CN104797268B - 一种新型志贺氏菌减毒活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种志贺氏菌减毒活疫苗，其基于缺乏LPS O抗原的粗糙志贺氏菌菌株，通过侵袭质粒的突变，其为非侵袭性的，特别地用于主体的免疫预防以防止感染性疾病，优选肠道疾病，以及一志贺氏菌菌株，其为删除了rfbF，ipaB和/或ipaC基因的福氏志贺菌2a菌株，以及基于突变志贺氏菌侵袭质粒的重组质粒载体，该侵袭质粒包含编码至少一种异源性抗原的核苷酸序列，其中质粒在ipaB和/或ipaC基因的至少之一处突变。

Description

一种新型志贺氏菌减毒活疫苗

本发明涉及一种志贺氏菌减毒活疫苗，其用特定目标突变产生，以引起血清型独立的交叉保护并表达异源(非志贺氏菌)抗原。

背景技术

志贺氏菌是高度获自人类的革兰氏阴性肠杆菌，其引起细菌性痢疾。该疾病只通过直接的个体接触或食物和水的人粪便污染而传播。因此，细菌性痢疾在卫生条件不理想的区域内流行。据估计在世界范围内有165M病例，多达1M的死亡大多数发生在五岁以下的儿童身上。在东南亚和撒哈拉以南非洲地区1-5岁儿童急性腹泻事件中分离的细菌性病原体中，发现志贺氏菌是最普遍的细菌性病原体之一(Kotloff et al.,Bull.W.H.O.77：651-666,1999)。细菌性痢疾在进入地方病国家的旅客和军事人员中也很常见。人们长期以来一直认为，疫苗对于控制痢疾是至关重要的，但是抗志贺氏菌的疫苗开发受到血清型特异性免疫反应的阻碍，即暴露于志贺氏菌(天然的或疫苗介导的)时，免疫保护通常仅限于给定的血清型。志贺氏菌属的四个种类包括总共50个血清型和血清亚型，按照它们的LPS O抗原进行区分。

Hong等人(Molecular Microbiology 24:779-91,1997)描述了染色体和质粒编码的脂多糖基因的突变对福氏志贺菌的侵袭性和血清抗性的影响。rfb和rfaL基因的突变会消除整个O抗原侧链或产生长度大大缩短的链。

Nagy等人(J.Infect.Diseases 198:1699-706,2008)描述了肠道沙门氏菌调节脂多糖突变体的疫苗潜力。转录反终止子RfaH的缺失导致长度不同的LPS链，“轻微粗糙”表型。

调节蛋白RfaH被显示包含在福氏志贺菌(S.flexneri)长链(即高数目的O抗原重复)LPS分子的独立于生长期的上调中(Carter et al.Microbiology.2007Oct；153(Pt10):3499-507)。

除LPS O抗原外，志贺氏菌的主要致病因子都出人意料地保守。这提示，对这些抗原的免疫调节进化压力的缺失证实了O抗原是唯一的保护性抗原的已被接受的观点。但是，存在针对所谓“侵袭质粒抗原”(Ipa-s)的标记抗体反应，特别是在重复的暴露之后。这些编码在大致病质粒上的抗原形成了负责侵袭并随后致病的3型分泌系统(T3SS)的组分。

志贺氏菌致病因子侵袭质粒抗原B(ipaB)的结构-功能分析由Guichon等人公开(J.Bacteriol.183:1269-76,2001)。ipaB突变体被产生以将功能和蛋白亚域联系起来。

Menard等人(J.Bacteriol.17518：5899-5906,1993)描述了福氏志贺菌的ipa基因ipaB、ipaC和ipaD的突变导致志贺氏菌侵袭潜力的丧失。

针对Ipa蛋白(例如对次要保守的抗原)的抗体被视为是非保护性的，因为没有该蛋白，血清型之间的交叉保护会被触发。现有的疫苗方法几乎仅仅依赖O抗原介导的免疫，利用五种或六种血清型提供针对大多数地方性和流行性痢疾病例的高度保护的事实。但是，考虑到大多数建议的多价疫苗基于纯化亚单元(O抗原)或数种具有不同LPS O抗原类型的减毒活细菌的事实，它们(很可能)太复杂并因此昂贵。此外，由于对疫苗血清型产生基于畜群免疫的免疫压力，逃逸以及非疫苗血清型的流行增加，部分血清型覆盖预期引起血清型取代，如其它多血清型病原例如肺炎链球菌所表明的。因此，理想的志贺氏菌疫苗预期提供针对所有循环血清型的大量交叉保护。

除了志贺氏菌外，肠毒素大肠杆菌(ETEC)是旅客腹泻的主要细菌性病原体，并且是地方病国家儿童死亡的主要死因之一。因此，人们采取努力开发同时解决这两种病原体的疫苗。

旅客的腹泻目前通过抗生素治疗；但是，对志贺氏菌菌株的抗性上升，使得该疾病的处理越来越困难。此外，ETEC感染者会遭受与肠易激综合症相关的长期后果。已被广泛接受的是，接种疫苗是解决这种高度未满足的医疗需求的最经济途径；但是，目前没有预防这些状况的疫苗。

ETEC菌株中已鉴别出两种肠毒素，热不稳定性毒素(LT)和热稳定性毒素(ST)，作为与猪疾病相关的ST(STp)或与人疾病相关的ST(STa)。LT在结构上与霍乱毒素高度同源。A亚单元是该毒素的活性组分，其作用以增加腺苷酸环化酶的活性。这由B亚单元传递到宿主细胞内，B亚单元结合到细胞表面上的神经节苷脂。STa是小的(19个氨基酸)非免疫原性多肽，其具有鸟苷酸环化酶激活活性。STm是无毒但仍然具有免疫原性的ST的突变形式。这种STm被认为可安全采用作为疫苗抗原(Taxt et al.Infect.Immun.78:1824-31,2010)。

已证明，ETEC菌株还产生EAST1，一种在大小和作用模式上与ST类似但在序列上不同的热稳定性毒素，最初在肠聚集性大肠杆菌菌株中鉴定出(Nataro and Kaper,ClinMicrobiol Rev.11:142-201,1998；Zhang et al.,Vet Microbiol.123：145-152,2007)。

Zheng等人(World J.Gastroeneterol.11：3411-18,2005)构建了asd突变体志贺氏菌菌株，其共表达肠毒素大肠杆菌的CS3和LTB/STm。通过经口途径免疫小鼠后，出现了针对CS3、LTB、ST和志贺氏菌脂多糖的抗体。

Xu等人(Vaccine 21:664-648，2003)描述了减毒侵袭性活福氏志贺菌血清型2arfbF突变体作为基于DNA的HIV gag疫苗的载体。

Noriega等人(Infection and Immunity 67(2):782-788，1999)描述了针对14种福氏志贺菌血清型的交叉保护策略，包括使用两种血清型2a和3a。描述的减毒菌株是福氏志贺菌2a菌株CVD1207(ΔguaB-AΔset1Δsen)和福氏志贺菌3a菌株CVD 1211(ΔguaB-AΔvirGΔsen)。

Bernardini等人(Infection and Immunity 69(2):1072-1083，2001)描述了福氏志贺菌5的突变体，其为aroC突变体以及双purE aroC突变体。

Levine等人(Behring Institute Mitteilungen 98:120-123,1997)描述了福氏志贺菌2a减毒菌株CVD 1203，以及福氏志贺菌2a候选疫苗CVD 1205，CVD 1203包含染色体基因aroA和质粒基因virG的突变，CVD 1205包含guaB-A的删除突变(使其在核酸合成方面有缺陷)以及virG的删除突变。

本发明的目标是提供改进的志贺氏菌疫苗，特别是用于预防与去地方病国家的旅客以及住在发展中国家的幼童高度相关的腹泻疾病。这些疫苗可基于能够异源性表达获自不同病原体的抗原并引起针对细菌性病原体尤其是志贺氏菌的广泛保护的减毒福氏志贺菌活疫苗菌株。

发明内容

可通过本发明要求保护的主题来实现这个目标。

本发明提供了志贺氏菌减毒活疫苗，其基于缺乏LPS O抗原的粗糙志贺氏菌菌株。

特别是，志贺氏菌菌株通过突变特别是侵袭质粒突变后是非侵袭性的。

特别地，本发明的疫苗通过LPS合成、转运和表达中包含的一个或多个基因的突变而减毒，所述基因优选选自rfb操纵子簇中的基因，所述rfb操纵子例如位于福氏志贺菌2a2457T菌株的Gnd(6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，2089155-2090561)和GalF(UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，2101928-2102821)基因之间的染色体上(Wei et al.Complete genomesequence and comparative genomics of Shigella flexneri serotype 2a strain2457T.Infect Immun.2003May；71(5):2775-86.)或位于致病质粒上(宋内氏志贺菌)。特别优选的是以下的突变：编码O抗原合成的rfb/wbb基因簇内的一个或多个基因，编码O抗原连接酶的waaL，编码O抗原转运中包含的O抗原翻转酶的wzx，O抗原聚合中包含的wzy/rfc，编码LPS核心合成的rfa/waa基因簇内的基因，影响O抗原表达的调节基因，例如rfaH，或缺失导致O抗原表达减少至少90％的功能。

根据一个特定的实施方案，所述突变是删除rfb F、D、C、E、J和/或I中的一个或多个，或删除其一部分，或删除不同志贺氏菌血清型中相应的基因。或者，可采用通过钝化的突变，例如暂时钝化、有条件地钝化或组成性钝化。

所述志贺氏菌菌株优选选自志贺氏菌属，例如选自任何志贺氏菌血清型或种，特别是福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌。

