KR20190110645A - 신규의 약독화된 시겔라 생백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히 감염성 질병, 바람직하게는 장 질병을 예방하기 위해 환자에서 예방학적으로 사용하기 위한, 침입 플라스미드의 돌연변이를 통해 비-침입성인, LPS O-항원이 결여된 거친 시겔라 균주를 기본으로 하는 약독화된 시겔라 생백신, 및 rfb F, ipa B 및/또는 ipa C 유전자가 결실된 시겔라 플렉스네리 2a 균주인 시겔라 균주뿐만 아니라 적어도 하나의 이종 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 돌연변이된 시겔라 침입 플라스미드(상기 플라스미드는 상기 ipa B 및/또는 ipa C 유전자 중 적어도 하나에서 돌연변이됨)를 기본으로 하는 재조합 플라스미드 벡터를 개시한다.

Description

신규의 약독화된 시겔라 생백신{A NOVEL LIVE ATTENUATED SHIGELLA VACCINE}

본 발명은 혈청형 독립적인 교차-보호를 유도하고 이종(비-시겔라) 항원을 발현하도록 특이적인 표적 돌연변이에 의해 생성시킨 약독화된 시겔라 생백신 균주에 관한 것이다.

시겔라에(Shigellae)는 세균성 이질을 유발하는 고도로 인간-입양된 그람-음성 장내세균이다. 상기 질병은 오직 직접적인 개인적 접촉 또는 식음료의 인분 오염에 의해서만 확산된다. 결과적으로, 세균성 이질은 수준낮은 위생 상태를 갖는 지역의 풍토병이다. 세계적으로 165M 건의 사례가 존재하는 것으로 추산되며, 사망자수가 1M 정도로 많고 이중 대부분은 5세 이하의 아동이며, 시겔라는 동남아 및 사하라사막 이남 아프리카의 1 내지 5세 아동의 급성 설사 에피소드의 사례에서 단리된 가장 만연된 세균성 병원균 중 하나인 것으로 밝혀졌다(Kotloff et al., Bull. W.H.O. 77: 651-666, 1999). 세균성 이질은 또한 풍토성 국가를 왕래하는 여행자 및 군인들 사이에 통상적이다. 백신이 이질을 억제하는데 중요한 것으로 오랫동안 인정되어 왔으나, 시겔라에에 대한 백신 개발은 혈청형-특이적인 면역 반응에 의해 방해를 받고 있다, 즉 시겔라에 노출시(자연적으로 또는 백신-매개된), 면역 보호는 대개 주어진 혈청형으로 한정된다. 상기 시겔라 속의 4 개의 종은 합해서 50 개의 혈청형 및 하위혈청형(이들은 이들의 LPS O-항원에 의해 분화됨)을 포함한다.

홍(Hong) 등(Molecular Microbiology 24:779-91, 1997)은 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)의 침입 및 혈청 내성에 대한 염색체 및 플라스미드-암호화된 리포폴리사카라이드의 돌연변이의 효과를 개시하였다. rfb 및 rfaL 유전자의 돌연변이는 전체 O-항원 측쇄를 제거하였거나 또는 크게 감소된 길이의 쇄를 생성시켰다.

네이지(Nagy) 등(J. Infect. Diseases 198: 1699-706, 2008)은 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 조절성 리포폴리사카라이드 돌연변이체의 백신 잠재력을 개시하였다. 전사 항종결자 RfaH의 상실은 이종 길이의 LPS 쇄, "약하게 거친" 표현형을 생성시켰다.

조절성 단백질 RfaH는 시겔라 플렉스네리의 장쇄(즉 높은 수의 O-항원 반복) LPS 분자의 증식기 의존적인 상향조절과 관련있는 것으로 나타났다(Carter et al. Microbiology. 2007 Oct; 153 (Pt 10):3499-507).

놀랍게도, LPS O-항원 이외의 시겔라에의 주요 독성 인자들은 보존된다. 이는 상기 항원들에 대한 면역-매개된 진화 압력의 결여를 암시하며 O-항원이 유일한 보호 항원이라는 것에 대한 용인된 견해를 입증한다. 그럼에도 불구하고, 특히 반복된 노출에 따른, 소위 "침입 플라스미드 항원"(Ipa)에 대한 현저한 항체 반응이 존재한다. 큰 독성 플라스미드상에 암호화된 이들 항원은 침입 및 따라서 독성에 필수불가결한 3형 분비 시스템(T3SS)의 성분을 형성한다.

상기 시겔라 독성 인자 침입 플라스미드 항원 B(ipaB)의 구조-작용 분석이 구이천(Guichon) 등(J. Bacteriol. 183:1269-76, 2001)에 의해 개시되었다. ipaB 돌연변이체가 단백질 서브도메인과의 작용을 서로 관련짓기 위해 생성되었다.

메나드(Menard) 등(J. Bacteriol. 17518: 5899-5906, 1993)은 시겔라 플렉스네리의 ipa 유전자 ipaB, ipaC 및 ipaD의 돌연변이유발이 시겔라의 침입 잠재력을 상실시킴을 개시하였다.

Ipa 단백질에 대한(예를 들어 보존된 부 항원에 대한) 항체는 비-보호성인 것으로 생각되는데, 그렇지 않으면 혈청형들간에 교차-보호가 촉발될 수 있기 때문이다. 현행의 백신 접근법들은 5 또는 6 개의 혈청형이 풍토성 및 유행성 이질 사례의 대부분에 대해 높은 보호를 제공할 수 있다는 점을 들어, 거의 독점적으로 O-항원 매개된 면역성에 의존한다. 그럼에도 불구하고, 상기 제안된 다가 백신들의 대부분이 정제된 서브유닛(O-항원) 또는 상이한 LPS O-항원 유형을 갖는 다수의 약독화된 생세균을 기본으로 한다는 사실을 고려할 때, 이들 백신은 십중팔구 너무 복잡하고 따라서 값이 비쌀 것이다. 더욱이, 부분적인 혈청형 커버리지는 백신 혈청형에 대한 면역성을 기본으로 하는 면역 압력의 집중 및 다른 다중-혈청성 병원체, 예를 들어 스트렙토코커스 뉴모니아아에(Streptococcus pneumoniae)에 대해 입증된 바와 같이, 비-백신 혈청형 우세의 이탈 및 증가로 인해 혈청형 교체를 유도하는 것으로 예상된다. 따라서, 이상적인 시겔라 백신은 모든 순환하는 혈청형에 대해 실질적인 교차-보호를 제공할 것으로 예상된다.

시겔라 외에, 장관독소생산성 대장균(ETEC)이 여행자 설사의 주요 원인인 세균성 병원균이며 풍토성 국가에서 아동의 주된 사망원인 중 하나를 나타낸다. 따라서, 상기 두 병원균을 동시에 다루는 백신을 개발하고자 하는 노력이 수행되고 있다.

여행자 설사는 현재 항생제에 의해 치료되고 있으나; 시겔라 균주에 대한 내성 비율이 증가하고 있어 상기 질병의 관리를 점점 더 어렵게 만든다. 더욱이, ETEC 감염은 과민성대장증후군과 관련된 장기적인 영향을 가질 수 있다. 백신접종이 이러한 고도로 충족되지 못한 의료 요구를 다루기에 가장 유효한 방법인 것으로 널리 인정되고 있으나; 현재 상기 병의 예방에 이용가능한 백신이 아직 없다.

2 가지 유형의 장내독소, 즉 이열성 독소(LT) 및 내열성 독소(ST)(돼지 질병과 관련된 ST(STp) 또는 인간 질병과 관련된 ST(STa)로서)가 ETEC 균주에서 동정되었다. LT는 콜레라 독소에 대해 구조상 고도로 상동성이다. A 서브유닛이 상기 독소의 활성 성분으로, 아데닐레이트 사이클라제의 활성을 증가시키는 작용을 한다. 이는 숙주 세포 표면상의 강글리오사이드에 결합하는 B 서브유닛에 의해 상기 숙주 세포내로 전달된다. STa는 구아닐레이트 사이클라제 자극 활성을 갖는 작은(19 아미노산) 비-면역원성 폴리펩티드이다. STm은, 무독성이지만 여전히 면역원성인 돌연변이된 형태의 ST이다. 상기와 같은 STm은 백신 항원으로서 안전하게 사용되는 것으로 생각된다(Taxt et al. Infect. Immun. 78:1824-31, 2010).

ETEC 균주는 또한 EAST1을 생산하며, 상기 EAST1은 ST와 크기 및 작용 방식이 유사하지만 서열이 상이한 내열성 독소이며, 장응집성 대장균 균주에서 최초로 동정되었다(Nataro and Kaper, Clin Microbiol Rev. 11: 142-201, 1998; Zhang et al., Vet Microbiol. 123: 145-152, 2007).

쳉(Zheng) 등(World J. Gastroeneterol. 11: 3411-18, 2005)은 장관독소생산성 대장균의 CS3 및 LTB/STm을 동시-발현하는 asd 돌연변이 시겔라 균주를 제작하였다. 경구 경로에 의한 마우스의 면역화후에, CS3, LTB, ST 및 시겔라 리포폴리사카라이드에 대한 항체가 발생하였다.

수(Xu) 등(Vaccine 21: 664-648, 2003)은 DNA-기본 HIV gag 백신에 대한 담체로서 약독화된 침입성 생 시겔라 플렉스네리 혈청형 2a rfbF 돌연변이체를 개시하였다.

노리에가(Noriega) 등(Infection and Immunity 67(2): 782-788, 1999)은 2 개의 혈청형 2a 및 3a의 사용을 수반하는, 14 시겔라 플렉스네리 혈청형에 대한 교차-보호 전략을 개시하였다. 개시된 약독화된 균주는 시겔라 플렉스네리 2a 균주 CVD1207(ΔguaB-A Δset1 Δsen) 및 시겔라 플렉스네리 3a 균주 CVD 1211(ΔguaB-A ΔvirG Δsen)이다.

베르나르디니(Bernardini) 등(Infection and Immunity 69(2): 1072-1083, 2001)은 시겔라 플렉스네리 5의 돌연변이체인 aroC 돌연변이체 및 이중 purE aroC 돌연변이체를 개시한다.

레빈(Levine) 등(Behring Institute Mitteilungen 98: 120-123, 1997)은 약독화된 시겔라 플렉스네리 2a 균주 CVD 1203(염색체 유전자 aroA 및 플라스미드 유전자 virG에서의 돌연변이를 갖음)뿐만 아니라 시겔라 플렉스네리 2a 백신 후보 CVD 1205(핵산 합성에 결함을 일으키는 guaB-A에서의 결실 돌연변이, 및 virG에서의 결실 돌연변이를 갖음)를 개시하였다.

본 발명의 목적은, 특히 풍토성 국가로 여행하는 여행자 및 개발도상국에 사는 어린아이들에게 매우 적합한 설사병의 예방을 위해 개선된 시겔라 백신을 제공하는 것이다. 상기와 같은 백신은 상이한 병원균으로부터 유래하는 항원들을 이종으로 발현하고 세균성 병원균, 및 특히 세균성 이질에 대한 광범위한 보호를 유도할 수 있는 약독화된 시겔라 플렉스네리 생백신 균주를 기본으로 할 수 있다.

상기 목적은 특허청구된 바와 같은 주제에 의해 해결된다.

본 발명에 따라 LPS O 항원이 결여된 거친 시겔라 균주(rough Shigella strain)를 기본으로 하는 약독화된 시겔라 생백신을 제공한다.

구체적으로, 상기 시겔라 균주는 돌연변이유발에 의해, 특히 상기 침입 플라스미드의 돌연변이에 의해 비-침입성(non-invasive)이다.

구체적으로 본 발명에 따른 백신은, 바람직하게는 예를 들어 시겔라 플렉스네리 2a 2457T 균주의 Gnd(6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제, 2089155-2090561) 및 GalF(UTP-글루코스-1-포스페이트 유리딜트랜스퍼라제, 2101928-2102821) 유전자 사이의 염색체상에 위치한(Wei et al. Complete genome sequence and comparative genomics of Shigella flexneri serotype 2a strain 2457T. Infect Immun. 2003 May;71(5):2775-86), 또는 독성 플라스미드(시겔라 손네이(Shigella sonnei)) 상에 위치한 rfb 오페론의 클러스터 중의 유전자들로 이루어지는 그룹 중에서 선택된, LPS 합성, 운반 및 발현에 관련된 하나 이상의 유전자의 돌연변이유발에 의해 약독화된다. O-항원 합성을 암호화하는 rfb/wbb 유전자 클러스터내 하나 이상의 유전자, O-항원 리가제를 암호화하는 waaL, O-항원 운반에 관련된 O-항원 플립파제(flippase)를 암호화하는 wzx, O-항원 중합에 관련된 wzy/rfc, LPS-코어 합성을 암호화하는 rfa/waa 유전자 클러스터내 유전자, O-항원 발현에 영향을 미치는 조절성 유전자, 예를 들어 rfaH, 또는 기능(들)의 상실이 O-항원의 발현을 적어도 90% 감소시키는 유전자의 돌연변이유발이 특히 바람직하다.

특정한 실시태양에 따라, 상기 돌연변이유발은 rfb F, D, C, E, J 및/또는 I 유전자 중 하나 이상의 결실, 또는 그의 일부 또는 다양한 시겔라 혈청형 중 상응하는 유전자의 결실에 의한다. 한편으로, 불활성화, 예를 들어 일시적이거나, 조건적이거나 구성적인 불활성화에 의한 돌연변이유발이 사용될 수도 있다.

상기 시겔라 균주는 바람직하게는 시겔라 속, 예를 들어 임의의 시겔라 혈청형 또는 종, 특히 시겔라 플렉스네리, 시겔라 손네이, 시겔라 다이센테리아에(Shigella dysentheriae) 및 시겔라 보이디이(Shigella boydii) 중에서 선택된다.

구체적으로, 상기 시겔라 균주는 외막 단백질을 발현하며, 교차-반응성 항체, 특히 OmpC, OmpA 및 OmpX를 포함한 보존된 단백질, 또는 침입 플라스미드상에 암호화된 것들을 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 백신은 특히 시겔라의 상이한 혈청형 및 종들, 특히 시겔라 플렉스네리 2a, 시겔라 플렉스네리 6 및 시겔라 손네이 중 어느 하나, 또는 장침입성 대장균에 대해 교차-보호성이다.

