MX2015002813A - Vacuna novedosa shigella atenuada viva. - Google Patents

Abstract

Una vacuna Shigella viva atenuada, que se basa en una cepa Shigella rugosa que carece de O-antígeno LPS que es no invasivo a través de una mutación del plásmido de invasión, específicamente para uso en la inmunoprofilaxis de un sujeto para prevenir enfermedades infecciosas, preferiblemente enfermedades entéricas y una cepa Shigella, que es una cepa S. flexneri 2a con una eliminación de los genes rfbF, ipaB y/o ipaC, así como un vector de plásmido recombinante basado en un plásmido de invasión Shigella mutado que comprende una secuencia nucleótida que codifica al menos un antígeno heterólogo, en donde el plásmido está mutado en al menos uno de los genes ipaB y/o ipaC.

Description

VACUNA NOVEDOSA SHIGELLA ATENUADA VIVA Campo de la invención La presente invención se relaciona con una cepa de vacuna Shigella atenuada viva generada con mutaciones objetivadas especificas para inducir protección cruzada independiente de serotipo y expresar antigenos heterólogos (no Shigella).

Antecedentes de la invención Las Shigella son enterobacterias altamente Gram-negativas adoptadas por humano que provocan disentería bacilar.

La enfermedad se esparce exclusivamente mediante contacto directo personal o contaminación fecal humana de comida y agua. Como resultado, la disentería bacilar es endémica en regiones condiciones higiénicas poco óptimas. Hay un estimado de 165M casos a nivel mundial, con tantas fatalidades como 1M mayormente entre niños bajo las edades de 5, Shigella se encontró que es uno de los patógenos bacterianos más prevalente aislados en caso de un episodio de diarrea aguda de entre niños de 1 a 5 años de edad en el sureste de Asia y el África subsahariana (Kotloff et al., Bull. W.H.O. 77: 651-666, 1999). La disentería basilar también es común entre los viajantes y el personal militar que entra a países endémicos. Se ha aceptado ya durante mucho tiempo que las vacunas son cruciales para el control de la disentería pero el desarrollo de vacunas contra Shigella se ha visto obstaculizado por la respuesta inmunitaria específica a serotipo, es decir con la exposición a Shigella (natural o mediada con vacuna) la protección inmunitaria es limitada usualmente al serotipo dado. Las cuatro especies del género Shigella comprenden una cantidad de 50 serotipos y subserotipos, que son diferenciados por sus O-antígenos LPS.

Hong et al. (Molecular Microbiology 24:779-91, 1997) describe el efecto de las mutaciones en genes lipopolisacáridos codificados por plásmidos y cromosomales en invasión y resistencia al suero de Shigella flexneri . Las mutaciones en los genes rfb y rfaL ya sea eliminados con cadenas laterales O-antígeno enteras o producidos con cadenas de longitud muy reducida.

Nagy et al. (J. Infect. Deseases 198: 1699-706, 2008) describen el potencial de la vacuna de un muíante lipopolisacárido regulador de salmonela entérica. La pérdida del antiterminador RfaH transcripcional en una longitud heterogénea de cadenas LPS, el fenotipo "gentilmente rugoso".

La proteína RfaH regulatoria se ha mostrado que se involucra en la sobrerregulación dependiente de fase de crecimiento de moléculas LPS de cadena larga (es decir un número grande de O-antígeno repetido) de S. flexneri (Cárter et al. Microbiology. Oct. 2007; 153 (Pt 10):3499-507).

Los factores de virulencia mayores de Shigellae diferentes a los O-antígenos LPS son sorprendentemente conservados. Esto implica una falta de presión que evolucione mediada inmunitariamente en estos antigenos que substancian la vista aceptada acerca del O-antígeno que es el único antigeno protector. Sin embargo, hay una respuesta de anticuerpo marcada, contra los tan llamados "antigenos de plásmido de invasión" (lpa-s), especialmente cuando siguen la exposición repetida. Estos antígenos codificados en el plásmido de virulencia grande forman componentes de un tipo de sistema de tres secreciones (T3SS) que es indispensable para la invasión y la virulencia por lo tanto.

El análisis de estructura y función del antígeno B (IpaB) de plásmido de invasión de factor de virulencia Shigella fue descrita por Guichon et al. (J. Bacteriol. 183:1269-76, 2001). Los mutantes IRDB fueron generados para correlacionar la función con los subdominios de proteina.

Menard et al. (J. Bacteriol. 17518: 5899-5906, 1993) describieron que la mutagénesis de los genes Ipa, IpaB, IpaC e IpaD de Shigella flexneri, resultó en la pérdida de invasión potencial de Shigella .

Los anticuerpos contra las proteínas Ipa (como para aminorar los antígenos conservados) son considerados no protectores, ya que de otro modo la protección cruzada entre los serotipos podría ser disparada. La vacuna actual y sus enfoques yacen casi exclusivamente en la inmunidad mediada por el 0-antígeno que explota el hecho de que cinco o seis serotipos podrían proporcionar alta protección contra la mayoría de las enfermedades por disentería endémica y epidémica. Sin embargo, considerando el hecho de que la mayoría de las vacunas multivalentes sugeridas se basan en subunidades purificadas (0-antígeno) o varias bacterias atenuadas vivas con diferentes tipos de 0-antígeno LPS, podrían, más probablemente, ser muy complejas y por lo tanto caras. Adicionalmente, una cobertura de serotipos parcial se espera que induzca un reemplazo serotípico debido a la inmunidad basada en serotipos de vacuna y el escape e incremento en la prevalencia de los serotipos de no vacuna, como fue demostrado para otros patógenos multiserotípicos, tales como Streptococcus neumoniae. Por lo tanto, una vacuna contra la Shigella se espera que proporcione protección cruzada substancial contra todos los serotipos circulantes.

Además de Shigella , Escherichia coli eneterotoxigénica (ETEC) es un patógeno bacteriano mayor responsable de la diarrea de los viajantes y representa una de las causas principales de la muerte en niños en países endémicos. Por lo tanto se toman esfuerzos para desarrollar vacunas que se dirijan a estos dos patógenos de manera simultánea.

La diarrea de los viajantes actualmente es tratada mediante antibióticos; sin embargo, hay un índice en crecimiento de la resistencia entre las cepas de Shigella que hace que el manejo de la enfermedad sea más y más difícil. Además, las infecciones por ETEC pueden tener consecuencias a largo plazo relacionadas con el síndrome de colon irritable. Ha sido grandemente aceptado que la vacunación sea la manera más efectiva para dirigirse a estas necesidades medicas no satisfechas; sin embargo, no hay vacunas disponibles actualmente para la prevención de estas enfermedades.

Dos tipos de enterotoxinas han sido identificadas en las cepas ETEC, la toxina lábil caliente (LT) y la toxina estable caliente (ST), ya sea que la ST esté asociada con las enfermedades porcinas (STp) o la ST asociada con enfermedades humanas (STa). La LT es altamente homologa en la estructura con la toxina del cólera. La subunidad es el componente activo de la toxina, que funciona para incrementar la actividad de cielasa adenilada. Esto se suministra en las células hospederas mediante subunidades B, que se enlazan a los gangliósidos en la superficie celular. La STa es un polipéptido no inmunogénico pequeño (19 aminoácidos) que tiene una actividad estimulante de cielasa o anilata. ST es una forma mutada de ST que no es tóxica, pero aun asi es inmunogénica. Tal STm es considerada como segura y se emplea como antigeno de vacuna (Taxt et al. Infect. Immun. 78:1824-31, 2010).

Se ha demostrado que las cepas de ETEC también producen EAST1, una toxina estable caliente similar en tamaño y modo de acción a la ST pero diferente en secuencia, originalmente identificada en las cepas E. coli entero agregativas (Nataro y Kaper, Clin Microbiol Rev.11: 142-201, 1998; Zhang et al., Vet Microbiol.123: 145-152, 2007).

Zheng et al. (World J. Gastroeneterol. 11:3411- 18, 2005) construyeron unas cepas Shigella mutantes asd que coexpresan CS3 y LTB/STm de E. coli enterotoxigénica. Después de la inmunización de los ratones vía oral, los anticuerpos fueron elevados contra CS3, LTB, ST, y Shigella lipopolisacárida.

Xu et al. (Vaccine 21: 664-648, 2003) describieron un mutante rfbF 2a de serotipo Shigella flexneri invasivo atenuado vivo o como un portador para una vacuna gag del V1H a base de ADN.

Noriega et al. (Infection and Immunity 67(2): 782-788, 1999) describieron una estrategia para la protección cruzada contra los serotipos de Shigella flexneri 14, que involucra el uso de dos serotipos 2a y 3a. las cepas atenuadas descritas son las cepas 2a S. flexneri CVD1207 (AguaB-A Asetl Asen) y S. flexneri 3a cepa CVD 1211 (AguaB-A AvirG Asen).

Bernardini et al. (Infection and Immunity 69(2): 1072-1083, 2001) describen mutantes de Shigella flexneri 5, que son un mutante aroC y un mutante aroC purE doble.

Levine et al. (Behring Institute Mitteilungen 98: 120-123, 1997) describieron una cepa CVD 1203 2a S. flexneri atenuada que alberga mutaciones en el gen cromosomal aroA y el gen de virG de plásmido, asi como en el candidato CVD 1205 de vacuna 2a S. flexneri que alberga una mutación de supresión en guaB-A que la hace poco efectiva en la síntesis de ácidos nucleicos, y una mutación de supresión en virG.

Es un objeto de la presente invención proporcionar vacunas contra Shigella mejoradas, en particular para la prevención de enfermedades diarreicas que son altamente relevantes para los viajeros a países endémicos y para niños jóvenes que viven en países en desarrollo. Tales vacunas pueden basarse en una cepa de vacuna Shigella flexneri y atenuada viva capaz de expresar antigenos de manera heterogénea derivados de diferentes patógenos e inducir protección amplia contra patógenos bacterianos, y particularmente la Shigellosis.

Sumario de la invención El objeto se resuelve mediante la materia objeto como se reclama.

De acuerdo con la invención se proporciona una vacuna contra Shigella atenuada viva, que se basa en una cepa Shigella rugosa que carece de 0-antígeno LPS.

De manera especifica, la cepa Shigella es no invasiva mediante mutagénesis, en particular una mutación del plásmido de invasión.

De manera especifica la vacuna de acuerdo con la invención es atenuada mediante mutagénesis de uno o más genes involucrados en la sintesis LPS, transporte y expresión, de preferencia seleccionados del grupo que consiste de genes en el grupo de operon rfb, por ejemplo localizado en el cromosoma entre Gnd (6-fosfogluconato de hidrogenasa, 2089155-2090561) y GalF (UTP-glucosa-1-fosfato uridiltransferasa, 2101928-2102821) genes de la cepa Shigella flexneri 2a 2457T (Wei et al. Complete genome sequence and comparative genomics of Shigella flexneri serotype 2a strain 2457T. Infect Immun. Mayo 2003;71(5):2775-86.) o ubicada en el plásmido de virulencia ( Shigella sonneí) . Se prefiere de manera especifica la mutagénesis de uno o más genes dentro del grupo de genes rfb /wbb que codifican las síntesis O-antígeno, waaL que codifica la ligasa de O-antígeno, wzx que codifica la flipasa de O-antígeno involucrada en el transporte de 0-antígeno, wzy/rfc involucrada en la polimerización de 0-antígeno, genes dentro del grupo de genes rfa/waa que codifican la síntesis de núcleo LPS, genes regulatorios que afectan la expresión de O-antígeno, tal como rfaH, o la pérdida de función o funciones que resulta en al menos 90% de reducción en la expresión de O-antígenos.

De acuerdo con una modalidad específica, la mutagénesis se hace mediante la supresión de uno o más de los rfb F, D, C, E, J y/o los genes I, o una supresión de la parte de los mismos, o de los genes correspondientes en varios serotipos Shigella. De manera alternativa, la mutagénesis mediante inactivación, por ejemplo trascendente, condicional o inactivación constitutiva, pueden utilizarse.

La cepa shigella de preferencia se selecciona del género Shigella, por ejemplo a partir de cualquier serotipo o especie shigella, en particular S. flexneri , S. sonnei , S. dysentheríae y S. boydii .

De manera específica, la cepa Shigella expresa proteínas de membrana externa, que pueden inducir anticuerpos de reacción cruzada, en particular proteínas conservadas, incluyendo OmpC, OmpA y OmpX, o aquellas codificadas en el plásmido de invasión.

