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MX2014012575A - Agentes para tratar trastornos que implican la modulacion de receptores de rianodina. - Google Patents

Agentes para tratar trastornos que implican la modulacion de receptores de rianodina.

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MX2014012575A
MX2014012575A MX2014012575A MX2014012575A MX2014012575A MX 2014012575 A MX2014012575 A MX 2014012575A MX 2014012575 A MX2014012575 A MX 2014012575A MX 2014012575 A MX2014012575 A MX 2014012575A MX 2014012575 A MX2014012575 A MX 2014012575A
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disorders
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pharmaceutical composition
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MX2014012575A
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Andrew R Marks
Nicole Villeneuve
Sandro Belvedere
Jiaming Yan
Yael Webb
Marc Bertrand
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Servier Lab
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a derivados de 1,4-benzotiazepina y a su uso para tratar afecciones, trastornos y enfermedades asociadas con los receptores de rianodina (RyR) que regulan el funcionamiento del canal de calcio en las células. La invención también describe composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos y usos de éstas para tratar enfermedades y afecciones asociadas con los RyR, en particular trastornos cardiacos, musculoesqueléticos y del sistema nervioso central (SNC por sus siglas en ingles).

Description

AGENTES PARA TRATAR TRASTORNOS QUE IMPLICAN LA MODULACIÓN DE RECEPTORES DE RIANODINA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a derivados 1,4-benzotiazepina y a su uso para tratar trastornos y enfermedades asociadas con los receptores de rianodina (RyR) que regulan el funcionamiento del canal de calcio en las células. La invención también describe composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos y usos de éstas para tratar enfermedades y afecciones asociadas con los RyR, en particular, trastornos cardiacos, musculoesqueléticos y del sistema nervioso central (SNC).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El retículo sarcoplásmico (SR) es una estructura en las células que funciona, entre otras cosas, como un almacén especializado de calcio (Ca2+) intracelular. Los RyR son canales en el SR, que se abren y cierran para regular la liberación de Ca2+ desde el SR al citoplasma intracelular de la célula. La liberación de Ca2+ en el citoplasma desde el SR incrementa la concentración citoplásmica de Ca2+. La probabilidad de apertura de los RyR se refiere a la probabilidad de que un RyR esté abierto en cualquier momento dado y, por lo tanto, sea capaz de liberar Ca2+ en el citoplasma desde el SR.
Existen tres tipos de RyR, todos los cuales son altamente homólogos: RyRl, RyR2 y RyR3. RyRl se encuentra predominantemente en el músculo esquelético asi como en otros tejidos, RyR2 se encuentra predominantemente en el corazón asi como en otros tejidos y RyR3 se encuentra en el cerebro asi como en otros tejidos. El RyR es un tetrámero. Parte del complejo RyR está formado por cuatro polipéptidos RyR en asociación con cuatro proteínas de unión FK506 (FKBP) (calstabinas), específicamente FKBP12 (calstabinal) y FKBP12.6 (calstabina2). La calstabinal se une a RyRl y RyR3 mientras que la calstabina2 se une a RyR2. Las calstabinas se unen al RyR (una molécula por subunidad de RyR) , estabilizan la función de RyR, facilitan la apertura o cierre acoplado entre RyR vecinos y evitan la activación anormal (escape de Ca2+) del canal estabilizando el estado cerrado del canal.
Receptor de Rianodina 2 y Enfermedades Cardiacas En el músculo estriado cardiaco, RyR2 es el canal de liberación de Ca2+ principal requerido para el acoplamiento excitación-contracción (EC) y la contracción muscular. Durante el acoplamiento EC, la despolarización de la membrana de las células musculares cardiacas durante la fase cero del potencial de acción activa los canales de Ca2+ con apertura y cierre regulados por voltaje. La entrada de flujo de Ca2+ a través de los canales con apertura y cierre regulados por voltaje abiertos inicia a su vez la liberación de Ca2+ desde el SR a través de RyR2. Este proceso se conoce como liberación de Ca2+ inducida por Ca2+. La liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ mediada por RyR2 activa las proteínas contráctiles en la célula cardiaca, lo que resulta en la contracción del músculo cardiaco.
La fosforilación de RyR2 por la proteína quinasa A (PKA) es una parte importante de la respuesta "lucha o huida" ("fight o flight") que incrementa la adquisición de acoplamiento EC cardiaco aumentando la cantidad de Ca2+ liberado para un desencadenante dado. Esta ruta de señalización proporciona un mecanismo por el cual la activación del sistema nervioso simpático (SNS), en respuesta al estrés, resulta en un gasto cardiaco incrementado. La fosforilación de RyR2 por PKA resulta en la disociación parcial de calstabina2 del canal, que a su vez, da lugar a una probabilidad de apertura incrementada, y a una liberación incrementada de Ca2+ desde el SR al citoplasma intracelular.
El fallo cardiaco (HE por sus siglas en ingles) se caracteriza por un estado hiperadrenérgico sostenido en el que los niveles séricos de catecolamina están elevados crónicamente. Una consecuencia de este estado hiperadrenérgico crónico es la hiperfosforilación persistente por PKA de RyR2, de manera que 3-4 de las cuatro Ser2808 en cada canal RyR2 homotetramérico están fosforiladas crónicamente (Marx SO, et al. Cell, 2000; 101(4): 365-376). En particular, la hiperfosforilación crónica por RK? de RyR2 está asociada con la depleción de la subunidad calstabina2 estabilisadora del canal del complejo macromolecular del canal RyR2. La depleción de calstabina resulta en un "escape" diastólico de Ca2+ del SR del complejo RyR, que contribuye a una contractibilidad defectuosa (Marx et al., 2000). Debido a la activación de las corrientes despolarizantes de entrada, este "escape" diastólico de Ca2+ del SR también está asociado con arritmias cardiacas fatales (Lehnart et al, J Clin Invest. 2008; 118(6): 2230-2245). De hecho, los ratones obtenidos por ingeniería con RyR2 que carece del sitio de fosforilación de PKA están protegidos frente a la progresión de HF después de infarto de miocardio (MI) (Wehrens XH et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2006; 103(3): 511-518). Además, la hiperfosforilación crónica por PKA de RyR2 en HF está asociada con el remodelado del complejo macromolecular RyR2 que incluye la depleción de fosfatasas (Marx et al. 2000) PP1 y PP2a (afectando la desfosforilación de Ser2808) y la fosfodiesterasa tipo 4 específica de AMPc (PDE4D3) del complejo RyR2. La depleción de PDE4D3 del complejo RyR2 causa la elevación sostenida de los niveles locales de AMPc (Lehnart SE, et al., Cell 2005; 123(1): 25-35). Así, el escape de Ca2+ diastólico del SR contribuye a la progresión de HF y arritmias. Además, una publicación reciente ha demostrado que los ratones con la variante génica RyR2-S2808D+/+ (ácido aspártico reemplazando a la serina 2808), que mimetiza la hiperfosforilación constitutiva por PKA de RyR2, muestran la depleción de calstabina2 y RyR2 permeable. Los ratones RyR2-S2808D+/+ desarrollan cardiomiopatía dependiente de la edad, demuestran una oxidación y nitrosilación elevadas de RyR2, un contenido almacenado reducido de Ca2+ en SR y un escape incrementado de Ca2+ diastólico del SR. Después del infarto de miocardio, los ratones RyR2-S2808D+/+ presentan una mortalidad incrementada comparados con otros miembros de la camada WT. El tratamiento con S107, un derivado 1,4-benzotiazepina que estabiliza las interacciones RyR2-calstabina2 (WO 2007/024717), inhibió el escape de Ca2+ diastólico del SR mediado por RyR2 y redujo la progresión de HF tanto en ratones WT como RyR2-S2808D+/+ (Shan et al., J Clin Invest. 2010 dic 1; 120(12): 4375-87).
Además, RyR2 contiene aproximadamente 33 residuos con tiol libre lo que la convierte en altamente sensible al estado redox celular. La oxidación de cisteína facilita la apertura de RyR y el escape de Ca2+ del SR. Shan et al, 2010, demostraron que la oxidación y nitrosilación de RyR2 y la disociación de la subunidad estabilizadora calstabina2 de RyR2 induce el escape de Ca2+ del SR.
La taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT por sus siglas en ingles) es un trastorno hereditario en individuos con corazones estructuralmente normales. Más de 50 mutaciones distintas de RyR2 se han ligado a CPVT. Los pacientes con CPVT experimentan sincope y muerte cardiaca súbita (SCD por sus siglas en ingles) desde la infancia hasta la edad adulta y hacia los 35 años de edad la mortalidad es de hasta el 50%. Los individuos con CPVT tienen arritmias ventriculares cuando se someten a ejercicio, pero no desarrollan arritmias en reposo. Las mutaciones de RyR2 asociadas con CPVT resultan en canales RyR2 "permeables" debido a la unión disminuida de la subunidad calstabina2 (Lehnart et al., 2008). Los ratones heterocigotos para la mutación R2474S en RyR2 (ratones RyR2-R2474S) presentan convulsiones tónicas-clónicas espontáneas generalizadas (que ocurrieron en ausencia de arritmias cardiacas), arritmias ventriculares inducidas por el ejercicio y SCD. El tratamiento con S107 aumentó la unión de calstabina2 al canal mutante RyR2-R2474S, inhibió el escape del canal, evitó las arritmias cardiacas y elevó el umbral de las convulsiones (Lehnart et al., 2008).
Receptor de Rianodina 1 y Enfermedades Musculoesqueléticas La contracción musculoesquelética se activa por la liberación de Ca2+ del SR a través de RyRl. La despolarización de la membrana del túbulo transversal (T) activa el sensor de voltaje del receptor de dihidropiridina (Cavl.l) que a su vez activa los canales RyRl a través de una interacción directa proteina-proteina que causa la liberación de los almacenes de Ca2+ del SR. El Ca2+ se une a troponina C lo que permite que ocurra el entrecruzamiento actina-miosina y el acortamiento del sarcómero.
En condiciones de estrés muscular prolongado (por ejemplo, durante una carrera de maratón) o en una enfermedad tal como fallo cardiaco, estando los dos caracterizados por la activación crónica del SNS, la función usculoesquelética está afectada, debido posiblemente a un acoplamiento EC alterado. En particular, se reduce la cantidad de Ca2+ liberado del SR durante cada contracción del músculo, pueden ocurrir eventos aberrantes de liberación de Ca2+, y se ralentiza la recaptación de Ca2+ (Reiken, S, et al.2003, J. Cell Biol . 160: 919-928). Estas observaciones sugieren que los efectos perjudiciales de la activación crónica del SNS en el músculo esquelético podrían deberse, al menos en parte, a defectos en la señalización del Ca2+.
El complejo macromolecular RyRl consiste en un tetrámero de la subunidad RyRl de 560 kDa que forma un andamio para proteínas que regulan la función del canal incluyendo PKA y la fosfodiesterasa 4D3 (PDE4D3), proteína fosfatasa 1 (PP1) y calstabinal. La proteína de anclaje quinasa A (mAKAP) dirige PKA y PDE4D3 a RyRl, mientras que la espinofilina dirige PP1 al canal (Marx et al. 2000; Brillantes et al., Cell, 1994, 77, 513-523; Bellinger et al. J. Clin . Invest. 2008, 118, 445-53). Las subunidades catalíticas y reguladoras de PKA, PP1 y PDE4D3 regulan la fosforilación mediada por PKA de RyRl en Ser2843 (Ser2844 en el ratón). Se ha mostrado que la fosforilación de RyRl mediada por PKA en Ser2844 incrementa la sensibilidad del canal al Ca2+ citoplásmico, reduce la afinidad de unión de calstabinal para RyRl y desestabiliza el estado cerrado del canal (Reiken et al., 2003; Marx, S.O. et al., Science, 1998, 281: 818-821). Se ha indicado que las concentraciones de calstabinal en el músculo esquelético son aproximadamente 200 nM y que la fosforilación por PKA de RyRl reduce la afinidad de unión de calstabinal para RyRl de aproximadamente 100-200 nM a más de 600 nM. Así, en condiciones fisiológicas, la reducción de la afinidad de unión de calstabinal para RyRl, que resulta de la fosforilación por PKA de RyRl en Ser2843, es suficiente para reducir sustancialmente la cantidad de calstabinal presente en el complejo RyRl. La hiperfosforilación crónica por PKA de RyRl en Ser2843 (definida como fosforilación por PKA de 3 ó 4 de los 4 sitios Ser2843 de PKA presentes en cada homotetrámero RyRl) resulta en canales "permeables" (es decir, canales que tienden a abrirse en reposo), lo que contribuye a la disfunción musculoesquelética que está asociada con estados hiperadrenérgicos persistentes tales como los que ocurren en individuos con fallo cardiaco (Reiken et al., 2003).
Además, se ha indicado que la regulación de RyRl por modificaciones posteriores a la traducción distintas de la fosforilación, tales como por nitrosilación de los grupos sulfidrilo libres en residuos de cisterna (S-nitrosilación) asi como la oxidación del canal, incrementan la actividad del canal RyRl. Se ha mostrado que tanto la S-nitrosilación como la oxidación de RyRl reducen la unión de calstabinal a RyRl.
Se ha indicado previamente por Bellinger et al.
( Proc . Nati . Acad. Sci . 2008, 105(6): 2198-2002) que durante el ejercicio extremo en ratones y seres humanos, RyRl se hiperfosforila por PKA, se S-nitrosila y depleciona de PDE4D3 y calstabinal progresivamente, lo que resulta en canales "permeables" que causan una capacidad de ejercicio disminuida en ratones. El tratamiento con S107 evitó la depleción de calstabinal del complejo RyRl, mejoró la generación de fuerza y la capacidad de ejercicio y redujo la actividad de la proteasa neutra dependiente de Ca2+ calpaina y los niveles plasmáticos de creatinina quinasa.
