CN109069424B

CN109069424B - 脂质体疫苗

Info

Publication number: CN109069424B
Application number: CN201680074917.3A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·戈德; 麦福思·扎曼
Original assignee: Griffith University
Current assignee: Griffith University
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: WO2017070735A1; CN106606775A; CN109069424A

Abstract

适合于针对一种或多种不同病原体来预防、治疗或免疫的免疫原性剂，其包含展示在脂质囊泡上的一种或多种病原体衍生的蛋白质、其片段、变体或衍生物和位于囊泡内空间的诸如白喉类毒素的载体蛋白质。免疫原性剂可适合于鼻内施用且能够引起粘膜免疫应答。免疫原性剂可进一步包含先天免疫的激活剂，例如海藻糖‑6,6′‑二山嵛酸酯(TDB)和/或诸如脱氧胆酸钠的胆汁盐。所述一种或多种病原体可以是A群链球菌、病毒或钩虫。

Description

脂质体疫苗

技术领域

本发明涉及传染性疾病的预防和治疗。更具体地，本发明涉及通过诱导粘膜免疫应答来治疗或预防传染性疾病和病症的脂质体疫苗。

背景技术

已经证明，全身免疫通过全身部位的血清免疫球蛋白(Ig)在预防由各种不同的病原体造成的疾病中是有效的，但在预防粘膜部位的定殖由此预防人与人之间的传播方面是无效的。因此，对于一些疾病，全身疫苗接种对于诱导免疫不是最佳的途径。相比之下，经鼻给药的抗多种生物体的粘膜疫苗在诱导全身和粘膜隔室的抗原特异性免疫应答方面是有效的。由于这种双层保护性免疫，粘膜疫苗接种对于抵抗全身性和粘膜感染是理想的策略，其具有的预防粘膜定殖的额外益处还会抑制通过来自上呼吸道的飞沫和气溶胶的传播。粘膜疫苗接种还具有经济上的优势，这是疫苗开发的一个重要的考量因素。由于通过鼻途径给予疫苗的便捷性，可以避免使用针具。无痛递送有助于更好的患者依从性。

发明内容

本发明的目的是提供引发对病原体的粘膜免疫应答的免疫原性剂和递送系统。在广义上，本发明涉及借助还包含诸如白喉类毒素(DT)的载体蛋白质的脂质囊泡，通过递送免疫原性蛋白、片段或变体，促进或诱发粘膜免疫。合适地，载体蛋白质位于囊泡内空间。在具体的形式中，单一免疫原性剂包括来自多种不同病原体的多种不同的免疫原性蛋白、片段或变体。

本发明的一方面提供了适于施用于哺乳动物的免疫原性剂，所述免疫原性剂包含一种或多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物，脂质囊泡和载体蛋白质或其片段或变体。

在一个实施方案中，载体蛋白质是白喉类毒素(DT)。

在一个实施方案中，免疫原性剂是包括来自不同病原体的多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物的脂质囊泡。

本发明的另一方面提供了包含前述方面的免疫原性剂的组合物。

在一个实施方案中，组合物包含免疫原性剂，所述免疫原性剂包括脂质囊泡，所述脂质囊泡包含相同或单种病原体的或来自相同或单种病原体的多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物。

在一个实施方案中，组合物包含多种不同的免疫原性剂，所述免疫原性剂各自包含不同的病原体的或来自不同的病原体的一种或多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物。

在一个实施方案中，组合物包含包括脂质囊泡的单一免疫原性剂，所述脂质囊泡包含不同的病原体的或来自不同的病原体的多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物。

在一个实施方案中，组合物包含多种不同的免疫原性剂，所述免疫原性剂各自包含不同病原体的或来自不同病原体的一种或多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物。

本发明的另一方面提供了在哺乳动物中引起针对一种或多种病原体的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤：向哺乳动物施用包含一种或多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物、脂质囊泡和白喉类毒素(DT)或其片段或变体的免疫原性剂，或包含其的组合物，从而在哺乳动物中引起针对所述一种或多种病原体的免疫应答。

本发明的另一方面提供了针对一种或多种病原体免疫哺乳动物的方法，所述方法包括下述步骤：向哺乳动物施用包含一种或多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物、脂质囊泡和白喉类毒素(DT)或其片段或变体的免疫原性剂，或包含其的组合物，从而针对所述一种或多种病原体免疫哺乳动物。

本发明的仍另一方面提供了在哺乳动物中治疗或预防被一种或多种病原体感染的方法，所述方法包括下述步骤：向哺乳动物施用包含一种或多种免疫原性蛋白、其片段、变体或衍生物、脂质囊泡和白喉类毒素(DT)或其片段或变体的免疫原性剂，或包含其的组合物，从而在哺乳动物中治疗或预防被所述一种或多种病原体感染。

合适地，免疫原性剂引起粘膜免疫应答。

典型地，粘膜免疫应答包括产生IgA。

在优选形式中，免疫原性剂经鼻内施用。

合适地，免疫原性蛋白、其片段或变体展示于脂质囊泡的表面上。合适地，白喉类毒素(DT)或其片段或变体位于囊泡中的囊泡内空间。在优选的实施方案中，所述脂质囊泡是脂质体。

合适地，免疫原性蛋白片段或变体是脂化的。在某些实施方案中，在免疫原性蛋白片段或变体的N-末端的赖氨酸(K)残基是脂化的。在优选形式中，N-末端的赖氨酸(K)残基通过α和ε氨基团被脂化。在一些实施方案中，每一脂质都是C₁₆脂肪酸，诸如棕榈酸。优选地，N-末端的赖氨酸(K)残基位于免疫原性蛋白片段或变体的N-末端的间隔子氨基酸序列中。

在一个特定实施方案中，所述免疫原性蛋白、片段或变体是A群链球菌M蛋白、其片段、变体或衍生物。在另外的或可选的实施方案中，免疫原性蛋白是促进嗜中性粒细胞活性恢复或增强的试剂。

在具体实施方案中，M蛋白片段为M蛋白的保守区域或者包含M蛋白的保守区域。在一个实施方案中，所述片段是免疫原性片段，其包含p145肽或者被包含于p145肽中。在具体实施方案中，所述免疫原性片段位于J8肽或其变体内，或者包含J8肽或其变体。

优选地，J8肽包含以下氨基酸序列或者基本由以下氨基酸序列组成：QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO:1)。

在一个广泛实施方案中，促进嗜中性粒细胞活性恢复或增强的试剂是蛋白SpyCEP或其片段。

在优选实施方案中，SpyCEP片段包含以下氨基酸序列或者基本由以下氨基酸序列组成：NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:2)。

在一个具体实施方案中，SpyCEP片段和M蛋白片段可以融合以形成单一的嵌合肽。

在一个实施方案中，所述嵌合肽为以下氨基酸序列或其变体，可包含以下氨基酸序列或其变体，或者基本由以下氨基酸序列或其变体组成：NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO:3)。

在一个具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是流感病毒的。流感病毒可以是甲型流感病毒。非限制性例子是以下氨基酸序列、包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:4)。流感病毒可以是乙型流感病毒。非限制性例子是以下氨基酸序列、或包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列PAKLLKERGFFGAIAGFLE(SEQ ID NO:5)。

在一个具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是鼻病毒的。非限制性例子是以下氨基酸序列、包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列GAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINY(SEQ ID NO:6)。另一非限制性例子是以下氨基酸序列、包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列GAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSL(SEQ ID NO:7)。

在一个具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是蠕虫的，比如钩虫的。非限制性例子是以下氨基酸序列、包含以下氨基酸序列或基本上由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列TSLIAGLKAQVEAIQKYIGAEL(SEQ ID NO:8)。

在一些实施方案中，免疫原性剂可以进一步包含先天免疫的激活剂。所述先天免疫激活剂可以靶向C型凝集素，例如巨噬细胞可诱导的Ca²⁺依赖性(C型)凝集素(“Mincle”)。先天免疫的激活剂可以是糖脂类的。非限制性实例包括糖脂，例如分枝杆菌索状因子海藻糖-6,6'-二霉菌酸酯(TDM)和/或其合成的类似物海藻糖-6,6'-二山嵛酸酯(TDB)或脂质A糖脂类佐剂。

在一些实施方案中，免疫原性剂可以进一步包含胆汁盐，例如脱氧胆酸钠。

除非上下文另外需要，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”以及“包含(comprising)”或类似的术语意图意为非排他性包含，以使叙述的元素或特征列表不仅包含阐明的或列出的那些，而可以包含未列出或阐明的其它元素或特征。

在氨基酸序列的背景下，通过“基本由……组成”意为叙述的氨基酸序列以及位于N-或C-端的另外1个、2个或3个氨基酸。

如本文所使用的，在此使用不定冠词‘一(a)’和‘一(an)’以指或者包含单数或复数元素或特征，并且不应被认为意为或者限定“一个/一种(one)”或“单一”元素或特征。

附图说明

图1.J8-Lipo-DT的理想化结构。脂质体将DT封装，同时在N端与间隔子KSS相连的J8与两个棕榈酸分子共价偶联，促进J8插入脂质体膜。

图2.单只BALB/c小鼠的J8特异性抗体应答。平均抗体滴度以bar表示。A)唾液IgA滴度。B)粪便IgA滴度。C)血清IgG滴度。利用单因素ANOVA进行统计分析，然后进行Tukey事后检验(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

图3.在BALB/C小鼠中，用M1GAS菌株进行鼻内攻击之后的细菌负荷。A)鼻腔脱落物。B)咽喉拭子。C)NALT的定殖。结果以下述表示：对于咽喉拭子、鼻腔脱落物而言，在第1-3天，10只小鼠/组的平均CFU+SEM；对于NALT，在第3天。利用非参数、非配对的曼-惠特尼U检验进行统计分析，以将测试组与PBS对照组进行比较(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

图4.单只B10.BR小鼠的J8特异性抗体应答(每组n＝5)。平均抗体滴度以bar表示。A)唾液IgA滴度。B)粪便IgA滴度。C)血清IgG滴度。利用单因素ANOVA进行统计分析，然后进行Tukey事后检验(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

图5.评估用M1菌株进行鼻内攻击之后的细菌负荷的URT GAS攻击模型。A)B10.BR小鼠的鼻腔脱落物。B)B10.BR小鼠的咽喉拭子。结果以第1-3天，5只小鼠/组的平均CFU+SEM表示。利用非参数、非配对的曼-惠特尼U检验进行统计分析，以将测试组与PBS对照组进行比较(ns，p>0.05；*，p<0.05)。

图6.单只BALB/c小鼠的J8特异性抗体应答。平均抗体滴度以bar表示。A)唾液IgA滴度。B)血清IgG滴度。利用单因素ANOVA进行统计分析，然后进行Tukey事后检验(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

图7.免疫的小鼠中抗原特异性分泌的趋化因子和细胞因子。取出脾细胞，并如所示添加下述刺激：LPS(2μg/mL)、J8(10μg/mL)或单独的培养基。刺激之后72小时，分离上清液，并利用流式微珠阵列对分泌的趋化因子或细胞因子的水平进行分析(参见材料与方法)。利用学生t检验进行统计分析(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01)。

