CN101260148A

CN101260148A - 奈瑟球菌蛋白质的杂合和串联表达

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Publication number: CN101260148A
Application number: CNA200810092103XA
Authority: CN
Inventors: M·皮扎
Original assignee: Chiron SRL
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2002-09-06
Publication date: 2008-09-10
Anticipated expiration: 2022-09-06
Also published as: PT2360176E; CA2459816C; NZ532115A; EP2327719A1; DK2360176T3; US20110250223A1; EP2327719B1; EP2360176B1; JP2014051497A; US8840907B2; US20120195919A1; EP1423419B1; NZ547145A; ES2556770T3; US9056075B2; MXPA04002216A; CN101260148B; EP2360176A3; WO2003020756A2; RU2339646C2

Abstract

连接两种或多种奈瑟球菌蛋白质从而使它们被翻译成一条多肽链。提供分子式为NH₂－A－[－X－L－]_n－B－COOH的杂合蛋白质，其中X是一种氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N－末端氨基酸序列，B是任选的C－末端氨基酸序列，n是大于1的整数。蛋白质中各n－X－部分的序列与其它－X－部分具有序列相同性，这种蛋白质是一种串联蛋白质。

Description

奈瑟球菌蛋白质的杂合和串联表达

本案是2002.09.06提交的申请号为02822187.7(PCT/IB02/03904)，名为“奈瑟球菌蛋白质的杂合和串联表达”的分案申请

所有本文所引用文献全部纳入本文供参考。

技术领域

本发明属于蛋白质表达领域。具体涉及奈瑟球菌(Neisseria)(如淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeaee)或优选脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis))的蛋白质表达。

背景技术

参考文献1和2揭示了参考文献3到6所述奈瑟球菌蛋白质表达的一种另和改进的方法。一个这种方法是生成“杂合性”蛋白质，此蛋白中两种或多种奈瑟球菌蛋白质表达为一条多肽链。此方法有两个优点。首先，自身表达可能不稳定或弱的蛋白质可通过加入适当的伴侣来协助克服其问题。第二，简化工业生产，因为仅需采用一次表达和纯化即可产生两种单独有用的蛋白质。

本发明的一个目标是进一步提供另一种和改进的奈瑟球菌蛋白质表达方法。

发明的概述

杂合蛋白质

因此发明提供同时表达两种或多种(如3、4、5、6或更多)奈瑟球菌蛋白质的方法，其中连接所述两种或多种蛋白质从而使它们被翻译成一条多肽链。一般，本发明的杂合蛋白质可表示为公式NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中X是一条氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数。

n的值在2和x之间，x的值通常是3、4、5、6、7、8、9或10。n优选是2、3或4；更优选是2或3；最优选n＝2。

-X-部分

本发明有两种主要的杂合蛋白质组。这两组不互相排斥。

在第一组中，各-X-部分是：

(a)orf1、orf4、orf25、orf40、orf46.1、orf83、NMB1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列；

(b)与(a)的氨基酸序列有序列相同性的氨基酸序列；或

(c)含(a)的氨基酸序列片断的氨基酸序列

优选(a)的亚组是：orf46.1、230、287、741、919、936、953、961和983。更优选的(a)的亚组是：orf46.1、287、741和961。图3显示优选的杂合蛋白质。

在第二组中，该杂合蛋白质包括第一个-X-部分(-X_a-)和第二个-X-部分(-X_b-)。-X_a-部分具有下列氨基酸序列之一：

(d)参考文献3所述的446个偶数序列编号SEQ IDs(即2、4、6...890、892)；

(e)参考文献4所述的45个偶数SEQ IDs(即2、4、6...88、90)；

(f)参考文献5所述的1674个偶数SEQ IDs 2-3020、偶数SEQ IDs 3040-3114和所有的SEQ IDs 3115-3241；

(g)参考文献7的2160个氨基酸序列，NMB0001到NMB2160；

(h)参考文献1或2所述的氨基酸序列。

-X_b-部分与-X_a-的关系如下：(i)-X_b-与-X_a-具有序列相同性和/或(j)-X_b-包括-X_a-的片断。

此第二种杂合性蛋白质例子包括的蛋白质中有两个或多个相同的-X-部分，或它们是同一蛋白质的变体，如同一蛋白质的两种多态，可表示为-X_a-X_b-；三种多态型，可表示为-X_a-X_b-X_c等。

-X_a-X_b-部分可以是从N-末端到C-末端的任一顺序。

-X_a-部分优选是orf1、orf4、orf25、orf40、orf46.1、orf83、NMB1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列。-X_a-部分更优选是orf46.1、230、287、741、919、936、953、961和983。-X_a-部分最优选是：orf46.1、287、741或961氨基酸序列。

这些蛋白质中，各n-X-部分与其它各-X-部分具有序列相同性，此蛋白质称为“串联蛋白质”。优选n＝2的串联蛋白质。

(b)和(i)中的‘序列相同性’程度优选大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高直至100％)。这包括突变体、同源物、直向同源物、等位基因变体等(如参见参考文献8)。相同性优选通过MPSRCH程序(Oxford Molecular)中应用的Smith-Waterman同源性检索算法来确定，使用参数空格开放罚分(gap openpenalty)＝12和空格延伸罚分(gap extension penalty)＝1的相关空格检索。通常，将两个蛋白质间50％或更高的相同性视为功能相等的指征。

(c)和(j)中所指‘片断’应包括(a)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的氨基酸序列的至少m个连续氨基酸，取决于具体序列。m是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更大)。

这些片断优选包含(a)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)氨基酸序列的抗原表位。优选的片断见参考文献9和10所述。

优选的(c)和(j)片断是C-和/或N-末端的截短物(如Δ1-287、Δ2-287等)。

优选的(b)、(c)和(j)序列删除了聚甘氨酸序列。已发现这样有助于表达[参考文献2]。聚甘氨酸序列可表示为(Gly)_g，其中g≥3(如4、5、6、7、8、9或更大)。如果-X-部分包含其野生型中的聚甘氨酸序列，在本发明的杂合蛋白质中优选删除此序列。这可以通过破坏或去除(Gly)_g，如通过缺失(如CGGGGS→CGGGS、CGGS、CGS或CS)、通过取代(如CGGGGS→CGXGGS、CGXXGS、CGXGXS等)和/或通过插入(如CGGGGS→CGGXGGS、CGXGGGS等)而实现。优选缺失(Gly)_g，缺失直至包含聚甘氨酸序列的蛋白质N-末端部分(如缺失SEQ ID 1中的残基1-32)本文称为‘ΔG’。删除聚甘氨酸序列具体用于蛋白质287、741、983和Tbp2(ΔG287、ΔG 741、ΔG 983和ΔG Tbp2-参考文献1和2)。

优选的(c)和(j)片断删除了整个蛋白质结构域。这具体用于蛋白质961、287和ORF46。一旦蛋白质在概念上分成结构域，(c)和(j)片断可删除一个或多个这些结构域(如287B、287C、287BC、ORF46_1-433、ORF46_433-608、961c-参考文献2；本文图4和5)。

287蛋白质在概念上分成三个结构域，称为A、B和C(参见参考文献2的图5)。结构域B具有IgA蛋白酶的排列，结构域C具有转铁蛋白-结合蛋白的排列，结构域A显示与数据库序列无强排列。287的多态型排列见参考文献8所述。

ORF46在概念上分成两个结构域：种和血清型之间非常保守的第一结构域(氨基酸1-433：ORF46.1)和不很保守的第二结构域(氨基酸433-608)。优选缺失该第二结构域，留下ORF46.1。ORF46的多态型排列见参考文献8所述。

961蛋白质在概念上分成几个结构域(图4)。

如果-X-部分含有野生型的前导肽序列，可将它包含在本发明的杂合蛋白质中或删除。当删除此前导肽时，这是(c)和(j)中氨基酸序列的优选例子。在一个实施方案中，缺失此前导肽，除了位于杂合蛋白质N-末端的-X-部分，即保留X₁的前导肽，但出去删去X₂...X_n的前导肽。这相当于缺失所有前导肽并采用X₁的前导肽作为部分-A-。

当n＝2时，-X-部分的优选配对是：ΔG287和230；ΔG287和936；ΔG287和741；961c和287；961c和230；961c和936；961cL和287；961cL和230；961cL和936；ORF46.1和936；ORF46.1和230；230和961；230和741；936和961；936和741。当n＝2时，串联蛋白质的-X-部分优选配对是：ΔG741和741；ΔG287和287。更具体的是，当n＝2时优选下列X₁和X₂的组合：

X₁	X₂
X₁	X₂	ΔG287	230
ΔG287	936	ΔG287	230
ΔG287	936	ΔG287	741
ΔG287	961	ΔG287	741
ΔG287	961	ΔG287	ORF46.1
ΔG287	919	ΔG287	ORF46.1
ΔG287	919	ΔG287	953
961c	287	ΔG287	953
961c	287	961c	230
961c	936	961c	230
961c	936	961c	741
961c	983	961c	741
961c	983	961c	ΔG983
961c	ORF46.1	961c	ΔG983
961c	ORF46.1	961	ORF46.1
961cL	287	961	ORF46.1
961cL	287	961cL	230
961cL	936	961cL	230

