CN102488898B - 龋齿疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于由变形链球菌感染所造成的龋齿的疫苗组合物，该疫苗组合物包括从变形链球菌表面蛋白PAC派生的抗原和从鞭毛素派生的佐剂。本发明进一步提供制备疫苗组合物的方法。本发明还提供了通过将该疫苗组合物应用到个体来预防或治疗由变形链球菌引起的龋齿的方法。

Description

龋齿疫苗及制备方法

技术领域

本发明一般涉及到疫苗的技术，更特别为龋齿疫苗，并进一步疫苗的制备方法。

背景技术

龋齿，或称为蛀牙，是一种慢性传染病，导致钙化组织的区域消融和破坏。如果不及时治疗，龋齿可以引起相当大的痛苦和不适，并最终失去牙齿。龋齿维持一个世界性的高患病率和使得治疗的费用非常高，是一个重大的公共卫生问题。

变形链球菌（S. mutans）被认为是造成人类龋齿的首要病源细菌。变形链球菌表达一种表面蛋白，指定为抗原I / II型，B，P1，或PAc。PAc于变形链球菌在牙齿表面的初始黏附和尔后变形链球菌在牙齿表面的聚集的过程中起作用；因此PAc被认为是一个关键的致病因子，促进龋齿的病理发生。由于其在变形链球菌的龋齿生成性(cariogenicity)中的重要性，PAc是公认的研制防龋齿疫苗的目标。

在一个早期的研究中，雷纳等(Lehner et al. (Immunization with Purified Protein Antigens from Streptococcus mutans Against Dental Caries in Rhesus Monkeys. Infection and Immunity 34, 407-415 (1981))) 从细菌培养中直接纯化了蛋白抗原I，I / II，Ⅱ，Ⅲ。纯化抗原与佐剂（弗氏不完全佐剂或氢氧化铝）肌注给药。抗原I，I / II 和抗原Ⅱ（程度较轻）引起龋齿的显著减少，但是抗原Ⅲ没有引起龋齿减少。对龋齿的保护主要是与血清和龈沟液中IgG抗体相关。在这项研究中使用的免疫计划下，血清IgA抗体的滴度在log₂ 0.7和2.8之间。然而，在实验中使用的抗原的纯度是一个问题。此外，声称的有效性可能得益于给药途径，即肌肉注射。

由于变形链球菌的感染模式，粘膜免疫应是研制一种有效疫苗的优选。不幸的是，许多研究都表明，当通过粘膜途径免疫时，没有一个合适的佐剂的PAc是一个弱的免疫原。为了解决这个问题，Saito等(Protective Immunity to Streptococcus mutans Induced by Nasal Vaccination with Surface Protein Antigen and Mutant Cholera Toxin Adjuvant. Journal of Infectious Diseases 183, 823-826 (2001))从变形链球菌培养上清中纯化了PAc。PAc和MCT的鼻腔免疫诱导PAc特异性IgA抗体，唾液中的滴度（log₂，6.1+/-1.7）和鼻洗液样本中的滴度（log₂，8.2+/ -1.5）。通过PAc和MCT的鼻腔免疫诱导的抗原特异性免疫应答提供显著抑制变形链球菌的定植。然而，这项研究有严重缺陷。首先，使用的PAc抗原不是一个表达的重组蛋白；从细菌培养直接纯化不能排除显示的成效由污染造成的可能性；这与以上所述的莱纳研究相似。二，CT是有毒的；尽管它已经被研究多年，离人体应用仍然需假以时日。最后，防止龋齿的有效性并没有直接显示。

综上所述，尽管先例中已经提示PAc可能是一个研发针对由变形链球菌引起的龋齿的疫苗的可能的抗原，但是对什么是一个针对变形链球菌引起的龋齿的有效黏膜疫苗并没有指导或提示。

因此，迫切需要的是研发一个针对变形链球菌引起龋齿的有效黏膜疫苗。

发明内容

本发明提供了一种用于由变形链球菌感染引起的龋齿的疫苗组合物，该疫苗组合物包含从变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原和从鞭毛素派生的佐剂。本发明进一步提供制备疫苗组合物的方法。本发明还提供了通过给一个个体应用该疫苗组合物来预防或治疗由变形链球菌引起的龋齿的方法。

下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。

附图说明

根据本发明的优选实施方案现在参考附图加以描述，其中相似参考数字代表相似元素。

图1显示了纯化的PAc和FLIC;（A）1道：免疫印迹纯化的PAc，用HRP-交联的抗His标签的抗体检测; 2道：纯化的重组PAc的考马斯亮蓝染色，SDS – PAGE；（B）3道：重组FLIC的考马斯蓝染色，SDS - PAGE; 4道：免疫印迹纯化的FLIC, 用HRP-交联的抗His标签的抗体检测。

图2是一个图表，显示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗体的滴度，四组小鼠滴鼻免疫：（1）PBS；（2）10微克PAc；（3）10微克PAc + 1微克FLIC；（4）10微克PAc + 5微克FLIC，其中数据表示为均值±标准差。

图3是一个图表， 显示（a）血清抗- PAc IgG，（b）血清抗PAc IgA和（c）唾液抗PAc IgA的滴度，四组大鼠滴鼻免疫：（1 ）PBS；（2）5微克FLIC;（3）20微克PAc + 5微克FLIC;（4）40微克PAc + 5微克FLIC，其中数据表示为均值±标准差。

图4显示了三个示范图片，说明（A）大鼠正常磨牙的中位数矢切片（右颌骨舌侧部分）及（B）大鼠龋磨牙的中位数矢切片（右舌侧下颌骨的一部分），大鼠经变形链球菌Ingbritt的挑战和感染， 其中在图片中的箭头表示不同程度的龋齿。 （C）大鼠磨牙的中位数矢切片（右舌侧下颌骨的一部分），大鼠经20微克PAc + 5微克FLIC免疫，随后用变形链球菌Ingbritt挑战。偶尔可观察到轻度龋斑和其中一个由箭头所示。

图5包含两个图表，显示（A）四组大鼠龋齿的整体得分，每个点代表一只大鼠的龋水平和（B）四组大鼠磨牙的不同部分的龋齿的凯斯(Keyes)得分，四组大鼠滴鼻免疫：（1）PBS；（2）5微克FLIC；（3）20微克PAc + 5微克FLIC;（4）40微克PAc + 5微克FLIC。得分值表示为均值加上标准偏差值。 *与阴性对照组有显着性差异（P <0.05）。 **与阴性对照组有显着性差异（P <0.01）。 ***与阴性对照组有显着性差异（P <0.001）。符号：

, 搪瓷病变；

, 牙本质病变轻微；

, 中度牙本质病变。

图6 显示pET28a-KF-PAc质粒构建的示意图。

图7显示pET28a-KFD2-PAc质粒构建的示意图。

图8显示纯化了的PAc， KF-PAc和KFD2-PAc的（A）SDS-PAGE图及（B）Western Blot图。

图9是一个图表，显示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值±标准差。

图10包括三个图表，显示（A）血清抗PAc IgG，（B）血清抗PAc IgA和（C）唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值±标准差。

图11包括三个图表，显示（A）血清抗PAc IgG，（B）血清抗PAc IgA和（C）唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值±标准差。

图12是一个图表，显示五组大鼠龋齿的凯氏（keyes）得分，每个点代表一只大鼠的龋患水平得分值表示为均值±标准偏差值。

具体实施方式

本发明可参考以下详细描述的某些实施例而更容易理解。

在这个申请书的通篇中，在出版物被引用，这些出版物的披露的全部成为本申请书的一部份，为了更充分地描述了与本发明相关的技术状态。

本发明的应用将使用，除非另有说明，分子生物学（包括重组技术），微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，这些技术为该领域的一般人员所熟知。这些技术在文献中有详细的解释，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, second edition (Sambrook et al., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987).。

本发明的一个方面提供针对变形链球菌感染引起龋齿的作为预防或治疗药剂使用的疫苗。在一个实施例中，本发明的疫苗包括来自变形链球菌的表面抗原（PAc）和作为佐剂的鞭毛素。在某些实施例中，PAc和鞭毛素分开表达，然后在利用它们制造疫苗时再混合；在某些实施例中，PAc和鞭毛素作为一个单一的重组蛋白表达，例如PAc插入鞭毛素的高变域或替换鞭毛素的部分或全部高变域；在某些实施例中，PAc和鞭毛素被标记或交联上互补性基团，使这两种分子非常接近;在某些实施例中，PAc和鞭毛素交联;在某些实施例中，PAc和鞭毛素吸附到一个载体上，使这两种分子非常接近。

在某些实施例中，PAc抗原是全长蛋白（SEQ ID NO. 2）。在某些实施例中，PAc抗原是一个全长蛋白的编辑版本，包括主要的抗原表位。编辑版本指一个或多个PAc的主要抗原表位在一个重组蛋白表达，其中抗原表位直接耦合或被一些氨基酸分开，只要能够维持其抗原构象即可。

整个申请书中使用的“变种”，是指一种多肽，具有功能的，并与在序列表中确定的序列至少有90％的同源性，更优选至少有95％的身份。例如，对于PAc，PAc的一个变种，是指一种多肽，能用于诱导针对PAc的免疫反应，并与SEQ ID NO.1序列至少有90％的同源性。

在某些实施例中，融合蛋白包括一个可裂解连接件，置于PAc和纯化标签之间，能够通过对融合蛋白的化学或酶处理而去除融合蛋白的标签。很明显，可裂解连接件可以根据用户的愿望置于融合蛋白中的任何位置。在表达载体中，可裂解连接件包括一个DNA序列，其编码可在其C -端由化学或酶裂解的一个氨基酸或氨基酸序列。

用于裂解蛋白的化学试剂的例子包括溴化氰，2-（2 nitrophenylsulfenyl）-3-溴-3'-methylindolinium（BNPS-skatole），羟胺，和类似物。溴化氰在蛋氨酸残基的C -末端裂解蛋白。BNPS-skatole在一个色氨酸残基的C -末端切割。羟胺在ASN - Z基团的C -末端切割， 其中 Z是甘氨酸，亮氨酸，或丙氨酸。

用于裂解蛋白的酶试剂的例子包括胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，纤维蛋白溶酶，凝血酶，肠激酶，和类似物。每一个在其识别的特定氨基酸序列进行切割。例如，肠激酶识别氨基酸序列 –(Asp)_n-赖氨酸，其中n是一个从2到4的整数。

在某些实施例中，融合蛋白包括一个或多个其它纯化标签。例如，6个组氨酸残基融合到PAc的N -或C-端，允许由Ni²⁺柱来纯化PAc。纯化后，可以通过化学或酶法裂解去掉6个组氨酸残基。事实上，任何已知的纯化标签都是合适的，这里包括myc基因标记，标志肽，KT3表位，α-微管蛋白表位，T7基因10蛋白肽​​标签，谷胱甘肽- S -转移酶（GST），链球菌标签，牛胰胰蛋白酶抑制剂（BPTI），麦芽糖结合蛋白（MBP）。