特别地，所述志贺氏菌菌株表达可引起交叉反应性抗体的外膜蛋白，特别是保守蛋白，包括OmpC、OmpA和OmpX，或编码在侵袭质粒上的那些蛋白。

本发明的疫苗对不同血清型和不同种的志贺氏菌，特别是对福氏志贺菌2a、福氏志贺菌6和宋内氏志贺菌或肠侵袭性大肠杆菌的任意之一特别地具有交叉保护性。

根据一个特定的方面，所述志贺氏菌通过侵袭质粒的进一步突变，特别是删除ipaB和/或ipaC和/或其它ipa基因的侵袭质粒的突变，而变成非侵袭性。

特别地，所述志贺氏菌包含重组内源性侵袭质粒，所述质粒包含编码异源性抗原的至少一个基因，以分泌所述抗原或将所述抗原表达在细菌细胞表面。

优选实施方案涉及这种疫苗，其中所述抗原是获自病原体的保护性抗原，所述病原体例如选自：

-细菌性抗原，优选为毒素或定居因子，

-病毒性抗原，优选来自引起肠内或粘膜感染的病原，

-真菌性抗原，优选来自引起肠内或粘膜感染的病原，以及

-寄生性抗原，优选来自引起肠内感染的病原。

特别地，细菌性抗原源自肠致病性细菌，优选选自：

a.大肠杆菌抗原，特别是选自以下的肠毒素：ETEC的LTB、突变的LTA和ST、亚单元，或其融合体，来自肠侵袭性大肠杆菌(EAEC)的抗原，或志贺样毒素1或2

b.空肠弯曲菌抗原，

c.艰难梭菌抗原，特别是毒素A和B

d.霍乱弧菌抗原，特别是CT-B抗原，以及

e.a)、b)、c)或d)的突变体或融合蛋白。

特别地，细菌性抗原是一肠毒素(ETEC)，其包含热不稳定毒素B亚单元(LTB)、热稳定毒素(ST)或亚单元或它们的融合体，优选为包含具有如SEQ ID 1所示氨基酸序列的STm的LTB/STm，其可选地不包括人ST的野生型序列。

特别是，所述ETEC抗原是LT的B单元和突变体ST的融合蛋白，优选一融合蛋白LTB/STm，其氨基酸序列获自图7SEQ ID 11-18(4个构造的LTA-启动子-LTB-ST-LTB终止子核苷酸和LTB-ST氨基酸序列)，例如在位置13和/或12处的ST突变体，例如P13F或P13G，和/或N12R或N12K)。

特别地，病毒性抗原源于腹泻病毒，优选选自轮状病毒和诺瓦克病毒(杯状病毒)。

特别地，寄生性抗原源于引起腹泻的原生动物，优选选自贾第鞭毛虫、隐孢子虫属的种以及溶组织内阿米巴。

特别地，真菌性抗原源于引起腹泻的真菌，优选选自皮炎芽生菌和组织胞浆菌属。

根据本发明的一个具体方面，志贺氏菌疫苗菌株进一步包括必要染色体基因的删除，以及所述基因插入到侵袭质粒，特别是ppa基因，或accD，acpS，dapE，era，frr，ftsI，ftsL，ftsN，ftsZ，infA，lgt，lpxC，msb，murA，murI，nadE，parC，proS，pyrB，rpsB，trmA，rho和rhoL中的任意基因。

然而，根据本发明的一个具体实施方案，该疫苗提供用于主体的预防或免疫预防以防止感染性疾病，特别是肠道疾病，例如腹泻疾病。特别地，所述疾病选自志贺菌病、痢疾和腹泻。

本发明还提供了预防主体中感染性疾病特别是肠道疾病的方法，特别是通过对所述主体分别进行疫苗接种和免疫来预防。

特别地，所述肠道疾病由任意志贺氏菌血清型或种引起。

优选地，所述(免疫)预防包括以粘膜或口服制剂给予疫苗。

特别地，所述疫苗经口或鼻内给予。

一个具体的实施方案涉及根据本发明使用的疫苗，其中

-多价疫苗用来表达志贺氏菌以及至少一种除志贺氏菌以外的种之一的保护性抗原，其是通过将所述病原体的保护性抗原纳入到经内源性修饰的重组侵袭质粒中，以及其中

-所述感染性疾病由任意志贺氏菌血清型或种和/或所述病原体引起。

本发明的另一方面提供了志贺氏菌菌株，其为福氏志贺菌2a菌株，例如福氏志贺菌2a2457T，其删除了rfbF，以及ipaB和/或ipaC基因中至少之一，或删除了其必要部分。

特别地，所述志贺氏菌菌株可进一步包括必要染色体基因的删除和所述基因插入到侵袭质粒中。

优选地，所述志贺氏菌菌株包括一重组侵袭质粒，所述质粒包含编码异源性抗原的至少一个基因以表达和/或分泌所述抗原。

然而，本发明进一步的方面提供了基于突变的志贺氏菌侵袭质粒的重组质粒载体，所述侵袭质粒包含编码至少一个异源性抗原的核苷酸序列，其中所述质粒在ipaB和/或ipaC基因至少之一处突变。这特别地指分别删除和/或钝化非编码或编码区域(例如可操作地连接至一基因的调控序列和一基因)的突变，优选为赋予细菌性宿主细胞非侵袭性的基因删除，特别是删除ipaB和/或ipaC基因，或删除其(必要)部分。

本发明进一步的具体方面涉及包含本发明载体的细菌性宿主细胞，其中所述宿主细胞特别地选自志贺氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌或耶尔森氏菌属。

所述宿主细胞特别地包含内源性侵袭质粒的突变。特别地，本发明的载体是内源性侵袭质粒，即对于宿主细胞是内源性或同源性的质粒。

附图说明

图1.缺乏LPS O抗原合成的福氏志贺菌和宋内氏志贺菌的五种减毒非侵袭性活菌株的交叉保护能力。

用福氏志贺菌2a(a和b)突变体的CRP(10⁶CFU)和CRN(10⁸CFU)变体或者宋内氏志贺菌(c)的I期(10^5.5CFU)和II期(10^7.5CFU)变体通过鼻内免疫8周龄BALB/c小鼠的组两次，中间间隔两周。对照组用盐水模拟接种疫苗。随后，用10⁶CFU的野生型福氏志贺菌6(a和c)或10^6.5CFU的野生型宋内氏志贺菌(b)通过相同途径攻击小鼠。随后检测存活率14天。附图显示了三个(b)或两个(a和c)独立实验的合并数据，每组5只小鼠，并重复实验。用Log-rank(Mantel-Cox)检验对存活率曲线进行统计分析。在存活率显著不同于模拟接种疫苗的小鼠的情况下，p值显示在图上。

图2.所使用的不同突变体的抗原性表型以及它们可能引起的抗体水平的差异的示意图。

图中显示了O抗原、其基因决定簇以及它们触发的抗体。图中显示了Ipa和次要保守的表面抗原。表达Ipa和O抗原两者的突变体(福氏志贺菌ΔaroC CRP和宋内氏志贺菌I期)触发主要针对这些主要抗原的抗体反应。相比之下，疫苗菌株中丧失这些抗原会引起对次要保守抗原的较高反应。ip：侵袭质粒，chr.：染色体，T3SS：三型分泌系统，LPS：脂多糖。

图3.获自用福氏志贺菌2a减毒活菌株接种疫苗的小鼠的广谱反应性粘膜IgA。用光滑ipa阳性菌株(ΔaroC CRP)和双重突变体(ΔrfbF CRN)免疫2次后收集的BAL样品中sIgA的免疫反应性用ELISA在不同目标细菌细胞上确定。反应性表示为相同稀释度下的比率(ΔaroC CRP样品的反应性除以ΔrfbF CRN样品的反应性)以使重复可比较。附图显示了用获自独立疫苗接种的BAL样品进行的四个实验的均值+均值的标准差。数据通过Mann-Whitney非参数检验对双重(ipa和O抗原)阳性目标(ΔaroC CRP；黑色柱)上获得的值进行统计对比。

图4.补充表1：用于产生和确定删除突变体的寡核苷酸。(SEQ ID 3–10)

图5.减毒福氏志贺菌2a 2457T菌株的示意图。

A.福氏志贺菌2a 2457T全测序菌株。O抗原是志贺氏菌的血清型决定簇。志贺氏菌染色体上的rfbF基因编码对LPS的O抗原组分的合成必不可少的因子。所有病原性志贺氏菌菌株中存在的侵袭质粒编码侵袭质粒抗原(IpaA-D)，其为III型分泌系统(T3SS)的重要分子组分。T3SS介导目标细胞-志贺氏菌相互作用的关键过程，并最终导致志贺氏菌因子转移到目标细胞内，使病原体能够侵袭并扩散。Ipa B和IpaC是此系统的关键必要组分。

B.在福氏志贺菌2a T2457rfbF^-ipaB/C^-突变体中引入了两处删除。从染色体中删除rfbF基因消除了O抗原的合成，并得到减毒的“粗糙”菌株，并在接种疫苗时引起血清型独立的免疫。侵袭质粒上ipaB和C基因的删除破坏了T3SS，从而赋予志贺氏菌突变体非侵袭性(以及刚果红阴性)。

C.为了稳定突变志贺氏菌菌株的侵袭质粒，从染色体中删除必要的染色体基因(无机焦磷酸酶，ppa(图7SEQ ID 24))，并作为合成构造体的一部分重新引入到侵袭质粒中。

