MXPA04002216A

MXPA04002216A - Expresion hibrida y en tandem de proteinas de neisseria.

Info

Publication number: MXPA04002216A
Application number: MXPA04002216A
Authority: MX
Inventors: Pizza Mariagrazia
Original assignee: Chiron Srl
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2002-09-06
Publication date: 2005-02-17
Also published as: PT2360176E; CA2459816C; NZ532115A; EP2327719A1; DK2360176T3; US20110250223A1; EP2327719B1; EP2360176B1; JP2014051497A; US8840907B2; US20120195919A1; EP1423419B1; NZ547145A; ES2556770T3; US9056075B2; CN101260148B; EP2360176A3; WO2003020756A2; RU2339646C2; BR0212363A

Abstract

La presente invencion se refiere a la union de dos o mas proteinas de Neisceria, de tal modo que son traducidas como una sola cadena polipeptidica. Las proteinas hibridas estan representadas por la Formula NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, en donde X es una secuencia de aminoacidos, L es una secuencia de aminoacidos ligadora opcional, A es una secuencia de aminoacidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoacidos C-terminal opcional y n es un numero entero mayor de 1. Las proteinas en donde cada una de las n porciones -X- comparten una identidad de secuencia con las otras porciones -X-, se denominan "proteinas en tandem".

Description

EXPRESIÓN HÍBRIDA Y EN TÁNDEM DE PROTEÍNAS DE NEISSERIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece al campo de la expresión de proteínas. En particular, se refiere a la expresión de proteínas de Neisseria (e.g., N. gonorrhoeae o, de preferencia, N. meningitidis) . ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Las referencias 1 y 2 describen enfoques alternativos y mejorados para la expresión de las proteínas de Neisseria. descritas en las referencias 3 a 6. Uno de tales métodos es producir proteínas "híbridas" en las cuales dos o más proteínas de Neisseria se expresan como una sola cadena peptldica. Este enfoque ofrece dos ventajas. Primero, una proteína que puede ser inestable o que se expresa poco por sí sola, puede ser asistida agregando un socio híbrido adecuado que resuelva el problema. Segundo, la producción comercial se simplifica ya que sólo se necesita una expresión y purificación con el fin de producir dos proteínas separadamente útiles. Un objetivo de la presente invención es proporcionar alternativas adicionales y mejorar enfoques para la expresión de proteínas de Neisseria. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Proteínas híbridas Así pues, la presente invención proporciona un método REF: 154747 para la expresión simultánea de dos o más (e.g. , 3, 4, 5, 6 ó más) proteínas de Neisseria, en el cual dos o más proteínas se unen de tal modo que sean traducidas como una sola cadena polipeptídica . En general, las proteínas híbridas de la presente invención se pueden representar por la Fórmula: ¾-A- [-X-L-]n-B-COOH en donde X es una secuencia de aminoácidos, L es una secuencia de aminoácidos ligadora opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional y n es un número entero mayor de 1. El valor de n está entre 2 y x y el valor de x típicamente es 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10. De preferencia n es 2 , 3 ó 4 ; más preferiblemente es 2 ó 3 más preferiblemente n = 2. Las porciones -X- Existen dos grupos principales de proteínas híbridas de conformidad con la presente invención. Estos dos grupos no son mutuamente exclusivos . En el primer grupo, cada porción -X- es: (a) una secuencia de aminoácidos orfl, orf4, orf25, orf40, orf46.1, orf83, MB1343, 230, 233, 287, 292, 594, 687, 736, 741, 907, 919, 936, 953, 961 ó 983; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del inciso (a) ; o (c) una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de una secuencia de aminoácidos del inciso (a) . Un subconjunto preferido del inciso (a) es: orf46.1, 230, 287, 741, 919, 936, 953, 961 y 983. Un subconjunto más preferido del inciso (a) es: orf46.1, 287, 741 y 961. La Figura 3 muestra algunas proteínas híbridas preferidas . En el segundo grupo, la proteína híbrida comprende una primera porción -X- (-Xa-) y una segunda porción -X- (-Xb-) · La porción -Xa- tiene una de las siguiente secuencias de aminoácidos : (d) las 446 SEQ IDs uniformes (i.e., 2, 4, 6, 890, 892) descritas en la referencia 3 ; (e) las 45 SEQ IDs uniformes (i.e., 2, 4, 6, 88, 90) descritas en la referencia 4 ; (f) las 1674 SEQ IDs uniformes 2-3020, SEQ IDs uniformes 3040-3114 y todas las SEQ IDs 3115-3241, descritas en la referencia 5; (g) las 2160 secuencias de aminoácidos N B0001 a MB2160 de la referencia 7; ó (h) una secuencia de aminoácidos descrita en la referencia 1 ó en la referencia 2. La porción -Xb- está relacionada con -Xa- de tal modo que: (i) -Xb- tenga una identidad de secuencia con -Xa-y/o (j ) -Xb- comprenda un fragmento de -Xa~ . Algunos ejemplos de este segundo tipo de proteína híbrida incluyen proteínas en las cuales dos o más porciones -X- son idénticas, o en las cuales hay variantes de la misma proteína, dos formas polimórficas de la misma proteína se pueden expresar como -Xa-Xb- y tres formas polimórficas se pueden expresar como -Xa-Xb~Xc- etc. Las porciones -Xa- y -Xb- pueden estar en cualquier orden desde los extremos N-terminal a C-terminal. La porción -Xa- de preferencia es una secuencia de aminoácidos orfl, orf4, orf25, orf40, orf46.1, orf83, N B1343, 230, 233, 287, 292, 594, 687, 736, 741, 907, 919, 936, 953, 961 ó 983. La porción -Xa~ más preferiblemente es una secuencia de aminoácidos orf 6.1, 230, 287, 741, 919, 936, 953, 961 ó 983. La porción -Xa- más preferiblemente es una secuencia de aminoácidos orf46.1, 287, 741 ó 961. En proteínas en las que cada una de las n porciones -X- comparte una identidad de secuencia con las demás porciones -X- , la proteína se denomina como una "proteína en tándem" . Se prefieren las proteínas en tándem en las cuales n = 2. El grado de "identidad de secuencia" referido en los incisos (b) e (i) de preferencia es mayor que el 50% (e.gr., 60, 70, 80, 90, 95, 99% ó más hasta 100%). Esto incluye mutantes, homólogos, ortólogos, variantes alélicas, etc. [e.g., véase la referencia 8] . De preferencia, la identidad se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, tal como se encuentra en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , utilizando una búsqueda de huecos con parámetros gap open penalty = 12 y gap extensión penalty = 1. Típicamente, una identidad del 50% ó más entre dos proteínas se considera como una indicación de equivalencia funcional. El "fragmento" referido en los incisos (c) y (j) debe consistir de cuando menos m aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos de los incisos (a) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) y, dependiendo de la secuencia particular, m es 7 ó más {e.g., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ó más) . De preferencia, el fragmento comprende un epítopo de una secuencia de aminoácidos de los incisos (a) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) . Los fragmentos preferidos son aquellos descritos en las referencias 9 y 10. Los fragmentos preferidos de los incisos (c) y (j) son proteínas truncadas en los extremos C-terminal y/o N-terminal (e.g., ??-287, ?2-287, etc.). Las secuencias preferidas de los incisos (b) , (c) , (i) y (j) omiten secuencias de poliglicina. Se ha encontrado que esto ayuda a la expresión [ref . 2] . Las secuencias de poliglicina se pueden representar como (Gly) g, en donde g > 3 (e.g. , 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó más) . Si una porción -X- incluye una secuencia de poliglicina en su forma silvestre, se prefiere omitir esta secuencia en las proteínas híbridas de la presente invención. Esto se puede realizar rompiendo o removiendo la fracción (Gly)g- - por deleción (e.g., CGGGGS —» CGGS, CGS o CS), por sustitución (e.g., CGGGGS -», CGXGGS, CGXXGS, CGSGXS, etc.) y/o por inserción (e.g., CGGGGS ? CGGXGGS, CGXGGGS, etc.) . Se prefiere la deleción de (Gly)g y la deleción de la porción N-terminal de una proteína hasta incluyendo la secuencia de poliglicina (e.g., la deleción de los residuos 1-32 de la SEQ ID No. 1, se refiere en la presente como "AG" . La omisión de la poliglicina es particularmente útil para las proteínas 287, 741, 983 y Tpb2 (AG287, ÁG741, AG983 y ÁGTbp2 - referencias 1 y 2) . Los fragmentos preferidos de los incisos (c) y (j) omiten dominios completos de proteína. Esto es particularmente útil para las proteínas 961, 287 y 0RF 6. Una vez que una proteína ha sido dividida en dominios, los fragmentos de los incisos (c) y (j) pueden omitir uno o más de estos dominios (e.g., 287B, 287C, 287BC, 0RF46i_433/ ORF4643 -so8, 961c - referencia 2; Figuras 4 y 5 de la presente) . La proteína 287 se ha dividido en tres dominios, referidos como A, B y C (véase la Figura 5 de la referencia 2) . El dominio B se alinea con proteasas de IgA, el dominio C se alinea con proteínas de unión a transferrina y el dominio A no muestra una fuerte alineación con bases de datos de secuencias. Una alineación de formas polimorficas de 287 se describe en la referencia 8. La proteína 0RF46 se ha dividido en dos dominios -un primer dominio (aminoácidos del 1 al 433; 0RF46.1) que esta bien conservado entre especies y serogrupos, y un segundo dominio (aminoácidos del 434 al 608) que no está bien conservado. El segundo dominio de preferencia se elimina, dejando sólo el ORF46.1. Una alineación de formas polimorficas de ORF46 se describe en la referencia 8. La proteína 961 se ha dividido en varios dominios (Figura 4) . Si una porción -X- tiene una secuencia peptídica líder en su forma silvestre, ésta se puede incluir u omitir en las proteínas híbridas de la presente invención. Cuando el peptido líder es omitido, éste es un ejemplo preferido de una secuencia de aminoácidos de los incisos (c) y (j) . En una modalidad, los péptidos líder serán eliminados excepto aquel de la porción -X- localizada en el extremo N-terminal de la proteína híbrida; es decir, el péptido líder de X2 será retenido, pero los péptidos líder de X2 ... Xn serán omitidos. Esto es equivalente a eliminar todos los péptidos líder y utilizar el péptido líder de Xi como porción -A- .