如上所述，表达载体的克隆，构建和扩增技术是众所周知的。因此，PAc或FLIC表达载体按常规程序构建; 为了不掩盖本发明,没有提供进一步的细节。

粘膜表面是身体的最重要保护屏障，这是由于主要亚型S-IgA,共同粘膜免疫系统（CMIS）的产品。有几个用于局部免疫的粘膜途径，包括口腔，胃灌注，鼻腔，肺，阴道和直肠。与其它粘膜途径相比，滴鼻免疫具有更多的优点，如更方便的给药和更容易引发黏膜反应，尤其是在口腔中。鼻腔给药是一种方便的投送途径和已被证明在防龋齿疫苗接种中有效诱导唾液IgA反应。

本文所用“疫苗”指一个用于在个体中诱发免疫反应的抗原制剂。疫苗可以有一个以上的成分是抗原。

本文所用“非蛋白载体”指不是蛋白质的载体，可以用来展示多个PAc和鞭毛素抗原表位。

“微载体”一词是指微粒组合物，不溶于水，其大小小于150，120或100微米左右，更常见的小于约50-60微米左右，并可能小于约10微米左右或甚至小于约5微米左右。微载体包括“nanocarriers”，这些微载体的大小小于1微米左右，优选地小于500纳米左右。微载体包括生物相容性自然发生的聚合物，合成聚合物或合成的共聚物组成的固相颗粒等颗粒。固相微载体可以由在生理条件下不蚀或非降解的聚合物或其它材料形成，如聚苯乙烯，聚丙烯，硅胶，陶瓷，聚丙烯酰胺，金，乳胶，羟基磷灰石，及铁磁和顺磁材料。可生物降解的固相微载体可以由在生理条件下降解的聚合物（例如，聚（乳酸），聚（乙醇酸）及其共聚物如聚（D，L -乳酸- CO -乙醇酸）或可蚀的（例如，聚（如邻酯3,9 - diethylidene - 2 ,4,8,10 - tetraoxaspiro [5,5]十一烷（DETOSU）或聚（酐），如聚癸二酸（酐），）等形成。微载体通常是球形的形状，但偏离球形的微载体这也是可以接受的（例如，椭圆形，杆状形等）。微载体也可能是液相（例如，油或脂为主），如脂质体，无抗原的iscoms（免疫刺激复合物，由胆固醇，磷脂和佐剂活性的皂甙形成的稳定复合物），或在水包油型或油包水的乳化液中的水滴或胶束，如MF59。可生物降解的液相微载体通常采用一种可生物降解的油，其中一些是众所周之，包括角鲨烯和植物油。 本文所用的“nonbiodegradable”一词是指一个微载体在哺乳动物正常生理条件下不被降解或侵蚀。一般地，一个微载体被认为是nonbiodegradable，如果它在正常人血清中37℃孵化72小时后没有被降解（即失去低于5％它的质量或聚合物的平均长度）。

“个体”或“主体”是脊椎动物，如鸟类，优选地是哺乳动物，如人类。哺乳动物包括但不仅限于人类，非人类灵长类动物，农场动物，运动的动物，实验动物，啮齿类动物（如小鼠和大鼠）和宠物。

一种物质的“有效量”或“足够量”指它的量足以达到所需的生物效应，如有利的结果，包括临床结果，正因为如此，一个“有效量”依赖于它被应用的环境。在本发明的背景下，包含所需抗原组合物的有效量的一个例子是一个足以在个体中引起免疫反应的量。一个有效量可以分一次或多次给予。

“刺激”免疫反应，如体液或细胞免疫反应，是指反应的增加，可能来自反应的诱导/或提高。

本文所用，并在行内广为理解，“治疗”是一种方法去获得有益的或预期的结果，包括临床结果。对于这项发明，有益的或所需的临床效果包括，但不局限于，减轻或改善一个或多个症状，感染的程度逐渐降低，稳定（即不恶化）感染，改善或缓解的状态传染病的状态，并缓解（不论是部分或全部），无论是检出或检测不到。 “治疗”，也意味着与如果不接受治疗的预期生存相比延长生存期。

根据本发明，疫苗组合物的“剂量”，是在一个特定的时间点给予的疫苗组合物的量。一个“剂量”也可能是使用缓释配方和/或设备逐步给予个体的疫苗组合物的量。在本发明的某些实施例中，疫苗组合物的两个或更多剂量在不同时间点给予个体。

根据本发明，PAc的“免疫有效量”是指一个PAc的量，在一个处理的个体中引起针对随后挑战的变形链球菌的完全或部分的免疫力。完全或部分的免疫力，无论是定性或定量，可以通过观察在被挑战后，比较未接种疫苗个体与接种疫苗个体的龋齿的临床症状。 如果接种疫苗的个体被挑战后的的临床症状与未接种疫苗的个体被相似或相同挑症状相比是减少，减轻或消除，给予接种疫苗的个体的PAc量被视为一个“免疫有效量”。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学名词具有通常理解的相同含义

PAc的剂量是0.1至60微克。优选地，PAc剂量是0.25微克至15微克。更优选地，剂量为1至3微克。

本发明的疫苗可能进一步包括另一个佐剂。合适的佐剂的非限制性例子包括角鲨烷和角鲨烯（或其他动物源性油）;嵌段共聚物;清洁剂如吐温80; Quil，矿物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油;棒状杆菌衍生佐剂，如短棒状杆菌，牛分枝杆菌（卡介苗，卡介苗或卡介苗）;白细胞介素如白细胞介素-2和白细胞介素12；单核细胞介素如白细胞介素1， 肿瘤坏死因子；干扰素如γ干扰；表面活性物质如十六烷胺，十八烷胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂和多元醇；油乳剂;和矿物质如磷酸铝，氢氧化铝或明矾凝胶。

本发明的治疗组合物可与辅料配制，要处理的对象对辅料耐受。这些辅料包括水，生理盐水，林格氏(Ringer’s)液，葡萄糖溶液，汉克氏(Hank’s)溶液，和其他水性生理平衡盐溶液。辅料还可以含有少量添加剂，如提高等张和化学或生物稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液，碳酸氢盐缓冲液，Tris缓冲液，而稳定剂的例子包括A1/A2稳定剂。

以有效的方式来给予治疗组合物的可接受的方案包括个人剂量的大小，剂量的数目，给药频率，及给药模式。本领域的技术人员可以确定方案，其例子在本文中已有披露。

给予被定义为引入物质到个体的身体，包括口腔，鼻腔，眼，直肠，阴道和肠外途径。组合物可单独或与其他药物相结合而通过任何给药途径来给予，包括但不限于皮下（SQ），肌肉注射（IM），静脉注射（IV），腹腔（IP），皮内（ID），通过鼻腔，眼或口腔粘膜（IN）或口头。

在本发明的背景下，给予病人的剂量应足以在一段适当的时间内达到有利于病人的反应。被给予的制剂的数量可能取决被治疗的个体，包括年龄，性别，体重和一般健康状况。

本发明的免疫治疗组合物可用于预防或治疗性地免疫个体如人类。然而，也包括其他动物，优选地，脊椎动物包括驯化动物如家畜和伴侣动物。

在本发明中优选地使用的药学上可接受的载体可能包括非水溶液的无菌水溶液，悬浮液，和乳液。非水溶剂的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水溶性载体包括水，酒精/水溶液，乳液或悬浮液, 例如盐水和缓冲介质。肠外用载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏溶液或固定油。静脉用载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂如林格氏葡萄糖， 和类似物。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如，抗菌剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体和类似物。

提供下面的例子的唯一目的是为了说明本发明的原则或实施；它们绝不是旨在限制或缩小本发明的范围。

例1 细菌

在厌氧条件下，变形链球菌Ingbritt在脑心浸液培养液（BHI）于 37℃培养18小时，培养物用于感染或在-70℃下保存于甘油-BHI培养液，直到使用。

重组PAc和FLIC的表达与纯化

pVAX1是在临床试验中由美国食品和药物管理局批准的唯一载体。

所使用的PAc和鼠伤寒沙门菌鞭毛素的基因和蛋白质由SEQ ID NO 1（PAc编码序列），SEQ ID NO 2（PAc蛋白质），SEQ ID NO 3（鞭毛素编码序列），SEQ ID NO 4（鞭毛素蛋白）。使用常规重组技术，由核苷酸（657-2694）编码的PAc片段（AA219-680）和FLIC从相关的菌株进行扩增并克隆到表达质粒pET28a中，分别得到pET28a-PAc 或pET28a-FLIC。重组PAC和FLIC蛋白C -末端与6HisTag融合便利纯化。表达质粒pET28a-PAc或pET28a-FLIC分别转化到大肠杆菌BL21（DE3），单阳性克隆进行了核实。转化菌在添加了50微克/ ml卡那霉素Luria-Bertani（LB）培养液中在37℃培养过夜;0.5毫摩尔异丙基- D -半乳糖苷（IPTG）诱导对数生长期细菌。表达的重组蛋白由亲和色谱法在Ni - NTA柱（QIAGEN）纯化，纯化的蛋白由Bradford法进行定量，并通过Western blot证实，采用小鼠抗HigTag抗体（QIAGEN）和第二辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（Pierce）。 Western blot检测采用SuperSignal化学发光底物（Pierce），由一个Versadoc3000成像仪成像（BIO - RAD）。污染的内毒素和脂多糖（LPS）的去除使用AffinityPak Detoxi凝胶内毒素卸下凝胶（Pierce）。最终的蛋白质制剂的内毒素和内毒素的含量用Limulus法(Associates of Cape Cod)进行了测定，其值为<0.001 EU/微克。

例2 小鼠的免疫

对于剂量效应，4组8周龄雌性BALB / c小鼠（N = 5）滴鼻（i.n.）免疫3次，间隔为24天：（1）PBS，（2）10微克PAc，（3）10微克PAc+1微克FLIC，或（4）10微克PAc + 5微克FLIC，每只老鼠的体积为10μl，所有的蛋白质溶解在PBS 。最终免疫4周后，收集血清和唾液。从麻醉动物放血，然后血液样本离心获得血清。唾液样本收集，在腹腔（IP）注射（小鼠50μL，大鼠250μL）200微克/毫升卡巴（Sigma），以刺激流量。抗体分析之前唾液样本需要离心。血清和唾液样本在-70℃保存，直到它们用ELISA法测定。

对于长期效应，3组8周龄雌性BALB / c小鼠（N = 5）滴鼻（i.n.）免疫3次，间隔为24天：（1）PBS，（2）10微克PAc，或（3）10微克PAc +5微克FLIC；每只老鼠的体积为10μL，所有的蛋白质溶解在PBS。最终免疫后，在指定时间，血清和唾液样本的收集如上所述。

对于大鼠的剂量效应，4组雌性Wistar大鼠（N = 5）滴鼻（i.n.）免疫3次，间隔24天：（1）PBS；（2）5微克FLIC; （3）20微克PAc+5微克FLIC;（4）40微克PAc +5微克FLIC, 每只大鼠的体积为10μl，所有的蛋白质溶解在PBS。唾液和血液样本在第3，6，9，10周收集。

