CN101411872A - 预防龋齿的疫苗试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种预防龋齿的疫苗试剂盒，所述的预防龋齿的疫苗试剂盒包括抗原和佐剂，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的至少一种表面蛋白抗原和至少一种龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶的重组质粒，所述佐剂为一种或者一种以上细菌的鞭毛蛋白。本发明的预防龋齿的疫苗试剂盒，免疫原性强、可激发全面持久的免疫应答，而且特异性强、免疫效果均一，操作简便。本发明还提供一种免疫效果优良、操作简便的预防龋齿的疫苗试剂盒的使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及口腔医学预防技术领域，特别涉及一种预防龋齿的疫苗试剂盒和使用该疫苗试剂盒的方法。
背景技术
目前，龋病仍是威胁人类口腔健康的全球性问题，寻求一种简便、经济、有效的防龋方法是众多龋病研究者追求的目标。免疫防龋研究已有40年的历史，积累了大量的理论与实践成果，并且还在不断发展。
上世纪60年代，大量流行病学和病因学研究显示，变形链球菌是人类主要的致龋微生物，它在口腔中的定植与龋病的发生密切相关。1965年，Thomas及其同事报道IgA系统是唾液中首要的特异性免疫成分。经过几十年的大量研究，一些重要的发现为免疫防龋奠定了理论基础。第一，变形链球菌和茸毛链球菌被公认为是主要的致龋菌，它们能够黏附于牙面，具有产酸和耐酸的致龋特性。变形链球菌的表面蛋白抗原Ag I/II(PAc，P1)、茸毛链球菌的细胞表面蛋白抗原SpaA(PAg)、它们的葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTF)和葡聚糖结合蛋白(Gbp)参与细菌在牙面的定植过程，是重要的毒力因子。目前，防龋疫苗的候选抗原多集中在这几个蛋白。第二，随着对黏膜免疫系统研究的深入，目前已明确唾液中的分泌性IgA(S-IgA)抗体对防龋起主要作用。通过黏膜免疫刺激共同黏膜免疫系统，诱导唾液S-IgA抗体是更为有效的免疫防龋途径，更容易被接受也更安全。唾液S-IgA抗体对抗致龋菌的机制包括干扰细菌对牙面的蔗糖非依赖性和蔗糖依赖性黏附，干扰细菌在牙面的聚集以及可能抑制细菌的代谢活动。此外，血清抗体、牙龈内抗体、补体和粒细胞不断地从龈沟渗出到口腔，这些成分也可能对牙颈部产生适度的保护作用，但对牙冠部分无明显作用。
DNA疫苗是20世纪90年代初出现的一种新型疫苗，其基本原理是将外源性基因直接导入宿主细胞内，诱导宿主免疫系统对目的基因所表达的蛋白发生免疫反应，达到预防疾病的目的。DNA疫苗具有免疫原性强、可激发全面持久的免疫应答、可制备成多价疫苗、制备简单等优点。但是，我们要看到目前为止DNA免疫所得到的结果还很不均一，有的DNA疫苗能起到很好的保护作用，有的却保护不明显，甚至还有免疫自然宿主反而加重了病毒感染的报道。目前DNA免疫尚处于探索时期，所用的动物、表达载体、基因片段等均不相同，结果差别甚大。
免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。分子生物学技术的发展，促进了基因重组疫苗和多肽疫苗的研究。这些疫苗如果用佐剂辅助其刺激机体产生强的免疫应答，将使机体更好的获得对病原体的保护免疫。目前在动物实验中使用最广泛的Freund不完全佐剂和完全佐剂，是一类强有力的TH1细胞活化剂，能诱导有效的细胞和体液免疫，但由于其严重的副作用，不能应用于人类。目前广泛应用于人类的佐剂只有铝盐和角鲨烷油/水乳化剂(M F59)，主要是增强体液免疫，但不能诱导强的CTL免疫应答，而后者对抗某些病毒(如H IV等)和一些肿瘤(如淋巴瘤EL4等)尤为重要。
因此，需要发明一种新的预防龋齿的疫苗以解决上述问题。
发明内容
本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种免疫原性强、可激发全面持久的免疫应答，而且特异性强、免疫效果均一的预防龋齿的疫苗试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种免疫效果优良、操作简便的预防龋齿的疫苗试剂盒的使用方法。
