taza de café están presentes en la materia prima, los granos verdes (semillas verdes) de las especies de la planta Coffea arábica o Coffea canephora (robusta) . Es decir, la mayoría de los compuestos saborizantes del café se generan durante uno o más de los múltiples procesos de los pasos que se siguen desde la recolección de los granos rojos maduros del café hasta el producto como granos de café tostado, o bien sus extractos, por ejemplo los productos solubles de café. Los diversos pasos en la producción de café están descritos en Smith, A. W., en Café; Volumen I: Química páginas 1-41, Clarck, R.J. y Macrea, R eds, Ciencia Aplicada de Elsevier Londres y Nueva York, 1985; Clarke, R.J., en Café: Botánica, Bioquímica, y Producción de Granos y Bebidas, páginas 230-250 y páginas 375-393; y Clifford, M.N. y Willson, K.C. eds, Croom Helm Ltd., Londres. Brevemente, el proceso comienza con la recolección de los granos rojos maduros. La capa externa, o pericarpio, puede ser removido usando ya sea un proceso en seco o bien húmedo. El proceso en seco es el más simple e involucra 1) .la clasificación y el lavado de los granos, 2) el secado (Secado por aire natural o bien por medio de un secado mecánico) de los granos después de haber sido clasificados, y 3) descascarar los granos secos para remover el pericarpio seco. El proceso húmedo es un poco más complicado, y generalmente conlleva a la producción de granos verdes de café de mayor calidad. El proceso húmedo se asocia más con los granos de C. Arábica. El proceso húmedo' consiste de 1) La clasificación de los granos, 2) despulpar los granos, este paso se hace de inmediato después de la recolección y generalmente involucra la remoción mecánica de la "pulpa", o pericarpio, de los granos maduros, 3) la "fermentación", se remueve el mucilago que se adhiere a los granos después de haber sido despulpados mediante la incubación tanto del grano como del mucilago con agua en tanques que usan un proceso por tandas. El proceso de "fermentación" se permite que continúe hasta un máximo de 80 horas, aunque 24 horas, es el periodo en que generalmente se produce una fermentación aceptable y en el que se produce una baja de pH cerca de 6.8-6.9 a 4.2-4.6, debido a varias actividades enzimáticas y a la acción metabólica de microorganismos que crecen durante la fermentación, 4) el secado, este paso involucra ya sea un secado al aire libre o bien mecánico con aire caliente de los granos fermentados de café y 5) el "deshollejado", este paso involucra la remoción mecánica del "parche" del grano seco de café (hollejo del café seco) y a menudo también se remueve la capa plateada del grano. Después del proceso en seco o húmedo, el grano resultante de café verde es seleccionado, con la mayoría de los procedimientos de selección que se basan en el tamaño o la forma del grano. El siguiente paso en el procesamiento del café es el tostado del grano verde después de. haber sido despulpado o descascarado del café seco o húmedo, respectivamente. Este es un proceso que depende del tiempo, en el cual se dan significantes cambios químicos en el grano. La primera fase del tostado ocurre cuando el calor suplido elimina el agua remanente del grano. Cuando la carga de agua se ha eliminado, comienza el adecuado tostado a medida que la temperatura se incrementa hasta 190-200 °C. El grado de tostado, que es usualmente monitoreado por el desarrollo de color en los granos, juega un papel importante en la . determinación de las características de sabor del producto .de bebida final. Por lo que, el tiempo y la temperatura del tostado son controladas al extremo para obtener el perfil de sabor de café deseado. -Después del tostado, el café es molido para facilitar la extracción durante la producción de la bebida de café o de extractos de café (este ultimo usado para hacer productos instantáneos de café) . Otra vez, el tipo de molienda puede influenciar el sabor final de la bebida. Aunque se ha hecho una cantidad considerable de investigación e la identificación de las moléculas de sabor en el café, se ha hecho menor trabajo referente a las reacciones físicas y químicas que ocurren en el grano de café en cada uno de los pasos de procesamiento. Este ultimo punto es particularmente evidente para el proceso de tostado, en donde un gran número de constituyentes del grano sufren una extrema serie compleja de reacciones inducidas por el calor (Homma, S. 2001, En "Café: Desarrollos Recientes", R.J. Clarke y O.G. Vizthum eds, Blackwell Science, Londres; Yeretzian, C, et al ((2002) Eur. Food Res. Technol . 214, 92-104; Flament, I (2002) Química del Sabor del Café, John Wiley e Hijos, UK; Reineccius, G.A.r "La Reacción de Mailliard y Sabor de Café" Conferencian Procedentes de ASIC, 16avo Coloquio, Kyoto, Japón 1995)·. Mientras que los detalles de la mayoría de las reacciones que ocurren durante los diferentes pasos del procesamiento del café permanecen relativamente no muy claros, se piensa que hay una reacción importante en la génesis del sabor, que es la responsable de muchos de los sabores asociados con el aroma de café y ésta es la reacción de "Mailliard" que ocurre durante el tostado del Café. Una Vigorosa reacción de Mailliard ocurre entre los productos de reducción de azucares/degradación de polisacáridos y de las moléculas que contienen el grupo amino. (particularmente las proteínas, péptidos y aminoácidos) durante la etapa de tostado. Debido a que aparentemente la reacción de Maillard hace una importante contribución a la generación del sabor de café y de moléculas de aroma durante el tostado del café, puede haber una asociación entre los niveles de los reactantes primarios de Maillard en los granos verdes y la calidad del sabor/aroma desarrollado después del tostado. Como se nota arriba, un grupo importante de substratos en la reacción de Maillard son los aminoácidos, péptidos y las proteínas. Usando la electroforesis 2-D, se ha demostrado que existen diferencias en los niveles y cantidades de mayor almacenamiento de proteínas en los granos de café procedentes de las clases arábica y robusta - sin embargo, no se ha notado asociación alguna entre estas diferencias de almacenamiento y la calidad de sabor (Rogers et al, 1999, Plant Physiol. Biochem. Vol. 37, 261-272) También recientemente se ha encontrado que existen pequeñas diferencias entre el almacenamiento de proteínas en los granos maduros e inmaduros de café, que tienen diferente calidad de sabor respectivamente (Montavon, P. et al, 2003, J. Agrie and Food Chemxstry Vol 51, 2328-2334). Debido a que ocurren muchos cambios .durante la maduración del grano, este último trabajo sugiere un vínculo entre la mejora de la calidad causada por la maduración del grano y las diferencias observadas en los patrones de gel 2-D de las principales proteínas de almacenamiento. Recientemente se ha demostrado que hay diferencias en los perfiles de péptidos extraídos de los granos verdes de café de las variedades arábica y robusta (Ludwig et al 2000, Eur. Food Res Technol., Vol 211, 111-116). Aunque los resultados mostraron que los extractos de péptidos de las variedades arábica y robusta difieren en el perfil del precursor del aroma, la información presentada en este reporte no identifica cuales componentes en los extractos es o son responsables por las diferencias en el perfil del aroma. También se detectaron por lo menos dos diferentes actividades de la proteinasa en los extractos crudos del café verde, pero esto no se correlaciona con actividades específicas pertinentes a la calidad del aroma/sabor (Ludwig et al 2000, Eur. Food Res. Technol., Vol. 211, 111-116) . Finalmente, también se piensa que las muy altas temperaturas utilizadas durante las ultimas etapas del tostado de los granos verdes de café causan una substancial descomposición de las proteínas presentes en el grano de café (Homma, S. 2001, In "Coffee: Recent Developments" . R.J. Clarke and O.G. Vitzhum eds, Blackwell Science, London; Montavon, P., et al 2003, "Changes in green coffee protein profiles during roasting", J. Agrie. Food Chem. 51, 2335-2343) . Sin embargo, el esquema general para esta degradación proteínica está muy pobremente entendido, pero se presume que depende de, dentro de otras cosas, el preciso estado de las proteínas principales del café en la materia prima antes de que se comience con el tostado. Para nuestro conocimiento, no existen otros reportes significativos que denoten que la posibilidad de que los perfiles peptídicos en el café puedan verse involucrados en la producción del aroma/sabor del café. En el tostado de los granos fermentados de Theobroma cacao (granos de cocoa) , parece que hay un involucramiento de los aminoácidos y péptidos de los granos en el desarrollo de la reacción de Maillard de sabores/aromas. En relaciona a otros granos, la T. Cacao han mostrado tener un alto nivel inusual de actividad de la proteinasa aspártica (Biehl, B. Voigt, J. , Voigt, G. , Heinrichs, H. Senyuk, V. And Bytof, G. (1994) "Formación enzimática de oligopéptidos y- aminoácidos, dependientes del pH, precursores del aroma en granos crudos de cocoa". En Las Sesiones de la llava Conferencia Internacional de Investigación de la Cocoa, 18-24 de Julio de 1993, Yamoussoukro, Costa de Marfil) . Se concluyó que para producir granos de cocoa con un alto nivel de precursores de sabor de cocoa, es necesario llevar a cabo una etapa natural de fermentación (los granos no fermentados desarrollan poco sabor cuando son tostados) . Durante este paso de fermentación, los azúcares de la pulpa son fermentados, generando altos niveles de ácidos, particularmente de ácido acético (Carr, J.G. (1982) Cocoa. In Fermented. Foods . Economic Microbiology . Vol 7, páginas 275-292. (A.H. Rose ed) . Academic Press) . A medida que la fermentación continúa, el pH en los granos disminuye y la •estructura de la célula se vuelve desorganizada. El bajo pH cataliza la movilización y/o la activación de la abundante proteinasa aspártica del grano de cacao, resultando en una masiva degradación de las proteínas celulares (Biehl., B., Passern, D. , and Sagemann, W. (1982) "El Efecto del Ácido Acético sobre las Estructuras Sub-Celulares de los Cotiledones del Grano de Cocoa". J. Sci. Food Agrie. 33, 1101-1109; Biehl., B., Brunner,' E., Passern, D., Quesnel, V.C., y Adomako, D. (1985) "Acidificación, Proteólisis y sabor potencial en la fermentación de los granos de cocoa". J. Sci. Food Agrie. 36, 583-598) . Se ha demostrado que los Péptidos y los aminoácidos son los precursores del sabor de cocoa (Rohan, T. (1964) "Los precursores del aroma de Chocolate: un estudio comparativo de los granos fermentados y sin fermentar de cocoa". J. Food Sci., 29, 456-459; Voight, J. y Biehl, B. (1995) "Los precursores de los componentes del aroma especifico de cocoa son derivados de la clase vicilin (7S) globulina de los granos de cocoa mediante un procesamiento proteolitico". Bot. Acta 108, 283-289) . Por lo que, la proteinasa aspártica del grano, de T. cacao, junto con una serina carboxipeptidasa, han sido propuestas como criticas para la generación de los precursores del sabor de cocoa durante la fermentación (Voight, J. y Biehl, B. (1995) "Los precursores de los componentes del aroma de cocoa de la clase vicilin (7S) globulina de los granos de cocoa mediante un procesamiento proteolitico" . Bot . Acta 108, 283-289; Voight, J., Heinrichs, H., Voight, G. y Biehl, B. (1994) "Los precursores específicos del aroma de cocoa se generan mediante digestión proteolítica de la globulina de tipo vicilina de los granos de cocoa". Food Chemistry, 50, 177-184). El gen que codifica la abundante proteinasa aspártica del grano de cacao ha sido identificado y ha sido recientemente descrito un método para sobre exponer esta proteína en los granos de cacao que pueden generar niveles incrementados de los péptidos y aminoácidos precursores del sabor de cacao en los granos fermentados de cocoa, en una Publicación Internacional de Patentes No. 02/04617, cuyo contenido en total ha sido incorporado en esté escrito mediante referencia. Sin . embargo, la enseñanza de la Publicación Internacional de Patentes No. 02/04617 está dirigida a los granos de cacao, que se ven sometidos a una etapa específica y larga de ácido de fermentación, distinta a la que se hace con los granos de café. Una importante proteinasa vacuolar cisteína (CP) es la KDEL que contiene cisteína-proteinasa . Este tipo de proteinasa ha sido caracterizada en varias plantas. Hasta la fecha, se han encontrado tres genes que codifican las cisteína proteinasas con secuencias KDEL y terminación C, en la arabidopsis (Gietl, C. And Schmid, M. 2001, Naturwissenschaften 88, 49-58) . Uno esta expresado en óvulos envejecidos, uno en contenedores vasculares, y el tercero en silicuas maduras. Sin embargo, estudios más detallados de esta proteina se han hecho en otras plantas. Por ejemplo, una CP llamada la sulfihidril-endoproteinasa (SH-EP) ha sido caracterizada en los cotiledones de los granos de Vigna mungo (Toyooka, K. , Okamoto, T. And Minamikawa, T. (200) J. Cell Biol . 148, 143-463). La SH-EP es expresada otra vez en los cotiledones que están germinando de la V. Mungo, y se propone que está involucrada en la degradación de las proteínas de almacenamiento acumuladas en las vacuolas de proteínas de almacenamiento (Okamato, T. And Minamikawa, T. J. Plant Physiol. 152, 675-682) . Una característica clave del polipéptido SH-EP es que posee una KDEL secuencia terminal específica de COOH que ' dirige el transporte . de esta proteína desde el retículo endoplasmático (RE) hacia las vacuolas que almacenan Proteínas (Toyooka et al., 2000) . También se ha propuesto recientemente que la proteína SH-EP está actualmente involucrada, con la presencia de la secuencia KDEL, en la formación de vesículas especiales llamadas KV (Vesículas KDEL) en un sistema vesicular previamente no descrito (Okamato, T., Shimada, T., Hara-Nishimura, I., Nishimura, M. , And Minamikawa, T. (2003) Plant Physiology, 132, 1892-1900). Una propuesta relacionada se ha hecho para una proteína KDEL conteniendo una CP encontrada en los cotiledones germinantes de semillas de castor (Ricinus communis) . En esta planta, se implica a la proteinasa KDEL en la muerte programada del endospermo celular para continuar supliendo de nutrientes para el embrión germinante de la semilla de castor (Gietl, C, and Schmid, . 2001, Naturwissenschaften 88, 49-58) . Estos autores proponen que, en la semilla de castor, la proteinasa KDEL se hace en la ER de semillas germinantes antes del tercer dia. Cuando la cubierta de la semilla se elimina, alrededor del tercer dia, ' la KDEL conteniendo CP se empaca en una vesícula especifica llamada Ricinosoma. Después, a medida que el endospermo se vuelve suave entre 4-5 dias, la KDEL-CP tiene su secuencia de ancla (KDEL) con una descomposición eliminada y esta proteinasa emigra hacia el citoplasma en donde ayuda en la degradación de la proteina celular.