例3 实验大鼠模型

六组雌性Wistar大鼠（N = 5），18日龄断奶和喂食致龋饲料，Keyes 2000。20至22日龄，添加抗生素（氯霉素，氨苄青霉素，羧苄青霉素，1.0克/公斤饲料或水），，暂时抑制口腔菌群，促进致龋细菌定植。24至26日龄，用预先浸泡细菌溶液的试子，通过口腔以1x109CFU的变形链球菌Ingbritt挑战大鼠。牙齿表面的细菌样本进行了检查，以验证每只大鼠感染。

治疗研究计划如下。0-3天，适应性喂养; 第4-8天，喂养抗生素，消除口腔内的细菌; 第9-14天，种植变形链球菌到牙齿; 第14天，首免; 第39和64天，加强免疫。预防研究计划如下。0-3天，适应性喂养; 第3天，首免；第28和52天，加强免疫; 第35-40天，喂养抗生素，消除口腔内的细菌;第41-46天，种植变形链球菌到牙齿。按照上述计划，四组大鼠分别滴鼻免疫：（1）PBS；（2）5微克FLIC；（3）20微克PAc +5微克FLIC;（4）40微克PAc +5微克FLIC。

例4 抗体分析

对于小鼠样本，用ELISA检测特异唾液分泌型IgA（S - IgA）和血清IgG和IgA。聚苯乙烯96孔酶标平底微孔板（Greiner，德国），100微升PAC（5微克/毫升，碳酸盐缓冲液，pH值9.6）包被，37℃，3小时。在4℃用含1％牛血清白蛋白（BSA）封闭过夜后，洗板3次，连续稀释的唾液或血清加入到每孔，并在37℃孵育2小时。用含0.05％吐温20的PBS（PBST）洗板6次；每孔加入100微升的碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG和羊抗鼠IgA（稀释1:2000，SouthernBiotech）。用PBST 洗板6次后，每孔加入100μL磷酸盐底物（P -硝基苯磷酸盐）。在37℃孵育后30分钟后，记录在405 nm的光密度（OD值405）。最高稀释度的吸光度与阴性对照（没有样品）的吸光度相比超过≥0.1，此最高稀释度定义为终点滴度。

对于大鼠样本，聚苯乙烯96孔酶标平底微孔板（Greiner，德国），100微升PAC（5微克/毫升，碳酸盐缓冲液，pH值9.6）包被，37℃，3小时。在4℃用含1％牛血清白蛋白（BSA）封闭过夜后，洗板3次，连续稀释的唾液或血清加入到每孔，并在37℃孵育2小时。每孔再用PBST洗涤，然后加入100μL羊抗鼠IgG或IgA（1:1000，Sigma公司），在37℃孵育2小时，再度洗涤。下一步，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG（1:10,000; SouthernBiotech），37℃孵育5小时，其次是磷酸盐底物（P -硝基苯磷酸盐），37℃孵育30分钟。在405 nm读取光密度（OD）值。最高稀释度的吸光度与阴性对照（没有样品）的吸光度相比超过≥0.1，此最高稀释度定义为终点滴度。

例5 大鼠龋齿评估

收集的血清和唾液样本后，处死大鼠，下颚被拆除，清理，并用紫脲酸铵染色。磨牙洗净，切片和龋齿程度用凯斯(Keyes)方法确定。龋损的延伸和深度记分为：搪瓷（E），浅表性牙本质（Ds），和温和牙本质（Dm）参与。龋损的整体得分为E，DS和DM分数的总和。

例6 统计分析

统计差异采用Student t检验进行分析。所有的动物实验至少重复3次，并以代表性的实验结果显示。

例7 结果

重组PAc和FLIC被纯化和用抗PAc和抗His - tag的抗体核实，一个85 kD的条带（图1，泳道1）和52 kD的条带（图1，泳道4）。

参照图2，此图显示小鼠的抗体滴度，小鼠经滴鼻免疫：（1）PBS，（2）10微克PAc，（3）10微克PAc +1微克FLIC，或（4）10微克PAc +5微克FLIC。结果表明，FLIC是一个强有力的增强剂，增加血清和唾液中抗PAc抗体滴度，更重要的是，在FLIC存在下，PAc能够诱导血清和唾液中高水平的特异性抗PAc IgG和IgA抗体。

参考图3，此图显示四组大鼠的血清抗PAc的IgG，血清抗- PAC IgA和唾液抗PAc IgA抗体滴度，大鼠分别滴鼻免疫：（1）PBS；（ 2）5微克FLIC;（3）20微克PAc +5微克FLIC;（4）40微克PAc +5微克FLIC，数据表示为平均值±标准差。大鼠的结果与从小鼠的结果相似，显示FLIC是一个强有力的增强剂，促进血清和唾液中抗PAc抗体滴度，更重要的是，在FLIC存在下，PAc能够诱导血清和唾液中高水平的特异性抗PAc IgG和IgA抗体。

参考图4，有两个示范照片说明（a）大鼠正常磨牙的中位数矢切片（右上颌舌侧部分）及（b）感染变形链球菌Ingbritt大鼠龋坏磨牙的中位数矢切片（右下颌骨舌侧部分），在图片中的箭头表示不同程度的龋齿。明显的，因为在受感染的大鼠上诱导了人工龋齿，所以大鼠模型是有用的。

参考图5，有两个图形显示（A）四组大鼠龋齿的整体得分，每个点代表每只大鼠的龋损水平和（B）在四组大鼠磨牙不同部位的龋齿的凯斯(Keyes)得分, 其中四组大鼠分别滴鼻免疫：（1）PBS；（2）5微克FLIC; （3）20微克PAc +5微克FLIC;（4）40微克PAc +5微克FLIC。数值表示为平均值加上标准偏差值。 *与阴性对照组有显着性差异（P <0.05）。 **与阴性对照组有显著性差异（P <0.01）。 ***与阴性对照组有显著性差异（P <0.001）。符号：

, 搪瓷病变；

, 牙本质病变轻微；

, 中度牙本质病变。

至于整体龋损（图5A），第3和4组大鼠通过滴鼻途径免疫，比第1和2组较少的病变。在第4组和第1组（P <0.01），第4组和第2组（P <0.001），第5组和第1组（P <0.001），第5组和第2组（P <0.001）之间有显著差异。 通过滴鼻途径免疫40微克PAc和5微克FLIC的大鼠显示最少病变。关于搪瓷，浅表性牙本质，中度牙本质病变，也有显著差异（图5B）。至于搪瓷病变（E），在第4组和第1组（P <0.001），第4组和第2组（P <0.001），第5组和第1组（P <0.001），第5组和第2组（P <0.001）之间有显着性差异;对于浅表性牙本质病变（DS），在第4组和第1组（P <0.05），第4组和第2组（P <0.01），第5组和第1组（P <0.01），第5组和第2组（P <0.001）之间有显著差异。由于中度牙本质病变的低龋坏评分，这些组之间没有统计上的显著差异，但我们依然可以看到与其它3组相比，第4和5组的平均得分较低。

第1，2，3，和4组的龋平均分数分别为54.2，54.4，28和23.8。因此，第4和5组大鼠分别有48％和56％减少。

例8 pET28a-KF-PAc质粒构建

KF-PAc的核苷酸序列（SEQ ID NO 5）和氨基酸序列（SEQ ID NO 6），其中KF表示来源于大肠杆菌的鞭毛素(SEQ ID NO 15 显示KF核苷酸序列；SEQ ID NO 16 显示KF氨基酸序列)。首先PCR扩增出KF和PAc片段，其中，KF的上游引物为： 5’ GCGCCATG GCACAAGTCATTAATACC 3’ (SEQ ID NO 7)，下游引物为：5’ AACAAGCTTACCCTGCAGCAGAGACAGAAC 3’ (SEQ ID NO 8)，上下游分别引入了Nco I和Hind III两个酶切位点（下划线处表示酶切位点）；PAc的上游引物为：5’ TCAAAGCTTGGAACCAATGCTGCCAATC 3’ (SEQ ID NO 9)，下游引物为：5’ ACGTCTCGAGCTCATAAGTT GGCTCAACAG 3’ (SEQ ID NO 10)，上下游分别引入了Hind III和Xho I两个酶切位点。选择pET28a作为载体，将两个片段依次连入载体中，连接产物转化BL21(DE3)star；挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定，将正确的重组质粒命名为pET28a-KF-PAc，其表达产物KF-PAc的C-端带有6聚组氨酸标签。质粒构建示意图如图6，其中KF片段 包含1494碱基，编码498个氨基酸（1-498），PAc片段包含2085碱基，编码695个氨基酸（501-1195）；KF和PAc片段之间包含2个氨基酸组成的连接。

例9 pET28a-KFD2-PAc质粒构建

KFD2-PAc的核苷酸序列（SEQ ID NO 11）和氨基酸序列（SEQ ID NO 12）。首先PCR扩增出PAc片段，上游引物为：5' TATAGCTAGCGGA ACCAATGCTGCCAATC 3’(SEQ ID NO 13)，下游引物为：5' ATTAGGATCCGTCGTCTCATAAGTTGGCTC 3' (SEQ ID NO 14)，分别在上下游引入了Nhe I和BamH I两个酶切位点（下划线处表示酶切位点），然后将片段连入构建好的质粒pET28a-KFD2中，连接产物转化BL21(DE3) star；挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定，将正确的重组质粒命名为pET28a-KFD2-PAc，其表达产物KFD2-Pac的C-端带有6聚组氨酸标签。质粒构建的示意图如图7；其中PAc片段包含2061碱基，编码687个氨基酸（174-860）。

图8显示纯化了的PAc， KF-PAc和KFD2-PAc的（A）SDS-PAGE图及（B）Western Blot图。

例10

五组小鼠滴鼻免疫：（1）PBS；（2）1微克PAc；（3）1微克PAc + 0.7微克KF；（4）1.7微克KF-PAc；（5）1.4微克KFD2-PAc。免疫三次后，抗体分析如例4。图9是一个图表，显示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值±标准差。

例11

11组大鼠滴鼻免疫：（1）PBS；（2）1微克PAc + 0.7微克KF；（3）1.4微克KFD2-PAc；（4）2.5微克PAc + 1.8微克KF；（5）3.5微克KFD2-PAc；（6）5微克PAc +3.5微克KF；（7）7微克KFD2-PAc；（8）10微克PAc + 7微克KF；（9）14微克KFD2-PAc；（10）20微克PAc + 14微克KF；（11）28微克KFD2-PAc。免疫三次后，抗体分析如例4。图10包括三个图表，显示（A）血清抗PAc IgG，（B）血清抗PAc IgA和（C）唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值±标准差。

例12

五组大鼠滴鼻免疫：（1）PBS；（2）5微克PAc；（3）5微克PAc + 3.5微克KF；（4）8.5微克KF-PAc；（5）7微克KFD2-PAc。免疫三次后，抗体分析如例4。图11包括三个图表，显示（A）血清抗PAc IgG，（B）血清抗PAc IgA和（C）唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值±标准差。

