ES2323845T3 - Secuencias genomicas de neisseria y procedimientos de uso. - Google Patents

Abstract

Una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.

Description

Secuencias genómicas de Neisseria y procedimientos de uso.

Esta invención se refiere a los procedimientos para obtener antígenos e inmunógenos, a los antígenos e inmunógenos obtenidos de esta manera, y a los ácidos nucleicos de la especie bacteriana: Neisseria meningitidis. En concreto, se refiere a las secuencias genómicas de las bacteria; más concretamente, su serogrupo "B".

Antecedentes

Neisseria meningitidis es un patógeno humano diplococo no motil gram negativo. Coloniza la faringe produciendo meningitis y, ocasionalmente, septicemia en ausencia de meningitis. Está estrechamente relacionado con N. gonorrhoea, aunque una característica que diferencia claramente meningococo de gonococo es la presencia de una cápsula polisacárida que está presente en todos los meningococos patógenos.

N. meningitidis produce enfermedades endémicas y epidémicas. En los Estados unidos la tasa de ataques es de 0,6-1 por 100.000 personas por año, y puede ser mucho mayor durante los brotes. (Véase Lieberman y col. (1996) Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children. JAMA 275(19): 1499-1503; Schuchat y col (1997) Bacterial Meningitis in the United States in 1995. N Engl J Med 337(14): 970-976). En los países en vías de desarrollo, los índices de enfermedades endémicas son mucho mayores y durante las incidencias epidémicas los índices pueden aumentar en 500 casos por 100.000 personas por año. La mortalidad es extremadamente elevada, un 10-20% en los Estados Unidos, y mucho mayor en los países en vías de desarrollo. Tras la introducción de la vacuna conjugada contra Haemophilus influenzae, N. meningitidis es la causa principal de la meningitis bacteriana a todas las edades en los Estados Unidos (Schuchat y col (1997) más arriba).

En función del polisacárido capsular del organismo, se han identificado 12 serogrupos de N. meningitidis. El grupo A es el patógeno más frecuentemente implicado en la enfermedad epidémica en el África subsahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la gran mayoría de los casos en los Estados Unidos y en los países más desarrollados. Los serogrupos W135 e Y son responsables del resto de los casos en los Estados Unidos y los países desarrollados. La vacuna meningocóccica actualmente en uso es una vacuna polisacárida tetravalente compuesta de los serogrupos A, C, Y y W135. Aunque eficaz en adolescentes y adultos, induce una mala respuesta inmune y corta duración de la protección, y no se puede usar en niños (por ejemplo, Morbidity and Mortality weekly report, Vol. 46, Nº RR-5 (1997)). Esto es debido a que los polisacáridos son antígenos independientes de las células T que inducen una respuesta inmune débil que no se puede estimular mediante inmunización repetida. Tras el éxito de la vacunación contra H. influenzae, se han desarrollado vacunas conjugadas contra los serogrupos A y C y están en la etapa final de ensayo clínico (Zollinger WD "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease". En: New Generation Vaccines, más arriba, pp. 469-488; Lieberman y col (1996) más arriba; Costantino y col (1992) Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A (menA) y C (menC) (Vaccine 10: 691-698)).

Sin embargo, el meningococo B (MenB) sigue siendo un problema. Este serotipo es responsable actualmente del 50% de meningitis total en los Estados Unidos, Europa, y Sudamérica. El enfoque del polisacárido no se puede usar debido a que el polisacárido capsular de MenB es un polímero del ácido N-acetil neuramínico \alpha(2,8)-unido que está también presente en el tejido de los mamíferos. Esto da como resultado la tolerancia al antígeno; de hecho, si se estimula una respuesta inmune, sería anti-auto, y por tanto indeseable. Con el fin de evitar la inducción de la autoinmunidad y para inducir una respuesta inmune protectora, el polisacárido capsular ha de ser, por ejemplo, modificado químicamente sustituyendo los grupos N-acetilo con grupos N-propionilo, quedando la antigenia específica inalterada (Romero y Outschoorn (1994) Current status of Meningococcal group B vaccine candidates: capsular or non-capsular? Clin Microbiol Rev 7(4): 559-575).

Las soluciones alternativas de las vacunas MenB han usado mezclas complejas de proteínas de membrana externa (OMP) que contienen tanto las OMP solas, como las OMP enriquecidas en porinas, o suprimidas las OMP de clase 4 que se cree que inducen los anticuerpos que bloquean la actividad bactericida. Esta solución produce vacunas que no están bien caracterizadas. Son capaces de proteger contra la cepa homóloga, pero no son eficazs a largo plazo cuando tienen muchas variantes antigénicas de las proteínas de membrana externa. Para superar la variabilidad antigénica, se han construido vacunas multivalentes que contienen hasta nueve porinas diferentes (por ejemplo, Poolman JT (1992) Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agentes Dis. 4:13-28. Las proteínas adicionales a usar en las vacunas de membrana externa han sido las proteínas opa y opc, pero ninguna de estas soluciones ha sido capaz de superar la variabilidad antigénica (por ejemplo, Ala'Aldeen y Boriello (1996). Las proteínas 1 y 2 de unión a la transferrina meningocócica se exponen ambas a la superficie y generan anticuerpos bactericidas capaces de matar cepas homólogas y heterólogas. Vaccine 14(1): 49-53).

Está disponible una cierta cantidad de datos de la secuencia para los genes y las proteínas meningocócicas y gonocócicas (por ejemplo, documentos EP-A-0467714, WO96/29412), pero esto no significa que estén completos. Se describe una proteína de N. meningitidis con el número de acceso X77920 del EMBL. La disposición de secuencias adicionales proporcionaría una oportunidad de identificar las proteínas segregadas o expuestas a la superficie que son presuntas dianas para el sistema inmune y que no son antigénicamente variables o al menos más antigénicamente conservadas que otras regiones más variables. De esta manera, aquellas secuencias antigénicas que están mucho más conservadas son secuencias preferidas. Aquellas secuencias específicas de Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae que están mucho más conservadas son secuencias preferidas adicionales. Por ejemplo, algunas de las proteínas identificadas serían componentes de vacunas eficaces contra el meningococo B, algunas serían componentes de vacunas contra todos los serotipos meningocócicos, y otras serían componentes de vacunas contra todas las Neisseriae patógenas. La identificación de las secuencias de las bacterias facilitará también la producción de sondas biológicas, concretamente, sondas específicas de organismos.

Es por tanto un objeto de la invención proporcionar secuencias de ADN Neisserial que (1) codifiquen proteínas predichas y/o demostradas como antigénicas o inmunogénicas, (2) se puedan usar como sondas o cebadores de amplificación, y (3) se puedan analizar mediante sistemas bioinformáticos.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras que no se refieren específicamente a la invención reivindicada son únicamente para ilustración. La Fig. 1 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 919 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 2 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 279 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 3 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 576-1 según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 4 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 519-1 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 5 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 121-1 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 6 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 128-1 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 7 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 206 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 8 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 287 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 9 ilustra los productos de expresión de la proteína y la purificación del ORF 406 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 10 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 919 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 11 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 279 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 12 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 576-1 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 13 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 519-1 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 14 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 121-1 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 15 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 128-1 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 16 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 206 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 17 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 287 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La Fig. 18 ilustra la representación gráfica de la hidrofilia, el índice antigénico y las regiones AMPHI de los productos de expresión de la proteína del ORF 406 predicho según se clonó y expresó en E. coli.

La invención

La invención proporciona una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.

La invención proporciona también una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1366680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1, cuya secuencia tiene un 95% o más de identidad con una secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.

La invención proporciona también un anticuerpo, un ácido nucleico y una composición tal como se define en las reivindicaciones.

Los aspectos de la siguiente descripción que no se refieren específicamente a la invención reivindicada se incluyen para comparación e ilustración y comparación.

La primera secuencia completa del genoma de N. meningitidis se describió como 961 secuencias parciales de nucleótidos contiguos, que se muestran como las SEC DE ID N^{os}: 1-961 del documento PCT/US99/23573 de propiedad compartida (la solicitud '573), presentado el 8 de Octubre de 1999 (que se va a publicar en Abril de 2000). Se describió también una única secuencia del genoma de longitud completa de N. meningitidis como la SEC DE ID Nº 1068 de la solicitud '573. La descripción se basa en un genoma de longitud completa de N. meningitidis que aparece como la SEC DE ID Nº: 1 en la presente solicitud como Apéndice A de la misma. Las 961 secuencias de la solicitud '573 representan sustancialmente el genoma completo del serotipo B de N. meningitidis (> 99,98%). Existe un solapamiento parcial entre algunas de las 961 secuencias contiguas ("contigs") que se muestran en las 961secuencias, cuyo solapamiento se usó para construir la secuencia única de longitud completa que se muestra en la SEC DE ID Nº 1 en el Apéndice A de la misma, usando el Ensamblador TIGR [G. S. Sutton y col., TIGR Assembler: A New Tool for Assembling Large Shotgun Sequencing Projects, Genome Science and Technology, 1: 9-19 (1995)]. Algunos de los nucleótidos en las contigs se han liberado anteriormente. (Véase ftp:11ftp.tigr.org/pub/data/n_meningitidis en la página web o "WWW"). Se presentan en el Apéndice A de la solicitud '573 las coordenadas de las 2508 secuencias liberadas en las presentes contigs. Estos datos incluyen el número de contig (o i.d.) según se presenta en la primera columna; el nombre de la secuencia que se encuentra en la WWW está en la segunda columna; con las coordenadas de las contigs en la tercera y cuarta columnas, respectivamente. Las secuencias de algunas ORF de MenB se presentan en el Apéndice B de la solicitud '573 que presenta la Solicitud de Patente Internacional presentada por Chiron SpA el 9 de Octubre de 1998 (PCT/IB98/01665) y el 14 de Enero de 1999 (PCT/IB99/00103) respectivamente. El Apéndice B de la misma proporciona un listado de 2158 marcos de lectura abiertos contenidos en el interior de la secuencia de longitud completa que se encuentra en la SEC DE ID Nº 1 en el Apéndice A de la misma. La información que se muestra en el Apéndice B de la misma incluye el nombre "NMB" de la secuencia, el presunto producto de traducción, y el comienzo y el final de las posiciones de los nucleótidos en el interior de la SEC DE ID Nº 1 que comprende los marcos de lectura abiertos. Estos marcos de lectura abiertos se refieren en el presente documento a los "marcos de lectura abiertos NMB".

En un primer aspecto, la descripción proporciona el ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en la SEC DE ID Nº 1 en el Apéndice A de la misma. Describe también el ácido nucleico que comprende las secuencias que tienen identidad de la secuencia con la secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento. Dependiendo de la secuencia concreta, el grado de identidad de la secuencia es preferiblemente mayor del 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). Estas secuencias incluyen, por ejemplo, las variantes mutantes y alélicas. El grado de identidad de la secuencia citado en el presente documento se determina a lo largo de la longitud de la secuencia determinada mediante el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman que se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de intervalo fino con los siguientes parámetros: penalización de intervalo abierto 12, penalización de extensión de intervalo 1.

La descripción proporciona también el ácido nucleico que incluye un fragmento de una o más de las secuencias de nucleótidos que se muestran en el presente documento, que incluyen los marcos de lectura abiertos NMB que se muestran en el Apéndice B del mismo. El fragmento debería comprender al menos n nucleótidos consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la secuencia concreta, n es 10 o más (por ejemplo, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 100 o más). Preferiblemente, el fragmento es único en el genoma de N. meningitidis, es decir que no está presente en el genoma de otro organismo. Más preferiblemente, el fragmento es único en el genoma de la cepa B de N. meningitidis. La descripción proporciona también el ácido nucleico que hibrida a aquellos que se proporcionan en el presente documento. Se describen en el presente documento las condiciones de hibridación.

La descripción proporciona también el ácido nucleico que incluye las secuencias complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo, para las de sentido contrario, para las sondas, o para los cebadores de la amplificación).

El ácido nucleico de acuerdo con la descripción puede, por supuesto, prepararse de muchas maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, a partir de las bibliotecas de ADN, a partir de los propios organismos, etc.) y puede tomar diversas formas (por ejemplo, de cadena única, de doble cadena, vectores, sondas, cebadores, etc.). El término "ácido nucleico" incluye el ADN y el ARN, y también sus análogos, tales como los que contienen esqueletos modificados, y también el ácido nucleico péptido (PNA) etc.

Se apreciará que, como las SEC DE ID N^{os}: 1-961 de la solicitud '573 representan el genoma sustancialmente completo del organismo, con solapamiento parcial, las referencias a las SEC DE ID N^{os}: 1-961 de la solicitud '573 incluyen en su alcance referencias a la secuencia genómica completa, esto es, la SEC DE ID Nº 1 de la misma. Por ejemplo, cuando dos SEC DE ID N^{os} se solapan, la descripción abarca la secuencia única formada por el ensamblaje de las dos secuencias solapantes, cuya secuencia completa se podrá encontrar en la la SEC DE ID Nº 1 de la misma. De esta manera, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que enlaza dos SEC DE ID N^{os} pero que no está presente en su totalidad en cualquier SEC DE ID Nº sigue estando dentro del alcance de la descripción. Dicha secuencia estará presente en su totalidad en la secuencia única de longitud completa de la SEC DE ID Nº 1 de la presente
solicitud.

La descripción proporciona también vectores que incluyen las secuencias de nucleótidos de la descripción (por ejemplo, vectores de expresión, vectores de secuenciación, vectores de clonación, etc.) y las células huésped transformadas con dichos vectores.

De acuerdo con un aspecto adicional, la descripción proporciona una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos codificada en el interior de una secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente documento. Describe también las proteínas que comprenden las secuencias que tienen identidad de la secuencia con aquellas proteínas. Dependiendo de la secuencia concreta, el grado de identidad de la secuencia es preferiblemente mayor del 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más). La identidad de la secuencia se determina como se describe anteriormente. Estas proteínas homólogas incluyen variantes mutantes y alélicas, codificadas en el interior de la secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente documento.

La descripción proporciona además proteínas que incluyen fragmentos de una secuencia de aminoácidos codificada en el interior de la secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el listado de secuencias. Los fragmentos deberían comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la secuencia concreta, n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o más). Preferiblemente, los fragmentos comprenden un epitopo procedente de la secuencia.

Las proteínas de la descripción pueden, por supuesto, prepararse de diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir del cultivo celular, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, natural, fusiones, etc.). Se preparan preferiblemente en forma sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libres de otras proteínas celulares huésped de N. meningitidis).

Se pueden usar diversos ensayos para evaluar la inmunogenia in vivo de las proteínas de la descripción. Por ejemplo, se pueden expresar las proteínas de manera recombinante o sintetizarse químicamente y usarse para seleccionar los sueros del paciente mediante inmunotransferencia. Una reacción positiva entre la proteína y el suero del paciente indica que el paciente ha articulado anteriormente una respuesta inmune a la proteína en cuestión, es decir, la proteína es un inmunógeno. Se puede usar también este procedimiento para identificar las proteínas inmunodominantes.

La descripción proporciona también un ácido nucleico que codifica una proteína de la invención.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona un ordenador, una memoria informática, un medio de almacenamiento informático (por ejemplo, un disco flexible, un disco fijo, CD-ROM, etc.), y/o una base de datos informática que contiene la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de acuerdo con la descripción. Preferiblemente, contiene una o más de las secuencias de nucleótidos de N. meningitidis que se muestran en el presente documento.

Esto se puede usar en el análisis de las secuencias de nucleótidos de N. meningitidis que se muestran en el presente documento. Por ejemplo, esto se puede usar en una búsqueda para identificar los marcos de lectura abiertos (ORF) o las secuencias de codificación en el interior de las secuencias.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona un procedimiento para identificar una secuencia de aminoácidos que comprende la etapa de buscar los presuntos marcos de lectura abiertos o las secuencias que codifican la proteína en el interior de una secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente documento. De forma similar, la descripción proporciona el uso de una secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente documento en una búsqueda de los presuntos marcos de lectura abiertos o las secuencias que codifican la proteína.

El análisis del marco de lectura abierto o la secuencia que codifica la proteína se lleva a cabo generalmente en un ordenador usando técnicas bioinformáticas estándar. Los algoritmos típicos o el programa usado en el análisis incluyen ORFFINDER (NCBI), GENMARK [Borodovsky y McIninch (1993) Computers Chem 17: 122-133], y GLIMMER [Salzberg y col. (1998) Nucl Acids Res 26: 544-548].

Una búsqueda de un marco de lectura abierto o secuencia que codifica la proteína puede comprender las etapas de buscar una secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente documento para un codón de iniciación y buscar la secuencia en la dirección 5' para un codón de terminación en el interior del marco. Los codones que intervienen representan una presunta secuencia de codificación de la proteína. Normalmente, se buscarán los seis marcos de lectura posibles de una secuencia.

Se puede expresar una secuencia de aminoácidos identificada de esta manera usando cualquier sistema adecuado para proporcionar una proteína. Se puede usar esta proteína para aumentar los anticuerpos que reconocen los epitopos en el interior de la secuencia de aminoácidos identificada. Se pueden usar estos anticuerpos para seleccionar N. meningitidis para detectar la presencia de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos identificada.

Además, una vez que se identifica un ORF o secuencia que codifica la proteína, se puede comparar la secuencia con las bases de datos de secuencias. Se pueden encontrar herramientas de análisis de secuencias en NCBI (http://www. Ncbi.nlm.nih.gov) por ejemplo, los algoritmos BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx, y tBLASTx [véase también Altschul y col. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: new Generation of protein Database search programs. Nucleic Acids Research 25: 2289-3402]. Las bases de datos adecuadas para comparación incluyen las secuencias no redundantes del GenBank, EMBL, DDBJ y PDB, y las traducciones CDS no redundantes del GenBank, secuencias PDB, SwissProt, Spupdate y PIR. Esta comparación puede proporcionar una indicación de la función de una proteína.

Se pueden predecir las regiones hidrófobas en la secuencia de aminoácidos usando algoritmos tales como los basados en los estudios estadísticos de Esposti y col. [Critical evaluation of the hydropathy of membrane proteins (1990) Eur j Biochem 190: 207-219] Las regiones hidrófobas representan potenciales regiones transmembrana o secuencias líder hidrófobas, lo que sugiere que se pueden segregar las proteínas o localizarse en la superficie. Estas propiedades son normalmente representativas de buenos inmunógenos.

De forma similar, se pueden predecir las regiones transmembrana o las secuencias líder usando el algoritmo PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp), y se pueden predecir las regiones funcionales usando el programa MOTIFS (GCG Wisconsin & PROSITE).

La descripción proporciona también un ácido nucleico que incluye un marco de lectura abierto o secuencia que codifica una proteína presente en una secuencia de nucleótidos de N. meningitidis que se muestra en el presente documento. Además, la descripción proporciona una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos codificada por este marco de lectura abierto o secuencia que codifica la proteína.

De acuerdo con un aspecto adicional, la descripción proporciona anticuerpos que se unen a estas proteínas. Estos pueden ser policlonales o monoclonales y se pueden producir mediante cualquier medio adecuado conocido por aquellas personas expertas en la técnica.

Se pueden usar los anticuerpos de la descripción en una variedad de formas, por ejemplo, para la confirmación de que se expresa una proteína, o para confirmar dónde se expresa una proteína. Se puede incubar el anticuerpo marcado (por ejemplo, marcado fluorescente para FACS) con bacterias intactas y la presencia de la marca sobre la superficie bacteriana confirma la localización de la proteína, por ejemplo.

De acuerdo con un aspecto adicional, la descripción proporciona composiciones que incluyen la proteína, el anticuerpo, y/o el ácido nucleico de acuerdo con la invención. Estas composiciones pueden ser adecuadas como vacunas, como composiciones inmunógenas, o como reactivos de diagnóstico.