특정한 태양에 따라, 상기 시겔라는 상기 침입 플라스미드의 추가적인 돌연변이유발, 특히 ipaB 및/또는 ipaC 및/또는 다른 ipa 유전자의 결실을 포함하는 상기 침입 플라스미드의 돌연변이에 의해 비-침입성이다.

구체적으로, 상기 시겔라는, 이종 항원을 분비하거나 세균세포 표면상에서 상기 항원을 발현하도록 상기 항원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 재조합 내인성 침입 플라스미드를 포함한다.

바람직한 실시태양은 상기와 같은 백신에 관한 것이며, 여기에서 상기 항원은 병원균, 예를 들어

- 세균성 항원, 바람직하게는 독소 또는 콜로니화 인자,

- 바이러스성 항원, 바람직하게는 장 또는 점막 감염을 유발하는 병원균으로부터의 항원,

- 진균성 항원, 바람직하게는 장 또는 점막 감염을 유발하는 병원균으로부터의 항원, 및

- 기생충성 항원, 바람직하게는 장 감염을 유발하는 병원균으로부터의 항원

으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 병원균으로부터 유래하는 보호 항원이다.

구체적으로, 상기 세균성 항원은 장병원성 세균으로부터 기원하며, 바람직하게는

a. 대장균 항원, 특히 ETEC의 LTB, 돌연변이된 LTA 및 ST, 이들의 서브유닛 또는 융합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 장독소, 장응집성 대장균(EAEC)으로부터의 항원, 또는 시가-형 독소 1 또는 2

b. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 항원,

c. 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 항원, 구체적으로 독소 A 및 B

d. 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 항원, 구체적으로 CT-B 항원, 및

e. a), b), c) 또는 d)의 돌연변이 또는 융합 단백질

로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

구체적으로, 상기 세균성 항원은 이열성 독소의 B 서브유닛(LTB), 내열성 독소(ST) 또는 이들의 서브유닛 또는 융합물, 바람직하게는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열(인간 ST의 야생형 서열을 임의로 제외함)을 갖는 STm을 포함하는 LTB/STm을 포함하는 장독소(ETEC)이다.

특히, 상기 ETEC 항원은 LT의 B 서브유닛과 돌연변이 ST의 융합 단백질, 바람직하게는 도 7 서열번호 11-18(4 개의 구조물에 대해서 LTA-프로모터-LTB-ST-LTB 종결자 뉴클레오티드 및 LTB-ST 아미노산 서열)로부터 유래된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 예를 들어 13 및/또는 12번 위치에 ST 돌연변이, 예를 들어 P13F 또는 P13G, 및/또는 N12R 또는 N12K를 갖는 융합 단백질 LTB/STm이다.

구체적으로, 상기 바이러스성 항원은, 바람직하게는 로타바이러스 및 노로바이러스(칼리시바이러스)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 설사 바이러스로부터 기원한다.

구체적으로, 상기 기생충성 항원은, 바람직하게는 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium) 종 및 엔타메바 히스톨리티카(Entameba histolytica)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 설사-유발 원생동물로부터 기원한다.

구체적으로, 상기 진균성 항원은, 바람직하게는 블라스토마이세스 더마티디티스(Blastomyces dermatiditis) 및 히스토플라스마 종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 설사-유발 진균으로부터 기원한다.

본 발명의 특정한 태양에 따라, 상기 시겔라 백신 균주는 필수 염색체 유전자의 결실 및 상기 유전자의 상기 침입 플라스미드내로의 삽입, 특히 ppa 유전자, 또는 accD, acpS, dapE, era, frr, ftsI, ftsL, ftsN, ftsZ, infA, lgt, lpxC, msbA, murA, murI, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho 및 rhoL 중 어느 하나를 추가로 포함한다.

더욱이, 본 발명의 특정한 실시태양에 따라, 상기 백신을 감염성 질병, 특히 장 질병, 예를 들어 설사병을 예방하기 위해서 환자에 예방학적으로 또는 면역예방학적으로 사용하기 위해 제공한다. 구체적으로, 상기 질병은 세균성 이질, 이질 및 설사로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

본 발명에 따라, 구체적으로 각각 환자의 백신접종 및 면역화에 의해 상기 환자에게서 감염성 질병, 특히 장 질병을 예방하는 방법을 추가로 제공한다.

구체적으로, 상기 장 질병은 임의의 시겔라 혈청형 또는 종에 의해 유발된다.

바람직하게, 상기 (면역)예방은 상기 백신을 점막 또는 경구 제형으로 투여함을 포함한다.

구체적으로, 상기 백신은 경구 또는 비내 투여된다.

특정한 실시태양은 본 발명에 따라 사용하기 위한 백신에 관한 것이며, 여기에서

- 병원균의 보호 항원을 내인성 변형된 재조합 침입 플라스미드내에 통합시킴으로써 시겔라의 보호 항원 및 시겔라 이외 종의 적어도 하나의 다른 보호 항원을 발현하는 다가 백신이 사용되고, 여기에서

- 상기 감염성 질병은 임의의 시겔라 혈청형 또는 종 및/또는 상기 병원균에 의해 유발된다.

본 발명의 추가의 태양에 따라, 상기 rfbF 및 상기 ipaB 및/또는 ipaC 유전자 중 적어도 하나의 결실, 또는 그의 필수 부분의 결실을 갖는, 시겔라 플렉스네리 2a 균주, 예를 들어 시겔라 플렉스네리 2a 2457T인 시겔라 균주를 제공한다.

구체적으로, 상기 시겔라 균주는 필수 염색체 유전자의 결실 및 상기 유전자의 침입 플라스미드 내로의 삽입을 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 시겔라 균주는 이종 항원을 발현하고/하거나 분비하도록 상기 항원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 재조합 침입 플라스미드를 포함한다.

또한, 본 발명의 추가의 태양에 따라, 적어도 하나의 이종 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 돌연변이된 시겔라 침입 플라스미드를 기본으로 하는 재조합 플라스미드를 제공하며, 여기에서 상기 플라스미드는 상기 ipaB 및/또는 ipaC 유전자 중 적어도 하나에서 돌연변이된다. 이는 구체적으로 비-암호화 또는 암호화 영역, 예를 들어 각각 유전자에 작동적으로 연결되는 조절 서열 또는 유전자의 결실 및/또는 불활성화, 바람직하게는 세균 숙주 세포를 비-침입성으로 만드는 유전자의 결실, 특히 상기 ipaB 및/또는 ipaC 유전자의 결실, 또는 그의 (실질적인) 부분의 결실에 대한 돌연변이를 지칭한다.

본 발명의 추가적인 특정한 태양은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 세균성 숙주 세포에 관한 것이며, 여기에서 상기 숙주 세포는 구체적으로 시겔라, 에스케리키아, 살모넬라, 캄필로박터 및 예르시니아 속 중에서 선택된다.

상기 숙주 세포는 구체적으로 내인성 침입 플라스미드 중의 돌연변이를 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 벡터는 내인성 침입 플라스미드, 즉 상기 숙주 세포에 대해 내인성이거나 상동성인 플라스미드이다.

도 1. LPS O-항원 합성이 결여된 시겔라 플렉스네리 및 시겔라 손네이의 약독화된 비-침입성 생 균주의 교차-보호 능력
8주된 BALB/c 마우스의 그룹을 시겔라 플렉스네리 2a(a 및 b) 돌연변이체의 CRP(10⁶ CFU) 및 CRN(10⁸ CFU) 변체 또는 한편으로 시겔라 손네이(c)의 I기(10^5.5 CFU) 및 II기(10^7.5 CFU) 변체에 의해, 2주-간격으로 2회 비내로 면역화시켰다. 대조군을 염수로 모의 백신접종하였다. 후속으로, 마우스를 동일한 경로를 통해 10⁶ CFU의 야생형 시겔라 플렉스네리 6(a 및 c) 또는 10^6.5 CFU의 야생형 시겔라 손네이(b)로 접종하였다. 후속으로 14일간 생존을 모니터하였다. 도면은 각 그룹에 5 마리의 마우스를 사용한 3 개(b) 또는 2 개(a 및 c)의 독립적인 실험들 및 반복 실험에 대한 복합 데이터를 도시한다. 상기 생존 곡선의 통계학적 분석을 로그-순위(만텔-콕스) 시험에 의해 수행하였다. 생존이 모의-백신접종된 마우스의 경우와 유의 수준으로 상이한 경우에, p 값을 그래프상에 나타낸다.
도 2. 유도할 수 있는 제안된 항체 수준의 차이뿐만 아니라 사용되는 다양한 돌연변이체의 항원 표현형의 도식적 표현.
O-항원, 그의 유전 결정인자, 및 이들에 의해 촉발된 항체를 도시한다. Ipa 및 소수의 보존된 표면 항원들을 도시한다. Ipa 및 O-항원을 모두 발현하는 돌연변이체(시겔라 플렉스네리 ΔaroC CRP 및 시겔라 손네이 I기)는 주로 이들 주요 항원들에 대한 항체 반응을 촉발한다. 대조적으로, 상기 백신 균주 중 이들 항원의 상실은 소수의 보존된 항원들에 대해 보다 높은 반응을 허용한다. ip: 침입 플라스미드, chr: 염색체, T3SS: 3형 분비 시스템, LPS: 리포폴리사카라이드.
도 3. 약독화된 생 시겔라 플렉스네리 2a 균주로 백신접종한 마우스로부터 획득된 광범위-반응성 점막 IgA.
평활한 ipa-양성 균주(ΔaroC CRP) 및 이중 돌연변이체(ΔrfbF CRN)로 2 회 면역화후 수집된 BAL 샘플 중 sIgA의 면역 반응성을 상이한 표적 세균 세포상에서 ELISA에 의해 측정하였다. 반응성을, 필적하는 반복을 수행하기 위해서 동일한 희석비(ΔrfbF CRN 샘플의 반응성으로 나눈 ΔaroC CRP 샘플의 반응성)로서 나타낸다. 그래프는 독립적인 백신접종으로부터 획득한 BAL 샘플로 수행된 4 개 실험의 평균 + 상기 평균의 표준 오차를 도시한다. 데이터를 만-휘트니 비모수 검정에 의해 상기 이중(ipa 및 O 항원) 양성 표적(ΔaroC CRP; 검은색 컬럼)상에서 획득된 값에 대해 통계학적으로 비교하였다.
도 4. 보충 표 1: 결실 돌연변이체들(서열번호 3-10)의 생성 및 확인에 사용된 올리고뉴클레오티드.
도 5. 약독화된 시겔라 플렉스네리 2a 2457T 균주의 도식적인 표현.
A. 시겔라 플렉스네리 2a 2457T 완전히 서열분석된 균주. O-항원은 시겔라에의 혈청형 결정인자이다. 상기 시겔라 염색체상의 rfbF 유전자는 LPS의 O-항원 성분의 합성에 필수적인 인자를 암호화한다. 모든 병원성 시겔라 균주 중에 존재하는 침입 플라스미드는 III형 분비 시스템(T3SS)의 중요한 분자 성분인 침입 플라스미드 항원(IpaA-D)을 암호화한다. T3SS는 표적 세포-시겔라 상호작용의 핵심 과정을 매개하고 최종적으로 시겔라 인자를 표적 세포내로 전달되게 하며, 이는 상기 병원균을 침입 및 확산되게 할 수 있다. IpaB 및 IpaC가 상기 시스템의 핵심적이고 필수적인 성분들이다.
B. 시겔라 플렉스네리 2a T2457 rfbF^-ipaB/C^- 돌연변이체에서 2 개의 결실이 도입된다. 상기 염색체로부터 rfbF 유전자의 결실은 상기 O-항원의 합성을 제거하며, 약독화되고 백신접종시 혈청형 독립적인 면역성을 유도하는 "거친" 균주를 생성시킨다. 상기 침입 플라스미드상의 상기 ipaB 및 C 유전자의 결실은 T3SS를 파괴하며, 따라서 상기 시겔라 돌연변이체를 비-침입성(및 콩고 레드 음성)으로 만든다.
C. 상기 돌연변이 시겔라 균주의 침입 플라스미드를 안정화시키기 위해서, 필수 염색체 유전자(무기 피로포스파타제, ppa(도 7 서열번호 24))를 상기 염색체로부터 결실시키고 합성 구조물의 일부로서 상기 침입 플라스미드내로 재도입시킨다.
도 6: ipa 클러스터, ipa B/C 결실에 대한 프라이머 위치(pK1,2) 및 ipa B/C의 결실을 모니터하기 위한 조절 프라이머(ko1,2)를 갖는 시겔라 플렉스네리 2a
301 균주의 침입 플라스미드 pCP301의 도식적인 예시. ipaJ와 IS100 요소 사이의 합성 유전자의 삽입 부위의 위치를 또한 나타낸다.
도 7: 서열
eltAB 프로모터 및 종결 서열과 함께 아미노산 위치 13(Pro에서부터 Phe까지)에 돌연변이를 갖는 ST를 암호화하는 LT-B/mST 융합 단백질에 대한 유전자
GP-P13F(뉴클레오티드 서열, 서열번호 11),
아미노산 위치 13(Pro에서부터 Phe까지)에 ST의 돌연변이를 갖는 LT-B/mST 융합 단백질
GP-P13F(아미노산 서열, 서열번호 12),
eltAB 프로모터 및 종결 서열과 함께 아미노산 위치 13(Pro에서부터 Gly까지)에 돌연변이를 갖는 ST를 암호화하는 LT-B/mST 융합 단백질에 대한 유전자
GS-P13G(뉴클레오티드 서열, 서열번호 13),
아미노산 위치 13(Pro에서부터 Gly까지)에 ST의 돌연변이를 갖는 LT-B/mST 융합 단백질
GS-P13G(아미노산 서열, 서열번호 14),
eltAB 프로모터 및 종결 서열과 함께 아미노산 위치 12(Asn에서부터 Arg까지)에 돌연변이를 갖는 ST를 암호화하는 LT-B/mST 융합 단백질에 대한 유전자
GS-N12R(뉴클레오티드 서열, 서열번호 15),
아미노산 위치 12(Asn에서부터 Arg까지)에 ST의 돌연변이를 갖는 LT-B/mST 융합 단백질
GS-N12R(아미노산 서열, 서열번호 16),
eltAB 프로모터 및 종결 서열과 함께 아미노산 위치 12(Asn에서부터 Lys까지)에 돌연변이를 갖는 ST를 암호화하는 LT-B/mST 융합 단백질에 대한 유전자
GS-N12K(뉴클레오티드 서열, 서열번호 17),
아미노산 위치 12(Asn에서부터 Lys까지)에 ST의 돌연변이를 갖는 LT-B/mST 융합 단백질
GS-N12K(아미노산 서열, 서열번호 18),
ipa 결실 돌연변이체 균주를 확인하기 위한 순방향 조절 PCR 프라이머
ipa co1(서열번호 19),
ipa 결실 돌연변이체 균주를 확인하기 위한 역방향 조절 PCR 프라이머
ipa co2(서열번호 20),
ipa 결실 돌연변이체 균주를 생성시키기 위한 순방향 PCR 프라이머
ipa pKD1(서열번호 21),
ipa 결실 돌연변이체 균주를 생성시키기 위한 순방향 PCR 프라이머
ipa pKD2(서열번호 22),
침입 플라스미드로부터 제거된 ipaB 및 ipC 유전자의 뉴클레오티드 서열
ipaBC(서열번호 23),
염색체로부터 침입 플라스미드로 이식된 ppa 유전자의 뉴클레오티드 서열
시겔라 ppa 유전자(서열번호 24),
ppa 결실 돌연변이체 균주를 생성시키기 위한 순방향 PCR 프라이머
ppa pKD-F(서열번호 25),
ppa 결실 돌연변이체 균주를 생성시키기 위한 역방향 PCR 프라이머
ppa pKD-R(서열번호 26),
ppa 결실 돌연변이체 균주를 확인하기 위한 순방향 조절 PCR 프라이머
ppa ko1(서열번호 27),
ppa 결실 돌연변이체 균주를 확인하기 위한 역방향 조절 PCR 프라이머
ppa ko2(서열번호 28),
가요성 폴딩을 위해 LT-B와 mST 사이에 삽입된 링커 펩티드
GGGGS(서열번호 29).
도 8:
rfbF 유전자가 결실된 염색체 영역의 PCR 증폭.
M: DNA 크기 마커; WT: 야생형 시겔라 플렉스네리 2a 2457T, 측면 인접 영역을 갖는 rfbF 유전자, 1100 bp 단편; mt: ΔrfbF 돌연변이체, 클로람페니콜 유전자에 의한 유전자 치환, 1300 bp.
도 9:
ipaC 및 ipaB 유전자가 결실된 침입 플라스미드 영역의 PCR 증폭.
M: DNA 크기 마커; WT: 야생형 시겔라 플렉스네리 2a 2457T, 측면 인접 영역을 갖는 ipaB 및 ipaC 유전자, 1600 bp 단편; mt: ΔipaBC 돌연변이체 침입 플라스미드, 가나마이신 유전자에 의한 유전자 치환, 2570 bp.
도 10:
A. 필수 유전자 Ppa, LTB-mST 융합 단백질 및 가나마이신 내성 단백질을 암호화하는 다중-유전자 구조물의 구조.
LTB-mST 융합 단백질의 발현이 LTA-프로모터에 의해 구동되고 전사는 LTB 종결자에 의해 종결된다. 해독 ST 돌연변이를 갖는 4 개의 구조물(P13F, P13G, N12R, N12K)의 LTB-ST 아미노산 서열을 나타낸다(돌연변이된 코돈은 밑줄을 그음). 약어: CS: 클로닝 부위; H1 및 H2: 상동성 재조합을 지원하기 위한 침입 플라스미드 상의 상동 영역 1 및 2; ppa: 무기 피로포스파타제 유전자; pro: 프로모터; term: 종결자; GGGGS: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(LTB와 mST 사이의 서열번호 29 5-아미노산 링커); kan: 가나마이신 내성 유전자.
B. 시겔라 침입 플라스미드내로의 ETEC 유전자의 삽입.
M: DNA 크기 마커; WT: 야생형 시겔라 플렉스네리 2a 2457T, 칩입 플라스미드 유전자간 영역, 450 bp 단편; mt: LT-B + STm 유전자 돌연변이 침입 플라스미드, 가나마이신 유전자에 의한 유전자 치환, 2800 bp.
C. LTB를 검출하기 위한 면역블럿 분석.
재조합 LT-B(또한 대장균 및 시겔라 배양 상등액 분획)(선택된 단백질들)를 SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 단백질들을 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 옮기고 항-LTB 단클론 항체로 검출하였다. 레인 1: 야생형 시겔라 플렉스네리(음성 대조군); 레인 2: 침입 플라스미드 중에 융합 유전자를 갖는 시겔라 플렉스네리; 레인 3: 도 10A에 도시된 바와 같은 합성 구조물을 함유하는 pGET 벡터로 형질전환된 DH5α 대장균; 레인 4: LT를 발현하는 ETEC 균주(양성 대조군).
도 11:
가공된 rfbF 및 ipaC/ipaB 복합 돌연변이를 갖는 시겔라 플렉스네리 2a 백신 균주에 의해 유도된 이종 보호.
5 마리 마우스의 그룹들을 치사량에 가까운 용량의 야생형 균주 시겔라 플렉스네리 2a 2457T(5x10⁵ cfu/마우스) 또는 그의 동질유전자 결실 돌연변이체 2457TΔrfb, 2457TΔipaBC, 2457TΔrfbΔipaBC(모두 10⁸ cfu/마우스)로 비내 면역화하거나, 또는 PBS 완충제로 모의 면역화하였다. 3 회의 동일한 면역화를 2-주 간격으로 수행하였다. 최종 추가 면역화후 1 주일째에, 마우스를 치사 용량의 시겔라 손네이 균주(2x10⁶ cfu/마우스)로 접종하였다. 동물의 생존을 매일 모니터하였다.