例13

五组大鼠滴鼻免疫：（1）PBS；（2）5微克PAc；（3）5微克PAc + 3.5微克KF；（4）8.5微克KF-PAc；（5）7微克KFD2-PAc。先感染再免疫，感染剂量为：2x10⁹CFU，感染后12周计算得分, 龋齿分析如例5。图12是一个图表，显示五组大鼠龋齿的凯氏（keyes）得分，每个点代表一只大鼠的龋患水平得分值表示为均值±标准偏差值。

<110> 中科院武汉病毒研究所

<120> 龋齿疫苗及制备方法

<130> Yan-PAc vaccine

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4689

<212> DNA

<213> 变形链球菌（Streptococcus mutans）

<400> 1

atgaaagtca aaaaaactta cggttttcgt aaaagtaaaa ttagtaaaac actgtgtggt 60

gctgttctag gaacagtagc agcagtctct gtagcaggac aaaaggtttt tgccgatgaa 120

acgaccacta ctagtgatgt agatactaaa gtagttggga cacaaactgg aaatccagcg 180

accaatttgc cagaggctca agggagtgcg agtaaggaag ctgaacaaag tcaaaaccaa 240

gctggagaga caaatggttc aataccagtt gaagtaccta aaactgatct tgatcaagca 300

gcaaaagatg ctaagtctgc tggtgtcaat gttgtccaag atgctgatgt taataaagga 360

actgttaaaa cagctgaaga agcagtccaa aaagaaactg aaattaaaga agattacaca 420

aaacaagctg aggatattaa gaagacaaca gatcaatata aatcggatgt agctgctcat 480

gaggcagaag ttgctaaaat taaagctaaa aatcaggcaa ctaaagaaca gtatgaaaaa 540

gatatggcag ctcataaagc cgaggttgaa cgcattaatg ctgcaaatgc tgccagtaaa 600

acagcttatg aatctaaatt ggctcaatat caagtagatt tagcagccgt tcaaaaaacc 660

aatgctgcca atcaagcagc ctatcaaaaa gcccttgctg cttatcaggc tgaactgaaa 720

cgtgttcagg aagctaatgc agccgccaaa gccgcttatg atactgctgt agcagcaaat 780

aatgccaaaa atacagaaat tgccgctgcc aatgaagaaa ttagaaaacg caatgcaacg 840

gccaaagctg aatatgagac taagttagct caatatcaag ctgaactaaa gcgtgttcag 900

gaagctaatg ccgcaaacga agcagactat caagctaaat tgaccgccta tcaaacagag 960

cttgctcgcg ttcaaaaggc taatgcggat gctaaagcgg cctatgaagc agctgtagca 1020

gcaaataatg ccaaaaatgc ggcactcaca gctgaaaata ctgcaattaa gcaacgcaat 1080

gagaatgcta aggcgactta tgaagctgca ctcaagcaat atgaggccga tttggcaacg 1140

gtgaaaaaag ctaatgccgc aaacgaagca gactatcaag ctaaattgac cgcctatcaa 1200

acagagctcg ctcgcgttca aaaagccaat gcggatgcta aagcggccta tgaagcagct 1260

gtagcagcaa ataatgccgc aaatgcagcg ctcacagctg aaaatactgc aattaagaag 1320

cgcaatgcgg atgctaaagc tgattacgaa gcaaaacttg ctaagtatca agcagatctt 1380

gccaaatatc aaaaagattt agcagactat ccagttaagt taaaggcata cgaagatgaa 1440

caagcttcta ttaaagctgc actggcagaa cttgaaaaac ataaaaatga agacggaaac 1500

ttaacagaac catctgctca aaatttggtc tatgatcttg agccaaatgc gaacttatct 1560

ttgacaacag atgggaagtt ccttaaggct tctgctgtgg atgatgcttt tagcaaaagc 1620

acttcaaaag caaaatatga ccaaaaaatt cttcaattag atgatctaga tatcactaac 1680

ttagaacaat ctaatgatgt tgcttcttct atggagcttt atgggaattt tggtgataaa 1740

gctggctggt caacgacagt aagcaataac tcacaggtta aatggggatc ggtactttta 1800

gagcgcggtc aaagcgcaac agctacatac actaacctgc agaattctta ttacaatggt 1860

aaaaagattt ctaaaattgt ctacaagtat acagtggacc ctaagtccaa gtttcaaggt 1920

caaaaggttt ggttaggtat ttttaccgat ccaactttag gtgtttttgc ttccgcttat 1980

acaggtcaag ttgaaaaaaa cacttctatt tttattaaaa atgaatttac tttctatgac 2040

gaagatggaa aaccaattaa ttttgataat gcccttctct cagtagcttc tcttaaccgt 2100

gaaaataatt ctattgagat ggctaaagat tatacgggta aatttgtcaa aatctctgga 2160

tcatctatcg gtgaaaagaa tggcatgatt tatgctacag atactctcaa ctttaggcag 2220

ggtcaaggtg gtgctcgttg gaccatgtat accagagcta gcgaaccggg atctggctgg 2280

gatagttcag atgcgcctaa ctcttggtat ggtgctggtg ctatccgcat gtctggtcct 2340

aataacagtg tgactttggg tgctatctca tcaacacttg ttgtgcctgc tgatcccaca 2400

atggcaattg aaactggcaa aaaaccaaat atttggtatt ctttaaatgg taaaatccgt 2460

gcggttaatg ttcctaaagt tactaaggaa aaacccacac ctccggttaa accaacagct 2520

ccaactaaac caacttatga aacagaaaag ccattaaaac cggcaccagt agctccaaat 2580

tatgaaaagg agccaacacc gccgacaaga acaccgaatc aagcagagcc aaacaaaccc 2640

acaccgccga cctatgaaac agaaaagccg ttggagccag cacctgttga gccaagctat 2700

gaagcagagc caacaccgcc gacaaggaca ccggatcagg cagagccaaa taaacccaca 2760

ccgccgacct atgaaacaga aaagccgttg gagccagcac ctgttgagcc aagctatgaa 2820

gcagagccaa cgccaccgac accaacacca gatcaaccag aaccaaacaa acctgttgag 2880

ccaacttatg aggttattcc aacaccgccg actgatcctg tttatcaaga tcttccaaca 2940

cctccatctg taccaactgt tcatttccat tactttaaac tagctgttca gccgcaggtt 3000

aacaaagaaa ttagaaacaa taacgatgtt aatattgaca gaactttggt ggctaaacaa 3060

tctgttgtta agttccagct gaagacagca gatctccctg ctggacgtga tgaaacaact 3120

tcctttgtct tggtagatcc cctgccatct ggttatcaat ttaatcctga agctacaaaa 3180

gctgccagcc ctggctttga tgtcgcttat gataatgcaa ctaatacagt caccttcaag 3240

gcaactgcag caactttggc tacgtttaat gctgatttga ctaaatcagt ggcaacgatt 3300

tatccaacag tggtcggaca agttcttaat gatggcgcaa cttataagaa taatttcacg 3360

ctcacagtca atgatgctta tggcattaaa tccaatgttg ttcgggtgac aactcctggt 3420

aaaccaaatg atccagataa cccaaataat aattatatta aaccaactaa ggttaataaa 3480

aacgaaaatg gcgttgttat tgatggtaaa acagttcttg ccggttcaac gaattattat 3540

gagctaactt gggatttgga tcaatataaa aacgaccgct cttcagcaga taccattcaa 3600

aaaggatttt actatgtaga tgattatcca gaagaagcgc ttgaattgcg tcaggattta 3660

gtgaagatta cagatgctaa tggtaatgaa gttactggtg ttagtgtgga taattatact 3720

agtcttgaag cagcccctca agaaattaga gatgttcttt ctaaggcagg aattagacct 3780

aaaggtgctt tccaaatttt ccgtgccgat aatccaagag aattttatga tacttatgtc 3840

aaaactggaa ttgatttgaa gattgtatca ccaatggttg ttaaaaaaca aatgggacaa 3900

acaggcggca gttatgaaaa tcaagcttac caaattgact ttggtaatgg ttatgcatca 3960

aatatcgtta tcaataatgt tcctaagatt aaccctaaga aagatgtgac cttaacactt 4020

gatccggctg atacaaataa tgttgatggt cagactattc cacttaatac agtctttaat 4080

taccgtttga ttggtggcat tatccctgca aatcactcag aagaactctt tgaatacaat 4140

ttctatgatg attatgatca aacaggagat cactatactg gtcagtataa agtttttgcc 4200

aaggttgata tcacttttaa agacggttct attatcaagt caggtgctga gttaactcag 4260

tatacgacag cggaagttga taccgctaaa ggtgctatca caattaagtt caaggaagcc 4320

tttctgcgtt ctgtttcaat tgattcagcc ttccaagctg aaagttatat ccaaatgaaa 4380

cgtattgcgg ttggtacttt tgaaaatact tatattaata ctgtcaatgg ggtaacttac 4440

agttcaaata cagtgaagac aactactcct gaggatccta cagaccctac tgatccgcaa 4500

gatccatcat caccgcggac ttcaactgta attaactata aacctcaatc aactgcttat 4560

caaccaagct ctgttcaaga aacattacca aatacgggag taacaaacaa tgcttatatg 4620

cctttacttg gtattattgg cttagttact agttttagtt tgcttggttt aaaggctaag 4680

aaagattga 4689

<210> 2

<211> 1562

<212> PRT

<213> 变形链球菌（Streptococcus mutans ）

<400> 2

Met Lys Val Lys Lys Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Ser Lys Ile Ser Lys

1 5 10 15

Thr Leu Cys Gly Ala Val Leu Gly Thr Val Ala Ala Val Ser Val Ala

20 25 30

Gly Gln Lys Val Phe Ala Asp Glu Thr Thr Thr Thr Ser Asp Val Asp

35 40 45

Thr Lys Val Val Gly Thr Gln Thr Gly Asn Pro Ala Thr Asn Leu Pro

50 55 60

Glu Ala Gln Gly Ser Ala Ser Lys Glu Ala Glu Gln Ser Gln Asn Gln

65 70 75 80

Ala Gly Glu Thr Asn Gly Ser Ile Pro Val Glu Val Pro Lys Thr Asp

85 90 95

Leu Asp Gln Ala Ala Lys Asp Ala Lys Ser Ala Gly Val Asn Val Val

100 105 110

Gln Asp Ala Asp Val Asn Lys Gly Thr Val Lys Thr Ala Glu Glu Ala

115 120 125

Val Gln Lys Glu Thr Glu Ile Lys Glu Asp Tyr Thr Lys Gln Ala Glu

130 135 140

Asp Ile Lys Lys Thr Thr Asp Gln Tyr Lys Ser Asp Val Ala Ala His

145 150 155 160

Glu Ala Glu Val Ala Lys Ile Lys Ala Lys Asn Gln Ala Thr Lys Glu

165 170 175

Gln Tyr Glu Lys Asp Met Ala Ala His Lys Ala Glu Val Glu Arg Ile

180 185 190

Asn Ala Ala Asn Ala Ala Ser Lys Thr Ala Tyr Glu Ser Lys Leu Ala

195 200 205

Gln Tyr Gln Val Asp Leu Ala Ala Val Gln Lys Thr Asn Ala Ala Asn

210 215 220

Gln Ala Ala Tyr Gln Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Gln Ala Glu Leu Lys