Objetivos de la Invención Es un objetivo de la presente invención, modificar los yacimientos de proteinas/péptidos/aminoácidos precursores de sabor en el café. Con mayor especificidad, es un objetivo de la presente invención el modificar los niveles de los precursores de sabo en la materia prima ' (el grano verde) para que, el seguido tratamiento después de la recolecta y el proceso de tostado, pueda conseguir un sabor alterado. Sin estar definido por teoría, se cree que, si hay variaciones en los niveles de degradación de péptidos y de proteínas entre cafés con significante diferencias en sabores, por lo que estas variaciones sean dadas a diferencias en las actividades de la proteinasa endógena en estos granos diferentes. Esta diferencia puede ser detectada al nivel de expresión del mARN mediante variaciones en los niveles de expresión para gentes particulares de proteinasa en los granos.

Declaraciones de la Invención La presente invención involucra por lo tanto, la identificación de secuencias genéticas que codifican las proteinasas especificas del grano de café (Semilla) y mostrar que de cierto hay variaciones en la expresión de estos genes en las variaciones arábica y robusta. Con mayor especificidad, el presente invento comprende dos grandes proteinasas de cisteína (CcCP-1 y CcCP-4), cuatro grandes inhibidores de la proteinasa de cisteína del café (CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3 y. CcCPI-4) y dos proteinasas aspárticas del café (Cci¾P-l y CcAP-2), todas presentes en los granos de café. Mostraremos mas adelante como una sobreabundancia de estas proteínas específicamente tardías en el desarrollo del grano, o la mínima expresión de estas proteínas durante el tardío desarrollo del grano, pueden alterar los perfiles de aminoácidos, péptidos y proteínas de los. granos maduros. Mediante el uso de una o más de las secuencias genéticas descritas y construcciones genéticas para alterar el perfil de aminoácidos, péptidos y proteínas de los granos maduros, brindamos un nuevo método para alterar el perfil de precursores de sabor en granos maduros de café. En un primer aspecto, la presente invención provee un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una actividad de proteinasa de cisteína, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC. DE IDENT. No. 2 ó 16 tienen por lo menos un 70%, preferiblemente un 80%, de secuencia de identidad basada en el método de alineamiento ClustalW; o bien el complemento de la secuencia de los nucleótidos, en donde el complemento contiene el mismo número de nucleótidos que la secuencia" de nucleótidos, y el complemento y la secuencia de los nucleótidos son un 100% complementarios entre sí. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. Nos. 2 ó 16 • tienen por lo menos un 85%, preferiblemente por lo menos 90%, opcionalmente por lo menos un 95%, de secuencia de identidad basada en el Método de Alineamiento ClustalW. Preferiblemente, el nucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de las SEC. DE IDENT. Nos. 1 ó 15. · Preferiblemente, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. Nos. 2 ó 16.

En un segundo aspecto, se ha provisto de un nucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una actividad de inhibición de la proteinasa de cisterna, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC. DE IDENT. Nos. 4, 10, 12 y. 14 tienen por lo menos un 70%, preferiblemente por lo menos 80%, de la identidad de la secuencia basada en el método de alineamiento ClustalW; o bien el complemento de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento contiene el mismo número de nucleótidos que la secuencia de nucleótidos, y el complemento y la secuencia de . nucleótidos son un 100% complementarios. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido y de la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC. DE IDENT. Nos. 4, 10, 12 y 14 tienen por lo menos un 85%, preferiblemente un 90%, opcionalmente por lo menos un 95%, de secuencia de identidad basada en el método de alineamiento ClustalW. Preferiblemente la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada de las SEC. DE IDENT. Nos. 3, 9, 11 ó 13, opcionalmente de las SEC. DE IDENT. Nos. 9, 11 ó 13, opcionalmente mas delante de las SEC. DE IDENT. Nos. 9 ó 13; opcionalmente aun más adelante siendo la SEC. DE IDENT. No. 9. Preferiblemente, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC. DE IDENT. Nos. 4, 10, 12 y 14, opcionalmente de las SEC' DE IDENT. Nos. 10, 12 y 14, opcionalmente más delante de las SEC. DE IDENT. Nos. 10 ó 14; opcionalmente aun más adelante la SEC. DE IDENT. No. 10. En un tercer aspecto, se ha provisto de un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polipéptidos que tienen una actividad de endoproteinasa aspártica, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC. DE IDENT. Nos. 6 ó 8, preferiblemente las SEC. DE IDENT. No. 8, tienen por lo menos un 75%, preferiblemente por lo menos 80%, de la identidad de la secuencia basada en el método de alineamiento ClustalW; o bien el complemento de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento contiene el mismo número de nucleótidos que la secuencia de nucleótidos, y el complemento y la secuencia de nucleótidos son un 100% complementarios. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del polipéptido y de la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC. DE IDENT. Nos. 6 u 8, preferiblemente las SEC. DE IDENT. No. 8, tienen por lo menos un 85%, preferiblemente un 90%, opcionalmente por lo menos un 95%, de secuencia de identidad basada en el método de alineamiento ClustalW. Preferiblemente la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada, de las SEC. DE IDENT. Nos. 5 ó 7, preferiblemente la. SEC. DE IDENT. No. 7. Preferiblemente, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC. DE IDENT. Nos. 6 u 8, preferiblemente la SEC. DE IDENT. No. 8. E un posterior aspecto, hay un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de los aspectos primero al tercero de esta invención. En otro aspecto, existe una construcción de ADN no nativo recombinante que comprende el polinucleótido de cualquiera de los aspectos del primero al tercero de esta invención, operablemente vinculados a una secuencia reguladora. Posteriormente se apreciara, en la construcción no nativa, que ya sea el poli nucleótido es no nativo o bien la secuencia reguladora es no nativa o ambas son no nativas. En otro aspecto, hay un método para transformar una célula que comprende transformar la célula con el polinucleótido de cualquiera de los aspectos primero al tercero de la presente invención. En otro aspecto, hay una célula que comprende las antes mencionadas construcciones de ADN no nativo recombinante, en donde la célula es preferiblemente una célula procariota, una célula eucariota o una célula de planta, preferiblemente una célula de café. En otro aspecto, hay una planta transgenética que contiene dicha célula transformada. En la presente aplicación, los términos de grano de café se definen como sigue: grano de café, fruta entera, exocarpio, piel; pericarpio, capa carnosa externa del grano; y grano, semilla de café. Para, una mejor explicación de estos términos, se hace una referencia de Clarke, R.J. en Café: Botánica, Bioquímica, y la Producción de Granos y Bebida, página 230, Clifford, M.N. y Willson, K.C. eds, Croom Helm Ltd, London, el contenido del cual esta incorporado en su totalidad.

Breve Descripción de la Invención La Invención puede ser comprendida a partir de la siguiente descripción detallada y el Listado de las Secuencias que acompaña las cuales forman parte de la presente aplicación. La Tabla 1 aquí dada detalla los polipéptidos que se describen aquí, así como su correspondiente identificador de secuencia (SEC. DE IDENT. No.) como se usa en la lista dada.

Tabla 1: SEC. DE IDENT. No. 1 (CcCPl: Proteinasa de Cisteína, ácido nucleico y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 2 (CcCPl: Proteinasa de Cisteína, aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 3 (CcCPI-1: Inhibidor de Proteinasa de Cisteína, ácido nucleico y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 4 (CcCPI-1: Inhibidor de Proteinasa de Cisteína, aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 5 (CcAPl: Endoproteinasa aspártica 1, ácido nucleico y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT . No. 6 (CcAPl: Endoproteinasa Áspártica 1, aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 7 (CcAP2: Proteinasa Aspártica 2, ácido nucleico. y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 8 (CcAP2: Proteinasa Aspártica 2, aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 9 (CcCPI-2: Inhibidor de Proteinasa de Cisterna, ácido nucleótido y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 10 (CcCPI-2: Inhibidor de Proteinasa de Cisterna, aminoácido) SEC. DE IDENT.. No. 11 (CcCPI-3: Inhibidor de Proteinasa de Cisterna, ácido nucleico y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 12 (CcCPI-3: Inhibidor de la Proteinasa de Cisterna, aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 13 (CcCPI-4: Proteinasa Inhibidora de Cisterna, ácido nucleico y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 14 (CcCPI-4: Inhibidor de la proteinasa de Cisterna, aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 15 (CcCP-4": Proteinasa de la Cisteina, ácido nucleico y su correspondiente aminoácido) SEC. DE IDENT. No. 16 (CcCP-4: Proteinasa de Cisterna, aminoácido) La secuencia del listado emplea el único código de letras para los caracteres de la secuencia de nucleótidos para aminoácidos definida por los estándares IUPAC-AUBMB y están descritos en la Investigación de Ácidos Nucléicos 13:3021-3030 (1985), la cual esta incorporada aquí para referencia.

Dibujos En los dibujos, La Figura 1 muestra un análisis Northern blot de un gen de proteinasa de cisteina en diferentes tejidos de Coffea arábica, en los cuales las hileras están etiquetadas R: raíz, S: tallo; L: hojas jóvenes; y SG, LG, Y y Red son granos de la fruta verde pequeña, fruta verde grande, fruta amarilla y fruta roja, respectivamente. Se cargaron 5 microgramos de ARN total en cada hilera. MW es una escalera del tamaño de ARN. El Panel B ilustra una autoradiografia después de una exposición de 24 horas mostrando la apariencia de CcCP-1 mARN en los tejidos analizados y el Panel A demuestra una tinción de bromuro de etidio de los geles antes de ser sometidos a tinción. La Figura 2 muestra un análisis Northern blot de la expresión de la proteinasa de cisteina en diferentes tejidos de Coffea arábica, en los cuales las hileras están etiquetadas, R, raíz; S, tallo; L, hojas jóvenes; F, Flores. SG(G), LG (G) , Y (G) y Red(G) que corresponden a ARN aislado del los granos de la fruta verde pequeña, Fruta verde grande, fruta amarilla y fruta roja, respectivamente y las hileras que están etiquetadas SG(P), LG(P), Y(P) y Red(P) correspondientes a ARN aislado del tejido del pericarpio de granos de la fruta verde pequeña, Fruta verde grande, fruta amarilla y fruta roja. Se cargaron cinco microgramos de ARN total en cada hilera. El Panel A ilustra una tinsión de bromuro de etidio del grande ARN ribosomal sometidos a tinsión como un control de carga, el Panel B es un auto-radiograma que muestra la apariencia de la CcCP-1 mARN en los tejidos específicos analizados. Figura 2A: La alineación de la secuencia completa de la proteína codificada por CcCP-1 cADN con otra proteinasa de cisteína completa disponible en la base de datos NCBI. Esto fue hecho en Megalign mediante el método CLUSTAL en el MegAlign (ADNSTAR) . Los bloques sometidos a tinsión indican aminoácidos idénticos. Los números de acceso de la base de datos EMBL están dados en paréntesis. Arabidopsis thaliana (AYO70063 ) ; Vicia sativa (Z99172); Glicina max GMCP3 (Z32795) ; Glicina max GmPM33 (AF167986) ; Phaseolus vulgaris Moldavain (Z99955) ; Solanum melongena (AF082181) ; Nicotiana tabacum (AJ242994); Lycopersicon esculentum (Z14028) ; Vicia faba (AY161277). La Figura 3 muestra un Análisis Northern blot de un gen inhibidor de la proteinasa de Cisteína (CcCPI-1) en diferentes tejidos de Coffea arábica, en los cuales las hileras están etiquetadas R: raíz, S: tallo, L: hojas jóvenes; F: Flores jóvenes y SG, LG, Y y Red que corresponden a los granos de la fruta verde pequeña, Fruta verde grande, fruta amarilla y fruta roja, respectivamente. Se cargaron 5 microgramos de ARN total en cada hilera. MW es una escalera del tamaño del ARN. El ¦ Panel B ilustra una auto-radiograma después de 24 horas de exposición y el Panel A demuestra una tinsión de bromuro de etidio de los geles sometidos a tinsión. La Figura 4 muestra un análisis Northern blot de un gen Inhibidor de proteinasa de Cisteina (CcCPI-1) en los diferentes estados de desarrollo de la fruta de Coffea arábica (ARA) y Coffea robusta (ROB) . Las hileras están etiquetadas como fruta verde pequeña (SG) , fruta verde grande (LG) , fruta amarilla (Y) y fruta roja (Red), respectivamente. Se cargaron un total de 5 microgramos de ARN en cada hilera. MW es una escalera del tamaño del ARN. El Panel B ilustra un auto- radiograma después de 24 horas de exposición mostrando la apariencia de CcCPI-1 mARN en los tejidos específicos analizadas y el Panel A demuestra una tinsión de bromuro de etidio de los geles sometidos a tinsión. La Figura 5 muestra del análisis RT-PCR de la expresión de CcCP-1 durante la germinación del grano de Coffea arábica. La reacción PCR se llevo a cabo usando 10 microlitros de cada cADN diluidos en una proporción de uno en cien. Las condiciones cíclicas fueron 2 minutos a, 94°C, 35 ciclos de 94°C, 61°C, por 1.5 minutos, y 72°C por 2.5 minutos. La extensión final del paso fue de 7 minutos a 72 °C. Los detonadores PCR fueron: A4-43-alto: 5' ACCGAGGAGGAGTTTGAGGCTACG - 3' A4-43-bajo: 5'- ACGCTTCCCCCATGAGTTCTTGA - 3' Los mARN fueron amplificados mediante RT-PCR usando detonadores especificos (CcCP-1 hasta/CcCP-1 bajo) en diferentes plantillas: cADN de semilla esterilizada (TO) y semillas tomadas después de 2 días (2d) , 3 días (3d) , 5 días (5d) , 1 mes (lm) y 2 meses (2m) de germinación, respectivamente. Los productos PCR se revelaron en una mezcla de 1% (p/v) de agar gel y sometidos a tinsión con bromuro de etidio. RPL39; fragmento amplificado de- cADN que codifica la proteína L39 de la gran subunidad ribosomal 60S. La Figura 6 muestra un análisis de Western-blot de la proteína CcCPl (A) . El total de proteínas fueron extraídas de los granos (g) y pericarpio (p) recolectado de las frutas de café en desarrollo en las diferentes etapas Pequeña Verde (SG) Gran Verde (LG) Amarilla (Y) y Roja. Panel B- separación de 50 µ? de proteína total ¦ en un gel al 12% SDS-PAGE y sometidos a tinsión con Azul de Comassie. Panel A - la detección de las proteínas fue realizada usando un anticuerpo policlonal anti-CRP4 (conejo) como se describe en los métodos. El tamaño aproximado de las bandas en el panel B se indica con las flechas a la izquierda. La flecha grande dentro de cada panel indica la presencia de proteínas de almacenamiento mayores que tienen reacciones cruzadas con uno de los anticuerpos.

