CN107683332A

CN107683332A - 用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物

Info

Publication number: CN107683332A
Application number: CN201680029466.1A
Authority: CN
Inventors: 金才旭; 金珉贞; 宋万基
Original assignee: International Vaccine Institute
Current assignee: International Vaccine Institute
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2018-02-09
Also published as: US10426826B2; US20180133300A1; WO2016171524A1

Abstract

本发明涉及志贺菌菌株，其中，由于志贺菌属菌种的wzy基因的破坏，而使存在于细胞膜上的保护性抗原的表面暴露增加；并且涉及含有志贺菌突变株作为活性成分的用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物。由于编码O‑糖类抗原的聚合所必需的蛋白质的基因被删除，本发明的志贺菌菌株的细胞壁的厚度变薄，结果，普遍存在于不同的志贺菌属菌种中的膜抗原(包括蛋白质抗原)更多地暴露至免疫细胞，并且因此所述志贺菌菌株可有利地用作疫苗组合物以用来治疗或预防源自志贺菌属不同菌种的志贺菌病。

Description

用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物

技术领域

本发明涉及用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物，更具体而言，涉及能够有效地用于疫苗组合物中以预防源于志贺菌属各菌种的志贺菌病(这是因为存在于细胞膜上的保护性抗原的表面暴露由于志贺菌菌种的wzy基因的破坏而增加)的志贺菌(Shigella)菌株，以及用于治疗或预防志贺菌病的包含该菌株的疫苗组合物。

背景技术

志贺菌属(Shigella sp.)是一种革兰氏阴性细菌病原体，在人体内通过感染结肠的上皮细胞而导致志贺菌病(shigellosis)。志贺菌主要感染肠上皮细胞，表达数种蛋白质，提供了用于递送效应物的机制，该效应物诱导了通过吞噬作用进行的向宿主细胞中的细菌摄入。为了完成效应物的注射，志贺菌使用III型分泌(TTS)系统以诱导进入上皮细胞并触发受感染的巨噬细胞的细胞凋亡。

志贺菌属(包括痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、福氏志贺菌(S.flexneri)、鲍氏志贺菌(S.boydii)和宋内志贺菌(S.sonnei))的细菌是引起人类的志贺菌病的原因。志贺菌病是特征在于结肠上皮破坏的疾病，在发展中国家每年导致100万人死亡。痢疾志贺菌有15种血清型，福氏志贺菌有14种血清型和亚型，鲍氏志贺菌有20种血清型，并且宋内志贺菌有1种血清型，但这些菌株的致病率(prevalence)并不均匀分布。

虽然有可能采用抗生素来控制和治疗志贺菌病的暴发，但抗生素的高成本和抗生素耐药性的志贺菌属(甚至针对最新的抗生素)的不断出现，强调了需要有效的疫苗来帮助在全球的发展中地区控制志贺菌疾病和相关的肠侵袭性大肠杆菌疾病。

天然的志贺菌感染赋予免疫力，并提供抵抗随后的同源的毒性的志贺菌感染的保护。流行病学和志愿者研究揭示了抵抗志贺菌的保护性免疫针对的是LPS或O-特异性抗原，并因此与志贺菌的血清型相关。关于志贺菌疫苗已经进行了许多研究，包括使用活的减毒志贺菌、死的志贺菌全菌以及与载体(如蛋白体、破伤风类毒素和核糖体)缀合的志贺菌脂多糖(LPS)或O-多糖。尽管经过了多年的广泛研究，然而，还没有获得任何有效且廉价的抵抗这些志贺菌属菌种的疫苗。

当将减毒的志贺菌菌株用作活的口服疫苗时，其已被证明诱导了保护效力(protective efficacy)。遗传学上良好表征的侵袭性志贺菌疫苗的临床试验结果是有希望的。在志愿者试验中，已经证明了口服给予CVD1208疫苗、SC602疫苗、WRSS1疫苗和WRSd1疫苗是安全的且产生免疫性，并且尤其是SC602保护免于志贺菌病。使用CVD1208的临床试验表明，可通过消除来自疫苗菌株的sen基因和set基因来减少使用一些活的志贺菌疫苗时观察到的轻度发热和腹泻的症状。在6个亚洲国家对志贺菌腹泻的研究表明，从患者中分离的志贺菌属菌种的相对分布随着不同的国家和地点变化。此外，福氏志贺菌的血清型在各地之间、甚至在年与年之间是高度不均匀分布的。志贺菌属菌种和血清型的不均匀分布表明，需要多价志贺菌疫苗或交叉保护的志贺菌疫苗来预防世界各地的志贺菌病。旨在赋予广泛覆盖范围的疫苗可能需要包括所有重要的志贺菌血清型。为了解决这样的困境，已经提出了基于使用“五价制剂”(包括减毒的宋内志贺菌菌株和痢疾志贺菌1菌株、以及福氏志贺菌2a菌株、福氏志贺菌3a菌株和福氏志贺菌6菌株)的疫苗策略。另一方面，使用由源自志贺菌的血清型特异性抗原和交叉反应性抗原组成的复合结构(例如死的全菌体或者减毒的活的全菌)例如已被认为是一种有希望的途径，用来接种疫苗抵抗由志贺菌的最常见菌种和血清型引起的感染(WO 2010/046778A2)。

同时，在志贺菌属的情况中，由于wzy酶(O-抗原聚合酶)的作用，细胞壁上存在丰厚的O-多糖，因此存在于细胞膜上且为该菌种共有或特有的各种蛋白质抗原被埋在细胞壁中而阻断了向免疫细胞的暴露。因此，该类蛋白质抗原在用于抵抗志贺菌的免疫力方面有很多限制。

发明内容

技术问题

因此，本发明的一个方面是提供其中的交叉保护性抗原的表面暴露增加的基因工程化的志贺菌菌株，以及使用该志贺菌菌株的用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供了志贺菌菌株，其中，由于志贺菌属菌种的wzy基因的破坏而使存在于细胞膜上的保护性抗原的表面暴露增加。

根据本发明的一个示例性实施方式，wzy基因可具有选自于由SEQ ID NO：1至SEQID NO：5所组成的组中的一个碱基序列，但本发明不限于此。

根据本发明的另一示例性实施方式，所述保护性抗原可为IcsP2蛋白或SigA2蛋白，但本发明不限于此。根据本发明的优选的示例性实施方式，所述IcsP2蛋白可具有SEQID NO：6所示的氨基酸序列，且所述SigA2蛋白可具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，但本发明不限于此。

根据本发明的一个示例性实施方式，所述志贺菌属菌种可选自于由痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌所组成的组。根据本发明的优选的示例性实施方式，所述志贺菌属菌种可选自于由以下所组成的组：痢疾志贺菌1型、痢疾志贺菌2型、福氏志贺菌2a、福氏志贺菌3a、福氏志贺菌5a、福氏志贺菌5b、福氏志贺菌6、鲍氏志贺菌血清型4、鲍氏志贺菌7和宋内志贺菌482-79，但本发明不限于此。

并且，本发明提供了用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物，该组合物包含上述的志贺菌菌株，在该菌株中由于志贺菌属菌种的wzy基因的破坏而使存在于细胞膜上的保护性抗原的表面暴露增加。

根据本发明的一个示例性实施方式，所述志贺菌菌株可为减毒菌株，该减毒菌株可选自于由活的菌株和死的菌株所组成的组。

根据本发明的另一示例性实施方式，所述疫苗组合物可进一步包含佐剂，并且所述佐剂可选自于由以下所组成的组：铝盐、免疫刺激复合物(ISCOM)、基于皂苷的佐剂、水包油乳剂、油包水乳剂、toll样受体配体(如胞壁酰二肽)、大肠杆菌(E.coli)LPS、包含未甲基化的DNA的寡核苷酸、聚(I:C)、脂磷壁酸、肽聚糖、霍乱毒素、不耐热的大肠杆菌肠毒素、百日咳毒素以及志贺毒素，但本发明不限于此。