本发明提供一种预防龋齿的疫苗试剂盒，所述的预防龋齿的疫苗试剂盒包括抗原和佐剂，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的至少一种表面蛋白抗原和至少一种龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶的重组质粒，所述佐剂为一种或者一种以上细菌的鞭毛蛋白。
作为本发明优选实施方式，预防龋齿的疫苗试剂盒所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶GTF的重组质粒，所述佐剂为沙门氏杆菌鞭毛蛋白。
作为本发明优选实施方式，预防龋齿的疫苗试剂盒所述的重组质粒的质粒载体为pVAX、pcDNA3.0或pcDNA3.1。预防龋齿的疫苗试剂盒所述的重组质粒的质粒载体最优选为pVAX。
本发明预防龋齿的疫苗试剂盒提供的预防龋齿的疫苗，由于采用的疫苗的活性成分是编码变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶的重组质粒，能够将编码变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶的外源性基因直接导入宿主细胞内，诱导宿主免疫系统对变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶发生免疫反应，达到预防龋齿的目的。该疫苗免疫原性强、可激发全面持久的免疫应答，而且特异性强、免疫结果均一，是理想的防龋疫苗。
本发明预防龋齿的疫苗试剂盒所述的重组质粒的质粒载体为pVAX、pcDNA3.0或pcDNA3.1，符合美国FDA的标准，不会对使用人群构成安全威胁。预防龋齿的疫苗试剂盒所述的重组质粒的质粒载体最优选为pVAX，在pVAX、pcDNA3.0或pcDNA3.1的预防效果中最好。
本发明预防龋齿的疫苗试剂盒提供的预防龋齿的疫苗，采用的疫苗的佐剂为沙门氏杆菌鞭毛蛋白。鞭毛，决定细菌活动性的重要因素，一般由钩形鞘(hook)、基体和鞭毛丝(filament)构成。已知鞭毛具有多种功能，如细菌的泳动活动性或爬动活动性，决定细菌的趋向性，形成生物膜和决定细菌的粘附性。沙门氏杆菌具有极性鞭毛。鞭毛的结构成分称为鞭毛蛋白，且该鞭毛蛋白形成规则排列的鞭毛丝。根据最近的研究结果，已???知哺乳动物Toll-样受体-5(Toll-likereceptor-5，TLR-5)识别革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的鞭毛蛋白，并随后激活宿主细胞的NF-kB途径。TLR，识别与病原体相关的分子模型的受体，作为抵抗各种传染病原体的第一防线天然免疫系统的主要成分，而且是与有效适应性免疫应答的刺激相关的细胞受体。因此，TLR激动剂可以是开发各种疫苗佐剂的靶标。
本发明的发明人发现沙门氏杆菌的鞭毛蛋白是TLR-5的激动剂，刺激上皮细胞、成熟人树突细胞产生白细胞介素8(IL-8)，在与变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶混合，并用其经由鼻内途径对小鼠免疫1次的情况下，与只给予变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶的情况相比，显示出显著提高的粘膜IgA。
本发明还提供一种将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，所述方法包括：
(a)将预防龋齿的疫苗试剂盒中有效量的抗原施用于所述的对象上，所述的抗原是共表达龋齿变形链球菌的至少一种表面蛋白抗原和至少一种龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶的重组质粒；
(b)在步骤(a)实施后间隔2-4天，将预防龋齿的疫苗试剂盒中有效量的佐剂施用于已经实施步骤(a)的对象上，所述的佐剂为一种或者一种以上细菌的鞭毛蛋白。
作为本发明优选实施方式，将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，所述的步骤(b)在步骤(a)实施后间隔3天，将预防龋齿的疫苗试剂盒中有效量的佐剂施用于已经实施步骤(a)的对象上。
作为本发明优选实施方式，将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，所述的步骤(a)和步骤(b)的施用方式为黏膜免疫。