명세서 전체를 통해 사용되는 바와 같은 특정 용어들은 하기의 의미를 갖는다.

"약독화된"이란 용어는 본 발명에서 더 이상 질병을 유발할 수 없도록 변형된, 즉 변형된 균주가 무독성인 시겔라의 독성 균주를 개시하는데 사용된다. 상기 약독화된 시겔라에 관하여 "생"이란 용어는 본 발명에서 증식하고 번식할 수 있는 시겔라를 개시하는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 시겔라 생균주는 약독화된 생백신에 사용되며 특이적으로 환자의 결장에 대량서식할 수 있지만, 장 또는 설사 병원균에 의해 유발된 장 질병과 관련된 임상 증상은 유발하지 않는다. 더욱이, 본 발명의 생 균주는 특이적으로, 백신접종된 환자에서 제한된 복제가 가능하며 시겔라의 독성 균주에 대해 보호성인 보호 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 약독화된 세균을 고유 세균에 의해서는 발현되지 않는 이종 항원을 발현하도록 유전학적으로 가공할 수 있으며, 따라서 상기 약독화된 세균은 상기 이종 항원의 담체로서 작용한다.

본 발명에 따라 사용된 바와 같은 "항원"이란 용어는 특히, 가능하게는 항체의 결합 부위에 의해 인식될 수 있는 임의의 항원 결정인자를 지칭할 것이다. 특히 바람직한 항원은 면역학적으로 또는 치료학적으로 관련된 것으로 이미 입증되었거나 또는 관련될 수 있는 분자 또는 구조, 특히 임상 효능이 시험된 것들이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 상기 용어는 특히 면역접근성 및 면역관련성 에피토프를 포함하는 항원, 특히 하나 이상의 종 또는 혈청형에서 발견되는 보존된 항원 중에서 선택된 분자 또는 구조를 포함할 것이다. 면역접근성 에피토프는 전형적으로는 세포 표면상에서 발현된 항원에 의해 제공되거나 또는 상기 항원 중에 포함된다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "보호 항원"이란 용어는 생체내에서 면역 반응을 촉발하고, 따라서 상기 항원에 대한 중화 항체를 유도하는 항원을 지칭할 것이다. 이는 상기 항원에 의한 능동 면역시 유효한 보호를 제공한다. 단백질 항원이 세포 및 체액 면역 반응을 이끌어내는 그의 본래의 능력으로 인해 바람직한 항원이다.

"이종"이란 용어는 본 발명에서 구체적으로 항원에 관해서 사용되며, 상기 이종 항원을 발현하는 세포에 대해 외래인 항원으로서 이해된다. 시겔라 세포 또는 균주에 관하여, 상기 용어는 구체적으로 각각 상기 시겔라 또는 균주에 대해 외래인 항원들을 지칭한다. 따라서, 상기와 같은 이종 또는 외래 항원은 야생형 세포 또는 균주에서 발현되지 않고, 상기 항원을 암호화하는 이종 유전자를 포함하는 재조합 세포 또는 균주에서 발현될 것이다. 이에 의해, 상기 재조합 세포 또는 균주는, 예를 들어 세포 표면상에서 상기 이종 항원을 발현할 것이다. 본 발명의 세포를 이종 항원, 예를 들어 LT 및/또는 ST 또는 STm의 무독성 성분 또는 형태를 발현하도록 유전학적으로 가공할 수 있다. 상기와 같은 세포는 상기 이종 항원뿐만 아니라 고유 항원에 대한 면역 반응을 유도하며 따라서 백신에 의해 제공된 보호를 개선시킨다.

본 발명에 사용된 바와 같은 항원에 관하여 "교차-반응성"이란 용어는 상이한 병원균들, 예를 들어 동일한 종 또는 상이한 세균 종의 상이한 혈청형들간에 공유된 에피토프를 갖는 항원을 의미한다. 교차-반응성 항원은 전형적으로는 보존된 구조이다. 교차-반응성 에피토프는 상이한 병원균에 의해 발현된 동일 항원으로부터, 또는 달리, 유사한 구조를 갖는 상이한 항원으로부터 기원할 수 있다.

특정한 교차-반응성 항원은 교차-반응성 항체, 예를 들어 항혈청의 항체, 단리된 항체 또는 재조합 항체에 의해 인식된다. 상기와 같은 교차-반응성 항체는 상이한 병원균의 교차-반응성 항원을 인식할 수 있다. 특정한 교차-반응성 항체는 중화 항체이다.

"교차-보호성" 백신 또는 면역 반응은 상기 반응을 이끌어내기 위해 사용된 것과 동일하지 않은, 적어도 하나의 상이한 병원균, 예를 들어 상이한 종 또는 혈청형에 의한 감염에 대해 보호하는 것으로서 이해된다. 교차-보호 효능을 전형적으로는 상기 상이한 병원균들에 노출된 환자로부터의 상이한 항혈청을 사용하여 시험할 수 있다.

교차-반응성 항원을 교차-보호성 면역을 유도하도록 설계하는 경우, 상기 항원을 동물 모델에서, 예를 들어 상기 동물을 면역 반응을 촉발하는 하나의 병원균으로부터 유래한 교차-반응성 항원으로 면역화하고 상기 동물을 상기 반응을 이끌어내는데 사용된 것과 상이한 적어도 하나의 병원균으로 접종함으로써 시험할 수 있다. 일례로서, 교차-반응성 항원을 갖는 하나보다 많은 시겔라 혈청형 또는 다른 장침입성 세균, 예를 들어 대장균에 대한 상기와 같은 교차-보호성 면역을 구체적으로, 상이한 개인의 세균 종내의 독특한 변이, 예를 들어 아종 수준의 변이에 대한 보호라 칭한다. 공통 항원을 갖는 혈청형변이주의 그룹을 혈청그룹 또는 혈청형이라 칭한다.

광범위한, 예를 들어 다중-균주 및/또는 다중-혈청형 및/또는 다중-종 시겔라 백신의 개발을 위한 기본은 시겔라 혈청형변이주 중에 우세한 교차-반응성 항원의 동정이다. 이는 특히 인간 감염과 관련된 단리물을 포함한다.

다가 백신을 상이한 병원균에 대한 교차-보호성 면역을 유도하도록 설계하는 경우, 상기 면역 반응은 전형적으로 다수의 항원, 예를 들어 상기 상이한 병원균으로부터의 개별적인 항원에 의해 유도된다. 일례로서, 상기와 같은 다가 백신은 상이한 종들로부터, 예를 들어 시겔라 및 에스케리키아로부터 유래된 적어도 2 개의 상이한 보호 항원뿐만 아니라, 다른 세균, 바이러스, 진균 또는 기생충 항원을 기본으로 할 수 있다. 상기 교차-보호성 다가 백신을 예를 들어 동물 모델에서, 상기 동물을 면역 반응을 촉발하는 적어도 2 개의 상이한 병원균으로부터 유래한 상이한 보호 항원을 포함하는 백신으로 면역화하고 상기 동물을 상기 병원균 중 하나, 둘 또는 그 이상으로 접종함으로써 시험할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 바와 같이, 특정한 약독화된 시겔라 세균을 기본으로 하는 다중-종 백신 후보의 개발을 위한 기본은, 일련의 상이한 혈청형들에 대해 교차-반응성이든 아니든간에, 보호가 추구되는 상이한 병원성 종들 중에 우세한 보호 항원의 동정이다.

본 발명에서 구체적으로 질병 또는 병원균과 관련하여 사용되는 바와 같은, "장"(또한 "장내"로서도 공지됨)이란 용어는 장과 관련되거나 상기 장에 영향을 미치는 질병 상태 또는 병원균, 예를 들어 이질 또는 설사병을 지칭할 것이다. 구체적으로 상기와 같은 장 질병은 결장의 감염성 질병을 지칭한다. 특정한 증상은 출혈성의 점액질 설사; 복부 통증; 발열 및 신체로부터 체액의 손실을 포함한다. 설사병은 하루에 3 회 이상의 묽은 변 또는 물설사를 발생시키는 상태, 또는 당사자에게 통상적인 경우보다 더 많은 변을 보는 상태를 지칭한다. 장 병원균은 환자가 상기 병원균에 의해 감염시, 또는 독소, 특히 장독소로 중독시, 상기 환자에게서 장 질병을 유발하는 것으로 생각된다.