La Figura 6A muestra el alineamiento óptimo de la proteina completa codificada por CcCPI- cADN con otras homologas de proteinasas de cisteina de tamaño completo que se encuentran en el NCBI . Los bloques sometidos a tinsión- indican aminoácidos idénticos. Los números de acceso de la base de datos de la EMBL y el porcentaje de identidades son dados en paréntesis. Malus x domestica (AA018638; 42.3% identidad), Girasol común (JE0308; 41.5% identidad), Arabidopsis thaliana (AAM64985, 30% identidad) Rumex obtusifolius (CAD21441; 29.3% de identidad) ; La Figura 7 muestra un análisis RT-PCR de la expresión del gen CcCPI-1 en diferentes tejidos de Coffea arábica CCCA2 (A) y Coffea robusta (FRT-32 (B) . Se llevo a cabo una reacción PCR usando 10 µ? de cada cADN diluido 1/1000. Las condiciones cíclicas fueron 2 minutos a 94 °C, 40 ciclos de 9 °C por 1 minuto, 60°C por 1.5 minutos y 72°C por 1 minuto. El paso final de extensión fue de 7 minutos a 72 °C. Los detonadores PCR ¦ fueron: CcCPI-1 (Superior) 5' AGGAAAGTGGGAGCAAGGGAGAAGA3 ' CcCPI-1 (Inferior) 5' TAGTATGAACCCAAGGCCGAACCAC 3' Las hileras fueron etiquetadas como se detalla: -M, Marcadores; +P, plasmado diluido conteniendo el gen CcCPI-1; R, raíz; S, tallo; L, Hojas jóvenes; F, flores. SG(G), LG(G), Y (G) y Red (G) que son granos aislados de frutos pequeños verdes, grandes verdes, amarillos y rojos, respectivamente. SG(P), LG(P), Y(P) y Res (P) son tejido del pericarpio extraído de frutos verdes pequeños, verdes grandes, amarillos y rojos, respectivamente. La Figura ¦ 8 muestra la alineación óptima de la proteína completa codificada por CcCPI-2 cADN con otras homólogas de proteinasas de Cistexna de tamaño completo que se encuentran en el NCBI . Los bloques sometidos a tinsión indican aminoácidos idénticos. Los números de acceso de la base de datos y el porcentaje de identidades se dan en paréntesis. Rumex obtusifolíus (CAD21441 66.7% de identidad), Dianthus caryophyllus (AAK30004; 71.7% de identidad); Manihot esculenta (AAF72202; 65.2% de identidad). La Figura 9 muestra un análisis RT-PCR de la expresión del gen CcCPI-2 en diferentes tejidos de Coffea arábica CCCA2 (A) y Coffea ¦ robusta FRT-32 (B) . Se llevó a cabo una reacción PCR usando' 10 µ? de cada cADN diluido 1/1000. Las condiciones cíclicas fueron 2 minutos a 9 °C, 40 ciclos de 94 °C por I- minuto, 60 °C por 1.5 minutos y 72 °C por 1 minuto. El paso final de extensión fue de 7 minutos a 72 °C. Los detonadores PCR fueron: CcCPI-2 (Superior) 5' GTGAAGCCATGGTTGAACTT 3' CcCPI-2 (Inferior) 5' GTAATGATACTCAAGCCAGA 3' Las hileras fueron etiquetadas como se detalla: -M, Marcadores; + P, Plásmido diluido conteniendo el gen CcCPI-2; R, raíz; S, tallo; L, Hojas jóvenes; F, flores. -SG(G), LG(G), Y(G) y Red (G) que son granos aislados de frutos pequeños verdes, grandes verdes, amarillos y rojos, respectivamente. -SG(P), LG(P), Y(P) y Res (P) son tejidos del pericarpio extraído de frutos verdes pequeños, verdes grandes, amarillos y rojos, respectivamente. La Figura 10 muestra la alineación óptima de la proteína completa codificada por CcCPI-3 cADN con otras homologas de proteinasas de Cisteína de tamaño completo que se encuentran en el NCBI . Los bloques sometidos a tinción indican aminoácidos idénticos. Los números de acceso de la base de datos y el porcentaje de identidades se dan en paréntesis. Citrus x paradisi . (AAG38521; 42.4% de identidad); Actinidia deliciosa (AAR92223; 44.4% de identidad); y Arabidopsis thaliana (AAM64661; 44% de identidad) . La Figura 11 muestra la alineación óptima de la proteína completa codificada por CcCPI-4 cADN con otras homologas de proteinasas de Cisteína de tamaño completo que se encuentran en el NCBI. Los bloques sometidos a tinción ' indican aminoácidos idénticos. Los números de. acceso de la base de datos y el porcentaje de identidades se dan en paréntesis. Citrus x paradisi (AAG38521; 23.6% de identidad); y Arabidopsis thaliana (AAM64661; 20% de identidad) . . La Figura 12 muestra un análisis RT-PCR de la expresión del gen CcCPI-4 en diferentes tejidos de Coffea arábica CCCA2 (A) y de Coffea robusta FRT-32 (B) . Se llevo a cabo una reacción PCR usando 10 µ? de cada cADN diluido 1/1000. Las condiciones cíclicas fueron 2 minutos a 94 °C, 40 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 60 °C por 1.5 minutos y 72 °C por 1 minuto. El paso final de extensión fue de 7 minutos a 72 °C. Los detonadores PCR fueron: CcCPI-4 (Superior) 5' CTACGGTCGCAGCCAAATC 3' CcCPI-4 (Inferior) 5' ACAACTGCACCTTCAATGTAC 3' Las hileras fueron etiquetadas como se detalla: -M, Marcadores; +P, plásmido diluido conteniendo el gen CcCPI-4: R, raíz; S, tallo;. L, Hojas jóvenes; F, flores. -SG(G), LG(G), Y(G) y Red (G) que son granos aislados de frutos pequeños verdes, grandes verdes, amarillos y rojos, respectivamente. -SG(P), LG(P), Y(P) y Red (P) son tejido del pericarpio extraído de frutos verdes pequeños, verdes grandes, amarillos y rojos, respectivamente. La Figura 13 muestra un Análisis Northern blot de la expresión del gen de la proteinasa aspártica 2 (CcAP2) en diferentes tejidos de Coffea arábica, en los cuales las hileras están etiquetadas R: raíz, S: tallo, L: hojas jóvenes; F: Flores y SG(G) y (P) , LG (G) y (P) , Y (G) y (P) y Red(G) y (P) son para granos y para pericarpio, respectivamente de los granos de la fruta verde pequeña, fruta verde grande, fruta amarilla y fruta roja, respectivamente y las hileras que están etiquetadas SG(G), LG(G), Y(G) y Red(G) correspondientes al pericarpio de granos de la fruta verde pequeña, fruta verde grande, fruta amarilla y fruta roja. Se cargaron cinco microgramos de ARN total en cada hilera. El Panel A ilustra una tinción de bromuro de etidio del grande ARN ribosomal sometido a tinción como un control de carga, el Panel B es un auto-radiograma que muestra la apariencia de la CcCP-2 mARN en los tejidos específicos analizados. La Figura 14 muestra la secuencia de cADN y la secuencia deducida de aminoácidos de CcCP- . En las minúsculas: 5' y 3' , regiones no traducidas; en las mayúsculas: estructura de lectura abierta; carácter negritas: secuencia de aminoácidos;*: codón de detención. La Figura 15 muestra la alineación de la secuencia completa de la proteína codificada por CcCP-4 CADN con otras proteinasas de Cisteina de tamaño completo que se encuentran en la base de datos de NCBI. Esto fue hecho usando el programa CLUSTAL W en el software MegAlign (Lasergene package, ADNSTAR) . Los bloques sometidos a tinción indican aminoácidos idénticos. Los números de acceso son dados en paréntesis. Dacus carrota (JC7787); Ricinus communis (AF050756) ; Vicia sativa (Z34895) ; Phaseolus vulgaris (X56753) ; Helianthus annuus (AB109188) ; Glycine max Cysl (AE092555) ; Glycine max Cys2 (AB092557) ; Canavalia ensíformis (P49046) ; Oryza sativa (AB004648); Vigna mungo (P12412); Pisum sativum (AJ004985; La Figura 16 muestra la secuencia completa del cADN del CcCP-4 KDDL y la secuencia parcial de cADN del CcCP-4 (KDEL) fueron alineados usando el programa ClustalW en Megalign; La Figura 17 muestra el espectro completo abierto de lectura del CcCP-4 ( DDL) y el espectro parcial de lectura de CcCP-4 (KDEL) que fueron alineados usando el programa ClustalW en Megalign; La Figura 18 muestra los cromatogramas de la secuencia del ADN para el PCR amplificado del genoma ADN que codifica la región KDEL/KDDL del gen CcCP-4. Rob indica la variedad robusta y Arab, indica la variedad arábica. La Figura 19 muestra un Análisis Northern blot del gen de la proteinasa de cisteina CcCP-4 en diferentes tejidos de Coffea arábica. Las hileras están etiquetadas como sigue: -R, raíz; S, tallo; L, hojas jóvenes; F,. flores. - SG (G) , LG (G) , Y (G) y Red (G) que corresponden a los granos aislados de la fruta verde pequeña, fruta verde grande, fruta amarilla y fruta roja, respectivamente. Se cargaron cinco microgramos de ARN total en cada hilera. El panel A muestra una tinsión de bromuro de etidio del gran ARN ribosomal antes · de ser bombardeado como un control de carga, el Panel B es un auto-radiograma que muestra la apariencia del CcCP-3 mARN en los tejidos específicos analizados. La Figura 20 muestra el Análisis RT-PCR de la expresión de CcCP-4 en el grano completo durante la germinación. Los tiempos de muestreo fueron 0, inmediatamente después del tratamiento de esterilización; 2D, 2 días después del tratamiento; 3D, 3 dias después del tratamiento; 5D, 5 días después del tratamiento; 1M, un mes después del tratamiento; 2M, dos meses después del tratamiento; sin control de ADN; +P, ADN plasmático del CcCP-4 diluido; M, marcadores de peso molecular. La Figura. 21 muestra la alineación óptima de la proteina completa ' codificada por CcAP-1 cADN con otras secuencias homologas de proteinasas de aspártica de tamaño completo disponible en el NCBI . Los bloques sometidos a tinción indican aminoácidos idénticos. Los números de acceso a la base de datos se dan en el paréntesis. Arabidopsis thaliana (AY099617) y Arabidopsis thaliana (BAB09366) ; y La Figura 22 muestra la alineación óptima de la proteina completa codificada por CcAP-2 cADN con otras secuencias homologas de la proteinasa aspártica de tamaño completo disponible en el NCBI. Los bloques sometidos a tinción indican aminoácidos idénticos. Los números de acceso a la base de datos se dan en paréntesis. Glycine max (BAB64296) , Ipomoea batatas (AAK48494) , Lycopersicon esculentum (S71591) y Nepenthes alata (BAB20972) .

Descripción. Detallada de la Invención Como se usará de aqui en adelante, un "polinucleótido" es una secuencia de nucleótidos tal como un fragmento de ácido nucleico. Un poliriucleótido puede ser un polímero de ADN o de ARN que sea sencillo o de doble hebra, que opcionalmente contenga bases nucleótidas sintéticas, no naturales o. alteradas. Un polinucleótido en la forma de un polímero de ADN puede contener uno o más segmentos de cADN, ADN genómico, ADN sintético, o mezclas de estos. Similares fragmentos de ácidos nucleicos se caracterizan, en el presente invento, por medio de la identidad de las secuencias de aminoácidos que estos codifican, para las secuencias de aminoácidos dadas aquí, como se determina por medio de algoritmos comúnmente usados por los expertos en esta materia. Los fragmentos apropiados de ácido nucleico (o bien polinucleótidos aislados del primer al tercer aspecto de la presente invención) codifican polipéptidos que son por lo menos un 70% idénticos, preferiblemente por lo menos un 80% idénticos, a las secuencias de aminoácidos detalladas aquí. Los fragmentos de ácidos nucleicos preferidos que codifican las secuencias de aminoácidos que son por lo menos en un 85% idénticas a las secuencias de aminoácidos dadas aquí. Los fragmentos de ácidos nucleicos más preferidos que codifican las secuencias de aminoácidos que son por lo menos en un 90% idénticas a las secuencias de aminoácidos dadas aquí. Los fragmentos de ácidos nucleicos que son todavía aún más preferidos que codifican las secuencias de aminoácidos que son por lo menos en un '95% idénticas a las secuencias de aminoácidos dadas aquí. Deben hacerse múltiples alineaciones de secuencias usando el método de alineación ClustalW (Thompson et al, 1994, Investigación de Ácidos Nucleicos, Vol. 22, p4673-4680; Higgins & Sharp, 1989, Cabios. 5:151-153). Como se usa de aquí en adelante, el término "Fragmentos similares de Ácidos Nucleicos" se refiere a secuencias polinucleótidas en las cuales los cambios en una o más bases nucleótidas resultan en la substitución de uno o más aminoácidos, pero cuyos cambios no afectan la habilidad del fragmento de ácidos nucleicos de mediar la expresión genética mediante la vía de silenciar genes, por ejemplo, la tecnología de co-expresión o antisentido. El término "Fragmentos Similares de Ácidos Nucleicos" también se refiere a las secuencias modificadas de nucleótidos, en las cuales una o más de las bases nucleótidas es o son eliminadas o bien insertadas, de modo que estas modificaciones ya sean que no afecte la habilidad del fragmento de ácidos nucleicos para mediar la expresión genética mediante la vía de silenciar genes. Por lo que se comprenderá que la visión del presente invento se extiende más allá de los polinucleótidos y de las secuencias polipeptídicas específicamente dadas aquí. Fragmentos similares de ácidos nucleicos pueden ser seleccionados mediante la detección de fragmentos de ácidos nucleicos en la planta o en las células de la. planta. El término "operablemente vinculados" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un solo fragmento de ácidos nucleicos para que la función de uno se vea afectada por la. del otro. Las "Secuencias Reguladoras" se refieren a las secuencias de nucleótidos localizadas en el nivel superior, dentro, o en el nivel inferior, de una secuencia que codifica y la cual , influencia la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada con la misma. Las secuencias reguladoras pueden .incluir detonadores, secuencias líderes de traducción, reconocimiento de secuencias de intrones, trascripción de secuencias terminales y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. Cuando una secuencia reguladora en la forma de un detonante se ve operablemente vinculada a la secuencia codificadora, la secuencia reguladora es capaz de afectar la expresión de la secuencia codificadora. Las secuencias codificadoras pueden ser operablemente vinculadas a las secuencias reguladoras en la orientación en sentido o antisentido. El término "Expresión" se refiere a la transcripción, y la acumulación estable del sentido del ARN (mARN) o del antisentido del ARN derivado de los fragmentos de ácido nucleico del presente invento. -La expresión también puede referirse a la translación del mARN en un Polipéptido. La sobre expresión se refiere a la producción de productos genéticos en una célula t ansgenética, que excede los niveles de producción en lo normal, ó células no transformadas. Los "Niveles Alterados" se refiere a la producción de productos genéticos en una célula transgenética en cantidades o proporciones que difieren de aquellos de células normales o no transformadas. La transformación se refiere a transferir un fragmento de ácido nucleico en un genoma de una célula huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados, se refieren de aqui en adelante como "células Transgenéticas". El ADN estándar recombinate y las técnicas moleculares de clonación que se usan aqui se conocen muy bien en la técnica y se describen con mayor detalle en Sambrook et al "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio", Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, -1989, que está incorporado aqui para referencia.

Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar la misma. En los ejemplos, todas las partes y porcentajes son en peso y los grados se expresan en la escala Celsius, a menos que se especifique lo contrario. En los siguiente ejemplos, se usan las abreviaturas: PCR: Reacción en Cadena de Polimerasa RACE: Rápida Amplificación de Terminales de cADN De la discusión anterior y de los siguientes ejemplos, aquellos expertos en la técnica pueden indagar las características esenciales del presente invento, y sin desviarnos de la visión de éste, pueden hacer varios cambios y modificaciones al mismo, para adaptarlo a diversos usos y condiciones como se deseen.

Selección y Producción de Bibliotecas de cADN Producción de ARN Específico de la Semilla Las semillas de café de la variedad Robusta Q121 fueron recolectadas 30 WAF (semanas después del florecimiento) en el ICCRI, en Indonesia. Los pericarpios de estas semillas fueron entonces removidos y el periesperma/endosperma remanente fue congelado y molido a polvo bajo nitrógeno líquido. Se extrajo el ARN del- polvo congelado usando el método descrito anteriormente para la extracción del ARN de las semillas de cacao (Guilloteau, M. , et al, .2003, "Cuerpos Oleosos en las Semillas de Theobroma cacao: clonación y caracterización del cADN codificador de las oleosinas kDa 15.8 y 16.9. Plant Science, Vol. 164, 597-606). Se preparó el Poli ARN A+ de aproximadamente 250 µg de ARN total usando el estuche "PolyA Purist™" de la marca AMBION (fabricado por Ambion Inc.) de acuerdo a las instrucciones dadas en el estuche.

Producción del Primer Lote de Clones de cADN de las Semillas Aproximadamente de 50 a 100 ng de este Poli A+ ARN fue empleado en la síntesis de la primera cadena de cADN usando los "Estuches de Transcriptaza Recesa Super Script™ II R Nase (GIBCOBRL™) y la síntesis SMART™ PCR de cADN, (Clontech) " como sigue. Una reacción que contiene 2 µ? de ARN Poli A+ de 30WAF, 1 µ? de oligo CDS (Estuche SMART™ PCR de cADN, Clontech), 1 µL de Smart II oligo (Estuche SMART™ PCR de cADN, Clontech) , y 8 µL ¾0 desionizada. Esta mezcla fue calentada a 72 °C durante 5 minutos y luego se colocó en hielo. Luego se le adicionó lo siguiente; 1 µ?, de dNTP de- lOmM, 4 µ?, de un Buffer Detonante SuperScriptII™ y 2 [í, de DTT. Esta mezcla fue puesta a 42 °C durante 2 minutos, luego se le agregó 1 µL de Transcriptaza Reversa SuperScriptII™ RNaseH" (200 unidades/jiL GIBCO BRL™) y la mezcla fue incubada en una incubadora de aire circulante a 42 °C durante 50 minutos más. Después de la reacción de transcripción reversa, la siguiente reacción PCR se llevó a cabo. 98 L de la mezcla maestra descrita en el estuche SMART™ PCR cADN (Clontech) conteniendo la Polimeraza Advantege™ 2 (Estuche Adevantage™ 2 PCR, Clontech) se colocó en hielo y luego se le adicionó 3 µL de la Primera Cadena de la reacción para la síntesis de cADN descrita en lo anterior. Estos 100 µL de la reacción PCR se colocaron en un aparato de Investigación MJ PTC-150 HB y se dieron las siguientes condiciones de PCR: 95°C por 1 minuto, luego 16 ciclos de 95°C durante 15 segundos 65°C durante 30 segundos, 68 °C durante 6 minutos. El ADN amplificado fue purificado usando el Estuche de Purificación Strataprep™ PCR (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El ADN fue diluido en 50 µ?? de agua desionizada, luego fue "pulido" usando los reactivos de polimeraza Pfu-1 encontrados en el Estuche de Clonación de Amp PCR-Script™ (Stratagene) como sigue; 50 µ? de ADN, 5 µ? de dNTP de lOmM, 6.5 µ? de buffer pulidor de lOx Pfu-1, 5 µ?, de Polimeraza de ADN clonada Pfu-1 (0.5 ?/µ?) . Esta reacción fue encubada a 72°C durante 30 minutos en un aparato PCR con una tapadera caliente (Perkin Elmer) . Osando el protocolo descrito en el Estuche de Amp pPCR-Script™ (Stratagene), los productos de la PCR pulidos (bruscos) fueron ligados al vector Amp SK(+) Srf-1 digerido pPCR-Script™ en la presencia de la enzima Srf-1 y los productos de la . ligación fueron transformados a Células Kan Ultracompetentes de E. coli XL-10 Gold™. La selección para la transformación con plásmidos que contienen insertos se hizo usando placas Amp-LB y IPTG y una sustancia Xgal que se dispersó en la superficie como se describe en el estuche Amp pPCR-Script™. Se seleccionaron colonias blancas y los clones fueron llamados Davl-1, etc.

Producción del Segundo Lote de Clones de cADN en Semillas con cADN Seleccionado por su Tamaño. Las semillas expresan altamente un pequeño número de proteínas, tal como, las proteínas de almacenamiento de las semillas (White et ai, 2000, Plant Physiology, Vol. 124, 1582-1594) . Cuando el cADN se prepara de tal tejido, el muy alto nivel de las proteínas de almacenamiento y de otras proteínas específicas de las semillas, conlleva a un nivel de "redundancia" de cADN, 'que es, la población de cADN producida que contiene altas proporciones del mismo cADN. Para reducir esta redundancia de cADN hecha del mARN de semillas de café, y para caracterizar selectivamente los cADN grandes y débiles expresados, una segunda estrategia de clonación de cADN también fue usada. Usando los productos de la reacción de la transcriptasa reversa descrita arriba, se dieron las siguientes reacciones PCR usando el estuche PCR Advantage™ 2 (Clontech)-: 3 microlitros de la reacción de la transcriptasa reversa, 5 microlitros de buffer PCR lOx Advantage™ 2, 1 ? de dNTP (de lOm cada uno) , 2 µ? de detonador PCR (Estuche PCR cADN SMART™, Clontech) , 39 µ?. de agua desionizada, y 1 µ?, de mezcla de polimerasa 50 x Advantage™ 2. Esta reacción PCR fue colocada en un aparato PTC-150 HB de Investigación MJ y se corrieron las siguientes condiciones PCR: 95 °C durante 1 minuto, luego 16 ciclos por 15 segundos, 68 °C durante 6 minutos. Al final de la PCR, se le agregó 1 µ? de SDS al 10% con un buffer de carga en gel, la muestra fue calentada a 37 °C durante diez minutos. Luego la muestra fue dividida para ser cargada en un gel de agarosa del 0.7% sin bromuro de etidio: 10% fue cargado en un pozo pequeño a la par de una hilera marcadora de ADN y el otro 90% · fue cargado en un gran pozo de escala vecina de preparación. Después de correrse el gel, la sección del gel con los marcadores de tamaño, más el 10% de la muestra de reacción, fueron sometidos a tinción con bromuro de etidio. La sección sometida a tinción del gel fue usada como un modelo para generar pedazos de Gel que contengan una PCR de ADN amplificado de diferentes tamaños de cADN presente en la parte remanente no sometida a tinción del gel. Seis pedazos fueron generados teniendo el rango indicado de tamaño de los ¦ fragmentos de PCR; A1A (0.8-lkb), A1B (1-1.5 kb) , A2 (1.5-2.25 kb) , A3 (2.25-3.25 kb) , A4 (3.25-4 kb) , y A5 (4-6.5 kb) . El ADN en cada pedazo de gel fue eluido de la agarosa usando un estuche de QIAEX II de Qiagen siguiendo las instrucciones de los proveedores (para las muestras 3A, 4A y 5A se calentaron por 10 minutos a 50 °C y las 1A, IB y 2A fueron calentadas durante 10 minutos a temperatura ambiente) . El cADN purificado de doble hebra fue luego re-amplificado posteriormente mediante PCR con una mezcla enzimática TAQ la que hace fragmentos que tienen una 3'T saliente como sigue: 30 µL de gel con el ADN aislado de doble hebra, 5 µL de 10 x de Buffer TAQ (Suplido con la Mezcla de Precisión de Polimerasa TAQ PLUS, Stratagene) , 1 µL de dNTP de 40 mM (cada uno de lOmM) , 2 ? de mezcla de polimerasa de precisión (Stratagene) y 11.5 µL de agua desionizada. Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 95 °C durante un minuto, luego 7 ciclos de 95DC durante 15 segundos, 65°C durante 1 minuto, 72°C por 8 minutos, luego 1 ciclo a 95°C por 15 segundos, 65°C durante 1 minuto, 72 °C durante 10 minutos. El ADN amplificado producido de la PCR fue luego ligado al vector PCR™-T0P0™ y clonado en células E, coli TOP10 usando el estuche TOPO™ TA (Invitrogen) como los describe el suplidor. Los clones fueron llamados por el orden en el que fueron aislados · y por su posición en el gel determinante de tamaño (por ejemplo, A2-1, A2-2, etc) .

Selección e Identificación Preliminar de los cADN de las Semillas El primer lote de colonias blancas obtenido de la Biblioteca genética Dav-1 fue seleccionado primeramente mediante la determinación del tamaño de cada inserto por medio de la ampliación del inserto usando los detonadores T3 y T7 que bordeaban .el sitio de clonación utilizado y por medio de la examinación de los fragmentos amplificados de PCR en el gel. Cada colonia blanca fue resuspendida en 200 µ?, de agua estéril y de 10 a 30 µ? de esta mezcla fue adicionado a 5 µ? de un buffer Taq polimerasa 10X (Stratagene) , 1 µ? 10 mM de mezcla dNTP, 2.5 µ? de detonador T3 de 20µ?, 2.5 µ? de detonador T7 de 20 µ?, 1. µ? de DMSO, 0.5 µ? de polimerasa Taq (Stratagene), y H20 para completar a un volumen final de 50 µ? . El programa de la reacción PCR usado fue 9 °C durante 1 minuto, luego 30 ciclos de 94 °C durante un minuto, 55 °C durante 1.5 minutos y .3.5 minutos a 72 °C, y un ciclo final de 7 minutos a 12°C. Para reducir la redundancia, los insertos de PCR de tamaño similar fueron sometidos a una digestión por medio de la restricción de la enzima Hae III. Esos fragmentos de PCR con el mismo patrón de restricción de la enzima Hae III no se continuaron estudiando. Los plásmidos de clones con fragmentos de PCR mayores que 500 bp y que tenían un patrón singular de restricción Hae III fueron luego purificados usando el estuche de plásmidos 8 ultra Qia all (Qiagen) para terminaciones 5' con dideoxi secuencias utilizando los detonadores codificadores de secuencia apropiados T7 o T3 en las secuencias circundantes del vector. Debido a que los insertos no fueron clonados en una manera ordenada, primero fue necesario determinar la terminación 5' de cada clon mediante una digestión Sea 1 del ADN puro del plásmido (El detonador CDS SMART contiene un sitio Sea 1 que permite que se determine la orientación del inserto) . La información de la secuencia del ADN obtenida fue subsecuentemente bombardeada en contra de una base de datos proteica no redundante en el GENEBANK (Banco Genético) para obtener una anotación preliminar de cada clon cADN usando el programa BLASTX™. Los bancos de cADN de semillas tienen un alto nivel de redundancia. Eso es, un pequeño número de mARN de semillas que tienen un nivel inusual de expresión, tal como aquellas que codifican las proteínas de almacenamiento en las semillas, y por lo tanto su cADN es muy abundante en los bancos de cADN en las semillas (White et al, 2000, Plant Physiology, Vol. 124, · 1582-1594) . Por lo tanto, tan pronto como los principales cADN redundantes fueron identificados en la primera ronda de determinar la secuencia del cADN de las semillas del café, una etapa previa a la selección fue adicionada- para los insertos blancos que contenían colonias previas a la determinación del tamaño del inserto. Cuatro secuencias fueron muy altamente expresadas y los siguientes grupos de detonadores específicos fueron hechos para cada una de estas secuencias redundantes, 1) Proteína 2S, contig 8A 5' AGCAACTGCAGCAAGGTGGAG 3r y contig 8B 5' CGATTTGGCACTGCTGGTTC 3' (55°C utilizados en PCR, fragmento de 114 bp) , 2) Proteína 2S, contig 15A 5' GCCCGTGCTCCTGAACCA 3' y contig 15B 5' GTATGGTTGCGGTGGCTGAA 3' (usando 55°C en la PCR, fragmento de 255 bp) , 3) Oleosina 15.5 contig 30A 5' ACCCCGCTTTTCGTTAT 3' y contig 30B TCTGGCTACATCTTGAGTTCT 3' (usando 55°C en PCR, fragmento de 261 bp) , y 4) Proteína US contig 37A' 5' GTTTCCAGACCGCCATCAG 3' y contig 37B-5' ATATCCATCCTCTTCCAACACC 3' (usando 59°C en la PCR, fragmento de 261 bp) . Las reacciones PCR para este paso de pre-selección se corrieron de la siguiente manera: 10 a 30 µ? de colonias blancas en agua estéril, 5 µ? de 10X Taq buffer (Stratagene) , 1 µ? de dNTP de 10. mM, 2.5 µ? de cada detonador a 20 µ?, 1 µ? de DMSO, 0.5 µ? de polimerasa Taq (Stratagene 10 unidades/microlitro) y H20 estéril fueron añadidos para producir una reacción final de un volumen total de 50 µ? . El programa PCR fue de 1 minuto a 94 °C, 1.5 minutos a una temperatura especifica para cada pareja del detonador, 2.5 minutos a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Secuenciación de los Insertos de cADN de tamaño completo y Análisis de Secuencias Los clones de cADN cuyas sécuencias parciales mostraron una similitud inicial a las proteinasas y a los inhibidores de proteinasas, sus .secuencias fueron determinadas completamente en ambas hileras usando la estrategia de Caminar del dideoxidetonador estándar. Las secuencias se muestran como SEC. DE IDENT. Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. Las secuencias totales obtenidas fueron bombardeadas en contra de una base de datos no redundante del Banco Genético usando un BLASTX para reforzar la anotación preliminar. Las identidades de secuencia de los pares de secuencias fueron calculadas usando el programa ClustalW™ contenido en el módulo MegAlign™ del paquete de softv/are Lasergene™ (ADNSTAR Inc.). Los parámetros de perdida fueron escogidos de la siguiente manera: ( 1-PARÁMETROS DE ALINEACIÓN MÚLTIPLE- Una sanción de Vacio 15.00, longitud de sanción del vacio 6.66, Atraso en las secuencias divergentes (%) 30, Peso de transición de ADN 0.5, Series de Peso de Matriz-Gonnet de las Proteínas, Peso de la Matriz IUB de ADN. 2- PARÁMETROS DE ALINEACIÓN DE LAS PAREJAS- Lento/Exacto (Penalidad de Vacío 15.00, Penalidad de longitud de vacío 6.66), peso de Matriz-Gonnet de las proteínas 250, Peso de matriz IÜB de ADN y las secuencias usadas fueron ya sea la secuencia completa de nucleótidos de cada cADN o la completa ORF (Rango abierto de lectura) de cada cADN. Tabla 2: Los valores de identidad entre ácidos nucleicos y las secuencias de aminoácidos de CcCP-1, CcCPI-1, CcAP-1 y CcAP-2 y los genes relacionados encontrados en una base de datos no redundante de proteínas del Banco Genético y aquellas de la WO 02/04617.