La descripción proporciona también un ácido nucleico, proteína o anticuerpo de acuerdo con la descripción para uso como medicamentos (por ejemplo, como vacunas) o como reactivos de diagnóstico. Proporciona también el uso de un ácido nucleico, proteína, o anticuerpo de acuerdo con la descripción en la fabricación de (I) un medicamento para tratar o evitar la infección debida a la bacteria Neisserial (ii) un reactivo diagnóstico para detectar la presencia de la bacteria Neisserial o de los anticuerpos aumentados contra la bacteria Neisseria. Dichas bacterias Neisseriales pueden ser cualquier especie o cepa (tal como N. gonorrhoeae) pero son preferiblemente N. meningitidis, especialmente la cepa A, cepa B o cepa C.

En otro aspecto adicional más, la presente descripción proporciona composiciones que incluyen proteínas, moléculas de ácido nucleico, o anticuerpos. Los aspectos más preferibles de la presente descripción se dirigen a las composiciones inmunógenas de las proteínas. Los aspectos preferibles adicionales de la presente descripción contemplan las composiciones inmunógenas farmacéuticas de las proteínas o las vacunas y el uso de las mismas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección debida a la bacteria Neisserial, preferiblemente, la infección de MenB.

La descripción proporciona un procedimiento para tratar un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido nucleico, proteína, y/o anticuerpo de acuerdo con la invención.

De acuerdo con los aspectos adicionales, la descripción proporciona diversos procedimientos.

Se proporciona un procedimiento para producir las proteínas de la descripción, que comprende la etapa de cultivar la célula huésped de acuerdo con la descripción en condiciones que induzcan la expresión de la proteína. Un procedimiento que puede incluir además la síntesis química de las proteínas y/o la síntesis química (al menos en parte) de los nucleótidos.

Se proporciona un procedimiento para detectar los polinucleótidos de la descripción, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una sonda nucleica de acuerdo con la descripción con una muestra biológica bajo condiciones de hibridación para formar dúplex; y (b) detectar dichos dúplex.

Se proporciona un procedimiento para detectar las proteínas de la descripción, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con la descripción con una muestra biológica en las condiciones adecuadas para la formación de complejos antígeno-anticuerpo; y (b) detectar dichos complejos.

Otro aspecto de la presente descripción proporciona un procedimiento para detectar anticuerpos que se unen de manera seleccionable a los antígenos o polipéptidos o proteínas específicas de cualquier especie o cepa de bacteria Neisserial y preferiblemente a cepas de N. gonorrhoeae pero más preferiblemente a cepas de N. meningitidis, especialmente la cepa A, cepa B o cepa C, más preferiblemente MenB, en el que el procedimiento comprende las etapas de: (a) poner en contacto el antígeno o polipéptido o proteína de acuerdo con la descripción con una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de complejos antígeno-anticuerpo, y (b) detectar dichos complejos.

Habiendo ahora descrito de manera general la descripción, la misma será más fácilmente comprensible a través de referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan como ilustración.

Metodología-Resumen de los procedimientos y técnicas estándar General

Esta descripción proporciona secuencias del nucleótido MenB de Neisseria meningitidis, secuencias de aminoácidos codificadas de las anteriores. Con estas secuencias descritas, se pueden producir ensayos de sondas de ácidos nucleicos y casetes y vectores de expresión. Se pueden sintetizar también químicamente las proteínas. Se pueden transformar los vectores de expresión en las células huésped para producir proteínas. Se pueden usar polipéptidos purificados o aislados para producir anticuerpos para detectar las proteínas MenB. También, se pueden utilizar células huésped o extractos para los ensayos biológicos para aislar agonistas o antagonistas. Además, con estas secuencias se puede buscar identificar marcos de lectura abiertos e identificar secuencias de aminoácidos. Se pueden usar también las proteínas en composiciones inmunógenas y como componentes de vacunas.

La práctica de la presente descripción empleará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunobiología, que están comprendidas dentro del alcance de la persona experta en la técnica, Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y ii (D. N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer y Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Segunda Edición (Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds. 1986).

En esta memoria se usan abreviaturas estándar de nucleótidos y aminoácidos.

Sistemas de expresión

Se pueden expresar las secuencias de nucleótidos MenB de Neisseria en una variedad de diferentes sistemas de expresión; por ejemplo, aquellos usados con células de mamíferos, células de plantas, baculovirus, bacterias, y levaduras.

i Sistemas en mamíferos

Se conocen en la técnica los sistemas de expresión en mamíferos. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción en la dirección 3' (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región iniciadora de la transcripción, que se sitúa normalmente próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación, y una secuencia TATA, localizada normalmente 25-30 pares de bases (pb) en la dirección 5' del emplazamiento de iniciación de la trascripción. Se piensa que la secuencia TATA dirige la síntesis de la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el emplazamiento correcto. Un promotor de mamífero contendrá también un elemento promotor en la dirección 5', localizado normalmente a unos 100 a 200 pb en la dirección 5' de la secuencia TATA. Un elemento promotor en la dirección 5' determina la velocidad a la cual se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación (Sambrook y col. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells". En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.).

Los genes víricos en mamíferos se expresan muy a menudo y tienen un amplio intervalo de huéspedes; por tanto, las secuencias que codifican los genes víricos en mamíferos proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Los ejemplos incluyen el promotor temprano de SV40, el promotor LTR del virus del tumor mamario de ratón, promotor principal tardío del adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus del herpes simple, Además, las secuencias derivadas de los genes no víricos, tales como el gen de la metalotionenina de murino, proporcionan también secuencias de promotor útiles. La expresión puede ser tanto constitutiva como regulada (inducible). Dependiendo del promotor seleccionado, muchos promotores pueden ser inducibles usando sustratos conocidos, tales como el uso del promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) con el elemento responsable del glucocorticoide (GRE), que está inducido por el glucocorticoide en las células transformadas responsables de la hormona (véase por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.783.681).

La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos del promotor descritos anteriormente, aumentará normalmente los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia reguladora de ADN que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se une a los promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el emplazamiento normal de partida del ARN. Los potenciadores son también activos cuando se sitúan en la dirección 5' o en la dirección 3' del emplazamiento de inicio de la transcripción, en cualquier orientación normal o girada, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos del promotor (Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237; Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.). Los elementos potenciadores derivados de los virus pueden ser particularmente útiles, debido a que normalmente tienen un intervalo de huéspedes más amplio. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema y col (1985) EMBO J. 4: 761) y los potenciadores/promotores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Gorman y col. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777) y del citomegalovirus humano (Boshart y col. (1985) Cell 41: 521). Adicionalmente, algunos potenciadores son regulables y llegan a ser activos únicamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o ión metálico (Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237).

Se puede expresar intracelularmente una molécula de ADN en células de mamíferos. Se puede unir directamente una secuencia del promotor con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el término N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir el término N de la proteína mediante incubación in vitro en bromuro de cianógeno.

Alternativamente, se pueden segregar también las proteínas extrañas dese la célula a los medios de crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en las células de mamíferos. Preferiblemente, existen emplazamientos de procesamiento codificado entre el fragmento líder y el gen extraño que se pueden escindir tanto in vivo como in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica normalmente un péptido señal comprendido de aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. El líder tripartito adenovírico es un ejemplo de secuencia líder que proporciona la secreción de una proteína extraña en las células de mamíferos.

Normalmente, la terminación de la transcripción y las secuencias de poliadenilación reconocidas por las células de mamíferos son regiones reguladoras localizadas en el extremo 3' del codón de parada de la traducción y de esta manera, conjuntamente con los elementos del promotor, flanquean la secuencia de codificación. El término 3' del ARNm maduro está formado por la rotura post-transcripcional específica del emplazamiento y la poliadenilación (Birnstiel y col. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot y Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA". En Transcription and splicing (ed. B.D. Hames y D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105). Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de señales terminadoras/de poliadenilación de la transcripción incluyen aquellas derivadas de SV40 (Sambrook y col (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, la señal de poliadenilación, y la secuencia de terminación de la transcripción se ponen juntos en los constructos de expresión. Se pueden incluir también potenciadores, intrones con emplazamientos donantes y aceptores con ayustamiento funcional, y secuencias líder en un constructo de expresión, si se desea. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un huésped, tal como células de mamíferos o bacterias. Los sistemas de replicación en mamíferos incluyen aquellos derivados de virus animales, que requieren factores de trans-actuación para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los sistemas de replicación de los papovavirus, tales como SV40 (Gluzman (1981) Cell 23: 175) o los poliomavirus, se replican con un número de copias extremadamente elevado en presencia de un antígeno T vírico apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los derivados del papilomavirus bovino y el virus Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de esta manera que éste se mantenga, por ejemplo, en células de mamíferos para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y la amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de bacterias de mamíferos incluyen pM72 (Kaufman y col. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946 y pHEBO (Shimizu y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074).

El procedimiento de transformación usado depende del huésped que se va a trasformar. Se conocen en la técnica los procedimientos de introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(de los) polinucleótido(s) en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Se conocen en la técnica líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), que incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2, y otras numerosas líneas celulares.

ii. Sistemas de expresión celular en plantas

Se conocen en la técnica muchos cultivos celulares de plantas y sistemas completos de expresión genética en plantas. Los sistemas de expresión genética celular de plantas a modo de ejemplo incluyen aquellos descritos en patentes, tales como: documento US 5.693.506; documento US 5.659.122; y documento US 5.608.143. Se han descrito ejemplos adicionales de expresión genética en cultivos celulares de plantas por Zenk, Phytochemistry 30: 3861-3863 (1991). Se pueden encontrar descripciones de los péptidos señal de proteínas de plantas además de las referencias descritas anteriormente en Vaulcombe y col., Mol. Gen. Genet. 209: 33-40 (1987); Chandler y col., Plant Molecular Biology 3: 407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985); Rothstein y col., Gene 55: 353-356 (1987); Whittier y col., Nucleic Acids Research 15: 2515-2535 (1987); Wirsel y col., Molecular Microbiology 3: 3-14 (1989); Yu y col., Gene 122: 247-253 (1992). Se puede encontrar una descripción de la regulación de la expresión génica en plantas mediante la fitohormona, ácido giberélico y enzimas segregadas inducidas por el ácido giberélico en R. L Jones y J. MacMillin, Gibberellins: en: Advanced Plant Physiology,. Malcolin B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, Londres, pp. 21-52. Referencias que describen otros genes metabólicamente regulados: Sheen, Plant Cell, 2: 1027-1038 (1990); Maas y col., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1337-1339 (1987).

Normalmente, usando técnicas conocidas en la técnica, se inserta una secuencia de polinucleótidos deseada en un casete de expresión que comprende los elementos reguladores genéticos diseñados para la operación en plantas. El casete de expresión se inserta en un vector de expresión deseado con secuencias parejas en la dirección 5' y en la dirección 3' del casete de expresión adecuado para la expresión en una planta huésped. Las secuencias parejas serán de plásmido o de origen vírico y proporcionarán al vector las características necesarias para permitir que los vectores muevan el ADN desde un huésped de clonación original, tal como una bacteria, hasta el huésped de la planta deseado. El constructo del vector bacteriano/planta básico proporcionará preferiblemente un origen de replicación procariota con amplio intervalo de huéspedes; un marcador seleccionable procariota, y, para las transformaciones de Agrobacterias, las secuencias de ADN T para la transferencia mediada por Agrobacterias en cromosomas de plantas. Cuando no se consigue fácilmente la detección del gen heterólogo, el constructo tendrá también preferiblemente un gen marcador seleccionable adecuado para determinar si se ha transformado una célula de planta. Se encuentra una revisión general de marcadores adecuados, por ejemplo para los miembros de la familia de las herbáceas, en Wilmink y Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2): 165-185.

Se recomiendan también las secuencias adecuadas para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la planta. Estas deben incluir secuencias de transposones y similares para la recombinación homóloga así como secuencias Ti que permitan la inserción aleatoria de un casete de expresión heterólogo en un genoma de planta. Los marcadores seleccionables procariotas adecuados incluyen resistencia a los antibióticos tales como ampicilina o tetraciclina. Pueden estar también presentes en el vector otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales, según se conoce en la técnica.

Se pueden incluir moléculas de ácido nucleico de la invención sujeto en un casete de expresión para la expresión de la(s) proteína(s) de interés. Normalmente, habrá únicamente un casete de expresión, aunque son factibles dos o más. El casete de expresión recombinante contendrá además de la proteína heteróloga que codifica la secuencia los siguientes elementos, una región del promotor, las secuencias 5' no traducidas de la planta, el codón de iniciación dependiendo de si el gen estructural viene o no equipado con uno, y la secuencia de terminación de la transcripción y la traducción. Los emplazamientos del enzima de restricción único en los extremos 5' y 3' del casete permiten una fácil inserción en un vector preexistente.

Una secuencia de codificación heteróloga puede ser para cualquier proteína relacionada con la presente invención. La secuencia que codifica la proteína de interés codificará un péptido señal que permite el procesamiento y las translocación de la proteína, según sea apropiado, y carecerá normalmente de cualquier secuencia que pueda dar como resultado la unión de la proteína deseada de la invención con una membrana. Debido a que, para la mayor parte, la región de iniciación transcripcional será un gen que se expresa y transloca durante la germinación, empleando el péptido señal que proporciona la translocación, se puede proporcionar también la translocación de la proteína de interés. De esta forma, la(s) proteína(s) de interés se translocarán a partir de las células en las que se expresan y se pueden cosechar eficientemente. Normalmente, la secreción en semillas es a través de la aleurona o capa de epitelio escutelar en el endosperma de la semilla. Aunque no se requiere que se segregue la proteína a partir de las células en las que se produce la proteína, esto facilita el aislamiento y la purificación de la proteína recombinante.

Debido a que la expresión última del producto génico deseado será en una célula eucariota es deseable determinar si cualquier porción del gen clonado contiene las secuencias que serán procesadas en forma de intrones por la maquinaria del ayustosoma del huésped. Si acaso, se puede llevar a cabo la mutagénesis dirigida al emplazamiento de la región del "intrón" para evitar la pérdida de una porción del mensaje genético como un código de intrón falso, Reed y Maniatis, Cell 42: 95-105, 1985.

Se puede microinyectar el vector directamente en las células de la planta mediante el uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202: 179-185, 1985. Se puede transferir también el material genético a la célula de la planta usando polietilenglicol, Krens, y col., Nature, 296, 72-74, 1982. Otro procedimiento de introducción de segmentos de ácido nucleico es la penetración balística a elevada velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico tanto en el interior de la matriz de perlas o partículas pequeñas, como en la superficie, Klein, y col., Nature, 327, 70-73, 1987 y Knudsen y Muller, 1991, Planta, 185: 330-336 muestran el bombardeo de partículas de endosperma de malta para crear malta transgénica. Otro procedimiento más de introducción sería la fusión de protoplastos con otras entidades, ya sean minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos lípido-superficiales fusionables, Fraley, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 79, 1859-1863, 1982.

Se puede introducir también el vector en las células de la planta mediante electroporación. (Fromm y col., Proc. Natl Acad. Sci. EEUU 82: 5824, 1985). En esta técnica, los protoplastos de la planta se electroporan en presencia de plásmidos que contienen el constructo del gen. Los impulsos eléctricos de alta intensidad de campo permeabilizan de manera reversible las biomembranas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de la planta electroporada reforman la pared celular, dividen, y forman el callo de la planta.

Todas las plantas de las cuales se pueden aislar y cultivar los protoplastos para proporcionar plantas regeneradas completas se pueden transformar mediante la presente invención de tal manera que las plantas completas que se recuperan contengan el gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas se pueden regenerar a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo pero sin limitarse a todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, frutales y otros árboles, legumbres y vegetales. Algunas plantas adecuadas incluyen, por ejemplo, especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, y Datura.

Los medios para la regeneración varían de especie a especie de planta, pero generalmente, se proporciona en primer lugar una suspensión de protoplastos transformados que contiene las copias del gen heterólogo. Se forma el tejido del callo y se pueden inducir los brotes a partir del callo y posteriormente enraizarse. Alternativamente, se puede inducir la formación del embrión a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citoquinas. Es también ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para las mencionadas especies como maíz y alfalfa. Normalmente, los brotes y las raíces se desarrollan simultáneamente. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo, y de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es completamente reproducible y repetible.

En algunos sistemas de cultivo de células de plantas, la proteína deseada de la invención se puede excretar o alternativamente, la proteína se puede extraer a partir de la planta completa. Cuando la proteína deseada de la invención se segrega en el medio, ésta se puede recoger. Alternativamente, los embriones y las semillas semiembrionadas u otro tejido de la planta se pueden perturbar mecánicamente para liberar cualquier proteína segregada entre las células y los tejidos. Se puede suspender la mezcla en una disolución tampón para recuperar las proteínas solubles. A continuación se usarán los procedimientos de aislamiento y purificación de proteínas convencionales para purificar la proteína recombinante. Se ajustarán los parámetros de tiempo, temperatura, pH, oxígeno, y los volúmenes mediante procedimientos rutinarios para optimizar la expresión y la recuperación de la proteína heteróloga.

iii. Sistemas de baculovirus

Se puede insertar también el polinucleótido que codifica la proteína en un vector de expresión de insecto adecuado, y que se une de manera operable a los elementos de control en el interior de este vector. La construcción del vector emplea técnicas que se conocen en la técnica. Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, normalmente un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del genoma del baculovirus, y un emplazamiento de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos que se van a expresar; un baculovirus de tipo natural con una secuencia homóloga a la del fragmento específico del baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus); y las células huésped de insectos apropiadas y los medios de crecimiento.

Tras insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma vírico de tipo natural se transfectan a una célula huésped de insecto en la que se deja recombinar el vector y el genoma vírico. Este virus recombinante empaquetado se expresa y las placas recombinantes se identifican y purifican. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos están comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Las personas expertas en la técnica conocen generalmente estas técnicas y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555 (1987) (a partir de ahora en el presente documento "Summers y Smith").

Antes de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, la secuencia líder (si se desea) la secuencia de codificación de interés, y la secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan normalmente en un constructo de sustitución intermedio (vector de transferencia). Este constructo puede contener un único gen y los elementos reguladores unidos de manera operable; múltiples genes, cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos de manera operable; o múltiples genes regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Los constructos de sustitución intermedios se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz del mantenimiento estable en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de esta manera que éste se mantenga en un huésped adecuado para la clonación y la amplificación.

Actualmente, el vector de transferencia más comúnmente usado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. Se han diseñado también otros muchos vectores, conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de inicio de la polihedrina de ATG a ATT, y que introduce 32 pares de bases del emplazamiento de clonación BamHI en la dirección 3' de ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989) 17: 31.

El plásmido contiene también normalmente la señal de poliadenilación de la polihedrina (Miller y col. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) y un gen procariota de resistencia a la ampicilina (amp) y el origen de la replicación para la selección y propagación en E. coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen normalmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción en la dirección 3' (5' a 3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente proximal al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de la transcripción incluye normalmente un emplazamiento de unión a la ARN polimerasa y una región de inicio de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus puede tener también una segunda región denominada potenciador, que, si está presente, es normalmente distal al gen estructural. La expresión puede ser tanto regulada como constitutiva.

Los genes estructurales, abundantemente transcritos en los últimos tiempos en un ciclo de infección vírica, proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Los ejemplos incluyen las secuencias derivadas procedentes del gen que codifica la proteína poliédrica vírica, Friesen y col., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression," en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); Publ. EPO N^{os}. 127 839 y 155 476; y the gene encoding the p10 protein, Vlak y col., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.