图8.在用或未用试剂进行治疗的情况下，人DC亚群上的表面标志物水平。如所示添加下述刺激：聚肌苷酸：聚胞嘧啶核苷酸(pIC，10μg/mL)、J8-Lipo-DT(150μg/mL)或单独的培养基。在刺激之后24小时，通过流式细胞仪测量细胞表面标志物。A)CD123+类浆细胞DC。B)CD141+经典1型DC。C)CD1c+经典2型DC。值以来自三个单独供体的混合数据的中位荧光强度(MFI)±SEM表示。利用非参数、非配对的曼-惠特尼U检验进行统计分析，以将测试组与媒介物对照组进行比较(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

图9.人树突状细胞中由J8-Lipo-DT诱导分泌的趋化因子和细胞因子。取出树突状细胞，并如所示添加下述刺激：pIC(10μg/mL)、J8-Lipo-DT(150μg/mL)或单独的媒介物。刺激之后24小时分离上清液，并利用流式微珠阵列对分泌的趋化因子或细胞因子的水平进行分析(参见材料和方法)。利用学生t检验进行统计分析(ns，p>0.05；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。

图10.SpyCEP肽(S2；SEQ ID NO:2)脂质体递送试剂引发粘膜IgA应答。向小鼠鼻内施用展示棕榈酸脂化的S2肽或S2-J8嵌合体(SEQ ID NO:3)的脂质体以及囊内DT，并测量S2特异性IgA滴度。

图11.J8+S2-Lipo-DT免疫原性剂在小鼠中诱导抗原特异性IgA、IgG应答。

图12.可以挤压J8-Lipo-DT免疫原性剂以形成纳米或微米尺寸的颗粒。通过Nanosizer(动态光散射或DLS)进行脂质体尺寸测量。

图13.J8-Lipo-DT免疫原性剂的尺寸不影响全身性IgG应答。

图14.更大尺寸的J8-Lipo-DT免疫原性剂诱导J8特异性粘膜应答。

图15.PBS中复原的冷冻干燥的J8-Lipo-DT粉末的粒径分布。通过Nanosizer(动态光散射或DLS)进行脂质体尺寸测量。

图16.在无其它佐剂的情况下，复原的冷冻干燥的J8-Lipo-DT脂质体免疫原性剂诱导J8特异性全身性应答。

图17.复原的冷冻干燥的J8-Lipo-DT脂质体免疫原性剂诱导J8特异性粘膜应答。

图18.包含糖脂类佐剂海藻糖6,6′-二山嵛酸酯(TDB)的脂质体J8-Lipo-DT免疫原性剂的示意图描述。

图19.TDB增加了J8-Lipo-DT诱导的粘膜IgA应答。用30μg的J8-Lipo-Dt+TDB鼻内免疫小鼠(n＝5每组)。初次(第0天)施用至小鼠加上两次强化(第21天和第42天)。在唾液和粪便样品中，与J8-Lipo-DT相比，并入TDB导致显著更高的粘膜IgA应答。结果来自冻干粉末形式的消除了脂质体的稳定性问题的J8-Lipo-DT+TDB。

图20.包含胆汁盐脱氧胆酸钠的脂质体免疫原性剂的示意图描述。

图21.(A)示意性描绘了单一免疫原性剂，其包括脂质囊泡、囊内DT和多种不同病原体的免疫原性蛋白或来自多种不同病原体的免疫原性蛋白，所述多种不同病原体即甲型流感病毒、乙型流感病毒和A群链球菌；(B)示意性描绘了单一免疫原性剂，其包括脂质囊泡、囊内DT和多种不同病原体的免疫原性蛋白或来自多种不同病原体的免疫原性蛋白，以及糖脂类佐剂海藻糖6,6′-二山嵛酸酯(TDB)和单磷酰基3-脱酰基脂质A

所述多种不同的病原体即甲型流感病毒、乙型流感病毒和A群链球菌。

图22.相比用各抗甲型流感病毒、乙型流感病毒和A群链球菌的分开的免疫原性剂单独接种(“Single Antigen-vax”)，抗甲型流感病毒、乙型流感病毒和A群链球菌的单免疫原性剂(“Multivax”)的免疫原性，如通过抗原特异性唾液IgA滴度所测量的。

具体实施方式

本发明至少部分依据下述发现为基础：用包含展示于脂质体表面的免疫原性肽与囊内载体蛋白质例如白喉类毒素(DT)的脂质体免疫原性剂进行小鼠鼻内疫苗接种，引起粘膜和全身性抗体应答，该应答可与由建立的非人类可兼容的佐剂CTB诱导的那些相当。在A群链球菌和J8肽的特定背景下，由脂质体制剂诱导的保护性免疫的水平明显超过由J8/CTB所诱导的水平。此外，纯化的人树突状细胞(DC)亚群的细胞因子应答表明，此类脂质体在诱导人粘膜J8特异性IgA和全身性IgG应答中将是有效的。在一些实施方案中，脂质体免疫原性剂可以单独包含SpyCEP肽或其其它片段或者还包含J8肽。在具体形式中，脂质体免疫原性剂可以适用于治疗或预防由对用于A群链球菌感染的常用抗生素治疗具有抗性的A群链球菌的特别强毒株或分离菌所导致的感染。这些菌株或分离菌通常引起皮肤严重感染(例如坏死性筋膜炎)，以及在一些情况下，可含有CovR/SCovR/S突变。这可能概括至其他病原体和它们相关的疾病、病症和病况，包括但不限于流感、鼻病毒和蠕虫，比如钩虫。所以，本发明的实施方案提供了单一免疫原性剂，其包括多种不同的病原体的或来自多种不同的病原体的一种或多种免疫原性蛋白、片段、变体或衍生物。

为本发明目的，“分离的”意指已经从其天然状态移出的材料，或已经接受人工操作的材料。分离的材料可以基本上或本质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分，或可以被操作从而与在其天然状态下通常伴随的组分一起处于人工状态。分离的材料可以为天然、化学合成或重组形式。

“蛋白质”意指氨基酸聚合物。如本领域内公知，氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸，D-氨基酸或L-氨基酸。

术语“蛋白质”包括并涵盖“肽”和“多肽”，肽通常用于描述具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质，多肽通常用于描述具有多于五十(50)个氨基酸的蛋白质。

如本文大体上所使用，当蛋白质被称为“病原体的”或“来自病原体的”意思是该蛋白包括至少部分或全部存在于病原体的蛋白中的氨基酸序列。

“片段”为蛋白质的区段、结构域、部分或区域，其构成不到所述蛋白质100％的氨基酸序列。将认识到，片段可以为单独的片段，或可以单独重复，或可以与其他片段重复。

通常，片段可包含全长蛋白质的至多5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600个氨基酸，基本上由所述氨基酸组成或由所述氨基酸组成。

如本文所用，蛋白质“变体”与参照氨基酸序列共有可确定的核苷酸或氨基酸序列关系。“变体”蛋白质可以缺失参照氨基酸序列的一个或多个氨基酸，或所述氨基酸由不同的氨基酸替换。领域内公知，一些氨基酸可以被替换或缺失，而不改变免疫原性片段和/或蛋白质的活性(保守型替换)。优选地，蛋白质突变体与参照氨基酸序列共有至少70％或75％，优选至少80％或85％，或更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

本文通常使用的描述各个蛋白质和核酸之间的序列关系的术语包括“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本上相同”。由于各个核酸/蛋白质可各自包含(1)由核酸/蛋白质共有的完整核酸/蛋白质序列的仅一个或多个部分，和(2)核酸/蛋白质之间不同的一个或多个部分，通常通过在“比较窗”比较序列来执行序列比较，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。“比较窗”是指与参照序列比较的通常6、9或12个连续残基的概念上的区段。比较窗可以包含与参照序列相比约20％或更少的添加或删除(即空位)，用于各个序列的最优比对。用于对齐比较窗的序列最优比对可以通过算法的计算机运行(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin遗传学软件包发行版7.0(GeneticsSoftware Package Release 7.0)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics ComputerGroup,575Science Drive Madison,WI,USA，通过引用将其并入本文)或通过目测来实施，通过所选择的各种方法的任一种产生最佳比对(即，产生比较窗中的最高同源性百分比)。例如Altschul et al,1997,Nucl.Acids Res.25:3389公开的BLAST程序家族也可以作为参考，通过引用将其并入本文。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等人编著的分子生物学通用手册(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley&Sons Inc NY,1995-1999)的19.3单元。

本文所用的术语“序列同一性”以其最宽泛的含义使用，以包括关于使用标准算法的合适比对，关于在比较窗相同的序列的程度，精确的核苷酸或氨基酸匹配的数量。因此，“序列同一性百分比”通过以下来计算：在比较窗中比较两个最优比对的序列，确定相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)在两条序列中出现的位置的数目以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗中总位置数(即，窗大小)，并将得到的结果乘以100以得到序列同一性百分比。例如，可以理解“序列同一性”意指通过DNASIS计算机程序(windows版，版本2.5；可从Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA获得)计算的“匹配百分比”。

如本文所用，“衍生物”为已被改变的诸如蛋白或其片段或变体的分子，如本领域所理解的，例如通过与其他化学部分连接或络合，通过翻译后修饰(例如磷酸化、乙酰化等)、糖基化作用修饰(例如添加、去除或改变糖基化)、脂化和/或包含额外的氨基酸序列。在一具体实施方案中，额外的氨基酸序列可包括在其N端和/或C端的一个或多个赖氨酸残基。多个赖氨酸残基(例如，多赖氨酸)可以为赖氨酸残基的线性序列或赖氨酸残基的支链序列。这些额外的赖氨酸残基可促进增加的肽溶解性。

额外的氨基酸序列可包括产生融合蛋白的融合伴侣氨基酸序列。例如，融合伴侣氨基酸序列可辅助分离的融合蛋白的检测和/或纯化。非限制性实例包括金属结合(例如，多组氨酸)融合伴侣、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、蛋白质A、谷胱甘肽S转移酶(GST)、荧光蛋白质序列(例如，GFP)、表位标记例如myc、FLAG和血球凝集素标记。其他额外的氨基酸序列包括间隔子序列。间隔子序列的一个实例为在免疫原性蛋白质片段或变体的氨基酸序列的N端或C端的氨基酸序列，其包含适于脂化的赖氨酸(K)残基。通常，间隔子氨基酸序列包括两个(2)至十个(10)氨基酸，例如三个(3)氨基酸序列KSS。

本发明涵盖的其他衍生物包括但不限于，侧链的修饰，在肽或蛋白质合成期间并入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用交联剂，和向本发明的免疫原性蛋白质、片段和变体施加构象约束的其他方法。

在此方面，本领域技术人员可参考Coligan等人编著的蛋白质科学通用手册(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)(John Wiley&Sons NY 1995-2008)的第15章，关于蛋白质的化学修饰的更广泛的方法学。

应理解，本文公开的免疫原性蛋白质、片段和变体可以单独地呈现在脂质囊泡的表面，或作为包含多个拷贝的相同肽或多个不同肽的嵌合蛋白质或融合蛋白质呈现。非限制性实例为SEQ ID NO:3的嵌合肽，将在下文更详细地描述。