La distrofia muscular de Duchenne (DMD por sus siglas en ingles) es una de las principales enfermedades genéticas letales de la infancia. DMD está ligada a X, afecta a 1 de 3.500 nacimientos de varones y resulta típicamente en la muerte hacia los ~ 30 años de edad de fallo respiratorio o cardiaco. Las mutaciones en distrofina asociadas con DMD dan lugar a una pérdida completa de la proteina distrofina, interrumpiendo de esta manera el vínculo entre el citoesqueleto del subsarcolema y la matriz extracelular. Este vínculo es esencial para proteger y estabilizar el músculo frente al daño inducido por la contracción. Actualmente, no existe cura para DMD y la mayor parte de los tratamientos en clínica son paliativos. Las intervenciones que surgen en los ensayos clínicos de Fasel/II son omisión de exones, inhibición de miostatina y regulación al alza de utrofina. Sin embargo, existen problemas con la administración sistémica, omisión de exones sostenida y regulación al alza de utrofina. Además, en los ensayos clínicos de Fase I/II, la inactivación de miostatina para incrementar el tamaño muscular no mostró una resistencia o función muscular mejorada. La inestabilidad del sarcolema debida a las mutaciones en distrofina tiene un efecto de cascada. Un efecto principal es la concentración incrementada de Ca2+ citosólico, que da lugar a la activación de proteasas dependientes de Ca2+ (calpaínas). Otro efecto es la inflamación y actividad elevada de iNOS, que puede causar la oxidación/nitrosilación de proteínas, lípidos y ADN. La patología muscular de DMD es progresiva y excede con mucho la inestabilidad del sarcolema. Así, la patología es consistente con la inestabilidad del sarcolema incrementando la susceptibilidad a daño adicional. Recientemente, se ha demostrado que la oxidación o nitrosilación excesiva de RyRl puede interrumpir la interacción de calstabinal con el complejo RyRl, dando lugar a la permeabilidad de RyRl y debilidad muscular en un modelo de ratón de distrofia muscular (mdx) y que el tratamiento con S107 mejora los índices de función muscular en este modelo de ratón (Bellinger, A. et al.2009, Nature Medicine, 15: 325-330).
La pérdida de masa y fuerza muscular relacionada con la edad (sarcopenia) contribuye a la discapacidad y mortalidad incrementadas. Andersson, D. et al. ( Cell Metab. 2011 ago 3; 14(2): 196-207) indicaron que RyRl de ratones mayores (24 meses) está oxidado, nitrosilado en cisteína y deplecionado de calstabinal, comparado con RyRl de adultos más jóvenes (3-6 meses). Este remodelado del complejo del canal RyRl resultó en canales "permeables" con una probabilidad de apertura incrementada, que da lugar a escape de calcio intracelular en el músculo esquelético. El tratamiento de ratones mayores con S107 estabilizó la unión de calstabinal a RyRl, redujo el escape de calcio intracelular, disminuyó las especies de oxigeno reactivas (ROS por sus siglas en ingles) y aumentó la liberación tetánica de Ca2+, fuerza específica muscular y capacidad de ejercicio .
Las publicaciones de patente internacionales PCT WO 2005/094457, WOO 2006/101496 y WO 2007/024717 describen derivados 1,4-benzotiazepina y su uso en el tratamiento de trastornos cardiacos, musculoesqueléticos y cognitivos, entre otros.
La publicación de patente internacional PCT WO 2008/060332 se refiere al uso de derivados 1,4-benzotiazepina para tratar fatiga muscular en sujetos que padecen patologías tales como distrofia muscular, o en sujetos que padecen fatiga muscular como resultado de ejercicio sostenido, prolongado y/o extenuante, o estrés crónico.
La publicación de patente internacional PCT WO 2008/021432 se refiere al uso de derivados 1,4-benzotiazepina para el tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos y afecciones que afectan al sistema nervioso.
La publicación de patente internacional PCT WO 2012/019076 se refiere al uso de derivados 1,4- benzotiazcpina para el tratamiento y/o prevención de daño cardiaco por isquemia/reperfusión. Fauconnier et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2011, 108(32): 13258-63 indicaron que el escape de RyR mediado por la activación de caspasa-8 da lugar a daño ventricular izquierdo después de isquemia- reperfusión miocárdica y que el tratamiento con S107 inhibió el escape de Ca2+ del SR, redujo las arritmias ventriculares, tamaño del infarto y remodelado ventricular izquierdo a los 15 dias después de la reperfusión.
La publicación de patente internacional PCT WO 2012/019071 se refiere al uso de derivados 1,4-benzotiazepina para el tratamiento y/o prevención de sarcopenia .
La publicación de patente internacional PCT WO 2012/037105 se refiere al uso de derivados 1,4-benzotiazepina para el tratamiento y/o prevención de trastornos y enfermedades neuronales inducidas por el estrés .
Existe una necesidad de identificar nuevos compuestos eficaces para tratar trastornos y enfermedades asociadas con los RyR, incluyendo trastornos y enfermedades musculoesqueléticas y cardiacas. Más particularmente, permanece una necesidad de identificar nuevos agentes que puedan usarse para tratar trastornos asociados con RyR, por ejemplo, reparando el escape en canales RyR y aumentando la unión de las calstabinas a los RyR fosforilados por PKA/oxidados/nitrosilados y a RyR mutantes que de otra manera tienen una afinidad reducida para, o no se unen a, calstabinas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevos derivados 1,-benzotiazepina y sus sales farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención son estabilizadores del canal de calcio del receptor de rianodina (RyR por sus siglas en ingles), algunas veces referidos como "Rycals™". La presente invención proporciona además métodos para usar estos compuestos para tratar trastornos y enfermedades asociadas con los RyR.
Los compuestos de la presente invención son una selección de los derivados 1,4-benzotiazepina descritos en los documentos WO 2007/024717. WO 2007/024717 describe compuestos estructuralmente similares, sin embargo, como además se describe en la presente memoria, se ha encontrado que estos compuestos son altamente inestables y por ello está limitada su utilidad terapéutica como fármacos. Asi, el problema que subyace en la presente invención es proporcionar derivados 1,4-benzotiazepina alternativos que no sean solo farmacológicamente activos - sino que también tengan propiedades favorables tales como alta estabilidad metabólica, y asi sean adecuados como fármacos para tratar enfermedades y afecciones asociadas con RyR, por ejemplo trastornos cardiacos, musculoesqueléticos y del sistema nervioso central (CNS por sus siglas en ingles). Se ha descubierto de forma inesperada que los compuestos de fórmula (I) son estables asi como farmacológicamente activos, proporcionando asi una solución téenica al problema que subyace en la presente invención.
Los compuestos de la presente invención se representan por la estructura de Fórmula (I): (I) en la que R es COOH; y sales farmacéuticamente aceptables de éste.
Los compuestos de Fórmula (I) pueden estar presentes en la forma de una sal con un ácido o base farmacéuticamente aceptable. Dichas sales se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en sales de sodio, potasio, magnesio, hemifumarato, hidrocloruro e hidrobromuro, representando cada posibilidad una realización separada de la presente invención. Una sal actualmente preferida es la sal de sodio. Otra sal actualmente preferida es la sal hemifumarato.
En algunas realizaciones especificas, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en compuesto 1, compuesto 4 y compuesto 6 y sales farmacéuticamente aceptables de éstos. Las estructuras de estos compuestos se describen más adelante en la presente memoria.
En una realización preferida, el compuesto se representa por la estructura del compuesto (1): (1) o sales farmacéuticamente aceptables de éste.
En algunas realizaciones, el compuesto 1 se proporciona como el compuesto parental. En otras realizaciones, sin embargo, el compuesto 1 se proporciona en la forma de una sal con un ácido o base farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, dicha sal se selecciona del grupo que consiste en sales de sodio, potasio, magnesio, hemifumarato, hidrocloruro e hidrobromuro, representando cada posibilidad una realización separada de la presente invención. Una sal actualmente preferida es la sal de sodio. Otra sal actualmente preferida es la sal hemifumarato.
La presente invención también proporciona métodos para la síntesis de compuestos de la invención, y sales de éstos .
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los compuestos de la invención, y al menos un aditivo o excipiente, por ejemplo, materiales de relleno, diluyentes, aglutinantes, disgregantes, tampones, colorantes, emulsionantes, agentes que mejoran el sabor, gelificantes, deslizantes, conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes de suspensión, edulcorantes, agentes de tonicidad, agentes humectantes, emulsionantes, agentes de dispersión, agentes expansores, retardantes, lubricantes, absorbentes y agentes que incrementan la viscosidad. Las composiciones pueden presentarse en forma de dosificación de cápsulas, gránulos, polvos, disoluciones, sobres, suspensiones o comprimidos.
La presente invención proporciona además métodos para tratar o prevenir varios trastornos, enfermedades y afecciones asociadas con RyR, tales como trastornos y enfermedades cardiacas, musculoesqueléticas, cognitivas, SNC y neuromuscular que comprenden administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad de un compuesto de Fórmula (I) o una sal de éste, eficaz para prevenir o tratar un trastorno o enfermedad asociada con un RyR. La presente invención también proporciona un método para prevenir o tratar un escape en RyR (incluyendo RyRl, RyR2 y RyR3) en un sujeto, incluyendo administrar al sujeto una cantidad de un compuesto de Fórmula (I) o una sal de éste, eficaz para prevenir o tratar un escape en RyR.
Además, la presente invención proporciona un método para modular la unión de RyR y calstabinas en un sujeto, incluyendo administrar al sujeto una cantidad de un compuesto de Fórmula (I) o una sal de éste, eficaz para modular la cantidad de calstabina unida a RyR.
La presente invención se refiere además al uso de un compuesto de Fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trastornos, enfermedades y afecciones asociadas con RyR, tales como trastornos y enfermedades cardiacas, musculoesqueléticas y cognitivas/SNC. En otra realización, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de Fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar un escape en RyR. En otra realización, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de Fórmula (I) para la fabricación de un medicamento para modular la cantidad de calstabinas unidas a RyR.
Los métodos de la invención pueden llevarse a la práctica en un sistema in vitro (por ejemplo, células o tejidos cultivados) o in vivo (por ejemplo, en un animal no humano o un ser humano).
En algunas realizaciones, los compuestos de la invención se proporcionan en combinación con terapia de omisión de exones, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido (AOs) para potenciar la omisión de exones en un mRNA de interés, por ejemplo el gen DMD, como se describe adicionalmente en la presente memoria. Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y figuras siguientes.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Figura 1A: Inmunotransferencia con anticuerpo frente a calstabina2 que muestra la unión de calstabina2 a RyR2 fosforilado por PKA en ausencia (-) o presencia de 100 nM del compuesto 1. (+): Unión de calstabina a RyR2 no fosforilado por PKA. S36 (US 7,544,678) se usa como control positivo.
Figura IB: Inmunotransferencia con anticuerpo frente a calstabina2 que muestra la unión de calstabina2 a RyR2 fosforilado por PKA en ausencia (-) o presencia de 100 nM del compuesto 2, compuesto 3 o compuesto 4. (+): Unión de calstabina a RyR2 no fosforilado por PKA. S36 se usa como control positivo.
Figura 1C: Inmunotransferencia con anticuerpo frente a calstabinal que muestra la unión de calstabinal a RyRl fosforilado por PKA en ausencia (Neg) o presencia de las concentraciones indicadas del compuesto 1 o compuesto 4. (Pos): unión de calstabina a RyRl no fosforilado por PKA. S36 se usa como control positivo.
Figura 2A, Figura 2B: Inmunotransferencia con anticuerpo frente a calstabinal que muestra los niveles de calstabinal en complejos RyRl inmunoprecipitados de U sados tibiales en ratones a los que se administró vehículo (50:50 DMSO/PEG) , isoproterenol solo (ISO por sus siglas en ingles) o isoproterenol junto con las concentraciones indicadas de compuesto 1 en bombas osmóticas. S36 se usa como control a 3.6 mM.
Figura 2C: cuantificación de % de re-unión de calstabinal a RyRl.
Figura 3 Modelo de fallo cardiaco crónico en rata inducido por daño por isquemia-reperfusión (I/R). Para el protocolo de I/R, se ocluyó la arteria coronaria izquierda descendente anterior (LAD por sus siglas en ingles) durante 1 h.
Figuras 4A-4C Volúmenes y fracción de cyección (EF por sus siglas en ingles) del ventrículo izquierdo (LV por sus siglas en ingles) en ratas tratadas con compuesto 1 a 5 mg/kg/d (5MK) ó 10 mg/kg/d (10MK) en el agua de bebida frente a animales tratados con vehículo (H2O) y con operación simulada. El fallo cardiaco crónico se indujo por daño por isquemia-reperfusión (I/R). La arteria LAD se ocluyó durante 1 h; el tratamiento empezó 1 semana después de la reperfusión y continuó durante 3 meses. Los parámetros ecocardiográficos se obtuvieron después de 1, 2 ó 3 meses de tratamiento. Figura 4A: Volumen Diastólico Final de LV; Figura 4B: Volumen Sistólico Final de LV; Figura 4C: EF. Figuras 4A y 4B: § P 0.001 frente a simulación; * P<0.05 frente a vehículo; † P 0.001 frente a vehículo. Figura 4C: § P<0.001 frente a simulación, † P<0.001 frente a vehículo.
Figuras 5A-5D representan el peso corporal (BW por sus siglas en ingles) (Figura 5A), Tamaño del infarto (figura 5B) y peso LV (Figura 5C) y la Figura 5D representa el contenido de colágeno en ratas tratadas con el compuesto 1 a 5 mg/kg/d (5MK) y 10 mg/kg/d (10MK) en el agua de bebida frente a animales tratados con vehículo (H20) y con operación simulada. El fallo cardiaco crónico se indujo por daño por isquemia-reperfusión (I/R). La arteria LAD se ocluyó durante 1 h; el tratamiento empezó 1 semana después de la reperfusión y continuó durante 3 meses. Los parámetros se midieron después de 3 meses de tratamiento. Figuras 5A-C: no significativo. Figura 5D: ††† P<0.001 frente a simulación; * P<0.05 frente a vehículo.
Figuras 6A-6C Hemodinámicas invasivas: Presión sistólica del ventrículo izquierdo (LV SP) (Figura 6A), dP/dtmax (Figura 6B); y dP/dtmin (Figura 6C) en ratas tratadas con el compuesto 1 a 5 mg/kg/d (5MK) ó 10 mg/kg/d (10MK) en el agua de bebida frente a animales tratados con vehículo (H2O) y con operación simulada. El fallo cardiaco crónico se indujo por daño por isquemia-reperfusión (I/R). La arteria LAD se ocluyó durante 1 h; el tratamiento empezó 1 semana después de la reperfusión y continuó durante 3 meses. Los parámetros hemodinámicos se midieron después de 3 meses de tratamiento. Figura 6A: no significativo. Figura 6B: § P<0.05 frente a simulación; * P<0.05 frente a vehículo. Figura 6C: † P<0.01 frente a simulación, * P<0.05 frente a vehículo.
Figura 7: Concentración plasmática (mM) del compuesto 1 frente al momento del día.
Figura 8: EF en ratas tratadas con el compuesto 1 o compuesto A a 5 mg/kg/d (5MK) en el agua de bebida frente a animales tratados con vehículo (H20) y con operación simulada. La arteria LAD se ocluyó durante 1 h; el tratamiento empezó 1 semana después de la reperfusión y continuó durante 3 meses. Los parámetros ecocardiográficos se obtuvieron después de 1, 2 ó 3 meses de tratamiento. § P<0.001 frente a simulación; * P<0.05 frente a vehículo; † P 0.001 frente a vehículo.