图6：具有ipa簇、用于ipaB/C删除的引物位置(pKD1,2)和用于监控ipaB/C删除的对照引物(ko1,2)的福氏志贺菌2a 301菌株的侵袭质粒pCP301的示意图。还标明了ipaJ和IS100元件之间的合成基因的插入位点的位置。

图7：序列

LT-B/mST融合蛋白的基因，其编码在氨基酸位置13(从Pro到Phe)处有突变的ST以及eltAB启动子和终止子序列

GP-P13F(核苷酸序列，SEQ ID 11)，

LT-B/mST融合蛋白，ST中在氨基酸位置13处(从Pro到Phe)有突变

GP-P13F(氨基酸序列，SEQ ID 12)，

LT-B/mST融合蛋白的基因，其编码在氨基酸位置13处(从Pro到Gly)有突变的ST以及eltAB启动子和终止子序列

GS-P13G(核苷酸序列，SEQ ID 13)，

LT-B/mST融合蛋白，在ST的氨基酸位置13处(从Pro到Gly)有突变

GS-P13G(氨基酸序列，SEQ ID 14)，

LT-B/mST融合蛋白的基因，其编码在氨基酸位置12处(从Asn到Arg)有突变的ST以及eltAB启动子和终止子序列

GS-N12R(核苷酸序列，SEQ ID 15)，

LT-B/mST融合蛋白，其在ST的氨基酸位置12处(从Asn到Arg)有突变

GS-N12R(氨基酸序列，SEQ ID 16)，

LT-B/mST融合蛋白的基因，其编码在氨基酸位置12处(从Asn到Lys)有突变的ST以及eltAB启动子和终止子序列

GS-N12K(核苷酸序列，SEQ ID 17)，

LT-B/mST融合蛋白，其ST在氨基酸位置12处(从Asn到Lys)有突变

GS-N12K(氨基酸序列，SEQ ID 18)，

用于确认ipa删除突变菌株的正向对照PCR引物

ipa co1(SEQ ID 19)，

用于确认ipa删除突变菌株的反向对照PCR引物ipa co2(SEQ ID 20)，

用以产生ipa删除突变菌株的正向PCR引物

ipa pKD1(SEQ ID 21)，

用以产生ipa删除突变菌株的正向PCR引物

ipa pKD2(SEQ ID 22)，

从侵袭质粒移除的ipaB和ipC基因的核苷酸序列

ipaBC(SEQ ID 23)。

从染色体移植到侵袭质粒的ppa基因的核苷酸序列

志贺氏菌ppa基因(SEQ ID 24)。

用以产生ppa删除突变菌株的正向PCR引物

ppa pKD-F(SEQ ID 25)

用以产生ppa删除突变菌株的反向PCR引物

ppa pKD-R(SEQ ID 26)

用于确认ppa删除突变菌株的正向对照PCR引物

ppa ko1(SEQ ID 27)

用于确认ppa删除突变菌株的反向对照PCR引物

ppa ko2(SEQ ID 28)

在LT-B和mST之间插入的用于灵活折叠的连接肽

GGGGS(SEQ ID 29)

图8：

删除了rfbF基因的染色体区域的PCR扩增。M：DNA大小标记物；WT：野生型福氏志贺菌2a 2457T，带有侧翼区域的rfbF基因，1100bp片段；mt：ΔrfbF突变体，用氯霉素基因取代的基因，1300bP。

图9：

删除了ipaC和ipaB基因的侵袭质粒区域的PCR扩增。M：DNA大小标记物；WT：野生型福氏志贺菌2a 2457T，带有侧翼区域的ipaB和ipaC基因，1600bp片段；mt：ΔipaBC突变侵袭质粒，用卡那霉素基因取代的基因，2570bp。

图10：

A.编码必要基因Ppa，LTB-mST融合蛋白和卡那霉素抗性蛋白的多基因构造体的结构。LTB-mST融合蛋白的表达由LTA启动子驱动，转录用LTB终止子终止。带有解毒ST突变的4个构造体的LTB-ST氨基酸序列(P13F，P13G，N12R，N12K)被标记出(突变的密码子加了下划线)。缩写：CS：克隆位点；H1和H2：侵袭质粒上的同源性区域1和2以帮助同源重组；ppa：无机焦磷酸酶基因；pro：启动子；term：终止子；GGGGS：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID 29LTB和mST之间的五氨基酸连接子；kan：卡那霉素抗性基因。

B.ETEC基因插入到志贺氏菌侵袭质粒中。M：DNA大小标记物；WT：野生型福氏志贺菌2a 2457T，侵袭质粒基因间隔区域，450bp片段；mt：LT-B+STm基因突变侵袭质粒，用卡那霉素基因取代的基因，2800bp，

C.免疫印迹分析以检测LTB。用SDS-PAGE分离重组LT-B，以及大肠杆菌和志贺氏菌培养上清部分(分泌的蛋白)，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗LTB单克隆抗体检测。泳道1：野生型福氏志贺菌(阴性对照)；泳道2：侵袭质粒中带有融合基因的福氏志贺菌；泳道3：用pGET载体转化的DH5α大肠杆菌，其包含如图10A所示的合成构造；泳道4：表达LT的ETEC菌株(阳性对照)。

图11：

由福氏志贺菌2a疫苗菌株引起的异源性保护，所述菌株经rfbF和ipaC/ipaB共同突变的改造。5只小鼠的各组用野生型菌株福氏志贺菌2a 2457T(5×10⁵cfu/小鼠)或其等基因删除突变体2457TΔrfb，2457TΔipaBC，2457TΔrfbΔipaBC(所有均为10⁸cfu/小鼠)的亚致死剂量经鼻进行免疫，或用PBS缓冲液进行模拟免疫。进行三次相同的免疫，间隔是2周。最后一次加强免疫后一周，用致死剂量的宋内氏志贺菌菌株(2×10⁶cfu/小鼠)攻击小鼠。每日监测动物的存活率。

具体实施方式

专用术语在整个说明书中具有以下含义。

此处使用术语“减毒”来描述已经修饰的志贺氏菌的致病菌株，使得其不再能够引起疾病，即，经修饰的菌株是无毒的。此处使用与减毒志贺氏菌相关的术语“活”来描述能够生长和繁殖的志贺氏菌。因此，本发明的活志贺氏菌菌株用在减毒活疫苗中并特别地能够在主体的大肠中定植，但不引起与肠道疾病相关的临床症状(肠道或腹泻病原会引起)。此外，本发明的活菌株特别地能够在接种了疫苗的主体内有限地复制，并能够引起防止志贺氏菌的致病菌株的保护性免疫反应。本发明的减毒细菌可经基因改造以表达天然细菌不会表达的异源性抗原，使得减毒细菌作为异源性抗原的载体。

本发明使用的术语“抗原”应特别指任何抗原决定簇，其有可能被抗体的结合位点识别。特别优选的抗原是已经证实是或能够成为免疫或治疗相关的那些分子或结构，尤其是已经测试临床效力的那些。如此处使用的术语特别包括选自抗原的分子或结构，所述抗原包含免疫可接近和免疫相关表位，特别是在一个或多个种或血清型中找到的保守抗原。免疫可接近表位通常由细胞表面上表达的抗原呈现或包含于其中。此处使用的术语“保护性抗原”应指触发体内免疫反应以引起针对抗原的中和抗体的那些抗原。这提供了在用抗原进行活性免疫时的有效保护。蛋白抗原是优选的抗原，因为它们具有引起细胞和体液免疫反应的固有能力。

术语“异源性”在此处尤其对抗原使用，并理解为对表达所述异源性抗原的细胞来说是外来物的抗原。对于志贺氏菌细胞或菌株，该术语特别地指对于志贺氏菌细胞或菌株来说分别是外来物的抗原。因此，这种异源性或外来抗原不会在野生型细胞或菌株中表达，但重组体包含编码所述抗原的异源性基因。从而，所述重组细胞或菌株会将所述异源性抗原表达在例如细胞表面上。本发明的细胞可经基因改造以表达异源性抗原，例如LT和/或ST或STm的无毒组分或形式。这些细胞引起针对异源性抗原以及天然抗原的免疫反应，并因此改进了通过疫苗提供的保护。

此处使用的关于抗原的术语“交叉反应”应指带有不同病原之间共有的表位的抗原，包含例如相同种的或不同细菌种的不同血清型。交叉反应抗原通常是保守结构。交叉反应表位可源自不同病原表达的相同抗原，或源自具有类似结构的不同抗原。

特异性交叉反应抗原被交叉反应抗体识别，例如抗血清的抗体、分离的抗体或重组的抗体。这些交叉反应抗体可识别不同病原体的交叉反应抗原。特异性交叉反应抗体是中和抗体。

“交叉保护”疫苗或免疫反应应理解为通过至少一种不同的病原体例如不同种或血清型(其与引起反应所使用的不相同)来防止感染的疫苗或免疫反应。交叉保护效力通常可用来自暴露于不同病原体的主体的不同抗血清进行测试。

当交叉反应抗原设计来引起交叉保护免疫时，这可在动物模型中测试，例如用获自一种病原体的交叉反应抗原免疫动物触发免疫反应，以及用不同于用来引起该反应的病原体的至少一种病原体来攻击动物。作为举例，这种针对多于一种志贺氏菌血清型或其它具有交叉保护抗原的肠侵袭细菌例如大肠杆菌的交叉保护免疫特别地指防止不同个体的细菌的种内的不同变体，例如亚种水平的变体。具有共同抗原的血清变型的群称为血清群或血清型。

