CN119185523A - 预防b群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种预防血清群B脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗及用途，包括补体调节因子H结合蛋白fHbp；奈瑟菌肝素结合抗原NHBA；pile蛋白；将补体调节因子H结合蛋白fHbp去掉信号肽部分作为骨架，与一个附加抗原Opa的多变区融合表达的嵌合抗原；App蛋白；IgA protease；以及佐剂CpG。本发明中疫苗高效、广谱和低价，同时疫苗采用粘膜免疫的途径，无组织损伤、无局部副作用和使用简便，易推广。

Description

预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗及其用途

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗及其用途。

背景技术

脑膜炎奈瑟氏氏菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰氏阴性菌，可以引起脑脊髓膜炎和菌血症为主的呼吸道传染病，也叫流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)，脑膜炎在所有年龄人群中均有发生，其中1岁以下婴儿发病率最高。人类是脑膜炎奈瑟氏氏菌的唯一宿主，在约10％成年人的上呼吸道中存在，主要通过呼吸道传染，穿过黏膜和血脑屏障，形成侵袭性脑膜炎(IMD)，侵袭性脑膜炎可导致长期残疾，严重的致死率可达到10％-20％。

脑膜炎奈瑟氏氏菌的荚膜多糖是其主要的毒力因子，根据其多糖化学组分的不同，可以将其分为12个血清群，其中大多数流行性侵袭性脑膜炎是由A,B,C,W,Y和X 6个血清群导致的，但是这些血清群的分布也受到地理环境、疫苗接种情况的影响。目前针对A,C,W,Y和X都有多价结合的多糖疫苗，但是B群脑膜炎荚膜多糖的化学成分与人糖蛋白中的聚唾液酸相似，免疫原性和安全性差，所以不可以作为疫苗组分。

最早用于预防B群脑膜炎的疫苗是洗涤剂提取的外膜囊泡(OMV)疫苗。OMV疫苗的主要抗原是孔蛋白(PorA)。PorA表现出高度的抗原性变异性，限制了对不同菌株的交叉免疫保护，PorA的不保守对于将OMV作为一个广谱的疫苗来说是一个挑战。单一重组蛋白成分的疫苗难以取得较好的免疫效果，多组分疫苗成为发展趋势，为B群脑膜炎球菌疫苗的研究带来新的方向。

菌株fHbp是脑膜炎奈瑟菌的主要毒力因子之一，通过结合因子H(fH)使病原菌避开旁路补体途径而在人体血液中存活。fHbp基因的缺失导致fH结合失效，菌株在人血清中的生存能力降低，携带不同fHbp变体的菌株均能结合fH，且结合能力与fHbp表达水平有关(7,8)。同时fHbp也是两种获批的B型脑膜炎球菌疫苗的主要成分，一般来说，fHbp作为免疫源可诱导对同一亚家族菌株的杀菌抗体，具有交叉免疫保护。

Opa(neisserial colony opacity-associated protein adhesins)，在病原菌侵染过程中表达，与CEACAMs受体结合，对于病原菌在呼吸道上皮细胞的定植和感染起到重要作用，是脑膜炎奈瑟菌的主要毒力因子之一。

蛋白奈瑟菌肝素结合抗原(NHBA或GNA2132)是一种奈瑟菌特有的表面暴露脂蛋白，NHBA基因序列分析已经报道超过400种不同的NHBA多肽变体(1)。NHBA蛋白约由420-490个氨基酸组成，NHBA蛋白氨基酸序列的N端大概有250个残基左右，序列差异较大，而C端则由约180个氨基酸组成，形成8个β折叠结构域，具有高度保守性，重组NHBA免疫的小鼠血清抗体能够结合到不同的脑膜炎奈瑟菌菌株的表面，并诱导补体介导的杀菌活性，同时能被动保护幼鼠的菌血症，说明能提供对不同菌株的交叉免疫保护，是重组蛋白疫苗候选抗原之一。