Figura 9: Efecto del compuesto 1 en la actividad física espontánea de ratones mdx y WT comparado con controles tratados con vehículo (H2O). P<0,001 para los días de actividad 1-19 en ratones mdx dosificados con 10 y 50 mg/kg/d (dosis diana) administrado en el agua de bebida comparado con el control vehículo.
Figuras 10A, 10B: Relación frecuencia-fuerza específica del músculo EDL. (Fig.10A) ratones mdx tratados con el compuesto 1 (5, 10 y 50 mg/kg/d (dosis diana)) administrado en el agua de bebida, comparado con controles tratados con vehículo (H20) (n= 5). p<0.05 para la dosis 50 mg/kg/d, a frecuencias de 150 Hz y superiores. (Fig.10B) ratones WT, C57BL/6 tratados con el compuesto 1 (50 mg/kg/d (dosis diana)) administrado en el agua de bebida, comparado con controles tratados con vehículo (H20) (n= 4).
Figuras 11A, 11B: Peso medio corporal (Fig.11A) y consumo medio de agua (Fig. 11B) de ratones mdx y WT tratados con vehículo (H20) o compuesto 1 (50 mg/kg/d (dosis diana) administrado en el agua de bebida.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Debe entenderse gue la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque indican varias realizaciones de la invención se proporcionan sólo como ilustración, ya que varios cambios y modificaciones en el espíritu y alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la téenica a partir de esta descripción detallada.
Tal y como se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "la", "el" incluyen las referencias plurales a no ser que el contenido dicte claramente otra cosa. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad.
El término "Rycals™" se refiere a estabilizadores del canal de calcio del receptor de rianodina, representados por los compuestos de la Fórmula general (I) o (IA) según se proporciona por la invención, así como los compuestos específicos designados por los números numéricos según se proporciona por la invención, y referidos colectivamente en la presente memoria como "compuesto(s) de la invención".
Compuestos En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención se representan por la estructura de Fórmula (IA): (IA) en la que R es COOH o un bioisóstero de éste, COOR1 o CN; y R1 es un alquilo C1-C4/ y sales farmacéuticamente aceptables de éste.
En algunas realizaciones preferidas, R en la Fórmula (IA) es un ácido carboxilico (COOH). En otras realizaciones preferidas, R en la Fórmula (IA) es un bioisóstero de ácido carboxilico, por ejemplo tetrazol. Alternativamente, el bioisóstero de ácido carboxilico puede ser un heterociclo ácido tal como 1,2,4-oxadiazol-5(4H)-ona, 1,2,4-tiadiazol-5 (4H)-ona, 1,2,4-oxadiazol-5(4H)-tiona, 1,3,4-oxadiazol-2(3H)-tiona, 4-metil-1H-l,2,4-triazol-5 (4H)-tiona, ácido 5-fluoroorótico y semejantes. Los bioisósteros de ácido carboxilico adicionales se describen, por ejemplo, en Hamada, Y. et al·., Bioorg. Med. Chem . Lett. 2006; 16: 4354-4359; Herr, R.J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2002; 10: 3379-3393; Olesen, P.H., Curr. Opin. Drug Discov. Devel . 2001; 4: 471; Patani, G.A. et al., J.
Chem . Rev. 1996; 96: 3147; Kimura, T. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006; 16: 2380-2386; y Kohara, Y. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett . 1995; 5(17): 1903-1908. Los contenidos de cada una de las referencias mencionadas anteriormente se incorporan por referencia en la presente memoria .
En una realización preferida, los compuestos de la presente invención se representan por la estructura de Fórmula (IA) en donde R es COOH y sales farmacéuticamente aceptables de éste (es decir, un compuesto de fórmula (I)). En otras realizaciones preferidas, R en la Fórmula (IA) está en posición 4 del anillo fenilo (es decir, posición 7 del anillo benzotiazepina). Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. Los compuestos de Fórmula (IA) o (I) pueden estar presentes en forma de una sal con un ácido o base farmacéuticamente aceptable. Tales sales se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en sales de sodio, potasio, magnesio, hemifumarato, hidrocloruro e hidrobromuro, representando cada posibilidad una realización separada de la presente invención. Una sal actualmente preferida es la sal de sodio. Otra sal actualmente preferida es la sal hemifumarato .
En algunas realizaciones especificas, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en compuesto 1, compuesto 2, compuesto 3, compuesto 4, compuesto 5, compuesto 6, compuesto 7, compuesto 8, compuesto 9, compuesto 10, compuesto 11 y compuesto 12 y sales farmacéuticamente aceptables de éstos. Estos compuestos se representan por las estructuras siguientes: (4) (7) S2 (tt) 62 (12) Definiciones Químicas: El término "alquilo" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un hidrocarburo saturado lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono ("alquilo Cq-CV'). Los grupos alquilo representativos incluyen, pero no están limitados a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo y tere-butilo. El grupo alquilo puede no estar sustituido o estar sustituido con uno o más grupos seleccionados de halógeno, haloalquilo, hidroxi, alcoxi, haloalcoxi, cicloalquilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo, amido, alquilamido, dialquilamido, nitro, amino, ciano, N3, oxo, alquilamino, dialquilamino, carboxilo, tio, tioalquilo y tioarilo.
Los compuestos de la presente invención pueden existir en su forma tautomérica. Todas dichas formas tautoméricas se contemplan en la presente memoria como parte de la presente invención.
Todos los estereoisómeros de los compuestos de la presente invención (por ejemplo, aquellos que pueden existir debido a carbonos asimétricos en varios sustituyentes), incluyendo las formas enantioméricas y las formas diastereoméricas, se contemplan en el alcance de esta invención. Los estereoisómeros individuales de los compuestos de la invención pueden, por ejemplo, carecer sustancialmente de otros isómeros (por ejemplo, como un isómero óptico puro o sustancialmente puro que tiene una actividad especificada) o pueden estar mezclados, por ejemplo, como racematos, o como mezclas enriquecidas en un estereoisómero . Los centros quirales de la presente invención pueden tener la configuración S o R según se define por las Recomendaciones IUPAC 1974. Las formas racémicas pueden resolverse por métodos físicos, tales como, por ejemplo, cristalización fraccionada, separación o cristalización de derivados diastereoméricos o separación por cromatografía en columna quiral. Los isómeros ópticos individuales pueden obtenerse a partir de los racematos por cualquier método adecuado, incluyendo sin limitación, métodos convencionales, tales como, por ejemplo, formación de sales con un ácido o base ópticamente activo, seguido de cristalización.
Los compuestos de la presente invención, posteriormente a su preparación, se aíslan y se purifican preferiblemente para obtener una composición que contiene una cantidad en peso igual a o mayor de aproximadamente 90% del compuesto, aproximadamente 95% del compuesto e incluso más preferiblemente mayor de aproximadamente 99% del compuesto (compuesto "sustancialmente puro"), que se usa o formula como se describe en la presente memoria. Dichos compuestos "sustancialmente puros" de la presente invención también se contemplan en la presente memoria como parte de la presente invención.
Uso Terapéutico La presente invención proporciona compuestos que son capaces de tratar afecciones, trastornos y enfermedades asociadas con los RyR. Más particularmente, la presente invención proporciona compuestos que son capaces de reparar un escape en los canales RyR, que pueden ser canales RyRl, RyR2 y/o RyR3. En una realización, los compuestos de la invención aumentan la asociación y/o inhiben la disociación de RyR y calstabina (por ejemplo, RyRl y calstabinal; RyR2 y calstabina2; y RyR3 y calstabinal). "Afecciones, trastornos y enfermedades asociadas con los RyR" significa trastornos y enfermedades que pueden tratarse y/o prevenirse modulando los RyR e incluyen, sin limitación, trastornos y enfermedades cardiacas, fatiga muscular, trastornos y enfermedades musculoesqueléticas, trastornos y enfermedades del SNC, disfunción cognitiva, neuromuscular trastornos y enfermedades, mejora de la función cognitiva, trastornos y enfermedades óseas, Caquexia por cáncer, hipertermia maligna, diabetes, muerte súbita cardiaca y síndrome de la muerte súbita infantil.
Así, en una realización, la presente invención se refiere a un método para tratar o prevenir una afección seleccionada del grupo que consiste en trastornos y enfermedades cardiacas, fatiga muscular, trastornos y enfermedades musculoesqueléticas, trastornos y enfermedades del SNC, disfunción cognitiva, neuromuscular trastornos y enfermedades, trastornos y enfermedades óseas, caquexia por cáncer, hipertermia maligna, diabetes, muerte cardiaca súbita y síndrome de la muerte súbita infantil o para mejorar la función cognitiva, comprendiendo el método la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula (I) o (IA) como se describe en la presente memoria, o una sal de éste, para efectuar dicho tratamiento. Un compuesto actualmente preferido es un compuesto de Fórmula (1)· En otra realización, la presente invención se refiere al uso de una cantidad eficaz de compuesto de Fórmula (I) o (IA), como se describe en la presente memoria, o una sal de éste, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una afección seleccionada del grupo que consiste en trastornos y enfermedades cardiacas, fatiga muscular, trastornos y enfermedades musculoesqueléticas, trastornos y enfermedades del SNC, neuromuscular trastornos y enfermedades, disfunción cognitiva, trastornos y enfermedades óseas, caquexia por cáncer, hipertermia maligna, diabetes, muerte cardiaca súbita y síndrome de la muerte súbita infantil o para mejorar la función cognitiva. Un compuesto actualmente preferido es un compuesto de Fórmula (1).
En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de Fórmula (I) o (IA) como se describe en la presente memoria, o una sal de éste, para uso en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una afección seleccionada del grupo que consiste en trastornos y enfermedades cardiacas, fatiga muscular, trastornos y enfermedades musculoesqueléticas, trastornos y enfermedades del SNC, disfunción cognitiva, neuromuscular trastornos y enfermedades, trastornos y enfermedades óseas, caquexia por cáncer, hipertermia maligna, diabetes, muerte cardiaca súbita y síndrome de la muerte súbita infantil o para mejorar la función cognitiva. Un compuesto actualmente preferido es un compuesto de Fórmula (1).
En una realización, la afección, trastorno o enfermedad está asociada con una función anormal de RyRl. En otra realización, la afección, trastorno o enfermedad está asociada con una función anormal de RyR2. En otra realización, la afección, trastorno o enfermedad está asociada con una función anormal de RyR3. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.
Los trastornos y enfermedades cardiacas incluyen, pero no están limitados a, trastornos y enfermedades de latido cardiaco irregular, trastornos y enfermedades de latido cardiaco irregular inducido por el ejercicio, fallo cardiaco, fallo cardiaco congestivo, fallo cardiaco crónico, fallo cardiaco agudo, fallo cardiaco sistólico, fallo cardiaco diastólico, fallo cardiaco descompensado agudo, daño cardiaco por isquemia/reperfusión (I/R) (incluyendo daño I/R posterior a angioplastia coronaria o posterior a trombolisis durante infarto de miocardio (MI)), enfermedad pulmonar obstructiva crónica y presión sanguínea alta. Los trastornos y enfermedades de latido cardiaco irregular incluyen, pero no están limitados a, arritmia auricular y ventricular, fibrilación auricular y ventricular, taquiarritmia auricular y ventricular, taquicardia auricular y ventricular, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT por sus siglas en ingles) y variantes de éstas inducidas por el ejercicio.
Los compuestos de la invención también son útiles para tratar la fatiga muscular, que puede deberse a ejercicio prolongado o ejercicio de alta intensidad, o puede estar causada por unas enfermedades musculoesqueléticos. Los ejemplos de trastornos y enfermedades musculares incluyen, pero no están limitados a, fatiga usculoesquelética, enfermedades de los cuerpos centrales, fatiga musculoesquelética inducida por el ejercicio, trastornos de la vejiga, incontinencia, fatiga muscular asociada a la edad, sarcopenia, miopatias congénitas, miopatias y/o atrofias musculoesqueléticas, caquexia por cáncer, miopatia con cuerpos y varillas, miopatias mitocondriales [por ejemplo, síndrome de Kearns- Sayre, síndrome MELAS (miopatia mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica e ictus) y síndrome MERRF (epilepsia mioclónica con fibras irregulares-rojas)], miopatias endocrinas, enfermedades de almacenamiento de glucógeno muscular [por ejemplo, enfermedad de Pompe, enfermedad de Andersen y enfermedades de Cori], mioglobinurias [por ejemplo, enfermedad de McArdle, enfermedad de Tarui y enfermedad de DiMauro], dermatomiositis, miositis osificante, parálisis periódica familiar, polimiositis, miositis con cuerpos de inclusión, neuromiotonía, síndrome de la persona rígida, hipertermia maligna, calambres musculares comunes, tétanos, miastenia grave, atrofia muscular espinal (SMA por sus siglas en ingles), atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA, también conocido como atrofia muscular espinobulbar, atrofia bulboespinal, ligada a X neuropatía espinobulbar (XBSN por sus siglas en ingles), ligada a X atrofia espinal muscular de tipo 1 (SMAX1 por sus siglas en ingles), y enfermedad de Kennedy (KD por sus siglas en ingles)) y distrofia muscular. Los trastornos musculoesqueléticos preferidos incluyen, pero no están limitados a, fatiga musculoesquelética inducida por el ejercicio, una miopatia congénita, distrofia muscular, fatiga muscular relacionada con la edad, sarcopenia, enfermedad de los cuerpos centrales, caquexia por cáncer, trastornos de la vejiga e incontinencia .
Los ejemplos de distrofia muscular incluyen, pero no están limitados a, Distrofia Muscular de Duchenne (DMD por sus siglas en ingles), Distrofia Muscular de Becker (BMD por sus siglas en ingles), Distrofia Muscular de Cinturas de las Extremidades (LGMD por sus siglas en ingles) , Distrofia Muscular Congénita (CMD por sus siglas en ingles), distrofia muscular distal, distrofia facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica, distrofia muscular de Emery-Dreifuss y distrofia muscular oculofaringea, siendo DMD la preferida actualmente.
La distrofia muscular congénita tal y como se usa en la presente memoria se refiere a distrofia muscular que está presente en el nacimiento. La CMD se clasifica tomando como base mutaciones genéticas: 1) genes que codifican proteínas estructurales de la membrana basal o la matriz extracelular de las fibras musculoesqueléticas; 2) genes que codifican glicosiltransferasas posibles o demostradas, que a su vez afectan la glicosilación de distroglucano, una proteina de la membrana externa de la membrana basal; y 3) otras. Los ejemplos de CMD incluyen, pero no están limitados a, CMD deficiente en Laminina-a2 (MDC1A), CMG de Ullrich (UCMD 1, 2 y 3), síndrome de Walker-Warburg (WWS por sus siglas en ingles), enfermedad músculo-ojo-cerebro (MEB por sus siglas en ingles), CMD de Fukuyama (FCMD por sus siglas en ingles), CMD más deficiencia en laminina 1 secundaria (MDC1B por sus siglas en ingles), CMD más deficiencia en laminina 2 secundaria (MDC1C por sus siglas en ingles), CMD con retraso mental y paquigiria (MDC1D por sus siglas en ingles) y espina Rígida con distrofia muscular Tipo 1 (RSMD1 por sus siglas en ingles).