225 230 235 240

Arg Val Gln Glu Ala Asn Ala Ala Ala Lys Ala Ala Tyr Asp Thr Ala

245 250 255

Val Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Thr Glu Ile Ala Ala Ala Asn Glu

260 265 270

Glu Ile Arg Lys Arg Asn Ala Thr Ala Lys Ala Glu Tyr Glu Thr Lys

275 280 285

Leu Ala Gln Tyr Gln Ala Glu Leu Lys Arg Val Gln Glu Ala Asn Ala

290 295 300

Ala Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr Glu

305 310 315 320

Leu Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Ala Tyr Glu

325 330 335

Ala Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Ala Ala Leu Thr Ala Glu

340 345 350

Asn Thr Ala Ile Lys Gln Arg Asn Glu Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu

355 360 365

Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Ala Thr Val Lys Lys Ala

370 375 380

Asn Ala Ala Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln

385 390 395 400

Thr Glu Leu Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Ala

405 410 415

Tyr Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Ala Asn Ala Ala Leu Thr

420 425 430

Ala Glu Asn Thr Ala Ile Lys Lys Arg Asn Ala Asp Ala Lys Ala Asp

435 440 445

Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Lys Tyr Gln Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Gln

450 455 460

Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Pro Val Lys Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Glu

465 470 475 480

Gln Ala Ser Ile Lys Ala Ala Leu Ala Glu Leu Glu Lys His Lys Asn

485 490 495

Glu Asp Gly Asn Leu Thr Glu Pro Ser Ala Gln Asn Leu Val Tyr Asp

500 505 510

Leu Glu Pro Asn Ala Asn Leu Ser Leu Thr Thr Asp Gly Lys Phe Leu

515 520 525

Lys Ala Ser Ala Val Asp Asp Ala Phe Ser Lys Ser Thr Ser Lys Ala

530 535 540

Lys Tyr Asp Gln Lys Ile Leu Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ile Thr Asn

545 550 555 560

Leu Glu Gln Ser Asn Asp Val Ala Ser Ser Met Glu Leu Tyr Gly Asn

565 570 575

Phe Gly Asp Lys Ala Gly Trp Ser Thr Thr Val Ser Asn Asn Ser Gln

580 585 590

Val Lys Trp Gly Ser Val Leu Leu Glu Arg Gly Gln Ser Ala Thr Ala

595 600 605

Thr Tyr Thr Asn Leu Gln Asn Ser Tyr Tyr Asn Gly Lys Lys Ile Ser

610 615 620

Lys Ile Val Tyr Lys Tyr Thr Val Asp Pro Lys Ser Lys Phe Gln Gly

625 630 635 640

Gln Lys Val Trp Leu Gly Ile Phe Thr Asp Pro Thr Leu Gly Val Phe

645 650 655

Ala Ser Ala Tyr Thr Gly Gln Val Glu Lys Asn Thr Ser Ile Phe Ile

660 665 670

Lys Asn Glu Phe Thr Phe Tyr Asp Glu Asp Gly Lys Pro Ile Asn Phe

675 680 685

Asp Asn Ala Leu Leu Ser Val Ala Ser Leu Asn Arg Glu Asn Asn Ser

690 695 700

Ile Glu Met Ala Lys Asp Tyr Thr Gly Lys Phe Val Lys Ile Ser Gly

705 710 715 720

Ser Ser Ile Gly Glu Lys Asn Gly Met Ile Tyr Ala Thr Asp Thr Leu

725 730 735

Asn Phe Arg Gln Gly Gln Gly Gly Ala Arg Trp Thr Met Tyr Thr Arg

740 745 750

Ala Ser Glu Pro Gly Ser Gly Trp Asp Ser Ser Asp Ala Pro Asn Ser

755 760 765

Trp Tyr Gly Ala Gly Ala Ile Arg Met Ser Gly Pro Asn Asn Ser Val

770 775 780

Thr Leu Gly Ala Ile Ser Ser Thr Leu Val Val Pro Ala Asp Pro Thr

785 790 795 800

Met Ala Ile Glu Thr Gly Lys Lys Pro Asn Ile Trp Tyr Ser Leu Asn

805 810 815

Gly Lys Ile Arg Ala Val Asn Val Pro Lys Val Thr Lys Glu Lys Pro

820 825 830

Thr Pro Pro Val Lys Pro Thr Ala Pro Thr Lys Pro Thr Tyr Glu Thr

835 840 845

Glu Lys Pro Leu Lys Pro Ala Pro Val Ala Pro Asn Tyr Glu Lys Glu

850 855 860

Pro Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asn Gln Ala Glu Pro Asn Lys Pro

865 870 875 880

Thr Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro Leu Glu Pro Ala Pro Val

885 890 895

Glu Pro Ser Tyr Glu Ala Glu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asp

900 905 910

Gln Ala Glu Pro Asn Lys Pro Thr Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys

915 920 925

Pro Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu Pro Ser Tyr Glu Ala Glu Pro Thr

930 935 940

Pro Pro Thr Pro Thr Pro Asp Gln Pro Glu Pro Asn Lys Pro Val Glu

945 950 955 960

Pro Thr Tyr Glu Val Ile Pro Thr Pro Pro Thr Asp Pro Val Tyr Gln

965 970 975

Asp Leu Pro Thr Pro Pro Ser Val Pro Thr Val His Phe His Tyr Phe

980 985 990

Lys Leu Ala Val Gln Pro Gln Val Asn Lys Glu Ile Arg Asn Asn Asn

995 1000 1005

Asp Val Asn Ile Asp Arg Thr Leu Val Ala Lys Gln Ser Val Val

1010 1015 1020

Lys Phe Gln Leu Lys Thr Ala Asp Leu Pro Ala Gly Arg Asp Glu

1025 1030 1035

Thr Thr Ser Phe Val Leu Val Asp Pro Leu Pro Ser Gly Tyr Gln

1040 1045 1050

Phe Asn Pro Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ser Pro Gly Phe Asp Val

1055 1060 1065

Ala Tyr Asp Asn Ala Thr Asn Thr Val Thr Phe Lys Ala Thr Ala

1070 1075 1080

Ala Thr Leu Ala Thr Phe Asn Ala Asp Leu Thr Lys Ser Val Ala

1085 1090 1095

Thr Ile Tyr Pro Thr Val Val Gly Gln Val Leu Asn Asp Gly Ala

1100 1105 1110

Thr Tyr Lys Asn Asn Phe Thr Leu Thr Val Asn Asp Ala Tyr Gly

1115 1120 1125

Ile Lys Ser Asn Val Val Arg Val Thr Thr Pro Gly Lys Pro Asn

1130 1135 1140

Asp Pro Asp Asn Pro Asn Asn Asn Tyr Ile Lys Pro Thr Lys Val

1145 1150 1155

Asn Lys Asn Glu Asn Gly Val Val Ile Asp Gly Lys Thr Val Leu

1160 1165 1170

Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Glu Leu Thr Trp Asp Leu Asp Gln

1175 1180 1185

Tyr Lys Asn Asp Arg Ser Ser Ala Asp Thr Ile Gln Lys Gly Phe

1190 1195 1200

Tyr Tyr Val Asp Asp Tyr Pro Glu Glu Ala Leu Glu Leu Arg Gln

1205 1210 1215

Asp Leu Val Lys Ile Thr Asp Ala Asn Gly Asn Glu Val Thr Gly

1220 1225 1230

Val Ser Val Asp Asn Tyr Thr Ser Leu Glu Ala Ala Pro Gln Glu

1235 1240 1245

Ile Arg Asp Val Leu Ser Lys Ala Gly Ile Arg Pro Lys Gly Ala

1250 1255 1260

Phe Gln Ile Phe Arg Ala Asp Asn Pro Arg Glu Phe Tyr Asp Thr

1265 1270 1275

Tyr Val Lys Thr Gly Ile Asp Leu Lys Ile Val Ser Pro Met Val

1280 1285 1290

Val Lys Lys Gln Met Gly Gln Thr Gly Gly Ser Tyr Glu Asn Gln

1295 1300 1305

Ala Tyr Gln Ile Asp Phe Gly Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Ile Val

1310 1315 1320

Ile Asn Asn Val Pro Lys Ile Asn Pro Lys Lys Asp Val Thr Leu

1325 1330 1335

Thr Leu Asp Pro Ala Asp Thr Asn Asn Val Asp Gly Gln Thr Ile

1340 1345 1350

Pro Leu Asn Thr Val Phe Asn Tyr Arg Leu Ile Gly Gly Ile Ile

1355 1360 1365

Pro Ala Asn His Ser Glu Glu Leu Phe Glu Tyr Asn Phe Tyr Asp

1370 1375 1380

Asp Tyr Asp Gln Thr Gly Asp His Tyr Thr Gly Gln Tyr Lys Val

1385 1390 1395

Phe Ala Lys Val Asp Ile Thr Phe Lys Asp Gly Ser Ile Ile Lys

1400 1405 1410

Ser Gly Ala Glu Leu Thr Gln Tyr Thr Thr Ala Glu Val Asp Thr

1415 1420 1425

Ala Lys Gly Ala Ile Thr Ile Lys Phe Lys Glu Ala Phe Leu Arg

1430 1435 1440

Ser Val Ser Ile Asp Ser Ala Phe Gln Ala Glu Ser Tyr Ile Gln

1445 1450 1455

Met Lys Arg Ile Ala Val Gly Thr Phe Glu Asn Thr Tyr Ile Asn

1460 1465 1470

Thr Val Asn Gly Val Thr Tyr Ser Ser Asn Thr Val Lys Thr Thr

1475 1480 1485

Thr Pro Glu Asp Pro Thr Asp Pro Thr Asp Pro Gln Asp Pro Ser

1490 1495 1500

Ser Pro Arg Thr Ser Thr Val Ile Asn Tyr Lys Pro Gln Ser Thr

1505 1510 1515

Ala Tyr Gln Pro Ser Ser Val Gln Glu Thr Leu Pro Asn Thr Gly

1520 1525 1530

Val Thr Asn Asn Ala Tyr Met Pro Leu Leu Gly Ile Ile Gly Leu

1535 1540 1545

Val Thr Ser Phe Ser Leu Leu Gly Leu Lys Ala Lys Lys Asp

1550 1555 1560

<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> 沙门氏菌（Salmonella enteric）

<300>

<308> NC_004631.1

<309> 2010-05-12

<313> (1)..(1521)