在本发明语境中，本文所用的术语“免疫原性”是指在向哺乳动物或其他动物使用免疫原性剂后产生或引发免疫应答的能力或效力，例如针对病原体或其分子组分的免疫应答。

“引发免疫应答”意指产生或刺激免疫系统的一种或多种元件的产生或活性，包括细胞免疫系统、抗体和/或天然免疫系统。适当地，免疫系统的一种或多种元件包括B淋巴细胞、抗体、嗜中性粒细胞、包括浆细胞样树突细胞在内的树突细胞、细胞因子和/或趋化因子。细胞因子的非限制性实例包括促炎性细胞因子例如TNF-α、IL-6和IL-1(例如IL-1β)。趋化因子的非限制性实例为嗜中性粒细胞化学引诱剂IL-8。适当地，免疫应答为或包括粘膜免疫应答，例如包括IgA产生。优选地，由免疫原性剂引发的免疫应答为保护性的。

如本文通用，术语“免疫”、“接种疫苗”和“疫苗”是指引发针对病原体的保护性免疫应答，从而该病原体的进一步感染被至少部分地预防或减小的方法和/或组合物。

如本文使用，术语“病原体”指能够在动物，比如鸟类或哺乳动物中造成疾病、病症或病况的任何活体或非活体实体。病原体可以是病毒、细菌、原生动物或蠕虫，但不限于此。病原体的具体非限制性例子包括A群链球菌细菌、呼吸道病毒，比如流感病毒和鼻病毒和线虫，比如钩虫。

如从本公开所理解的，本发明提供脂质囊泡制剂，其包含配制在脂质囊泡中的免疫原性蛋白质片段、变体或衍生物，以及载体蛋白质。如本文广泛使用，脂质囊泡可以是脂质体、微细胞、多层囊泡、微胶粒(micelle)、空泡或包含脂双层的其他囊泡结构，适当地，免疫原性蛋白质片段、变体或衍生物经衍生以包含促进锚定至脂双层的一种或多种脂质，从而免疫原性蛋白质片段、变体或衍生物呈现在脂质囊泡的表面。在优选形式中，通过α和/或ε氨基脂化赖氨酸(K)残基。为促进脂化，免疫原性蛋白质片段、变体或衍生物可进一步包含N端间隔子，所述N端间隔子包含已被脂化的赖氨酸(K)残基。间隔子通常可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸。一个实施方案是三个(3)氨基酸的间隔子KSS。脂质可包括饱和或不饱和脂肪酸(例如单不饱的和或多不饱和的)。在一些实施方案中，所述脂质或每个脂质为C₁₆脂肪酸，例如棕榈酸。然而，还将理解，诸如具有C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀、C₂₁或C₂₂碳链的饱和或不饱和(例如，单不饱和的或多不饱和的)脂肪酸的其他脂质可以用于本发明。

适当地，脂质囊泡包括能够形成脂双层结构的任意脂质，或脂质的混合物。这些包括磷脂，包括胆固醇、胆固醇酯和植物固醇在内的甾醇类、脂肪酸和/或甘油三酸酯。磷脂的非限制性实例包括磷脂酰胆碱(PC)(卵磷脂)、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺(PE)(脑磷脂)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)，或其天然或合成的衍生物。天然衍生物包括蛋PC、蛋PG、大豆PC、氢化大豆PC、大豆PG、脑PS、鞘酯(sphingolipids)、脑SM、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂、脑苷脂、脑磷脂、心磷脂和双十六烷基磷酸酯。合成的衍生物包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二癸酰磷脂酰胆碱(DDPC)、二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSM)和二硬脂酰鞘磷脂(DSSM)。磷脂也可以是任一上述磷脂的衍生物或类似物。

适当地，脂质的混合物可以包含期望摩尔比或期望wt％比的各磷脂。各自脂质之间的比例可在20:1至1:1之间，包括15:1、12:1、10:1、7:1、5:1、4:1、3:1和2:1或这些叙述的值之间的任何比例。例如，可以使用摩尔比为7二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC):2胆固醇(CHOL):1L-α-磷脂酰甘油(PG)形成脂质体。

适当地，脂质囊泡进一步包含载体蛋白质。适当地，载体蛋白质为免疫原性的，或至少部分地促进或增强所述免疫原性剂的免疫原性。通常，将载体蛋白质与脂质囊泡一起配制使得载体蛋白质位于脂质囊泡内部在内部水性空间内。在一些实施方案中，载体蛋白质与其免疫原性蛋白片段、变体或衍生物分开。根据该实施方案中，其免疫原性蛋白片段、变体或衍生物可展示在囊表面上。在一些实施方案中，载体蛋白质可以与所述其免疫原性蛋白质片段、变体或衍生物融合、结合或络合。这可以包括重组蛋白融合、化学交联和分子间络合，例如通过生物素-抗生物素蛋白或其他分子间结合剂，尽管不限于此。在这类实施方案中，所述其免疫原性蛋白质片段、变体或衍生物位于脂质囊泡内部在内部水性空间中，与所述载体蛋白质融合、结合或络合。该实施方案可以特别有用于口服递送免疫原性剂，例如包含胆汁盐的脂质体中，如本文以下更详细地描述的。载体蛋白质的非限制性实例包括白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、诸如CRM197的CRM蛋白质、和百日咳毒素突变体，尽管不限于此。还涵盖载体蛋白质的片段和变体。在一具体实施方案中，载体蛋白质为白喉类毒素(DT)或其片段。

在一些实施方案中，脂质囊泡进一步包含先天性免疫的激活剂。先天性免疫的激活剂可靶向与先天性免疫相关的由一种或多种细胞表达的C-型凝集素。优选的C-型凝集素为巨噬细胞诱导的Ca²⁺-依赖性(C-型)凝集素(“Mincle”)。非限制性实例包括糖脂，例如分枝杆菌索状因子海藻糖-6,6′-二霉菌酸酯(TDM)和/或其合成的类似物海藻糖-6,6′-二山嵛酸酯(TDB)和/或脂质A糖脂类佐剂比如单磷酰基3-脱酰基脂质A，其可以为

3D-

和3D(6-酰基)

的形式。尽管不希望被任何特定理论限制，推测先天性免疫的激活剂(例如上述)可增强或改善由免疫原性剂引发的粘膜免疫。优选地，糖脂类可包括在脂质囊泡中，从而其占脂质囊泡中总脂质的不超过约25％、20％、15％、10％或5％。

在一些实施方案中，脂质囊泡可以进一步包含胆汁酸或胆汁盐。胆汁酸通常为二羟基化或三羟基化的类固醇(在一些实施方案中包括24个碳)，包括胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸。优选地，脂质囊泡包含胆汁盐，如胆酸盐、去氧胆酸盐、鹅去氧胆酸盐或熊去氧胆酸盐。优选地，胆汁盐为去氧胆酸钠。

在其他实施方案中，包含免疫原性剂的脂质体可以制备为特定、选择的或期望的颗粒尺寸或尺寸范围。在一些实施方案中，较大颗粒尺寸的脂质体可引发较强的粘膜免疫应答。

在其他实施方案中，包含免疫原性剂的脂质体可被冻干或冻干以促进长期存储。复原的冷冻干燥的脂质体免疫原性剂引发与“新鲜”脂质体免疫原性剂相当的免疫应答。

在一些实施方案中，病原体是A群链球菌。

如本文所用，术语“A群链球菌(streptococcus、Streptococci、Streptococcal、Strep)”和简称“GAS”是指兰氏A血清群的链球菌细菌，其为化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)种的革兰氏阳性的β溶血菌。GAS的重要毒力因子为M蛋白质，其为强烈抗吞噬细胞的并且与血清因子H结合，破坏C3-转化酶和阻止C3b的调理素作用。这些还包括毒性“突变体”，例如，Graham等人,2002,PNAS USA 99 13855描述的CovR/S或CovRS突变体，尽管不限于此。

A群链球菌引起的疾病和病况包括蜂窝织炎、丹毒、脓疱病、猩红热、喉感染例如急性咽炎(“链球菌性喉炎”)、菌血症、中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎、急性风湿热和急性肾小球肾炎，尽管不局限于此。

如本文所用，“嗜中性粒细胞”或中性粒细胞与嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞一起形成多形核细胞家族(PMN)的一部分。嗜中性粒细胞为由骨髓干细胞形成的相对短寿的吞噬细胞并且通常构成哺乳动物中的40％至75％的白细胞。除了吞噬性，嗜中性粒细胞释放可溶的抗微生物剂(例如颗粒蛋白)和产生嗜中性粒细胞胞外捕网。嗜中性粒细胞对诸如白介素-8(IL-8)、C5a、fMLP和白三烯B4的分子有应答，所述分子促进嗜中性粒细胞至损伤和/或急性炎症的部位的趋化性。

在一个实施方案中，免疫原性蛋白可以为M蛋白、其片段或变体。

如本文所用，“M蛋白片段”为具有免疫原性和/或能够被抗体或抗体片段结合的GAS M蛋白的任何片段。通常，片段为下述、包含下述或包含在下述内：GAS M蛋白的C-重复区的氨基酸序列或其片段。非限制性实例包括p145，其为20mer，具有氨基酸序列LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO:4)。在这方面，p145氨基酸序列的片段可以存在于J8肽中。

如本文所用，“J8肽”为包含至少部分来源于或对应于GAS M蛋白C-区肽的氨基酸序列的肽。J8肽适当地包含构象B-细胞表位并且不含潜在有害的T-细胞自体表位。优选的J8肽氨基酸序列为QAEDKVKQ

KQLEDKVQ(SEQ ID NO:1)或其片段或变体，其中所述加粗的残基对应于GAS M蛋白的残基344至355。在该实施方案中，J8为进一步包括侧翼的GCN4DNA-结合蛋白序列的嵌合肽，所述序列帮助维持J8肽的正确螺旋折叠和构象结构。

在另一实施方案中，免疫原性蛋白可以为促进嗜中性粒细胞活性恢复或增强的试剂。

如本文所用，“促进嗜中性粒细胞活性恢复或增强的试剂”为直接或间接地至少部分增加、增强或恢复嗜中性粒细胞的产生、迁移和/或趋化性和/或嗜中性粒细胞的一种或多种免疫学活性的分子。在一个实施方案中，所述试剂引发对嗜中性粒细胞抑制剂的免疫应答。在另一实施方案中，所述试剂结合嗜中性粒细胞抑制剂以及至少部分地使其失活。嗜中性粒细胞抑制剂可以为衍生于或源自A群链球菌的分子。在一个特定形式中，嗜中性粒细胞抑制剂为蛋白水解切割白介素8的丝氨酸蛋白酶或其片段。在一个特定实施方案中，嗜中性粒细胞抑制剂为SpyCEP或其片段。SpyCEP为在人类病原体化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的表面表达的170-kDa多结构域的丝氨酸蛋白酶，其在通过催化裂解和失活嗜中性粒细胞化学引诱物白介素-8而在感染中起着重要作用。SpyCEP氨基酸序列的非限制性实例可以见于登录号YP597949.1和(化脓性链球菌MGAS10270)和YP596076.1(化脓性链球菌MGAS9429)。因此，在一个特定实施方案中，SpyCEP片段为或包含SEQ ID NO:2(NSDNIKENQFEDFDEDWENF)中所示的氨基酸序列。提出SEQ ID NO:2为或包含SpyCEP上的优势表位，其可以诱导功能性抗体。

本文还提供了包含形成单一、连续的氨基酸序列的M-蛋白氨基酸序列和SpyCEP氨基酸序列的嵌合肽。M-蛋白氨基酸序列可以位于SpyCEP氨基酸序列的C-末端，或反之亦然。在一个实施方案中，嵌合肽可以包含氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO:3)或其变体。