X₁	X₂
X₁	X₂	230	ΔG287
936	ΔG287	230	ΔG287
936	ΔG287	741	ΔG287
961	ΔG287	741	ΔG287
961	ΔG287	ORF46.1	ΔG287
919	ΔG287	ORF46.1	ΔG287
919	ΔG287	953	ΔG287
287	961c	953	ΔG287
287	961c	230	961c
936	961c	230	961c
936	961c	741	961c
983	961c	741	961c
983	961c	ΔG983	961c
ORF46.1	961c	ΔG983	961c
ORF46.1	961c	ORF46.1	961
287	961cL	ORF46.1	961
287	961cL	230	961cL
936	961cL	230	961cL

ORF46.1	936
ORF46.1	936	ORF46.1	230
ORF46.1	741	ORF46.1	230
ORF46.1	741	ORF46.1	ΔG741
ORF46.1	983	ORF46.1	ΔG741
ORF46.1	983	ORF46.1	ΔG983
230	961	ORF46.1	ΔG983
230	961	230	741
230	ΔG741	230	741
230	ΔG741	936	961
936	741	936	961
936	741	936	ΔG741
ΔG741	741	936	ΔG741
ΔG741	741	ORF46.1	983
ΔG741	ORF46.1	ORF46.1	983
ΔG741	ORF46.1	ΔG741	983
ΔG741	961	ΔG741	983
ΔG741	961	ΔG741	961c
ΔG983	ORF46.1	ΔG741	961c
ΔG983	ORF46.1	ΔG983	961
ΔG983	961c	ΔG983	961

936	ORF46.1
936	ORF46.1	230	ORF46.1
741	ORF46.1	230	ORF46.1
741	ORF46.1	ΔG741	ORF46.1
983	ORF46.1	ΔG741	ORF46.1
983	ORF46.1	ΔG983	ORF46.1
961	230	ΔG983	ORF46.1
961	230	741	230
ΔG741	230	741	230
ΔG741	230	961	936
741	936	961	936
741	936	ΔG741	936
ΔG287	287	ΔG741	936
ΔG287	287	983	ORF46.1
ORF46.1	ΔG741	983	ORF46.1
ORF46.1	ΔG741	983	ΔG741
961	ΔG741	983	ΔG741
961	ΔG741	961c	ΔG741
ORF46.1	ΔG983	961c	ΔG741
ORF46.1	ΔG983	961	ΔG983
961c	ΔG983	961	ΔG983

其中287以全长形式使用，优选287位于杂合蛋白质的C-末端；如果287要用于N-末端，优选使用287的ΔG形式。类似的，当741以全长形式使用时，优选位于杂合蛋白质的C-末端；如果它要用于N-末端，优选使用741的ΔG形式。

-L-部分

对于[-X-L-]的各n实例，接头氨基酸序列-L-可以存在或没有。例如，当n＝2时，杂合物可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等。

接头氨基酸序列-L-通常较短(如20个或更少氨基酸即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括能促进克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)和组氨酸尾(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它适合的接头氨基酸序列是本领域技术人员懂得的。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID 27)，其中Gly-Ser二肽形成自BamHI限制性酶切位点从而有助于克隆和操作，Gly₄四肽是典型的聚甘氨酸接头。

如果X_n+1是ΔG蛋白质且L_n是甘氨酸接头，这相当于不是ΔG蛋白质且没有L_n的X_n+1。

-A-部分

-A-是任选的N-末端氨基酸序列。它通常较短(如40个或更少氨基酸即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或者有利于克隆或纯化的短肽序列(如含有组氨酸尾即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它适合的N-末端氨基酸序列是本领域技术人员懂得的。如果X₁缺乏自身的N-末端甲硫氨酸，-A-可以是甲硫氨酸残基。

-B-部分

-B-是任选的C-末端氨基酸序列。它通常较短(如40个或更少氨基酸即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的序列、有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸尾即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。或提高蛋白质稳定性的序列。其它适当的C-末端氨基酸序列是本领域技术人员懂得的。

蛋白质的多态型形式

本发明可使用任何脑膜炎奈瑟球菌菌株的氨基酸序列。因此涉及的具体蛋白质(如‘287’或‘ORF46.1’)包括任何菌株的蛋白质。菌株间的序列变化包括在(b)、(c)、(i)和(j)中。

脑膜炎奈瑟球菌血清群B的参考序列包括：

参考文献8揭示了蛋白质ORF4、ORF40、ORF46、225、235、287、519、726、919和953的多态型形式。961的多态形式见参考文献11和12所述。任何这些多态形式可用于本发明。

本文所列序列包括已鉴定的蛋白质741(SEQ IDs 1-22)和NMB 1343(SEQ IDs23-24)的多态形式。

血清群和菌株

本发明的优选蛋白质包括-X-部分，其具有脑膜炎奈瑟球菌血清群B中发现的氨基酸序列。在本发明的单个蛋白质中，各个-X-部分可以来自一种或多种菌株。例如当n＝2时，X₂可以来自与X₁相同或不同的菌株。当n＝3时，菌株可以是(i)X₁＝X₂＝X₃(ii)X₁＝X₂≠X₃(iii)X₁≠X₂＝X₃(iv)X₁≠X₂≠X₃或(v)X₁＝X₃≠X₂等。

在血清群B中，优选的-X-部分来自菌株2996、MC58、95N477或394/98。菌株95N477有时在本文中称为‘ET37’，这是其电泳形式。菌株394/98有时在本文中称为‘nz’，因为它是新西兰菌株。

当使用287的一种形式时，优选来自菌株2996或来自菌株394/98。

当使用741的一种形式时，优选来自血清群B的菌株MC58、2996、394/98或95N477，或者血清群C的菌株90/18311。

当使用961的一种形式时，优选来自菌株2996。

菌株以下标表示，如741_MC58是菌株MC58的蛋白质741。除非另有说明，本文所提及的蛋白质(如没有下标)来自脑膜炎奈瑟球菌菌株2996，它可作为‘参考’菌株。然而要理解的是本发明一般不受菌株的限制。如上所述，一般涉及的蛋白质(如‘287’或‘919’等)包括任何菌株的蛋白质。通常与2996有90％或更高的序列相同性(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。

蛋白质961的结构域为基础的表达

参考文献1和2揭示了蛋白质如何在概念上分成结构域且蛋白质如何以这些结构域的基础进行操作。本发明将此方法扩展应用于蛋白质961(也称为‘NadA’[11、12])。

在脑膜炎奈瑟球菌血清群B的菌株2996中，NadA有405个氨基酸。此蛋白质在概念上分成下列九个结构域(图4)：

此信息可用于定位其它961形式中的相同结构域

已用各种方法从菌株2996中的961缺失掉这些结构域(图5)。961的优选片断删除了些几个结构域如下的一个或多个：

-961-2到961-5(‘961a’)

-961-6到961-9(‘961b’)

-961-1到961-8(‘961cL’)

-961-2到961-8(‘961c’)

-961-2到961-6和结构域961-7的氨基酸287-325(‘961d’)

-961-2到961-8和结构域961-9的氨基酸351-383(‘961Δ1’)

-961-1到961-8和结构域961-9的氨基酸351-383(‘961Δ1L’)

-961-1到961-7和结构域961-8的氨基酸331-343(‘961cL-Δaro’)

961-1到961-6和结构域961-7的氨基酸287-315(‘961cL-Δcc’)

-961-1到961-5(‘961aL’)

-961-1到961-4(‘961aL-Δ1’)

-961-1到961-3(‘961aL-Δ2’)

-961-1到961-2(‘961aL-Δ3’)

这13个片断(和其一端或两端缺少1、2、3、4或5个氨基酸的亚片断)是优选的(c)和(j)片断，但它们也可自身表达，即不是本发明的杂合蛋白质形式。因此本发明提供含这些片断之一的蛋白质，此蛋白质不是全长961且不是参考文献1或2具体描述的蛋白质。此蛋白质可以是融合蛋白(如GST-融合或His-尾融合)

序列

本发明还提供具有SEQ IDs 1-24的氨基酸序列的蛋白质。也提供与这些蛋白质具有序列相同性的蛋白质和核酸。如上所述，‘序列相同性’程度优选大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。