La vacuna de acuerdo con la invención es en particular de protección cruzada contra diferentes serotipos y especies de Shigella, en particular contra cualquiera de S. flexneri 2a, y S. flexneri 6 y S. sonnei, o las enteroinvasivas Escherichia coli .

De acuerdo con un aspecto especifico, la Shigella es no invasiva mediante mutagénesis adicional del plásmido de invasión, en particular una mutación del plásmido de invasión, que comprende una supresión de los genes ipaB y/o ipaC y/u otros genes ipa .

De manera especifica, la Shigella comprende un plásmido de invasión endógeno recombinante que incorpora al menos un gen que codifica un antigeno heterólogo para secretar el antigeno o para expresar el antigeno en la superficie celular bacteriana.

Las modalidades preferidas se refieren a tal vacuna como en donde el antigeno es un antigeno protector derivado de un patógeno, por ejemplo seleccionado del grupo que consiste de: Un antigeno bacteriano de preferencia una toxina o factor de colonización, Un antigeno viral, de preferencia de un patógeno que provoca infecciones entéricas o de la mucosa, un antígeno fúngico de preferencia de un patógeno gue provoca infecciones entéricas o de la mucosa, y un antigeno parasitario, de preferencia de un patógeno gue provoca infecciones entéricas.

De manera especifica, el antigeno bacteriano se origina de las bacterias enteros patogénicos, de preferencias seleccionadas del grupo que consiste de: a. Antigenos E. coli, en particular una enterotoxina seleccionada del grupo que consiste de LTB, LTA y ST de ETEC mutadas, subunidades, o funciones de las mismas, antigenos de enteroagregativos E. coli (EAEC), o toxinas 1 o 2 tipo Shiga. b. Antigenos Campylobacter jejuni , c . Antigenos Clostridium difficile especialmente toxinas A y B d. Antigenos Vibrio cholera específicamente el antígeno CT-B e. Proteínas mutantes o de fusión del inciso a), b) c) o d).

De manera específica, el antígeno bacteriano es una enterotoxina (ETEC) que comprende la subunidad B de la toxina termolábil (LTB), la toxina estable caliente (ST) o las subunidades o funciones de las mismas, de preferencia LTB/STm comprende una STm con una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID 1, que excluye opcionalmente la secuencia de tipo salvaje de la ST humana.

En particular, el antigeno ETEC es una proteína de fusión de la subunidad B de la LT y la ST mutante, de preferencia una proteina de fusión LTB/STm con una secuencia de aminoácidos como la derivada de la figura 7 la secuencia SEC ID 11-18 (nucleótido terminador LTA-promotor-LTB-ST-LTB y la secuencia de aminoácido LTB-ST para 4 constructos), por ejemplo con mutaciones ST en la posición 13 y/o 12, tal como P13F o P13G, y/o N12R o N12K).

De manera especifica, el antígeno viral se origina de los virus diarreicos, de preferencia seleccionados del grupo que consisten de rotavirus y virus Norwalk (calicivirus).

De manera específica, el antigeno parasitario se origina de los protozoarios que provocan la diarrea, de preferencia seleccionados del grupo que consisten de Giardia lamblia, de las especies Cryptosporidium y la Entameba histolytica .

De manera específica, el antígeno fúngico se origina de los hongos que provocan la diarrea, de preferencia seleccionados del grupo que consisten de Blastomyces dermatiditis y Histoplasma spp.

De acuerdo con un aspecto específico de la invención, la cepa de la vacuna Shigella comprende además una supresión del gen cromosómico esencial y una inserción del gen en el plásmido de invasión, en particular en gen ppa, o cualquiera de accD, acpS, dapE, era, frr, ftsl, ftsL, ftsN, ftsZ, infA, Igt, lpxC, msbA, murA, murl, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho y rhoL.

Incluso, de acuerdo con una modalidad especifica de la invención, la vacuna se proporciona para uso en la profilaxis o immunoprofilaxis de un sujeto para evitar enfermedades infecciosas, y en particular enfermedades entéricas, tales como la enfermedad diarreica. De manera especifica, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de Shigellosis, disenteria y diarrea.

De acuerdo con la invención también se proporciona un método para evitar enfermedades infecciosas en un sujeto, en particular enfermedad entérica, especialmente mediante vacunación e inmunización de tal sujeto, respectivamente.

De manera especifica, tal enfermedad entérica es provocada por cualquier serotipo o especie de Shigella.

De preferencia, la profilaxis (inmunitaria) comprende la administración de la vacuna en una formulación mucosa u oral.

De manera especifica, la vacuna se administra oral o intranasalmente.

Una modalidad específica se refiere a una vacuna para uso de acuerdo con la invención, en donde: Una vacuna polivalente se usa y expresa los antígenos protectores de Shigella y al menos una de otras de las especies diferentes a Shigella mediante la incorporación de un antígeno protector de tal patógeno en el plásmido de invasión recombinante modificado endógeno, y en donde Tal enfermedad infecciosa es provocada por cualquier serotipo o especie de Shigella y/o el patógeno.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una cepa Shigella, que es una cepa S. flexneri 2a, tal como S. flexneri 2a 2457T, con una supresión de rfbF y al menos uno de los genes ipaB y/o ipaC, o una supresión de las partes esenciales de los mismos.

De manera específica, tal cepa Shigella puede comprender además una supresión de un gen cromosómico esencial y una inserción del gen en el plásmido de invasión.

De preferencia, tal cepa Shigella comprende un plásmido de invasión recombinante que incorpora al menos un gen que codifica un antígeno heterólogo para expresar y/o secretar tal antígeno.

Incluso, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un vector de plásmido recombinante con base en un plásmido de invasión Shigella mutado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica al menos un antigeno heterólogo, en donde el plásmido se muta en al menos uno de los genes IpaB y/o IpaC. Esto se refiere específicamente a una mutación de la supresión y/o inactivación de una región no codificante o codificante, tal como las secuencias regulatorias enlazadas operablemente a un gen y un gen, respectivamente, de preferencia una supresión de los genes que lleva a producir células hospederas bacterianas no invasivas, en particular una supresión de los genes IpaB y/o IpaC o una supresión de la parte de los mismos (substancial).

Un aspecto específico adicional de la invención se relaciona con una célula hospedera bacteriana que comprende el vector de acuerdo con la invención en donde la célula hospedera se selecciona específicamente del género Shigella, Escherichia, Salmonella, Campylobacter o Yersinia.

Tal célula hospedera comprende específicamente una mutación en el plásmido de invasión endógeno. Específicamente, el vector de acuerdo con la invención es un plásmido de invasión endógeno, es decir un plásmido endógeno u homólogo a la célula hospedera.

Breve descripción de las figuras Figuras la-lc. Capacidad de protección cruzada de cepas no invasivas atenuadas vivas de S. flexneri y S. sonnei que carecen de sintesis de O-antigeno LPS.

Grupos de ratones BALB/c de 8 semanas de edad (106 CFU) y variantes de CRN (108 CFU) de mutantes de S. flexneri 2a (figs. la y Ib) o alternativamente variantes de fase I (105·5 CFU) y fase II (107·5 CFU) de S. sonnei (fig. 1c) dobles con dos semanas de intervalo. Los grupos de control fueron vacunadas simuladamente con solución salina. Subsecuentemente, los ratones fueron desafiados con 106 CFU de S. flexneri 6 tipo salvaje (figs. la y 1c) o 1065 CFU de S. sonnei tipo salvaje (fig. Ib) por la misma via. La supervivencia fue monitoreada subsecuentemente durante 14 dias. Las Figuras muestran datos combinados de tres (fig. Ib) o dos (figs. la y le) experimentos independientes con 5 ratones en cada grupo y repetidos. El análisis estadístico de las curvas de supervivencia fue realizado con la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). En caso de que la supervivencia fuera significativamente diferente a la de los ratones vacunados de manera simulada, el valor p se muestra en la gráfica.

Figura 2. Representación esquemática de fenotipos antigénicos de varios mutantes utilizados también como diferencia propuesta en los niveles de anticuerpo que podrían inducir.

Los O-antígenos, los determinantes genéticos y los cuerpos disparados por los mismos se muestran. Se muestran también los antígenos de superficie conservados menores e Ipa. Los mutantes que expresan tanto Ipa como los O-antígenos { S. flexneri AaroC CRP y S. sonnei fase I) disparan una respuesta de anticuerpo principalmente contra estos antígenos mayores. En contraste, la pérdida de estos antigenos en las cepas de vacuna permite una respuesta mayor a los antígenos conservados menores. Ip: plásmidos de invasión, cr.: cromosoma, T3SS: sistema de secreción tipo árbol, LPS: Lipopolisacárido.

Figura 3. Mucosa lgA de reacción amplia obtenida de los ratones vacunados con cepas S. Flexneri 2a atenuadas vivas.

La reactividad inmunitaria de slgA en muestras BAL recolectadas después de dos inmunizaciones con la cepa Ipa positiva lisa ( AaroC CRP) y el mutante doble ( ArfbF CRN) fueron determinadas con el ELISA en diferentes células bacterianas objetivo. La reactividad se expresa como proporción (reactividad de la muestra AaroC CRP dividida entre la reactividad de la muestra ArfbF CRN) en la misma dilución para hacer que las repeticiones sean comparables. La gráfica muestra los medios + error estándar de los medios de cuatro experimentos realizados con muestras BAL obtenidas mediante la prueba no paramétrica Mann-Whitncy a los valores obtenidos en el objetivo positivo doble (ipa y 0-antígeno) ( AaroC CRP; columna negra).

Figura 4. Tabla suplementaria 1: Oligonucleótidos usados para la generación y confirmación de los mutantes de supresión. (SEC ID 3 - 10) Figuras 5a-5c. Presentación esquemática de una cepa Shigella flexneri 2a 2457T atenuada.

Figura 5a.- Cepa completamente secuenciada de Shigella flexneri 2a 2457T.0-antígeno es el determinante serotipíco de Shigellae. El gen rfhF en el cromosoma Shigella codifica un factor esencial para la síntesis del componente 0-antígeno de LPS. El plásmido de invasión presente en todas las cepas Shigellae patogénicas codifica los antígenos de plásmido de invasión (IpaA-D) que son componentes moleculares importantes del sistema de secreción tipo 3 (T3SS). T3SS media los procesos clave de las interacciones de Shigella con células objetivo y eventualmente lleva a la transmisión de los factores Shigella en la célula objetivo que permite que se invada y se esparsa. Ipa B e IpaC son clave y son componentes esenciales de este sistema.

Figura 5b.- En el mutante de Shigella flexneri 2a T2457 rfbFipaB/C- dos supresiones son introducidas. La supresión del gen rfbF del cromosoma elimina la síntesis del O-antígeno y resulta en una cepa "rugosa" que se atenúa e induce la inmunidad independiente serotipica después de la vacunación. La supresión de los genes ipaB y C en el plásmido de invasión afecta a T3SS, lo cual hace que el mutante de Shigella no sea invasivo (y negativo rojo Congo).

Figura 5c.- Para estabilizar el plásmido de invasión de la cepa Shigella mutante, un gen cromosómico esencial (pirofosfatasa inorgánica, ppa (Fig.7 SEC ID 24)) se suprime del cromosoma y se vuelve a introducir como una parte del constructo sintético en el plásmido de invasión.

Figura 6: Ilustración esquemática del plásmido de invasión pCP301 de la cepa Shigella flexneri 2a con el grupo ipa, las posiciones del cebador para la supresión ipaB/C (pKDl, 2) y los cebadores de control para monitorear la supresión de ipaB/C (kol, 2). Posición del sitio de inserción del gen sintético entre ipaJ y un elemento IS100 también se indica.

Figura 7: Secuencias El gen para la proteína de fusión LT-B/mST que codifica ST con una mutación en la posición 13 de aminoácido (desde Pro a Phe) junto con el promotor eltAB y las secuencias de terminación.

GP-P13F (secuencia de nucleótido, SEC ID 11), Proteína de fusión LT-B/mST con una mutación en ST en la posición de aminoácido 13 (desde Pro a Phe).

GP-P13F (secuencia de aminoácido, SEC ID 12), Gen para la proteína de fusión LT-B/mST que codifica ST con una mutación en la posición 13 de aminoácido (desde Pro a Gly) junto con el promotor eltAB y las secuencias de terminación.

GS-P13G (secuencia de nucleótido, SEC ID 13), Proteina de fusión LT-B/mST con una mutación en ST en la posición de aminoácido 13 (desde Pro a Gly).