바이러스, 세균, 진균 및 기생충을 포함하여, 감염성 장 질병, 예를 들어 이질 또는 설사의 원인은 많다. 예를 하기와 같이 제공한다: 노로바이러스는 성인에서 바이러스성 설사의 가장 흔한 원인이나, 로타바이러스는 5세 이하의 아동에서 가장 흔한 원인이다. 아데노바이러스 유형 40 및 41, 및 아스트로바이러스는 상당수의 감염을 유발한다. 세균 캄필로박터가 세균성 이질 또는 설사의 통상적인 원인이나, 일부 분야에서는 살모넬라에, 시겔라에 및 대장균(이콜라이)의 일부 균주에 의한 감염이 흔하다. 노인, 특히 관련되지 않은 감염에 대해 항생제로 치료된 노인에게서, 클로스트리디움 디피실레에 의해 생산된 독소는 종종 심한 설사를 유발한다. 기생충의 예로는 만성 감염을 유발할 수 있는 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 및 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)가 있다. 본 발명의 백신에 의해 가능한 한 다루어질 수 있는 예시적인 장 질병은 세균성 이질 및 ETEC-관련된 설사이다.

플라스미드와 관련하여 본 발명에 사용되는 바와 같은 "내인성"이란 용어는 특정 숙주 세포에서 기원하는 플라스미드를 의미할 것이다. 내인성 플라스미드를, 예를 들어 플라스미드를 원위치에서, 즉 고유의 내인성 플라스미드가 잠복되어 있는 숙주 세포내에서 가공하는 재조합 기법에 의해, 또는 달리, 숙주 세포로부터 제거시 상기 플라스미드에 실험실 조작을 가함으로써 유전학적으로 가공하여 재조합 내인성 플라스미드를 수득하고, 이어서 동일한 유형의 숙주 세포내에 재도입시킬 수 있다. 시겔라의 침입성 표현형은 내인성 220-kb 독성 플라스미드(또한 침입 플라스미드라 칭함), 또는 고유의 또는 내인성 침입 플라스미드에 의해 특이적으로 부여된다. 시겔라의 내인성 침입 플라스미드는 재조합을 목적으로, 단리된 침입 플라스미드로서 또는 원위치 재조합을 위해 본 발명에 따라 특이적으로 제공된다.

유전자에 관하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "필수적인"이란 용어는 살아있는 유기체가 생존하기 위해서 필요한, 예를 들어 세균 세포가 복제를 위해 필요한 유전자를 지칭하는 것으로 이해된다. 필수 유전자의 돌연변이, 예를 들어 결실 및/또는 불활성화는 치사 표현형 또는 비-복제성 세포를 유발할 것이다. 시겔라의 필수 유전자를, 상기 시겔라 염색체의 유전자(들)를 결실시키고, 추가로 상기 유전자(들)를 침입 플라스미드내에 통합시켜 상기 침입 플라스미드를 안정화시키도록 돌연변이시킬 수도 있다. 이는 안정한 재조합 내인성 침입 플라스미드를 갖는 시겔라의 배양을 제공한다. 상기 시겔라의 필수 유전자들 중에는 ppa, accD, acpS, dapE, era, frr, ftsI, ftsL, ftsN, ftsZ, infA, lgt, lpxC, msbA, murA, murI, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho 및 rhoL 유전자가 있다.

여기에서 유전자의 "불활성화"는 항상 유전자의 일시적이거나, 유도성이거나 또는 구성적인 하향-조절, 따라서 유전자 산물의 발현을 감소시키거나 억제시킴을 지칭한다. 이는 구체적으로 유전자 또는 상기 유전자에 작동적으로 연결되는 조절 서열, 예를 들어 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 인헨서 등의 돌연변이에 의해 수행될 수 있다. 상기 불활성화 돌연변이 중에는 특히 폴리뉴클레오티드 또는 유전자, 예를 들어 독성 인자를 암호화하는 유전자의 발현을 감소 또는 억제시키거나, 또는 각각의 비-작용성 단백질, 예를 들어 비-작용성 독성 인자의 발현을 유도하는 것들이 있다.

유전자에 관하여 본 발명에 사용되는 바와 같은 "침입성" 또는 "비-침입성"이란 용어는 하기의 방식으로 이해된다. 침입성 병원성 세균은 진핵생물 세포를 침입할 수 있다. 예를 들어, 침입 후에 시겔라는 세포내에서 번식하고 이웃하는 상피 세포로 확산되어, 조직 파괴 및 세균성 이질의 특징적인 병리를 생성시킬 수 있다. 시겔라의 침입을 매개하는 유전자 중에는, 예를 들어 침입 플라스미드 항원을 암호화하는 ipa 유전자가 있다. 상기와 같은 유전자들 중 하나 이상의 결실 및/또는 불활성화는 비-침입성 시겔라를 이끌어낼 수 있다.

세레니 검사는 시겔라 또는 대장균과 같은 유기체의 침입을 측정하는 표준 검사이다(Wood et al. J. Clin. Microbiol. 24: 498?500, 1986). 이는 세균의 현탁액을 기니 피그의 눈에 접종함으로써 수행된다. 중증 점액농성 결막염 및 중증 각막염은 양성 검사를 가리킨다.

핵산 및 특히 벡터, 플라스미드 및 구체적으로 시겔라의 침입 플라스미드에 관하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "단리된" 또는 "단리"란 용어는 자연적으로 관련될 수 있는 환경으로부터 충분히 분리되어, "실질적으로 순수한" 형태로 존재하는 상기와 같은 화합물을 지칭할 것이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"이란 용어는 적어도 50%(w/w), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 화합물, 예를 들어 핵산 분자 또는 플라스미드를 포함하는 제제를 지칭할 것이다. 순도를 화합물에 적합한 방법(예를 들어 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정한다.

"단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물의 배제, 또는 근본적인 활성을 방해하지 않는 불순물 및 예를 들어 불완전한 정제로 인해 존재할 수도 있는 불순물의 존재를 반드시 의미하는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 또한 화학적으로 합성된 것들을 포함함을 의미한다.

본 발명의 단리된 침입 플라스미드와 관련하여, 상기 용어는 상기 플라스미드가 기원한 세포질로부터 분리된 상기 플라스미드를 지칭한다. "단리된 플라스미드"는 또한 생물학적 수단 또는 합성 수단에 의해 직접 생성되고 그의 생성 도중 존재하는 다른 성분들로부터 분리된 플라스미드를 나타낼 수도 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이 유전자에 관하여 "돌연변이유발"이란 용어는 돌연변이된 유전자를 획득하기 위한, 유전자 서열의 돌연변이, 특히 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입 중 어느 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 의미할 것이다. 이는 특히 전체 유전자(들) 또는 그의 상당 부분, 예를 들어 상기 유전자의 적어도 50%의 결실을 지칭한다. "돌연변이유발" 및 "돌연변이"란 용어들은 본 발명에서 호환적으로 사용된다.

그람-음성 세균, 예를 들어 시겔라에 관하여 "거친"이란 용어는 평활함과 다름을 의미하며, 구체적으로 "약하게-거친"(즉 하향조절된 O-ag 합성) 또는 "심하게-거친" 세균을 포함할 것이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "거친"이란 용어는 불규칙한 콜로니 형태와 같은 특징을 포함할 수 있으며, 예를 들어 물결모양 및/또는 돌출 형태를 포함할 수 있다. 상기 용어는 구체적으로 균주가 O-폴리사카라이드를 생산할 수 없고/없거나 실질적으로 생산할 수 없음을 의미한다. LPS내에 함유된 반복적인 글리칸 중합체를 상기 세균의 O-항원, O-폴리사카라이드, 또는 O-(측)쇄라 칭한다. 상기 O 항원은 코어 올리고사카라이드에 부착되며 상기 LPS 분자의 가장 바깥쪽 도메인을 포함한다. 상기 O-쇄의 존재 또는 부재는, 상기 LPS가 거친지 평활한지를 결정한다. 변경된 O-항원 구조를 갖는 세균 균주들은 아가 플레이트상에서 증식할 때 그들의 외관이 평활함에서 무딜게 변한다. 완전-길이 O-쇄는 상기 LPS를 평활하게 만드는 반면, O-쇄의 부재 또는 감소는 상기 LPS를 거칠게 만든다. "평활한" 세균은 완전 코어 및 O-항원을 포함한다. "거친" 세균은 LPS O-항원의 결여를 포함하는데, 이는 O-항원이 없음 또는 감소된 쇄 길이의 O-항원 또는 감소된 수의 평활한 LPS 쇄를 의미한다. "약하게-거친"이란 용어는 거친 세균의 하위그룹을 지칭하며, 이는 감소된 쇄 길이의 O-항원 또는 감소된 수의 평활한 LPS 쇄를 갖는다. "심하게 거친" 세균은 상기 LPS 코어의 손실된 부분들을 가지며, 결과적으로 O-항원이 또한 결여된다.

거친 시겔라에 관하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "LPS O-항원의 결여"란 용어는 구체적으로 표준 분석에서 측정된 바와 같이, 50% 미만, 또는 40% 미만, 또는 30% 미만, 또는 20% 미만, 또는 10% 미만의 LPS O-항원, 또는 LPS O-항원이 없거나 필수적으로 없음을 지칭할 것이다.

표준 시험을 사용하여 균주의 거친 특성을 측정할 수 있다.

예를 들어, LPS 돌연변이체의 표현형을 예를 들어 LPS의 SDS-PAGE 분리 및 혈청형-특이적인 면역혈청을 사용하는 은 염색 또는 응집에 의해 측정할 수 있다.

상기 거친 시겔라를 약독화에 의해서, 예를 들어 적어도 하나의 유전자 또는 그의 중요 부분의 돌연변이에 의해서, 예를 들어 결실 및/또는 불활성화에 의해서 생성시킬 수 있으며, 상기 유전자는 상기 LPS 합성, 운반 및/또는 발현에 관련되고, 바람직하게는 rfb 오페론의 클러스터 중의 유전자들 또는 O-항원 합성을 암호화하는 rfb/wbb 유전자 클러스터내 하나 이상의 유전자, O-항원 리가제를 암호화하는 waaL, O-항원 운반에 관련된 O-항원 플립파제를 암호화하는 wzx, O-항원 중합에 관련된 wzy/rfc, LPS-코어 합성을 암호화하는 rfa/waa 유전자 클러스터내 유전자, O-항원 발현에 영향을 미치는 조절성 유전자, 예를 들어 rfaH, 또는 기능(들)의 상실이 O-항원의 발현을 적어도 90% 감소시키는 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 다.

LPS 당 합성에 관련된 유전자의 구체적인 예는 rfbA, B, D 및 C이다.

LPS 당 트랜스퍼라제에 관련된 유전자의 구체적인 예는 rfbF 및 G이다.

LPS O-항원 폴리머라제에 관련된 유전자의 구체적인 예는 rfc/wzy이다.

상기 rfb 오페론의 클러스터는 염색체상이나 침입 플라스미드(시겔라 손네이)상에 위치한다. 상기 클러스터 중의 구체적인 유전자는 rfb F, D, C, E, J 및/또는 I 유전자이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "재조합체"란 용어는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 분자 또는 구조물을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 재조합 핵산 분자는 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결되는 2 개 이상의 천연 서열을 함유한다. 재조합 단백질은 재조합 핵산에 의해 암호화되고/되거나 발현되는 단백질을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "재조합 세포"는 상기 세포의 고유한(즉 비-재조합체) 형태내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하고/하거나 달리 비정상적으로 과-발현되고, 불충분-발현되고/되거나 의도적인 인간 중재로 인해 전혀 발현되지 않는 고유 유전자를 발현한다. 재조합 세포는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 함유한다. "재조합", "재조합하는", 및 "재조합된" 핵산의 생성은 일반적으로 적어도 2 개의 핵산 단편의 조립을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 재조합 단백질 및 재조합 핵산은 작용성으로 남아있는다, 즉 숙주 세포에서 그들의 활성을 유지하거나 증대된 활성을 나타낸다. 어쨌든 본 발명의 약독화된 세균, 예를 들어 약독화된 시겔라는 재조합 세포로 간주된다. 핵산 구조물, 예를 들어 플라스미드 또는 벡터, 핵산(예를 들어 폴리뉴클레오티드), 폴리펩티드, 또는 숙주 세포를, 상기가 비-천연이거나, 인공적이거나 가공되는 경우, 본 발명에서는 "재조합체"로서 지칭한다. 시겔라의 재조합 침입 플라스미드는 하나, 둘 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들) 또는 유전자들의 특정한 결실 및/또는 불활성화, 예를 들어 침입 플라스미드 항원을 암호화하는 유전자의 적어도 하나의 결실을 포함하도록 특별히 가공되고/되거나 하나 이상의 이종 유전자, 예를 들어 보호 항원을 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다.

시겔라의 "안정한" 재조합 침입 플라스미드는 시겔라 세포 배양물 중에서 상기 플라스미드를 유지하도록 선택된 조건 하에서 상기 세포 배양물 중에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 90% 초과의 체류를 나타내는 시겔라 플라스미드이다. 시겔라의 안정한 재조합 침입 플라스미드의 특정한 예는, 염색체 자리에 위치하고 상기 침입 플라스미드의 자리에 통합된 필수 유전자를 결실 및/또는 불활성화하도록 돌연변이된 재조합 시겔라 숙주 세포를 지칭한다. 상기 침입 플라스미드가 없는 시겔라는 증식하거나 복제되지 않을 것이지만, 내인성 침입 플라스미드를 갖는 시겔라는 생체내에서 증식하고 복제될 수 있을 것이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "벡터"란 용어는 DNA 또는 RNA 서열, 예를 들어 외래(이종) 유전자를 숙주 세포에 도입시켜 상기 숙주를 형질전환시키고 상기 도입된 서열의 발현(예를 들어 전사 및 번역)을 촉진시킬 수 있는 비히클을 지칭한다. 플라스미드, 특히 시겔라의 침입 플라스미드, 구체적으로 내인성 침입 플라스미드가 본 발명의 바람직한 벡터이다.