在替代实施方案中，可以产生包含M-蛋白氨基酸序列和SpyCEP氨基酸序列的各个脂质体用于以“混合物”施用。

在一个特定实施方案中，变体M蛋白或肽可以在其N和/或C-末端包含一个或多个赖氨酸残基。多个赖氨酸残基(例如聚赖氨酸)可以为赖氨酸残基的线性序列或者可以为赖氨酸残基的支链序列。这些另外的赖氨酸残基可以促进增加的肽的溶解性。

J8肽变体的非限制性实例包括：

S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q V E K A L C(SEQ ID NO：5)

S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K C(SEQ ID NO：6)

S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K K Q V E K A L C(SEQ ID NO：7)

S R E A K K Q V E K A L D A S R E A K K Q V E K A L C(SEQ ID NO：8)

其它变体可以基于诸如Cooper et al.,1997中所述的七肽。

举例来说，如果已知表位位于α-螺旋蛋白结构构象内，那么可以合成折叠成该构象的模式肽。模式α-螺旋卷曲螺旋肽已经基于GCN4亮氨酸拉链的结构(O’Shea et al.,1991)。第一七肽含有序列MKQLEDK(SEQ ID NO:9)，其包含稳定卷曲螺旋七肽重复基序(a-b-c-d-e-f-g)n中存在的若干特征(Cohen&Parry,1990)。这些包括在位置a和d的大的非极性残基，在位置e和g的酸/碱对(Glu/Lys)(通常有利于链间离子相互作用)以及在位置b、c、f的极性基团(与Lupas et al.(1991)的预测相一致)。GCN4肽还在位置a含有共有的缬氨酸。也已注意到，当位置a和d被V和L占据时，卷曲螺旋二聚体为优选的(Harburyet al.,1994)。模式七肽重复区来源于GCN4亮氨酸拉链肽的这些共有特征：(VKQLEDK；SEQ ID NO:10)，具有形成α-螺旋卷曲螺旋的潜力。该肽变为框架肽。研究中的构象表位的重叠片段嵌入模式卷曲螺旋肽中以产生嵌合肽。每当在螺旋模式肽和表位序列中发现相同的残基时，将设计成确保正确的螺旋卷曲螺旋构象的氨基酸置换(Cohen&Parry,1990)掺入嵌合肽中。通常使用下述置换：位置a，V至I；b，K至R；c，Q至N；d，L至A；e，E至Q；,f:D至E；g，K至R。所有这些替换残基通常见于卷曲螺旋蛋白中它们各自的位置(Lupas et al.,1991)。

描述于Olive et al.,2002,Infect&Immun.70 2734中的一个特定的J8肽衍生物为“脂质核心肽”。在一个实施方案中，脂质核心肽可以包含在偶联至亲脂性锚的分枝的聚赖氨酸核心的每个赖氨酸的两个氨基上直接合成的多个J8肽(例如四个J8肽)。

M蛋白片段或变体和/或SpyCEP片段或变体可以被衍生化以包含促进锚定于上文所述的脂质双层的一个或多个脂质。在另一实施方案中，包含M-蛋白氨基酸序列和SpyCEP氨基酸序列的嵌合肽(例如SEQ ID NO:3)可以在其N-末端包含间隔子氨基酸序列。因此，在SpyCEP片段或变体包括在脂质囊泡的实施方案中，它可以连同M蛋白片段或变体一起被分别地脂化或者可以以脂化的嵌合肽存在。

在一些实施方案中，病原体是流感病毒。在一个具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是甲型流感病毒的。免疫原性蛋白或片段可以是基质蛋白2，或其片段。非限制性例子是、或包括氨基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:4)。在一个具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是乙型流感病毒的。免疫原性蛋白或片段可以是血凝素蛋白，或其片段。非限制性例子是或包括氨基酸序列PAKLLKERGFFGAIAGFLE(SEQ IDNO:5)。

在一些实施方案中，病原体是鼻病毒。在一个具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是鼻病毒B蛋白，比如衣壳蛋白。非限制性例子是或包括氨基酸序列GAQVSTQKSGSHENQNILTNGSNQTFTVINY(SEQ ID NO:6)。在另一具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是鼻病毒A蛋白的，比如衣壳蛋白。另一非限制性例子是或包括氨基酸序列GAQVSRQNVGTHSTQNMVSNGSSL(SEQ ID NO:7)。

在一些实施方案中，病原体是蠕虫，比如钩虫。在一个具体的实施方案中，免疫原性蛋白、片段或变体是美洲钩虫(Necator americanus)。非限制性例子是或包括氨基酸序列TSLIAGLKAQVEAIQKYIGAEL(SEQ ID NO:8)。

本发明的分离的免疫原性蛋白、片段和/或衍生物可以通过本领域已知的任何手段来产生，所述手段包括但不限于化学合成、重组DNA技术和蛋白水解裂解以产生肽片段。

化学合成包括固相和液相合成。尽管参考SYNTHETIC VACCINES Ed.Nicholson(Blackwell Scientific Publications)的第9章以及CURRENT PROTOCOLS IN PROTEINSCIENCE Eds.Coligan et al.,(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2008)的第15章中提供的化学合成技术的实例，但此类方法为本领域熟知的。在这方面，还参考了国际公布WO99/02550和国际公布WO 97/45444。

重组蛋白可以使用标准方案通过本领域熟练技术人员方便地制备，所述标准方案描述于例如Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING.A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press,1989)，特别是第16部分和第17部分；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY Eds.Ausubel et al.,(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2015)，特别是第10章和第16章；以及CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan et al.,(JohnWiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2015)，特别是第1章、第5章和第6章。通常，重组蛋白制备包括在合适的宿主细胞中表达编码蛋白质的核酸。

如上文所述，本发明提供了免疫原性剂和/或它们用于预防或治疗哺乳动物或其它动物中病原体相关的疾病、病症或病况的用途。

如本文所用，“治疗(treating/treat/treatment)”是指在开始形成之后至少部分地改善、消除或减少病原体相关的疾病、病症或病况的症状或病理学迹象的治疗性干预。治疗不一定绝对有益于受试者。有益效果可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法或标准来测定。

如本文所用，防止(preventing/prevent/prevention)是指在感染或暴露于病原体或其分子组分之前和/或疾病、病症或病况的症状或病理学迹象发作之前开始的的作用过程，以便防止感染和/或减少症状或病理学迹象。应理解此类防止不一定绝对有益于受试者。“预防性”治疗是以降低发展出疾病、病症或病况的症状或病理学迹象的风险的目的，施用于未显示出疾病、病症或病况的迹象或者仅显示出早期迹象的受试者的治疗。

在一个实施方案中，疾病、病症或病况可以为A群链球菌相关的疾病、病症或病况。

在本发明的背景下，“A群链球菌相关的疾病、病症或病况”意指由A群链球菌感染引起的任何临床病理学并且包括蜂窝组织炎、丹毒、脓疱病、猩红热、喉感染例如急性咽炎(“链球菌性喉炎”)、菌血症、中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎、急性风湿热和急性肾小球肾炎，尽管不局限于此。

如上文所述，本文公开的用于治疗和/或免疫的用途包括向哺乳动物施用包含M蛋白片段、变体或衍生物、脂质囊泡、载体蛋白质和/或SpyCEP肽或促进嗜中性粒细胞活性恢复或增强的其它片段的免疫原性剂。

如本文所公开的，治疗和/或免疫可以另外包括施用抗体或抗体片段以治疗性治疗GAS感染，例如通过在感染部位(例如皮肤)靶向SpyCEP，和/或结合M蛋白、其片段或变体的抗体或抗体片段。

抗体和抗体片段可以为多克隆的或单克隆的、天然的或重组的。抗体片段包括Fc、Fab或F(ab)2片段和/或可以包括单链Fv抗体(scFv)。此类scFv可以例如根据分别描述于下述的方法来制备：美国专利第5,091,513号、欧洲专利第239,400号或Winter&Milstein,1991,Nature 349:293的文章。抗体还可以包括含有多个scFv的多价重组抗体片段，如双链抗体、三链抗体和/或四链抗体，以及二聚作用活化的半链抗体(demibodies)(例如WO/2007/062466)。举例来说，此类抗体可以根据描述于Holliger et al.,1993Proc NatlAcad Sci USA 90 6444；或者Kipriyanov,2009Methods MolBiol 562 177中的方法来制备。可应用于抗体产生、纯化和用途的熟知方案可以见于，例如Coligan et al.,CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons NY,1991-1994)的第2章和Harlow,E.&Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Cold Spring HarborLaboratory,1988。

用于产生多克隆抗体的方法对本领域技术人员而言是熟知的。可以使用的示例性方案描述于例如Coligan et al.,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,见上文和Harlow&Lane,1988,见上文中。在特定实施方案中，抗-SpyCEP多克隆抗体可以获得自或纯化自来自暴露于或感染A群链球菌的个体的人血清。可选地，可以在例如马的生产物种中产生针对纯化的或重组的SpyCEP或其免疫原性片段的多克隆抗体，然后在施用之前随后纯化。

单克隆抗体可以使用标准方法来制备，例如最初描述于

Milstein,1975,Nature 256,495的文章中的标准方法，或者通过例如描述于Coligan et al.,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(见上文)的其更近期的改良来制备，通过永生化来自已接种过本发明的一种或多种分离的蛋白、片段、变体或衍生物的产生物种的脾细胞或其它产生抗体的细胞。因此，可针对M蛋白片段、变体或衍生物和/或促进嗜中性粒细胞活性恢复或增强的试剂(例如SpyCEP)产生单克隆抗体，用于根据本发明的用途。在某些实施方案中，单克隆抗体或其片段可以为重组形式。如果单克隆抗体最初由非人类哺乳动物的脾细胞产生，则这可以特别有利于“人源化”单克隆抗体或片段。

对于与治疗性抗体相关的实施方案，优选的M蛋白片段可以为p145肽。

用于抗体产生的SpyCEP的优选片段可以包括下述氨基酸序列或者由下述氨基酸序列组成：NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:2)。

在一些实施方案中，疾病、病症或病况可以是流感病毒相关的疾病、病症或病况。流感病毒可造成传播性或以其他方式传染的疾病，称为“流感”。典型的症状包括发烧、头疼、咳嗽、嗜睡、呼吸道和鼻咽粘液积累以及分泌、肌肉疼痛、恶心和呕吐。症状可持续数天或持续数周。在一些情况下，可能出现继发性呼吸道细菌感染，在一些情况下造成严重的病况，比如肺炎。因此，本发明的免疫原性剂和/或方法可治疗或预防流感病毒相关的疾病、病症或病况比如上面所述的。

在一些实施方案中，疾病、病症或病况可以是鼻病毒相关的疾病、病症或病况。鼻病毒(例如，鼻病毒A和鼻病毒B)是病毒微小核糖核酸病毒科肠病毒属的种。鼻病毒通常是普通感冒的致病因子，其症状与流感相似，但是一般严重性更低并且继发性细菌感染，比如肺炎的概率更低。

因此，本发明的免疫原性剂和/或方法可治疗或预防鼻病毒相关的疾病、病症或病况例如上面所描述的。

在一些实施方案中，疾病、病症或病况可以是钩虫相关的疾病、病症或病况。钩虫是线虫类蠕虫，其寄生在许多不同的动物中。通常感染人类的钩虫可包括美洲钩虫和十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenalis)。钩虫具有钩状口器，其将钩虫附着至肠壁，刺穿血管并且吸食血液，在一些情况下导致严重的贫血。孕期的钩虫感染可造成胎儿的生长迟滞、早产和低的出生体重。儿童中的钩虫可造成智力、认知和生长问题。