Secuencias de cADN Identidad de Identidad de Nucleótidos (%) Proteínas (ORF) (%) CcAPl vrs TcAPl 2.9 13.3 CcAPl vrs TCAP2 2.4 9.8 CcAP2 vrs TcAPl 55.0 61.5 CcAP2 vrs TcAP2 55.1 61.3 CcCP-1 vs Arabidopsis thaliana 51.8 64.3 · proteinaza de cisteína putativa (AY070063) CcCP-1 vs Endopeptidaza de 49.1 61.3 Glicina max Cisteina (Z32795) CcCP-1 vs Vicia sativa precursor 49.0 60.9 de Proteinaza de cisterna CcAP2 vs Lycopersicon esculentum 65.9 71.1 Precursor de la Proteinaza Aspártica (L46681) CcAP2 vs Ipomoea batatas 71.7 69.6 Proteinaza putativa aspártica del mARN (AF259982) CcAP2 vs Nepenthes alata NaAP4 58.4 66.5 mARN para la 4 proteinaza aspártica (AB045894) CcCPI-1 vs Malus x domestica 38.8 45.5 Cistatina (AY176584) PCR de RACE 5' Se encontró que el inserto de cADN del clon A5-812 contenia intrones,. Por lo tanto, para confirmar la secuencia de esta proteina, fue necesario aislar un nuevo cADN que tuviera la secuencia ' codificadora completa. Esto se logró usando el estuche de amplificación de RACE de cADN SMART™ (Clontech) . La primera cadena de cADN usado para el RACE 5' se llevó a acabo. como se ha descrito ya para las Bibliotecas genéticas de cADN.

Un detonador . especifico genético rAP2 (5' CATATAATATTAAAAGCACCACCCATAA 3') fue designado - esta secuencia esta situada a 92 pb del clon A5-812 con poli-terminación (A) . Este detonador específico fue luego usado con la Mezcla Detonadora Prima (UPM) del estuche CLONTECH en una reacción PCR bajo las siguientes condiciones: 2.5 µ? de la primera cadena de producto de cADN, 5 µ? de Buffer PCR Advantage 2 10X (CLONTECH) , 1 µ? de mezcla dNTP (10 m ) , 1 µ? de Mezcla de Polimerasa Advantage 2 50X (CLONTECH), 5 µ? de "Mezcla Prima A Universal" (10X) (CLONTECH), 1 µ? de rAP2 (10 µ?) y se añadió agua estéril para llegar a un volumen total de 50 µ?. Las condiciones cíclicas de la PCR fueron de 20 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 68 °C y 3 minutos a 72°C, seguido de una reacción final de extensión de 5 minutos a 72 °C. Se obtuvo un fragmento de alrededor de 1700 pb, extirpado del gel usando el "estuche de Extracción Rápida en Gel CONCERT™" (GibcoBRL) . El fragmento aislado fue clonado en un vector 4-TOPO PCR y transformado a Escherichiá coli usando el Estuche de Clonación Topo-TA (Invitrogen) . El plásmido obtenido fue luego purificado usando un estuche de extracción de Plásmidos (Estuche QIAfilter Plasmid Midi, Qiagen, Francia) y el inserto de este plásmido era secuenciado con doble hebra. Se encontró que el ADN del clon A5-442 (API) no tenía la región 5' del cADN. Para aislar- -esta región se hizo un RACE 5' usando el estuche de RACE de Amplificación de cADN SMART™ (Clontech) . Se designó un detonador específico de secuencia rAPl (5' -TGGAGTCACAAGATGTCTCGACGAACTG 3') situado a 396 pb de la terminación poli (A) . Este detonador especifico se usó luego con la Mezcla Detonante Universal (ÜPM) del estuche de CLONTECH en una reacción PCR bajo las siguientes condiciones: 2.5 µ? de la primera hilera de cADN, 5 µ? de Buffer PCR Advantage 2 10X (CLONTECH) , 1 µ? de Mezcla de dNTP de (10 mM) , 1 µ? de Mezcla de Polimerasa Advantage 2 50X (CLONTECH) , 5 µ? de "Mezcla de Detonador A Universal" (10X) (CLONTECH), 1 µ? de rAPl, y agua estéril para completar un volumen total de 50 µ? . Las condiciones ciclicas de la PCR fueron 20 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 68°C y 3 minutos a 72°C, seguidos de una reacción final de extensión por 5 minutos a 12°C Se obtuvo un fragmento de alrededor de 2,000 bp, extirpado del gel utilizando el "Estuche de Extracción Rápida en- Gel CONCERT™" (GibcoBRL) . El fragmento aislado fue clonado en el vector PCR 4-TOPO y fue transformado en Escherichia coli usando el Estuche de Clonación ???-?? (Invitrogen) . El plásmido obtenido luego fue purificado usando el Estuche de Extracción de Plásmidos (Estuche QIAfilter Plasmid Midi, Qiagen, Francia) y el inserto de este plásmido era secuenciado con doble hebra. . Preparación de ARN para Bibliotecas EST: El ARN fue aislado de tejidos cortados de granos y del pericarpio en varias etapas de desarrollo, y de hojas jóvenes usando el método descrito anteriormente. Las variedades y los tejidos usados para preparar el ARN para generar las diferentes Bibliotecas Est fueron como sigue: (1) Hojas Jóvenes, una variedad) FRT-32) ; (2) pericarpio (8 diferentes etapas de desarrollo) de 5 variedades (FRT 32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001, y Q121) ; (3) El Fruto completo, 22 semanas antes de la fertilización (WAF) de una variedad (FRT-31); (4) grano, 18 + 22 AF de cinco variedades (FRT 32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001, y Q121) ; (5) grano, 30 WAF de .5 variedades (FRT 32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001 y Q121) ; (6) Grano, 42 WAF de cinco variedades (FRT 32, FRT-31, FRT-400, FRT-4001, y Q121) y (7) grano, 46 WAF de 2 variedades (FRT-32 y Q 121) . Producción de clones de cADN, y análisis de secuencia de ADN. Los Clones de cADN de las diversas Bibliotecas Est fueron preparados .de la siguiente manera: mARN Poli A+ fue aislado usando el Sistema de Aislamiento de mARN PolyATrack™ (System IV, Promega) de acuerdo con las instrucciones dadas por el fabricante para un aislamiento a pequeña escala. El mARN Poli A+ fue luego utilizado para preparar cADN para una clonación unidireccional dentro de la fago lambda como se describe en el Estuche de Construcción de Bibliotecas ZAP-cADN™ (cat #200450 Stratagene) . El protocolo de extirpación de la masa fue para extirpar el fagémido pBlueScript del vector Uni-ZAP XR y se obtuvieron colonias blancas después de haberse colocado en placas de 150mm de agar LB-ampicilina con 80 µ? x-gal (20 -mg/ml) y 16 µ? de IPTG (1.5M). Colonias Unitarias fueron escogidas al azar para producir ADN plásmido en el cual fue utilizado para secuenciar las terminales 5' de los insertos de cADN. Las secuencias obtenidas de ADN producidas de una secuencia Est (Extremo · de Secuencia Expresada) para cada clon. Toda la información de la secuencia Est de las 7 Bibliotecas fue luego agrupada "In-silico" , produciendo un singular grupo de secuencias llamadas el Set de secuencias "unigen". Por lo que, cada secuencia de un "unigen" teóricamente corresponde a un producto genético distinto. Sin embargo, debe notarse que, debido a que muchos unigene solamente representan las secuencias parciales de cADN, es muy probable que algunos genes puedan estar representados por dos o más unigene. Luego una preliminar anotación del set de unigene se llevó a cabo con una Investigación automática BLAST en donde cada secuencia de ungen fue. buscada en contra de la base' de datos no redundante de proteina del Banco genético. Esta propuesta de búsqueda BLAST produjo los cinco mejores "éxitos" BLAST ("éxitos" con los valores-e más bajos) a los cuales se refieren como la "Anotación unigen".

Análisis Northern-Blot Las raices frescas recolectadas, las hojas jóvenes, el tallo, las flores y los frutos en diferentes etapas de desarrollo (fruta verde pequeña (SG) , fruta verde grande (LG) . fruta Amarilla (Y) y la fruta roja (R) ) fueron recolectadas de la variación de Coffea arabica CCCA2 crecida bajo condiciones de invernadero (25°C, 70 HR) en Tours, Francia, y de la variación Coffea canephora FRT32 crecida en Ecuador o en ICCRI, Indonesia. Los tejidos frescos fueron congelados inmediatamente en nitrógeno liquido y el ARN total fue aislado de cada tejido utilizando el procedimiento de extracción anteriormente descrito. Un total de 5 µg de ARN se corrieron en un gel de desnaturalización del ARN al 1.2% (p/v) que contenia formaldehido. Las muestras totales de ARN de cada tejido de la planta fueron calentados a 65 °C durante 15 minutos en la presencia de 7 µ? de un "Buffer de Carga de Muestras de ARN" (sin bromuro de etidio, Sigma) , luego se colocaron inmediatamente en hielo durante 2 minutos antes de ser cargadas en un gel de ARN al 1.2%. Los geles se corrieron a 60 Voltios durante 5 horas. Luego el gel fue sumergido dos veces en lOx de SSC durante 20 minutos.. El ARN en el gel "fue transferido durante la noche mediante la transferencia capilar a una "'Membrana Positiva TM" (Qbiogene) en lOx SSC y el ARN se arregló mediante un calentamiento de tinción durante 30 minutos a 80°C. Se generaron caladores el Estuche del "Sistema Rediprime™ II de etiquetado al azar" (Amersham) en la presencia de dCTP (P32) . La Hibridización ' se llevó a cabo a 65 °C durante 24 horas en una solución de hibridización (5X SSC, 40 µg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón, 5% [p/v] de SDS, y 5x de solución de Denhardt) . Luego, la membrana fue lavada dos veces a 65°C usando 2X SSC, 0.1% de SDS [p/vj y IX SSC, 0.1% de SDS [p/v] durante 30 minutos cada una. El Análisis Northern blot mostrado en la Figura 1 demuestra que el geri de la proteinasa de Cisteina del Café CcCP-1 se expresa den los frutos de C. Arábica en todas las etapas analizadas, con frutos amarillos exhibiendo apenas altos niveles de expresión que en otras etapas, no se detecto expresión alguna de este gen en la raíz, tallo, u hojas de C. Arábica. La Figura 2 muestra otro experimento de exposición de Northern blot que examina la expresión de CcCP-1 en C. Arábica usando una nueva preparación de ARN. Para este experimento, los frutos de las cuatro etapas fueron cortadas en pedazos para analizarlas minuciosamente para generar tejido del pericarpio y tejido del grano para capa etapa del desarrollo del fruto. Entonces se extrajo el ARN total de estos tejidos. Los resultados obtenidos muestran el mismo patrón temporal de expresión para CcCP-1 durante el desarrollo del fruto, pero este nuevo experimento adicionalmente muestra que el CcCP-1 es primeramente expresado en altos niveles solo en el tejido del grano de los frutos. No se observa una expresión significativa del gen CcCP-1 en el pericarpio del fruto del café. Este último resultado apoya el papel de este producto genético en la alteración exclusiva del perfil proteico, peptidico y aminoácidico del grano de café bajo condiciones normales de crecimiento.

Se han generado Bibliotecas EST de hojas de café, asi mismo de tejidos de la semilla y del pericarpio que han sido cortados de diferentes etapas del desarrollo de los frutos del café. La detección de los EST de CcCP-1 en las diferentes Bibliotecas (mostrado abajo - véase Tabla 3) también demuestra que este gen está expresado en mayor cantidad en el grano, pero no se expresa de manera significativa en el pericarpio ni en las hojas. El patrón de expresión del . CcCP-1 durante el desarrollo de la semilla es similar a aquel visto para su secuencia homologa propuesta de Vicia sativa, (gen CPR4 : Fischer, J. et al 200. Plant Molecular Biology, 43, 83-101). Estos autores mostraron que CPR4 no se detecta por el Análisis Northern blotting en las hojas, raices, o tallos reforzando asi el argumento que la CcCP-1 es especifica del grano. Alterar la expresión de CcCP-1 específicamente - en el grano como aquí se sugiere, tal como usando un promotor específico del grano para la construcción en antisentido de CcCP-1 o una constricción de sobre expresión de CcCP-1, no se esperaría que interfiriese con el metabolismo en otros tejidos. TABLA 3 Nombre Número de EST del Gen Semilla Fruto Semilla Semilla Semilla 46 Pericarpio Hoj a 18 Entero 30 42 Semanas Semanas 22 Semanas Semanas - Semanas CcCP-1 0 0 4 0 15 0 0 La alineación opcional para CcCP-1 (Figura 2?) muestra que este cADN codifica una proteinasa de cisteina. El Análisis Northern blot mostrado en la Figura 3 demuestra que el gen nhibidor de la proteinasa de cisteina CcCPI-1 se expresa en el fruto de C. Arábica en todos los estados analizados. Sin embargo, en contraste con la expresión observada para la proteinasa de cisteina CcCP-1, CcCPI-1 exhibe una mayor expresión en las dos etapas, prematuras del desarrollo del fruto del café (Pequeño verde y grande verde) , y este gen está expresado a niveles más bajos en las dos últimas etapas del desarrollo del fruto. El patrón de expresión es consistente con la presente hipótesis de que la proteína inhibidora de la proteinasa de la cisteína (CcCPI-1) controla el nivel de actividad de la proteinasa de cisteína que se expresa específicamente en las semillas, como la CcCP-1, en el fruto del café. Puede · esperarse que una proteína controladora como la Proteína inhibidora de la proteinasa de la cisteína, se exprese con anterioridad que su proteína objetivo si es necesario controlar el nivel de actividad de su proteína objetivo continuamente desde el momento en que la proteína objetivo se vea expresada. No se detectó expresión alguna para este gen en la raíz, tallo u hojas de C. Arábica. Se notó que la similaridad de los patrones de expresión para CcCP-1 y CcCPI-1 son consistentes con la presente hipótesis que estas proteínas interactúan funcionalmente .