Se puede derivar el ADN que codifica las secuencias señal adecuadas a partir de genes de las proteínas segregadas de insectos o baculovirus, tales como el gen de la polihedrina de baculovirus (Carbonell y col. (1988) Gene, 73: 409). Alternativamente, debido a que las señales de las modificaciones postraduccionales de las células de mamíferos (tales como la rotura del péptido señal, la rotura proteolítica, y la fosforilación) parecen ser reconocidas por las células de insectos, y las señales requeridas para la secreción y la acumulación nuclear también parecen conservarse entre las células de invertebrados y las células de vertebrados, se pueden usar también las secuencias líder de origen no insecto, tales como aquellas derivadas de los genes que codifican el \alpha-interferón (alfa) humano, Maeda y col., (1985), Nature 315: 592; human gastrin-releasing peptide, Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129; human IL-2, Smith y col., (1985) Proc. Nat Acad. Sci. EEUU, 82:8404; mouse IL-3, (Miyajima y col., (1987) Gene 58: 273; and human glucocerebrosidase, Martin y col. (1988) DNA, 7: 99, para proporcionar la secreción en insectos.

Se puede expresar un polipéptido o poliproteína recombinante intracelularmente o, si se expresa con las secuencias reguladoras apropiadas, se puede segregar. La buena expresión intracelular de las proteínas extrañas no fusionadas requiere normalmente genes heterólogos que idealmente tienen una secuencia líder corta que contiene señales de iniciación de la traducción adecuadas que preceden a una señal de inicio de ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina en el término N a partir de la proteína madura mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Alternativamente, se pueden segregar las poliproteínas o proteínas recombinantes que no se segregan naturalmente a partir de la célula de insectos creando moléculas de ADN quimérico que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en insectos. El fragmento de secuencia líder codifica normalmente un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la translocación de la proteína en el retículo endoplásmico.

Tras la inserción de la secuencia de ADN y/o el gen que codifica el producto de expresión precursor de la proteína, un huésped de célula de insecto se transforma simultáneamente con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico del baculovirus de tipo natural -normalmente mediante transfección simultánea. El promotor y la secuencia de terminación de la transcripción del constructo comprenderán normalmente una sección de 2-5 kb del genoma del baculovirus. Se conocen en la técnica los procedimientos para introducir el ADN heterólogo en el emplazamiento deseado en el virus baculovirus. (Véase Summers y Smith más arriba; Ju y col. (1987); Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de la polihedrina, mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento; la inserción puede ser también en un emplazamiento del enzima de restricción construido mediante ingeniería genética en el gen de baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioessays 4: 91. Cuando se clona la secuencia de ADN en lugar del gen de la polihedrina en el vector de expresión, está flanqueada en 5' y 3' por las secuencias específicas de la polihedrina y se posiciona en la dirección 3' del promotor de la polihedrina.

El vector de expresión de baculovirus formado de nuevo se empaqueta posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia (entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 5%); de esta manera, la mayoría del virus producido tras la transfección simultánea sigue siendo un virus de tipo natural. Por tanto, es necesario un procedimiento para identificar los virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una selección visual que permite distinguir los virus recombinantes. La proteína polihedrina, que está producida por el virus nativo, se produce a niveles muy elevados en los núcleos de las células infectadas en los últimos momentos después de la infección vírica. La proteína polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que contienen también partículas incluidas. Estos cuerpos de oclusión, de hasta 15 \mum de tamaño, son muy refráctiles, lo que les proporciona una apariencia luminosa brillante, que se visualiza fácilmente bajo el microscopio óptico. Las células infectadas con virus recombinantes carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir los virus recombinantes de los virus de tipo natural, se plaquea el sobrenadante de la transfección sobre una monocapa de células de insecto mediante técnicas conocidas por aquellas personas expertas en la técnica. Concretamente, las placas se seleccionan bajo el microscopio óptico para la presencia (indicativa de virus de tipo natural) o la ausencia (indicativa de virus recombinante) de cuerpos de oclusión. Current Protocols in Microbiology Vol. 2 (Ausubel y col. eds) en 16.8 (Supl. 10, 1990); Summers y Smith, supra; Miller y col. (1989).

Se han desarrollado vectores recombinantes de expresión de baculovirus para la infección en diversas células de insectos. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para, entre otros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (Pub. PCT Nº. WO 89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright (1986) Nature 321: 718; Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156; y véase generalmente, Fraser, y col. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).

Las células y los medios de cultivos celulares están comercialmente disponibles para la expresión directa y mediante fusión de los polipéptidos heterólogos en un sistema de expresión de baculovirus, las personas expertas en la técnica conocen generalmente la tecnología del cultivo celular. Véase, por ejemplo, Summers y Smith más arriba.

A continuación se pueden hacer crecer las células de insecto modificadas en un medio nutriente apropiado, que permita el mantenimiento estable de(de los) plásmido(s) presentes en el huésped de insecto modificado. Cuando el gen del producto de expresión está bajo control inducible, se puede hacer crecer el huésped hasta una densidad elevada, e inducir la expresión. Alternativamente, cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará continuamente en el medio, y debe circularse continuamente el medio nutriente, retirando a la vez el producto de interés y aumentando los nutrientes agotados. Se puede purificar el producto mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo, HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.; electroforesis; centrifugación por gradiente de densidad; extracción del disolvente, o similar. Según sea apropiado, el producto se puede purificar además, según se requiera, con el fin de eliminar sustancialmente cualquier proteína de insecto que se secrete también en el medio o sea el resultado de la lisis de las células de insecto, con el fin de proporcionar un producto que esté al menos sustancialmente libre de residuos del huésped, por ejemplo, proteínas, lípidos y polisacáridos.

Con el fin de obtener la expresión de la proteína, se incuban las células huésped recombinantes derivadas de los transformantes en condiciones que permitan la expresión de la secuencia de codificación de la proteína recombinante. Estas condiciones variarán, dependientes de la célula huésped seleccionada. Sin embargo, las condiciones son fácilmente determinables para aquellas personas normalmente expertas en la técnica, basándose en las que se conocen en la técnica.

iv. Sistemas bacterianos

Se conocen en la técnica las técnicas de expresión bacteriana. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción en la dirección 3' (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se sitúa normalmente proximal al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de la transcripción incluye normalmente un emplazamiento de unión a la ARN polimerasa y un emplazamiento de iniciación de la transcripción. Un promotor bacteriano puede tener también una segunda región denominada operador, que puede solapar un emplazamiento de unión a la ARN polimerasa adyacente en el cual se inicia la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada negativa (inducible), a medida que la proteína represora del gen puede unirse al operador e inhibir por tanto la transcripción de un gen específico. Se puede producir la expresión constitutiva en ausencia de los elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, se puede conseguir la regulación positiva mediante una secuencia de unión a la proteína activadora del gen, que, si está presente, es normalmente proximal (5') a la secuencia de unión de la ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de gen es la proteína activadora del catabolito (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) (Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173). La expresión regulada puede por tanto ser tanto positiva como negativa, potenciando o reduciendo de esta manera la transcripción.

Las secuencias que codifican las enzimas de la ruta metabólica proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias de promotor derivadas de las enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) (Chang y col. (1977) Nature 198: 1056), y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias de promotor derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) (Goeddel y col. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; Patente de los Estados Unidos 4.738.921; Publ. EPO N^{os}. 036 776 y 121 775). El sistema promotor de la beta lactamasa (bla) (Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." En Interferon 3 (ed. I. Gresser)), el bacteriófago lambda PL (Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128) y los sistemas promotores de T5 (Patente de los Estados Unidos 4.689.406) proporcionan también secuencias de promotor útiles.

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza funcionan también como promotores bacterianos, Por ejemplo, se pueden unir las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético (Patente de los Estados Unidos 4.551.433). Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido comprendido por las secuencias del promotor trp y el operón lac que está regulado por el represor lac (Amann y col. (1983) Gene 25: 167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21). Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se producen naturalmente de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen no bacteriano que se produce naturalmente puede acoplarse también a una ARN polimerasa compatible para producir niveles elevados de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema ARN polimerasa/promotor del bacteriófago T7 es un ejemplo de sistema promotor acoplado (Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor y col. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82: 1074). Además, un promotor híbrido también puede estar comprendido por un promotor bacteriófago y una región de operador de E. coli (Publ. EPO Nº 267 851).

Además de una secuencia promotora en funcionamiento, es también útil un emplazamiento eficiente de unión al ribosoma para la expresión de los genes extraños en procariotas. En E. coli, el emplazamiento de unión al ribosoma se denomina la secuencia Shine-Dalgamo (SD) e incluye un codón de iniciación (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos en la dirección 5' del codón de iniciación (Shine y col. (1975) Nature 254: 34). Se piensa que la secuencia SD promueve la unión del ARNm con el ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el extremo 3' del ARNr de la subunidad 16S de E. coli (Steitz y col. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger)). Para expresar los genes eucariotas y los genes procariotas con emplazamientos de unión al ribosoma débiles, a menudo es necesario optimizar la distancia entre la secuencia SD y la ATG del gen eucariota (Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

Se puede expresar una molécula de ADN intracelularmente. Se puede unir directamente una secuencia del promotor con la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer aminoácido en el término N será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina en el término N de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa N terminal de metionina bacteriana (Publ. EPO Nº 219237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona en el extremo 5' de las secuencias de codificación heterólogas. Tras la expresión, este constructo proporcionará una fusión de dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, se puede unir el gen celular del bacteriófago lambda en el término 5' de un gen extraño y expresarse en la bacteria. La proteína de fusión resultante retiene preferiblemente un emplazamiento de un enzima de procesamiento (factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago procedente del gen extraño (Nagai y col. (1984) Nature 309: 810). Se pueden preparar proteínas de fusión con secuencias de los genes lacZ (Jia y col.(1987) Gene 60: 197), trpE (Allen y col. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff y col. (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11), y Chey (Publ. EPO Nº. 324 647). La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede codificar o no un emplazamiento escindible. Otro ejemplo es la proteína de fusión de la ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de la ubiquitina que retiene preferiblemente un emplazamiento para el enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina a partir de la proteína extraña. Mediante este procedimiento, se puede aislar la proteína extraña natural (Miller y col. (1989) Biol Technology 7:698).

Alternativamente, se pueden segregar también las proteínas extrañas desde la célula creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia de péptido señal que proporciona la secreción de la proteína extraña en la bacteria (Patente de los Estados Unidos 4.336.336). El fragmento de secuencia señal codifica normalmente un péptido señal comprendido de aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. La proteína se secreta tanto en el medio de crecimiento (bacterias gram positivas) como en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la células (bacterias gram negativas). Preferiblemente, existen emplazamientos de procesamiento, que se pueden escindir tanto in vivo como in vitro codificados entre el fragmento del péptido señal y el gen extraño.

Se puede derivar el ADN que codifica secuencias señal adecuadas a partir de los genes de las proteínas bacterianas segregadas, tales como el gen de la proteína de membrana externa de E. coli (ompA) (Masui y col. (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984) EMBO J. 3: 2437) y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) (Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212). Como ejemplo adicional, se puede usar la secuencia señal del gen de la alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus para segregar las proteínas heterólogas de B. subtilis (Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 79: 5582; Publ. EPO Nº. 244 042).

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras 3' localizadas en el codón de inicio de la traducción, y de esta manera, junto con el promotor, flanquean la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente las secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tallo y lazo que ayudan en la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen las secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, la secuencia señal (si se desea), la secuencia de codificación de interés, y la secuencia de terminación de la transcripción, se introducen juntos en los constructos de expresión. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz del mantenimiento estable en un huésped, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiéndole mantenerse de esta manera en un huésped procariota para la expresión o para la clonación y la amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido con un número de copias tanto alto como bajo. Un plásmido con un alto número de copias tendrá por lo general un número de copias que oscila entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente de 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido con un alto número de copias contendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Se puede seleccionar cualquier vector con un alto o bajo número de copias. Dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña en el huésped.

Alternativamente, se pueden integrar los constructos de expresión en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen normalmente al menos una secuencia homóloga del cromosoma bacteriano que permite integrarse al vector. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con el ADN de diversas cepas de Bacilos se integran en el cromosoma del Bacilo (Publ. EPO Nº 127 328). Los vectores de integración pueden estar comprendidos también por bacteriófagos o secuencias de transposones.

Normalmente, los constructos de expresión extracromosómica y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Se pueden expresar los marcadores seleccionables en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que vuelven a las bacterias resistentes a los fármacos tales como ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina), y tetraciclina (Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 4569). Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como aquellos en las rutas biosintéticas de histidina, triptófano, y leucina.

Alternativamente, alguno de los componentes anteriormente descritos pueden colocarse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están normalmente comprendidos por un marcador seleccionable, que es cualquiera que se mantiene en un replicón o se desarrollas en un vector de integración, tal como se ha descrito anteriormente.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, tanto replicones extracromosómicos como vectores de integración, para la transformación en muchas bacterias, Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis (Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 79: 5582; Publ. EPO N^{os}. 036 259 y 063 953; Publ. PCT Nº. WO 84/04541), Escherichia coli (Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128; Amann y col. (1985) Gene 40: 183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Publ. EPO N^{os}. 036 776, 136 829 y 136 907), Streptococcus cremoris (Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655); Streptococcus lividans (Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655), Streptomyces lividans (Patente de los Estados Unidos 4.745.056).

Se conocen bien en la técnica los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos, e incluyen normalmente cualquiera de la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. Se puede introducir también el ADN en las células bacterianas mediante electroporación. Los procedimientos de transformación varían normalmente con las especies bacterianas que se van a transformar. (Véase por ejemplo, use of Bacillus: Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 79: 5582; Publ. EPO N^{os}. 036 259 y 063 953; Publ. PCT Nº. WO 84/04541; use of Campylobacter: Miller y al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; y Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172: 949; use of Escherichia coli: Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; use of Lactobacillus: Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173; use of Pseudomonas: Fiedler y col. (1988) Anal. Biochem 170: 38; use of Staphylococcus: Augustin y col. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203; use of Streptococcus: Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, En: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y col. (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4º Evr. Cong. Biotechnology
1:412.

v. Expresión en levaduras

Una persona normalmente experta en la técnica conoce también los sistemas de expresión en levaduras. Un promotor de levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de la levadura e iniciar la transcripción en la dirección 3' (3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que se sitúa normalmente proximal al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de iniciación de la transcripción incluye normalmente el emplazamiento de unión con la ARN polimerasa (la "secuencia TATA" y el emplazamiento de iniciación de la transcripción. Un promotor de levadura puede tener también una segunda región denominada secuencia activadora en la dirección 5' (UAS), que, si está presente, es normalmente distal al gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser tanto positiva como negativa potenciando o reduciendo por tanto la transcripción.

La levadura es un organismo fermentativo con una ruta metabólica activa, por tanto, los enzimas que codifican las secuencias en la ruta metabólica proporcionan secuencias de promotor particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (Publ. EPO Nº. 284 044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglycerate mutasa, y piruvato quinasa (PyK) (Publ. EPO Nº. 329 203). El gen pHO5 de levadura, que codifica la fosfatasa ácida, proporciona también secuencias de promotor útiles (Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 80: 1).

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza funcionan también como promotores de levadura. Por ejemplo, se pueden unir las secuencias UAS de un promotor de levadura con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de ADH y la secuencia unida a la región de activación de la transcripción de GAP (Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.876.197 y 4. 880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que están constituidos por secuencias reguladores de cualquiera de los genes ADH2, GAL4, GAL10, OR PHO5, combinadas con la región de activación transcripcional de un gen del enzima glicolítico tal como GAP o PyK (Publ. EPO Nº 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores que se producen naturalmente de origen no levadura que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, entre otros, (Cohen y col. (1980) Proc. Natl. Acad Sci. EEUU 77: 1078; Henikoff y col. (1981) Nature 283: 835; Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg y col. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis y A. Puhler); Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11:163; Panthier y col. (1980) Curr. Genet. 2: 109;).

Se puede expresar una molécula de ADN intracelularmente en levaduras. Se puede unir directamente una secuencia de promotor con la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer aminoácido en el término N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina en el término N a partir de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para los sistemas de expresión de levaduras, así como en sistemas de expresión de mamíferos, plantas, baculovirus y bacterianos. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N terminal de una proteína de levadura endógena, u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5' de las secuencias de codificación heterólogas. Tras la expresión, este constructo proporcionará una fusión de dos secuencias de aminoácidos. Se pueden por ejemplo unir la levadura o el gen de la superóxido dismutasa humana (SOD) en el término 5' de un gen extraño y expresarse en la levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un emplazamiento escindible. Véase por ejemplo, Publ. EPO Nº 196056. Otro ejemplo es una proteína de fusión de la ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de la ubiquitina que retiene preferiblemente un emplazamiento para el enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina a partir de la proteína extraña. Mediante este procedimiento, por tanto, se puede aislar la proteína extraña natural (por ejemplo, documento WO88/024066).

Alternativamente, se pueden segregar también las proteínas extrañas a partir de la célula en los medios de crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción en la levadura de la proteína extraña. Preferiblemente, hay emplazamientos de procesado codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que se pueden escindir tanto in vivo como in vitro. El fragmento de secuencia líder que codifica normalmente un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína procedente de la célula.

Se puede derivar el ADN que codifica las secuencias señal adecuadas a partir de los genes de las proteínas de levadura segregadas, tales como el gen de la invertasa de levadura (Publ. EPO No. 012 873; JPO Publ. No. 62: 096.086) y el gen del factor A (Patente de los Estados Unidos 4.588.684). Alternativamente, las secuencias líder de origen no levadura, tales como el interferón líder, existen de tal manera que proporcionan también la secreción en levaduras (Publ. EPO Nº 060 057).

Una clase preferida de secuencias líderes de secreción son aquellas que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levadura, que contiene una secuencia señal "pre", y una región "pro". Los tipos de fragmentos del factor alfa que se pueden emplear incluyen secuencias líder del factor alfa pre-pro de longitud completa (aproximadamente 83 residuos de aminoácido) así como secuencias líderes del factor alfa truncadas (normalmente aproximadamente 25 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos) (Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.546.083 y 4.870.008; Publ. EPO Nº 324 274). Las secuencias líderes adicionales que emplean un fragmento líder del factor alfa que proporciona la secreción incluyen secuencias líderes del factor alfa híbridas preparadas tanto con una presecuencia de una primera levadura, como con una región pro de un segundo factor alfa de levadura (véase por ejemplo, Publ. PCT Nº WO 89/02463).

Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura son regiones reguladoras 3' localizadas en el codón de inicio de la traducción, y de esta manera, junto con el promotor, flanquean la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Ejemplos de secuencia terminadora de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por la levadura, son tales como las que codifican los enzimas glicolíticos.

Normalmente, los componentes anteriormente descritos comprendiendo un promotor, un líder (si se desea) secuencia de codificacación de interés y secuencia de terminación de la transcripción, se introducen juntos en los constructos de expresión. Los constructos de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces del mantenimiento estable en un huésped, tal como una levadura o bacterias. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga, por ejemplo, en la levadura para la expresión y en el huésped procariota para la clonación y la amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera levadura-bacteria incluyen YEp24 (Botstein y col. (1979) Gene 8: 17-24), pCl/l (brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci EEUU 81: 4642-4646), e YRp17 (Stinchcomb y col. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157). Además, un replicón puede ser un plásmido con número de copias tanto alto como bajo. Un plásmido con número de copias alto tendrá generalmente un número de copias que oscila entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido con número de copias alto tendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10 y más preferiblemente al menos aproximadamente 20. Se puede seleccionar un vector con un número de copias alto o bajo, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña en el huésped. Véase por ejemplo, Brake y col, más arriba.