作为本发明优选实施方式，将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶GTF的重组质粒，所述佐剂为沙门氏杆菌鞭毛蛋白。
黏膜免疫系统亦称黏膜相关淋巴组织，主要指呼吸道、肠道及泌尿生殖道黏膜固有层和上皮细胞下散在的无被膜淋巴组织以及某些带有生发中心的器官化的淋巴组织，如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结、阑尾等。黏膜系统在机体免疫防御机制中的重要作用表现为：①人体黏膜的表面积约400m2，是阻止病原微生物等入侵机体的主要物理屏障；②机体近50％的淋巴组织存在于黏膜系统，故黏膜相关淋巴组织被视为执行局部特异性免疫功能的主要部位。
在呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道黏膜皮下区含有大量具有免疫能力的细胞，如B淋巴细胞和T淋巴细胞。这些细胞组成黏膜相关淋巴组织，是黏膜免疫系统的主要构成成分。黏膜表面免疫系统与全身免疫系统相比有许多不同的功能。研究表明通过注射免疫诱导的全身免疫反应可有效地清除其感染，但通常不能保护黏膜表面。黏膜免疫系统的诱导，尤其是感染部位黏膜免疫的诱导，为抵御黏膜感染提供主要保护作用。
黏膜免疫系统在很多方面不同于全身免疫系统。黏膜免疫可以刺激黏膜和全身免疫反应，系统免疫不能激活黏膜免疫，只能诱导全身免疫反应。黏膜免疫反应可以诱导机体产生分泌性IgA，而系统免疫通常不产生分泌性IgA。黏膜表面分泌性IgA的产生是由于抗原暴露于局部黏膜相关淋巴组织，尤其是位于上呼吸道(鼻相关淋巴组织)和胃肠道(肠相关淋巴组织)的淋巴组织。鼻相关淋巴组织包含腭扁桃体和咽扁桃体，肠相关淋巴组织由派氏集合淋巴结、阑尾、胃肠道孤立淋巴结组成。鼻相关淋巴组织和肠相关淋巴组织表面上皮均含有特异抗原采样细胞，如M细胞。这些细胞可以将抗原从黏膜表面转运到底层淋巴组织。进入黏膜相关淋巴组织后，抗原很快被诸如皮下树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞内化和加工，并提呈位于黏膜相关淋巴组织中的B细胞和T细胞。遭遇特异性抗原的B淋巴细胞活化、增殖并转化成定向IgA细胞。这些细胞最终离开黏膜相关淋巴组织，通过循环系统到达各个不同的黏膜位点，包括初始诱导位点，最终分化为产生分泌性IgA的浆细胞。
研究证实，在一个黏膜位点刺激黏膜免疫系统可以导致刺激部位和异端黏膜表面产生分泌性IgA。在胃肠道中的派氏集合淋巴结的抗原刺激不仅使肠道中的B细胞产生分泌性IgA，而且在支气管和泌尿生殖道也产生分泌性IgA。这种诱导和产生分泌性IgA彼此相联系的黏膜系统被称为共同黏膜免疫系统。
几项研究发现在共同黏膜免疫系统中存在次级划分。来自于黏膜诱导位点的定向IgA B细胞可以优先移居到一定的效应位点而不是无选择地到所有黏膜表面。来自于鼻相关淋巴组织的定向IgA B细胞主要提供上呼吸道、消化道黏膜保护作用，而泌尿生殖道的定向IgA B细胞可来自下消化道；来自于肠相关淋巴组织的定向IgA B细胞主要提供给胃肠道。这种在共同黏膜免疫系统中的次级划分对免疫途径的选择有重要影响。利用该特点，通过呼吸道接种疫苗间接实现上消化道免疫防护，可以避免消化道免疫无法克服的困难。
本发明将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，由于疫苗与佐剂采用了间隔2-4天的不同的施用时机，操作简便，取得了意想不到的免疫效果，比同时施用疫苗和佐剂的效果好，特别是间隔3天施用佐剂，免疫效果更佳。
本发明将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，采用的施用方式为黏膜免疫，操作方便，能够同时诱导黏膜和系统免疫增强免疫效率。
附图说明
图1为本发明预防龋齿的疫苗试剂盒首次免疫三周后抗血清的滴度示意图；
图2为本发明预防龋齿的疫苗试剂盒加强免疫后小鼠唾液中抗原特异性IgA应答水平的示意图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。本发明的具体实验方法可参见美国冷泉港实验室出版社的《分子克隆实验指南》第三版。
实施例1
一种预防龋齿的疫苗试剂盒，包括抗原和佐剂，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶GTF的重组质粒，所述佐剂为沙门氏杆菌鞭毛蛋白。