因此，本发明的免疫原性剂和/或方法可治疗或预防蠕虫相关的疾病、病症或病况比如上面所描述的。

在具体的实施方案中，前述方法可如下进行：

(i)施用免疫原性剂，所述免疫原性剂包括单一或相同病原体的一种或多种不同的蛋白质、片段、变体或衍生物；

(ii)施用多种不同的免疫原性剂，所述免疫原性剂各自包括不同病原体的一种或多种不同的蛋白质、片段、变体或衍生物；或

(iii)施用免疫原性剂，所述免疫原性剂包括不同病原体的一种或多种不同的蛋白质、片段、变体或衍生物；

从而：

引发针对所述病原体的免疫应答；

针对所述病原体免疫；或

预防或治疗所述一种或多种病原体造成的一种或多种疾病、病症或病况。

在某些方面和实施方案中，免疫原性剂可以以组合物形式施用。

在具体的实施方案中，所述组合物可包含：

免疫原性剂，所述免疫原性剂包括相同或单一病原体的一种或多种不同的蛋白质、片段、变体或衍生物；

多种不同的免疫原性剂，所述免疫原性剂各自包括不同病原体的一种或多种蛋白质、片段、变体或衍生物；或

免疫原性剂，所述免疫原性剂包括不同病原体的一种或多种不同的蛋白质、片段、变体或衍生物；

在优选形式中，所述组合物包含可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

“可接受的载体、稀释剂或赋形剂”意指可以安全用于全身施用的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。取决于特定的施用途径，可以使用本领域熟知的多种载体、稀释剂和赋形剂。这些可以选自包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲液、乳化剂、等渗盐水和盐(例如无机酸盐，包括盐酸盐、溴酸盐和硫酸盐；有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐)、水和无热原水的组。

描述可接受的载体、稀释剂和赋形剂的可用参考为Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)，其通过引用并入本文。

优选地，为了引发免疫应答的目的，某些免疫剂可以与本文公开的免疫原性剂组合用于制剂中。

术语“免疫剂”在其范围内包括本领域熟知的载体、递送剂、免疫刺激剂和/或佐剂。本领域将会理解，免疫刺激剂和佐剂指或者包括一种或多种增强制剂的免疫原性和/或效力的物质。合适的免疫刺激剂和佐剂的非限制性实例包括：角鲨烷和角鲨烯(或植物或动物来源的其它油)；嵌段共聚物；洗涤剂例如吐温

矿物油例如Drakeol或Marcol、植物油例如花生油；棒状杆菌来源的佐剂例如短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)；丙酸杆菌来源的佐剂例如痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne)；牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG)；百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)抗原；破伤风类毒素；白喉类毒素；表面活性物质例如十六胺、十八胺、十八基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基双二十八烷基溴化铵、N,N-双十八烷基-N’,N’二(2-羟乙基-丙二酰胺)、甲氧基十六烷甘油和普朗尼克多元醇；聚胺例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC卡波普；肽例如胞壁酰二肽和衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬素；油乳剂；以及矿物凝胶例如磷酸铝、氢氧化铝或明矾；白介素例如白介素2和白介素12；单核因子例如白介素1；肿瘤坏死因子；干扰素例如γ干扰素；免疫刺激性DNA例如CpG DNA、组合物例如皂苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝；脂质体；

和

佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成的糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物；阿夫立定；脂质A衍生物；硫酸葡聚糖；单独的DEAE葡聚糖或与磷酸铝一起的DEAE葡聚糖；羧聚乙烯例如Carbopol’EMA；丙烯酸共聚物乳剂例如Neocryl A640(例如美国专利号5,047,238)；油包水乳化剂例如Montanide ISA 720；脊髓灰质炎病毒、牛痘或动物痘病毒蛋白质；或者它们的混合物。

免疫剂可以包含：载体蛋白质例如甲状腺球蛋白；白蛋白例如人血清白蛋白；毒素、类毒素或来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌(Pseudomonas)、大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌(Staphylococcus)以及链球菌(Streptococcus)的毒素的任何突变体交叉反应性物质(CRM)；聚氨基酸例如聚(赖氨酸：谷氨酸)；流感；轮状病毒VP6、细小病毒VP1和VP2；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重组疫苗等。可选地，可以使用载体蛋白质的片段或表位或者其它免疫原性蛋白。例如，可以使用细菌毒素、类毒素或CRM的T细胞表位。在该方面，可以参考美国专利号5,785,973，将其以引用的方式并入本文。

预期任何合适的方案以用于产生疫苗制剂。示例性方案包括，例如NewGeneration Vaccines(1997,Levine et al.,Marcel Dekker,Inc.New York,Basel,HongKong)中所述的那些，将其以引用的方式并入本文。

可以采用任何安全的给药途径，包括：鼻内给药、口服给药、直肠给药、肠胃外给药、舌下给药、颊部给药、静脉内给药、关节内给药、肌肉内给药、真皮内给药、皮下给药、吸入给药、眼内给药、腹膜内给药、脑室内给药、局部给药、粘膜给药以及经皮给药，尽管不限于此。

剂型包括片剂、分散液、悬液、注射剂、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊、鼻腔喷雾、栓剂、气雾剂、皮肤贴片等。这些剂型还可以包括为该目的专门设计的注射或植入控制释放装置或者改进的其它形式的植入物，从而以该种形式额外发挥作用。控释可能由包被疏水聚合物实现，所述疏水聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。

组合物可以呈分离的单元，例如胶囊、囊剂、功能性食品/饲料或片剂，其各包含预先确定量的本发明的一种或多种治疗剂，呈粉末或颗粒囊或者呈水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水液体乳液中的溶液或悬液。可以通过任何药学方法来制备此类制剂，但是所有方法都包括下述步骤：将如上文所述的一种或多种试剂与构成一种或多种必需成分的载体联合。一般而言，通过下述来制备所述制剂：将本发明的试剂与液体载体或细碎的固体载体或这两者均匀且密切地混合，然后，如果需要，将产物塑成期望的形式。

上述制剂可以以与所述剂型相容的方式以有效的量使用。在本发明的背景下，施用于患者的剂量应足以在一段适当的时间后在患者中产生有益的应答。待施用的药剂的量可取决于待治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和总体健康状况，取决于医生判断的因素。

在一个具体实施方案中，所述组合物适于经鼻内施用于受试者。

如本文通常所用，术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文公开的治疗或制剂的任何哺乳动物接受者的背景下使用。因此，本文公开的方法和制剂可用于医疗和/或兽医应用。在优选的形式中，所述哺乳动物为人。

为使本发明可被充分理解并产生实际效果，参照以下非限制性实施例。

实施例

实施例1

前言

A群链球菌(GAS)主要感染人的上呼吸道(URT)粘膜以及皮肤，导致众多疾病。感染可导致中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎和肌肉炎。坏死性筋膜炎发病率为10万分之一，而死亡率高达70％(1)。后链球菌病—风湿热(RF)和风湿性心脏病(RHD)—同样备受关注。估计约有1560万RHD现患病例，并且每年几乎40万例死亡(2)。细菌定殖于URT后最常见的疾病是咽炎，并且RF和RHD与未治疗的原发性咽部感染密切相关(3)。GAS感染及其相关疾病在热带地区、发展中国家和发达国家的本地人群中普遍存在，每年导致50万例死亡(4)，突显了疫苗的亟需。

GAS疫苗候选物可分为基于M蛋白和非M蛋白的疫苗(5)。细胞表面的M蛋白(由3个主要结构域组成的卷曲螺旋蛋白)是主要的毒性决定因素(6)。该蛋白质由高变的氨基末端和用于流行病学分子分型(emm或M分型)的A-重复结构域；B-重复结构域和保守的C-重复结构域(6)组成。处于临床研究的主要亚单位疫苗是基于氨基末端M蛋白的多价疫苗和保守的C-重复M蛋白肽疫苗(5)。基于其诱导全身免疫力的成功，这些GAS疫苗候选物已进入临床试验(7)。已证明全身免疫力有效阻止GAS向深层组织散播，并在全身位点通过血清免疫球蛋白(Ig)防止疾病，但没有阻止在粘膜位置的定殖以及由此人与人之间的传播(8)。因此，全身疫苗并非诱导针对GAS的免疫力的最佳方法。相反，经鼻施用的针对各种生物体的粘膜疫苗在全身和粘膜隔室有效地诱导了抗原特异性免疫应答(9-11)。由于这样的双层保护性免疫力，粘膜疫苗是应对全身和粘膜GAS感染的理想策略，其增加的益处为，对粘膜定殖的阻止也会抑制通过来自UTR的液滴和气溶胶的传播(7)。粘膜疫苗在经济上也是有益的，这是开发疫苗的重要考量。由于易于经鼻施用疫苗，可免于使用针具(7)。无痛递送有助于更大的患者的依从性。

基于来自M蛋白的保守C3-重复结构域的最小B细胞表位，我们此前确定了一种疫苗候选物肽J8(12)。该J8肽(QAEDKVKQ

KQLEDKVQ；SEQ ID NO:1)为嵌合肽，其含有来自C-区(显示为黑体字)的12个氨基酸，其侧翼为GCN4DNA-结合蛋白序列，以维持正确的螺旋构象结构(13)。当连接至载体蛋白质白喉类毒素(DT)并与明矾一起施用时，J8诱导了IgG抗体，其保护小鼠防止多种GAS菌株的全身和皮肤攻击(4,13)。而且，当与限于动物的粘膜助剂CTB(14,15)一起施用，或当作为蛋白酶体施用时(16)，基于GAS的M蛋白保守区的疫苗候选物有效地保护防止GAS鼻内感染。当诱导了粘膜免疫力和降低的URT定殖时，确定了与IgA产生的相关性。清楚这点以后，我们的目标是开发基于J8的人相容性粘膜疫苗。

然而，开发用于人的粘膜疫苗的限制之一是，缺少安全有效的粘膜助剂(17,18)。

脂质体是由生物相容性磷脂双层组成的球状囊泡，其可装载和递送亲水和疏水分子(19)。脂质体已通过鼻内途径安全地递送至人体(20,21)。然而，呈递肽抗原的脂质体并非诱导肽特异性抗体应答的理想平台。肽仅包含有限的能够激活对于B细胞抗体反应所需的辅助T细胞的抗原表位。它们需要缀合至“载体”蛋白质以使其在远交群中产生免疫性，因此其由脂质体来呈递并非非常合适。不过，由颗粒例如脂质体赋予的免疫原性增强并不奇怪，因为天然病原体也是颗粒，且被免疫系统很好地识别(22)。脂质体与抗原呈递细胞相互作用的天然倾向已作为用脂质体来呈递抗原至免疫系统的主要原理(23)。该研究的目的是开发基于J8的脂质体制剂(在缺少助剂时)，其中亲脂性J8构建体被并入脂质双层，并且亲水性载体蛋白质(DT)被包封于内部的含水核心中。