벡터는 전형적으로 외래 DNA가 삽입되는 전달제의 DNA를 포함한다. DNA의 하나의 분절을 DNA의 또 다른 분절에 삽입하는 통상적인 방법은 제한 부위라 칭하는 특정한 부위(특정한 그룹의 뉴클레오티드)에서 DNA를 절단하는 제한 효소라 칭하는 효소의 사용을 수반한다. "카세트"는 한정된 제한 부위에서 벡터내로 삽입될 수 있는 발현 산물을 암호화하는 DNA 암호화 서열 또는 DNA의 분절을 지칭한다. 상기 카세트 제한 부위는 적합한 판독 프레임에 상기 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 일반적으로, 외래 DNA를 상기 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입하고 이어서 상기 전달 벡터 DNA와 함께 상기 벡터에 의해 숙주 세포내로 운반한다. 삽입되거나 첨가된 DNA를 갖는 DNA의 분절 또는 서열, 예를 들어 발현 벡터를 또한 "DNA 구조물"이라 칭할 수 있다. 통상적인 유형의 벡터가 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로, 대개 세균 기원의, 이중 가닥 DNA의 자립 분자이며; 추가적인(외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포내로 쉽게 도입될 수 있다.

본 발명의 시겔라는 바람직하게는 하나 이상의 이종 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용되는 재조합 내인성 침입 플라스미드를 포함한다. 따라서, 바람직한 실시태양에 따라, 상기 시겔라는 "인공 벡터" 균주가 아니며, 이는 상기 균주가 임의의(재조합) 내인성 플라스미드 외에, 인공 플라스미드를 포함하지 않음을 의미한다.

플라스미드 벡터는 종종 암호화 DNA 및 프로모터 DNA를 함유하며, 외래 DNA의 삽입에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 암호화 DNA는 특정 단백질 또는 효소에 대한 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 상기 암호화 DNA의 발현을 개시하거나, 조절하거나 또는 달리 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 암호화 DNA는 동일한 유전자로부터 또는 상이한 유전자로부터 나올 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 나올 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다. "발현 시스템"이란 용어는, 예를 들어 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포내로 도입되는 외래 DNA에 의해 암호화되는 단백질의 발현에 적합한 조건 하의 상기 숙주 세포 및 적합한 벡터를 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 약독화된 시겔라는 특별히 생백신의 개발에 사용된다.

상기 약독화된 시겔라는 구체적으로 시겔라 종 및 혈청그룹(혈청형) 중 어느 하나, 예를 들어 하기의 그룹 중 어느 하나의 독성 균주로부터 유래한다:

·혈청그룹 A: 시겔라 다이센테리아에(12 혈청형)

·혈청그룹 B: 시겔라 플렉스네리(15 혈청형 및 하위혈청형)

·혈청그룹 C: 시겔라 보이디이(18 혈청형)

·혈청그룹 D: 시겔라 손네이(1 혈청형)

약독화를 목적으로 본 발명에 사용된 바와 같은 독성 시겔라 균주는 임상적으로 공지된 독성 균주 또는 독성 인자를 함유하는 것으로서 동정된 균주일 수 있다. 구체적으로 상기 균주는 시겔라 플렉스네리, 시겔라 손네이, 시겔라 다이센테리아에 및 시겔라 보이디이 중 어느 하나, 특히 시겔라 플렉스네리 2a, 예를 들어 시겔라 플렉스네리 2a 2457T(ATCC 700930, DNA = 700930D-5) 및 CIP 107659(인스티튜트 파스퇴르(Institute Pasteur), 프랑스 소재)로부터 선택된다.

상기 독성 시겔라 균주를, 생성 균주를 약독화하는, 특히 무독성으로 하는, 환자에게서 질병을 유발할 수 없도록 하는 수회의 연속 계대배양, 온도 민감성 약독화, 돌연변이 등을 포함한, 당해 분야에 공지된 방법들에 의해 변형시킬 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 독성 균주의 변형은, 독성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 발현의 감소 또는 억제를 포함한 유전자의 결실 및/또는 불활성화를 생성시키거나 또는 비-작용성 독성 인자의 발현을 유도한다.

예를 들어 폴리뉴클레오티드 발현을 감소시키거나 없애기 위해서 약독화 돌연변이를 획득하기 위한 당해 분야에 널리 공지된 다수의 기법들이 존재한다. 예를 들어, 돌연변이를 재조합 DNA-기술을 사용하여 소정의 부위, 예를 들어 프로모터 영역 또는 암호화 서열내에 도입시켜 넌센스 돌연변이를 생성시킬 수 있다. 재조합 DNA 기법은 관심 유전자의 암호화, 부위-지향된 돌연변이유발에 의한 유전자 서열의 변형, 제한 효소 절단에 이은 재-연결 및 돌연변이 유전자에 의한 야생형 유전자의 후속 치환을 포함한다.

적합한 표준 재조합 DNA 기법들이 당해 분야에 공지되어 있으며 특히 문헌[Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989), 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory press)]에 개시되어 있다.

상기 약독화 돌연변이를, 야생형 유전자의 DNA 서열을 벡터, 예를 들어 플라스미드내로 클로닝하고, 임의로 선택성 마커를 상기 클로닝된 DNA 서열내에 삽입하거나 또는 상기 DNA 서열의 일부를 결실시켜 불활성화시킴을 포함하는, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 결실을, 예를 들어 상기 DNA 서열을 상기 암호화 서열내 또는 바로 바깥의 2 개 지점에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 절단하고 남아있는 서열에서 두 단부를 함께 연결함으로써 도입시킬 수 있다. 한편으로, 표적 유전자의 측면에 인접한 영역이 별도로 증폭되고, 사이에 낀 표적 서열을 생략하면서, 별도의 중복 PCR 반응에서 직접 함께 연결되는 돌연변이 대립유전자를 제작할 수 있다. 상기 돌연변이된 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 공지된 기법, 예를 들어 일렉트로포레이션 화학적 형질전환 또는 접합에 의해 상기 세균내로 형질전환시킬 수 있다. 이어서 적합한 선택에 의해 돌연변이체를 동정할 수 있으며, 여기에서 상기 불활성화된 DNA 서열은 상기 세균의 염색체내로 재결합되었고 야생형 DNA 서열은 상동 재조합에 의해 비-작용성으로 되었다.

더욱 또한, 항생제 내성 유전자를 사용하는 경우, 상기 유전자는 일반적으로 상기 유전자가 백신에 사용되기 전에 세균으로부터 제거된다. 다트센코(Datsenko) 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 6640-6645 (2000))의 방법에 따라 돌연변이유발은 암호화된 플라스미드와 염색체 유전자 모두의 특이적인 파괴를 허용하는 람다 박테리오파지 레드 리콤비나제 시스템을 기본으로 한다. 상기 전략은 상기와 같은 유전자를, 예를 들어 선택성 항생제 내성 유전자(이는 표적 유전자에 대해 40 내지 60 nt 상동 연장부를 갖는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 생성됨)로 치환하는 것이다. 상기 레드-기본 재조합은 상기 상동성 서열에서 매개된다. 선택에 이어서, 상기 항생제 내성 유전자를 또한, 상기 항생제 내성 유전자의 측면에 인접하는 FRT 직접 반복부(FLP 인식 표적)를 사용하는 FLP 리콤비나제를 발현하는 헬퍼 벡터를 사용하여 제거할 수 있다.

일부 실시태양에서, 돌연변이를 염색체 또는 염색체외 DNA, 예를 들어 플라스미드 중의 소정의 부위에, 삽입, 결실, 또는 한 뉴클레오티드의 또 다른 것에 의한 치환, 예를 들어 점 돌연변이를 통해 도입시킬 수 있으며, 이는 발현이 감소되거나 없는 돌연변이 유전자를 유도한다. 상기 돌연변이는 이질을 일으키는 능력이 감소된 시겔라 균주를 생산할 것이다. 바람직하게는, 상기 돌연변이는 결실 돌연변이이며, 이때 상기 유전자의 파괴는 핵산의 절제에 의해 유발된다. 상기와 같은 돌연변이는, 예를 들어 연속된 길이의 염기쌍의 결실에 의해 수행될 수 있다. 매우 작은 결실, 예를 들어 10 염기쌍의 범위조차도 상기 유전자가 단백질을 암호화할 수 없게 또는 비-작용성 단백질 암호화하게 할 수 있다. 하나의 단일 염기쌍의 결실조차도, 상기와 같은 돌연변이의 결과로서 다른 염기쌍들이 더 이상 정확한 판독 프레임 중에 있지 않거나 또는 전사가 억제되거나 감소되기 때문에, 단백질을 암호화하지 못하게 하거나 비-작용성 단백질을 암호화하게 할 수 있다. 보다 바람직하게, 보다 긴 범위, 예를 들어 100 염기쌍 또는 적어도 유전자의 상당 부분, 예를 들어 상기 유전자의 적어도 50%가 제거된다. 훨씬 더 바람직하게는 전체 유전자가 결실된다.

단편 또는 전체 유전자, 또는 이들의 조합의 결실을 수반하는 잘-한정되고 의도적으로 수행된 돌연변이가, 고전적으로 유도된 돌연변이(야생형으로 복귀되지 않을 것임)에 비해 유리하다. 따라서, 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 백신 균주는 독성 인자를 암호화하는 유전자의 돌연변이가 상응하는 단백질을 생산하지 않거나 상기 단백질이 비-작용성이도록 상기 독성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 파괴하는 결실 또는 삽입을 포함한다.

약독화된 시겔라 균주를 가공하기 위해 선택되는 예시적인 독성 인자는 rfb, ipaB, ipaC 또는 aroC이다.

상기 약독화는 예를 들어 하기의 유전자들 및 그의 (상당) 부분 중 하나 이상, 또는 상기 유전자의 약독화를 초래하는 상기 유전자의 조절인자 중 어느 하나의 결실 및/또는 불활성화에 의해 일어날 수 있다: rfb, aroA, aroC, aroD, aroE, virG 및 ipaA-D. 본 발명의 바람직한 약독화된 시겔라 균주는 적어도 3 개 이상의 약독화 돌연변이를 갖는 이중 돌연변이 또는 다중 돌연변이 균주이다. 약독화 돌연변이를 위한 표적 유전자의 바람직한 조합은 적어도 하나의 rfb 유전자(예를 들어 rfb F, D, C, E, J 및/또는 I 유전자) 및 적어도 하나의 ipa 유전자(예를 들어 ipaB, ipaC)를 포함한다.

유전 공학으로부터 생성되는 약독화 돌연변이에 대한 대안으로서, 무독성이거나 생백신 균주로서 사용될 수 있는 독성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 하나 이상의 기존 돌연변이를 포함하는 천연 시겔라 균주를 동정하는 것도 또한 가능할 것이다. 상기 천연 시겔라 균주는 일단 표준 기법에 의해 단리되었으면, 추가적인 돌연변이유발 또는 재조합 DNA 기법을 가하여 이중 또는 다중 돌연변이 균주를 제작할 수 있다.

독성 인자를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 돌연변이를 갖는 세균의 동정 기법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 따라서, 상술한 기법들에 의해 돌연변이된 시겔라 균주의 결실을 위한 통상적인 기법은 본 발명의 어딘가에 개시되어 있는 바와 같은 노던 및 웨스턴 블럿팅, PCR, ELISA 및 세포독성 분석을 포함한다. 특정한 독성 인자를 암호화하는 비작용성 유전자를 갖는 돌연변이 균주를 표준 기법을 사용하여 쉽게 선택할 수 있다.

약독화하려는 독성 인자를 암호화하는 유전자는 플라스미드-매개일 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서 독성 시겔라 균주에 대한 변형은 하나 이상의 내인성 시겔라 플라스미드를 돌연변이시킴을 포함한다. "플라스미드"란 용어는 구체적으로 세균 염색체와 독립적으로 복제하는 세포질 DNA를 지칭한다. 상기 시겔라 독성 또는 침입 플라스미드의 일부의 돌연변이 또는 심지어 플라스미드의 제거가 고려될 수 있다. 그러나, 상기 약독화된 시겔라가 여전히 내인성 침입 플라스미드, 보다 바람직하게는 안정한 침입 플라스미드를 포함하는 것이 바람직하다. 이는 특히 상기 약독화된 세포에 의한 상기 침입 플라스미드의 잠재적인 손실, 또는 야생형 시겔라로부터 유래한 (고유) 침입 플라스미드의 잠재적인 흡수(불안정한 균주 또는 불안정한 침입 플라스미드에 의해 발생할 수 있음)에 관하여 상기 약독화된 균주의 안정성을 보장한다.

상기 시겔라 침입 플라스미드는 대부분의 시겔라 균주에서 내인성이다. 상기 침입 플라스미드가 시겔라 균주의 배양시 상실될 수도 있지만, 상기 플라스미드를, 높은 수준의 안정성을 나타내는 재조합 플라스미드가 수득되도록 가공할 수 있으며, 이는 상기 플라스미드를, 항원, 특히 보호 항원을 암호화하는 이종 유전자를 통합시키기에 유용한 벡터로서의 개발에 매력적인 표적으로 만든다.

이후 본 발명에 개시되는 실시예에서 수득되는 본 발명의 재조합 침입 플라스미드는 도 5 및 10a에 나타낸 바와 같은 특징들을 갖는다.

본 발명의 플라스미드는 시겔라에서 자율적으로 복제가 가능한 그의 유도체를 포함한다. 상기와 같은 유도체는 상기 침입을 맡고 있는 영역 이외의 부분이 제거된 상기 침입 플라스미드에 상응하는 것, 또는 또 다른(이종) DNA 서열이 삽입된 상기 침입 플라스미드에 상응하는 것일 수 있다. 이에 의해 시겔라에서 자율적으로 복제가 가능한 적합한 셔틀 벡터를 수득할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 발명에 따른 약독화된 시겔라 생백신 균주 중 어느 하나, 또는 장침입성 대장균을 포함한, 침입 플라스미드를 통합할 수 있는 임의의 다른 세균에 사용할 수도 있다.