GS-P13G (secuencia de aminoácido, SEC ID 14), Gen para la proteina de fusión LT-B/mST que codifica ST con una mutación en la posición de aminoácido 12 (desde Asn a Arg) junto con el promotor eltAB y las secuencias de terminación.

GS-N12R (secuencia de nucleótido, SEC ID 15), Proteína de fusión LT-B/mST con una mutación en ST en la posición de aminoácido 12 (desde Asn a Arg) GS-N12R (secuencia de aminoácido, SEC ID 16), Gen para la proteína de fusión LT-B/mST que codifica ST con una mutación en la posición 12 de aminoácido (desde Asn a Lys) junto con el promotor eltAB y las secuencias de terminación.

GS-N12K (secuencia de nucleótido, SEC ID 17), Proteina de fusión LT-B/mST con una mutación en ST en la posición de aminoácido 12 (desde Asn a Lys) GS-N12K (secuencia de aminoácido, SEC ID 18), Cebador PCR de control hacia adelante para confirmar las cepas ipa col mutantes de supresión ipa (SEC ID 19), Cebador PCR de control inverso para confirmar las cepas ipa co2 mutantes de supresión ipa (SEC ID 20), Cebador PCR hacia adelante para generar cepas ipa pKDl mutantes de supresión ipa (SEC ID 21), Cebador PCR hacia adelante para generar cepas ipa pKD2 mutantes de supresión ipa (SEC ID 22), Secuencia de nucleótido de los genes ipaB e ipC removida del plásmido de invasión. ipaBC (SEC ID 23).

Secuencia de nucleótido del gen ppa implantado del cromosoma al plásmido de invasión Gen de Shigella ppa (SEC ID 24).

Cebador PCR hacia adelante para generar las cepas ppa pKD-F mutantes de supresión ppa (SEC ID 25).

Cebador PCR inverso para generar cepas ppa pKD-R mutantes de supresión ppa (SEC ID 26).

Cebador PCR de control hacia adelante para confirmar las cepas ppa kol mutantes de supresión ppa (SEC ID 27).

Cebador PCR de control inverso para confirmar cepas ppa ko2 mutantes de supresión ppa (SEC ID 28).

Péptido enlazador insertado entre LT-B y mST para doblez flexible GGGGS (SEC ID 29).

Figura 8: Amplificación de PCR de la región cromosómica en donde el gen rfbF se suprime. M: marcador de tamaño de ADN; WT: Shigella flexneri 2a 2457T tipo salvaje, gen rfbF con región flanqueante, 1100 fragmento bp; mt: mutante ArfbF, reemplazo de gen con gen cloranfenicol, 1300 bp.

Figura 9: Amplificación de PCR de la región de plásmido de invasión en donde los genes ipaC e ipaB se suprimen. M: marcado de tamaño de ADN; WT: Shigella flexneri 2a 2457T tipo salvaje, genes ipaB e ipaC con región flanqueante, fragmento 1600 bp; mt: plásmido de invasión mutante AipaBC, reemplazo de gen con gen kanamicina, 2570 bp.

Figuras 10a-10c: Figura 10a.- Estructura de los constructos multigen que codifican el gen ppa esencial, la proteina de fusión LTB-mST y la proteina de resistencia a kanamicina.

Expresión de la proteina de fusión LTB-mST que se dirige con el promotor LTA y la transcripción se termina con el terminador LTB. Las secuencias de aminoácido LTB-ST de 4 constructos con mutaciones desintoxicantes ST (P13F, P13G, N12R, N12K) se indican (codones mutados subrayados). Abreviaturas: CS: sitio de clonación; H1 y H2: Regiones homologas 1 y 2 en el plásmido de invasión para ayudar a la recombinación homologa; ppa: gen pirofosfatasa inorgánica; pro: promotor; term: terminador; GGGGS: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID 29 enlazador de penta-aminoácido entre LTB y MST; kan: gen de resistencia a kanamicina.

Figura 10b.- Inserción de genes ETEC en el plásmido de invasión de Shigella. M: marcador de tamaño de ADN; WT: Shigella flexneri 2a 2457T tipo salvaje, región intergénica de plásmido de invasión, fragmento 450 bp; mt: LT-B + STm plásmido de invasión mutante de gen LT-B + STm, reemplazo de gen con gen de kanamicina, 2800 bp, Figura 10c.- Análisis inmunoblot para detectar LTB. LT-B recombinante, asi como las fracciones supernadantes de cultivo de E. coli y Shigellla (proteínas secretadas) se separan mediante SDS-PAGE, proteínas transferidas a la membrana nitrocelulósica y detectadas con el anticuerpo monoclonal anti-LTB, carril 1: Shigella flexneri tipo salvaje (control negativo); carril 2: Shigella flexneri que lleva el gen de fusión en el plásmido de invasión; carril 3: DH5D E. coli transformado con vector pGET que contiene el constructo sintético como se muestra en la figura 10a; Carril 4: cepa ETEC que expresa LT (control positivo).

Figura 11. Protección heteróloga inducida por la cepa de vacuna Shigella flexneri 2a con mutación combinada de rfbF e ipaC/ipaB modificadas. Los grupos de 5 ratones fueron inmunizados intranasalmente con dosis subletales ya sea de las cepa tipo salvaje Shigella flexneri 2a 2457T (5><105 cfu/ ratón) o sus mutantes de supresión isogénicos 2457TArfb, 2457TAipaBC, 2457TArfbAipaBC (todos a 108 cfu/ratón), o fueron inmunizados simuladamente con el regulador de PH PBC. 3 inmunizaciones idénticas fueron realizadas con intervalos de 2 semanas. Una semana después de la ultima inmunización más fuerte, los ratones fueron tratados desafiadamente con una dosis letal de una cepa de S. sonnei (2*106 cfu/ratón). La supervivencia de los animales fue monitoreada diariamente.

Descripción detallada de la invención Los términos específicos como se usan a través de la descripción tienen el siguiente significado. El término "atenuado" se usa en la presente para describir una cepa virulenta de Shigella que ha sido modificada para que no sea capaz de provocar enfermedad, es decir, la cepa modificada no es virulenta. El término "vivo" con respecto a la shigella atenuada se usa en la presente para describir Shigella que es capaz de desarrollarse y de producirse. Por consiguiente, la cepa de Shigella viva de la presente invención se usa en la vacuna viva atenuada y es capaz específicamente de colonizar el colon de un sujeto, pero no de provocar síntomas clínicos asociados con enfermedades entéricas provocadas por patógenos entéricos o de diarrea. Adicionalmente, la cepa viva de la presente invención es específicamente capaz de limitar la replicación en el sujeto vacunado y de inducir una respuesta inmunitaria protectora que protege contra cepas de Shigella virulentas. Una bacteria atenuada de la invención puede modificarse genéticamente para expresar un antígeno heterólogo que no se expresa mediante la bacteria nativa, de manera que la bacteria atenuada actúa como un portador antígeno heterólogo.

El término "antígeno" se usa de acuerdo con la presente invención y se refiere en particular a cualquier determinante antigénico, que pueda ser reconocido posiblemente por un sitio de enlace de un anticuerpo. Los antígenos preferidos específicamente son las moléculas o estructuras, que ya han sido probadas o que son capaces de ser inmunológica o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellas, para las cuales una eficacia clínica ha sido probada. El termino como se usa en la presente comprende en particular moléculas o estructuras seleccionadas de antígenos que comprenden epítopos inmunoaccesibles e inmunorrelevantes, en particular antígenos conservados encontrados en una o más especies o serotipos. Los epítopos inmunoaccesibles se presentan típicamente mediante o están comprendidos en los antígenos expresados en una superficie celular. El término "antígeno protector" como se usa en la presente se refiere a aquellos antígenos que disparan una respuesta inmunitaria en vivo, para inducir a los anticuerpos neutralizantes contra el antígeno. Esto proporciona la protección efectiva después de la inmunización activa con el antígeno. Los antígenos de proteína son antígenos preferidos debido a su habilidad inherente para obtener tanto respuestas inmunitarias celulares como humorales.

El término "heterólogo" se usa en la presente específicamente con respecto a un antígeno, y entendido como un antígeno exterior a la célula que expresa el antígeno heterólogo. Con respecto a una célula Shigella o cepa, el termino se refiere específicamente a antígenos exteriores a la célula o cepa de Shigella, respectivamente. Por lo tanto, tal antígeno heterólogo o exterior no sería expresado en una célula o cepa de tipo salvaje, sino por el recombinante que comprende un gen heterólogo que codifica el antígeno. Por lo tanto esa célula recombinante o cepa expresaría tal antígeno heterólogo, por ejemplo en la superficie celular. Las células de la invención pueden generarse genéticamente para expresar un antígeno heterólogo, por ejemplo, un componente no tóxico o forma de LT y/o ST o STm. Tales células inducen una respuesta inmunitaria contra el antígeno heterólogo asi como los antígenos nativos y por lo tanto mejoran la protección proporcionada por una vacuna.

El término "reacción cruzada" con respecto a los antigenos, como se usa en la presente significa antigenos con epitopos con partidos entre diferentes patógenos, incluyendo por ejemplo diferentes serotipos de las mismas especies o diferentes especies bacterianas. Los antigenos de reacción cruzada por lo general son estructuras conservadas. Los epitopos de reacción cruzada pueden originarse de los mismos antigenos expresados por los patógenos diferentes, o desde antigenos diferentes con estructura similar.

Los antigenos de reacción cruzada específicos son reconocidos por los anticuerpos de reacción cruzada, por ejemplo anticuerpos de antisuero, anticuerpos aislados o recombinantes. Tales anticuerpos de reacción cruzada pueden reconocer los antígenos de reacción cruzada de diferentes patógenos. Los anticuerpos de reacción cruzada específicos son anticuerpos neutralizantes.

Una vacuna de "protección cruzada" o respuesta inmunitaria se entiende como la que protege contra la infección mediante al menos un patógeno diferente, por ejemplo una especie o serotipos diferentes, que no son idénticos al usado para obtener la respuesta. La eficacia de protección cruzada por lo general puede ser probada con diferentes antisueros de sujetos que han sido expuestos a diferentes patógenos.

Cuando un antigeno de reacción cruzada está diseñado para inducir una inmunidad de protección cruzada, esto puede ser probado en modelos de animales, por ejemplo mediante la inmunización de animales con antigenos de reacción cruzada derivados de un patógeno que dispara una respuesta inmunitaria, y se pueden desafiar a los animales con al menos un patógeno diferente del usado para obtener la respuesta. Como ejemplo, tal inmunidad de protección cruzada contra más de un serotipo de Shigella o de otras bacterias enteroinvasivas con antigenos de reacción cruzada, tal como E. coli, específicamente se refiere a la protección contra variaciones distintas dentro de las especies de bacterias de diferentes individuos, por ejemplo variaciones en el nivel de subespecie. El grupo de serotipos con antigenos comunes se le llama un serogrupo o serotipo.

La base para el desarrollo de una espectro amplio, por ejemplo vacunas de Shigella multicepa y/o multiserotipo y/o multiespecies es la identificación de los antigenos de reacción cruzada que son prevalentes en los serotipos Shigella. Esto incluye particularmente aislados asociados con infecciones en humanos.

Cuando una vacuna polivalente está diseñada para inducir una inmunidad de protección cruzada contra diferentes patógenos, la respuesta inmunitaria por lo general es obtenida mediante varios antigenos, por ejemplo antigenos individuales de diferentes patógenos. Como ejemplo, tal vacuna polivalente puede basarse en al menos dos antigenos protectores diferentes de diferentes especies, tal como los derivados de Shigella y Escherichia, pero también otros antígenos bacterianos, virales, fúngicos o parasitarios. La vacuna de protección cruzada polivalente puede por ejemplo ser probada en un modelo de animal mediante la inmunización de animales, con la vacuna que comprende diferentes antigenos protectores derivados de al menos dos patógenos diferentes que disparan una respuesta inmunitaria, y desafian a los animales con 1, o dos más de los patógenos.

La base para el desarrollo de una vacuna candidato de multiespecies con base en bacterias Shigellas atenuadas especificas, como se usa de acuerdo con la invención, es la identificación de antigenos protectores, ya sea de reacción cruzada para dirigirse a una serie de diferentes serotipos o no, que son prevalentes en especies diferentes patogénicas, contra cuya protección se busca.