<400> 3

atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60

tcccagtccg cactgggcac tgctatcgag cgtttgtctt ccggtctgcg tatcaacagc 120

gcgaaagacg atgcggcagg acaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt 180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240

gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgcg 300

aatggtacta actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360

aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420

gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tattgattta 480

aaagaaatca gctctaaaac actgggactt gataagctta atgtccaaga tgcctacacc 540

ccgaaagaaa ctgctgtaac cgttgataaa actacctata aaaatggtac agatcctatt 600

acagcccaga gcaatactga tatccaaact gcaattggcg gtggtgcaac gggggttact 660

ggggctgata tcaaatttaa agatggtcaa tactatttag atgttaaagg cggtgcttct 720

gctggtgttt ataaagccac ttatgatgaa actacaaaga aagttaatat tgatacgact 780

gataaaactc cgttggcaac tgcggaagct acagctattc ggggaacggc cactataacc 840

cacaaccaaa ttgctgaagt aacaaaagag ggtgttgata cgaccacagt tgcggctcaa 900

cttgctgcag caggggttac tggcgccgat aaggacaata ctagccttgt aaaactatcg 960

tttgaggata aaaacggtaa ggttattgat ggtggctatg cagtgaaaat gggcgacgat 1020

ttctatgccg ctacatatga tgagaaaaca ggtgcaatta ctgctaaaac cactacttat 1080

acagatggta ctggcgttgc tcaaactgga gctgtgaaat ttggtggcgc aaatggtaaa 1140

tctgaagttg ttactgctac cgatggtaag acttacttag caagcgacct tgacaaacat 1200

aacttcagaa caggcggtga gcttaaagag gttaatacag ataagactga aaacccactg 1260

cagaaaattg atgctgcctt ggcacaggtt gatacacttc gttctgacct gggtgcggtt 1320

cagaaccgtt tcaactccgc tatcaccaac ctgggcaata ccgtaaataa cctgtcttct 1380

gcccgtagcc gtatcgaaga ttccgactac gcaaccgaag tctccaacat gtctcgcgcg 1440

cagattctgc agcaggccgg tacctccgtt ctggcgcagg cgaaccaggt tccgcaaaac 1500

gtcctctctt tactgcgtta a 1521

<210> 4

<211> 506

<212> PRT

<213> 沙门氏菌（Salmonella enterica）

<300>

<308> GeneID/1070204

<309> 2010-05-12

<313> (1)..(506)

<400> 4

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala

85 90 95

Val Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile

100 105 110

Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu

130 135 140

Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Glu Ile Ser Ser Lys Thr Leu Gly Leu Asp Lys Leu Asn Val Gln

165 170 175

Asp Ala Tyr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Val Thr Val Asp Lys Thr Thr

180 185 190

Tyr Lys Asn Gly Thr Asp Pro Ile Thr Ala Gln Ser Asn Thr Asp Ile

195 200 205

Gln Thr Ala Ile Gly Gly Gly Ala Thr Gly Val Thr Gly Ala Asp Ile

210 215 220

Lys Phe Lys Asp Gly Gln Tyr Tyr Leu Asp Val Lys Gly Gly Ala Ser

225 230 235 240

Ala Gly Val Tyr Lys Ala Thr Tyr Asp Glu Thr Thr Lys Lys Val Asn

245 250 255

Ile Asp Thr Thr Asp Lys Thr Pro Leu Ala Thr Ala Glu Ala Thr Ala

260 265 270

Ile Arg Gly Thr Ala Thr Ile Thr His Asn Gln Ile Ala Glu Val Thr

275 280 285

Lys Glu Gly Val Asp Thr Thr Thr Val Ala Ala Gln Leu Ala Ala Ala

290 295 300

Gly Val Thr Gly Ala Asp Lys Asp Asn Thr Ser Leu Val Lys Leu Ser

305 310 315 320

Phe Glu Asp Lys Asn Gly Lys Val Ile Asp Gly Gly Tyr Ala Val Lys

325 330 335

Met Gly Asp Asp Phe Tyr Ala Ala Thr Tyr Asp Glu Lys Thr Gly Ala

340 345 350

Ile Thr Ala Lys Thr Thr Thr Tyr Thr Asp Gly Thr Gly Val Ala Gln

355 360 365

Thr Gly Ala Val Lys Phe Gly Gly Ala Asn Gly Lys Ser Glu Val Val

370 375 380

Thr Ala Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Ser Asp Leu Asp Lys His

385 390 395 400

Asn Phe Arg Thr Gly Gly Glu Leu Lys Glu Val Asn Thr Asp Lys Thr

405 410 415

Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr

420 425 430

Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile

435 440 445

Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Ser Ala Arg Ser Arg

450 455 460

Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala

465 470 475 480

Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln

485 490 495

Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg

500 505

<210> 5

<211> 3585

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> KF-PAc 融合（KF-PAc fusion）

<400> 5

atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60

aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120

gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180

ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240

gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300

accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360

gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420

aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480

aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatggtttta gcgttaaaaa taacgataca 540

gttaccacta gtgctccagt aactgctttt ggtgctacca ccacaaacaa tattaaactt 600

actggaatta ccctttctac ggaagcagcc actgatactg gcggaactaa cccagcttca 660

attgagggtg tttatactga taatggtaat gattactatg cgaaaatcac cggtggtgat 720

aacgatggga agtattacgc agtaacagtt gctaatgatg gtacagtgac aatggcgact 780

ggagcaacgg caaatgcaac tgtaactgat gcaaatacta ctaaagctac aactatcact 840

tcaggcggta cacctgttca gattgataat actgcaggtt ccgcaactgc caaccttggt 900

gctgttagct tagtaaaact gcaggattcc aagggtaatg ataccgatac atatgcgctt 960

aaagatacaa atggcaatct ttacgctgcg gatgtgaatg aaactactgg tgctgtttct 1020

gttaaaacta ttacctatac tgactcttcc ggtgccgcca gttctccaac cgcggtcaaa 1080

ctgggcggag atgatggcaa aacagaagtg gtcgatattg atggtaaaac atacgattct 1140

gccgatttaa atggcggtaa tctgcaaaca ggtttgactg ctggtggtga ggctctgact 1200

gctgttgcaa atggtaaaac cacggatccg ctgaaagcgc tggacgatgc tatcgcatct 1260

gtagacaaat tccgttcttc cctcggtgcg gtgcaaaacc gtctggattc cgcggttacc 1320

aacctgaaca acaccactac caacctgtct gaagcgcagt cccgtattca ggacgccgac 1380

tatgcgaccg aagtgtccaa tatgtcgaaa gcgcagatca tccagcaggc cggtaactcc 1440

gtgttggcaa aagctaacca ggtaccgcag caggttctgt ctctgctgca gggtaagctt 1500

ggaaccaatg ctgccaatca agcagcctat caaaaagccc ttgctgctta tcaggctgaa 1560

ctgaaacgtg ttcaggaagc taatgcagcc gccaaagccg cttatgatac tgctgtagca 1620

gcaaataatg ccaaaaatac agaaattgcc gctgccaatg aagaaattag aaaacgcaat 1680

gcaacggcca aagctgaata tgagactaag ttagctcaat atcaagctga actaaagcgt 1740

gttcaggaag ctaatgccgc aaacgaagca gactatcaag ctaaattgac cgcctatcaa 1800

acagagcttg ctcgtgttca aaaagccaat gcggatgcta aagcgaccta tgaagcagct 1860

gtagcagcaa ataatgccaa aaatgcggca ctcacagctg aaaatactgc aattaagcaa 1920

cgcaatgaga atgctaaggc gacttatgaa gctgcactca agcaatatga ggccgatttg 1980

gcagcggtga aaaaagctaa tgccgcaaac gaagcagact atcaagctaa attgaccgcc 2040

tatcaaacag agctcgctcg cgttcaaaaa gccaatgcgg atgctaaagc ggcctatgaa 2100

gcagctgtag cagcaaataa tgccgcaaat gcagcgctca cagctgaaaa tactgcaatt 2160

aagaagcgca atgcggatgc taaagctgat tacgaagcaa aacttgctaa gtatcaagca 2220

gatcttgcca aatatcaaaa agatttagca gactatccag ttaagttaaa ggcatacgaa 2280

gatgaacaaa cttctattaa agctgcactg gcagaacttg aaaaacataa aaatgaagac 2340

ggaaacttaa cagaaccatc tgctcaaaat ttggtctatg atcttgagcc aaatgcgaac 2400

ttatctttga caacagatgg gaagttcctt aaggcttctg ctgtggatga tgcttttagc 2460

aaaagcactt caaaagcaaa atatgaccaa aaaattcttc aattagatga tctagatatc 2520

actaacttag aacaatctaa tgatgttgct tcttctatgg agctttatgg gaattttggt 2580

gataaagctg gctggtcaac gacagtaagc aataactcac aggttaaatg gggatcggta 2640

cttttagagc gcggtcaaag cgcaacagct acatacacta acctgcagaa ttcttattac 2700

aatggtaaaa agatttctaa aattgtctac aagtatacag tggaccctaa gtccaagttt 2760

caaggtcaaa aggtttggtt aggtattttt accgatccaa ctttaggtgt ttttgcttct 2820

gcttatacag gtcaagttga aaaaaacact tctattttta ttaaaaatga attcactttc 2880

tatgacgaag atggaaaacc aattaatttt gataatgccc ttctctcagt agcttctctt 2940

aaccgtgaac ataactctat tgagatggct aaagattata gtggtaaatt tgtcaaaatc 3000

tctggttcat ctattggtga aaagaatggc atgatttatg ctacagatac tcttaacttt 3060

aaacagggtg aaggtggctc tcgctggact atgtataaaa atagtcaagc tggttcagga 3120

tgggatagtt cagatgcgcc gaattcttgg tatggagcag gggctattaa aatgtctggt 3180

ccgaataacc atgttactgt aggagcaact tctgcaacaa atgtaatgcc agtttctgac 3240

atgcctgttg ttcctggtaa ggacaatact gatggcaaaa aaccaaatat ttggtattct 3300

ttaaatggta aaatccgtgc ggttaatgtt cctaaagtta ctaaggaaaa acccacacct 3360

ccggttaaac caacagctcc aactaaacca acttatgaaa cagaaaagcc attaaaaccg 3420

gcaccagtag ctccaaatta tgaaaaggag ccaacaccgc cgacaaggac accggatcaa 3480

gcagagccaa acaaacccac accgccgacc tatgaaacag aaaagccgtt ggagccagca 3540

cctgttgagc caacttatga gctcgagcac caccaccacc accac 3585

<210> 6

<211> 1195

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> KF-Pac融合蛋白（ KF-PAc fusion protein）

<400> 6

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr

85 90 95

Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met

130 135 140

Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Ser Val Lys

165 170 175

Asn Asn Asp Thr Val Thr Thr Ser Ala Pro Val Thr Ala Phe Gly Ala

180 185 190

Thr Thr Thr Asn Asn Ile Lys Leu Thr Gly Ile Thr Leu Ser Thr Glu

195 200 205

Ala Ala Thr Asp Thr Gly Gly Thr Asn Pro Ala Ser Ile Glu Gly Val

210 215 220

Tyr Thr Asp Asn Gly Asn Asp Tyr Tyr Ala Lys Ile Thr Gly Gly Asp

225 230 235 240

Asn Asp Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Thr Val Ala Asn Asp Gly Thr Val