Alternativamente, se pueden integrar los constructos de expresión en el genoma de la levadura con un vector de integración. Los vectores de integración contienen normalmente al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite al vector integrar, y preferiblemente contener dos secuencias homólogas que flanquean el constructo de expresión. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de la levadura (Orr-Weaver y col. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228-245). Se puede dirigir un vector de integración a un locus específico en la levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col., más arriba. Se pueden integrar uno o más constructos de expresión, afectando posiblemente los niveles de la proteína recombinante producida (Rine y col. (1983) Pro. Natl. Acad Sci EEUU 80: 6750) Se pueden producir cualquiera de las secuencias cromosómicas incluidas en el vector como un segmento único en el vector, que da como resultado la integración del vector completo, o dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y flanqueando el constructo de expresión en el vector, lo que puede dar como resultado en la integración estable de únicamente el constructo de expresión.

Normalmente, los constructos de expresión extracromosómica y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de las cepas de levadura que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en la levadura huésped, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRPI, y ALG7, y el gen de la resistencia G418, que confiere resistencia en las células de levadura a la tunicamicina y G418, respectivamente. Además, se puede proporcionar también un marcador seleccionable adecuado de la levadura con la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como metales. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite a la levadura crecer en presencia de iones de cobre (Butt y col. (1987) Microbiol, Rev. 51: 351).

Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos se pueden introducir juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos normalmente por un marcador seleccionable que es tanto mantenido en un replicón como desarrollado en un vector de integración, tal como se ha descrito anteriormente.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, tanto replicones extracromosómicos como vectores de integración, para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, se han desarrollado vectores y procedimientos de expresión para introducir ADN exógeno en levaduras huéspedes, para, entre otras, las siguientes levaduras: Candida albicans (Kurtz, y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142); Candida maltosa (Kunze, y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141); Hansenula polymorpha (Gleeson, y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302); Kluyveromyces fragilis (Das, y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165); Kluyveromyces lactis (De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8: 135); Pichia guillerimondii (Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141); Pichia pastoris (Cregg, y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes de los Estados Unidos. 4.837.148 y 4.929.555); Saccharomyces cerevisiae (Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 75: 1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153: 163); Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706); y Yarrowia lipolytica (Davidow, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49).

Se conocen bien en la técnica los procedimientos para introducir ADN exógeno en huéspedes de levaduras, y normalmente incluyen tanto la transformación de esferoplastos como la de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación varían normalmente con las especies de levaduras que se van a transformar. Véase por ejemplo, [Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Patentes de los Estados Unidos. 4.837.148 y 4.929.555; Pichia]; [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 75; 1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow y col. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].

Definiciones

Una composición que contiene X está "sustancialmente libre de" Y cuando al menos el 85% en peso del total de X+Y en la composición es X, Preferiblemente, X comprende al menos aproximadamente el 90% en peso del total de X+Y en la composición, más preferiblemente aproximadamente el 95% o incluso el 99% en peso.

El término "heterólogo" se refiere a dos componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza, los componentes pueden ser células huéspedes, genes, o regiones reguladoras, tales como promotores. Aunque los componentes heterólogos no se encuentran juntos en la naturaleza, pueden funcionar conjuntamente, así como cuando un promotor heterólogo en un gen se une de manera operable al gen. Otro ejemplo es cuando la secuencia Neisserial es heteróloga en una célula huésped de ratón.

Un "origen de replicación" es una secuencia de polinucleótidos que inicia y regula la replicación de los polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de la replicación se comporta como una unidad de replicación de polinucleótidos autónoma en el interior de una célula, capaz de replicación bajo su propio control. Se puede necesitar un origen de replicación de un vector para replicarse en una célula huésped concreta. Con algunos orígenes de replicación se puede reproducir un vector de expresión con un número alto de copias en presencia de las proteínas apropiadas en el interior de la célula. Ejemplos de orígenes son las secuencias autónomamente replicativas, que son eficazs en levaduras, y el antígeno T vírico, efectivo en las células COS-7.

Se define una secuencia "mutante" como una secuencia de ADN, ARN o de aminoácidos que difiere de, pero que tiene homología con la secuencia natural o descrita. Dependiendo de la secuencia concreta, el grado de homología entre la secuencia natural o descrita y la secuencia mutante es preferiblemente mayor del 50% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o más) que se calcula tal como se ha descrito anteriormente. Tal como se usa en el presente documento, una "variante alélica" de una molécula o región de ácido nucleico, para cuya secuencia de ácido nucleico se proporciona en el presente documento, es una molécula, o región de ácido nucleico, que se produce esencialmente en el mismo locus en el genoma de otro o segundo aislado, y que, debido a la variación natural producida por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una secuencia de ácido nucleico similar, pero no idéntica. Una variante alélica de la región de codificación codifica normalmente una proteína que tiene actividad similar a la de la proteína codificada por el gen al cual se está comparando. Una variante alélica puede comprender también una alteración en las regiones 5' o 3' no traducidas del gen. Tal como en las regiones de control regulador (véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos 5.753.235).

Anticuerpos

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos compuestos por al menos un emplazamiento de combinación del anticuerpo. Un "emplazamiento de combinación del anticuerpo" es un espacio de unión tridimensional con una forma de superficie interna y una distribución de carga complementarias de las características de un epitopo de un antígeno, que permite una unión del anticuerpo con el antígeno. "Anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos de vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, proteínas Fab, y anticuerpos de región única.

Los anticuerpos frente a las proteínas de la invención son útiles para la cromatografía de afinidad, inmunoensayos, y la distinción/identificación de las proteínas MenB de Neisseria. Los anticuerpos estimulados frente a las proteínas de la presente invención se unen a los polipéptidos o proteínas antigénicas o fragmentos de proteínas que están presentes y asociados específicamente alas cepas de MenB de Neisseria meningitidis. En algunos ejemplos se pueden asociar estos antígenos con cepas específicas, tales como aquellos antígenos específicos para las cepas MenB. Se pueden inmovilizar los anticuerpos de la invención en una matriz y utilizarse en un inmunoensayo o en una columna de cromatografía de afinidad para permitir la detección y/o separación de los polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas o células que comprenden dichos polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas. Alternativamente, se pueden inmovilizar dichos polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas con el fin de detectar los anticuerpos que se pueden unir específicamente con los anteriores.

Los anticuerpos de las proteínas de la invención, tanto policlonales como monoclonales, se pueden preparar mediante procedimientos convencionales. En general, la proteína se usa en primer lugar para inmunizar un animal adecuado, preferiblemente un ratón, rata, conejo o cabra. Se prefieren los conejos y cabras para la preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero que se puede obtener, y la disponibilidad de anticuerpos anti-conejo y anti-cabra marcados. La inmunización se lleva a cabo generalmente mezclando o emulsionando la proteína en solución salina, preferiblemente en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión parenteralmente (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Una dosis de 50-200 \mug/inyección es normalmente suficiente. La inmunización se estimula generalmente 2-6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, usando preferiblemente adyuvante incompleto de Freund. Se pueden generar alternativamente anticuerpos mediante inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica, que, para los objetivos de esta invención se consideran equivalentes a la inmunización in vivo. Los antisueros policlonales se obtienen extrayendo sangre del animal inmunizado en un contenedor de vidrio o plástico, incubando la sangre a 25ºC durante una hora, seguido por la incubación a 4ºC durante 2-18 horas. El suero se recupera mediante centrifugación (por ejemplo, 1.000 g durante 10 minutos). Se pueden obtener de conejos aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre.

Se preparan anticuerpos monoclonales usando el procedimiento estándar de Koheler y Milstein (1975) 256: 495-96), o una modificación del mismo. Normalmente, se inmuniza un ratón o rata tal como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en lugar de extraer sangre del animal para extraer el suero, se retira el bazo (y opcionalmente algunos nódulos linfáticos grandes) y se disocian en células únicas. Si se desea, se pueden seleccionar las células de bazo (tras la eliminación de las células no específicamente adherentes) aplicando una suspensión celular a una placa o pocillo recubierto con el antígeno de la proteína. Las células B que expresan la inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa, y no se eliminan por lavado con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células de bazo disociadas, se inducen a continuación a fusionarse con células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se plaquean mediante dilución limitante, y se evalúan para la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno inmunizante (y que no se unen a los antígenos no relacionados). Los hibridomas que segregan el MAb seleccionado se cultivan a continuación tanto in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejidos o reactores de fibra hueca), como in vivo (como ascites en ratones).

Si se desea, se pueden marcar los anticuerpos (tanto policlonales como monoclonales) usando las técnicas convencionales. Las marcas adecuadas incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radioactivos (concretamente ^{32}P y ^{125}I), reactivos densos en electrones, enzimas, y ligandos que tienen parejas de unión específicas. Los enzimas se detectan normalmente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante se detecta normalmente por su capacidad para convertir 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "pareja de unión específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula ligando con una especificidad elevada, tal como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico del anterior. Otras parejas de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y numerosos pares receptor-ligando conocidos en la técnica. Debería entenderse que en la anterior descripción no se pretende clasificar las diversas marcas en clases distintas, así como que la misma marca puede servir de diversos modos diferentes. Por ejemplo, ^{125}I puede servir como marca radioactiva o como reactivo denso en electrones. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un MAb. Además, se pueden combinar diversas marcas para el efecto deseado. Por ejemplo, los MAb y la avidina requieren también marcas en la práctica de esta invención: de esta manera, se puede marcar un MAb con biotina, y detectar su presencia con avidina marcada con ^{125}I, o con una antibiotina MAb marcada con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente aparentes para aquellas personas normalmente expertas en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención.

Los antígenos, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas de la presente invención estimulan la formación de anticuerpos con pareja de unión específica. Estos antígenos, inmunógenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas de la presente invención comprenden composiciones inmunógenas de la presente invención. Dichas composiciones inmunógenas pueden comprender o incluir además adyuvantes, vehículos, u otras composiciones que promueven o potencian o estabilizan los antígenos, polipéptidos, proteínas o fragmentos de proteínas de la presente invención. Dichos adyuvantes y vehículos serán fácilmente aparentes para aquellas personas normalmente expertas en la técnica.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir cualesquiera de los polipéptidos, anticuerpos, o ácidos nucleicos de la descripción. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los polipéptidos, anticuerpos, o polinucleótidos de la invención desvelada.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar, o evitar una enfermedad o dolencia deseada, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto se puede detectar mediante, por ejemplo, marcadores químicos o niveles de antígeno. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción de los síntomas físicos, tales como la disminución de la temperatura corporal, cuando se proporcionan a un paciente que tiene fiebre. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del tamaño y la salud del sujeto, la naturaleza y extensión de la dolencia, y de los compuestos terapéuticos o combinación de compuestos terapéuticos seleccionados para la administración. De esta manera, no es útil especificar una cantidad eficaz exacta por adelantado. Sin embargo, se puede determinar la cantidad eficaz para una situación dada mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del médico.

Para los objetivos de la presente descripción, una dosis eficaz estará entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 50 mg/kg o 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de los constructos de ADN en el individuo al cual se administra.

Una composición farmacéutica puede contener también un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, genes, y otros agentes terapéuticos. El término se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que se pueden administrar sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son bien conocidos por aquellas personas normalmente expertas en la técnica.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables en el presente documento, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Está disponible una descripción completa de los excipientes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener líquidos como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tamponantes del pH, y similares, pueden estar presentes en dichos vehículos. Normalmente, las composiciones terapéuticas se preparan como inyectables, cualquiera como en soluciones o suspensiones líquidas; se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. Se incluyen liposomas dentro de la definición de un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Procedimientos de administración

Una vez formuladas, las composiciones de la descripción se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se van a tratar pueden ser animales; en concreto, se van a tratar seres humanos.

La administración directa de las composiciones se llevará a cabo generalmente mediante inyección, cualquiera de subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, o intramuscular o administrarse en el espacio intersticial de un tejido. Se pueden administrar también las composiciones en una lesión. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas, agujas, y cañones de genes o hipopulverizaciones. El tratamiento de dosificación puede ser una pauta de dosis única o una pauta de dosis múltiples.

Vacunas

Las vacunas de acuerdo con la descripción pueden ser tanto profilácticas (es decir, para evitar la infección) como terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de la infección).

Dichas vacunas comprenden el(los) antígeno(s) o inmunógeno(s) inmunizantes, el polipéptido inmunógeno, la(s) proteína(s) o fragmentos de proteínas, o los ácidos nucleicos (por ejemplo, ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico), normalmente en combinación con "vehículos farmacéuticamente aceptables" que incluyen cualquier vehículo que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales en el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son normalmente macromoléculas grandes metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas), o partículas de virus inactivos. Dichos vehículos son bien conocidos por aquellas personas normalmente expertas en la técnica. Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Además, se puede conjugar el inmunógeno o antígeno con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de difteria, tétanos, cólera, H. pylori, etc., patógenos.

Los adyuvantes preferidos para potenciar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (Publ. PCT Nº WO 90/14837), que contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, y Span 85 al 0,5%) conteniendo opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación), aunque no se requiere), formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, conteniendo escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado con plurónico al 5%, y thr-MDP (véase a continuación) tanto microfluidizado en emulsión submicrométrica como sometido a vortización para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) el sistema de adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) conteniendo escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) se pueden usar adyuvantes de la saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir del anterior tales como los ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) Adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA); (5) citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, gamma interferón), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc; (6) mutantes detoxificados de toxina ribosilante de ADP bacteriano tal como toxina del cólera (CT) una toxina pertussis (PT), o una toxina de E. coli lábil al calor (LT), concretamente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; véanse, por ejemplo, los documentos WO 93/13302 y WO 92/19265; y (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la efectividad de la composición. Se prefieren alum y MF59.

Tal como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Las composiciones de vacuna que comprenden composiciones inmunógenas (por ejemplo, que pueden incluir el antígeno, el vehículo farmacéuticamente aceptable, y el adyuvante) contendrán normalmente diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tamponantes del pH, y similares. Alternativamente, las composiciones de vacuna que comprenden composiciones inmunógenas pueden comprender un antígeno, polipéptido, proteína, fragmento de proteína o ácido nucleico en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Más específicamente, las vacunas que comprenden composiciones inmunógenas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos inmunógenos, así como cualquier otro de los componentes anteriormente mencionados, según se necesite. Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se entiende que la administración de la cantidad en un individuo, tanto en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del doctor que dirige el tratamiento, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad
esté comprendida en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos rutinarios.

Normalmente, las composiciones de vacuna o composiciones inmunógenas se preparan como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. Se puede emulsionar o encapsular también la preparación en liposomas para potenciar el efecto adyuvante, tal como se ha descrito anteriormente para los vehículos farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones inmunógenas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección, tanto subcutánea como intramuscularmente. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios, y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas. El tratamiento de dosificación puede ser una pauta de dosis única o una pauta de dosis múltiples. Se puede administrar la vacuna en conjunción con otros agentes inmunoreguladores.

Como alternativa a las vacunas basadas en proteínas, se puede emplear la vacunación de ADN (por ejemplo, Robinson y Torres (1997) Seminars in Immunology 9: 271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15: 617-648).

Vehículos de administración de genes

Se puede administrar terapia génica, vehículos para la administración de constructos, que incluyen una secuencia de codificación de un compuesto terapéutico de la descripción, que se va a administrar al mamífero para la expresión en el mamífero, tanto local como sistémicamente, Estos constructos pueden utilizar soluciones de vectores víricos o no víricos en modalidad in vivo o ex vivo. Se puede inducir la expresión de dicha secuencia de codificación usando promotores endógenos de mamíferos o heterólogos. La expresión de la secuencia de codificación in vivo puede ser tanto constitutiva como regulada.

Esta descripción incluye vehículos de administración de genes capaces de expresar las secuencias de ácidos nucleicos contempladas.

El vehículo de administración del gen es preferiblemente un vector vírico y, más preferiblemente, un vector retrovírico, adenovírico, vírico adenoasociado (AAV), herpesvírico, o alfavírico. El vector vírico puede ser también un astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, para mixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus, o vector vírico de togavirus. Véase en general, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1: 51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5: 845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6: 185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Se conocen bien en la técnica los vectores retrovíricos, que incluyen los retrovirus de tipo B, C y D, los retrovirus xenotrópicos (por ejemplo, NZB-X1, NZB-X2 y NZB9-1 (véase O'Neill (1985) J. Virol. 53: 160), los retrovirus politrópicos, por ejemplo, MCF y MCF-MLV (véase Kelly 81983) J. Virol, 45: 291), los espumavirus y los lentivirus. Véase RNA Tumor Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Se pueden derivar porciones del vector de terapia génica retrovírico a partir de diferentes retrovirus. Por ejemplo, se pueden derivar los retrovectores LTR a partir del Virus de Sarcoma Murino, un emplazamiento de unión al ARNt del Virus del Sarcoma de Rous, una señal empaquetada de un Virus de Leucemia Murino, y un origen de síntesis de segunda cepa de un Virus de Leucosis Aviaria.

Se pueden usar estos vectores retrovíricos recombinantes para generar la transducción competente de las partículas de vector retrovírico introduciéndolas en líneas celulares de empaquetado apropiado (véase la patente de los Estados Unidos 5.591.624). Se pueden construir vectores retrovíricos para la integración específica del emplazamiento en el ADN de la célula huésped mediante la incorporación de un enzima integrasa quimérico en la partícula retrovírica (véase documento WO 96/37626). Es preferible que el vector vírico recombinante sea un virus recombinante defectivo de la replicación.

Se conocen bien en la técnica las líneas celulares empaquetadas adecuadas para el uso con los vectores retrovíricos anteriormente descritos, se preparan fácilmente (véase documentos WO95/30763 y WO92/05266), y se pueden usar para crear líneas celulares productoras (denominadas también líneas celulares de vectores o "VCL") para la producción de partículas de vectores recombinantes. Preferiblemente, las líneas celulares empaquetadas se preparan a partir de células parentales humanas (por ejemplo, células HT1080) o líneas parentales de visón, que eliminan la inactivación en suero humano.

Los retrovirus preferidos para la construcción de vectores retrovíricos de terapia génica incluyen el Virus de la Leucosis Aviaria, el Virus de la Leucemia Bovina, el Virus de la Leucemia Murina, El Virus que induce el Foco Celular de Visón, el Virus del Sarcoma Murino, el Virus de la Reticuloendoteliosis y el Virus del Sarcoma de Rous. Los Virus de la Leucemia Murina particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe (1976) J Virol 19: 19-25), Abelson (ATCC Nº. VR-999), Friend (ATCC Nº. VR-245), Graffi, Gross (ATCC Nº VR-590), Kirsten, Virus del Sarcoma de Harvey y Rauscher (ATCC Nº. VR-998) y el Virus de la Leucemia Murina de Moloney (ATCC Nº. VR-190). Se pueden obtener dichos retrovirus a partir de depositarios o colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC") en Rockville, Maryland o aislarse de Fuentes conocidas usando las técnicas comúnmente disponibles.