Los resultados del Análisis Northern blotting (Figura 3) indicaron que el CcCPI-1 sé expresa' en todas las etapas en el fruto del café. Sin embargo, este experimento no determinó si la expresión se dio en todo el fruto, o solamente en el pericarpio o solo en el grano. Tampoco se examinó su expresión en las hojas. Sin embargo, la expresión de CcCPI-1 en las diferentes Bibliotecas (mostradas en la Tabla 4 de abajo) demuestra, que este gen se expresa fuertemente y específicamente solo en el grano, no se detectó expresión alguna en el pericarpio ni en las hojas. Este resultado sugiere posteriormente que la CcCPI-1 controla el nivel de actividad de una proteinasa de cisteína que se expresa específicamente en las semillas como la CcCPI-1. TABLA 4 Análisis Northern blot mostrado en la Figura demuestra que el gen inhibidor de la proteinasa de cisteína del café CcCPI-1 se expresa de manera diferente en los frutos de C. Canephora (robusta) versus los frutos de C. Arábica.. Primero, los datos de la Figura 4 muestran que el gen CcCPI-1 apenas se expresa tempranamente en C. Arábica. Segundo, y más importante, que el gen CcCPI-1 se expresa a niveles significativamente altos en los frutos de C. Canephora. Esta diferencia de expresión probablemente afecte el nivel de la actividad de la proteinasa de cisterna encontrada en los frutos de C. Arábica versus C. Canephora . Debido a' que esta clase de proteina es reconocidamente asociada con la resistencia frente a los insectos por parte de las plantas, también es posible que la alta expresión del gen CcCPI-1 en C. Canephora contribuya a la alta resistencia a enfermarse a menudo vista en las variedades robusta versus las variedades arábica.

Análisis RT-PCR de la Expresión de CcCP-1 Durante la Germinación del Grano Para determinar la expresión de CcCP-1 durante la germinación del grano de café, se recolectaron frutas de café en su etapa madura, se lavaron con agua, y luego se les quitó el pericarpio (cada fruto normalmente contiene dos granos) . El' grano obtenido estuvo secándose durante una semana al aire libre a temperatura ambiente. Antes de la germinación, el parche y la capa plateada (testa) de cada grano fueron manualmente removidas y los granos fueron luego esterilizados colocándolos en una solución de hipoclorito de sodio al 1% (p/v) , y luego se lavaron dos veces con agua destilada esterilizada. Para la Germinación, 150 los granos esterilizados fueron colocados individualmente en tubos de ensayo que contenían 10 mi de un medio de crecimiento sólido Heller H15, conteniendo sales de Heller (Heller, 1953) y 7 g/1 agar y luego fueron encubados a 25 °C, con 8 horas de luz por día. Se tomaron tres grupos de diez granos después de 2 días, 3 días, 5 días, 1 mes y 2 meses de germinación, y fueron inmediatamente congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80 °C hasta la extracción del ARN. Para las muestras de 1 y 2 meses, las radículas asociadas con estas muestras se extirparon en el momento del muestreo y se congelaron separadamente del grano. Treinta granos esterilizados se tomaron a T=0 y se congelaron para su uso como control T(0). Se usaron 4 µg de ARN total tratados con DNasa extraídos de cada muestra para sintetizar cADN usando oligonucleótidos hexámeros de acuerdo al protocolo de la Transcriptasa Reversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Un fragmento del gen de la proteína ribosomal L39 del café fue amplificado para cada muestra de cADN como un control para la etapa de síntesis de cADN. Las reacciones PCR se llevaron acabo usando reacciones de 50 µ? que contenían 10 µ? de una dilución de 1/100 de cADN, 1 µ? de cada detonador, 5 µ? de Buffer PCR ThermoPol 10X (10 mM (NH4)2S04, 2mM MgS04, 20 mM Tris-HCl, pH 8.8 a 25°C, 10 mM KC1, y 0.1% Tritón X-100) y 2.5 unidades de polimeraza Taq (New England Biolabs, Beverly, MA) . Xas condiciones cíclicas fueron 2 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 60°C por 1.5 minutos, y' 72°C durante 2.5 minutos. La extensión del paso final fue por 7 minutos a 72 °C. Los siguientes detonadores fueron usados para la amplificación mediante ' PCR: CcCP-1 alto 5' ACCGAGGAGGAGTTTGAGGCTACG 3' y CcCP-1 bajo: 5' ACGCTTCCCCCATGAGTTCTTGA 3', rindiendo productos de cADN de 726 bp. Los detonadores para la proteina RPL39 fueron : A5-1750-superior 5' TGGCGAAGAAGCAGAGGCAGA 3' A5-1750-inferior5' 5' TTGAGGGGGAGGGTAAAAAG 3' Se usó RT-PCR para determinar la expresión de CcCP-1 durante las diferentes etapas de germinación. Los resultados obtenidos demostraron que los transcriptos de CcCP-1 se detectan en el grano completo a todos los tiempos de germinación analizados (Figura 5) . Se ha demostrado previamente por Fischer, J. et al 2000 (Plant Molecular Biology, 43, 83-101) que el ARN de la propuesta CcCP-1 homologa del CPR4 de la V. Sativa también se expresa en el axis del embrión y en los cotiledones de las semillas de V. Sativa durante la .germinación.

Análisis Western Blot Los tejidos de la hoja y frutos analizados de Coffea arábica CCCA2, y antes de usarse, los tejidos fueron almacenados congelados a -80 °C. Los tejidos del grano y del pericarpio fueron cortados separadamente con lo menos posible de descongelamiento del pericarpio. Estos diferentes tejidos fueron rápidamente molidos a un polvo fino, lo mejor posible usando nitrógeno liquido con un mortero y pistilo previamente congelados. Se preparó un extracto de proteina de este tejido usando una versión modificada del procedimiento de extracción descrito por Tanaka et al.r 198.6 (Fisiología de las Plantas, 81, 802-806) . Los Buffer usados fueron: Buffer Tanaka: • . Sacarosa 0.7M • Tris-HCl pH 8 0.5M • ß-mercapto-etanol 2% (v/v) • NaCl 0.1 M Y justo antes de utilizar este Buffer adicionado: • EDTA 5 mM • PMSF 2 mM Buffer de Carga en el Gel: • Glicerol ' 15% (v/v) • ß-mercapto-etanol 2% (v/v) • SDS 3% (v/v) • Tris-HCl pH 6.8 62.5mM Unos pocos cientos de miligramos de los polvos molidos congelados fueron añadidos a 650 µ? del Buffer Tanaka. Las proteínas fueron extraídas con la adición de un volumen de fenol Tri-saturado pH8 (por ejemplo, saturado con 10 mM de Tri-HC1 pH8) . Cada muestra fue agitada vigorosamente , durante 20 minutos y luego centrifugada por 20 minutos a temperatura ambiente a 13,000 " g. Después de la centrifugación, las proteínas están en una fase fenólica. 20 ul de muestras fueron retenidas para análisis (ver abajo y las proteínas remanentes en la fase fenólica se precipitaron en la noche a -20°C seguido de una adición de cinco volúmenes de metanol conteniendo acetato de amonio 0.1 M. Subsecuentemente, las muestras fueron centrifugadas por 20 minutos a temperatura ambiente a 13,000 g, y las pildoras resultantes fueron lavadas dos veces en 500 µ? de metanol conteniendo acetato de amonio 0.1 M. Las pildoras obtenidas fueron resuspendidas en 30 µ? de buffer de carga en gel hasta la cuantificación de. las proteínas.- Las proteínas de 20 µ? de .muestras de la fase fenólica fueron también precipitadas de la misma manera que arriba, y la pildora final fue resuspendida en el Buffer muestra del estuche de Análisis de Proteínas BioRad Dc. La cuantificación de las proteínas totales en esta muestra se llevó a cabo usando el estuche de análisis de Proteínas BioRad Dc como lo describe el suplidor. Subsecuentemente, todas las muestras principales fueron ajustadas para dar 5 µg/µl mediante la adición de un buffer de carga e.n gel . Las muestras que contenían aproximadamente 50 µg de proteína de cada muestra fueron separadas mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida (12% tris-glicina, (Novex® Invitrogen ) ) . Las proteínas luego fueron transferidas a una membrana PVDF mediante un electrobombardeo usando protocolos estándar. Se bloquearon sitios no específicos de unión mediante la encubación de la membrana en un buffer de leche seca sin grasa al 10% (BioRad™) , por una hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Las proteínas se someten a tinción fueron probadas por dos horas a temperatura ambiente o durante la. noche a 4°C con un anticuerpo policlonal (una dilución de l/5000e en TBS 10% de leche seca sin grasa) , levantado en contra del homólogo previsto de CPR-4 de Vicia sativa, que fue donado por A. Schlereth y K. Muntz, del Instituto para Genética de Plantas y Cultivo de Plantas para el Futuro (IPK) , Alemania (A. Schlereth, C. Becker,, C. Horstmann, J. Tiedmann y K. Müntz 2000, Revista de Botánica Experimental, 51: 1423-1433). La membrana fue luego lavada 3 veces durante 20 minutos en un buffer de TBS + Tween 20 al 0.1%. La membrana subsecuentemente encubada durante una hora con un anticuerpo secundario etiquetado con peroxidasa de rábano (Ig de Cabra anti-conejo, Inmmunopure®, Pierce™) . La membrana fue luego lavada 2 veces durante 20 minutos en el buffer de TBS + Tween 20 al 0.1%, luego una vez más por 20 minutos en TBS. La presencia de la enzima emparejada con el segundo anticuerpo fue visualizada mediante la detección por quimiluminiscencia usando el sistema Mejorado ECL+® (Amersham Life Science) como lo describe el suplidor.

Los resultados obtenidos mostraron que un polipéptido de aproximadamente 41kDa, el cual corresponde muy cercanamente con el peso molecular predicho de un polipéptido precursor de CcCP-1 (43 735 Da), es detectado en todas las etapas analizadas de maduración del grano, pero no es detectado en el tejido del pericarpio (Figura 6) . Este patrón de expresión proteico es similar a aquel visto para el mARN del CcCP-1 (Figura 2). También fue detectado otro polipéptido de aproximadamente 22 kDa en el grano en la etapa amarilla y en la etapa roja, pero en menores cantidades que el polipéptido de 41 kDa. El tamaño de este segundo polipéptido es consistente con el tamaño que se esperaba de la forma madura del CcCP-1 25, 239 Da) . El tamaño que se esperaba del CcCP-1 maduro después de haber sido procesado fue determinado mediante una alineación proteica entre una secuencia completa ORF de CcCPl y la secuencia de la forma pronosticada madura de CPR4 (Vicia sativa-número de acceso Z99172, 60.9% de identidad con CcCP-1). El sitio N-terminal del polipéptido CPR4 procesado para generar la forma madura fue pronosticado mediante la comparación de secuencia con otros polipéptidos de CPR similares a la papaina (J. Fisher, C. Becker, S. Hillmer, C. Horstmann, B. Neubohn, A. Schlereth, V. Seynuk, A. Shutov y K. Müntz. 2000 Biología Molecular de Plantas 43: 83-101). De manera interesante, en contraste con los resultados aquí presentados, tanto el precursor como la forma madura de CcCP-1 son detectadas durante el desarrollo del grano, solamente la forma madura del polipéptido fue detectado en las . semillas en desarrollo y también durante la germinación las semillas de V. Sativa (Fisher y al, 2000) Análisis RT-PCR de la Expresión del Gen para la Variedad robusta FRT-32 Se prepararon diferentes tejidos de FRT-32 y se extrajeron un total de ARN de estos tejidos mediante el método descrito anteriormente. Se preparó el cADN del ARN total tratado con DNasa como se describió anteriormente para los experimentos RT-PCR con el cADN de la variedad arábica. Luego, se hicieron reacciones PCR especificas usando las condiciones de reacción descritas anteriormente para los experimentos RT-PCR con el cADN - de la variedad arábica. Las condiciones especificas de amplificación y los detonadores oligonucleótidos usados dados en la leyenda de la Figura para cada experimento.

CcCPI-1 - a) Alineación óptima para CcCPI-1 (Figura 6A) mostrando , que este cADN codifica un inhibidor de proteinasa de cisterna . b) Los datos de la expresión RT-PCR para CcCPI-1 (Figura 7) en las variedades arábica y robusta. Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo como previamente se ha ¦ descrito y las condiciones cíclicas y los detonadores PCR usados están dados en la leyenda de la Figura. Esta información complementa y extiende la información presentada antes para la expresión de la variedad arábica, en eso se muestra que el CcCPI-1 es el único expresado en el grano y no en el pericarpio. Una débil expresión de este gen también fue detectada en las flores, como un resultado de un Análisis Northern blot previamente no visto. La expresión RT-PCR en la variedad robusta también fue determinada (Figura 7). Es. el mismo patrón de expresión que el visto para la variedad arábica con la excepción que no se detectó expresión alguna en las flores ni en el grano verde pequeño. La ausencia de expresión observada en la etapa pequeña verde de la variedad robusta también se observa para otros genes y por lo que esto no es único para el gen CcCPI-1.

TABLA 5: Ocurrencia de EST para cada gen Inhibidor de Proteinasa de Cisterna en CPI-2, CPI-3 Y CPI-4 en diferentes Bibliotecas Est.

Inhibidor de Proteinaza Número de EST de Cisteina Semilla Frutos Semilla Semilla Semilla Pericarpio Ho a 18 Enteros 30 42 46 Semanas 22 Semanas Semanas Semanas Semanas CcCPI-2 0 2 12 0 1 1 0 CcCPI-3 0 0 1 0 2 0 0 CcCPI-4 0 0 1 0 0 0 6 CcCPI-2 -a) Alineación óptima para CcCPI-2 (Figura 8) mostrando que este cADN codifica un inhibidor de proteinasa de cisteina. b) Los datos de la expresión RT-PCR para CcCPI-2 (Figura 9) para las variedades arábica y robusta. Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo como previamente se ha descrito y los detonadores PCR usados están dados en la leyenda de la Figura. Los datos muestran que el CcCP-2 está expresado en todos los tejidos y por lo que el producto proteico de este gen probablemente juega un papel importante en el control de una o más proteinasas de cisteina presentes en estos tejidos. Los números de cada Biblioteca Est vistos en la Tabla 5 arriba sugieren que " el CPI-2 puede ser expresado más en el grano (semilla) a las 30 semanas después de la fertilización que en las hojas, pericarpio, o semillas con 46 semanas después de la fertilización.