根据本发明的一个示例性实施方式，所述疫苗组合物可通过注射给予或通过粘膜途径给予，但本发明不限于此。根据本发明的优选的示例性实施方式，所述疫苗组合物可通过皮下注射、真皮内注射或肌内注射给予，并且所述粘膜途径可选自于由口服、口腔、舌下、鼻内和直肠所组成的组，但本发明不限于此。

根据本发明的一个示例性实施方式，所述疫苗组合物的有效剂量可处于约10μg至约2mg的范围内，但本发明不限于此。

有益效果

因为编码O-糖类抗原的聚合所需的蛋白质的基因被删除，所以本发明的志贺菌菌株的细胞壁的厚度减小。因此，由于普遍存在于不同的志贺菌属菌种中的膜抗原(包括蛋白质抗原)更多地暴露至免疫细胞，所述志贺菌菌株可以有效地用作疫苗组合物，以用来治疗或预防源于志贺菌属各菌种的志贺菌病。

附图说明

图1为示意性地显示出野生型志贺菌菌株和根据本发明的ΔWZY志贺菌菌株的细胞壁结构的图解。

图2显示了使用银染色法的脂多糖(LPS)分析的结果。通过14％Tris/Tricine SDSPAGE(30ng/泳道；在福氏志贺菌2a WT和ΔWZY的情况下，16.5％凝胶和100ng/泳道)和银染色法分析源自野生型志贺菌菌株和ΔWZY菌株的LPS。从野生型中观察到对LPS(O-抗原聚合)而言特异性的梯状条带，但是这种条带从ΔWZY中消失。

图3a至图3c为说明激发(challenge)后的实验动物的存活率的图表。每隔2周用ΔWZY对小鼠进行鼻内免疫三次。最后一次免疫一周后，用福氏志贺菌2a或福氏志贺菌6以及痢疾志贺菌对小鼠进行鼻内激发。每天监测动物的存活。*表示使用对数秩检验的p<0.05的值。

图4a至图4c为说明ΔWZY在小鼠中提供抵抗志贺菌的同源激发的保护的图表。每隔2周用活的ΔWZY、福尔马林灭活的ΔWZY(FI ΔWZY)或各阳性菌株(福氏志贺菌2a-SC602、福氏志贺菌6-0.13％FI野生型以及宋内志贺菌-4％FI野生型)对小鼠进行鼻内免疫三次。最后一次免疫一周后，用福氏志贺菌2a 2457T或福氏志贺菌6以及宋内志贺菌对小鼠进行鼻内激发。每天监测动物的存活。每组使用5-6只小鼠。

图5a和图5b为说明异源保护的存活测试的结果的图表。每隔2周用活的ΔWZY、福尔马林灭活的ΔWZY(FI ΔWZY)或各阳性菌株(福氏志贺菌2a-SC602、福氏志贺菌6-0.13％FI野生型以及宋内志贺菌-4％FI野生型)对小鼠进行鼻内免疫三次。最后一次免疫一周后，用福氏志贺菌2a 2457T或福氏志贺菌6对小鼠进行鼻内激发。每天监测动物的存活。每组使用5只小鼠。

图6a和图6b为说明ΔWZY免疫在小鼠中诱导全身性体液免疫应答和局部免疫应答的图表。每隔2周用5μg的活的SC602、活的福氏志贺菌2a(ΔWZY)、福氏志贺菌2a(0.13％FIΔWZY)以及福氏志贺菌2a(0.13％FIΔWZY+dmLT)各自对小鼠进行鼻内免疫三次。第三次免疫后六天，从各个小鼠中收集血清，并通过ELISA检测IgG。*表示使用t检验(n＝4-5)的p<0.05的值。

图7a至图7e为说明细菌上的PSSP的表达的流式细胞分析的结果的图表(使用抗PSSP-1(＝IcsP2)抗体)。与野生型志贺菌相比，在ΔWZY中检测到更大量的IcsP。假定为外膜蛋白IcsP在野生型菌株中被O-多糖掩埋，但是由于一个单元的O-抗原(one unit O-antigen)的长度较短，在ΔWZY的表面上容易被检测到。

具体实施方式

本发明提供了志贺菌菌株，其中，由于志贺菌属菌种的wzy基因的破坏而使存在于细胞膜上的保护性抗原的表面暴露增加；以及提供了用于治疗或预防志贺菌病的包含所述志贺菌菌株的疫苗组合物。

根据本发明的一个示例性实施方式，通过破坏wzy(O-抗原聚合酶)基因来制备减毒的志贺菌菌株(下文称为“ΔWZY”)。根据本发明的优选的示例性实施方式，通过破坏wzy(O-抗原聚合酶)基因来制备减毒的福氏志贺菌2a菌株，并且所得的福氏志贺菌2a ΔWZY仅表达一个单元的O-抗原，因此与野生型菌株相比，其细胞壁的厚度显著降低(见图1)。根据本发明的另一示例性实施方式，与天然菌株相比，ΔWZY菌株显示出表面蛋白质抗原的增加的暴露。

根据本发明的优选的示例性实施方式，本发明的志贺菌菌株在细胞壁上的多糖的厚度减小，因此显示出掩埋于野生型菌株的细胞壁中的潜在的保护性抗原的表面暴露增加。因此，使用如上所述的由于wzy基因的破坏而使其细胞壁厚度减小的突变菌株的免疫策略可有效地应用于对其它革兰氏阴性细菌以及志贺菌属的免疫。

根据本发明的一个示例性实施方式，当所述福氏志贺菌2a ΔWZY通过鼻内给予小鼠时，小鼠被保护抵抗由属于不同种和血清型的菌株(包括福氏志贺菌2a、福氏志贺菌6和痢疾志贺菌1)诱导的实验性肺炎。

根据本发明的一个示例性实施方式，制备了志贺菌属的其它的ΔWZY菌株(如宋内志贺菌482-79(pWR105)ΔWZY、痢疾志贺菌2 ΔWZY和福氏志贺菌6 ΔWZY)，并且动物实验被计划用于抵抗志贺菌激发的交叉保护，随后进行伴随有或没有佐剂(dmLT)的ΔWZY免疫(EBNorton,L.B.Lawson,L.C.Freytag,J.D.Clements,Characterization of a mutantEscherichia coli heat-labile toxin,LT(R192G/L211A),as a safe and effectiveoral adjuvant,Clin Vaccine Immunol 18(2011)546-551)。

根据本发明的优选的示例性实施方式，本发明所述的经基因修饰的志贺菌菌株(具有增强的常见外膜蛋白质的暴露)的预防接种可单独使用或作为志贺菌疫苗制剂的一种组分与佐剂组合使用。

根据本发明的一个示例性实施方式，本发明公开的志贺菌菌株可与药学上可接受的稀释剂一起给予。这种制剂可通过注射(皮下、真皮内或肌内)给予，或者可使用贴片(adhesive patch)局部施用到皮肤上。另一方面，所述疫苗可使用药学上可接受的媒介物通过粘膜途径(口服、口腔、舌下、鼻内、滴鼻剂、直肠)给予。所述志贺菌菌株也可与佐剂混合以改善随后发生的免疫应答。这种佐剂的实例可包括：铝盐、ISCOM、基于皂苷的佐剂、水包油乳剂和油包水乳剂、toll样受体配体(如胞壁酰二肽)、大肠杆菌LPS、包含未甲基化的DNA的寡核苷酸、聚(I:C)、脂磷壁酸和肽聚糖，但本发明不限于此。活性衍生物(如霍乱毒素、不耐热的大肠杆菌肠毒素、百日咳毒素、志贺毒素及类似物)可用作肠毒素及其佐剂。

根据本发明，包括通常用于分子免疫学、细胞免疫学、药理学和微生物学中的各种手段和技术可落入本发明的技术精神和范围内。此类手段和技术在本领域普通技术人员已知的各种现有技术文献中具体公开。