Los vectores retrovíricos de terapia génica ejemplares conocidos que se pueden usar en esta descripción incluyen aquellos descritos en las solicitudes de patente GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349, WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US 4.777.127, US 5.591.624. Véanse también Vile (1993) Cancer Res 53: 3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53: 962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33: 493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79: 729-735; Mann (1983) Cell 33: 153; Cane (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Se conocen también en la técnica y se pueden usar en esta descripción vectores adenovíricos humanos de terapia génica. Véanse, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6: 616 y Rosenfeld (1991) Science 252: 431, y los documentos WO93/07283, WO93/06223, y WO93/07282. Los vectores adenovíricos de terapia génica conocidos a modo de ejemplo se pueden usar en esta descripción incluyen aquellos descritos en los documentos anteriormente referenciados y en los documentos WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984 WO95/00655 WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506, WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/2815, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 y WO95/09654. Alternativamente, se puede emplear la administración de ADN unido a adenovirus muerto según se describe en Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3: 147-154. Los vehículos de administración de genes de la descripción incluyen también vectores víricos asociados a adenovirus (AAV). Los ejemplos principales y preferidos de dichos vectores para uso en esta invención son los vectores basados en AAV-2 descritos en Srivastava, documento WO93/09239. Los vectores AAV más preferidos comprenden las dos repeticiones terminales invertidas AAV en las que las secuencias D naturales están modificadas mediante la sustitución de los nucleótidos, de tal manera que al menos 5 nucleótidos naturales y hasta 18 nucleótidos naturales, preferiblemente al menos 10 nucleótidos naturales hasta 18 nucleótidos naturales, más preferiblemente 10 nucleótidos naturales están retenidos y los nucleótidos restantes de la secuencia D se eliminan o sustituyen con nucleótidos no naturales. Las secuencias D naturales de las repeticiones terminales invertidas AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada repetición terminal invertida AAV (es decir, existe una secuencia en cada extremo) que no están implicadas en la formación de HP. El nucleótido de sustitución no natural puede ser cualquier nucleótido diferente del nucleótido que se encuentra en la secuencia D natural en la misma posición. Otros vectores AAV a modo de ejemplo se pueden usar son pWP-19, pWN-1, los cuales se describen en Nahreini (1993) Gene 124: 257-262. Otro ejemplo de dicho vector AAV es psub201 (véase Samulski (1987) J. virol. 61: 3096). Otro vector AAV a modo de ejemplo es el vector ITR Doble D. Se describe la construcción del vector ITR Doble D en la Patente de los Estados Unidos 5.478.745. Otros vectores adicionales son aquellos descritos por Carter en la Patente de los Estados Unidos 4.797.368 y Muzyczka en la Patente de los Estados Unidos 5.139.941, por Chartejee en la Patente de los Estados Unidos 5.474.935, y por Kotin en el documento WO94/288157. Un ejemplo adicional más de un vector AAV que se puede usar en esta invención es SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador AFP y el promotor de la albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado. Se describen su estructura y construcción en Su (1996) Human Gene Therapy 7: 463-470. Se describen vectores AAV de terapia génica adicionales en los documentos US 5.354.678, US 5.173.414, US 5.139.941, y US 5.252.479.

Los vectores de terapia génica que comprenden las secuencias de la descripción incluyen los vectores del herpes. Los vectores principales y preferidos son los vectores del virus del herpes simple que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de la timidina quinasa tal como aquellos descritos en los documentos US 5.288.641 y EP0176170 (Roizman). Los vectores del virus del herpes simple a modo de ejemplo adicional incluyen HFEM/ICP6-LacZ descrito en el documento WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac descrito en Geller (1998) Science 241: 1667-1669 y en los documentos WO90/09441 y WO92/07945, Us3::pgC-lacZ descrito en Fink (1992) Human Gene Therapy 3: 11-19 y HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4 descrito en el documento EP 0453242 (Breakefield), y aquellos depositados con la ATCC con números de acceso ATCC VR-977 y ATCC VR-260.

También se contemplan los vectores de terapia génica del virus alfa que se pueden emplear en esta descripción. Los vectores del virus alfa preferidos son los vectores de los virus Sindbis. Los togavirus, el virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), el virus Middleberg (ATCC VR-370, el virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), el virus de la encefalitis equina de Venezuela (ATCC VR293; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249, ATCC VR-532), y aquellos descritos en las patentes de los Estados Unidos 5.091.309, 5.217.879 y el documento WO92/10578. Más concretamente, se pueden usar aquellos vectores del virus alfa descritos en el documento de los Estados Unidos con nº de serie 08/405.627, presentado el 15 de Marzo de 1995, y en los documentos WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091.309 y US 5.217.879. Se pueden obtener dichos virus alfa de los depositarios o colecciones tales como la ATCC en Rockville, Maryland o aislarse de fuentes conocidas usando las técnicas comúnmente disponibles. Preferiblemente, se usan los vectores del Alfavirus con citotoxicidad reducida (véase documento USSN 08/679640).

Los sistemas de vectores de ADN tales como los sistemas de expresión eucariota en capas son también útiles para expresar los ácidos nucleicos de la descripción. Véase el documento WO95/07994 para una descripción detallada de los sistemas de expresión eucariota en capas. Preferiblemente los sistemas de expresión eucariota en capas de la descripción se derivan de los vectores de Alfavirus y más preferiblemente de los vectores víricos del los virus Sindbis.

Otros vectores víricos adecuados para el uso en la presente descripción incluyen aquellos derivados de los poliovirus, por ejemplo ATCC VR-58 y aquellos descritos en Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1: 115; los rinovirus, por ejemplo ATCC VR-1110 y aquellos descritos en Arnold (1990) J. Cell Biochem L401; los virus de la viruela tales como los virus de la viruela de los canarios o el virus vaccinia, por ejemplo ATCC VR-111 y ATCC VR-2010 y aquellos descritos en Fisher-Hoch 81989) Proc Natl Acad Sci 86: 317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569: 86, Flexner (1990) Vaccine 8: 17; en los documentos US 4.603.112 y US. 4.769.330 y WO89/01973; el virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y aquellos descritos en Mulligan (1979) Nature 277: 108 y Madzak 81992) J Gen Virol 73: 1533; el virus de la gripe, por ejemplo ATCC VR-797 y los virus recombinantes de la gripe preparados empleando técnicas genéticas inversas tal como se describe en el documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc Natl Acad Sci 87: 3802-3805; Enami y Palese (1991) J Virol 65: 2711-26713 y Luytjes (1989) Cell 59: 110, (véase también McMichael (1983) NEJ Med 309: 13, y Yap (1978) Nature 273: 238 y Nature (1979) 277: 108); el virus de la inmunodeficiencia humana tal como se describe en el documento EP-0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol. 66: 2731; el virus de la varicela, por ejemplo ATCC VR-67 y VR-1247 y aquellos descritos en el documento EP-0440219; el virus Aura, por ejemplo ATCC VR-368; el virus Bebaru, por ejemplo ATCC VR-600 y ATCC VR-1240; el virus Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; el virus Chikungunya, por ejemplo ATCC VR-64 y ATCC VR-1241; el Virus Fort Morgan, por ejemplo ATCC VR-924; el virus Getah, por ejemplo ATCC VR-369 y ATCC VR-1243; el virus Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR-927; el virus Mayaro, por ejemplo ATCC VR-66; el virus Mucambo, por ejemplo ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; el virus Ndumu, por ejemplo ATCC VR-371; el virus Pixuna, por ejemplo ATCC VR-372 y ATCC VR-1245; el virus Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; el virus Triniti, por ejemplo ATCC VR-469; el virus Una, por ejemplo ATCC VR-374; el virus Whataroa, por ejemplo ATCC VR-926; el virus Y-62-33, por ejemplo ATCC VR-375; el virus O'Nyong, el virus de la encefalitis oriental, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC VR-1242; el virus de la encefalitis occidental, por ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y los coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y aquellos descritos en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190.

La administración de las composiciones de esta descripción en células no se limita a los vectores víricos anteriormente mencionados. Se pueden emplear otros procedimientos y medios de administración tales como, por ejemplo, vectores de expresión de ácidos nucleicos, ADN condensado policatiónico unido o no unido sólo a adenovirus muerto, por ejemplo, véanse el documento de los Estados Unidos con nº de Serie 08/366.787, presentado el 30 de Diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gen Ther 3: 147-154 ligando unido al ADN, por ejemplo véanse Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, células eucariotas, células como vehículo de administración, por ejemplo véanse el documento de los Estados Unidos con Nº de Serie 08/240.030, presentado el 9 de mayo de 1994, y el documento de los Estados Unidos con nº de Serie 08/404.796, deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado, y pistola de partículas de transferencia de genes controlada manualmente, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos 5.149.655, radiación ionizante tal como se describe en los documentos US 5.206.152 y WO92/11033, neutralización o fusión de la carga nucleica con membranas celulares. Se describen soluciones adicionales en Philip (1994) Mol Cell Biol 14: 2411-2418 y en Woffendin (1994) Proc Natl Acad Sci 91: 1581-1585.

Se puede emplear la transferencia de genes mediada por partículas, véase, por ejemplo, el documento de los Estados Unidos con Nº de Serie 60/023.867. De manera breve, se puede insertar la secuencia en vectores convencionales que contienen secuencias control convencionales para la expresión de un nivel elevado, y a continuación incubarse con moléculas sintéticas de transferencia de genes tales como cationes de unión al ADN polimérico similares a la polilisina, protamina, y albúmina, unidos a ligandos dirigidos a células tales como asialoorosomucoide, tal como se describe en Wu y Wu (1987) J. Biol. Chem. 262; 4429-4432, insulina, tal como se describe en Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40: 253-263, galactosa, tal como se describe en Plank (1992) Bioconjugate Chem 3: 533-539, lactosa o transferrina.

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Se puede emplear también ADN desnudo para transformar una célula huésped. Se describen los procedimientos de introducción de ADN desnudo a modo de ejemplo en los documentos WO 90/11092 y US 5.580.859. Se puede mejorar la eficiencia de captación usando perlas de látex biodegradable. Los ADN recubiertos con perlas de látex son eficientemente transportados en las células después del inicio de la endocitosis por las perlas. Se puede mejorar el procedimiento mediante el tratamiento de las perlas para aumentar la hidrofobia y facilitar por tanto la perturbación del endosoma y la liberación del ADN en el citoplasma.

Se describen en los documentos US. 5.422.120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y EP-524.968 los liposomas que pueden actuar como vehículos de administración de genes. Tal como se describe en el documento USSN. 60/023.867, sobre la administración no vírica, se pueden insertar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido en vectores convencionales que contienen secuencias control convencionales para expresión de alto nivel, y a continuación incubarse con moléculas de transferencia de genes sintéticos tales como cationes de unión al ADN polimérico similares a polilisina, protamina, y albúmina, unidos a ligandos dirigidos a células tales como asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa, o transferrina. Otros sistemas de administración incluyen el uso de liposomas para encapsular el ADN que comprenden el gen bajo el control de una variedad de promotores específicos del tejido o ubicuamente activos. Además, la administración no vírica adecuada para el uso incluye sistemas de administración mecánica tales como la solución descrita en Woffendin y col (1994) Proc. Natl. Acad Sci EEUU 91(24): 11581-11585. Además, se pueden administrar la secuencia de codificación y el producto de expresión de los anteriores mediante la deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado. Otros procedimientos convencionales para la administración de genes que se pueden usar para la administración de la secuencia de codificación incluyen, por ejemplo, el uso de pistola de partículas de transferencia de genes controlada manualmente, tal como se describe en el documento U.S. 5.149.655; uso de radiación ionizante para activar el gen transferido, tal como se describe en los documentos U.S. 5.206.152 y WO92/11033.

Los vehículos de administración de genes policatiónicos y liposomas a modo de ejemplo son aquellos descritos en los documentos US 5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO 95/13796; WO94/23697; y WO91/14445; en el documento EP-0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600: 1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550: 464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149: 119; Wang (1987) Proc Natl Acad Sci 84: 7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Una composición de polinucleótidos puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de terapia génica, según se define el término anteriormente. Para los objetivos de la presente descripción, una dosis eficaz estará entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 50 mg/kg o 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de los constructos de ADN en el individuo al cual se va a administrar.

Procedimientos de administración

Una vez formuladas, las composiciones de polinucleótidos de la descripción se pueden administrar (1) directamente al sujeto; (2) administrarse ex vivo, a las células derivadas procedentes del sujeto, o (3) in vitro para la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos que se van a tratar pueden ser mamíferos o pájaros. También, se pueden tratar sujetos humanos.

La administración directa de las composiciones se llevará a cabo generalmente mediante inyección, cualquiera de por vía subcutánea, intraperitoneal, transdérmica, o transcutánea, intravenosa o intramuscular o administrarse en el espacio intersticial de un tejido. Se pueden administrar también las composiciones en un tumor o lesión. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas, agujas, y cañones de genes o hipopulverizadores. La dosificación de tratamiento puede ser una pauta de dosis única o una pauta de dosis múltiple. Véase documento WO98/20734.

Se conocen en la técnica procedimientos para la administración y reimplante ex vivo de las células transformadas en un sujeto y se describen en, por ejemplo, el documento WO93/14778. Los ejemplos de células útiles en aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, células madre, concretamente hematopoyéticas, células linfoides, macrófagos, células dendríticas, o células tumorales.

Generalmente, se puede llevar a cabo la administración de ácidos nucleicos para aplicaciones ex vivo e in vitro mediante los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada con dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada con polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del(de los) polinucleótido(s) en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos, todos bien conocidos en la técnica.

Composiciones farmacéuticas de polinucleótidos y polipéptidos

Además de los vehículos y sales farmacéuticamente aceptables descritos anteriormente, se pueden usar los siguientes agentes adicionales con las composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos.

A. Polipéptidos

Un ejemplo son los polipéptidos que incluyen, sin limitación: asialoorosomucoide (ASOR); transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpos; ferritina; interleucinas; interferones, granulocitos, factor estimulante de las colonias de macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF), factor de células madre y eritropoyetina. Se pueden usar también antígenos víricos, tales como las proteínas de la envuelta. También las proteínas de otros organismos invasivos, tales como el péptido de 17 aminoácidos procedente de la proteína del circumsporozoito de plasmodium falciparum conocido como RII.

B. Hormonas, vitaminas, etc.

Otros grupos que se pueden incluir en una composición farmacéutica incluyen, por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona tiroidea, o vitaminas, ácido fólico.

C. Polialquilenos, polisacáridos, etc.

También, se puede incluir polialquilenglicol en composiciones farmacéuticas con los polinucleótidos y/o polipéptidos deseados. En una forma de realización preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, se pueden incluir mono, di, o polisacáridos. En una forma de realización preferida de este aspecto, el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano. También, se pueden incluir quitosano y poli(láctido-co-glicólido) en una composición farmacéutica.

D. Lípidos y liposomas

Se puede también encapsular el polinucleótido o polipéptido deseado en lípidos o empaquetarse en liposomas antes de la administración al sujeto o a las células derivadas del anterior.

La encapsulación en lípidos se lleva a cabo generalmente usando liposomas que son capaces de unir o atrapar establemente y retener el ácido nucleico o polipéptido. La relación de polinucleótido condensado a la preparación de lípido puede variar pero generalmente estará alrededor de 1:1 (mg de ADN: micromoles de lípidos), o más de lípido. Para una revisión del uso de liposomas como vehículos para la administración de ácidos nucleicos, véanse Hug y Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097: 1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101: 512-527.

Las preparaciones liposómicas para uso en la presente descripción incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras: Se ha demostrado que los liposomas catiónicos median la administración intracelular de ADN plásmido (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 84: 7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 86: 6077-6081); y factores de transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265: 10189-10192), en forma funcional.

Los liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo, están disponibles liposomas de M(1.2,3.dioleiloxi)propil)-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) bajo la marca comercial lipofectina, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Véase, también, Felgner, más arriba). Otros liposomas comercialmente disponibles incluyen transfectace
(DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Se pueden preparar otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente disponibles usando las técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 75: 4194-4198; documento WO90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).

De forma similar, están fácilmente disponibles los liposomas aniónicos y neutros, tales como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), o se pueden preparar fácilmente usando materiales fácilmente disponibles. Dichos materiales incluyen fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleoilfosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), entre otros. Se pueden mezclar también estos materiales con los materiales de partida de DOTMA y DOTAP en las relaciones apropiadas. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para preparar liposomas usando estos materiales.

Los liposomas pueden comprender vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequeñas (SUV), o vesículas unilamelares grandes (LUV). Los diversos complejos liposoma-ácido nucleico se preparan usando los procedimientos conocidos en la técnica. Véanse por ejemplo, Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101: 512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad Sci. EEUU 75: 4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394: 483; Wilson (1979) Cell 17: 77); Deamer y Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443: 629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 76: 3348); Enoch y Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 76: 145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255: 10431; Szoka y Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 75: 145; y Schaefer-Ridder (1982) Science 215: 166.

E. Lipoproteínas

Además, se pueden incluir lipoproteínas con el polinucleótido o polipéptido que se va a administrar. Los ejemplos de lipoproteínas que se van a utilizar incluyen; quilomicrones, HDL, IDL, LDL, y VLDL. Se pueden usar también mutantes, fragmentos, o fusiones de estas proteínas. También, se pueden usar modificaciones de lipoproteínas que se producen naturalmente, tales como LDL acetilada. Estas lipoproteínas pueden dirigir la administración de polinucleótidos en las células que expresan los receptores de lipoproteínas. Preferiblemente, si se incluyen lipoproteínas con el polinucleótido que se va a administrar, no se incluye otro ligando director en la composición.

Las lipoproteínas que se producen naturalmente comprenden una porción de lípido y proteína. Las porciones de proteínas se conocen como apoproteínas. Hasta el momento, se han aislado e identificado las apoproteínas A, B, C, D, y E. Al menos dos de éstas contienen diversas proteínas, designadas por los números romanos, AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.

Una lipoproteína puede comprender más de una apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones que se producen naturalmente comprenden A, B, C, y E; con el tiempo, estas lipoproteínas pierden A y adquieren las apoproteínas C y E. VLDL comprende las apoproteínas A, B, C, y E, LDL comprende la apoproteína B; y HDL comprende las apoproteínas A, C, y E.

Se conocen las secuencias de aminoácidos de estas apoproteínas y se describen en, por ejemplo, Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54: 699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151: 162; Chen (1986) J Biol Chem 261: 12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci EEUU 77: 2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65: 232.

Las lipoproteínas contienen una variedad de lípidos que incluyen, triglicéridos, colesterol (libre y ésteres), y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en las lipoproteínas que se producen naturalmente. Por ejemplo, los quilomicrones comprenden los triglicéridos principales. Se puede encontrar una descripción más detallada del contenido lípido de las lipoproteínas que se producen naturalmente, por ejemplo, en Meth. Enzymol. 129 (1986). La composición de los lípidos se escoge para ayudar en la conformación de la apoproteína para la actividad de unión con el receptor. Se puede escoger también la composición de los lípidos para facilitar la interacción y asociación hidrófoba con la molécula de unión al polinucleótido.

Se pueden aislar las lipoproteínas que se producen naturalmente a partir del suero mediante ultracentrifugación, por ejemplo. Se describen dichos procedimientos en Meth. Enzymol. (más arriba); Pitas (1980) J. Biochem. 255: 5454-5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64: 743-750.

Se pueden producir también las lipoproteínas mediante procedimientos recombinantes e in vitro mediante la expresión de los genes de la apoproteína en una célula huésped deseada. Véase, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15: 403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443.

Se pueden adquirir las lipoproteínas de suministradores comerciales, tales como Biomedical Technologies, Inc., Stougton, Massachusetts, EEUU.

Se puede encontrar una descripción adicional de las lipoproteínas en Zuckermann y col., Solicitud PCT nº US97/
14465.

F. Agentes policatiónicos

Se pueden incluir agentes policatiónicos, con o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido y/o el polipéptido deseados que se van a administrar.

Los agentes policatiónicos, normalmente, presentan una carga neta positiva a pH fisiológico relevante y son capaces de neutralizar la carga eléctrica de los ácidos nucleicos para facilitar la administración en una localización deseada. Estos agentes tienen aplicaciones in vitro, ex vivo, e in vivo. Se pueden usar agentes policatiónicos para administrar ácidos nucleicos en un sujeto vivo cualquiera de por vía intramuscular, subcutánea, etc.

Los siguientes son ejemplos de polipéptidos útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina y protamina. Otros ejemplos de polipéptidos útiles incluyen histonas, protaminas; albúmina de suero humano, proteínas de unión con el ADN, proteínas cromosómicas no histona, proteínas recubiertas procedentes de virus de ADN, tales como \PhiX174, factores transcripcionales que contienen también regiones que se unen al ADN y por tanto pueden ser útiles como agentes condensantes de ácidos nucleicos. De manera breve, los factores transcripcionales tales como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP, y TFIID contienen regiones básicas que se unen a secuencias de ADN.

Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen, espermina, espermidina, y putrescina.

Se pueden extrapolar las dimensiones y las propiedades físicas de un agente policatiónico a partir de la lista anterior, para construir otros agentes policatiónicos polipéptidos o para producir agentes policatiónicos sintéticos.

G. Agentes policatiónicos sintéticos

Los agentes policatiónicos sintéticos que son útiles en las composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno. Lipofectina^{TM}, y lipofectAMINE^{TM} son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos o polipéptidos.

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Ensayos inmunodiagnósticos

Se pueden usar antígenos MenB de Neisseria, o fragmentos antigénicos de la misma, de la descripción, en inmunoensayos para detectar niveles de anticuerpo (o, inversamente, se pueden usar anticuerpos MenB anti-Neisseria para detectar niveles de antígeno). Se pueden desarrollar inmunoensayos basados en antígenos recombinantes bien definidos para sustituir procedimientos diagnósticos invasivos. Se pueden detectar anticuerpos de proteínas MenB de Neisseria o fragmentos de la misma en el interior de muestras biológicas, que incluyen, por ejemplo, muestras de sangre o suero. El diseño de los inmunoensayos es objeto de una gran amplitud de variaciones, y se conocen en la técnica amplia variedad de éstas. Los protocolos para el inmunoensayo pueden estar basados, por ejemplo, en la competición, o la reacción directa, o los ensayos tipo sándwich, Los protocolos pueden también, por ejemplo, usar soportes sólidos, o pueden ser mediante inmunoprecipitación. La mayor parte de los ensayos implica el uso de un anticuerpo o polipéptido marcado; las marcas pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, o de tinte. Se conocen también los ensayos que amplifican las señales de la sonda, ejemplos de los cuales son los ensayos que utilizan biotina y avidina, y los inmunoensayos marcados con enzima y mediados, tales como los ensayos
ELISA.

Los kits adecuados para la inmunodiagnosis y que contienen los reactivos marcados apropiados se construyen empaquetando los materiales apropiados, que incluyen las composiciones de la invención, en contenedores adecuados, junto con los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, tampones adecuados, soluciones salinas, etc.) requeridas para la realización del ensayo, así como el conjunto de instrucciones de ensayo adecuado.

Hibridación del ácido nucleico

"Hibridación" se refiere a la asociación de dos secuencias de ácidos nucleicos entre sí mediante enlace de hidrógeno. Normalmente, una secuencia se fijará a un soporte sólido y otra estará libre en solución. A continuación las dos secuencias se colocarán en contacto entre sí en condiciones que favorecen el enlace de hidrógeno. Los factores que afectan este enlace incluyen: el tipo y volumen del disolvente; la temperatura de reacción; el tiempo de hibridación; la agitación, los agentes para bloquear la unión no específica de la secuencia de la fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la concentración de las secuencias; el uso de los compuestos para aumentar la velocidad de asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o polietilenglicol), y la restricción de las condiciones de lavado tras la hibridación. Véase Sambrook y col. (más arriba) Volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 a 9.57.

"Restricción" se refiere a las condiciones en una reacción de hibridación que favorecen la asociación de secuencias muy similares sobre secuencias que difieren. Por ejemplo, deberían escogerse la combinación de la temperatura y la concentración de sal que es aproximadamente de 120 a 200º C por debajo de la Tm calculada del híbrido en estudio. Las condiciones de temperatura y sal se pueden determinar a menudo empíricamente en los experimentos preliminares en los cuales las muestras de ADN genómico inmovilizado sobre filtros se hibridan con la secuencia de interés y a continuación se lavan bajo condiciones de diferentes restricciones. Véase Sambrook y col. en la página 9.50

Las variables a considerar cuando se lleva a cabo, por ejemplo, una inmunotransferencia Southern son (1) la complejidad del ADN que se está inmunotransfiriendo y (2) la homología entre la sonda y las secuencias que se están detectando. La cantidad total del(de los) fragmento(s) que se estudian puede variar una magnitud de 10, desde 0,1 a 1 \mug para un plásmido o fago digerido de 10^{-9} a 10^{-8} para un gen de copia única en un genoma eucariota muy complejo. Para los polinucleótidos de menor complejidad, se pueden usar la inmunotransferencia sustancialmente más corta, la hibridación, y los tiempos de exposición, una cantidad más pequeña de polinucleótidos de partida, y menor actividad específica de las sondas. Por ejemplo, se puede detectar un gen de levadura de copia única con un tiempo de exposición de sólo 1 hora comenzando con 1 \mug de ADN de levadura, inmunotransferencia durante dos horas, e hibridación durante 4-8 horas con una sonda de 10^{8} cpm/\mug. Para un gen de mamífero de copia única una solución conservativa podría comenzar con 10 \mug de ADN, inmunotransferencia durante la noche, e hibridar durante la noche en presencia de sulfato de dextrano al 10% usando una sonda mayor de 10^{8} cpm/\mug, dando como resultado un tiempo de exposición de \sim 24 horas.

Diversos factores pueden afectar la temperatura de fusión (Tf) de un híbrido de ADN-ADN entre la sonda y el fragmento de interés, y consecuentemente, las condiciones apropiadas para la hibridación y el lavado. En muchos casos, la sonda no es un 100% homóloga con el fragmento. Otras variables que se encuentran comúnmente incluyen la longitud y el contenido G+C total de las secuencias de hibridación y la fuerza iónica y el contenido de formamida del tampón de hibridación. Se pueden aproximar los efectos de todos estos factores mediante una ecuación única: Tf = 81 + 16,6 (log_{10}Ci) + 0,4(%(G+C)) - 0,6 (% formamida) - 600/n - 1,5 (% sin emparejar) en el que Ci es la concentración de sal (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares de bases (modificada ligeramente de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284).

Al diseñar un experimento de hibridación, se pueden alterar convenientemente algunos factores que afectan la hibridación del ácido nucleico: La temperatura de la hibridación y los lavados y la concentración de sal durante los lavados son lo más simple de ajustar. A medida que la temperatura de la hibridación aumenta (es decir, restricción), se vuelve menos probable que se produzca la hibridación entre las cadenas que no son homólogas, y como resultado, el fondo disminuye. Si la sonda radiomarcada no es completamente homóloga con el fragmento inmovilizado (tal como es frecuentemente el caso en la familia de genes y en los experimentos de hibridación interespecies), se debe reducir la temperatura de hibridación, y el fondo aumentará. La temperatura de los lavados afecta a la intensidad de la banda de hibridación y al grado de fondo de una manera similar. Se aumenta también la restricción de los lavados con la disminución de las concentraciones de sal.

En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida al 50% son 42ºC para una sonda que es un 95% a un 100% homóloga con el fragmento diana, 37ºC para un 90% a 95% de homología, y 32ºC para un 85% a un 90% de homología. Para homologías menores, debería disminuir el contenido de formamida y ajustarse la temperatura de acuerdo con esto, usando la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento diana no se conoce, la solución más simple es comenzar con la hibridación y las condiciones de lavado que no sean restrictivas. Si se observan bandas específicas o mucho fondo tras la autorradiografía, se puede lavar el filtro con restricción elevada y volverse a exponer. Si el tiempo requerido para la exposición hace esta solución imposible de realizar, deberían ensayarse en paralelo diversas restricciones de la hibridación y o el lavado.

Ensayos de sonda de ácido nucleico

Procedimientos tales como la PCR, ensayos de sonda de ADN ramificado, o técnicas de inmunotransferencia que utilizan sondas de ácido nucleico de acuerdo con la descripción pueden determinar la presencia de ADNc o ARNm. Se dice que una sonda se "hibrida" con una secuencia de la descripción si esta puede formar un dúplex o un complejo de doble cadena, que es suficientemente estable para detectarse, Las sondas de ácido nucleico hibridarán a las secuencias de nucleótidos Neisseriales de la descripción (incluyendo las cadenas de sentido directo y sentido contrario. Se piensa que muchas secuencias de nucleótidos diferentes codificarán la secuencia de aminoácidos, se prefiere la secuencia Neisserial natural debido a que es la secuencia real presente en las células. El ARNm representa una secuencia de codificación y de esta manera una sonda debería ser complementaria con la secuencia de codificación; el ADNc de cadena única es complementario con el ARNm, y de esta manera una sonda de ADNc debería ser complementaria con la secuencia no codificante.

La secuencia de la sonda no necesita ser idéntica a la secuencia Neisserial (o su complemento) -alguna variación en la secuencia y la longitud puede conducir a aumentar la sensibilidad del ensayo si la sonda de ácido nucleico puede formar un dúplex con los nucleótidos diana, que se pueden detectar. También, la sonda de ácido nucleico puede incluir nucleótidos adicionales para estabilizar el dúplex formado. Puede ser también saludable una secuencia Neisserial adicional como una marca para detectar el dúplex formado. Por ejemplo, se puede unir una secuencia de nucleótidos no complementaria al extremo 5' de la sonda, siendo complementaria con el resto de la secuencia de la sonda de una secuencia Neisserial. Alternativamente, se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias más largas en la sonda, proporcionando que la secuencia de la sonda tenga suficiente complementariedad con una secuencia Neisserial con el fin de hibridar la anterior y por tanto formar un dúplex que se pueda detectar.

La longitud y la secuencia exacta de la sonda dependerán de las condiciones de hibridación, tales como la temperatura, la condición de sal y similar, Por ejemplo, para aplicaciones diagnósticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia del analito, la sonda de ácido nucleico contiene normalmente al menos 10-20 nucleótidos, preferiblemente 15-25, y más preferiblemente al menos 30 nucleótidos, aunque puede ser más corta que esto. Los cebadores cortos requieren generalmente temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con la plantilla.

Se pueden producir sondas mediante procedimientos sintéticos, tales como el procedimiento triéster de Matteucci y col. (J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185), o de acuerdo con Urdea y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU (1983) 80: 7461), o usando los sintetizadores de oligonucleótidos automatizados comercialmente disponibles.

Se puede seleccionar la naturaleza química de la sonda de acuerdo con las preferencias. Para algunas aplicaciones, son apropiados ADN o ARN. Para otras aplicaciones, se pueden incorporar modificaciones, por ejemplo, se pueden usar modificaciones en el esqueleto tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, para aumentar la semivida in vivo, alterar la afinidad del ARN, aumentar la resistencia a la nucleasa etc (por ejemplo, véase Agrawal y Iyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6: 12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14: 376-387); se pueden usar también análogos como ácidos nucleicos péptidos (por ejemplo, véase Corey (1997) TIBTECH 15: 224-229; Buchardt y col. (1993) TIBTECH 11: 384-386).

Un ejemplo de un ensayo de hibridación de nucleótidos se describe por Urdea y col. en la solicitud de patente internacional WO92/02526 (véase también la Patente de los Estados Unidos 5.124.246).

Alternativamente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es otro medio bien conocido para detectar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos diana. Se describe el ensayo en: Mullis y col. (Meth. Enzymol. (1987) 155: 335-350); patente de los Estados Unidos 4.683.195; y patente de los Estados Unidos 4.683.202. Dos nucleótidos "cebadores" hibridan con los ácidos nucleicos diana y se usan para cebar la reacción. Los cebadores pueden comprender la secuencia que no hibrida con la secuencia de la amplificación diana (o su complemento) para ayudar en la estabilidad del dúplex o, por ejemplo, para incorporar un emplazamiento de restricción conveniente. Normalmente, dicha secuencia flanqueará la secuencia Neisserial deseada.

Una polimerasa termoestable crea copias de los ácidos nucleicos diana a partir de los cebadores usando los ácidos nucleicos diana originales como plantilla. Después que se genera una cantidad umbral de ácidos nucleicos diana por la polimerasa, se pueden detectar mediante más procedimientos tradicionales, tales como las inmunotransferencias Southern; Cuando se usa el procedimiento de la inmunotransferencia Southern, la sonda marcada hibridará con la secuencia Neisserial (o su complemento).

También, se puede detectar el ARNm o el ADNc mediante las técnicas de inmunotransferencia tradicionales descritas en Sambrook y col (más arriba).. se puede purificar el ARNm, o el ADNc generado a partir de ARNm usando un enzima polimerasa, y separarse usando electroforesis en gel. A continuación se inmunotransfieren los ácidos nucleicos en el gel sobre un soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone a una sonda marcada y a continuación se lava para eliminar cualquier sonda no hibridada. A continuación, se detectan los dúplex que contienen la sonda marcada. Normalmente, la sonda se marca con un resto radioactivo.

Ejemplos

Se incluyen los aspectos de los siguientes ejemplos que no se refieren específicamente a la invención reivindicada para ilustración y comprobación.

La descripción se basa en las 961 secuencias de nucleótidos procedentes del genoma de N. meningitidis que se muestran en el Apéndice C, SEC DE ID N^{os}: 1-961 de la solicitud '573, que representan sustancialmente en conjunto el genoma completo del serotipo B de N. meningitidis, así como la secuencia del genoma de longitud completa que se muestra en el Apéndice D, SEC DE ID Nº 1068 de la solicitud '573, y la secuencia del genoma d longitud completa que se muestra en el apéndice A de la presente, SEC DE ID Nº 1.

Será muy evidente para la persona experta en la técnica cómo esta información de la secuencia se puede utilizar de acuerdo con la invención, tal como se ha descrito anteriormente.

Las técnicas y procedimientos estándar que se pueden emplear con el fin de llevar a cabo la descripción (por ejemplo, para utilizar las secuencias descritas para predecir los polipéptidos útiles para objetivos de vacunación o diagnóstico) se han resumido anteriormente. Este resumen no es una limitación sobre la descripción sino, más bien, proporciona ejemplos que se pueden usar, pero que no se necesitan.

Estas secuencias se derivan de las contig que se muestran en el Apéndice C (SEC DE ID N^{os} 1-961(y de la secuencia del genoma de longitud completa que se muestra en el Apéndice D (SEC DE ID Nº 1068), que se prepararon durante la secuenciación del genoma de N. meningitidis (cepa B). La secuencia de longitud completa se ensambló usando el ensamblador TIGR tal como se describe por G. S. Sutton y col., TIGR Assembler: A New Tool for Assembling Large Shotgun Sequencing Projects, Genome Science and Technology, 1: 9-19 (1995) [véanse también R. D. Fleischmann, y col., Science 269, 496-512 (1995); C. M. Fraser, y col., Science 270, 397-403 (1995); C. J. Bult, y col., Science 273, 1058-73 (1996); C. M. Fraser, y col, Nature 390, 580-586 (1997); J.-F. Tomb, y col., Nature 388, 539-547 (1997); H. P. Klenk, y col., Nature 390, 364-70 (1997); C. M. Fraser, y col., Science 281, 375-88 (1998); M. J. Gardner, y col., Science 282, 1126-1132-(1998); K. E. Nelson, y col., Nature 399, 323-9 (1999)]. A continuación, usando los procedimientos anteriormente descritos, se determinaron los presuntos productos de la traducción de las secuencias. Se determinaron los análisis asistidos por ordenador de los productos de la traducción basándose en las comparaciones de las bases de datos; Las secuencias del gen y la proteína correspondiente, si acaso, se identificaron en Neisseria meningitidis (cepa A) y Neisseria gonorrhoeae. A continuación se expresaron las proteínas, se purificaron, y se caracterizaron para evaluar su antigenia e inmunogenia.

En concreto, se usaron los siguientes procedimientos para expresar, purificar, y caracterizar bioquímicamente las proteínas.

Preparación del ADN cromosómico

Se hizo crecer la cepa 2996 de N. meningitidis hasta fase exponencial en 100 ml de medio GC, se cosechó mediante centrifugación, y se volvió a suspender en 5 ml de tampón (sacarosa al 20%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, ajustados a pH 8,0). Tras 10 minutos de incubación en hielo, se lisaron las bacterias añadiendo 10 ml de solución de lisis (NaCl 50 mM, Na-Sarkosil al 1%, 50 \mug/ml de Proteinasa K) y se incubó la suspensión a 37ºC durante 2 horas. Se llevaron a cabo dos extracciones fenólicas (equilibradas a pH 8) y una extracción de ChCl_{3}/alcohol isoamílico (24:1). Se precipitó el ADN mediante la adición de acetato de sodio 0,3 M y 2 volúmenes de etanol, y se recogió mediante centrifugación. Se lavó el residuo una vez con etanol al 70% y se volvió a disolver en 4 ml de tampón (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Se midió la concentración de ADN leyendo la DO a 260 nm.

Diseño de oligonucleótidos

Se diseñaron los cebadores de los oligonucleótidos sintéticos en función de la secuencia de codificación de cada ORF, usando (a) la secuencia del meningococo B cuando se encuentra disponible, o (b) la secuencia del gonococo/meningococo A, adaptada al uso del codón de preferencia del meningococo. Se omitieron cualquiera de los péptidos señal predichos, deduciendo la secuencia del cebador de la amplificación en el extremo 5' inmediatamente en la dirección 3' desde la secuencia líder predicha.

Para la mayor parte de los ORF, los cebadores 5' incluyeron dos emplazamientos de reconocimiento del enzima de restricción (BamHI-NdeI, BamHI-NheI o EcoRI-NheI, dependiendo del modelo de restricción del gen); los cebadores 3' incluyeron un emplazamiento de restricción XhoI. Se estableció este procedimiento con el fin de dirigir la clonación de cada producto de amplificación (correspondiente a cada ORF) en dos sistemas de expresión diferentes: pGEX-KG (usando cualquiera de BamHI-XhoI o EcoRI-XhoI), y pET21b+ (usando cualquiera de NdeI-XhoI o NheI-XhoI).

1

Para algunos ORF, se llevaron a cabo dos amplificaciones diferentes para clonar cada ORF en los dos sistemas de expresión. Se usaron dos cebadores 5' diferentes para cada ORF, se usó el mismo 3' XhoI como antes

2

Se clonaron otros ORF en el vector de expresión pTRC y se expresaron como un aminotérmino de fusión etiquetado con His. Se puede incluir el péptido señal predicho en el producto final. Se incorporaron los emplazamientos de restricción NheI-BamHI usando los cebadores

3

Así como conteniendo las secuencias de reconocimiento del enzima de restricción, los cebadores incluyeron los nucleótidos que se hibridaron con la secuencia que se va a amplificar, El número de nucleótidos de hibridación depende de la temperatura de fusión del cebador completo, y se determinó para cada cebador usando las fórmulas:

4

La temperatura promedio de fusión de los oligos seleccionados fue de 65-70ºC para el oligo completo y de 50-55ºC para la región de hibridación sola.

Se sintetizaron los oligos mediante un Sintetizador de ADN/ARN 394 de Perkin Elmer, eluidos a partir de las columnas en 2 ml de NH_{4}-OH y desprotegidos mediante 5 horas de incubación a 56ºC. se precipitaron los oligos mediante la adición de Na-Acetato 0,3 M y 2 volúmenes de etanol. A continuación se centrifugaron las muestras y se volvieron a suspender los residuos en cualquiera de 100 \mul o 1 ml de agua. Se determinó la DO_{260} usando un espectrofotómetro Lambda Bio de Perkin Elmer y se determinó la concentración y se ajustó a 2-10 pmol/\mul.