상기 내인성 시겔라 침입 플라스미드는 당해 분야에 잘 특성화되어 있으며, 이러한 지식은 적합한 번식 조건뿐만 아니라 상기와 같은 플라스미드 중 재조합 부위, 예를 들어 ntd 103187-103328 사이, IS100 내지 ipaJ 유전자 사이의 위치(이들 위치는 시겔라 플렉스네리 2a 301 균주의 pCP301 침입 플라스미드에 대해 측정됨)의 선택을 알려준다.

상기 플라스미드는 바람직하게는 단일 사본 플라스미드로서 사용된다.

본 발명의 플라스미드를 단리된 형태로, 예를 들어 세포로부터 플라스미드 DNA를 제조하기 위한 통상적인 방법에 의해 상기 시겔라 세포로부터 세포질의 DNA 분획을 제조함으로써 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 DNA 분획을 밀도-구배 원심분리 방법, 아가로스 젤 전기영동 등에 의해 정제할 수 있다.

셔틀 벡터의 제작을 위해서, 전체 서열 또는 그의 일부를 사용할 수 있다. 그의 일부를 사용하는 경우, 상기와 같은 부분은 전형적으로 상기 플라스미드의 복제를 맡고 있는 영역을 함유하지만, 상기 복제에 불필요한 영역은 제외시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 복제에 필요한 영역을, 상기 플라스미드를 제한 효소로 절단하여 수득한 일부를 시겔라에서 자율적으로 복제 가능한 플라스미드에 연결하고, 또 다른 세균, 예를 들어 또 다른 시겔라 균주 또는 대장균 균주를 상기 수득한 재조합 플라스미드로 형질전환시키고, 상기 재조합 플라스미드가 상기 형질전환체에 잠복 여부를 측정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 백신을 약독화된 세균 백신의 제형화에 대해 공지된 기법을 사용하여 제형화할 수 있다. 상기 백신을 유리하게는 경구 투여를 위해서, 예를 들어 수용액으로서, 또는 투여전에 적합한 완충액 중에서 재조성하기 위해서 건조된 분말로서 제공한다. 재조성을 유리하게는 상기 세균의 생육성을 보장하기에 적합한 pH의 완충액으로 수행한다. 상기 약독화된 세균 및 백신을 위 산도로부터 보호하기 위해서, 보호제, 예를 들어 나트륨 바이카보네이트를 상기 백신의 각각의 투여시 투여하는 것이 유리하다. 한편으로, 상기 백신을 동결건조된 캡슐화된 형태로 제공한다.

백신 균주를 약학적으로 허용 가능한 비히클 중에서, 예를 들어 스프레이로서 또는 음식물 및/또는 수중에 혼합하여 투여하거나 또는 적합한 담체, 희석제, 보조제 또는 부형제, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 글루코스 등과의 혼합물로 전달할 수 있다. 상기 백신 균주는 목적하는 투여 경로 및 제제에 따라, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 항원보강제, 젤화 또는 점도 증대용 첨가제, 보존제, 풍미제, 착색제 등을 함유할 수 있다. 약학 조성물 및 약제의 제조를 위한 약학 담체는 교과서, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990), 18th Edition (Mack Publishing Co.)]에 설명된 바와 같이, 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명의 백신 균주를 의학 또는 수의학 분야의 숙련가에게 널리 공지된 투여량 및 기법에 의해, 수용 환자의 연령, 성별, 체중, 종 및 조건 및 투여 경로와 같은 인자들을 고려하여 투여할 수 있다. 상기 투여 경로는 경피, 점막 투여(예를 들어 경구, 비, 항문, 질)를 통해 또는 비경구 경로(피내, 근육내, 피하, 정맥내 또는 복강내)를 통해 있을 수 있다. 백신 균주를 단독으로 투여하거나, 또는 다른 치료제 또는 요법과 함께 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 투여형은 현탁액, 시럽 또는 엘릭서, 및 비경구, 피하, 경피, 근육내 또는 정맥내 투여(예를 들어 주사가능한 투여)를 위한 제제, 예를 들어 멸균 현탁액 또는 유화액을 포함할 수 있다.

상기 백신을 환자, 특히 인간, 또는 달리, 구체적으로 돼지를 포함한 온혈 포유동물의 백신접종에 사용할 수 있다.

본 발명의 백신 균주를, 일단 생성되었으면, 능동 면역요법의 과정 중에, 구체적으로 백신접종에 의해, 장 질병, 구체적으로 시겔라 및 임의로 이종 장 또는 설사 병원균에 의해 유발된 이질을 예방하기 위해서 환자에게 투여할 수 있다. 이를 교차-보호성이고/이거나 다가인 본 발명에 따른 백신 중 어느 하나에 의해 성취할 수 있다.

따라서, 본 발명의 교차-보호성 및/또는 다가 백신에 의해 표적화된 시겔라 및 임의로 다른 미생물, 예를 들어 설사 미생물에 의해 유발된 감염을 유효 용량의 본 발명에 따른 백신의 투여에 의해 예방하거나 치료할 수 있다. 상기 사용되는 투여량은 최종적으로 의사의 판단에 의할 수 있으나, 상기 환자의 신체크기 및 체중 및 제형화된 백신의 유형을 포함한 다양한 인자들에 따라 다를 것이다. 그러나, 용량당 10⁷ 내지 10¹¹, 예를 들어 10⁸ 내지 10¹⁰ 세균의 경구 투여를 포함하는 투여량이 70 ㎏ 성인 인간 숙주에 편리할 수 있다.

따라서, 시겔라 및 임의로 다른 미생물, 특히 병원균에 의해 유발된 감염을 유효 용량의 본 발명에 따른 백신의 투여에 의해 예방하거나 치료할 수 있다. 상기 사용되는 투여량은 최종적으로 의사의 판단에 의할 수 있으나, 상기 환자의 신체크기 및 체중 및 제형화된 백신의 유형을 포함한 다양한 인자들에 따라 다를 것이다. 그러나, 용량당 10⁷ 내지 10¹¹, 예를 들어 10⁸ 내지 10¹⁰ 세균의 경구 투여를 포함하는 투여량이 70 ㎏ 성인 인간 숙주에 편리할 수 있다.

특정한 실시예들에 따라, 원형 시겔라 플렉스네리 2a 균주의 약독화된 동질유전자 돌연변이체를 제작하였다. 상기 돌연변이체는 O-항원(ΔrfbF)을 합성할 수 없거나 또는 -잘-증명된 백신 접근법을 나타내는 경우- 영양요구성이었다(ΔaroC). 마우스 폐 모델에서 상기 돌연변이체들의 독성은 필적하는 약독화 수준을 나타내었다. 후속으로, 우리는 Ipa를 암호화하는 침입 플라스미드가 결여된 2 개의 돌연변이체(콩고 레드 음성/CRN/돌연변이체)의 유도체를 단리하였다. 상기 후자의 돌연변이체 중 침입 표현형의 상실은 검출할 수 없는 수준까지 추가로 약독화를 증가시켰다. O-항원(ΔrfbF CRP), 또는 ipa 단백질(ΔaroC CRN), 또는 이들 항원 모두(ΔrfbF CRN)가 결여된, 또는 어느 것도 결여되지 않은(ΔaroC CRP) 상기 일련의 시겔라 플렉스네리 2a 돌연변이체들을 사용하여 마우스를 비내로 치사량에 가까운 용량으로 면역화시켰다. 후속으로, 마우스를 치사 용량의 이종 시겔라 플렉스네리 6(도 1a) 또는 시겔라 손네이(도 1b) 야생형 균주에 의해 접종하였다. ipa 및 O-항원을 모두 발현하는 약독화된 돌연변이체(Δaro CRP)는 모의 백신접종된 마우스에서 관찰된 수준 이상의 보호를 제공할 수 없었다. 대조적으로, 2 개의 주요 면역원성의 항원 그룹이 모두 결여된 이중 돌연변이체는 2 개의 이종 접종 균주 모두에 대해 높은 보호를 이끌어내었다. 독성 플라스미드 단독(ΔaorC CRN) 상실의 경우에조차도 교차-보호를 개선시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 확인하기 위해서, 마우스의 그룹들을 시겔라 손네이 단리물의 I기(Ipa 및 O-항원 양성) 및 II기(Ipa 및 O-항원 음성) 변체로 또한 면역화시켰다. 상기 II기 백신 균주는 시겔라 플렉스네리 6에 의한 접종에 대해 높은 보호를 제공한 반면, 완전히 독성인 I기 균주에 의한 면역화는 염수에 의해 제공된 경우와 그다지 상이하지 않은 생존을 제공하였다(도 1c).

개선된 교차-보호가 상기 돌연변이체 배경(즉 우성 항원의 상실시 - 도 2 참조)에서 부 항원의 증가된 면역원성으로부터 기원한다는 개념을 지지하기 위해서, 상기 면역화된 마우스로부터 수득된 혈청 및 기관지폐포 세척술(BAL) 샘플들의 면역 반응성을, 주 항원 그룹을 둘다 발현하거나 또는 이중 어느 것도 발현하지 않는 전체 세균 세포상에서 ELISA에서 비교하였다(도 3).

상기 ΔaroC CRP(ipa 및 O-항원 모두 양성) 돌연변이체를 백신접종한 마우스로부터 수득된 BAL이 침입성의 평활한 동종 표적에 더 면역반응성이었으며, 이는 이들 항원이 실제로 상기 면역 반응을 지배함을 입증한다. 반대로, 상기 백신 균주상의 면역우성 항원(ΔrfbF CRN)의 상실은 O- 및 Ipa 항원이 없는 동종 표적 균주에 대해 개선된 면역반응성을 생성시켰다.

더욱 또한, 상기 이종 시겔라 손네이 균주는 이중 돌연변이체에 의해 백신접종된 마우스로부터 수득된 BAL에 의해 보다 쉽게 인식되었다. 이러한 결과는 상기 표적에 접근하기 쉬운 부 항원을 공유하는 것들에 대해 보다 높은 역가의 점막 항체가 존재함을 입증한다. 흥미롭게도, 이러한 현상은 혈청 IgG의 경우에 뚜렷하지 않으며(데이터 도시 안 됨), 이는 혈청 IgG보다 오히려 sIgA가 상기 모델에서 보호를 매개함을 보이는 초기의 발견을 지지한다.

현행 백신 접근법(일반적으로뿐만 아니라 특히 시겔라에 대한)은 주 면역원성 항원의 사용에 의존한다. 그러나, 면역 반응을 피하기 위해서, 진화 압력은 혈청형들 중에서 병원균을 분류하는 토대를 형성하는 다수의 면역학적으로 독특한 상기 항원의 변체를 선택하였다. 따라서, 혈청형-결정 주 항원의 사용은, 모든 혈청형이 상기 백신 중에 포함될 수 있지 않는 한(예를 들어 폴리오바이러스 백신의 경우에), 병원균에 대해 단지 부분적인 보호만을 부여할 수 있다. 가장 우세한 혈청형들의 조합은 비교적 넓은 보호를 제공할 수 있지만, 이는 혈청형 교체로 인해 일시적일 수 있다(즉 덜 통상적인 혈청형은 상기 백신 혈청형의 근절에 의해 개방된 틈의 충전을 드러냄). 이는 때때로, 예를 들어 다가 백신 중에 추가적인 혈청형을 포함시킴에 의한 백신 최적화를 필요로 한다. 그러나, 항원 경쟁 및 간섭과 같은 현상뿐만 아니라 재정적인 고려사항들로 인해, 망라되는 혈청형의 최대수는 제한된다.

다른 한편으로, 주어진 세균성 병원균의 다양한 혈청형들은 그들의 표면상에서 막대한 수의 보존된 항원을 공유한다. 이들이 보존되어 남아있을 수 있다는 사실은 이들이 상기 표면상에서 쉽게 접근될 수 없고/없거나(보호 항원이 아님) 이들의 작용이 병인에 매우 필수적이어서 이들의 항원 구조에 변형을 허용하지 않음을 암시한다. 이는 고도로 보존되고(침입시 복잡한 작용으로 인해) 매우 면역원성이며, 아마도 오직 표적 세포에 접촉시 발현되기 때문에 여전히 교차-보호를 이끌어낼 수 없고, 따라서 아마도 항체-매개된 보호 기전에 이용될 수 없는 시겔라 ipa 단백질에 의해 예시된다.

구체적으로 우리는 ipa 및 O 항원과 같은 면역우성 항원이 상기 면역 반응을 부 항원에 대해 더 적은 항체가 발생되게 하는 방식으로 강탈함을 입증한다(도 2). Ipa가 보호성이 아니고 O-항원이 고도로 가변성인 한, 시겔라는 상기 면역 반응을 효율적으로 피할 수 있다. 그러나, 우리는 상기 부류의 항원의 결실이 생백신 균주의 교차-보호 잠재력을 대단히 개선시켰음을 입증한다.

상기 침입 플라스미드 돌연변이에 관하여, 콩고 레드 양성의 상실에 근거한 상기 침입 플라스미드의 자발적인 결실 돌연변이를 선택하는 대신에, 상기 플라스미드는 그대로 두면서 상기 ipaB 및 C 유전자를 제거할 수 있다.

더욱이, 상기 플라스미드를 상기 염색체에서부터 상기 침입 플라스미드로의 필수 유전자, 예를 들어 ppa의 이식에 의해 안정화시킬 수 있다.

더욱 또한, 외래(이종) 항원, 예를 들어 ETEC LTB 및 돌연변이된 STa(STm) 독소의 발현이 가능하다. STm은 바람직하게 하나 이상의 점 돌연변이를 함유한다. 구체적으로 바람직한 STm은

NSSNYCCELCCXXACTGCY(서열번호 1)이고, 여기에서

12번 위치의 X는 N, K 또는 R이고/이거나,

13번 위치의 X는 P, G, L 또는 F이고, 여기에서

상기 STm은 야생형 서열:

NSSNYCCELCCNPACTGCY(서열번호 2)을 제외한다.

점 돌연변이의 바람직한 조합은 P13F와 함께 N12K 또는 N12R이다.

