CN104371991B

CN104371991B - 四翅滨藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其应用

Info

Publication number: CN104371991B
Application number: CN201410497324.0A
Authority: CN
Inventors: 潘洪玉; 余刚; 李敬涛; 孙新华; 贾承国; 刘金亮; 张祥辉
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2034-09-23
Also published as: CN104371991A

Abstract

四翅滨藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其应用属植物基因工程技术领域，一种植物抗逆相关蛋白AcCysP1由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1的编码序列为下列之一:1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5’端第190‑1122位脱氧核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID NO:2蛋白质序列的核苷酸分子；一种重组表达载体，含有植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1；一种重组菌，含有植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1；在本源植物四翅滨藜中通过qRT‑PCR检测，该基因在NaCl和PEG胁迫下上调表达。同时，将AcCysP1导入酿酒酵母得到转基因酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，进行胁迫处理，结果亦可表明AcCysP1可以提升酵母耐干旱(山梨醇)和耐盐(NaCl)的能力。

Description

四翅滨藜半胱氨酸蛋白酶基因克隆及其应用

技术领域

本发明属植物基因工程技术领域，尤其涉及使用酿酒酵母Saccharomycescerevisiae INVSc1菌株表达与植物抗逆(具体为盐和干旱)相关的蛋白AcCysP1，同时采用实时荧光定量PCR(实时PCR，Real-Time-PCR，)的方法来研究该基因对非生物胁迫NaCl和PEG的功能。

背景技术

目前农业生产中逆境胁迫是影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。农作物在整个生长季节中，会受到各种逆境因素的影响，如生物胁迫的病虫害等及非生物胁迫的盐、碱、高温、低温、干旱等，这些胁迫限制了植物的生长发育，最终会导致作物产量降低，品质下降，直接影响甚至威胁到粮食安全，在这些严重影响作物生产的逆境因子中，极端温度、干旱、高盐、营养失调(包括矿物质中毒和矿物质缺乏)是影响作物产量的主要限制因子，每年直接从盐、碱、干旱、低温胁迫等逆境造成的农作物减产仍然超过总产量的20％，而干旱和盐胁迫是最主要的制约因素。因此，研究与非生物胁迫有关的基因并将其导入作物进行分子育种引起了科研工作者的广泛兴趣，而通过基因工程的方法进行逆境相关基因的克隆及其功能的解析能够为植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。然而，从直接解决农业生产中关键问题的角度来看，在农业生产上能起显著作用的转基因作物种类还不多，人类对植物逆境适应性分子机理的研究还远远不够，远不能满足植物分子育种的需求，同世界发达国家相比，我国拥有自主知识产权和具有重要利用价值的基因相对较少。同时，目前的研究也主要集中在草本植物，而对木本植物及其耐盐和干旱的分子遗传研究也相对较少。然而，草本和木本植物在结构、生长、发育、生理、及在应对生物和非生物胁迫等方面存在较大的差异性。所以，从木本植物中寻找抗逆相关的基因并进行研究，能够为通过基因工程提高作物的生物和非生物胁迫耐受性这种手段提供更多的候选基因。

四翅滨藜(Atriplex canescens[Pursh]Nute)是一种盐生灌木，在分类上为藜科，滨藜属，普遍存在于干旱、半干旱地区，具有较强的耐干旱、抗盐碱、耐寒冷和耐重金属的特性，尤其是耐干旱和盐特性。四翅滨藜在每年降雨量≥180mm的干旱半干旱地区，年平均气温仅为5℃左右的低温地区，甚至在极端低温为-40℃地区以及盐碱地等恶劣环境下依然生长良好，同时在海拔2000米左右的地区也适合生长，根据已有报道，四翅滨藜被有些国家称为“生物脱盐器”，它一年时间就可以从6.07亩的土地上吸收到1吨以上的盐分，灌木生物量也能达到15t/hm²，枝叶中的粗蛋白含量在12％以上，高产优质、富含营养，相关科学家们认为，四翅滨藜有及其丰富的营养价值和可观的饲料用途，因此成为了荒漠、半荒漠干旱地区非常有价值的优良饲料灌木树种。同时，四翅滨藜还具有积累硒的能力，因此在美国也广泛用于水土保持和路坡固定，但牧场改良仍然是其主要用途。近年来，四翅滨藜先后在中国的新疆，甘肃，宁夏，青海和其它地方种植，通过大量研究，充分体现了四翅滨藜较强的抗盐，碱，干旱，低温，贫瘠等优良特性，渐渐成为绿化和水土保持的优良树种。

酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系统，是二倍体，它在蛋白翻译后加工过程中能形成二硫键，具有糖基化以及蛋白折叠等特征，使得其基因表达模式更加接近于真核植物中的表达模式，它还具有生长快速、遗传操作简便和易于培养等的优点，所以在对植物功能基因的相关研究中，用酵母表达系统筛选具有原核表达系统不可替代的优势性。酿酒酵母菌株INVSc1(基因型为MATa his3D1leu2trp1-289ura3-52)是经过人工改造后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株的酵母转化子运用SC-U缺培养基筛选时，假阳性低，转化效率高，因此是理想的酵母表达菌株。利用酵母营养缺陷型菌株对植物cDNA文库的研究和挖掘，在植物中受到越来越多关注。Frommer等和Hsu等(1993年)在筛选拟南芥cDNA文库中克隆到氨基酸透过酶的NAT2/AAP1基因，该基因可以互补酵母的氨基酸转运缺陷突变体；酵母系统研究植物耐盐性表达基因的功能研究也被广泛应用，Yamada等(2002年)就利用酵母转化子来验证丙二烯环化氧化酶(AOC)基因可以大大提高抗盐性，进一步推测到AOC基因在植物中也可能具有抗盐功能。唐玉林等(2007年)利用酵母研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母转化子的耐盐能力得到显著提高，从而推测SALI3-2基因所具有的抗逆能力。由此可见，利用酵母表达外源蛋白并研究其功能已经受到广泛应用。

Real-Time PCR(RT-PCR)是一种目前应用普遍的检测基因表达的技术，它通过添加荧光基团，并利用荧光信号累积来实时监测整个PCR的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，该方法能够避免传统PCR定量终产物时产生的偏差，从而使实验的重复性得到提高，该技术现已被广泛用于监测细胞mRNA的表达量变化。SYBR green是Real-timePCR的常用方法之一，该法灵敏度高，通用性好，方法简单等优点而被国内外科研中普遍使用。

半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteases)是一类广泛分布于动物、植物、微生物等有机体内的蛋白水解酶。该类蛋白酶的分子量约为20,000～30,000，最佳pH范围为4～6.5，亲核的半胱氨酸残基分布于催化活性部位。植物半胱氨酸蛋白酶是对植物正常生长非常重要的一大类植物蛋白水解酶，其对蛋白加工有双重功能，在种子成熟时，半胱氨酸蛋白酶通过水解加工初级多肽帮助贮藏器官(如液泡、胚乳)完成蛋白沉积，而在种子萌发及幼苗生长过程中，该蛋白酶又动员降解贮藏蛋白从而为种子萌发和幼苗生长提供氨基酸。同时，植物半胱氨酸蛋白酶直接参与种子的萌发、组织器官的分化、植株生长发育、植物抗逆应答、细胞程序化死亡(PCD)及植物衰老等生理过程，所以也是目前研究较为深入的一大类植物水解蛋白。在植物中，该家族蛋白分为：木瓜蛋白酶C1亚族(papain C1)，大部分植物半胱氨酸蛋白酶属于这个亚族；钙依赖半胱氨酸蛋白酶C2亚家族(calpain C2)；豆类天冬氨酸蛋白内切酶C13亚家族(legumain C13)；天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶C14亚家族(caspase C14)；泛素类半胱氨酸蛋白酶C12和蛋白酶体C19是最近发现的催化蛋白去泛素化的植物半胱氨酸蛋白酶。在非生物逆境胁迫(干旱、高盐、低温等)和生物胁迫(病原菌侵染)下，植物半胱氨酸蛋白酶mRNA水平更显著升高，一般认为植物半胱氨酸蛋白酶会降解逆境条件下受损或变性的蛋白,并为新蛋白的合成提供肽段或游离的氨基酸。受到生物胁迫后，植物与病原物互作的过程中该类蛋白酶会诱导植物细胞程序化死亡从而避免入侵病原菌的蔓延进而增强植物自身对生物胁迫的耐受力。然而在目前的众多研究中，还无有关四翅滨藜AcCysP1基因在抗逆等生理功能方面的研究报道。