La tabla 1 muestra los cebadores directo en inverso usados para cada amplificación. En algunos casos, debe señalarse que la secuencia de los cebadores no empareja exactamente la secuencia en el ORF. Cuando se llevan a cabo las amplificaciones iniciales, no se puede conocer la secuencia 5' y/o 3' completa para algunos ORF meningocócicos, aunque se pueden haber identificado las secuencias correspondientes en gonococo. Par la amplificación, se usarían de esta manera las secuencias gonocócicas como la base para el diseño del cebador, alteradas para tener en cuenta el codón de preferencia. En concreto, se pueden cambiar los siguientes codones: ATA \rightarrow ATT; TCG \rightarrow TCT; CAG \rightarrow CAA; AAG \rightarrow AAA; GAG\rightarrow GAA; CGA y CGG \rightarrow CGC; GGG \rightarrow GGC.

Amplificación

El protocolo estándar de PCR fue como sigue: 50-200 ng de ADN genómico se usaron como plantilla en presencia de 20-40 \muM de cada oligo, 400-800 \muM de solución de dNTP, tampón de PCR 1x (incluyendo MgCl_{2} 1,5 mM), 2,5 unidades de polimerasa Taq/DNA (usando un equipo Perkin-Elmer AmpliTaQ, GIBCO Platinum, Pwo DNA polimerasa, o Tahara Shuzo Taq polimerasa).

En algunos casos, la PCR se optimizó por adicción de 10 \mul de DMSO o 50 \mul de betaína 2 M.

Tras inicio caliente (añadiendo la polimerasa durante una incubación preliminar de 3 minutos de la mezcla complete a 95ºC), cada muestra experimenta una amplificación de doble paso: los 5 primeros ciclos se realizaron usando como temperatura de hibridación una de las de los oligos excluyendo las colas de las enzimas de restricción seguidas por 30 ciclos realizados según la temperatura de hibridación de los oligos de longitud completa. Los ciclos fueron seguidos por una etapa final de 10 minutos de duración a 72ºC.

Los ciclos convencionales son como sigue:

5

El tiempo de elongación varía según la longitud del ORF a amplificar.

Las amplificaciones se realizaron usando un sistema Perkin Elmer GeneAmp PCR System bien 9600 ó 2400. Para comprobar los resultados, 1/10 del volumen amplificado se introdujo en un gel de agarosa al 1-1.5% y se comparó el tamaño de cada fragmento amplificado con un marcador de peso molecular de ADN.

El ADN amplificado bien se introduce directamente en un gel de agarosa al 1% o se precipita primero con etanol y se vuelve a suspender en un volumen adecuado a introducir en un gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN correspondiente a la banda de tamaño adecuado se eluye y purifica a continuación del gel, usando el kit Qiagen Gel Extraction Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen final del fragmento de ADN fue de 30 \mul o 50 \mul bien en agua o Tris 10 mM, pH 8.5.

Digestión de los fragmentos de PCR

El ADN purificado correspondiente al fragmento amplificado se dividió en dos alícuotas y se digirió doblemente con:

NdeI/XhoI o NheI/XhoI para clonar en el pET-21b+ y expresión adicional de la proteína como fusión His-etiqueta en el término C.

BamHI/XhoI o EcoRI/XhoI para clonar en el pGEX-KG y expresión adicional de la proteína como fusión GST en el término N.

Para ORF 76, NheI/BamHI para clonar en el vector pTRC-HisA y expresión adicional de la proteína como fusión His-etiqueta en el término N.

Cada fragmento de ADN purificado se incubó (37ºC durante de 3 horas a toda la noche) con 20 unidades de cada enzima de restricción (New England Biolabs) en un volumen final de 30 ó 40 \mul en presencia del tampón apropiado. El producto de digestión se purificó a continuación usando el kit de purificación QIAquick PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante, y se eluyó hasta un volumen final de 30 (ó 50) \mul bien de agua o Tris-HCl 10 mM, pH 8.5. La concentración final de ADN se determinó por electroforesis en gel de agarosa al 1% en presencia de un marcador de peso molecular valorado.

Digestión de los vectores de clonación (pET22B, pGEX-KG y pTRC-His A)

10 \mug de plásmido se digirieron por duplicado con 50 unidades de cada enzima de restricción en un volumen de reacción de 200 \mul en presencia del tampón adecuado mediante incubación durante la noche a 37ºC. Tras cargar la digestión completa en un gel de agarosa al 1%, se purificó la banda correspondiente al vector digerido del gel usando el kit de extracción Qiagen QIAquick Gel Extraction y el ADN se eluyó en 50 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,5. Se evaluó la concentración de ADN midiendo la DO_{260} de la muestra y se ajustó a 50 \mug/\mul. Se usó 1 \mul de plásmido en cada procedimiento de clonación.

Clonación

Los fragmentos correspondientes a cada ORF, anteriormente digeridos y purificados, si ligaron a ambos pET22b y pGEX-KG. En un volumen final de 20 \mul, se unió una relación molar 3:1 fragmento/vector usando 0.5 \mul de NEB T4 ADN ligasa (400 unidades/\mul), en presencia del tampón suministrado por el fabricante. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas. En algunos experimentos, la unión se realizó usando el "Rapid Ligation Kit" de Boheringer, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Con el fin de introducir el plásmido recombinante en una cepa adecuada, se incubaron 100 \mul de células E. coli DH5 competentes con la disolución de reacción de la ligasa durante 40 minutos sobre hielo, a continuación a 37ºC durante 3 minutos, a continuación, tras añadir 800 \mul de caldo LB, de nuevo a 37ºC durante 20 minutos. A continuación las células se centrifugaron a máxima velocidad en una microcentrífuga Eppendorf y se volvieron a suspender en aproximadamente 200 \mul del sobrenadante. A continuación la suspensión se plaqueó sobre ampicilina LB (100 mg/ml).

La selección de los clones recombinantes se realizó haciendo crecer 5 colonias de clones aleatoriamente seleccionadas durante la noche a 37ºC bien en 2 ml (clones pGEX o pTC) o 5 ml (clones pET) de caldo LB + 100 \mug/ml de ampicilina. A continuación las células se aglomeraron y se extrajo el ADN usando el Kit Qiagen prep Spin Miniprep, siguiendo las instrucciones del fabricante, hasta un volumen final de 30 \mul. 5 \mul de cada minipreparación individual (aproximadamente 1 g) se digirieron bien con NdeI/XhoI o BamHI/XhoI y la digestión completa se cargó sobre un gel de agarosa al 1-1,5% (dependiendo del tamaño esperado del inserto), en paralelo con el marcador de peso molecular (1Kb DNA Ladder, GIBCO). La selección de los clones positivos se realizó sobre la base del tamaño correcto del inserto.

Clonación

Algunos ORF se pueden clonar en el vector pGEX-HIS usando emplazamientos de clonación EcoRI-PstI, EcoRI-SalI, o SalI-PstI. Tras clonación, los plásmidos recombinantes se pueden introducir en el huésped E. coli W3110.

Expresión

Cada ORF clonado en el vector de expresión puede a continuación ser transformado en la cepa adecuada para expresión del producto de proteína recombinante. Se usó 1 \mul de cada constructo para transformar 30 \mul de E. coli BL21 (vector pGEX), E. coli TOP 10 (vector pTRC) o E. coli BL21-DE3 (vector pET), según se ha descrito anteriormente. En el caso del vector pGEX-His, se usó la misma cepa E. coli (W3110) para la clonación y expresión inicial. Colonias recombinantes simples se inocularon en 2ml de LB+Amp (100 \mug/ml), se incubaron a 37ºC durante la noche, a continuación se diluyeron 1:30 en 20 ml de LB+Amp (100 \mug/ml) en frascos de 100 ml, asegurándose de que la DO_{600} estaba comprendida entre 0,1 y 0,15. Los frascos se incubaron a 30ºC en agitadores giratorios con baño de agua hasta que la DO indicó crecimiento exponencial adecuado para la inducción de la expresión (DO 0,4-0,8 para los vectores pET y TRC; DO 0.8-1 para los vectores pGEX y pGEXHis). Para los vectores pET, pTRC y pGEX-His, se indujo la expresión de proteínas por adición de IPTG 1 mM, mientras que en el caso del sistema pGEX, la concentración final de IPTG fue 0,2 mM. Tras 3 horas de incubación a 30ºC, se comprobó la concentración final de la muestra mediante la DO. Para comprobar la expresión, se retiró 1 ml de cada muestra, se centrifugó en una microcentrífuga, el residuo se volvió a suspender en PBS, y se analizó mediante SDS-PAGE al 12% con tinción de azul Coomassie. La muestra completa se centrifugó a 6000g y el residuo se volvió a suspender en PBS para uso posterior.

Purificación a gran escala de las proteínas de fusión GST

Se hizo crecer una única colonia durante la noche a 37ºC sobre una placa de agar LB+Amp. Las bacterias se inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un agitador con baño de agua y se hicieron crecer durante la noche. Las bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio fresco y se dejaron crecer a temperatura óptima (20-37ºC) hasta DO_{550} 0,8-1. Se indujo la expresión de proteína con IPTG 0,2 mM seguido por tres horas de incubación. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC. Se descartó el sobrenadante, y el residuo bacteriano se volvió a suspender en 7,5 ml de PBS frío. Las células se rompieron por sonicación sobre hielo durante 30 s a 40 W usando un sonificador Branson B-15, se congelaron y descongelaron dos veces y se volvieron a centrifugar. Se recogió el sobrenadante y se mezcló con 150 \mul de resina Glutation-Sefarosa 4B (Pharmacia) (previamente lavada con PBS) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de PBS frío durante 10 minutos, se volvió a suspender en 1 ml de PBS frío, y se introdujo en una columna desechable. La resina se lavó dos veces con 2 ml de PBS frío hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión GST se eluyó por adición de 700 \mul de tampón de elución de glutatión 10 mM frío (glutatión reducida 10 mM, Tris-HCl 50 mM) y las fracciones se recogieron hasta que la OD_{280} fue de 0,1. 21 \mul de cada fracción se cargaron en un gel SDS al 12% usando el patrón de peso molecular de intervalo amplio bien de Biorad SDS-PAGE (M1) (200, 116,25, 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5, 14,4, 6,5 kDa) o de Amersham Rainbow Marker (M'') (220, 66, 46, 30, 21,5, 14,3 kDa) como patrones. Como el PM de GST es 26 kDa, este valor debe añadirse al PM de cada proteína de fusión GST.

Purificación a gran escala de las proteínas de fusión His solubles

Se hizo crecer una única colonia durante la noche a 37ºC sobre una placa de agar. Las bacterias se inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un agitador con baño de agua y se incubaron durante la noche en un agitador con baño de agua. Las bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio fresco y se dejaron crecer a temperatura óptima (20-37ºC) hasta DO_{550} 0,8-1. Se indujo la expresión de proteína con IPTG 0,2 mM y el cultivo se incubó tres horas. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC, se descartó el sobrenadante y el residuo bacteriano se volvió a suspender en 7,5 ml de tampón de imidazol 10 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 10 mM, pH 8). Las células se rompieron por sonicación sobre hielo durante 30 s a 40 W usando un sonificador Branson B-15, se congelaron y descongelaron dos veces y se volvieron a centrifugar. Se recogió el sobrenadante y se mezcló con 150 \mul de resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con tampón imidazol 10 mM) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de tampón imidazol 10 mM frío durante 10 minutos, se volvió a suspender en 1ml de tampón imidazol 10 mM frío y se introdujo en una columna desechable. La resina se lavó a 4ºC con 2 ml tampón imidazol hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión His se eluyó por adición de 700 \mul de tampón imidazol 250 mM frío (NaCl 300 mM, tampón fosfato 50 mM, imidazol 250 mM, pH 8) y las fracciones se recogieron hasta que la OD_{280} fue de 0,1. 21 \mul de cada fracción se cargaron en un gel SDS al 12%.

Purificación a gran escala de las proteínas de fusión His insolubles

Se hizo crecer una única colonia durante la noche a 37ºC sobre una placa de agar. Las bacterias se inocularon en 20 ml de cultivo líquido LB+Amp en un agitador con baño de agua y se hicieron crecer durante la noche en un agitador con baño de agua. Las bacterias se diluyeron a 1:30 en 600 ml de medio fresco y se dejaron crecer a temperatura óptima (20-37ºC) hasta DO_{550} 0,6-0,8. Se indujo la expresión de proteína por adición de IPTG 1 mM y el cultivo se incubó tres horas más. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC, se descartó el sobrenadante y el residuo bacteriano se volvió a suspender en 7,5 ml de tampón B (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 10 mM, pH 8,8). Las células se rompieron por sonicación sobre hielo durante 30 s a 40 W usando un sonificador Branson B-15, se congelaron y descongelaron dos veces y se volvieron a centrifugar. El sobrenadante se almacenó a -20ºC, mientras que el residuo se volvió a suspender en 2 ml de tampón de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, tampón fosfato 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5) y se trató en un homogenizador durante 10 ciclos. El producto se centrifugó a 13.000 rpm durante 40 minutos. El sobrenadante se mezcló con 150 \mul de resina Ni^{2+} (Pharmacia) (previamente lavada con tampón B) y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 700 g durante 5 minutos a 4ºC. La resina se lavó dos veces con 10 ml de tampón B durante 10 minutos, se volvió a suspender en 1ml de tampón B y se introdujo en una columna desechable. La resina se lavó a temperatura ambiente con 2 ml de tampón B hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280} de 0,02-0,06. La resina se lavó con 2 ml de tampón C (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 6,3) hasta que el flujo pistón alcanzó una OD_{280} de 0,02-0,06. La proteína de fusión His se eluyó por adición de 700 \mul de tampón de elución (urea 8 M, Tris-HCl 10 mM, tampón fosfato 100 mM, pH 4,5) y las fracciones se recogieron hasta que la OD_{280} fue de 0,1. 21 \mul de cada fracción se cargaron en un gel SDS al 12%.

Renaturalización de las proteínas de fusión His

Se añadió glicerol al 10% a las proteínas desnaturalizadas. A continuación las proteínas se diluyeron hasta 20 \mug/ml usando tampón de diálisis I (glicerol al 10%, arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, urea 2 M, pH 8,8) y se sometió a diálisis contra el mismo tampón a 4ºC durante 12-14 horas. La proteína se dializó adicionalmente contra tampón de diálisis II (glicerol al 10%, arginina 0,5 M, tampón fosfato 50 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, pH 8,8) durante 12-14 horas a 4ºC. Se evaluó la concentración de proteínas mediante la fórmula:

Proteína \ (mg/ml) = (1,55 \ x \ OD_{280}) - (0,76 \ x \ OD_{260})

Inmunizaciones de los ratones

Se usaron 20 \mug de cada proteína purificada para inmunizar ratones intraperitonealmente. En el caso de algunos ORF los ratones Balb-C se inmunizaron con Al(OH)_{3} como coadyuvante los días 1, 21 y 42, y se siguió la respuesta inmune con muestras tomadas el día 56. Para otros ORF, los ratones CD1 se inmunizarían usando el mismo protocolo. Para otros ORF, los ratones CD1 se inmunizarían usando adyuvante de Freund, y se usó el mismo protocolo de inmunización, excepto en que la respuesta inmune se midió el día 42, en lugar del 56. De manera similar, para otros ORF adicionales, los ratones CD1 se inmunizarían usando adyuvante de Freund pero la respuesta inmune se mediría el día 49.

Ensayo ELISA (análisis del suero)

Se plaqueó la cepa MenB M7 acapsulada en placas de agar chocolate y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se recogieron las colonias bacterianas de las placas de agar usando un hisopo dracon estéril y se inocularon en 7 ml de caldo Mueller-Hinton (Difco) conteniendo glucosa al 0,25%. Se controló el crecimiento bacteriano cada 30 minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejó crecer las bacterias hasta que la DO alcanzó el valor de 0,3-0,4. El cultivo se centrifugó durante 10 minutos a 10000 rpm. Se descartó el sobrenadante, y las bacterias se lavaron una vez con PBS, se volvieron a suspender en PBS conteniendo formaldehido al 0.025% y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y a continuación durante la noche a 4ºC con agitación. Se añadieron 100 \mul de células bacterianas a cada pocillo de una placa Greiner de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 4ºC. A continuación los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado PBT (Tween-20 al 0,1% en PBS). Se añadieron 200 \mul de tampón de saturación (Polivinilpirrolidona 10 al 2,7% en agua) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con PBT. 200 \mul del suero diluido (tampón de dilución: BSA al 1%, Tween-20 al 0,1%, NaN_{3} al 0,1% en PBS) se añadieron a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con PBT. 100 \mul de suero de conejo anti-ratón conjugado con HRP (Dako) diluidos 1:2000 en tampón de dilución se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con tampón PBT buffer. 100 \mul de tampón sustrato para HRP (25 ml de tampón citrato pH 5, 10 mg de O-fenildiamina y 10 \mul de H_{2}O) se añadieron a cada pocillo y las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron 100 \mul de H_{2}SO_{4} a cada pocillo, y se siguió la DO_{490}. El ELISA se consideró positivo cuando la DO_{490} fue 2,5 veces la correspondiente del suero preinmune.

Procedimiento de ensayo de unión de bacterias FACScan

Se plaqueó la cepa MenB M7 acapsulada en placas de agar chocolate y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se recogieron las colonias bacterianas de las placas de agar usando un hisopo dracon estéril y se inocularon en 4 tubos que contenían cada uno 8 ml de caldo Mueller-Hinton (Difco) conteniendo glucosa al 0,25%. Se controló el crecimiento bacteriano cada 30 minutos siguiendo la DO_{620}. Se dejó crecer las bacterias hasta que la DO alcanzó el valor de 0,35-0,5. El cultivo se centrifugó durante 10 minutos a 4000 rpm. Se descartó el sobrenadante, y el residuo se volvió a suspender en tampón de bloqueo (BSA al 1%, NaN_{3} al 0,4%) y se centrifugó durante 5 minutos a 4000 rpm. Las células se volvieron a suspender en tampón de bloqueo para alcanzar una DO_{620} de 0,07. 100 \mul de células bacterianas se añadieron a cada pocillo de una placa Costar de 96 pocillos. 100 \mul de suero diluido (1:200) (en tampón de bloqueo) se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron durante 2 horas a 4ºC. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm, se aspiró el sobrenadante, y las células se lavaron por adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo en cada pocillo. 100 \mul de F(ab)_{2} cabra anti-ratón conjugado con R-Phicoerytrin diluido 1:100, se añadieron a cada pocillo, y placas se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Las células se rompieron por centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos y se lavaron por adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo. Se aspiró el sobrenadante y las células se volvieron a suspender en 200 \mul/pocillo de PBS, formaldehido al 0,25%. Las muestras se transfirieron a tubos FACScan y se leyeron. El estado el escenario FACScan fue: FL1 on, FL2y FL3 off; umbral FSC-H: 92; Voltaje FSC PMT: E 02; SSC PMT: 474; Ganancia de amplificado 7,1; FL-2 PMT: 539. Valores de
compensación: 0.

Preparaciones de OMV

Las bacterias se hicieron crecer durante la noche en 5 placas GC, se cosecharon con un asa de siembra y se volvieron a suspender en 10 ml de Tris-HCl 20 mM. Se realizó inactivación por calor a 56ºC durante 30 minutos y las bacterias se rompieron con sonicación durante 10 minutos sobre hielo (50% ciclo de carga, 50% sin carga). Las células sin romper se retiraron por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos y se recuperó la fracción total de cubiertas celulares mediante centrifugación a 50000 g a 4ºC durante 75 minutos. Para extraer las proteínas de la membrana citoplasmática de las membranas exteriores brutas, la fracción completa se volvió a suspender en sarkosilo al 2% (Sigma) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La suspensión se centrifugó a 10000 g durante 10 minutos para eliminar agregados, y el sobrenadante se ultracentrifugó adicionalmente a 50000 g durante 75 minutos para aglomerar las membranas externas. Las membranas externas se volvieron a suspender en Tris-HCl 10 mM, pH8 y se midió la concentración de proteínas con el ensayo Bio-Rad Protein, usando BSA como patrón.