本发明提供的预防龋齿的疫苗试剂盒，由于采用的疫苗的活性成分是编码变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF的重组质粒，能够将编码变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF的外源性基因直接导入宿主细胞内，诱导宿主免疫系统对变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF发生免疫反应，达到预防龋齿的目的。该疫苗免疫原性强、可激发全面持久的免疫应答，而且特异性强、免疫结果均一，是理想的防龋疫苗。
龋病是一种严重危害人类口腔及全身健康的常见多发的细菌感染性疾病，其主要致病菌为变形链球菌。采用免疫学手段预防和控制致龋菌的感染，可以达到降低龋病发病率的目的。早在上世纪60年代末，国外有学者将变形链球菌全细胞制备灭活疫苗和减毒活疫苗，免疫动物后唾液和血清中抗变形链球菌抗体水平明显升高，有效地抑制了变形链球菌在牙面的聚集，并降低了龋病发生率。但进一步研究显示，变形链球菌某些抗原或成分可诱发与人心脏组织发生交叉反应的抗体，存在安全性问题。随着人们对变形链球菌细胞壁各种抗原性多聚物逐渐认识，80年代出现了以变形链球菌单一抗原成分制备的亚单位防龋疫苗。目前，已经明确，变形链球菌的表面蛋白抗原PAc，葡糖基转移酶GTF参与细菌在牙面的定植过程，是重要的毒力因子。针对变形链球菌表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF诱导产生口腔粘膜特异IgA抗体是疫苗保护效应的关键。DNA疫苗研制生产方便，保存运输简便，使用安全，能够在体内长期表达病原体抗原，刺激机体产生持久的免疫反应，但不能有效诱导口腔粘膜免疫应答，有效的粘膜佐剂就成为关键。
近年来，研究证明运动性革蓝氏阴性细菌的鞭毛素是一种具有潜力的免疫佐剂，能有效诱发固有性免疫应答和适应性免疫应答(Honko et al.，2004，2005；Ciacci-Woolwine et al，1998；Cuadros et al.，2004)。伤寒杆菌(Salmonllenaenteritidis)的鞭毛素作为鼻腔内免疫佐剂能在小鼠体内诱导有效防御致死量鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)的呼吸道感染(Honko et al，2006)。Vibrio vulnificus的鞭毛素作为鼻腔内免疫佐剂与破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)一起免疫小鼠能诱导有效的保护免疫效应(Le et al，2006)。而且，属于肠道病原的大肠杆菌鞭毛素能激发产生白细胞介素-8(Steiner et al.，2000；Zhou et al.，2003)。更重要的是体内已产生存在的鞭毛素特有免疫性并不会削弱鞭毛素融合蛋白疫苗的有效性(Ben-Yedidia et al.，1998)。鞭毛素成为一种潜在的优良粘膜佐剂。
本发明结合沙门氏杆菌鞭毛蛋白粘膜佐剂活性和预防龋齿DNA疫苗的优点，采用适当免疫策略，发现可以诱导口腔特异IgA抗体免疫应答。
实施例2
一种预防龋齿的疫苗试剂盒，包括抗原和佐剂，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶GTF的重组质粒，所述佐剂为沙门氏杆菌鞭毛蛋白；所述的重组质粒的质粒载体为pVAX。
本发明预防龋齿的疫苗试剂盒的其他实施例中，所述的重组质粒的质粒载体还可以为pcDNA3.0或pcDNA3.1。pVAX、pcDNA3.0或pcDNA3.1符合美国FDA的标准，其使用不会对使用人群构成安全威胁。预防龋齿的疫苗试剂盒所述的重组质粒的质粒载体最优选为pVAX，在pVAX、pcDNA3.0或pcDNA3.1的预防效果中最好。
实施例3
预防龋齿试剂盒中的抗原的制备方法，包括：
(a)用限制性酶NheI和NotI酶切处理靶向融合防龋真核表达质粒pGJA-P，切下靶向融合基因(包括CTLA-4-Ig目的基因、GLU、A-P片段)，将靶向融合基因克隆到pVAX1载体中，酶切证实构建的正确性，并命名为pGJA-P/VAX。
(b)将带有目的基因的载体导入大肠杆菌DH5a感受态细胞；
(c)大规模培养目的菌株，并使用EndoFree Plasmid Maxi Kit提取目的菌株中的质粒(该大提质粒QIAGEN试剂盒有去除内毒素的功能)；
(e)使用分光光度计测定提纯的质粒DNA浓度；