在本申请书中公开的缩写对应于如下的技术、性质、化合物或测量的单位：“min”代表分钟、“h”代表小时、“μL”代表微升、“mL”代表毫升、“mM”表示毫摩尔、“M”表示摩尔、“mmole”表示毫摩尔、“kb”表示千碱基、“bp”表示碱基对、并且“IU”表示国际单位。

术语“聚合酶链式反应”缩写为PCR；术语“逆转录聚合酶链式反应”缩写为RT-PCR；术语“非翻译区”缩写为UTR；术语“十二烷基硫酸钠”缩写为SDS；而术语“高压液相色谱”缩写为HPLC。

本发明中使用的术语DNA的“扩增”表示使用聚合酶链式反应(PCR)来提高DNA序列混合物中的某种DNA序列的浓度。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”或“碱基序列”是在核酸(如DNA和RNA)中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并代表两个以上的核苷酸的任何链。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括由细胞机器用来产生蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链的或单链的基因组和cDNA、RNA、任何合成的多核苷酸和基因操纵的多核苷酸，以及正义多核苷酸和反义多核苷酸(尽管在本发明中仅示出了正义链)。这包括单链分子和双链分子(即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA的杂合体)以及通过将碱基缀合至氨基酸骨架而形成的“蛋白质核酸”(PNA)。这也包括含有经修饰的碱基(例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶)的核酸。

在本发明中，所述核酸可两侧连接天然调控(表达控制)序列，或者可与包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、抑制子、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5'-非编码区和3'-非编码区等在内的异源序列相连接。所述核酸也可通过本领域已知的多种手段进行修饰。这种修饰的非限制性实例包括：甲基化、“盖帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、以及核苷酸间修饰(例如，诸如用不带电荷的键(linkage)(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)进行的修饰以及用带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)进行的修饰)。多核苷酸可例如含有一个或多个额外的共价连接的部分，例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷化剂(alkylator)。所述多核苷酸可通过形成甲基磷酸三酯键或乙基磷酸三酯键或烷基氨基磷酸酯键来进行衍生化。在本发明中，所述多核苷酸也可用能够直接或间接提供可检测信号的标签进行修饰。示例性的标签包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。

术语“核酸杂交”是指反向平行的氢在两个单链核酸之间的键合，其中A与T(或在RNA核酸中为U)配对，并且C与G配对。在给定的严格度的条件下，当一个核酸分子的至少一条链可与另一核酸分子的互补碱基形成氢键时，核酸分子彼此是“可杂交的”。杂交的严格度(stringency)例如通过如下确定：(i)进行杂交和/或洗涤时的温度、以及(ii)离子强度、以及(iii)变性剂(例如甲酰胺)在杂交液以及洗涤液中的浓度，以及其它参数。杂交需要两条链含有基本上互补的序列。然而，取决于杂交的严格度，可允许一定程度的错配。在“低严格度”条件下，较高百分比的错配是可容忍的(即，将不会阻止反向平行杂交体的形成)。

通常而言，具有高严格度的两条链的杂交要求这两条链在其长度的延伸部分上具有展现出高度互补性的序列。高严格度的条件的实例包括：在65℃下，在0.5M NaHPO₄、7％SDS和1mM EDTA中与结合至过滤器的DNA进行杂交，随后在68℃下于0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(其中1×SSC包含0.15M NaCl和0.15M柠檬酸钠)，或者在大约37℃下于6×SSC/0.5％焦磷酸钠中洗涤寡核苷酸分子(在大约14个核苷酸长度的寡核苷酸的情况下)；在大约48℃下于6×SSC/0.5％焦磷酸钠中洗涤寡核苷酸分子(在大约17个核苷酸长度的寡核苷酸的情况下)；在大约55℃下于6×SSC/0.5％焦磷酸钠中洗涤寡核苷酸分子(在20个核苷酸长度的寡核苷酸的情况下)；以及在大约60℃下于6×SSC/0.5％焦磷酸钠中洗涤寡核苷酸分子(在23个核苷酸长度的寡核苷酸的情况下)。因此，术语“高严格度杂交”是指仅当两条链具有几乎完全互补的核苷酸序列时，其中的两条链将配对以形成“杂交的”螺旋的溶剂和温度的组合。

中间或中等的严格度条件(例如，在65℃下的2×SSC的水溶液；任选地，例如在65℃下于0.5M NaHPO₄、7％SDS和1mM EDTA中与结合至过滤器的DNA杂交，随后在42℃下于0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤)以及低严格度条件(例如，在55℃下的2×SSC的水溶液)要求两条链具有相应较少的在其两条序列之间发生杂交所必需的整体互补性。任何给定严格度的杂交反应的某些温度和盐的条件取决于目标DNA的浓度以及探针的碱基组成和长度，并且通常在常规的初步实验中凭经验来确定。

如在本发明中所用的，术语“标准杂交条件”是指允许具有至少75％序列一致性的序列进行杂交的杂交条件。根据具体的示例性实施方式，可使用具有较高严格度的杂交条件来仅允许具有至少80％序列一致性、至少90％序列一致、至少95％序列一致性或至少99％序列一致性的序列进行杂交。

与本发明的任何期望的核酸“杂交”的核酸分子可具有任意长度。在一个示例性实施方式中，这种核酸分子的长度为具有至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个和至少70个核苷酸。在另一示例性实施方式中，待杂交的核酸分子具有与某些期望的核酸基本上相同的长度。

术语“分离的”意味着将目标材料从环境(在其中通常发现该目标材料)中移出。因此，分离的生物材料可不含细胞组分，即，在其中发现或产生生物材料的细胞的组分。例如，分离的核酸分子包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA或限制性片段。例如，分离的核酸分子还包括插入质粒、粘粒、人工染色体等中的序列。分离的核酸分子优选从在其中可发现该核酸分子的基因组中切除。更优选地，当在基因组中被发现时，分离的核酸分子不连接至非调控序列、非编码序列或位于该核酸分子的上游或下游的其它基因。分离的蛋白质可与其它蛋白质或核苷酸或两者相结合，所述分离的蛋白质与其它蛋白质或核苷酸在细胞中结合；或者当分离的蛋白质是膜结合蛋白时，所述分离的蛋白质与细胞膜结合。

术语“宿主细胞”包括可为用于载体的受体(recipient)或用于并入多核苷酸分子的受体、或可具有受体的个体细胞或细胞培养液。在本发明中，宿主细胞可为细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞。

术语病症、紊乱或症状的“治疗”或“医治”包括：

(1)在可能患有或倾向于患有病症、紊乱或症状但尚未经历或表现出病症、紊乱或症状的临床或亚临床征象的哺乳动物中，预防或延缓病症、紊乱或症状的临床或亚临床征象的出现；或者

(2)抑制病症、紊乱或症状，即，阻止、减少或延缓疾病的发作或者其复发(在维持治疗的情况下)或者其临床或亚临床征象之一；或者

(3)缓解疾病，即引起病症、紊乱或症状或者其临床或亚临床征象之一的消退。

对将被治疗的受试者的益处或者在统计学上是显著的，或者至少可被患者或医疗医师察觉到。

“免疫应答”是指对宿主中感兴趣的组合物或疫苗进行的细胞介导的免疫应答和/或抗体介导的免疫应答的发展。这种应答通常在受试者中进行，产生特异性地针对包含在感兴趣的组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或特异性的细胞毒性T细胞。免疫应答还可包括其活性超出感兴趣的生物体的调节性T细胞，并因此可抑制其它免疫应答或变应性应答。

“治疗有效量”是指当为了治疗病症、紊乱或症状的目的而给予哺乳动物时，足以实现这种治疗的化合物、佐剂或疫苗组合物的量。“治疗有效量”将随着如下而变化：待给予的化合物、细菌或类似物；和疾病及其严重程度；以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重、身体状况和响应性。

“预防有效量”是指以预期的剂量和期望的时间段达到期望的预防结果的有效的量。通常而言，由于预防剂量在疾病之前或疾病的较早阶段使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。