더욱 또한, 실시예는 공유된 보존된 항원의 상대 면역원성이 상기 백신 균주 중에서 주 항원의 부재하에 증가하였음을 입증한다. 상기 결실은 보호 범위를 개선시킬 뿐만 아니라 상기 백신 균주를 대단히 무독성으로 만들기 때문에, 상기 이중 돌연변이체는 대단히 높은 용량에서조차 매우 안전한 것으로서 간주된다. 더욱이, 생 경구 백신은 제조하기에 비교적 저렴하고, 투여를 위해 숙련된 의료인이 필요하지 않으며, 이는 풍토성 국가에서 표적 집단을 고려할 때 중요한 인자이다.

하기 정의들의 주제는 본 발명의 실시태양들로 간주된다:

1. LPS O 항원이 결여된 거친 시겔라 균주, 바람직하게는 비-침입성 균주를 기본으로 하는 약독화된 시겔라 생백신.

2. 정의 1에 따른 백신으로, 상기 LPS 합성, 운반 및 발현에 관련된, 바람직하게는 rfb의 클러스터 중의 유전자들, 및 O-항원 합성을 암호화하는 rfb/wbb 유전자 클러스터내 하나 이상의 유전자, O-항원 리가제를 암호화하는 waaL, O-항원 운반에 관련된 O-항원 플립파제를 암호화하는 wzx, O-항원 중합에 관련된 wzy/rfc, LPS-코어 합성을 암호화하는 rfa/waa 유전자 클러스터내 유전자, O-항원 발현에 영향을 미치는 조절성 유전자, 예를 들어 rfaH, 또는 기능(들)의 상실이 O-항원의 발현을 적어도 90% 감소시키는 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 유전자의 돌연변이유발에 의해 약독화된다.

3. 정의 1 또는 2에 따른 백신에서, 상기 돌연변이유발은 rfb F, D, C, E, J 및/또는 I 유전자 중 하나 이상의 결실, 또는 그의 일부 또는 다양한 시겔라 혈청형 중 상응하는 유전자의 결실에 의한다.

4. 정의 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 백신에서, 상기 시겔라 균주는 시겔라속으로부터, 예를 들어 임의의 시겔라 혈청형 또는 종, 특히 시겔라 플렉스네리, 시겔라 손네이, 시겔라 다이센테리아에 및 시겔라 보이디이로부터 선택된다.

5. 정의 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 백신에서, 상기 시겔라는 교차-반응성 외막 단백질을 발현한다.

6. 정의 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 백신으로, 시겔라의 상이한 혈청형 및 종에 대해서, 특히 시겔라 플렉스네리 2a, 시겔라 플렉스네리 6 및 시겔라 손네이 중 어느 하나, 또는 장침입성 대장균에 대해 교차-보호성이다.

7. 정의 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 백신에서, 상기 시겔라는 상기 침입 플라스미드의 추가의 돌연변이유발, 특히 ipaB 및/또는 ipaC 유전자 및/또는 다른 ipa 유전자의 결실에 의해 비-침입성이다.

8. 정의 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 백신에서, 상기 시겔라는 예를 들어 세균 세포 표면상에서 이종 항원을 분비하거나 상기 항원을 발현하도록 상기 항원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 재조합 내인성 침입 플라스미드를 포함한다.

9. 정의 8에 따른 백신에서, 상기 항원은

- 세균성 항원, 바람직하게는 독소 또는 콜로니화 인자,

- 바이러스성 항원, 바람직하게는 장 또는 점막 감염을 유발하는 병원균으로부터의 항원,

- 진균성 항원, 바람직하게는 장 또는 점막 감염을 유발하는 병원균으로부터의 항원, 및

- 기생충성 항원, 바람직하게는 장 감염을 유발하는 병원균으로부터의 항원

으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

10. 정의 9에 따른 백신에서, 상기 세균성 항원은 장병원성 세균으로부터 기원하며, 바람직하게는

a. 대장균 항원, 특히 ETEC의 LTB, 돌연변이된 LTA 및 ST, 이들의 서브유닛 또는 융합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 장독소, 장응집성 대장균(EAEC)으로부터의 항원, 또는 시가-형 독소 1 또는 2

b. 캄필로박터 제주니 항원,

c. 클로스트리디움 디피실레 항원, 구체적으로 독소 A 및 B

d. 비브리오 콜레라 항원, 구체적으로 CT-B 항원, 및

e. a), b), c) 또는 d)의 돌연변이 또는 융합 단백질

로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

11. 정의 10에 따른 백신에서, 상기 ETEC는 LTB와 돌연변이체 ST(STm)의 융합 장독소, 특히 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 STm을 포함하는 융합 단백질이다.

12. 정의 10에 따른 백신에서, 상기 바이러스성 항원은 바람직하게는 로타바이러스 및 칼리시바이러스, 예를 들어 노로 바이러스로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 설사 바이러스로부터 기원한다.

13. 정의 10에 따른 백신에서, 상기 기생충성 항원은 바람직하게는 지아르디아 람블리아, 크립토스포리디움 종 및 엔타메바 히스톨리티카로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 설사-유발 원생동물로부터 기원한다.

14. 정의 10에 따른 백신에서, 상기 진균성 항원은 바람직하게는 블라스토마이세스 더마티디티스 및 히스토플라스마 종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 설사-유발 진균으로부터 유래한다.

15. 정의 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 백신에서, 상기 시겔라는 필수 염색체 유전자의 결실 및 상기 유전자의 상기 침입 플라스미드내로의 삽입, 특히 ppa 유전자, 또는 accD, acpS, dapE, era, frr, ftsI, ftsL, ftsN, ftsZ, infA, lgt, lpxC, msbA, murA, murI, nadE, parC, proS, pyrB, rpsB, trmA, rho 및 rhoL 중 어느 하나를 추가로 포함한다.

16. 감염성 질병, 특히 장 질병, 예를 들어 설사 또는 이질을 예방하기 위해서 환자의 능동 면역요법에 사용하기 위한, 정의 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 백신.

17. 정의 16에 따라 사용하기 위한 백신에서, 상기 장 질병은 임의의 시겔라 혈청형 또는 종에 의해 유발된다.

18. 정의 16 또는 17에 따라 사용하기 위한 백신에서, 상기 면역요법은 상기 백신을 점막 또는 경구 제형으로 투여함을 포함한다.

19. 정의 16 내지 18 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 백신에서, 상기 백신을 경구 또는 비내 투여한다.

20. 정의 16 내지 19 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 백신에서,

- 병원균의 보호 항원을 내인성 침입 플라스미드내에 통합시킴으로써 상기 시겔라의 보호 항원 및 시겔라 이외 종의 적어도 하나의 병원균을 발현하는 다가 백신이 사용되고, 여기에서

- 상기 감염성 질병은 임의의 시겔라 혈청형 또는 종 및/또는 상기 병원균에 의해 유발된다.

21. 상기 rfbF 및 상기 ipaB 및/또는 ipaC 유전자의 결실, 또는 그의 필수 부분의 결실을 갖는, 시겔라 플렉스네리 2a 균주인 시겔라 균주.

22. 정의 21에 따른 시겔라 균주로, 이종 항원을 발현하거나 상기 항원을 분비하도록 상기 항원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포함하는 재조합 침입 플라스미드를 포함한다.

23. 정의 21 또는 22에 따른 시겔라 균주로, 필수 염색체 유전자의 결실 및 상기 유전자의 침입 플라스미드내로의 삽입을 추가로 포함한다.

24. 적어도 하나의 이종 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 돌연변이된 시겔라 침입 플라스미드를 기본으로 하는 재조합 플라스미드로, 여기에서 상기 플라스미드는 상기 ipaB 및/또는 ipaC 유전자 중 적어도 하나에서 돌연변이된다.

25. 정의 24에 따른 벡터를 포함하는 세균성 숙주 세포로, 여기에서 상기 숙주 세포는 시겔라, 에스케리키아, 살모넬라, 캄필로박터 및 예르시니아 속 중에서 선택된다.

26. 정의 25에 따른 숙주 세포로, 상기 벡터는 내인성 침입 플라스미드이다.

상기 설명은 하기의 실시예들을 참조하여 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예들은 단지 본 발명의 하나 이상의 실시태양의 실시 방법을 나타낼뿐이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 판독해서는 안 된다.

실시예

실시예 1: 약독화된 시겔라 균주의 제조

방법

세균 균주 및 배양 조건

세균을 루리아 베르타니(LB) 브로쓰 또는 아가 플레이트에서 통상적으로 증식시켰다. ipa 단백질을 발현하는 완전한 침입 플라스미드의 검출을 위해서 0.01% 콩고 레드 염료(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))가 보충된 트립신작용 대두 아가(TSA) 플레이트를 사용하였다. 신선한 배양물은 항상 콩고 레드-양성(CRP) 콜로니로부터 출발하여 플라스미드 운반을 확실히 하였다. 적합한 경우 배지에 하기 농도의 항생제를 보충하였다: 암피실린 100 ㎍/㎖, 가나마이신 100 ug/㎖, 클로람페니콜 25 ㎍/㎖.

서열분석된 원형 시겔라 플렉스네리 2a 균주 2(균주 2457T, ATCC 700930)를 돌연변이유발을 위한 모 균주로서 사용하였다. aroC 및 rfbF 유전자의 불활성화를 앞서 개시된 레드 리콤비나제 기법에 의해 수행하였다(Levine, M.M., et al. Nat. Rev. Microbiol. 5, 540-553 (2007)). aroC의 결실은 방향족 화합물을 합성할 수 없는 영양요구성 돌연변이체를 생성시킨다. RfbF는 O-항원 서브유닛의 합성에 관련되며, 그의 상실은 거친 LPS 표현형을 생성시킨다. 상기 돌연변이의 생성 및 확인에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 도 4에 보충 표 1로서 제공한다(서열번호 3 - 10). 후속으로 돌연변이체 2457TΔaroC::kan 및 2457TΔrfbF::cat를 콩고 레드(CR) 아가 플레이트상에서 배양하여 CR-양성(CRP) 및 CR-음성(CRN) 콜로니를 선택하였다. 상기 침입 플라스미드상에서 암호화된 독성 결정인자의 상실을 PCR에 의해 확인하였다. 유사하게, 시겔라 손네이의 I기 및 II기 돌연변이체를 CR 플레이트상에서 분화시켰다. I기는 침입 플라스미드-함유 야생형 시겔라 손네이 균주의 전통적인 명칭인 반면, II기는 플라스미드-상실된 균주를 지칭한다. O-항원 합성이 또한 상기 종 중의 상기 독성 플라스미드상에서 암호화되기 때문에, II기 변체는 비-침입성이면서 거칠다. 상기 접종 연구에 사용된 야생형 시겔라 플렉스네리 6 및 시겔라 손네이 균주는 세균성 이질의 임상적 사례들로부터 단리되었다. 이들의 혈청형을 상업적인 분류 혈청(마스트 어슈어(Mast Assure)(상표); 마스트 그룹 리미티드(Mast Group Ltd.), 영국 머지사이드 소재)을 사용하여 슬라이드 응집에 의해 측정하였다.

동물 실험

모든 생체내 연구를 앞서 개시된 마우스 폐 모델에서 수행하였다(van de Verg et al., Infect Immun 63: 1947-1954, 1995). 6 내지 8주된 암컷 BALB/c 마우스를 5 ㎎/㎖의 케타민(칼립솔(Calipsol), 리히터 게데온(Richter Gedeon), 헝가리 소재) 및 0.3 ㎎/㎖ 자일라진(프리마신(Primasine), 알파산(Alfasan))의 혼합물로 복강내로 마취하였다.

감염을 필요한 CFU의 세균을 함유하는 50 ㎕의 접종물(염수로 희석됨)로 비내로 수행하였다. 세균수를 상기 접종물로부터의 일련의 희석물의 도말에 의해 밝혔다. 50 퍼센트 치사 용량(LD50 값)을 문헌[Reed and Muench, Oaks, EV, et al. Infect. Immun. 53: 57-63, 1986]에 따라 0.5 log-연속 희석(10⁵ - 10⁸ CFU)에 의해 감염으로부터 계산하였다. 백신접종을 치사량에 가까운 용량의 세균(균주 2457T로부터 10⁶ CFU의 CRP 돌연변이체 및 10⁸ cfu의 CRN 돌연변이체; 10^5.5 CFU의 I기 및 10^7.5 CFU의 II기 시겔라 손네이)으로 2-주 간격으로 2회 수행하였다. 대조군은 염수를 수용하였다. 파일럿 연구에서 모든 백신 균주가 3일 p.i.이내에 제거되는 것으로 나타났다. 추가 면역화후 2주째에 마우스를 치사 용량의 시겔라 플렉스네리 6 또는 시겔라 손네이 야생형 균주로 접종하였다.

후속으로, 치사율을 14일 동안 모니터하였다. 한편으로, 면역화된 마우스를 상기 추가접종 및 기관지폐포 세척액(BAL) 및 혈액 샘플을 수거한 후 2주째에 죽였다. BAL의 수거를 위해서 마취된 마우스의 기관을 무딘 바늘로 캐뉼라 삽입을 위해 준비하고 200 ㎕ 염수를 주사하고 각 마우스의 기관지로부터 회수하였다.

ELISA

신선한 CR 플레이트로부터 접종된 세균을 LB 브로쓰에서 밤새 증식시켰다. 96-웰 플레이트(C.E.B., 프랑스 소재)를 4 ℃에서 카보네이트 완충제(pH 9.5) 중의 0.1 ㎖의 세척된 세균 현탁액(5 x 10⁸ CFU/㎖)으로 밤새 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척하고, 이어서 실온에서 1 시간 동안 2% BSA(시그마-알드리치)를 함유하는 PBS로 차단하였다. BAL 및 혈청 샘플을 0.5% BSA를 함유하는 PBS로 희석하고 37 ℃에서 1 시간 동안 상기 항원-코팅된 플레이트와 함께 배양하였다. 상기 플레이트에 걸쳐 일련의 희석을 수행하였다. 3회의 세척 후에, 플레이트를 HRPO(다코(Dako) A/S, 덴마크 소재)와 접합된 항-마우스 IgG(혈청 IgG의 경우) 또는 항-마우스 IgA(BAL 샘플의 경우) 면역글로불린으로 탐침하였다. 상기 ELISA 기질은 H₂O₂를 함유하는 시트르산 완충제 중에 용해된 o-페닐렌다이아민(시그마-알드리치)이었다. OD를 통상적인 ELISA 플레이트 판독기상에서 492 ㎚에서 측정하였다. 면역반응성을 동일한 희석비(1:10)로 Δaro CRP BAL 샘플의 반응성과 관련하여 나타내었다. 평균+SEM을 4 개의 독립적인 분석으로부터 계산하였다.