中国发明CN202011644037.X说明书中记载了一种脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗，其包括细菌菌影和H因子结合蛋白(fHBP)。该发明中疫苗成分简单，难以取得广谱的免疫效果。目前尚缺乏用于预防B群脑膜炎球菌感染的广谱疫苗，且研发适用于B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗存在着许多技术困难。因此，亟需开发一种预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗。

发明内容

本发明提供一种预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗及用途，利用多种B群脑膜炎球菌的保守抗原粘膜免疫小鼠，有效诱导小鼠Th17和抗体的反应，有效预防B群脑膜炎球菌的流行，对B群脑膜炎球菌提供广泛的保护作用同时疫苗采用粘膜免疫的途径，具有无组织损伤、无局部副作用和使用简便的特点，易于推广使用。

本发明中的一种预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗的活性成分由成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己、成分庚组成；

所述成分甲为补体调节因子H结合蛋白fHbp、具有所述fHbp全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述fHbp全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述fHbp全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述fHbp全长或部分编码基因DNA表达载体；

所述成分乙为NHBA、具有所述NHBA全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述NHBA全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述NHBA全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述NHBA全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分丙为fHbp-Opa(HV2)、具有所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分编码基因DNA表达载体；

所述成分丁为pile、具有所述pile全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述pile全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述pile全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述pile全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分戊为App、具有所述App全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述App全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述App全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述App全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分己为IgA protease、具有所述IgA protease全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述IgA protease全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述IgAprotease全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述IgA protease全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分庚为免疫佐剂CpG；

所述疫苗的功能为对B群脑膜炎球菌提供免疫保护作用；

所述成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己、成分庚的质量配比为1：1：1：1：1：1：1。

本发明的一种较佳的实施方式中，所述成分甲为fHbp，具有所述fHbp去除信号肽之后的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:3所示；

所述成分乙为NHBA，具有所述NHBA去除信号肽和细胞壁锚定结构域后的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:6所示；

所述成分丙为fHbp-Opa(HV2)-GST，具有所述fHbp去除信号肽和Opa(HV2)多变区的氨基酸序列，以及GST标签，具体如SEQ ID NO:14所示；

所述成分丁为pile，具有所述pile去除信号肽后的氨基酸序列，具体如SEQ IDNO:17所示；

所述成分戊为App，具有所述App的结合结构域的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:20所示；

所述成分己为IgA Protease，具有所述IgA Protease去除信号肽和细胞壁锚定结构域后的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:23所示。

所述疫苗的使用方式包括肺部吸入、鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮内注射、生殖道注入、肛内注入。

在一个较佳的实施方式中，所述疫苗的使用方式为鼻腔吸入。

在一个较佳的实施方式中，所述疫苗中成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己、成分庚的用量为10μg/次；免疫次数为3次，间隔一周。

本发明的另一方面提供以上任一所述疫苗在制备预防B群脑膜炎球菌感染的药物中的用途。

所述疫苗的功能为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)：(Ⅰ)高效诱导血清中IgG以及黏膜中分泌型IgA；(Ⅱ)能诱导肺中及脾脏Th17为主的特异性T细胞反应；(Ⅲ)黏膜免疫能诱导对临床菌株具有高杀菌活性的中和抗体。所述的B群脑膜炎临床菌株为2015-16#。

所述的B群脑膜炎球菌包括不同的B群脑膜炎球菌流行菌株。

所述预防B群脑膜炎球菌感染为预防不同B群脑膜炎球菌导致的人感染。

所述人感染为呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统、皮肤以及血液循环系统感染。

Th17细胞是近年来新发现的一类T细胞，粘膜免疫后产生的免疫记忆Th17细胞能迅速迁移到感染的粘膜部位，在抗粘膜细菌感染起重要作用。与B细胞提供的免疫不同，T细胞提供的免疫具有耐受抗原变异的特点，能提供对同种异型细菌的交叉免疫保护，是新型疫苗构建的理论基础。Th17细胞活化后释放的细胞因子IL-17激活中性粒细胞和巨噬细胞吞噬，有效地杀死进入机体的病原菌。所选疫苗组分能够诱导以Th17细胞为主的免疫反应。

fHbp、NHBA等抗原位于B群脑膜炎球菌表面，针对这些毒力因子的抗体能够特异性的中和毒力因子的致病作用，或通过补体接到的抗体依赖的杀菌活性起到抗B群脑膜炎球菌感染的作用。