尽管为了治疗目的可使用本发明提供的组合物，但是所述组合物可优选以药物制剂的形式(例如，相对于预期的给予途径和标准的药学实践选择的合适的药学上的赋形剂、稀释剂或载体的混合物)给予。因此，根据本发明的一个方面，提供了包括至少一种活性组合物或其药学上可接受的衍生物以及与药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体相结合的药物组合物或制剂。所述赋形剂、稀释剂和/或载体在与制剂的其它成分相容并且对其受体无害方面应是“可接受的”。

本发明的组合物可被配制为以任何便利的方式给予，从而用于人或脊椎动物的药物中。因此，本发明的范围包括含有适用于人或脊椎动物的药物中的本发明的产品的药物组合物。

根据优选的示例性实施方式，药物组合物作为液体口服制剂而被方便地给予。尽管制剂的递送没有物理限制，但是因为口服递送简单方便且口服制剂容易容纳额外的混合物(例如奶、酸奶和婴儿配方)，优选口服递送。其它口服制剂在相关领域是公知的，包括片剂、囊片、软胶囊、胶囊和医疗食品。例如，所述片剂可通过熟知的压制技术(使用湿法制粒方法、干法制粒方法或流化床制粒方法)来制造。

借助于一种或多种合适的赋形剂、稀释剂和载体，可提供此类口服制剂用来以常规方式使用。药学上可接受的赋形剂辅助生物活性材料制剂的形成或使该形成成为可能，并且包括稀释剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、着色剂和其它成分。也可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。所述防腐剂的实例包括苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸的酯。也可使用抗氧化剂和助悬剂。只要赋形剂在摄取时良好耐受且是无毒的，并且不会干扰生物活性材料的吸收以及执行赋形剂的期望的功能，则该赋形剂是药学上可接受的。

用于治疗用途的可接受的赋形剂、稀释剂和载体在药学领域是公知的，并且药物赋形剂、稀释剂和载体的选择可依据预期的给予途径和标准的药学实践进行选择。

如在本发明中所使用的，短语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物通常被认为是生理上可耐受的。

术语“患者”、“靶标”或“受试者”是指哺乳动物，并且包括人和兽医靶标。

含有佐剂的佐剂制剂或疫苗组合物的剂量将随着疾病的性质、患者的病史、给予频率、给予方式、试剂从宿主中的清除等而广泛地变化。初始剂量可能会较大，随后的维持剂量较小。所述剂量可每月或每年不规律地给予，以维持有效的免疫记忆。

术语“载体”是指与化合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体可为无菌液体，如水、以及油(包括石油、动物油、植物油或合成来源的油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等))。优选采用水或水溶液、盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油水溶液作为载体、尤其是用于可注射溶液的载体。任选地，载体可为用于固体制剂的载体，包括选自粘合剂(在压制丸剂的情况下)、助流剂、成胶囊剂、调味剂和着色剂中的一种或多种，但本发明不限于此。

并且，本发明涵盖了药物组合物和疫苗。本发明的药物组合物和疫苗组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂以及一种或多种新的志贺菌抗原和一种或多种佐剂。配制药物组合物和疫苗的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

制剂：本发明的疫苗组合物可包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。此类组合物具有各种缓冲成分(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)以及pH和离子强度，并且包含添加剂，例如表面活性剂和增溶剂(例如吐温80、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞(Thimersol)、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)；其中，将材料掺入聚合的化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸等)的某些制剂中或掺入到脂质体中。也可使用透明质酸。

在考虑之列的是将口服固体制剂用于本发明中。所述固体制剂可包括片剂、胶囊剂、丸剂、含片(troch)、锭剂(lozenge)、扁囊剂、小丸(pellet)、散剂或颗粒剂。并且，可使用脂质体包封或类蛋白质包封来配制本发明的组合物。可使用脂质体包封并且该脂质体可用各种聚合物进行衍生化。一般而言，制剂将包含允许保护胃不受环境影响且在肠内释放生物活性物质的非活性成分和治疗剂。

而且，在考虑之列的是将口服给予的液体制剂(包含药学上可接受的乳剂、溶液剂、助悬剂和糖浆)用于本发明。在这种情况下，液体制剂可包含其它组分，包括非活性稀释剂、佐剂、润湿剂、乳化剂和助悬剂、以及甜味剂、调味剂、着色剂和芳香剂。

对口服制剂而言，组分的释放位置可为胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域普通技术人员可采用通过使用肠溶包衣而使其不会溶于胃中但其材料将被释放到十二指肠或肠道的其它部位的制剂。用作肠溶包衣的较常见的非活性成分的实例包括：醋酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP55、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)、丙烯酸树脂L30D、Aquateric、邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)、丙烯酸树脂L、丙烯酸树脂S和虫胶。这些包衣可用作混合膜。

并不旨在保护胃的片剂上也可使用包衣或包衣混合物。这可包括糖衣或使吞咽片剂变得容易的包衣。胶囊可由用于递送干燥的治疗剂(即粉末)的硬壳(例如明胶)构成，且当胶囊处于液体形式时，可使用软的明胶壳。扁囊剂的壳材料可为厚淀粉或其它的可食用纸。对于丸剂、锭剂、模制片剂或研制片剂，可使用湿混技术(moist massing technique)。用于胶囊给予的材料的制剂也可处于粉末、轻微压制的栓形或甚至片剂的形式。所述治疗剂可通过压制来制备。

本领域普通技术人员可使用非活性材料来稀释或增加治疗剂的体积。所述稀释剂可包括碳水化合物，尤其是甘露醇、β-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。也可将某些无机盐(包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠)用作填充剂。一些可商购的稀释剂包括Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。

在治疗剂的制剂中，可将崩解剂掺入固体制剂中。用作崩解剂的材料包括淀粉、可商购的基于淀粉的崩解剂、淀粉乙醇酸钠(Explotab)、羟基乙酸淀粉钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉(ultramylopectin)、海藻酸钠、明胶、桔皮、羧甲基纤维素酸、天然海绵和膨润土，但本发明不限于此。在这种情况下，所有的材料皆可使用。崩解剂也可是不溶性的阳离子交换树脂。粉状胶可用作崩解剂和粘合剂，并且可包括如琼脂、刺梧桐树胶(Karaya)或黄蓍胶的粉状胶。海藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。粘合剂可与治疗剂一起形成硬片剂(hard tablet)，并且包括天然产物衍生的物质，如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其它粘合剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)均可用于在酒精溶液中将肽(或衍生物)制成颗粒。

可在制剂中包含抗摩擦剂以防止在配制过程中粘连。润滑剂可用作肽(或衍生物)和模壁(die wall)之间的层。在这种情况下，所述润滑剂可包括硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡，但本发明不限于此。也可将可溶性润滑剂(如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、具有不同分子量的聚乙二醇、以及Carbowax 4000和Carbowax 6000)用作润滑剂。

可添加在配制过程中可改善药物的流动性并且在压制过程中可帮助重新排列药物的助流剂。所述助流剂可包括淀粉、滑石、热解硅石(pyrogenic silica)和水合硅铝酸盐。

为了辅助将治疗剂溶解在水性环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。所述表面活性剂可包括阴离子去污剂，如月桂基硫酸钠、琥珀酸二异辛酯磺酸钠和二辛基磺酸钠。可使用阳离子去污剂，并且可包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可包含在制剂中作为表面活性剂的潜在的非离子型去污剂的清单包括：聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、聚氧乙烯氢化蓖麻油50和聚氧乙烯氢化蓖麻油60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65和聚山梨醇酯80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。此类表面活性剂可以以不同的比例单独或以其混合物的形式存在于蛋白质或衍生物的制剂中。

可用受控释放的口服制剂来实施本发明。可将治疗剂掺入非活性基质中，该基质允许治疗剂通过如同树胶一样的浸出机制扩散或释放。在所述制剂中也可包含缓慢分解的基质。任何肠溶包衣也具有延缓释放的效果。其它类型的受控释放通过基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法(即，将治疗剂封入由于渗透作用通过单个小开口允许水的进入和试剂的释放的半透膜中的方法)来实现。