本发明还提供编码这些蛋白质的核酸。

此外，本发明提供优选在‘高严紧性’条件下(如65℃在0.1xSSC、0.5％SDS溶液中)可与此核酸杂交的核酸，

发明也提供编码本发明蛋白质的核酸。

还应理解的是本发明提供的核酸包含与上述序列互补的序列(如用于反义或探测目的)。

本发明的核酸当然可以许多方法制备(如通过化学合成，从基因组或cDNA文库，从生物体本身制备等)，并可采用各种形式(如单链、双链、载体、探针等)。

此外，术语“核酸”包括DNA和RNA以及它们的类似物，如含修饰主链的类似物和肽核酸(PNA)等。

混合物

本发明还提供一种组合物，该组合物包含两种或多种(即2、3、4、5、6或7)以下蛋白质：

(1)287

(2)741

(3)ORF46.1

(4)961

(5)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝953

(6)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝919

(7)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝961

此混合物可包含一种或两种下列蛋白质，与(1)到(7)的两种或多种或仅与(1)到(7)中的一种蛋白质组合：

(8)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝741

(9)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝936，X₂＝741

当蛋白质287和741包括在此混合物中时(即在蛋白质1、2、5、6、7或8中)，它们可能是‘ΔG’形式。当包括蛋白质961时，优选‘961c’形式，其中没有N-末端前导序列和C-末端膜锚定序列。

优选的混合物包含下列三种蛋白质：

(5)961c，优选961c₂₉₉₆(如本文的SEQ ID 31)；

(6)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n为2，-X₁-是ΔG287(优选ΔG287_NZ)，-X₂-是缺乏前导肽的953(优选953₂₉₉₆)，-L₁-是GSGGGG且-A-包括N-末端甲硫氨酸(如-A-是M或MA)(如本文的SEQ IDs 28和29)；

(7)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝936(优选936₂₉₉₆)，X₂＝ΔG741(优选ΔG741_MC58)，L₁＝GSGGGG(如本文的SEQ ID 30)。

此混合物也可包含脑膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡。

异源宿主

当本发明的蛋白质在奈瑟球菌中表达时，本发明优选使用异源宿主。异源宿主可以是原核生物(如细菌)或真核生物细胞。优选大肠杆菌，但其它适当的宿主，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neissria lactamica)、脊髓灰质炎奈瑟菌(Neissria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(如结核分枝杆菌)、酵母等。

载体等

本发明提供(a)编码上述蛋白质的核酸(b)含有这些核酸序列的载体(c)含所述载体的宿主细胞(d)含本发明蛋白质或核酸的组合物，也许其适合用作免疫原性组合物(如疫苗)或用作诊断试剂(e)这些组合物作为药物(如疫苗)或作为诊断试剂的用途(f)这些组合物在生产(1)治疗或预防奈瑟球菌感染的药物(2)检测奈瑟球菌或抗奈瑟球菌抗体存在的诊断试剂，和/或(3)提高抗奈瑟球菌抗体的制剂的用途，以及(g)治疗病人的方法，包括给予病人治疗有效量的这些组合物。

实施本发明通常包括以下基本步骤：获得编码第一种蛋白质的第一种核酸；获得编码第二种蛋白质的第二种核酸；连接第一种和第二种核酸。可将所得核酸插入表达载体中或可作为表达载体的一部分。

为改进溶解性，纯化杂合蛋白质时可包括本文所述重折叠技术。

免疫原性组合物和药物

本发明的组合物优选是免疫原性组合物，更优选疫苗组合物。该组合物的pH值优选在6和7之间。此pH值可通过采用缓冲液来维持该组合物可以是无菌的。

本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但一般是预防性的。

本发明也提供本发明的组合物作为药物用途。药物优选能提高哺乳动物免疫应答(即它是免疫原性组合物)，更优选是疫苗。

本发明也提供本发明组合物在生产能提高哺乳动物免疫应答的药物中的用途。药物优选是疫苗。

本发明也提供提高哺乳动物免疫应答的方法，该方法包括给予有效量的本发明组合物的步骤。免疫应答优选是保护性的。此方法可提高加强的免疗应答。

哺乳动物优选是人。当此疫苗用于预防时，优选的人是儿童(如初学走路的孩子或婴儿)；当疫苗用于预防时，优选的人是成年人。针对儿童的疫苗也可给予成人，以例如评估安全性、剂量、免疫原性等。

这些用途和方法优选用于预防和/或治疗奈瑟球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血病、淋病等)。优选预防和/或治疗细菌脑膜炎。

此组合物的其它成分

除上述成分外，本发明的组合物通常包含一种或多种‘药学上可接受的远载体’，包括自身不诱导接受此组合物的个体产生有害抗体的任何远载体。适当的远载体一般是大的代谢缓慢的大分子、如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖(WO 00/56365)和脂类凝聚物(如油滴或脂质体)。这种远载体是本领域技术人员熟知的。此疫苗也可包含稀释液，如水、盐水、甘油等。此外，辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在。药学上可接受赋形剂的完整论述可获自《Remington药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)。

用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫有效量的抗原以及任何其它需要的上述成分。‘免疫有效量’指将此剂量以单剂量或作为系列剂量的一部分给予个体，能有效地治疗或预防。此剂量的变化取决于待治疗个体的健康和身体情况、年龄、待治疗个体的分类(如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的配方、治疗医生对医疗情况的评估和其它相关因素。预期此剂量有相对宽的范围，可通过常规试验确定。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括强化剂量)。此疫苗可结合其它免疫调节剂施用。

疫苗可结合其它免疫调节剂施用。

除(或取代)铝盐外，该组合物可包含其它佐剂。能提高该组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)水包油乳剂(含有或没有其它特定免疫刺激剂如胞壁酰肽(见下)或细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59^TM(WO90/14837；参考文献中的第10章)，含5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85(任选含MTP-PE)，用微流化剂制成亚微米颗粒、(b)SAF，含10％鲨烯、0.4％吐温80和5％pluronic-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或旋涡混合产生较大颗粒大小的乳剂、(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，含2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁成分，选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖dimycolate(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；(2)皂角苷佐剂，如可使用QS21或Stimulon^TM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或它们所产生的颗粒如ISCOMs(免疫刺激复合物)，ISCOMS可避免采用其它去污剂，如WO 00/07621；(3)弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO 99/44636)等)、干扰素(例如γ干扰)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3d MPL)，如GB-2220221、EP-A-0689454；(6)3d MPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)含CpG基序的寡核苷酸[Krieg Vaccine2000，19，618-622；Krieg Curr opin Mol Ther 20013：15-24；Roman等.，Nat.Med，1997，3，849-854；Weiner等.，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等.，J.Immunol.，1998，160，870-876；Chu等.，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等.，Eur.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等.，Vaccine，1998，16.1216-1224，Krieg等.，Nature，1995，374，546-549；Klinman等.，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等.，J.Immunol.，1996157，1840-45；Cowdery等，J.Immunol，1996，156，4570-75；Halpern等Cell lmmunol.，1996，167，72-78；Yamanoto等.，Jpn.J.CancerRes.，1988，79，866-873；Stacey等.，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等.，J.Immunol.，1991，147，1759-1764；Yi等.，J.Immunol.，1996，157，4918-4925；Yi等.，J.Immunol.，1996，157，5394-5402；Yi等.，J.Immunol.，1998，160，4755-4761；Yi等.，J.Immunol.，1998，160，5898-5906；国际专利申请WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581]即含至少一个CG二核苷酸，5-甲基胞嘧啶可任选用于取代胞嘧啶；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯如WO99/52549；(9)结合辛氧基(octoxynol)的聚氧乙烯山梨糖酯类表面活性剂(如WO 01/21207)或结合至少一种其它非离子表面活性剂如辛氧基(octoxynol)聚氧乙烯烷基醚或酯的表面活性剂(如WO 01/21152)；(10)免疫刺激寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)和皂角苷如WO 00/62800；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒如WO 00/23105；(12)皂角苷和水包油乳剂如WO99/11241；(13)皂角苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选类固醇)如WO98/57659；(14)作为免疫刺激剂能提高此组合物效果的其它物质。

胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-nor胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2(1’2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基(phosphoryloxy))-乙醇胺MTP-PE)等。

其它抗原

可包含在本发明组合物中的其它抗原包括：

-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜泡囊(OMV)制品，如见参考文献13、14、15、16、17等所述。

-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献18中所述的血清群C的寡糖[同样参见参考文献19]或参考文献20的寡糖。

-肺炎链球菌的糖抗原

-幽门螺杆菌的蛋白质抗原，如CagA[如24]、VacA[如24]、NAP[如25]、HopX[如26]、HopY[如26]和/或尿素酶。

-甲肝病毒抗原，如灭活病毒[如27、28]。

-乙肝病毒抗原，如表面抗原和/或核心抗原[如28、29]。

-丙肝病毒抗原[如30]。

-百日咳杆菌(Bordetella pertussis)抗原，如百日咳杆菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，还任选与百日核毒素(pertactin)和/或凝集素2和3[如参考文献31和32]组合使用。