CcCPI-3 a) Alineación óptima para CcCPI-3 (Figura 10) mostrando que este cADN codifica un inhibidor de proteinasa de cisteina. b) No se tiene disponible ningún dato de expresión RT-PCR para este inhibidor de proteinasa de cisteina. Sin embargo, en la expresión "en-Silica" de este gen, como se determinó mediante el número de Est que aparece en cada Biblioteca (Tabla 5 arriba) , indica que el CcCPI-3 se expresa en el grano de café (presente en las Bibliotecas de semillas "Semilla de 30S" y "Semilla de 46S". por ejemplo 30 y 46 semanas) . La ausencia de Est para' este gen en el pericarpio, hoja y fruto completo sugiere que puede ser un gen especifico del grano.

CcCPI-4 a) Alineación óptima para CcCPI-4 (Figura 11) mostrando que este cADN codifica un inhibidor de proteinasa de cisterna. b) Los datos de expresión RT-PCR para CcCPI-4 (Figura 12) en las variedades arábica y robusta . Las reacciones PCR se llevaron a cabo como previamente se ha descrito y los detonadores PCR usados están dados en la leyenda de la Figura. Los datos obtenidos muestran que este gen, expresado significativamente en la variedad arábica, en las hojas y en el grano en la etapa roja. Debido a una examinación más exhaustiva del gel original (Panel A: arábica) indica que también hay bandas débiles detectadas en el grano verde pequeño y en las hileras del pericarpio verde grande, este gen también puede expresarse levemente, en la variedad arábica, en el grano y el pericarpio en todas las etapas estudiadas de desarrollo del fruto. Los datos obtenidos para la variedad robusta muestran que este gen se expresa significativamente en la hoja, flores, grano verde pequeño y grano verde grande. Solamente se encontró un Est para CcCPI-4 en las Bibliotecas de la semilla o el pericarpio (Tabla 5 arriba) , indicando que la expresión de este gen en el grano y/o en el pericarpio es relativamente baja o está confinada a regiones pequeñas definidas de ambos tejidos. En cada caso para los - genes Inhibidores de Proteinasas de Cisteina (CPI) , la sobre-expresión o la inhibición de la expresión de estos genes durante el desarrollo de los granos (esto es, bajo el control de un fuerte promotor especifico del grano como el promotor de café 11S) se espera que altere los perfiles proteicos, peptidicos y aminoacidicos en el grano maduro (y asi mismo el nivel de los precursores de sabor) .

Análisis de Germinación y RT-PCR Granos esterilizados, secos de C. Arábica CCCA2 (removidos del parche y la cubierta plateada) fueron colocados individualmente en tubos de ensayo conteniendo el- medio de crecimiento sólido Heller H15 y 7 g/1 agar y fueron encubados a 25°C, con 8 horas de luz al dia. Después de 2 días, 3 días, 5 días, 1 mes y 2 meses de germinación, se tomaron tres granos, y cuando estuviese presente, las radículas fueron removidas y tanto los granos como las radículas fueron inmediatamente congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80°C hasta la extracción del ARN. Sirailármente, granos secos, esterilizados no germinados (TO) fueron usados como control. Se extrajo el ARN de las muestras de granos como anteriormente se ha descrito. EL ARN total tratado con DNasa de cada muestra fue usado para sintetizar usando oligo (dT)2o como detonador de acuerdo con el protocolo del estuche de Transcriptasa Reversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Una reacción PCR se llevó a cabo usando alícuotas de cada reacción de cADN. (50 µ? conteniendo 10 µ? de los cAD diluidos en 1/10, 1 µ de cada detonador, 5 µ? de Buffer PCR ThermoPol 10X, dNTP de 200um y 2 unidades de Polimerasa Taq (New England Biolabs, Beverly, MA) . Las · condiciones cíclicas fueron 2 minutos a 94 °C, 40 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 54 °C por 1.5 minutos, y 72 °C 'por 2.5 minutos. El paso final de extensión fue 7 minutos a 72 °C. Los detonadores PCR fueron CP-4KDDL61: 5' - GAAGAACTCATGGGGAACAGGAT - 3' CP-4KDDL345 : 5'- TTATTCAAACCA CAC GGAGCAG - 3' PCR Genómico y secuencia de ADN de los fragmentos PCR Purificados · ¦ . El ADN genómico de cinco variedades de café diferentes (FRT-07, FRT-19, FRT-32, CCCA2, y GPFA57) fue usado en la reacción PCR arriba descrita para la germinación de un estudio de expresión RT-PCR. Los productos PCR del tamaño esperado fueron obtenidos y estos, fragmentos fueron purificados del gel. El ADN amplificado de PCR se sometió luego a una segunda ronda de amplificación PCR y el ADN obtenido de esta reacción en secuencia fue luego secuenciado usando los mismos detonadores usados para la amplificación.

Aislamiento y Caracterización de CcCP-4 de Proteinasa de Cisteina Usando una colección de Est (Etiqueta de Secuencia Expresada) hechas 'de. un ARN aislado de 1) granos de café en diferentes etapas de desarrollo, tejido de pericarpio de café en diferentes etapas de desarrollo, y de hojas, se ha aislado un cADN completo que codifica una proteinasa de cisteina del café que tiene una · secuencia terminal C KDDL. Se le ha llamado CcCP-4 (KDDL) (Figura 14) . La alineación de la proteina codificada por este cADN con otras proteinasas de cisteina de plantas altamente homologas se muestra en la Figura 15. Estos datos de alineación, y las Investigaciones relacionadas Blast, claramente muestran que la proteina codificada por la secuencia del CcCP-4 (KDDL) del, café es un miembro de la KDEL de la planta conteniendo una familia de proteinasas de cisteina (Figura 15) . Las identidades precisas entre CcCP-4 (KDDL) y la mayoría de la base de datos de secuencias de sus homólogos se da en las Tablas 6A y 6B.

Tabla 6 A: Identidad de la secuencia aminoacídica de la proteinasa de cisteina del CcCP-4 (KDDL) de la variedad Coffea canephora con las secuencias de amino de las secuencias más homologas del Banco Genético.

Tabla 6B: Identidad de la secuencia de ácidos nucleicos (cADN) de la proteinasa de cisteina del CcCP-4 (KDDL) de la variedad Coffea canephora con las secuencias nucleicas de las secuencias más homologas del Banco Genético.

Obviamente, la secuencia obtenida de CcCP-4 KDDL del café tiene una diferencia importante de casi todas las secuencias mostradas en la Figura 15 , que. es, que no tiene la esperada secuencia de retención del retículo endoplasmático (RE) (la secuencia terminal C KDEL) pero si tiene una variante de esta secuencia, por ejemplo KDDL. Mediante el análisis de las capacidades de las variaciones en la secuencia terminal C KDEL para la retención directa en el RE de · las células de las plantas, Denecke et al (Denecke, J. Dycke, R. , y Botterman, J. 1992 EMBO J. 11, 2345-2355) han mostrado previamente las variantes de las terminales C como las SDEL, KDDL, KDEI y KDEV que pueden producir una pérdida completa de la función de retención del reticulo endoplasmático . Por lo tanto, la presencia de la secuencia KDDL en la proteinasa de cisterna KDEL homologa de la planta fue algo inesperado. La Tabla 7 muestra que el unigen que contiene el CcCP-4 (KDDL) de CADN tiene 21 Est. Por lo tanto, se ha examinado la secuencia de otro Est en su unigen y se encontró que 7 de Est contenían buenos datos de secuencia para la región KDDL. De estas siete secuencias de cADN, seis tienen la secuencia KDDL y una tiene una secuencia KDEL. Subsiguientemente, se aisló el clon de cADN con una secuencia terminal cKDEL y se obtuvo la secuencia completa para este clon parcial de cADN. Las secuencias de ADN y de proteínas obtenidas se muestran en las Figuras 16 y 17 respectivamente .

Tabla 7. Número de Est en el unigen que contiene el tamaño completo CcCP-4 (KDDL) . de cADN.

Nombre de Unigen Número la de EST Proteinaza de Cisteina Semilla Fruto Semilla Semilla Semilla Pericarpio Hoja 18 Entero 30 42 46 Semanas 22 Semanas Semanas Semanas Semanas CcCP-4 125103 0 0 8 0 13 0 0 El ADN que codifica la secuencia para CcCP-4 (KDEL) mostrada en la Figura 16 solamente es un cADN parcial, que es, que tiene sólo 817 bp largos versus 1336 para el clon completo CcCP-4 (KDDL) de cADN. El CcCP-4 (KDEL) de cADN parcial tiene 8 cambios sencillos de residuos de nucleótidos de la secuencia equivalente encontrada en el clon CcCP-4 (KDDL) de cADN, aunque sólo dos de estos cambios de nucleótidos conllevaron a un cambio en la secuencia de aminoácido de la hilera de lectura abierta (Figura 17) . En la región 3' no traducida, hay tres claros cambios de nucleótidos. En adición, también hay una inserción de 12 nucleótidos en la región 3' no traducida de la secuencia del CcCP-4 (KDEL) de cADN que parece estar con una región microsatelital. Los datos solamente presentaron descubiertos dos diferentes e importantes marcadores moleculares para estos dos alelos del gen CcCP-4 del café, uno es un SNP asociado con el sitio KDEL funcionalmente importante, y el otro es un marcador microsatelital asociado con la región 3' no traducida de este gen. Este último punto es importante en cuanto las secuencias microsatelitales son usualmente consideradas como marcadores genéticos con alta variabilidad y por lo tanto, es muy dado que otros alelos de este gen puedan ser encontrados usando esta región que contiene este microsatélite . Para examinar la distribución de los dos alelos del gen CcCP-4 arriba identificado en las diferentes variedades de arábica y robusta, una pequeña región de la secuencia genómica que bordea el gen CcCP-4 fue amplificada mediante PCR de cinco diferentes genotipos. Los fragmentos de PCR del tamaño esperado (207 pares básicos) fueron obtenidos de cada muestra de ADN genómico y estos productos PCR fueron purificados en gel y luego re-amplificados para generar suficiente ADN para dirigir la secuencia de ADN del producto PCR. Los resultados obtenidos de las reacciones de secuencia se muestran en la Figura 18. Los cromatografías de secuencia para las cinco secuencias muestran que las dos variedades de arábica analizadas claramente tenían secuencias KDEL y las tres variedades de robusta examinadas tenían, secuencias KDDL. Este resultado implica que el alelo KDDL podría estar restringido a las variedades robusta, y que no se encuentra en las variedades arábica. Mientras no se encontró alguna secuencia KDEL en tres variedades de robusta estudiadas aquí, el descubrimiento de una secuencia KDEL en las Bibliotecas Est Cornell indica que este alelo puede existir en por lo menos algunos clones de robusta. Se estudió la expresión del gen CcCP-4 usando el Análisis Northern blot y el análisis de RT-PCR. La Figura 19 muestra el resultado obtenido del experimento de expresión de Northern blot usando ARN extraído de diferentes etapas de desarrollo de grano de café y del pericarpio, así mismo como el ARN aislado de raíces, hojas jóvenes, tallos y flores de una variedad de arábica. Los datos obtenidos usando. una sonda CcCP-4 (KDDL) , que tiene un 98% de aproximación de ser homólogo con la conocida secuencia de ADN del alelo CcCP-4 (KDEL) , mostró que CcCP-4 se expresa únicamente en el grano. No se detecto expresión en el pericarpio ni en las raíces, tallos, flores y hojas. Debido al muy alto nivel de identidad entre los dos alelos, la sonda CcCP-4 (KDDL) se espera que produzca una hibridación en dos transcripciones de ambos alelos. Un experimento similar usando el análisis RT-PCR también demostró el mismo perfil de expresión para el gen CcCP-4. También se estudió en toda la semilla el CcCP-4 durante la germinación usando el análisis RT-PCR. Este experimento uso detonadores que son comunes a ambos alelos de CcCP-4 KDEL y CcCP-4 KDDL. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 20. Las Transcripciones de CcCP-4 fueron detectadas en todos las etapas . de germinación analizadas, aunque el nivel de las transcripciones parecieron bajar un poco a los 3 días y luego volvieron a incrementar a medida ¦ que progresó la germinación. (Con los más altos niveles en las muestras de 1 y de 2 meses) . Ling et al. (Ling, J. .-Q., Kojima, T., Shiraiwa, M., y Takahara, H., 2003, Biochim. Biophys . Acta 1627, 129-139) han aislado dos cADN de los cotiledones de ,1a soja que codifican el KDEL que contiene las proteinasas de cisterna. Estos dos cADN tienen un 93.5% de similitud al nivel de ADN, y fueron expresados en raíces, flores, y durante el desarrollo de la semilla. No se encontró expresión mediante el Análisis Northern blotting en las semillas en desarrollo ni en las semillas maduras, aunque se detectó expresión en vainas maduras. Un cADN que codifica el KDEL que contiene proteinasa- de cisterna también fue aislado de la zanahoria (Sakuta, C, Oda, A., Konishi, M., Yamakawa, S., Kamada, H., y Satoh, S. 2001 Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2243-2248). Los transcriptos de este gen fueron detectados en semillas secas maduras, y en semillas completas germinantes en el dia 2 y día 3 después de su incubación. La expresión de este gen en otros tejidos de zanahoria o durante el desarrollo de las semillas no se presentó. Otra proteina que contiene KDEL, y su correspondiente cAD . ha. sido aislada de V. Sativa (Fischer, J. , Becker, C, Hillmer, S., Horstmann, C.,. Neubohn, B. , Schlereth, A., Senyuk, V. , . Shutov, A., y Muntz, K. (2000) plant Molecular Biol. 43, 83-101.). Usando el Northern blotting, las transcripciones de este gen fueron detectadas en los cotiledones durante la germinación, pero no asi en el axis, del embrión de las semillas germinantes. No se detectaron transcripciones en las semillas madurantes, semillas maduras, o en las hojas y raices. Los resultados aquí presentados muestran que la proteinasa de cisteína tipo KDEL del café exhibe algunas características únicas e inesperadas. Primero, se ha descubierto que los granos de café de la variedad robusta expresa el gen CP tipo KDEL que tiene- una única mutación en la secuencia codificadora para la región KDEL resultando en un cambio de KDEL a KDDL. Basado en los datos de Denecke et al. (1992) , esta alteración en particular en la secuencia de retención se espera . que altere la localización y/o el control de la proteina CcCP-4 (KDDL) de la variedad robusta. La presencia de una copia transcrita del gen CcCP-4 KDDL puede producir un cambio significativo en el perfil peptidico/aminoacidico en el grano de café relativo a variedades con la secuencia CcCP-4 KDEL. También se ha mostrado que la proteinasa de cisteina tipo (KDEL) del café, mientras que muestra la expresión esperada durante la germinación de granos, también se expresa inesperadamente durante todas las etapas estudiadas del desarrollo del grano. Como se observa en lo anterior, hasta ahora, no existen datos claros en la literatura publicada, que demuestra una expresión significante de una proteinasa de cisteina tipo KDEL durante el desarrollo de la siembra en otras plantas, aunque sus transcripciones han sido detectadas en semillas de zanahoria madura (Sakuta et al., 2001) . Las propiedades novedosas de la proteinasa de cisteina tipo KDEL de café presentadas en lo anterior probablemente tiene un efecto importante en los perfiles de péptidos y aminoácidos en el grano maduro de arábica y robusta, y por lo tanto altera este grupo de precursores de sabor de café critico. Considerando que las transcripciones para la proteinasa de cisteina tipo KDEL están presentes en el grano maduro, es también posible gue la proteina tipo KDEL pudiera ser activada durante el proceso húmedo del café y por consiguiente además alterar el perfil del péptido/aminoácido del grano de café de proceso húmedo. El trabajo descrito ha generado marcadores moleculares (SNP's y un marcador de microsatelital) que pueden utilizarse en selección clásica y trabajo de cultivo para obtener variedades de café con alelos específicos del gen de proteinasa de cisteina tipo KDEL (el cual tendrá alteraciones concomitantes en perfiles de proteína/péptido/aminoácido) . Por ejemplo, las variedades de robusta podrían seleccionarse/cultivarse de las que tienen solamente el alelo CcCP-4 KDEL, o tienen solamente bajos niveles de expresión del alelo CcCP-4 KDEL. Además, utilizando técnicas de modificación genética puede ser visualizado para alterar la actividad de proteinasa de cisteina tipo KDEL en café, o en otras plantas, por la sobreexpresión específica de semilla de las proteinasas de cisterna tipo KDEL o KDDL. Alternativamente, los niveles de. proteinasa de cisteina tipo KDEL pueden reducirse utilizando tecnologías antisentido, sentido o RNAi. En ambos casos, el grupo de proteína/péptido/aminoácido en las plantas transformadas resultantes se alterarán, conduciendo a nuevos perfiles de los grupos precursores de sabor de proteína/péptido/aminoácido. El análisis Northern blot mostrado en la Figura 13 demuestra que el gen CcAP-2 de proteinasa aspártica de café se expresa en el grano y el pericarpio de la cereza de café C. arábica en todas las etapas de desarrollo de cereza probadas. El gen CcAP-2 también tiene una expresión relativamente elevada en las raices. Cuando la película se expone durante más tiempo, la expresión CcAP-2 también se detecta en los tejidos de los tallos, hojas y flores de C. arábica.