Disfunción cognitiva puede ser asociado con o incluye, pero no está limitado a, pérdida de memoria, pérdida de memoria dependiente de la edad, trastorno de estrés post-traumático (PTSD por sus siglas en ingles), trastorno de déficit de atención con hiperactividad (ADHD por sus siglas en ingles), trastorno del espectro autista (ASD por sus siglas en ingles), trastorno de ansiedad generalizado (GAD por sus siglas en ingles), trastorno obsesivo compulsivo (OCD por sus siglas en ingles), Esquizofrenia, trastorno Bipolar o depresión mayor.
Trastornos o enfermedades del SNC incluyen, pero no están limitados a, Enfermedad de Alzheimer (AD por sus siglas en ingles), una neuropatía, convulsiones, Enfermedad de Parkinson (PD por sus siglas en ingles), y Enfermedad de Huntington.
Trastornos o enfermedades neuromuscular incluyen, pero no están limitados a, degeneración espinocerebelosa (SCA), esclerosis lateral amiotrofica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig's).
En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención mejoran la función cognitiva, que puede seleccionarse de memoria a corto plazo, memoria a largo plazo, atención, aprendizaje y cualquier combinación de éstas .
En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención son útiles en el tratamiento de la caquexia por cáncer, es decir, debilidad muscular que está asociada con cáncer en general, y preferiblemente debilidad muscular en cáncer metastásico, tales como metástasis óseas. La debilidad muscular y atrofia muscular (caquexia) son síntomas paraneoplásicos comunes en pacientes de cáncer. Estas afecciones causan fatiga significativa y reducen dramáticamente la calidad de vida de los pacientes. La presente invención proporciona un método para tratar y prevenir la debilidad muscular en un paciente de cáncer, basado, en parte, en el descubrimiento que, en algunos tipos de cáncer, por ejemplo cáncer de próstata y de mama con metástasis óseas, RyRl se oxida lo que induce a que se vuelva "con escapes". Se ha encontrado además que la prevención de los escapes por administración de los compuestos Rycal mejora la función muscular. Los cánceres ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de colon, y cáncer gastrointestinal .
Terapia de omisión de exones: En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención modulan (por ejemplo, potencian) el corte y empalme de mRNA potenciando la omisión de exones mediada con antisentido. Esta modulación de corte y empalme se lleva a cabo en presencia de oligonucleótidos antisentido (AOs) que son específicos para el corte y empalme de secuencias de interés. En algunas realizaciones de la invención, el compuesto de fórmula (I) o (IA) y el AO puede actuar de forma sinérgica en donde el compuesto de fórmula (I) o (IA) potencia la omisión de exones mediada con AO. Así, en algunas realizaciones, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o prevención de cualquiera de las afecciones descritas en la presente memoria que están asociadas con RyR con escapes, que además comprenden el uso de un AO antisentido que es especifico para una secuencia de corte y empalme en una secuencia de mRNA, para potenciar la omisión de exones en el mRNA de interés.
Una realización particular para la potenciación de la omisión de exones mediante los compuestos de la presente invención pertenece a la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD por sus siglas en ingles). DMD es una enfermedad recesiva letal ligada a X caracterizada por la debilidad muscular progresiva durante la vida de un paciente. DMD está causada principalmente por deleciones de multi-exones fuera de marco en el gen DMD que eliminan la producción de proteina distrofina. La pérdida de la expresión de distrofina solo no explica la patofisiologia DMD. La disrupción del complejo distrofina-glicoproteina (DGC por sus siglas en ingles) da también como resultado estrés oxidativo, sobrecarga mitocondrial de Ca2+ y apoptosis, entrada de Ca2+ aumentada en el músculo, y señalización de Ca2+ patológica. No hay terapias curativas para DMD, y el único tratamiento farmacológico demostrado son corticosteroides, que pueden prolongar la ambulación, pero tienen efectos secundarios sustanciales. La omisión de exones mediada por oligonucleótidos antisentido es una estrategia terapéutica prometedora destinada a restablecer el marco de lectura DMD y permitir la expresión de un complejo distrofina glicoproteína intacto. Hasta la fecha, los niveles bajos de la proteina distrofina en humanos se han producido por este método. Kendall et al. { Sci Transí Med, 2012, 4(164), p. 164ral60) han informado que algunas moléculas pequeñas tales como Dantroleno y otros moduladores de RyR, potencian la omisión de exones guiada por oligómeros antisentido para aumentar la omisión de exones para restaurar el marco de lectura de mRNA, la proteina distrofina sarcolémica, y el complejo distrofina glicoproteína en el músculo esquelético de ratones mdx, un modelo de ratón de DMD.
Así, en una realización, la presente invención se refiere a un método para tratar DMD, mediante la administración a un sujeto que lo necesite de un compuesto de fórmula (I) o (IA) según la presente invención, en combinación con un oligonucleótido antisentido (AO por sus siglas en ingles) que es específico para una secuencia de corte y empalme de uno o más exones del gen DMD, por ejemplo exón 23, 45, 44, 50, 51, 52 y/o 53 del gen DMD. AOs preferidos incluyen, pero no se limitan a, AO que se dirigen al exón 23 DMD, 50 y/o 51 del gen DMD, tal como AOs 2'-O-metil (2'0Me) fosforotioato o morfolino fosforodiamidato (PMO por sus siglas en ingles). Ejemplos de tales AOs incluyen, pero no se limitan a, Pro051/GSK2402968, AVI4658/Eteplirsen, y PMO E23 morfolino (5'-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3').
El término una "cantidad eficaz", "cantidad suficiente" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente tal y como se usa en la presente memoria indistintamente, es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos y, como tal, una "cantidad eficaz" o sus variantes depende del contexto en el que se está aplicando. La respuesta es, en algunas realizaciones, preventiva, en otra terapéutica y en otras una combinación de éstas. El término "cantidad eficaz" también incluye la cantidad de un compuesto de la invención, que es "terapéuticamente eficaz" y que evita o atenúa sustancialmente efectos secundarios no deseables.
Tal y como se usa en la presente memoria y como se entiende bien en la téenica, "tratamiento" es una estrategia para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no están limitados a, alivio o mejora de uno o más síntomas o afecciones, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado de la enfermedad (es decir, sin empeoramiento), prevención de la diseminación de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia comparado con la supervivencia esperada si no se recibiera tratamiento.
Composiciones Farmacéuticas Los compuestos de la invención se formulan en composiciones farmacéuticas para la administración a sujetos humanos en una forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo. Según otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende compuestos de la invención mezclados con un diluyente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable es preferiblemente "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y no perjudicial para el receptor de ésta.
El compuesto puede administrarse solo, pero se administra preferiblemente con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. El vehículo farmacéuticamente aceptable empleado en la presente memoria puede seleccionarse de varios materiales orgánicos o inorgánicos que se usan como materiales para formulaciones farmacéuticas y que se incorporan como uno cualquiera o más de materiales de relleno, diluyentes, aglutinantes, disgregantes, tampones, colorantes, emulsionantes, agentes que mejoran el sabor, gelificantes, deslizantes, conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes de suspensión, edulcorantes, agentes de tonicidad, agentes humectantes, emulsionantes, agentes de dispersión, agentes expansores, retardantes, lubricantes, absorbentes y agentes que incrementan la viscosidad.
Los compuestos de la presente invención se administran a un sujeto humano o animal por procedimientos conocidos incluyendo, sin limitación, administración oral, sublingual, bucal, parenteral (intravenosa, intramuscular o subcutánea), transdérmica, per o trans-cutánea, intranasal, intra-vaginal, rectal, ocular y respiratoria (mediante inhalación). Los compuestos de la invención también pueden administrarse al sujeto mediante la administración a los músculos del sujeto incluyendo, pero no limitado a, los músculos cardiacos o esqueléticos del sujeto. En una realización, el compuesto se administra al sujeto mediante la administración dirigida a las células del músculo cardiaco a través de un catéter insertado en el corazón del sujeto. En otras realizaciones, los compuestos pueden administrarse directamente en el SNC, por ejemplo por inyección intralumbar o infusión intraventricular de los compuestos directamente en el fluido cerebroespinal (CSF por sus siglas en ingles) o por administración intraventricular intratecal o intersticial. La administración oral es la que se prefiere actualmente.
Las composiciones farmacéuticas según la invención para administración oral sólida incluyen especialmente comprimidos o grageas, comprimidos sublinguales, sobres, cápsulas incluyendo cápsulas de gelatina, polvos y gránulos y aquellas para administración liquida oral, nasal, bucal u ocular incluyen especialmente emulsiones, disoluciones, suspensiones, gotas, jarabes y aerosoles. Los compuestos también pueden administrarse como una suspensión o disolución mediante agua de bebida o con la comida. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, derivados de celulosa incluyendo carboximetil celulosa, metil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etil celulosa y celulosa microcristalina; azúcares tales como manitol, sacarosa o lactosa; glicerina, goma arábiga, estearato de magnesio, estearil fumarato de sodio, disolución salina, alginato de sodio, almidón, talco y agua, entre otros.
Las composiciones farmacéuticas según la invención para inyecciones parenterales incluyen especialmente disoluciones estériles, que pueden ser acuosas o no acuosas, dispersiones, suspensiones o emulsiones y también polvos estériles para la reconstitución de disoluciones o dispersiones inyectables.
Los compuestos de la invención pueden combinarse con una disolución acuosa estéril que es isotónica con la sangre del sujeto. Dicha formulación se prepara disolviendo un ingrediente sólido activo en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles, tales como cloruro de sodio, glicina y semejantes, y que tiene un pH tamponado compatible con las condiciones fisiológicas, de manera que se produce una disolución acuosa, y volviendo dicha disolución estéril. La formulación se presenta en contenedores de una o múltiples dosis, tales como ampollas o viales sellados. La formulación se administra por cualquier modo de inyección, incluyendo, sin limitación, epifascial, intracapsular, intracraneal, intracutánea, intratecal, intramuscular, intraorbital, intraperitoneal, intraespinal, intraesternal, intravascular, intravenosa, parenquimatosa, subcutánea o sublingual o mediante un catéter en el corazón del sujeto.
Las composiciones farmacéuticas para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios, y aquellas para administración per o trans cutánea incluyen especialmente polvos, aerosoles, cremas, pomadas, geles y parches.
Para la administración transdérmica, los compuestos de la invención se combinan con potenciadores de la penetración cutánea, tales como propilen glicol, polietilen ylicol, isopropanol, etanol, ácido oleico, N-metilpirrolidona y semejantes, que incrementan la permeabilidad de la piel a los compuestos de la invención y permiten que I03 compuestos penetren a través de la piel y en la corriente sanguínea. Las composiciones de compuesto/potenciador también pueden combinarse además con una sustancia polimérica, tal como etilcelulosa, hidroxipropil celulosa, etilen/vinilacetato, polivinil pirrolidona y semejantes, para proporcionar la composición en forma de gel, que se disuelve en un disolvente, se evapora hasta la viscosidad deseada y se aplica en un material de soporte para proporcionar un parche.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención se preparan por métodos muy conocidos en las téenicas farmacéuticas, incluyendo pero no limitado a métodos de granulación húmeda y seca, o por compresión directa. La elección del vehículo se determina por la solubilidad y naturaleza química de los compuestos, ruta elegida de administración y práctica farmacéutica estándar.
Las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente ilustran la invención pero no la limitan de ninguna forma.
Según los métodos de la presente invención, cualquiera de estos compuestos puede administrarse al sujeto (o se pone en contacto con las células del sujeto) en una cantidad eficaz para limitar o prevenir una disminución en el nivel de calstabina unida a RyR en el sujeto, particularmente en las células del sujeto. Esta cantidad la determina fácilmente el experto en la téenica, tomando como base procedimientos conocidos, incluyendo el análisis de las curvas de titulación establecidas in vivo y los métodos y ensayos descritos en la presente memoria. Una cantidad adecuada de los compuestos de la invención eficaz para limitar o prevenir una disminución en el nivel de calstabina unida a RyR en el sujeto varía de aproximadamente 0.01 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día (por ejemplo, 1, 2, 5, 10, 20, 25, 50 ó 100 mg/kg/día) y/o es una cantidad suficiente para conseguir niveles plasmáticos que varían de aproximadamente 300 ng/ml a aproximadamente 5.000 ng/ml. Alternativamente, la cantidad de los compuestos de la invención varía de aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 50 mg/kg/día. Alternativamente, la cantidad de los compuestos de la invención varía de aproximadamente 10 mg/kg/día a aproximadamente 20 mg/kg/día. También se incluyen cantidades que pueden administrarse de aproximadamente 0.01 mg/kg/día ó 0.05 mg/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día o aproximadamente 10 mg/kg/día.
Métodos de Síntesis La presente invención proporciona, en un aspecto adicional, procesos para la preparación de un compuesto de la invención y sales de éste. Más particularmente, la presente invención proporciona procesos para la preparación de compuestos de Fórmula (I) o (IA), por ejemplo, compuesto 1, compuesto 2, compuesto 3, compuesto 4, compuesto 5, compuesto 6, compuesto 7, compuesto 8, compuesto 9, compuesto 10, compuesto 11 y compuesto 12 o sales de éstos. Las distintas rutas sintéticas hacia los compuestos se describen en los ejemplos. La ruta general de síntesis (ROS por sus siglas en ingles) se muestra en el Esquema 1 siguiente : Esquema 1 En el esquema 1, Ra es COOR1 o CN; R1 es un alquilo C1-C4, y L es un grupo saliente, que es, como ejemplo, un halógeno, un sulfonato (OSC^R1 en el que R' es alquilo o arilo, por ejemplo, OMs (mesilato), OTs (tosilato)) y semejantes. El material de partida amina se hace reaccionar con el agente alquilante (derivado de bencilo mostrado anteriormente), preferiblemente en presencia de una base, para rendir el compuesto deseado o un precursor de éste (R = Ra). Si se desea, dicho precursor puede hacerse reaccionar adicionalmente para convertir el grupo Ra en el grupo R como se ejemplifica más adelante en la sección experimental de la presente memoria o por cualquier otro método conocido para un experto en la téenica. Por ejemplo, un precursor éster (Ra = COOR1 en el que R1 es un alquilo Ci~C4), puede convertirse en el ácido carboxilico correspondiente (R = COOH) por hidrólisis en condiciones ácidas o básicas según métodos conocidos. Alternativamente, un precursor nitrilo (Ra = CN) puede convertirse en un tetrazol (un isóstero de ácido carboxilico) por reacción con azida sódica en condiciones adecuadas o en un ácido carboxilico (R = COOH) por hidrólisis.