Cuando n = 2, los pares preferidos de porciones -X-son: AG287 y 230; AG287 y 936; AG287 y 741; 961c y 287; 961c y 230; 961c y 936; 961cL y 287; 961cL y 230; 961cL y 936; orf46.1 y 936; ORF4.1 y 230; 230 y 961; 230 y 741; 936 y 961; 936 y 741. Cuando n = 2, los pares preferidos de porciones -X- para proteínas en tándem son: AG741 y 741; AG287 y 287. Más específicamente, las siguientes combinaciones de Xi y X2 se prefieren cuando n = 2 : TABLA 1 X2 Xi X2 AG287 230 230 AG287 AG287 936 936 AG287 AG287 741 741 AG287 AG287 961 961 AG287 AG287 ORF46.1. ORF46.1 AG287 AG287 919 919 AG287 AG287 953 953 AG287 961c 287 287 961c 961c 230 230 961c 961c 936 936 961c 961c 741 741 961c 961c 983 983 961c 961c AG983 AG983 961c 961c ORF46.1 ORF46.1 961c 961 ORF46.1 ORF46.1 961 961cL 287 287 961cL 961cL 230 230 961cL 961cL 936 936 961cL ORF46.1 936 936 ORF46.1 ORF46.1 230 230 ORF46.1 ORF46.1 741 741 ORF46.1 ORF46.1 AG741 AG7 1 ORF46.1 0RF46.1 983 983 ORF46.1 ORF46.1 AG983 AG983 ORF46.1 230 961 961 230 230 741 741 230 230 AG741 AG741 230 936 961 ' 961 936 936 741 741 936 936 AG741 AG741 936 AG741 741 741 AG741 ORF46.1 983 983 ORF46.1 AG741 ORF46.1 ORF46.1 AG741 AG741 983 983 AG741 AG741 961 961 AG741 AG741 961c 961c AG741 AG983 ORF46.1 ORF46.1 AG983 AG983 961 961 AG983 AG983 961c 961c AG983 Cuando se utiliza la proteína 287 en su forma de longitud completa, de preferencia está en el extremo C-terminal de una proteína híbrida; si se utiliza en el extremo N-terminal, se prefiere utilizar una forma AG de la proteína 287. De manera similar, cuando la proteína 741 se utiliza en su forma de longitud completa, se preferencia se encuentra en el extremo C-terminal de una proteína híbrida; si se utiliza en el extremo N-terminal, se prefiere utilizar una forma AG de la proteína 741. Las porciones -L- Para cada n veces que se presente [-X-L-] , puede estar presente o ausente la secuencia de aminoácidos ligadora -L-. Por ejemplo, cuando n = 2, el híbrido puede ser H2-X1-Li-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-Xi-Li-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. La secuencia de aminoácidos ligadora -L-típicamente será corta (e.gr. , 20 ó menos aminoácidos; i.e., 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Algunos ejemplos incluyen secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, ligadores de poliglicina (i.e., Glyn en donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más), y marcas de histidina (i.e., Hisn en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más) . Otras secuencias de aminoácidos ligadoras adecuadas serán evidentes para los técnicos en la materia. Un ligador útil es la secuencia GSGGGG (SEQ ID 27) , con el dipéptido Gly-Ser formado a partir de un sitio de restricción SarriHI, ayudando de esta manera a la clonación y a la manipulación, y siendo el tetrapéptido Gly un ligador de poliglicina típico. Si Xn+i es una proteina ÁG y Ln es un ligador de glicina, esto puede ser equivalente a que Xn+i no es una proteína AG y Ln está ausente . La porción -A- La porción -A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Ésta típicamente será corta (e.g., 40 ó menos aminoácidos, i.e., 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Algunos ejemplos incluyen secuencias líderes para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación {e.g., marcas de histidina, i.e., HiSn en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más) . Otras secuencias de aminoácidos N-terminales adecuadas serán evidentes para los técnicos en la materia. Si ?? carece de su propia metionina N-terminal, -A- puede ser un residuo metionina . La porción -B- La porción -B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Ésta típicamente será corta (e.g.r 40 6 menos aminoácidos, í.e., 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Algunos ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (e.g., que comprenden marcas de histidina, i.e., Hisn en donde r¡ = 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más) , o secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína. Otras secuencias de aminoácidos C-terminales adecuadas serán evidentes para los técnicos en la materia. Formas polimorficas de proteínas La presente invención puede utilizar secuencias de aminoácidos de cualquier cepa de N. meningitidis . Por lo tanto, las referencias a una proteína particular {e.g., "287" ó "ORF46.1") incluyen esa proteína de cualquier cepa. Las variaciones de secuencia entre cepas se incluyen en los incisos (b) , (c) , (i) y (j ) . Las secuencias de referencia de N. meningitidis serogrupo B incluyen: TABLA 2 La referencia 8 describe formas polimórficas de las proteínas ORF4, ORF40, RF46, 225, 235, 287, 519, 726, 919 y 953. Las formas polimórficas de la proteína 961 se describen en las referencias 11 y 12. Cualquiera de estas formas polimórficas se puede utilizar de conformidad con la presente invención. El listado se secuencia de la presente incluye formas polimórficas de las proteínas 741 (SEQ IDs Nos. 1-22) y N B1343 (SEQ IDs Nos. 23-24) las cuales se han identificado. Serogrupos y cepas Las proteínas preferidas de la presente invención comprenden porciones -X- que tienen una secuencia de aminoácidos encontrada en N. weningitidis serogrupo B. En una sola proteína de la presente invención, las porciones -X-individuales pueden provenir de una o más cepas . Cuando n = 2 , por ejemplo, X2 puede provenir de la misma cepa que Xx ó de una cepa diferente. Cuando n = 3, las cepas podrían ser (i) Xi=X2=X3; (ü) Xi=X2?X3; (iü) Xi?X2=X3; (iv) XX?X2?X3 ó (v) ?a=?3??2, etc. En el serogrupo B, las porciones -X- preferidas provienen de las cepas 2996, MC58, 95N477 6 394/98. La cepa 95N477 a veces es denominada en la presente como "ET37" , siendo éste su tipo electroforático. La cepa 394/98 a veces es referida en la presente como "nz" , ya que es una cepa de Nueva Zelanda . Cuando se utiliza una forma de la proteína 287, ésta de preferencia proviene de la cepa 2996 ó de la cepa 394/98. Cuando se utiliza una forma de la proteína 741, ésta de preferencia proviene de las cepas serogrupo B MC58, 2996, 394/98 ó 95N477, ó de la cepa serogrupo C 90/18311. Cuando se utiliza una forma de la proteína 961, ésta de preferencia proviene de la cepa 2996. Las cepas se indican como subíndice, e.g., 741Mcs8/ lo cual significa que es la proteína 741 proveniente de la cepa MC58. A menos que se especifique de otra manera, las proteínas mencionadas en la presente {e.g., sin subíndice) provienen de N. meningitidis cepa 2996, la cual se puede considerar como una cepa de "referencia". Sin embargo, se observará que la presente invención en general no está limitada por las cepas. Como se mencionó anteriormente, las referencias generales a una proteina (e.g., "287", "919", etc.) se puede considerar que incluyen esa proteína proveniente de cualquier cepa. Ésta típicamente tendrá una identidad de secuencia del 90% ó más con la cepa 2996 (e.g., 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ó más). Expresión de la proteína 961 basada en dominio Las referencias 1 y 2 describen cómo una proteína se puede dividir en dominios y cómo la proteína se puede manipular basándose en esos dominios . la presente invención extiende la aplicación de este enfoque a la proteína 961 (también conocida como "NadA" [11, 12] . En N. meningitidis serogrupo B cepa 2996, la proteína NadA tiene 405 aminoácidos. Esta proteína se ha dividido en los siguientes nueve dominios (Figura 4) : TABLA 3 Nombre del dominio Aminoácidos Nombre del dominio Aminoácidos 961-1 "L" 1-23 961-6 269-286 961-2 24-87 961-7 287-330 961-3 88-143 961-8 331-350 961-4 144-180 961-9 351-405 961-5 181-268 Esta información se puede utilizar para localizar los mismos dominios en otras formas de la proteína 961. Estos dominios han sido eliminados de la proteína 961 en la cepa 2S96 de varias maneras (Figura 5) . Los fragmentos de 961 preferidos omiten uno o más de estos nueve dominios, e.g., los siguientes: 961-2 a 961-5 ("961a") 961-6 a 961-9 ("961b") 961-1 a 961-8 ("961cL") - 961-2 a 961-8. ("961c") 961-2 a 961-6 y los aminoácidos 287-325 del dominio 961-7 ("961d") 961-2 a 961-8 y los aminoácidos 351-383 del dominio 961-9 ("961?1") - 961-1 a 961-8 y los aminoácidos 351-383 del dominio 961-9 ("961A1L") 961-1 a 961-7 y los aminoácidos 331-343 del dominio 961-8 ("961cL-Aaro" ) 961-1 a 961-6 y los aminoácidos 287-315 del dominio 961-7 ("961cL-Acc") 961-1 a 961-5 ("961aL") 961-1 a 961-4 ("961aL-Al") 961-1 a 961-3 ("961aL-A2") 961-1.a 961-2 ("961aL-Á3") Estos trece fragmentos (y subfragmentos de los mismos a los que les faltan los aminoácidos 1, 2, 3, 4 ó 5 en cualquiera de ambos extremos) son los fragmentos preferidos de los incisos (c) y (j), pero también se pueden expresar por su propio derecho, i.e., no en la forma de una proteina híbrida de la presente invención. Así pues, la presente invención proporciona una proteína que comprende uno de estos fragmentos, siempre y cuando la proteína no sea la proteina 961 de longitud completa y no sea una proteína específicamente descrita en las referencias 1 ó 2. Esta proteína puede ser una proteína de fusión (e.g. , una fusión-GST o una fusión His-tag) . Secuencias La presente invención también proporciona una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ IDs Nos . 1 a 24. También proporciona proteínas y ácidos nucleicos que tienen una identidad de secuencia con ellas . Como se describió anteriormente, el grado de "identidad de secuencia" de preferencia es mayor del 50% (e.g. , 60, 70, 80, 90, 95, 99% ó más) . La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican para tales proteínas. Además, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que se pueden hibridizar con este ácido nucleico, de preferencia bajo condiciones "altamente estrictas" {e.g., 65°C en una solución 0.1 x SSC, 0.5% SDS) . La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican para proteínas de conformidad con la presente invención. También debe observarse que la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a las anteriormente descritas (e.g., para propósitos antisentido o de sondeo) . El ácido nucleico de conformidad con la presente invención, por supuesto, se puede preparar de cualquier manera (e.g., por síntesis química, a partir de bibliotecas de ADN genómico o ADNc, a partir del microorganismo mismo, etc.) y puede tener varias formas, (e.g., de una sola cadena, de doble cadena, vectores, sondas, etc.) . Además, el término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen estructuras modificadas y también ácidos nucleicos peptídicos (???) , etc. Mezclas La presente invención también proporciona una composición que comprende dos o más (i.e., 2, 3, 4, 5, 6 ó 7) de la siguientes proteínas : (1) 287 (2) 741 (3) ORF46.1 (4) 961 (5) H2-A- [-X-L-] n-B-COOH, en donde n = 2, Xx = 287, X2 = 953 (6) N¾-A- [-X-L-] n-B-COOH, en donde n = 2 , Xa = 287, X2 = 919 (7) NH2-A- [-X-L-] n-B-COOH, en donde n = 2, Xi = 287, X2 = 961 La mezcla puede incluir una o ambas de las siguientes proteínas, ya sea en combinación con dos o más de los incisos (1) a (7) , o bien, en combinación con solamente uno de los incisos (1) a (7) : (8) N¾-A- [-X-L-] a-?