El término "entérico" también conocido como "enteral", como se usa en la presente especificamente en conexión con una enfermedad o patógeno se refiere a una enfermedad o trastorno o patógeno que se relaciona o que afecta a los intestinos, por ejemplo enfermedad diarreica o disenteria. Específicamente tal enfermedad entérica se refiere a la enfermedad infecciosa del colon. Los síntomas específicos incluyen diarrea llena de moco, sangrienta; dolor abdominal; fiebre y pérdidas de fluidos del cuerpo. La enfermedad diarreica se refiere a condiciones que resultan en tres o más deposiciones sueltas o liquidas por día, o como que tienen más deposiciones de las normales para esa persona. Un patógeno entérico se entiende que provoca una enfermedad entérica en un sujeto, ya sea después de la infección con el patógeno, o de la intoxicación del sujeto con una toxina, en particular una enterotoxina.

Puede haber muchas causas de la enfermedad entérica infecciosa, tal como la disentería, o la diarrea, que incluyen virus, bacterias, hongos y parásitos. Los ejemplos se proporcionan de la siguiente manera: el norovirus es la causa más común de la diarrea viral en adultos pero el rotavirus es la causa más común en niños por abajo de los 5 años. Los tipos de adenovirus 40 y 41, y los antivirus provocan un número significativo de infecciones. La bacteria Campylobacter es una causa común de la disenteria o diarrea bacteriana, pero las infecciones por Salmonellae, Shigellae y algunas cepas de Escherichia coli ( E. coli ) son frecuentes en algunos territorios. En los últimos, particularmente aquellos que han sido tratados con antibióticos para infecciones no relacionadas, una toxina producida por Clostridium difficile con frecuencia provoca diarrea severa. Los ejemplos de parásitos incluyen Giardia lamblia, que puede provocar infecciones crónicas, y Entamoeba histolytica . La enfermedad entérica ejemplar como posiblemente este dirigida mediante la vacuna de la invención es Shigellosis y la diarrea relacionada con la ETEC.

El término "endógeno" como se usa en la presente con respecto a un plásmido significa que el plásmido se origina en una célula hospedera particular. Un plásmido endógeno puede modificarse genéticamente para obtener un plásmido endógeno recombinante, mediante téenicas recombinantes para modificar el plásmido in situ, es decir, dentro de la célula hospedera que obstaculiza el plásmido endógeno nativo, o de otro modo después de la eliminación de la célula hospedera, sometiéndolo a manipulación en el laboratorio y luego se vuelve a introducir en una célula hospedera del mismo tipo. El fenotipo invasivo de Shigella se confiere específicamente mediante el plásmido de virulencia 220-kb endógeno, también llamado plásmido de invasión, o plásmido de invasión endógeno o nativo. El plásmido de invasión endógeno de Shigella se proporciona específicamente de acuerdo con la invención para propósitos de recombinación, ya sea como plásmido de invasión aislado o para recombinación in si tu .

El término "esencial" como se usa en la presente respecto a un gen se entiende que se refiere a un gen necesario para que un organismo vivo sobreviva, por ejemplo para que una célula bacteriana se replique. La mutación de un gen esencial, tal como una supresión y/o inactivación, provocarla un fenotipo letal o una célula no replicable. Los genes esenciales de Shigella pueden ser mutados para suprimir el gen o genes del cromosoma Shigella, y después incorporar el gen o genes en el plásmido de invasión para estabilizar el plásmido de invasión. Esto proporciona una cultivación de Shigella con un plásmido de invasión endógeno recombinante, estable. Entre los genes esenciales de Shigella están los genes ppa, accD, acpS, dapE, era, frr, ftsl, ftsL, ftsN, ftsZ, infA, Igt, IpxC, msbA, murA, murl, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho y rhoL.

En la presente "inactivación" de un gen siempre se entiende que se refiere a una modulación hacia abajo constitutiva o inducidle, trascendente de un gen, para reducir o inhibir la expresión de un producto de gen. Esto puede hacerse específicamente mediante mutación de un gen o secuencia regulatoria operablemente enlazada al gen, tal como promotores, mejoradores, etc. Que regulan la expresión de un gen. Entre las mutaciones de inactivación están aquellas que particularmente resultan en la reducción o supresión de expresión de los poli nucleótidos o genes, por ejemplo genes que codifican los factores de virulencia, o que llevan a la expresión de proteínas no funcionales respectivas, por ejemplo factores de virulencia no funcionales.

El término "invasivo" o "no invasivo" como se usa en la presente con respecto a un gen se entiende de la siguiente manera. Las bacterias patogénicas invasivas son capaces de invadir las células eucarióticas. Por ejemplo, después de la invasión, Shigella puede multiplicarse ultra celularmente y esparcirse a células epiteliales vecinas, resultando en la destrucción del tejido y una patología característica de la Shigellosis. Entre los genes que son mediadores de la invasividad de Shigella están por ejemplo los genes ipa que codifican los antígenos de plásmido de invasión. La supresión y/o inactivación de al menos uno de estos genes puede llevar a una Shigella no invasiva.

La prueba Sereny es una prueba estándar para determinar la invasividad de los organismos tal como Shigella o Escherichia coli . (Wood et al. J. Clin.

Microbiol. 24: 498-500, 1986). Esto se hace mediante inoculación de la suspensión de las bacterias en el ojo de un cerdo Guinea. La conjuntivitis mucopurulenta severa y la queratitis severa indican una prueba positiva.

El término "aislado" o "aislamiento" como se usa en la presente con respecto a un ácido nucleico, y en particular con un vector, plásmido y específicamente el plásmido de invasión de Shigella, se refieren a tal compuesto que ha sido separado suficientemente del ambiente con el que sería naturalmente asociado, para existir en forma "substancialmente puras". El término "substancialmente puro" o "purificado" como se usa en la presente se refiere a una preparación que comprende al menos 50% (w/w), de preferencia al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de un compuesto, tal como una molécula o un plásmido de ácido nucleico. La pureza se mide mediante métodos adecuados para el compuesto (por ejemplo métodos cromatográficos, electroforesis de gel políacrilamida, análisis HPLC, y similares,).

"Aislado" no necesariamente significa la exclusión de mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o materiales, o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad fundamental, y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a la purificación incompleta. En particular, moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención también pueden significar que incluyen aquellas sintetizadas químicamente.

Con referencia al plásmido de invención aislado de la invención, este término se refiere a un plásmido que se separa del citoplasma en el cual se origino. Un "plásmido aislado" puede representar adicionalmente un plásmido producido directamente mediante medios biológicos o sintéticos y separado de otros componentes presentes durante su producción.

El término "mutagénesis" con respecto a un gen como se usa en la presente puede significar la mutación de una secuencia genética, en particular cualquiera de supresión, sustitución, inserción de al menos ácido nucleótido, o cualquier combinación de los mismos, para obtener un gen mutado. Esto en particular se refiere a todo el gen o genes o a una parte significativa de los mismos, por ejemplo una supresión de al menos 50% del gen. Los términos "mutagénesis" y "mutación" se utilizan en la presente de manera intercambiable.

El término "rugoso" con respecto a una bacteria Gram-negativa, tal como Shigella, significa lo contrario a suave, y específicamente incluye "un poco rugoso" (es decir síntesis 0-ag de regulación hacia abajo) o bacterias "de muchas asperezas". El término "rugoso" como se usa en la presente puede incluir características tal como una morfología de colonia irregular, y puede incluir por ejemplo morfología ondulada y/o en forma de lóbulo. El termino significa específicamente que una cepa no es capaz y/o substancialmente no es capaz de producir 0-polisacáridos. Un polímero glicano repetitivo contenido dentro de un LPS se refiere como él 0-antígeno, 0-polisacárido, O-(lado-) cadena de la bacteria. El 0-antígeno se sujeta al núcleo del oligosacárido, y comprende el dominio más externo de la molécula LPS. La presencia o ausencia de las 0-cadenas determina, ya sea que el LPS este considerado como rugoso o liso. Las cepas bacterianas que tienen estructuras O-antígeno alteradas cambian su apariencia de lisas a opacas cuando se desarrollan en placas de agarre. Las 0-cadenas de longitud completa hacen que las LPS se vuelvan lisas, mientras que la ausencia o reducción de las 0-cadenas hace que las LPS sean rugosas. Las bacterias "lisas" incluyen el núcleo completo y el 0-antígeno. Las bacterias "rugosas" incluyen una falta de LPS-O-antígeno, significando que no hay 0-antígeno o una cadena de longitud reducida de 0-antígenos o un número reducido de cadenas LPS lisas. El término "poco rugoso" se refiere a un subgrupo de bacterias rugosas, que tienen una longitud de cadena reducida de 0-antígenos o un número reducido de cadenas LPS lisas. Las bacterias "muy rugosas" tienen muchas partes del núcleo de LPS, y por consecuencia carecen también de O-antígenos.

El término "falta de LPS 0-antígeno" como se usa en la presente con respecto a Shigella rugosa se refiere específicamente a menos de 50% o menos de 40%, o menos de 30%, o menos de 20%, o menos de 10%, o esencialmente ningún LPS O-antígeno como se determina en un ensayo estándar.

Una prueba estándar puede utilizarse para determinar las características de aspereza de una cepa. Por ejemplo, el fenotipo de mutantes LPS puede por ejemplo ser determinado mediante separación SDS-PAGE de LPS y la tensión de plata o las pruebas de aglutinación utilizando suero inmunitario específico de serotipo.

La Shigella rugosa puede ser producida mediante atenuación, por ejemplo mediante mutación de al menos de un gen o una parte significativa para el mismo tal mediante supresión y/o inactivación, cuyo gen está involucrado en la síntesis, transporte y/o expresión de LPS, de preferencia seleccionados del grupo que consiste de genes en el grupo de operon rfb, o uno o más de los genes dentro del grupo de genes rfb/wbb que codifican las síntesis de O-antígeno, waaL que codifica la oligasa O-antígeno, wzx que codifica la flipasa O-antígeno involucrados en el transporte de 0-antígeno, wzy/rfc involucrada en la polimerización de 0-antígeno, genes dentro del grupo de genes r fa/waa que codifican la síntesis de LPS-núcleo, genes regulatorios que afectan la expresión de 0-antígeno, tal como rfaH, o pérdida de función o funciones que resultan al menos 90% de reducción en la expresión de los O-antígenos.

Los ejemplos específicos de los genes involucrados en la síntesis de azúcar de LPS son rfbA, B, D y C.

Los ejemplos específicos de los genes involucrados en la transferasa de azúcar LPS son rfbF y G.

Un ejemplo específico de un gen involucrado en la polimerasa de LPS O-antígeno es rfc/wzy.

El grupo del operon rfb se localiza en el cromosoma o en el plásmido de invasión ( Shigella sonnei ) . Los genes específicos en este grupo son rfb F, D, C, E, J y/o genes I.

Tal como se utiliza aquí, el término "recombinante" se refiere a una molécula o constructo que no se produce naturalmente en una célula hospedera. En algunas modalidades, las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes contienen dos o más secuencias de origen natural que están unidas entre sí de una manera que no se produce naturalmente. Una proteína recombinante se refiere a una proteína que está codificada y/o se expresa por un ácido nucleico recombinante. En algunas modalidades, las "células recombinantes" expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (es decir, no recombinante) de la célula y/o expresan genes nativos que de otra manera son anormalmente sobre expresados, bajo expresados, y/o no se expresan en absoluto debido a la intervención humana deliberada. Las células recombinantes contienen al menos un polinucleótido o polipéptido recombinante. "Recombinación", "recombinar", y la generación de un ácido nucleico "recombinado" generalmente abarcan el conjunto de al menos dos fragmentos de ácido nucleico. En ciertas modalidades, las proteínas recombinantes y ácidos nucleicos recombinantes permanecen funcionales, es decir, mantienen su actividad o exhiben una actividad mejorada en la célula hospedera. En cualquier caso una bacteria atenuada, tal como la Shigella atenuada de la invención se considera una célula recombinante. Un constructo de ácido nucleico, tal como un plásmido o vector, ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido), polipéptido o célula hospedera se denomina aquí como "recombinante" cuando es de origen no natural, artificial o procesado. Un plásmido de invasión recombinante de Shigella está diseñado en particular para incorporar una eliminación y/o inactivación específica de uno, dos o más polinucleótidos o genes, tal como al menos una eliminación de los genes que codifican antígenos de plásmido de invasión, y/o comprende además uno o más genes heterólogos, tales como genes gue codifican antigenos protectores.