-白喉抗原，例如白喉类毒素[如参考文献33的第3章]，如CRM₁₉₇突变体[如34]。

-破伤风抗原，如破伤风类毒素[参考文献33的第4章]。

-流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenzae)的糖抗原[如19]。

-淋病奈瑟球菌抗原[如3、4、5]。

-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原[如3、4、5]。

-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[如42]。

-Porphyromonas gingivalis的抗原[如43]。

-polio抗原[如44、45]，例如IPV或OPV。

-狂犬病毒抗原[如46]，例如冻干的灭活病毒[如47、RabAvert^TM]。

-麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献33的第9、10和11章]。

-流感病毒抗原[如参考文献33的第19章]，例如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

-卡它性莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[如48]。

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)蛋白质抗原[如49、50]。

-无乳链球菌糖抗原。

-化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)抗原[如50、51、52]。

-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原[如53]。

该组合物可包括一种或多种这些其它抗原。

当采用糖类或碳水化合物抗原时，优选将其偶联于载体蛋白以提高免疫原性[如参考文献54到63]。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。尤其优选CRM₁₉₇白喉类毒素。其它适当的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[如参考文献64]、合成肽[如65、66]、热激蛋白[如67]、百日咳蛋白[如68、69]、流感嗜血杆菌的蛋白质D[如70]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[如71]等。当混合物包含血清群A和C的荚膜糖类时，MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)优选大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。可将脑膜炎奈瑟球菌不同血清群的糖类偶联于相同或不同的载体蛋白。

可利用任何适当的偶联反应，必要时可采用任何合适的接头。

必要时可使毒性蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方法[32]使百日毒素脱毒)。

当该组合物包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似的，当包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。类似的，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。

抗原优选与铝盐(如磷酸铝、氢氧化铝、羟基磷酸铝、正氢氧化铝、正磷酸铝、硫酸铝)混合铝盐可采用任何适当的形式(如凝胶，晶体，无定形等)。

此组合物中的抗原通常以各至少1μg/ml的浓度存在。一般，任何给定抗原的浓度应足够引起抗此抗原的免疫应答。

采用本发明组合物中的蛋白质抗原的另一种方法，可采用编码此抗原的核酸(如参考文献72到80)。因此本发明组合物的蛋白质成分可用编码此蛋白质的核酸取代(优选DNA，如以质粒形式)。

定义

术语“包括”指“包含”以及“由...组成”，如“包括”X的组合物可只由X组成或包含一些另外成分如X+Y。

涉及数值χ的术语“约”指例如χ±10％。

附图简述

图1显示蛋白质741的23种序列的排列。这些是SEQ IDs1到22加上MC58的序列。

图2显示淋菌(顶部；SEQ ID 25)和脑膜炎球菌(底部；SEQ ID 26)的NMB1343序列的排列。

图3显示本发明的杂合和串联蛋白质。

图4显示961₂₉₉₆中的9个结构域，图5显示如何操作这些结构域。

实施本发明的模式

杂合蛋白质-X1＝ΔG287

除了参考文献1和2所述外，构建了七个N-末端含有菌株2996的ΔG287的杂合蛋白质，还制备了八个287串联蛋白质(见下)。

这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3mg/ml明矾作为佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验测试抗不同奈瑟球菌菌株抗体。采用蛋白质#3测得的滴定度如下：

菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	NGH38^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)
菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	NGH38^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	氢氧化铝	8192	32768	8192	＞2048	16384	8192
FCA	16384	262144	8192	＞2048	＞32768	8192	氢氧化铝	8192	32768	8192	＞2048	16384	8192

在用蛋白质#3和氢氧化铝的进一步实验中，特定了抗287和抗741抗体，各ELISA滴度超过984150，BCA滴度如下：

2996^(B)	MC58^(B)	NGH38^(b)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)
2996^(B)	MC58^(B)	NGH38^(b)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)	8000	65000	4000	4000	32000	8000	16000

用参考文献1和2所述蛋白质免疫后测定抗同源菌株抗体获得的结果如下：

杂合蛋白质-X1＝961c或961cL

除了参考文献1和2所述外，构建了八个在N-末端含有961c或961cL(即961c+前导肽)的杂合蛋白质：

这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3.3mg/ml明矾作为佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验测试抗不同奈瑟球菌菌株抗体。采用蛋白质#8测得的滴定度如下：

菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)
菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	氢氧化铝	8192	8192	512	1024	＜16
FCA	65536	16384	＞2048	＞2048	8192	氢氧化铝	8192	8192	512	1024	＜16

用961c-741[参考文献1和2]免疫后获得的滴度如下：

菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)
菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)	氢氧化铝	65536	32768	4096	＞32768	16384	＞2048
FCA	＞16384	262144	4096	＞16384	-	＞2048	氢氧化铝	65536	32768	4096	＞32768	16384	＞2048

这些结果可通过将961c-741与ORF46.1或ΔG287-919混合来改进。

杂合蛋白质-X1＝ORF46.1

除了参考文献1和2所述外，构建了两个在N-末端含有ORF46.1的杂合蛋白质：

这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3mg/ml明矾作佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验和ELISA测试抗同源菌株抗体。

用参考文献1和2所述蛋白质免疫后获得的结果如下：

杂合蛋白质-X1＝230

除了参考文献1和2所述外，构建了四个在N-末端含有230的杂合蛋白质：

杂合蛋白质-X1＝936

除了参考文献1和2所述外，构建了七个在N-末端含有936的杂合蛋白质：

这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3mg/ml明矾作佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验测试抗不同的奈瑟球菌菌株抗体。采用蛋白质#2测得的滴定度如下：

菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)
菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	氢氧化铝	16348	32768	1024	2048	＜16
FCA	65536	65536	＞2048	8192	2048(36％)	氢氧化铝	16348	32768	1024	2048	＜16

采用蛋白质#4测得的滴定度如下：

菌株^(血清群)	2996^(b)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)
菌株^(血清群)	2996^(b)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	氢氧化铝	256	＞262144	＞2048	32768	8192
FCA	1024	＞262144	＞2048	＞32768	＞32768	氢氧化铝	256	＞262144	＞2048	32768	8192

采用蛋白质#7测得的滴定度如下：

菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)
菌株^(血清群)	2996^(B)	MC58^(B)	394/98^(B)	44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)	氢氧化铝	256	13000	16000	32000	8000	16000

杂合蛋白质的混合物

小鼠用氢氧化铝为佐剂的三种蛋白质免疫，单种或三种蛋白质的组合：(1)287_NZ-953；(2)936-741；和(3)961c。混合物能诱导抗不同菌株的高杀菌滴度：

	2996^(B)	MC58^(B)	NGH38	394/98^(B)	H44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)	C11^(C)
	2996^(B)	MC58^(B)	NGH38	394/98^(B)	H44/76^(B)	F6124^(A)	BZ133^(C)	C11^(C)	(1)	32000	16000	130000	16000	32000	8000	16000	8000
(2)	256	131000	128	16000	32000	8000	16000	＜4	(1)	32000	16000	130000	16000	32000	8000	16000	8000
(2)	256	131000	128	16000	32000	8000	16000	＜4	(3)	32000	8000	-	-	-	8000	-	32000
混合物	32000	32000	65000	16000	260000	65000	＞65000	8000	(3)	32000	8000	-	-	-	8000	-	32000

(X)

4000

1000

＞4000

1000

4000

n.c.

‘-’表示此菌株不含Nad A基因

(X)是蛋白质287和外膜泡囊的组合，用于比较

观察各个小鼠，该混合物诱导了高而恒定的杀菌滴度：

#	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
#	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	2996	32768	16384	65536	32768	32768	65536	65536	32768	65536	8192
MC58	65536	32768	65536	65536	65536	8192	65536	32768	32768	65536	2996	32768	16384	65536	32768	32768	65536	65536	32768	65536	8192
MC58	65536	32768	65536	65536	65536	8192	65536	32768	32768	65536	394/98	65536	4096	16384	4096	8192	4096	32768	16384	8192	16384

串联蛋白质

本发明的杂合蛋白质可表示为公式NH₂-[-X-L-]n-COOH。其中-X-的所有n实例是相同的碱性蛋白质(相同或者不同菌株或种类的相同蛋白质)，此蛋白质称为“串联”蛋白质。

十二种具体串联蛋白质是：

#	n	X₁	L₁	X₂	L₂
#	n	X₁	L₁	X₂	L₂	1	2	ΔG741_MC58	-	741_MC58	(His)₆
2	2	ΔG287₂₉₉₆	(Gly)₆	ΔG287_394/98	(His)₆	1	2	ΔG741_MC58	-	741_MC58	(His)₆
2	2	ΔG287₂₉₉₆	(Gly)₆	ΔG287_394/98	(His)₆	3	2	ΔG287₂₉₉₆	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	(His)₆
4	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287_394/98	(His)₆	3	2	ΔG287₂₉₉₆	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	(His)₆
4	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287_394/98	(His)₆	5	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	(His)₆
6	2	ΔG287₂₉₉₆	-(Gly)₆	ΔG287_394/98	-	5	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	(His)₆
6	2	ΔG287₂₉₉₆	-(Gly)₆	ΔG287_394/98	-	7	2	ΔG287₂₉₉₆	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	-
8	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287_394/98	-	7	2	ΔG287₂₉₉₆	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	-
8	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287_394/98	-	9	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	-
10	2	ΔG741_MC58	-	741_394/98	(His)₆	9	2	ΔG287_394/98	-(Gly)₆	ΔG287₂₉₉₆	-
10	2	ΔG741_MC58	-	741_394/98	(His)₆	11	2	ΔG741_MC58	-	741_90/18311	(His)₆
12	2	ΔG741_MC58	-	749_5N477	(His)₆	11	2	ΔG741_MC58	-	741_90/18311	(His)₆