发明内容

本发明通过构建四翅滨藜(Atriplex canescens)的低温(-10℃)及盐胁迫(400mMNaCl)全长cDNA文库，并利用Gateway技术将cDNA文库LR重组到酵母表达载体(pYES-DEST52)中，混合质粒载体经转化到酵母菌株INVSc1中，并通过模拟逆境胁迫(NaCl、山梨醇)筛选出与逆境胁迫相关的基因，同时利用RT-PCR技术检测该基因在逆境胁迫(NaCl，PEG6000)条件下的表达量变化，以初步研究该基因在四翅滨藜中逆境胁迫的相应作用。本发明不仅对四翅滨藜的耐干旱和耐盐分子机制的研究提供新的依据，同时为获得具有抗逆能力的转基因农作物和林木(耐盐、干旱)奠定基础。本发明中，转pYES-AcCysP1的重组酵母转化子表现出了明显的抗干旱和抗盐胁迫的能力。同时在本源植物四翅滨藜中，AcCysP1基因的表达也对盐胁迫和旱胁迫表现出了明显的响应。

本发明提供了四翅滨藜中一种含半胱氨酸蛋白酶功能域的与植物抗逆(盐和旱)相关的蛋白及其编码基因序列，通过利用酵母系统进行功能验证，并在本源植物中通过RT-PCR检测的方法对该基因进行进一步解析及其在植物抗逆中的应用：

本发明提供的半胱氨酸蛋白酶基因，名称为AcCysP1，为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。通过四翅滨藜全长cDNA文库测序得到AcCysP1基因。该基因共由1454个碱基组成，完整的开放阅读框含有930bp，同时还含有5’非翻译区和3’非翻译区序列，开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

本发明所提供的蛋白耐干旱和盐胁迫，名称为AcCysP1，来源于盐生灌木四翅滨藜，植物抗逆相关蛋白AcCysP1由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1的编码序列为下列之一:

1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5’端第190-1122位脱氧核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID NO:2蛋白质序列的核苷酸分子。

一种重组表达载体，含有植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1。

一种重组菌，含有植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1。

序列表中的序列2根据DNAMAN分析，蛋白由310个氨基酸组成，等电点7.09，蛋白总量34KDa。一般情况下，蛋白二级结构含190个卷曲，40个螺旋，81个折叠，有10个抗原肽段。蛋白含127个亲水氨基酸，184个疏水氨基酸，具有弱亲水性，根据Expasy protscale 的Hphob./Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面区域在N端。PSORT Prediction预测蛋白最可能定位到细胞质和线粒体基质中。

本发明涉及的酵母表达载体pYES-DEST52(购自Invitrogen公司)与AcCysP1基因重组为pYES-AcCysP1，且该重组酵母表达载体转化的宿主感受态细胞为酿酒酵母INVSc1。该酵母表达载体除了含有AcCysP1的编码DNA序列外，还携带有GAL1启动子、T7启动子、URA3基因、氨苄青霉素抗性标记基因、CYC1终止转录信号、LR重组位点attR1和attR2、用于逆向筛选的致死基因ccdB，蛋白纯化的6xHis Tag，蛋白表达检测的V5epitope等外源基因蛋白在酵母中高效表达所需的各种调控元件。

本发明通过RT-PCR方法检测了该基因在对于干旱和盐胁迫的响应(PEG，NaCl处理)，基因在两种胁迫处理下表现出了基因上调，进一步推测该基因在植物参与逆境响应尤其是干旱和盐胁迫中起重要作用，该基因的上调表达有助于提高四翅滨藜的抗干旱和抗盐的能力。

本发明在通过酵母(NaCl，山梨醇)及RT-PCR(NaCl，PEG)关于干旱和盐的研究后,AcCysP1基因在逆境方面的应用：该基因过量表达可能提高植物的抗逆性，所述植物抗逆性具体可为对非生物胁迫和生物胁迫的抗逆性，非生物胁迫如干旱、极端温度、盐碱等，特别是植物的抗干旱和盐胁迫的能力。

附图说明

图1为四翅滨藜总RNA提取图片

图2为1Kb Plus DNA Ladder

图3为cDNA文库插入片段长度PCR检测图片

图4为为cDNA文库插入片段长度PCR检测图片

图5为1Kb Plus DNA Ladder

图6为pYES-AcCysP1重组质粒PCR扩增凝胶电泳图

M：DL2000DNA Marker；M：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1，2：扩增片段