本发明人经过长期深入研究发现联合使用fHbp、NHBA、fHbp-Opa(HV2)、pile、App和IgAprotease，既可诱导诱导中和抗体，又可激活Th17细胞的反应，从而对B群脑膜炎球菌起到更有效的保护作用。因此，联合使用fHbp、NHBA、fHbp-Opa(HV2)、pile、App和IgAprotease能够对B群脑膜炎球菌有广谱的杀菌作用。粘膜佐剂可促进疫苗亚单位在粘膜部位被抗原加工细胞摄取，显著增强其免疫原性和免疫效果，同时避免肌肉或皮下免疫因佐剂会引起的局部组织反应。

本发明多联重组蛋白疫苗(以下简称Men.B-V6)所采用的抗原在奈瑟菌中普遍存在，同源性达90％以上。通过充分利用各种抗原在奈瑟菌中的普遍性和同源性、粘膜途径免疫、粘膜免疫佐剂增强抗原免疫原性，显著提高了Th17细胞活化和抗体的水平，达到阻止病原菌定居和迅速清除病原菌的作用，并对B群脑膜炎奈瑟菌菌株具有保护效果，具有高效、广谱、和低价的优越性。同时本发明提供的疫苗采用粘膜免疫的途径，具有无组织损伤、无局部副作用和使用简便的特点，易于推广使用；

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为制备fHbp、NHBA、fHbp-Opa(HV2)、pile、App、IgA Protease蛋白过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图2为实施例2中Men.B-V6免疫诱导小鼠产生的抗原特异性血清IgG反应结果图；

图3为实施例2中Men.B-V6免疫诱导小鼠产生的抗原特异性分泌型IgA反应结果图；

图4为实施例3中Men.B-V6免疫诱导小鼠产生对抗原特异性的Th17免疫细胞反应结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明中做进一步的阐述：

便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

CpG：参考文献Iho S,Maeyama J,Suzuki F.CpG oligodeoxynucleotides asmucosal adjuvants.Hum Vaccin Immunother.2015；11(3):755-60.

载体pET28a(+)：Novagen公司,Cat.No.69846-3。载体pGEX6P-1：淼灵生物,Cat.P0005。载体pCold-SUMO：海基生物科技有限公司,Cat.C1801M。大肠杆菌BL21(DE3)：购自北京全式金生物技术有限公司,产品编号:CD601-02。(ICR)IGS小鼠：购自CharlesRiver；STRAIN CODE：201。

实施例1

补体结合蛋白(fHbp)的制备

1、以B群脑膜炎临床菌株2015-16#的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CATCATATGGTCGCCGCCGACATCGGCGC-3’；

R1：5’-GATCTCGAGCTACTGTTTGCCGGCGATGC-3’。

2、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切载体pET28a(+)，回收约5400bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-fHbp。根据测序结果，对重组质粒pET28a-fHbp进行结果描述如下：在载体pET28a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第28-274位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列2所示的融合基因，表达序列表的序列3所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-fHbp导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/ml，37℃、220rpm振荡培养4小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、3000rpm离心20分钟收集菌体沉淀，用pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇6秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用溶液Ⅰ(pH为7.4，溶剂为水，含20mM Na2HPO4和500mM NaCl)进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后用溶液Ⅱ(pH为7.4，溶剂为水，含200mM咪唑、20mM Na2HPO4和500mM NaCl)进行2个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ洗脱时的过柱后溶液，将其命名为fHbp溶液。

每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的蛋白10毫克。

NHBA的制备

1、B群脑膜炎临床菌株2015-16#的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CCGCCATGGCGAATGGCGGTAGCAATTTT-3’；