蛋白质#1到#5都已在大肠杆菌中以可溶形式表达。表达水平在0.24和0.50mg蛋白质/每升培养物之间。纯化这些串联蛋白质并与作为佐剂的磷酸铝混合。串联蛋白质#2、#4和#5易被磷酸铝吸附；串联蛋白质#1和#3吸附不完全。

等位基因变体-741

发现了741的22种多态性序列(SEQ IDs 1到22)。这些序列和MC58序列排列于图1中。

等位基因变体-NMB1343

对不同血清群脑膜炎球菌的42种菌株使用PCR，在24/42菌株中发现编码NMB1343蛋白的基因但在18/42菌株中无(表1)。测序10个NMB1343+菌株的NMB1343基因(表1，第3列)。所有10个菌株中此核酸序列(和氨基酸序列SEQ ID23；GenBank AAF41718)相同。

NMB1343也在2种淋病奈瑟球菌菌株(F62和SN4)中检测到。淋球菌的氨基酸序列是SEQ ID 24。脑膜炎球菌序列的排列是：

对应的核苷酸序列的排列示于图2中。这显示淋球菌序列在NMB1343基因5’区域有一个4聚体插入，导致移码和随后失去5’甲硫氨酸残基。

结构域缺失-961

961不存在于脑膜炎奈瑟球菌血清群a的基因组序列[81]中，尽管周围区域在血清群A和B间保守(＞90％)。参考文献11和12揭示了961的多态型形式。发现此基因存在于91％的血清群B菌株中，属于高毒性谱系ET-5、ET-37和A4簇，但该基因在所有测试的谱系3菌株中缺乏。即使不属于高毒性谱系，大部分测试的血清群C菌株为阳性。对于含血清型2a和2b的血清群B菌株也同样如此。对于血清群A，属于亚群III的一菌株为阳性，而另两种属于亚群IV-1的菌株为阴性。淋病奈瑟菌中和乳酰胺奈瑟菌与脊髓灰质炎奈瑟球菌的共生种类中缺乏961。

图4和5显示蛋白质961中的结构域。

当蛋白质961的锚定区域(结构域9)缺失并在大肠杆菌中表达时，此蛋白质被输出到周质，分泌于培养物的上清中。

为进一步研究，在结构特征基础上(就961cΔaro突变体而言缺失芳香族残基，和其它情况中缺失卷曲螺旋区)构建了缺失961C-末端区域的突变体(961cL-Δaro、961cLΔcc、961aL、961aL-Δ1、961aL-Δ2、961aL-Δ3)。分析这些突变体表达和分泌入周质和培养物上清中的情况。在所有这些缺失突变体中，蛋白质大量产生、存在于周质组分中且释放到培养物上清中。

ΔG287-杂交菌株的杀菌活性

克隆了5个不同脑膜炎奈瑟球菌血清群B菌株的287并对其进行操作以去掉N-末端至聚甘氨酸区域末端并引入C-末端组氨酸尾。这产生了5种ΔG287蛋白质。这些蛋白质用FCA作佐剂用于产生小鼠免疫血清，随后测试了血清对所有5种血清群B菌株以及血清群A和C菌株的杀菌活性。杀菌滴度如下：

*抗同源菌株的滴度以粗体表示

重折叠

为改进一些杂合蛋白质的可溶蛋白质水平，采纳了参考文献2所述的另外重折叠方案。

包含体(IBs)的分离如下：

1.细胞(5mg湿重)用ultraturrax(1000rpm)4℃在25ml 0.1M Tris-HClpH7.1、1mM EDTA中匀浆。

2.每克细胞加入1.5ml溶菌酶，用ultraturrax简单混合，4℃孵育30分钟。

3.用超声波或高压匀浆(French press)破裂细胞。

4.为消化DNA，加入MgCl₂到3mM终浓度和加DNA酶到10μg/ml终浓度，25℃孵育30分钟。

5.加入0.5体积的60mM EDTA、6％Triton X-100、1.5M NaCl pH7到溶液中，4℃孵育30分钟。

6.4℃31000g(20,000rpm)离心10分钟沉降包含体。

7.用ultraturrax重悬浮沉淀于40ml 0.1M tris-HCl pH7、20mM EDTA中。

8.重复离心步骤6。

9.可使用包含体沉淀或-20℃冻存。

杂合蛋白质如下在大肠杆菌中表达：

蛋白质	培养物体积(升)	烧瓶体积(升)	温度(℃)	最终的OD₆₀₀	产生的包含体(w/w)
蛋白质	培养物体积(升)	烧瓶体积(升)	温度(℃)	最终的OD₆₀₀	产生的包含体(w/w)	ORF46.1-961-His	1	2	37	1.51	33.2％
ORF46.1-961c-His	1	2	37	1.6	28.3％	ORF46.1-961-His	1	2	37	1.51	33.2％
ORF46.1-961c-His	1	2	37	1.6	28.3％	961c-ORF46.1His	1	2	37	1.18	23.5％
orf46.1-741His	5	5	37	12.42	35.2％	961c-ORF46.1His	1	2	37	1.18	23.5％

溶解沉淀、重折叠、超滤、透析，随后纯化得到蛋白质：

ORF46.1-961-His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml 6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到1mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.1M Tris-HCl、1M L-精氨酸、2mM EDTA pH8.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到5μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度再孵育1小时，得到10μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生130ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。

orf46.1-961c His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml 6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到1mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.5M Tris-HCl、1M L-精氨酸、2mM EDTA pH8.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到5μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度下再孵育1小时，得到10μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生150ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。

961c-orf46.1His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml 6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到1mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质和2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.1M Tris-HCl、0.5M L-精氨酸、2mM EDTA pH8.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到5μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度下再孵育1小时，得到10μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生150ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。

orf46.1-741His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml 6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到10mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.5M Tris-HCl、0.7M L-精氨酸、2mM EDTApH7.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到50μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度再孵育1小时，得到100μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生120ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。

与参考文献2所述纯化的蛋白质相比，杀菌试验滴定度如下：

当没有His-尾表达时(‘ORF46.1K’)，将类似过程用于ORF46.1以从IBs纯化此蛋白质：

蛋白质

培养物体积(升)

烧瓶体积(升)

温度(℃)

最终的OD₆₀₀

产生的包含体(w/w)

ORF46.1K

5

37

13.7

29.4

将IB蛋白质重悬浮于4ml 6M盐酸胍、1mM EDTA pH8.5缓冲液中到10mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.5MTris-HCl、0.7M L-精氨酸、2mM EDTA pH7.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到50μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度下再孵育1小时，得到100μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生120ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 50mM磷酸钠、2mM EDTA pH7.2缓冲液透析12小时。以10L相同缓冲液进行第二次24小时透析。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于阳离子交换层析。纯化在AKTA探测器层析系统(Amersham-Pharmacia Biotech)上进行，采用5ml HiTrap SP琼脂糖HP柱(Amersham-Pharmacia Biotech)。应用流速为1.5ml/每分钟。尾析柱用35ml 50mM磷酸钠缓冲液pH7.2洗涤。用50mM磷酸钠缓冲液pH7.2进行线性梯度(0-1M NaCl)洗脱。蛋白质洗脱在92mM和320mM NaCl的两个峰中。收集含各个峰的组分并分别命名为合并液1和合并液2。

与参考文献2所述纯化的蛋白质相比，用氢氧化铝作佐剂时杀菌试验滴度从＜4提到到1024。此重折叠蛋白质用磷酸铝作佐剂的滴度为2048。ELISA滴度如下：

应理解本发明仅通过实施例作了描述，可进行修改且同时使这些修改保持在本发明的范围和思路内。

表1

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序列表

<110>启龙有限公司(cHIRON SRL.)