开发广谱例如多菌株和/或多血清型和/或多种类志贺氏菌疫苗的基础是普遍存在于志贺氏菌血清变型中的交叉反应抗原的鉴定。这尤其包括与人感染相关的分离株。

当多价疫苗设计来引起针对不同病原的交叉保护免疫时，免疫反应通常由数种抗原引起，例如来自不同病原的各种抗原。作为举例，这种多价疫苗可基于来自不同种的至少两种保护抗原，例如获自志贺氏菌和大肠杆菌，但还可以获自其它细菌、病毒、真菌或寄生性抗原。交叉保护的多价疫苗可例如在动物模型中测试，通过用包含获自至少两种不同病原体的不同保护抗原免疫动物触发免疫反应，以及用一种、两种或多种病原体攻击动物。

开发基于特定减毒志贺氏菌细菌(如本发明所使用的)的多种类候选疫苗的基础是鉴定保护性抗原，其或者是交叉反应性的以对付一系列不同的血清型，或者不是交叉反应性的，其在不同病原性的种中普遍存在，是寻求保护所针对的对象。

如此处使用的特别地与疾病或病原体相关的术语“肠内”也称为“肠道内”，应指与肠道有关或影响肠道的疾病状况或病原体，例如痢疾或腹泻疾病。特别地，这种肠内疾病指结肠的感染疾病。特定的症状包括流血、充满粘液的腹泻；腹痛；发烧或损失体液。腹泻疾病是指导致每天三次或多次稀粪或液体粪便，或排便多于该人正常次数的状况。肠道病原体理解为在用所述病原体感染时或用毒素特别是肠毒素使主体中毒时引起主体患肠道疾病。

肠道感染疾病例如痢疾或腹泻有许多起因，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。实例提供如下：诺如病毒是成人病毒性腹泻最常见的起因，但轮状病毒是五岁以下儿童病毒性腹泻最常见的起因。40和41型腺病毒以及星状病毒引起大量的感染。细菌弯曲杆菌是细菌性痢疾或腹泻的常见起因，但沙门氏菌、志贺氏菌以及某些大肠埃希氏菌(大肠杆菌)的菌株引起的感染频繁出现在一些地区。在老年人中，特别是那些用抗生素治疗不相关感染的老年人中，艰难梭菌产生的毒素常引起严重腹泻。寄生虫的实例包括可引起慢性感染的贾第鞭毛虫，以及溶组织内阿米巴。本发明疫苗可解决的示例性肠道疾病是志贺氏菌病和ETEC相关的腹泻。

此处相对于质粒使用的术语“内源性”应指源自特定宿主细胞的质粒。内源性质粒可经基因改造以获得重组内源性质粒，例如通过重组技术以原位改造质粒，即在包含天然内源性质粒的宿主细胞内，或从宿主细胞移除质粒时，使其接受实验室操作，然后重新引入相同类型的宿主细胞中。志贺氏菌的侵袭表型特别地由内源性220-kb致病质粒所赋予，该质粒也称为侵袭质粒，或天然或内源性侵袭质粒。志贺氏菌的内源性侵袭质粒特别地根据本发明提供用于重组目的，作为分离的侵袭质粒或用于原位重组。

此处相对于基因使用的术语“必要”理解为指活的生物生存(例如细菌细胞复制)所需的基因。必要基因的突变，例如删除和/或钝化，会引起致死表型或非复制细胞。志贺氏菌的必要基因可经突变以删除志贺氏菌染色体的基因，并进一步将基因纳入到侵袭质粒中以稳定侵袭质粒。这提供了带有稳定重组内源性侵袭质粒的志贺氏菌的培养。志贺氏菌的必要基因有ppa，accD，acpS，dapE，era，frr，ftsI，ftsL，ftsN，ftsZ，infA，lgt，lpxC，msbA，murA，murI，nadE，parC，proS，pyrB，rpsB，trmA，rho和rhoL基因。

此处，基因的“钝化”总是理解为指基因的暂时、诱导或组成性下调，以减少或抑制基因产物的表达。这可特别地通过基因或可操作地连接到该基因的调节序列例如调节基因表达的启动子、增强子等的突变来完成。钝化突变中，特别地存在那些导致多核苷酸或基因例如编码致病因子的基因的表达减少或抑制的突变，或导致各非功能性蛋白例如非功能性致病因子表达的突变。

此处相对于基因使用的术语“侵袭”或“非侵袭”按照以下方式理解。侵袭病原细菌能够侵袭真核细胞。例如，侵袭后，志贺氏菌可在细胞内繁衍并扩散到邻近的上皮细胞，导致组织破坏和志贺氏菌病的病理特征。在调节志贺氏菌侵袭力的基因中，存在例如编码侵袭质粒抗原的ipa基因。至少一个这些基因的删除和/或钝化会导致非侵袭志贺氏菌。

Sereny试验是确定生物体例如志贺氏菌或大肠杆菌的侵袭力的标准试验(Woodet al.J.Clin.Microbiol.24：498-500,1986)。这是通过将细菌悬液接种到豚鼠眼中完成的。严重的粘液脓性和严重的角膜炎表明阳性试验。

关于核酸以及特别地关于载体、质粒特别是志贺氏菌的侵袭质粒的此处使用的术语“分离的”或“分离”应指从天然相关的环境中充分分离出来的这种化合物，以使其以“基本纯”的形式存在。此处使用的术语“基本纯”或“纯化”应指包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物例如核酸分子或质粒的制备物。纯度通过适合于该化合物的方法(例如层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等等)进行测量。

“分离的”不必指排除人工或合成混合物，所述混合物具有其它化合物或材料，或存在不干扰基本活性以及例如由于不完全纯化而存在的杂质。特别地，本发明分离的核酸分子也指包括那些化学合成的。

提到本发明分离的侵袭质粒时，这个术语指从所起源的细胞质中分离的质粒。“分离的质粒”可进一步表示通过生物或合成方法直接产生的质粒以及从其产生过程中存在的其它组分中分离的质粒。

此处相对于基因使用的术语“突变”应指基因序列的突变，特别是至少一个核苷酸的任何删除、取代、插入，或其任何组合，以获得突变基因。这应特别指整个基因或其大部分，例如删除至少50％的基因。术语“突变(mutagenesis)”和“突变(mutation)”在此处互换使用。

与革兰氏阴性细菌例如志贺氏菌相关的术语“粗糙”指不光滑，并应特别地包括“轻微粗糙”(即O-ag合成下调)或“深度粗糙”细菌。此处使用的术语“粗糙”可包括特征例如不规则菌落形态并可包括例如波浪形和/或叶状形态。该术语特别地指不能和/或基本不能产生O多糖的菌株。LPS中包含的重复多糖聚合物被称为细菌的O抗原、O多糖或O(侧)链。O抗原连接到核心寡糖，并包含LPS分子的最外层域。O链存不存在决定LPS被视为粗糙还是光滑。O抗原结构已改变的细菌性菌株在琼脂平板上生长时，它们的外观从光滑变为呆滞。全长O链使LPS光滑，而O链缺乏或缩短使LPS粗糙。“光滑”细菌包含完整的核心和O抗原。“粗糙”细菌包含LPS O抗原的缺乏，意味着没有O抗原或O抗原的链长度缩短或光滑LPS链的数目减少。术语“轻微粗糙”指粗糙细菌的亚群，其具有链长度减少的O抗原或数量减少的光滑LPS链。“深度粗糙”细菌失去部分LPS核心，因此也缺乏O抗原。

此处使用的关于粗糙志贺氏菌的术语“缺乏LPS O抗原”应特别地指如标准试验确定的，少于50％，或少于40％，或少于30％，或少于20％，或少于10％，或基本无或无LPS O抗原。

可使用标准试验来确定菌株的粗糙特征。

例如，LPS突变体的表型可例如通过LPS的SDS-PAGE分离以及银染或使用血清型特异的免疫血清的凝集试验来确定。

粗糙志贺氏菌可通过减毒产生，例如，通过至少一个基因或其大部分的突变，例如通过删除和/或钝化，所述基因包含在LPS合成、转运和/或表达中，优选选自rfb操纵子簇中的基因，或编码O抗原合成的rfb/wbb基因簇内的一个或多个基因，编码O抗原连接酶的waaL、编码包含在O抗原转运中的O抗原翻转酶的wzx、包含在O抗原合成中的wzy/rfc，编码LPS核心合成的rfa/waa基因簇内的基因，影响O抗原表达的调节基因，例如rfaH，或丧失导致O抗原表达减少至少90％的功能。

LPS糖合成中包含的具体基因实例是rfbA，B，D和C。

LPS糖转移酶中包含的具体基因实例是rfbF和G。

LPS O抗原聚合酶中包含的具体基因实例是rfc/wzy。

rfb操纵子簇位于染色体上或位于侵袭质粒上(宋内氏志贺菌)。此簇中的具体基因是rfb F，D，C，E，J和/或I基因。

如此处所使用，术语“重组”指天然不存在于宿主细胞内的分子或构造。在一些实施方案中，重组核酸分子包含两个或多个天然存在的序列，其以非天然存在的方式连接在一起。重组蛋白指由重组核酸编码和/或表达的蛋白。在一些实施方案中，“重组细胞”表达在天然(即，非重组)形式的细胞内找不到相同形式的基因，和/或表达一般会异常过表达、低表达和/或根本不表达(由于有意的人为干预)的天然基因。重组细胞包含至少一个重组多核苷酸或多肽。“重组”、“重组中”和产生“重组的”核酸通常包括组装至少两个核酸片段。在某些实施方案中，重组蛋白和重组核酸仍然是功能性的，即，在宿主细胞中保留它们的活性或显示增强的活性。在任何情况下，减毒细菌例如本发明的减毒志贺氏菌被视为重组细胞。核酸构造例如质粒或载体、核酸(例如多核苷酸)、多肽或宿主细胞此处被称为“重组”，当其不是天然存在，是人工的或经改造时。志贺氏菌的重组侵袭质粒特别地经改造以包含一个、两个或多个多核苷酸或基因的特定删除和/或钝化，例如至少一个编码侵袭质粒抗原的基因的删除，和/或进一步包含一个或多个异源性基因，例如编码保护性抗原的基因。