R1：5’-CCGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCG-3’。

2、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a(+)，回收约6000bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-NHBA。根据测序结果，对重组质粒pET28a-NHBA进行结果描述如下：在载体pET28a(+)的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第397-1284位核苷酸所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列5所示的融合基因，表达序列表的序列6所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-NHBA导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/ml，37℃、220rpm振荡培养4小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用溶液Ⅰ(pH为7.4，溶剂为水，含20mM Na2HPO4和500mM NaCl)进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后用溶液Ⅱ(pH为7.4，溶剂为水，含200mM咪唑、20mM Na2HPO4和500mM NaCl)进行2个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ洗脱时的过柱后溶液，将其命名为NHBA溶液。

每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的蛋白24毫克。

fHbp-Opa(HV2)的制备

1、Opa作为穿膜蛋白，结构要更复杂，具有16个跨膜区，同样无法获得可溶性蛋白，将毒力因子fHbp作为Opa膜外可溶区域的分子支架，将Opa膜外可溶区域VR2 loop与fHbp构成嵌合抗原，并且嵌合抗原可以产生免疫保护。具有为fHbp删除信号肽的氨基酸序列，同时删除其第240位天冬氨酸，并插入Opa膜外可溶区域VR2 loop。其中以B群脑膜炎球菌临床菌株2015-16#基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，测序获得HV2序列:

F1：5′-TGAAAACCGTAGCCTACGGACACGTTAGGCATCA-3′

R1：5′-CAGCATCCGCCGCTTGGGTGGCATACGCCATATCG-3′

2、B群脑膜炎球菌标准菌株MC58基因组DNA为模板,用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，获得fHbp骨架：

F1：5′-TGTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGTCGCCGCCGACATCGGT-3′

R1：5′-ATATCGGCCTTGCCGCCAAGCAACTCGAGCGGCCGCATCGTG-3′

4、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切载体pGEX6P-1。

5、将步骤2、3的酶切产物和步骤4的载体骨架同源重组，得到重组质粒pGEX6P-1-fHbp-Opa(HV2)。根据测序结果，对重组质粒pGEX6P-1-fHbp(Opa)进行结果描述如下：在载体pGEX6P-1的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列7和序列8所示的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列9所示的融合基因，表达序列表的序列10所示的融合蛋白。

6、将重组质粒pGEX6P-1-fHbp-Opa(HV2)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

7、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD560nm＝0.6时加入IPTG诱导，37℃、220rpm振荡培养4小时。

8、取步骤7的培养体系，4℃、3000rpm离心20分钟收集菌体沉淀，用pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

9、将步骤8得到的上清液上样于GST rap HP，先用平衡缓冲液进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后用洗脱液洗脱以获得目的蛋白。

10、将步骤9所的洗脱液经过AKTA purifier进一步纯化，得到较纯的目的蛋白。

pile的制备

1、以B群脑膜炎球菌临床菌株2015-16#基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CCGCCATGGCCTGCTTATCAAGACTACACAGC-3’；

R1：5’-CCGCTCGAGGCTGGCAGATGAAGCGTCGC-3’。

2、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pCold-sumo(+)，回收约6000bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pCold-sumo-pile。根据测序结果，对重组质粒pcold-sumo-pile进行结果描述如下：在载体pCold-sumo(+)的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列11自5’端第85-504所示核苷酸双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列12所示的融合基因，表达序列表的序列13所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pCold-sumo-pile导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含50μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD560nm＝0.6时加入IPTG诱导并使其浓度为40μg/ml，37℃、220rpm振荡培养4小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、3000rpm离心20分钟收集菌体沉淀，用pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于GE公司Ni Sepharose 6Fast Flow，先用溶液Ⅰ(pH为7.4，溶剂为水，含20mM Na2HPO4和500mM NaCl)进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后用溶液Ⅱ(pH为7.4，溶剂为水，含200mM咪唑、20mM Na2HPO4和500mM NaCl)进行2个柱体积的洗脱以获得目的蛋白，收集采用溶液Ⅱ洗脱时的过柱后溶液，将其命名为pile溶液。

每升步骤6的培养体系可获得90％纯度以上的蛋白12毫克。

App的制备

1、以B群脑膜炎球菌临床菌株2015-16#基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5′-CATGCCATGGGGATCCGAAAAAGACAACG-3′