245 250 255

Thr Met Ala Thr Gly Ala Thr Ala Asn Ala Thr Val Thr Asp Ala Asn

260 265 270

Thr Thr Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Pro Val Gln Ile

275 280 285

Asp Asn Thr Ala Gly Ser Ala Thr Ala Asn Leu Gly Ala Val Ser Leu

290 295 300

Val Lys Leu Gln Asp Ser Lys Gly Asn Asp Thr Asp Thr Tyr Ala Leu

305 310 315 320

Lys Asp Thr Asn Gly Asn Leu Tyr Ala Ala Asp Val Asn Glu Thr Thr

325 330 335

Gly Ala Val Ser Val Lys Thr Ile Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Gly Ala

340 345 350

Ala Ser Ser Pro Thr Ala Val Lys Leu Gly Gly Asp Asp Gly Lys Thr

355 360 365

Glu Val Val Asp Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ser Ala Asp Leu Asn

370 375 380

Gly Gly Asn Leu Gln Thr Gly Leu Thr Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr

385 390 395 400

Ala Val Ala Asn Gly Lys Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp

405 410 415

Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln

420 425 430

Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn

435 440 445

Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu

450 455 460

Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser

465 470 475 480

Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu

485 490 495

Gln Gly Lys Leu Gly Thr Asn Ala Ala Asn Gln Ala Ala Tyr Gln Lys

500 505 510

Ala Leu Ala Ala Tyr Gln Ala Glu Leu Lys Arg Val Gln Glu Ala Asn

515 520 525

Ala Ala Ala Lys Ala Ala Tyr Asp Thr Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala

530 535 540

Lys Asn Thr Glu Ile Ala Ala Ala Asn Glu Glu Ile Arg Lys Arg Asn

545 550 555 560

Ala Thr Ala Lys Ala Glu Tyr Glu Thr Lys Leu Ala Gln Tyr Gln Ala

565 570 575

Glu Leu Lys Arg Val Gln Glu Ala Asn Ala Ala Asn Glu Ala Asp Tyr

580 585 590

Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr Glu Leu Ala Arg Val Gln Lys

595 600 605

Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn

610 615 620

Asn Ala Lys Asn Ala Ala Leu Thr Ala Glu Asn Thr Ala Ile Lys Gln

625 630 635 640

Arg Asn Glu Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr

645 650 655

Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn Ala Ala Asn Glu Ala

660 665 670

Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr Glu Leu Ala Arg Val

675 680 685

Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Ala Tyr Glu Ala Ala Val Ala

690 695 700

Ala Asn Asn Ala Ala Asn Ala Ala Leu Thr Ala Glu Asn Thr Ala Ile

705 710 715 720

Lys Lys Arg Asn Ala Asp Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala

725 730 735

Lys Tyr Gln Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Gln Lys Asp Leu Ala Asp Tyr

740 745 750

Pro Val Lys Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Glu Gln Thr Ser Ile Lys Ala

755 760 765

Ala Leu Ala Glu Leu Glu Lys His Lys Asn Glu Asp Gly Asn Leu Thr

770 775 780

Glu Pro Ser Ala Gln Asn Leu Val Tyr Asp Leu Glu Pro Asn Ala Asn

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Leu Ser Leu Thr Thr Asp Gly Lys Phe Leu Lys Ala Ser Ala Val Asp

805 810 815

Asp Ala Phe Ser Lys Ser Thr Ser Lys Ala Lys Tyr Asp Gln Lys Ile

820 825 830

Leu Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ile Thr Asn Leu Glu Gln Ser Asn Asp

835 840 845

Val Ala Ser Ser Met Glu Leu Tyr Gly Asn Phe Gly Asp Lys Ala Gly

850 855 860

Trp Ser Thr Thr Val Ser Asn Asn Ser Gln Val Lys Trp Gly Ser Val

865 870 875 880

Leu Leu Glu Arg Gly Gln Ser Ala Thr Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Gln

885 890 895

Asn Ser Tyr Tyr Asn Gly Lys Lys Ile Ser Lys Ile Val Tyr Lys Tyr

900 905 910

Thr Val Asp Pro Lys Ser Lys Phe Gln Gly Gln Lys Val Trp Leu Gly

915 920 925

Ile Phe Thr Asp Pro Thr Leu Gly Val Phe Ala Ser Ala Tyr Thr Gly

930 935 940

Gln Val Glu Lys Asn Thr Ser Ile Phe Ile Lys Asn Glu Phe Thr Phe

945 950 955 960

Tyr Asp Glu Asp Gly Lys Pro Ile Asn Phe Asp Asn Ala Leu Leu Ser

965 970 975

Val Ala Ser Leu Asn Arg Glu His Asn Ser Ile Glu Met Ala Lys Asp

980 985 990

Tyr Ser Gly Lys Phe Val Lys Ile Ser Gly Ser Ser Ile Gly Glu Lys

995 1000 1005

Asn Gly Met Ile Tyr Ala Thr Asp Thr Leu Asn Phe Lys Gln Gly

1010 1015 1020

Glu Gly Gly Ser Arg Trp Thr Met Tyr Lys Asn Ser Gln Ala Gly

1025 1030 1035

Ser Gly Trp Asp Ser Ser Asp Ala Pro Asn Ser Trp Tyr Gly Ala

1040 1045 1050

Gly Ala Ile Lys Met Ser Gly Pro Asn Asn His Val Thr Val Gly

1055 1060 1065

Ala Thr Ser Ala Thr Asn Val Met Pro Val Ser Asp Met Pro Val

1070 1075 1080

Val Pro Gly Lys Asp Asn Thr Asp Gly Lys Lys Pro Asn Ile Trp

1085 1090 1095

Tyr Ser Leu Asn Gly Lys Ile Arg Ala Val Asn Val Pro Lys Val

1100 1105 1110

Thr Lys Glu Lys Pro Thr Pro Pro Val Lys Pro Thr Ala Pro Thr

1115 1120 1125

Lys Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro Leu Lys Pro Ala Pro Val

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Ala Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro

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Asp Gln Ala Glu Pro Asn Lys Pro Thr Pro Pro Thr Tyr Glu Thr

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Glu Lys Pro Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu Pro Thr Tyr Glu Leu

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Glu His His His His His His

1190 1195

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 7

gcgccatggc acaagtcatt aatacc 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 8

aacaagctta ccctgcagca gagacagaac 30

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 9

tcaaagcttg gaaccaatgc tgccaatc 28

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 10

acgtctcgag ctcataagtt ggctcaacag 30

<210> 11

<211> 2880

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> KFD2-PAc 融合蛋白编码序列（KFD2-PAc fusion protein encoding sequence）

<400> 11

atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60

aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120

gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180

ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240

gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300

accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360

gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420

aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480

aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatgctagcg gaaccaatgc tgccaatcaa 540

gcagcctatc aaaaagccct tgctgcttat caggctgaac tgaaacgtgt tcaggaagct 600

aatgcagccg ccaaagccgc ttatgatact gctgtagcag caaataatgc caaaaataca 660

gaaattgccg ctgccaatga agaaattaga aaacgcaatg caacggccaa agctgaatat 720

gagactaagt tagctcaata tcaagctgaa ctaaagcgtg ttcaggaagc taatgccgca 780

aacgaagcag actatcaagc taaattgacc gcctatcaaa cagagcttgc tcgtgttcaa 840

aaagccaatg cggatgctaa agcgacctat gaagcagctg tagcagcaaa taatgccaaa 900

aatgcggcac tcacagctga aaatactgca attaagcaac gcaatgagaa tgctaaggcg 960

acttatgaag ctgcactcaa gcaatatgag gccgatttgg cagcggtgaa aaaagctaat 1020

gccgcaaacg aagcagacta tcaagctaaa ttgaccgcct atcaaacaga gctcgctcgc 1080

gttcaaaaag ccaatgcgga tgctaaagcg gcctatgaag cagctgtagc agcaaataat 1140

gccgcaaatg cagcgctcac agctgaaaat actgcaatta agaagcgcaa tgcggatgct 1200

aaagctgatt acgaagcaaa acttgctaag tatcaagcag atcttgccaa atatcaaaaa 1260

gatttagcag actatccagt taagttaaag gcatacgaag atgaacaaac ttctattaaa 1320

gctgcactgg cagaacttga aaaacataaa aatgaagacg gaaacttaac agaaccatct 1380

gctcaaaatt tggtctatga tcttgagcca aatgcgaact tatctttgac aacagatggg 1440

aagttcctta aggcttctgc tgtggatgat gcttttagca aaagcacttc aaaagcaaaa 1500

tatgaccaaa aaattcttca attagatgat ctagatatca ctaacttaga acaatctaat 1560

gatgttgctt cttctatgga gctttatggg aattttggtg ataaagctgg ctggtcaacg 1620

acagtaagca ataactcaca ggttaaatgg ggatcggtac ttttagagcg cggtcaaagc 1680

gcaacagcta catacactaa cctgcagaat tcttattaca atggtaaaaa gatttctaaa 1740

attgtctaca agtatacagt ggaccctaag tccaagtttc aaggtcaaaa ggtttggtta 1800

ggtattttta ccgatccaac tttaggtgtt tttgcttctg cttatacagg tcaagttgaa 1860

aaaaacactt ctatttttat taaaaatgaa ttcactttct atgacgaaga tggaaaacca 1920

attaattttg ataatgccct tctctcagta gcttctctta accgtgaaca taactctatt 1980

gagatggcta aagattatag tggtaaattt gtcaaaatct ctggttcatc tattggtgaa 2040

aagaatggca tgatttatgc tacagatact cttaacttta aacagggtga aggtggctct 2100

cgctggacta tgtataaaaa tagtcaagct ggttcaggat gggatagttc agatgcgccg 2160

aattcttggt atggagcagg ggctattaaa atgtctggtc cgaataacca tgttactgta 2220

ggagcaactt ctgcaacaaa tgtaatgcca gtttctgaca tgcctgttgt tcctggtaag 2280

gacaatactg atggcaaaaa accaaatatt tggtattctt taaatggtaa aatccgtgcg 2340

gttaatgttc ctaaagttac taaggaaaaa cccacacctc cggttaaacc aacagctcca 2400

actaaaccaa cttatgaaac agaaaagcca ttaaaaccgg caccagtagc tccaaattat 2460

gaaaaggagc caacaccgcc gacaaggaca ccggatcaag cagagccaaa caaacccaca 2520

ccgccgacct atgaaacaga aaagccgttg gagccagcac ctgttgagcc aacttatgag 2580

acgacggatc cgctgaaagc gctggacgat gctatcgcat ctgtagacaa attccgttct 2640

tccctcggtg cggtgcaaaa ccgtctggat tccgcggtta ccaacctgaa caacaccact 2700

accaacctgt ctgaagcgca gtcccgtatt caggacgccg actatgcgac cgaagtgtcc 2760

aatatgtcga aagcgcagat catccagcag gccggtaact ccgtgttggc aaaagctaac 2820

caggtaccgc agcaggttct gtctctgctg cagggtctcg agcaccacca ccaccaccac 2880

<210> 12

<211> 960

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> KFD2-PAc 融合蛋白（KFD2-PAc fusion protein）