志贺氏菌的“稳定”重组侵袭质粒是这样一种志贺氏菌质粒，其在经选择以维持细胞培养物中的质粒的条件下在志贺氏菌细胞培养物中显示至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或大于90％的保留。志贺氏菌的稳定重组侵袭质粒的一个特定实例是经突变删除和/或钝化位于染色体基因座的必要基因，并在侵袭质粒基因座处整合的重组志贺氏菌宿主细胞。无侵袭质粒的志贺氏菌不会生长或不会复制，而包含内源性侵袭质粒的志贺氏菌能够在体内生长和复制。

如此处所使用，术语“载体”指一工具，DNA或RNA序列例如外来(异源性)基因可借以引入宿主细胞，以改变细胞并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)。质粒是本发明优选的载体，特别是志贺氏菌的侵袭质粒，特别地包括内源性侵袭质粒。

载体通常包含可遗传媒介的DNA，外来DNA可插入其中。将一个DNA片段插入到另一DNA片段中的一种常用方法包括使用称为限制酶的酶，限制酶在称为限制性位点的特定位点(特定的核苷酸群)裂解DNA。“盒”指编码序列的DNA或编码可插入限定的限制位点的表达产物的DNA片段。盒的限制性位点设计的目的在于确保基因盒插入到适当的阅读框中。一般来说，外来DNA在载体DNA的一个或多个限制性位点处插入，然后由载体携带随可遗传载体DNA进入宿主细胞。具有插入的或增加的DNA的DNA片段或序列，如表达载体，也被称为“DNA构造体”。载体的一种常见类型是“质粒”，其通常是双链DNA的自包含分子，一般是细菌来源的；能容易地接受额外的(外来)DNA，并能容易地引入到合适的宿主细胞中。

本发明的志贺氏菌优选包含用作载体的重组内源性侵袭质粒以表达一个或多个异源性基因。因此，根据一个优选的实施方案，该志贺氏菌是“无人工载体”菌株，意思是，除了任何(重组)内源性质粒以外，该菌株不包含人工质粒。

质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合用于插入外来DNA的限制性位点。编码DNA是编码特定蛋白或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调节或者介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以是来自相同的基因或不同基因，可以是来自相同或不同的生物。重组克隆载体通常包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统、一个或多个在宿主中用于筛选的标记物，如抗生素抗性，以及一个或多个基因盒。术语“表达系统”指的是处于合适条件下的宿主细胞和相容的载体，例如用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外来DNA编码的蛋白。

因此，本发明的减毒志贺氏菌特别地用于活疫苗的开发中。

减毒志贺氏菌特别地获自任何志贺氏菌种和血清群(血清型)的致病菌株。例如，任何以下群：

·血清群A：痢疾志贺菌(12种血清型)

·血清群B：福氏志贺菌(15种血清型和血清亚型)

·血清群C：鲍氏志贺菌(18种血清型)

·血清群D：宋内氏志贺菌(1种血清型)

此处出于减毒目的使用的致病志贺氏菌菌株可以是临床已知的致病菌株或鉴定为包含致病因子的菌株。特别是，该菌株选自任何的：福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌，特别是福氏志贺菌2a，例如福氏志贺菌2a 2457T(ATCC 700930,DNA＝700930D-5)，或CIP 107659(Institute Pasteur,France)。

致病志贺氏菌菌株通过本领域已知的方法进行修饰，包括多次连续传代、温度敏感减毒、突变等等，使得所得菌株减毒，特别是无毒，不能引起主体患病。

在一些实施方案中，对致病菌株的修饰导致基因的删除和/或钝化，包括减少或抑制编码致病因子的多核苷酸或基因的表达，或导致非功能性致病因子的表达。

本领域有许多已知的技术来获得减毒突变，例如用于减少或消除多核苷酸表达。例如，利用重组DNA技术，突变可引入到预定位点，例如启动子区域或编码序列内以产生无义突变。重组DNA技术包括克隆目标基因，通过定点突变修饰基因序列，限制酶消化，然后重新连接，随后用突变基因取代野生型基因。

合适的标准重组DNA技术在本领域是已知的，并特别描述于Sambrook et al.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(1989),2nd Edition(Cold Spring HarborLaboratory press)。

减毒突变可采用本领域熟知的方法进行，包括将野生型基因的DNA序列克隆到载体例如质粒内，可选地将选择性标记插入克隆的DNA序列内或删除部分DNA序列，导致其钝化。删除的引入可通过例如用限制酶切割DNA序列，所述限制酶在编码序列内或只在其外侧的两个点处切割，然后将余下序列的两个末端连接在一起。或者，可构建突变等位基因，其中目标基因的侧翼区域单独扩增并在单独的重叠PCR反应中直接连接在一起，而没有其间的目标序列。携带突变的DNA序列的质粒可通过已知技术例如电穿孔化学转化或连接转移到细菌内。然后可通过合适的选择来鉴定突变体，其中通过同源重组，钝化的DNA序列重组到细菌的染色体内，野生型DNA序列被赋予非功能性。

此外，如果使用抗生素抗性基因，在它们用于疫苗之前通常将其从细菌中移除。根据Datsenko等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97,6640-6645(2000))的方法，突变是基于λ噬菌体Red重组系统，该系统能够特异性地破坏质粒编码和染色体编码的基因。该策略是例如用选择性抗生素抗性基因取代这些基因，所述选择性抗生素抗性基因通过PCR使用与目标基因有40-60nt同源延伸的引物产生。这些同源序列介导基于Red的重组。选择后，抗生素抗性基因还可使用表达FLP重组酶的辅助载体来消除，FLP重组酶使用接在抗生素抗性基因两侧的FRT直接重复(FLP识别目标)。

在一些实施方案中，经由插入、删除，或用另一核苷酸取代一个核苷酸例如点突变，突变可引入染色体或染色体外DNA例如质粒的预定位点，其导致表达减少或无表达的突变基因。该突变应产生引起痢疾的能力减弱的志贺氏菌菌株。优选地，突变是删除突变，其中基因的破坏由核酸的剪切引起。这种突变可例如通过删除相邻跨度的碱基对来实现。甚至非常小的删除例如10个碱基对的延伸可引起基因不编码蛋白或编码非功能性蛋白。甚至一个单碱基对的删除可导致无蛋白或非功能性蛋白，因为这种突变的结果是，其它碱基对不再在正确的阅读框中，或者转录被抑制或消除。更优选地，较长的延伸被移除例如100个碱基对或至少基因的大部分，例如基因的至少50％。甚至更优选地，删除整个基因。

与经典诱导的突变相比，明确定义并有意制造的突变(包括片段或整个基因的删除，或它们的组合)具有的优势在于它们不会恢复到野生型。因此，在本发明的一些实施方案中，疫苗菌株包含志贺氏菌减毒活菌株，其中编码致病因子的基因的突变包括删除或插入以破坏编码致病因子的多核苷酸序列，使得无相应的蛋白产生，或蛋白是非功能性的。

选择来改造减毒志贺氏菌菌株的示例性致病因子是rfb，ipaB，ipaC或aroC。

减毒可例如通过删除和/或钝化一个或多个以下基因，或其(大)部分，或任何导致所述基因削弱的所述基因的调节子而带来：rfb，aroA，aroC，aroD，aroE，virG和ipaA-D。本发明优选的减毒志贺氏菌菌株是具有至少三个或更多个减毒突变的双重或多重突变菌株。用于减毒突变的优选的目标基因的重组包括至少一个rfb基因(例如rfb F，D，C，E，J和/或I基因)和至少一个ipa基因(例如ipaB，ipaC)。

作为由基因改造所得到的减毒突变的替代，还可以鉴定志贺氏菌的天然存在的菌株，该菌株是无毒的或在编码致病因子的多核苷酸或基因中包含一个或多个预先存在的突变，其可用作活疫苗菌株。这些天然存在的志贺氏菌菌株，一旦通过标准技术分离出来，可经历进一步的突变或重组DNA技术以构建双重或多重突变菌株。

本领域技术人员已知用于鉴定细菌的技术，所述细菌在编码致病因子的基因中具有一个或多个突变。因此，用于检测通过上面描述的技术突变的志贺氏菌菌株的常规技术包括此处以外的地方描述的Northern和Western印迹法、PCR、ELISA和细胞毒性试验。无编码特定致病因子的功能性基因的突变菌株可采用标准技术容易地选择出。

编码待削弱的致病因子的基因可以是质粒携带的。因此，在一些实施方案中，对致病志贺氏菌菌株的修饰包括突变一个或多个内源性志贺氏菌质粒。术语“质粒”特别地指独立于细菌染色体复制的细胞质DNA。可设计部分志贺氏菌致病或侵袭质粒的突变，甚至是消除质粒的突变。但是，优选减毒志贺氏菌仍然包含内源性侵袭质粒，更优选稳定侵袭质粒。这确保减毒菌株的稳定性，特别是考虑到减毒细胞引起侵袭质粒的潜在丧失，或潜在摄取获自野生型志贺氏菌的(天然)侵袭质粒，不稳定菌株或不稳定侵袭质粒可发生这些情况。