图7为AcCysP1在NCBI中功能域比对分析结果

图8为AcCysP1与其它物种的同源蛋白系统进化分析

图9为pYES-AcCysP1阳性重组酵母转化子PCR凝胶电泳图

M：DL2000DNA Marker；M：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1，2：阳性酵母转化子PCR电泳鉴定

图10为重组酵母pYES-AcCysP1和pYES-DEST52非胁迫下的结果

图11为重组酵母pYES-AcCysP1和pYES-DEST52在3M山梨醇胁迫下的结果

图12为重组酵母pYES-AcCysP1和pYES-DEST52在2MNaCl胁迫下的结果

图10--12中：pYES-AcCysP1酵母转化在对2MNaCl和3M山梨醇的抗逆能力明显强于空载体pYES-DEST52酵母转化子。

图13为AcCysP1基因在400mM NaCl胁迫处理后的表达量变化图

图14为为AcCysP1基因在20％PEG6000胁迫处理后的表达量变化图

图13和14中：AcCysP1基因在NaCl处理6h后开始上调表达；同时，在PEG处理6h后该基因开始上调表达。

具体实施方式

实施例一：AcCysP1基因全长cDNA的获得及序列分析

1.胁迫处理四翅滨藜：

-10℃条件下生长三个月的四翅滨藜植株移栽到人工气候培养箱，正常培养10天后，待植株复苏存活，发出新叶，生长健壮。将植株转移到含有营养的水培条件下，正常生长两天后，用500mL的含NaCl400mM的盐液水培处理四翅滨藜植株，胁迫处理4天后，采摘叶片，嫩茎部和幼根清洗干净并液氮速冻，-80℃冻存，以备建库。

2.构建cDNA文库：

将NaCl处理4天后的四翅滨藜样品(叶片、嫩茎和幼根)提取总RNA(图1、图2)，然后使用Invitrogen公司的‘cap antibody module’将含有完整帽子结构的单链cDNA进行富集，并按照Full-Length cDNA Library Construction Kit试剂盒构建全长cDNA文库，并通过Gateway技术将该cDNA文库LR重组到酵母表达载体pYES-DEST52中，随机对cDNA文库进行PCR检测(图3、图4、图5)，将长度500bp以上的片段进行测序，利用NCBI的BlastX进行功能域的比对及相关生物信息学分析，获得了四翅滨藜盐胁迫的表达序列标签(ESTs)。

2.1四翅滨藜总RNA提取的方法：

2.1.1取100mg植物样品，在预冷的研钵中用液氮迅速研成粉末，快速转移到遇冷的2mL离心管中。(保证全过程在通风厨中，防止RNA降解。)

2.1.2加入1ml Trizol试剂，剧烈振荡混匀15s，静置10min充分裂解细胞。

2.1.3加入0.2mL氯仿(三氯甲烷)，迅速震荡混匀15s，静置5min。

2.1.4高速低温(12,000rpm，4℃)离心15min。

2.1.5将上清小心转移到新的1.5mL离心管，加0.5mL异丙醇，颠倒混匀，静置10min。

2.1.6再次高速低温(12,000rpm，4℃)离心10min。

2.1.7去除上清，加0.5mL75％的乙醇，7,500rpm低温离心5min以洗涤沉淀。

2.1.8重复步骤2.1.7一次，进一步洗涤沉淀，去除离子。

2.1.9小心吸取上清，并通风厨中干燥RNA沉淀，并用50μL的DEPC水溶解RNA。

3.筛选AcCysP1基因片段的克隆：

根据测序分析，获得四翅滨藜ESTs，从中获得了一个编码半胱氨酸蛋白酶的cDNA全序列AcCysP1，将LR重组得到的酵母表达载体pYES-AcCysP1转化至大肠杆菌感受态细胞中(DH5α)，过夜培养后，挑取单菌落，并于LB(含100mg/L的Amp)液体培养基过夜培养，通过质粒提取试剂盒(鼎国公司)提取质粒。并根据载体上的通用序列PCR引物，并进行质粒PCR扩增验证，以鉴定获得的cDNA序列。

上游(T7)：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

下游(R)：5’-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3’