El material de partida amina puede prepararse según los métodos descritos en WO 2009/111463 o WO 2007/024717 o por cualquier otro método conocido para un experto en la técnica. Los contenidos de todas las referencias mencionadas anteriormente se incorporan por referencia en la presente memoria. La naturaleza de la base no es particularmente limitante. Las bases preferidas incluyen, pero no están limitadas a, hidruros (por ejemplo hidruro de sodio o de potasio) y N,N-diisopropiletilamina. Otras bases adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, una base orgánica tal como una amina terciaria, seleccionada del grupo que consiste en aminas acielicas (por ejemplo, trimetilamina, trietilamina, dimetilfenilamina, diisopropiletilamina y tributilamina), aminas cíclicas (por ejemplo, N-metilmorfolina) y aminas aromáticas (di etilanilina, dimetilaminopiridina y piridina) .
La reacción puede llevarse a cabo en presencia o ausencia de un disolvente. La naturaleza del disolvente, cuando se usa, no es particularmente limitante, incluyendo los ejemplos disolventes tales como un áster (por ejemplo, acetato de etilo), un éter (por ejemplo, THF), un disolvente clorado (por ejemplo, diclorometano o cloroformo), dimetilformamida (DMF por sus siglas en ingles) y otros disolventes tales como acetonitrilo o tolueno o mezclas de estos disolventes entre si o con agua.
Las sales de los compuestos de fórmula (I) en la que R= COOH pueden prepararse haciendo reaccionar la molécula parental con una base adecuada, por ejemplo, NaOH o KOH para rendir las sales de metal alcalino correspondientes, por ejemplo, las sales de sodio o de potasio. Alternativamente, los ásteres (R= COOR1) pueden convertirse directamente en sales por reacciones con bases adecuadas.
Las sales de compuestos de fórmula (I) también se pueden preparar haciendo reaccionar la molécula parental con un ácido adecuado, por ejemplo, HCl, ácido fumárico o ácido para-toluenosulfónico para proporcionar las sales correspondientes, por ejemplo, hidrocloruro, tosilato o hemi-fumarato .
EJEMPLOS Los ejemplos siguientes se proporcionan como ilustraciones de algunas realizaciones preferidas según la invención .
EJEMPLO 1: Síntesis Instrumentos : RMN: Bruker AVANCE III 400 o Varían Mercury 300 LC/MS: Waters Delta 600 equipado con Automuestreador 717Plus, Detector con Foto Diodos en Serie 2996, y Detector de Masa 3100 o Shimadzu 210 Procedimiento general para la alquilación de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo [f][1,4]tiazepina ("Amina").
Amina La amina (estructura mostrada anteriormente) (1 mxnol) se disolvió en 3 mi de diclorometano. A la disolución se añadió reactivo de alquilación (1 ol), seguido de N,N- diisopropiletilamina (0,34 mi, 2 m oles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La disolución se cargó en una columna directamente y se eluyó con hexano/EtOAc (2:1, v/v).
Compuesto 2 3-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzoato de metilo: XHRMN (300 MHz, CDCI3): 7.96 (m, 2H), 7.46 (m, 3H), 6.70 (dd, J= 8.4 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.09 (s, 2H) , 3,90 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.35 (m, 2H), 2.72 (m, 2H) MS: 344 (M+l) Compuesto 3 4- ((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzoato de metilo: 1HRMN (300 MHz, CDCI3): 7.99 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.46 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.37 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.70 (dd, J= 8.4 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.09 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.35 (m, 2H), 2.72 (m, 2H). MS: 344(M+l) Compuesto 5 2- ( ( 7-Metoxi-2 , 3-dihidrobenzo [ f ] [1 , 4 ] tiazepin-4 ( 5H) - il)metil)benzoato de metilo: El compuesto se convirtió en sal hidrocloruro con 2M HCI en éter.1HRMN (300 MHz, DMSO- d6): 10.33 (br, 1H), 8.08 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.80-7.65 (m, 3H), 7.51 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.99 (dd, J= 8.4, 2.1 Hz, 1H), 4.90-4.40 (m, br, 4H), 3.88 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.40 (m, 2H), 3.26 (m, 1H), 3.11 (, 1H). MS: 344(M+l) Compuesto 7 2- ((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)- il)metil)benzonitrilo: 1HRMN (300 MHz, CDCl3): 7.67-7.26 (m, 5H) , 6.73 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 6.74 (dd, J= 2.7, 8.4 Hz, 1H), 4.14 (s, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.70 (s, 2H), 3.36 (m, 2H) , 2.76 (m, 2H). MS: 311 (M+l) Compuesto 8 3-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)- il)metil)benzonitrilo: 1IIRMN (300 MHz, CDCl3): 7.64-7.42 (m, 5H), 6.74 (dd, J= 2.7, 8.4 Hz, 1H), 6.48 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H). MS: 311 (M+l) Compuesto 9 4-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)- il)metil)benzonitrilo: 1HRMN (300 MHz, CDC13): 7.64 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.42 (m, 3H), 6.74 (dd, J= 2.7, 8.4 Hz, 1H), 6.48 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H). MS: 311 (M+l) Hidrólisis del éster (procedimiento general) El éster de metilo (3 mmoles) se disolvió en 30 i de THE/metanol/1 M NaOH (1:1:1, v/v). La mezcla se agitó durante 8 horas y la TLC mostró la desaparición completa del éster. Se añadió 1 mi de HCl Conc. Para ajustar a pH ácido. El disolvente orgánico se eliminó y el sólido formado se recogió por filtración. El sólido se secó al aire .
Compuesto 4 Ácido 3-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)~ il)metil)benzoico: Éste se obtuvo por extracción con EtOAc como disolvente.1HRMN (300 MHz, CDCl3): 8.10 (s, 1H), 8.04 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.80 (br, 1H), 7.46 (m, 2H), 6.80 (m, 2H), 4.40 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.76 (s, 3H), 3.42 (s, 2H) , 2.86 (s, 2H). MS: 330 (M+l), 328 (M-l).
Compuesto 1 Ácido 4-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il )metil)benzoico: Éste se obtuvo por extracción con EtOAc como disolvente.1HRMN (300 MHz, CDC13): 8.02 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.46 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.42 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 6.70 (dd, J= 8.4 Hz, 3.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J= 3.0 Hz, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.62 (s, 2H), 3.35 (m, 2H), 2.76 (m, 2H). MS: 330 (M+l), 328 (M-l).
Compuesto 1, sal de sodio La sal de sodio del compuesto 1 se preparó a partir de la molécula parental usando un equivalente de NaOH en EtOH (p. f. de la sal: > 290°C). 1HRMN (DMSO-D6, 600MHz), d (ppm): 7.77 (2H, m), 7.41 (1H, d), 7.13 (2H, m), 6.75 (1H, dd), 6.63 (1H, d), 4.00 (2H, s), 3.70 (3H, s), 3.49 (2H, s), 3.18 (2H, m), 2.70 (2H, m).
Compuesto 1, sal hemifu arato: 1.6 g de compuesto 1 (forma neutra) y 265 g de ácido fumárico se introdujeron en un matraz de fondo redondo.
Después de añadir 18 mi de acetona y 2 mi de agua, la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo. Se observó una solubilización parcial (pero no una clarificación completa) seguida de precipitación. A continuación la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo toda la noche, Después de enfriar el sólido resultante se aisló por filtración, se lavó con 3 mi de acetona y se secó a vacio (40°C / 10 mbars) durante 4 horas. 1HRMN (DMSO-D6, 600MHz), d (ppm) : 12.97 (2H, bs), 7.90 (2H, m), 7.43 (1H, d), 7.40 (2H, m), 6.77 (1H, dd), 6.64 (1H, d), 6.62 (1H, s), 4.03 (2H, s), 3.70(3H, s), 3.58 (2H s), 3.20 (2H, m), 2.72 (2H, m).
Compuesto 6 Ácido 2-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzoico: El compuesto se convirtió en sal hidrocloruro con 2M HCl en éter. 1HRMN (300 MHz, DMSO-dg): 10.10 (br, 1H), 8.08 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.66-7.51 (m, 4H), 7.17 (d, J= 2.1 Hz, 1H), 6.99 (dd, J= 8.4, 2.1 Hz, 1H), 4.80-4.40 (m, br, 4H), 3.78 (s, 3H), 3.46 (m, 2H), 3.13 (m, 2H). MS: 330 (M+l), 328 (M-l).
Síntesis de tetrazol (procedimiento general) Se agitaron el precursor nitrilo (3.22 mmoles), azida sódica (830 mg, 12.9 mmoles) e hidrocloruro de trietilamina (1.72 g, 12.9 mmoles) en 40 mi de DMF anhidra a 100°C durante 5 días. La DMF se eliminó en vacío alto y el residuo se mezcló con agua. La disolución en agua se extrajo con diclorometano (3 x 100 mi). El compuesto puro se purificó por cromatografía en columna (EtOAc/ etanol).
Compuesto 10 4- (2-(1H-Tetrazol-5-il)bencil)-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo [f][1,4]tiazepina: ^R N (300 MHz, CDC13 y una gota de CD30D): 8.30 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.53 (m, 2H), 7.14 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 7.20 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 6.84 (dd, J= 2.7, 8.4 Hz, 1H), 6.69 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.43 (m, 2H), 2.96 (m, 2H). MS: 354 (M+l), 352 (M-l).
Compuesto 11 4-(3-(1H-Tetrazol-5-il)bencil-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo [f][1,4]tiazepina: 1HRMN (300 MHz, CDC13) 8.16 (s, 1H), 7.90 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.40 (t, J= 8.4 Hz 1H), 7.20 (m, 2H), 6.74 (dd, J= 2.7, 8.4 Hz, 1H), 6.58 (d J= 2.7 Hz, 1H), 4.18 (s, 2H), 3.75 (s, 5H), 3.36 (m, 2H) 2.76 (m, 2H). MS: 354 (M+l), 352 (M-l).
Compuesto 12 4- (4-(lH-Tetrazol-5-il)bencil)-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo [f][1,4]tiazepina: 1HRMN (300 MHz, CDC13 y una gota de CD30D): 7.99 (d, J= 7.2 Hz, 2H), 7.42 (m, 3H), 6.74 (dd, J= 2.7, 8.4 Hz, 1H), 6.53 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 4.10 (s, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 3.36 (m, 2H), 2.76 (m, 2H). MS: 354 (M+l), 352 (M-l).
Síntesis de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo [f][1,4]tiazepina ("Amina") 2-(4-Metoxifenilfcio)etanamina (1) 4-Metoxitiofenol (50 g, 0.357 mol), monohidrocloruro de 2-cloroetilamina (39.8 g, 0.343 ol.), K2CO3( 78.8 g, 0.57 mol) y diisopropil etilamina (32 ml, 0.178 mol) se mezclaron en 200 ml de THF. La mezcla se desgasificó durante 5 min. A presión reducida y se mantuvo a reflujo bajo argón toda la noche. Se eliminó el disolvente y se añadió agua (300 mL) al matraz. La mezcla se extrajo con diclorometano (3 x 200 ml). Los extractos orgánicos se recogieron, se eliminó el diclorometano y se añadieron 50 ml de HCl conc., seguido de 200 ml de agua. La disolución se extrajo con EtOAc/hexano 1:1 (3 x 200 ml). La capa acuosa se ajustó a pH 10 con NaOH 2M, y se extrajo con diclorometano (3 x 200 ml). La disolución orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La eliminación del disolvente proporcionó 61 g del compuesto diana como un liquido incoloro, con un rendimiento de 97%. 1H-R N (300 MHz, CDCl3): 7.35(d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.81 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 3.77 (s, 3H), 2.88-2.80 (m, 4H), 1.44 (s, 2H). 2-(4-metoxifeniltio)etilcarbamato de bencilo (2) Primer método Al matraz que contiene el compuesto 1 (8.0 g, 43.7 mmol), bicarbonato de sodio (12.1 g, 144 mmol), agua (100 ml) y diclorometano (200 ml) se añadió cloroformato de bencilo (8.2 g, 48.1 mmol, diluido en 100 mi de diclorometano) gota a gota a 0 °C. Después de la adición, la mezcla se agitó a t.a. durante 5 h. La capa orgánica se recogió y se extrajo la disolución acuosa con 100 mi de diclorometano. La disolución orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio. El disolvente se eliminó y el sólido resultante se trituró con 200 mi de THF/hexano (1:10). El sólido se recogió y se secó dejando el producto diana (12.9 g) en el rendimiento de 93%.
Método alternativo A la disolución del compuesto 1 (10 g, 54.6 mmol) y trietilamina (15 mi, 106 mmol) en 200 mi de diclorometano se añadió cloroformato de bencilo (7.24 mi, 51.5 mmol, diluido en 100 i de diclorometano) gota a gota a 0°C. Después de la adición, la disolución se agitó a t.a. durante una hora. El sólido se eliminó por filtración. La disolución se extrajo con 100 mi de HCl 0.1 M y 100 mi de carbonato de sodio sat., y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La eliminación del disolvente proporcionó un sólido blanco que se agitó en 200 mi de THF/hexano (1:20) durante tres horas. El sólido se recogió por filtración para dar 14.2 g del compuesto diana con 87% de rendimiento. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): 7.35 (m, 7H), 6.83 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 5.07 (m, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.10 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 2.92 (t, J= 6.3 Hz, 2H). 7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-carboxilato de bencilo (3) Una mezcla del compuesto 2 (7.3 g, 23 mmol), paraformaldehido (6.9 g 0.23 mol) y ácido p-toluenosulfónico (1.45 g, 7.6 mmol) en 250 mi de tolueno se agitó a 70° C toda la noche. Después de enfriar a t.a., el sólido se separó por filtración. La disolución se extrajo con carbonato de sodio sat. (100 mi), y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Se obtuvo el producto diana (7.4 g) como un liquido después de la eliminación del disolvente con 97% de rendimiento. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): 7.44 (d, J= 8.1 Hz, 0.77H), 7.32 (m, 5.60H), 7.07 (d, J= 2.7 Hz, 0.33H), 6.68 (m, 1.30H), 5.04 (s, 2H), 4.59 (ss, 2H), 3.96 (br, 1.80), 3.80 (ss, 1.23 H), 3,55 (s, 1.97H), 2.76 (m, 2H).