CcAP-1 y CcAP-2 Las Figuras 21 y 22 muestran que cada uno de CcAP-1 y CcAP-2 codifican una proteinasa aspártica. La sobre-expresión y bajo-expresión de las secuencias de gen de proteinasa CcCP-1 CcCP-4r CcAP-1 y CcAP-2 y los inhibidores de proteinasa CcCPI-1 ,2, 3, y 4 en las semillas de café. Se espera que el perfil de proteína de almacenaje principal y el aminoácido/perfil de péptido puede cambiarse en el grano del café maduro alterando, ya sea hacia arriba o hacia abajo, la expresión de uno o más genes descritos .aquí Los métodos para la sobre-expresión de un gen de interés se conocen en la técnica. Tales métodos consisten en crear un gen quimérico de tres componentes principales 1) una secuencia promotora en el extremo 5' del gen, preferiblemente en la aplicación actual de un promotor específico de semilla tal como el promotor específico de semilla de café descrito en Marraccini et al. 1999 (Marraccini et al. 1999 Molecular cloning of the complete 11S seed storage protein gene of Coffea arábica y promoter analysis in transgenic tobáceo plants, Plant Physiol. Biochem. Vol 37, 273-282, y WO 99/02688), 2) la secuencia de codificación completa del gen a ser expresado, y 3) una región de control 3' tal como la región 3' del gen de nopalina sintasa de la T-DNA o del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . Entonces, el gen quimérico puede clonarse en un vector de transformación Agrobacterium tumefaciens, y este vector puede transformarse en una cepa Agrobacterium tumefaciens para el uso en la transformación de café que ha sido descrita en detalle por Leroy et al 2000, (Leroy et al 2000 Genetically modified coffee plants expressxng the Bacillus thuringíensis crylAc gene for resitance to leaf minor. " Plant Cell Reports' 2000, 19, 382-389) . Las plantas con insertos de transformación estables puede entonces tamizarse por aquellos los cuales sobre-expresan los genes específicos utilizados en el exprimento de transformación específicamente en semillas maduras utilizando métodos tales como la detección de la sobre-expresión de gen o la sobre expresión de actividad de proteína contra las semillas de las plantas transformadas simulado. Por ejemplo, una persona bien experimentada en la técnica puede producir una construcción recombinante compuesta de 1) la secuencia promotora del gen 11S de café extensa descrita en Marraccini et al. (1999), 2) la secuencia ADNc de longitud completa de CcCP-1, o de CcCP-4 (KDDL) sin la cola Poli A, y 3) una secuencia terminadora de transcripción conocida tal como el terminador de nopalina bien estudiado. También es posible que niveles elevados de la sobre-expresión para las construcciones del recombinante de la sustitución de la región sin codificar 5' de las secuencias CcCP4 u otra ADNc con la región sin codificar 5' del gen 11S de café" o las regiones sin codificar de los otros promotores específicos de semilla fuerte de cualquier café u otras especies de plantas relacionadas. Las secuencias de gen recombinante entonces pueden insertarse en un sitio apropiado del vector Agrobacterium T-DNA descrito en Leroy et al. El vector T-DNA de este modo se construye pero no se pone en una cepa Agrobacterium apropiada, tal como la cepa descrita en Leroy et al, y el T-DNA contiene el Agrobacterium que puede utilizarse para transformar el café siguiendo el método detallado en Leroy et al. Se conoce bien en la técnica que la expresión de las secuencias de gen conocidas pueden reducirse o completamente bloquearse por la supresión de antisentido y por la expresión de gen utilizando fragmentos de ácido nucleico que . representan menos de la región de codificación completa de un gen, y por ácidos nucleicos que no .comparten la identidad de la secuencia al 100% co el gen a ser suprimido. En este caso, las secuencias se seleccionan por la supresión de antisentido particular o el experimento de co-supresión que reemplazará el gen de longitud completa en el esquema de construcción de gen quimérico presentado en lo anterior. Las construcciones quiméricas de supresión o co-supresión de antisentido resultantes son nuevamente clonadas en un vector de transformación Agrobacterium tumefaciens y transformadas en la capa Agrobacterium tumefaciens para utilizarse en la transformación de café como se describe en lo anterior. Las plantas con inserto de transformación estable pueden entonces tamizarse por aquellos con expresión reducida de las secuencias de gen específicas utilizadas en las semillas de las plantas transformadas. La expresión reducida puede detectarse por técnicas tales como Norther blotting; RT-PCR semicuantitativa, y/o RT-PCR cuantitativa. Otro método para reducir, o eliminar la expresión de un gen en plantas es. utilizar las porciones pequeñas de las secuencias de gen descritas en la presente para producir RNA mediante la via de silenciar utilizando RNAi (HAnnon, G.J., 2002, Nature, Vol 418, 244-251; Tang et al.,. 2003, Genes Dey, Vol 17, 46-63) . En este método, la regionespequeñas de una o más de las secuencias descritas aquí se clonan en un vector de transformación Agrobacterium tumefaciens como se describe en lo anterior el cual tiene un promotor específico de semilla y una región reguladora 3' apropiada. Esta nueva secuencia insertada para RNAi debe . construirse de modo que el RNA producido forma una estrcutura RNA in vivo que resulta en la producción de RNA de doble hebra pequeña en las células transformadas y por lo que estas secuencias RNA de doble hebra pequeña desencadena la degradación del mRNA homólogo en estas células transformadas. Tamización para variaciones que ocurren naturalmente en los genes CcCP-1, CcCP-4, CcAP-1 , CcAP-2, CcCPI-1 , CcCPI-2, CcCPI-3r CcCPI-4 y crear nuevas mutaciones en estos genes. Las secuencias descritas en la presente pueden utilizarse para tamizar poblaciones naturales para variantes alélicas en estos genes. Esto puede lograrse utilizando las secuencias CcCP-1, CcCP-4, CcAP-1, CcAP-2, CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3, CcCPI-4 como investigaciones en una búsqueda para que ocurra naturalmente RFLP's (polimorfismos de longitud de fragmento de restricción) en DNA genómico de las diferentes variedades de plantas de café, ün método más eficaz para encontrar variantes alélicas es utilizar las tecnología de tamización de mutación · asociada con el método TILL1NG (Till, BJ et al 2003 Large scale discovery of induced point mutations with higt-thruput TILLING. Genome Research Vol 13, 524-530) . En este caso, una vez que una secuencia de gen específica se ha aislado y clonado, tal como las secuencias CcCP-1, CcCP-4, CcAP-1, CcAP-2, CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3 y CcCPI-4 en la presente, la técnica de tamización de mutación asociada con el método TILLING puede utilizarse para identificar las variantes de secuencia' entre la secuencia clonada y el cADN correspondiente o secuencia genómica en diferentes variedades. Utilizando pares de detonadores PCR que se codifican para los segmentos DNA de 700-1000 pares de base, el gen clonado conocido puede tamizarse por variaciones de secuencia que ocurren naturalmente en diferentes variedades. En la- situación ideal, una o más variantes de secuencia también pueden correlacionarse con una variación fenotipica particular por lo que identifica un marcador genético para esta variante genotipica. Adicionalmente, utilizando las secuencias descritas en la presente para CcCP-1, CcCP-4, CcAP-1, CcAP-2, CcCPI-1, CcCPI-2, CcCPI-3 y CcCPI-4, la aplicación del método TILLING completo puede utilizarse para crear y detectar nuevos mutantes en estos genes . y de este modo producir plantas que contiene estos mutantes específicos. Por ejemplo, utilizando el método TILLING completo, las plantas de café pueden crearse las cuales tienen mutaciones especificas tal como una mutación sin sentido en la secuencia de codificación que inactiva el gen objeto de interés .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Polinucleótido . aislado que comprende una secuencia nucleótida codificadora de un polipéptido que tiene una actividad de proteinasa de cisteina, caracterizado porque, la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de SEC. DE IDENT. No. 2 tiene por lo menos 70%, preferiblemente por lo menos 80% de secuencia de identidad basada en el método de alineación ClustalW; o el complemento de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento contiene el mismo número de nucleótidos como la secuencia de nucleótidos, y el complemento y la secuencia de nucleótidos son 100% complementarias.
2. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. No . 2 tienen por lo menos un 85%, preferiblemente por lo menos un 90%, opcionalmente por lo menos un 95%, de identidad de. las secuencias basadas en el método de alineación- ClustalW.
3. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE IDENT . No. 1.
4. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. No. 2.
5. Polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia nucleótida codificadora de un polipéptido que tiene una actividad de proteinasa de cisterna, en donde, la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. Nos. 4, 10, 12, y 14 tienen por lo menos un 70%, preferiblemente por lo menos 80% de secuencia de identidad basada en el método de alineación Clustal ; o el complemento de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento contiene el mismo número de nucleótidos como la secuencia de nucleótidos, y el complemento y la secuencia de nucleótidos son 100% complementarias.
6. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de las SEC. DE IDENT. Nos. 4, 10, 12 y 14 tienen por lo menos un 85%, preferiblemente por lo menos un 90%, opcionalmente por lo menos un 95%, de identidad de las, secuencias basadas en el método de alineación ClustalW.
7. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de nucleótido comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. Nos. 3, 9, 11 y 13.
8. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación ' 5, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de las SEC. DE IDENT. Nos. 4, 10, 12 y 14.
9. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia nucleótida codificadora de un polipéptido que tiene una actividad de endoproteinasa aspártica, en donde, la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. No. 6 u 8 tienen por lo menos un 75%, preferiblemente por lo menos 80% de secuencia de identidad basada en el método de alineación ClustalW; o el complemento de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento contiene el mismo número de, nucleótidos como la secuencia de nucleótidos, y el complemento y la secuencia de nucleótidos son 100% complementarias.
10. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. No. 6 u 8, preferiblemente la SEC. DE IDENT. No. 8, tienen por lo menos un 85%, preferiblemente por lo menos un 90%, opcionalmente por lo menos un 95%, de identidad de las secuencias basadas en el método de alineación ClustalW.
11. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE IDENT. No. 5 ó 7, preferiblemente la SEC. DE IDENT. No. 7.
12. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. No. 6 u 8, preferiblemente la SEC. DE IDENT. No. 8.
13. Polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia nucleótida- codificadora de un polipéptido que tiene una actividad de proteinasa de cisterna, en donde, la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. No. 16 tienen por lo menos un 70%, preferiblemente por lo menos 80% de secuencia de identidad basada en el método de alineación ClustalW; o el complemento de la secuencia de nucleotidos, en donde el complemento contiene el mismo número de nucleotidos como la secuencia de nucleotidos, y el complemento y la secuencia de nucleotidos son 100% complementarias.
14. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado .porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido y la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT'. No. 16 tienen por lo menos un 85%, preferiblemente por lo menos un 90%, opcionalmente por lo menos un 95%, de identidad de las secuencias basadas en el método de alineación ClustalW. 15. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE IDENT. No.
15. 16. Polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13,.· caracterizado porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. No.
16.
17. Vector caracterizado porque comprende polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 al 16.
18. Construcción de ADN no nativo recombinante caracterizada porque comprende polinucleótido operablemente vinculado a una secuencia reguladora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
19. Método para transformar una célula caracterizado porque comprende la trasformación de una célula con polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
20. Célula caracterizada porque comprende una construcción no nativa recombinante de ADN de conformidad con la reivindicación 18. 21. Célula de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque es una célula pro-cariota, una célula eucariota, o una célula de planta, preferiblemente una célula de café. 22. Planta transgenética caracterizada porque comprende la célula de conformidad con la reivindicación 20 ó
21. 23. Método para modular los niveles de los precursores del sabor en el café, en los granos verdes de café, el método caracterizado porque comprende la introducción en la planta de café la construcción de ADN no nativa recombinante de conformidad con la reivindicación 18.