其它的包衣可用于制剂。此类包衣包括可施用于包衣锅的各种糖。所述治疗剂也可提供在薄膜包衣片剂中，并且在这种情况下使用的材料被分成两类。第一类由非肠道材料组成，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮以及聚乙二醇。第二类由肠溶材料(通常为邻苯二甲酸的酯)组成。材料的混合物可用于提供最适宜的薄膜包衣。所述薄膜包衣可在锅式包衣机(pan coater)中或在流化床中进行，或者通过压制包衣法进行。

在一个示例性实施方式中，本发明中公开的志贺菌菌株可与药学上可接受的稀释剂一起给予。此类制剂可通过注射(皮下、真皮内或肌内)给予，或者可使用贴片局部施用到皮肤上。另一方面，疫苗可使用药学上可接受的媒介物通过粘膜途径(口服、口腔、舌下、滴鼻剂、气雾剂或直肠)给予。志贺菌菌株也可与佐剂混合以增强随后的免疫应答。这种佐剂的实例可包括：铝盐、ISCOM、基于皂苷的佐剂、水包油乳剂、油包水乳剂、toll样受体配体(如胞壁酰二肽)、大肠杆菌LPS、含有未甲基化的DNA的寡核苷酸、聚(I:C)、脂磷壁酸和肽聚糖，但本发明不限于此。肠毒素及其佐剂包括活性衍生物，例如霍乱毒素、不耐热的大肠杆菌肠毒素、百日咳毒素、志贺毒素及类似物。

根据本发明的用于胃肠外给予的制剂包含无菌水溶液或非水溶液、助悬剂或乳剂。非水溶剂或媒介物的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。此类制剂还可包含佐剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。药物组合物可例如通过凭借细菌截留过滤器过滤组合物、将灭菌剂掺入组合物、照射组合物或加热组合物来灭菌。也可紧接在其使用前用无菌水或其它无菌可注射介质来制备这些组合物。

疫苗：就疫苗而言，经常观察到在缺少佐剂的情况下，用单独的抗原进行的初次激发(primary challenge)不能引起体液免疫应答或细胞免疫应答。因此，本发明的疫苗可含有佐剂，包括但不限于：霍乱毒素、具有佐剂性质的片段和突变体或衍生物、大肠杆菌不耐热肠毒素、具有佐剂性质的片段和突变体或衍生物、水包油乳剂和油包水乳剂、toll样受体配体(如胞壁酰二肽)、大肠杆菌LPS、含有未甲基化的DNA的寡核苷酸、聚(I:C)、脂磷壁酸和肽聚糖。肠毒素及其佐剂包括活性衍生物，如霍乱毒素、不耐热的大肠杆菌肠毒素、百日咳毒素、志贺毒素及类似物。可使用其它佐剂，如完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂)、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)以及潜在的有用的人佐剂(如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))。佐剂可充当缓慢释放抗原的组织库(tissue depot)，并且也可充当以非特异性方式增强免疫应答的淋巴系统激活剂。当意图将所述疫苗用于人类受试者时，所述佐剂应当是药学上可接受的。

给予：此类药物组合物和疫苗可口服(以固相或液相)给予、肠胃外(通过肌内注射、腹膜内注射、静脉内(IV)注射或皮下注射)给予、经皮(被动或利用离子电泳作用或电穿孔法)给予、经粘膜(经鼻、经阴道、经直肠或舌下)给予或通过吸入途径给予，或者使用生物溶蚀性插入物给予，并可制备成适于各种给予途径的制剂。

在一个优选的示例性实施方式中，组合物或疫苗通过肺部递送而给予。组合物或疫苗在吸入过程中被递送到哺乳动物的肺，并穿过肺的上皮层进入血流中。

根据本发明的一个示例性实施方式，可考虑种类繁多的被设计用于肺部递送治疗产品的机械装置，包括但不限于：雾化器、定量吸入器和粉末吸入器(所有这些装置都是本领域技术人员所熟悉的)。适用于实施本发明的可商购的装置的任何具体实例包括：Ultravent雾化器(Mallinckrodt Inc.,St.Louis,Mo.)、Acorn II雾化器(MarquestMedical Products,Englewood,CO)、Ventolin定量吸入器(Glaxo Inc.,ResearchTriangle Park,N.C.)以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.,Bedford,MA)。所有此类装置都需要使用适于分发治疗剂的制剂。通常而言，各制剂对于所采用的装置的类型而言是特异性的，并且除了在治疗有用的常规稀释剂、佐剂、表面活性剂和/或载体之外，可涉及适当的抛射剂材料的使用。同样，考虑使用脂质体、微胶囊或微球剂、包合物(inclusioncomplexes)或其它类型的载体。

与定量吸入器装置一起使用的制剂通常可包含借助于表面活性剂悬浮于抛射剂中的含有治疗剂的细分粉末(finely divided powder)。抛射剂可包括为此目的采用的任何常规材料，例如含氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃(包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷)或它们的组合。合适的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。也可有效地将油酸用作表面活性剂。

从粉末吸入器装置分发的制剂将包含含有治疗剂的细分的干燥粉末，并且还可包含处于促进粉末从装置中分散的量(例如，占制剂重量的50％-90％)的填充剂，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。为了最有效地递送至远端肺部，应当以平均粒径为10mm(或微米)以下、最优选为0.5mm-5mm的颗粒的形式最有利地制备治疗剂。

也在考虑之列的是通过鼻腔递送或通过其它粘膜递送治疗剂。在将组合物给予鼻子之后，鼻腔递送允许组合物直接进入血流，而不需要将产品沉积在肺部。用于鼻腔递送的制剂包括具有葡聚糖或环糊精和皂苷作为佐剂的制剂。

本发明的组合物或疫苗可与一种或多种额外的活性成分、药物组合物或疫苗联合给予。本发明的治疗剂可给予动物、优选哺乳动物、最优选人。

剂量：遵循相关技术领域中已经确立的方法，在临床前研究中使用小动物模型(例如小鼠或大鼠)来确定易于用于体外测试中的化合物和组合物的有效剂量和毒性，在所述动物模型中，已发现志贺菌菌株或疫苗组合物具有治疗有效性或预防有效性，并且这些药物可通过对人临床试验提出的相同的途径进行给予。

用于本发明的制剂或剂型不需要含有治疗有效量或预防有效量的本发明中公开的组分，因为可通过给予多种这样的制剂或剂型来实现这样的治疗有效量或预防有效量。

对于本发明的方法中使用的任何疫苗组合物，治疗有效剂量或预防有效剂量可优先从动物模型中估计。然后使用来自动物系统的剂量-应答曲线来确定人的初始临床试验的测试剂量。为了确定不同组合物各自的安全性，给予剂量和给予频率应当符合或超过预期用于临床试验中的要求。

如本发明所公开的，确定本发明的组合物中的各组分的剂量以确保连续或间歇的给予剂量不超过在考虑动物试验结果和患者个体症状后确定的量。当然，一定的剂量随着剂量程序、患者或靶标动物的征象(如年龄、体重、性别、敏感度、进食、给药周期、组合使用的药物以及疾病的严重程度)而变化。在一定条件下的适当剂量和给药时间可通过基于上述指标的试验来确定，但可基于从业者的判断和个体患者的情况(年龄、一般状况、症状的严重程度、性别等)根据标准的临床技术来完善和最终决定。

本发明的组合物的毒性和治疗功效或预防功效可根据实验室动物中的标准药学程序来确定，例如通过测量LD₅₀(使50％群体致死的剂量)和ED₅₀(使50％群体治疗有效的剂量)来确定。治疗功效和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，其可用ED₅₀/LD₅₀的比值来表示。优选显示出高治疗指数的组合物。

从动物研究得到的数据可用于制定人用剂量的范围。人的治疗有效剂量优选落入包括具有很小毒性或没有毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。所述剂量可随着采用的制剂和使用的给药途径而在此范围内变化。理想地，单一剂量的各药物应当每日使用。