PCR反应体系(25μL)：Buffer2.5μL、上下游引物(T7、R)各0.5μL、Tag酶0.5μL、dNTP0.5μL、模板0.2μL、ddH₂O20.8μL。PCR反应的条件：在94℃预变性5分钟；94℃变性30秒；迅速冷却至58℃退火30秒；72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟；4℃冷却保存。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，在大约1454bp的位置上有特异性的目的条带(图6)。

实施例二：AcCysP1基因的序列分析

经测序分析后，AcCysP1基因的全长cDNA序列全长为1454bp，包含930bp的开放阅读框，根据DNAMAN分析，蛋白由310个氨基酸组成，等电点7.09，蛋白总量34KDa。一般情况下，蛋白二级结构含190个卷曲，40个螺旋，81个折叠，有10个抗原肽段。蛋白含127个亲水氨基酸，184个疏水氨基酸，具有弱亲水性，根据Expasy protscale的Hphob./Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面区域在N端。PSORT Prediction预测蛋白最可能定位到细胞质和线粒体基质中，这是半胱氨酸蛋白酶家族的主要特征。通过分析表明，获得了AcCysP1基因的全长cDNA序列，并且在GenBank上的登录号为KJ027049。

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对该编码基因进行保守区域分析(图7)，该基因编码的蛋白属于半胱氨酸蛋白酶家族蛋白。通过NCBI对AcCysP1基因编码的氨基酸序列进行BLASTX，通过与已确定功能的其它物种的氨基酸序列进行同源性分析和系统进化分析，利用MEGA4软件进行进化树分析，结果表明：AcCysP1与其它已知物种中的半胱氨酸蛋白酶基因编码的氨基酸进化关系较远。(图8)。

实施例三：重组酵母的转化及检测

酿酒酵母菌株INVSc1为尿氨酸营养缺陷型(Ura^-)的模式菌株，在缺乏尿氨酸的酵母基本培养基(SC-Ura^-)上,该酵母菌株几乎不能生长和繁殖。而酵母表达载体(pYES2-DEST52)上含有URA3基因,且该基因的表达可以使酵母转化子在SC-Ura^-培养基上正常生长。因此，SC-Ura^-选择培养基可以进行阳性和非阳性酵母转化子的筛选。通过醋酸锂法将载体质粒pYES-AcCysP1和pYES-DEST52分别转化到酵母感受态菌株INVSc1中，将转化酵母菌液涂在SC-Ura^-固体选择培养基上，以未转化的酵母做对照，进行培养，2d后除了空酵母完全不长外，转化两种质粒的酵母均可以生长并有菌落长出，说明酵母转化成功，挑取酵母单菌落，过夜培养后进行破除细胞壁，并通过菌液PCR方法进行阳性转化子的进一步鉴定。

1.运用醋酸锂化学转化法转化酿酒酵母INVSc1，其具体转化步骤：

1.1将一个酵母菌株单克隆(INVSc1)加入到10mL YPD液体培养基中，30℃过夜摇培。

1.2检测酵母菌液的OD₆₀₀值，利用50mL YPD液体培养基将过夜培养的酵母菌液稀释至OD₆₀₀为0.4，30℃继续摇培2-4h。

1.3低温离心(4℃，2500rpm)5min后，去除上清收集菌体，用40mL1xTE缓冲液重悬菌体。

1.4再次低温离心(4℃，2500rpm)5min后，收集菌体，用2mL1xLiAc/0.5xTE缓冲液重悬菌体。

1.5将获得的重悬菌体按照每管100μL的体系分装到1.5mL离心管。

1.6将分装的酵母细胞置于室温孵育10min。

1.7在每个转化体系(100μL)中，加入1μg质粒DNA，100μg变性鲑鱼精DNA，混匀。

1.8每个体系中加入700μL1xLiAc/40％PEG-3350/1xTE，混匀。

1.930℃孵育步骤1.8中的混合液30min。

1.10在每个体系中再加入88μL的DMSO，混匀后，42℃条件下水浴热击7min。

1.115000rpm低温离心1min，去除上清。

1.12用备好的1mL1xTE的缓冲液重悬菌体，5000rpm低温离心1min，进一步去除上清。

1.13用100μL1xTE的缓冲液将菌体重悬，并涂于酵母选择培养基上，30℃培养24h。

2.阳性转化子的鉴定

从酵母选择培养基上随机挑取5个酵母转化子(pYES2-AcCysP1)的单菌落，30℃振荡培养过夜(200rpm)，收集过夜培养菌体，沸水煮5min，迅速置于冰上5min以破碎细胞，重复几次，以细胞破碎液离心浓缩样品作为模板进行菌液PCR，以引物T7和R进行PCR扩增，PCR反应体系为(25μL)：Buffer2.5μL、上下游引物(T7、R)各0.5μL、Tag酶0.5μL、dNTP0.5μL、模板5μL、ddH₂O15.5μL。

PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，扩增片段大小为1454bp，与目标长度吻合(图9)。证明重组质粒pYES2-AcCysP1已经转化到酵母菌株中。

实施例四：阳性转化酵母逆境胁迫处理

1.逆境胁迫处理前准备

取适量阳性酵母转化子(pYES-DEST52，pYES2-AcCysP1)菌液，接种到含2％葡萄糖的SC-U液体培养基中，30℃条件下200rpm振荡培养24h，测OD₆₀₀值，并用SC-U液体培养基(2％葡萄糖)将菌液OD₆₀₀统一调整为0.4，总体积5mL，8000rpm离心1min，吸取上清液，加2mL含2％半乳糖的酵母诱导培养基重悬菌体，以1:50的比例接到5mL的诱导培养基中扩大培养，30℃振荡培养24h，检测酵母INVSc1(pYES-DEST52)和INVSc1(pYES2-AcCysP1)的OD₆₀₀值,并统一调整到OD₆₀₀值为2，备用。对这两种酵母转化子进行不同的非生物胁迫处理，比较两种酵母转化子抗盐和干旱胁迫能力,实验重复3次。

2.模拟逆境胁迫处理

存在于自然界中的植物面对各种生物和非生物逆境，非生物胁迫中最主要的是盐胁迫(NaCl、KCl等)和干旱胁迫。

在实验室条件下进行盐和干旱的模拟，用2M NaCl模拟盐胁迫，3M的山梨醇模拟干旱胁迫。运用以上两种模拟条件处理酵母转化子，通过酵母的生长情况对比，从而评价该基因在酵母中诱导表达后对酵母抗逆性的影响，以对该基因在酵母中的抗逆功能进行初探(图10、图11、图12)。

2.1NaCl处理：将上述备用菌体分别以不稀释和稀释10、100、1000、10000倍的菌体，吸取2μL菌液接种到含2％半乳糖的SC-U固体培养基上，30℃培养两天后，比较两种酵母转化菌的菌落生长状态。

2.23M山梨醇干旱模拟处理：将上述备用菌体分别以不稀释和稀释10、100、1000、10000倍的菌体，吸取2μL菌液接种到含2％半乳糖的SC-U固体培养基上，30℃培养两天后，比较两种酵母转化菌的菌落生长状态。

实施例五：AcCysP1基因在四翅滨藜PEG和NaCl胁迫下的应答

1.四翅滨藜胁迫处理：

将四翅滨藜种子种在营养土中，正常条件生长50天后，选取生长良好的四翅滨藜，转移到MS营养液中进行水培，每天更换营养液，水培3天待四翅滨藜生长健壮后，分别用400mM NaCl和20％PEG6000处理，并在0、6、12、24、48h后取根茎叶，液氮速冻，-80℃保存。

2.RNA提取及反转录：

采用Trizol法提取总RNA(如实施例一，2.1)，利用Takara公司的RTreagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行反转录以制备cDNA，用于quantity Real-timePCR分析。

3.荧光定量PCR分析：

利用SYBRGreenReagent试剂盒，使用7500荧光定量系统检测AcCysP1基因(F:GCAACAGTTGGTGGACTGTG；R:ACGTTCAATACCACCGGCTT)在不同处理下随时间变化的表达量差异。真核延伸生长因子(EF1-α)作为内参基因(F:5’-CCCCAGTTCTCGACTGTCAC-3’；R5’-TGGTGGGAACCATCTTCACG-3’)。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火延伸34秒，进行40个循环；95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟，95℃变性15秒；60℃延伸15秒。采用法分析表达量差异(图13、图14)。

Claims

1.一种植物抗逆性相关蛋白AcCysP1，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.按权利要求1所述植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1，其特征在于，所述编码基因AcCysP1的编码序列为编码序列表中SEQ ID NO:2蛋白质序列的核苷酸分子。

3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1。

4.一种重组菌，其特征在于，含有权利要求2所述植物抗逆性相关蛋白AcCysP1的编码基因AcCysP1。