Un plásmido recombinante de invasión "estable" de Shigella es un plásmido de Shigella que muestra al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, o mayor que 90% de retención en un cultivo de células Shigella bajo condiciones seleccionadas para mantener el plásmido en el cultivo celular. Un ejemplo especifico de un plásmido recombinante estable de invasión de Shigella se refiere a una célula hospedera recombinante Shigella que ha mutado para eliminar y/o desactivar un gen esencial situado en un locus cromosómico e integrado en un locus del plásmido de invasión. Mientras que un Shigella sin el plásmido de invasión no crecería o no sería replicado, la Shigella que lleva el plásmido endógeno de invasión sería capaz de crecer y replicarse in vivo.

Tal como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a un vehículo mediante el cual una secuencia de ADN o ARN, por ejemplo, un gen (heterólogo) exterior, se puede introducir en una célula hospedera, a fin de transformar al hospedero y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los plásmidos son los vectores preferidos de la invención, en particular, el plásmido de invasión de Shigella, incluyendo específicamente un plásmido de invasión endógeno.

Los vectores comprenden típicamente el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta el ADN extraño. Una forma común para insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas denominadas enzimas de restricción que escinden el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) denominados sitios de restricción. Un "casete" se refiere a una secuencia codificante de ADN o segmento de ADN que codifica para un producto de expresión que puede insertarse en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción de casete están diseñados para asegurar la inserción del casete en el marco de lectura apropiado. En general, se inserta ADN extraño en uno o más sitios de restricción del ADN vector, y luego es transportado por el vector en una célula hospedera junto con el ADN vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene insertado o añadido ADN, como un vector de expresión, también puede ser llamado un "constructo de ADN." Un tipo común de vector es un "plásmido", que por lo general es una molécula autónoma de doble hebra de ADN, generalmente de origen bacteriano; que puede aceptar fácilmente ADN adicional (extraño) y que puede fácilmente ser introducido en una célula hospedera adecuada.

La Shigella de la presente invención comprende preferiblemente el plásmido endógeno de invasión recombinante utilizado como un vector para expresar uno o más genes heterólogos. Asi, según una forma de modalidad preferida, la Shigella es una cepa de "no vector artificial", lo que significa que la cepa no comprende un plásmido artificial, además de cualquier (recombinante) plásmido endógeno.

Un vector de plásmido contiene a menudo ADN codificante y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para la inserción de ADN extraño. La codificación de ADN es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos particular para una proteina o enzima particular. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula, o de otro modo media o controla la expresión del ADN de codificación. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser del mismo o de diferentes organismos. Los vectores de clonación recombinantes a menudo incluyen uno o más sistemas de replicación para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedero, por ejemplo, resistencia a los antibióticos, y uno o más casetes de expresión. El término "sistema de expresión" significa una célula hospedera y vector compatibles en condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresión de una proteína codificada por ADN extraño transportado por el vector e introducido en la célula hospedera.

Por lo tanto, la Shigella atenuada de acuerdo con la invención se utiliza específicamente en el desarrollo de una vacuna viva.

La Shigella atenuada específicamente se deriva de una cepa virulenta de cualquiera de las especies y serogrupos (serotipos) de Shigella. Por ejemplo, cualquiera de los siguientes grupos: El serogrupo A: S. dysenteriae (12 serotipos) El serogrupo B: S. flexneri (15 serotipos y subserotipos) El serogrupo C: S. boydii (18 serotipos) El serogrupo D: S. sonnei (1 serotipo) La cepa virulenta Shigella como se usa aquí con el propósito de atenuación puede ser una cepa virulenta clínicamente conocida o una cepa que se identifica como que contiene factores de virulencia. Específicamente, la cepa se selecciona de cualquiera de S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae y S. boydii, en particular, S. flexneri 2a, tales como S. flexneri 2a 2457T (ATCC 700930, ADN = 700930D-5), o CIP 107659 (Instituto Pasteur, Francia).

La cepa de Shigella virulenta puede ser modificada por métodos conocidos en la téenica, incluyendo el paso múltiple en serie, atenuación sensible a la temperatura, mutación o similares, tales que la cepa resultante se atenúa, específicamente no virulenta, no es capaz de causar enfermedad en un sujeto.

En algunas modalidades, la modificación de la cepa virulenta da como resultado la eliminación y/o inactivación de un gen, incluyendo la reducción o eliminación de la expresión de polinucleótidos o genes que codifican factores de virulencia o conduce a la expresión de factores de virulencia no funcionales.

Hay una serie de téenicas bien conocidas en el arte para obtener mutaciones atenuantes, por ejemplo, para reducir o abolir la expresión polinucleótida. Por ejemplo, una mutación puede introducirse en un sitio predeterminado, tal como la región promotora o dentro de la secuencia de codificación para producir una mutación sin sentido, mediante el uso de la tecnología del ADN recombinante. Las técnicas de ADN recombinante comprenden la clonación del gen de interés, la modificación de la secuencia del gen por utagénesis dirigida al sitio, la digestión con enzimas de restricción seguido por religación y posterior sustitución del gen de tipo salvaje con el gen mutante.

Las técnicas de ADN recombinante estándar adecuadas son conocidas en el arte y se describen ínter alia, en Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". (1989), segunda edición (prensa Coid Spring Harbor Laboratory).

Las mutaciones atenuantes se pueden realizar por los métodos bien conocidos en el arte, incluyendo la clonación de la secuencia de ADN del gen de tipo salvaje en un vector, por ejemplo, un plásmido, insertando opcionalmente un marcador seleccionable en la secuencia de ADN clonado o eliminando una parte de la secuencia de ADN, dando como resultado su inactivación. Una eliminación se puede introducir mediante, por ejemplo, cortando la secuencia de ADN usando enzimas de restricción gue cortan en dos puntos en o justo fuera de la secuencia codificante y enlazando juntos los dos extremos en la secuencia remanente. Alternativamente, un alelo mutante en el que las regiones flangueantes de un gen diana se amplifican por separado y se unen directamente entre si en una reacción de PCR de solapamiento separado, se puede construir con omisión de la secuencia diana intermedia. Un plásmido que lleva la secuencia de ADN mutada puede ser transformado en la bacteria por téenicas conocidas tales como transformación química electroporación o conjugación. Entonces es posible mediante la selección adecuada para identificar un mutante en el que la secuencia de ADN inactivada se ha recombinado en el cromosoma de la bacteria y la secuencia de ADN de tipo salvaje se ha vuelto no funcional por recombinación homologa.

Además, si se utilizó un gen de resistencia a los antibióticos, se elimina generalmente a partir de las bacterias antes de que se utilice en una vacuna. De acuerdo con el método de Datsenko et ai. (Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97 A 6.640-6.645 (2000)) la mutagénesis se basa en el sistema de recombinasa Red de bacteriófago lambda que permite la interrupción especifica de ambos genes plasmídicos codificados y cromosómicos. La estrategia es reemplazar tales genes, por ejemplo, con un gen de resistencia a los antibióticos seleccionable, que se genera por PCR utilizando cebadores con extensiones 40-60 nt de homología con el gen diana. La recombinación basada en Red está mediada en estas secuencias homologas. Después de la selección, el gen de resistencia a los antibióticos también puede ser eliminado utilizando un vector auxiliar que expresa la recombinasa FLP, que utiliza repeticiones directas FRT (diana de reconocimiento de FLP) que flanquean el gen de resistencia a antibiótico.

En algunas modalidades, una mutación puede introducirse en un sitio predeterminado en ADN cromosómico o extracromosómico, por ejemplo, un plásmido, a través de una inserción, una eliminación o una sustitución de un nucleótido por otro, tal como una mutación puntual, que conduce a un gen mutado que ha reducido o ninguna expresión. La mutación debe producir una cepa Shigella que tiene una capacidad reducida para causar disenteria. Preferiblemente, la mutación es una mutación por eliminación, donde la interrupción del gen es causada por la escisión de ácidos nucleicos. La mutación puede, por ejemplo, hacerse mediante la eliminación de un tramo contiguo de pares de bases. Incluso muy pequeñas eliminaciones tales como tramos de 10 pares de bases pueden provocar que el gen codifique ninguna proteina o una proteina no funcional. Incluso la eliminación de un solo par de base puede conducir a ninguna proteina o una proteina no funcional, ya que como resultado de tal mutación, los otros pares de bases ya no están en el marco de lectura correcto o la transcripción ha sido inhibida o disminuida. Más preferiblemente, se elimina un tramo más largo, por ejemplo, 100 pares de bases o al menos la parte significativa de un gen, por ejemplo, al menos 50% del gen. Incluso más preferiblemente, se elimina el gen completo.

Las mutaciones bien definidas y deliberadamente hechas implican la eliminación de fragmentos o todo el gen, o combinaciones de los mismos, tienen la ventaja, en comparación con las mutaciones inducidas de manera clásica, de que no volverán a ser de tipo salvaje. Por lo tanto, en algunas modalidades de la invención, la cepa de la vacuna comprende una cepa de Shigella atenuada viva en el que una mutación en un gen que codifica un factor de virulencia comprende una eliminación o una inserción para interrumpir la secuencia de polinucleótido que codifica el factor de virulencia de manera que no se produce ninguna proteina correspondiente o la proteina no es funcional.

Factores de virulencia ejemplares seleccionados para diseñar una cepa Shigella atenuada son rfb, IPAB, IPAC o aroC.

La atenuación puede, por ejemplo, ser provocada por la eliminación y/o inactivación de uno o más de los siguientes genes, o (una significativa) parte del mismo, o cualquiera de los moduladores del gen que efectúan la atenuación de los genes: rfb, aroA, aroC, aroD, aroE, virG y ipaA-D. Las cepas de Shigella atenuadas preferidas de la invención son mutantes dobles o múltiples cepas mutantes con al menos tres o más mutaciones atenuantes. Las combinaciones preferidas de los genes diana para atenuar mutaciones incluyen al menos un gen rfb (por ejemplo, rfb F, D, C, E, J y/o genes I) y al menos un gen ipa (por ejemplo ipaB, ipaC) .

Como una alternativa a la atenuación de las mutaciones resultantes de la ingeniería genética, también sería posible identificar cepas de Shigella de origen natural que son avirulentas o que comprenden una o más mutaciones preexistentes en un polinucleótido o gen que codifica un factor de virulencia que se puede utilizar como cepas de vacunas vivas. Estas cepas de Shigella que ocurren naturalmente, una vez aisladas por téenicas estándar, pueden ser sometidas a más técnicas de mutagénesis o de ADN recombinante para construir cepas mutantes dobles o múltiples.

Las técnicas para la identificación de bacterias que tienen una o más mutaciones en genes que codifican factores de virulencia son conocidos por un experto en la técnica. En consecuencia, las técnicas de rutina para la detección de cepas de Shigella que han sido mutadas por las técnicas descritas anteriormente incluyen transferencia Northern y Western, PCR, ELISA y ensayos de citotoxicidad como se describe en este documento. Las cepas mutantes sin genes funcionales que codifican factores de virulencia específicos pueden seleccionarse fácilmente empleando técnicas estándar.

Los genes que codifican los factores de virulencia para ser atenuados pueden ser transmitidos por el plásmido. Por lo tanto, en algunas modalidades, la modificación de una cepa virulenta Shigella comprende la mutación de uno o más plásmidos de Shigella endógenos. El término "plásmido", se refiere específicamente a ADN citoplasmático que se replica independientemente del cromosoma bacteriano. Se puede prever la mutación de partes de la virulencia o plásmido de invasión Shigella o incluso la eliminación de un plásmido. Sin embargo, se prefiere que la Shigella atenuada todavía comprenda el plásmido de invasión endógeno, más preferible un plásmido de invasión estable. Esto asegura la estabilidad de la cepa atenuada, en particular con respecto a la posible pérdida del plásmido de invasión de la célula atenuada o la absorción potencial de un plásmido de invasión (nativo) derivado de un tipo salvaje de Shigella, que puede ocurrir con una cepa inestable o plásmido de invasión inestable.

El plásmido de invasión Shigella es endógeno en la mayoría de las cepas de Shigella.

Aunque el plásmido de invasión puede perderse en el cultivo de una cepa de Shigella, puede ser diseñado para obtener uno recombinante que exhibe un alto nivel de estabilidad, lo que hace que sea un objetivo atractivo para el desarrollo como un vector útil para incorporar genes que codifican antígenos heterólogos, en particular antígenos protectores.