实施例

在下文中，将参照其示例性实施方式来详细描述本发明。

然而，应该理解的是，以下实施例仅仅是用于说明目的的优选实施例，并不旨在限制或限定本发明的范围。

实施例1：wzy敲除(ΔWZY)的志贺菌菌株的构建

使用列于表1中的正向引物和反向引物通过PCR扩增长度为约600nt的wzy的各内部DNA片段(在福氏志贺菌2a中，从核苷酸121至核苷酸720(600nt)(SEQ ID NO：1)；在福氏志贺菌6中，从核苷酸5,027至核苷酸5,672(645nt)(SEQ ID NO：2)；在痢疾志贺菌2中，从核苷酸1,936至核苷酸2,525(590nt)(SEQ ID NO：3)；在宋内志贺菌482-79(pWR105)中，从核苷酸5,207至核苷酸5,796(590nt)(SEQ ID NO：4)；以及在鲍氏志贺菌7中，从核苷酸9,161至核苷酸9,799(639nt)(SEQ ID NO：5))(C.Daniels,C.Vindurampulle,R.Morona,Overexpression and topology of the Shigella flexneri O-antigen polymerase(Rfc/Wzy),Mol Microbiol 28(1998)1211-1222)。

表1

在引物序列中，下划线部分分别代表XbaI和EcoRI限制性位点。

将PCR片段克隆到pGEM-T载体系统(Promega)中，用XbaI酶和EcoRI酶进行消化，然后插入到自杀质粒pSW23.oriT中(D.W.Kim,G.Lenzen,A.L.Page,P.Legrain,P.J.Sansonetti,C.Parsot,The Shigella flexneri effector OspG interferes withinnate immune responses by targeting ubiquitin-conjugating enzymes,Proc NatlAcad Sci USA102(2005)14046-14051)。使用热激法以各重组质粒pSWwzyTr转化大肠杆菌菌株BW19610(pir⁺ Amp^s Cm^r)。通过核苷酸测序验证重组质粒pSWwzyTr的wzy片段。使用Qiagen mini-prep试剂盒从BW19610中纯化质粒pSWwzyTr，并使用热激法将经纯化的质粒pSWwzyTr转化大肠杆菌SM10λpir(pir⁺ Tra⁺ Amp^s Cm^r)。将大肠杆菌SM10λpir与链霉素抗性的志贺菌以及链霉素抗性和氯霉素抗性的志贺菌缀合，然后在刚果红/链霉素/氯霉素琼脂平板上分离缀合的志贺菌克隆(D.W.Kim等，Proc Natl Acad Sci USA 102(2005)14046-14051)。此后，通过14％Tris/Tricine SDS PAGE(30ng/泳道；在福氏志贺菌2a WT和福氏志贺菌2aΔWZY的情况下，用16.5％凝胶和100ng/泳道)和银染色法来分析源自野生型志贺菌和ΔWZY的经纯化的LPS。

结果证实，从野生型中观察到对于LPS(O-抗原聚合)而言特异性的梯状条带，但是这种条带在ΔWZY中消失(图2)。

实施例2：ΔWZY菌株的培养

在添加有0.01％刚果红和100mg/mL链霉素(福氏志贺菌2aΔWZY)、20mg/mL氨苄青霉素和10mg/mL氯霉素(福氏志贺菌6ΔWZY)、50mg/mL链霉素和10mg/mL氯霉素(痢疾志贺菌2 ΔWZY和宋内志贺菌ΔWZY)或25mg/mL链霉素和10mg/mL氯霉素(鲍氏志贺菌7 ΔWZY)作为抗生素的BTCS琼脂上，在37℃下从等分试样(在-70℃下于80％甘油中冷冻)过夜培养ΔWZY菌株。将一个代表性的刚果红染色的菌落随着在含有100mg/mL链霉素的BTCS培养液中搅拌而在37℃下培养过夜。第二天早晨，向含有如上所述的对各菌株而言适当的抗生素的新鲜的BTCS培养液中加入ΔWZY的等分试样(新鲜培养基的1％-2％体积)，并在37℃下培养2-3小时。在600nm处测量OD(将0.5的OD值确定为2×10⁸cfu/mL的量)之后，将ΔWZY培养液离心，并将细菌沉淀团悬浮于PBS中至浓度为2.5×10⁹cfu/mL。

实施例3：小鼠的免疫和激发

每隔2周向Balb/c小鼠(雌性，6周龄)通过鼻内途径给予40μL含有1×10⁸cfu ΔWZY的PBS三次。用0.13％福尔马林/PBS(v/v)将细菌灭活2小时。使用经SC602免疫的小鼠作为对照(P.J.Sansonetti,Infect Agents Dis 2(1993)201-206)。仅将PBS给予年龄和性别匹配的对照小鼠。最后一次免疫后一周，用感染性的活的痢疾志贺菌1、福氏志贺菌2a2457T、福氏志贺菌6、宋内志贺菌通过鼻内途径对小鼠进行激发。以与ΔWZY菌株相同的方式来制备和培养用于激发的菌株。每天监测小鼠的存活，共7-10天。

结果显示出，ΔWZY菌株的鼻内给予提供了部分或完全的保护以抵抗由属于不同的志贺菌属菌种(福氏志贺菌和痢疾志贺菌)和不同的志贺菌血清型(福氏志贺菌2a和福氏志贺菌6)的菌株诱导的实验性肺炎。实验的结果总结于表2中并示于图3a至图6b中。

表2

实施例4：通过多种多克隆血清对全细胞进行的流式细胞分析

将等数量(约2×10⁷cfu)的新鲜培养的志贺菌野生型和其ΔWZY用于经由抗-IcsP小鼠多克隆血清对全细胞的表面进行染色。将该菌株用0.13％福尔马林/PBS(v/v)或4％福尔马林/PBS(v/v)灭活2小时。将全细胞用PBS进行洗涤并用来自抗原特异性小鼠的稀溶液进行染色。将所得到的样品用PBS洗涤三次后，将抗小鼠山羊IgG-RPE抗体加入样品中。用PBS洗涤细胞，然后通过流式细胞仪进行分析。

通过与dmLT共同给予免疫小鼠3-4次来开发抗PSSP-1(作为部分的IcsP)的抗血清(E.B.Norton等，Clin Vaccine Immunol 18(2011)546-551；J.O.Kim等，Clin VaccineImmunol 22(2015)381-388)。使用天然的小鼠血清作为对照。

结果证实，与野生型志贺菌相比，在ΔWZY中检测到更大量的IcsP，并且证实了外膜蛋白IcsP被野生型菌株中的O-多糖掩埋，但是由于一个单元的O-抗原的长度较短而容易在ΔWZY的表面上被检测到(图7a至图7e)。

本申请书中引用的所有文件均包括在本申请书中，尽管看起来表明个别文件通过引用而被具体且单独地涵盖。提供前述发明的目的是为了清楚理解，并且参照实施例而部分地进行了详细描述。因此，基于本发明公开的内容对本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离所附的权利要求书的精神和范围的情况下，可对实施例进行一些改变和修改。

序列表

<110> 国际疫苗研究所（INTERNATIONAL VACCINE INSTITUTE）

<120> 用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物

<130> 2015-OPA-7385PCT

<150> US 62/152,221

<151> 2015-04-24

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> 福氏志贺菌2a(Shigella flexneri 2a)