Hidrobromuro de 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo [f][1,4]tiazepina (Amina) (sal 4 HBr) Primer método Una disolución de HBr (33% en ácido acético, 10 mi) se añadió al compuesto 3 (4.2 g, 12.8 mmol). Después de la adición, empezó a desarrollarse dióxido de carbono y se formó un sólido blanco. La mezcla se dejó permanecer a t.a. durante otras 2 horas. Se añadió éter dietilico (150 mi) a la mezcla, y se agitó durante 30 min. El sólido se recogió por filtración y se lavó con éter dietilico. El sólido se secó a vacío para proporcionar los 3.40 g de compuesto diana con el rendimiento de 91.8%. 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): 9.02 (br, 2H), 7.52 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.27 (d, J= 3.3 Hz, 1H), 6.92 (dd, J= 8.4, 2.7 Hz, 1H), 4.41 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.53 (m, 2H), 2.96 (m, 2H).
Método alternativo (base libre 4a) El compuesto 3 (10 g, 30 m ol) se mezcló con 50 mi de HCl conc., 50 mi de agua y 30 mi de dioxano. La mezcla se agitó a 100°C toda la noche. Después de enfriar a t.a., la mayoría del disolvente y HC1 se eliminaron a presión reducida. Se añadió agua (100 mi) a la disolución y el sólido se separó por filtración. La disolución acuosa se extrajo con EtOAc/hexano (1:1, 3 xlOO mi) y se basificó añadiendo 15 g de NaOH. La mezcla se extrajo con diclorometano (3 x 150 mL). La disolución combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La eliminación del disolvente proporcionó un líquido que solidificó después de permanecer a t.a. dejando 6.2 g del compuesto diana. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3): 7.42 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 6.78 (d, J= 2.7 Hz, H), 6.68 (dd, J= 2.7, 8.1 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.96 (br, 1.80), 3.76 (s, 3 H), 3.38 (m, 2H), 2.68 (m, 2H). EJEMPLO 2: Unión de calstab±na2 a RyR2 fosforilado por PKA Se prepararon membranas de SR cardiaco como se ha descrito previamente (Marx et al., 2000; Kaftan et al., Ciro. Res., 1996, 78: 990-97). Se realizó inmunotransferencia de los microsomas (50 mV) como se ha descrito, con anticuerpo anti-calstabina (1:1.000) (Jayaraman et al., J. Biol . Chem. , 1992, 267: 9474-77) durante 1 hr a temperatura ambiente (Reiken et al., Circulation, 107: 2459-66, 2003). Después de incubar con IgG anti-conejo marcada con HRP (dilución 1:5.000; Transduction Laboratories, Lexington, Ky.), las transferencias se desarrollaron usando ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.) y se detectaron en película de rayos X o se expusieron a anticuerpos secundarios marcados con marcador infrarrojo y se visualizaron en un equipo de Li-Cor Biosciences (modelo Odysscy). A no ser que se indique otra cosa, los compuestos se ensayaron a una concentración de 100 nM. Un ensayo de unión de calstabina2 representativo se presenta más adelante.
A. Fosforilación por PKA de retículo sarcoplásmico cardiaco (CSR) Se preparó una mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi. Se añadieron 200 mg de SR cardiaco a una mezcla de reacción de tampón quinasa, PKA y ATP hasta un volumen final de 100 ml (Mezcla de reacción más adelante). El ATP se añadió el último para iniciar la reacción.
Mezcla de reacción: 20 m1= Muestra (SR cardiaco, 2 ó 10 mV/ml) 10 m1= 10x Tampón quinasa (80 mM MgCl2, 100 mM EGTA, 500 mM Tris/PIPES) , pH= 7.0 20 m1= PKA (2 unidades/ml) (Sigma # P2645) 10 m1= IOc ATP (1.0 mM) (Sigma # A 9187) 40 m1= H2O destilada 1. Los tubos se incubaron a 30°C durante 30 minutos . 2. La mezcla de reacción se transfirió a tubos de vidrio de pared gruesa de 0,5 mi. 3. Los tubos de vidrio que contenían la mezcla de reacción se centrifugaron durante 10 min a 50.000xg en una Centrífuga Sorvall RCM120EX usando un rotor S120AT3. La centrifugación a 50.000 x g durante 10 min es suficiente para aislar los microso as. 4. El sedimento resultante se lavó 4 veces con tampón de unión (10 mM Imidazol, 300 mM Sacarosa, pH= 7.4).
Cada vez, se añadieron 100 m? de lx tampón de unión al tubo para lavar el sedimento. El sedimento se resuspendió lavando con movimientos ascendentes y descendentes usando la punta de una pipeta. Después de la última centrifugación, se añadieron 50 m? de tampón de unión y los sedimentos de todos los tubos se combinaron. La reacción se almacenó a -20°C. 5. La fosforilación se confirmó separando aproximadamente 10 mg de CSR por electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% (PAGE) y analizando las inmunotransferencias tanto para RyR total (Ab 5029, dilución 1:3.000 o Ab monoclonal de Affinity Bioreagents, Cat # MA3-916, dilución 1:2.000) como para RyR2 fosforilado por PKA (Ab P2809, dilución 1:10.000). 6. Las alícuotas pueden almacenarse a -80°C.
B . Ensayo de Re-unión de Calstabina 1. Se incubó CSR fosforilado por PKA (aproximadamente 20 mg) con 250 nM Calstabina2 en 100 ml de tampón de unión (como se ha descrito anteriormente) con o sin los compuestos. 2. La reacción se preparó en un tubo de vidrio de pared gruesa de 0.5 mi (producto de Hitachi Centrifuge, Catálogo # B4105). 3. Se añadió calstabina2 como el último reactivo en la mezcla de reacción. La reacción se realizó a temperatura ambiente durante 30 min. 4. Después de la reacción, los tubos se centrifugaron durante 10 min a 100.000 g. (Centrifuga Sorvall RCM120EX con un rotor S120AT3). 5. El sedimento resultante se lavó 4 veces en lx tampón de unión a 4°C. Después de cada lavado, los tubos se centrifugaron a 50.000 g durante 10 min a 4°C. 6. Después del lavado final, el sobrenadante se desechó. 7. Se añadieron 20 ml de tampón de muestra (2x) [6x tampón de muestra descrito más adelante] y el sedimento se resuspendió con la punta y/o por agitación breve con agitador vórtex. La suspensión se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi. 8. Los tubos se calentaron a 90°C durante 4 min. 9. Las proteínas se separaron usando 15% SDS/PAGE. 10. La unión de calstabina2 se detectó con anticuerpo primario aFKBP (Jayaraman et al., J. Biol . Chem. 1992; 267: 9474-77, 1:2.000) y un anticuerpo secundario apropiado. 6x Tampón de Muestra 7.0 mi 4x Tris-HCl/SDS, pH 6.8 3.0 mi glicerol (30% concentración final) 1.0 g SDS (10% concentración final) 0.93 g DTT (0.6 M final) 1 g Azul de bromofenol (0.001% concentración final) Agua destilada hasta 10 mi de volumen final Almacenar en alícuotas de 1 mi a -70°C.
Resultados: La Figura 1A representa una inmunotransferencia con anticuerpo frente a calstabina2 que muestra la unión de calstabina2 a RyR2 fosforilado por PKA en ausencia (-) o presencia de 100 nM de compuesto 1. (+): Unión de calstabina a RyR2 no fosforilado por PKA, S36, una benzotiazepina descrita en US 7.544.678, se usó como control. Como se muestra, el compuesto 1, a una concentración de 100 nM, evitó la disociación de calstabina2 de RyR2 fosforilado por PKA y/o aumentó la (re)unión de calstabina2 a RyR fosforilado por PKA.
Como se muestra en la Figura IB, también se encontró que los compuestos representativos siguientes evitan la disociación de calstabina2 de RyR2 fosforilado por PKA y/o aumentan la (re)unión de calstabina2 a RyR2 fosforilado por PKA cuando se ensayan en el ensayo de re-unión de calstabina2 mencionado anteriormente a 100 nM: compuesto 2, compuesto 3 y compuesto 4.
EJEMPLO 3: Unión de calstabinal a RyRl fosforilado por PKA Se prepararon membranas de SR de músculo esquelético de una manera similar al Ejemplo 2 y como se describe adicionalmente en la publicación de solicitud de patente US No.2004/0224368, cuyos contenidos se incorporan por referencia en la presente memoria. Se realizó la inmunotransferencia de los microsomas (50 pg) como se ha descrito, con anticuerpo anti-calstabinal (Zymed) (1:1.000). Las transferencias se desarrollaron y cuantificaron como se ha descrilo en el Ejemplo 2.
La Figura 1C representa una inmunotransferencia con anticuerpo frente a calstabinal que muestra la unión de calstabinal a RyRl fosforilado por PKA en ausencia (Neg) o presencia de las concentraciones indicadas del compuesto 1 o el compuesto 4. (Pos): unión de calstabina a RyRl no fosforilado por PKA. S36 se usa como control. Como se muestra, el compuesto 1 y el compuesto 4 evitaron la disociación de calstabinal de RyRl fosforilado por PKA y/o aumentaron la (re)unión de calstabinal a RyRl fosforilado por PKA de manera dependiente de la dosis, con una CE50 estimada de aproximadamente 100 nM y 150 nM, respectivamente.
EJEMPLO 4: Re-unión de Calstabinal a RyRl en Ratones Tratados con Isoproterenol El isoproterenol, un agonista del receptor beta adrenérgico, induce fallo cardiaco en ratones a través de la sobreestimulación del receptor beta adrenérgico. Simultáneamente a esto, se produce la activación de PKA, la fosforilación del RyR2 en el SR y la interacción disminuida de calstabina2 (FKBP12.6) con RyR2. Una cascada de eventos similar ocurre en el músculo esquelético, en el que RyRl se fosforila, dando lugar a una unión disminuida de calstabinal (FKBP12) a RyRl.
Como se describe con detalle en la publicación internacional no. W02008/064264 , cuyos contenidos se incorporan por referencia en la presente memoria, el tratamiento crónico con isoproterenol de un ratón de tipo salvaje ofrece un método rápido y fiable para inducir cambios en la bioquímica de RyR que podrían cuantificarse fácilmente. Estos cambios incluyen una fosforilación incrementada de RyR y una unión disminuida de calstabina concomitante .
Animales y Reactivos Los ratones C57B1/6 se mantuvieron y estudiaron según protocolos aprobados. El agonista beta-adrenérgico sintético, isoproterenol (ISO por sus siglas en ingles) se obtuvo de Sigma (165627) y se preparó como una disolución madre de 100 mg/ml en agua. El tampón de lisis se preparó añadiendo sacarosa (1 mM), ditiotreitol (320 M) y 1 comprimido de inhibidor de proteasa (10X) a 10 mi de disolución madre (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 M NaF, 2 mM Na3V04).
Preparación de la Bomba Osmótica e Implante Quirúrgico Se infundió a los ratones continuamente durante cinco días 10 mg/ml de isoproterenol (1 ml/hr) mediante una bomba de infusión osmótica implantada subcutáneamente (mini bomba osmótica Alzet, Modelo 2001, Durect Corporation, Cupertino, CA).
Para la carga del fármaco, la bomba osmótica se mantuvo verticalmente y se inyectaron 200 ml de disolución de fármaco en la bomba a través de una jeringa de 1 mi (unida a una cánula) que contenia un exceso de disolución del fármaco (~ 250-300 ml). La disolución del fármaco se inyectó lentamente hacia abajo, mientras la jeringa se subía lentamente, hasta que la bomba estuvo colmada. El sobrante del fluido desplazado después de tapar la bomba confirmó que la bomba se había llenado apropiadamente.
Las bombas osmóticas cargadas se implantaron subcutáneamente mediante las etapas siguientes. El ratón receptor se anestesió con 1.5-2% isoflurano en 02 administrado a 0.6 L/min y su peso se midió y registró. El ratón se puso boca abajo en espuma de poliestireno, con su cara en el cono de la nariz. El pelo se recortó en la parte posterior del cuello, extendiéndolo por detrás de las orejas hasta la parte superior de la cabeza. El área se limpió suavemente con alcohol al 70% y se hizo una pequeña incisión en la línea media en la nuca de la cabeza/cuello. Se frotó con alcohol un soporte de sutura, se insertó en el corte y se abrió para liberar la piel del tejido subyacente. Para acomodar la bomba, esta apertura se extendió hacia atrás hacia los cuartos traseros. La bomba cargada se insertó en la apertura, con su sitio de liberación situado lejos de la incisión, y se dejó que se fijara por debajo de la piel con una tensión mínima. La incisión se cerró con sutura de nilón 5.0, que requirió aproximadamente 5-6 suturas y el área se limpió suavemente con alcohol al 70%. Después de la cirugía, los ratones se pusieron en jaulas individuales para minimizar el daño y posible activación del sistema nervioso simpático.
Aislamiento del Músculo Esquelético El tejido de músculo esquelético de ratón se aisló como sigue. Los músculos de las patas se expusieron cortando la piel en el tobillo y tirando hacia arriba. El tejido se mantuvo humedecido con ta pón de Tyrode (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.68 mM KC1, 0.42 mM Na2HP04, 1.7 mM MgCl2, 11.9 mM NaHCO3, 5 mM glucosa, 1.8 mM CaCl2, preparado añadiendo 20 mg de CaCl2 a 100 mi de IX tampón preparado a partir de una disolución 10X sin CaCl2). Los músculos siguientes se aislaron y congelaron en nitrógeno líquido. El extensor largo de los dedos (EDL por sus siglas en ingles) se aisló insertando las tijeras entre el tendón lateral y la X formada por los tendones EDL y tibiales, cortando hacia arriba hacia la rodilla; cortando el músculo fibular para exponer el tendón con forma de abanico del gastroenemio; insertando fórceps bajo la X y bajo el músculo para soltar el tendón EDL; cortando el tendón EDL y tirando del músculo; y finalmente dejando libre el EDL. El soleo se aisló eliminando el músculo fibular de la parte superior del gastroenemio; exponiendo el soleo en la parte inferior del gastrocnemio cortando y elevando el tendón de Aquiles; cortando el soleo en la parte superior del músculo por detrás de la rodilla; y finalmente tirando del soleo y cortándolo del músculo gastrocnemio. El tibial se aisló cortando el tendón tibial de la parte frontal del tobillo, tirando del tendón hacia arriba y cortándolo de la tibia. El vasto (músculo del muslo) se aisló de ambas patas, cortando el músculo justo por encima de la rodilla y extirpando el haz muscular. Las muestras se congelaron en nitrógeno liquido.
Inmunoprecipitación de RyRl de los Lisados de Tejido RyRl se inmunoprecipitó de las muestras incubando 200-500 mV de homogenado con 2 ml de anticuerpo anti-RyRl (Zymed) en 0.5 mi de un tampón RIPA modificado (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.9% NaCl, 5.0 mM NaF, 1.0 mM Na3V04, 0.5% Tritón-X100 e inhibidores de proteasas) a 4°C durante 1.5 hr. Las muestras se incubaron con lechos de sefarosa Proteína A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 4°C durante 1 hora, después de lo cual los lechos se lavaron tres veces con RIPA enfriado en hielo. Las muestras se calentaron hasta 95°C y se fraccionaron por tamaño por SDS-PAGE (15% SDS-PAGE para calstabina) . Las inmunotransferencias se desarrollaron usando un anticuerpo anti-FKBP (FKBP12/12.6, Jayaraman et al., J. Biol . Chem. 1992; 267: 9474-77) a una dilución 1:2.000. Los anticuerpos se diluyeron en leche 5% o TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween® 20, 0.5% Tritón X-100).