材料和方法

小鼠。采用的所有动物方案均经格里菲斯大学针对基于动物工作的研究伦理审查委员会(Griffith University Research Ethics Review Board for Animal-BasedWork,GU Ref No:GLY/09/14/AEC)批准。严格根据澳大利亚全国健康和医学研究委员会(NHMRC)的关于实验动物的指南实施该研究。所选的方法最大限度减少小鼠的痛苦和折磨，由受过训练的动物护理人员每天观察动物。采用CO₂吸入室处死小鼠。

人的血液。书面征得同意，在格里菲斯大学健康中心由抽血技术人员从捐献者获得血液。该研究由格里菲斯大学人类研究伦理委员会(GUHREC,Protocol#GLY/03/14/HREC)批准。实验人员处理样品前，将样品去识别化。

J8-脂质-DT制剂。为促进J8与脂质双层的非共价配位，将由两个棕榈酸(C16)组成的疏水锚添加至存在于J8氨基末端的三肽间隔子(由Lys Ser Ser组成)的赖氨酸的ε和伯氨基(C16-C16-KSSJ8)。该构建体由上海强耀生物科技有限公司(Chinapeptides Co.,Ltd.,Shanghai,China)生产。该构建体的预计分子量(MW 4061.97g/mol)通过ESI-MS验证，获得的产品纯度大于95％(通过曲线分析下的分析性RP-HPLC面积)。采用薄膜水合作用法(42)制备脂质体。采用来自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster,United States)的脂质，其摩尔比为7二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC):2胆固醇Cholesterol(CHOL):1L-α-磷脂酰甘油(PG)。采用旋转蒸发器将氯仿(CHCl₃)溶液中的脂质体与预定量的C16-C16-KSSJ8涂布至圆底烧瓶。所用的体积为：0.7ml的DPPC(10mg/ml)于CHCl₃中，0.2ml的CHOL(5mg/ml)于CHCl₃中，以及0.1ml的PG(10mg/ml)于CHCl₃中。然后将脂质薄膜水化，并在室温通过剧烈搅拌分散于含有预定量DT的1mL磷酸盐缓冲液。将得到的脂质体悬浮液以16,162g离心10min，移除上清液，将脂质体小球重悬于合适量的待施用于小鼠的PBS中。为确定DT的封装效率，收集上清液，并采用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计测定上清液中未包封的DT的量(Thermo Scientific,Massachusetts,United States)。从用于再水化脂质以产生脂质体的PBS起始DT浓度减去上清液的DT浓度，允许定量包封效率。于25℃用具有一次性毛细管比色皿的纳米粒度仪(Zetasizer Nano Series ZS,Malvern Instruments,United Kingdom)测量脂质体的平均粒径(nm)。用非侵入性反向散射系统分析尺寸，并以173°散射角进行测量。相关的时间基于每次运行10秒，每个测量至少连续运行5次。结果是采用散射技术软件分析的一式三份独立测量的平均。针对J8-Lipo-DT显示通过低多分散指数(PDI)0.238确定的均质大小分布。PDI是样品大小分布多窄的指示，其值大于0.7指示样品具有宽的大小分布。

小鼠的鼻内免疫。用甲苯噻嗪和氯胺酮(甲苯噻嗪:氯胺酮:H₂O＝1:1:10的混合物)的混合物，麻醉待免疫的B10.BR和BALB/c小鼠(Animal Resources Centre,WesternAustralia,Australia)。对小鼠施用总体积20μL PBS(10μL/鼻孔)中的30μg单独J8-Lipo-DT，而对照小鼠施用20μL的PBS(10μL/鼻孔)。阳性对照小鼠接受30μg的缀合至DT的J8，同时施用总体积20μL PBS中的10μg CTB(Sigma Aldrich,St.Louis,United States)。以和初次免疫相同的方式，小鼠间隔21天接受两次加强免疫。其他对照组如上所述接受等量的单独的J8、DT或脂质体。

血清、唾液和排泄物样品收集。初次免疫后，在第20、40和60天收集血清，以测定J8-特异性全身抗体的水平。通过尾动脉收集小鼠的血液，于37℃允许凝集至少30min。以1000g离心10min后收集血清，于56℃加热灭活10min并在–20℃存储。

对小鼠施用50μL的0.1％毛果芸香碱溶液以诱导分泌唾液。将唾液收集至含有2μL的50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich)的微量离心管中。以13,000g离心10min分离微粒物质，将样品在-80℃储存。

从单只小鼠收集6-10份新鲜的排泄物粪球，冷冻并冻干。测定粪固体的干重，然后通过涡旋将其重悬于5％脱脂奶粉，50mmol/L EDTA(Sigma Aldrich)，0.1mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma Aldrich)和2mmol/L PMSF(20μL/mg干重)中。以15,000g离心10min分离固体物质，将上清液在-80℃储存。

通过酶联免疫吸附分析(ELISA)鉴定抗体滴度。如其他处所描述的(43)，使用ELISA来测量J8-特异性血清IgG和粘膜IgA。用碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)将J8肽稀释至0.5mg/ml，并且以100μl/孔的体积将其包被在聚碳酸酯板上，于4℃孵育过夜。去除未结合肽，并且用150μl的5％脱脂乳PBS-吐温20于37℃将所述孔封闭2小时。然后用PBS-吐温20缓冲液将所述板洗涤3次。在0.5％脱脂乳PBS-吐温20缓冲液中，在板中对样品进行系列稀释，其开始于1:100的最初稀释至1:12,800的最终稀释(对于血清)，以及1:2至1:256(对于唾液/粪便样品)。将各个样品稀释成100μl的终体积，并于37℃孵育1.5小时。将所述板洗涤5次，并且将过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG或IgA(Invivogen，San Diego，United States)以1:3000或1:1000的稀释度分别地加在0.5％脱脂乳PBS-吐温中，于37℃孵育1.5小时。洗涤后，根据制造商的说明书添加100μl OPD底物(Sigma Aldrich)，并且在室温下暗孵育30分钟。在Victor³ 1420多标记计数仪(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences，Shelton，United States)中，于450nm下测量吸光度。滴度被描述为得到在阴性对照孔(含有用PBS免疫的正常小鼠血清)的平均吸光度之上的>3标准偏差(SD)的吸光度的最低稀释度。利用单因素方差分析(ANOVA)与Tukey事后检验，利用GraphPad Prism 5软件(GraphPad，California，United States)测定统计学显著性(p<0.05)。

GAS攻击的过程。初次免疫后第63天，用预定剂量的GAS菌株M1经鼻内攻击免疫小鼠和对照小鼠。GAS菌株M1已在小鼠脾脏中被连续地传代以提高毒力，并得到链霉素抗性使得咽拭子中的GAS与正常的鼠细菌菌群不同(44)。为了测定GAS的定殖，攻击后1-3天，从小鼠获得咽拭子。将所述咽拭子划线培养于含有2％去纤维蛋白马血的Todd-Hewitt琼脂板上，并于37℃过夜孵育。通过将各个小鼠的鼻孔压在哥伦比亚血琼脂(CBA)板的表面十次(一式三份的CBA板/小鼠/天)测定鼻脱落物中的细菌负荷，并且将呼出的粒子划线培养。第3天，对小鼠进行拣选，在PBS中使器官样品均质化，并且使用浇注平板法，将样品一式三份接种。对于鼻脱落物和咽拭子，结果被表示为平均克隆形成单位(CFU)+均数的标准误差(SEM)，用于第1、2和3天的10只小鼠/组。对于器官样品，结果被表示为平均CFU+SEM，用于第3天的10只小鼠/组。用GraphPad Prism 5，利用非参数、非成对的Mann-Whitney U检验分析差异性来比较测试组与PBS对照组(p<0.05被认为是显著的)。

DC的制备和成熟。从健康志愿者收集外周血，并基于Ficoll-Paque(AmershamPharmacia，Uppsala，Sweden)，通过标准过程将其分级。基于Ficoll Paque，通过离心收获PBMC，洗涤并以每0.35mL MACS缓冲液(Miltenyi Biotec S.L.，Germany)1x 10⁸个细胞的最终密度重悬。利用Pan DC分离试剂盒(Miltenyi Biotec)，根据制造商的说明书分离DC。将得到的DC群体重悬于补充有10％FCS(Gibco)的RPMI 1640(Gibco，Gaithersburg，UnitedStates)完全培养基(具有2mM l-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1％Pen-strep，10mMHEPES)。接种总体积0.2mL的DC(2X 10⁶)，并按所示添加下述刺激物：10μg/mL的pIC(Invivogen，San Diego，United States)，J8-Lipo-DT(150μg/mL)或仅完全培养基，孵育24小时。24小时后收集上清液，并储存于–20℃。

通过流式细胞术进行免疫表型分析。为了分析各种标志物的表面表达，用一种或多种下述荧光团标记的mAb对被处理的DC进行染色，并利用LSR Fortessa细胞计数器(Becton Dickinson，California，United States)和FlowJo软件(Treestar，Inc.，California，United States)，通过流式细胞术进行分析。利用下述抗体(BectonDickinson)，通过流式细胞术分析来评估得到的群体：抗HLA-DR-V450、-CD1c-APC、-CD80-PE-Cy7、-CD83-PE-TexasRed、-CD86-PE、-CD123-Percp-5.5、-CD141-APC-Cy7。用合适的抗体于4℃暗染色30分钟之后，将细胞用PBS洗涤两次，并用1％多聚甲醛固定。基于大的粒状细胞进行设门，并且从各个样品收集2000–5000次设门事件。简言之，将HLA-DR阳性细胞设门来限定人DC，并且根据之前确立的方法(45)将其进一步细分为CD141+常规DC 1型、CD1c+DC常规(髓样)DC 2型和CD123+类浆细胞DC。基于设门群体，测定平均荧光强度(MFI)值。所述数据被报告为平均值+SEM，并且利用学生t检验，用GraphPad Prism 5软件(GraphPad，California，United States)分析差异性。小于0.05的P值被认为是显著的。

用抗原体外刺激脾细胞。使用流式微球阵列(CBA)分析和流式细胞术分析来定量由脾细胞被J8肽刺激后产生的促炎性应答。简言之，在RPMI 1640培养基中制备来自J8-Lipo-DT免疫小鼠的脾脏的不含红细胞的单细胞悬浮液。接种总体积0.1mL的脾细胞(4x10⁵)，并且按指示添加下述刺激物：2μg/mL LPS(Sigma Aldrich)、J8(10μg/mL)或仅RPMI1640培养基，孵育72小时。72小时之后分离上清液，并储存于-80℃，用于CBA流式细胞分析。

通过CBA定量分泌的趋化因子和细胞因子。根据制造商的说明书定量累积的炎症性细胞因子的水平。对于小鼠炎症试剂盒CBA，样品和标准物的体积被缩减至10μl，并且使用2μl的每种捕获珠。根据制造商的推荐，来自人DC孔的上清液使用人炎症试剂盒CBA(Becton Dickinson)。在LSR Fortessa细胞计数仪上运行样品，并用FCAP阵列(v1.01forWindows)软件(Becton Dickinson)分析数据。所述数据被报告为平均值+均值的标准误差(SEM)，并且利用学生t检验，用GraphPad Prism 5软件分析差异。小于0.05的P值被认为是显著的。

结果

如材料和方法中所描述的构建具有表面相关的J8肽且含有白喉类毒素的脂质体(图1)。被施用制剂每剂包含使用基于棕榈酸的部分而连接至脂质体表面的30μg J8。脂质体在内部含有每剂30μg DT。通过动态光散射所测量的脂质体的平均直径是1.8μm(标准偏差＝100.3nm)(参见材料和方法)。