El plásmido de invasión recombinante de la presente invención obtenido en los ejemplos descritos en lo sucesivo, tiene las características como se indica en las Figuras 5a-5c y 10a.

El plásmido de la presente invención incluye derivados de los mismos autónomamente replicables en Shigella. Tal derivado puede ser uno correspondiente al plásmido de invasión de cuya porción distinta de la región responsable de la invasión es retirada del mismo, o uno correspondiente al plásmido de invasión del cuya parte se inserta con otra (heteróloga) secuencia de ADN. De esta manera, se puede un vector de transporte autónomamente adecuado replicable en Shigella. Tal vector puede utilizarse en cualquiera de las cepas de vacuna viva de Shigella atenuadas de acuerdo con la invención o en cualquier otra bacteria capaz de incorporar un plásmido de invasión, incluyendo Escherichia enteroinvasiva.

El plásmido de invasión endógeno Shigella está bien caracterizado en el arte, y éste conocimiento informa la selección de sitios para la recombinación en los plásmidos, asi como las condiciones de propagación apropiados, por ejemplo, en la posición entre ntds 103187-103328 entre unos genes IS100 y ipaJ (éstas posiciones se determinan por el plásmido de invasión pCP301 de la cepa Shigella flexneri 2a 301).

El plásmido se emplea preferiblemente como un único plásmido de copia.

El plásmido de la presente invención puede proporcionarse en la forma aislada, por ejemplo, mediante la preparación de una fracción de ADN de citoplasma de las células de Shigella por un método común para la preparación de un plásmido de ADN de las células. Además, la fracción de ADN puede purificarse por el método de centrifugación de densidad-gradiente, electroforesis en gel de agarosa y similares.

Para la construcción de un vector de transporte, puede usarse la secuencia completa o parte de la misma. Cuando se utiliza una parte del mismo, una parte típicamente contiene la región responsable de la replicación del plásmido, pero una región innecesaria para la replicación puede excluirse. Por ejemplo, la región necesaria para la replicación puede determinarse mediante la ligación de una parte obtenida mediante la digestión del plásmido con una enzima de restricción de un plásmido autónomamente replicadle en Shigella, transformando otra bacteria, tal como otra cepa de Shigella o una cepa de Escherichia, con el plásmido recombinante obtenido, y determinar si el plásmido recombinante se alberga en el transformante.

La vacuna de acuerdo con la invención puede formularse usando téenicas conocidas para la formulación de vacunas bacterianas atenuadas. La vacuna se presenta ventajosamente para administración oral, por ejemplo como una solución acuosa o seca en polvo para reconstitución en un regulador de pH adecuado antes de la administración. La reconstitución se efectúa ventajosamente en un regulador de pH a un pH adecuado para asegurar la viabilidad de las bacterias. A fin de proteger las bacterias atenuadas y la vacuna de la acidez gástrica, un agente protector, tal como bicarbonato sódico se administra ventajosamente con cada administración de la vacuna. Alternativamente, la vacuna se presenta en una forma encapsulada liofilizada.

Las cepas de vacuna pueden administrarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como un aerosol o mezclados en los alimentos y/o agua o entregado en una mezcla con un vehículo adecuado, diluyente, adyuvante o excipiente tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las cepas de la vacuna pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, adyuvantes, gelificantes o aditivos que aumentan la viscosidad, conservadores, agentes aromatizantes, colores y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. Los vehículos farmacéuticos para la preparación de composiciones farmacéuticas y medicamentos son bien conocidos en el arte, tal como se establece en los libros, tales como "Remingtons Pharmaceutical Sciences" (1990), 18a edición (ack Publishing Co.).

Las cepas de vacuna de la presente invención pueden administrarse en dosis y mediante téenicas bien conocidas por los expertos en la técnica médica o veterinaria, teniendo en cuenta factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del sujeto receptor, y via de administración. La via de administración puede ser percutánea, a través de administración en la mucosa (por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal) o a través de una via parenteral (intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal). Las cepas de la vacuna pueden administrarse solas o se pueden coadministrar o administrar de manera secuencial con otros tratamientos o terapias. Las formas de administración pueden incluir suspensiones, jarabes o elixires, y preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable) tales como suspensiones o emulsiones estériles.

La vacuna puede utilizarse en la vacunación de un sujeto, particularmente un ser humano, o bien un mamífero de sangre caliente, incluyendo específicamente los cerdos.

Una vez producida la cepa de la vacuna de la presente invención puede administrarse a un sujeto en el curso de una inmunoterapia activa, en concreto por vacunación, para prevenir la enfermedad entérica, específicamente disentería causada por Shigella y opcionalmente heteróloga entérica o patógenos diarreicos. Esto puede lograrse por cualquiera de las vacunas de acuerdo con la invención, que son de protección cruzada y/o polivalente.

Una infección causada por Shigella y opcionalmente otro un microorganismo, tales como microorganismos diarreicos dirigidos por una vacuna de protección cruzada y/o polivalente de la invención, puede, por lo tanto, prevenirse o tratarse mediante la administración de una dosis eficaz de la vacuna de acuerdo con la invención. La dosis empleada puede ser en última instancia a discreción del médico, pero será dependiente de varios factores incluyendo el tamaño y el peso del sujeto y el tipo de vacuna formulada. Sin embargo, una dosificación que comprende la administración oral de 107 a 1011, por ejemplo, 10 -10 , bacterias por dosis puede ser conveniente para un adulto humano de 70 kg hospedero.

Por lo tanto, una infección causada por Shigella y opcionalmente otro un microorganismo, especialmente un patógeno, puede prevenirse o tratarse mediante la administración de una dosis eficaz de una vacuna de acuerdo con la invención. La dosis empleada puede ser en última instancia a discreción del médico, pero será dependiente de varios factores incluyendo el tamaño y el peso del sujeto y el tipo de vacuna formulada. Sin embargo, una dosificación que comprende la administración oral de 107 a 1011, por ejemplo, , bacterias por dosis puede ser conveniente para un adulto humano de 70 kg hospedero.

De acuerdo con ejemplos específicos, se construyeron mutantes atenuados isogénicos de un prototipo de la cepa de S. flexneri 2a. Los mutantes fueron incapaces de sintetizar 0-antígenos {ArfbF) o - lo que representa un enfoque vacuna bien probado - eran auxotróficos ( AaroC ) . La virulencia de estos mutantes en el modelo de pulmón de ratón mostró un nivel comparable de atenuación. Posteriormente, aislamos los derivados de ambos mutantes que carecían del plásmido de invasión que codifica la Ipa-s (rojo Congo negativo /CRN/ mutantes). La pérdida del fenotipo invasivo en estos últimos mutantes aumento la atenuación aún más a un nivel indetectable. Esta serie de mutantes de S. flexneri 2a carecen de cualquier O-antígenos [ArfbF PCR), o proteínas ipa ( AaroC CRN) o ambos ( ArfbF CRN) o ninguno de estos antígenos ( AaroC CRP) se utilizaron para inmunizar ratones a dosis subletales por vía intranasal. Posteriormente, los ratones fueron desafiados por dosis letales de cepas de tipo salvaje S. flexneri heteróloga 6 (Fig. la) o S. sonnei (Fig. Ib). El mutante atenuado que expresa tanto ipa y O-antígenos ( AaroC CRP) no pudo proporcionar una protección por encima del nivel observado en los ratones vacunados de manera simulada. En contraste, el doble mutante que carece de ambos grupos principales inmunogénicos de antigenos suscitó alta protección contra ambas cepas desafio heterólogas. Incluso la pérdida del plásmido de virulencia solo ( AaroC CRN) pareció mejorar la protección cruzada. Para corroborar estos resultados, los grupos de ratones también fueron inmunizados con la Fase I (Ipa y 0-antígeno positivo) y la Fase II (Ipa y 0-antígeno negativo) variantes de una S. sonnei aislada. La fase II de la cepa de la vacuna proporcionó una alta protección contra un desafío por S. flexneri 6, mientras que la inmunización con la fase I plenamente virulenta de la cepa no proporcionó una divergencia de supervivencia de la prevista por solución salina (ig. le).

Para apoyar el concepto de que la mejora de la protección cruzada origina a partir de una mayor inmunogenicidad de los antígenos menores en los antecedentes de éste mutante (es decir, sobre la pérdida de antígenos dominantes - ver Fig. 2), muestras de la reactividad inmunitaria de suero y lavado broncoalveolar (BAL) obtenidas de los ratones inmunizados fueron comparados en ELISA en células bacterianas enteras que expresan ambos o ninguno de los principales grupos antigénicos (Fig.3).

Muestras BAL obtenidas de ratones vacunados con la AaroC CRP (tanto Ipa y O-antígeno positivo) mutante eran más reactogénicas a la diana homologa lisa invasiva verificando que estos antigenos, de hecho, dominaban la respuesta inmunitaria. Por el contrario, la pérdida de los antigenos inmunodominantes en la cepa de la vacuna ( ArfbF CRN) resultaron en una mejora de la reactogenicidad a la cepa homologa diana carente de ambos O-antígenos e ipa.

Además, la cepa de S. sonnei heteróloga fue reconocido más fácilmente por las muestras BAL obtenidas de ratones vacunados por el doble mutante. Estos resultados corroboran que existe un mayor título de anticuerpos de la mucosa contra esos antígenos menores compartidos que son accesibles en estos objetivos. Curiosamente, éste fenómeno no era evidente en el caso de IgG sérica (datos no mostrados), apoyando conclusiones anticipadas que muestran que slgA en lugar de IgG sérica remite protección en éste modelo.

Enfoques actuales de vacunas (en general, así como a Shigella, en particular) se basan en la utilización de los principales antígenos inmunogénicos. Con el fin de evadir la respuesta inmunitaria, sin embargo, la presión evolutiva ha seleccionado múltiples variantes inmunológicamente distintas de estos antígenos, que forman la base de la clasificación de los agentes patógenos en los serotipos. Por lo tanto, la utilización de los principales antigenos que determinan el serotipo, podría conferir una protección parcial frente a un patógeno, a menos que todos los serotipos puedan ser incluidos en la vacuna (por ejemplo, en el caso de las vacunas de poliovirus). La combinación de los serotipos más prevalentes puede dar una relativamente amplia protección, sin embargo, esto podría ser transitorio debido a la sustitución de serotipos (es decir, los serotipos menos comunes surgen al llenar la brecha abierta por la erradicación de los serotipos de la vacuna). Esto requiere la optimización de la vacuna de vez en cuando, por ejemplo mediante la inclusión de los serotipos adicionales en las vacunas multivalentes. Debido a los fenómenos como la competencia antigénica y la interferencia, así como consideraciones financieras, sin embargo, es limitado el número máximo de serotipos para ser cubiertos.

Por otro lado, diversos serotipos de un patógeno bacteriano dado comparten un gran número de antígenos conservados en su superficie. El hecho de que ellos podrían haber permanecido conservados implica que, o bien no son accesibles en la superficie (antígenos no protectores) y/o su función es tan indispensable para la patogénesis que permite ninguna modificación en su estructura antigénica. Esto se ejemplifica por las proteínas Shigella ipa, que son altamente conservadas (debido a su función sofisticada en la invasión) y muy inmunogénicas, todavía no puede provocar una protección cruzada, probablemente debido a que sólo se expresan en contacto a la célula diana, por lo tanto, probablemente no son accesibles para un mecanismo de protección mediada por anticuerpos.

Específicamente mostramos (Fig. 2), que los antígenos inmunodominantes tales como lipa y O-antígenos secuestran la respuesta inmunitaria de una manera que permite menos que anticuerpos se planteen contra antígenos menores. Dado que los Ipa-s no son protectores y los 0-antígenos son muy variables, Shigella puede evadir con eficiencia la respuesta inmunitaria. Sin embargo, mostramos que la eliminación de estas clases de antígenos mejora altamente el potencial de protección cruzada de cepas vacunas vivas.

En cuanto a la mutación del plásmido de invasión, en lugar de la selección para eliminación mutante espontánea del plásmido de invasión basado en la pérdida de positividad rojo Congo, los genes ipaB y C pueden eliminarse, mientras que el resto del plásmido está intacto.

Por otra parte, el plásmido puede estabilizarse mediante la implantación de un gen esencial, tal como ppa, a partir del cromosoma al plásmido de invasión.