-COOH, en donde n = 2 , Xx = 287, X2 = 741 (9) H2-A- [-X-L-] n-B-COOH, en donde n = 2 , Xz = 936, X2 = 741 Cuando las proteínas 287 y 741 se incluyen en la mezcla (í.e., en la proteína 1, 2, 5, 6, 7 u 8) , pueden estar en la forma "?T" . Cuando la proteína 961 se incluye, de preferencia está en la forma "961c" en la cual la secuencia líder del extremo N-terminal y el ancla de membrana C-terminal están ausentes [e.gr. , véanse las referencias 1, 2 y 11] . Una mezcla preferida comprende las siguientes tres proteínas : (1) 961c, de preferencia 961c2sg6 (e.gr., SEQ ID No. 31 de la presente) ; (2) H2-A- [-X-L-]n-B-COOH, en donde n es 2, -Xx- es AG287 (de preferencia AG287NZ) , -X2- es 953 (de preferencia 95329ss) ue carece de su péptido líder, -Lx- es GSGGGG y -A- comprende una metionina de extremo M-terminal (e.g., -A- es M o MA) {e.g., SEQ IDs Nos. 28 y 29 de la presente) ; y (3) N¾-A- [-X-L-] n-B-COOH, en donde n = 2, Xx = 936 (de preferencia 936299e) / ¾ = AG741 (de preferencia AG741McS8) , La = GSGGGG {e.g., SEQ ID No. 30 de la presente) . Las mezclas también pueden comprender vesículas de membrana externa de N. meningitidis . Huésped heterologo Mientras que la expresión de las proteínas de la presente invención se puede llevar a cabo en Neisseria, la presente invención de preferencia utiliza un huésped heterologo. El huésped heterologo puede ser procariótico {e.g. , una bacteria) o eucariótico. De preferencia es E. coli, pero otros huéspedes adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhí, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinérea, Mycobacteria (e.g., M. tuberculosis) , levaduras, etc. Vectores, etc. La presente invención proporciona (a) un ácido nucleico que codifica para las proteínas anteriormente descritas; (b) vectores que comprenden estas secuencias de ácido nucleico; (c) células huésped que contienen dichos vectores; (d) composiciones que comprenden las proteínas o ácidos nucleicos de la presente invención, que pueden ser adecuadas como composiciones inmunogénicas (e.g., vacunas) o como reactivos de diagnóstico; (e) estas composiciones para utilizarse como medicamentos (e.g., como vacunas) o como reactivos de diagnóstico; (f) el uso de estas composiciones en la manufactura de (1) un medicamento para el tratamiento o prevención de infecciones causadas por bacterias del género Neisseria; (2) un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de bacterias del género Neisseria o anticuerpos dirigidos contra bacterias del género Neisseria, y/o (3) un reactivo que puede inducir la producción de anticuerpos contra bacterias del género Neisseria y (g) un método para el tratamiento de un paciente, que comprende administrarle al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de estas composiciones . La implantación de la invención típicamente involucrará los pasos básicos de: obtener un primer ácido nucleico que codifica para una primera proteína; obtener un segundo ácido nucleico que codifica para una segunda proteína; y ligar el primero y segundo ácidos nucleicos. El ácido nucleico resultante se puede insertar en un vector de expresión o puede ser ya parte de un vector de expresión. Para mejorar la solubilidad, la purificación de las proteínas híbridas puede incluir las técnicas de reconformación descritas en la presente . Composiciones inmunog nicas y medicamentos Las composiciones de la presente invención de preferencia son composiciones inmunogénicas y más preferiblemente son composiciones de vacuna. El pH de la composición de preferencia está entre 6 y 7. El pH se puede mantener mediante el uso de una solución reguladora. La composición puede ser estéril . Las vacunas de conformidad con la presente invención pueden ser profilácticas (i.e., para prevenir infecciones) o terapéuticas (i.e., para el tratamiento de infecciones), pero típicamente serán profilácticas. La presente invención también proporciona una composición para utilizarse como medicamento. El medicamento de preferencia es capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero (i.e., es una composición inmunogénica) y más preferiblemente es una vacuna. La presente invención también proporciona el uso de una composición en la manufactura de un medicamento, para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero. El medicamento de preferencia es una vacuna. La presente invención también proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de una composición de la presente invención. La respuesta inmunitaria de preferencia es protectora. El método puede inducir una respuesta de refuerzo. El mamífero de preferencia es un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano de preferencia es un niño (e.g., un bebé o un niño pequeño); cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano de preferencia es un adulto. Una vacuna que se pretende para niños también puede ser administrada a adultos, e.g., para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc. Estos usos y métodos de preferencia son para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por una Neisseria (e.g., meningitis, septicemia, gonorrea, etc.). La prevención y/o tratamiento de la meningitis bacteriana es el preferido . Otros componentes de la composición La composición de la presente invención típicamente tendrá, además de los componentes anteriormente mencionados, uno o más "vehículos farmacéuticamente aceptables" , los cuales incluyen cualquier vehículo que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados típicamente son macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, trehalosa (Publicación Internacional de Patente WO00/56365) y agregados lipidíeos (tales como gotitas de aceite o liposomas) . Tales vehículos son conocidos para los técnicos en la materia. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol; etc. Adicionalmente, puede haber presentes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias reguladoras de pH y similares. Una discusión completa de los excipientes farmacéuticamente aceptables, está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences . Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva del antigeno, así como cualquier otro componente de los anteriormente mencionados, conforme sea necesario. El término "cantidad inmunológicamente efectiva" , significa que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, que es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que se está tratando, la edad, el grupo taxonómico del individuo por ser tratado [e.g., un primate no humano, un primate, etc. , la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación clínica por parte del médico y otros factores relevantes . Se espera que la cantidad caiga en un rango relativamente amplio, que puede ser determinado a través de estudios rutinarios. La dosis de tratamiento puede ser una sola dosis o un programa de dosis múltiples (e.g., incluyendo dosis de refuerzo) . La vacuna se puede administrar en conjunto con otros agentes inmunorreguladores . La vacuna se puede administrar en conjunto con otros agentes inmunorreguladores . La composición puede incluir otros adyuvantes en adición a (o en lugar de) la sal de aluminio. Los adyuvantes preferidos para mejorar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: (1) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como muramilpéptidos (véase más adelante) o paredes celulares bacterianas) , tales como por ejemplo (a) MF59™ (Publicación Internacional de Patente WO90/14837; Capítulo 10 de la referencia 13), conteniendo 5% de escualeno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% de Span 85 (opcionalmente conteniendo MTP-PE) formulado en partículas de orden inferior que las mieras utilizando un microfluidizador, (b) SAF, conteniendo 10% de escualeno, 0.4% de Tween 80, polímero L121 bloqueado con pluronic al 5% y thr-MDP, ya sea mícrofluidizado en una emulsión de orden inferior que mieras, o bien mezclado en vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor y (c) el sistema adyuvante Ribi™ (SAR) , (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) conteniendo 2% de escualeno, 0.2% de Tween 80 y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforil lípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (DMT) y esqueleto de pared celular (EPC) , de preferencia MPL + EPC (Detox™) ; (2) se pueden utilizar adyuvantes de saponina tales como QS21 o Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de ellos tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes) , en donde los ISCOMS pueden estar desprovistos de detergente adicional, e.g. , Publicación Internacional de Patente WO00/07621; (3) Adyuvante Completo de Freund (ACF) y Adyuvante Incompleto de Freund (AIF) ; (4) citocinas, tales como interleucinas [e.g. , IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (Publicación Internacional de Patente W099/44636) , etc.), interferones {e.g., interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (FEC-M) , factor de necrosis tumoral (FNT) , etc. ; (5) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) , e.g., Patente Británica GB-2220221, Patente Europea EP-A-0689454 ; (6) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua, e.g. , Patentes Europeas EP-A-0835318 , EP-A-0735898 , EP-A-0761231; (7) oligonucleótidos que comprenden porciones CpG [Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3: 15-24; Román et al., Nat. 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Immunol., 1998, 160, 5898-5906; Publicaciones Internacionales de Patente WO96/02555, W098/16247, WO98/18810, WO98/40100, W098/55495, W098/37919 y W098/52581] i.e., que contienen cuando menos un dinucleótido CG, con 5-metilcitosina opcionalmente utilizada en lugar de citosina; (8) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno, e.g., Publicación Internacional de Patente W099/52549; (9) un tensoactivo de éster de polioxietilén sorbitán en combinación con un octoxinol (e.g., Publicación Internacional de Patente WOOl/21207) ó un tensoactivo de éter de polioxietilenalquilo o éster de polioxietilenalquilo en combinación con cuando menos un tensoactivo no iónico adicional tal como octoxinol (e.g., Publicación Internacional de Patente WOOl/21152) ; (10) un oligonucleótido inmunoestimulante (e.g'., un oligonucleótido CpG) y una saponina e.g., Publicación Internacional de Patente WO00/62800; (11) un inmunoestimulante y una sal metálica en partículas, e.g., Publicación Internacional de Patente WO00/23105; (12) una saponina y una emulsión de aceite en agua, e.g., Publicación Internacional de Patente W099/11241; (13) una saponina (e.g., QS21) + 3d PL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) , e.g., Publicación Internacional de Patente W098/57659; (14) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición . Los muramilpéptidos incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' , 2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina ( TP-PE) , etc. Otros antígenos Otros antígenos que se pueden incluir en la composición de la presente invención incluyen: una preparación de vesículas de membrana externa (VME) de N. meningitidis serogrupo B, tales como las descritas en las referencias 14, 15, 16, 17, etc., un antígeno sacárido de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacárido descrito en la referencia 18 del serogrupo C [véase también la referencia 19] ó los oligosacáridos de la referencia 20, un antigeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [e.g., referencias 21, 22, 23], un antígeno de protelna de elicohacter pylori tal como CagA [e.g., 24], VacA [e.g., 24], NAP [e.g., 25], HopX [e.g., 26], HopY [e.g., 26] y/o ureasa, un antigeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [e.g. , 27,28], un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como el antígeno de superficie y/o el antígeno principal [e.g., 28, 29], un antígeno del virus de la hepatitis C [e.g., 30], un antígeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (HAF) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [e.g. , referencias 31 y 32] , un antígeno diftérico, tal como un toxoide diftérico [e.g., capítulo 3 de la referencia 33] e.g., la mutante CRMi97 [e.g., 34], un antxgeno tetánico, tal como el toxoide tetánico [e.g., capítulo 4 de la referencia 33], un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [e.g., 19] , un antígeno de N. gonorrhoeae [e.g., 3, 4, 5], un antígeno de Chlamydia pneumoniae [e.g., 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41], un antígeno de Chlamydia trachomatís [e.g., 42], un antígeno de Porphyromonas gíngivalis [e.g. , 43] , un antígeno o antígenos del virus de la polio [e.g., 44, 45] tales como IPV u OPV, un antígeno o antígenos del virus de la rabia [e.g., 46] tales como el virus inactivado liofilizado [e.g., 47, RabAvert™] , antígenos de los virus del sarampión, parotiditis y/o rubela [e.g., capítulos 9, 10 y 11 de la referencia 33] , un antígeno o antígenos del virus de la influenza [e.g., capítulo 19 de la referencia 33], tal como las proteínas hemaglutinina y/o neuraminidasa superficial, un antígeno de Moraxella catarrhalis [e.g., 48], un antígeno proteico de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [e.g., 49, 50] , un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [e.g., 50, 51, 52], un antígeno de Staphylococcus aureus [e.g., 53] . La composición puede comprender uno o más de estos antigenos adicionales . Cuando se utiliza un antígeno sacárido o carbohidrato, de preferencia se conjuga con una proteína de vehículo con el fin de mejorar la inmunogenicidad [e.g., referencias 54 a 63] . Las proteínas de vehículo preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como los toxoides diftérico o tetánico. El toxoide diftérico CRM197 es particularmente preferido. Otras proteínas de vehículo adecuadas incluyen la proteína de membrana externa de N. meningitidís [e.g., referencia 64], péptidos sintéticos [e.g., 65, 66], proteínas de choque térmico [e.g., 67], proteínas de pertussís [e.g., 68, 69], proteína D de H. influenzae [e.g., 70], toxina A o B de C difficile [e.g., 71] , etc. Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de los serogrupos A y C, se prefiere que la relación (p/p) del sacárido MenA: sacárido MenC sea mayor que 1 (e.g., 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ó mayor). Se pueden conjugar sacáridos de diferentes serogrupos de N. meningitidís con la misma o con diferentes proteínas de vehículo. Se puede utilizar cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier ligador adecuado cuando sea necesario . Los antigenos de proteínas tóxicas se pueden detoxificar cuando sea necesario {e.g., detoxificación de la toxina pertussis por medios químicos y/o genéticos [32] ) . Cuando se incluye un antígeno diftérico en la composición, se prefiere también incluir el antígeno tetánico y el antígeno pertussis . De manera similar, cuando se incluye un antígeno tetánico se prefiere también incluir el antígeno diftérico y el pertussis. De modo similar, cuando se incluye un antígeno pertussis se prefiere también incluir el antígeno diftérico y el tetánico. Los antígenos de preferencia se mezclan con (y más preferibles se adsorben a) una sal de aluminio {e.g., fosfato, hidróxido, hidroxifosfato, oxihidróxido , ortofosfato, sulfato) . La sal puede tener cualquier forma adecuada (e.g., gel, cristalina, amorfa, etc.) . Los antígenos en la composición típicamente estarán presentes a una concentración de cuando menos 1 µg/mL cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para inducir una respuesta inmunitaria contra ese antígeno. Como alternativa al uso de proteínas antigénicas en la composición de la presente invención, se puede utilizar un ácido nucleico que califica para el antígeno [e.g., referencias 72 a 80] . Los componentes proteicos de las composiciones de la presente invención, entonces, pueden ser reemplazados por ácidos nucleicos (de preferencia ADN, e.g., en la forma de un plásmido) que codifican para las proteínas. Definiciones El término "que comprende" significa "que incluye" asi como "que consiste de" e.g. , una composición que "comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, e.g., X + Y. El término "aproximadamente" con relación al valor numérico x, significa por ejemplo + 10%. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una alineación de veintitrés secuencias de la proteina 741. Éstas son las SEQ IDs Nos. 1 a 22 más la secuencia de MC58. La Figura 2 muestra una alineación de la secuencia NMB1343 de gonococo (parte superior; SEQ ID No . 25) y de meningococo (parte inferior; SEQ ID No. 26) . La Figura 3 muestra proteínas híbridas y en tándem de la invención. La Figura 4 muestra 9 dominios dentro de la proteína 9612996 y la Figura 5 muestra cómo estos han sido manipulados . MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Proteínas híbridas - ¾ = ÁG287 En adición a aquellas descritas en las referencias 1 y 2, se construyeron siete proteínas híbridas con AG287 de la cepa 2996 en el extremo N-terminal. También se prepararon ocho proteínas en tándem de la proteína 287 (véase más adelante) . TABLA 4 Estas proteínas fueron mezcladas con adyuvante completo de Freund (ACF) o con 3 mg/mL de alumbre y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros resultantes se probaron contra varias cepas de Neisseria utilizando el ensayo bactericida. Los títulos utilizando la proteína #3 fueron los siguientes: TABLA 5 otros experimentos utilizando la proteína mezclada con adyuvante de hidróxido de aluminio, los títulos de anticuerpos anti-287 y anti-741 por ELISA excedieron el valor de 984150 y los títulos de BCA fueron los siguientes: TABLA 6 Los resultados obtenidos después de la inmunización con proteínas descritas en las referencias 1 y 2, probadas contra la cepa homologa, fueron los siguientes: TABLA 7 Proteínas híbridas -¾ = 961c ó 961cL Además de aquellas descritas en las referencias 1 y 2, se construyeron 8 proteínas híbridas con las proteínas 961c ó 961cL (i.e., 961c + el péptido líder) en el extremo N-terminal : TABLA 8 Estas proteínas fueron auxiliadas con el adyuvante completo de Freund (ACF) o con 3.3 mg/mL de alumbre y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros resultantes se probaron contra varias cepas de Neisseria utilizando el ensayo bactericida. Los títulos usando la proteína #8 fueron los siguientes: TABLA 9 Cepa<serogrupo> 2996 (B) C58<B 394/98 (B> 44/76(B> F6124(A> Hidróxido de Al 8192 8192 512 1024 <16 ACF 65536 16384 >2048 >2048 8192 Los títulos obtenidos después de una inmunización con la proteina híbrida 961c-741 [referencias 1 y 2] fueron los siguientes: TABLA 10 Estos resultados se podían mejorar al mezclar 961c-741 con ORF46.1 ó con AG287-919. Los resultados obtenidos después de la inmunización con las proteínas descritas en las referencias 1 y 2, probadas contra la cepa homologa, fueron los siguientes: TABLA 11 Proteínas híbridas - X2 = ORF46.1 Además de aquellas descritas en las referencias 1 y 2, se construyeron dos proteínas híbridas con ORF46.1 en el extremo N-terminal : TABLA 12 Estas proteínas fueron auxiliadas con el adyuvante completo de Freund (ACF) o con 3 mg/mL de alumbre y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros resultantes se probaron contra la cepa homologa utilizando el ensayo bactericida y por ELISA. Los resultados obtenidos después de la inmunización con las proteínas descritas en las referencias 1 y 2 fueron los siguientes: TABLA 13 Proteínas híbridas - X±- = 230 Además de aquellas descritas en las referencias 1 y 2, se construyeron cuatro proteínas híbridas con la proteína 230 en el extremo N-terminal : TABLA 1 Proteínas híbridas - ¾ = 936 Además de aquellas descritas en las referencias 1 y 2, se construyeron siete proteínas híbridas con la proteína 936 en el extremo N-terminal: TABLA 15 Estas proteínas fueron auxiliadas con el adyuvante completo de Freund (ACF) o con 3 mg/mL de alumbre y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros resultantes se probaron contra varias cepas de Neíssería utilizando el ensayo bactericida. Los títulos utilizando la proteina #2 fueron los siguientes: TABLA 16 Los títulos utilizando la proteína #7 fueron los siguientes : TABLA 18 Los resultados obtenidos después de la inmunización con proteínas descritas en las referencias 1 y 2 , probadas contra la cepa homologa, fueron los siguientes: TABLA 19 inmunizaron ratones con tres proteínas auxiliadas con el adyuvante hidróxido de aluminio, ya sea por sí solas o bien, en una combinación triple: (1) 287NZ-953; (2) 936-741; y (3) 961c. La mezcla fue capaz de inducir altos títulos bactericidas contra varias cepas: TABLA 20 indica que esta cepa no contiene el gen NadA (X) fue una combinación de la proteína 287 con vesículas de la membrana externa, para comparación. Considerando ratones individuales, la mezcla indujo títulos altos y consistentes bactericidas: TABLA 21 Proteínas en tándem Las proteínas híbridas de la presente invención pueden ser representadas por la Fórmula N¾- [-X-L-] n-COOH . Cuando todas las n veces que se presenta -X- es la misma proteína básica (ya sea idéntica, o la misma proteína proveniente de diferentes cepas o especies) , la proteína se denomina como una proteína "en tándem". Doce proteínas en tándem específicas son: TABLA 22 # n Xi Li x2 L2 1 2 AG7 1MC58 - 741MC58 (His)6 2 2 AG2.8 2996 (Gly)6 AG287394/98 (His)6 3 2 AG2872996 (Gly)6 ÁG2872996 (His)6 4 2 AG28739 98 (Gly)5 AG28739 /98 (His)6 5 2 ÁG287394/98 (Gly)6 AG2872996 (His)6 6 2 AG2872996 (Gly)6 AG287394/98 - 7 2 AG2872996 (Gly)6 ?T2872996 - 8 2 AG287394/98 (Gly)6 AG28739 /98 - 9 2 AG287394/98 (Gly)6 AG2872996 - 10 2 AG287MC58 741394/98 (His) 6 11 2 ÁG287MC58 74190/18311 (His)6 12 2 ÁG287MC58 _ 7 1g5N 77 (His)6 Las proteínas #1 a #5 se han expresado en forma soluble en E. coli. Los niveles de expresión estuvieron entre 0.24 y 0.50 rr.g de proteína por litro de cultivo. Las proteínas en tándem se purificaron y se mezclaron con fosfato de aluminio como adyuvante. Las proteínas en tándem #2, #4 y #5 se adsorbieron fácilmente al fosfato de aluminio; la adsorción fue menos completa para las proteínas en tándem #1 y #3. Variantes alélicas - 741 Se encontraron veintidós secuencias polimórficas de la proteína 741 (SEQ IDs Nos. 1 a 22) . Éstas y la secuencia de la proteína MC58 están alineadas en la Figura 1. Variantes alélicas - NMB1343 Utilizando una Reacción en Cadena catalizada con Polimerasa (RCP) en 42 cepas de meningococos de varios serogrupos, se encontró el gen que codifica para la proteína NMB1343 en 24/42 y estuvo ausente en 18/42 cepas (Tabla 1) . El gen NMB1343 fue secuenciado para 10 de las cepas NMB1343"1" (Tabla 28, columna 3). La secuencia de ácidos nucleicos (y por lo tanto la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 23; GenBank AAF41718) fue idéntica en las 10 cepas. La NMB1343 también se detectó en dos cepas de ?7. gonorrhoeae (F62 y SN4) . La secuencia de aminoácidos del gonococo es la SEQ ID No. 24. Una alineación con la secuencia meningocóccica es: . , . .60 . . . .70 . . . .80 . . . .90 . . . 100 . . . 110 . . . 120 . . . 130 . . . 140 . . . 150 Una alineación de las correspondientes secuencias de nucleótidos se muestra en la Figura 2. Esto muestra que la secuencia gonocóccica tiene una inserción 4mer en la región 5' del gen NMB1343, que causa un cambio de estructura y en consecuencia la pérdida del residuo metionina en 5' . Deleción de dominio - proteína. 961 La proteina 961 no está presente en la secuencia genómica de N. meningitidis serogrupo A [81], aún cuando las regiones que la rodean estén conservada (>90%) entre los serogrupos A y B. Las referencias 11 y 12 describen forman polimórficas de la proteina 961. El gen se encontró que estaba presente en el 91% de las cepas del serogrupo B que pertenecían a las líneas hipervirulentas ET-5, ET-37 y grupo A4, pero estuvo ausente en todas las cepas de la línea 3 probadas . Gran parte de las cepas del serogrupo C probadas fueron positivas incluso si no pertenecían a las líneas hipervirulentas . Se encontró lo mismo para las cepas del serogrupo B con serotipo 2a y 2b. Para el serogrupo A, una cepa que pertenecía al serogrupo III fue positiva, mientras que las otras dos cepas que pertenecían al subgrupo IV-1 fueron negativas. La proteína 961. estuvo ausente en N. gonorrhoeae y en especies comensales N. lactamica y N. cinére . Las Figuras 4 y 5 muestran los dominios de la proteína 961. Cuando la región de ancla (dominio 9) de la proteína 961 es eliminada ("961cL") y se expresa en E. coli, la proteína es exportada hacia el periplasma y secretada en el sobrenadante del cultivo. Para investigar esto adicionalmente, se construyeron mutantes por delecion en la región C-terminal de la proteína 961 (961cL-Aaro, 961cL-Acc, 961aL, 961aL-Al, 961aL-A2, 961aL-A3) sobre la base de las características estructurales (deleciones de residuos aromáticos en los casos de la mutante 961cAaro y regiones superenrolladas para las otras) . Éstas fueron analizadas con respecto a su expresión y secreción en el periplasma y el sobrenadante del cultivo. En todas estas mutantes por delecion, la proteína es producida en una gran cantidad, está presente en la fracción periplásmica y se libera al sobrenadante del cultivo. AG287 - actividad bactericida de cepas cruzadas La proteina 287 se clonó con cinco diferentes cepas de N. meningitidís del serogrupo B y se manipuló para eliminar el extremo N-terminal hasta terminar la región poliglicina e introducir una marca His C-terminal. Esto produjo cinco proteínas AG287. Éstas fueron auxiliadas con ACF y se utilizaron para inducir un suero inmune en ratones, las cuales posteriores se probaron con respecto a su actividad bactericida contra las cinco cepas del serogrupo B y también contra cepas del serogrupo A y del C. Los títulos bactericidas fueron los siguientes: TABLA 23 * Los títulos contra la cepa homologa se muestran en letra negrilla .