통계학적 분석

상기 50% 치사 용량을 리드와 민츠(Reed and Muench) 6의 통계학적 방법으로 계산하였다. 생존 곡선의 통계학적 분석을 윈도우용 그래프패드 프리즘 버전 5.00을 사용하여 로그랭크(LogRank)(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 시험으로 수행하였다. BAL의 IgA 역가를 만-휘트니 비모수 분석으로 비교하였다. p 값은 0.05 미만인 경우 유의수준으로 간주되었다.

결과

약독화된 시겔라 플렉스네리 2457T(혈청형 2a) 백신 균주로 면역화되고 야생형 시겔라 균주가 접종된 동물의 생존 곡선을 근거로, 이종 접종 환경에서 rfbF 유전자 결실이 침입 플라스미드의 상실과 겸비되어 상승적인 보호 효과가 관찰되었다. 상기 동물을 이종 시겔라 플렉스네리 6 균주로 접종시 콩고 레드 양성(CNR, 완전한 침입 플라스미드) 시겔라 플렉스네리 2a ΔrfbF 균주의 경우에 비해 콩고 레드 음성(CNR, 침입 플라스미드 결실된) 시겔라 플렉스네리 2457T(2a) ΔrfbF 균주에 의한 면역화에 의해 현저하게 더 양호한 보호가 성취되었다(도 1b). 야생형 시겔라 플렉스네리 544 균주(2a)에 의한 동종 접종의 경우에, 상기 두 백신 균주는 모두 동등하게 보호성이었으며, 이는 동종 접종의 경우 상기 rfbF 유전자의 결실조차 충분함을 암시한다(도 1a). 백신접종 효능의 차이는 부분적으로, 상기 ΔrfbF-침입 플라스미드 이중 돌연변이체의 보다 높은 허용 가능한 치사량에 가까운 접종 용량과 관련있는 듯하지만, 상기 이중 돌연변이체로서 필적하는 접종 용량으로 사용된 CRN Δaro(대조용) 균주가 동종 및 이종 접종 실험 모두에서 부분적인 보호를 유도하였으므로 완전히 해명될 수는 없다(도 1a,b).

이종 접종에 대해 현저한 보호를 성취하는 상기 rfbF 유전자 및 침입 플라스미드를 불활성화하는 돌연변이의 이로운 효과에 대한 추가적인 증거는 시겔라 손네이 백신 균주의 사용에 의해 제공된다. 시겔라 손네이 II기 변체(상기 침입 복합체 및 rfbF 유전자 모두의 발현을 맡고 있는 침입 플라스미드가 결실된)에 의한 면역화는 야생형 시겔라 플렉스네리 542 균주(혈청형 6)의 치사량 접종에 대해 높은 수준의 보호를 제공한 반면, 상기 야생형 시겔라 손네이 균주 I기 변체(상기 침입 복합체 및 rfbF 유전자를 갖는 완전한 침입 플라스미드)는 낮은(통계학적으로 유의수준이 아닌) 보호 효과를 나타내었다(도 1c).

실시예 2: 침입 플라스미드상에 합성 유전자 구조물을 갖는 시겔라 플렉스네리 2a 2457 돌연변이체의 제조

돌연변이체 제작을 위한 공급원 물질은 상술한 바와 같은 ATCC 균주 시겔라 플렉스네리 2a 2457T이다. rfbF 및 ipaB 및 ipaC 유전자뿐만 아니라 ppa 유전자의 결실을 레드 리콤비나제 기법을 사용하여 수행한다(Datsenko,K.A. & Wanner,B.L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 6640-6645 (2000)).

단계 1: 상기 rfbF 유전자를 염색체로부터 제거하였다. 상기 RfbF의 결여는 표현형 변화와 관련된다: 상기 시겔라 균주는 아가 플레이트상에서 육안으로 검출될 수 있는 전형적인 형태적 변화로 "거칠게" 된다. 이러한 표현형 변화가 관찰되었지만, 상기 rfbF 유전자의 성공적인 제거는 또한 PCR 분석에 의해 확인되었다. 이는 야생형 또는 돌연변이된 시겔라로부터의 게놈 DNA에 의해 수득된 PCR 산물의 상이한 길이에 근거하였다(도 8).

단계 2: 상기 ipaB 및 ipaC 유전자를 상기 침입 플라스미드로부터 제거하였다. 이들 유전자는 이웃하며 상기 rfbF 유전자 결실에 적용된 동일한 레드 리콤비나제 기법에 의해 함께 결실되었다. 상기 유전자 결실은 또한 표현형을 생성시킨다: 상기 시겔라는 염료 콩고 레드를 흡수하는 능력을 상실하고 따라서 적색인 아생형 플라스미드를 갖는 시겔라와 대조적으로 콩고 레드 함유 아가상에 백색 콜로니를 형성한다. 시겔라는 시험관내 배양 동안 자발적으로 그의 플라스미드를 상실할 수 있기 때문에, 상기 ipaB 및 ipaC 유전자의 결실은 상기 돌연변이체의 PCR 분석에 의해 확인되었으며, 이는 야생형 플라스미드에 비해, 상기 돌연변이체에 의해 수득된 보다 짧은 PCR 단편들에 근거하였다(도 9).

단계 3: 상기 ETEC 독소 LT-B 및 ST의 발현을 구동할 뿐만 아니라 상기 염색체로부터 상기 침입 플라스미드내로 필수 유전자(ppa)를 이식하는 상기 합성 유전자의 삽입(도 10a 참조). 상기 LTB-mST 융합 유전자의 성공적인 도입은 유전자 조작 영역의 부위 특이적인 PCR 증폭에 의해 입증되었다(도 10b). 시겔라로부터 독소 융합 유전자의 발현을 면역블럿팅에 의해 시험하였다(도 10c). 상기 염색체(시겔라의 증식에 필수적인)로부터 ppa 유전자의 제거는 최종 백신 균주로부터 앰플리콘의 보다 짧은 길이에 근거한 PCR에 의해 입증되었다.

모든 유전자 조작은 항생제 내성 유전자의 삽입을 수반하였다. 각 단계 후에 항생제 내성을 맡고 있는 유전자들이 문헌[Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 6640-6645 (2000)]에 개시된 바와 같이 헬퍼 플라스미드에 의해 제거되었다.

실시예 3: 실시예 2의 돌연변이 균주를 시험하기 위한 동물 보호 연구

동질유전자 돌연변이 균주 대 그의 모 야생형 균주의 독성 약독화가 세균성 이질의 마우스 폐 모델에서 입증되었다. 마우스의 그룹을 각 균주의 최소 치사 용량을 측정하기 위해서 상이한 세균성 균주의 10배 연속 희석물(10⁶ 내지 10⁸ cfu)로 비내 감염시켰다. 상기 야생형 균주의 경우에, 10⁶, 10⁷ 및 10⁸ cfu/마우스 용량에서 각각 30, 50 및 100% 치사율이 밝혀졌다. 대조적으로, 상기 시험된 용량 중 어느 용량에서도 동질유전자 돌연변이체 2457TΔrfb, 2457TΔipaBC, 또는 이중 돌연변이체 2457TΔrfbΔipaBC 중 어느 것으로부터도 마우스는 죽지 않았다. 이러한 결과는 상응하는 유전자의 결실시 모든 돌연변이체의 높은 독성 약독화를 암시한다.

후속으로, 마우스의 그룹을 동일한 모델에서 치사량에 가까운 용량의 야생형 균주 2457T(5 x 10⁵ cuf/마우스) 또는 그의 동종유전자 결실 돌연변이체 2457TΔrfb, 2457TΔipaBC, 2457TΔrfbΔipaBC(모두 10⁸ cfu/마우스에서)로 면역화시키거나 또는 단지 PBS만으로 모의 면역화시켰다. 3 회의 동등한 면역화를 2-주 간격으로 수행하였다. 최종 추가 접종 후 1주째에 마우스를 (앞서 최적화된) 치사 용량(2 x 10⁶ cfu/마우스)의 시겔라 손네이 균주로 접종하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 야생형 균주에 의한 면역화는 보호를 제공할 수 없었던 반면, 단일 자리 돌연변이체(2457TΔrfb 또는 2457TΔipaBC)는 각각 단지 부분 보호만을 이끌어내었다. 대조적으로, 상기 이중 돌연변이체(2457TΔrfbΔipaBC)는 상기 이종 시겔라 종에 의한 감염에 대해 충분한 보호를 제공할 수 있었다.

<110> EveliQure Biotechnologies GmbH <120> A novel live attenuated Shigella vaccine <130> IPA150167-AT-D1 <150> EP 12183347.9 <151> 2012/09/06 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> artificial <220> <223> bacterial antigen <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(12) <223> X can be N, K or R wherein Sequence NSSNYCCELCCNPACTGCY is excluded <220> <221> PEPTIDE <222> (13)..(13) <223> X can be P, G, L or F, wherein Sequence NSSNYCCELCCNPACTGCY is excluded <400> 1 Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Xaa Xaa Ala Cys Thr 1 5 10 15 Gly Cys Tyr <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Escherichia Sp. <400> 2 Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr 1 5 10 15 Gly Cys Tyr <210> 3 <211> 63 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 cgcacgggct ggcgctcggc tgctgcatcg tcgatggtgt tccgtgtagg ctggagctgc 60 ttc 63 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 tatcagtctt cacatcggca ttttgcgccc gctgccgtaa catatgaata 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Claims (13)

1. 내인성 침입 플라스미드의 돌연변이에 의해 비-침입성(non-invasive)이며, O-항원 합성을 암호화하는 rfb/wbb 유전자 클러스터 내 유전자, O-항원 리가제를 암호화하는 waaL, O-항원 운반에 관련된 O-항원 플립파제(flippase)를 암호화하는 wzx, O-항원 중합에 관련된 wzy/rfc, LPS-코어 합성을 암호화하는 rfa/waa 유전자 클러스터 내 유전자, 및 rfaH 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 결실 및/또는 불활성화시키는 돌연변이에 의해 얻어지는 거친(rough) LPS 표현형을 가지는 돌연변이 시겔라 균주를 포함하는, 시겔라 생백신.
2. 제1항에 있어서, 상기 시겔라 균주가 시겔라 플렉스네리(S. flexneri), 시겔라 손네이(S. sonnei), 시겔라 다이센테리아에(S. dysenteriae) 및 시겔라 보이디이(S. boydii)로 이루어진 군에서 선택되는, 시겔라 생백신.
3. 제1항에 있어서, 시겔라 플렉스네리 및 시겔라 손네이를 포함하는 시겔라의 상이한 혈청형 및/또는 종에 대해 교차-보호성인, 시겔라 생백신.
4. 제1항에 있어서, 상기 내인성 침입 플라스미드의 돌연변이가 ipaB 유전자, ipaC 유전자, 또는 임의의 다른 ipa 유전자의 적어도 하나의 결실 및/또는 불활성화를 포함하는, 시겔라 생백신.
5. 제1항에 있어서, 상기 내인성 침입 플라스미드의 돌연변이가 이종 항원을 분비하거나 또는 세균 세포 표면상에서 이종 항원을 발현하도록 상기 이종 항원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 통합(incorporate)시키는 것을 포함하는, 시겔라 생백신.
6. 제5항에 있어서, 상기 항원이 하기 그룹으로부터 선택되는, 시겔라 생백신:
   - 세균성 항원,
   - 바이러스성 항원,
   - 진균성 항원, 및
   - 기생충성 항원.
7. 제6항에 있어서, 상기 세균성 항원이, 이열성 독소의 B 서브유닛(LTB), 내열성 독소(ST), 또는 이들의 서브유닛 또는 융합물, 바람직하게는 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 STm을 포함하는 LTB/STm을 포함하는, 장독소 (ETEC)인, 시겔라 생백신.
8. 제1항에 있어서, 개체의 감염성 질병을 예방하기 위해 사용되는, 시겔라 생백신.
9. 제8항에 있어서, 경구 또는 비내 투여되는, 시겔라 생백신.
10. 제8항에 있어서, 병원균의 보호 항원을 내인성 침입 플라스미드 내에 통합시킴으로써 시겔라 이외 종의 적어도 하나의 병원균의 보호 항원 및 시겔라의 보호 항원을 발현하는 다가 백신이 사용되고,
    상기 감염성 질병이 임의의 시겔라의 혈청형 또는 종, 및/또는 상기 병원균에 의해 유발되는, 시겔라 생백신.
11. 하기 단계를 포함하는 시겔라 생백신의 제조방법:
    - 병원성 시겔라 균주를 제공하는 단계;
    - O-항원 합성을 암호화하는 rfb/wbb 유전자 클러스터 내 유전자, O-항원 리가제를 암호화하는 waaL, O-항원 운반에 관련된 O-항원 플립파제(flippase)를 암호화하는 wzx, O-항원 중합에 관련된 wzy/rfc, LPS-코어 합성을 암호화하는 rfa/waa 유전자 클러스터 내 유전자, 및 rfaH 유전자로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 결실 및/또는 불활성화시키는 돌연변이, 및 내인성 침입 플라스미드의 돌연변이에 의해 병원성 시겔라 균주를 변형시켜 거칠고 비-침입성인 시겔라 균주를 얻는 단계; 및
    - 상기 거칠고 비-침입성인 시겔라 균주를 포함하는 백신을 제형화하는 단계.
12. 제11항에 있어서, LPS 합성, 운반 및 발현에 관련된 적어도 하나의 유전자가 적어도 하나의 rfb 유전자를 포함하고/하거나 내인성 침입 플라스미드의 돌연변이가 적어도 하나의 ipa 유전자의 결실 및/또는 불활성화를 포함하는, 제조방법.
13. 제11항에 있어서, 추가로 이종 항원을 발현 및/또는 분비하도록 이종 항원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 통합시키는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.

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