志贺氏菌侵袭质粒在大多数志贺氏菌菌株中是内源性的。尽管侵袭质粒在培养志贺氏菌菌株时可能会丧失，但是其可经改造以获得表现出高度稳定性的重组质粒，使其成为开发有用载体以包含编码抗原特别是保护性抗原的异源性基因的有吸引力的目标。

下文描述的实例中获得的本发明的重组侵袭质粒具有图5和10A表明的特征。

本发明的质粒包括其在志贺氏菌中可自主复制的衍生物。这种衍生物可以是相应于侵袭质粒的一部分的衍生物，该部分而非负责侵袭的区域被从中移除，或者可以是相应于侵袭质粒的一部分的衍生物，该部分被另一(异源性)DNA序列插入。从而可获得在志贺氏菌种可自主复制的合适的穿梭载体。这种载体可用在任何本发明志贺氏菌减毒活疫苗菌株中，或用在能够包含侵袭质粒的任何其它细菌包括肠侵袭性大肠杆菌中。

内源性志贺氏菌侵袭质粒在本领域得到充分表征，这种知识给出了用于在这些质粒中重组的位点的选择以及合适的繁殖条件的信息，例如IS100和ipaJ基因之间ntds103187-103328之间的位置(这些位置被确定用于福氏志贺菌2a 301菌株的pCP301侵袭质粒)。

质粒优选采用作为单拷贝质粒。

本发明的质粒可以以分离的形式提供，例如通过使用从细胞制备质粒DNA的常见方法从志贺氏菌细胞制备细胞质的DNA片段。此外，DNA片段可通过密度梯度离心法、琼脂糖凝胶电泳等纯化。

对于穿梭载体的构建，可使用整个序列或其一部分。当使用其一部分时，这部分通常包含负责质粒复制的区域，但可排除复制非必需的区域。例如，复制所需的区域的确定可通过将限制酶消化质粒所得的部分连接到可在志贺氏菌中自主复制的质粒，用获得的重组质粒转化另一细菌，例如另一志贺氏菌菌株或大肠杆菌菌株，并确定转化体是否包含该重组质粒。

本发明的疫苗可使用已知的配制减毒细菌疫苗的技术来配制。疫苗有利地呈现用于口服，例如作为水溶液或用于在给予前在合适的缓冲液中重构的干粉。有利地在合适pH的缓冲液中重构，以确保细菌的活力。为了保护减毒细菌或疫苗不受胃酸性破坏，每次给予疫苗时有利地给予保护剂例如碳酸氢钠。或者，疫苗以冻干封装形式呈现。

疫苗菌株可在药学上可接受的工具中给予，例如作为喷雾或混在食品和/或水中或以与合适的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等的混合物递送。根据所需的给予和制备途径，疫苗菌株可包含辅助的物质例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等。用于制备药物组合物和药品的药物载体在本领域是熟知的，如教科书中所给出的例如“Remington's Pharmaceutical Sciences”(1990),18th Edition(Mack Publishing Co.)。

本发明的疫苗菌株可以多剂量并通过医学或兽医领域的技术人员熟知的技术，考虑如年龄、性别、重量、种类和接受主体的状况以及给予途径的因素进行给予。给予途径可以是经皮途径，经由粘膜给予(例如，经口、鼻、肛门、阴道)或经由胃肠外途径(皮内，肌内，皮下，静脉内，或腹膜内)。疫苗菌株可单独给予，或可与其它治疗或疗法共给予或依次给予。给予的形式可包括悬液、糖浆或酏剂，以及用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内给予(例如可注射给予)的制备物例如无菌悬液或乳液。

疫苗可用于主体接种疫苗，特别是人类或温血哺乳动物，特别地包括猪。

一旦产生，本发明的疫苗菌株可在主动免疫疗法过程中给予主体，特别是通过疫苗接种，以防止肠道疾病，特别是由志贺氏菌以及可选地异源性肠道或腹泻病原体引起的痢疾。这可通过本发明交叉保护性和/或多价的任何疫苗达到。

由志贺氏菌以及可选地其它微生物例如本发明交叉保护性和/或多价疫苗靶向的腹泻微生物引起的感染可因此通过给予有效量的本发明疫苗得到预防或治疗。采用的剂量最终由医师酌情决定，但依赖于不同的因素包括主体的大小和重量以及配制的疫苗的类型。但是，口服包含10⁷-10¹¹例如10⁸-10¹⁰细菌每剂对70kg成年人类宿主是方便的。

由志贺氏菌以及可选地其它微生物特别是病原体引起的感染可因此通过给予有效剂量的本发明疫苗得到预防或治疗。采用的剂量最终由医师酌情决定，但依赖于不同的因素包括主体的大小和重量以及配制的疫苗的类型。但是，口服包含10⁷-10¹¹例如10⁸-10¹⁰细菌每剂对70kg成人人类宿主是方便的。

根据特定的实例，构建了原型福氏志贺菌2a菌株的等基因减毒突变体。突变体或者不能合成O抗原(ΔrfbF)，或者-代表充分证明的疫苗方法-是营养缺陷的(ΔaroC)。这些突变体在小鼠肺模型中的致病性显示相当水平的减毒。随后，我们分离出缺乏编码Ipa-s的侵袭质粒的两种突变体的衍生物(刚果红阴性/CRN/突变体)。这些后者的突变体丧失侵袭表型将减毒进一步增加至不可检测水平。缺少O抗原(ΔrfbF CRP)或ipa蛋白(ΔaroC CRN)或两者(ΔrfbF CRN)或无这些抗原(ΔaroC CRP)的这种福氏志贺菌2a突变体系列用来以亚致死剂量经鼻内免疫小鼠。随后，用致死剂量的异源性福氏志贺菌6(图1a)或宋内氏志贺菌(图1b)野生型菌株攻击小鼠。表达ipa和O抗原(ΔaroC CRP)的减毒突变体不能提供对模拟接种疫苗小鼠的观察到的水平的保护。相反，缺乏两种主要免疫原性抗原群的双重突变体引起针对异源性攻击菌株的高保护。甚至仅仅丧失致病质粒(ΔaroC CRN)似乎都会改善交叉保护。为了确证这些结果，各组小鼠还用宋内氏志贺菌分离物的I期(Ipa和O抗原阳性)和II期(Ipa和O抗原阴性)变体进行免疫。II期疫苗菌株提供对福氏志贺菌6攻击的保护，而用完全致病的I期菌株免疫提供与盐水比较无显著性差异的存活率。

为了支持在此突变背景下(即丧失主要的抗原-见图2)改进的交叉保护源自次要抗原增强的免疫性的理念，将获自接受免疫的小鼠的血清和支气管肺泡灌洗(BAL)样品的免疫反应性在ELISA中在表达主要抗原性群的两者或不表达其的整个细菌细胞上进行对比(图3)。

获自用ΔaroC CRP(ipa和O抗原均为阳性)突变体进行疫苗接种的小鼠的BAL对侵袭性光滑同源性目标更具反应原性，证实这些抗原确实主导免疫反应。相反，疫苗菌株(ΔrfbF CRN)上丧失免疫主导抗原导致对缺乏O抗原和Ipa抗原两者的同源性目标菌株的反应原性增加。

此外，异源性宋内氏志贺菌菌株更容易被获自用双重突变体进行疫苗接种的小鼠的BAL识别。这些结果证实，针对这些目标上可接近的那些共有次要抗原的粘膜抗体具有较高滴度。有趣的是，这种现象在血清IgG的情况下并不明显(数据未显示)，支持了早期的发现，早期的发现显示，sIgA而非血清IgG在此模型中介导保护。

目前的疫苗方法(一般来说也指特别是志贺氏菌)依靠主要免疫原性抗原的利用。但是，为了回避免疫反应，进化压力已选择这些抗原的多种免疫学上不同的变体，这形成了按照血清型将病原体分类的基础。因此，利用确定血清型的主要抗原仅可赋予针对病原体的部分保护，除非所有血清型可包括在疫苗内(例如在脊髓灰质炎病毒疫苗的情况下)。最流行血清型的组合可给予较广泛的保护，但是，由于血清型替换(即较不常见的血清型出现，填充疫苗血清型的消除打开的缺口)，这可能是短暂的。这使得有必要时不时地优化疫苗，例如通过将额外的血清型包含到多价疫苗中。然而，由于例如抗原竞争和干扰的现象以及经济考虑，待覆盖血清型的最大数量受到限制。

另一方面，既定细菌病原体的不同血清型在其表面共有大量的保守抗原。它们仍然保持保守的事实暗示，它们在表面上不可接近(非保护性抗原)和/或它们的功能对于发病如此不可或缺，其抗原性结构不允许修饰。这由志贺氏菌ipa蛋白例证，该蛋白高度保守(由于它们在侵袭方面的复杂功能)并具有相当的免疫原性，其仍不能引起交叉保护，很有可能是因为它们仅在接触目标细胞时表达，因此很有可能不能用于抗体介导的保护性机制。

特别是，我们表明(图2)，免疫主导抗原例如Iipa和O抗原以允许较少抗体升高来对抗次要抗原的方式劫持免疫反应。鉴于Ipa-s是非保护性的以及O抗原高度可变，志贺氏菌可有效回避免疫反应。但是，我们表明，这些类别抗原的删除高度改进了活疫苗菌株的交叉保护潜力。