使用初次和2次加强方案，用J8-Lipo-DT和多种对照经鼻免疫BALB/c小鼠(每组10只)：单独的脂质体(Lipo)；包封DT的脂质体(Lipo-DT)；J8嵌在脂质体表面但是无包封的DT(J8-Lipo)；J8-DT+CTB；PBS+CTB；和PBS。

为了与其它构建体相比较来评价J8-Lipo-DT的功效，然后将经鼻免疫接种的小鼠用获自猩红热患者的咽分离物M1GAS株鼻内攻击(16)。在攻击之前，我们观察到，相比J8-Lipo，J8-Lipo-DT诱导出较高的J8-特异性IgA(粪便和唾液)和血清IgG滴度。尽管对于任何一组，J8-Lipo-DT和J8-Lipo之间的差异在统计学上都不显著，但是观察到J8-Lipo-DT对于唾液IgA应答、粪便IgA应答和血清IgG应答是较优的(图2A-C)。用GAS激发之后，与PBS组相比，在J8-Lipo-DT免疫的小鼠中，鼻涕中的细菌负担显著较低，并且与用J8-DT+CTB免疫的小鼠相当(第3天，图3A)。

然而，出人意料的是，J8-DT+CTB免疫的小鼠并没有保护防止喉咙或NALT的定植，而J8-Lipo-DT免疫的小鼠则显示出显著的保护防止在两个隔室内的定植(图3B和C)。J8-Lipo-DT的保护显著优于J8-Lipo所诱导的保护。鼠NALT是持续GAS感染的侵入门户(24)，并且是人扁桃体的功能同源物(25)。因此，这些结果强调了J8-Lipo-DT在降低粘膜GAS感染的优选位点中生物负担的功效。

然后，我们疑问J8-Lipo-DT是否能类似地保护不同品系的小鼠。J8-DT/CTB和PBS充当对照免疫原。用J8-Lipo-DT免疫B10.BR小鼠(n＝5)诱导了显著的J8-特异性抗体滴度(图4)。唾液和粪便样品中的粘膜抗体滴度与J8-DT+CTB免疫小鼠中的滴度相当(图4A-B)。为了测试J8-Lipo-DT是否将在B10.BR小鼠中保护防止GAS感染，将另一小鼠群体(n＝5)免疫并用GAS M1株攻击。在3天的观察期内监测鼻脱落物和咽拭子。到第2天，J8-Lipo-DT和J8-DT+CTB免疫的小鼠在鼻脱落物中具有不可检测的生物负担(图5A)。与BALB/c小鼠类似，数据还证实，到激发后第2天时，J8-Lipo-DT免疫的小鼠的咽拭子没有细菌，而J8-DT+CTB免疫的小鼠在第3天时在咽拭子中仍有可检测水平的GAS(图5B)。

之前的研究证实了，尽管脂质体内包封的肽不诱导免疫球蛋白应答，但是脂质体加脂质A(脂多糖的成分)在腹膜内免疫之后能诱导抗体应答(26)，因而提示脂质A的脂尾可以作为佐剂起作用。为了解答将J8锚定于脂质体表面的双C16脂尾是否负责抗体应答的诱导，另一小鼠群体用C16-C16-KSSJ8、J8-Lipo-DT、J8-DT+CTB或PBS免疫。我们观察到，J8-Lipo-DT和J8-DT+CTB是免疫原性的，而C16-C16-KSSJ8不是(图6A-B)。

测量来自经鼻免疫小鼠的脾细胞的细胞因子应答，以确定经鼻免疫是否诱导了可以解释J8-Lipo-DT的自我佐剂性和抗体同种型向IgA的转换的全身细胞免疫应答。分析了促炎性细胞因子(γ干扰素[IFN-γ]、白细胞介素1[IL-1]、IL-6、IL-12p70、单核细胞趋化蛋白1[MCP-1]、和肿瘤坏死因子α[TNF-α])。将J8-Lipo-DT免疫的B10.BR小鼠处死，并用J8、LPS或介质刺激脾细胞。我们观察到显著的应答于J8和LPS的IFN-γ、MCP-1和IL-6产生(图7)。没有被检测到所评估的其它细胞因子。该结果证实，用J8-Lipo-DT免疫接种诱导了促炎性应答，提供了J8-Lipo-DT自我佐剂性的潜在机制。具体而言，已知IL-6负责抗体应答向IgA的转换(27)。此外，已知化学引诱剂MCP-1在GAS防御机制中起主要作用(28)。

为了评价J8-Lipo-DT在人体内诱导具有自我佐剂活性的有效免疫应答的潜能，从三名健康志愿者的血液分离树突细胞子集，并用J8-Lipo-DT刺激。成熟DC是有效的抗原呈递细胞，表达高水平的参与促进抗原识别和细胞-细胞相互作用的抗原呈递以及共刺激的细胞表面分子。为了表征人DC成熟，通过流式细胞术检查多种细胞表面分子应答于J8-Lipo-DT的调整(图8A-C)。合成的双链RNA佐剂，多聚次黄嘌呤胞嘧啶核苷酸(pIC)用作对照(29)。与J8-Lipo-DT一起培养的CD123+类浆细胞DC(pDC)上的共刺激分子CD80、CD83和CD86的水平显著较高(图8A)。在两个经典DC子集(cDC)，CD141+经典1型DC和CD1c+经典2型DC中，CD80的表达也增加(图8B-C)。此外，CD141+DC的CD86表达也是增加的(图8B)。

为了进一步明确与人DC的相互作用，使用流式微珠阵列评估刺激后促炎性细胞因子的水平。我们观察到了促炎性细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β(IL-1β))以及嗜中性粒细胞化学引诱剂IL-8的增加的表达(图9)。已知嗜中性粒细胞对GAS感染的IgA控制至关重要(30)。还观察到升高水平的抗炎性细胞因子IL-10(图9)。这可能是由于IL-10在DC成熟步骤和平衡宿主促炎性应答中的调节作用(31,32)。然而，具体而言，IL-6应答提示，J8-lipo-DT将导致人体中的IgA转换，以及嗜中性粒细胞应答(经由IL-8)，将很好地使宿控制GAS感染。如图10所示，当被单独展示以及作为S2-J8嵌合物(SEQ ID NO:3)展示时，由脂质体展示的SpyCEP肽(S2；SEQ ID NO:2)和囊内DT一起引发了粘膜IgA应答。

参见图11，J8+S2-Lipo-DT诱导了抗原特异性IgA，IgG应答。观察到对J8-Lipo-DT和S2-Lipo-DT的相当的免疫应答。不同的配制策略采用(i)在脂质体中的两种表位(J8+S2-Lipo-DT)或(ii)J8/S2S2-Lipo-DT脂质体的混合物。

A群链球菌感染能引起多种皮肤和软组织感染，其中的一些是重度的，甚至是威胁生命的。因此，感兴趣的是查看J8-Lipo-DT是否能保护防止88/30株攻击后的皮肤感染。采用单独包含DT和J8的脂质体的经鼻施用的初始实验显示J8-Lipo-DT经鼻免疫后显著的IgG滴度，但是在皮肤攻击测定中没有保护(数据未显示)。正在进行通过不同脂质体制剂或通过用皮下给予J8-DT+Alum免疫的全身IgG应答的增强。

讨论

我们已经开发出了A群链球菌(GAS)的粘膜活性亚单元脂质体疫苗候选物。将脂质体的免疫刺激特性与蛋白质载体DT的封装和脂质体表面上的GAS特异性B细胞表位的展示相结合。肽和载体蛋白质都是最佳免疫力所需要的。复合脂质体所诱导的粘膜免疫力优于与CTB一起施用的肽-蛋白质缀合物所诱导的粘膜免疫力。

粘膜免疫作为激发针对感染性疾病的保护性免疫的手段，引起了许多关注。绝大部分感染发生在或起始于粘膜表面。因此，能诱导粘膜保护性免疫应答的疫苗的应用是理想的并且具有实用性的。在实践中，经常证实难以刺激出强的粘膜IgA免疫应答，并且利用亚单元肽抗原进行粘膜疫苗接种努力的过程并不理想。这部分是由于难以刺激出与常规的基于全生物体的方法相当的强的免疫应答。添加佐剂以及将亚单元抗原与蛋白质载体缀合作为T细胞辅助的来源已被证实对于系统性免疫是有效的。但是，诱导粘膜免疫力需要新的策略。

脂质体相关联的抗原的“地形”位置影响抗原加工和向B细胞和辅助T细胞的呈递(33)。已表明，脂质体表面上暴露的抗原被优先加工，并由B细胞呈递，而脂质体封装的抗原被抗原呈递细胞更有效地加工和呈递给T细胞(34)。由此，疫苗候选物J8-Lipo-DT代表了合理的亚单元脂质体疫苗设计，这确保B细胞表位与脂质体双层相关联，以被进行暴露而结合B细胞的Ig受体，同时DT的封装允许有效的递送、加工和呈递给T细胞。

我们证实了包括NALT的URT组织中GAS被清除。疫苗候选物提供的有效的鼻咽免疫力显示出降低RF和RHD的理想潜力，RF和RHD与原发咽部感染相关联(7)。在人类URT中，扁桃腺是GAS的初级贮留部位，维持全球范围内的地方性疾病(25)。人类扁桃腺的功能类似物NALT中GAS定殖的减少提示利用J8-Lipo-DT的鼻内免疫会减少人类扁桃腺的定殖和感染，从而减少GAS的传播(25)。

虽然脂质体先前被报道用于递送封装的肽来诱导细胞免疫应答，这样的脂质体不诱导IgA或IgG应答，除非存在强的佐剂，例如LipidA(26，35)。可能的情况是，J8上的脂质尾部提供了佐剂活性，因此对J8-Lipo-DT的免疫原性作出贡献；然而，在自身具有脂质尾部的J8肽不具有免疫原性，这表明需要脂质体制剂。脂质体的自身佐剂的免疫刺激活性先前已有报道，并被证实是由于与抗原呈递细胞的相互作用和促炎症应答的诱导(36)。我们的研究中的体外检测揭示了免疫小鼠中抗原特异性炎症趋化因子和细胞因子的诱导。特别值得注意的是抗原特异性MCP-1和IL-6的分泌。MCP-1是淋巴细胞、单核细胞和抗原呈递细胞的化学趋附剂(37)。之前被提示参与介导粘膜炎症，其由于能显著地增加粘膜IgA分泌而已被报道为强的粘膜佐剂(37)。

虽然抗原可以由很多细胞类型呈递给免疫系统，但是天然T细胞的启动需要成熟、抗原呈递、以及仅发现于专职抗原呈递细胞(例如DC)的共刺激分子的接合(38)。DC是桥接对感染的先天性和适应性免疫应答的关键要素(39)。成熟DC产生炎症细胞因子，上调共刺激和抗原呈递分子，并迁移至淋巴结，在淋巴结中，它们的功能是作为天然T淋巴细胞的强的抗原呈递细胞，以启动适应性免疫应答。我们证实，体外暴露后，J8-Lipo-DT介导人类DC上细胞表面活化和成熟标志物的表达，诱导包括IL-6和IL-8的促炎症细胞因子。人和鼠IL-6在B细胞终末分化中发挥关键作用，并且在粘膜部位，其刺激粘膜部位中IgA的增殖和分泌(27)。针对GAS的IgA特异性免疫需要嗜中性粒细胞的存在(30)。IL-8在嗜中性粒细胞的动员和活化中发挥关键作用。对此，单独施用由脂质体颗粒递送体系展示的SpyCEP S2肽(SEQID NO:2)或联合施用J8肽引起肽特异性IgA。