Reconformación Para mejorar los niveles de proteina soluble para algunas proteínas híbridas, se adoptaron protocolos de reconformación alternativos a aquellos descritos en la referencia 2. Se aislaron cuerpos de inclusión (CI) de la siguiente manera : 1. Se homogeneizaron células (5 g peso húmedo) en 25 mL de Tris-HCl 0.1 M, pH 7, AEDT 1 mM a 4°C, utilizando un aparato ultraturrax (10,000 rpm) . 2. Se agregaron 1.5 mg de lisozima por gramo de células, se mezcló brevemente con el ultraturrax y se incubó a 4°C durante 30 minutos. 3. Se utilizó sonicación u homogeneización a alta presión (prensa francesa) para romper las células. . Para digerir el ADN, se agregó MgCl2 hasta una concentración final de 3 mM y DNAsa hasta una concentración final de 10 µg/mL y se incubó durante 30 minutos a 25 °C. 5. Se agregaron 0.5 volúmenes de AEDT 60 mM, Tritón X100 al 6%, NaCl 1.5 M, pH 7, a la solución y se incubó durante 30 minutos a 4°C. 6. Se centrifugaron los cuerpos de inclusión a 31,000 g (20,000 rpm) durante 10 minutos a 4°C. 7. La pella se resuspendió en 40 mL de Tris-HCl 0.1 M, pH 7, AEDT 20 mM, utilizando un ultraturrax. 8. Se repitió la centrifugación del paso 6. 9. La pella de cuerpos de inclusión se puede utilizar almacenar congelada a -20 °C. Se expresaron proteínas híbridas en E. coli de guíente manera: TABLA 24 Las pellas se disolvieron, se reconfortaron, se ultrafiltraron, se dializaron y la proteína después se purificó : Los CI de ORF46.1-961-His se disolvieron de la siguiente manera: las proteínas CI se resuspendieron en 4 mL de solución reguladora de guanidina-HCl 6 M, AEDT 1 mM, pH 8.5, hasta una concentración final de proteína de 1 mg/mL. Para reconformar la proteína, se diluyeron 2 mL de proteína solubilizada en 400 mL de solución reguladora de reconformación (Tris-HCl 0.1 M, L-arginina 1 M, AEDT 2 mM, pH 8.2) y se incubó durante 1 hora a 15°C, dando como resultado una concentración de proteína de 5 µg/mL. Subsecuentemente, se agregaron otros 2 mL de proteína solubilizada y se incubaron durante una hora adicional a la misma temperatura, dando como resultado una concentración final de proteína de 10 µg mL. El material se ultrafiltró utilizando una celda de ultrafiltración Amicon de 300 mL (8400) , aplicando una presión de 3 bares sobre una membrana Amicon con un corte de 30 kDa (YM30) , obteniéndose 130 mL de volumen inal. El material ultrafiltrado se dializó utilizando una membrana tubular de celulosa regenerada con un valor de corte de 12 a 14 kDa (Cellusep - Step bio) durante 24 horas, contra 10 L de solución reguladora Tris-HCl 0.1 M, pH 8.2. Se realizó una segunda diálisis de 24 horas contra 10 L de NaCl 300 M, solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0. El material dializado se centrifugó a 22,000 rpm durante 45 minutos a 4°C, en una centrífuga Beckman con rotor JA25.5. El sobrenadante aislado después de la centrifugación se utilizó para la purificación His-tag. Se disolvieron CI de orf 6. l-961c-His de la siguiente manera: Las proteínas CI se resuspendxeron en 4 mL de solución reguladora de guanidina-HCl 6 M, AEDT 1 mM, pH 8.5, hasta una concentración final de proteína de 1 mg/mL. Para reconformar la proteína, se diluyeron 2 mL de proteína solubilizada en 400 mL de solución reguladora de reconformación (Tris-HCl 0.5 M, L-arginina 1 M, AEDT 2 mM, pH 8.2) y se incubó durante 1 hora a 15°C, dando como resultado una concentración de proteína de 5 µg/mL. Subsecuentemente, se agregaron otros 2 mL de proteina solubilizada y se incubaron durante una hora adicional a la misma temperatura, dando como resultado una concentración final de proteina de 10 µg/mL. El material se ultrafiltró utilizando una celda de ultrafiltración Amicon de 300 mL (8400) , aplicando una presión de 3 bares sobre una membrana Amicon con un valor de corte de 30 kDa (YM30) , obteniéndose 150 mL de volumen final. El material ultrafiltrado se dializó utilizando una membrana tubular de celulosa regenerada con un valor de corte de 12 a 14 kDa (Cellusep - Step bio) durante 24 horas, contra 10 L de solución reguladora Tris-HCl 0.1 M, pH 8.2. Se realizó una segunda diálisis de 24 horas contra 10 L de NaCl 300 mM, solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0. El material dializado se centrifugó a 22,000 rpm durante 45 minutos a 4°C, en una centrífuga Beckman con rotor JA25.5. El sobrenadante aislado después de la centrifugación se utilizó para la purificación His-tag. Los CI de 961c-orf46.1-His se solubilizaron de la siguiente manera: Las proteínas CI se resuspendieron en 4 mL de solución reguladora de guanidina-HCl 5 M, AEDT 1 mM, pH 8.5, hasta una concentración final de proteína de 1 mg/mL.