R1：5′-CCGCTCGAGCTCGAGGTCGACGCCTAATT-3′

2、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-App。根据测序结果，对重组质粒pET28a-App进行结果描述如下：在载体pET28a-App的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列14自5’末端第3229-4362位所示核苷酸的双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列15所示的融合基因，表达序列表的序列16所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-App导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD560nm＝0.6,待培养基冷却至15℃后，加入IPTG诱导，15℃、220rpm振荡培养24小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、3000rpm离心20分钟收集菌体沉淀，用pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于Ni Sepharose 6Fast Flow，先用平衡缓冲液进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后分别用0、20、50、100、150mM的咪唑洗脱以获得目的蛋白，收集采用150mM咪唑洗脱时的过柱后溶液。

9、将步骤8所的洗脱液经过AKTA purifier进一步纯化，得到较纯的目的蛋白。

IgA Protease的制备

1、以B群脑膜炎球菌临床菌株2015-16#基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5′-CATGCCATGGGCATTGGTCAGAGACGATGTCG-3′

R1：5′-ACGCCTCGAG GTTCTCGGCATAAGGATTGTACAAT-3′

2、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-IgAProtease。根据测序结果，对重组质粒pET28a-IgA Protease进行结果描述如下：在载体pET28a的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列17自5’末端第82-2904所示核苷酸双链DNA分子。插入的双链DNA分子与载体骨架上的部分DNA形成序列表的序列18所示的融合基因，表达序列表的序列19所示的融合蛋白。

5、将重组质粒pET28a-IgA Protease导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

6、将步骤5得到的重组菌接种于含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养至OD560nm＝0.6,待培养基冷却至15℃后，加入IPTG诱导，15℃、220rpm振荡培养24小时。

7、取步骤6的培养体系，4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体沉淀，用pH7.4的PBS缓冲液悬浮菌体沉淀并进行超声破碎(功率为200W，每工作4秒间歇8秒，循环99次)，然后12000rpm离心20分钟，收集上清液。

8、将步骤7得到的上清液上样于Ni Sepharose 6Fast Flow，先用平衡缓冲液进行10个柱体积的洗脱以去除杂蛋白，然后分别用0、20、50、100、150mM的咪唑洗脱以获得目的蛋白，收集采用150mM咪唑洗脱时的过柱后溶液。

9、将步骤8所的洗脱液经过AKTA purifier进一步纯化，得到较纯的目的蛋白。

以上制备fHbp、NHBA、fHbp-Opa(HV2)、pile、App、IgAprotease蛋白过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图如附图1所示。其中Men.B重组蛋白fHbp(Mw≈34kd)，NHBA(Mw≈30kd)，fHbp-Opa(HV2)-GST(Mw≈59kd)，pile(Mw≈27kd)，App(Mw≈42kd)，IgA Protease(Mw≈107kd)。

实施例2

Men.B-V6免疫诱导小鼠产生的抗体反应，将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为两组，分组处理如下：

CpG组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入CpG溶液；

Men.B-V6组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是将实施例1制备的6种重组蛋白和CpG溶液混合得到的，每只小鼠每次给予6种重组蛋白各10μg和10μg CpG)。实验第21天，麻醉小鼠后尾部取血和口腔灌洗液，ELIAS测血清IgG，口腔灌洗液IgA。结果见附图2和附图3。与CpG组相比，Men.B-V6组显著诱导了抗原特异性血清IgG和分泌型IgA。

实施例3

Men.B-V6粘膜免疫诱导Th17细胞的免疫反应，将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为两组，分组处理如下：

CpG组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入CpG溶液；

Men.B-V6组：实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入疫苗液(疫苗液是将实施例1制备的6种重组蛋白和CpG溶液混合得到的，每只小鼠每次给予6种重组蛋白各10μg和10μg CpG)。实验第21天，取脾脏和肺部组织提取细胞，采用ELISPOT测Men.B-V6抗原特异性IL-17+细胞。结果见附图4，与CpG组相比，GBSV6组显著诱导脾脏和肺部组织中抗原特异性Th17细胞，表明Men.B-V6鼻腔免疫小鼠诱导Th17细胞的反应。