<120>奈瑟球菌蛋白质的杂合和串联表达

<130>P028101WO

<150>GB-0121591.2

<151>2001-09-06

<160>31

<170>SeqWin99，版本1.03

<210>1

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株1000

<400>1

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Thr Pro

35 40 45

Leu Asp Hi s Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

180 185 190

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr Hi s Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>2

<211>256

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株2201731(提前终止密码子)，通过可靠序列

<400>2

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Thr Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

115 120 125

Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His

130 135 140

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr

165 170 175

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr

180 185 190

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His

195 200 205

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys

210 215 220

Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala

245 250 255

<210>3

<211>234

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株90/18311(不完全)

<400>3

Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser

1 5 10 15

Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu

20 25 30

Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser

35 40 45

Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe

50 55 60

Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly

65 70 75 80

Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln

85 90 95

Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln

100 105 110

Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn

115 120 125

Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser

130 135 140

Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys

145 150 155 160

Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val

165 170 175

Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val

180 185 190

Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His

195 200 205

Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr

210 215 220

Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Thr

225 230

<210>4

<211>247

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株L93/4286

<400>4

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

1 5 10 15

Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Met Leu Asp Gln Ser

20 25 30

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

35 40 45

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

50 55 60

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

65 70 75 80

Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His

85 90 95

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

100 105 110

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

115 120 125

Gly Glu His Thr Ala Phe Ash Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

130 135 140

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

145 150 155 160

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

165 170 175

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

180 185 190

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

195 200 205

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

210 215 220

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

225 230 235 240

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245

<210>5

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株2996

<400>5

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

180 185 190

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>6

<211>229

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株30/00

<400>6

Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys

1 5 10 15

Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly

20 25 30

Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser

35 40 45

Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr

50 55 60

Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu

65 70 75 80

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85 90 95

Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His

100 105 110

Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly

115 120 125

Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile

130 135 140

Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser

145 150 155 160

Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly

165 170 175

Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu

180 185 190

Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val

195 200 205

Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly

210 215 220

Leu Ala Ala Lys Gln

225

<210>7

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株312294

<400>7

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1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

180 185 190

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>8

<211>228

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株39/99

<400>8

Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn

1 5 10 15

Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn

20 25 30

Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met

85 90 95

Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr

100 105 110

Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr

115 120 125

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130 135 140

Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro

145 150 155 160

Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys

165 170 175

Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys

180 185 190

Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala

195 200 205

Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu

210 215 220

Ala Ala Lys Gln

225

<210>9

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株5/99

<400>9

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

180 185 190

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

2l0 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>10

<211>280

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株67/00

<400>10

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Phe Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

115 120 125

Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His

130 135 140

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr

165 170 175

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr

180 185 190

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His

195 200 205

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys

210 215 220

Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala

245 250 255

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His

260 265 270

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

275 280

<210>11

<211>225

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株BZ169

<400>11

Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu

1 5 10 15

Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser

20 25 30

Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe

35 40 45

Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly

50 55 60

Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln

65 70 75 80

Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys

85 90 95

Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp

100 105 110

Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly

115 120 125

Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala

130 135 140

Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn

145 150 155 160

Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala

165 170 175

Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr

180 185 190

Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala

195 200 205

Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys

210 215 220

Gln

225

<210>12

<211>225

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株72/00

<400>12

Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu

1 5 10 15

Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser

20 25 30

Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe

35 40 45

Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly

50 55 60

Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln

65 70 75 80

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100 105 110

Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly

115 120 125

Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala

130 135 140

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Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala

165 170 175

Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr

180 185 190

Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala

195 200 205

Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys

210 215 220

Gln

225

<210>13

<211>280

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株93/114

<400>13

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Phe Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

115 120 125

Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His

130 135 140

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Arg Phe Lys Ile Gly Asp Ile Ala

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr

165 170 175

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr

180 185 190

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His

195 200 205

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys

210 215 220

Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Gln Asp Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala

245 250 255

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His

260 265 270

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

275 280

<210>14

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株95N477

<400>14

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

180 185 190

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>15

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Nei sseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株96217

<400>15

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

180 185 190

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>16

<211>280

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株BZ133

<400>16

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

115 120 125

Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His

130 135 140

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr

165 170 175

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr

180 185 190

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His

195 200 205

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys

210 215 220

Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala

245 250 255

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg

260 265 270

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

275 280

<210>17

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株BZ232

<400>17

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

180 185 190

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>18

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株C11

<400>18

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

180 185 190

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>19

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株M1090

<400>19

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

180 185 190

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>20

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株M1096

<400>20

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Thr Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

180 185 190

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>2l

<211>280

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株M198/172

<400>21

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

115 120 125

Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu His

130 135 140

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr

165 170 175

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr

180 185 190

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His

195 200 205

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys

210 215 220

Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

225 230 235 240

Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala

245 250 255

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg

260 265 270

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

275 280

<210>22

<211>279

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>741，来自菌株NGH38

<400>22

Met Thr Arg Ser Lys Pro Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Ala Leu Ile Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

35 40 45

Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

50 55 60

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

100 105 110

Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His

115 120 125

Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys

130 135 140

Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

145 150 155 160

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

165 170 175

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr

180 185 190

Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu

195 200 205

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala

210 215 220

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu

260 265 270

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

275

<210>23

<211>145

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>NMB1343来自10种脑膜炎球菌菌株

<400>23

Met Gly Asn Phe Leu Tyr Arg Gly Ile Ser Cys Gln Gln Asp Glu Gln

1 5 10 15

Asn Asn Gly Gln Leu Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ala Glu Val Ala Ile

20 25 30

Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Lys Tyr Asp Gly Lys Ala Thr His Gly Pro

35 40 45

Ser Val Lys Asn Ala Val Tyr Ala His Gln Ile Glu Thr Gly Leu Tyr

50 55 60

Asp Gly Cys Tyr Ile Ser Thr Thr Thr Asp Lys Glu Ile Ala Lys Lys

65 70 75 80

Phe Ala Thr Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Tyr Ile Tyr Val Leu Asn

85 90 95

Arg Asp Leu Phe Gly Gln Tyr Ser Ile Phe Glu Tyr Glu Val Glu His

100 105 110

Pro Glu Asn Pro Asn Glu Lys Glu Val Thr Ile Arg Ala Glu Asp Cys

115 120 125

Gly Cys Ile Pro Glu Glu Val Ile Ile Ala Lys Glu Leu Ile Glu Ile

130 135 140

Asn

145

<210>24

<211>150

<212>PRT

<213>淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)

<220>

<223>NMB1343来自淋球菌

<400>24

Ile Asn Asn Leu Trp Glu Ile Ser Tyr Leu Tyr Arg Gly Ile Ser Cys

1 5 10 15

Gln Gln Asp Glu Gln Asn Asn Gly Gln Leu Lys Pro Lys Gly Asn Lys

20 25 30

Ala Glu Val Ala Ile Arg Tyr Asp Gly Lys Phe Lys Tyr Asp Gly Lys

35 40 45

Ala Thr His Gly Pro Ser Val Lys Asn Ala Val Tyr Ala His Gln Ile

50 55 60

Glu Thr Asp Leu Tyr Asp Gly Cys Tyr Ile Ser Thr Thr Thr Asp Lys

65 70 75 80

Glu Ile Ala Lys Lys Phe Ala Thr Ser Ser Gly Ile Glu Asn Gly Tyr

85 90 95

Ile Tyr Val Leu Asn Arg Asp Leu Phe Gly Gln Tyr Ser Ile Phe Glu

100 105 110

Tyr Glu Val Glu His Pro Glu Asn Pro Asp Glu Lys Glu Val Thr Ile

115 120 125

Arg Ala Glu Asp Cys Gly Cys Ile Pro Glu Glu Val Ile Ile Ala Lys

130 135 140

Glu Leu Ile Glu Ile Asn

145 150

<210>25

<211>634

<212>DNA

<213>淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)

<220>

<223>NMB1343核酸序列(淋球菌)

<400>25

tccgccgcat taccttataa aataaaacat ccctctcaag cagtctgata atgtttggat 60

tgcttgagat tgatgagtga tggtgttaaa ttcaaacttt aaattaataa cttatgggaa 120

atttcttatt tatatagagg cattagttgc caacaagatg agcaaaataa tggacagtta 180

aaacctaaag gtaataaagc tgaagttgca attcgttatg atggtaagtt taaatatgat 240

ggtaaagcta cacatggtcc aagtgtgaag aatgcagttt acgcccatca aattgaaaca 300

gatctatatg acggatgtta tatatctacg acaacagaca aggaaattgc caagaaattt 360

gcaacaagct ccggcatcga aaatggctat atatatgttt taaatagaga tttgtttggt 420

caatattcta tttttgaata tgaggttgaa catccagaaa acccagatga gaaggaagta 480

acaatcagag ctgaagattg tggctgtatt cctgaagaag tgattattgc taaagagttg 540

atagaaatta actaagttga aaggtcaata taatggcttt agttgaattg aaagtgcccg 600

acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgc 634

<210>26

<211>630

<212>DNA

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>NMB1343核酸序列(脑膜炎球菌)