至于侵袭质粒突变，除了基于刚果红阳性丧失选择侵袭质粒的自发删除突变体，还可移除ipaB和C基因，同时质粒其余部分保持完整。

此外，可通过从染色体移植必要基因例如ppa到侵袭质粒来稳定质粒。

此外，外来(异源性)抗原例如ETEC LTB和突变的STa(STm)毒素的表达是可行的。STm优选包含一个或多个点突变。特别优选的STm是

NSSNYCCELCCXXACTGCY(SEQ ID 1)，

其中

位置12处的X是N、K或R，和/或

位置13处的X是P、G、L或F，

其中STm不包括野生型序列：

NSSNYCCELCCNPACTGCY(SEQ ID 2)。

优选的点突变组合是N12K或N12R与P13F的组合。

此外，实例显示，共有保守抗原的相对免疫原性在疫苗菌株缺少主要抗原时升高。由于这些删除不仅改进了保护范围，还赋予疫苗菌株高度无毒性，因此双重突变体被视为非常安全，甚至在极高剂量时也是。此外，口服活疫苗的制造较便宜，并且不需要受过训练的医务人员来给予，这在考虑流行国家目标群体时是重要的因素。

以下定义的主题被认为是本发明的实施方案：

1.志贺氏菌减毒活疫苗，其基于缺乏LPS O抗原的粗糙志贺氏菌，优选非侵袭性菌株。

2.根据定义1所述的疫苗，其通过以下突变减毒：LPS合成、转运和表达中包含的一个或多个基因，优选选自rfb簇中的基因或编码O抗原合成的rfb/wbb基因簇内的一个或多个基因，编码O抗原连接酶的waaL，编码O抗原转运中包含的O抗原翻转酶的wzx，O抗原聚合中包含的wzy/rfc，编码LPS核心合成的rfa/waa基因簇内的基因，影响O抗原表达的调节基因，例如rfaH，或缺失导致O抗原表达减少至少90％的功能。

3.根据定义1或2所述的疫苗，其中所述突变通过删除rfb F、D、C、E、J和/或I基因中的一个或多个，或删除其一部分，或删除不同志贺氏菌血清型中相应的基因。

4.根据定义1-3任一项的疫苗，其中所述志贺氏菌菌株选自志贺氏菌属，例如选自任何志贺氏菌血清型或种，特别是福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌。

5.根据定义1至4任一项的疫苗，其中所述志贺氏菌表达交叉反应性外膜蛋白。

6.根据定义1-5任一项的疫苗，其对不同血清型和不同种的志贺氏菌，特别是对福氏志贺菌2a、福氏志贺菌6和宋内氏志贺菌或肠侵袭性大肠杆菌任意之一具有交叉保护性。

7.根据定义1-6任一项的疫苗，其中所述志贺氏菌通过进一步突变侵袭质粒特别是删除ipaB和/或ipaC基因和/或其它ipa基因变成无侵袭性。

8.根据定义1-7任一项的疫苗，其中所述志贺氏菌包含重组内源性侵袭质粒，所述质粒包含编码异源性抗原的至少一个基因，以分泌所述抗原或将所述抗原表达在例如细菌性细胞表面。

9.根据定义8的疫苗，其中所述抗原选自：

-细菌性抗原，优选为毒素或定居因子，

-病毒性抗原，优选来自引起肠道或粘膜感染的病原，

-真菌性抗原，优选来自引起肠道或粘膜感染的病原，以及

-寄生性抗原，优选来自引起肠道感染的病原。

10.根据定义9的疫苗，其中所述细菌性抗原源自肠致病性细菌，优选选自：

a.大肠杆菌抗原，特别是选自以下的肠毒素：ETEC的LTB、突变的LTA和ST、亚单元，或其融合体，来自肠侵袭性大肠杆菌(EAEC)的抗原，或志贺样毒素1或2

b.空肠弯曲菌抗原，

c.艰难梭菌抗原，特别是毒素A和B

d.霍乱弧菌抗原，特别是CT-B抗原，以及

e.a)、b)、c)或d)的突变体或融合蛋白。

11.根据定义10的疫苗，其中所述ETEC是LTB和突变ST(STm)的融合肠毒素，特别是包含具有如SEQ ID 1所示的氨基酸序列的STm的融合蛋白。

12.根据定义10的疫苗，其中所述病毒性抗原源自腹泻病毒，优选选自轮状病毒和杯状病毒，如诺瓦克病毒。

13.根据定义10的疫苗，其中寄生性抗原源于引起腹泻的原生动物，优选选自贾第鞭毛虫、隐孢子虫属的种以及溶组织内阿米巴。

14.根据定义10的疫苗，其中真菌性抗原源自引起腹泻的真菌，优选选自皮炎芽生菌和组织胞浆菌属。

15.根据定义1-14任一项的疫苗，其中所述志贺氏菌进一步包括删除必要染色体基因，以及将所述基因插入到侵袭质粒，特别是ppa基因，或accD，acpS，dapE，era，frr，ftsI，ftsL，ftsN，ftsZ，infA，lgt，lpxC，msbA，murA，murI，nadE，parC，proS，pyrB，rpsB，trmA，rho和rhoL中的任意一个。

16.根据定义1-15任一项的疫苗，用于主体的主动免疫疗法以防止感染疾病，特别是肠道疾病例如腹泻或痢疾疾病。

17.根据定义16使用的疫苗，其中所述肠道疾病由任何志贺氏菌血清型或种引起。

18.根据定义16或17使用的疫苗，其中免疫疗法包括以粘膜或口服制剂给予疫苗。

19.根据定义16-18任一项使用的疫苗，其中所述疫苗经口或鼻内给予。

20.根据定义16-19任一项使用的疫苗，其中

-多价疫苗用来表达志贺氏菌以及除志贺氏菌以外的种的至少一种病原体的保护性抗原，其通过将所述病原的保护性抗原纳入到经内源性侵袭质粒中，以及其中

-所述感染性疾病由任意志贺氏菌血清型或种和/或所述病原体引起。

21.志贺氏菌菌株，其为删除了rfbF，ipaB和/或ipaC基因，或删除了其必要部分的福氏志贺菌2a菌株。

22.根据定义21的志贺氏菌菌株，其包括一重组侵袭质粒，所述质粒包含至少一个编码异源性抗原的基因以表达所述抗原或分泌所述抗原。

23.根据定义21或22的志贺氏菌菌株，其进一步包括删除必要染色体基因和插入所述基因到侵袭质粒中。

24.基于突变的志贺氏菌侵袭质粒的重组质粒载体，所述质粒包含编码至少一个异源性抗原的核苷酸序列，其中所述质粒在至少一个ipaB和/或ipaC基因处突变。

25.包含定义24的载体的细菌性宿主细胞，其中所述宿主细胞选自志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌或耶尔森氏菌属。

26.根据定义25的宿主细胞，其中所述载体是内源性侵袭质粒。

通过参考下述实例能够更充分地理解上述说明。但是，这些的实例仅仅是代表本发明的一个或多个实施方法，而不应理解为限制本发明的范围。

实例

实例1：志贺氏菌菌株的制备

方法

细菌菌株和培养条件

细菌常规生长在Luria Bertani(LB)肉汤中或琼脂平板上。为了检测表达ipa蛋白的完整侵袭质粒，使用补充有0.01％刚果红染料(Sigma-Aldrich)的胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)平板。新鲜的培养物总是从确保携带质粒的刚果红阳性(CRP)菌落开始。在适当的地方，用以下浓度的抗生素补充培养基：氨苄青霉素100μg/ml，卡那霉素100ug/ml，氯霉素25μg/ml。

使用经测序的原型福氏志贺氏菌2a菌株2(菌株2457T，ATCC 700930)作为肠胃外菌株用于突变。aroC和rfbF基因的钝化通过之前描述的Red重组酶技术进行(Levine,M.M.,et al.Nat.Rev.Microbiol.5,540-553(2007))。aroC的删除导致不能合成芳香族化合物的营养缺陷型突变体。RfbF包含在O抗原亚单元的合成中，其丧失会导致粗糙LPS表型。用于产生和确认突变体的寡核苷酸作为图4中的补充表1提供(SEQ ID 3-10)。随后将突变体2457TΔaroC::kan和2457TΔrfbF::cat培养在刚果红(CR)琼脂平板上以选择CR阳性(CRP)和CR阴性(CRN)菌落。在侵袭质粒上编码的致病决定簇的丧失通过PCR来确认。类似地，宋内氏志贺菌的I期和II期变体在CR平板上进行区分。I期是包含侵袭质粒的野生型宋内氏菌株的传统设计，而II期是指质粒缺失菌株。由于O抗原合成也编码在此种类的致病质粒上，因此，II期变体既是非侵袭性的，也是粗糙的。用于攻击研究的野生型福氏志贺菌6和宋内氏志贺菌菌株已从细菌性痢疾的临床病例中分离出来。它们的血清型通过使用商业分型血清的玻片凝集法确定。

动物实验

所有体内研究在之前描述的小鼠肺模型中进行(van de Verg et al.,InfectImmun63:1947-1954,1995)。6-8周龄雌性BALB/c小鼠用5mg/ml氯胺酮(Calipsol,RichterGedeon,Hungary)和0.3mg/ml甲苯噻嗪(Primasine,Alfasan)的混合物腹腔麻醉。

通过用50μl包含所需CFU的细菌的接种物(稀释于盐水中)经鼻内进行感染。通过用接种物的系列稀释涂布平板，证实细菌计数是合理的。根据Reed和Muench(Oaks,EV,etal.Infect.Immun.53:57-63,1986)用0.5log-系列稀释(10⁵-10⁸CFU)进行的感染计算50％致死剂量(LD50值)。用亚致死剂量的细菌(来自菌株2457T的10⁶CFU的CRP突变体和10⁸cfu的CRN突变体；10^5.5CFU的I期和10^7.5CFU的II期宋内氏志贺菌)进行疫苗接种两次，间隔是2周，完成疫苗接种。对照组接受盐水。在初步研究中，已表明所有疫苗菌株在注射后3天内清除。增强免疫后两周，用致死剂量的福氏志贺菌6或宋内氏志贺菌野生型菌株攻击小鼠。