Para reconformar la proteina, se diluyeron 2 mL de la proteína solubilizada en 400 mL de solución reguladora de reconformación (Tris-HGl 0.1 M, L-arginina 0.5 M, AEDT 2 mM, pH 8.2) y se incubó durante 1 hora a 15 °C, dando como resultado una concentración de proteina de 5 µg/mL. Subsecuentemente, se agregaron otros 2 mL de proteína solubilizada y se incubaron durante una hora adicional a la misma temperatura, dando como resultado una concentración final de proteína de 10 µg/mL. El material se ultrafiltró utilizando una celda de ultra iltración Amicon de 300 mL (8400) , aplicando una presión de 3 bares sobre una membrana Amicon con un valor de corte de 30 kDa (YM30) , obteniéndose 150 mL de volumen final. El material ultrafiltrado se dializó utilizando una membrana tubular de celulosa regenerada con un valor de corte de 12 a 14 kDa (Cellusep -Step bio) durante 24 horas, contra 10 L de solución reguladora Tris-HCl 0.1 M, pH 8.2. Se realizó una segunda diálisis de 24 horas contra 10 L de NaCl 300 mM, solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0. El material dializado se centrifugó a 22,000 rpm durante 45 minutos a 4°C, en una centrífuga Beckman con rotor JA25.5. El sobrenadante aislado después de la centrifugación se utilizó para la purificación His-tag. Se solubilizaron CI de orf46.1-741-His de la siguiente manera : Las proteínas CI se resuspendieron en 4 mL de solución reguladora de guanidina-HCl 6 M, AEDT 1 mM, pH 8.5, hasta una concentración final de proteína de. 10 rag/mL. Para reconformar la proteína, se diluyeron 2 mL de la proteína solubilizada en 400 mL de solución reguladora de reconformación (Tris-HCl 0.5 M, L-arginina 0.7 M, AEDT 2 mM, pH 7.2) y se incubó durante 1 hora a 15°C, dando como resultado una concentración de proteína de 50 µg/mL·. Subsecuentemente, se agregaron otros 2 mL de proteína solubilizada y se incubaron durante una hora adicional a la misma temperatura, dando como resultado una concentración final de proteína de 100 g/mL. El material se ultrafiltró utilizando una celda de ultrafiltración Amicon de 300 mL (8400) , aplicando una presión de 3 bares sobre una membrana Amicon con un valor de corte de 30 kDa (YM30) , obteniéndose 120 mL de volumen final. El material ultrafiltrado se dializó utilizando una membrana tubular de celulosa regenerada con un valor de corte de 12 a 14 kDa (Cellusep -Step bio) durante 24 horas, contra 10 L de solución reguladora Tris-HCl 0.1 M, pH 8.2. Se realizó una segunda diálisis de 24 horas contra 10 L de NaCl 300 mM, solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, pH 8.0. El material dializado se centrifugó a 22,000 rpm durante 45 minutos a 4°C, en una centrífuga Beckman con rotor JA25.5. El sobrenadante aislado después de la centrifugación se utilizó para la purificación His-tag.