<400>26

tccgccgcat taccttataa aataaaacat ccctctcaag cagtctgata atgtttggat 60

tgcttgagat tgatgagtaa tggtgttaaa ttcaaccttt aaattaataa cttatgggaa 120

atttcttata tagaggcatt agttgccaac aagatgagca aaataatgga cagttaaaac 180

ctaaaggtaa taaagctgaa gttgcaattc gttatgatgg taagtttaaa tatgatggta 240

aagctacaca tggtccaagt gtgaagaatg cagtttacgc ccatcaaatt gaaacaggtc 300

tatatgacgg atgttatata tctacgacaa cagacaagga aattgccaag aaatttgcaa 360

caagttccgg catcgaaaat ggctatatat atgttttaaa tagggatttg tttggtcaat 420

attctatttt tgaatatgag gttgaacatc cagaaaaccc aaatgagaag gaagtaacaa 480

tcagagctga agattgtggc tgtattcctg aagaagtgat tattgctaaa gagttgatag 540

aaattaacta agttgaaagg tcaatataat ggctttagtt gaattgaaag tgcccgacat 600

tggcggacac gaaaatgtag atattatcgc 630

<210>27

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>聚甘氨酸接头

<400>27

Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210>28

<211>579

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>优选ΔG287-953杂交体

<400>28

Met Ala Ser Pro Asp Val Lys Ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala

1 5 10 15

Ala Pro Val Val Ala Glu Lys Glu Thr Glu Val Lys Glu Asp Ala Pro

20 25 30

Gln Ala Gly Ser Gln Gly Gln Gly Ala Pro Ser Thr Gln Gly Ser Gln

35 40 45

Asp Met Ala Ala Val Ser Ala Glu Asn Thr Gly Asn Gly Gly Ala Ala

50 55 60

Thr Thr Asp Lys Pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Pro Gln Asn Asp Met

65 70 75 80

Pro Gln Asn Ser Ala Glu Ser Ala Asn Gln Thr Gly Asn Asn Gln Pro

85 90 95

Ala Asp Ser Ser Asp Ser Ala Pro Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Asn

100 105 110

Gly Gly Ser Asn Phe Gly Arg Val Asp Leu Ala Asn Gly Val Leu Ile

115 120 125

Asp Gly Pro Ser Gln Asn Ile Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Ser

130 135 140

Cys Asn Gly Asp Asn Leu Leu Asp Glu Glu Ala Pro Ser Lys Ser Glu

145 150 155 160

Phe Glu Asn Leu Asn Glu Ser Glu Arg Ile Glu Lys Tyr Lys Lys Asp

165 170 175

Gly Lys Ser Asp Lys Phe Thr Asn Leu Val Ala Thr Ala Val Gln Ala

180 185 190

Asn Gly Thr Asn Lys Tyr Val Ile Ile Tyr Lys Asp Lys Ser Ala Ser

195 200 205

Ser Ser Ser Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser Leu

210 215 220

Pro Ala Glu Met Pro Leu Ile Pro Val Asn Gln Ala Asp Thr Leu Ile

225 230 235 240

Val Asp Gly Glu Ala Val Ser Leu Thr Gly His Ser Gly Asn Ile Phe

245 250 255

Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Ala Glu Lys Leu

260 265 270

Pro Gly Gly Ser Tyr Ala Leu Arg Val Gln Gly Glu Pro Ala Lys Gly

275 280 285

Glu Met Leu Ala Gly Thr Ala Val Tyr Asn Gly Glu Val Leu His Phe

290 295 300

His Thr Glu Asn Gly Arg Pro Tyr Pro Thr Arg Gly Arg Phe Ala Ala

305 310 315 320

Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Gly Ile Ile Asp Ser Gly

325 330 335

Asp Asp Leu His Met Gly Thr Gln Lys Phe Lys Ala Ala Ile Asp Gly

340 345 350

Asn Gly Phe Lys Gly Thr Trp Thr Glu Asn Gly Gly Gly Asp Val Ser

355 360 365

Gly Arg Phe Tyr Gly Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly Lys Tyr Ser

370 375 380

Tyr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lys Gly Gly Phe Gly Val Phe Ala Gly

385 390 395 400

Lys Lys Glu Gln Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Lys Val

405 410 415

Asp Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala Ile Asp His Phe Asn Thr

420 425 430

Ser Thr Asn Val Gly Gly Phe Tyr Gly Leu Thr Gly Ser Val Glu Phe

435 440 445

Asp Gln Ala Lys Arg Asp Gly Lys Ile Asp Ile Thr Ile Pro Val Ala

450 455 460

Asn Leu Gln Ser Gly Ser Gln His Phe Thr Asp His Leu Lys Ser Ala

465 470 475 480

Asp Ile Phe Asp Ala Ala Gln Tyr Pro Asp Ile Arg Phe Val Ser Thr

485 490 495

Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys Lys Leu Val Ser Val Asp Gly Asn Leu

500 505 510

Thr Met His Gly Lys Thr Ala Pro Val Lys Leu Lys Ala Glu Lys Phe

515 520 525

Asn Cys Tyr Gln Ser Pro Met Ala Lys Thr Glu Val Cys Gly Gly Asp

530 535 540

Phe Ser Thr Thr Ile Asp Arg Thr Lys Trp Gly Val Asp Tyr Leu Val

545 550 555 560

Asn Val Gly Met Thr Lys Ser Val Arg Ile Asp Ile Gln Ile Glu Ala

565 570 575

Ala Lys Gln

<210>29

<211>644

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>ΔG287NZ-953杂交体

<400>29

Met Ala Ser Pro Asp Val Lys Ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala

1 5 10 15

Ala Pro Val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Ala Pro

20 25 30

Gln Ala Gly Ser Gln Gly Gln Gly Ala Pro Ser Ala Gln Gly Gly Gln

35 40 45

Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr Gly Asn Gly Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Thr Asp Lys Pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Ala Gln Asn Asp Met

65 70 75 80

Pro Gln Asn Ala Ala Asp Thr Asp Ser Leu Thr Pro Asn His Thr Pro

85 90 95

Ala Ser Asn Met Pro Ala Gly Asn Met Glu Asn Gln Ala Pro Asp Ala

100 105 110

Gly Glu Ser Glu Gln Pro Ala Asn Gln Pro Asp Met Ala Asn Thr Ala

115 120 125

Asp Gly Met Gln Gly Asp Asp Pro Ser Ala Gly Gly Glu Asn Ala Gly

130 135 140

Asn Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asn Gln Ala Glu Asn Asn Gln Thr Ala

145 150 155 160

Gly Ser Gln Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asn Pro Ser Ala Thr Asn Ser

165 170 175

Gly Gly Asp Phe Gly Arg Thr Asn Val Gly Asn Ser Val Val Ile Asp

180 185 190

Gly Pro Ser Gln Asn Ile Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Ser Cys

195 200 205

Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val Gln Leu Lys Ser Glu Phe

210 215 220

Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lys Ile Ser Asn Tyr Lys Lys Asp Gly

225 230 235 240

Lys Asn Asp Gly Lys Asn Asp Lys Phe Val Gly Leu Val Ala Asp Ser

245 250 255

Val Gln Met Lys Gly Ile Asn Gln Tyr Ile Ile Phe Tyr Lys Pro Lys

260 265 270

Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser

275 280 285

Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu Ile Pro Val Asn Gln Ala Asp Thr Leu

290 295 300

Ile Val Asp Gly Glu Ala Val Ser Leu Thr Gly His Ser Gly Asn Ile

305 310 315 320

Phe Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Ala Glu Lys

325 330 335

Leu Pro Gly Gly Ser Tyr Ala Leu Arg Val Gln Gly Glu Pro Ser Lys

340 345 350

Gly Glu Met Leu Ala Gly Thr Ala Val Tyr Asn Gly Glu Val Leu His

355 360 365

Phe His Thr Glu Asn Gly Arg Pro Ser Pro Ser Arg Gly Arg Phe Ala

370 375 380

Ala Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Gly Ile Ile Asp Ser

385 390 395 400

Gly Asp Gly Leu His Met Gly Thr Gln Lys Phe Lys Ala Ala Ile Asp

405 410 415

Gly Asn Gly Phe Lys Gly Thr Trp Thr Glu Asn Gly Gly Gly Asp Val

420 425 430

Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly Lys Tyr

435 440 445

Ser Tyr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lys Gly Gly Phe Gly Val Phe Ala

450 455 460

Gly Lys Lys Glu Gln Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Lys

465 470 475 480

Val Asp Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala Ile Asp His Phe Asn

485 490 495

Thr Ser Thr Asn Val Gly Gly Phe Tyr Gly Leu Thr Gly Ser Val Glu

500 505 510

Phe Asp Gln Ala Lys Arg Asp Gly Lys Ile Asp Ile Thr Ile Pro Val

515 520 525

Ala Asn Leu Gln Ser Gly Ser Gln His Phe Thr Asp His Leu Lys Ser

530 535 540

Ala Asp Ile Phe Asp Ala Ala Gln Tyr Pro Asp Ile Arg Phe Val Ser

545 550 555 560

Thr Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys Lys Leu Val Ser Val Asp Gly Asn