随后，监测致死性14天。或者，经免疫的小鼠在增强后两周处死并收集支气管肺泡灌洗(BAL)液和血样。对于BAL的收集，制备安乐死小鼠的气管，用钝针插管并注射200μl盐水，从每只小鼠的支气管抽出。

ELISA

接种自新鲜CR平板的细菌在LB肉汤中生长过夜。96孔板(C.E.B.,France)用0.1ml处于碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中的洗过的细菌悬液(5x10⁸CFU/ml)在4℃下包覆过夜。第二天，用包含0.05％吐温20的PBS清洗平板，然后用包含2％BSA(Sigma-Aldrich)的PBS在室温下封闭1h。BAL和血清样品稀释在包含0.5％BSA的PBS中，用抗原包被的平板在37℃下温育1h。在平板上进行系列稀释。清洗三次后，用与HRPO(Dako A/S,Denmark)连接的抗小鼠IgG(用于血清IgG)或抗小鼠IgA(用于BAL样品)免疫球蛋白检测平板。ELISA底物是溶解在包含H₂O₂的柠檬酸缓冲液中的邻苯二胺(Sigma-Aldrich)。在常规ELISA平板读数仪上在492nm处测量OD。免疫反应性表示为在相同稀释度(1:10)下Δaro CRP BAL样品的反应性。从4次独立试验计算均值+SEM。

统计学分析

50％致死剂量用Reed and Muench 6的统计学方法计算。存活率曲线的统计学分析使用用于Windows的GraphPad Prism version 5.00，用LogRank(Mantel-Cox)检验进行。BAL的IgA滴度用Mann-Whitney无参数分析进行比较。p值如果低于0.05，则视为显著。

结果

基于用减毒福氏志贺菌2457T(血清型2a)疫苗菌株免疫并用野生型志贺氏菌菌株攻击的动物的存活率曲线，通过结合rfbF基因删除和异源性攻击设定中侵袭质粒的丧失，观察到协同保护效果。当用异源性福氏志贺菌6菌株攻击动物时，用刚果红阴性(CNR，消除侵袭质粒)福氏志贺菌2457T(2a)ΔrfbF菌株进行免疫相对于用刚果红阳性(CNP，完整的侵袭质粒)福氏志贺菌2aΔrfbF菌株进行免疫获得显著较好的保护(图1b)。在用野生型福氏志贺菌544菌株(2a)进行同源性攻击的情况下，两种疫苗菌株具有同等保护性，提示对于同源攻击，即使删除rfbF基因都是足够的(图1a)。疫苗接种功效的差异很可能与较高可允许亚致死攻击剂量的ΔrfbF-侵袭质粒双重突变体部分相关，但不完全相关，因为以与双重突变体相当攻击剂量使用的CRNΔaro(对照)菌株在同源性和异源性攻击实验中均引起部分保护(图1a,b)。

钝化rfbF基因以及侵袭质粒突变获得针对异源性攻击的显著保护的有益效果的进一步证据由使用宋内氏志贺菌疫苗菌株提供。用宋内氏志贺菌II期变体(删除了负责表达侵袭复合体和rfbF基因两者的表达的侵袭质粒)免疫提供了针对野生型福氏志贺菌542菌株(血清型6)的致死性攻击的高水平保护，而野生型宋内氏志贺菌I期变体(携带侵袭复合体和rfbF基因的完整侵袭质粒)显示低(统计学上不显著)保护效果(图1c)。

实例2：侵袭质粒上具有合成基因构造的福氏志贺菌2a 2457突变体的制备

突变体构造的源材料是如上描述的ATCC菌株福氏志贺菌2a 2457T。rfbF和ipaB和ipaC基因以及ppa基因的删除使用Red重组酶技术进行(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97,6640-6645(2000))。

步骤1：将rfbF基因从染色体中移除。RfbF的缺失与表型改变相关：志贺氏菌菌株变成“粗糙”的，一种可通过肉眼在琼脂平板上检测到的典型形态改变。这种表型改变被观察到，但rfbF基因的成功移除还通过PCR分析进行了证实。这是基于野生型或突变的志贺氏菌的基因组DNA获得的PCR产物的长度不同(图8)。

步骤2：从侵袭质粒移除ipaB和ipaC基因。这些基因是相邻的，并用相同的应用于rfbF基因删除的Red重组酶技术一起删除。这种基因删除还导致一表型：志贺氏菌丧失摄取染料刚果红的能力并因此在包含刚果红的琼脂平板上形成白色菌落，与携带野生型质粒的志贺氏菌形成的红色形成对比。由于志贺氏菌在体外培养过程中可自发丧失其质粒，因此ipaB和ipaC基因的删除通过PCR分析突变体来证实，以及其基于与野生型质粒相比，突变体获得的PCR片段较短(图9)。

步骤3：驱动ETEC毒素LT-B和ST表达的合成基因的插入，以及从染色体移植必要基因(ppa)到侵袭质粒中(参见图10A)。LTB-mST融合基因的成功引入通过基因操作区域的位点特异性PCR扩增来证明(图10B)。来自志贺氏菌的毒素融合基因的表达通过免疫印迹法测试(图10C)。ppa基因(对志贺氏菌的生长是必要的)从染色体的移除通过PCR基于来自最终疫苗菌株的扩增产物长度较短来证明。

所有基因操作均包括抗生素抗性基因的插入。在每个步骤之后，负责抗生素抗性的基因用如Datsenko and Wanner所描述的辅助质粒来移除(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97,6640-6645(2000))。

实例3：测试实例2的突变菌株的动物保护研究

等基因突变菌株对它们的亲本野生型菌株的减毒性显示在志贺氏菌病的小鼠肺模型中。各组小鼠用不同细菌菌株的10倍系列稀释(10⁶至10⁸cfu之间)通过鼻内感染以确定每种菌株的最小致死剂量。在野生型菌株的情况下，在10⁶，10⁷和10⁸cfu/小鼠剂量下分别发现30，50和100％的致死性。相反，等基因突变体2457TΔrfb，2457TΔipaBC或双重突变体2457TΔrfbΔipaBC的任一个在任何测试剂量下均没有小鼠死亡。这些结果提示，在删除相应基因时所有突变体均高度减毒。

随后，各组小鼠在相同的模型中用亚致死剂量的野生型菌株2457T(5×10⁵cfu/小鼠)或其等基因删除突变体2457TΔrfb，2457TΔipaBC，2457TΔrfbΔipaBC(所有均为10⁸cfu/小鼠)免疫，或仅用PBS模拟免疫。进行三次相同的免疫，间隔是2周。最后一次增强后一周，用(之前优化的)宋内氏志贺菌菌株的致死剂量(2×10⁶cfu/小鼠)攻击。如图11所描绘的，用野生型菌株进行免疫不能提供保护，而每个单基因座突变(2457TΔrfb或2457TΔipaBC)仅引起部分保护。相反，双重突变体(2457TΔrfbΔipaBC)可提供针对异源性志贺氏菌种感染的完全保护。

Claims (13)

1.志贺氏菌减毒活疫苗，其对不同血清型和不同种的志贺氏菌具有交叉保护性，所述志贺氏菌包括通过删除rfbF基因，及删除侵袭质粒上ipaB和ipaC基因成为粗糙的和非侵袭性的志贺氏菌菌株，其中所述侵袭质粒是重组内源性侵袭质粒，所述质粒包含至少一个编码异源性抗原的基因，以分泌所述抗原或表达所述抗原。

2.根据权利要求1的疫苗，其中所述志贺氏菌菌株选自志贺氏菌属。

3.根据权利要求2的疫苗，其中所述志贺氏菌菌株选自福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌。

4.根据权利要求1-3任一项的疫苗，其对福氏志贺菌2a、福氏志贺菌6和宋内氏志贺菌或肠侵袭性大肠杆菌任意之一具有交叉保护性。

5.根据权利要求1的疫苗，其中所述抗原选自：

-细菌性抗原，

-病毒性抗原，

-真菌性抗原，以及

-寄生性抗原。

6.根据权利要求5的疫苗，其中所述细菌性抗原为毒素或定居因子；所述病毒性抗原来自引起肠道或粘膜感染的病原体；所述真菌性抗原来自引起肠道或粘膜感染的病原体；所述寄生性抗原来自引起肠道感染的病原体。

7.根据权利要求5的疫苗，其中所述细菌性抗原是一肠毒素(ETEC)，其包含热不稳定毒素B亚单元(LTB)、热稳定毒素(ST)或亚单元或它们的融合体。

8.根据权利要求7的疫苗，其中所述细菌性抗原包含具有如SEQ ID 1所示氨基酸序列的STm的LTB/STm。

9.根据权利要求1的疫苗，其中所述志贺氏菌进一步包括必要染色体基因的删除和所述基因插入到侵袭质粒中。

10.根据权利要求1-9任一项的疫苗在药物制备中的应用，所述药物用于主体的预防以防止感染性疾病。

11.根据权利要求10所述的应用，所述药物用于主体的预防以防止肠道疾病。

12.根据权利要求10所述的应用，其中所述疫苗经口或鼻内给予。

13.根据权利要求10-12任一项所述的应用，其中

-多价疫苗用来表达志贺氏菌以及除志贺氏菌以外的种的至少一种病原体的保护性抗原，其通过将所述病原体的保护性抗原纳入到内源性侵袭质粒中，以及其中

-所述感染性疾病由任意志贺氏菌血清型或种和/或所述病原体引起。