<400> 1

atgaataata taaataaaat ttttataaca tttttatgta ttgaactgat tattggtggt 60

ggtggaagat tactggagcc attgggaata ttccctttgc gatatttatt atttgtattt 120

agttttatac ttttaatttt taatttagtt acattcaatt tttcaatcac ccaaaaatgt 180

gtcagtcttt ttatatggtt gcttttattt cctttttatg gcttctttgt cggcttatta 240

gctggtaata aaataaatga tatactgttt gatgtgcaac catacctttt tatgctgtca 300

cttatatatc tatttacact aagatatact ttaaaagtat tttcatgtga gatttttatt 360

aaaatagtta atgcatttgc attatatgga tcactgttat atatttcata cataattttg 420

ttgaatttcg gtttgttaaa ttttaattta atttatgaac acttatcatt gactagcgag 480

ttcttttttc gtcccgatgg ggcttttttt tccaaatcct tctacttttt tggtgtcggt 540

gcgattatca gttttgtcga caaaaaatat ttaaaatgtc tcataatagt gcttgcgata 600

ttattgacag aatcaagagg tgtattactt tttacaacat tatcactgtt attagccagt 660

tttaaattac ataagctata tttaaatact attataataa tattgggcag cgttctattt 720

ataattatgc tttacatggt cggatcacgc agtgaagatt ctgactctgt tagatttaat 780

gatttatatt tttattataa aaatgttgat ttagcgacgt tcttgtttgg aagaggattt 840

ggttcattta tattagatcg attaaggatt gaaatagtac ctcttgagat acttcagaaa 900

acaggcgtta ttggtgtatt tatatcatta gttcctatgt tgcttatctt tttgaaaggc 960

tattttttaa atagtacaaa aacatcatta atgatgtcgt taatactttt tttcagtatt 1020

accgtttcta taactaatcc atttcttttt acacccatgg gaatttttat tataggcgtt 1080

gtagttttat gggtattttc tatagaaaat atccaaatta gtaataacct cacttctgga 1140

gcaaaataa 1149

<210> 2

<211> 1188

<212> DNA

<213> 福氏志贺菌6(Shigella flexneri 6)

<400> 2

atgacttctg atttttataa ctcaaaagac aaaagtttaa gtgttctttt gttttttggg 60

tttatatttt tccttacacg tagctttcca tttattcaat atagttggat tatggagggg 120

tttttatgtc tttgtatcat gtcatttaca aagaaaattg caaacggaat atatcactat 180

cctgttattt taatatttct attagctctt tttataaatt ttatttattc ctatatcaag 240

ggtaacgata tagcgataat aattaggttt tatattatca tattatttat attatgtgct 300

tatttctgct cttatggaac catctcgatt gttaaaatat ttttatattt aatggtatta 360

caggcggtta ttatatccat cattagtatt tatatgacaa aaacatatgg tattggtgat 420

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catatagtca taaaagatta tttctattat cgattcaaaa atacaataac cgttattctg 600

gctataggta ctatagtggc tggtaatttt gcatattttg tttcgatatg cttgtttttt 660

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tttggggttt ttcttactgt gattctccct ttttttatta catattcaat tgagttgata 780

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gtcatcaaaa ttcaaactcc tatccgtgat tatagtgcat atatatatta tgaattgcag 960

tcagtttatt ttttaaatca acttggcgtt attttattta ctttgttttt attaattaat 1020

ctccttctca cgattaaaat cataaaatac agtgagttgt gtgtgctata ttttctatat 1080

gtttcttatg caattactaa tccttatatt ttagactcta accatgttgc tgtaataatt 1140

gtattagtga cattaagtaa tgttctaaaa aagatgaaag ctaaatga 1188

<210> 3

<211> 1086

<212> DNA

<213> 痢疾志贺菌2(Shigella dysenteriae 2)

<400> 3

atgataaaaa aaaataatat ttatagattt tatattttag tatgtgtatt tagtggtttt 60

tatatatttg gattctttcc tgccccatac tatctttgtt taatattggg gtttgtgttt 120

ttaagcctta gcaaaatcaa acatgttgat aaaaatattt tatttctgtt atgcattgtt 180

attatctata tggtttttat gttgtttaac tctagaatta atgtttggag ttattatttt 240

attggccttc tgacttattt tattattatc ttactaagaa ataatcttga taattatcaa 300

aaaattgcaa ttgtgagaaa gactgtctta atctcattgt tacttgtcat attggatact 360

atatatagat tctattatcc gcgagaagaa tatttacttg caatagaaca acaagggaaa 420

attgattatc tcttttatgg atataaacat agctttttat tccaagacag taatttcgta 480

ggtttatata ttttgtcagt tttttttctg tttagggata acatgtctat ctttaaatgg 540

aaaaaaagta tcctattgac aataataata ttaattattt tatccttatc aagggcggca 600

atagtcgcat tgattttaac cgaatgtata cgtatgttat gtggcatgaa agttgatgta 660

cgattgaaaa ttgtgtcatt aatatttatg gccataccga caatatatct cttatttgtt 720

ttggtagcta atattgatga cacaagtttt gaatcgaaat tcatgctatt aaataaattt 780

cttactactt ttcaagaaag aaattttact gaattattat ttggatgggg cttagataat 840

acacgagaac actggggaat agctgctcat agtttattta atacattact tctggaaatg 900

ggattggtgg gattcattat aattaccata tcaatagtat attgttggtg cttaaacacc 960

aaaacgttat atcattttat ggggttaagc atagcatttc tttcatttgg tttgattttt 1020

actccatttt ttattcctct tggcttaaat ataattatgc gagatgtgtc gaatgaaaaa 1080

ctatga 1086

<210> 4

<211> 1173

<212> DNA

<213> 宋内志贺菌482-79(Shigella sonnei 482-79)

<400> 4

atgttaatat acctatatcc tgtacttttg ttatttaata tccttccggt ttttttttat 60

ggacaaatga actctgattt agagcgtttt tttggagttc ctattggcta tattccagat 120

ctaatatttt atttctttgt tgttttaaca tctataataa cgttgaggtt tcacgtttct 180

ctgtggacaa agaaattatt atttttaggc atcatattcc tgatttatat cagcattcag 240

atgttgttgt tatcagcgga tatatcaggt gtcgtaattt tattatcgtt tttttctaat 300

tttatagctt tggttctttt ggtgtcattt tgcattggta aagatgagct ttatttaact 360

cattcggtta gaaatataaa tgttgtaatg tgttttggta ttatctgtgg agttgtaaaa 420

ttatttattg gttattctga agatagtaat tttatagttt atttaaatag aaatgccacc 480

gcaattatag tagtgtgctt ttattgtgta tattcatact tttatcgtgg tcgaaagtct 540

tggtatgtct catctgtatt gtactctctg ttctttcttt ttctggatag ccgagcagga 600

ataatatcat ttgctatatc gttgtttttt gtttttcttc agttaacaaa gaaggaaaag 660

ttattaatat cattgttttt tgttcctctt ctaactttag gtatttcttt tactgatata 720

ggcactcgtc ttgaacgaat gctgtcttcg tcacaggtta tattctctgg tggtaacact 780

cttacaaaaa gtcagaatga ttatcgtcga gttgagttag tatttattgg ggttgatgtt 840

ttaaaagaaa attatttaat tggcactgga ttaggtgttg caaattatgt aaaggctata 900

gataaaaagt ttttaggaag taccaacttt gggttggcgc ataattttta tttatcttat 960

tcggctcagt tagggattat tggttttatt ttgcttattt ctgtatttta tataatgctg 1020

tctccaattt ttaaatgcgg agggtatatt ggtaaaggat gcgtttttgc tttggctttc 1080

tatgtctttt ttaatgagta tatattgacg ccagcgatat atatttatat ttctattttt 1140

ttatcggtgg tttttatacg taattctaaa tag 1173

<210> 5

<211> 1296

<212> DNA

<213> 鲍氏志贺菌7(Shigella boydii 7)