(f)使用鲎试剂检测提纯的质粒DNA的内毒素含量是否超标，内毒素含量<10EU/mg。
CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)，又称CD152，是免疫球蛋白超家族的一员。它主要表达于活化的T细胞表面，亦可表达于CTL细胞。CTLA4结构基因包括四个外显子，分别编码先导序列、胞外区、跨膜区及胞浆区四个独立的功能区，其胞外区包含一个Ig的V样功能区，侧翼与两个疏水区相接，其中一个可以将CTLA4锚定在细胞膜上。研究表明CTLA4与表达于抗原递呈细胞(APC)表面的CD80和CD86分子有很强的结合能力，是另一配体CD28的10-100倍(Ostrov DA，Shi W，Schwartz JCD，et al.Structure of MurineCTLA-4 and its role in modulating T cell responsiveness.Science，2000，290(27)：816-819)1998年澳大利亚学者Boyle等研究了结合有CTLA4基因片段的DNA疫苗并免疫小鼠，2周后测得特异性抗体水平比对照组高达10000倍(Boyle JS，Brady JL，Lew AM.，Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigenthat is directed to sites of immune induction.Natrue，1998，392(26)：408-411)。其原因可能为CTLA4定向引导抗原与APC表面的B7分子结合，促进了APC摄取抗原，而APC在摄取抗原之后，自身被激活，表达了更多的B7分子，从而使更多的抗原被DC摄取、加工，起到了放大免疫反应的作用。
实施例4
预防龋齿试剂盒中的佐剂——沙门氏杆菌鞭毛蛋白的制备方法，包括：
(a)沙门氏杆菌鞭毛蛋白克隆制备：
①PCR扩增编码E.coli K 12 strain鞭毛素的DNA；
②将其与质粒载体pET28a基因重组，得到重组质粒。
(b)表达大肠杆菌鞭毛蛋白：
①将重组质粒转化到宿主载体E.coli DE3中；
②菌液扩增至对数期后用IPTG与乳糖诱导4—5小时，离心收取菌体。
(c)纯化大肠杆菌鞭毛蛋白：
①超声破碎菌体；
②利用Ni柱纯化蛋白，超滤浓缩，透析；
③用Trion-X114法去内毒素。
(d)鉴定大肠杆菌鞭毛蛋白：
①SDS-PAGE法跑胶确定蛋白纯度>98％；
②Western-blot鉴定蛋白；
③鲎试剂法确定内毒素含量<0.005Eu/ug。
通常已知的是，在通过粘膜途径接种疫苗的情况下，与通过皮内或皮下途径接种疫苗相比，能更有效地诱导粘膜免疫应答，而且粘膜免疫应答主要通过免疫球蛋白A(IgA)来介导。经由粘膜途径的接种疫苗的优点是不仅增强全身免疫应答而且同时还增强粘膜免疫应答。因此，扩大了对诱导粘膜组织内有效免疫应答的预防性疫苗开发研究的关注。
疫苗佐剂最重要的因素之一是具有免疫控制功能，如控制抗原递呈细胞的共刺激分子的表达和由抗原特异性T细胞诱导作用诱导的细胞因子分泌。目前使用的或相关的作为疫苗佐剂的物质是无机盐如氢氧化铝凝胶、表面活性剂、源自细菌的物质、细胞因子、激素、聚阴离子、聚丙烯(polyacryls)，利用载体(carrier)和病毒的活载体(living vector)，以及诸如矿物油或脂质体的媒介物(vehicle)。其中，研究最积极和引人注意的疫苗佐剂是源自蛋白的粘膜疫苗佐剂，如来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的霍乱毒素(cholera toxin，CT)和来自埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)的热不稳定性毒素(heat-labile toxin，LT)。据报道，这些疫苗佐剂经由粘膜组织途径的给药诱导血清和粘膜组织中产生抗原特异性抗体，并促进由抗原递呈细胞表面上B7-2表达诱导的T细胞的共刺激信号。然而，这些佐剂是具有高肠毒素毒性的外毒素，因此不适于直接用于人类。现今世界范围内正在进行的研究的目的是制备毒性更低但佐剂活性更高的佐剂。
本发明的发明人发现沙门氏杆菌的鞭毛蛋白是TLR-5的激动剂，刺激上皮细胞、成熟人树突细胞产生白细胞介素8(IL-8)，在与变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF混合，并用其经由鼻内途径对小鼠免疫1次的情况下，与只给予变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF的情况相比，显示出显著增多的粘膜IgA。