565 570 575

Leu Thr Met His Gly Lys Thr Ala Pro Val Lys Leu Lys Ala Glu Lys

580 585 590

Phe Asn Cys Tyr Gln Ser Pro Met Ala Lys Thr Glu Val Cys Gly Gly

595 600 605

Asp Phe Ser Thr Thr Ile Asp Arg Thr Lys Trp Gly Val Asp Tyr Leu

610 615 620

Val Asn Val Gly Met Thr Lys Ser Val Arg Ile Asp Ile Gln Ile Glu

625 630 635 640

Ala Ala Lys Gln

<210>30

<211>456

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>936-ΔG741杂交体

<400>30

Met Lys Pro Lys Pro His Thr Val Arg Thr Leu Ile Ala Ala Ile Phe

1 5 10 15

Ser Leu Ala Leu Ser Gly Cys Val Ser Ala Val Ile Gly Ser Ala Ala

20 25 30

Val Gly Ala Lys Ser Ala Val Asp Arg Arg Thr Thr Gly Ala Gln Thr

35 40 45

Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Arg Ile Glu Thr Thr Ala Arg Ser Tyr

50 55 60

Leu Arg Gln Asn Asn Gln Thr Lys Gly Tyr Thr Pro Gln Ile Ser Val

65 70 75 80

Val Gly Tyr Asn Arg His Leu Leu Leu Leu Gly Gln Val Ala Thr Glu

85 90 95

Gly Glu Lys Gln Phe Val Gly Gln Ile Ala Arg Ser Glu Gln Ala Ala

100 105 110

Glu Gly Val Tyr Asn Tyr Ile Thr Val Ala Ser Leu Pro Arg Thr Ala

115 120 125

Gly Asp Ile Ala Gly Asp Thr Trp Asn Thr Ser Lys Val Arg Ala Thr

130 135 140

Leu Leu Gly Ile Ser Pro Ala Thr Gln Ala Arg Val Lys Ile Val Thr

145 150 155 160

Tyr Gly Asn Val Thr Tyr Val Met Gly Ile Leu Thr Pro Glu Glu Gln

165 170 175

Ala Gln Ile Thr Gln Lys Val Ser Thr Thr Val Gly Val Gln Lys Val

180 185 190

Ile Thr Leu Tyr Gln Asn Tyr Val Gln Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly

195 200 205

Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro

210 215 220

Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser

225 230 235 240

Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys

245 250 255

Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp

260 265 270

Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln

275 280 285

Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His

290 295 300

Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His

305 310 315 320

Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala

325 330 335

Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr

340 345 350

Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr

355 360 365

Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His

370 375 380

Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys

385 390 395 400

Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn

405 410 415

Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala

420 425 430

Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg

435 440 445

His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

450 455

<210>31

<211>328

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<220>

<223>961c

<400>31

Met Ala Thr Asn Asp Asp Asp Val Lys Lys Ala Ala Thr Val Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ala Ala Tyr Asn Asn Gly Gln Glu Ile Asn Gly Phe Lys Ala Gly

20 25 30

Glu Thr Ile Tyr Asp Ile Asp Glu Asp Gly Thr Ile Thr Lys Lys Asp

35 40 45

Ala Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala Asp Asp Phe Lys Gly Leu Gly Leu

50 55 60

Lys Lys Val Val Thr Asn Leu Thr Lys Thr Val Asn Glu Asn Lys Gln

65 70 75 80

Asn Val Asp Ala Lys Val Lys Ala Ala Glu Ser Glu Ile Glu Lys Leu

85 90 95

Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala

100 105 110

Ala Leu Asp Ala Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lys Leu Gly Glu Asn Ile

115 120 125

Thr Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lys Thr Asn Ile Val Lys Ile Asp Glu

130 135 140

Lys Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr Val Asp Lys His Ala Glu Ala Phe

145 150 155 160

Asn Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr Asn Thr Lys Ala Asp Glu

165 170 175

Ala Val Lys Thr Ala Asn Glu Ala Lys Gln Thr Ala Glu Glu Thr Lys

180 185 190

Gln Asn Val Asp Ala Lys Val Lys Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gly Lys

195 200 205

Ala Glu Ala Ala Ala Gly Thr Ala Asn Thr Ala Ala Asp Lys Ala Glu

210 215 220

Ala Val Ala Ala Lys Val Thr Asp Ile Lys Ala Asp Ile Ala Thr Asn

225 230 235 240

Lys Asp Asn Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg

245 250 255

Glu Glu Ser Asp Ser Lys Phe Val Arg Ile Asp Gly Leu Asn Ala Thr

260 265 270

Thr Glu Lys Leu Asp Thr Arg Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Ile Ala

275 280 285

Asp His Asp Thr Arg Leu Asn Gly Leu Asp Lys Thr Val Ser Asp Leu

290 295 300

Arg Lys Glu Thr Arg Gln Gly Leu Ala Glu Gln Ala Ala Leu Ser Gly

305 310 315 320

Leu Phe Gln Pro Tyr Asn Val Gly

325

Claims

1.一种具有以下分子式的杂合蛋白质：NH₂-A-[-X-L-]n-B-COOH，

其特征在于，其中L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数，X是：

(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列；或

(c)含有(a)的氨基酸序列片断的氨基酸序列

2.一种具有以下分子式的杂合蛋白质：NH₂-A-[-X-L-]n-B-COOH，

其特征在于，其中X是一氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数，其中第一种X部分(-X_a-)具有下列氨基酸序列之一：

(d)参考文献3所述的446个偶数编号序列SEQ IDs(即2、4、6...890、892)；

(e)参考文献4所述的45个偶数编号序列SEQ IDs(即2、4、6...88、90)；

(f)参考文献5所述的1674个偶数编号序列SEQ IDs 2-3020、偶数编号序列SEQ IDs 3040-3114和所有的编号序列SEQ IDs 3115-3241；

(g)参考文献7的2160个氨基酸序列，NMB0001至NMB2160；

(h)参考文献1或2所述的氨基酸序列。

和第二种-X-部分(-X_b-)，其中-X_b-与-X_a-具有序列相同性，和/或-X_b-包括-X_a-的片断。

3.如权利要求1或2所述的杂合蛋白质，其中，n＝2。

4.如权利要求2所述的杂合蛋白质，其中，-X_a-是orf46.1、230、287、741、919、936、953、961或983氨基酸序列。

5.如权利要求2所述的杂合蛋白质，其中，X₁。。。X_n都相互具有序列相同性。

6.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，n＝2，其中-X-部分是ΔG287和230；ΔG287和936；ΔG287和741；961c和287；961c和230；961c和936；961cL和287；961cL和230；961cL和936；ORF46.1和936；ORF46.1和230；230和961；230和741；936和961；936和741；ΔG741和741；或ΔG287和287。

7.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，L具有20个或较少的氨基酸。

8.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，L是一种聚甘氨酸接头。

9.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，A具有40个或较少的氨基酸。

10.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，B具有40个或较少的氨基酸。

11.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，-X-部分具有脑膜炎奈瑟球菌血清群B中发现的氨基酸序列。

12.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，至少一个-X-部分是961氨基酸序列，但该序列中缺失了一个或多个结构域。

13.一种蛋白质，其中，所述蛋白质含的氨基酸序列选自SEQ IDs 1至38。

14.一种核酸，其中，所述核酸编码任何前述权利要求的所述蛋白质。

15.一种组合物，其中，所述组合物包含任何前述权利要求所述的蛋白质或核酸。

16.一种组合物，其中，所述组合物包含两种或多种下列蛋白质：

(1)287

(2)741

(3)ORF46.1

(1)961

(2)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝953

(3)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝919

(4)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝961

(8)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝287，X₂＝741

(9)NH₂-A-[-X-L-]_n-B-COOH，其中n＝2，X₁＝936，X₂＝741

17.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物包含蛋白质(4)、(5)和(9)。

18.如权利要求17所述的组合物，其中，蛋白质(4)包含SEQ ID 31，蛋白质(5)包含SEQ ID 28或SEQ ID 29，蛋白质(9)包含SEQ ID 30。

19.如权利要求15到18中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括：

-脑膜炎奈瑟球菌蛋白质抗原；

-脑膜炎奈瑟球菌外膜泡囊(OMV)制品；

-脑膜炎奈瑟球菌糖抗原；

-肺炎链球菌糖抗原；

-甲肝、乙肝或丙肝病毒抗原；

-百日咳杆菌抗原；

-白喉抗原；

-破伤风抗原；

-幽门螺杆菌蛋白质抗原

-流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)糖抗原；

-淋病奈瑟球菌抗原；

-肺炎衣原体抗原；

-沙眼衣原体抗原；

-Porphyromonas gingivalis的抗原；

-polio抗原；

-狂犬病毒抗原；

-麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹病毒抗原；

-流感病毒抗原；

-卡定性莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原；

-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)抗原；

-化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)抗原；

-金黄色葡萄球菌抗原。

20.如权利要求15至19中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述组合物可用作药物。

22.一种治疗病人的方法，其中，所述方法包括给予病人治疗有效量的权利要求20所述的组合物。