<400> 5

atgactaata taacgttcag aactctgaga attccaggat atttactctc attatttgtt 60

cttttaatcg gatttataac atatttcatc tttaatgaaa ctcttgcagc gaatttatta 120

gcagtggggg ctattggcat tatcattctt gatagtttac atgataagcg gattttttat 180

ttaacacttt ttcccgtgta tgtcctcgta ggtcaactca tttcattatt attagttgag 240

cacggatgga ttctaatcga acttggaggt attaaaagct atcccattgg ttcaattctt 300

tttatggcgt taacaatagt tttattccat tttatcatat ttttaactgt aaaaatttca 360

atattcaaat ttgatcgaac atgtattgat aagttaagtg gtaattcttt tatttattac 420

ttgccgattt tttatctatg cttagtatat attcctgttt ttatttatgg ctctgcatta 480

tctgtaacaa atggtaatcg agttgtatac aatcaaataa tatcacctgt ttttttatat 540

ttatttcaaa ttaaacaatt tatacttcct gttgcaggat tgtatttgct taaaaataaa 600

aaaatattta ctatatatct gtttgcaatt ttactatgga atatattgat tggagagaag 660

gcaacgggca tttggcagtc attgtatcca atgctgttac cttatgtttt gataaattat 720

gataaaataa aaacaaaaaa tatattaata gtattaggtt tttgtattgt atttataacc 780

agtagcatag taattaatta tatatttatt gaaaagtcag gtgctacgtt tatatttgat 840

agaatatcaa tgcaaggaca attgtggtgg tattatttta atgagcacgt tttgttagct 900

aagacccctc atgaattatc tgaagagttc tcgtcagaat atagtgggct tcttaatctg 960

atgtatcatt caatgcctgc ccatcttttc aatagctata tcgagcgcgg tgtagtcttg 1020

acgagtggtt tccccgcaat atttcttttt tactttggac aatactggct ccttcctacg 1080

ttattatcac cttttctttt tggtttagtt gtctattttt tttcaagaag tttatatagc 1140

ggtagtatat tgagtttgct tatatcaagt aaactatttt ttgcttttac tgtttttttt 1200

gcccgtggag atatcgcaac ttttttagat tataaattgc ttatttatct attgattata 1260

ataattttac aatatttgcc aagggttaag gtttaa 1296

<210> 6

<211> 130

<212> PRT

<213> 福氏志贺菌(Shigella flexneri)

<400> 6

Ser Glu Asn Gly Gly Ser Arg Asn Lys Lys Gly Ala His Pro Ser Gly

1 5 10 15

Glu Arg Thr Ile Gly Tyr Lys Gln Leu Phe Lys Ile Pro Tyr Ile Gly

20 25 30

Leu Thr Ala Asn Tyr Arg His Glu Asn Phe Glu Phe Gly Ala Glu Leu

35 40 45

Lys Tyr Ser Gly Trp Val Leu Ser Ser Asp Thr Asp Lys His Tyr Gln

50 55 60

Thr Glu Thr Ile Phe Lys Asp Glu Ile Lys Asn Gln Asn Tyr Cys Ser

65 70 75 80

Val Ala Ala Asn Ile Gly Tyr Tyr Val Thr Pro Ser Ala Lys Phe Tyr

85 90 95

Ile Glu Gly Ser Arg Asn Tyr Ile Ser Asn Lys Lys Gly Asp Thr Ser

100 105 110

Leu Tyr Glu Gln Ser Thr Asn Ile Ser Gly Thr Ile Lys Asn Ser Ala

115 120 125

Ser Ile

130

<210> 7

<211> 265

<212> PRT

<213> 福氏志贺菌(Shigella flexneri)

<400> 7

Glu Lys Ala Phe Asn Lys Ile Tyr Met Ala Gly Gly Lys Gly Thr Val

1 5 10 15

Lys Ile Asn Ala Lys Asp Ala Leu Ser Glu Ser Gly Asn Gly Glu Ile

20 25 30

Tyr Phe Thr Arg Asn Gly Gly Thr Leu Asp Leu Asn Gly Tyr Asp Gln

35 40 45

Ser Phe Gln Lys Ile Ala Ala Thr Asp Ala Gly Thr Thr Val Thr Asn

50 55 60

Ser Asn Val Lys Gln Ser Thr Leu Ser Leu Thr Asn Thr Asp Ala Tyr

65 70 75 80

Met Tyr His Gly Asn Val Ser Gly Asn Ile Ser Ile Asn His Ile Ile

85 90 95

Asn Thr Thr Gln Gln His Asn Asn Asn Ala Asn Leu Ile Phe Asp Gly

100 105 110

Ser Val Asp Ile Lys Asn Asp Ile Ser Val Arg Asn Ala Gln Leu Thr

115 120 125

Leu Gln Gly His Ala Thr Glu His Ala Ile Phe Lys Glu Gly Asn Asn

130 135 140

Asn Cys Pro Ile Pro Phe Leu Cys Gln Lys Asp Tyr Ser Ala Ala Ile

145 150 155 160

Lys Asp Gln Glu Ser Thr Val Asn Lys Arg Tyr Asn Thr Glu Tyr Lys

165 170 175

Ser Asn Asn Gln Ile Ala Ser Phe Ser Gln Pro Asp Trp Glu Ser Arg

180 185 190

Lys Phe Asn Phe Arg Lys Leu Asn Leu Glu Asn Ala Thr Leu Ser Ile

195 200 205

Gly Arg Asp Ala Asn Val Lys Gly His Ile Glu Ala Lys Asn Ser Gln

210 215 220

Ile Val Leu Gly Asn Lys Thr Ala Tyr Ile Asp Met Phe Ser Gly Arg

225 230 235 240

Asn Ile Thr Gly Glu Gly Phe Gly Phe Arg Gln Gln Leu Arg Ser Gly

245 250 255

Asp Ser Ala Gly Glu Ser Ser Phe Asn

260 265

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggctctagaa gttttatact tttaattttt aatttagtt 39

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccgaattca aatagaacgc tgcccaata 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcattttcta gaaaaattgc aaacggaat 29

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagaaggaat tcctccattt gatttcatga tt 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttattcta gaggattctt tcctgcccca ta 32

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aattttgaat tcacatcaac tttcatgcca ca 32

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gattctagac gttgaggttt cacgtttctc 30

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aacgaattcc gaagacagca ttcgttcaa 29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggctctagat cccattggtt caattcttt 29

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccggaattct tagctaacaa aacgtgctca 30

Claims

1.一种志贺菌菌株，其中，由于志贺菌属菌种的wzy基因的破坏，而使存在于细胞膜上的保护性抗原的表面暴露增加。

2.根据权利要求1所述的志贺菌菌株，其中，所述wzy基因具有选自于由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：5所组成的组中的碱基序列。

3.根据权利要求1所述的志贺菌菌株，其中，所述保护性抗原是IcsP2蛋白或SigA2蛋白。

4.根据权利要求3所述的志贺菌菌株，其中，所述IcsP2蛋白具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的志贺菌菌株，其中，所述SigA2蛋白具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的志贺菌菌株，其中，所述志贺菌属菌种选自于由痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌所组成的组。

7.根据权利要求1所述的志贺菌菌株，其中，所述志贺菌属菌种选自于由以下所组成的组：痢疾志贺菌1型、痢疾志贺菌2型、福氏志贺菌2a、福氏志贺菌3a、福氏志贺菌5a、福氏志贺菌5b、福氏志贺菌6、鲍氏志贺菌血清型4、鲍氏志贺菌7和宋内志贺菌482-79。

8.一种用于治疗或预防志贺菌病的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含权利要求1-7中任一项所述的志贺菌菌株。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述志贺菌菌株选自于由减毒菌株、活菌株和死菌株所组成的组。

10.根据权利要求8所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物进一步包含佐剂。

11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂选自于由以下所组成的组：铝盐、免疫刺激复合物(ISCOM)、基于皂苷的佐剂、水包油乳剂、油包水乳剂、toll样受体配体(如胞壁酰二肽)、大肠杆菌LPS、包含未甲基化的DNA的寡核苷酸、聚(I:C)、脂磷壁酸、肽聚糖、霍乱毒素、不耐热的大肠杆菌肠毒素、百日咳毒素和志贺毒素。

12.根据权利要求8所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物通过注射给予或通过粘膜途径给予。

13.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其中，所述注射选自于由皮下注射、真皮内注射和肌内注射所组成的组。

14.根据权利要求12所述的疫苗组合物，其中，所述粘膜途径选自于由口服、口腔、舌下、鼻内和直肠所组成的组。

15.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物的有效剂量处于约10μg至约2mg的范围内。