实施例5
本发明预防龋齿试剂盒中的疫苗和佐剂的使用方法：
(a)用混合的沙门氏杆菌鞭毛蛋白和编码变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF的DNA鼻内免疫小鼠；
(b)用单独的沙门氏杆菌鞭毛蛋白(SF)鼻内免疫小鼠，分别间隔1-5天后，将编码变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶GTF的DNA鼻内免疫小鼠；
(c)测量初次免疫后小鼠血清中抗原特异性免疫应答的水平。
结果见图1。
(d)测量加强免疫后小鼠唾液中抗原特异性IgA应答的水平。
| 初免(0周) | 加强(第2周) | 第二次加强(第8周) | |
| 2 | DNA(50ug) | 蛋白(50ug) | 蛋白(50ug) |
| 3 | 蛋白(50ug) | 蛋白(50ug) | 蛋白(50ug) |
| 4 | 空载体 | 蛋白(50ug) | —— |
| 5 | 空载体 | PBS | PBS |
| 6 | DNA(50ug)+同时加佐剂SF(5ug) | 蛋白(50ug) | 蛋白(50ug) |
| 7 | DNA(50ug)+3天后加佐剂SF(5ug) | 蛋白(50ug) | 蛋白(50ug) |
| 8 | DNA(50ug)+5天后加佐剂SF(5ug) | 蛋白(50ug) | 蛋白(50ug) |
结果见图2。
由图1和图2可见，由于疫苗与佐剂采用了间隔2-4天的不同的施用时机，操作简便，取得了意想不到的免疫效果，比同时施用疫苗和佐剂的效果好，特别是间隔3天施用佐剂，免疫效果更佳。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种预防龋齿的疫苗试剂盒，其特征在于，所述的预防龋齿的疫苗试剂盒包括抗原和佐剂，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的至少一种表面蛋白抗原和至少一种龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶的重组质粒，所述佐剂为一种或者一种以上细菌的鞭毛蛋白。
2.如权利要求1所述的预防龋齿的疫苗试剂盒，其特征在于，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶GTF的重组质粒，所述佐剂为沙门氏杆菌鞭毛蛋白。
3.如权利要求1或2所述的预防龋齿的疫苗试剂盒，其特征在于，所述的重组质粒的质粒载体为pVAX、pcDNA3.0或pcDNA3.1。
4.如权利要求3所述的预防龋齿的疫苗试剂盒，其特征在于，所述的重组质粒的质粒载体为pVAX。
5.一种将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，所述方法包括：
(a)将预防龋齿的疫苗试剂盒中有效量的抗原施用于所述的对象上，所述的抗原是共表达龋齿变形链球菌的至少一种表面蛋白抗原和至少一种龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶的重组质粒；
(b)在步骤(a)实施后间隔2-4天，将预防龋齿的疫苗试剂盒中有效量的佐剂施用于已经实施步骤(a)的对象上，所述的佐剂为一种或者一种以上细菌的鞭毛蛋白。
6.如权利要求5所述的将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，其特征在于，所述的步骤(b)在步骤(a)实施后间隔3天，将预防龋齿的疫苗试剂盒中有效量的佐剂施用于已经实施步骤(a)的对象上。
7.如权利要求5所述的将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，其特征在于，所述的步骤(a)和步骤(b)的施用方式为黏膜免疫。
8.如权利要求5至7中任一权利要求中所述的将预防龋齿的疫苗试剂盒施用到对象上的方法，其特征在于，所述抗原是共表达龋齿变形链球菌的表面蛋白抗原PAc和龋齿变形链球菌的葡糖基转移酶GTF的重组质粒，所述佐剂为沙门氏杆菌鞭毛蛋白。
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