Preparación de extractos completos

Las bacterias se hicieron crecer durante la noche en una placa GC, se cosecharon con un asa de siembra y se volvieron a suspender en 1 ml de Tris-HCl 20 mM. La inactivación por calor se realizó a 56ºC durante 30 minutos.

Inmunotransferencia Western

Proteínas purificadas (500 ng/hilera, vesículas de la membrana externa (5 \mug) y extractos celulares totales (25
\mug) derivados de la cepa MenB 2996 se cargaron en SDS-PAGE al 15% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 2 horas a 150 mA a 4ºC, en tampón de transferencia (base Tris al 0,3%, glicina al 1,44%, metanol al 20%). La membrana se saturó por incubación durante la noche a 4ºC en tampón de saturación (leche desnatada al 10%, Triton X100 al 0,1% en PBS). La membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (leche desnatada al 3%, Triton X100 al 0,1% en PBS) y se incubó durante 2 horas a 37ºC con suero de ratón diluido 1:200 en tampón de lavado. La membrana se lavó dos veces y se incubó durante 90 minutos con una dilución 1:2000 de Ig anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano picante. La membrana se lavó dos veces con Triton X100 al 0,1% en PBS y se reveló con el kit Opti-4CN Substrate Kit (Bio-#Rad). Se detuvo la reacción añadiendo agua.

Ensayo bactericida

Se hizo crecer la cepa MC58 durante la noche a 37ºC en placas de agar chocolate. Se recogieron 5-7 colonias que se usaron para inocular 7 ml de caldo Mueller-Hinton. La suspensión se incubó a 37ºC en un nutator y se dejó crecer hasta que la DO_{620} estuvo comprendida entre 0,5-0,8. El cultivo repartió en alícuotas en tubos Eppendorf estériles de 1,5 ml y se centrifugó durante 20 minutos a máxima velocidad en una microcentrífuga. El residuo se lavó una vez en tampón de Gey (Gibco) y se volvió a suspender en el mismo tampón hasta una DO_{620} de 0,5, se diluyó 1:20000 en tampón de Gey y se almacenó a 25ºC.

Se añadieron 50 \mul de tampón de Gey/BSA al 1% a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se añadieron 25 \mul de suero de ratón diluido (1:100) (tampón de dilución: tampón de Gey/BSA al 0,2%) a cada pocillo y la placa se incubó a 4ºC. Se añadieron 25 \mul a cada pocillo de la suspensión bacteriana anteriormente descrita. Se añadieron a cada pocillo 25 \mul de complemento de cría de conejo bien inactivada por calor (baño de agua a 56ºC durante 30 minutos) o normal. Inmediatamente tras la adición del complemento de cría de conejo, se plaquearon
22 \mul de cada muestra/pocillo en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 0). La placa de 96 pocillos se incubó durante 1 hora a 37ºC con rotación y a continuación 22 \mul de cada muestra/pocillo se plaquearon en placas de agar Mueller-Hinton (tiempo 1). Tras incubación durante la noche se contaron las colonias correspondientes al tiempo 0 y al
tiempo 1 h.

Las siguientes secuencias de ADN y aminoácido se identifican por los títulos de la siguiente forma: [g, m, o a] [#].[sec o pep], en la que "g" significa una secuencia procedente de N. gonorrhoeae, "m" significa una secuencia procediente de N. meningitidis B, y "a" significa una secuencia procediente de N. meningitidis A; "#" significa el número de la secuencia; "sec" significa una secuencia de ADN, y "pep" significa una secuencia de aminoácido. Por ejemplo, "g001.sec" se refiere a una secuencia de ADN de N. gonorrohoeae número 1. La presencia del sufijo
"-1" o "-2" en dichas secuencias indica una secuencia adicional encontrada en el mismo ORF. Además, los marcos de lectura abiertos se identifican como ORF #, en el que "#" significa el número del ORF, correspondiente al número de la secuencia que codifica el ORF, y las designaciones del ORF pueden tener un sufijo con ".ng" o ".a", indicando que el ORF corresponde a una secuencia de N. gonorrhoeae o a una secuencia de N. meningitidis A respectivamente. Se realizó análisis asistido por ordenador durante las comparaciones que siguen entre las secuencias de péptido
"g", "m", y "a" y en estas el sufijo "pep" queda implícito dónde no se define expresamente.

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Ejemplo 1

Se predijeron los siguientes ORF a partir de las secuencias contig y/o las secuencias de longitud completa usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Localización de los ORF

ORF:

CONTIG

279

gnm4.sec

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Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 2>:

m279.sec

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7

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Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 3; ORF 279>:

m279.pep

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8

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 4>:

g279.sec

\vskip1.000000\baselineskip

9

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Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 5; ORF 279.ng>:

g279.pep

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10

\vskip1.000000\baselineskip

El ORF 279 muestra una identidad del 89,5% sobre un solapamiento del aa 152 con un ORF predicho
(ORF 279.ng) procedente de N. gonorrhoeae:

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11

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 6>:

a.279.sec

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12

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 7; ORF 279.a>:

a279.pep

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13

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m279/a279 Los ORF 279 y 279.a mostraron una identidad del 88,2% en el solapamiento del aa 152

\vskip1.000000\baselineskip

14

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 8>

m519.sec (parcial)

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15

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 9; ORF 519>:

m519.pep (parcial)

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 10>

g519.sec

17

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos >SEC DE ID 11; ORF 519.ng>:

g519.pep

18

El ORF 519 muestra una identidad del 87,5% sobre un solapamiento del aa 200 con un ORF predicho (ORF 519.ng) procedente de N. gonorrhoeae:

19

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 12>:

a519.sec

20

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 13; ORF 519.a>:

a519.pep

21

\vskip1.000000\baselineskip

m519/a519 Los ORF 519 y 519.a mostraron una identidad del 99,5% en el solapamiento del aa 199

22

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El trabajo reveló además la siguiente secuencia de ADN identificada en N. meningitidis <SEC DE ID 14>:

m519.1.sec

23

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 15; ORF 519-1>:

m519-1.

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 16>:

g519-1.sec

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 17; ORF 519-1.ng>:

g519-1.pep

\vskip1.000000\baselineskip

26

\newpage

m519-1/g519-1 Los ORF 519-1 y 519-1.ng mostraron una identidad del 99,0% en el solapamiento del aa 315

27

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 18>:

a519-1.sec

\vskip1.000000\baselineskip

28

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 19; ORF 519-1.a>:

a519-1.pep.

29

\vskip1.000000\baselineskip

m519-1/a519-1 Los ORF 519-1 y 519-1.a mostraron una identidad del 99,0% en el solapamiento del aa 315

30

300

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Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 20>:

m576.sec.. (parcial)

31

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 21; ORF 576>:

m576.pep.. (parcial)

32

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Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 22>:

g576.sec.. (parcial)

33

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SECDE ID 23; ORF 576.ng>:

g576.pep.. (parcial)

34

\vskip1.000000\baselineskip

El análisis asistido por ordenador de esta secuencia de aminoácidos proporcionó los siguientes resultados:

Homología con un ORF predicho de N. gonorrhoeae

m576/g576 Identidad del 97,2% en el solapamiento del aa 215

35

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 24>

a576.sec

36

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 25; ORF 576.a>:

a576.pep

37

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m576/a576 Los ORF 576 y 576.a mostraron una identidad del 99,5% en el solapamiento del aa 222

38

El trabajo adicional reveló la siguiente secuencia de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 26>:

m576-1.sec

39

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 27; ORF 576-1>:

m576-1.pep

40

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 28>:

g576-1.sec

41

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 29; ORF 576-1.ng>:

g576-1.pep

42

g576-1/m576-1 Los ORF 576-1 y 576-1.ng mostraron una identidad del 97,8% en el solapamiento del aa 272

43

Se identificó la siguiente secuencia de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 30>:

a576-1.sec

44

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 31; ORF 576-1.a>:

a576-1.pep

45

a576-1/m576-1 Los ORF 576-1 y 576-1.a mostraron una identidad del 99,6% en el solapamiento del aa 272

46

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 32>

m919.sec

47

48

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 33; ORF 919>:

m919.pep

49

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 34>:

m919-2.sec

50

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 35; ORF 919-2>:

m919-2.pep

52

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 36>:

g919.sec

53

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 37; ORF 919.ng>:

g919.pep

54

\newpage

El ORF 919 muestra una identidad del 95,9% sobre un solapamiento del aa 441 con un ORF predicho (ORF 919.ng) procedente de N. gonorrhoeae:

m919/g919

\vskip1.000000\baselineskip

55

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 38>:

a919.sec

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 39; ORF 919.a>:

a919.pep

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57

\newpage

m919/a919 Los ORF 919 y 919.a mostraron una identidad del 98,6% en el solapamiento del aa 441

58

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 40>:

m121.sec

59

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 41; ORF 121>:

m121.pep

60

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 42>:

g121.sec

61

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 43; ORF 121.ng>:

g121.pep

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

El ORF 121 muestra una identidad del 73,5% sobre un solapamiento del aa 366 con un ORF predicho (ORF121.ng) procedente de N. gonorrhoeae:

m121/g121

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 44>:

a121.sec

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 45; ORF 121.a>:

a121.pep

\vskip1.000000\baselineskip

66

\newpage

m121/a121 Los ORF 121 y 121.a mostraron una identidad del 74,0% en el solapamiento del aa 366

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

El trabajo adicional reveló la secuencia de ADN identificada en N. meningitidis <SE DE ID 46>:

m121-1.sec

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 47; ORF 121-1>:

m121-1.pep

70

\vskip1.000000\baselineskip

m121-1/g121 Los ORF 121-1 y 121.ng mostraron una identidad del 95,6% en el solapamiento del aa 366

71

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 48>:

a121-1.sec

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 49; ORF 121-1.a>:

a121-1.pep

\vskip1.000000\baselineskip

73

\newpage

m121-1/a121-1 Los ORF 121-1 y 121-1.a mostraron una identidad del 96,4% en el solapamiento del aa 366

\vskip1.000000\baselineskip

74

\newpage

128 y 128-1

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 50>

m128.sec (parcial)

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 51; ORF 128>:

m128.pep (parcial)

\vskip1.000000\baselineskip

76

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 52>

g128.sec

77

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 53; ORF 128.ng>:

g128.pep

78

El ORF 128 muestra una identidad del 91,7% sobre un solapamiento del aa 475 con un ORF predicho (ORF 128.ng) procedente de N. gonorrhoeae:

m128/g128

79

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 54>:

a128.sec

80

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 55; ORF 128.a>:

a128.pep

81

\newpage

m128/a128 Los ORF 128 y 128.a mostraron una identidad del 66,0% en el solapamiento del aa 677

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

El trabajo adicional reveló la secuencia de ADN identificada en N. meningitidis <SEC DE ID 56>:

m128-1.sec

84

85

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 57; ORF 128-1>:

m128-1.pep.

\vskip1.000000\baselineskip

86

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 58>:

g128-1.sec (parcial)

87

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 59; ORF 128-1.ng>:

m128.sec (parcial)

88

\vskip1.000000\baselineskip

m128-1/g128-1 Los ORF 128-1 y 128-1.ng mostraron una identidad del 94,5% en el solapamiento del aa 491

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 60>

a128-1.sec

91

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 61; ORF 128-1.a>:

a128-1.pep

92

m128-1/a128-1 Los ORF 128-1 y 128-1.a mostraron una identidad del 97,8% en el solapamiento del aa 677

93

94

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 62>

m206.sec

95

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 63; ORF 206>:

m206.pep..

96

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 64>:

g206.sec

\vskip1.000000\baselineskip

97

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 65; ORF 206.ng>:

g206.pep

98

\vskip1.000000\baselineskip

El ORF 206 muestra una identidad del 96,0% sobre un solapamiento del aa 177 con un ORF predicho (ORF 206.ng) procedente de N. gonorrhoeae:

m206/g206

99

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 66>:

a206.sec

100

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 67; ORF 206.a>:

a206.pep..

101

\newpage

m206/a206 Los ORF 206 y 206.a mostraron una identidad del 99,4% en el solapamiento del aa 177

102

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 68>:

m287.sec

\vskip1.000000\baselineskip

103

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 69; ORF 287>:

m287.pep

104

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 70>:

g287.sec

105

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 71; ORF 287.ng>:

g287.pep

106

m287/g287 Los ORF 287 y 287.ng mostraron una identidad del 70,1% en el solapamiento del aa 499

107

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 72>:

a287.sec

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 73; ORF 287.a>:

a287.pep

111

m287/a287 Los ORF 287 y 287.a mostraron una identidad del 77,2% en el solapamiento del aa 501

112

113

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 74>:

m406.sec

114

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 75; ORF 406>:

m406.pep

115

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. gonorrhoeae <SEC DE ID 76>:

g406.sec

116

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 77; ORF 406.ng>:

g406.pep

117

El ORF 406.ng muestra una identidad del 98,8% sobre un solapamiento del aa 320 con un ORF predicho (ORF 406.a) procedente de N. gonorrhoeae:

g406/m406

118

119

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 78>:

a406.sec

120

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 79; ORF 406.a>:

a406.pep

121

\newpage

m406/a406 Los ORF 406 y 406.a mostraron una identidad del 98,8% en el solapamiento del aa 320

122

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 80>:

m726.sec

123

\newpage

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos >SEC DE ID 81; ORF 726>:

m726.pep

124

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 82>:

m907-2.sec

125

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 83; ORF 907-2>:

m907-2.pep

126

\vskip1.000000\baselineskip

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 84>:

m953.sec

127

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 85; ORF 953>:

m953.pep

128

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 86>:

orfl-1.sec

129

131

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 87; ORF oral-1>:

orfl-1.pep

132

\newpage

Se identificó la siguiente secuencia parcial de ADN en N. meningitidis <SEC DE ID 88>:

orf46-2.sec

133

\vskip1.000000\baselineskip

Esta corresponde a la secuencia de aminoácidos <SEC DE ID 89; ORF orf46-2>:

orf46-2.pep

134

\newpage

Usando los procedimientos anteriormente descritos, se emplearon los siguientes cebadores de oligonucleótidos en el ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el fin de clonar los ORF según se ha indicado:

Oligonucleótidos usados en la PCR TABLA 1

\vskip1.000000\baselineskip

135

\newpage

Ejemplo 2 Expresión de ORF 919

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 919 para localizar y clonar el ORF 919. Se clonó el gen 919 predicho en el vector pET y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de expresión y purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de la proteína de fusión 919-His. Se inmunizaron los ratones con la 919-His purificada y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular; PP, proteína purificada, TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 919 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 10 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 919. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11:9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 919 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 3 Expresión de ORF 279

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 279 para localizar y clonar ORF 279. Se clonó el gen 279 predicho en el vector pGex y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de expresión y purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de 279-GST. Se inmunizaron los ratones con la 279-GST purificada y se usó el suero para el análisis de la inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 279 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 11 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 279. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 279 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 4 Expresión de ORF 576

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 576 para localizar y clonar ORF 576. Se clonó el gen 576 predicho en el vector pGex y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de la proteína de fusión 576-GST. Se inmunizaron los ratones con la 576-GST purificada y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que ORF 576 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 12 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 576. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 279 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 5 Expresión de ORF 519

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 519 para localizar y clonar ORF 519. Se clonó el gen 519 predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de la proteína de fusión 510-His. Se inmunizaron los ratones con la 519-His purificada y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 519 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 13 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 519. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 519 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 6 Expresión de ORF 121

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 121 para localizar y clonar ORF 121. Se clonó el gen 121 predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de la proteína de fusión 121-His. Se inmunizaron los ratones con la 121-His purificada y se usó el suero para el análisis de la inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Los resultados muestran que 121 es una proteína expuesta a la superficie. Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 121 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 14 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 121. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 121 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 7 Expresión de ORF 128

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 128 para localizar y clonar ORF 128. Se clonó el gen 128 predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de la 128-His. Se inmunizaron los ratones con la 128-His purificada y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Los resultados muestran que 128 es una proteína expuesta a la superficie. Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 128 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 15 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 128. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 128 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 8 Expresión de ORF 206

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 206 para localizar y clonar ORF 206. Se clonó el gen 206 predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de 206-His. Se inmunizaron los ratones con la 206-His purificada y se usó el suero para la inmunotransferencia occidental (panel B). No tiene mayor importancia que la banda inmunorreactiva en los extractos de proteínas del meningococo sea de 38 kDa en vez de 17 kDa (panel A). Para obtener información sobre la naturaleza de esta tinción de anticuerpo los inventores expresaron ORF 206 en E. coli sin la etiqueta His e incluyeron el péptido líder predicho. Los análisis de inmunotransferencia sobre los extractos de proteína total de E. coli que expresaban esta forma nativa de la proteína 206 mostraron una banda reactiva en una posición de 38 kDa, tal como se observó en meningococo. Los inventores concluyen que la banda de 38 kDa en el panel B) es específica y que los anticuerpos anti-206, reconocen probablemente un complejo de proteínas multiméricas. En el panel C se muestra el análisis FACS, en el panel D el ensayo bactericida, y en el panel E el ensayo ELISA. Los resultados muestran que 206 es una proteína expuesta a la superficie. Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 206 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 16 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 519. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 206 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 9 Expresión de ORF 287

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 287 para localizar y clonar ORF 287. Se clonó el gen 287 predicho en el vector pGex y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de la proteína de fusión 287-GST. Se inmunizaron los ratones con la 287-GST purificada y se usó el suero para el análisis FACS (panel B), el ensayo bactericida (panel C), y el ensayo ELISA (panel D). Los resultados muestran que 287 es una proteína expuesta a la superficie. Símbolos: M1, marcador de peso molecular. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A). Estos experimentos confirman que 287 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 17 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 287. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 287 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

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Ejemplo 10 Expresión de ORF 406

Se usó el cebador descrito en la Tabla 1 de ORF 406 para localizar y clonar ORF 406. Se clonó el gen 406 predicho en el vector pEt y se expresó en E. coli. Se analizó el producto de purificación de la proteína mediante SDS-PAGE. En el panel A) se muestra el análisis de la purificación de la proteína de fusión 406-His. Se inmunizaron los ratones con la 406-His purificada y se usó el suero para el análisis de inmunotransferencia occidental (panel B), el análisis FACS (panel C), el ensayo bactericida (panel D), y el ensayo ELISA (panel E). Los resultados muestran que 406 es una proteína expuesta a la superficie. Símbolos: M1, marcador de peso molecular; TP, extracto de proteína total de N. meningitidis; OMV, preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis. Las flechas indican la posición del producto de proteína recombinante principal (A) y la banda inmunorreactiva de N. meningitidis (B). Estos experimentos confirman que 406 es una proteína expuesta a la superficie y que es un inmunógeno útil. En la Figura 18 se proporcionan las representaciones gráficas de la hidrofilia, el índice antigénico, y las regiones anfipáticas de ORF 406. Se usó el programa AMPHI para predecir los presuntos epitopos de las células T (Gao y col 1989, J. Immunol 143: 3007; Roberts y col. 1996, AIDS Res Human Retroviruses 12: 593; Quakyi y col. 1992, Scand J Immunol Supl 11: 9). En el Ejemplo 1 se proporcionan la secuencia de ácidos nucleicos de ORF 406 y por tanto la secuencia de aminoácidos codificada.

Se pretende que los anteriores ejemplos ilustren, pero no limiten la invención.

Claims (8)

1. Una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.

2. Una proteína constituida por una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1, cuya secuencia tiene un 95% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.

3. Un anticuerpo que se une a una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, constituido por los nucleótidos 1363680 a 1364114 de la SEC DE ID Nº: 1.

6. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. El ácido nucleico constituido por una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos según se define en la reivindicación 5.

8. Una composición que comprende una proteína, un ácido nucleico, o un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.