Por otra parte, la expresión de (heterólogos) antígenos extraños, como ETEC LTB y toxinas STa (STM) mutadas son factibles. STm contiene preferiblemente una o más mutaciones puntuales. Específicamente, las STm preferidas son: NSSNYCCELCCXXACTGCY (SEC ID 1), en donde, X en la posición 12 es N, K o R, y/o X en la posición 13 es P, G, L o F, en donde la STm excluye la secuencia de tipo salvaje: NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEC ID 2).

Las combinaciones preferidas de mutaciones puntuales son N12K o N12R en combinación con P13F.

Además, los ejemplos muestran que la inmunogenicidad relativa de antígenos conservados compartidos había aumentado en ausencia de los principales antígenos de la cepa de la vacuna. A medida que estas supresiones no sólo mejoran el espectro de protección, si no también hacen que la cepa de la vacuna sea altamente no virulenta, el doble mutante es considerado como muy seguro, incluso en dosis extremadamente altas. Por otra parte, las vacunas orales vivas son relativamente baratas de fabricar, y no requieren personal médico capacitado para la administración, que son factores importantes al considerar la población objetivo en los países endémicos.

La materia objeto de las siguientes definiciones se considera modalidades de la presente invención: 1. Una vacuna viva atenuada de Shigella, que se basa en una cepa Shigella rugosa carente de 0-antígeno LPS, preferiblemente una cepa no invasiva. 2. Vacuna de conformidad con la definición 1, que es atenuada por mutagénesis de uno o más genes implicados en la síntesis de LPS, transporte y expresión, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de genes en el grupo rfb o uno o más genes dentro de grupo de genes rfb/wbb que codifica la síntesis 0-antígeno, waaL que codifica la ligasa de O-antígeno, wzx que codifica la flípasa de 0-antígeno involucrado en el transporte de 0-antígeno, wzy/rfc involucrados en la polimerización del 0-antígeno, los genes dentro del grupo de genes rfa/waa que codifica la síntesis del núcleo LPS, los genes reguladores que afectan la expresión del 0-antígeno, tales como rfaH o pérdida de la(s) función(es) de lo que resulta en al menos 90% de reducción en la expresión de O-antígenos. 3. Vacuna de conformidad con la definición 1 o 2, en la que la mutagénesis es mediante una eliminación de uno o más de los rfb F, D, C, E, J y/o genes I, o una eliminación de una parte del mismo, o genes correspondientes en diversos serotipos de Shigella. 4. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 1 a 3, en las que la cepa de Shigella se selecciona del género Shigella, por ejemplo, de cualquier serotipo o especies Shigella, en particular, S. flexnerí, S. sonneí, S. dysentheriae y S. boydii . 5. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 1 a 4, en donde la Shigella expresa proteínas de membrana externa de reacción cruzada. 6. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 1 a 5, que es de protección cruzada contra diferentes serotipos y especies de Shigella, en particular contra cualquiera de S. flexnerí 2a, S. flexnerí 6 y S. sonneí, o Escheríchía colí enteroinvasiva. 7. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 1 a 6, en donde la Shigella es no invasiva por mutagénesis adicional del plásmido de invasión, en particular, una eliminación de los genes ípaB y/o ipaC y/u otros genes íap. 8. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 1 a 7, en donde la Shigella comprende un plásmido de invasión endógeno recombinante que incorpora al menos un gen que codifica un antígeno heterólogo para secretar el 0-antígeno para expresar el antigeno, por ejemplo, en la superficie celular bacteriana. 9. Vacuna de conformidad con la definición 8, en donde el antigeno se selecciona de entre el grupo que consiste en Un antigeno bacteriano preferiblemente una toxina o factor de colonización, Un antigeno viral, preferiblemente de un patógeno que causa infecciones entéricas o de las mucosas, Un antigeno fúngico, preferiblemente de un patógeno que causa infecciones entéricas o de las mucosas, y - Un antigeno parasitario, preferiblemente de un patógeno que causa infecciones entéricas. 10. Vacuna de conformidad con la definición 9, en la que el antigeno bacteriano se origina a partir de bacterias enteropatógenas, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en: a. Antigenos de E. coli, en particular, una enterotoxina seleccionada de entre el grupo constituido por LTB, LTA mutado y ST de ETEC, subunidades o fusiones de los mismos, antigenos de E. coli enteroagregativa (CEEA) o la toxina similar a Shiga 1 o 2 b. Antigenos de Campylobacter jejuni, c. Antigenos Clostridium difficile, toxinas específicamente A y B d. Antígenos de Vibrio cholera, específicamente el antígeno CT-B, y e. mutantes o proteínas de fusión de a), b) c) o d). 11. Vacuna de conformidad con la definición 10, en la que el ETEC es una enterotoxina de fusión de LTB y mutante ST (STm), en particular una proteína de fusión que comprende un STm con una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID 1. 12. Vacuna de conformidad con la definición 10, en donde el antígeno viral se origina a partir de virus de diarrea, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en rotavirus y calicivirus, tales como el virus de Norwalk. 13. Vacuna de conformidad con la definición 10, en la que el antígeno del parásito es originario de la diarrea que causa protozoos, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste de Giardia lamblia, especies de Cryptosporidium y Entamoeba histolytica . 14. Vacuna de conformidad con la definición 10, en donde el antígeno fúngico se origina a partir de hongos causantes de diarrea, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en Blastomyces dermatiditis y Histoplasma spp. 15. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 1 a 14, en donde la Shigella comprende además una eliminación de un gen cromosómico esencial y una inserción del gen en el plásmido de invasión, en particular, el gen ppa o cualquiera de accD, acpS , dapE, era , frr, ftsl , ftsL, ftsN, EtsZ, IinfA, lgt , lpxC, msbA, murA, murl, nadE , parC, proS, pyrB, rpsB , trmA, rho y rhoL. 16. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 1 a 15, para uso en la inmunoterapia activa de un sujeto para prevenir enfermedades infecciosas, en particular, la enfermedad entérica, tales como diarrea o disenteria. 17. Vacuna de conformidad con la definición 16, en donde la enfermedad entérica es causada por cualquier serotipo o especies de Shigella. 18. Vacuna de conformidad con la definición 16 o 17, en donde la inmunoterapia comprende la administración de la vacuna en una mucosa o formulación oral. 19. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 16 a 18, en donde la vacuna se administra por vía oral o por vía intranasal. 20. Vacuna de conformidad con cualquiera de las definiciones de 16 a 19, en donde - Una vacuna polivalente se utiliza para expresar antigenos protectores de Shigella y al menos un agente patógeno de una especie distinta de Shigella por la incorporación de un antigeno protector del patógeno en el plásmido de invasión endógeno, y en donde La enfermedad infecciosa es causada por cualquier serotipo o especie Shigella y/o el patógeno. 21. Cepa Shigella, que es una cepa de S. flexneri 2a con una eliminación de los genes rfbF, ipaB y/o ipaC o una eliminación de partes esenciales de la misma. 22. Cepa Shigella de conformidad con la definición 21, que comprende un plásmido de invasión recombinante que incorpora al menos un gen que codifica un antigeno heterólogo para expresar el antigeno secretar el antigeno. 23. Cepa Shigella de conformidad con la definición 21 o 22, que comprende además una eliminación de un gen cromosómico esencial y una inserción del gen en el plásmido de invasión. 24. Un vector de plásmido recombinante basado en un plásmido de invasión Shigella mutado que comprende una secuencia nucleótidos que codifica al menos un antigeno heterólogo, en el que el plásmido está mutado en al menos uno de los genes ipaB y/o ipaC. 25. Célula hospedera bacteriana que comprende el vector de conformidad con la definición 24, en la que la célula hospedera se selecciona de entre los géneros Shigella, Escherichia, Salmonella, Campylobacter o Yersinia. 26. Célula hospedera de conformidad con la definición 25, en la que el vector es un plásmido de invasión endógeno.

La descripción anterior se comprenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son, sin embargo, meramente representativos de los métodos de la práctica de una o más modalidades de la presente invención y no deben ser leídos como limitantes del ámbito de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de una cepa de Shigella atenuada MÉTODOS Cepas y condiciones de cultivo bacteriano Las bacterias se cultivaron rutinariamente en caldo o placas de agar Luria Bertani (LB). Para la detección de un plásmido de invasión intacto que expresa las proteínas ipa de soja tríptico de placas de agar (TSA) suplementado con 0.01% de colorante rojo Congo (Sigma-Aldrich). Los cultivos frescos siempre se iniciaron a partir de una colonia rojo Congo positivo (CRP) que garantiza transporte plásmido. Cuando se suplementaron los medios apropiadas con la siguiente concentración de antibióticos: ampicilina 100 mg/ml, kanamicina 100 ug/ml, cloranfenicol 25 pg/ml.

El prototipo secuenciado de Shigella flexneri 2a cepa 2 (cepa 2457T, ATCC 700930) se utilizó como una cepa parental para la mutagénesis. La inactivación de los genes aroC y rfbF se realizó por la téenica de recombinasa Red descrita anteriormente (Levine, MM, et al . Nat. Rev. Microbiol., 5, 540-553 (2007)). La eliminación aroC da como resultado en un mutante auxotrófico incapaz de sintetizar compuestos aromáticos. RfbF está implicado en la síntesis de las subunidades de O-antígeno, la pérdida del cual resulta en un fenotipo LPS rugoso. Los oligonucleótidos utilizados para la generación y la confirmación de las mutaciones se proporcionan como Tabla suplementaria 1 en la Figura 4 (SEC ID 3-10). Los mutantes 2457TAaroC:: kan y 2457TñrübF:: cat fueron posteriormente cultivados en placas de agar rojo Congo (CR) para seleccionar colonias CR-positivo (CRP) y (CRN) CR-negativo. La pérdida de determinantes de virulencia codificados en el plásmido de invasión fue confirmada por PCR. Del mismo modo, las variantes de la fase I y fase II de S. sonnei se han diferenciado en placas CR. La fase I es la denominación tradicional de cepas S. sonnei tipo salvaje que portan plásmido de invasión, mientras que la fase II se refiere a cepas de plásmido perdido. Como la síntesis de O-antígeno también se codifica en el plásmido de virulencia de esta especie, los variantes de fase II son tanto no invasivos y rugosos. El tipo salvaje de Shigella flexneri 6 y cepas de S. sonnei utilizado para los estudios de desafío habían sido aislados a partir de casos clínicos de disentería bacilar. Sus serotipos se determinaron por aglutinación con sueros de tipificación comercial (Mast AssureTM; Mast Group Ltd., Merscyside, Reino Unido).

Experimentos con animales Todos los estudios in vivo se realizaron en el modelo de pulmón de ratón descrito anteriormente (van de Verg et al, Infect Imun. 63: 1947-1954, 1995). Ratones hembras BALB/c de 6 a 8 semanas de edad fueron anestesiadas intraperitonealmente con una mezcla de 5 mg/ml de ketamina (Calipsol, Richter Gedeon, Hungría) y 0.3 mg/ml de xilazina (Primasine, Alfasan).

Las infecciones se realizaron vía intranasal con 50 ml de inoculo (diluido en solución salina) que contiene el CFU requerido de bacterias. Los recuentos bacterianos fueron justificados por chapado de diluciones seriadas de los inóculos. 50 por ciento de las dosis de letalidad (valores de LD50) se calcularon a partir infecciones por 0.5 diluciones en serie de registro (105-108 UFC) de acuerdo con Reed y Muench (Oaks, EV, et al . Infect Immun 53:57-63, 1986). Las vacunaciones se realizaron con dosis subletales de bacterias (106 CFU de los mutantes de CRP y 108 cfu de mutantes CRN de la cepa 2457T; 1055 CFU de la fase I y 1075 CFU de la fase II S. sonnei) dos veces con intervalos de 2 semanas. El grupo de control recibió solución salina. En un estudio piloto se ha demostrado que todas las cepas de vacunas se han despejado dentro de un plazo de 3 días p.i. Dos semanas después de la inmunización de refuerzo los ratones fueron retados con una dosis letal de S. flexneri 6 o bien con la cepa de tipo salvaje S. sonnei .

Posteriormente, la letalidad se controló durante 14 dias. Alternativamente, los ratones inmunizados se sacrificaron dos semanas después de la dosis de refuerzo y se recogieron muestras de sangre y fluidos de lavado broncoalveolar (BAL). Para la recolección de BAL se preparó la tráquea de los ratones sacrificados para la canulación con una aguja roma y se inyectó 200 ml de solución salina y se retiró de los bronquios de cada ratón.