<400> 12

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr

85 90 95

Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met

130 135 140

Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Ala Ser Gly Thr Asn

165 170 175

Ala Ala Asn Gln Ala Ala Tyr Gln Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Gln Ala

180 185 190

Glu Leu Lys Arg Val Gln Glu Ala Asn Ala Ala Ala Lys Ala Ala Tyr

195 200 205

Asp Thr Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Thr Glu Ile Ala Ala

210 215 220

Ala Asn Glu Glu Ile Arg Lys Arg Asn Ala Thr Ala Lys Ala Glu Tyr

225 230 235 240

Glu Thr Lys Leu Ala Gln Tyr Gln Ala Glu Leu Lys Arg Val Gln Glu

245 250 255

Ala Asn Ala Ala Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr

260 265 270

Gln Thr Glu Leu Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala

275 280 285

Thr Tyr Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Ala Ala Leu

290 295 300

Thr Ala Glu Asn Thr Ala Ile Lys Gln Arg Asn Glu Asn Ala Lys Ala

305 310 315 320

Thr Tyr Glu Ala Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val

325 330 335

Lys Lys Ala Asn Ala Ala Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr

340 345 350

Ala Tyr Gln Thr Glu Leu Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala

355 360 365

Lys Ala Ala Tyr Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Ala Asn Ala

370 375 380

Ala Leu Thr Ala Glu Asn Thr Ala Ile Lys Lys Arg Asn Ala Asp Ala

385 390 395 400

Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Lys Tyr Gln Ala Asp Leu Ala

405 410 415

Lys Tyr Gln Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Pro Val Lys Leu Lys Ala Tyr

420 425 430

Glu Asp Glu Gln Thr Ser Ile Lys Ala Ala Leu Ala Glu Leu Glu Lys

435 440 445

His Lys Asn Glu Asp Gly Asn Leu Thr Glu Pro Ser Ala Gln Asn Leu

450 455 460

Val Tyr Asp Leu Glu Pro Asn Ala Asn Leu Ser Leu Thr Thr Asp Gly

465 470 475 480

Lys Phe Leu Lys Ala Ser Ala Val Asp Asp Ala Phe Ser Lys Ser Thr

485 490 495

Ser Lys Ala Lys Tyr Asp Gln Lys Ile Leu Gln Leu Asp Asp Leu Asp

500 505 510

Ile Thr Asn Leu Glu Gln Ser Asn Asp Val Ala Ser Ser Met Glu Leu

515 520 525

Tyr Gly Asn Phe Gly Asp Lys Ala Gly Trp Ser Thr Thr Val Ser Asn

530 535 540

Asn Ser Gln Val Lys Trp Gly Ser Val Leu Leu Glu Arg Gly Gln Ser

545 550 555 560

Ala Thr Ala Thr Tyr Thr Asn Leu Gln Asn Ser Tyr Tyr Asn Gly Lys

565 570 575

Lys Ile Ser Lys Ile Val Tyr Lys Tyr Thr Val Asp Pro Lys Ser Lys

580 585 590

Phe Gln Gly Gln Lys Val Trp Leu Gly Ile Phe Thr Asp Pro Thr Leu

595 600 605

Gly Val Phe Ala Ser Ala Tyr Thr Gly Gln Val Glu Lys Asn Thr Ser

610 615 620

Ile Phe Ile Lys Asn Glu Phe Thr Phe Tyr Asp Glu Asp Gly Lys Pro

625 630 635 640

Ile Asn Phe Asp Asn Ala Leu Leu Ser Val Ala Ser Leu Asn Arg Glu

645 650 655

His Asn Ser Ile Glu Met Ala Lys Asp Tyr Ser Gly Lys Phe Val Lys

660 665 670

Ile Ser Gly Ser Ser Ile Gly Glu Lys Asn Gly Met Ile Tyr Ala Thr

675 680 685

Asp Thr Leu Asn Phe Lys Gln Gly Glu Gly Gly Ser Arg Trp Thr Met

690 695 700

Tyr Lys Asn Ser Gln Ala Gly Ser Gly Trp Asp Ser Ser Asp Ala Pro

705 710 715 720

Asn Ser Trp Tyr Gly Ala Gly Ala Ile Lys Met Ser Gly Pro Asn Asn

725 730 735

His Val Thr Val Gly Ala Thr Ser Ala Thr Asn Val Met Pro Val Ser

740 745 750

Asp Met Pro Val Val Pro Gly Lys Asp Asn Thr Asp Gly Lys Lys Pro

755 760 765

Asn Ile Trp Tyr Ser Leu Asn Gly Lys Ile Arg Ala Val Asn Val Pro

770 775 780

Lys Val Thr Lys Glu Lys Pro Thr Pro Pro Val Lys Pro Thr Ala Pro

785 790 795 800

Thr Lys Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro Leu Lys Pro Ala Pro Val

805 810 815

Ala Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asp

820 825 830

Gln Ala Glu Pro Asn Lys Pro Thr Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys

835 840 845

Pro Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu Pro Thr Tyr Glu Thr Thr Asp Pro

850 855 860

Leu Lys Ala Leu Asp Asp Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser

865 870 875 880

Ser Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu

885 890 895

Asn Asn Thr Thr Thr Asn Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp

900 905 910

Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile

915 920 925

Gln Gln Ala Gly Asn Ser Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln

930 935 940

Gln Val Leu Ser Leu Leu Gln Gly Leu Glu His His His His His His

945 950 955 960

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 13

tatagctagc ggaaccaatg ctgccaatc 29

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 14

attaggatcc gtcgtctcat aagttggctc 30

<210> 15

<211> 1497

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 15

atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60

aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120

gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180

ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240

gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300

accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360

gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420

aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480

aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatggtttta gcgttaaaaa taacgataca 540

gttaccacta gtgctccagt aactgctttt ggtgctacca ccacaaacaa tattaaactt 600

actggaatta ccctttctac ggaagcagcc actgatactg gcggaactaa cccagcttca 660

attgagggtg tttatactga taatggtaat gattactatg cgaaaatcac cggtggtgat 720

aacgatggga agtattacgc agtaacagtt gctaatgatg gtacagtgac aatggcgact 780

ggagcaacgg caaatgcaac tgtaactgat gcaaatacta ctaaagctac aactatcact 840

tcaggcggta cacctgttca gattgataat actgcaggtt ccgcaactgc caaccttggt 900

gctgttagct tagtaaaact gcaggattcc aagggtaatg ataccgatac atatgcgctt 960

aaagatacaa atggcaatct ttacgctgcg gatgtgaatg aaactactgg tgctgtttct 1020

gttaaaacta ttacctatac tgactcttcc ggtgccgcca gttctccaac cgcggtcaaa 1080

ctgggcggag atgatggcaa aacagaagtg gtcgatattg atggtaaaac atacgattct 1140

gccgatttaa atggcggtaa tctgcaaaca ggtttgactg ctggtggtga ggctctgact 1200

gctgttgcaa atggtaaaac cacggatccg ctgaaagcgc tggacgatgc tatcgcatct 1260

gtagacaaat tccgttcttc cctcggtgcg gtgcaaaacc gtctggattc cgcggttacc 1320

aacctgaaca acaccactac caacctgtct gaagcgcagt cccgtattca ggacgccgac 1380

tatgcgaccg aagtgtccaa tatgtcgaaa gcgcagatca tccagcaggc cggtaactcc 1440

gtgttggcaa aagctaacca ggtaccgcag caggttctgt ctctgctgca gggttaa 1497

<210> 16

<211> 498

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 16

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Ile Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Ile Asn Lys Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ala Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Val Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Ser Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Thr

85 90 95

Val Gln Ala Thr Thr Gly Thr Asn Ser Glu Ser Asp Leu Ser Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Lys Ser Arg Leu Asp Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Asn Val Leu Ala Lys Asn Gly Ser Met

130 135 140

Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Asn Gln Thr Ile Thr Ile Asp Leu

145 150 155 160

Lys Gln Ile Asp Ala Lys Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Ser Val Lys

165 170 175

Asn Asn Asp Thr Val Thr Thr Ser Ala Pro Val Thr Ala Phe Gly Ala

180 185 190

Thr Thr Thr Asn Asn Ile Lys Leu Thr Gly Ile Thr Leu Ser Thr Glu

195 200 205

Ala Ala Thr Asp Thr Gly Gly Thr Asn Pro Ala Ser Ile Glu Gly Val

210 215 220

Tyr Thr Asp Asn Gly Asn Asp Tyr Tyr Ala Lys Ile Thr Gly Gly Asp

225 230 235 240

Asn Asp Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Thr Val Ala Asn Asp Gly Thr Val

245 250 255

Thr Met Ala Thr Gly Ala Thr Ala Asn Ala Thr Val Thr Asp Ala Asn

260 265 270

Thr Thr Lys Ala Thr Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Pro Val Gln Ile

275 280 285

Asp Asn Thr Ala Gly Ser Ala Thr Ala Asn Leu Gly Ala Val Ser Leu

290 295 300

Val Lys Leu Gln Asp Ser Lys Gly Asn Asp Thr Asp Thr Tyr Ala Leu

305 310 315 320

Lys Asp Thr Asn Gly Asn Leu Tyr Ala Ala Asp Val Asn Glu Thr Thr

325 330 335

Gly Ala Val Ser Val Lys Thr Ile Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Gly Ala

340 345 350

Ala Ser Ser Pro Thr Ala Val Lys Leu Gly Gly Asp Asp Gly Lys Thr

355 360 365

Glu Val Val Asp Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ser Ala Asp Leu Asn

370 375 380

Gly Gly Asn Leu Gln Thr Gly Leu Thr Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr

385 390 395 400

Ala Val Ala Asn Gly Lys Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp

405 410 415

Ala Ile Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val Gln

420 425 430

Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Thr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn

435 440 445

Leu Ser Glu Ala Gln Ser Arg Ile Gln Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu

450 455 460

Val Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Ile Gln Gln Ala Gly Asn Ser

465 470 475 480

Val Leu Ala Lys Ala Asn Gln Val Pro Gln Gln Val Leu Ser Leu Leu

485 490 495

Gln Gly

Claims (3)

1.用于预防或治疗由变形链球菌感染引起的龋齿的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括：

从变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原；

从鞭毛素派生的佐剂；

药学上可接受的载体；

所述抗原是由SEQ ID NO：1编码的PAc多肽或由SEQ ID NO：2代表的PAc多肽变种；所述鞭毛素派生的佐剂是由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：15编码的多肽或由SEQ ID NO：4代表的鞭毛素变种；所述变种是指一种多肽，具有功能的、并与在序列表中确定的序列至少有90%的同源性；

所述抗原和鞭毛素派生的佐剂表达为一个单一的重组蛋白，重组蛋白序列为SEQ ID NO：6；或所述抗原被插入到鞭毛素派生的佐剂的高变域，且重组蛋白序列为SEQ ID NO：12。

2.权利要求1所述疫苗组合物在制备预防或治疗个体中由变形链球菌感染引起的龋齿的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述个体是人。

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