En comparación con las proteínas purificadas de la manera descrita en la referencia 2, los títulos de ensayos bactericidas fueron los siguientes: TABLA 25 Se utilizaron procedimientos similares a los de ORF46.1, para purificar la proteína de CI cuando se expresó sin marca His ("ORF46.1K") : TABLA 26 Las proteínas CI se resuspendieron en 4 mL de solución reguladora de guanidina-HCl 6 M, AEDT 1 mM, pH 8.5, hasta una concentración final de proteína de 10 mg/mL. Para reconformar la proteína, se diluyeron 2 mL de la proteína solubilizada en 400 mL de solución reguladora de reconformación (Tris-HCl 0.5 M, L-arginina 0.7 M, AEDT 2 mM, pH 7.2) y se incubó durante 1 hora a 15°C, dando como resultado una concentración de proteína de 50 µg/mL. Subsecuentemente, se agregaron otros 2 mL de la proteína solubilizada y se incubaron durante una hora adicional a la misma temperatura, dando como resultado una concentración final de proteína de 100 µg/mL. El material se ultrafiltró utilizando una celda de ultrafiltración Amicon de 300 mL (8400) , aplicando una presión de 3 bares sobre una membrana Amicon con un valor de corte de 30 kDa (YM30) , obteniéndose 120 mL de volumen final. El material ultrafiltrado se dializó utilizando una membrana tubular de celulosa regenerada con un valor de corte de 12 a 14 kDa (Cellusep -Step bio) durante 24 horas, contra 10 L de solución reguladora Tris-HCl 0.1 M, pH 8.2. Se realizó una segunda diálisis de 24 horas contra 10 L de la misma solución reguladora. El material dializado se centrifugó a 22,000 rpm durante 45 minutos a 4°C, en una centrífuga Beckman con rotor JA25.5. El sobrenadante aislado después de la centrifugación se utilizó para realizar una cromatografía de intercambio catiónico. La purificación se realizó en un sistema de cromatografía de exploración AKTA Amersham-Pharmacia Biotech) utilizando una columna HiTrap SP shepharose HP de 5 mL (Amersham-Pharmacia Biotech) . La velocidad de flujo aplicada fue de 1.5 mL por minuto. La columna se lavó con 35 mL de solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2. Se ejecutó un gradiente lineal (NaCl de 0 a 1 M) utilizando solución reguladora de fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2. La proteina eluyó en dos picos a 92 mM y 380 mM de NaCl. Las fracciones que constituían cada pico se mezclaron y respectivamente se denominaron combinado 1 y combinado 2. En comparación con proteínas purificadas de la manera descrita en la referencia 2, los títulos de ensayo bactericida cuando se auxiliaron con adyuvante de hidróxido de aluminio se mejoraron de <4 a 1024. El título utilizando adyuvante de fosfato de aluminio con la proteína reconformada, fue de 2048. Los títulos de ELISA fueron los siguientes : TABLA 27 Deberá entenderse que la invención ha sido descrita únicamente por medio de ejemplos y se pueden realizar modificaciones quedando dentro de los alcances y el espíritu la invención. TABLA 28 Cepa 1343 Secuencia Clasificación de la cepa 72/00 + ET5 B:15:Pl.7,13,13a 30/00 + ET5 B:15:P1.7,16 39/99 + ET5 C:15:P1.7,16 95330 + ET5 B:4:P1.15 M4102 + ET5 nd MC58 (21) + + ET5 B:15:Pl.7,16b BZ16 (7) + + ET5 B:NT:P1.16 BZ83 (19) + ET5 B:15:-.- CU385 + + ET5 B:4:P1.15 2201731 + ET5 NG:4:P1.15 64/96 + + ET5 NG:15:P1.7,16 (vehículo) 2201731 + ET5 B:4:pl.l5 (vehículo) ISS1071 + nd B:15:pl.7,16 (ET5?) BZ198 (2) + + lin.3 B:8:pl.l 980-2543 + + lin.3 B:8:P1.4 16060 + + otro B:4:P1.14 (vehículo) 394-98 + nd B:4:P1.4 (lin 3?) ISS1106 + nd B:4:P1.4 (lin 3?) BZ133 (10) sub I B : T : - . - S3446 nd B:14:P1.23,14 ISS1001 nd B:14:P1.13 2411751 otro NG:21:P1.16 (vehículo) 1712741 otro NG:15:- (vehículo) 56/96 otro B:17:P1.15 (vehículo) 961-5945 A4 96217 A4 312294 ?4 90/18311 (24) ET37 93/4286 (25) ET37 M986 ET37 1000 (5) otro NGE28 (13) otro vehículo NGH38 (14) otro vehículo BZ232 (18) otro F6124 (23) sub III A: - . - Cll C:- NMB nd 8047 nd ISS759 nd C:2b:Pl.2 ISS1113 nd C:2:P1.5 65/96 nd 4:P1.14 2996 (96) nd B:2b:P1.5,2 REFERENCIAS (el contenido de las mismas se incorpora en su totalidad como referencia) . 1 - Solicitud Internacional de Patente WOOl/64920. 2 - Solicitud Internacional de Patente WO01/64922. 3 - Solicitud Internacional de Patente W099/24578. 4 - Solicitud Internacional de Patente W099/36544. 5 - Solicitud Internacional de Patente W099/57280. 6 - Solicitud Internacional de Patente WO22430. 7 - Tettelin et al. 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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una proteína híbrida de la Fórmula: NH2-A- [-X-L-] n-B-COOH caracterizada porgue L es una secuencia de aminoácidos ligadora opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C~ terminal opcional y n es un número entero mayor de 1, y X es ya sea: (a) una secuencia de aminoácidos de orfl, orf4, orf25, orf40, orf46.1, orf83, NMB1343 , 230, 233, 287, 292, 594, 687, 736, 741, 907, 919, 936, 953, 961 Ó 983 ; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos del inciso (a) ; o bien, (c) una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento de una secuencia de aminoácidos del inciso (a) .