因此，在人类中赋予对GAS感染的免疫力的根本机制可以使用脂质体平台来介导，为基础研究与临床应用的关联性提供了支撑。

我们证实，当用J8-Lipo-DT进行刺激时，人类pDC增加成熟和共刺激标志物两者。人类pDC容易地吞噬和加工封装于颗粒递送体系中的抗原(40)，表明颗粒递送体系可用于促进抗原向pDC的有效递送。据我们认为，我们的结果首次表明用基于脂质体的颗粒递送体系刺激人类pDC的能力。最初在血液中鉴定出的人类pDC后续在脾脏、淋巴结和包括扁桃腺的粘膜部位中已被检测到(41)。因此，基于脂质体的疫苗递送有潜力被开发用于靶向该DC亚组用于人类中期望的粘膜免疫应答。

实施例2

进行以下实验来研究脂质体尺寸对免疫原性的影响。

脂质体挤压是用热模块完成的，利用1mL注射器迷你挤压机(Avanti PolarLipids)。使再水化的溶液11次通过50nm、400nm、1000mm滤器(Avanti Polar Lipids)，同时将热模块设定为～40℃。脂质体尺寸测量通过Nanosizer进行(动态光散射或DLS)。

如图12所示，J8-Lipo-DT可以被挤压而形成纳米或微米尺寸的颗粒。颗粒尺寸的大部分具有狭窄的分子量分布(低多分散性指数<0.3)。图13的数据显示，J8-Lipo-DT尺寸不影响全身性IgG应答。但是，如图14所示，较大尺寸的脂质体诱导J8特异性粘膜应答。

实施例3

进行以下实验来研究脂质体的冷冻干燥对免疫原性的影响。用含10％海藻糖的milliQ水使脂质体薄膜再水化，然后冻干。冻干后1、4和7周，将J8-Lipo-DT粉末用PBS复原。

图15显示了通过Nanosizer(动态光散射或DLS)进行的脂质体尺寸测量的尺寸结果。颗粒尺寸的大部分具有狭窄的分子量分布(低多分散性指数<0.3)。图16显示，复原的冻干的J8-Lipo-DT脂质体诱导J8特异性全身应答，而不需要额外的佐剂。这是与新鲜制备的J8-Lipo-DT相当的免疫应答。海藻糖对于冷冻干燥的J8-Lipo-DT的免疫原性是重要的。图17显示，复原的冻干的J8-Lipo-DT脂质体诱导J8特异性粘膜应答。

实施例4

进一步的实验确定包含先天免疫的糖脂类激活剂，比如海藻糖6,6′-二山嵛酸酯(TDB)和3D-

的免疫原性脂质体的功效，比如图18中示意性显示。TDB基于脂质体中总磷脂的百分比与脂质体配制。使用9mg的磷脂，TDB使用的比例是该量的20％(1.8mg)。通过免疫后抗体滴度(IgA和IgG抗体)和利用GAS菌株的皮肤攻击实验测量功效。数据显示在图19中。用30ug的J8-Lipo-Dt+TDB鼻内免疫小鼠(n＝5/组)。初次(第0天)施用至小鼠加上两次强化(第21天和第42天)。在唾液和粪便样品中，与J8-Lipo-DT相比，加入TDB都导致显著更高的粘膜IgA应答。结果来自冷冻粉末形式的J8-Lipo-DT+TDB，其提高了脂质体的稳定性。

进一步的实验会确定包含胆汁盐(例如脱氧胆酸钠)的免疫原性脂质体的功效。包含胆汁盐脱氧胆酸钠的脂质体的实例示意性地示于图20。将注意到，免疫原性剂(在该情况下，J8肽)可融合或缀合至载体蛋白质(例如DT)或可展示在脂质体的表面上。当磷脂水合时，胆汁盐将配制于脂质体中以产生脂质体(含胆汁盐的脂质体被称为“胆汁体(bilosomes)”)。胆汁体的制备如下。

在圆底烧瓶中，将摩尔比为7:3:1的山梨醇酐三硬脂酸酯(150mmol)、胆固醇和双十六烷基磷酸酯(DCP)以及150g的用棕榈酸部分修饰的J8溶解于10mL氯仿中。通过旋转蒸发仪去除溶剂，以在圆底烧瓶的玻璃表面上形成薄膜。然后，用含100mg脱氧胆酸钠(胆汁盐)以及150g白喉类毒素的3.5mL PBS(pH 7.4)使膜水合。

实施例5

通过抗原特异性唾液IgA滴定测量了脂质囊泡针对甲型流感病毒、乙型流感病毒和A群链球菌的免疫原性。图21显示了免疫原性剂的示意性描绘，所述免疫原性剂包括单一脂质囊泡，所述脂质囊泡具有来自各甲型流感病毒、乙型流感病毒和A群链球菌的各自免疫原。图22中显示的结果显示包括来自各甲型流感病毒、乙型流感病毒和A群链球菌的各自免疫原的脂质囊泡(如图21A中显示)在小鼠中诱导针对各这些病原体的免疫。进一步的工作将研究例如图21B中示意性显示的包括糖脂类佐剂的免疫原性剂的免疫原性。

总之，本研究首次报道了基于脂质体的粘膜活性GAS疫苗候选物。我们的发现对于克服目前在开发用于预防粘膜部位的感染和社区传播的GAS疫苗中的难题是重要的一步。本研究为脂质体颗粒递送体系如何能整体诱导理想的粘膜免疫应答从而对抗GAS感染提供了重要的机制性启示。本文报道的策略与开发针对其他病原体生物体的亚单位粘膜疫苗相关。非限制性例子包括流感病毒、鼻病毒和钩虫，如前文所描述的。在一些实施方案中，单一脂质囊泡可包括针对多种不同病原体的免疫原。

在本说明书中，目的是为了描述本发明的优选实施方案，而并不是将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。在不脱离本发明的宽泛实质和范围的情况下，可以对本文描述和展示的实施方案进行各种改变和修改。

将本文引用的所有的计算机程序、算法、专利和科学文献通过引用的方式整体并入本文。

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Claims

1.适合于向哺乳动物鼻内施用的免疫原性剂，所述免疫原性剂包含一种或多种免疫原性蛋白或其片段，脂质囊泡以及载体蛋白质，其中所述载体蛋白质位于所述脂质囊泡内空间，并且所述免疫原性蛋白或其片段展示在所述脂质囊泡的表面上，其中所述免疫原性剂能够在哺乳动物中引起粘膜免疫应答，并且其中所述载体蛋白质是白喉类毒素，其中所述一种或多种免疫原性蛋白选自A群链球菌细菌M蛋白或其片段，甲型流感病毒的免疫原性蛋白或其片段，以及乙型流感病毒的免疫原性蛋白或其片段。

2.如权利要求1所述的免疫原性剂，其中所述脂质囊泡是脂质体。

3.如权利要求1或2所述的免疫原性剂，其包含相同病原体的或来自相同病原体的一种或多种免疫原性蛋白或其片段。

4.如权利要求1或2所述的免疫原性剂，其包含多种不同病原体中的每一种的或来自多种不同病原体中的每一种的一种或多种免疫原性蛋白或其片段。

5.如权利要求1或2所述的免疫原性剂，其中所述A群链球菌细菌M蛋白的片段位于J8肽之内，或者包含J8肽。

6.如权利要求5所述的免疫原性剂，其中所述J8肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

氨基酸序列QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO:1)。

7.如权利要求1-2和6任一项所述的免疫原性剂，其中所述免疫原性蛋白或其片段包含作为单一嵌合肽的SpyCEP片段和M蛋白片段或包含SpyCEP片段和M蛋白片段的混合物，其中所述SpyCEP片段促进中性粒细胞活性恢复或增强。

8.如权利要求7所述的免疫原性剂，其中所述SpyCEP片段包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:2)；或者

其中所述嵌合肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENFQAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO:3)。

9.如权利要求1所述的免疫原性剂，其中所述免疫原性蛋白或其片段包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：氨基酸序列MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO:4)或氨基酸序列PAKLLKERGFFGAIAGFLE(SEQ ID NO:5)。

10.如权利要求1-2、6、8和9任一项所述的免疫原性剂，其进一步包含先天免疫的激活剂。

11.如权利要求10所述的免疫原性剂，其中所述先天免疫的激活剂是糖脂或包含糖脂。

12.如权利要求10所述的免疫原性剂，其中所述先天免疫的激活剂为海藻糖-6,6′-二山嵛酸酯(TDB)或脂质A糖脂类佐剂。

13.如权利要求1-2、6、8、9、11和12任一项所述的免疫原性剂，其进一步包含胆汁盐。

14.如权利要求13所述的免疫原性剂，其中所述胆汁盐为脱氧胆酸钠。

15.如权利要求1-2、6、8、9、11、12和14任一项所述的免疫原性剂，其为冷冻干燥的或冻干的。

16.如权利要求1-2、6、8、9、11、12和14任一项所述的免疫原性剂，其以选定的尺寸或选定的尺寸范围来生产。

17.一种组合物，其包含权利要求1-16中任一项所述的免疫原性剂。

18.如权利要求17所述的组合物，其包含单一免疫原性剂，所述免疫原性剂包含相同病原体的或来自相同病原体的一种或多种免疫原性蛋白或其片段。

19.如权利要求17所述的组合物，其包含单一免疫原性剂，所述免疫原性剂包含多种不同病原体中的每一种的或来自多种不同病原体中的每一种的一种或多种免疫原性蛋白或其片段。

20.如权利要求17所述的组合物，其包含多种不同的免疫原性剂，所述不同的免疫原性剂各自包含不同病原体的或来自不同病原体的一种或多种免疫原性蛋白或其片段。

21.如权利要求1-16中任一项所述的免疫原性剂或如权利要求17-20中任一项所述的组合物在制备一种在哺乳动物中引起针对一种或多种病原体的粘膜免疫应答的制剂中的用途，其中所述免疫原性剂或组合物被制备来鼻内施用至所述哺乳动物，并且所述病原体选自A群链球菌细菌、甲型流感病毒和乙型流感病毒。

22.如权利要求1-16中任一项所述的免疫原性剂或如权利要求17-20中任一项所述的组合物在制备一种针对一种或多种病原体免疫哺乳动物的制剂中的用途，其中所述免疫原性剂或组合物被制备来鼻内施用至所述哺乳动物，并且所述免疫原性剂引起粘膜免疫应答，并且所述病原体选自A群链球菌细菌、甲型流感病毒和乙型流感病毒。

23.如权利要求1-16中任一项所述的免疫原性剂或如权利要求17-20中任一项所述的组合物在制备一种治疗或预防哺乳动物中由一种或多种病原体造成的感染的药物中的用途，其中所述免疫原性剂或组合物被制备来鼻内施用至所述哺乳动物，并且所述免疫原性剂引起粘膜免疫应答，并且所述病原体选自A群链球菌细菌、甲型流感病毒和乙型流感病毒。

24.如权利要求21-23中任一项所述的用途，其中所述哺乳动物是人。