实施例4

补体介导的杀菌测定，为了制备小鼠抗血清，Men.B-V6粘膜免疫诱导Th17细胞的免疫反应，将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分组，分组处理如下：

表1.多组分疫苗成分的配方分组

实验第1天、第7天和第14天分别经鼻腔滴入对照组(CpG佐剂组)疫苗液(疫苗液是将实施例1制备的6种重组蛋白按照表一分组与CpG溶液混合得到的，免疫小鼠。实验第21天，断尾取血，并在测试前在56℃下热灭活30分钟，来自幼兔血清用作补体来源，血清杀细菌滴度被定义为细菌与反应混合物孵育60分钟后，所剩CFU相比反应前减少50％所对应的血清稀释度。结果见表2：

表2B群脑膜炎临床菌杀菌力实验BC50(Titer)

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员还应理解，可以对实施例进行多种修改而不脱离本发明的范围和精神。本发明的范围由所附权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种预防血清群B脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗的活性成分包括成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己、成分庚；

所述成分甲为补体调节因子H结合蛋白fHbp、具有所述fHbp全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述fHbp全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述fHbp全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述fHbp全长或部分编码基因DNA表达载体；

所述成分乙为NHBA、具有所述NHBA全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述NHBA全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述NHBA全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述NHBA全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分丙为fHbp-Opa(HV2)、具有所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述fHbp-Opa(HV2)全长或部分编码基因DNA表达载体；

所述成分丁为pile、具有所述pile全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述pile全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述pile全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述pile全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分戊为App、具有所述App全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述App全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述App全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述App全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分己为IgA protease、具有所述IgA protease全长或部分氨基酸序列的融合蛋白、所述IgA protease全长或部分氨基酸序列与佐剂蛋白共轭连接的蛋白、所述IgAprotease全长或部分氨基酸序列与多糖的连接复合物或携带所述IgA protease全长或部分编码基因的DNA表达载体；

所述成分庚为免疫佐剂CpG；

所述成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己、成分庚的质量配比为1：1：1：1：1：1：1。

2.根据权利要求1所述的一种预防血清群B脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗，其特征在于：

所述成分甲为fHbp，具有所述fHbp去除信号肽之后的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:3所示；

所述成分乙为NHBA，具有所述NHBA去除信号肽和细胞壁锚定结构域后的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:6所示；

所述成分丙为fHbp-Opa(HV2)-GST，具有所述fHbp去除信号肽和Opa(HV2)多变区的氨基酸序列，以及GST标签，具体如SEQ ID NO:14所示；

所述成分丁为pile，具有所述pile去除信号肽后的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:17所示；

所述成分戊为App，具有所述App的结合结构域的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:20所示；

所述成分己为IgA Protease，具有所述IgA Protease去除信号肽和细胞壁锚定结构域后的氨基酸序列，具体如SEQ ID NO:23所示。

3.根据权利要求1或2所述的一种预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗的使用方式包括肺部吸入、鼻腔吸入、口服、皮下注射、皮内注射、生殖道注入、肛内注入。

4.根据权利要求3所述的一种预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗的使用方式为鼻腔吸入。

5.根据权利要求4所述的一种预防B群脑膜炎球菌感染的广谱多联亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中成分甲、成分乙、成分丙、成分丁、成分戊、成分己、成分庚的用量为10μg/次；免疫次数为3次，间隔一周。

6.权利要求1-5任一项所述的疫苗在制备预防B群脑膜炎球菌感染的药物中用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述疫苗的功能为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)或(III)：(Ⅰ)高效诱导血清中IgG以及黏膜中分泌型IgA；(Ⅱ)能诱导肺中及脾脏Th17为主的特异性T细胞反应；(Ⅲ)黏膜免疫能诱导对临床菌株具有高杀菌活性的中和抗体。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的B群脑膜炎球菌包括不同的B群脑膜炎球菌流行菌株。

9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述预防B群脑膜炎球菌感染为预防不同B群脑膜炎球菌导致的人感染。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述人感染为呼吸系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统、皮肤以及血液循环系统感染。