Resultados Se implantaron bombas osmóticas que contenían isoproterenol con o sin el compuesto de ensayo en ratones como se ha descrito anteriormente. Los ratones se perfundieron osmóticamente durante cinco días con vehículo solo (DMSO/PEG por sus siglas en ingles), isoproterenol solo (ISO por sus siglas en ingles) (0.5 mg/kg/hr) o una combinación de isoproterenol (0.5 mg/kg/hr) y compuesto 1 a las concentraciones indicadas. En el día 6, cada ratón se sacrificó y el tejido del músculo esquelético se aisló y se usó para analizar la unión de calstabinal en inmunoprecipitados de RyRl.
El efecto del compuesto 1 en el aumento de la unión de calstabinal a RyRl en músculo esquelético aislado de ratones tratados con isoproterenol se representa en las Figuras 2A (inmunotransferencia) y 2B (cuantificación gráfica). Como se muestra, el compuesto 1 aumentó los niveles de calstabinal unida a RyRl en membranas de músculo esquelético hasta un nivel similar al observado por la administración de 3.6 mM S36, otro derivado de benzotiazepina usado como control positivo (W02008/064264). Se obtuvieron resultados similares para el compuesto 4 (datos no mostrados).
EJEMPLO 5: Efecto del Compuesto 1 en un modelo de fallo cardiaco post-isquémico crónico en ratas Objetivo El objetivo de este estudio fue ensayar la capacidad del compuesto 1 para reducir la disfunción cardiaca y atenuar el remodelado ventricular en un modelo de fallo cardiaco inducido por isquemia-reperfusión.
Metodología El fallo cardiaco crónico se indujo en ratas macho wistar (224-240 g, 10-11 semanas de edad) por daño por isquemia-reperfusión (I/R). Para el protocolo de I/R, se ocluyó la arteria coronaria izquierda descendente anterior (LAD por sus siglas en ingles) durante 1 h. El tratamiento con el fármaco (5 mg/kg/d ó 10 mg/kg/d en el agua de bebida) se inició 1 semana después de la reperfusión y se mantuvo durante un periodo de estudio de 3 meses. La eficacia del compuesto 1 se evaluó por ecocardiografia en uno, dos o tres meses después de que empezara el tratamiento y por hemodinámicas invasivas a los 3 meses en comparación con animales tratados con vehículo y con operación simulada. Las muestras cardiacas también se analizaron para evaluar hipertrofia y contenido de colágeno. Se recogió sangre de cada rata en el día final del estudio para evaluar las concentraciones plasmáticas del fármaco como se muestra en la Figura 3. El diseño del estudio se representa en la Figura 3. Los experimentos se realizaron de manera ciega.
Metodos estadísticos Sobre los parámetros medidos en el tiempo, se analiza la comparación de Simulado frente a Vehículo y la comparación de los tratamientos con el fármaco por ANOVA de 2 vías con mediciones repetidas. Sobre los parámetros medidos en el sacrificio y la morfometría, se analizan las comparaciones de Simulado frente a Vehículo por ensayo de t y las comparaciones de los tratamientos con el fármaco por ANOVA de 1 vía seguido de ensayo de Dunnett.
Resultados Los animales I/R tratados con vehículo, comparados con los animales con operación simulada, mostraron volúmenes del ventrículo izquierdo (LV por sus siglas en ingles) sistólico final (LV ESV por sus siglas en ingles) y diastólico final (LV EDV por sus siglas en ingles) incrementados (Figuras 4A y 4B), función cardiaca deprimida según se mide por Fracción de Eyección (EF por sus siglas en ingles) disminuida (Figura 4C) y contenido de colágeno intersticial incrementado (Figura 5D). El compuesto 1, administrado a 5 y 10 mg/kg/d, incrementó significativamente EF, así como disminuyó tanto LVESV como LVEDV comparado con el vehículo, desde uno a tres meses (Figuras 4A-C), así como redujo el contenido de colágeno intersticial (Figura 5D).
El estudio hemodinámico invasivo (a los 3 meses) mostró una conservación de LV dP/dt max y LV dP/dt min en los animales tratados con el compuesto 1 a 5 y 10 mg/kg/d comparado con el vehículo (Figuras 6B y 6C), sin cambio estadísticamente significativo en la presión sistólica LV después del tratamiento (Figura 6A).
No se observaron efectos en el peso corporal (BW por sus siglas en ingles), tamaño del infarto o hipertrofia (peso LV) después del tratamiento (Figuras 5A-C). Las concentraciones plasmáticas del fármaco se representan en la Figura 7.
Los resultados muestran que el compuesto 1, a concentraciones tan bajas como 5 mg/kg/d, ejerce un efecto beneficioso tanto en la función cardiaca sistólica como diastólica en un modelo de fallo cardiaco post-isquémico crónico en ratas.
El compuesto 1 fue significativamente y sorprendentemente más activo en comparación con el compuesto A, un derivado de benzotiazepina relacionado estructuralmente descrito en WO 2007/024717. Como se muestra en la Figura 8, el compuesto A, administrado a una concentración de 5 mg/kg/d durante 3 meses, no mejoró la función cardiaca sistólica y diastólica cuando se compara con el compuesto 1 en el modelo de fallo cardiaco post isquémico crónico en la rata al final del estudio. Así, se observaron efectos beneficiosos del compuesto 1, pero no del compuesto A, a una dosis de 5 mg/kg/d después de 3 meses de tratamiento en el modelo CHF en ratas.
Compuesto A EJEMPLO 6: Efecto del Compuesto 1 en la función muscular en un modelo de distrofia muscular en ratones (dx) Objetivo El objetivo de este estudio fue ensayar si el tratamiento con el compuesto 1 mejora la función muscular en un modelo de deficiencia de distrofina en ratones (mdx) .
Metodología Se aclimataron ratones C51BL/10ScSn-DMåfdx/J (abreviado como mdx , n=5 por grupo) de 6 semanas y aproximadamente 20 gramos al inicio del estudio, en jaulas de rueda durante 6 días antes de la aleatorización en grupos que recibieron tratamiento bien con el vehículo (H2O) O dosis diana de 5 mg/kg/d, 10 mg/kg/d, o 50 mg/kg/d (dosis reales: 7.9 mg/kg/d; 12.8 mg/kg/d; y 61.5 mg/kg/d, respectivamente, determinados a partir del consumo medido de la disolución de fármaco dividido por el peso corporal) de la sal de sodio del compuesto 1 (tomando como base el peso del fármaco parental; la sal de sodio se refiere de aquí en adelante en la presente memoria en este Ejemplo como "compuesto 1") administrados en el agua de bebida ad libitum durante 4 semanas. Los ratones C57BL/6 de la misma edad (abreviados como WT, n=4 por grupo), se aleatorizaron en grupos que recibieron el tratamiento bien con el vehículo (H2O) o una dosis diana de 50 mg/kg/d (dosis real 67.7 mg/kg/d) de la sal de sodio del compuesto 1.
Se midió la actividad voluntaria en la rueda, el peso corporal, y el consumo medio de agua en las primeras 3 semanas. Se midió la fuerza específica del músculo después de 4 semanas de tratamiento, al final del estudio.
La distancia recorrida (Km/día) durante un periodo de 24 hr se analizó como un índice de actividad funcional mejorada (véase, DMD_M.2.1.002 SOP en http://www.treat.nmd.eu/). ? la finalización del estudio, se aisló el músculo extensor largo de los dedos (EDL por sus siglas en ingles) para el análisis de fuerza muscular como se describe adicionalmente más adelante en la presente memoria. Se recogió sangre de cada ratón por sangrados retro-orbitales al final del estudio (después del final de ciclo de oscuridad-aproximadamente 7AM) para evaluar las concentraciones plasmáticas del fármaco. Los experimentos fueron ciegos.
Mediciones de fuerza Al final del estudio, el músculo EDL se diseccionó de las extremidades posteriores para análisis de fuerza isométrica usando el Sistema de Ensayo Muscular 407A de Aurora Scientific (Aurora, Ontario, Canadá). Se ató una sutura 6-0 a cada tendón y el músculo EDL completo, tendón a tendón, se transfirió a un baño de Ragnoti de disolución de Tyrode con burbujeo de O2/CO2 (95%/5%) (en mM: NaCl 121, KC1 5.0, CaCl21,8, MgCl2, NaH2P04, NaHCO324 y glucosa 5.5). Usando las suturas, se ató un tendón verticalmente a un gancho de acero inoxidable conectado a un transductor de fuerza. El otro tendón suturado se fijó en un brazo movible en el sistema Aurora. El músculo EDL se estimuló para contraerse usando un campo eléctrico entre dos electrodos de platino. Al inicio de cada experimento, la longitud del músculo se ajustó para rendir la máxima fuerza. Se determinaron las relaciones fuerza-frecuencia desencadenando la contracción usando frecuencias de estimulación crecientes (5-250 Hz durante 200 ms a voltaje supraliminal). Entre las estimulaciones, se dejó que el músculo descansara ~ 3 min. Al final de la medición de la fuerza, se midió la longitud del músculo EDL (Lo) cuando estaba suturada en el sistema Aurora excluyendo los tendones. El músculo EDL se quitó del sistema y se pesó después de cortar los tendones finales y las suturas. El músculo EDL se congeló en nitrógeno liquido. El área transversal (mm2) del músculo EDL se calculó dividiendo el peso del músculo EDL por la longitud del músculo EDL y la constante de densidad muscular de mamíferos de 1.056 mg/mm3 (Yamada, T., et al., Arthritis and rheumatism 60: 3280-3289). Para determinar la fuerza específica de EDL (kN/m2), la fuerza tetánica absoluta se dividió por el área transversal del músculo EDL.
Metodos Estadísticos Para determinar la significancia estadística, se usó el ensayo de la t de student para comparación entre dos grupos. Todos los datos combinados se expresaron como media +/- SEM.
Resultados Se ensayó la capacidad del compuesto 1 para mejorar el ejercicio voluntario en ratones mdx. Después de aclimatar los ratones a la jaula de rueda voluntaria, se monitorizó la actividad de los ratones en las ruedas voluntarias por un ordenador 24/7. Los datos recogidos se transcribieron a la distancia recorrida por día durante 3 semanas. Los ratones mdx tratados con 10 y 50 mg/kg/d (dosis diana) del compuesto 1 recorrieron distancias significativamente mayores en la rueda comparado con los ratones mdx tratados con vehículo solo (H2O) (P<0.001 del día 1 al día 19). El efecto del tratamiento se observó tan pronto como 2-3 días después del inicio del tratamiento y continuó a lo largo del periodo de monitorización de la actividad. No se observó efecto del compuesto 1 en la distancia recorrida con ratones WT tratados con 50 mg/kg/d del compuesto 1 (Figura 9). Además, según se determina por las mediciones de fuerza ín vitro en el músculo EDL (Figuras 10A, 10B), el tratamiento con el compuesto 1 incrementó la fuerza específica en el músculo mdx de forma dependiente de la dosis. A frecuencias de estimulación de 150 Hz y superiores, los ratones mdx tratados con 50 mg/kg/d mostraban un aumento estadísticamente significativo en la fuerza especifica del músculo (P<0.05). No se observó efecto del tratamiento con el compuesto 1 en la fuerza específica del músculo en los ratones WT.
Como se muestra en las Figuras 11A, 11B, el tratamiento con el compuesto 1 no afectaba al peso corporal. No se observaron efectos dependientes de la dosis en el consumo de agua. La exposición de la sangre matinal del compuesto 1 fue (media ± SEM) 3.3 ± 0.4 mM para los ratones mdx dosificados con 5 mg/kg/d, 10.7 ± 0.9 mM para los ratones mdx dosificados con 10 mg/kg/d, 52.8 ± 1.7 mM para los ratones mdx dosificados con 50 mg/kg/d y 72.8 ± 7.0 mM para los ratones WT dosificados con 50 mg/kg/d. Los resultados, tomados juntos, muestran que comparado con los controles tratados con el vehículo, el tratamiento con el compuesto 1 a 10 mg/kg/d y 50 mg/kg/d (dosis diana) mejoraban el ejercicio voluntario en rueda después de 3 semanas y la fuerza especifica del músculo después de 4 semanas en los ratones mdx, un modelo murino de la distrofia muscular de Duchenne (DMD por sus siglas en ingles), demostrando de ese modo la utilidad del compuesto 1 y sus análogos como se reivindican en la presente memoria, en el tratamiento de la distrofia muscular.
EJEMPLO 7: Estabilidad Metabólica La estabilidad metabólica del compuesto 1, un Rycal™ representativo según la presente invención, se comparó con el compuesto B y el compuesto C, derivados de benzotiazepina relacionados estructuralmente descritos en WO 2007/024717.
A. Estabilidad metabólica en microsomas hepáticos humanos Métodos: Solubilización del compuesto: Se prepararon disoluciones madre en DMSO y disoluciones de trabajo en agua que contenía 1 mg/ l BSA.
Predicción de la biodisponibilidad metabólica: Las predicciones de biodisponibilidad metabólica (MF%) se basaron en mediciones in vitro de estabilidad metabólica con microsomas hepáticos asumiendo una absorción total. Brevemente, se cuantificaron los fármacos inalterados por LC-MS-MS después de incubación (107M) con microsomas hepáticos de rata y humanos (0.33 mg de proteína/ml) después de 0.5, 15, 30 y 60 mín de incubación en presencia de NADPH (1 m ). La reacción enzimática se paró con metanol (v/v) y las proteínas se precipitaron por centrifugación. Los aclaramientos intrínsecos in vitro (Clint_mic) expresados como ml/min/g de proteína fueron la pendiente (después de linealización LN) de la concentración de fármaco inalterado remanente frente al tiempo de incubación. Las Clint in vitro se aumentaron de escala a un cuerpo entero in vivo (vivoClint) usando 0.045 mg prot/kg de hígado y peso del hígado de 11 g para la rata y 1.2 kg para el ser humano. Los Clint in vivo se transformaron en aclaramientos hepáticos (HepCl) usando el modelo "well- stirred" (HepCl=vivoClint*HBF/(vivoClint + HBF) en el que se tomó HBF (flujo sanguíneo hepático) como 22 ml/min para la rata y 1.500 ml/min para el ser humano. Las MF% se dedujeron a partir de la proporción de extracción con la ecuación siguiente (MF%= 1-HepCl/HBF). Los resultados se presentan en la Tabla 1: Tabla 1: Estabilidad en microsomas humanos a. Clint_mic: aclaramiento intrínseco in vitro en ml/min/g de proteína b. MF%: biodisponibilidad metabólica en % B. Estabilidad metabólica en hepatocitos hepáticos de rata y humanos Solubilización del compuesto: Se prepararon disoluciones madre en DMSO y disoluciones de trabajo en medio William que contenía 1/10 plasma de rata ó 1/4 plasma humano.