2. Una proteína híbrida de la Fórmula: NH2-A- [-X-L-] ,-B-COOH caracterizada porque X es una secuencia de aminoácidos, L es una secuencia de aminoácidos ligadora opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional, n es un número entero mayor de 1, y en donde una primera porción X (-Xa-) tiene una de las siguientes secuencias de aminoácidos : (d) las 446 SEQ IDs uniformes (í.e., 2, 4, 6, 890, 892) descritas en la referencia 3 ; (e) las 45 SEQ IDs uniformes (i.e., 2, 4, 6, 88, 90) descritas en la referencia 4 ; (f) las 1674 SEQ IDs uniformes 2-3020, SEQ IDs uniformes 3040-3114 y todas las SEQ IDs 3115-3241, descritas en la referencia 5 ; (g) las 2160 secuencias de aminoácidos NMB0001 a NMB2160 de la referencia 7; ó (h) una secuencia de aminoácidos descrita en la referencia 1 ó en la referencia 2, y una segunda porción -X- (-Xi>-), en donde -Xb- tiene una identidad de secuencia con -Xa- y/o - b~ comprende un fragmento de -Xa- .

3. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque n = 2.

4. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque -Xa- es una secuencia de aminoácidos de orf46.1, 230, 287, 741, 919, 936, 953 , 961 ó 983.

5. La proteína híbrida de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque Xl7 Xn tienen una identidad de secuencia unos con los otros .

6. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque n = 2 y en donde las porciones -X-son: AG287 y 230; ÁG287 y 936; AG287 y 741; 961c y 287; 961c y 230; 961c y 936; 961cL y 287; 961cL y 230; 961cL y 936; ORF46.1 y 936; ORF46.1 y 230 ; 230 y 961; 230 y 741; 936 y 961; 96 y 741; AG741 y 741; ó AG287 y 287.

7. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque L tiene 20 6 menos aminoácidos.

8. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque L es un ligador de poliglicina.

9. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque A tiene 40 ó menos aminoácidos.

10. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque B tiene 40 ó menos aminoácidos.

11. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque las porciones -X- tienen una secuencia de aminoácidos encontrada en N. meningitidis serogrupo B.

12. La proteína híbrida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque cuando menos una porción -X- es una secuencia de aminoácidos de la proteína 961 en la cual uno o más dominios han sido eliminados.

13. Una proteína caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SEQ IDs Nos. 1 a 38.

14. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica para una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

15. Una composición caracterizada porque comprende una proteína o ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

16. Una composición caracterizada porque comprende dos o más de las siguientes proteínas: (1) 287 (2) 741 (3) O F46.1 (4) 961 (5) NH2-A- [ -X-L- ] fl-B-COOH, en donde n = 2, Xx = 287, X2 = 953 (6) NH2-A~ [-X -L-] n-B-COOH, en donde n = 2, Xx = 287, X2 = 919 (7) NH2-A- [-X -L-] a-B-COOH, en donde n = 2, Xa = 287, X2 = 961 (8) NH2-A- [-X -L-] p-?-COOH, en donde n = 2 , Xa = 287, X2 = 741 (9) NH2-A- [-X -L-] n-B-COOH, en donde n = 2, Xx = 287, X2 = 741

17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende las proteínas (4) , (5) y (9) .

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porgue la proteína (4) comprende la SEQ ID No. 31, la proteína (5) comprende la SEQ ID No. 28 ó SEQ ID No. 29 y la proteína (9) comprende la SEQ ID No . 30.

19. La composición de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizada porgue además comprende : un antígeno proteico de N. meningitidis; una preparación de vesículas de membrana externa (VME) de N. meningitidis ; un antígeno sacárido de N. meningitidis; un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae; un antígeno del virus de la hepatitis A, B o C; un antlgeno de Bordetella pertussis; un antígeno diftérico ; un antígeno tetánico ; un antígeno proteico de Helicobacter pylori; un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae ; un antígeno de N. gonorrhoeae ; un antígeno de Chlamydia pneumoniae; un antígeno de Chlamydia tracho atis ; un antlgeno de Porphyromonas gingivalis; un antígeno o antígenos del virus de la polio; un antígeno o antígenos del virus de la rabia; antlgenos de los virus del sarampión, parotiditis y/o rubela; un antígeno o antígenos del virus de la influenza; un antígeno de Moraxella catarrhalis ; un antígeno de Streptococcus agalactiae; un antígeno de Streptococcus pyogenes; y/o un antígeno de Staphylococcus aureus .

20. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada porque además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable .

21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, para utilizarse como medicamento.

22. Un método para el tratamiento de un paciente, caracterizado porque comprende administrarle al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 20.