ELISA Las bacterias inoculadas de las placas de CR frescas se cultivaron durante la noche en caldo LB. Placas de 96 pocilios (C.E.B., Francia) se recubrieron durante la noche con 0.1 mi de suspensiones bacterianas lavadas (5x10® UFC/ml) en regulador de pH de carbonato (pH 9.5) a 4°C. El día siguiente, las placas se lavaron con PBS que contenía 0.05% de Tween 20, y luego se bloqueó con PBS que contenía 2% de 3SA (Sigma-Aldrich) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de BAL y de suero se diluyeron en PBS que contenía 0.5% de BSA y se incubaron con las placas recubiertas de antígeno durante 1 hora a 37°C. Las diluciones en serie se llevaron a cabo a través de las placas. Después de tres lavados, las placas se sondearon con IgG anti-ratón (de suero IgG) o anti-IgA de ratón (para muestras de BAL) de inmunoglobulina conjugada con HRPO (Dako A/S, Dinamarca) . El sustrato de ELISA fue o-fenilendiamina (Sigma-Aldrich) disuelto en regulador de pH de ácido cítrico que contiene H2O2. La OD se midió a 492 nm en un lector de placas de ELISA convencional. La inmunorreactividad se expresó en relación a la reactividad de la muestra ñaro CRP BAL a la misma dilución (1:10). Los medios+SEM se calcularon a partir de 4 ensayos independientes.

Análisis estadístico La dosis letal de 50% se calculó con el método estadístico de Reed y Muench 6. El análisis estadístico de las curvas de supervivencia se realizó con la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) utilizando GraphPad Prism versión 5.00 para Windows. Los títulos de IgA de BAL fueron comparados con el análisis no paramétrico de Mann-Whitncy. El valor de p fue considerado significativo si es inferior a 0.05.

RESULTADOS Basado en las curvas de supervivencia de animales inmunizados con las cepas de vacuna Shigella flexneri 2457T (serotipo 2a) atenuadas y desafiados con las cepas de tipo salvaje de Shigella, se observó un efecto protector sinérgico mediante la combinación de la eliminación del gen rfbF con la pérdida del plásmido de invasión en el ajuste del desafio heterólogo. Significativamente se logra mejor protección por inmunización con el negativo rojo Congo (CNR, con la eliminación de plásmido de invasión) la cepa Shigella flexneri 2457T (2a) ArfbF con respecto a la del positivo rojo Congo (CNP, plásmido de invasión intacto) cepa Shigella flexneri 2a ArfbF cuando los animales fueron desafiados con la cepa heteróloga Shigella flexneri 6 (Fig. Ib). En caso de exposición homologa con la cepa Shigella flexneri 544 tipo salvaje (2a), ambas cepas de vacuna fueron igualmente protectoras, lo gue sugiere gue para el desafio homólogo incluso la eliminación del gen rfbF es suficiente (Fig. la). La diferencia en la eficacia de la vacunación es probable que sea parcialmente relacionada con la dosis más alta subletal de desafio permitida con el ArfbF - plásmido de invasión mutante doble, pero no plenamente responsable, ya que la cepa CRN Aaro (control) utilizada en dosis de desafio comparables como el doble mutante, inducida por una protección parcial en los dos experimentos de desafio homólogos y heterólogos (Fig. la, Ib).

Otra prueba para que el efecto beneficioso de las mutaciones que inactivan el gen rfbF y que el plásmido de invasión logre una protección significativa contra el desafio heterólogo se proporciona mediante el uso de cepas de la vacuna de Shigella sonnei . La inmunización con la variante Fase II de Shigella sonnei (plásmido de invasión eliminado responsable de la expresión de tanto el complejo de -invasión y el gen rfbF) proporcionó alto nivel de protección contra el desafio letal con la cepa Shigella flexneri 542 tipo salvaje (serotipo 6), mientras que el variante fase I S. sonnei de tipo salvaje (plásmido de invasión intacto que llevó a cabo la invasión compleja y el gen rfbF) exhibió efecto protector bajo (estadísticamente no significativa) (Fig. le).

Ejemplo 2: Preparación de Shigella flexneri 2a 2457 mutante con constructo de gen sintético en el plásmido de invasión El material de origen para la construcción mutante es la cepa ATCC Shigella flexneri 2a 2457T como se describió anteriormente. La eliminación de los genes rfbF y ipaB y ipaC, asi como el gen ppa se llevó a cabo mediante la téenica de recombinasa Red (Datsenko, KA y Wanner, BL inactivación de un paso de los genes de los cromosomas en Escherichia coli K-12 utilizando los productos de PCR. Proc. Na ti . Acad. Sci . EE. UU. A 97, 6640-6645 (2000)).

Paso 1: el gen rfbF fue retirado del cromosoma.

La falta de RfbF se asocia con un cambio fenotipico: la cepa de Shigella se vuelve "rugosa", un cambio morfológico típico que puede ser detectado por el ojo desnudo en placas de agar. Se observó éste cambio fenotipico, pero la eliminación con éxito del gen rfbF también se confirmó por análisis PCR. Estaba basado en la diferente longitud del producto de PCR obtenido con el ADN genómico de Shigella tipo salvaje o mutado (Fig.8).

Paso 2: Los genes ipaB e ipaC fueron retirados del plásmido de invasión. Estos genes son vecinos y se eliminaron junto con la misma técnica recombinasa Red aplicada a la eliminación de genes rfbF. Esta eliminación de genes también resulta en un fenotipo: la Shigella pierde la capacidad de tomar hasta el colorante rojo Congo y por lo tanto forma una colonia blanca en rojo Congo que contiene placas de agar en contraste con Shigella que porta el plásmido de tipo salvaje que es de color rojo. Ya que Shigella puede perder sus plásmidos espontáneamente durante el cultivo in vitro, la eliminación de los genes ipaB y ipaC se confirmó por análisis PCR de los mutantes, y se basó en fragmentos de PCR más cortos obtenidos con los mutantes, en comparación con el plásmido de tipo salvaje (Fig .9).

Paso 3: Inserción del gen sintético que impulsa la expresión de las toxinas ETEC LT-B y ST, asi como trasplantes de un gen esencial (ppa) del cromosoma en el plásmido de invasión (véase la Figura 10a). La exitosa introducción del gen de fusión LTB-mST fue probado por el sitio de la amplificación por PCR especifico de la región de la manipulación genética (Fig. 10b). La expresión del gen de fusión de toxina de Shigella se puso a prueba por inmunotransferencia (Fig. 10c). La eliminación del gen ppa del cromosoma (esencial para el crecimiento de Shigella) fue probado por PCR basado en una longitud más corta de amplicón de la cepa de la vacuna final.

Todas las manipulaciones genéticas implicaban la inserción de genes de resistencia a antibióticos. Después de cada paso los genes responsables de la resistencia a los antibióticos se eliminaron con plásmidos auxiliares como se describe por Datsenko y Wanner ( Proc. Nati . Acad. Sci . EE. UU. A 97, 6.640-6.645 (2000)).

Ejemplo 3: Estudios de protección animal para probar la cepa mutante del Ejemplo 2 La atenuación de virulencia de las cepas mutantes isogénicas frente a su cepa parental de tipo salvaje se muestran en el modelo de pulmón de ratón de shigelosis. Los grupos de ratones fueron infectados por vía intranasal con diluciones seriadas 10 veces (entre 106 y 108 ufe) de las diferentes cepas bacterianas con el fin de determinar la dosis letal mínima para cada cepa. En el caso de la cepa de tipo salvaje, hubo una letalidad de 30, 50, y 100% que se encuentra en 106, 107, y 108 ufe/dosis de ratón, respectivamente. En contraste, no murieron ratones de cualquiera de los mutantes isogénicos 2457TArfb, 2457TAipaBC, o doble mutante 2457TArfbAipaBC en cualquiera de las dosis probadas. Estos resultados sugieren alta atenuación de la virulencia en todos los mutantes debido a la eliminación de los genes correspondientes.

Posteriormente, se inmunizaron grupos de ratones en el mismo modelo con dosis subletales de cualquier cepa de tipo salvaje 2457T (5><105 efu/ratón) o de sus mutantes de eliminación isogénicos 2457TArfb, 2457TAipaBC, 2457TArfbAipaBC (todos a 108 efu/ratón), o inmunizados de manera simulada con sólo PBS. Tres inmunizaciones idénticas se realizaron con intervalos de 2 semanas. Una semana después los últimos ratones de refuerzo fueron desafiados con una (previamente optimizada) dosis letal (2 c 106 efu/ratón) de una cepa S. sonnei . Como se representa en la Fig. 11, la inmunización con la cepa de tipo salvaje no podría proporcionar protección, mientras que cada uno de los mutantes de un solo lugar (ya sea 2457TArfb o 2457TAipaBC) provocaron una protección parcial, solamente. En contraste, el doble mutante (2457TArfbAipaBC) podría proporcionar una protección completa contra la infección por las especies heterólogas de Shigella.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna Shigella viva atenuada, caracterizada porque se basa en una cepa de Shigella rugosa que carece de 0-antígeno LPS, que es no invasiva por una mutación del plásmido de invasión.

2. Vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es atenuada por mutagénesis de uno o más genes implicados en la síntesis de LPS, de transporte y de expresión, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste de genes en el grupo del operon rfb o uno o más genes dentro del grupo de genes rfb/wbb que codifican la síntesis del 0-antígeno, waaL codifica la ligasa 0-antígeno, wzx codifica flipasa 0-antígeno involucrada en el transporte del 0-antígeno, wzy/rfc involucrados en la polimerización del 0-antígeno, los genes dentro del grupo de genes rfa/waa que codifican la síntesis del núcleo LPS, los genes reguladores que afectan a la expresión del 0-antígeno, tales como rfaH o la pérdida de la(s) función(es) de lo que resulta en al menos 90% de reducción en la expresión de O-antígenos.

3. Vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la cepa de Shigella se selecciona del género Shigella, en particular, S. flexneri , S . sonnei , S. boydii y S. dysentheriae .

4. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque es de protección cruzada contra diferentes serotipos y especies de Shigella, en particular contra cualquiera de S. flexneri 2a , S. flexneri 6 y S. sonnei o Escherichia coli enteroinvasiva.

5. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la mutación del plásmido de invasión comprende una eliminación de los genes ipaB y/o ipaC y/u otros ipa .

6. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la Shigella comprende un plásmido de invasión endógeno recombinante que incorpora al menos un gen que codifica un antigeno heterólogo para secretar el antigeno o para expresar el antigeno en la superficie celular bacteriana.

7. Vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el antígeno se selecciona de entre el grupo que consiste en un antigeno bacteriano preferiblemente una toxina o factor de colonización, un antigeno viral, preferiblemente de un patógeno que causa infecciones entéricas o de las mucosas, un antígeno fúngico, preferiblemente de un patógeno que causa infecciones entéricas o de las mucosas, y - un antigeno parasitario, preferiblemente de un patógeno que causa infecciones entéricas.

8. Vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el antigeno bacteriano es una enterotoxina (ETEC) que comprende la subunidad B de la toxina termolábil (LTB), la toxina estable al calor (ST) o subunidades o fusiones de los mismos, preferiblemente LTB/STm que comprende una STm con una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID 1.

9. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la Shigella comprende además una eliminación de un gen cromosómico esencial y una inserción del gen en el plásmido de invasión.

10. Vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en la profilaxis de un sujeto para · prevenir enfermedades infecciosas, preferiblemente enfermedades entéricas.

11. Vacuna para uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde la vacuna se administra por vía oral o por vía intranasal.

12. Vacuna de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque - se utiliza una vacuna polivalente que expresa antigenos protectores de Shigella y al menos un agente patógeno de una especie distinta de Shigella mediante la incorporación de un antígeno protector del patógeno en el plásmido de invasión endógeno, y en donde la enfermedad infecciosa es causada por cualquier serotipo o especie de Shigella y/o el patógeno.

13. Cepa Shigella, caracterizada porque es una cepa S. flexneri 2a con una eliminación de rfbF y al menos uno de los genes ipaB y/o ipaC o una eliminación de partes esenciales de la misma.

14. Cepa Shigella de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un plásmido de invasión recombinante que incorpora al menos un gen que codifica un antígeno heterólogo para expresar y/o secretar el antígeno.

15. Un vector plásmido recombinante basado en un plásmido de invasión Shigella mutado que comprende una secuencia nucleótida que codifica al menos un antígeno heterólogo, caracterizado porque el plásmido está mutado en al menos uno de los genes ipaB y/o ipaC.