Determinación de la estabilidad metabólica: Los compuestos se incubaron a 107 M con hepatocitos aislados (6E+5 células/ml para hepatocitos de rata y 4E+5 células/ml para hepatocitos humanos) a 37°C en plasma de la misma especie diluido en medio Williams (dilución 1/10 para rata y dilución 1/4 para humano). Los tiempos de muestreo se realizaron a 0, 10, 20, 30, 60 y 120 min y la reacción enzimática se paró con metanol (v/v). Las proteínas se precipitaron por centrifugación y el sobrenadante se analizó por LC/MS/MS. Los Clint expresados como ml/min/g de proteina se calcularon como para los microsomas hepáticos usando una proporción de 0,134 mg de proteína/ml para 4E+5 células/ml para los seres humanos y 0,201 mg de proteína/ml para 6E+5 células/ml para la rata. La presencia del fármaco de referencia y el metabolito potencial se comprobó por LC/MS/MS durante el ensayo en cada muestra. Los resultados se presentan en la Tabla 2: Tabla 2: Estabilidad en hepatocitos de rata y humanos a. Clint_mic: aclaramiento intrínseco in vitro en ml/min/gproteína b. MF%: biodisponibilidad metabólica en % c. C: cantidad de células por mi C. Estabilidad metabólica en microsomas de ratón y de rata Materiales y Métodos Tampón de Dilución: Tampón 0.1 M Tris HCl a pH 7.4 que contiene 5 mM EDTA.
Disolución del cofactor NADPH: A un tubo falcon de 50 mL que contiene 2.79 mL de tampón de dilución se añadieron 0.429 mL de disolución regeneradora A de NADPH y 0.079 mL de disolución regeneradora B de NADPH.
Preparación de Microsomas: (disolución 1.5 mg/mL) Un tubo falcón de 50 mL que contiene 3.32 mL de tampón de dilución se precalentó a 37°C durante 15 min. (Al menos 10 min.). Se añadieron 0.178 mL de microsomas (24.6 mg/mL) al tampón de dilución precalentado. La concentración de proteínas de esta preparación de microsomas era 1.25 mg/mL.
Muestra (Compuesto de ensayo) - Disoluciones Madre original e intermedia: Se preparó una disolución de 1 mg/mL (se usó 0.5 mg/mL para el compuesto 1) del compuesto de ensayo en metanol. Se preparó una disolución intermedia de 100 mM del compuesto de ensayo a partir de la disolución madre original usando el tampón de dilución. Se preparó una disolución 5 mM diluyendo la disolución intermedia 100 mM usando tampón de dilución.
Experimento : (Los experimentos se llevaron a cabo en tubos eppendorf de microcentrífuga de 1.5 mL) Incubación de 0 minutos. Procedimiento: a. Añadir 100 m? de microsomas precalentados b. Añadir 50 mL de disolución 5 mM del compuesto de ensayo. c. Añadir 500 m? de disolución de parada fría (Metanol enfriado en hielo) d. Añadir 100 mL de disolución de cofactor NADPH al eppendorf. a. Mezclar con vórtex el eppendorf.
Incubación de "t" minutos b. Añadir 100 pL de disolución de cofactor NADPH al eppendorf. c. Añadir 50 pL de disolución 5 mM del compuesto de ensayo. d. Añadir 100 pL de microsomas precalentados e. Incubar el eppendorf a 37°C 300 rpm durante "t" min en un termomezclador. f. Quitar el eppendorf del termomezclador. g. Añadir 500 pL de disolución de parada fría (Metanol enfriado en hielo) h. Mezclar con vórtex el eppendorf.
Tanto la muestra incubada "0" minutos como "t" minutos se centrifugaron a 15.000 rcf a 4°C durante 15 min.
Se tomaron 500 pL de la disolución de sobrenadante y se sometieron a análisis por LC/MS (SIM - Monitorización Selectiva de Iones).
Los resultados se expresan como % del compuesto de ensayo remanente = (Área MS de la respuesta de la muestra "t" min/Área MS de la repuesta de la muestra "0" min) * 100. El área MS usada es una media de inyecciones duplicadas.
Puntos de tiempo= 0, 15, 30 y 60 min. Para cada compuesto de ensayo.
Control Positivo: Se usó una incubación de 2 mM Imipramina - 5 min. y 2 mM Imipramina - 15 min como un control positivo para los experimentos de estabilidad con microsomas hepáticos de rata y ratón.
Los resultados se presentan en la Tabla 3: Tabla 3: Estabilidad en microsomas de ratón y de rata Sorprendentemente, como se observa en las Tablas 1-3, el compuesto 1 fue significativamente más estable en los microsomas de ratón, rata y humanos y en los hepatocitos de rata y humanos, comparado con los análogos estructurales, compuestos B y C descritos en el documento WO 2007/024717, habiéndose encontrado que ambos poseen estabilidad metabólica in-vi tro deficiente en los sistemas ensayados, haciendo a estos compuestos inadecuados para ser desarrollados como candidatos a fármacos. Sorprendente e inesperadamente, el reemplazamiento del resto H u OH en los compuestos de la téenica anterior con un resto COOH daba como resultado el compuesto 1, que mostraba estabilidad metabólica elevada en todos los sistemas ensayados. La estabilidad metabólica incrementada del Compuesto 1 comparada con sus análogos estructurales fue de hecho sorprendente y apoya los beneficios inesperados de este compuesto sobre los compuestos conocidos en la técnica.
Todas las publicaciones, referencias, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad en el mismo grado que si se indicara específicamente e individualmente que cada solicitud, patente o solicitud de patente se incorpora por referencia en su totalidad.
La descripción anterior de las realizaciones específicas revelará de manera tan completa la naturaleza general de la invención que otros, aplicando el conocimiento actual, pueden modificar y/o adaptar fácilmente dichas realizaciones específicas para varias aplicaciones sin experimentación innecesaria y sin alejarse del concepto genérico y, por lo tanto, dichas adaptaciones y modificaciones deberían estar, y se pretende que estén, comprendidas en el significado y rango de los equivalentes de las realizaciones descritas. Debe entenderse que la fraseología o terminología empleada en la presente memoria es para el propósito de ilustración y no de limitación. Los medios, materiales y etapas para llevar a cabo varias funciones descritas pueden tomar varias formas alternativas sin alejarse de la invención.

Claims (27)

REIVINDICACIONES
1.- Un compuesto representado por la estructura de Fórmula (I): 5 (I) en la que R es COOH; y sales farmacéuticamente aceptables de éste.
2 .- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en forma de una sal con un ácido o base farmacéuticamente aceptable.
3.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la sal se selecciona del grupo que consiste en sodio, potasio, magnesio, hemifumarato, hidrocloruro e hidrobromuro, preferiblemente en donde la sal es la sal de sodio o el hemifumarato.
4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en: (6)
5.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se representa por la estructura de Fórmula (1): (1) o sales farmacéuticamente aceptables de éste.
6.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, en la forma de una sal con un ácido o base farmacéuticamente aceptable.
7.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la sal se selecciona del grupo que consiste en sodio, potasio, magnesio, hemifumarato, hidrocloruro e hidrobromuro.
8.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sal es la sal de sodio .
9.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la sal es la sal hemifumarato .
10.- Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en combinación con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
11.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención de una afección seleccionada del grupo que consiste en trastornos y enfermedades cardiacas, fatiga muscular, trastornos y enfermedades musculoesqueléticas, trastornos y enfermedades del SNC, trastornos y enfermedades neuromuscular, disfunción cognitiva, trastornos y enfermedades óseas, caquexia por cáncer, hipertermia maligna, diabetes, muerte cardiaca súbita y síndrome de la muerte súbita infantil o para mejorar la función cognitiva.
12.- Un método para tratar o prevenir una afección s lccionada del grupo que consiste en trastornos y enfermedades cardiacas, fatiga muscular, trastornos y enfermedades musculoesqueléticas, trastornos y enfermedades del SNC, disfunción cognitiva, trastornos y enfermedades neuromuscular, trastornos y enfermedades óseas, caquexia por cáncer, hipertermia maligna, diabetes, muerte cardiaca súbita y síndrome de la muerte súbita infantil o para mejorar la función cognitiva, comprendiendo el método la etapa de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una composición farmacéutica según la reivindicación 10 para efectuar tal tratamiento .
13.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención de una afección según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que la afección está asociada con una función anormal de un receptor de rianodina 1 (RyRl), un receptor de rianodina de tipo 2 (RyR2), un receptor de rianodina de tipo 3 (RyR3) o una combinación de éstos.
14.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención de una afección según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que los trastornos y enfermedades cardiacas se seleccionan del grupo que consiste en trastornos y enfermedades de latido cardiaco irregular tales como trastornos y enfermedades de latido cardiaco irregular seleccionadas del grupo que consiste en arritmia auricular y ventricular, fibrilación auricular y ventricular, taquiarritmia auricular y ventricular, taquicardia auricular y ventricular, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT por su siglas en ingles), y variantes de éstas inducidas por el ejercicio; trastornos y enfermedades de latido cardiaco irregular inducido por el ejercicio; fallo cardiaco; fallo cardiaco congestivo; fallo cardiaco crónico; fallo cardiaco agudo; fallo cardiaco sistólico; fallo cardiaco diastólico; fallo cardiaco descompensado agudo; daño cardiaco por isquemia/reperfusión (I/R); enfermedad pulmonar obstructiva crónica; daño por I/R posterior a angioplastia coronaria o posterior a trombolisis para el tratamiento de infarto de miocardio (MI por sus siglas in ingles); y presión sanguínea elevada.
15.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que la fatiga muscular se debe a una enfermedad, trastorno o afección musculoesquelética.
16.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que el trastorno, enfermedad o afección musculoesquelética se selecciona del grupo que consiste en fatiga musculoesquelética inducida por el ejercicio; fatiga muscular inducida por el ejercicio prolongado o de alta intensidad; una miopatia congénita; una distrofia muscular tal como una Distrofia Muscular de Duchenne (DMD por sus siglas en ingles), Distrofia Muscular de Becker (BMD por sus siglas en ingles), Distrofia Muscular De Cinturas de las Extremidades (LGMD por sus siglas en ingles) por sus siglas en ingles, distrofia facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica, distrofia muscular congénita (CMD por sus siglas en ingles), distrofia muscular distal, distrofia muscular de Emery-Dreifuss y distrofia muscular oculofaringea, atrofia muscular espinal (SMA por sus siglas en ingles), atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA por sus siglas en ingles); fatiga muscular relacionada con la edad; sarcopenia; enfermedad de los cuerpos centrales; caquexia por cáncer; trastornos de la vejiga; e incontinencia.
17.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que los trastornos o enfermedades del SNC se selecciona del grupo que consiste en Enfermedad de Alzheimer (AD por sus siglas en ingles), una neuropatía, convulsiones, Enfermedad de Parkinson (PD por sus siglas en ingles) , y Enfermedad de Huntington; y trastornos o enfermedades neuromuscular se selecciona del grupo que consiste en degeneración espinocerebelosa (SCA por sus siglas en ingles) y esclerosis lateral amiotrofica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig's).
18.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que la disfunción cognitiva está relacionada con el estrés o relacionada con la edad, o en la que la función cognitiva que se quiere mejorar es memoria a corto plazo, memoria a largo plazo, atención o aprendizaje, o en la que la disfunción cognitiva está asociada con una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer (AD por sus siglas en ingles), trastorno de déficit de atención con hiperactividad (ADHD por sus siglas en ingles), trastorno del espectro autista (ASD por sus siglas en ingles), trastorno de ansiedad generalizado (GAD por sus siglas en ingles), trastorno obsesivo compulsivo (OCD por sus siglas en ingles), Enfermedad de Parkinson (PD por sus siglas en ingles), trastorno de estrés post-traumático (PTSD por sus siglas en ingles), Esquizofrenia, trastorno Bipolar, y depresión mayor.
19.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que la afección es caquexia por cáncer, preferiblemente debido a un cáncer que tiene metástasis óseas.
20.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que el compuesto se usa a una dosis suficiente para restaurar o aumentar la unión de calstabina2 a RyR2.
21.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que el compuesto se usa a una dosis suficiente para restaurar o aumentar la unión de calstabinal a RyRl.
22.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, en la que el compuesto se usa a una dosis suficiente para disminuir el escape de Ca2+ a través de un canal RyR.
23.- Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal de éste, para uso en el tratamiento o prevención de una afección seleccionada del grupo que consiste en trastornos y enfermedades cardiacas, fatiga muscular, trastornos y enfermedades musculoesqueléticas , trastornos y enfermedades del SNC, disfunción cognitiva, trastornos y enfermedades neuro uscular, trastornos y enfermedades óseas, caquexia por cáncer, hipertermia maligna, diabetes, muerte cardiaca súbita y síndrome de la muerte súbita infantil, o para mejorar la función cognitiva.
24.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento o prevención según la reivindicación 11, o un método según la reivindicación 12, que además comprende el uso de un oligonucleótido antisentido (AO por sus siglas en ingles) que es específico para corte y empalme de una secuencia en un mRNA de interés, para potenciar la omisión de exones en dicha mRNA de interés.
25.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, para uso en el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD por sus siglas en ingles), en la que el oligonucleótido antisentido (AO por sus siglas en ingles) es específico para una secuencia de corte y empalme de al menos un exón del gen DMD, preferiblemente una secuencia de corte y empalme del exón 23, 45, 44, 50, 51, 52 y/o 53 del gen DMD.
26.- Un método para tratar un sujeto que tiene Distrofia Muscular de Duchenne (DMD por sus siglas en ingles), que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una composición farmacéutica según la reivindicación 10, en combinación con un oligonucleótido antisentido (AO por sus siglas en ingles) que es específico para una secuencia de corte y empalme de al menos un exón del gen DMD, preferiblemente una secuencia de corte y empalme del exón 23, 45, 44, 50, 51, 52 y/o 53 del gen DMD.
27.- Un proceso para la preparación de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende la etapa de hacer reaccionar compuestos de la fórmula en el que Ra es COOR1 o CN; R1 es un alquilo Ci-C4, y L es un grupo saliente para proporcionar un compuesto de la fórmula: convertir el grupo Ra en el grupo R para proporcionar un compuesto de fórmula (I).
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